ES2873377T3 - Procedimientos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de cáncer de pulmón - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para determinar si un paciente que padece cáncer de pulmón es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de cáncer de pulmón
Campo:
La presente divulgación pertenece al campo de la medicina, en particular la oncología.
Antecedentes:
Los cánceres de pulmón consisten en dos tipos histológicos principales, el carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) y el carcinoma de pulmón microcítico. El NSCLC consiste en carcinoma epidermoide (SCC), adenocarcinoma (AD), carcinoma de células grandes y otros. El NSCLC representa ~85 % de todos los cánceres de pulmón y existen ~80 % de los casos de NSCLC en estadio avanzado donde el pronóstico sigue siendo desfavorable. Por lo tanto, todavía es necesaria la investigación del mecanismo de inicio, progresión e identificación de marcadores de pronóstico para la selección de pacientes con NSCLC y para proporcionar un mejor tratamiento individualizado.
FHIT, también conocida como bis(5-adenosil)-trifosfatasa, es uno de los miembros de la familia de genes de la tríada de histidina y es una enzima codificada por el gen FHIT. El gen FHIT localiza el sitio frágil más común en el genoma humano, FRA3B (3p14.2), una región que con frecuencia experimenta reordenamiento genómico, pérdida bialélica y anomalías citogenéticas en tumores. Los informes previos mostraron que FHIT se inactivaba por la pérdida de heterocigosis y metilación en las células cancerosas, lo que indica que FHIT es una proteína supresora de tumores. Su función precisa se ha estudiado intensamente en varios tumores, induciendo la detención del ciclo celular y la apoptosis, la inhibición de la proliferación celular e incrementando la sensibilidad celular a los agentes que dañan el ADN. Recientemente se demostró que FHIT controla el fenotipo invasor de las células tumorales de pulmón regulando la expresión de genes asociados con la transición epiteliomesenquimatosa tal como vimentina o MMP-9 a través de una vía de señalización de EGFR. Más en particular, se informó de que la hipermetilación de FHIT, que induce la inactivación del gen FHIT, desempeña un papel importante en la carcinogénesis y el resultado clínico y puede servir como una diana farmacológica potencial del NSCLC (Yan, Wei, et al. "The clinicopathological significance of FHIT hypermethylation in non-small cell lung cancer, a meta-analysis and literature review". Scientific reports 6 (2016): 19303).
Las mutaciones somáticas en el dominio de tirosina cinasa (TK) del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en los cánceres de pulmón han generado un interés enorme, porque predicen la sensibilidad a los inhibidores de TK (TKI) (Shigematsu, Hisayuki y Adi F. Gazdar. "Somatic mutations of epidermal growth factor receptor signaling pathway in lung cancers". International journal of cancer 118.2 (2006): 257-262). En particular, el factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2/ERBB2/neu) es un miembro de la familia ERBB de receptores de tirosina cinasa y se activa por homodimerización o heterodimerización con otros receptores ERBB. Se ha demostrado que la desregulación del gen HER2 por sobreexpresión y/o amplificación génica es importante en el cáncer de mama y gástrico, en los que la sobreexpresión de HER2 confiere una mayor respuesta al tratamiento anti-HER2 específico, incluyendo trastuzumab. En la carcinogénesis pulmonar, se cree que las mutaciones de HER2 son más pertinentes clínicamente que la sobreexpresión o la amplificación génica. Las mutaciones de HER2 en el NSCLC, descritas exclusivamente en la histología del adenocarcinoma, están presentes en aproximadamente un 4 % de este subconjunto de pacientes con cáncer de pulmón.
Se sugirió un papel protector para FHIT en tumores mamarios impulsados por HER2 (Bianchi, Francesca, et al. "Fhit expression protects against HER2-driven breast tumor development: unraveling the molecular interconnections". Cell Cycle 6.6 (2007): 643-646).
Sumario de la invención:
La presente invención se define por las reivindicaciones. En particular, la presente invención se refiere a:
- un procedimiento para determinar si un paciente que padece un cáncer de pulmón es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado,
- al menos un inhibidor de HER2 para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado, y
- un procedimiento para determinar si un paciente que padece un cáncer de pulmón logrará una respuesta a un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente logrará una respuesta a un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.
Descripción detallada:
Los autores de la invención demostraron que FHIT regula la actividad de HER2 en células tumorales de pulmón y que los inhibidores de HER2 reducen la invasión inducida por la inhibición de FHIT.
En consecuencia, un aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar si un paciente que padece un cáncer de pulmón es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.
Otro objetivo de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar el cáncer de pulmón en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.
Otro objetivo de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar si un paciente que padece un cáncer de pulmón logrará una respuesta a un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente logrará una respuesta a un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.
Como se usa en el presente documento, el término "cáncer de pulmón" incluye, pero no se limita a, todos los tipos de cánceres de pulmón en todos los estadios de progresión como carcinomas de pulmón, cáncer de pulmón metastásico, carcinomas de pulmón no microcíticos tales como adenocarcinoma de pulmón o carcinoma escamoso de pulmón.
Como se usa en el presente documento, los términos "HER2" y "ErbB2" tienen su significado general en la técnica y se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a la proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al., PNAS (EE. UU.) 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (número de acceso de Genebank X03363).
En particular, el cáncer de pulmón no está asociado con una mutación de HER2. Las mutaciones de HER2 que están asociadas con el cáncer de pulmón son bien conocidas en la técnica y típicamente incluyen inserciones del exón 20 tales como c. 2325_2326 ins12, p. A775_G776insYVMA; c. 2324_2325 ins12, p. A775_G776insYVMA; c. 2326_2327 ins3, p. G776>VC; c. 2339_2340 ins9, p. P780_Y781insGSP; c. 2322_2323 ins12, p. M774_A775insAYVM).
