ES2677555T3 - Conjugado molecular - Google Patents

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ES2677555T3
ES2677555T3 ES15001958.6T ES15001958T ES2677555T3 ES 2677555 T3 ES2677555 T3 ES 2677555T3 ES 15001958 T ES15001958 T ES 15001958T ES 2677555 T3 ES2677555 T3 ES 2677555T3
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ES
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thiol
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ES15001958.6T
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Christopher Bieniarz
Julia Ashworth-Sharpe
Casey A. Kernag
Jerome W. Kosmeder
Mark Lefever
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Ventana Medical Systems Inc
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Abstract

Conjugado, que comprende: un anticuerpo, un marcaje detectable que comprende un enzima que incluye aproximadamente 17 a 25 grupos maleimida introducidos en el enzima mediante conectores NHS-PEG-maleimida, encontrándose cada conector unido covalentemente a un grupo amino del enzima, y una pluralidad de conectores hidrazida-tiol, comprendiendo cada conector hidrazida-tiol uno o más átomos de unión situados entre un grupo hidrazida y un grupo tiol, en el que el conector hidrazida-tiol se selecciona de entre hidrazida de ácido mercaptobutírico (MBH), carbohidrazida de ácido mercaptobutírico (MBCH), hidrazida de mecaptoacetamido-ácido mercaptobutírico (MAMBH), hidrazida de ácido tiohexanamidomercaptobutírico (THMBH), N,N'-(6-hidrazinil-6-oxohexano-1,5-diil)bis(2- mercaptoacetamida) (BTAL), bistiohexanamidohidrazidolisina (BTHL), N-(1,5-dihidrazinil-1,5- dioxopentán-2-il)-2-mercapto-acetamida (TAGD), dihidrazida de ácido tiohexamidoglutámico (THGD), un conector hidrazida-tiol basado en PEG, un conector hidrazida-tiol multifuncional, un conector hidrazidatiol multifuncional basado en PEG, un conector hidrazida-tiol de poliacrilamida y combinaciones de los mismos, el grupo hidrazida de cada conector hidrazida-tiol está unido covalentemente a una parte Fc glucosilado oxidado del anticuerpo y el grupo tiol de uno de los conectores hidrazida-tiol unidos covalentemente al marcaje detectable mediante uno de los grupos maleimida.

Description

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DESCRIPCION
Conjugado molecular Datos de solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente U.S. n° 60/739.794, presentada el 23 de noviembre de 2005.
Campo
La presente invencion se refiere a conjugados moleculares y a sus usos tal como se indica en las reivindicaciones. Se dan a conocer ademas conectores para preparar dichos conjugados, metodos para preparar los conjugados y los conectores y metodos de utilizacion de los conjugados. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a conjugados de anticuerpos espedficos de Fc y a sus usos tal como se indica en las reivindicaciones. Se dan a conocer ademas conectores de hidrazida-tiol para preparar conjugados espedficos de Fc, metodos para preparacion de conjugados espedficos de Fc y metodos de utilizacion de conjugados de anticuerpos espedficos de Fc.
Antecedentes
Se ha desarrollado una amplia diversidad de metodos para unir moleculas entre sf para formar conjugados. Resultan de particular interes los conjugados biomoleculares que se preparan tfpicamente para combinar las funcionalidades de las moleculas unidas en un solo constructo. Un tipo de conjugado biomolecular combina una molecula biologica que se une espedficamente a otra molecula (tal como un acido nucleico, un anticuerpo, una lectina o una avidina) y un marcaje detectable (tal como un marcaje fluorescente, nanopartfcula fluorescente o un enzima).
Pueden utilizarse conjugados de anticuerpos y marcajes detectables (conjugados de anticuerpos) en inmunoensayos para la deteccion de moleculas diana espedficas en muestras biologicas. La parte anticuerpo de dichos conjugados se une espedficamente a una diana en la muestra y el marcaje detectable se utiliza para proporcionar una senal detectable que indica la presencia y/o localizacion de la diana. Un tipo de conjugado que se ha vuelto ampliamente utilizado, especialmente para el analisis inmunohistoqmmico, es un conjugado de un anticuerpo y un enzima (conjugado de anticuerpo-enzima). Se genera una senal detectable mediante la adicion de un sustrato a la muestra bajo condiciones en las que la parte enzima del conjugado de anticuerpo-enzima convierte el sustrato en un producto detectable (tal como un producto coloreado, de color diferente o fluorescente) en el sitio en el que la parte anticuerpo se une a su diana.
Los conjugados de anticuerpos tfpicamente se preparan utilizando reactivos de acoplamiento que se caracterizan porque presentan por lo menos dos grupos reactivos, uno de los cuales se hace reaccionar con un grupo funcional en el anticuerpo mientras que el otro se hace reaccionar con un grupo funcional en el marcaje detectable. Sin embargo, el acoplamiento puede conducir a la inactivacion del anticuerpo o el marcaje detectable o de ambos. En particular, el acoplamiento puede desactivar los conjugados de anticuerpo-enzima mediante efectos estericos o debido a que los reactivos de acoplamiento reaccionan con grupos funcionales situados en partes del anticuerpo y/o enzima que resultan cnticos para su especificidad y/o actividad catalttica. Ademas, algunos esquemas de acoplamiento conducen a que los conjugados presentan una solubilidad en agua reducida.
Los esquemas de acoplamiento que pueden proporcionar conjugados de anticuerpo-enzima con menores alteraciones de la especificidad del anticuerpo y/o de la actividad enzimatica resultan deseables y permiten alcanzar una sensibilidad mas alta de los ensayos inmunoqmmicos, tales como los ensayos inmunohistoqmmicos. Una mayor sensibilidad resulta de particular importancia para los procedimientos automatizados, en los que etapas de amplificacion adicionales no resultan deseables.
