KR101207336B1

KR101207336B1 - 방사선 치료 반응 예측을 위한 ｈｌｔｆ의 발현 수준 측정 방법 및 ｈｌｔｆ 발현 억제 물질을 포함하는 암의 방사선 치료 감작용 조성물

Info

Publication number: KR101207336B1
Application number: KR1020100086510A
Authority: KR
Inventors: 박우윤; 유재란
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2012-12-05
Also published as: KR20120059669A

Abstract

본 발명은 암의 방사선 치료 반응을 예측하는데 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 HLTF (Helicase-like transcription factor) 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법, 및 HLTF 유전자 발현 억제 물질 또는 HLTF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암의 방사선 치료 감작용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 환자 시료로부터 HLTF 유전자의 발현 수준을 측정하여 암의 방사선 치료 반응을 용이하게 예측할 수 있으며, HLTF 유전자 발현 억제물질 또는 HLTF 단백질 활성 억제물질을 암세포에 도입함으로써 암의 방사선 치료 효율을 크게 향상시킬 수 있다.

Description

방사선 치료 반응 예측을 위한 ＨＬＴＦ의 발현 수준 측정 방법 및 ＨＬＴＦ 발현 억제 물질을 포함하는 암의 방사선 치료 감작용 조성물{Method Of Measuring Expression Level of HLTF Gene For Predicting Efficiency of Cancer Radiotherapy and Radiation Sensitizing Composition For Cancer Therapy Comprising HLTF Expression Inhibiting Agent}

본 발명은 암의 방사선 치료 반응을 예측하는데 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 HLTF (Helicase-like transcription factor) 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법 및 HLTF 유전자 발현 억제 물질 또는 HLTF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암의 방사선 치료 감작용 조성물에 관한 것이다.

자궁경부암(cervical cancer)은 매우 효과적으로 스크리닝하는 방법이 존재함에도 불구하고 여성에게 있어서 세계적으로 두 번째로 흔한 암이다(Waggoner, 2003). 방사선 치료(radiation therapy)는 자궁경부암의 모든 단계에서 치료에 사용될 수 있으나, 암 초기 단계의 의학적으로 부적합한 환자에게는 통상적으로 사용이 보류되고 있다. IB 질환 단계에 있는 환자들의 약 1/3에서 사용되고 있는 외과적 수술 이후의 보조적 방사선 치료를 포함하여, 방사선 치료는 전체 자궁경부암 치료 중에서 60％ 이상에 사용되고 있다(Chung et al., 2005). 자궁경부암의 표준 방사선 치료에서 가장 두드러진 변화는 국소적으로 발전된 단계의 질환을 갖는 환자에 대해 방사선 치료와 함께 시스플라틴(cisplatin)-함유 동시 화학치료법을 행하는 것이었다(Keys et al., 1999; Morris et al., 1999; Rose et al., 1999). 화학방사선 동시치료법이 골반 질환 조절 및 생존에서 현저한 향상을 가져왔다는 것이 증명되었음에도 불구하고, 종양세포의 방사선에 대한 내성은 치료에서 주요한 문제점으로 남아있다.

DNA는 유전물질의 전달이라는 본연의 특성 때문에 모든 유기체들은 DNA 손상을 인지하고 이에 반응하는 메카니즘을 진화시켜왔다. 방사선-유도 DNA 손상이 발생되면 세포들은 DNA 손상을 수리하거나 아폽토시스(apoptosis)를 촉진시키기 위해서 세포주기의 진행을 중지하게된다(Shiloh, 2003). DNA 수리의 효율성은 방사선 치료 이후에 세포의 운명을 결정하는 가장 중요한 결정요소중의 하나이다(Polischouk et al., 2001). 염기 및 뉴클레오타이드 제거(excision) 수리 메카니즘은 방사선치료에 의해 야기되는 DNA 가닥 절단의 수리에 있어서 특히 중요하다. DNA 수리 능력은 유전, 환경요인 및 생리학적 요인의 결과에 따라 개인간에 따라 다양한 차이를 보인다(Scully et al., 2000).

최근 인간 HLTF가 이스트(yeast) Rad5와 몇 가지 기능 및 구조적 유사성을 가지고 있다는 것이 밝혀졌다. HLTF 발현을 감소시키면 DNA 손상 민감도가 증대되고 DNA 손상에 대한 GCR을 촉진하며, HLTF가 민감화된 유전적 배경에서 이스트 Rad5 기능을 부분적으로 보충할 수 있다(Gangavarapu et al., 2006; Unk et al., 2008). 또한, HLTF는 C3HC4 RING 도메인을 갖는 이스트 Rad5-유사 도메인 구조가 SWI/SNF2 헬리케이즈(helicase) 모티프에 포함되어 있다.