Como se usa en el presente documento, el término "muestra de tejido tumoral" tiene su significado general en la técnica y engloba trozos o cortes de tejido que se han retirado, incluyendo después de una extirpación quirúrgica del tumor. La muestra de tejido tumoral se puede someter a una variedad de técnicas de almacenamiento y preparación posteriores a la obtención bien conocidas (por ejemplo, fijación, almacenamiento, congelación, etc.) antes de determinar las densidades celulares. Típicamente, la muestra de tejido tumoral se fija en formol y se incluye en un fijador rígido, tal como parafina (cera) o epoxi, que se coloca en un molde y después se endurece para producir un bloque que se corta fácilmente. A continuación, se pueden preparar cortes delgados de material usando un micrótomo, colocarlos en un portaobjetos de vidrio y someterlos, por ejemplo, a inmunohistoquímica (usando IHQ automatizada tal como BenchMark® XT, para obtener portaobjetos teñidos).
Como se usa en el presente documento, el término "FHIT" tiene su significado general en la técnica y se refiere al gen de la tríada de histidina frágil (ID del gen: 2272). Este gen, un miembro de la familia de genes de la tríada de histidina, codifica una diadenosina 5',5'"-P1,P3-trifosfato hidrolasa implicada en el metabolismo de las purinas.
Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos ejemplares se referencian típicamente bajo NM_001166243.2 NP_001159715.1 (secuencias de referencia de NCBI).
La determinación de un nivel de expresión de un gen (por ejemplo, FHIT) en una muestra de tumor obtenida de un paciente se puede implementar por un panel de técnicas bien conocidas en la técnica. Típicamente, el nivel de expresión de un gen se evalúa determinando la cantidad de ARNm producido por este gen.
Los procedimientos para determinar una cantidad de ARNm son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en primer lugar, el ácido nucleico contenido en las muestras (por ejemplo, célula o tejido preparado a partir del paciente) se extrae de acuerdo con procedimientos estándares, por ejemplo usando enzimas líticas o soluciones químicas o se extrae por resinas de unión a ácido nucleico siguiendo las instrucciones del fabricante. Por tanto, el ARNm extraído se detecta, a continuación, por hibridación (por ejemplo, análisis de transferencia Northern) y/o amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Típicamente, se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa ultrarrápida es en particular ventajosa. Otros procedimientos de amplificación incluyen reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), secuenciación de nueva generación cuantitativa de ARN (NGS).
Los ácidos nucleicos (polinucleótidos) que comprenden al menos 10 nucleótidos y que presentan complementariedad u homología de secuencia con el ARNm de interés en el presente documento, encuentran utilidad como sondas de hibridación o cebadores de amplificación. Se entiende que dichos ácidos nucleicos no necesitan ser completamente idénticos, pero típicamente son al menos aproximadamente un 80 % idénticos a la región homóloga de tamaño comparable, más típicamente un 85 % idénticos e incluso más típicamente un 90­ 95 % idénticos. En particular, será ventajoso usar ácidos nucleicos en combinación con medios apropiados, tales como un marcador detectable, para detectar la hibridación. Son conocidos en la técnica una amplia variedad de indicadores apropiados que incluyen ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros (por ejemplo, avidina/biotina).
Las sondas comprenden típicamente ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 a 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de entre 10 y 800, más típicamente de entre 15 y 700, típicamente de entre 20 y 500 nucleótidos. Los cebadores son típicamente ácidos nucleicos monocatenarios más cortos, de entre 10 a 25 nucleótidos de longitud, diseñados para coincidir perfecta o casi perfectamente con un ácido nucleico de interés, que se va a amplificar. Las sondas y los cebadores son "específicos" para los ácidos nucleicos con los que se hibridan, es decir, se hibridan típicamente en condiciones de hibridación muy rigurosas (correspondientes a la temperatura de fusión más alta Tf, por ejemplo, formamida al 50 %, 5x o 6x SCC. SCC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M).
Los ácidos nucleicos que se pueden usar como cebadores o sondas en el procedimiento de amplificación y detección anterior se pueden ensamblar como un kit. Un kit de este tipo incluye cebadores consenso y sondas moleculares. Un kit preferido también incluye los componentes necesarios para determinar si se ha producido la amplificación. Un kit también puede incluir, por ejemplo, tampones y enzimas de PCR; secuencias de control positivo, cebadores de control de reacción; e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas. En particular, los procedimientos de la divulgación comprenden las etapas de proporcionar ARN totales extraídos de células cancerosas y someter los ARN a amplificación e hibridación con sondas específicas, más en particular por medio de una RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa.
Las sondas preparadas con los procedimientos divulgados también se pueden usar para la detección de ácidos nucleicos, tales como los procedimientos de hibridación in situ (ISH) (por ejemplo, hibridación in situ con fluorescencia (FISH), hibridación in situ cromogénica (CISH) e hibridación in situ con plata (SISH)) o hibridación genómica comparativa (CGH). Por ejemplo, la hibridación in situ (ISH) implica poner en contacto una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómica) en el contexto de una preparación de cromosomas en metafase o interfase (tal como una muestra de célula o tejido montada en un portaobjetos) con una sonda marcada específicamente hibridable o específica para la secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómica). Los portaobjetos se pretratan opcionalmente, por ejemplo, para retirar la parafina u otros materiales que pueden interferir con la hibridación uniforme. La muestra y la sonda se tratan ambas, por ejemplo, por calentamiento para desnaturalizar los ácidos nucleicos bicatenarios. La sonda (formulada en un tampón de hibridación adecuado) y la muestra se combinan en condiciones y durante suficiente tiempo para permitir que se produzca la hibridación (típicamente para alcanzar el equilibrio). La preparación de cromosomas se lava para retirar el exceso de sonda y la detección del marcaje específico de la diana cromosómica se realiza usando técnicas estándares. Son conocidos en la técnica numerosos procedimientos para FISH, CISH y SISH. Por ejemplo, los procedimientos para realizar FISH se describen en las pat. de EE. UU. n.os 5.447.841; 5,472,842; y 5.427.932; y por ejemplo, en Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988; y Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988. CISH se describe en, por ejemplo, Tanner et al., Am. J. Pathol.
