KR101875935B1 - Ｈｅｒ2 저해제 내성 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제 중 HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 타겟 치료제, 즉 HER2 저해제를 사용한 경우, 상기 HER2 저해제에 대한 감수성이 감소하는 현상과 ECM(Extracellular Matrix)의 발현이 증가하는 현상의 관계를 이용하여, HER2 저해제에 대한 내성이 생겼는지 여부를 결정하는 결정 수단으로서 ECM(Extracellular Matrix)의 발현 정도를 마커로 사용하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
이와 같은 ECM(Extracellular Matrix) 발현 여부를 결정하여 HER2 저해제, 예를 들어 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 내성 여부를 판단함으로써 적절한 대체 항암제를 사용할 수 있게 하고, 또한 HER2 저해제에 대한 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제 개발에 유용하다.

Description

ＨＥＲ2 저해제 내성 바이오마커 {A Biomarker of the resistance about HER2 inhibitor}

본 발명은 HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) 타겟 치료제의 내성(resistance, tolerance)을 나타내는 경우, 이를 진단할 수 있는 바이오마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로 HER2 저해제, 예를 들어, 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)에 대한 내성을 진단할 수 있는 마커 및 이를 이용한 유방암 치료 및 재발방지용 백신에 관한 것이다.

유방암 (BCa)는 여성에서 가장 흔한 암 진단물이며, 여성들 간에 암-관련 사망의 제2의 주요 원인이다 [참조:Ries LAG, et al. (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003, National Cancer Institute, Bethesda,MD]. 지난 20년간 유방암 치료에 있어서의 주요한 진전은 무병 생존 (disease-free survival: DFS) 비율을 상당히 개선시켰다. 예를 들어, 종양-관련된 항원에 대해 반응성인 항체를 사용하는 요법을 이용하여 질환 진행을 느리게 하거나 질환 재발을 예방하도록 특정 세포성 과정을 차단하였다. 유방암 치료에 있어 최근의 진전에도 불구하고, 상당수의 환자들이 종국에는 재발된 질환에 의해 사망할 것이다. 따라서, 재발 질환의 진전을 방지하거나 느리게 하거나 막는 처리가 필요하다.

HER2/neu 원종양유전자에 기초한 표적화된 수동 면역요법은 주로 Tz (trastuzumab)(Herceptin®)의 사용에 초점이 맞추어졌다. Tz는 HER2/neu 단백질의 세포외 근접막 도메인에 결합하는 재조합의 사람화된 모노클로날 항체이다. Tz는 규제 기관에 의해 승인되었으며, 전이성 유방암 환자 및 결절-양성 유방암 환자에 대해 정해진 애주번트에서 HER2/neu 과발현 (IHC 3+ 또는 FISH >2.0) 종양의 치료를 위해 처방된다. Tz는 다수의 임상 시험을거쳤으며, 현재 전이 환자의 치료 및 HER2/neu가 과발현되는 고위험의 유방암 환자의 애주번트 치료에 관례적으로 사용된다.

그러나, Tz는 낮거나 중간 정도의 HER2/neu 발현을 갖는 환자에서는 제한된 활성을 나타낸다. 따라서, Tz로 보여진 이전의 결과에 기초할 때, HER2/neu를 표적하는 면역원성 펩타이드 백신은 낮은 수준 및 중간 수준의 HER2/neu 종양 발현을 갖는 암 환자에서는 효과적인 것으로 예상되지 않는다.

특히, Tz (Herceptin®)의 내성(저항성)으로 인해 유방암의 임상적 징후, 방사선학적 징후 및 증상이 완전히 사라지지 않고, 종양이 재발(relapse, recurrence)하는 경우가 많다.

앞으로 항암제의 연구개발은 기존 항암제의 문제점인 부작용, 전이, 내성 극복을 위해 '분자생물학'과 '지놈프로젝트' 유전정보 활용 연구가 가속화될 것으로 전망된다.

