JP2022522265A - エリスロフェロンの変異体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、貧血、鉄の過剰負荷、及び骨髄悪性腫瘍の領域に関する。本発明者らは、患者におけるヘプシジンの抑制及び鉄の蓄積をもたらす、エリスロフェン（ＥＲＦＥ）タンパク質の濃度上昇の原因となる、ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ骨髄異形成症候群に特異的なＥＲＦＥの変異転写物を同定する。この転写物は、追加の４アミノ酸を有する変異タンパク質へと翻訳され得る終止コドンを誘導しない、フレーム内に付加された１２ヌクレオチドのイントロン配列を含有している。精密質量分析を使用することによって、本発明者らは、付加されたポリペプチドＶＰＱＦ（配列番号５）に対応するペプチドを同定し、ＳＦＢ１の突然変異したＭＤＳ患者の骨髄赤芽球による、変異タンパク質の活発な産生を実証する。この変異体は、ＳＦ３Ｂ１ＭＵＴ患者における貧血の処置をモニタリングするための、クローン性造血の妥当なバイオマーカーとして使用され得る。したがって、本発明は、ＥＲＦＥの転写物の変異体、並びに、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を有する患者における、貧血及び鉄の過剰負荷の診断及びモニタリングにおけるその使用に関する。

Description

発明の分野：
本発明は、エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）の転写物の変異体、並びに、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を有する患者における、貧血及び鉄の過剰負荷の診断及びモニタリングにおけるその使用に関する。

発明の背景：
骨髄異形成症候群は、高齢患者の罹るクローン性造血幹細胞障害であり、症例の４０％は急性骨髄性白血病（２０％以上の骨髄芽球によって定義される）に進行し、残りの症例は、骨髄不全へと進行する傾向がある。患者は、末梢血の血球減少症、主に貧血（症例の８０％）、そして、それほど頻繁ではないが、好中球減少症及び／又は血小板減少症に罹り、これは加齢及びおそらくクローン性造血の発症に関連した合併症を大抵は伴う。骨髄異形成症候群は不均質であり、世界保健機構は、その２０１６年の分類において７つのサブタイプを認識している（１）。骨髄造血細胞内における反復突然変異の明確に異なる組合せの発見以来、個体間の不均質は増している。これらの突然変異は、後成的な転写調節に関与する遺伝子（ＴＥＴ２、ＩＤＨ１／２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＳＸＬ１、ＥＺＨ２）、スプライシング因子（ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、ＺＲＳＲ２）、コヒーシン（ＳＴＡＧ２）、転写因子（ＲＵＮＸ１、ＴＰ５３）、及びシグナル伝達分子（ＫＩＴ、ＣＢＬ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ）に影響を及ぼす。これらの各突然変異は、骨髄のより未熟な幹細胞及び前駆細胞において検出可能な事象を惹起する可能性があり、それらの赤血球系及び顆粒球－単球系の前駆細胞、時にはＢリンパ球へと伝達される（２）。リスク因子は、血球減少症の数及び強度、骨髄芽球の比率、並びに細胞遺伝学的異常の種類及び数であり、これらは全て、改訂された国際予後判定システム（Ｒ－ＩＰＳＳ；参考文献３）に言及されている。患者は、非常に低い、低い、中間、高い、及び非常に高いリスクと認識される。突然変異の状態を含む、新規な予後判定システムは、研究中である。より低いリスクの患者における処置の目的は、血球減少症を治癒することであるが、より高いリスクの患者では白血病の進行を止めることである。第一選択の処置は、赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）、及び失敗した場合には輸血である。赤血球造血刺激因子製剤は、組換えエリスロポエチン（Ｅｐｏ）（エポエチンアルファ、エポエチンベータ、及びダルベポエチンを含む）、及びレタクリット（エポエチンゼータ）のようなバイオ後続品を含む（概説については参考文献４）。

しかしながら、貧血患者の５０％は、赤血球造血刺激因子製剤に対して一次耐性又は二次耐性を示し、他の治療選択肢の必要性が強調される。レナリドミドは、５番染色体長腕の欠失を有するＭＤＳの特定のサブタイプを患っている患者において成功裡に使用されている（５）。レナリドミドはまた、５番染色体長腕の欠失を有さないＭＤＳ患者において、赤血球造血刺激因子製剤と併用すると、一過性に有効であった（６、７）。これとは対照的に、より高いリスクの患者における生存期間を効果的に延長する低メチル化剤は、貧血の処置においてあまり有効ではない（ＧＦＭ aza/Epo）。近年、ＴＧＦ－βファミリーメンバーのリガンドの捕捉剤であるラスパテルセプトは、より低いリスクの患者における貧血の処置のために有効な薬剤として報告されている。この処置は、２つの無効造血モデルであるβ－サラセミア又はＭＤＳのマウスモデルにおいて初めて試験された。結果は、後期段階の造血の救出及び鉄パラメーターの改善を実証する（８、９）。より低いリスクのＭＤＳに関する第ＩＩ相試験の近年の報告では、５０％を超える奏効率、及び環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ－ＲＳ）患者では７０％を超える奏効率が強調されている。

環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ－ＲＳ）は、大球性貧血の原因である、骨髄（ＢＭ）の顕著な赤血球異形成を伴う、クローン性造血幹細胞（ＨＳＣ）障害である。ミトコンドリアにおける鉄の蓄積及び成熟赤芽球のアポトーシスは、無効造血を引き起こす（１０、１１）。他のＭＤＳサブタイプとは対照的に、ＭＤＳ－ＲＳ患者は、上昇したレベルのフェリチン及びトランスフェリン非結合性鉄によって反映される、全身の鉄の蓄積の兆候を示し、その後、輸血に依存するようになり、その後、実質細胞内の鉄の過剰負荷を発症する（１２、１３）。全身の鉄の過剰負荷は、ＬＰＩ（不安定性血漿鉄）源であり、これは細胞内の活性酸素種の発生をもたらし得る。これは、造血前駆細胞の短縮された生存期間及びＤＮＡ損傷の原因となり、それ故、骨髄における無効造血は悪化する。鉄のキレート化は、鉄の過剰負荷の結果を抑制し、ＭＤＳ患者における造血及び寿命を改善する（１４、１５）。

スプライシング因子の遺伝子であるＳＦ３Ｂ１は、ＭＤＳ－ＲＳの約９０％において突然変異しており、診断は、環状鉄芽球の比率が５～１５％と比較的低い場合でさえも、遺伝子が突然変異している場合にはいつでも、診断が考慮される（１６～１８）。突然変異は造血幹細胞において生じる（２、１９～２０）。異常なスプライシング事象が、ＭＤＳ及び他のＳＦ３Ｂ１により引き起こされるがん（ブドウ膜黒色腫及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む）において報告されている（２１～２４）。選択的な分岐部位（ＢＳ）の選択の結果により生じる、潜在性３’スプライス部位（ｓｓ）の使用は、最も頻繁に検出される異常である。コンピューター分析は、潜在性３’スプライス部位の大半が、カノニカルな３’スプライス部位の上流の３の倍数ではないヌクレオチド距離に位置し、このことは、異常な転写物が、中途終止コドン（ＰＴＣ）を含む可能性が高く、ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）によって分解されるであろうことを示唆する。ＳＦ３Ｂ１の突然変異した細胞において異常にスプライシングされた転写物の半分が、ナンセンス変異依存分解機構に感受性であり、カノニカルなアイソフォームはダウンレギュレートされると予測されている。例えば、Ｆｅ－Ｓクラスターの排出に関与しているミトコンドリア輸送体をコードしているＡＢＣＢ７転写物は、異常にスプライシングされ、ナンセンス変異依存分解機構を受ける（２１、２５～２７）。また、ナンセンス変異依存分解機構に感受性ではない異常な転写物は、機能の改変されたタンパク質へと翻訳されることも可能である（２１）。どのようにこれらの異常なスプライシング事象が、疾患の表現型の原因となり、特に、全身の鉄の過剰負荷の原因となるのかは、不明である。

他のＭＤＳサブタイプとは対照的に、ＭＤＳ－ＲＳは、より低いレベルの鉄恒常性調節因子のヘプシジンを伴い、結果として、十二指腸の腸細胞による鉄の吸収、及び赤血球貪食マクロファージからの鉄の放出は増加し得る（２８～３３）。ＭＤＳ－ＲＳにおける不適切に低いヘプシジンレベルは、ミトコンドリアにおける鉄の捕捉のためにヘムへの鉄の取り込みが障害されていることに関連した、又はヘプシジンリプレッサーの発現上昇に関連した、無効造血度に依存し得る（３４）。形質転換増殖因子βスーパーファミリーの２つのメンバーである、増殖分化因子１５（ＧＤＦ－１５）及びねじれ原腸形成因子（twisted gastrulation）（ＴＷＳＧ１）は、無効造血におけるヘプシジンの病的抑制因子であると提唱されている（３５、３６）。つい最近、補体Ｃ１ｑ/腫瘍壊死因子関連タンパク質ファミリー（ＣＴＲＰ）メンバーであるエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）は、ヘプシジンの主な赤芽球由来調節因子として記載され、β－サラセミア患者におけるヘプシジンの病的抑制に関与している（３７、３８）。

貧血の処置は、５０～７０％の症例において失敗した。赤血球の応答は、８週間あたりの赤血球単位数及びヘモグロビンレベルを含む国際ワーキンググループ（ＩＷＧ）基準（２００６）を使用して評価され、このことは造血が包括的に評価されることを意味する。輸血非依存性は、処置後８週間以上の間、赤血球の輸血が行なわれないことによって定義され、血液学的改善は、以前の８週間における前処置の輸血回数と比較して、８週間あたり赤血球の輸血の絶対数で少なくとも４回の、赤血球輸血単位の相対的な減少として定義される。９．０ｇ/dL以下のヘモグロビンの前処置のために、又はヘモグロビンレベルを１．５ｇ/dL以上増加させるために、投与された赤血球輸血のみが、赤血球輸血の応答の評価に勘定されるだろう（３９）。北欧グループは、血清中エリスロポエチンレベル及び処置前の輸血回数に基づいた、赤血球造血刺激因子製剤に対する応答の予測スコアを提唱した（４０）。このスコアは、フランスの骨髄異形成グループを含む、他者によって検証及び改善された（Park S, Blood 2006）。しかし現実的には、北欧スコアの幅広い普及にも関わらず、赤血球造血刺激因子製剤に対する奏効率は依然として５０％付近のままであった（４１）。それ故、代替的な治療選択肢についての適切な予測スコアは、依然としてない。応答の機序をより良く理解するために、診断時及び進行中及び処置中における病的な骨髄における造血の正確な評価。病的な造血の特徴の同定は、処置に対する応答のバイオマーカーの設計を助け得る。

発明の要約：
本研究では、本発明者らは、患者におけるヘプシジンの抑制及び鉄の蓄積をもたらす、ＥＲＦＥタンパク質の濃度上昇の原因となる、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ骨髄異形成症候群に特異的なＥＲＦＥの変異転写物を同定する。この転写物は、追加の４アミノ酸を有する変異タンパク質へと翻訳され得る、終止コドンを誘導しない、フレーム内に付加された１２ヌクレオチドのイントロン配列を含有している。精密質量分析を使用することによって、本発明者らは、付加されたポリペプチドＶＰＱＦ（配列番号５）に対応するペプチドを同定し、ＳＦＢ１の突然変異したＭＤＳ患者の骨髄赤芽球による、変異タンパク質の活発な産生を実証する。組換え変異タンパク質ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱは、野生型組換えＥＲＦＥと同程度にヘプシジンｍＲＮＡの発現を抑制する。この変異体は、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者における貧血の処置をモニタリングするための、クローン性造血の妥当なバイオマーカーである。

したがって、本発明は、ＥＲＦＥの転写物の変異体、並びに、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を有する患者における、貧血及び鉄の過剰負荷の診断及びモニタリングにおけるその使用に関する。

発明の詳細な説明：
本発明の変異体
本発明の第一の態様は、配列番号２の核酸配列に対して少なくとも７０％の相同率を有するＥＲＦＥの転写物の変異体、及び、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の相同率を有するＥＲＦＥタンパク質の変異体に関する。

本発明によると、本発明の変異体は、配列番号２又は配列番号４に対して、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同率を有し得る。

１つの実施態様では、ＥＲＦＥの転写物の変異体は、配列番号２の核酸配列を有する（ＥＲＦＥ^＋１２）。

別の実施態様では、ＥＲＦＥタンパク質の変異体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する（ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ）。

別の実施態様では、ＥＲＦＥタンパク質の変異体は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同率を有し、配列内に配列番号５の４つのアミノ酸ＶＰＦＱを含む。

別の実施態様では、ＥＲＦＥタンパク質の変異体は、配列番号３に対して少なくとも７０％の相同率を有し、配列番号５の４つのアミノ酸ＶＰＦＱを含む。

別の実施態様では、ＥＲＦＥタンパク質の変異体は、配列番号３に対して少なくとも７０％の相同率を有し、配列番号３の配列内に配列番号５の４つのアミノ酸ＶＰＦＱを含む。

別の実施態様では、ＥＲＦＥタンパク質の変異体は、配列番号３に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同率を有し、配列内に配列番号５の４つのアミノ酸ＶＰＦＱを含む。

別の実施態様では、ＥＲＦＥ転写物の変異体は、配列番号１に対して少なくとも７０％の相同率を有し、配列内に配列番号６の１２個の核酸GTTCCCTTTCAGを含む。

別の実施態様では、ＥＲＦＥタンパク質の変異体は、そのアミノ酸配列内に少なくとも配列番号７のアミノ酸配列を含む。

別の実施態様では、ＥＲＦＥタンパク質の変異体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する。

本発明によると、「変異体」（複数形）という用語は、ＥＲＦＥ転写物の全ての変異体、及びＥＲＦＥタンパク質の全ての変異体を示す。

本明細書において使用する、本発明に従って使用される「相同率」という用語は、「同一率」という用語と同じ意味を有する。

本発明の診断法及びモニタリング法
本発明の第二の態様は、患者から得られた試料中の、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血を診断するための方法に関し、ここで、このような変異体の検出は、患者が、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を伴う貧血を患っていることを示す。

本発明者らは、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者において、特定の貧血の処置が使用される場合、変異体（転写物又はタンパク質）の量を有意に改変することができることを示した。変異体の発現のこの改変は、薬物が、骨髄内のＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞に直接的に又は間接的に標的化することを意味する。したがって、ＥＲＦＥ変異体の発現を決定することにより、薬物の作用機序を探索することが可能となる。例えば、レナリドミドのようないくつかの薬物が貧血の処置に使用される場合、該変異体は有意に減少し、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞に標的化され、処置（レナリドミド）は有効である（結果の部を参照）。逆に、ラスパテルセプトのようなＴＧＦ－βファミリーメンバーのリガンドの捕捉剤が貧血の処置に使用される場合、該変異体は有意に減少せず、処置は有効であるが、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞には標的化されない。

換言すれば、ラスパテルセプトのようなターミナルの造血に標的化する薬物が貧血の処置に使用される場合、該変異体は有意に減少せず、処置は有効であるが、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞には標的化されない。

本発明によると、「ターミナルの造血」という用語は、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、及び正染性赤芽球のような、ターミナルの造血の全ての細胞を示す。

したがって、本発明の第三の態様は、患者から得られた試料中の、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、貧血の処置が、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者において、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞に標的化するであろうか否かを示すことを可能とする方法に関し、ここで、このような変異体の検出は、該処置が、クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血に標的化するのに有効か否かを示す。

１つの実施態様では、貧血の処置は、レナリドミドであり得る。

したがって、特定の実施態様では、本発明は、患者から得られた試料中の、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、レナリドミドによる処置が、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者において、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞に標的化するであろうか否かを示すことを可能とする方法に関し、ここで、このような変異体の検出は、該処置が、クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血に標的化するのに有効であることを示す。

本明細書において使用する「クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血」という用語は、クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血を排除／除去する事実を示す。したがって、「該処置は、クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血に標的化するのに有効である」という用語は、該処置が、クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血の排除／除去を可能とすることを示す。したがって、「ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞に標的化されない」という用語は、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞は排除／除去されないことを示す。

本明細書において使用する「前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞」という用語は、造血幹細胞から始まり網状赤血球に至る、全ての造血（赤血球を生じるプロセス）の細胞を示す。この用語は、例えば、骨髄球系共通前駆細胞、巨核球・赤芽球前駆細胞、赤芽球バースト形成細胞、赤芽球コロニー形成細胞、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、及び正染性赤芽球を示す。本発明によると、「クローン性造血」又は「クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血」という用語は、「前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞」と同じ意味を有する。

本明細書において使用する「ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞」は、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する全ての造血の細胞を示す。

本発明の別の態様は、ｉ）患者から得られた試料中における、レナリドミドによる処置の前後における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）レナリドミドによる処置の前後に得られた該発現レベルを比較する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、レナリドミドによる貧血の処置をモニタリングする方法に関し、ここで、レナリドミドによる処置後に得られた該変異体の発現レベルが、処置前に得られた該変異体の発現レベルと比較して減少している場合、このことは、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血が減少し、該患者はレナリドミドによる処置に応答していることを示す。

本発明によると、該変異体がＥＲＦＥ転写物変異体である場合、該試料は特に、骨髄単核細胞であり、該変異体がＦＲＦＥタンパク質変異体である場合、該試料は特に末梢血血清である。

本発明者らはまた、ＥＲＦＥ変異体を、全身の鉄の過剰負荷のバイオマーカーとして使用することができたことを示した。

したがって、本発明の第四の態様は、患者から得られた試料中における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、全身の鉄の過剰負荷を診断するための方法に関し、ここで、このような変異体の検出は、該患者が、全身の鉄の過剰負荷を有することを示す。

別の態様では、本発明は、患者から得られた試料中における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、肝臓及び心臓における実質細胞内の鉄の過剰負荷を予測するための方法に関し、ここで、このような変異体の検出は、該患者が、肝臓及び心臓の実質細胞内の鉄の過剰負荷の素因を有するであろうことを示す。