157:1467-1472, 2000 y la pat. de EE. UU. n.° 6.942.970. Se proporcionan procedimientos de detección adicionales en la pat. de EE. UU. n.° 6.280.929.
Las sondas se marcan típicamente con una molécula detectable. Por ejemplo, se puede detectar una sonda biotinilada usando avidina marcada con fluoresceína o avidina-fosfatasa alcalina. Para la detección de fluorocromo, se puede detectar el fluorocromo directamente o se pueden incubar las muestras, por ejemplo, con avidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC). La amplificación de la señal de FITC se puede efectuar, si fuera necesario, por incubación con anticuerpos antiavidina de cabra conjugados con biotina, lavando y una segunda incubación con avidina conjugada con FITC. Para la detección por actividad enzimática, las muestras se pueden incubar, por ejemplo, con estreptavidina, lavar, incubar con fosfatasa alcalina conjugada con biotina, lavar de nuevo y preequilibrar (por ejemplo, en tampón de fosfatasa alcalina (AP)). Para una descripción general de los procedimientos de hibridación in situ, véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 4.888.278. Se pueden emplear numerosos reactivos y esquemas de detección junto con los procedimientos FISH, CISH y SISH para mejorar la sensibilidad, resolución u otras propiedades deseables. Como se analiza anteriormente, las sondas marcadas con fluoróforos (incluyendo los tintes fluorescentes y QUANTUM DOTS®) se pueden detectar directamente de forma óptica cuando se realiza FISH. De forma alternativa, la sonda se puede marcar con una molécula no fluorescente, tal como un hapteno (tal como los siguientes ejemplos no limitantes: biotina, digoxigenina, DNP y diversos oxazoles, pirrazoles, tiazoles, nitroarilos, benzofurazanos, triterpenos, ureas, tioureas, rotenonas, cumarina, compuestos a base de cumarina, podofilotoxina, compuestos a base de podofilotoxina y combinaciones de los mismos), ligando u otro resto detectable indirectamente. Las sondas marcadas con dichas moléculas no fluorescentes (y las secuencias de ácido nucleico diana a las que se unen) se pueden detectar, a continuación, poniendo en contacto la muestra (por ejemplo, la muestra de célula o tejido a la que se une la sonda) con un reactivo de detección marcado, tal como un anticuerpo (o receptor u otro compañero de unión específico) específico para el hapteno o ligando elegido. El reactivo de detección se puede marcar con un fluoróforo (por ejemplo, QUANTUM DOT®) o con otro resto detectable indirectamente, o se puede poner en contacto con uno o más agentes de unión específicos adicionales (por ejemplo, anticuerpos secundarios o específicos), que se pueden marcar con un fluoróforo. En otros ejemplos, la sonda se marca con una enzima que puede convertir una composición fluorógena o cromógena en una señal detectable fluorescente, coloreada o detectable de otro modo (por ejemplo, como en el depósito de partículas metálicas detectables en SISH). Como se indica anteriormente, la enzima se puede unir directa o indirectamente por medio de un conector a la sonda o reactivo de detección pertinente. Los ejemplos de reactivos adecuados (por ejemplo, reactivos de unión) y compuestos químicos (por ejemplo, compuestos químicos conectores y de fijación) se describen en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.os 2006/0246524; 2006/0246523 y 2007/0117153 .
Se apreciará por los expertos en la técnica que seleccionando apropiadamente pares de agentes de unión específicos de sonda marcados, se pueden producir esquemas de detección múltiple para facilitar la detección de múltiples secuencias de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico diana genómicas) en un único ensayo (por ejemplo, en una única célula o muestra de tejido o en más de una célula o muestra de tejido). Por ejemplo, se puede marcar una primera sonda que corresponde a una primera secuencia diana con un primer hapteno, tal como biotina, mientras que una segunda sonda que corresponde a una segunda secuencia diana se puede marcar con un segundo hapteno, tal como DNP. Después de la exposición de la muestra a las sondas, se pueden detectar las sondas unidas poniendo en contacto la muestra con un primer agente de unión específico (en este caso, avidina marcada con un primer fluoróforo, por ejemplo, un primer QUANTUM DOT® espectralmente distinto, por ejemplo, que emite a 585 nm) y un segundo agente de unión específico (en este caso, un anticuerpo anti-DNP, o fragmento de anticuerpo, marcado con un segundo fluoróforo (por ejemplo, un segundo QUANTUM DOT® espectralmente distinto, por ejemplo, que emite a 705 nm). Se pueden añadir pares de sondas/agentes de unión adicionales al esquema de detección múltiple usando otros fluoróforos espectralmente distintos. Se pueden concebir numerosas variaciones de directa e indirecta (una etapa, dos etapas o más), todas las que son adecuadas en el contexto de las sondas y ensayos divulgados.
Las sondas comprenden típicamente ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 a 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de entre 10 y 800, más típicamente de entre 15 y 700, típicamente de entre 20 y 500. Los cebadores son típicamente ácidos nucleicos monocatenarios más cortos, de entre 10 a 25 nucleótidos de longitud, diseñados para coincidir perfecta o casi perfectamente con un ácido nucleico de interés, que se va a amplificar. Las sondas y los cebadores son "específicos" para los ácidos nucleicos con los que se hibridan, es decir, se hibridan típicamente en condiciones de hibridación muy rigurosas (correspondientes a la temperatura de fusión más alta Tf, por ejemplo, formamida al 50 %, 5x o 6x ScC. SCC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M).
Los cebadores o sondas de ácido nucleico usados en el procedimiento de amplificación y detección anterior se pueden ensamblar como un kit. Un kit de este tipo incluye cebadores consenso y sondas moleculares. Un kit preferido también incluye los componentes necesarios para determinar si se ha producido la amplificación. El kit también puede incluir, por ejemplo, tampones y enzimas de PCR; secuencias de control positivo, cebadores de control de reacción; e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas.