Descripcion resumida
Se da a conocer un conjugado molecular que incluye un conector hidrazida-tiol. En una realizacion se proporciona el conjugado de anticuerpo y marcaje detectable, incluyendo un conector hidrazida-tiol unido covalentemente a la parte Fc del anticuerpo. El conjugado espedfico para Fc de la presente realizacion proporciona una sensibilidad de deteccion mejorada, permitiendo de esta manera que la deteccion inmunohistoqmmica de una molecula diana permita mas facilmente la automatizacion y las aplicaciones de alto rendimiento.
Se da a conocer ademas un metodo para preparar un conjugado que utiliza un conector de hidrazida-tiol. En una realizacion, no se requiere un grupo protector para un grupo tiol del conector debido a que el conector se hace reaccionar con una primera molecula bajo condiciones en las que el grupo tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma acida neutra y, de esta manera, es sustancialmente no reactivo. Bajo dichas condiciones, puede formarse un enlace covalente entre un grupo hidrazida del compuesto conector y una primera molecula, conservando simultaneamente de manera sustancial el grupo tiol para una reaccion posterior con un grupo reactivo con el tiol de una segunda molecula.
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Se dan a conocer ademas conectores hidrazida-tiol y metodos para preparar conectores hidrazida-tiol. Ademas, se describen metodos para utilizar un conjugado dado a conocer para detectar una molecula diana en una muestra, tal como una seccion de tejido o una muestra de citologfa. Los metodos para detectar una molecula diana pueden automatizarse facilmente debido a la sensibilidad mejorada que muestran los conjugados dados a conocer. En determinadas realizaciones, se proporcionan ensayos multiplexados que utilizan los conjugados dados a conocer, por ejemplo ensayos multiplexados que utilizan conjugados de anticuerpo dados a conocer que presentan moleculas fluorescentes o nanopartmulas fluorescentes a modo de marcaje detectable.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es una serie de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion de Kappa en tejido de airngdala que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 2 es una serie de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion de Kappa en tejido de airngdala que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 3 es una serie de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion del CMV en tejido de pulmon que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 4 es una serie de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion de EBER en tejido de bazo que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 5 es una serie de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion del VPH en tejido de xenoinjerto CaSKi que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 6 es una serie de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion del VPH en tejido de xenoinjerto HeLa que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 7 es una pareja de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion del VPH en tejido de xenoinjerto SiHa que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 8 es una serie de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion del VPH en muestras de citologfa que utilizan un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 9 es una pareja de imagenes que muestran patrones de tincion para la deteccion de actina en tejido muscular que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo espedfico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina.
La FIG. 10 es una serie de imagenes que muestra una comparacion de la sensibilidad de los diferentes conjugados de anticuerpo-enzima dados a conocer entre sf y respecto a conjugados de anticuerpo-enzima corporal preparados mediante otros metodos.
Descripcion detallada de varias realizaciones ilustrativas
Se ilustran aspectos adicionales de la invencion mediante las descripciones y ejemplos, posteriormente, despues de las abreviaturas y terminos a continuacion.
I. Abreviaturas
Ab - anticuerpo
(Ab - AP) - conjugado de anticuerpo-fosfatasa alcalina
AP - fosfatasa alcalina
BSA - albumina de suero bovino
CMV - citomegalovirus
EBER - ARN temprano del virus de Epstein-Barr
MD - marcaje detectable
Fc - fragmento cristalizable
HRP - peroxidasa de rabano picante
IHQ - immunohistoqmmica
ISH - hibridacion in situ
MAL - maleimida
MBCH - carbohidrazida de acido mercaptobutmco
MBH - hidrazida de acido mercaptobutmco
NHS - N-hidroxi-succinimida
PEG - polietilenglicol
MUE - molecula de union espedfica
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II Terminos
Los terminos "un", "una", "el" o "la" incluyen los referentes tanto singulares como plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El termino "animacion" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la reaccion de un grupo carbonilo de un aldehfdo o de una cetona con un grupo amina, en el que un compuesto que contiene amina, tal como una amina o una hidrazida, reacciona con el aldehndo o cetona para formar en primer lugar una base de Schiff que seguidamente puede reorganizarse reversiblemente para generar una forma mas estable, u opcionalmente resultar reducida para impedir la reversion de la reaccion. Entre las condiciones de "aminacion reductora" se incluyen la adicion de un agente reductor, mas rtpicamente la adicion de un agente reductor suave, tal como cianoborohidruro sodico o uno de sus congeneres, por ejemplo triacetoxiborohidruro sodico. Entre otros agentes reductores suaves que pueden utilizarse se incluyen diversos boranos de amina.