本発明によると、「全身の鉄の過剰負荷」という用語はまた、高フェリチン血症も示す。

本発明の別の態様は、ｉ）患者から得られた試料中における、処置の前後における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）処置の前後に得られた該発現レベルを比較する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、全身の鉄の過剰負荷の処置をモニタリングする方法に関し、ここで、処置後に得られた該変異体の発現レベルが、処置前に得られた該変異体の発現レベルと比較して減少している場合、このことは、該患者が処置に応答していることを示す。

換言すれば、該変異体の発現レベルが減少している場合、鉄の過剰負荷の処置は有効であり、該変異体の発現レベルが減少していないか又は増加している場合、処置は有効ではなく、全身の鉄の過剰負荷は悪化している。

別の態様では、ＥＲＦＥ変異体（ＥＲＦＥ^Ｖと記載）（転写物又はタンパク質）の量（濃度）と、ＥＲＦＥ変異体（ＥＲＦＥ^Ｖと記載）（転写物又はタンパク質）＋野生型ＥＲＦＥ（転写物又はタンパク質、ＥＲＦＥ^ＷＴと記載）の量（濃度）の比を、本発明の方法のために使用することができる（ＥＲＦＥ^Ｖ／ＥＲＦＥ^Ｖ＋ＥＲＦＥ^ＷＴ）。特に、比は、ＥＲＦＥ転写物の変異体を用いて行なわれ、これを使用して貧血の処置をモニタリングする。

本発明の第五の態様は、ｉ）患者から得られた試料中における、処置の前後における、ＥＲＦＥ^Ｖ／ＥＲＦＥ^Ｖ＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比を決定する工程、ｉｉ）処置の前後で得られた該比を比較する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血の処置をモニタリングする方法に関し、ここで、該比が、所定の基準値と比較して減少している場合、患者は、処置に応答しているであろう、それが所定の基準値と比較して不変のままである場合、患者は処置に応答していないであろう。

特定の実施態様では、該試料は、患者の骨髄単核細胞である。

本発明はまた、クローン性造血のバイオマーカーとしてのＥＲＦＥ変異体（転写物変異体又はタンパク質変異体）に関する。

本発明の全ての態様によると、「Ｉ遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍」という用語は、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群、症例の９０％に環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ－ＲＳ）、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する急性骨髄球性白血病（新規又は続発性）、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄増殖性腫瘍、及びＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する混合型の骨髄増殖性腫瘍／骨髄異形成症候群（環状鉄芽球と血小板増加症を伴う貧血、及びその他を含む）を示す。

本明細書において使用され、本発明の全ての態様によるとおり、「試料」という用語は、骨髄単核細胞、骨髄血清、末梢血、単核細胞、末梢血血清、及び末梢血血漿を示す。

本明細書において使用されるように、「患者」という用語は、貧血疾患のために管理されているか、若しくは貧血を発症しやすいか、若しくは鉄の過剰負荷を有している個体、又は、骨髄悪性腫瘍、特に、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を有する患者を指す。

本発明の全ての態様によると、ＥＲＦＥ変異体は、ＥＲＦＥ^＋１２（配列番号２）のようなＥＲＦＥ転写物の変異体、又はＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ（配列番号４）のようなＥＲＦＥタンパク質の変異体であり得る。

本発明の全ての態様によると、本発明に記載の全ての変異体の量（濃度）は、本発明の方法の状況で使用され得る。

本明細書において使用する「ＥＲＦＥ^Ｖ」という用語は、ＥＲＦＥの任意の変異体を示す。該変異体は、ＥＲＦＥの転写物の変異体、又はＥＲＦＥのタンパク質の変異体であり得る。

本明細書において使用する「ＥＲＦＥ^ＷＴ」という用語は、野生型形のＥＲＦＥを示す。

本明細書において使用する「ＥＲＦＥ^＋１２」という用語は、野生型ＥＲＦＥのヌクレオチド配列（配列番号２）と比較して、１２個より多く核酸を含有しているＥＲＦＥ転写物の変異体を示す。

本明細書において使用する「ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ」という用語は、野生型ＥＲＦＥのアミノ酸配列（配列番号４）と比較して、４個より多くアミノ酸を含有しているＥＲＦＥタンパク質の変異体を示す。

本明細書において使用する「ＥＲＦＥ」という用語は、「エリスロフェロン」としても知られているが、これはヘプシジンの作用を阻害し、よってヘモグロビンの合成に利用可能な鉄の量を増加させる、赤芽球によって産生されるタンパク質を指す。該遺伝子の配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１７８７５２の下に見出すことができる。

ＥＲＦＥの核酸配列（配列番号１）：

ＥＲＦＥ^＋１２の核酸配列（配列番号２）

ＥＲＦＥのアミノ酸配列（配列番号３）：

ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱのアミノ酸配列（配列番号４）：

本明細書において使用する「ＳＦ３Ｂ１」という用語は、スプライシング因子３ｂタンパク質複合体のサブユニット１をコードする遺伝子を示す。スプライシング因子３ｂは、スプライシング因子３ａ及び１２Ｓ ＲＮＡユニットと共に、Ｕ２核内低分子リボ核タンパク質複合体（Ｕ２ ｓｎＲＮＰ）を形成する。スプライシング因子３ｂ／３ａ複合体は、配列非依存的に、ｍＲＮＡ前駆体のイントロンの分岐部位の上流に結合し、Ｕ２ ｓｎＲＮＰをｍＲＮＡ前駆体にアンカーし得る。スプライシング因子３ｂは、Ｕ１２型のマイナースプライセオソームの一成分でもある。サブユニット１のカルボキシ末端の３分の２は、２２個の同一ではない直列型のＨＥＡＴリピートを有し、これは棒状のらせん構造を形成している。選択的スプライシングにより、異なるアイソフォームをコードしている複数の転写物変異体が得られる。該遺伝子の配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１１５５２４の下に認められ得る。

本発明によると、ＳＦ３Ｂ１の突然変異は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｅ６２２Ｄ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｙ６２３Ｃ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｒ６２５Ｌ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｒ６２５Ｃ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｒ６２５Ｈ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｎ６２６Ｙ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｎ６２６Ｄ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｈ６６２Ｄ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｈ６６２Ｑ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ６６６Ｍ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ６６６Ｅ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ６６６Ｑ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ６６６Ｎ}、ＳＦＲ３Ｂ１^{Ｋ６６６Ｒ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ６６６Ｔ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｉ７０４Ｎ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｉ７０４Ｆ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７４２Ｄ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｇ７４２Ｄ}、ＳＦ３Ｂ１^{Ｄ７８１Ｇ}及びＳＦ３Ｂ１^{Ｄ７８１Ｅ}であり得る。

本発明によると、本発明による貧血の処置は、組換えエリスロポエチンをはじめとする赤血球造血刺激因子製剤、バイオ後続品、免疫調節性イミド薬（ＩｍｉＤｓ）、例えばレナリドミド、アクチビンＩＩＢ受容体アゴニスト、例えばラスパテルセプト、及び他のＴＧＦ－βファミリーメンバーのリガンドの捕捉剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、プロリンヒドロキシラーゼ阻害剤、脱メチル化剤、例えばアザシチジン、又は低用量の鉄キレート剤のデフェラシロクスであり得る。

本発明によると、鉄の過剰負荷の処置は、鉄キレート剤、例えば、デスフェラール（ＤＣＩ デフェロキサミン）、エクジェイド（ＤＣＩ デフェラシロクス）、フェリプロキス（デフェリプロン）又は他のシデロフォア、例えばデスフェリチオシン、又は他の適応症に使用される可能性がある合成キレート分子、例えば神経変性処置におけるクリオキノール、心臓保護剤であるデクスラゾキサン、抗がん治療薬であるトリアピン、アテローム性動脈硬化症に対する処置であるフロラノール、又は心血管疾患に使用されるフィチン酸であり得る。鉄の過剰負荷の処置のために現在開発中である他の薬物、例えば組換えＢＭＰ６、Ｔｍｐｒｓｓ６に対するＲＮＡｉ、ヘプシジンアゴニスト、例えば小型で薬物のようなヘプシジンアゴニストであるミニヘプシジン、又はヘプシジンの赤芽球由来調節因子であるエリスロフェンを妨害する薬物も使用することができる。

本明細書において使用する「患者から得られた試料中の、ＥＲＦＥの転写物又はタンパク質の変異体の発現を決定する工程」という用語は、様々な技術による、ＥＲＦＥの転写物又はタンパク質の変異体の検出を示す。換言すれば、ＥＲＦＥの転写物又はタンパク質の変異体の簡易検出は少量でさえ、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における貧血の診断又はモニタリングを可能とするだろう。特定の実施態様では、ＥＲＦＥ^＋１２変異体又はＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ変異体の発現（特に発現レベル）を検出することができる。別の特定の実施態様では、ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱの断片、例えば、配列番号７のペプチドVPFQFGLPGPPGPPGPQGPPGPIIPPEALLKを検出することができる。

生物学的試料中のＥＲＦＥタンパク質の変異体（変異体のレベル）を測定するための方法は、ＨＰＬＣ又は他の種類のクロマトグラフィーなどの事前の分画技術を伴うか又は伴わない、質量分析に基づいた定量法、タンパク質マクロアレイ法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）、ルミネックス、エリスポット、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような直接的な方法を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドのレベルを測定するための当業者には周知の多種多様な方法のいずれかによって評価され得る。

前記の直接的な分析は、生物学的試料中に存在するポリペプチドと選択的に相互作用することのできる結合対と、生物学的試料を接触させることによって評価され得る。結合対は、該ポリペプチドに特異的に結合する、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体（例えば、同位体で標識された抗体、元素で標識された抗体、放射能で標識された抗体、発色団で標識された抗体、フルオロフォアで標識された抗体、又は酵素で標識された抗体）、抗体誘導体（例えば、基質との、又は、タンパク質／リガンド対（例えばビオチン－ストレプトアビジン）のタンパク質若しくはタンパク質のリガンドとの抗体コンジュゲート、又は抗体断片（例えば、一本鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）であり得る。いくつかの実施態様では、結合対は、本発明の抗体であり得る。別の実施態様では、結合対は、本発明のアプタマーであり得る。

抗体又はアプタマーなどの本発明の結合対は、同位体、化学元素、蛍光分子、放射性分子、酵素、又は当技術分野において公知である任意の他の標識などの、検出可能な分子又は物質を用いて標識されていてもよい。一般的にシグナルを（直接的に又は間接的にのいずれかで）発生する標識は、当技術分野において公知である。

本明細書において使用する抗体に関する「標識されている」という用語は、抗体又はアプタマーへの、同位体、元素、放射性物質、又はフルオロフォア（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はヨードシアニン（Ｃｙ５））などの検出可能な物質を結合（すなわち物理的に連結）させることによる、抗体又はアプタマーの直接的な標識、並びに、検出可能な物質との反応性による、プローブ又は抗体の間接的な標識を包含することを意味する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野において公知である任意の方法によって、特定の同位体又は放射性分子を用いて生成され得る。例えば、放射性分子としては、シンチグラフィー研究及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用の放射性原子、例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられるがこれらに限定されず、特定の同位体としては、１３Ｃ、１５Ｎ、１２６Ｉ、７９Ｂｒ、８１Ｂｒが挙げられるがこれらに限定されない。

前記のアッセイは一般的に、固相支持体への結合対（すなわち、抗体又はアプタマー）の結合を含む。本発明の実施に使用され得る固相支持体としては、ＥＬＩＳＡプレート、
エリスポットプレート、ビーズ（例えばサイトメトリービーズ、磁気ビーズ）、マイクロアレイ（例えばＳＩＭＳマイクロアレイ）、スライド、又はプレートが挙げられる。該支持体は、例えば、ニトロセルロース（例えばガラス、メンブラン、又はマイクロタイターウェルの形状）；ポリビニルピロリドン（例えばシート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズ又はマイクロタイタープレート）；フッ化ポリビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ、シリコンウエハなどの基質でコーティングされていてもよい。

特定の実施態様では、ＥＬＩＳＡ法を使用することができ、ここで、マイクロタイタープレートのウェルは、該ポリペプチドを認識するワンセットの抗体でコーティングされている。その後、該ポリペプチドを含有しているか又は含有していることが疑われる生物学的試料を、コーティングされたウェルに加える。抗体－抗原複合体の形成を可能とするに十分なインキュベーション期間後、プレート（群）を洗浄して結合していない部分を除去し、検出可能なように標識された二次結合分子を加える。二次結合分子を、任意の捕捉された試料マーカータンパク質と反応させて、プレートを洗浄し、二次結合分子の存在を、当技術分野において周知である方法、例えばシングレックス、クワンテリックスＭＳＤ、バイオスケール、サイトフローメトリーを使用して検出する。

１つの実施態様では、酵素結合免疫スポット（エリスポット）法を使用してもよい。典型的には、生物学的試料を、所望の抗ポリペプチド捕捉抗体でコーティングされたプレートに移す。ビオチニル化二次抗体、及び標準的な比色法又は蛍光測定法、例えばストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ及びＮＢＴ－ＢＣＩＰを用いて顕現させ、スポットを計数した。

１つの実施態様では、複数のポリペプチドレベルの測定が必要とされる場合には、関心対象の結合対を有するビーズの使用が好ましくあり得る。特定の実施態様では、ビーズは、フローサイトメトリーで使用するためのサイトメトリービーズであり得る。このようなビーズは、例えば、ＢＤバイオサイエンシーズ社（サンノゼ、カリフォルニア州）によって市販されているＢＤ（商標）サイトメトリービーズ、又はルミネックス（LUMINEX）（商標）ビーズ、又はエレナ（ERENNA）(商標)（シンギュレックス（SINGULEX）（商標））ビーズに相当し得る。典型的には、サイトメトリービーズが、マルチプレックスビーズアッセイを準備するのに適切であり得る。マルチプレックスビーズアッセイ、例えば、ＢＤ（商標）サイトメトリービーズアレイは、可溶性抗原を捕捉及び定量するのに使用することのできる、一連のスペクトルの明確に異なるビーズである。典型的には、ビーズは、１つ以上のスペクトルの明確に異なる蛍光色素を用いて標識され、検出は、多数の光検出器を使用して行なわれ、それぞれ別個の色素に対して１つのビーズが検出される。識別可能なビーズのセットを作製及び使用する多くの方法が文献に記載されている。これらは、サイズによって識別可能なビーズ（ここで、各々のサイズのビーズは、異なる標的特異的抗体でコーティングされている）（例えば、Fulwyler and McHugh, 1990, Methods in Cell Biology 33:613-629参照）、様々な濃度の２つ以上の蛍光色素を有するビーズ（ここで、ビーズは、蛍光色素のレベルによって同定される）（例えば、欧州特許第０，１２６，４５０号参照）、及び２つの異なる色素を用いて識別可能なように標識されたビーズ（ここで、ビーズは、各々の色素の蛍光強度を別々に測定することによって同定される）（例えば、米国特許第４，４９９，０５２号及び第４，７１７，６５５号参照）を含む。フローサイトメトリーによる複数の抗原の同時分析のための一次元アレイ及び二次元アレイの両方が市販されている。蛍光強度のレベルによって識別可能な単一の色素を有するビーズの一次元アレイの例としては、ＢＤ（商標）サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）（ＢＤバイオサイエンシーズ社、サンノゼ、カリフォルニア州）、及びＣｙｔｏ－Ｐｌｅｘ（商標）フローサイトメトリーミクロスフィア（Duke Scientific社、パロアルト、カリフォルニア州）が挙げられる。蛍光強度（５つのレベル）とサイズ（２つのサイズ）の組合せによって識別可能なビーズの二次元アレイの一例は、QuantumPlex（商標）ミクロスフィア（バングラボラトリーズ社、フィッシャー、インディアナ州）である。別の例は、SIMOA（商標）技術（QUANTERIX（商標））である。２つのそれぞれの色素の蛍光レベルによって識別可能な、２つの色素を有するビーズの二次元アレイの一例は、Fulton et al.（1997, Clinical Chemistry 43(9):1749-1756）に記載されている。ビーズは、当技術分野において公知である任意の蛍光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ＦＬ１）、フィコエリトリン（ＰＥ）（ＦＬ２）、青色レーザーで使用するためのフルオロフォア（例えば、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＰＥ－Ｃｙ７（フィコエリトリン－シアニン７）、ＰＥ－Ｃｙ５（フィコエリトリン－シアニン５）、ＦＬ３、及び、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はシアニン５（Ｃｙ５）、ＦＬ４）、赤色、紫色、又は紫外線レーザーで使用するためのフルオロフォア（例えばパシフィックブルー、パシフィックオレンジ）で標識され得る。別の特定の実施態様では、ビーズは、磁気分離に使用するための磁気ビーズである。磁気ビーズは、当業者には公知である。典型的には、磁気ビーズは好ましくは、金属（例えば鉄、コバルト、及びニッケル）、その合金、及びその酸化物からなる群より選択された磁気材料から作られる。別の特定の実施態様では、ビーズは、色素を有し、磁気を帯びているビーズである。

別の特定の実施態様では、ビーズは、同位体又は（化学）元素で標識され、ビーズは、質量分析における元素分析によって同定される（Ｃｙｔｏｆ）。

１つの実施態様では、タンパク質マイクロアレイ法が使用され得る。典型的には、ポリペプチド（群）に対して指向される少なくとも１つの抗体又はアプタマーが、アレイ（群）、固体表面（群）、又は半固体表面（群）に固定又は移植される。その後、該ポリペプチド（群）を含有しているか又は含有していることが疑われる生物学的試料を、試験される生物学的試料中に天然には含まれていない、少なくとも、１つの同位体又は１つの元素又は反応性タグ又は１つのフルオロフォア又は１つの比色定量用タグを用いて標識する。抗体－抗原複合体の形成を可能とするに十分な、該生物学的試料とアレイとのインキュベーション期間後、次いで、アレイを洗浄し、乾燥させる。結局、該ポリペプチドの定量は、任意の適切なマイクロアレイスキャナー、例えば蛍光スキャナー、比色定量スキャナー、ＳＩＭＳ（二次イオン質量分析）スキャナー、ＭＡＬＤＩスキャナー、電磁気スキャナー、電気化学発光スキャナー、又は該標識の定量を可能とする任意の技術を使用して成し遂げられ得る。別の実施態様では、アレイ上に移植された抗体又はアプタマーが、標識される。