En particular, el nivel de expresión se determina por análisis de microchip de ADN. Dicho microchip de ADN o micromatriz de ácido nucleico consiste en diferentes sondas de ácido nucleico que están fijadas químicamente a un sustrato, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla de tamaño de microesfera. Un microchip puede estar constituido por polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, carbono, metales, vidrios inorgánicos o nitrocelulosa. Las sondas comprenden ácidos nucleicos tales como ADNc u oligonucleótidos que pueden tener de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 pares de bases. Para determinar el nivel de expresión, una muestra de un sujeto de prueba, opcionalmente sometida en primer lugar a una transcripción inversa, se marca y se pone en contacto con la micromatriz en condiciones de hibridación, lo que da lugar a la formación de complejos entre los ácidos nucleicos diana que son complementarios a las secuencias de sonda fijadas a la superficie de la micromatriz. A continuación, se detectan los complejos hibridados marcados y se pueden cuantificar o semicuantificar. El marcaje se puede lograr por diversos procedimientos, por ejemplo, usando marcaje radioactivo o fluorescente. Están disponibles muchas variantes de la tecnología de hibridación de micromatrices para el experto en la técnica (véase, por ejemplo, la revisión de Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7: 200-210).
El nivel de expresión de un gen se puede expresar como nivel de expresión absoluto o nivel de expresión normalizado. En el presente procedimiento se pueden usar ambos tipos de valores. El nivel de expresión de un gen se expresa típicamente como nivel de expresión normalizado cuando se usa PCR cuantitativa como procedimiento de evaluación del nivel de expresión porque pequeñas diferencias al comienzo de un experimento podrían proporcionar enormes diferencias después de una serie de ciclos.
Típicamente, los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un gen comparando su expresión con la expresión de un gen que no es pertinente para determinar el estadio de cáncer del paciente, por ejemplo, un gen de mantenimiento que se expresa de forma constitutiva. Los genes adecuados para la normalización incluyen genes de mantenimiento tales como el gen ACTB de actina, el gen 18S ribosómico... Esta normalización permite comparar el nivel de expresión de una muestra, por ejemplo, una muestra de paciente, con el nivel de expresión de otra muestra, o comparar muestras de diferentes fuentes.
De forma alternativa, se puede determinar el nivel de expresión de un gen (por ejemplo, FHIT) a nivel de proteína. Por ejemplo, la muestra de tumor del paciente se puede poner en contacto con un compañero de unión específico para la proteína de interés (es decir, FHIT).
En particular, el compañero de unión es un anticuerpo o un aptámero. Los anticuerpos policlonales divulgados en el presente documento o un fragmento de los mismos se pueden generar de acuerdo con procedimientos conocidos administrando el antígeno o epítopo apropiado a un animal huésped seleccionado, por ejemplo, de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Se pueden usar diversos adyuvantes conocidos en la técnica para potenciar la producción de anticuerpos. Aunque los anticuerpos útiles en la práctica de la presente divulgación pueden ser policlonales, son preferentes los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales divulgados en el presente documento o un fragmento de los mismos se pueden preparar y aislar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas de producción y aislamiento incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma; la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos; y la técnica de VEB-hibridoma. En particular, el compañero de unión puede ser un aptámero. Los aptámeros son una clase de moléculas que representan una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos u oligopéptidos que pueden reconocer prácticamente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos se pueden aislar a través de la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una colección de secuencias aleatorias.
Los compañeros de unión divulgados en el presente documento, tales como anticuerpos o aptámeros, se pueden marcar con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radioactiva o cualquier otro marcador conocido en la técnica. Son conocidos en la técnica marcadores que proporcionan, en general, (directa o bien indirectamente) una señal. Como se usa en el presente documento, el término "marcado", con respecto al anticuerpo o aptámero, pretende englobar el marcaje directo del anticuerpo o aptámero acoplando (es decir, enlazando físicamente) una sustancia detectable, tal como un agente radioactivo o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)) al anticuerpo o aptámero, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable. Un anticuerpo o aptámero divulgado en el presente documento se puede marcar con una molécula radioactiva por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas radioactivas incluyen, pero no se limitan a, átomos radioactivos para estudios gammagráficos tales como I123, I124, In111, Re186, Re188. Típicamente, los anticuerpos frente a los marcadores de superficie ya están conjugados con un fluoróforo (por ejemplo, conjugado con FITC y/o conjugado con PE).
En particular, los cortes inmunoteñidos de la muestra de tejido tumoral se pueden obtener con un sistema de tinción de portaobjetos automatizado usando un compañero de unión marcado como se describe anteriormente (por ejemplo, un anticuerpo). La inmunoquímica (IHQ) es un procedimiento adecuado para cuantificar el nivel de expresión de un marcador en una muestra de tejido. Típicamente, la muestra de tumor se fija típicamente en formol y se incluye en un fijador rígido, tal como parafina (cera) o epoxi, que se coloca en un molde y después se endurece para producir un bloque que se corta fácilmente. Se preparan cortes delgados de material usando un micrótomo, se colocan en un portaobjetos de vidrio y se someten a inmunohistoquímica, por ejemplo, usando IHQ automatizada tal como BenchMark® XT que permite la preparación automática de portaobjetos teñidos para implementar la tinción inmunohistoquímica. A continuación, después de la digitalización de los cortes, se puede usar para cuantificar el nivel del marcador. La digitalización de los cortes se puede realizar por captura de exploración, por ejemplo, con un escáner Hamamatsu NanoZoomer® 2.0-HT de alta resolución. Se pueden proporcionar la media, la mediana, el mínimo y el máximo de la intensidad de tinción pertinente de todas las células teñidas positivas detectadas en la muestra de tumor. Los valores y la distribución de la intensidad de tinción se pueden comparar con el valor de referencia predeterminado.