특히, 암 치료시 항암제에 대한 내성(耐性)이 흔히 발생, 완치가 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서 암을 치료하는데 있어 일차적으로 암을 제거하기 위하여 항암제를 사용하는 것 못지 않게 중요한 것이 항암제 사용으로 인한 내성 발현을 어떻게 조절하느냐와 처음부터 항암제에 대한 내성 때문에 효과적으로 항암제를 사용할 수 없는 경우의 문제점을 해결해야 한다는 것이다. 본 발명자들은 항암제의 내성 발현 기전을 연구하고 이를 극복하기 위한 방법 및 그 적절한 물질을 연구하였다. 이것은 암정복을 위하여 반드시 해야 하는 분야이며 암정복이라는 궁극적 목적에 도달하는 지름길일 것이다.

따라서, 당해 기술 분야에서는 항암제에 대한 내성을 가지는, 임상적 완화 상태에 있는 유방암 환자에게 질환의 재발에 대해 신뢰할 수 있는 보호를 제공할 내성 진단 마커 및 백신을 개발할 필요가 있다

이에, 본 발명자들은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 타겟 치료제로써 '허셉틴'(Herceptin, trastuzumab)을 사용한 경우 내성을 나타내는 세포집단에 대하여, Erk, Akt, HER2 활성 및 프로테옴을 분석하여 상기 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)내성 바이오 마커로서의 가능성을 보이는 단백질들을 발굴하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 항암제, 특히 HER2 저해제 내성 진단을 위한 바이오 마커용 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 HER2 저해제 내성 진단용 키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 HER2 저해제에 대한 내성을 억제하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ECM(Extracellular Matrix)을 포함하는, 항암제 내성 진단을 위한 바이오 마커용 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 항암제는 HER2 저해제인 것이 바람직하고, 특히, 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)인 것이 더욱 바람직하다.

상기 암은 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 세포암, 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있고, 특히, 유방암이 바람직하다.

한편, 상기 ECM(Extracellular Matrix)은 ECM1이 바람직하고, 특히, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, HER2 저해제에 대한 내성 발현 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 정상 세포인 대조군에 대한 HER2 저해제, 바람직하게는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)을 투여한 암세포 조직에서의 ECM(Extracellular Matrix)의 발현양을 비교함으로써 그 과발현 여부로 항암제 내성 발현 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이 때도 마찬가지로 상기 ECM은 ECM1인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 항암용 HER2 저해제에 대한 내성을 억제하는 방법을 제공한다.

이 때, 항암용 HER2 저해제를 투여한 암세포 조직에 ECM(Extracellular Matrix) 발현 억제제를 이용하여 항암용 항암용 HER2 저해제를 억제하는 것이 바람직하고,

예를 들어, 상기 ECM(Extracellular Matrix) 발현 억제제는, ECM 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 RNAi로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이거나, ECM 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용할 수 있다.

상기 HER2 저해제의 가장 바람직한 경우는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 ECM 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 항암용 HER2 저해제 내성 진단용 키트를 제공할 수 있다.

상기 항암용 HER2 저해제는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)인 것이 바람직하고, 상기 암은 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 세포암, 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

이 때, 상기 키트는 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체; 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지액을 추가로 포함할 수 있다.

그리고, 상기 이차항체 접합체의 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 HER2 저해제 투약 환자의 예후 판정 및 치료를 위한 정보를 제공하기 위하여, HER2 저해제를 투여받고 있는 암 환자의 체액으로부터 ECM의 발현량을 측정하는 방법을 제공한다. 이 때, 상기 ECM은 ECM1인 것이 바람직하다.

이처럼, 본 발명은 HER2 저해제, 예를 들어 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)의 내성 여부를 판단하고, 나아가 이를 이용한 내성 억제방법을 제공한다.

본 발명은 ECM(Extracellular Matrix) 발현 여부를 결정하여 항암용 HER2 저해제, 바람직하게는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)의 내성 여부를 판단함으로써 적절한 대체 항암제를 사용할 수 있게 하고, 또한 항암제에 대한 내성을 극복할 수 있는 새로운 항암제 개발의 모델을 수립할 수 있다.

