CN103901191A - 纳米金靶向标记抗体的造影剂及其制备方法 - Google Patents
纳米金靶向标记抗体的造影剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103901191A CN103901191A CN201210572229.3A CN201210572229A CN103901191A CN 103901191 A CN103901191 A CN 103901191A CN 201210572229 A CN201210572229 A CN 201210572229A CN 103901191 A CN103901191 A CN 103901191A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- solution
- nano
- connexon
- particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种纳米金靶向标记抗体造影剂,以及其制备方法。本发明采用特定的连接子间接媒介,将荧光标记的抗体定向共价连接到纳米金粒子核上,从而提高了抗体的利用率,提高了造影剂的特异性和稳定性。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物免疫技术领域,具体涉及一种靶向标记抗体的纳米金造影剂及其制备方法。
【背景技术】
分子光学造影技术在图像化分子生物标记方面表现出了光明的前景。分子光学造影技术能够达到亚细胞的分辨率并且具有实时性和对细胞无侵害性的优点。在分子光学造影技术的领域中以纳米为基础的造影剂在生物学和药学方面的应用越来越广泛。而以纳米金为载体的成像技术尤其适用于生物学领域。
由于纳米金粒子具有光学稳定性、水溶性以及无毒性,故以纳米金为载体的技术可被用于多种成像、传感及应用治疗中。现阶段,分子成像用球形的纳米金已被用于标记上皮细胞表面癌受体、还有对细胞内肌动蛋白的动力学成像。
纳米金是指金的微小颗粒,通常在水溶液中以胶体的形态存在。目前最经典的制备胶体金的方法是柠檬酸钠还原法。根据还原剂的种类和浓度的不同,可以在实验室条件下制备出不同粒径的胶体金,而且方法简单、原料价廉。胶体金在其粒径为510~550nm的可见光谱范围内有一吸收峰,吸收波长随着金颗粒的直径增大而增加。当粒径从小到大时,表观颜色依次呈现出淡橙黄色(<5nm)、葡萄酒红色、深红色和蓝紫色(通常为金颗粒的聚集体)的变化。
胶体金的性质主要取决于金颗粒的直径及其表面特性。由于其直径在1~100nm之间,而大多数的生物分子(如蛋白质、核酸等)的尺寸都在这一尺度内,因此可以利用纳米金作为探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能,进而在分子水平上揭示生命过程,或对特异性的靶标进行检测,或利用其作靶向药物的载体等。而它独特的颜色变化也是其应用于生物化学的重要基础。
目前,许多科研单位和公司都致力于发展更精确,更灵敏,更高效,更价廉的纳米金定量或半定量的快速免疫层析技术。其原理是:利用金纳米粒子作为探针,通过抗原抗体反应,使检测信号得到放大,从而实现对抗原快速灵敏检测。
在对单细胞的研究中,尽管荧光和比色原位杂交测试已经被广泛使用,但相比于其它细胞着色方法,纳米金检测为光镜观察提供了一种优良的黑色着色方法。与荧光法相比,它不需要昂贵的荧光仪器,也不会随着观察时间的延长而漂白或退色。
而将纳米颗粒作为药物的携带载体是纳米金颗粒的另一项优势:将药物分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面。若同时结合靶向药物技术即在颗粒表面偶联特异性的靶向分子(如特异性配体和单克隆抗体等),通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,并在细胞摄粒作用下将药物分子引入到细胞内,就可以实现安全有效的靶向给药。
此外,随着载药纳米微粒定位问题的解决,不仅可以减少对药物不良反应,而且还可将一些特殊药物输送到机体天然的生物屏障部位,来治疗以往只能通过手术治疗的疾病。近年来,国内外学者对纳米载体在靶向药物制备中的应用进行了大量的研究。