다른 RING 도메인함유 단백질과 유사하게, HLTF는 Rad6-Rad18 및 Mms2-Ubc13 유비퀴틴-컨쥬게이팅 복합체(ubiquitin-conjugating complex)와 함께 PCNA 폴리유비퀴틴화(polyubiquitylation)를 수행하는 유비퀴틴 리가아제이다(Gangavarapu et al., 2006; Lee and Myung, 2008; Unk et al., 2008). HLTF는 전통적으로 종양 억제유전자로 간주되었고, 이러한 개념은 HLTF 프로모터 과메틸화가 다양한 타입의 암조직 및 세포주에서 검출되면서 지지되고 있다(Moinova et al., 2002). 그러나 최근에 관찰된 변형된세포(transformed cell) 및 암 조직내에서 HLTF의 발현이 증가된다는 것은 HLTF가 암발생과 연관되어 있고, 암유전자와 유사하게 작용할 수 있다는 것을 제시하였다(Capouillez et al., 2009; Debauve et al., 2008). 더욱 최근에 Blastyak et al은 손상된 DNA의 복제에 있어서 인간 HLTF의 이중쇄 DNA 트랜스로카아제(translocase) 활성을 보고하였다. 그러나, 인간암의 방사선 내성에 있어서 HLTF의 기능에 관해서는 아직 보고되어 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암의 방사선 치료의 반응성에 대한 예측 인자를 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 암의 방사선 치료 후 재발성 환자의 조직에서 HLTF (Helicase-like transcription factor)의 발현이 증가되어 있음을 발견하였으며, 암세포에서 siRNA (small interfering RNA)의 도입을 통해 HLTF의 발현을 녹다운(knock-down)시킨 경우 암세포의 방사선에 대한 감수성이 크게 증가하였음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 암의 방사선 치료 반응을 예측하는데 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 HLTF (Helicase-like transcription factor) 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 HLTF (Helicase-like transcription factor) 유전자의 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암의 방사선 치료 감작용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 암의 방사선 치료 반응을 예측하는데 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 HLTF (helicase-like transcription factor) 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 암의 방사선 치료 후 재발성 환자의 조직에서 HLTF 발현이 증가되어 있는 것을 실험적으로 확인하였다. 하기 실시예에서 증명되는 바와 같이, HLTF는 암의 방사선 치료후 완치된 환자의 시료에서 보다 재발성 환자의 시료에서 더욱 고발현되어 있다. 즉, 본 발명은 HLTF의 고발현과 암 방사선 치료 후 재발 가능성의 증대와의 상관관계가 있다는 것에 기초한다.

본 발명의 방법에 따르면, 환자의 시료로부터 HLTF의 발현 수준을 측정함으로써 암의 방사선 치료 반응을 예측하는데 필요한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 측정된 HLTF의 발현 수준은 암 환자의 방사선 치료 후에 재발 가능성을 예측하기 위한 정보로도 활용될 수 있다.

본 명세서에서 "HLTF (Helicase-like transcription factor)"는 바람직하게는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

본 명세서에서 용어 "시료"는 HLTF 유전자의 발현을 측정하는 환자의 세포 또는 조직을 의미하며, 예를 들어, 혈액, 조직, 체액, 오줌 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "HLTF 유전자"는 상기 HLTF 단백질을 코딩하고 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "암"은 특정 종류의 암으로 한정되지 않으며, 예를 들어 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 구강암, 구강 인두암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 유방암, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암 또는 뇌암이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 HLTF 유전자의 발현 수준의 측정은 HLTF 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 HLTF 단백질의 발현 수준 측정이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 HLTF 단백질의 발현 수준 측정은 HLTF 단백질을 면역분석(immunoassay)하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법에서 HLTF 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 유전적 분석(genetic analysis) 방법과 면역 분석(immunoassay)방법으로 실시할 수 있다.

유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, HLTF 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다.

프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 HLTF 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 HLTF 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 세포 또는 조직)에서 HLTF mRNA 발현양을 조사하여 HLTF 유전자의 발현 정도를 결정한다. 따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다. mRNA를 얻기 위하여, 먼저 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포 내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺ 와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 명세서의 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당 업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 발명에서 증폭 반응에 이용되는 프라이머는 HLTF 유전자의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 HLTF cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 HLTF cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다. 본 발명에서 프라이머는 HLTF의 mRNA (즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 HLTF의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다.

이렇게 증폭된 HLTF를 적합한 방법으로 분석하여 HLTF 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 HLTF 유전자의 발현 정도를 조사한다.

또한, HLTF 유전자 또는 HLTF의 cDNA에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 할 수도 있다. 본 명세서에서 용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, HLTF의 cDNA에 혼성화되는 본 발명의 프로브는 불용성 담체 (예컨대, 니트로셀 룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 마이크로어레이에 있어서, 본 발명의 프로브는 혼성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다. HLTF의 cDNA는 상술한 과정에 의해 얻을 수 있다. 프로브 대신에 HLTF의 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다. 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine),ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t- NBT(nitroblue tetrazolium)등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 상술한 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다.