더 나아가 본 발명은 ECM(Extracellular Matrix) 발현 여부를 검출함으로써 암세포의 전이성 여부를 판단하는 검정 방법으로 응용할 수 있고, 기존의 종양 표지자들과 함께 종양에 대한 항암 작용의 저항성 억제제, 예방제 또는 치료제의 개발에 광범위하게 사용될 수 있다

도 1은 허셉틴 내성(herceptin resistance,HR) 클론을 수립하는 공정에 관한 사진이다.
도 2는 HR clone들을 이용하여 MTT assay를 수행한 결과이다.
도 3은 HR clone에 대하여, 허셉틴이 증식에 미치는 영향을 알아보기 위한 3D-growth assay 결과이다.
도 4는 LC-MS/MS를 이용한 BT474 허셉틴 저항성(내성) 세포의 프로테옴 분석 결과이다.
도 5는 LC-MS/MS를 이용한 Secretome 분석결과이다.
도 6은 발굴한 허셉틴 내성 마커에 대한 RT-PCR 및 웨스턴 블럿팅 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.

'마커'는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물 (예를 들어, 단백질)을 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는발현된 뉴클레오티드 서열로부터 (예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

"표지"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 본 발명에서의 암의 예는 HER2를 발현하는 경우로, 예를 들어, 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 세포암, 전립선암 또는 결장직장암을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 특정 유전자의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 HER2 저해제 및 ECM 저해제(억제제)는 각각 HER2 및 ECM(Extracellular Matrix)의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질이다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항암제에 대한 내성에 관한 것으로, 특히, (항암용) HER2 저해제에 대한 내성, 가장 바람직하게는 Her2(ErbB2) 항체인 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)에 내성(저항성)을 나타내는지 여부를 진단할 수 있는 바이오마커에 관한 것이다.

항암제 "내성"이란 암세포가 항암제에 대응하여 유전자 변화를 일으킴으로써 항암제의 공격을 피해 항암치료의 효과를 약화시키는 것을 말한다. 상기 "내성"이라는 용어는 "저항성"이라는 용어와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

HER2(ErbB2) 유전자는 상피 성장 인자 수용체들의 erbB 군(family)에 속하는 Mr 185,000 막간 당단백질(transmembrane glycoprotein)을 인코드한다. 리간드 결합(binding)은 erbB 동질-(homo-) 및 이질이량체들(heterodimers)의 형성을 유도하여 세포질 키나아제(kinase) 영역이 활성화되도록 한다. HER2는 리간드가 없는 수용체이며 리간드 결합 EGFR 군 HER1(EGFR), HER3 및 HER4 중에서 바람직한 이질이량체화 파트너이다. 공수용체(co-receptor)로서, HER2는 신호 전달을 매개하여 유사분열생식(mitogenesis), 세포자살(apoptosis), 혈관형성(angiogenesis) 및 세포분화(cell differentiation)를 일으킨다. 경로들을 신호화하는 엄격히 조절된 erbB 수용체에 임의의 변화가 가해지면 중요한 이상 및 종양형성이 나타난다. HER2 유전자는 약 20-30 %의 침습성 유방암종에서 증폭 및 과다발현되며 증가된 전이성 잠재성 및 빈약성 예후와 관련된다. 또한, 자궁, 전립선, 위, 허파, 방광 및 신장 암종들을 포함한 다양한 인간 암들에서 HER2수용체의 과다발현이 발생한다.

HER2 저해제란 상기 HER2(ErbB2) 유전자의 발현 또는 활성을 저해(억제)하는 물질로서, 예를 들어 HER2 발현 저해제는, HER2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 RNAi로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이거나, HER2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 가장 바람직하게는 HER2 항체로 알려져 있는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)이다.

상기 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)은 HER2(인간표피성장인자수용체 2)를 차단하는 인간화 단클론성 항체이다. ErbB2라고도 알려진 HER2의 과발현은 유방암 환자 20∼30%에서 관찰되며 침윤형 유방암과 관련돼 환자들은 예후가 불량하다. 허셉틴은 이러한 HER2 과발현 종양을 지닌 전이성 유방암 환자들에 쓰이나, 전반적 반응률은 35% 미만이며 무엇이 허셉틴에 대한 반응을 결정하는지는 알려져 있지 않다.

또한 PTEN 결핍 유방암을 가진 환자들은 PTEN이 정상인 환자들에 비해 허셉틴(화학요법 병용) 치료에 대한 반응이 현저히 불량한 것으로 나타났다. 아울러 PTEN을 차단하는 PI3K를 억제하는 화합물이 PTEN 결핍 유발 허셉틴 내성을 구제하는 것으로 밝혀져, PI3K 억제제가 이러한 내성을 극복할 수 있음을 시사했다.