１つの実施態様では、質量分析に基づいた定量法が使用されてもよい。質量分析に基づいた定量法は、標識されたアプローチ又は標識されていないアプローチのいずれかを使用して実施され得る［DeSouza and Siu, 2012］。質量分析に基づいた定量法は、化学標識、代謝標識、又はタンパク質分解標識を使用して行なわれ得る。質量分析に基づいた定量法は、質量分析のラベルフリー定量、抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）に基づいた定量を使用して行なわれ得、その後、プロファイルアラインメントを行ない、様々なレベルのポリペプチドを決定し得る。

１つの実施態様では、特に有用な質量分析に基づいた定量法は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）、データ非依存性解析（ＤＩＡ）、及び全理論質量スペクトルの逐次窓取得（ＳＷＡＴＨ）［Moving target Zeliadt N 2014 The Scientist;Liebler Zimmerman Biochemistry 2013 targeted quantitation pf proteins by mass spectrometry; Gallien Domon 2015 Detection and quantification of proteins in clinical samples using high resolution mass spectrometry. Methods v81 p15-23 ; Sajic, Liu, Aebersold, 2015 Using data-independent, high-resolution mass spectrometry in protein biomarker research: perspectives and clinical applications. Proteomics Clin Appl v9 p 307-21］などの標的化された質量分析法の使用であり得る。

１つの実施態様では、質量分析に基づいた定量を使用して、ペプチド及び／又はタンパク質のプロファイリングが行なわれ、これは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ；ＣＬＩＮＰＲＯＴ）、及びＭＡＬＤＩバイオタイパー装置［Solassol, Jacot, Lhermitte, Boulle, Maudelonde, Mange 2006 Clinical proteomics and mass spectrometry profiling for cancer detection. Journal: Expert Review of Proteomics V3, I3, p311-320 ; FDA K130831］と共に使用され得る。

１つの実施態様では、本発明のポリペプチドを測定するために特別に設計されたＥＬＩＳＡサンドイッチが使用されてもよい。原理は、Ｃ末端に対する捕捉抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡであり、二次抗体はＮ末端に対するものである。このサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ポリペプチドの濃度が得られる。

特定の実施態様では、変異ＥＲＦＥの産生を評価するために、本発明者らは、ＬＣ ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）を使用した血清用量の設定を開始した。この目的のために、本発明者らは、組換え変異タンパク質ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ（配列番号４）をトリプシンにより消化することによって生成された、特定のＶＰＦＱペプチド（配列番号５）のパラメーターを規定した。その後、本発明者らは、アルブミンをはじめとする大半の豊富なタンパク質の除去後に、血清タンパク質の中からこのペプチドを標的化することができた。

ＥＲＦＥ転写物の変異体の発現（特に発現レベル）の測定は、当技術分野において周知である様々な技術によって行なわれ得る。

典型的には、転写物の発現（特に発現レベル）は、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。ｍＲＮＡの量の決定法は当技術分野において周知である。例えば、試料（例えば、患者から調製された細胞又は組織）中に含有される核酸をまず、標準的な方法、例えば、溶解酵素若しくは化学溶液を使用して抽出するか、又は、製造業者の説明書に従って核酸結合性樹脂によって抽出する。その後、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えば、ノザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（例えば逆転写ＰＣＲ）によって検出される。

他の増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介性増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、及び核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。

少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、そして本明細書の関心対象のｍＲＮＡに対して配列相補性又は相同性を示す、核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして有用性を見出す。このような核酸は同一である必要はないが、典型的には同等なサイズの相同領域に対して少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０～９５％同一であることが理解される。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを検出するための、検出可能な標識などの、適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利であろう。

典型的には、核酸プローブは、例えば、開示されたプローブを使用した標的核酸分子の検出を可能とする、１つ以上の標識を含む。インサイチュハイブリダイゼーション手順などの様々な適用において、核酸プローブは、標識（例えば検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、試料中のプローブ（特に結合した又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を示す、検出可能なシグナルを発生させるために使用され得る、分子又は物質である。したがって、標識された核酸分子は、試料中の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）（これに、標識された独特で特異的な核酸分子が結合するか又はハイブリダイズする）の存在又は濃度の指標を与える。１つ以上の核酸分子と会合した標識（例えば、開示された方法によって生成されたプローブ）は、直接的に又は間接的にのいずれかで検出され得る。標識は、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視光線周波数、及び紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出、及び／又は散乱を含む、任意の公知の機序又はまだ発見されていない機序によって検出され得る。検出可能な標識としては、着色した、蛍光の、リン光の、及び発光している分子及び材料、ある物質を別の物質へと変換して（例えば、無色物質を着色物質へと変換若しくはその逆によって、又は沈降物を生成するか若しくは試料の濁度を増加させることによって）検出可能な差を与える触媒（例えば酵素）、抗体の結合する相互作用によって検出され得るハプテン、並びに常磁性及び磁性の分子又は材料が挙げられる。

検出可能な標識の特定の例としては、蛍光分子（又は蛍光色素）が挙げられる。数多くの蛍光色素が当業者には公知であり、例えば、ライフテクノロジーズ社（以前はインビトロジェン社）から選択され得る。例えば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies参照。核酸分子（例えば独特で特異的な結合領域）に付着（例えば化学的にコンジュゲート）することのできる特定のフルオロフォアの例、例えば、４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、アクリジン、及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４－アミノ－Ｎ－［３－（ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド－３，５－ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ（アミノメチルクマリン）、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６－ジアミニジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’ジブロモピロガロール－スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’－ジイソチオシアナトジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルフォルリック酸；５－［ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４－（４'－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２－イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ Ｑ（ＲＩＴＣ）；２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（オレゴングリーン（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローサニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリトリン；ｏ－フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、酪酸ピレン、及びスクシンイミジル１－ピレン酪酸；リアクティブレッド４（シバクロンブリリアントレッド３Ｂ－Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体が、Nazarenko et al.の米国特許第５，８６６，３６６号に提供されている。他の適切なフルオロフォアとしては、約６１７nmで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）並びに、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、リサミン（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７－ジクロロローダミン及びキサンテン（Lee et al.の米国特許第５，８００，９９６号に記載のような）及びその誘導体が挙げられる。当業者に公知である他のフルオロフォアも使用することができ、例えば、ライフテクノロジーズ社（インビトロジェン社；モレキュラープローブ（ユージーン、オレゴン州））から入手可能なもの、及び、例えば、ALEXA FLUOR（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、第６，１３０，１０１号、及び第６，７１６，９７９号に記載のような）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの色素（例えば米国特許第４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、第５，３３８，８５４号、第５，４５１，６６３号及び第５，４３３，８９６号に記載のような、ジピロメテンボロンジフルオリド色素）、カスケードブルー（米国特許第５，１３２，４３２号に記載のスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）、及びマリンブルー（米国特許第５，８３０，９１２号）である。

上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、蛍光ナノ粒子、例えば半導体ナノ結晶、例えばQUANTUM DOT（例えば、ライフテクノロジーズ社（QuantumDot社、インビトロジェンナノクリスタルテクノロジーズ社、ユージーン、オレゴン州から得られる；また米国特許第６，８１５，０６４号；第６，６８２，５９６号；及び第６，６４９，１３８号も参照）であり得る。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性の光学的及び／又は電気的特性を有する、微細粒子である。半導体ナノ結晶に、一次エネルギー源を照射すると、半導体ナノ結晶に使用される半導体材料のバンドギャップに相当する周波数の二次エネルギーの放出が起こる。この放出は、特定の波長の色の付いた光又は蛍光として検出され得る。様々なスペクトル特徴を有する半導体ナノ結晶が、例えば、米国特許第６，６０２，６７１号に記載されている。半導体ナノ結晶を、例えば、Bruchez et al., Science 281 :20132016, 1998; Chan et al., Science 281:2016-2018, 1998；及び米国特許第６，２７４，３２３号に記載の技術によって、様々な生物学的分子（ｄＮＴＰ及び／又は核酸を含む）又は基質に結合させることができる。様々な組成物の半導体ナノ結晶の形成が、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；第６，９１４，２５６号；第６，８５５，２０２号；第６，７０９，９２９号；第６，６８９，３３８号；第６，５００，６２２号；第６，３０６，７３６号；第６，２２５，１９８号；第６，２０７，３９２号；第６，１１４，０３８号；第６，０４８，６１６号；第５，９９０，４７９号；第５，６９０，８０７号；第５，５７1，０１８号；第５，５０５，９２８号；第５，２６２，３５７号、及び米国特許出願公開公報第２００３/０１６５９５１号、並びに、ＰＣＴ公開公報第９９/２６２９９号（１９９９年５月２７日に発行）に開示されている。それらの異なるスペクトル特徴に基づいて識別可能である、別の半導体ナノ結晶の集団を生成することができる。例えば、それらの組成、サイズ、又はサイズと組成に基づいて異なる色の光を放出する、半導体ナノ結晶を生成することができる。例えば、本明細書に開示されたプローブにおける蛍光標識として適切である、サイズに基づいて異なる波長の光（５６５nm、６５５nm、７０５nm、又は８００nm発光波長）を放出する量子ドットは、ライフテクノロジーズ社（カールズバッド、カリフォルニア州）から入手可能である。

追加の標識としては、例えば、放射性同位体（例えば３Ｈ）、金属キレート、例えばＧｄ３＋などの放射性又は常磁性の金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレート、並びにリポソームが挙げられる。

核酸分子と共に使用され得る検出可能な標識としては、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、又はβ－ラクタマーゼも挙げられる。

あるいは、酵素が、金属組織学的検出スキームに使用され得る。例えば、銀インサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイズしたゲノム標的核酸配列の同定及び場所特定のための金属組織学的検出スキームを含む。金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン及び酸化還元不活性な酵素の基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することを含む。基質は、酵素によって酸化還元活性剤へと変換され、酸化還元活性剤は金属イオンを還元し、それが検出可能な沈降物を形成することを引き起こす。（例えば、米国特許出願公開公報第２００５/０１００９７６号、ＰＣＲ公開公報第２００５/００３７７７号及び米国特許出願公開公報第２００４/０２６５９２２号を参照）。金属組織学的検出法はまた、水溶性金属イオン、酸化剤、及び還元剤と共に酸化還元酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を使用して、ここでもまた、検出可能な沈降物を形成することを含む（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号参照）。

開示された方法を使用して作製されたプローブは、核酸の検出のために、例えばインサイチュハイブリダイゼーション手順（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色性インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び銀インサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などに使用され得る。

インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、中期又は間期の染色体の調製物（例えばスライド上に載せられた細胞又は組織の試料）の状況の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）を含有している試料を、標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）に特異的にハイブリダイズ可能であるか又は特異的である標識されたプローブと接触させる工程を含む。スライドを場合により前処理して、例えば、パラフィン又は均一なハイブリダイゼーションを妨害する可能性のある他の物質を除去する。試料及びプローブを両方共に例えば加熱によって処理して、二本鎖核酸を変性させる。プローブ（適切なハイブリダイゼーション緩衝液中で調合）及び試料を、ハイブリダイゼーションが起こる（典型的には平衡に達する）ことの可能な条件下及び十分な時間かけて合わせる。染色体の調製物を洗浄して過剰なプローブを除去し、染色体の標的の特異的な標識の検出が、標準的な技術を使用して行なわれる。

例えば、ビオチニル化プローブを、フルオレセインで標識されたアビジン又はアビジン－アルカリホスファターゼを使用して検出することができる。蛍光色素の検出では、蛍光色素を直接検出しても、又は、試料を、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートさせたアビジンと共にインキュベートしてもよい。ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要であれば、ビオチンにコンジュゲートさせたヤギ抗アビジン抗体とのインキュベーション、洗浄、及びＦＩＴＣにコンジュゲートさせたアビジンとの２回目のインキュベーションによって行なわれ得る。酵素活性による検出では、試料を、例えば、ストレプトアビジンと共にインキュベートし、洗浄し、ビオチンにコンジュゲートさせたアルカリホスファターゼと共にインキュベートし、再度洗浄し、（例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）緩衝液中で）事前に平衡化させ得る。インサイチュハイブリダイゼーション手順の一般的な説明については、例えば、米国特許第４，８８８，２７８号を参照されたい。

ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのための数多くの手順が、当技術分野において公知である。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号；第５，４７２，８４２号；及び第５，４２７，９３２号；並びに、例えば、Pir1kel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988；並びにLichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988に記載されている。ＣＩＳＨは、例えば、Tanner et al., Am. .1. Pathol. 157:1467-1472, 2000及び米国特許第６，９４２，９７０号に記載されている。追加の検出法は、米国特許第６，２８０，９２９号に提供されている。

数多くの試薬及び検出スキームを、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨ手順と併用して使用することにより、感度、解像度、又は他の所望の特性を改善することができる。上記に検討されているように、フルオロフォア（蛍光色素及びQUANTUM DOTS（登録商標）を含む）で標識されたプローブを、ＦＩＳＨを実施する場合には直接光学的に検出することができる。あるいは、プローブを、ハプテンなどの非蛍光分子（例えば、以下の非限定的な例：ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、及び様々なオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物、及びその組合せ）、リガンド、又は他の間接的に検出可能な部分を用いて標識してもよい。このような非蛍光分子で標識されたプローブ（及びそれらが結合する標的核酸配列）はその後、試料（例えば、プローブが結合する細胞又は組織の試料）を、標識された検出用試薬、例えば選択されたハプテン又はリガンドに特異的な抗体（又は受容体、又は他の特異的な結合対）と接触させることによって検出され得る。検出用試薬は、フルオロフォア（例えばQUANTUM DOTS（登録商標））を用いて若しくは別の間接的に検出可能な部分を用いて標識されていても、又は、フルオロフォアで標識され得る１つ以上の追加の特異的な結合物質（例えば、二次抗体又は特異的な抗体）と接触させてもよい。

他の例では、プローブ、又は特異的な結合物質（例えば抗体、例えば一次抗体、受容体、又は他の結合物質）を、蛍光発生組成物又は発色性組成物を検出可能な蛍光シグナル、着色シグナル、又は別の方法で検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおける検出可能な金属粒子の沈着のような）へと変換することのできる酵素で標識する。上記に示されているように、酵素は、関連するプローブ又は検出用試薬に直接付着していても、又はリンカーを介して間接的に付着していてもよい。適切な試薬（例えば結合試薬）及び化学物質（例えばリンカー及び付着用化学物質）の例は、米国特許出願公開公報第２００６／０２４６５２４号；第２００６／０２４６５２３号及び第２００７／０１１７１５３号に記載されている。

標識されたプローブ－特異的な結合物質の対を適切に選択することによって、多重検出スキームを作成し、１回のアッセイ（例えば、単一の細胞若しくは組織の試料上、又は１つを超える細胞若しくは組織の試料上）で複数の標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）の検出を容易にすることができることが当業者によって理解されるだろう。例えば、第一の標的配列に相当する第一のプローブを、ビオチンなどの第一のハプテンで標識することができ、一方、第二の標的配列に相当する第二のプローブは、ジニトロフェノールなどの第二のハプテンで標識することができる。プローブに試料を曝した後、試料を、第一の特異的な結合物質（この場合、第一のフルオロフォアで標識されたアビジン、例えば、５８５nmで発光する、例えば、第一のスペクトルの明確に異なるQUANTUM DOTS（登録商標））、及び第二の特異的な結合物質（この場合、第二のフルオロフォア（例えば、７０５nmで発光する、例えば第二のスペクトルの明確に異なるQUANTUM DOTS（登録商標））で標識された、抗ＤＮＰ抗体又は抗体断片）と接触させることによって、結合したプローブを検出することができる。さらなるプローブ／結合剤の対を、他のスペクトルの明確に異なるフルオロフォアを使用して多重検出スキームに加えることができる。直接的及び間接的な数多くの変法（１工程、２工程、又はそれ以上）を想定することができ、これら全てが、開示されたプローブ及びアッセイの状況において適切である。

プローブは典型的には、１０～１０００、例えば１０～８００、より好ましくは１５～７００、典型的には２０～５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは典型的には、増幅しようとする関心対象の核酸と完全に又はほぼ完全に一致するように設計された、１０～２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、それらは好ましくは、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下（最も高い融点Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＳＣに相当する。ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でハイブリダイズする。

上記の増幅法及び検出法に使用された核酸プライマー又はプローブは、キットとして構築され得る。このようなキットは、共通プライマー及び分子プローブを含む。好ましいキットはまた、増幅が起こったかどうかを決定するのに必要とされる成分も含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素；正の制御配列、反応制御プライマー；並びに、特異的な配列を増幅及び検出するための説明書も含み得る。

特定の実施態様では、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出された全ＲＮＡを準備する工程、及び、より特定すると定量又は半定量逆転写ＰＣＲを用いてＲＮＡを増幅及び特異的なプローブに対するハイブリダイゼーションにかける工程を含む。

別の好ましい実施態様では、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラス、又はマイクロスフィアのサイズのビーズであり得る、基材に化学的に付着させた様々な核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ、又はシリカをベースとした材料、炭素、金属、無機ガラス、又はニトロセルロースからなり得る。プローブは、核酸、例えばｃＤＮＡ又は約１０～約６０塩基対であり得るオリゴヌクレオチドを含む。発現レベルを決定するために、場合によりまず逆転写にかけた試験被験者の試料を標識し、そして、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に付着させたプローブ配列に対して相補的である標的核酸との間で複合体を形成するに至る。次いで、標識されたハイブリダイズした複合体を検出し、定量又は半定量することができる。標識は、様々な方法によって、例えば放射能標識又は蛍光標識を使用することによって成し遂げることができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変法が、当業者には利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210による総説を参照）。

別の実施態様では、発現レベルは、代謝イメージングによって決定される（例えば、Yamashita T et al., Hepatology 2014, 60:1674-1685又はUeno A et al., Journal of hepatology 2014, 61:1080-1087参照）。