다음으로, 면역분석(immunoassay) 방법에 기초하여 본 발명을 설명하면 다음과 같다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 HLTF 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다. HLTF 단백질에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. HLTF 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법 (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow,E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999;Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984;및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 HLTF 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차 항체로서 HLTF 단백질에 대한 항체와 상기 시료 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine),ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)와 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 HLTF 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, HLTF 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다.상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵ ), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 HLTF 단백질의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) HLTF (Helicase-like transcription factor) 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 (b) HLTF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암의 방사선 치료 감작용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 “방사선 치료 감작 (radiation therapy sensitizing)”은 암의 방사선 치료시에 암세포의 방사선에 대한 손상 민감도를 향상시켜 방사선 치료의 효과를 보다 상승시키려는 처치를 의미한다. 다시 말하면, 방사선에 대한 암세포의 내성을 억제하여 방사선에 의한 암세포의 사멸 유도가 쉽게 발생하도록 처리하는 것을 의미한다.

본 발명에서 암세포에서 HLTF의 발현 또는 HLTF 단백질 활성을 억제하면 방사선 치료에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 HLTF 유전자 서열에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드는 siRNA (small interference RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA)이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 HLTF 유전자에 대한 siRNA는 서열목록 제 2 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 암은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 구강암, 구강 인두암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 유방암, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암 또는 뇌암이다.

본 발명에서 HLTF의 발현을 저해시키기 위해서 이에 한정되는 것은 아니나 예를 들어 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 방법을 이용할 수 있다. HLTF 유전자에 대한 siRNA(small interfering RNA)를 설계 및 합성하고 이를 세포내로 도입시킴으로써 RNAi를 유도할 수 있다.

본 발명에서 용어 "RNAi"란 dsRNA (double-strand RNA)가 표적 유전자에 특이적 및 선택적으로 결합하고 해당 표적유전자를 절단함으로써 그의 발현을 효율적으로 저해하는 현상이다. 예컨대, dsRNA를 세포내에 도입하면, 도입된 RNA 서열과 상동 서열을 갖는 유전자의 발현이 억제 (녹다운, knockdown)된다. 본 발명에서 용어 "siRNA"는 RNAi를 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(HLTF mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(HLTF mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA 끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 - 100 염기, 바람직하게는 15 - 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 - 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명에서 siRNA의 설계는 다음과 같이 실시할 수 있다.

(ⅰ) HLTF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이면 특별히 한정되지 않고, 이 서열의 임의의 영역을 모두 후보로 할 수 있다. 즉, 본 발명에서 HLTF 유전자 발현 저해용 siRNA는 HLTF를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 중 일부 영역에 상보적인 서열을 가진다.

(ⅱ) 선택한 영역에서 염기 AA로 시작되는 서열을 선택하고, 그 서열의 길이는 19 - 25 염기, 바람직하게는 19 - 21 염기이다. 이 서열의 GC 함량은, 예를 들어 40 - 60％가 되도록 선택하는 것이 바람직하다. 제작한 siRNA를 세포에 도입하기 위해서는, 생체외에서 합성한 siRNA를 플라스미드 DNA에 삽입하여 이를 세포에 도입하는 방법고, 2 개의 RNA를 어닐하는 방법 등을 채용할 수 있다.

또한, 본 발명은 RNAi 효과를 얻기 위해, shRNA(short hairpin RNA)를 사용할 수도 있다. 본 발명에서 "shRNA"는 하나의 사슬의 일부 영역이 다른 영역과 상보쇄를 형성하여 스템 앤 루프(stem and loop) 구조를 갖는 RNA 분자를 의미한다. shRNA는 그 일부가 스템 앤 루프 구조를 형성하도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 어떤 영역의 서열을 서열 A로 하고, 서열 A에 대한 상보쇄를 서열 B로 하면, 서열 A - 스페이서(spacer) - 서열 B의 순서가 되도록 이들의 서열이 한 개의 RNA 사슬에 존재하도록 하여, 전체 45 - 60 염기의 길이가 되도록 설계한다. 예컨대, 서열 A는 표적이 되는 HLTF 유전자의 일부 영역의 서열이고, 표적 영역은 특별히 한정되는 것은 아니고, 임의의 영역을 후보로 할 수 있다. 그리고 서열 A의 길이는 19 - 25 염기, 바람직하게는 19 - 21 염기이다.

shRNA 염기 서열을 합성한 후, 예컨대 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터(렌티바이러스 또는 아데노바이러스)에 클로닝하여 발현 컨스트럭트를 제조하고, 이를 세포내로 도입하여 세포내에서 발현시키면, 루프가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 형성된다. shRNA는 세포내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. shRNA를 포함하는 발현 컨스트럭트 또는 벡터는 당분야에서 공지된 방법으로 제조할 수 있다(미국 특허 공개공보 제20040106567호 및 제20040086884호 참조).