특히, 허셉틴 치료는 Src의 억제를 통해 PTEN 타이로신 인산화를 감소시켜 PTEN의 세포질에서 세포막으로의 국소화 및 PTEN 인산분해효소의 활성화를 신속 증가시키고, 유방암 세포에서 PTEN 유전자의 불활성화로 PTEN을 감소시키면 허셉틴 내성이 유발된다는 사실이 밝혀졌다.

이에, 본 발명자들은 유방암 환자들의 유방암 조직에서 HER2 저해제인 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)의 항암 작용에 대해 감수성이 감소되는 세포에 대하여 Erk, Akt, HER2 활성 및 프로테옴을 분석하여, 상기 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)의 내성(저항성)과 ECM(Extracellular Matrix)의 과발현이 관련되어 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, ECM(Extracellular Matrix)을 포함하는, 항암제 내성 진단을 위한 바이오마커 또는 이를 함유하는 바이오마커용 조성물에 관한 것이다. 이 때, 상기 항암제로는 HER2를 타겟으로 하는 치료제로서, HER2 저해제가 바람직하고, 가장 바람직한 예로서는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)을 들 수 있다.

그리고, 상기 암은 HER2를 발현하는 암종으로서, 예를 들어, 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 세포암, 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는 유방암이다.

이 때, 상기 항암제 내성 바이오마커 ECM(Extracellular Matrix)은 바람직하게는 ECM1일 수 있고, 특히, 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 HER2 저해제, 예를 들어, 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 내성 발현 암세포에서 ECM 발현이 증가한다는 사실을 이용하여, HER2를 발현하는 환자 암세포에서 ECM 과발현 여부를 확인함으로써 항암제, 특히, HER2 저해제, 예를 들어 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)에 대한 내성발현 여부를 조기에 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ECM(Extracellular Matrix)의 발현을 억제시키는 단계를 포함하는, 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 항암 작용에 대한 감수성을 증가시키기 위해 ECM(Extracellular Matrix)를 이용하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 ECM1을 사용할 수 있다.

상기 ECM의 발현을 억제시키는 방법은 ECM 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 RNAi로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하거나, ECM 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용할 수 있다.

"RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 ‘RNA 간섭’이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다. 'small RNA'는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17~25 뉴클레오티드 정도 길이의 리보핵산을 지칭한다. small RNA는 그 생성되는 방식에 따라 크게 microRAN(줄여서 miRNA)와 small interfering RNA(줄여서 siRNA)로 분류한다. miRNA는 부분적으로 이중나선을 이루는 RNA(hairpin RNA)로부터 생성되고, siRNA는 긴 이중나선 RNA(dsRNA)로부터 유래한다. 일반적으로 정의할 때, 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 하는 small RNA는 microRNA로, 실험 기술적으로 특정 유전자의 발현을 조절하는데 사용되는 small RNA는 siRNA로 분류한다. miRNA는 세포 내에서 자연적으로 만들어지며, 특정 mRNA에 특이적으로 결합하여 mRNA로부터 단백질이 합성되는 과정을 억제한다. siRNA는 인위적으로 세포내로 도입시키는 small RNA로서, 상보적인 서열을 가지고 있는 특정 mRNA에 결합하여 그 mRNA를 분해하는 역할을 한다.

“siRNA" 는 표적 mRNA의 번역을 막는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. RNA가 전사되는 주형으로 DNA를 포함하는, siRNA를 세포에 도입하는 표준기술이 사용된다. 상기 siRNA는 dsRNA 또는 shRNA 모두 가능하다. 'dsRNA'는 한 개 가닥과 이에 상보적인 서열을 가지는 다른 가닥으로 구성된 두 개의 RNA 분자 컨스트럭트를 지칭하며, 두 분자는 상보적 서열을 가지므로 서로 결합하여 이중-가닥의 RNA 분자를 형성한다. 두 가닥의 핵산 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열에서 선택된 RNA의 "센스" 또는 “안티센스”서열 뿐만 아니라 표적 유전자의 비암호화 영역(non-coding region)에서 선택된 RNA 분자도 포함될 수 있다. 'shRNA' 용어는 서로 상보적인 첫 번째 및 두 번째 영역, 즉 센스 및 안티센스 가닥을포함하는 줄기-루프 구조(stem-loop structure)를 가지는 siRNA를 지칭한다. 상보성의 정도와 상보성 부위의 방위가 충분하면 상기 영역간의 충분한 염기쌍의 결합이 일어나고, 첫 번째 부위와 두 번째 부위는 루프 부위에 의해 연결되고, 루프 부위는 루프 부위의 핵산(또는 핵산 유사체)간의 염기쌍의 부재에 의해 이루어진다. 상기 shRNA의 루프 부위는 센스 및 안티센스 가닥의 사이의 단일 가닥 부위이며, 또한, “개입한 단일 가닥”로 지칭될 수 있다. 본 발명의 바람직한 예로서, ECM의 siRNA를 이용할 수 있다.