Típicamente, el valor de referencia predeterminado es un valor umbral o un valor de corte. Un "valor umbral" o "valor de corte" se puede determinar experimental, empírica o teóricamente. También se puede seleccionar de forma arbitraria un valor umbral basándose en las condiciones experimentales y/o clínicas existentes, como se reconocería por un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la medición retrospectiva del nivel de expresión de FHIT en muestras de sujetos históricas apropiadamente depositadas para establecer el valor de referencia predeterminado. Se tiene que determinar el valor umbral para obtener la sensibilidad y especificidad óptimas de acuerdo con la función de la prueba y el balance beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). Típicamente, se pueden determinar la sensibilidad y especificidad óptimas (y, por lo tanto, el valor umbral) usando una curva de rendimiento diagnóstico (CRD) en base a datos experimentales. Por ejemplo, después de determinar el nivel de expresión de FHIT en un grupo de referencia, se puede usar el análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de los niveles de expresión determinados en las muestras que se van a someter a prueba, y por tanto, obtener un patrón de clasificación que tenga significancia para la clasificación de la muestra. El nombre completo de la curva CRD es curva de rendimiento diagnóstico, que también es conocida como curva de eficacia diagnóstica. Se usa principalmente para pruebas de diagnóstico bioquímico clínico. La curva CRD es un indicador exhaustivo que refleja las variables continuas de la tasa de positivos verdaderos (sensibilidad) y la tasa de positivos falsos (especificidad 1). Revela la relación entre sensibilidad y especificidad con el procedimiento de composición de imágenes. Una serie de diferentes valores de corte (umbrales o valores cruciales, valores delimitadores entre los resultados normales y anómalos de la prueba de diagnóstico) se establecen como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. A continuación, se usa la sensibilidad como coordenada vertical y se usa la especificidad como coordenada horizontal para trazar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (ABC), mayor será la exactitud del diagnóstico. En la curva CRD, el punto más cercano al extremo superior izquierdo del diagrama de coordenadas es un punto crucial que tiene valores tanto de alta sensibilidad como de alta especificidad. El valor de ABC de la curva CRD está entre 1,0 y 0,5. Cuando el ABC>0,5, el resultado del diagnóstico mejora cada vez más a medida que el ABC se acerca a 1. Cuando el ABC está entre 0,5 y 0,7, la exactitud es baja. Cuando el ABC está entre 0,7 y 0,9, la exactitud es moderada. Cuando el ABC es mayor que 0,9, la exactitud es bastante alta. Este procedimiento algorítmico se realiza preferentemente con un ordenador. Se pueden usar programas informáticos o sistemas existentes en la técnica para el trazado de la curva CRD, tales como: el programa informático estadístico médico MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., EE. UU.), etc.
En particular, los procedimientos divulgados en el presente documento comprenden además a) determinar el nivel de expresión de pHER2, b) comparar el nivel determinado en la etapa a) con su correspondiente valor de referencia predeterminado. Más en particular, otro objetivo de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar si un paciente que padece un cáncer de pulmón es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT y pHER2, ii) comparar los niveles determinados en la etapa i) con sus correspondientes valores de referencia predeterminados y iii) concluir que el paciente es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado para FHIT sea menor que su correspondiente nivel de referencia predeterminado y el nivel de pHER2 sea mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado.
Como se usa en el presente documento, el término "pHER2" tiene su significado general en la técnica y se refiere a la forma fosforilada de HER2. La fosforilación de HER2 es de hecho una condición previa para la señalización corriente abajo y representa la forma funcional y activa de HER2. El sitio principal de autofosforilación de HER2 es en el residuo de tirosina 1248 (Tyr1248) (Cicenas J, Urban P, Kiing W, Vuaroqueaux V, Labuhn M, Wight E, Eppenberger U, Eppenberger-Castori S: Phosphorylation of tyrosine 1248-ERBB2 measured by chemiluminescence-linked immunoassay is an independent predictor of poor prognosis in primary breast cancer patients. Eur J Cancer 42: 636-645).
Los procedimientos para determinar el nivel de pHER2 son bien conocidos en la técnica y típicamente implican el uso de dicha forma fosforilada dirigida por anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de ratón primarios frente a HER2 fosforilado en Tyr1248 están disponibles comercialmente (por ejemplo, HER2-pY-1248, clon PN2A; Dako).
Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de HER2" se refiere a un agente que interfiere con la activación o función de HER2. Los ejemplos de inhibidores de HER2 incluyen anticuerpos frente a HER2; antagonistas de HER2 de moléculas orgánicas pequeñas; inhibidores de tirosina cinasa frente a HER2; moléculas antisentido; y/o agentes que se unen a, o interfieren con la función de, moléculas de señalización corriente abajo, tales como MAPK o Akt. Típicamente, el inhibidor de HER2 es un anticuerpo o una molécula orgánica pequeña. Los procedimientos para determinar inhibidores de HER2 son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en detalle en el documento EP1877398.