HLTF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 내용은 상기 본 발명의 다른 일 양태인 암의 방사선 치료 반응을 예측하는데 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 시료로부터 HLTF 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법에서 설명된 내용과 동일하다. 본 발명에서 HLTF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 HLTF의 활성을 억제함으로써 상기 설명된 HLTF 유전자 서열의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 HLTF의 발현 억제 효과와 동일한 효과를 기대할 수 있다. 즉, 상기 HLTF에 대한 항체를 암세포에 도입함으로써 방사선 치료 감수성을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에는 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏체중이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

도 1은 HLTF 면역조직화학 분석결과를 보여주는 사진이다. 패널 A-D: DF 인간 자궁경부암에서의 HLTF의 중간 강도의 염색 패턴을 보여준다. 패널 E-H: 재발성 인간 자궁경부암에서 HLTF의 강한 과발현 및 핵 세포질내의 국재화(localization)을 보여준다 (bar = 200μm).
도 2a 및 도 2b는 RNA 간섭을 사용한 HLTF 발현의 억제에 관한 결과를 보여준다.
도 2a는 RT-PCR을 사용하여 HLTF siRNA로 트랜스펙션된 후의 HLTF의 전사(transcription) 수준을 검출한 결과를 보여준다. HLTF의 전사 수준은 NeoFX 시약으로 트랜스펙션된 세포에서 보다 HLTF siRNA-트랜스펙션된 세포에서 현저히 낮았다(P < 0.05). mRNA 로딩을 정상화(normalize)하기 위해 GAPDH를 내부 대조군(internal control)로 사용하였다. HLTF의 상대적 mRNA 수준은 동일 시점에서 GAPDH에 대한 HLTF의 상대적 변화량으로서 표시하였다.
도 2b는 HLTF siRNA-트랜스펙션된 HeLa 세포내에서 HLTF 단백질 수준을 분석하기 위한 웨스턴 블로팅 결과를 보여준다. HLTF 단백질의 발현은 대조군 보다 HLTF siRNA 트랜스펙션된 세포에서 더 낮았다(P < 0.05). β-액틴을 단백질 로딩을 정상화하기 위한 내부 대조군으로서 사용하였다. 나타낸 결과는 3회의 반복 실험의 대푯값이다.
도 3a 및 도 3b는 HLTF siRNA에 의한 세포 증식의 억제 결과를 보여준다. 세포 증식 분석은 WST-1을 사용하여 수행하였다. HeLa 세포는 siRNA으로 48 시간 동안 일시적 트랜스펙션을 행하고, 도 3a의 경우 방사선 조사하지 않았고, 도 3b의 경우 4 Gy로 방사선 조사하였다. 도 3a 및 도 3b의 양쪽 모두에서 광학밀도(optical density)는 0, 24, 및 48 시간에서 측정하였다. 그래프에서 비-처리 대조군(NT, 다이아몬드형), 트랜스펙션 시약만으로 처리한 대조군(Rg, 직사각형) 및 siRNA 처리(삼각형)을 각각 나타내었다.
도 4a 및 도 4b는 아폽토시스 프로세스의 특성을 분석한 결과를 보여준다.
도 4a는 아폽토시스에 대한 DNA 단편화 분석 결과를 보여준다. siRNA으로 48 시간 동안 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 4 Gy에서 방사선 조사하였다. 단편화된 DNA를 방사선 조사후 0, 24, 및 48 시간에서 추출하고 1.5％ 아가로즈 젤상에서 분리하였다.
도 4b는 아폽토시스-관련 단백질들의 발현을 보여준다. HLTF siRNA으로 48 시간 동안 처리한 HeLa 세포 또는 처리하지 않은 HeLa 세포들을 4 Gy의 방사선으로 조사하고, 조사후 0, 24, 및 48 시간에서 웨스턴 블로팅을 수행하였다. β-액틴은 동등한 로딩양을 보장하기 위해 내부 대조군으로 사용하였다.
도 5a 및 도 5b는 숙주세포 재활성화(host-cell reactivation, HCR) 분석의 결과를 보여준다. HCR 분석을 수행하여 HeLa 세포의 DNA 수리능을 평가하였다. HeLa 세포들은 siRNA으로 48 시간 동안 일시적 트랜스펙션하거나 또는 트랜스펙션 하지 않았고, 이어서, 손상되지 않은 pGL3으로 트랜스펙션하거나(도 5a) 또는 손상된(조사된) pGL3으로 트랜스펙션하였다(도 5b). HeLa 세포의 LUC 활성은 트랜스펙션 후 24, 48, 및 72 시간에서 대조군 및 siRNA 처리 세포의 것을 비교하였다. siRNA-처리된 HeLa 세포내에서 손상되지 않은 pGL3 및 손상된 (방사선 조사된) pGL3의 LUC 활성 백분율을 나타내었다(도 5c). 데이터는 3회 독립적인 실험의 평균 및 SD 값으로 표시하였다.
도 6은 자궁경부암에서 초기 CIN 단계에서 HLTF의 차별적 발현을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 세포 및 배양 조건

