KR102036867B1 - Ard1을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ARD1(Arrest-defective 1 protein)을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암줄기세포 제어 표적으로서의 ARD1의 용도에 대한 것으로, 항암제에 내성을 지닌 난소암 세포주가 줄기세포기능을 획득하면서 ARD1의 발현이 증가됨을 확인하였는바, ARD1 발현 수준을 분석하면 난소암 환자의 항암제 치료에 대한 내성 여부를 예측하고, 동시에 암 조직내의 암줄기세포 분포 탐색이 가능하여, 이에 따른 난소암 환자의 항암제 치료방향을 결정하는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

ARD1을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for diagnosing anticancer drug resistance of ovarian cancer patients comprising ARD1}
본 발명은 ARD1(Arrest-defective 1 protein)을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암줄기세포 제어 표적으로서의 ARD1의 용도에 관한 것이다.
난소암은 다른 여성암과는 달리 재발률이 85% 이상 높고 항암제 내성이 연관되어, 재발 시에는 항암 치료가 매우 어려워 생존율이 매우 낮은 암이다. 암줄기세포(cancer stem cell)란 암의 발생과정 중 특정 세포에 유전자 변이가 초래돼 줄기세포처럼 무한히 분열증식하고, 다양한 표현형을 가진 암세포를 끊임없이 만들어내는 독보적인 능력을 가진 세포로, 암의 형태, 진행단계 등에 따라 조직 내에서 적은 양(0.1~5%)으로 존재하지만, 항암제/방사선 치료에 대한 내성 및 재발, 그리고 전이를 유발시키는 주요 원인이다. 따라서 난소암의 재발 및 항암제 내성, 전이 등을 억제하려면 암세포의 줄기세포능을 제어하는 것이 필수적이나 현재 난소암 특이적인 표지인자나 제어 방법은 전무한 실정이다.
Arrest-defective 1 protein (ARD1)은 다양한 암에서 발현이 증가되어 있음이 보고되었으며, 암세포 증식 및 암 혈관 신생에 관여됨이 알려져 있다. 그러나 ARD1이 난소암 환자에서 암의 재발 및 생존에 어떠한 역할을 수행하는지에 관한 보고는 전혀 없다.
중국등록특허 제001246481호 (2006.03.22 등록)
본 발명은 ARD1(Arrest-defective 1 protein)을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물, ARD1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 조성물 및 ARD1의 발현 수준 측정을 통한 난소암 환자의 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 ARD1(Arrest-defective 1 protein)을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ARD1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 난소암 환자에서 분리된 시료로부터 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 항암제 내성을 나타내는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 항암제 내성 난소암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 항암제 내성 난소암 세포에서 ARD1 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 ARD1 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 ARD1(Arrest-defective 1 protein)을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암줄기세포 제어 표적으로서의 ARD1의 용도에 대한 것으로, 항암제에 내성을 지닌 난소암 세포주가 줄기세포기능을 획득하면서 ARD1의 발현이 증가됨을 확인하였는바, ARD1 발현 수준을 분석하면 난소암 환자의 항암제 치료에 대한 내성 여부를 예측하고, 동시에 암 조직내의 암줄기세포 분포 탐색이 가능하여, 이에 따른 난소암 환자의 항암제 치료방향을 결정하는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 일반 난소암 세포주와 파클리탁셀(Pacritaxel)에 내성을 지닌 난소암 세포주에서 암줄기세포 마커와 ARD1의 발현을 비교한 결과이다. 항암제에 내성을 지닌 난소암 세포주에서 줄기세포 마커인 SOX2, Oct4의 발현이 증가되는 것을 통해, 내성 세포가 줄기세포능을 획득한 것을 확인하였고, 이와 동시에 ARD1의 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하여 ARD1이 암 줄기세포능 획득 및 항암제 내성과 관련이 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 일반 난소암 세포주와 파클리탁셀(Pacritaxel)에 내성을 지닌 난소암 세포주에서 암줄기세포 마커와 ARD1의 발현을 비교한 결과, 항암제에 내성을 지닌 난소암 세포주에서 줄기세포 마커인 SOX2, Oct4의 발현이 증가되는 것을 통해, 내성 세포가 줄기세포능을 획득한 것을 확인하였고, 이와 동시에 ARD1의 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하여 ARD1이 암 줄기세포능 획득 및 항암제 내성과 관련이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 ARD1(Arrest-defective 1 protein)을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 ARD1은 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 ARD1을 가지는 모든 진핵 생물 유래의 유전자 또는 단백질일 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는 NCBI accession no. NM_003491을 표적으로 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
또한, 본 발명은 ARD1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 ARD1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 ARD1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 ARD1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 항암제는 파클리탁셀(pacritaxel)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 ARD1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
또한 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
또한, (1) 난소암 환자에서 분리된 시료로부터 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 항암제 내성을 나타내는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 (3) 단계의 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우, 암줄기세포 마커인 SOX2 및 Oct4의 발현이 증가되고, 난소암 세포가 줄기세포능을 획득한 것으로 추가적으로 판단할 수 있다.
바람직하게는, 상기 항암제는 파클리탁셀(pacritaxel)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (northern blotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (complement fixation assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "난소암 환자에서 분리된 시료"란 항암제 내성 진단용 바이오마커인 상기 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 항암제 내성 난소암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 항암제 내성 난소암 세포에서 ARD1 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 ARD1 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 항암제는 파클리탁셀(pacritaxel)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실시예 >
Human ovarian cancer cell line인 Ovcar3는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입한 뒤, 10% FBS를 포함한 RPMI 1640 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
Ovcar3 세포를 파클리탁셀(pacritaxel)에 20nM부터 100nM 까지의 농도로 단계적으로 장기간 노출시킨 뒤, 살아남은 세포들을 골라내어 Ovcar3/PTX 세포주를 확립하였다.
Ovcar3와 Ovcar3/PTX 세포주에서 RIPA buffer를 사용하여 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 정량하였다.
단백질 50ug을 사용하여 웨스턴블랏(western blot)을 수행하였으며, ARD1, sox-2, Oct4, N-cadherin, E-cadherin, β-actin 단백질들의 항체(antibody)를 사용하여 각각의 단백질 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 항암제 내성을 지닌 Ovcar3/PTX 세포주에서 암의 침윤, 전이를 촉진하는 N-cadherin, Vimentin의 발현이 증가하였고, 암줄기세포 마커인 SOX2, Oct4의 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한, ARD1의 발현 역시 내성 세포주에서 증가하여 ARD1이 항암제 내성, 암줄기세포 기능과 관련이 있음을 확인하였다.

Claims (10)

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  6. (1) 난소암 환자에서 분리된 시료로부터 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (2) 상기 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 ARD1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ARD1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우, 암줄기세포 마커인 SOX2 및 Oct4의 발현이 증가되고, 난소암 세포가 줄기세포능을 획득한 것으로 판단하여, 항암제 내성을 나타내는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
KR1020180014143A 2018-02-05 2018-02-05 Ard1을 유효성분으로 포함하는 난소암 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 조성물 KR102036867B1 (ko)

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