El termino "anticuerpo" se refiere colectivamente a una inmunoglobulina o molecula de tipo inmunoglobulina (incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y moleculas similares producidas durante una respuesta inmunologica en cualquier organismo, por ejemplo en mairnferos, tales como mairnferos, cabras, conejos y ratones), o un fragmento de las mismas que se une espedficamente a una diana (o a un grupo de dianas altamente similares) excluyendo sustancialmente la union a otras moleculas. En algunas realizaciones, un anticuerpo se une espedficamente a una diana con una constante de union que es por lo menos 10 M- superior, 10 M- superior o 10 M- superior a una constante de union para otras moleculas en una muestra. En otras realizaciones, un anticuerpo presenta un valor de Kd para la union a un determinante antigenico (tal como un hapteno o eprtopo) que es del orden de 10-6 M o inferior, tal como 10-9 M o inferior, o incluso 10-12 M o inferior. Los valores de Kd pueden determinarse, por ejemplo, mediante ELISA competitiva (ensayo de inmunosorcion ligada a enzima) o utilizando un dispositivo de resonancia del plasmon superficial, tal como Biacore T100, que se encuentra disponible de Biacore, Inc., Piscataway, NJ. Entre los fragmentos de anticuerpo se incluyen fragmentos de anticuerpo proteolrticos [tales como los fragmentos F(ab')2, los fragmentos Fab', los fragmentos Fab'-SH y los fragmentos Fab tal como se conocen de la tecnica], fragmentos de anticuerpo recombinante (tales como fragmentos sFv, fragmentos dsFv, fragmentos sFv biespedficos, fragmentos dsFv biespedficos, diacuerpos y triacuerpos, tal como se conocen de la tecnica) y anticuerpos de camelidos (ver, por ejemplo, las patentes US n° 6.015.695, n° 6.005.079; n° 5.874.541; n° 5.840.526; n° 5.800.988 y n° 5.759.808). Entre los anticuerpos se incluyen preparaciones de anticuerpos monoclonales y policlonales. Aunque un anticuerpo de un conjugado dado a conocer puede unirse espedficamente a cualquier molecula particular o a cualquier grupo particular de moleculas altamente similares, en realizaciones particulares, el anticuerpo comprende un anticuerpo anti-hapteno (que puede utilizarse, por ejemplo, para detectar una secuencia de sonda marcada con hapteno con diana en una secuencia de acidos nucleicos de interes). En realizaciones particulares, el anticuerpo comprende un anticuerpo anti-anticuerpo que puede utilizarse como anticuerpo secundario en un inmunoensayo. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un anticuerpo anti-IgG, tal como un anticuerpo anti-IgG de raton, un anticuerpo anti- IgG de conejo o un anticuerpo anti-IgG de cabra.
La expresion "condiciones en las que un grupo tiol de un conector hidrazida-tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma acida neutra" se refiere a condiciones, tales como las condiciones de pH, en las que menos de aproximadamente 1% del grupo tiol (-SH, la forma de acido neutra protonada) del conector se encuentra presente en su forma de base conjugada (-S'; no protonada, forma con carga negativa). Por ejemplo, bajo dichas condiciones menos de aproximadamente 1%, menos de aproximadamente 0,01%, o incluso menos de aproximadamente 0,001% del conector puede encontrarse en la forma de base conjugada. Entre las condiciones bajo las que el grupo tiol del compuesto conector hidrazida-tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma de acido neutro se incluyen un pH inferior a aproximadamente 7, por ejemplo un pH inferior a aproximadamente 6, tal como un pH inferior a aproximadamente 5,5. En realizaciones particulares, entre dichas condiciones se incluye un abanico de valores de
pH, por ejemplo un pH de entre aproximadamente 3 y un pH de aproximadamente 7, un pH de entre
aproximadamente 4 y un pH de aproximadamente 7, un pH de entre aproximadamente 4 y un pH de
aproximadamente 6, un pH de entre aproximadamente 4,5 y un pH de aproximadamente 5,5. o cualquier
subintervalo de cada uno de dichos intervalos. En otras realizaciones, el lfmite superior del intervalo de pH en el que un grupo tiol de un conector particular se encuentra particularmente presente en su forma acida neutra (encontrandose presente menos de 1% del grupo tiol como forma de base conjugada) puede ser superior a 7, tal como un pH de 8. El experto ordinario en la materia podra determinar facilmente un lfmite superior al intervalo de pH en el que un grupo tiol dado se encontrara sustancialmente presente en la forma acida neutra utilizando la ecuacion de Henderson-Hasselbach y un valor de pKa para un grupo tiol del conector. En todavfa otras realizaciones, un grupo tiol de un conector particular puede encontrarse sustancialmente presente en su forma de acido neutro en un sistema de solventes para el que no puede determinarse un pH exacto, y el experto ordinario en la materia reconocera que los sistemas de solventes que son menos polares que el agua pueden ayudar a mantener el grupo tiol en su forma de acido neutro a pH aparentes mas altos. Alternativamente, puede llevarse a cabo una determinacion experimental de si bajo condiciones particulares un grupo tiol de un conector se encuentra sustancialmente presente en su forma de acido neutro mediante la determinacion de si el tiol reducira un enlace disulfuro presente en otra molecula. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una determinacion del numero de grupos tiol libres (por ejemplo utilizando reactivo de Ellman) introducidos en una molecula que presenta disulfuros (tal como una inmunoglobulina) mediante contacto con el conector bajo condiciones particulares de pH (o pH estimado para
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sistemas no acuosos). La adicion de un exceso del conector hidrazida-tiol (tal como un exceso de 50 veces o mas) durante un periodo de tiempo (tal como una hora o mas) puede seguirse mediante la determinacion del numero medio de tioles libres introducidos en la molecula. En el caso de que se generen tioles libres en un grado sustancial (por ejemplo que se introduzcan por cada molecula de inmunoglobulina un numero superior a una media de dos tioles), se demuestra que el tiol del conector no se encuentra sustancialmente presente en su forma de acido neutro bajo las condiciones sometidas a ensayo. Por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7, un exceso de cien veces del conector MBH respecto a una inmunoglobulina se producira una media de aproximadamente 2 tioles por cada molecula de inmunoglobulina. A un pH inferior, de 5, un exceso de mil veces del conector MBH producira, de media, sustancialmente menos de 1 tiol por cada inmunoglobulina en 24 horas. Estos resultados demuestran que para el conector MBH, el grupo tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma de acido neutro a un pH de aproximadamente 7 o menos, ya que al bajar el pH, el equilibrio entre la forma de acido neutro y su base conjugada se desplaza mas hacia la forma de acido neutro.
Un "conjugado" se refiere a dos o mas moleculas (y/o materiales, tales como nanopartfculas) que se encuentran covalentemente unidas a un constructo mas grande. En algunas realizaciones, un conjugado incluye una o mas moleculas biologicas (tales como peptidos, acidos nucleicos, protemas, enzimas, azucares, polisacaridos, lfpidos, glucoprotemas y lipoprotemas) unidas covalentemente a otra u otras moleculas, tales como otra u otras moleculas biologicas. En otras realizaciones, un conjugado incluye una o mas moleculas de union espedfica (tales como anticuerpos y secuencias de acidos nucleicos) unidas covalentemente a uno o mas marcajes detectables (tales como moleculas fluorescentes, nanopartfculas fluorescentes, haptenos, enzimas y combinaciones de los mismos).