항체는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함한다.

또한, 다른 관점에서 본 발명은 ECM의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 ECM의 발현 억제제는 ECM 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 RNAi로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이거나, ECM 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이와 같은 ECM의 발현 저해제는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 항암제에 대해 내성을 효과적으로 극복(억제)함으로써, 암세포의 성장억제 및 사멸을 유도함으로써 항암 내성 치료제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다

본 발명의 항암용 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물은, 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 ECM의 발현 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HER2를 발현하는 암에 있어서 HER2 저해제의 내성, 특히 바람직하게는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)의 내성을 억제하는 방법을 제공한다.

상기 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

한편, 본 발명에 있어서, ECM 발현의 억제로 인해 암세포의 아포토시스(apoptosis) 비율이 증가되어 항암 작용에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 HER2 저해제 내성을 극복하는 새로운 방법 및 그 물질을 제공한다.

또한, 본 발명은 HER2 저해제, 예를 들어 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 에 저항성(내성)을 유발하는 새로운 유전자 발굴에 ECM을 이용하는 방법에 관한 것으로서, 이를 이용하여 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 항암제 내성에 관여하는 새로운 유전자를 확인함으로써 내성 극복을 위한 새로운 진단 방법 및 치료 방법을 제공한다.

따라서, 유사한 관점에서 본 발명은 HER2 저해제 투약 환자의 예후 판정 및 치료를 위한 정보를 제공하기 위하여, HER2 저해제를 투여받고 있는 암 환자의 체액으로부터 ECM의 발현량을 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 정상 이상으로 상승된 ECM의 발현 검출은 환자가 HER2 저해제에 대해 내성을 나타내고 있음을 의미한다. 또한, HER2 저해제를 투여받고 있는 암 환자의 시료에서 ECM의 정상적인 발현 검출은 해당 암치료가 성공적임을 의미하고, 상기 시료에서 정상 이상으로 상승된 ECM의 검출은 투여받고 있는 HER2 저해제에 대하여 내성이 생겼음을 의미한다. 아울러, 시료에서 ECM의 정상적인 발현 검출은 HER2 저해제 투약 환자의 예후가 좋다는 것을 의미하고, 상기 시료에서 정상 이상으로 상승된 ECM의 검출은 HER2 저해제에 대한 내성이 생겨 환자의 예후가 좋지 않다는 것을 의미한다.

샘플에서 바이오마커 ECM의 발현은 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 분석, 정량적 혈액기반 분석 (예를 들어 혈청 ELISA) (예를 들어 단백질 발현 수준을 조사하기 위해), 생화학적 효소 활성 분석, mRNA의 계내 혼성화, 노던 블럿 분석 및/또는 PCR 분석, 및 게놈 웨스턴 블럿 분석 (예를 들어 유전자 결실 또는 증폭을 조사하기 위해), 및 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 분석 중의 임의의 하나를 포함하여 이로 제한되지 않는 많은 방법에 의해 분석할 수 있고, 상기 방법 중 많은 방법은 당업계에 공지되고 당업자에게 이해되고 있다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 볼 수 있다.

한편, 본 발명은 항암제 중 HER2 저해제, 예를 들어 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 항암제에 좀 더 민감하게 반응할 수 있는 항암제의 감수성 증강제를 개발하는데 ECM을 표지 물질로 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ECM의 발현을 억제함으로써 HER2 저해제의 사용을 감소시켜 고용량으로 사용하였을 때 발생할 수 있는 부작용은 감소시키고 항암 효과는 증강시키는데 ECM를 표지 마커로 이용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 HER2 저해제 내성 바이오마커 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 항암제 내성 진단용 키트에 관한 것이다.