本発明の全ての方法によると、ＥＲＦＥ転写物の変異体の検出は、キャピラリー電気泳動によって分析される、特異的逆転写定量ＰＣＲ又は蛍光ＰＣＲによって行なわれ得、ＥＲＦＥタンパク質の変異体の検出は、ペプチドＶＰＦＱ（配列番号５）のみの検出又は配列番号３のＥＲＦＥタンパク質の検出（配列番号４のＥＦＲＥ^ＶＰＦＱタンパク質又は配列番号７のペプチドの検出のように）によって行なわれ得る。

比較のために使用される所定の基準値は、本明細書に記載のように決定され得る、「カットオフ値」又は「閾値」の数値を含み得る。転写物／タンパク質の発現のための各基準値（「カットオフ値））は、
ａ）ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍、又はＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を伴う貧血を患っている患者の試料の収集物を（例えば、これらの疾患の診断後に）準備する工程；
ｂ）工程ａ）で準備された収集物に含まれる各試料についての変異体（転写物又はタンパク質）の発現レベルを決定する工程；
ｃ）該変異体の該発現レベルに従って組織試料を順位付け、閾値を決定する工程（閾値を超えれば、発現レベルは「高い」と言われ、閾値より低ければ、発現レベルは「低い」と言われる）；
ｄ）該変異体についてのｃＤＮＡ又はタンパク質の既知の投入量を使用して検量曲線を作成することによってなされるものである、閾値／カットオフ値／基準値に相当する該遺伝子のコピー数を決定することによって、閾値／カットオフ値／基準値を定量的に定める工程；
ｅ）該試料を、それらの発現レベルに従って順位付けされたそれぞれ数の増加しているメンバー、数の減少しているメンバーの部分集合対に分類する工程；
ｆ）工程ａ）で準備された各試料について、対応するがん患者についての実際の臨床転帰に関連した情報（すなわち、診断、処置に対する応答）を提供する工程；
ｇ）試料の各部分集合対について、診断／反応曲線のカプランマイヤー率を得る工程；
ｈ）試料の各部分集合対について、両方の部分集合間の統計学的有意性（ｐ値）を計算する工程；
ｉ）発現レベルについての基準値として、ｐ値が最小である発現レベルの数値を選択する工程
を含む方法を実施することによって予め決定され得る。

例えば、１００人の患者の１００個の試料についての変異体（転写物又はタンパク質）の発現レベルを評価した。１００個の試料を、それらの発現レベルに従って順位付けする。試料１は最高の発現レベルを有し、試料１００は最低の発現レベルを有する。最初のグループ分けは２つの部分集合を与える：片方の側には試料番号１、他方の側には９９個の他の試料。次のグループ分けは片方の側に試料１及び２、他方の側に９８個の残りの試料を与えるなど、最後のグループ分けまで続く：片方の側には試料１～９９、他方の側では試料番号１００である。対応する患者についての実際の臨床転帰に関する情報に従って、２つの部分集合の９９個のグループのそれぞれについてカプランマイヤー曲線を作成する。また、９９個のグループのそれぞれについて、両方の部分集合間のｐ値を計算した。

最小ｐ値の基準に基づいた識別が最強となるように基準値を選択する。換言すれば、ｐ値が最小である両方の部分集合間の境界に対応する発現レベルを、基準値と考える。基準値は、発現レベルの中央値では必ずしもないことを注記すべきである。

日常の研究では、基準値（カットオフ値）は、本発明の方法において、試料、及びそれ故に対応する患者を識別するために使用され得る。

時間の関数としてのカプランマイヤー生存率曲線が、処置後の一定の時間におよび生存している患者の割合を測定するためによく使用され、これは当業者には周知である。

当業者はまた、変異体（転写物又はタンパク質）の発現レベルの同じ評価技術が勿論、基準値を得るために、その後、本発明の方法にかけられる患者の遺伝子の発現レベルの評価のために使用されるべきであることを理解している。

このような予め決められた発現レベルの基準値は、上記に定義された任意の変異体について決定され得る。

別の特定の実施態様では、結果を患者に伝達する工程が、本発明の全ての方法に加えられてもよい。結果は、貧血若しくは全身の鉄の過剰負荷の診断に関する結果、又は、貧血及び全身の鉄の過剰負荷をモニタリングした結果であり得る。

別の実施態様では、本発明は、上記に列挙されているような転写物変異体又はタンパク質変異体の検出を可能とする技術による、骨髄悪性腫瘍を患っている患者の試料中における、ＥＲＦＥ転写物変異体又はＥＲＦＥタンパク質変異体を検出するための方法に関する。

別の態様では、本発明は、ＥＲＦＥ転写物変異体又はＥＲＦＥタンパク質変異体を検出するための及び／又は生物学的試料中のその量を評価するための方法に関する。

別の実施態様では、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内の少なくとも１つの突然変異を伴う貧血、又は全身の鉄の過剰負荷の診断が、本発明の方法に従って行われる場合、あるいは、本発明の方法による貧血又は全身の鉄の過剰負荷のモニタリングにより、処置が奏功していないことが判明した場合、新規処置を患者に投与して、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内の少なくとも１つの突然変異を伴う貧血を処置、又は全身の鉄の過剰負荷を処置することができる。このような処置は、上記の説明の中に列挙されている。

したがって、本発明はまた、上記に列挙されているような貧血又は鉄の過剰負荷の処置を患者に投与する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内の少なくとも１つの突然変異を有し、及びＳＦ３Ｂ１遺伝子内の少なくとも１つの突然変異を伴う貧血又は全身の鉄の過剰負荷を有すると診断された患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置法にも関する。

治療法
上昇したレベルのＥＲＦＥは、ＳＦ３Ｂ１の突然変異したＭＤＳにおけるあらゆる輸血に先行する高フェリチン血症を説明することを考えると、ＥＲＦＥレベルを減少させることは、高フェリチン血症の程度を低減させ、鉄の過剰負荷及び毒性を予防するための治療選択肢であり得る。野生型及び変異体の両方のＥＲＦＥタンパク質が産生されるので、異常な変異体アイソフォームの標的化は、正常なアイソフォームによるヘプシジン及び日常的な鉄の代謝の調節を止めることなく、ＥＲＦＥの量を低減させる目的に適う。

この目的のために、本発明者らは、２種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した：Exiqon社（キアゲン社）のロックド核酸－アンチセンスオリゴヌクレオチド及びGeneTools社のモルホリノ－アンチセンスオリゴヌクレオチド。ＥＲＦＥ^＋１２に対するそれらの特異性及び抑制効力が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してＳＦ３Ｂ１突然変異を発現するように工学操作されたヒト細胞株において試験されている。

したがって、本発明はまた、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置に使用するための、ＥＲＦＥの転写物又はタンパク質の変異体の阻害剤に関する。

したがって、本発明はまた、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置に使用するための、ＥＲＦＥの転写物の変異体を認識又は標的化する、単離されているか、合成であるか、又は組換えのオリゴヌクレオチドに関する。

特定の実施態様では、単離されているか、合成であるか、又は組換えのオリゴヌクレオチドを使用して、ＥＲＦＥ転写物の発現レベル、続いてタンパク質の発現レベルを減少させることにより、ヘプシジンの抑制を低減し、循環中の血漿中鉄レベルを制限し、続発性ヘモクロマトーシスのリスクを低減させることができる。

「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、その通常の転写方向と比べて逆方向であり、よって、宿主細胞内で発現される標的遺伝子ｍＲＮＡ分子に対して相補的である（例えば、それは、ワトソンクリック塩基対形成を通して、標的遺伝子ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる）ＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列に相当する、オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンス鎖は、多くの異なる方法で構築されてもよく、ただし、それは標的遺伝子の発現を妨害することができる。例えば、アンチセンス鎖は、その通常の転写方向と比べて標的遺伝子のコード領域（又はその一部）を逆方向に補完することによって構築されることにより、その相補体の転写が可能となり得る（例えば、アンチセンス遺伝子及びセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡは、相補的であり得る）。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子と同じイントロン又はエキソンのパターンを有する必要はなく、標的遺伝子のノンコーディングセグメントは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの、アンチセンスによる標的遺伝子の発現の抑制の達成において、コーディングセグメントと同等に有効であり得る。いくつかの実施態様では、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などのオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子と同じエキソンパターンを有する。

本発明によると、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＲＦＥ変異体をコードしているｍＲＮＡに標的化し、細胞内のＥＲＦＥ変異体の量を減少させることができる。本明細書において使用するｍＲＮＡに「標的化する」オリゴヌクレオチドは、該ｍＲＮＡに特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドを指す。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該ｍＲＮＡの配列の一領域に対して少なくとも部分的に相補的である、特に完全に相補的である配列を含み、該相補性は、細胞内条件下で特異的な結合を生じるのに十分である。当業者にはすぐに明らかであるように、第二の配列に対して「完全に相補的」である配列によって、ＤＮＡ分子の形状又はＲＮＡ分子の形状のいずれかの下で、第二の配列の逆方向の相補体である対応物を意味する。配列は、１つ以上のミスマッチが存在する場合には、第二の配列に対して「部分的に相補的」である。ＥＲＦＥの変異体をコードしているｍＲＮＡに標的化する、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば生物情報学的ツールを使用して、基本として該ｍＲＮＡの配列を使用することによって設計され得る。例えば、配列番号２の配列（ＥＲＦＥの遺伝子変異体の配列）が、ＥＲＦＥの変異体をコードしているｍＲＮＡに標的化する、核酸を設計するための基本として使用され得る。特に、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内のＥＲＦＥの変異体の量を低減させることができる。オリゴヌクレオチドが細胞内のＥＲＦＥ変異体の量を低減させることができるかどうかを決定するための方法は、当業者には公知である。これは、例えば、逆転写定量ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーションなどによるＥＲＦＥ ＲＮＡの発現の変異体を分析することによって、又は免疫組織化学法、ウェスタンブロットなどによりＥＲＦＥタンパク質変異体の発現を分析することによって、及び試験される予定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下及び非存在下においてＥＲＦＥタンパク質変異体の発現を比較することによって、行なわれ得る。

特定の実施態様では、該オリゴヌクレオチドは、配列番号２の変異体を認識又は標的化する。

特定の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列：AACTGAAAGGGAAC（配列番号８）、AAAGGGAACCTTGGCAGTGAGGACA（配列番号９）、又はACCTTGGCAGTGAGGACATGT（配列番号１０）を有し得る。

特定の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８、９又は１０に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同率を有し得る。

本発明はまた、以下の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドにも関する：AACTGAAAGGGAAC（配列番号８）、AAAGGGAACCTTGGCAGTGAGGACA（配列番号９）又はACCTTGGCAGTGAGGACATGT（配列番号１０）。

特定の実施態様では、エンドヌクレアーゼを使用して、ＥＲＦＥの遺伝子、転写物、又はタンパク質変異体の発現を低減又は消失させることができる。

実際に、ｃＤＮＡの過剰発現又はＲＮＡ干渉によるダウンレギュレーションなどの、より慣用的なアプローチに対する代替選択肢としての、新規な技術は、ゲノムを操作する手段を提供する。実際に、天然の及び工学操作されたヌクレアーゼ酵素は、近年、かなりの注目を集めている。エンドヌクレアーゼに基づいたゲノムの不活化の背後にある機序は、一般的に、ＤＮＡの一本鎖又は二本鎖の切断という第一工程を必要とし、これは次いで、ＤＮＡ修復の２つの明確に異なる細胞性機序をトリガーし得、これをＤＮＡの不活化に活用することができる：誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び高忠実度である相同組換え修復（ＨＤＲ）。

特定の実施態様では、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓである。本明細書において使用する「ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、短い反復塩基配列を含有している原核生物ＤＮＡのセグメントである、関連しているクラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返しを指す。

いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌に由来するＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、米国特許出願第８６９７３５９Ｂ１号及び米国特許出願第２０１４/００６８７９７号に記載されている。元来、原核細胞における獲得免疫系（Barrangou and Marraffini, 2014）であるＣＲＩＳＰＲは、近年、ゲノム編集のための新規で強力なツールへと工学操作されている。それはすでに、ヒト（Mali et al., 2013, Science, Vol. 339 : 823-826）、細菌（Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671）、ゼブラフィッシュ（Hwang et al., 2013, PLoS One, Vol. 8:e68708）、Ｃ．エレガンス（Hai et al., 2014 Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11）、細菌（Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671）、植物（Mali et al., 2013, Science, Vol. 339 : 823-826）、アフリカツメガエル（Xenopus tropicali）（Guo et al., 2014, Development, Vol. 141 : 707-714）、酵母（DiCarlo et al., 2013, Nucleic Acids Res., Vol. 41 : 4336-4343）、ショウジョウバエ（Gratz et al., 2014 Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713）、サル（Niu et al., 2014, Cell, Vol. 156 : 836-843）、ウサギ（Yang et al., 2014, J. Mol. Cell Biol., Vol. 6 : 97-99）、ブタ（Hai et al., 2014, Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11）、ラット（Ma et al., 2014, Cell Res., Vol. 24 : 122-125）及びマウス（Mashiko et al., 2014, Dev. Growth Differ. Vol. 56 : 122-129）をはじめとする、多くの細胞株及び生物における重要な遺伝子を標的化するために成功裡に使用されている。いくつかのグループが、今では、この方法を活用して、単一のガイドＲＮＡを介して、特定の標的遺伝子内に単一の点突然変異（欠失又は挿入）を導入している。一対のガイドＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼを代わりに使用して、大きな欠失、又は逆位若しくは転座などのゲノム再編成を誘導することも可能である。近年の面白い展開は、ｄＣａｓ９バージョンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した、転写の調節、後成的な修飾、及び特定のゲノム遺伝子座の顕微鏡による可視化のための、タンパク質ドメインの標的化である。

いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１であり、これは、Zetsche et al.（“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015); Cell; 163, 1-13）において、つい最近特徴付けられたプレボテラ及びフランシセラ由来のＣＲＩＳＰＲ１（Ｃｐｆ１）である。

特定の実施態様では、本発明は、ＥＲＦＥの遺伝子又は転写物の変異体を認識又は標的化する、単離されているか、合成であるか、又は組換えのオリゴヌクレオチドを、それを必要とする患者に投与することによって、骨髄異形成症候群、環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群、又は貧血を処置するための方法に関する。

別の実施態様では、オリゴヌクレオチドを使用して、ＥＲＦＥ転写物の変異体の出現をもたらす異常なスプライシングを修正することができる。

したがって、本発明はまた、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置における、野生型ＥＲＦＥ遺伝子を認識又は標的化する、単離されているか、合成であるか、又は組換えのオリゴヌクレオチドに関する。

「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、その通常の転写方向と比較して逆方向であり、宿主細胞内で発現される標的遺伝子ｍＲＮＡ分子に対して相補的である（例えば、それは、ワトソンクリック塩基対形成を通して、標的遺伝子ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる）ＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列に相当する、オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンス鎖は、多くの異なる方法で構築されてもよく、これにより、野生型ＥＲＦＥ転写物及びタンパク質のレベルを増加させ得るか、又は、スプライシング調節によって、完全に機能的な若しくは部分的に機能的なタンパク質をコードしている野生型ＥＲＦＥ転写物の転写を回復させ得る。例えば、アンチセンス鎖は、その通常の転写方向と比べて標的遺伝子のコード領域（又はその一部）を逆方向に補完することによって構築され得る（例えば、アンチセンス遺伝子及びセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡは、相補的であり得る）。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、標的遺伝子及び標的遺伝子のノンコーディングセグメントと同じイントロン又はエキソンのパターンを有する必要はない。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的部位ブロッカー（ＴＳＢ）（例えばｍｉＲＮＡ結合ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＭＢＢＯ））又はスプライシングブロッカーオリゴヌクレオチド（ＳＢＯ）である。

本発明によると、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型ＥＲＦＥをコードしているｍＲＮＡに標的化し、野生型ＥＲＦＥの転写物及びタンパク質のレベルを増加させることができるか、又はスプライシング調節によって、細胞内の完全に機能しているか若しくは部分的に機能しているタンパク質をコードしている野生型ＥＲＦＥ転写物の転写を回復させることができる。本明細書において使用するｍＲＮＡに「標的化」するオリゴヌクレオチドは、該ｍＲＮＡに特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドを指す。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該ｍＲＮＡの配列の一領域に対して少なくとも部分的に相補的である、特に完全に相補的である配列を含み、該相補性は、細胞内条件下で特異的な結合を生じるのに十分である。当業者にはすぐに明らかであるように、第二の配列に対して「完全に相補的」である配列によって、ＤＮＡ分子の形状又はＲＮＡ分子の形状のいずれかの下で、第二の配列の逆方向の相補体である対応物を意味する。配列は、１つ以上のミスマッチが存在する場合には、第二の配列に対して「部分的に相補的」である。野生型ＥＲＦＥをコードしているｍＲＮＡに標的化する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば生物情報学的ツールを使用して、基本として該ｍＲＮＡの配列を使用することによって設計され得る。例えば、配列番号１の配列が、野生型ＥＲＦＥをコードしているｍＲＮＡに標的化する核酸を設計するための基本として使用され得る。特に、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型ＥＲＦＥの量を増加させることができる。オリゴヌクレオチドが細胞内の野生型ＥＲＦＥの量を増加させることができるかどうかを決定するための方法は、当業者には公知である。これは、例えば、ＰＣＲ、逆転写定量ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーションなどによる野生型ＥＲＦＥ転写物の発現を分析することによって、又は免疫組織化学法、ウェスタンブロットなどにより野生型ＥＲＦＥタンパク質の発現を分析することによって、及び試験される予定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下及び非存在下において野生型ＥＲＦＥ転写物の発現又は野生型ＥＲＦＥタンパク質の発現を比較することによって、行なわれ得る。