En particular, el inhibidor de HER2 es un "anticuerpo anti-HER2" que es un anticuerpo que se une a un receptor HER2, en particular al dominio extracelular de HER2. El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad biológica deseada. El término incluye fragmentos de anticuerpo que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único (DAB), dímero de TandAb, Fv, scFv (Fv monocatenario), dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpos lineales, minicuerpos, dicuerpos, fragmentos de anticuerpo biespecíficos, bicuerpo, tricuerpo (fusiones scFv-Fab, biespecíficas o triespecíficas, respectivamente); sc-dicuerpo; cuerpos kappa(lamda) (fusiones scFv-CL); BiTE (ligador biespecífico del linfocito T, tándems de scFv-scFv para atraer linfocitos T); DVD-Ig (anticuerpo de dominio variable doble, formato biespecífico); SIP (inmunoproteína pequeña, una especie de minicuerpo); SMIP (dímero scFv-Fc de "inmunofármaco modular pequeño"; DART ("reselección de afinidad doble" de dicuerpo estabilizado con ds); miméticos de anticuerpos pequeños que comprenden una o más CDR y similares. Las técnicas para preparar y usar diversas construcciones y fragmentos a base de anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase Kabat et al., 1991). Los dicuerpos, en particular, se describen además en los documentos EP 404.097 y WO 93/1 1161; mientras que los anticuerpos lineales se describen además en Zapata et al. (1995). En particular, el anticuerpo anti-HER es un anticuerpo "quimérico" en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (véase, por ejemplo la pat. de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). En particular, el anticuerpo anti-HER es un anticuerpo humanizado. Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En particular, el anticuerpo anti-HER es un anticuerpo humano. Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. En particular, el anticuerpo anti-HER es un anticuerpo de dominio único. El término "anticuerpo de dominio único" (sdAb) o "VHH" se refiere al dominio variable de la cadena pesada única de anticuerpos del tipo que se puede encontrar en mamíferos camélidos que carecen naturalmente de cadenas ligeras. Dichos VHH también se denominan "nanobody®". De acuerdo con la presente divulgación, sdAb puede ser en particular sdAb de llama.
En particular, el inhibidor de HER2 es una molécula orgánica pequeña. Como se usa en el presente documento, el término "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula de tamaño comparable a las moléculas orgánicas usadas, en general, en fármacos. El término excluye macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.); las moléculas orgánicas pequeñas preferentes varían en tamaño hasta 2000 Da, y lo más preferentemente hasta aproximadamente 1000 Da.
Los ejemplos de inhibidores de HER2 incluyen pertuzumab, trastuzumab, dacomitinib, anticuerpos (HER2) como se describe en el documento WO-2012162561, neratinib, tosilato de aliitinib, poziotinib, CUDC-101 (Curis), BT-211 1 (biOsasis), margetuximab, Exelixis, NT-004 o NT-113 (Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd), S-22261 1 (Shionogi & Co Ltd), AG879, Mubritinib, AC-480 (Bristol-Myers Squibb Co), sapitinib, MM-111 (Merrimack Pharmaceuticals inc), PR-810 (Universidad de Auckland), cipatinib trastuzumab-duocarmicina, Prolanta, varlitinib, kahalalide F, TrasGEX, masoprocol, ARRY-380 (Cascadian Therapeutics), erbicinumab, Hu ax-Her2, CP-724714 (Pfizer), COVA-208 (Covagen), lapatinib y pazopanib, AEE-788 (Novartis), canertinib, pilitinib, BMS-690514 (Bristol-Meyers Squibb), afatinib, dacomitinib, derivados y sales de los mismos. En particular, el inhibidor de HER2 es N4-(4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-7-iloxi)-3-metilfenil)-N6-(4,4-dimetil-4,5-dihidrooxazol-2-il)quinazolina-4,6-diamina (también denominada "ARRY-380"), que tiene la estructura:
es un inhibidor de ErbB2 (HER2) selectivo descrito en el documento WO 2007/059257.
En particular, el inhibidor de HER2 es un inhibidor de expresión. Un "inhibidor de expresión" se refiere a un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir la expresión de un gen. Por lo tanto, un "inhibidor de la expresión de HER2" indica un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir la expresión del receptor HER2. Típicamente, el inhibidor de la expresión génica es un ARNip, un oligonucleótido antisentido o una ribocima. Los inhibidores de la expresión génica divulgados en el presente documento se pueden basar en construcciones de oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo las moléculas de ARN antisentido y las moléculas de ADN antisentido, actuarían para bloquear directamente la traducción del ARNm del receptor HER2 uniéndose al mismo y evitando, por tanto, la traducción de proteínas o incrementando la degradación del ARNm, disminuyendo, por tanto, el nivel del receptor HER2, y por tanto, su actividad, en una célula. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones únicas de la secuencia de transcrito de ARNm que codifica el receptor HER2 se pueden sintetizar, por ejemplo, por técnicas con fosfodiéster convencionales y administrar, por ejemplo, por inyección o infusión intravenosa. Los procedimientos para usar técnicas antisentido para inhibir específicamente la expresión génica de genes con una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véanse las pat. de EE. UU. n.os 6.566.135; 6.566.131; 6.365.354; 6.410.323; 6.107.091; 6.046.321; y 5.981.732). Los ARN inhibidores pequeños (ARNip) también pueden funcionar como inhibidores de la expresión génica para su uso en la presente divulgación. La expresión génica se puede reducir poniendo en contacto el tumor, el sujeto o la célula con un ARN bicatenario pequeño (ARNbp), o un vector o construcción que provoque la producción de un ARN bicatenario pequeño, de modo que la expresión génica se inhiba específicamente (es decir, interferencia por ARN o iARN). Los procedimientos para seleccionar un ARNbp o un vector que codifica ARNbp apropiado son bien conocidos en la técnica para genes con una secuencia conocida (por ejemplo, véase Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); las pat. de EE. UU. n.os 6.573.099 y 6.506.559; y las publicaciones de patentes internacionales n.os WO 01/36646, WO 99/32619 y WO 01/68836). Las ribocimas también pueden funcionar como inhibidores de la expresión génica para su uso en la presente divulgación. Las ribocimas son moléculas de ARN enzimáticas que pueden catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo de acción de las ribocimas implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribocima con el ARN diana complementario, seguida de la escisión endonucleolítica. Las moléculas de ribocima con motivo de horquilla o cabeza de martillo genomanipuladas que catalizan específica y eficazmente la escisión endonucleolítica de las secuencias de ARNm del receptor HER son de este modo útiles dentro del alcance de la presente divulgación. Los sitios de escisión de ribocimas específicos dentro de cualquier diana de ARN potencial se identifican inicialmente explorando la molécula diana para detectar sitios de escisión de ribocimas, que típicamente incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, se pueden evaluar las secuencias de ARN cortas de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión para determinar los rasgos característicos estructurales predichos, tales como la estructura secundaria, que pueden hacer que la secuencia de oligonucleótidos sea inadecuada. La idoneidad de las dianas candidatas también se puede evaluar sometiendo a prueba su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando, por ejemplo, ensayos de protección de ribonucleasa. Los oligonucleótidos antisentido, ARNip y ribocimas divulgados en el presente documento se pueden administrar in vivo solos o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo que puede facilitar la transferencia del ácido nucleico del oligonucleótido antisentido, ARNip o ribocima a las células. En general, los vectores útiles en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagómidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes víricas o bacterianas que se han manipulado por la inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico del oligonucleótido antisentido, ARNip o ribocima. Los vectores víricos son un tipo preferente de vector e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, tal como el virus de la leucemia murina de Moloney, el virus del sarcoma murino de Harvey, el virus del tumor mamario murino y el virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adenoasociado; virus de tipo SV40; virus de polioma; virus de Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus de la variolovacuna; virus de la poliomielitis; y virus de ARN tal como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la técnica.