상기 항암제는 HER2를 타겟으로 하는 치료제로서, HER2 저해제, 가장 바람직하게는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)을 사용할 수 있다. 그리고, 상기 암은 HER2를 발현하는 암종으로서, 예를 들어, 난소암, 복막암, 난관암, 유방암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 편평 세포암, 전립선암 및 결장직장암으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는 유방암이다.

본 발명의 내성 진단용 키트는, ECM과 반응하는 하나 이상의 물질 및 반응 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, ECM과 반응하는 하나 이상의 물질은 ECM의 RNA 또는 DNA에 상보적인 RNA 또는 DNA, 및 ECM 단백질에 결합하는 항체일 수 있고 반응 생성물 검출용 시약은 핵산 또는 단백질 표지 및 발색시약일 수 있다.

예를 들어, 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 그리고, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

따라서, 예를 들어, 본 발명의 HER2 저해제 내성 진단용 키트는 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체; 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이 때, 상기 이차항체 접합체의 표지체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.

이처럼, 본 발명에 따른 HER2 저해제 내성 진단용 바이오 마커 및 암 환자의 HER2 저해제 내성 진단용 키트는 HER2 발현 암환자의 HER2 저해제, 예를 들어 허셉틴(Herceptin, trastuzumab) 내성을 조기에 예측할 수 있게 하여 HER2 발현 환자에 대한 선택적, 개별적 항암제 치료가 가능하게 한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: herceptin resistance ( HR ) 클론 확립

HER2 단백질 양성 인간 유방암 세포 BT474를 면역 결핍 생쥐에 이종이식 하기 위해, 0.72 mg, 60 day release 17-beta-estradiol pellet(Innovative research)의 이식을 선행하고, 다음날, 2 x 10⁷ 개의 BT474(ATCC) 세포를 PBS에 준비하여 22-guage 바늘을 이용하여 쥐의 옆구리에 주사하였다.

이식된 BT474 세포가 약 250 mm³ (width 2 x length /2) 크기의 종양으로 발달하면, 주 2회 Herceptin(Roche)을 IP 투여하였다. 발생한 종양이 지속적인 Herceptin의 투여에 의해 크기가 줄어들다가, Herceptin 투여 상태에서 다시 재발하면, Herceptin에 내성을 갖는 BT474세포로 간주하여 종양 조직을 적출하고 IMEM(0.25 % Trypsin, Gibco)으로 Digestion하여 배양하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, herceptin resistance(HR) 클론을 수립하였다(22 clones).

실시예 2: MTT assay

상기 수립한 HR clone들을 이용하여 MTT assay를 수행하였다.

96-well plate에 5x10³의 세포를 심은 뒤, 24시간 뒤에 Herceptin을 20 μg/ml의 농도로 처리하고 48 시간 뒤에 3시간의 MTT 반응 후, 형성된 formazan crystal을 DMSO(Sigma)로 용해시킨 뒤, ELISA를 이용하여 O.D value를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, HER2 타겟 치료제 내성을 지닌 누드마우스로부터 적출한 종양세포 (HR clones) 의 hereceptin에 대한 resistance를 확인할 수 있었다.

실시예 3: 3D- growth assay

HER2 타겟 치료제 내성을 지닌 누드마우스로부터 적출한 종양세포 (HR clones)의 3차원 환경에서의 herceptin이 증식에 미치는 영향을 3D-growth assay를 수행하여 확인하였다.

0.8 % low melting point agarose(Sigma)의 bottom layer를 6-well plate에 만들고 bottom layer가 굳어지면 0.4 %의 cell layer에 3x104개의 BT474 wildtype, HR clone 세포를 함께 섞고 Herceptin을 20 μg/ml의 농도로 처리하여 배양하였다.72 시간 마다 추가로 Herceptin을 처리하고 100X의 비율로 관찰하였다.

5x10⁵개의 BT474 wildtype, HR clone을 6-well plate에서 media:Matrigel(BD Biosciences)= 3:1의 비율로 이루어진 3차원 환경 상태로 배양하였다. Herceptin을 20 μg/ml의 농도로 처리하여 배양하고 72 시간 마다 추가로 Herceptin을 처리하고 100X의 배율로 관찰하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, BT474 herceptin 저항성 세포들을 확인하였다.