자궁경부암세포주(HeLa)는 한국세포주은행(한국)에서 구입하였다. HeLa 세포는 10％ 우태아혈청(FBS), 100 IU/㎖ 페니실린 및 100 μg/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 사용하여 37℃의 5％ CO₂ 분위기에서 배양하였다. 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 수집한 후 계대배양하였다. 세포배양에 필요한 모든 시약들은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.

실시예 2: 환자 샘플

포르말린-고정 파라핀-봉밀된 인간 자궁경부암의 조직 샘플은 2003년 5월 부터 2005년 7월 까지 충북대학교 병원에서 방사선 치료를 받은 환자의 자궁경부조직으로부터 얻어 실험에 사용하였다. 모든 실험은 충북대학교병원의 윤리위원회의 승인하에 수행하였다.

실시예 3: 면역조직화학

면역조직화학 염색은 제조자의 지시에 따라, 항원-회수(antigen-retrieval) 후에 Immunohistochemistry Accessory Kit (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)를 사용하여 파라핀-봉밀된 조직 섹션상에 대해 수행하였다. 간단하게 설명하면, 파라핀을 제거한 섹션을 pH 6.0의 시트레이트(citrate) 완충액을 사용하여 마이크로웨이브 오븐에서 6분간 처리하여 항원을 회수하였다. 내인성 퍼옥시다아제는 메탄올내에서 0.6％ 과산화수소를 사용하여 20 분간 블로킹하였다. 조직 섹션은 단백질 블로킹 용액으로 30 분간 처리하였다. 1차 항체 [HLTF에 대해 1:100 희석(Aviva Systems San Diego, CA, USA)]를 슬라이드에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBST내에서 세정한 후, 섹션을 적합한 2차 항체와 60분간 인큐베이션하였다. 색깔 반응은 Liquid DAB substrate Pack (Bethyl Laboratory, Montgomery, TX, USA)을 사용하여 전개하였다. 섹션은 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색하였다.

실시예 4: siRNA 처리

HLTF의 siRNA 올리고들은 Ambion (Austin, TX, USA)에서 합성하였다: (s13138) 5′-GGAAUUUUAGCUGAUGAUATT-3′(서열목록 제 2 서열). 일시적 트랜스펙션을 위해, 5 X 10⁴ HeLa 세포들을 6-웰 플레이트상에 접종하고 70％ 컨플루언스에 도달할 때 까지 배양하였다. 배지를 제거한 후, 제조자의 추천에 따라 2 μl 의 NeoFX transfection reagent (Ambion)에 용해된 HLTF의 0.4 nM siRNA를 각 웰에 첨가하였다. 48 시간의 siRNA 트랜스펙션 후에, 배양 배지를 10％ FBS를 함유하는 배지로 교환하고, 세포들을 상온에서 4 Gy의 방사선으로 조사하였다. RNA 억제의 효과는 정량 실시간(real-time) PCR 및 웨스턴 블로팅에 의해 측정하였다.

실시예 5: 실시간 (real-time) RT-PCR 분석

제조자의 프로토콜에 따라 총 RNA를 Trizol(Invitrogen)을 사용하여 HeLa 세포로부터 분리하고 RNeasy kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)으로 더욱 정제하였다. RNA는 cDNA 합성을 위해 iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 처리하였다. 간략하게 설명하면, 1μg의 RNA를 42℃에서 30 분간 역전사효소를 사용하여 역전사하였다. 실시간 PCR (iCycler iQ, Bio-Rad)은 10μl의 마스터믹스(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad), 1μl의 cDNA 주형, 1μl의 각 HLTF 프라이머쌍 [20 nM; 전방향 프라이머, TGAAGGACATGCCATACGAA (서열목록 제 3 서열), 역방향 프라이머, TCCTCCTTCATCTCCCATTG (서열목록 제 4 서열)], 및 7μl의 RNase-free 물을 포함하는 PCR 마스터 믹스을 사용하여 행하였다. PCR 반응은 95℃에서 2분간의 변성(denaturation) 및 95℃에서 15초, 60℃에서 15초, 및 72℃에서 15초의 40 사이클 증폭(amplification) 과정을 거쳤다. HLTF 유전자의 실시간 정량은 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 사이클 문턱수(threshold number of cycles, C_T)에 정상화하였고, 여기에서 C_T는 증폭된 샘플 생성물의 양이 100 상대 형광 유닛에 도달하는 PCR 사이클의 수에 동등한 것이다. KD 발현과 비교한 HLTF mRNA 발현 차이는 C_T (2^-ΔΔ ^CT)를 비교하여 계산되었다. 모든 생성물에 대한 융해 커브(melting curve)는 각각 10초의 85 사이클 동안 65℃ 부터 0.4℃만큼의 온도 증가에 의한 증폭 직후에 얻었다. 각각의 실험은 독립적으로 3회 수행하였다.