本発明はまた、ＥＲＦＥの転写物の変異体に特異的に結合するプライマーに関する。特に、該プライマーは配列番号２の変異体に結合する。

特定の実施態様では、本発明は、配列番号６の核酸配列を含む、ＥＲＦＥ転写物の変異体に特異的に結合するプライマーに関する。

本発明によると、本発明の任意のプライマーを使用して、ＰＣＲのようなこのようなツールを使用した技術において、ＥＲＦＥ転写物の変異体を増幅するだろう。

特定の実施態様では、ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱのようなＥＲＦＥタンパク質の変異体に対する抗体を、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置のために使用することができる。

本発明によると、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において同等に使用されるだろう。本明細書において使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有している分子を指す。したがって、抗体という用語は、完全な抗体分子だけでなく、抗体断片並びに抗体及び抗体の断片の変異体（誘導体を含む）も包含する。天然抗体では、２本の重鎖が互いにジスルフィド結合によって連結し、各々の重鎖は、ジスルフィド結合によって軽鎖に連結している。ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）という２種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する、５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は、明確に異なる配列ドメインを含有している。軽鎖は２つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、まとめてＣＨと称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域は、抗原に対する結合の認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体との結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖と１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存する。抗体結合部位は、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に主に由来する、残基からなる。時に、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が、全体のドメイン構造、従って結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に規定する、アミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ＶＬ－ＣＤＲ３、及びＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３とそれぞれ称される、３つのＣＤＲを有する。それ故、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖の可変領域の各々に由来するＣＤＲセットを含んでいる、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。

ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱのようなＥＲＦＥタンパク質の変異体に対する抗体は、適切な抗原又はエピトープを、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びとりわけマウスから選択された宿主動物に投与することによって、既知の方法に従って生じさせることができる。当技術分野において公知である様々なアジュバントを使用して、抗体の産生を増強させることができる。本発明の実施に有用な抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクロ―ナル抗体が好ましい。ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱのようなＥＲＦＥタンパク質の変異体に対するモノクロ―ナル抗体は、細胞株の連続培養による抗体分子の産生をもたらす、任意の技術を使用して、調製及び単離され得る。産生及び単離のための技術としては、Kohler and Milstein（1975）によって初めて記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Cote et al., 1983）；及びエプスタインバーウイルス－ハイブリドーマ技術（Cole et al. 1985）が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、一本鎖抗体の作製について記載された技術（例えば米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、抗ＤＨＯＤＨ（ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ）抗体又はＣｈｋ１一本鎖抗体を産生するように適応させることができる。本発明の実施に有用な化合物はまた、Ｆ（ａｂ’）２断片（これは、インタクト抗体分子のペプシンによる消化によって作製され得る）及びＦａｂ断片（これは、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド橋を還元することによって作製され得る）を含むがこれらに限定されない、ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ抗体断片のような、抗ＥＲＦＥタンパク質変異体抗体断片も含む。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築することにより、ＥＲＦＥ^ＶＰＦのようなＥＲＦＥタンパク質変異体に対して望ましい特異性を有する断片の迅速な同定を可能とすることができる。

ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ抗体及びそれに由来する抗体断片のような、ヒト化抗ＥＲＦＥタンパク質変異体抗体及びそれに由来する抗体断片はまた、既知の技術に従って調製されてもよい。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有している、非ヒト（例えばげっ歯類）キメラ抗体の形態である。大半の部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有している、マウス、ラット、ウサギ、又はヒト以外の霊長類などの非ヒト種の超可変領域に由来する残基（ドナー抗体）で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の能力をさらに精巧にするために行なわれる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全部を実質的に含み、超可変ループの全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、フレームワークの全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体はまた場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むだろう。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えば、Winter（米国特許第５，２２５，５３９号）及びBoss（Celltech、米国特許第４，８１６，３９７号）に記載されている。

別の実施態様では、本発明による抗体は、ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱのようなＥＲＦＥのタンパク質変異体に対する単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、軽鎖を天然的に欠失している、ラクダ化哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一の重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨはまた、「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によると、ｓｄＡｂは特に、ラマｓｄＡｂであり得る。「ＶＨＨ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有している、単一の重鎖を指す。「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」という用語は、ＶＨＨの結合親和性及び特異性を規定する、超可変アミノ酸配列を指す。

本発明によるＶＨＨは、日常的な実験を使用して当業者によって容易に調製され得る。ＶＨＨ変異体及びその修飾形は、インビトロにおける成熟などの、当技術分野における任意の公知の技術の下で生成され得る。

ＶＨＨ又はｓｄＡｂは通常、免疫化動物から得られた血液、リンパ節、又は脾臓ｃＤＮＡに由来する可変ドメインレパートリーの、ファージディスプレイベクター、例えばｐＨＥＮ２へのＰＣＲクローニングによって生成される。抗原特異的ＶＨＨは一般的に、固定された抗原、例えば、試験管のプラスチック表面上にコーティングされた抗原、ストレプトアビジンビーズ上に固定されたビオチニル化抗原、又は細胞表面上に発現される膜タンパク質上でファージライブラリーをパンニングすることによって選択される。しかしながら、このようなＶＨＨは、数回の免疫化を受けた動物に由来するＶＨＨよりも、その抗原に対してより低い親和性を示すことが多い。免疫ライブラリーに由来するＶＨＨの高い親和性は、免疫化動物のリンパ器官におけるＢ細胞のクローン性増殖中の変異ＶＨＨの自然淘汰に起因する。非免疫ライブラリーに由来するＶＨＨの親和性はしばしば、インビトロでこの戦略を模倣することによって、すなわち、ＣＤＲ領域の部位特異的突然変異誘発、及び高めたストリンジェンシー条件下（より高い温度、高い又は低い塩濃度、高い又は低いｐＨ、及び低い抗原濃度）における固定された抗原上でのさらに多くの回数のパンニングによって改善され得る。ラクダに由来するＶＨＨは、慣用的な抗体の対応するドメインよりもはるかに高いレベルで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）周辺質において容易に発現され、そこから精製される。ＶＨＨは一般的に、高い溶解度及び安定性を示し、また、酵母、植物、及び哺乳動物細胞において容易に産生され得る。例えば、「Ｈａｍｅｒｓ特許」は、任意の所望の標的に対するＶＨＨを生成するための方法及び技術を記載している（例えば、米国特許第５，８００，９８８号；米国特許第５，８７４，５４１号、及び米国特許第６，０１５，６９５号参照）。「Ｈａｍｅｒｓ特許」はより特定すると、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主（例えば米国特許第６，７６５，０８７号参照）、及びカビ（例えばアスペルギルス又はトリコデルマ）などの下等真核細胞宿主、又は酵母（例えば、サッカロマイセス、クルイベロマイセス、ハンゼヌラ、又はピキア）（例えば米国特許第６，８３８，２５４号参照）における、ＶＨＨの産生を記載している。

１つの実施態様では、本発明による化合物はアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物を代表するクラスの分子である。アプタマーは、実質的にあらゆるクラスの標的分子を高い親和性及び特異性で認識する能力を有する、オリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載のような、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（SELEX））を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリー内の各メンバーは、独特な配列の、最終的に化学修飾された、鎖状オリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、使用、及び利点が、Jayasena S.D., 1999に記載されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択された、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡなどの、プラットフォームタンパク質によって示されるコンフォメーション的に拘束された抗体可変領域からなる（Colas et al., 1996）。

本発明はまた、ＥＲＦＥタンパク質変異体に特異的に結合する抗体にも関する。特に、該抗体は、配列番号４の変異体に結合する。

特定の実施態様では、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、ＥＲＦＥタンパク質変異体に特異的に結合する、抗体に関する。

特定の実施態様では、本発明は、配列番号７のペプチドに特異的に結合する抗体に関する。

特定の実施態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、ＥＲＦＥタンパク質の変異体に特異的に結合する抗体に関する。

治療用組成物
本発明の別の目的は、骨髄悪性腫瘍を患っている患者における貧血及び／又は鉄の過剰負荷の処置に使用するための、本発明によるＥＲＦＥタンパク質の変異体に特異的に結合する抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療用組成物に関する。

本発明の任意の治療剤を、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出可能なマトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療用組成物を形成してもよい。

「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の都合の悪い反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意のタイプの製剤化補助剤を指す。

医薬組成物の剤形、投与経路、用量及び処方計画は、処置される容態、病気の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに自然に依存する。

本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、鼻腔内投与、非経口投与、眼内投与、静脈内投与、筋肉内投与、又は皮下投与用などに製剤化され得る。

好ましくは、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。

投与のために使用される用量は、様々なパラメーターの関数として適応させ得、特に、使用される投与形態、関連する病態、又は代替的には所望の処置期間の関数として適応させ得る。

さらに、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形剤；徐放性カプセル剤が挙げられ；任意の他の剤形も現在使用することができる。

本発明の医薬組成物は、さらなる治療活性薬剤を含んでいてもよい。本発明はまた、本発明に記載の抗体及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとさらなる治療活性薬剤とを含むキットにも関する。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

質量分析によるＥＲＦＥ^ＶＰＦＱペプチドの同定、及び組換え変異ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱタンパク質によるヘプシジンの抑制。ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱは、ヘプシジンの強力な抑制物質である。組換えヒトＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^ＶＰＦＱを、２９３Ｆ細胞において産生した。Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞腫の細胞を、ＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^ＶＰＦＱを過剰発現している２９３Ｆ細胞の上清を用いて１６時間かけて処置した。ＨＡＭＰを逆転写定量ＰＣＲによって定量し、その発現をＨＰＲＴの量に対して正規化した。示されるデータは、４回の独立した実験の平均値±標準誤差であり、非処置（対照）細胞と比較した、処置されたＥＰＦＥにおけるヘプシジンｍＲＮＡの発現の変化倍率を示す。Ｐ値については両側スチューデントｔ検定。 ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者におけるＥＲＦＥの上昇した血漿中濃度。２０人の非献血者の健康な試験志願者、学習コホートを示す９４人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ及び６２人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴを含む１５６人のＭＤＳ患者（Ａ～Ｄ）、及び検証コホートを示す４２人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ及び１３人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴを含む５５人のＭＤＳ患者（Ｅ～Ｈ）から収集された血漿中に投薬を行なった。エリスロフェン（Ａ、Ｅ）、フェリチン（Ｂ、Ｆ）、ヘプシジン（Ｃ、Ｇ）の定量、及びヘプシジン／フェリチンの比（Ｄ、Ｈ）。結果は、中央値±四分位範囲（ＩＱＲ）として表現される。箱ひげ図は、中央値及び第１四分位数及び第３四分位数を示し、ひげは、依然として下四分位点から１．５ＩＱＲ以内にある最低の数値、及び依然として上四分位点から１．５ＩＱＲ以内にある最高の数値を示す。Ｐ値についてはマンホイットニー。 ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者におけるＥＲＦＥの上昇した血漿中濃度。２０人の非献血者の健康な試験志願者、学習コホートを示す９４人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ及び６２人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴを含む１５６人のＭＤＳ患者（Ａ～Ｄ）、及び検証コホートを示す４２人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ及び１３人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴを含む５５人のＭＤＳ患者（Ｅ～Ｈ）から収集された血漿中に投薬を行なった。エリスロフェン（Ａ、Ｅ）、フェリチン（Ｂ、Ｆ）、ヘプシジン（Ｃ、Ｇ）の定量、及びヘプシジン／フェリチンの比（Ｄ、Ｈ）。結果は、中央値±四分位範囲（ＩＱＲ）として表現される。箱ひげ図は、中央値及び第１四分位数及び第３四分位数を示し、ひげは、依然として下四分位点から１．５ＩＱＲ以内にある最低の数値、及び依然として上四分位点から１．５ＩＱＲ以内にある最高の数値を示す。Ｐ値についてはマンホイットニー。 学習コホートの１５６人のＭＤＳ患者の生物学的パラメーター。（Ａ）ＥＲＦＥの濃度による血清中エリスロポエチンレベル。ピアソンの相関検定；Ｐ＝０．４０３。（Ｂ）９４人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴと６１人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴと２０人の健康な非献血者対照との間の可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）レベルの比較。結果は中央値±ＩＱＲとして表現される。Ｐ値についてはマンホイットニー検定。ｎｓ：有意ではない。 学習コホートの１５６人のＭＤＳ患者の生物学的パラメーター。（Ａ）ＥＲＦＥの濃度による血清中エリスロポエチンレベル。ピアソンの相関検定；Ｐ＝０．４０３。（Ｂ）９４人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴと６１人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴと２０人の健康な非献血者対照との間の可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）レベルの比較。結果は中央値±ＩＱＲとして表現される。Ｐ値についてはマンホイットニー検定。ｎｓ：有意ではない。 学習コホートの輸血負荷の少ないＭＤＳ患者の生物学的パラメーター。２５人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者と３６人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴ患者との間の、フェリチン（Ａ）、血漿中鉄（Ｂ）、ヘプシジン／フェリチンの比（Ｃ）、ヘプシジン／血漿中鉄の比（Ｄ）、及びＥＲＦＥ（Ｅ）の比較。結果は、中央値±ＩＱＲとして表現される。Ｐ値についてはマンホイットニー検定。 ＥＲＦＥ^＋１２の発現は、クローン性造血のバイオマーカーである。（Ａ）蛍光ＰＣＲが、ＧＦＭ－ＬｅｎＥｐｏ－０８臨床試験に参加したＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者からの１４個の対になった試料（８人の非応答患者と６人の応答患者）において行なわれた。各カテゴリーの３つの例が示されている。ＥＲＦＥ^＋１２シグナル及びＥＲＦＥ^ＷＴシグナルのピーク高さは、スクリーニング時及び４サイクルの処置後の評価時における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比として統合された。比が示されている。（Ｂ）８人の非応答患者（左）及び６人の応答患者（右）における、スクリーニング時及び４サイクルの処置後の評価時における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比の進展。（Ｃ）８人の応答患者及び６人の非応答患者における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比の変動率（左）。８人中６人の非応答患者及び６人中４人の応答患者について入手可能であったＳＦ３Ｂ１変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の変動率も示されている（右）。結果は、中央値±四分位範囲（第１四分位数及び第３四分位数）として表現される。Ｐ値についてはマンホイットニー検定。 ＥＲＦＥ^＋１２の発現は、クローン性造血のバイオマーカーである。（Ａ）蛍光ＰＣＲが、ＧＦＭ－ＬｅｎＥｐｏ－０８臨床試験に参加したＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者からの１４個の対になった試料（８人の非応答患者と６人の応答患者）において行なわれた。各カテゴリーの３つの例が示されている。ＥＲＦＥ^＋１２シグナル及びＥＲＦＥ^ＷＴシグナルのピーク高さは、スクリーニング時及び４サイクルの処置後の評価時における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比として統合された。比が示されている。（Ｂ）８人の非応答患者（左）及び６人の応答患者（右）における、スクリーニング時及び４サイクルの処置後の評価時における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比の進展。（Ｃ）８人の応答患者及び６人の非応答患者における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比の変動率（左）。８人中６人の非応答患者及び６人中４人の応答患者について入手可能であったＳＦ３Ｂ１変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の変動率も示されている（右）。結果は、中央値±四分位範囲（第１四分位数及び第３四分位数）として表現される。Ｐ値についてはマンホイットニー検定。 ＥＲＦＥ^＋１２の発現は、クローン性造血のバイオマーカーである。（Ａ）蛍光ＰＣＲが、ＧＦＭ－ＬｅｎＥｐｏ－０８臨床試験に参加したＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者からの１４個の対になった試料（８人の非応答患者と６人の応答患者）において行なわれた。各カテゴリーの３つの例が示されている。ＥＲＦＥ^＋１２シグナル及びＥＲＦＥ^ＷＴシグナルのピーク高さは、スクリーニング時及び４サイクルの処置後の評価時における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比として統合された。比が示されている。（Ｂ）８人の非応答患者（左）及び６人の応答患者（右）における、スクリーニング時及び４サイクルの処置後の評価時における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比の進展。（Ｃ）８人の応答患者及び６人の非応答患者における、ＥＲＦＥ^＋１２／ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比の変動率（左）。８人中６人の非応答患者及び６人中４人の応答患者について入手可能であったＳＦ３Ｂ１変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の変動率も示されている（右）。結果は、中央値±四分位範囲（第１四分位数及び第３四分位数）として表現される。Ｐ値についてはマンホイットニー検定。

実施例：
材料及び方法
患者
学習コホートについて、２００８年から２０１７年まで低リスクのＭＤＳ患者（ｎ＝１５６人）を記録した。各患者が施設内治験審査委員会及び倫理審査委員会の推奨に従って生物学的調査についてのインフォームドメインコンセントを提出した後に（施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）番号：IdF X GFM-LenEpo-08 EudraCT 2008-008262-12; IdFII 2010-A00033-36; IdFV 212-A01395-38 EudraCT 2012-002990-7338; OncoCCH 2015-08-11-DC）、骨髄（ＢＭ）穿刺液及び末梢血（ＰＢ）血漿を収集した。検証コホートについては、患者が２０１６年から２０１８年までフランス（５つのセンター；IRB Onco-CCH 2015-08-11DC）及びドイツ（１つのセンター；IRB Ethikkommission an der TU Dresden; EK 115032015）における血漿の収集について同意した後に、低リスクのＭＤＳ患者（ｎ＝５５）を前向きに記録した。１０人の同年齢の対照に由来する骨髄試料、及び２０人の健康な対照に由来する骨髄試料も収集した。骨髄単核細胞を、フィコール勾配で精製した。細胞ペレットを、ＤＮＡ抽出のために処理し、さらにトリゾール（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ州）に入れ、その後、ＲＮＡを抽出した。少ない輸血負荷は、８週間あたり４単位未満の赤血球単位として定義された。