실시예 4: 단백질분석

상기 실시예 3에서 수득한 BT474 herceptin 저항성 세포 (HR clones)의 프로테옴을 분석하여(LC-MS/MS에 의한 differential proteome profiling), Herceptin 내성 바이오 마커로서의 가능성을 보이는 여러 단백질들을 발굴하였다(도 4).

또한, BT474 HR clone들로부터 얻어진 media를 LC-MS/MS방법으로 Secretome 분석하였다(도 5).

상기 결과들을 통해 herceptin 저항성(내성)을 가지는 경우의 바이오마커 ECM을 발굴하였다. 이를 서열번호 1로 표시하였다.

실시예 5: RT - PCR 및 웨스턴 블럿팅

BT474 wildtype 및 HR clone 세포를 수득하고, Trizol로 5 분 동안 lysis하고, chloroform (Sigma)을 넣고 원심분리하여 상층액의 RNA를 isoprophyl alcohol로 침전시켜 얻은 RNA를 RT-PCR하여 cDNA를 합성하고 하기 ECM-특이적(specific)인 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다(94 ℃ 2 분 후, 94 ℃ 25 초, 60 ℃ 20 초, 72 ℃ 40 초로 29 cycle, 72 ℃ 5 분).

Forward-5' AGG CTC GGT TCT CCT GCT TCC AG 3'(서열번호 2)

Reverse-5' TTG GGG TAA GGA GCC CGA CGG 3'(서열번호 3)

상기 PCR 산물을 1% agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.

BT474 wildtype 및 HR clone 세포를 수득하고 RIPA lysis buffer로 15분 동안 lysis한 다음, 30 μg의 lysate를 10% SDS-gel에 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 transfer한 뒤, 5% skin milk로 blocking하고 1차 항체(ECM1, Actin-Santacruz)로 overnight 배양하고, 2차 항체에 2시간 동안 배양하여 ECL solution에 반응시켜 현상하였다.

Media속의 Protein E를 detect하기 위해, TCA(Sigma)와 media의 비율을 1:4로 하여 단백질을 침전시키고 원심분리 후, acetone으로 pellet washing한 뒤, lysis buffer로 1 시간 동안 lysis하여 lysate를 얻고 위와 동일한 방법으로 western blot을 수행하였다.

그 결과를 도 6에 도시하였다. ECM의 발현이 전사수준에서는 높고 세포 내 단백질 수준에서는 높지 않았다. 또한, 세포밖으로 분비되는 양이 HR 세포가 훨씬 많은 것으로 나타났다. 즉, xtracellular Herceptin Resistance Marker로서, ECM(Extracellular Matrix)을 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