실시예 6: 세포 증식 분석

세포증식은 WST-1 (Roche, Indianapolis, IN, USA)을 사용하여 분석하였다. 이 분석은 세포 마이토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 테트라졸륨염이 절단되어 포르마잔을 생성하는 것에 기초한 분석법이다. HeLa 세포들을 웰당 1 X 10⁵ 세포의 밀도로 96-웰 마이크로플레이트에 플레이팅하였다. 70％ 컨플루언시까지 배양한 후, 세포들을 NeoFX reagent (Ambion)을 사용하여 HLTF에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA으로 48 시간 동안 트랜스펙션하였고, 대조군 세포들은 처리하지 않았다. WST-1 시약을 0, 24 및 48 시간에서 각각 1 시간 동안 처리하고, 생성된 포르마잔 염색을 450 nm에서 Microplate Reader (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 정량하였다. 세포 증식은 3회 반복 평가하였다. 데이터는 네가티브-대조군 증식에 대비하여 백분율로 나타내었고, P값 < 0.05을 유의한 것으로 간주하였다. 각 실험은 3회 수행하였다.

실시예 7: DNA 단편화 분석

DNA 단편화 분석은 제조자의 추천에 따라 Quick apoptotic DNA ladder detection kit (BioVision, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 간단하게 설명하면, 5 X 10⁴ HeLa 세포들을 6-웰 플레이트내에서 70％ 컨플루언시에 도달할때 까지 배양하였다. 48 시간 동안 siRNA 트랜스펙션한 후에, 배지를 10％ FBS를 포함하는 새로운 배지로 교환하고, 각 세포들을 상온에서 4 Gy으로 조사하였다. DNA를 세포로부터 분리하고 1.5％ 아가로스젤상에서 100V, 20 분 동안 전기영동하고, 젤의 이미지를 얻었다(SL-20 Image Visualizer, Seolin Scientific, Seoul, Korea).

실시예 8: 웨스턴 블로팅

세포들을 PBS로 세정하고, 20 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1％ Triton, 1 mM EGTA, 및 단백질분해효소 억제제를 포함하는 냉각시킨 세포 용해 완충액(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 50 μl에서 용해시켰다. 얼음상에서 초음파 처리한 후, 19,000g 에서 4℃, 10 분간 원심분리하여 단백질 용해물을 얻었다. 단백질 농도는 브래드포드 분석시약(Bradford assay reagent, Bio-Rad)으로 측정하였다. 15 μl의 단백질을 6 X 샘플 완충액 [360 mM Tris HCl (pH 6.7), 60％ 글리세롤, 및 12％ SDS] 3μl와 혼합하였다. 이어서, 단백질 샘플들을 100℃에서 5분간 가열하고 10％ SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate??polyacrylamide gel electrophoresis)를 행하고, PVDF막(Bio-Rad)에 옮겼다. 막을 0.5％ 탈지유로 블로킹하였고 HLTF, EndoG (survivin, endonuclease G), XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis), PARP(poly ADP ribose polymerase)에 대한 모노클로날 항체와 AIF(apoptosis-inducing factor)에 대한 폴리클로날 항체으로 탐침하였다. HLTF에 대한 항체는 Aviva Systems (San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였고, survivin, PARP, cytochrome c, 및 AIF에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)으로부터 구입하였으며, EndoG 및 XIAP의 항체는 Cell Signaling Technology으로부터 구입하였다. 이어서, 필터를 호오스래디쉬-퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 2차 항체와 인큐베이션시키고, WEST-ZOL Plus (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Korea)으로 전개시켰다. 각 레인의 단백질의 양이 비교가능한 것인지를 결정하기 위해, 필터를 벗겨내어 β-액틴에 대한 염소 폴리클로날 항체로 다시 탐침하였다(Santa Cruz Biotechnology).