ゲノム研究
骨髄単核細胞を、フィコール勾配で精製し、ＤＮＡ抽出のためにＤＮＡ／ＲＮＡキット（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）を使用して処理した。選択された２６個の遺伝子のパネル（ＡＳＸＬ１、ＣＢＬ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＨＦ６、ＰＴＰＮ１１、ＲＩＴ１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＷＴ１及びＺＲＳＲ２）における突然変異を、次世代シークエンス（ＮＧＳ）アッセイによって、イオンＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ライブイラリーキット２ ３８４（ライフテクノロジーズ社、シカゴ、ＩＬ州）を使用してスクリーニングした。多重ＰＣＲ増幅（２３３プライマー対）を、２×１０ngのゲノムＤＮＡから行なった。増幅後、バーコード及びアダプターをアンプリコンにライゲーションによって付加した。生成物を、ＡＭＰｕｒｅビーズ（ライフテクノロジーズ社）上での選択的精製にかけた。エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）を、ＯｎｅＴｏｕｃｈＶ２（ライフテクノロジーズ社）機器を使用して行なった。シークエンスは、イオンＰＧＭ（商標）（ライフテクノロジーズ社）で３１８Ｖ２チップ（１つのチップあたり１５個の試料）上で行なわれた。全ての試料はまた、ＡＳＸＬ１（例えばｃ.１９３４ｄｕｐＧ；ｐ．Ｇ６４６ＷｆｓＸ１２）及びＳＲＳＦ２の突然変異についてもサンガーシークエンスによってスクリーニングした。ＪＡＫ２、ＮＰＭ１及びＦＬＴ３－ＩＴＤの突然変異も、定量ＰＣＲ及び蛍光ＰＣＲによって調べた。分析のための、ベースコールは、トレントブラウザーソフトウェアによって、追加のプラグインと共に含まれているバリアントコーラー（ライフテクノロジーズ社）を使用して生成された。.bam及び.vcfファイルをさらなる分析のために使用した。.vcfファイルに、Ion reporterソフトウェア（ライフテクノロジーズ社）を用いて注釈を付け、NextGENeソフトウェア（Softgenetics社、ステートカレッジ、ＰＡ州）を使用してインデックスファイルの二回目の分析のために処理した。結果を比較して、さらに検討される異常を選択した。

ＲＮＡシークエンス
ｃＤＮＡ合成を、ＭｕＬＶ逆転写酵素（インビトロジェン社、カールスバッド、ＣＡ州）を用いて実施し、品質制御は、Agilent 2100バイオアナライザ（アジレント社、レ・ジュリス、フランス）で実施された。ライブラリーを、TruSeq Stranded mRNAサンプル調製キット（イルミナ社、サンディエゴ、ＣＡ州）を使用して構築し、１００ｂｐのペアエンドシークエンス戦略を使用して、イルミナ社のHiSeq2500プラットフォームでシークエンスした。平均深度が１億１４００万という網羅的シークエンスカバレッジ及び中央値が１億１２００万というカバレッジに到達した。分析のために、TopHat（バージョン２．０．６）を使用して、ＵＣＳＣゲノムブラウザー（http://genome.ucsc.edu）からダウンロードされたヒトリファレンスゲノムＨｇ１９ＲｅｆＳｅｑ（ＲＮＡ配列、ＧＲＣｈ３７）に対して、リードをアラインした。

ＲＮＡシークエンスの生物情報学的分析
ＦＡＳＴＱファイルを、TopHat（バージョン２．０．６）２８を使用してマッピングし、ＵＣＳＣゲノムブラウザー（http://genome.ucsc.edu）からダウンロードされたヒトリファレンスゲノムＨｇ１９ＲｅｆＳｅｑ（ＲＮＡ配列、ＧＲＣｈ３７）に対して、リードをアラインした。カウント数を、関連する精度の重みを用いて、１００万個あたりのｌｏｇカウント数へと変換するＤＥＳｅｑ２を使用して、リードカウント数の正規化及びグループの比較を実施し、フラグを、Ｒ内のカスタムアルゴリズムを使用してコンピューター計算した（統計的計算についてのＲ計画［http://www.r-project.org/］）。遺伝子の最大８０％が発現されると仮定して、本発明者らは、バックグラウンドとして各試料について２０％の最低のカウント数を選択した。閾値は、バックグラウンドの平均値に対する２つの標準偏差で固定される。正規化されたカウント数が、コンピューター計算された閾値よりも低かった全ての転写物を、各アレイについてのバックグラウンドとして指定した。２つのグループ間の正規化されたカウント数を比較する場合、転写物のカウント数が、少なくとも１つのグループに由来する試料の少なくとも８０％においてバックグランドを上回る場合に、その転写物を分析に含めた。発現変動する転写物を同定するために、本発明者らは、経験的ベイズの推定量を使用した。発現変動の研究のために、Deseq2比較後に得られた結果を、さらなる分析のために選択し、０．０５以下のＰ値、及び１．２、１．５又は２の変化倍率でフィルターにかけた。ＲｅｆＳｅｑ遺伝子記号による、平均化されたＲｅｆＳｅｑのエキソンのロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）値から計算された主成分分析は、Ｒ及びＧＧｐｌｏｔ２パッケージを使用して行なわれた。二変量正規密度は、第一主成分及び第二主成分であるＸ変数及びＹ変数の平均値及び標準偏差の関数である。楕円は、各グループへの二変量正規分布の当てはめからコンピューター計算された。junctions.bed TopHatアウトプットからのスプライスジャンクションについてのリードカウント数が考えられた。差異分析が、ＤＥＳｅｑ２を使用して、ジャンクションリードカウント数に対して実施された（２９）。選択的受容スプライス部位（２つ以上の３０ｓｓがジャンクションを用いて同５０ｓｓへ）及び選択的供与スプライス部位（２つ以上の５０ｓｓがジャンクションを用いて同３０ｓｓへ）のみが、この分析のために考えられた。Alsafadi et alによると、分岐点配列分析の予測及び分析は、オンラインツールであるSVM-BPfinder（http://regulatorygenomics.upf.edu/ Software/SVM_BP/）及びHuman Splicing Finder（http://www.umd.be/HSF/）を用いて行なわれた（１３、５７、５８）。ＳＶＭ＿ＢＰコードを変更して、svm_getfeat.pyにminidist3ss=6を設定することによって、３’スプライス部位からの分岐点の６塩基対が可能となった。

蛍光ＰＣＲ及び定量ＰＣＲ
ＲＮＡを、RNeasy Miniキット（キアゲン社）を使用して抽出し、Maxima First Strand cDNA合成キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いたｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。その後、ｃＤＮＡを、特異的な５’ＦＡＭ正方向プライマー又は５’ＦＡＭ逆方向プライマーを使用して、ＰＣＲ（Phire Hot Start II DNAポリメラーゼ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によって増幅した。最後に、ＤＮＡ断片分析を、キャピラリー電気泳動によって実施した。１μlの希釈されたＰＣＲ産物を、０．２μlのGeneScan 500 ROX色素サイズスタンダード（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及び１８μlのリボヌクレアーゼ非含有水に加えた。ＤＮＡを９５℃で５分間かけて変性させ、４℃で置いた。断片を、３７３０ｘｌＤＮＡアナライザを使用して分離し、データをGeneMapperソフトウェア５（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して分析した。逆転写定量ＰＣＲについての、各ＰＣＲの平均増幅効率は９５％であった。ＭＩＱＥ（定量的リアルタイムＰＣＲ実験の公表に必要な最低限の情報）指針に従い、関心対象の各遺伝子の発現は、２つのハウスキーピング遺伝子であるＢ２Ｍ及びＡＣＴＢの発現に対して正規化された。

トランスフェクション
ＵＴ－７／ＥＰＯ細胞株に、S. Buonamici博士（H3 Biomedicine社、ケンブリッジ、ＭＡ州）によって提供された、合成品で完全長のＳＦ３Ｂ１^ＷＴ又は突然変異体ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ｃＤＮＡを、Ｒ溶液中のAmaxa program T-024（ロンザ社、バーゼル、スイス）を使用してトランスフェクトした。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による同系ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}細胞株及びＳＦ３Ｂ１^ＷＴ細胞株の作製
マウス赤血球細胞株Ｇ１Ｅ－ＥＲ４を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により刺激された相同組換えにより媒介される修復を使用して、同系ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}細胞株及びＳＦ３Ｂ１^ＷＴ細胞株を作製した（５９）。細胞に、Amaxa Nucleofector（商標）２ｂ装置プログラムＡ－０２４及びNucleofectorキットＬ（ロンザ社）を使用して、１：１：１の比のＣａｓ９（参照番号４１８１５、アドジーン社、ケンブリッジ、ＭＡ州）、ｍＳｆ３ｂ１特異的ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡクローニングベクターから構築、参照番号４１８２４、アドジーン社）、及びハイグロマイシン選択カセットをコードしているドナー鋳型をトランスフェクトした。２日後、ハイグロマイシンを８００μg/mLで培養液に７２時間かけて加え、４００μg/mLでさらに７２時間維持した。その後、ハイグロマイシン耐性細胞を、FACS Aria III（ベクトンディッキンソンバイオサイエンシーズ社、フランクリン・レイクス、ＮＪ州）を使用して単一細胞選別を行ない、クローンを３週間後に、ＤＮＡシークエンスによって分析して、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}突然変異の存在を評価した。選択カセットは、フリッパーゼにより媒介される切断によって除去された。ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}及びＳＦ３Ｂ１^ＷＴハイグロマイシン耐性クローンに、フリッパーゼをコードするベクターをトランスフェクトし、単一細胞選別した。カセットの切断されたクローンをＰＣＲによって評価し、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}及びＳＦ３Ｂ１^ＷＴの発現を逆転写ＰＣＲ及びｃＤＮＡサンガーシークエンスによって確認した。

ＥＲＦＥ及びＥＮＯＳＦ１ミニ遺伝子
ＥＲＦＥミニ遺伝子は、本発明者らがイントロン２～３の１００ｂｐ上流及びエキソン３の１００ｂｐ下流にフランキングする選択的３’スプライス部位（ＡＧ'）の中央にＥＲＦＥ配列を挿入した、鎖状化されたｐＥＴ０１エキソントラップベクター（モビテック社、ゲッティンゲン、ドイツ）から合成された。ＥＲＦＥ挿入断片は、２Ｕ/μlのPhusion高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用してＭＯＬＭ－１４細胞のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅され、QIAquick PCR精製キット（キアゲン社）を用いて精製した。本発明者らは、鎖状化ベクターの末端と相同な１６ｂｐを、正方向プライマー及び逆方向プライマーの５'末端に導入した。In-Fusion HDクローニングキット（クロンテック社、マウンテンビュー、ＣＡ州）を使用して、本発明者らは、機能的なスプライス供与部位を含有している、エキソントラップベクターのＸｈｏＩ制限酵素部位とＸｂａＩ制限酵素部位の間に、精製されたアンプリコンをクローニングした。検証されたＥＮＯＳＦ１ミニ遺伝子を、対照として使用した（１３）。Ｇ１Ｅ－ＥＲ４ ９．２細胞（ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ）及びＧ１Ｅ－ＥＲ４ ５．１３Ｈ細胞（ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}）に、電気穿孔法（Amaxa Nucleofector（商標）２ｂ、ロンザ社）によって、Ｌ溶液中の４００ngのＥＲＦＥ又はＥＮＯＳＦ１ミニ遺伝子をトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを、RNeasyミニキット（キアゲン社）を用いて抽出し、蛍光ＰＣＲのために処理した。

一次細胞培養
赤血球及び顆粒球の増殖のために、ＣＤ３４^＋細胞を、MidiMacsシステム（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を使用して骨髄試料の単核細胞画分から単離した。赤血球の分化のために、ＣＤ３４^＋細胞（その純度は８０％より高かった）を、１５％ＢＩＴ９５００（ミルテニーバイオテク社）、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、２UI/mLのエリスロポエチン（ロシュ社、バーゼル、スイス）、１００ng/mLの幹細胞因子（ミルテニーバイオテク社）、１０ng/mLのＩＬ６（ミルテニーバイオテク社）、及び２×１０^－７Ｍのデキサメタゾン（シグマメルク社、ダルムシュタット、ドイツ）を含有しているイスコフ改変ダルベッコ培地中、１mLあたり０．８×１０^６個で４日間培養した。細胞を毎日同じ培地中で４日目まで希釈した。４日目から、ＩＬ６を除去した。１０日目から１６日目まで、細胞を、エリスロポエチン（２UI/mL）に切り替えて、ターミナル赤血球分化を得て、その後、フローサイトメトリーを行なった（ＧＰＡ、ＣＤ７１、ＣＤ４９ｄ、及びＢａｎｄ３）。顆粒球の分化のために、ＣＤ３４^＋細胞を、１００ng/mLの幹細胞因子、１０ng/mLのＩＬ３（ミルテニーバイオテク社）、及び２０ng/mLの顆粒球コロニー刺激因子（サンド社、ホルツキルフェン、ドイツ）を含む同培地中で培養した。２日間毎に、赤血球遺伝子（ＧＡＴＡ１、ＨＢＢ）又は顆粒球遺伝子（ＭＰＯ、ＳＰ１１）についてメイ・グリュンワルド・ギムザ染色及び逆転写定量ＰＣＲを実施した。

細胞選別
細胞を、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ３機器（ベクトンディッキンソン社、フランクリン・レイクス、米国）を使用して、骨髄又は血液試料の単核細胞画分から、ＣＤ４５－ＰＥ抗体、ＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体、ＣＤ１９－ＥＣＤ抗体、及びＣＤ５－ＡＡ７００抗体（ベックマンコールター社、ブレア、米国）を使用して選別した。選別された細胞個体群において、ＲＮＡを抽出し、ＳＦ３Ｂ１遺伝子を、サンガー法によってシークエンスした。

質量分析
プロメガ社から購入したシークエンス等級のトリプシン（５０ng）を使用して、溶液中の赤芽球溶解物のタンパク質を３７℃で一晩かけて消化した。結果として得られた産物を、データ依存的スキームで作動している、ナノ液体クロマトグラフィー－Q-Exactive Plus質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によって分析した：クロマトグラフィーにローディングされたペプチドを捕捉し、ミリＱ水中０．１％トリフルオロ酢酸、２％アセトニトリルを用いてＣ_１８逆相プレカラム（Acclaim Pepmap、１００Å孔、５μmの粒子、２cm長、７５μmの内径）で５μL/分で３分間洗浄した。その後、捕捉されたペプチドをＣ_１８逆相分析用カラム（２μmの粒径、１００Åの孔径、７５μmの内径、２５cm長）で、ミリＱ水中０．１％ギ酸を含有している９９％の溶媒Ａで開始し、ミリＱ水中８０％アセトニトリル及び０．０８５％のギ酸を含有している４０％の溶媒Ｂで終了する、１．５時間の勾配を用いて分離した。質量分析計は、溶出プロセス全体を通してデータを取得した。質量分析の走査は、３５０から１５００Ｔｈ（トムソン）におよび、ＡＧＣターゲットは１×１０^６、最大注入時間は６０ミリ秒、解像度は７００００であった。ＨＣＤ（高エネルギー衝突解離）フラグメンテーションが、３０秒のダイナミックエクスクルージョン時間で１０個の最も豊富なイオンに対して行なわれた。前駆体イオン選択域は、２Ｔｈに設定された。高エネルギー衝突解離の正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）は２７％に設定され、ＭＳ／ＭＳ走査解像度は１７，５００、ＡＧＣターゲットは１×１０^５、最大注入時間は６０ミリ秒以内に設定された。スペクトルはプロファイルモードで記録された。質量分析データは、Mascot 2.5.1（www.matrixscience.com）を使用して分析された。使用されるデータベースは、Uniprot-Swissprotデータベース（２０１７年１０月に公開、２０３１４個の配列）に由来するヒト配列の連結されたもの、及びＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ配列をはじめとする修飾された配列のカスタム化されたデータベース、及び社内の一般的なコンタミ配列のリストであった。システインカルバミドメチル化が、定常的な修飾として設定され、メチオニン酸化及びプロリンヒドロキシル化は、変動的な修飾として設定された。スペクトルの注釈は、Roepstorff及びFohlman（６０）によって提案されたペプチド断片化の命名法に従って行われた。

組換えＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^＋１２の産生及び精製
ヒトＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^＋１２のｃＤＮＡ配列を、以下の修飾を施して、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした：ベクターのシグナル配列（インターロイキン－２）を天然シグナル配列の代わりに使用し、この後にはスペーサー及びＦＬＡＧタグがある。組換えタンパク質は、Freestyle F－MAX試薬（ライフテクノロジーズ社）を使用して一過性にトランスフェクトされたFreestyle293F細胞（ライフテクノロジーズ社）の懸濁培養液中で産生された。ＦＬＡＧタグ化ＥＲＦＥタンパク質を過剰発現している細胞由来の上清を、５日後に収集し、プロテアーゼ阻害剤混液を補充した。組換えタンパク質を、製造業者（Sigma-Aldrich Chimie社、サン・カンタン・ファラヴィエ、フランス）のプロトコールに従って抗ＦＬＡＧ抗体アフィニティゲルを使用して精製し、１５０μg/mLのＦＬＡＧペプチド（シグマ社）で溶出した。ＦＬＡＧペプチドを、アミコンウルトラ３０Ｋ装置（メルクミリポア社、ギュイヤンクール、フランス）を通して調製物をろ過することによって排除し、組換えＥＲＦＥタンパク質を、食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）に懸濁した。タンパク質濃度を、クーマシーインペリアルタンパク染色色素及びピアス社のビシンコニン酸タンパクアッセイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して決定した。

ウェスタンブロット分析
ＥＲＦＥ^ＷＴを分泌している２９３Ｆ細胞又はＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ細胞に由来する上清を、還元条件下（１０％の２－メルカプトエタノールを含むレムリ（Laemmli）緩衝液で希釈し、９５℃で５分間インキュベートする）及び非還元条件下（２－メルカプトエタノールを含まないレムリ緩衝液で希釈する）でＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜（バイオラッド社）にエレクトロブロットした。膜を、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液（１０mMトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０）中５％ドライミルクを用いてブロッキングし、DYKDDDDKエピトープ（ＦＬＡＧタグ）を認識するセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせた抗ＤＤＫモノクローナル抗体（８６８６１、セルシグナリング社）と共に室温で２時間、又は、ＥＲＦＥに対するウサギポリクローナル抗体（YenZym社によって作製）と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、ヤギ抗ウサギＨＲＰ連結抗体（７０７４Ｓ、セルシグナリング社）と共にインキュベートした。酵素活性は、電気化学発光法に基づいた検出システム（ＧＥライフサイエンシーズ社）によって可視化された。ブロットイメージング及び分析は、Chemidoc MPイメージングシステム（バイオラッド社）でImage Labソフトウェアを用いて実施された。

Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞腫の細胞株におけるヘプシジンの抑制
Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞腫の細胞株を、１０％ウシ胎児血清と、対照であるフリースタイル２９３Ｆ細胞又はＥＲＦＥ^ＷＴ若しくはＥＲＦＥ^＋１２のｃＤＮＡをコードしているプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞に由来する５０％（ｖ/ｖ）上清の補充された、Ｄ－ＭＥＭグルタマックス（ライフテクノロジーズ社）中で一晩（１６時間）インキュベートした。Ｈｅｐ３Ｂ細胞に由来する全ＲＮＡを、ＵＰｚｏｌ全ＲＮＡ単離試薬（バイオテックラビット社）を使用して抽出した。ｃＤＮＡは、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（プロメガ社）を使用して合成された。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応は、LightCycler（登録商標）４８０ＤＮＡ ＳＹＢＲグリーンＩマスター反応ミックス（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて準備され、LightCycler（登録商標）４８０システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社）で二回実行された。ＨＡＭＰ ｍＲＮＡ転写物の量は、リファレンス遺伝子であるＨＰＲＴに対して正規化された。

ヒトヘプシジン及び可溶性トランスフェリン受容体の用量
血漿中の可溶性トランスフェリン受容体アッセイを、Dimension VISTA 1500（シーメンスヘルスケア社、サン・ドニ、フランス）で実施した。循環中のヘプシジンは、以前に記載された質量分析に直列に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法によってＥＤＴＡ血漿試料から定量された（６１）。

ヒトエリスロフェロンイムノアッセイ
血漿中エリスロフェロン濃度は、以前に記載^２８されている通りに決定された。簡潔に言えば、高い結合度の９６ウェルプレート（コーニング社）に、５０mMの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中１．０μg/mLの捕捉用抗体を１００μL/ウェルで４℃で一晩かけてコーティングした。プレートを洗浄（ＴＢＳ、０．５％Tween-20）し、２００μL/ウェルのブロッキング遮断緩衝液（ＰＢＳ、０．２％カゼインナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて室温で１時間かけてブロッキングした。組換えヒトＥＲＦＥ標準物質を、１０、５、２．５、１．２５、及び０．６２５ng/mLに連続希釈した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１ウェルあたり１００mLのヒトエリスロフェロンに対するビオチニル化ウサギモノクローナル抗体（１μg/mL）と共に１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、Neutravidin－セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、３１０３０番）１/５０００（１００mL/ウェル）と共に４５分間インキュベートし、３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ用の１００μLのテトラメチルベンジジン基質システム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、３４０２８番）を用いて暗闇で室温で１０分間かけて展開した。反応を、５０μlの２Ｎ硫酸を添加することによって停止し、プレートを、Spectramax250（モレキュラーデバイス社）で４５０nmで解読した。

統計分析
量的変数については、数値は、中央値と四分位範囲（ＩＱＲ）、又は平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表現され、マンホイットニー検定を使用して比較した。カウント数又は比率として報告されるカテゴリー変数を、カイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定を使用して比較した。転写物の定量については、マンホイットニー検定を使用して、各グループの比較のために統計学的有意性を割り当てた。０．０５未満のＰ値を有意と考えた。多重ロジスティック回帰分析を、一変量分析で０．１未満のＰ値を用いて選ばれた選択変数のために調整した（ＪＭＰバージョン１０．０．２、SAS Institute社、ケーリー、ＮＣ州）。

結果：
ＳＦ３Ｂ１の突然変異したＭＤＳにおける選択的３’スプライス部位の使用によるＥＲＦＥのアップレギュレーション
全身の鉄の過剰負荷の機序を調べるために、６０人の単一血球系統異形成（ＳＬＤ）を伴うＭＤＳ－ＲＳ、１７人の多血球系統異形成（ＭＬＤ）を伴うＭＤＳ－ＲＳ、２人の
５ｑ症候群、１７人のＭＤＳ－ＳＬＤ、４２人のＭＤＳ－ＭＬＤ、及び１８人の１型の芽球増加を伴う（ＥＢ１）ＭＤＳを含む、１５６人のＭＤＳ患者の集団を確立した（表１）。改訂版国際予後スコアリングシステムスコアは２１人の患者において非常に低く、９８人の患者において低く、２９人の患者において中間であり、２人の患者において高かった。骨髄単核細胞（ＭＮＣ）画分中の、ＭＤＳにおいてよく突然変異している２６個の遺伝子をシークエンスした。ＳＦ３Ｂ１遺伝子は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}の突然変異に罹っている６３（６７％）症例を含む、９４症例のＭＤＳにおいて突然変異していた。ＳＦ３Ｂ１の突然変異を全く有さない６２人の患者の中には、他のスプライシング遺伝子であるＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１、又はＺＲＳＲ２が、２７症例において突然変異し、３５症例においてはスプライシング遺伝子の突然変異は全く観察されなかった。いくつかの症例は、２つのスプライシング突然変異を呈した（データは示されていない）。本発明者らは、２１人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ、６人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳを含む、集団の２７人の患者、及び５人の健康な対照から単離された骨髄単核細胞のトランスクリプトームをシークエンスすることによって、遺伝子の発現及びスプライシングに対するＳＦ３Ｂ１遺伝子の突然変異の結果を評価した。遺伝子発現及びスプライスジャンクションの差異分析を、ＤＥＳｅｑ（２９）を使用して実施した。本発明者らは、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳとＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳとの間で発現変動を有するとして６，３４３個の遺伝子を０．０５未満のＰ値で検出した（データは示されていない）。遺伝子発現プロファイルの主成分分析（ＰＣＡ）は、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳとＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳとを分離した（データは示されていない）。発現変動する遺伝子を、ｌｏｇ２変化倍率（ＦＣ）の絶対値＞１、及びベンジャミン・ホッホベルク（ＢＨ）により補正されたＰ値＜０．０５を用いて、７３個の特定の遺伝子オントロジータームに集めた（データは示されていない）。ｌｏｇ２（変化倍率）＜－１を有する遺伝子は、セリン／トレオニンキナーゼシグナル伝達、アポトーシス、骨髄細胞分化、炎症、細胞間接着に関与したが、一方、ｌｏｇ２（変化倍率）＞１を有する遺伝子は、ヘム代謝、赤血球分化、及び鉄の恒常性に関与していた（データは示されていない）。本発明者らは、IRON_ION_HOMEOSTASIS遺伝子セットＧＯ：００５５０７２（http://amigo.geneontology.org）に属している１６個の発現変動する遺伝子のｌｏｇ２（変化倍率）をプロットし、エリスロフェロンをコードしているＦＡＭ１３２Ｂ/ＥＲＦＥ転写物がアップレギュレートされたことを示した（データは示されていない）。

その後、本発明者らは、注釈の付けられた５'供与スプライス部位及び３'受容スプライス部位、不明瞭なジャンクション、並びにカノニカルジャンクションを含む、１，５２８個の発現変動する５'及び３’ジャンクションを、ベンジャミン・ホッホベルク（ＢＨ）により補正されたＰ値≦１０^－５及びｌｏｇ２（変化倍率）の絶対値≧１で同定した（データは示されていない）。これらのジャンクションは、２１個のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ試料及び６個のＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳ試料の階層的クラスタリングを可能とした（データは示されていない）。発現変動するカノニカルジャンクションを排除した後、次いで、本発明者らは、１，１４７個の選択的なジャンクションを検討し、その中で本発明者らは、７８６個の３’受容ジャンクション（６８．５％）、１７６個の５’供与ジャンクション（１５．３％）、及び選択的５’スプライス部位若しくは３’スプライス部位のいずれか又は選択的５’スプライス部位と３’スプライス部位の両方に帰せられる１８５個の不明瞭なジャンクション（１６．１％）を同定した（データは示されていない）。選択的３’スプライス部位とカノニカル３’スプライス部位との間の距離の分析は、選択的３’スプライス部位（ＡＧ）の大半が、カノニカル３’スプライス部位（ＡＧ）より－２４から－９ヌクレオチド前に位置していたことを示した（データは示されていない）。これらの新規スプライスバリアントにおける選択的ＡＧ’ジャンクションの比率は一般的に、ＳＦ３Ｂ１突然変異体において増加し、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ試料においてはあまり頻繁に増加しなかった（データは示されていない）。長さが改変された有意な量の変異タンパク質を生じる可能性の高かった選択的スプライシングによる転写物を検出するために、本発明者らは、３の倍数の数である追加のヌクレオチド鎖伸長を有し、選択的ジャンクションカバレッジ＋カノニカルジャンクションカバレッジ（ＡＧ’＋ＡＧ）に対する選択的ジャンクションカバレッジ（ＡＧ'）の比率が０．１を超え、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ試料に対するＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ試料における選択的ジャンクションの発現比が１０を超える、転写物を選択するフィルターを適用した（データは示されていない）。本発明者らは、６３個の遺伝子に６６個の選択的ジャンクションを得た（データは示されていない）。これらの遺伝子は、後生的な調節及び転写、ｍＲＮＡのプロセシング及び翻訳、細胞内輸送、細胞周期及び細胞遊走、シグナル伝達及びアポトーシス、ミトコンドリアにおける代謝、並びに鉄の恒常性に関与していた（データは示されていない）。６６個の選択的ジャンクションの中で、２９個が９～２７個のヌクレオチドのフレーム内への挿入に関連し、その中の２６個が、ｌｏｇ２（変化倍率）の絶対値＞０．３で、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳとＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳとの間で発現変動していた（データは示されていない）。エキソン２と３の間（第２染色体：２３９，０７０，３５７～２３９，０７１，３６４）に位置する潜在性３’スプライス部位の使用及び全く中途終止コドンがないことに因り、選択的ジャンクションを有するアップレギュレートされた遺伝子の中で、ＦＡＭ１３２Ｂ/ＥＲＦＥ遺伝子が同定された。異常な転写物は、オープンリーディングフレーム内に１２個の追加のヌクレオチドを含有し、これは、これからＥＲＦＥ^＋１２と称される（データは示されていない）。それは、全てのＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ試料において系統的に検出され、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳでは平均２４．８％のＦＡＭ１３２Ｂ/ＥＲＦＥ転写物を示し、これに対してＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳでは０．２％であった。このことは、ＥＲＦＥ^＋１２の発現が、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の突然変異の存在に関連していたことを示す。

選択的スプライシングによるＥＲＦＥ^＋１２転写物のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴに限定された発現
ＥＲＦＥ^＋１２転写物の発現が、ＳＦ３Ｂ１の突然変異の存在に依存していることを確かめるために、本発明者らは、赤芽球・巨核球細胞株ＵＴ７／ＥＰＯに、合成で完全長のＳＦ３Ｂ１^ＷＴのｃＤＮＡ又は突然変異体のＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}のｃＤＮＡをコードしているｐＬＶＸプラスミドをトランスフェクトした。その後、本発明者らは、キャピラリー電気泳動により１６２ヌクレオチド（ｎｔ）断片及び１５０ヌクレオチド断片としてＥＲＦＥ^＋１２及びＥＲＦＥ^ＷＴの転写物の検出を可能とする、感度の高い蛍光逆転写ＰＣＲを設計した（データは示されていない）。トランスフェクションから２４時間後、ＥＲＦＥ^＋１２転写物が、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}のトランスフェクトされた細胞株において検出されたが、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴの細胞株には検出されなかった（データは示されていない）。ＥＲＦＥｍＲＮＡ前駆体内におけるＳＦ３Ｂ１の突然変異の状況で誘発されるスプライスパターンを検証するために、本発明者らは、ミニ遺伝子スプライシングアッセイを実施した。潜在性３’スプライス部位（ＡＧ'）の両側に位置する約２００ヌクレオチドのＥＲＦＥ配列を、エキソントラップベクターにクローニングした。同ベクターにクローニングされたＥＮＯＳＦ１遺伝子（第１８染色体：６８３，３９５～６８５，９２０）における選択的ジャンクションを、対照として使用した（１３）。ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}突然変異が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術によって編集されたＧ１Ｅ－ＥＲ４マウス細胞株に、これらのミニ遺伝子がトランスフェクトされた。予想された通り、種間のイントロンの相同性が欠落しているために、Ｇ１Ｅ－ＥＲ４ ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}細胞株又は同系ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ細胞株のトランスクリプトームのシークエンスにより、内因性マウスＥＲＦＥ及びＥＮＯＳＦ１が、選択的スプライシングを受けなかったことが実証された（示されていない）。トランスフェクション後、選択的３’スプライス部位ＡＧ’ ＥＲＦＥ^＋１２は、キャピラリー電気泳動上で、Ｇ１Ｅ－ＥＲ４ ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}細胞には検出されたが、同系Ｇ１Ｅ－ＥＲ４ ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ細胞には検出されなかった（データは示されていない）。選択的３’スプライス部位ＡＧ’の使用は、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ細胞株におけるＥＮＯＳＦ１遺伝子について検出することができ、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}細胞株において優性となり、このことは、突然変異は選択的ＡＧ’の使用を選好することを示唆する。

その後、本発明者らは、蛍光ＰＣＲを使用して、ＭＤＳ患者の初代骨髄試料中におけるＥＲＦＥ^＋１２の発現を調べた。４６人の低リスクのＭＤＳ患者において、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴが２５症例に存在し、これには、２０症例のＭＤＳ－ＳＬＤ－ＲＳ／ＭＤＳ－ＭＬＤ－ＲＳ、３症例のＭＤＳ－ＭＬＤ、及び２症例のＭＤＳ－ＥＢ１が含まれる。ＥＲＦＥ^＋１２は、全てのＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳの骨髄単核細胞画分において検出され、どのＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳにも検出されなかった。ＥＲＦＥ^＋１２は、ＳＲＳＦ２（ｎ＝１０）、Ｕ２ＡＦ１（ｎ＝１）、ＺＲＳＲ２（ｎ＝１）に突然変異を有する全ての他のＭＤＳの症例、又は他の遺伝子に突然変異を有する２１人のＭＤＳ患者には検出されなかった（データは示されていない）。ＳＦ３Ｂ１の単一対立遺伝子の欠失と、残りの対立遺伝子上の置換Ｇ７４２Ｄを有する１人の患者において、選択的ＥＲＦＥ^＋１２の発現は、カノニカルＥＲＦＥ^ＷＴの発現を上回った（データは示されていない）。その後、本発明者らは、２人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ及び１人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳの骨髄のＣＤ３４陽性細胞から初代赤芽球を増幅し、ＥＲＦＥ^＋１２が、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴの赤血球には発現されたが、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴの赤血球には発現されなかったことを示した（データは示されていない）。このことはさらに、ＥＲＦＥ^＋１２が、ＳＦ３Ｂ１の突然変異に関連していることを支持する。ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳは、骨髄に赤血球が豊富であることによって特徴付けられる。ＥＲＦＥ^＋１２が、別の遺伝子的バックグラウンドを有する骨髄の赤芽球から派生する細胞にも検出され得るかどうかを調べるために、本発明者らは、３８％の骨髄赤芽球、１５％を超える環状鉄芽球、正常な核型、ＳＦ３Ｂ１の突然変異は全くないが、１つのＳＲＳＦ２突然変異及び１つのＴＥＴ２突然変異を有する、後天性鉄芽球性貧血を有する１人の患者、ＡＬＡＳ２の突然変異／欠失又はＧＬＲＸ５の突然変異に起因する後天性鉄芽球性貧血を有する３人の患者、重度のβ－サラセミアを有する１人の患者、及びＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＭＤＳを有する１人の患者から試料を収集した。蛍光ＰＣＲを使用すると、ＥＲＦＥ^ＷＴは存在したが、ＥＲＦＥ^＋１２は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＭＤＳ試料を除いて、いずれの場合にも検出できなかった（データは示されていない）。このことは、異常なＥＲＦＥ^＋１２の発生は、赤血球区画の増幅、又は環状鉄芽球の存在には依存しないが、突然変異体ＳＦ３Ｂ１の存在には依存することを確認する。

ＥＲＦＥ^＋１２から、ヘプシジンを抑制する変異タンパク質への翻訳
ヒトＥＲＦＥは、３５４アミノ酸ポリペプチドをコードしている。ＥＲＦＥｍＲＮＡへの１２ヌクレオチドの付加は、コラーゲンドメインのすぐ上流にバリン－プロリン－フェニルアラニン－グルタミン（ＶＰＦＱ）の挿入配列を含有している、ＥＲＦＥ変異体（さらにＥＲＦＥ^ＶＰＦＱと称される）を生じる（データは示されていない）。突然変異体ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱタンパク質がインビボにおいて産生されたかどうかを調べるために、本発明者らは、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者の骨髄のＣＤ３４^＋細胞培養液から得られた、赤芽球の細胞溶解液を調製した。ＬＣ ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の同定を通して、本発明者らは、公共データベース（www.proteomicsdb.org/）においてすでに報告されていたALHELGVYYLPDAEGAFRペプチド（配列番号１１）を含むいくつかのペプチドに適合した提案を得（データは示されていない）、本発明者らは、ＥＲＦＥの１０８位のＶＰＦＱ挿入配列に相当する潜在性ペプチドVPFQFGLPGPPGPPGPQGPPGPIIPPEALLK（配列番号７）を同定した（データは示されていない）。このことは、選択的スプライシングによるＥＲＦＥ^＋１２転写物が、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ赤芽球においてＥＲＦＥ^ＶＰＦＱへと翻訳されることを確認する。