Un "marcaje detectable" es una molecula o material que puede producir una senal detectable (tal como visual, electronica o de otro tipo) que indica la presencia y/o la concentracion del marcaje en una muestra. En caso de encontrarse conjugado con una molecula de union espedfica, el marcaje detectable puede utilizarse para localizar y/o cuantificar la diana de la molecula de union espedfica. De esta manera, la presencia y/o la concentracion de la diana en una muestra puede detectarse mediante la deteccion de la senal producida por el marcaje detectable. Un marcaje detectable puede detectarse directa o indirectamente y pueden utilizarse varios marcajes detectables diferentes conjugados con diferentes moleculas de union espedfica en combinacion para detectar una o mas dianas. Por ejemplo, un primera marcaje detectable, tal como un hapteno conjugado con una sonda de acidos nucleicos o anticuerpo espedfico para una diana puede detectarse indirectamente mediante la utilizacion de un segundo marcaje detectable que se conjuga con una molecula que se une espedficamente al primer marcaje detectable. Pueden conjugarse multiples marcajes detectables que pueden detectarse separadamente, con diferentes moleculas de union espedfica que se unen espedficamente a diferentes dianas, proporcionando un ensayo multiplexado que puede proporcionar la deteccion simultanea de las multiples dianas en una muestra. Puede generarse una senal detectable mediante cualquier mecanismo conocido o por descubrir, incluyendo la absorcion, emision y/o dispersion de un foton (incluyendo las radiofrecuencias, la frecuencia de microondas, la frecuencia de infrarrojos, la frecuencia visible y los fotones de frecuencia ultravioleta). Entre los marcajes detectables se incluyen moleculas y materiales coloreados, fluorescentes, fosforescentes y luminiscentes, catalizadores (tales como enzimas) que convierten una sustancia en otra sustancia, proporcionando una diferencia detectable (tal como mediante la conversion de una sustancia incolora en una sustancia coloreada o viceversa, o mediante la produccion de un precipitado o incrementando la turbidez de la muestra), haptenos que pueden detectarse mediante interacciones de union anticuerpo-hapteno utilizando conjugados de anticuerpos detectablemente marcados adicionales y moleculas o materiales paramagneticos y magneticos. Entre los ejemplos particulares de marcajes detectables se incluyen enzimas tales como la peroxidasa de rabano picante, la fosfatasa alcalina, la fosfatasa acida, la glucosa oxidasa, la p-galactosidasa, la p-glucuronidasa o la p-lactamasa; moleculas fluorescentes tales como las fluorescemas, las coumarinas, los pigmentos BODIPY, las resorufinas y las rodaminas (pueden encontrarse muchos ejemplos adicionales de moleculas fluorescentes en The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes, Eugene, OR); nanopartfculas tales como los puntos cuanticos (obtenidos, por ejemplo, de QuantumDot Corp., Invitrogen Nanocrystal Technologies, Hayward, CA; ver tambien las patentes US n° 6.8l5.064, n° 6.682.596 y n° 6.649.138); quelatos metalicos tales como los quelatos DOTA y DpTA de iones metalicos radioactivos o paramagneticos como Gd3+, y liposomas, por ejemplo liposomas que contienen moleculas fluorescentes atrapadas. En el caso de que el marcaje detectable incluya un enzima, puede utilizarse un sustrato detectable, tal como un cromogeno, un compuesto fluorogenico o un compuesto luminogenico en combinacion con el enzima, generando una senal detectable (se encuentran disponibles comercialmente una amplia diversidad de dichos compuestos, por ejemplo de Invitrogen Corporation, Eugene, OR). Entre los ejemplos particulares de compuestos cromogenicos se incluyen diaminobencidina (DAB), 4-nitrofenilfosfato (pNPP), Fast Red, fosfato de bromocloroindolilo (BCIP), azul de nitro-tetrazolio (NBT, por sus siglas en ingles), BClP/NBT, Fast Red, naranja-AP, azul-AP, tetrametilbencidina (TMB), 2,2’-azino-di-[3-etilbenzotiazolm sulfonato] (ABTS, por sus siglas en ingles), o- dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-p-D-galactopiranosido (ONPG), o-fenilendiamina (OPD, por sus siglas en ingles), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-galactopiranosido (X-Gal), metilumbeliferil-p-D-galactopiranosido (MU-Gal), p- nitrofenil-a-D-galactopiranosido (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucuronido (X-Gluc), 3-amino-9-etil-carbazol (AEC), fucsina, yodonitrotetrazolio (INT), azul tetrazolio y violeta tetrazolio. Alternativamente, puede utilizarse un enzima en un esquema de deteccion metalografica. Entre los metodos de deteccion metalografica se incluyen utilizar un enzima tal como fosfatasa alcalina en combinacion con un ion metalico soluble en agua y un sustrato redox- inactivo del enzima. El sustrato es convertido en un agente redox-activo por el enzima y el agente redox-activo reduce el ion metalico, provocando que forme un precipitado detectable. (ver, por ejemplo, la solicitud de patente US
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en tramitacion junto con la presente, n° 11/015.646, presentada el 20 de diciembre de 2004; publicacion de patente PCT n° 2005/003777 y la solicitud publicada de patente US n° 2004/0265922). Entre los metodos de deteccion metalografica se incluyen utilizando un enzima oxidorreductasa (tal como la peroxidasa de rabano picante) conjuntamente con un ion metalico soluble en agua, un agente oxidante y un agente reductor, nuevamente para formar un precipitado detectable (ver, por ejemplo, la patente US n° 6.670.113). Los haptenos son moleculas pequenas se unen espedficamente a anticuerpos, aunque por sf mismos no induciran una respuesta inmunologica en un animal y deben en primer lugar unirse a una molecula portadora de mayor tamano, tal como una protema o un acido polinucleico para generar una respuesta inmunologica. Entre los ejemplos de haptenos se incluyen dinitrofenol, biotina, digoxigenina y fluorescema. Se dan a conocer ejemplos adicionales de oxazol, pirazol, tiazol, nitroarilo, benzofurano, triterpeno, urea, tiourea, rotenoide, coumarina y haptenos ciclolignano en la solicitud en tramitacion junto con la presente, de la patente provisional US n° 60/856133, presentada el 1 de noviembre de 2006. La expresion "conjugado espedfico de Fc" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un conjugado de una inmunoglobulina (o fragmento de la misma) en la que una segunda molecula (tal como un marcaje detectable) se une covalentemente a la parte glucosilada de la inmunoglobulina (o a un fragmento de una inmunoglobulina que conserva la parte glucosilada). La parte glucosilada de una inmunoglobulina se encuentra en la region Fc, que es una region de una inmunoglobulina que se encuentra situada en las cadenas pesadas de la inmunoglobulina en posiciones exteriores a la parte de la inmunogloublina que es responsable para la actividad de union espedfica de la inmunoglobulina.