실시예 9: 숙주세포 재활성화(Host-cell reactivation, HCR) 분석

루시퍼라아제(LUC) 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 발현 벡터 pGL-3 (Promega, Madison, WI, USA)를 LUC 분석에 사용하였다. 1 ml의 pGL-3 (500 μg/ml)을 조사하지 않거나 또는 X-선(4 Gy)으로 조사하였다. 37℃에서 3 시간 동안 인큐베이션한 후에, 플라스미드 DNA를 99％ 에탄올로 침전시키고, 75％ 에탄올로 세정한 후에, 최종 농도가 0.3 mg/ml이 되도록 0.1 M Tris-EDTA 완충액에 용해시켜 -20℃에서 트랜스펙션에 사용할 때 까지 보관하였다. HeLa 세포들을 2 X 10⁵ 세포/웰이 되도록 6-웰 플레이트에 분주하였다. 퍼펙틴(Perfectin, Bio-Rad)을 사용하여 손상되지 않은 pGL-3 또는 X-선 손상된 pGL-3으로 세포를 트랜스펙션하였다. 48 시간 동안 트랜스펙션한 후에, 세포들을 PBS로 세정하고 4℃에서 14,000g으로 원심분리하고 스크랩핑하여 회수하였다. 세포 펠릿을 50μl의 리포터 용해 완충액(Promega)내에 현탁시키고, 동결한 후 37℃의 에탄올-드라이-아이스 수조내에서 녹여 1,400g 에서 15 초간 원심분리하였다. 각 LUC 분석을 위해, 20 μl의 세포 추출물 상등액을 상온의 96-웰 플레이트내에서 20 μl의 LUC 분석 기질(Promega)과 혼합하였다. LUC 활성은 루미노미터(luminometer, Lumat LB 9507, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)으로 측정한 후에, 손상되지 않은 플라스미드(대조군) 및 X-선 손상된 플라스미드(수리)를 갖는 세포들에 대해 기록된 임의 LUC 광-강도 유닛에서 정량화하였다. DNA 수리능은 손상되지 않은 플라스미드의 것과 비교하여 손상된 플라스미드의 LUC 활성의 백분율로서 계산하였다.

실시예 10: 통계분석

모든 실험은 적어도 3회 반복하여 세 번 실시하였다. 모든 데이터는 평균 및 SD 값으로 표현하였다. 통계적 차이는 Student's t test (two-way ANOVA)에 의해 평가하였고, P 값이 < 0.05인 경우를 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 11: 무병(DF, disease free) 및 재발성 자궁경부암에서 HLTF 발현 측정

방사선 치료를 행한, 16개의 무병 (DF, disease free) 생존자 샘플 및 11개의 재발성(recurrence) 샘플로 구성된 27개의 인간 자궁경부암 조직에서 HLTF의 발현을 면역조직화학을 통해 분석하였다. HLTF의 발현 및 국재화(localization)은 DF 및 재발성 샘플들간에 상당한 변이를 보였다. DF 샘플에서 HLTF의 발현은 대부분 세포질에서 나타났으며, 종양세포군과 중간 정도의 강도로 연관되어 있었다(도 1의 패널 A 내지 D 참조, 하기 표 1 참조). 하기 표 1은 인간 자궁경부암 재발 환자 및 DF 환자의 조직내에서 HLTF 발현의 면역조직화학 염색 강도를 표로 나타난 것이다. 재발성 조직 샘플의 HLTF 면역조직화학 염색 결과 핵세포질 국재화와 관련된 과발현을 갖는 흥미로운 패턴이 관찰되었다. 이 결과는 HLTF의 고발현이 암의 방사선 치료 후에 재발성과 상관성이 있다는 것을 암시한다. 염색 강도는 기질 침투성(stromal invading) 악성세포군에서 더욱 높게 나타났다. 발현은 커다란 속이 빈 핵을 갖는 특정 악성 세포의 핵주위 영역 근처에서 발견되었다(도 1의 패널 E 내지 H 참조). 종양 근처의 자궁경부 내 악성 병변 조직은 HLTF가 강하게 염색되는 패턴을 보였다. 초기 자궁경부암 단계인 CIN Ⅰ 및 CIN Ⅱ에서는 중간 강도를 갖는 HLTF의 발현이 관찰된 반면, 보다 높은 단계인 CIN III에서는 HLTF 발현이 전혀 관찰되지 않았다(도 6 참조).

실시예 12: HLTF siRNA 트랜스펙션에 의해 HLTF 발현이 감소하였다.

RNAi 기술을 이용하여 HeLa 세포에서 HLTF의 발현을 일시적으로 녹-다운시켜 HLTF의 역할을 평가하고, 세포 성장에 대한 영향을 평가하였다(도 2a, 도 2b, 도 3a, 도 3b 참조) HLTF siRNA 트랜스펙션은 대조군과 비교하여 HLTF 단백질 발현을 감소시켰다. HLTF의 생성 감소가 유전자 전사 감소에 기인한 것인지를 결정하기 위해, HLTF 전사물을 실시간(real time) RT-PCR을 사용하여 평가하였다. 도 2a에서 보여지는 바와 같이, HLTF의 전사 수준은 대조군과 대비하여 siRNA-트랜스펙션된 세포에서 현저하게 낮았다(P < 0.05).