Como se usa, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco (por ejemplo, un inhibidor de HER2) eficaz para tratar el cáncer de pulmón en el paciente. La cantidad eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferentemente detener) la metástasis del tumor; inhibir, en cierta medida, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en el que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La cantidad eficaz puede extender la supervivencia sin progresión (por ejemplo, como se mide por los criterios de evaluación de respuesta para tumores sólidos, RECIST, o cambios en CA-125), dar como resultado una respuesta objetiva (incluyendo una respuesta parcial, RP, o una respuesta completa, RC), mejorar la supervivencia (incluyendo la supervivencia global y la supervivencia sin progresión) y/o mejorar uno o más síntomas del cáncer (por ejemplo, como se evalúa por FOSI). Lo más preferentemente, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco es eficaz para mejorar la supervivencia sin progresión (SSP) y/o la supervivencia global (SG). Por "prolongar la supervivencia" se quiere decir incrementar la supervivencia global o sin progresión en un paciente tratado en relación con un paciente no tratado (es decir, en relación con un paciente no tratado con un inhibidor de HER2), o en relación con un paciente que no expresa un receptor HER2 en el nivel designado. Típicamente, la cantidad terapéuticamente eficaz es la cantidad que da lugar a una respuesta objetiva, una respuesta parcial o una respuesta completa. Una "respuesta objetiva" se refiere a una respuesta mensurable, incluyendo la respuesta completa (RC) o la respuesta parcial (RP). Por "respuesta completa" o "RC" se entiende la desaparición de todos los signos de cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre quiere decir que el cáncer se haya curado. "Respuesta parcial" o "RP" se refiere a una disminución del tamaño de uno o más tumores o lesiones, o del alcance del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento. Se entenderá que el uso diario total de los compuestos de la presente divulgación se decidirá por el médico especialista dentro del alcance del criterio médico razonable. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se trata y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de eliminación del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o en coincidencia con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está completamente dentro de las destrezas de la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos se puede variar sobre un amplio intervalo de 0,01 a 1000 mg por adulto al día. Típicamente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto que se va a tratar. Un medicamento típicamente contiene de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferentemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Habitualmente se suministra una cantidad eficaz del fármaco a un nivel de dosificación de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal al día.
Los compuestos divulgados en el presente documento (es decir, los inhibidores de HER2) se administran como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para formar una composición farmacéutica. Como se usa en el presente documento, el término "farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra perjudicial cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, como sea apropiado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material encapsulante o adyuvante de formulación sólido, semisólido o líquido no tóxico de cualquier tipo. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración de compuestos divulgados en el presente documento y los procedimientos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. En las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación para administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo (es decir, un compuesto divulgado en el presente documento), solo o en combinación con otro principio activo, se puede administrar en una forma de administración unitaria, como mezcla con apoyos farmacéuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administración unitaria adecuadas comprenden las formas para vía oral tales como comprimidos, cápsulas de gel, polvos, gránulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administración sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administración subcutánea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, intratecal e intranasal y formas de administración rectal. En particular, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que se puede inyectar. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solución salina fisiológica, permiten la constitución de soluciones inyectables. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Las soluciones que comprenden compuestos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Los compuestos divulgados en el presente documento se pueden formular en una composición en forma neutra o de sal como se describe anteriormente. El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede ser conseguir por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos divulgados en el presente documento en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución se debe tamponar adecuadamente si fuera necesario y el diluyente líquido, en primer lugar, se debe volver isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que se pueden emplear a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación se podría disolver en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o bien inyectarse en el sitio de infusión propuesto. Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se trate. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Los compuestos divulgados en el presente documento se pueden formular dentro de una mezcla terapéutica para que comprendan aproximadamente de 0,0001 a 1,0 miligramo, o aproximadamente de 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente de 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis más o menos. También se pueden administrar dosis múltiples. Además de los compuestos formulados para administración parenteral, tales como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; formulaciones liposómicas; cápsulas de liberación prolongada; y cualquier otra forma usada actualmente.
La presente divulgación se ilustrará además por las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se deben interpretar de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente divulgación.
Figuras:
Figura 1: La pérdida de FHIT se correlaciona con la activación de HER2 in vivo en NSCLC humano. A. Análisis de inmunoelectrotransferencia que muestra una correlación negativa entre el nivel de FHIT y la tasa de activación de HER2 (pHER2/tHER2) en una serie de 48 casos de NSCLC; B. Análisis de inmunohistoquímica que muestra imágenes especulares de marcajes FHIT y pHER2 en secciones seriadas de dos casos de NSCLC. Abreviaturas: pHER2, fosfo-HER2; tHER2, HER2 total.
Figura 2: La modulación de la expresión de FHIT regula la activación de HER2. Análisis de inmunoelectrotransferencia de FHIT, pHER2 y tHER2 después del silenciamiento de FHIT en líneas celulares HBE-4-E6/E7, H441 y A549 transfectadas de forma transitoria por ARNip de FHIT o el control permutado y después de la sobreexpresión de FHIT en la línea celular H1299 transfectada de forma estable por ADNc de FHIT o el vector vacío de control. GAPDH sirve como control de carga.