La expresion "grupo hidrazida" se refiere a un grupo hidrazida (-CO-NH-NH2), un grupo carbohidrazida (-NH-NH-CO- NH-NH2), un grupo semicarbazida (-NH-CO-NH-NH2), un grupo tiosemicarbazida (-NH-CS-NH-NH2), un grupo tiocarbazida (-NH-NH-CS-NH-NH2), un grupo dihidrazina de acido carbonico (-NH-CO-NH-NH-CO-NH-NH2) o un derivado que contiene azufre del mismo, o un grupo carboxilato de hidrazina (-O-CO-NH-NH2) o un derivado que contiene azufre de los mismos.
La expresion "grupo reactivo con hidrazida" se refiere a un grupo de atomos que pueden reaccionar con y formar un enlace covalente con un grupo hidrazida. Los grupos aldehfdo y cetona son ejemplos de grupos reactivos con hidrazida. Los grupos reactivos con hidrazida pueden ser una parte intrmseca de una molecula o pueden introducirse en una molecula. Un metodo para introducir un grupo aldehndo (un grupo reactivo con hidrazida) en polisacaridos y glucoprotemas (incluyendo anticuerpos) es mediante oxidacion, tal como la oxidacion mediada por peryodato de dioles vecinales. Ademas, los dobles enlaces en acidos grasos insaturados y ceramidas pueden convertirse en dioles con tetraoxido de osmio y despues ser oxidados por peryodato a aldehfdos. Ademas, los residuos N-terminales de serina y treonina de peptidos y protemas pueden oxidarse selectivamente con peryodato en grupos aldehndo, permitiendo la modificacion selectiva de determinadas protemas, tales como la corticotrofina y la p-lactamasa. La modificacion de los anticuerpos oxidados con peryodato no inactiva tfpicamente el anticuerpo. La modificacion de la concentracion del peryodato sodico durante la reaccion de oxidacion proporciona cierta especificidad con respecto a los tipos de residuos sacaridos que se modifican. Por ejemplo, el peryodato sodico a una concentracion de 1 mM a 0°C tfpicamente corta unicamente en los hidroxilos contiguos entre los atomos de carbono 7, 8 y 9 de residuos de acido sialico. La oxidacion de polisacaridos utilizando concentraciones de 10 mM o superiores de peryodato sodico resulta en la oxidacion de residuos sacaridos diferentes del acido sialico, creando de esta manera muchos aldehndos en un polisacarido dado. Se describe un protocolo general adecuado en Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996, ISBN 36-8. Otro metodo para introducir aldehndo en biomoleculas es mediante la utilizacion de azucar oxidasas espedficas, por ejemplo galactosa oxidasa, que es un enzima que oxida residuos de galactosa terminal en aldehndos, en particular en glucoprotemas. En el caso de que los residuos galactosa sean penultimos tras residuos de acido sialico, puede utilizarse neuramidasa para eliminar el residuo de acido sialico y exponer la galactosa para que sea el residuo terminal. Se proporciona un protocolo para utilizar una combinacion de neuramidasa y galactosa oxidasa para oxidar residuos de galactosa, proporcionando un grupo de aldehndo reactivo, en Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996, ISBN 36-8. Tambien pueden introducirse aldehndos en una molecula mediante la reaccion de un grupo amina de una molecula con un NHS-aldehndo, tal como p-formilbenzoato de succinimidilo (SFB, por sus siglas en ingles) o p-formilfenoxiacetato de succinimidilo (SFPA, por sus siglas en ingles) (Invitrogen Corp., Eugene, OR). Alternativamente, pueden utilizarse compuestos bis-aldehndo, tales como glutaraldehndo, para modificar un grupo amino para proporcionar un grupo aldehndo. Nuevamente se proporcionan protocolos adecuados en Hermanson, "Bioconjugate Techniques," Academic Press, San Diego, 1996, ISBN 36-8. La expresion "conector hidrazida-tiol" se refiere a una molecula que incluye uno o mas grupos hidrazida y uno o mas grupos tiol (- SH) unidos covalentemente mediante uno o mas atomos de union. El grupo o grupos hidrazida y el grupo o grupos tiol de un conector hidrazida-tiol pueden unirse mediante uno o mas de entre diversos grupos de atomos, entre ellos los grupos metileno (-CH2-), los grupos de alquileno ramificado, los grupos hidrazida adicionales, los grupos aromaticos, los grupos heteroaromaticos, los grupos alidclicos, los grupos de polialquilenglicol (tales como los grupos de oxido de etileno, -O-CH2CH2-), los grupos amida (-CONH-), los grupos amina (-NH-), los grupos eter (-O-) y las combinaciones de los mismos. Un "conector hidrazida-tiol basado en PEG" se refiere a un conector que incluye 1 o mas grupos de etilenglicol como parte de su estructura. Un "conector hidrazida-tiol multifuncional" se refiere a un conector ramificado que presenta por lo menos un grupo hidrazida, por lo menos un grupo tiol y por lo menos un grupo reactivo adicional, tal como un grupo hidrazida adicional, un grupo tiol adicional o cualquier otro grupo util para preparar conjugados moleculares. En algunas realizaciones, un conector hidrazida-tiol basado en PEG comprende un conector PEG discreto (dPEG), que puede prepararse a partir de materiales de partida de dPEG tales como los
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dados a conocer en la solicitud de patente US publicacion n° 2006/0020134 y puede obtenerse de Quanta Biodesign (Powell, OH). Entre los ejemplos de grupos reactivos adicionales que pueden incluirse en un conector hidrazida-tiol polifuncional se incluyen grupos maleimida y esteres activos, tales como esteres de N-hidroxisuccinimida, y grupos hidroxi (-OH). Pueden encontrarse ejemplos adicionales de grupos reactivos en Hermanson, "Bioconjugate Techniques," Academic Press, San Diego, 1996, ISBN 36-8. El termino "muestra" se refiere a cualquier lfquido, sustancia (o material) semisolida o solida en o sobre el cual puede encontrarse presente una diana. En particular, una muestra puede ser una muestra biologica o una muestra obtenida de un material biologico. Entre los ejemplos de muestras biologicas se incluyen muestras de tejido y muestras de citologfa.