ＥＲＦＥは、マウスにおけるヘプシジンを抑制し、輸血を受けた及び輸血を受けていないβ－サラセミア患者における病的ヘプシジン抑制の原因であることが知られている（２７、２８）。ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱもヘプシジンを抑制するかどうかを試験した。この目的のために、組換えタンパク質であるＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^ＶＰＦＱを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において産生した。還元条件及び非還元条件における、ＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^ＶＰＦＱのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析は、どちらのタンパク質も主に、約１３０ｋＤａの三量体の形態で見られるので、同等な分子量及び多量体化パターンを示した（データは示されていない）。その後、Ｈｅｐ３Ｂ肝細胞腫の細胞を、ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ又はＥＲＦＥ^ＷＴを過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｆ細胞上清を用いて１６時間かけて処置した。どちらのタンパク質も、対照と比較して、ＨＡＭＰ ｍＲＮＡの発現において類似した５倍の減少を引き起こした（図１）。これらのデータは、コラーゲンドメインの上流への４アミノ酸の挿入が、該タンパク質の生理活性に影響を及ぼさなかったことを示す。

エリスロフェンの過剰産生は、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳにおける高フェリチン血症を予測する
その後、本発明者らは、検証されたイムノアッセイを使用して、１５６人のＭＤＳ患者及び２０人の健康な非献血者対照の学習コホートにおける、血漿中ＥＲＦＥのレベルを測定した（２８）。本発明者らはまず、ＥＲＦＥイムノアッセイが、ＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^ＶＰＦＱの両方を検出できたことを確認した。実際に、ヒトＥＲＦＥ ＥＬＩＳＡは、ＥＲＦＥ^ＷＴ及びＥＲＦＥ^ＶＰＦＱの発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の上清中に、同じような量（１μg/mL）の各組換えタンパク質を検出した。このことは、どちらのアイソフォームもＥＬＩＳＡによって検出できることを確立する。ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ又はＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳにおけるＥＲＦＥの平均濃度は、対照よりも高かった（Ｐ＜０．０００１；図２Ａ）。ＭＤＳ試料の中で、ＥＲＦＥ濃度は、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳ（６２．１±３６．７ng/mL）と比較して、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ（１３５．０±７２．５ng/mL）の方が高かった（Ｐ＜０．０００１；図２Ａ）。一貫して、ＥＲＦＥ濃度は、全ての他の世界保健機構（ＷＨＯ）のＭＤＳサブタイプと比較して、ＭＤＳ－ＲＳの方が高かった（データは示されていない）。その後、本発明者らは、血漿中ヘプシジンレベルを測定し、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳにおけるヘプシジンの濃度が、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳと比較して有意により低かったことを確認した（Ｐ＝０．０３０９；図２Ｂ）。本発明者らは、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳと健康な対照との間に差異を全く認めなかった。フェリチンレベルは、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ患者と比較して、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者の方が有意により高かった（Ｐ＜０．０００１；図２Ｃ）。ヘプシジン／フェリチン比は、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳに対してＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳにおいて（Ｐ＜０．０００１；図２Ｄ）、及びまた他のＷＨＯのサブタイプと比較してＭＤＳ－ＲＳにおいてさらにより減少し（データは示されていない）、このことは、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者におけるより低いレベルのヘプシジン及びより高い濃度のフェリチンの両方に起因していた。ＥＲＦＥの血漿中濃度は、ヘプシジン／フェリチン比と逆相関していた（ピアソン検定；Ｐ＜０．０００１；ｒ^２＝０．３６０）。本発明者らの分析はまた、１００ng/mLの閾値を上回るＥＲＦＥ濃度が、ヘプシジンをより効率的に抑制したことを強調する（データは示されていない）。上昇した血漿中ＥＲＦＥ濃度は、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳ患者と比較してＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者において、可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）の血漿中濃度の有意な上昇によって評価されるように、より顕著な度合の無効造血に関連していた（図３Ａ）。血清中エリスロポエチンレベルは、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者及びＳＦ３Ｂ１^ＷＴ患者において同等に増加し（表１）、ＥＲＦＥはマウスにおいてはエリスロポエチンによって調節されているが、本発明者らは、血清中エリスロポエチンレベルとＥＲＦＥ濃度との間に全く相関を見出さず、このことは、ＥＲＦＥの産生が、エリスロポエチンによる赤血球細胞の刺激に限定されなかったことを示唆する（図３Ｂ）（２７）。

これらの所見を検証するために、本発明者らは、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳの数が、学習コホートの数と同等になるまで、より低リスクのＭＤＳ患者の外部コホートを本発明者らの研究に前向きに登録した（表２）。この検証コホートは、５５人のＭＤＳ患者（４２人（７８％）はＳＦ３Ｂ１突然変異を伴うＭＤＳ）を含んでおり、及び特に、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者とＳＦ３Ｂ１^ＷＴ患者との間で同じような赤血球単位数の平均値/８週間であった。ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者においてＥＲＦＥ及びフェリチンの平均濃度は、有意に上昇したが（それぞれ、Ｐ＝０．０００５及びＰ＝０．０４８８；図２Ｅ、２Ｆ）、ヘプシジン及びヘプシジン／フェリチンの比は、有意に減少していた（それぞれ、Ｐ＝０．００３８及びＰ＝０．０００２；図２Ｇ、２Ｈ）。このことは、学習コホートの結果を確認し、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者におけるＥＲＦＥ濃度の上昇は、赤血球の輸血とは独立していることを示唆する。

鉄の恒常性は、赤血球の輸血時に変化し、これにより貧血の程度は減少し、循環中の鉄のレベルは上昇し、両方の効果によりヘプシジンはアップレギュレートされる。本発明者らの分析における赤血球の輸血の影響を除外するために、本発明者らは、包含する前に低い輸血負荷を有する（８週間あたり４単位未満の赤血球）、２５人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者及び３６人のＳＦ３Ｂ１^ＷＴ患者を含む、学習コホートにおける６１人のＭＤＳの部分集合を作成した。この部分集合では、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ又はＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳの患者に同等に輸血されたが（８週間あたり平均０．５単位の赤血球）、フェリチン及び血漿中鉄レベルは、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者においてより高いままであった（図４Ａ、４Ｂ）。ヘプシジン/フェリチン又はヘプシジン/血漿中鉄の比は、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者において有意により低く（図４Ｃ、４Ｄ）、ＥＲＦＥの循環中濃度は、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ患者と比較して、低い輸血負荷のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ患者の方が有意により上昇したままであった（図４Ｅ）。

その後、本発明者らは、低い輸血負荷の患者において、３００μg/mLを超える高フェリチン血症の決定要因を探究した。単変量分析によると、ＥＲＦＥ、ヘプシジン、及びＳＦ３Ｂ１突然変異は、血清中フェリチン濃度と有意に連関していたが、可溶性トランスフェリン受容体レベル及び輸血赤血球単位数は連関していなかった。多変量分析によると、ＥＲＦＥ、ヘプシジン、及びＳＦ３Ｂ１突然変異は、高フェリチンレベルとは独立した予測因子のままであった（データは示されていない）。要するに、これらの結果は、患者が輸血依存性の臨界閾値に達する前に、高フェリチン血症が、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴにより誘発されるＥＲＦＥの発現によって引き起こされ、これは次いでヘプシジンを低下させることを示す。

赤血球系統に限定されたＥＲＦＥ^＋１２の発現
マウスにおいて骨髄におけるＥＲＦＥｍＲＮＡの発現は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）によって調節され、これは好塩基性赤芽球及び多染性赤芽球において優性である（２７）。ＥＲＦＥ及びＥＲＦＥ^＋１２の発現が赤血球系統に限定されているかどうかを調べるために、本発明者らは、１つのＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ及び１つのＳＦ３Ｂ１^ＷＴの骨髄ＣＤ３４陽性細胞試料に由来する赤血球前駆細胞又は顆粒球前駆細胞を平行して増幅した。各系統の純度は、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色されたサイトスピンの細胞学的検査、及び逆転写定量ＰＣＲによる系統に限定されたマーカーの定量によって評価された（データは示されていない）。様々な分化段階における各転写物のアイソフォームの量を比較するために、本発明者らは、逆転写定量ＰＣＲによって、カノニカルＥＲＦＥ^ＷＴ及び異常なＥＲＦＥ^＋１２を定量した（データは示されていない）。正規化された比の量（ＮＲＱ）として表現されるカノニカル転写物ＥＲＦＥ^ＷＴの発現は、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ及びＳＦ３Ｂ１^ＷＴの両方のＭＤＳ赤芽球において増加した。顆粒球において、ＥＲＦＥ^ＷＴの発現は、検出限界に近かった（データは示されていない）。ＥＲＦＥ^＋１２の発現は赤血球系統に限定され、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ赤芽球の分化に沿って増加し、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴ赤芽球と比較してＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ赤芽球の方が高かった（データは示されていない）。これらの結果は、ＥＲＦＥ^＋１２の発現が、赤血球系統に特異的であることを示す。

ＳＦ３Ｂ１遺伝子は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を患っている患者の１５％において突然変異し、ＣＤ１９陽性リンパ球に存在している（１４、３０）。ＥＲＦＥ^＋１２が、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ慢性リンパ球性白血病において検出可能であるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＣＬＬに続いてＭＤＳを有する患者（骨髄単核細胞は、クローン性ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}を発現していた）に由来する１つの試料、及び２人のＣＬＬ患者に由来する３つの末梢血（ＰＢ）単核細胞試料（その中の１つは、４０％を超える変異対立遺伝子頻度を有するクローン性ＳＦ３Ｂ１^{Ｔ６６３Ｉ}突然変異を有し、第二は、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の突然変異を全く有さず、第三は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}突然変異を有する１人のＭＤＳ患者に由来する）を収集した。潜在性３’スプライス部位の使用によって、ＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＣＬＬ又はＭＤＳにおいて選択的にスプライシングされることがすでに知られているＭＡＰ３Ｋ７転写物を分析した（１４、１７）。選択的スプライシングによるＭＡＰ３Ｋ７転写物に相当する１７０ヌクレオチド断片が、ＳＦ３Ｂ１^ＷＴＣＬＬと比較して、全てのＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ試料に集まっていた（データは示されていない）。ＥＲＦＥ^＋１２は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＭＤＳの骨髄単核細胞には検出されたが、ＳＦ３Ｂ１^{Ｔ６６３Ｉ}又はＳＦ３Ｂ１^ＷＴのＣＬＬには検出されなかった。ＥＲＦＥ^＋１２は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＣＬＬ＋ＭＤＳの骨髄単核細胞試料には検出されなかった。ＥＲＦＥ^＋１２を発現している細胞型に関するさらなる洞察を得るために、本発明者らは、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＣＬＬ＋ＭＤＳ、１つのＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＭＤＳ、及び１つのＳＦ３Ｂ１^ＷＴＭＤＳの骨髄単核細胞画分に由来する、並びにＳＦ３Ｂ１^{Ｔ６６３Ｉ}ＣＬＬの末梢血単核細胞に由来する、赤芽球、ＣＤ１９陽性ＣＤ５陰性Ｂ細胞、ＣＤ１９陽性ＣＤ５陽性の病的Ｂ細胞、及びＣＤ３陽性Ｔ細胞を含有している骨髄細胞を選別した。ＳＦ３Ｂ１^{Ｔ６６３Ｉ}ＣＬＬの骨髄画分における細胞数は、さらなる研究には小さすぎた（データは示されていない）。ＭＡＰ３Ｋ７の１７０ヌクレオチド断片は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＣＬＬ＋ＭＤＳ及びＳＦ３Ｂ１^{Ｔ６６３Ｉ}ＣＬＬのＣＤ１９陽性ＣＤ５陽性の病的Ｂ細胞において、及びまた骨髄画分においても検出されたが、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＭＤＳのＣＤ１９陽性ＣＤ５陰性Ｂ細胞には検出されなかった（データは示されていない）。ＳＦ３Ｂ１のＲＮＡをシークエンスすることによって、本発明者らは、突然変異が、選択的なスプライシングによるＭＡＰ３Ｋ７転写物が検出された細胞集団に存在することを実証した（データは示されていない）。選択的なスプライシングによるＥＲＦＥ^＋１２転写物は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}ＭＤＳ＋ＣＬＬ又はＳＦ３Ｂ１^{Ｔ６６３Ｉ}ＣＬＬのＣＤ１９陽性ＣＤ５陽性の病的Ｂ細胞には検出されず、その発現は、ＳＦ３Ｂ１^{Ｋ７００Ｅ}骨髄ＭＤＳ細胞に限定された。要するに、これらの結果は、ＥＲＦＥが赤血球細胞において発現され、ＥＲＦＥ^＋１２がＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴ赤血球細胞に限定されることを示す。

レナリドミドに対する応答に相関したＥＲＦＥ^＋１２の発現の変化
より低リスクのＭＤＳ患者の５０％（ＭＤＳ－ＲＳ患者を含む）が、貧血を治癒するために受けた処置に対して、一次耐性又は続発性の効力低下を経験する。耐性機序がクローン性造血の存続に関与するかどうかは常に不明である。本発明者らは以前に、赤血球造血刺激因子製剤に耐性である５番染色体長腕欠失を伴わないＭＤＳに投与されたレナリドミドが、悪性クローンに標的化し、場合によっては、反応の持続時間中、優性なＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴクローンを排除することを示した（３１）。しかしながら、赤血球細胞及び骨髄細胞に発現されている、ＳＦ３Ｂ１変異対立遺伝子の出現頻度は、クローン性赤芽球の量を反映するだけではない。ここで、本発明者らは、ＧＦＭ－ＬｅｎＥｐｏ－０８臨床試験（クリニカルトライアルズ・ドット・ガブにおいてＮＣＴ０１７１８３７９）に含まれる患者の経過観察のために、赤血球に特異的なＥＲＦＥ^＋１２の転写物の発現を使用した。この目的のために、本発明者らは、対を形成したＲＮＡ試料を入手することのできた、１４人のＳＦ３Ｂ１^ＭＵＴＭＤＳ患者における、蛍光ＰＣＲを実施し、ＥＲＦＥ^＋１２及びＥＲＦＥ^ＷＴのピーク高さを、ＥＲＦＥ^＋１２/ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比として統合した。ＥＲＦＥ^＋１２/ＥＲＦＥ^＋１２＋ＥＲＦＥ^ＷＴの比は、６人の応答患者においては減少したが、８人の非応答患者においては常に安定であり続けた（図５Ａ、５Ｂ）。スクリーニング時と、４サイクルの処置後の評価時との間の比の変動率は、応答患者と非応答患者の間で有意差があった（マンホイットニー検定Ｐ＝０．００１３；図５Ｃ、左）。対照的に、スクリーニング時と４サイクル後の評価時との間の骨髄単核細胞のＳＦ３Ｂ１変異対立遺伝子の出現頻度の変動率は、８人中６人の非応答患者と、６人中４人の応答患者との間であまり変化がなかった（図５Ｃ、右）。要するに、本発明者らの結果は、ＥＲＦＥ^＋１２の発現が、治療下にあるクローン性造血の評価を可能とすることを実証する。

参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によってここに組み入れられる。

Claims (15)

1. 配列番号２の核酸配列に対して少なくとも７０％の相同率を有するエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）の転写物の変異体、又は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の相同率を有するＥＲＦＥタンパク質の変異体。
2. 変異体が、配列番号２の核酸配列（ＥＲＦＥ^＋１２）を有する、請求項１記載のＥＲＦＥ転写物の変異体。
3. 変異体が、配列番号４のアミノ酸配列（ＥＲＦＥ^ＶＰＦＱ）を有する、請求項１記載のＥＲＦＥタンパク質の変異体。
4. 変異体が、そのアミノ酸配列内に少なくとも配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＥＲＦＥタンパク質の変異体。
5. 変異体が配列番号３に対して少なくとも７０％の相同率を有し、配列内に配列番号５の４つのアミノ酸ＶＰＦＱを含む、請求項１記載のＥＲＦＥタンパク質の変異体。
6. 患者から得られた試料中における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における貧血を診断するための方法であって、ここでのこのような変異体の検出は、該患者が、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内の少なくとも１つの突然変異を伴う貧血を患っていることを示す、方法。
7. 患者から得られた試料中における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、貧血の処置が、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した前駆細胞及び／又は赤血球前駆細胞に標的化するであろうか否かを示すことを可能とする方法であって、ここでのこのような変異体の検出は、該処置が、クローン性の／異常なＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血に標的化するのに有効であるか否かを示す、方法。
8. ｉ）患者から得られた試料中における、レナリドミドによる処置の前後における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）レナリドミドによる処置の前後に得られた該発現レベルを比較する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、レナリドミドによる貧血の処置をモニタリングする方法であって、ここで、レナリドミドによる処置後に得られた該変異体の発現レベルが、処置前に得られた該変異体の発現レベルと比較して減少している場合、このことは、ＳＦ３Ｂ１の突然変異した造血が減少し、患者はレナリドミドによる処置に応答していることを示す、方法。
9. 患者から得られた試料中における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、全身の鉄の過剰負荷を診断するための方法であって、ここで、このような変異体の検出は、該患者が、全身の鉄の過剰負荷を有することを示す、方法。
10. 患者から得られた試料中における、ＥＲＦＥ転写物の変異体又はＥＲＦＥタンパク質の変異体の発現を決定する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、肝臓及び心臓の実質細胞内の鉄の過剰負荷を予測するための方法であって、ここで、このような変異体の検出は、該患者が、肝臓及び心臓の実質細胞内の鉄の過剰負荷の素因を有するであろうことを示す、方法。
11. 患者に貧血又は鉄の過剰負荷の処置を投与する工程を含む、ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有し、請求項６によりＳＦ３Ｂ１遺伝子内の少なくとも１つの突然変異を伴う貧血、又は請求項１０により全身の鉄の過剰負荷を有すると診断されている患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置法。
12. ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置に使用するための、ＥＲＦＥの転写物又はタンパク質の変異体の阻害剤。
13. 以下の配列：AACTGAAAGGGAAC（配列番号８）、AAAGGGAACCTTGGCAGTGAGGACA（配列番号９）又はACCTTGGCAGTGAGGACATGT（配列番号１０）を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
14. ＳＦ３Ｂ１遺伝子内に少なくとも１つの突然変異を有する骨髄悪性腫瘍を患っている患者における、貧血及び／又は全身の鉄の過剰負荷の処置に使用するための、ＥＲＦＥタンパク質の変異体に対する抗体。
15. 変異体が、請求項２又は３に記載の変異体である、請求項６、７、８、９、１０、若しくは１１に記載の方法、又は請求項１２記載の阻害剤、又は請求項１４記載の抗体。

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