Figura 3: La invasión celular inducida por el silenciamiento de FHIT es dependiente de HER2. Análisis de la capacidad de invasión celular en un ensayo de cámara de Boyden modificado con Matrigel que muestra que el inhibidor de HER2, irbinitinib, (10 nM) reduce la invasión celular inducida por el silenciamiento de FHIT en líneas celulares HBE-4-E6/E7 (A) y A549 (B), respectivamente. * p < 0,05; ** p< 0,01.
Figura 4: La invasión en gel de colágeno I por esferoides A549 inducida por silenciamiento de FHIT es dependiente de HER2. Videomicroscopía con cámara rápida de la dispersión de células tumorales de los esferoides en la matriz de colágeno I que muestra que irbinitinib (15 nM) reduce la invasión de esferoides inducida por el silenciamiento de FHIT en la línea celular A549 (permutada DMSO frente a ARNip de FHIT DMSO: p = 0,0036; ARNip de FHIT DMSO frente a ARNip de FHIT irbinitinib: p = 0,0001). A. Imágenes de contraste de fase representativas de esferoides a T0 y T = 72 h. B. Análisis de la evolución temporal de la media del diámetro de los esferoides. ** p <0,01; *** p<0,001.
Ejemplo:
La falta o disminución de la expresión de FHIT (tríada de histidina frágil) es un acontecimiento común en el cáncer de pulmón. Recientemente se demostró que FHIT actúa como un supresor de la invasión tumoral. De hecho, FHIT controla el fenotipo invasor de las células tumorales de pulmón regulando la expresión de genes asociados con la transición epitelio-mesenquimatosa tal como vimentina o MMP-9 a través de una vía de señalización de EGFR. En consecuencia, se centró el enfoque en otro miembro de esta familia de receptores de tirosina cinasas: HER2.
En primer lugar, se observó in vivo, por inmunohistoquímica e inmunoelectrotransferencia en una serie de muestras de carcinoma de pulmón no microcítico, una correlación negativa entre la expresión de FHIT y la forma activada de HER2 (pospho-HER2, pHER2) (figura 1). Esta correlación también se observó in vitro en un panel de líneas celulares de pulmón; las líneas celulares más invasoras que expresan un nivel bajo de FHIT y un nivel alto de pHER2. Además, la inhibición a través de ARNip o la sobreexpresión por transfección estable con ADNc de FHIT dio lugar a un incremento o disminución respectivamente de la actividad del receptor HER2 (figura 2). El uso de un inhibidor específico, irbinitinib (ARRY-380; ONT-380), permitió demostrar que la invasión inducida por la inhibición de FHIT es dependiente de HER2 en dos modelos complementarios: un ensayo de cámara de Boyden modificado que imita el cruce de la membrana basal (figura 3) y un modelo 3D de esferoides celulares incluidos en una matriz de colágeno que imita la infiltración del estroma por células tumorales (figura 4).
En conclusión, se demostró que FHIT regula la actividad de HER2 en las células tumorales de pulmón y que un inhibidor de HER2 reduce la invasión inducida por la inhibición de FHIT. Este estudio permitiría la identificación de nuevas pistas terapéuticas para el cáncer de pulmón.
Referencias:
A lo largo de la presente solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica al que pertenece la presente divulgación.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un procedimiento para determinar si un paciente que padece cáncer de pulmón es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente es idóneo para un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.
  2. 2. Al menos un inhibidor de HER2 para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón en un paciente que lo necesita, que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.
  3. 3. Un procedimiento para determinar si un paciente que padece un cáncer de pulmón logrará una respuesta a un tratamiento con un inhibidor de HER2 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT en una muestra de tejido tumoral obtenida del paciente, ii) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa i) con un valor de referencia predeterminado y iii) concluir que el paciente logrará una respuesta a un tratamiento con un inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado en la etapa i) sea menor que el nivel de referencia predeterminado.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicación 1 o 3 o el inhibidor de HER2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además a) determinar el nivel de expresión de pHER2, b) comparar el nivel determinado en la etapa a) con su correspondiente valor de referencia predeterminado.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende las etapas de i) determinar el nivel de expresión de FHIT y pHER2, ii) comparar los niveles determinados en la etapa i) con sus correspondientes valores de referencia predeterminados y iii) concluir que el paciente es idóneo para un tratamiento con un Inhibidor de HER2 cuando el nivel de expresión determinado para FHIT sea menor que su correspondiente nivel de referencia predeterminado y el nivel de pHER2 sea mayor que su correspondiente valor de referencia predeterminado.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicación 1 o 3 o el inhibidor de HER2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el inhibidor de HER2 es un anticuerpo anti-HER2 que es un anticuerpo que se une a un receptor HER2, en particular al dominio extracelular de HER2.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicación 1 o 3 o el inhibidor de HER2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el inhibidor de HER2 es una molécula orgánica pequeña.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicación 1 o 3 o el inhibidor de HER2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el inhibidor de HER2 se selecciona del grupo que consiste en pertuzumab, trastuzumab, dacomitinib, neratinib, tosilato de aliitinib, poziotinib, CUDC-101 (Curis), BT-211 1 (biOsasis), margetuximab, NT-004, NT-113, S-22261 1, AG879, Mubritinib, AC-480, sapitinib, MM-111, PR-810, cipatinib trastuzumab-duocarmicina, Prolanta, varlitinib, kahalalide F, masoprocol, ARRY-380, erbicinumab, Hu ax-Her2, CP-724714, COVA-208, lapatinib y pazopanib, AEE-788, canertinib, pilitinib, BMS-690514, afatinib, dacometinib, derivados y sales de los mismos.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicación 1 o 3 o el inhibidor de HER2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el inhibidor de HER2 es un inhibidor de expresión.
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