La expresion "molecula de union espedfica" se refiere a una molecula que se une espedficamente a una segunda molecula. La expresion "se une espedficamente" se refiere a que la molecula de union espedfica se une a la segunda molecula excluyendo sustancialmente a otras moleculas presentes en una muestra (por ejemplo la constante de union de la molecula de union espedfica es de por lo menos 102 M-1 superior, 103 M-1 superior, 104 M-1 superior o 105 M-1 superior a una constante de union para otras moleculas en la muestra). Entre los ejemplos de moleculas de union espedfica se incluyen acidos nucleicos, receptores, anticuerpos, enzimas, lectinas y avidinas. Entre los ejemplos de interacciones de union espedfica en las que pueden particular moleculas de union espedfica se incluyen la formacion de duplex y triplex de secuencias de acidos nucleicos, las interacciones de receptor-ligando (tales como las interacciones de folato-receptor de folato), las interacciones de anticuerpo-antfgeno, las interacciones de enzima-sustrato, las reacciones de lectina-sacarido y las interacciones de avidina-biotina (tales como las interacciones de estreptavidina-biotina).
El termino "diana" se refiere a cualquier molecula de la que se determina o puede determinarse la presencia, la localizacion y/o la concentracion. Entre los ejemplos de moleculas diana se incluyen protemas, secuencias de acidos nucleicos y haptenos, tales como haptenos unidos covalentemente a secuencias de acidos nucleicos o protemas. Las moleculas diana se detectan tfpicamente utilizando uno o mas conjugados de una molecula de union espedfica y un marcaje detectable.
La expresion "grupo reactivo con tiol" se refiere a un atomo o atomos que pueden reaccionar con y formar un enlace covalente con un grupo tiol. Un grupo reactivo tiol puede ser una parte intrmseca de una molecula o puede introducirse en la molecula mediante reaccion con otra u otras moleculas. Entre los ejemplos de grupos reactivos con tiol se incluyen aceptores de Michael no polimerizables, grupos haloacetilo (tales como los grupos bromoacetilo y yodoacetilo), los haluros de alquilo, las maleimidas, las aziridinas, los grupos acriloilo, las vinilsulfonas, las benzoquinonas, los grupos aromaticos que pueden experimentar sustitucion nucleofflica, tales como los grupos fluorobenceno (tales como los grupos tetra- y penta-fluorobenceno) y grupos disulfuro tales como los grupos disulfuro piridilo y los tioles activados con reactivo de Ellman. Los ejemplos adicionales de cada uno de dichos tipos de grupo resultaran evidentes para el experto en la materia. Se proporcionan ejemplos e informacion adicionales respecto a las condiciones de reaccion y metodos para intercambiar un tipo de grupo reactivo por otro para anadir un grupo reactivo con tiol en Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996, ISBN 0-12342336-8. En una realizacion particular, se une una molecula de conector heterobifuncional a una molecula para introducir un grupo reactivo con tiol. Por ejemplo, un conector que presenta un grupo maleimida y un grupo N- hidroxisuccinimida (NHS) pueden unirse a un grupo amina en una molecula mediante el grupo NHS, proporcionando de esta manera a la molecula un grupo maleimida reactivo con tiol que puede hacerse reaccionar con un grupo tiol de otra molecula (tal como una introducida utilizando un conector hidrazida-tiol y el metodo dado a conocer), formando un conjugado.
III. Descripcidn general
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en un aspecto se da a conocer un metodo para formar un conjugado de dos o mas moleculas. El metodo incluye la reaccion de un conector hidrazida-tiol con una primera molecula (tal como un anticuerpo) que presenta un grupo reactivo con hidrazida (tal como un aldelddo) para formar una primera molecula tiolada. La reaccion se lleva a cabo bajo condiciones en las que un grupo tiol del conector hidrazida-tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma acida neutra (protonada). La primera molecula tiolada seguidamente puede hacerse reaccionar con una segunda molecula que presenta un grupo reactivo con tiol (tal como un grupo maleimida introducido en la segunda molecula) para formar el conjugado. En una realizacion particular, la reaccion de la primera moleclua con el conector se lleva a cabo a un pH de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7. En otras realizaciones particulares, el conector de hidrazida-tiol puede ser un conector de hidrazida-tiol basado en PEG, un conector de hidrazida-tiol multifuncional o un conector de hidrazida-tiol multifuncional basado en PEG.