실시예 13: HLTF siRNA의 HeLa 세포의 증식에 대한 영향

HLTF KD의 HeLa 세포 증식에 대한 영향은 WST-1 분석을 사용하여 평가하였다. siRNA 트랜스펙션에 의해 유도된 HLTF 기능 손실에 의해 세포 증식은 감소되었고(도 3a), 이러한 현상은 방사선 조사에 의해 증대되었다(도 3b). siRNA 트랜스펙션 및 방사선 조사 후에 증식되는 세포의 수가 2개의 대조군 세포주에 비해 크게 감소하였다(P < 0.05).

실시예 14: HLTF의 하향조절에 의해 아폽토시스가 유도되었다

HLTF의 KD의 영향은 HeLa 세포들을 6-웰 플레이트내에서 0.4 nM siRNA으로 48 시간 동안 처리하고 X-선을 조사하여 분석하였다. siRNA 처리된 HeLa 세포들은 세포 수축과 같은 전형적인 아폽토시스의 형태적 특성을 나타내었다. DNA 단편화 분석을 사용하여 siRNA에 의한 아폽토시스 유도를 추가적으로 평가하였다. 아폽토시스의 후반기 단계에서 발생하는 것으로 알려져 있는 전형적인 래더링(laddering) 패턴은 siRNA 처리된 세포들에서 더욱 심하게 나타났다(도 4a). 웨스턴 블로팅을 사용하여 친-아폽토시스 단백질 AIF, EndoG (caspase-independent), 및 PARP (caspasedependent)와 항-아폽토시스 유전자 XIAP 및 survivin의 발현을 검사하였다(Daugas et al., 2000; Suzuki et al., 1999). 친-아폽토시스 EndoG 및 PARP의 발현은 방사선 조사후에 증가하였으나, 항-아폽토시스 유전자 XIAP 및 survivin은 감소하였고, AIF는 영향이 없었다. 이는 세포 성장의 억제와 siRNA에 의해 유도되는 증가된 아폽토시스는 EndoG, XIAP, PARP, 및 survivin 단백질들의 발현에서의 변화와 관련되어 있다는 것을 암시한다(도 4b).

실시예 15: HLTF 발현의 하향 조절에 의해 외인적으로 손상된 플라스미드 수리가 효과적으로 수행되지 않았다.

숙주세포에 도입하기 전 손상된 외부 DNA의 수리된 기능을 정량하는 숙주세포 재활성화(host-cell reactivation, HCR) 분석을 사용하여 세포의 DNA-수리능을 조사하였다(Mallya and Sikpi, 1998; Yang et al., 1998). 따라서, X-선에 의해 손상된 pGL3 DNA를 HeLa 세포에 도입하여 기능적 회복을 검사하는 HCR 분석을 사용하였다. pGL3를 손상시키지 않거나 또는 X-선(4 Gy)에 의해 손상시키고 숙주 HeLa 세포에 트랜스펙션하고, 트랜스펙션 후 24, 48, 및 72 시간에서 상대적 LUC 유닛을 결정하였다. 방사선 조사하지 않은(손상되지 않은) 플라스미드로 트랜스펙션된 세포내에서, LUC 활성은 HLTF KD에 의해 24, 48, 및 72 시간에서 (siRNA 처리되지 않은) 대조군세포의 24.9％, 21.9％, 및 9.37％ 수준으로 각각 감소하였다(도 5a). 조사된 (손상된) 플라스미드로 트랜스펙션된 세포내에서, LUC 활성은 HLTF KD에 의해 대조군 세포의 9.97％, 15.1％, 및 3.37％으로 각각 감소하였다(도 5b).

도 5c는 siRNA-처리된 숙주세포내에서 LUC 활성을 대조군 세포들의 것에 대해 백분율로서 나타내었다. 48 및 72 시간에서의 백분율은 방사선 조사되지 않은 플라스미드에서 보다 방사선 조사된 플라스미드에서 낮은 값을 나타내었는데, 이는 HLTF KD에 의한 X-선 손상의 수리능이 감소한 것을 암시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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서열목록 전자파일 첨부

Claims

인체의 자궁경부조직으로부터 분리된 시료에서 HLTF (Helicase-like transcription factor) 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 방사선 치료 후 재발 가능성을 예측하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 HLTF 유전자의 발현 수준의 측정은 HLTF 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 HLTF 단백질의 발현 수준의 측정인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 HLTF 단백질의 발현 수준 측정은 HLTF 단백질을 면역분석(immunoassay)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) HLTF (Helicase-like transcription factor) 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 (b) HLTF 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 자궁경부암의 방사선 치료 감작용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 HLTF 유전자 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 si(small interference) RNA 또는 sh(small hairpin)RNA 인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 HLTF 유전자에 대한 siRNA는 서열목록 제 2 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.