<110> HANYANG UNIVERSITY INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> A Biomarker of the resistance about HER2 inhibitor <130> 2010-P-301 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 567 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Thr Thr Ala Arg Ala Ala Leu Val Leu Thr Tyr Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Ser Glu Gly Gly Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Gln 20 25 30 Leu Arg Pro Glu His Phe Gln Glu Val Gly Tyr Ala Ala Pro Pro Ser 35 40 45 Pro Pro Leu Ser Arg Ser Leu Pro Met Asp His Pro Asp Ser Ser Gln 50 55 60 His Gly Pro Pro Phe Glu Gly Gln Ser Gly Lys Glu Gly Arg Gly Pro 65 70 75 80 Arg Pro His Ser Gln Pro Trp Leu Gly Glu Arg Val Gly Cys Ser His 85 90 95 Ile Pro Pro Ser Ile Val Gln Pro Pro Pro Ser Gln Glu Ala Thr Pro 100 105 110 Leu Gln Gln Glu Lys Leu Leu Pro Ala Gln Leu Pro Ala Glu Lys Glu 115 120 125 Val Gly Pro Pro Leu Pro Gln Glu Ala Val Pro Leu Gln Lys Glu Leu 130 135 140 Pro Ser Leu Gln His Pro Asn Glu Gln Lys Glu Gly Thr Pro Ala Pro 145 150 155 160 Phe Gly Asp Gln Ser His Pro Glu Pro Glu Ser Trp Asn Ala Ala Gln 165 170 175 His Cys Gln Gln Asp Arg Ser Gln Gly Gly Trp Gly His Arg Leu Asp 180 185 190 Gly Phe Pro Pro Gly Arg Pro Ser Pro Asp Asn Leu Asn Gln Ile Cys 195 200 205 Leu Pro Asn Arg Gln His Val Val Tyr Gly Pro Trp Asn Leu Pro Gln 210 215 220 Ser Ser Tyr Ser His Leu Thr Arg Gln Gly Glu Thr Leu Asn Phe Leu 225 230 235 240 Glu Ile Gly Tyr Ser Arg Cys Cys His Cys Arg Ser His Thr Asn Arg 245 250 255 Leu Glu Cys Ala Lys Leu Val Trp Glu Glu Ala Met Ser Arg Phe Cys 260 265 270 Glu Ala Glu Phe Ser Val Lys Thr Arg Pro His Trp Cys Cys Thr Arg 275 280 285 Gln Gly Glu Ala Arg Phe Ser Cys Phe Gln Glu Glu Ala Pro Gln Pro 290 295 300 His Tyr Gln Leu Arg Ala Cys Pro Ser His Gln Pro Asp Ile Ser Ser 305 310 315 320 Gly Leu Glu Leu Pro Phe Pro Pro Gly Val Pro Thr Leu Asp Asn Ile 325 330 335 Lys Asn Ile Cys His Leu Arg Arg Phe Arg Ser Val Pro Arg Asn Leu 340 345 350 Pro Ala Thr Asp Pro Leu Gln Arg Glu Leu Leu Ala Leu Ile Gln Leu 355 360 365 Glu Arg Glu Phe Gln Arg Cys Cys Arg Gln Gly Asn Asn His Thr Cys 370 375 380 Thr Trp Lys Ala Trp Glu Asp Thr Leu Asp Lys Tyr Cys Asp Arg Glu 385 390 395 400 Tyr Ala Val Lys Thr His His His Leu Cys Cys Arg His Pro Pro Ser 405 410 415 Pro Thr Arg Asp Glu Cys Phe Ala Arg Arg Ala Pro Tyr Pro Asn Tyr 420 425 430 Asp Arg Asp Ile Leu Thr Ile Asp Ile Gly Arg Val Thr Pro Asn Leu 435 440 445 Met Gly His Leu Cys Gly Asn Gln Arg Val Leu Thr Lys His Lys His 450 455 460 Ile Pro Gly Leu Ile His Asn Met Thr Ala Arg Cys Cys Asp Leu Pro 465 470 475 480 Phe Pro Glu Gln Ala Cys Cys Ala Glu Glu Glu Lys Leu Thr Phe Ile 485 490 495 Asn Asp Leu Cys Gly Pro Arg Arg Asn Ile Trp Arg Asp Pro Ala Leu 500 505 510 Cys Cys Tyr Leu Ser Pro Gly Asp Glu Gln Val Asn Cys Phe Asn Ile 515 520 525 Asn Tyr Leu Arg Asn Val Ala Leu Val Ser Gly Asp Thr Glu Asn Ala 530 535 540 Lys Gly Gln Gly Glu Gln Gly Ser Thr Gly Gly Thr Asn Ile Ser Ser 545 550 555 560 Thr Ser Glu Pro Lys Glu Glu 565 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 2 aggctcggtt ctcctgcttc cag 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 ttggggtaag gagcccgacg g 21

Claims (19)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 유방암 세포에 항암용 HER2 저해제를 처리하고, 서열번호 1로 표시되는 ECM(Extracellular Matrix)의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하고,
   상기 HER2 저해제는 허셉틴(Herceptin, trastuzumab)인 것을 특징으로 하는 유방암 세포의 항암용 HER2 저해제 내성 확인을 위한 정보제공 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 측정 결과 ECM의 발현 수준이 높을수록 HER2 저해제에 대한 내성이 높고, ECM의 발현 수준이 낮을수록 HER2 저해제에 대한 내성이 낮은 것으로 분류하는 것을 특징으로 하는 유방암 세포의 항암용 HER2 저해제 내성 확인을 위한 정보제공 방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 ECM(Extracellular Matrix)은 ECM1인 것을 특징으로 하는 방법.
   
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