En otra realizacion, el metodo puede utilizarse para unir covalentemente una molecula de union espedfica a un marcaje detectable. En una realizacion mas particular, el metodo puede utilizarse para unir una primera molecula que presenta una parte glucosilada a otra molecula. En dicha realizacion, la parte glucosilada en primer lugar se oxida para generar un grupo aldehfdo que puede hacerse reaccionar con un conector hidrazida-tiol. En una realizacion todavfa mas particular, la primera molecula glucosilada puede ser un anticuerpo que presenta una region Fc glucosilada. Se forma un anticuerpo tiolado espedfico para Fc mediante reaccion con un conector hidrazida-tiol, y
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el anticuerpo tiolado espedfico para Fc puede hacerse reaccionar con un marcaje detectable que presenta un grupo reactivo con tiol.
En otro aspecto se proporciona una diversidad de conectores hidrazida-tiol y metodos para la preparacion de los mismos, tal como se describe de manera general en la descripcion general sintetica y en los Ejemplos espedficos, posteriormente. Un aspecto adicional es un conjugado preparado con un conector dado a conocer. En un aspecto adicional, se da a conocer un kit que incluye un conector dado a conocer e instrucciones para poner en practica el metodo dado a conocer de preparacion de un conjugado. Se dan a conocer ademas metodos para utilizar los conjugados dados a conocer para detectar una diana en una muestra.
IV. Descripcidn general sintetica
A. Preparacion de conector hidrazida-tiol
Aunque puede utilizarse cualquier conector hidrazida-tiol en el metodo dado a conocer de preparacion de un conjugado, en una realizacion, puede proporcionarse un conector hidrazida-tiol mediante la reaccion de una tiolactona con hidrazina, carbohidrazida o una dihidrazida segun el Esquema 1, posteriormente, en el que n=1, 2 o 3, R1 es H, -CONHNH2, o -CO-A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente con 1 a 100 atomos de carbono que puede encontrarse interrumpido por uno o mas heteroatomos (por ejemplo de O, N o S) y puede sustituirse; por ejemplo, con uno o mas grupos alquilo, hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina. En realizaciones mas particulares, A es un grupo divalente que consiste en 1 a 10 grupos metileno (-CH2) y/o 1 a 24 grupos de oxido de etileno (-CH-CH2-O-). En realizaciones todavfa mas particulares, A es un grupo divalente que consiste de 1 a 6 grupos metileno o 4 a 12 grupos de oxido de etileno.
imagen1
Tambien puede proporcionarse segun el Esquema 2, posteriormente, una amplia diversidad de conectores hidrazida-tiol que pueden utilizarse en el metodo dado a conocer. En dicho esquema, Z es un grupo divalente que presenta entre 1 y 100 atomos de carbono, en el que el grupo divalente puede encontrarse interrumpido por uno o mas heteroatomos (por ejemplo de O, N o S) y que puede sustituirse, por ejemplo, con uno o mas grupos hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina. En realizaciones mas particulares, Z es un grupo divalente que consiste en 1 a 10 grupos metileno (-CH2) y/o 1 a 24 grupos de oxido de etileno (-CH-CH2-O-). En realizaciones todavfa mas particulares, Z es un grupo divalente que consiste en 1 a 6 grupos metileno o 4 a 12 grupos de oxido de etileno. R2 es H, -CONHNH2 o -CO-A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente que presenta entre 1 y 100 atomos de carbono que encontrarse interrumpido por uno o mas heteroatomos (por ejemplo O, N o S) y puede sustituirse, por ejemplo, con uno o mas grupos alquilo, hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina.
imagen2
acoplamiento mediado por carbodiimida
H2N-------NHR2
RoHNHN
Z-----SH
Esquema 2
En algunas realizaciones, se proporciona un conector hidrazida-tiol basado en PEG que puede utilizarse en el metodo dado a conocer y se prepara segun el Esquema 3. En el Esquema 3, m=2 a 50; R3 es H, -CONHNH2, o -CO- 5 A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente que presenta entre 1 y 100 atomos de carbono que puede encontrarse interrumpido por uno o mas heteroatomos (por ejemplo de O, N o S) y puede sustituirse, por ejemplo, con uno o mas grupos alquilo, hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina, y X e Y son, independientemente, un enlace o un grupo divalente con 1 a 20 atomos de carbono. En realizaciones mas particulares, A es un grupo divalente que consiste en 1 a 10 grupos metileno (-CH2) y/o 1 a 24 grupos de oxido de 10 etileno (-CH-CH2-O-). En realizaciones todavfa mas particulares, A es un grupo divalente que consiste de 1 a 6 grupos metileno o 4 a 12 grupos de oxido de etileno. Los grupos divalentes X e Y pueden encontrarse interrumpidos por uno o mas heteroatomos (por ejemplo, O, N o S) y pueden sustituirse, por ejemplo, con uno o mas grupos alquilo, hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina. En realizaciones mas particulares, X e Y son independientemente un enlace o -(CH2)p- en el que p = 1 a 3. La carbodiimida utilizada en la 15 reaccion de acoplamiento puede ser cualquier carbodiimida que proporcione el acoplamiento deseado segun el esquema. Entre los ejemplos de carbodiimidas adecuadas se incluyen DCC (N,N'-diciclohexilcarbodiimida) y DIC (N,N'-diisopropilcarbodiimida). En una realizacion de trabajo que se comenta posteriormente, se utiliza DCC para llevar a cabo el acoplamiento.
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En otras realizaciones, se proporciona un conector hidrazida-tiol multifuncional que puede utilizarse en el metodo dado a conocer. Los Esquemas 4a, 4b, 4c y 4d, posteriormente, muestran metodos generales para preparar conectores multifuncionales a partir de homocistema, lisina, acido glutamico y homoserina, respectivamente. En los Esquemas 4a, 4b, 4c y 4d, D es un grupo divalente que presenta entre 1 y 100 atomos de carbono, en el que el 5 grupo divalente puede estar interrumpido por uno o mas heteroatomos (por ejemplo, O, N o S) y puede sustituirse, por ejemplo, con uno o mas grupos alquilo, hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina. En realizaciones mas particulares, D es un grupo divalente que consiste de 1 a 10 grupos metileno (-CH2) y/o 1 a 24 grupos de oxido de etileno (-CH-CH2-O-). En realizaciones todavfa mas particulares, D es un grupo divalente que consiste de 1 a 6 grupos metileno o 4 a 12 grupos de oxido de etileno. Tambien en los Esquemas 4a, 4b, 4c y 10 4d, R4 es H, -CONHNH2 o -CO-A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente que presenta entre 1 y 100 atomos
de carbono que puede encontrarse interrumpido por uno o mas heteroatomos (por ejemplo de O, N o S) y puede sustituirse, por ejemplo, con uno o mas grupos alquilo, hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina. En realizaciones mas particulares, A es un grupo divalente que consiste en 1 a 10 grupos metileno (-CH2) y/o 1 a 24 grupos de oxido de etileno (-CH-CH2-O-). En realizaciones todavfa mas particulares, A es 15 un grupo divalente que consiste de 1 a 6 grupos metileno o 4 a 12 grupos de oxido de etileno.
20
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5 En otras realizaciones particulares, se proporciona un conector hidrazida-tiol multifuncional basado en PEG que puede utilizarse en el metodo dado a conocer. Los Esquemas 5a, 5b y 5c ilustran esquemas sinteticos generales que pueden utilizarse para proporcionar dichos conectores. En dichos esquemas, p=2 a 50 y R5 es H, -CONHNH2 o - CO-A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente que presenta entre 1 y 1O0 atomos de carbono que puede encontrarse interrumpido por uno o mas heteroatomos (por ejemplo de O, N o S) y puede sustituirse, por ejemplo, 10 con uno o mas grupos alquilo, hidroxilo, alcoxi, acilo, carboxi, halogeno, sulfonato, oxo, fosfonato y/o amina. En realizaciones mas particulares, A es un grupo divalente que consiste en 1 a 10 grupos metileno (-CH2) y/o 1 a 24 grupos de oxido de etileno (-CH-CH2-O-). En realizaciones todavfa mas particulares, A es un grupo divalente que consiste de 1 a 6 grupos metileno o 4 a 12 grupos de oxido de etileno. R7 puede ser H, alquilo o un grupo protector.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    10
    15
    20
  2. 2.
    25
  3. 3.
  4. 4. 30
  5. 5.
    Conjugado, que comprende: un anticuerpo,
    un marcaje detectable que comprende un enzima que incluye aproximadamente 17 a 25 grupos maleimida introducidos en el enzima mediante conectores NHS-PEG-maleimida, encontrandose cada conector unido covalentemente a un grupo amino del enzima, y
    una pluralidad de conectores hidrazida-tiol, comprendiendo cada conector hidrazida-tiol uno o mas atomos de union situados entre un grupo hidrazida y un grupo tiol, en el que el conector hidrazida-tiol se selecciona de entre hidrazida de acido mercaptobutmco (MBH), carbohidrazida de acido mercaptobutmco (MBCH), hidrazida de mecaptoacetamido-acido mercaptobutmco (MAMBH), hidrazida de acido tiohexanamidomercaptobutmco (THMBH), N,N'-(6-hidrazinil-6-oxohexano-1,5-diil)bis(2- mercaptoacetamida) (BTAL), bistiohexanamidohidrazidolisina (BTHL), N-(1,5-dihidrazinil-1,5- dioxopentan-2-il)-2-mercapto-acetamida (TAGD), dihidrazida de acido tiohexamidoglutamico (THGD), un conector hidrazida-tiol basado en PEG, un conector hidrazida-tiol multifuncional, un conector hidrazida- tiol multifuncional basado en PEG, un conector hidrazida-tiol de poliacrilamida y combinaciones de los mismos,
    el grupo hidrazida de cada conector hidrazida-tiol esta unido covalentemente a una parte Fc glucosilado oxidado del anticuerpo y el grupo tiol de uno de los conectores hidrazida-tiol unidos covalentemente al marcaje detectable mediante uno de los grupos maleimida.
    Conjugado segun la reivindicacion 1, en el que el conector hidrazida-tiol comprende un conector hidrazida- tiol basado en PEG.
    Conjugado segun la reivindicacion 2, en el que el conector hidrazida-tiol basada en PEG comprende un conector mercapto-dPEG-hidrazida.
    Conjugado segun la reivindicacion 1, en el que el conector hidrazida-tiol comprende MBH o MBCH.
    Conjugado segun la reivindicacion 1, en el que el enzima es fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante.
  6. 6. Conjugado segun la reivindicacion 5, en el que el enzima es la fosfatasa alcalina.
    35
  7. 7. Conjugado segun la reivindicacion 6, en el que la fosfatasa alcalina comprende fosfatasa alcalina entrecruzada.
  8. 8. Conjugado segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo antihapteno.
    40
  9. 9. Conjugado segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo antianticuerpo.
  10. 10. Metodo para detectar una molecula diana en una muestra celular o tisular, que comprende:
    45 poner en contacto la muestra celular o tisular con un conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones
    1 a 9, y
    detectar una senal generada por el conjugado que indica la presencia de la molecula diana en la muestra celular o tisular.
    50
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    FIG. 6A
    imagen7
    FIG. 6C
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    imagen12
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