以纳米金为载体的成像技术尤其适用于生物学领域。由于纳米金粒子具有光学稳定性、水溶性以及无毒性,故以纳米金为载体的技术可被用于多种成像、传感及应用治疗中。现阶段,分子成像用球形的纳米金已被用于标记上皮细胞表面癌受体,以及对细胞内肌动蛋白的动力学成像。
在纳米金的应用治疗方面,有报到显示可使用纳米壳、纳米棒和球型纳米对癌细胞进行选择性的光热疗法。在研究一些特定分子时,可用探针分子靶向标定一些生物标记,并利用有生物标记的探针来研究这些特定分子。这些生物标记主要包括:小肽、寡核苷酸适配子、抗体或抗体片段。
其中,抗体被广泛的应用于这些识别部分,主要由于在大量已建立的生物标记中抗体具有高度的亲和性和稳定性。这其中关键的步骤即是合成分子特异性的纳米颗粒,即将探针分子与纳米颗粒结合。
纳米金抗体复合物基本上是利用抗体在其等电点处,在静电作用力下能够轻易的吸附于纳米颗粒表面,而使用高浓度的抗体与纳米金颗粒溶液共孵育来制备。然而这种方式有很多的缺陷。主要包括:在纳米金抗体复合物的制备中,抗体的浓度要求高(~50ug/ml)用量大,成本高;由于是利用金颗粒表面的静电作用力,故抗体在金表面的取向随机,不能保证是抗体的Fc端与纳米金粒子结合,暴露Fab端;由于抗体是以非共价键的方式吸附于纳米颗粒的表面,所以它们很容易被生物样品中其他的分子所代替。
也有利用共价策略将媒介连接子(linker)或通过抗生物素蛋白系统直接将抗体连接于纳米金颗粒表面。然而,这些技术都没有提供能够使IgG分子定向连接于纳米颗粒表面。但是,定向连接却是抗体至靶目标使其可用的功能最大化的关键。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种纳米金粒子靶向标记抗体的造影剂,能够以共价方式,将抗体定向连接到纳米金粒子表面。
本发明提供一种纳米金靶向标记抗体的造影剂,包括:纳米金粒子核;包覆纳米金粒子核并且Fab端暴露的一种或多种抗体,其中的一种抗体靶向于所要成像的分子并连接有荧光基团;通过金硫醇键连接到纳米金粒子核表面的巯基聚乙二醇化合物;以及具有下式I结构的连接子,其中,所述连接子的巯基端通过金硫醇键吸附到纳米金粒子核表面,并且所述连接子的酰肼端与抗体的Fc端或非靶位点共价连接。
其中,所述纳米金粒子的粒径可以为10-25nm。
当所要成像分子为细胞表面分子时,抗体为一种抗体;当所要成像的分子为活细胞内分子时,抗体有两种以上,其中的另一种抗体为抗生物素抗体,并且该抗生物素抗体上还连接有抗原穿膜肽。
巯基聚乙二醇化合物可以是分子量为5k Da的甲氧基-聚乙二醇-巯基。
本发明还提供一种制备纳米金靶向标记抗体造影剂的方法,包括以下步骤:
S1氧化抗体:在抗体溶液中添加NaIO4,室温避光孵育,之后加入磷酸盐缓冲液停止反应,得到氧化抗体溶液,其中每10-15mg抗体添加0.1mmol的NaIO4,以使充分氧化;
S2使抗体与连接子相连:在氧化抗体溶液中添加与抗体等摩尔量的式I的连接子,室温孵育,之后加入HEPES溶液停止反应,得到抗体-连接子溶液;
S3连接纳米金粒子:将抗体-连接子溶液加入纳米金粒子溶液,室温震荡孵育,添加聚乙二醇化合物溶液,室温震荡孵育,得到纳米金靶向标记抗体造影剂的溶液。
步骤S1中,抗体溶液的pH可以为在7-8之间,例如为7.5。
步骤S2还可以包括用10MWCO 2000g 4℃过滤离心,并以HEPES溶液重悬余下溶液,以保证抗体-连接子溶液中抗体的浓度为100ug/ml。
当所要成像的分子为细胞内分子时,步骤S3还可以包括:在添加巯基聚乙二醇化合物溶液并在室温震荡孵育之后,添加抗原穿膜肽-聚乙二醇混合溶液,室温震荡孵育。
此外,步骤S3还可以包括用10MWCO 2000g 4℃过滤离心,并以HEPES溶液重悬沉淀。
本发明利用特殊的连接子将抗体与纳米金颗粒相连,连接子的酰肼基与抗体Fc端,或非靶位点的糖基化位点反应连接,故不会破坏抗体Fab端的结合功能,且有效地实现了抗体与纳米金粒子的定向结合。同时还大大降低了抗体浓度的需求量,抗体的使用量也有所降低,节约了成本,提高了抗体结合的灵敏度。
而且,由于抗体Fc端与连接子相连是通过化学反应以共价键的方式与连接子相连,所以当抗体连接子这种复合体与金颗粒连接后,样品中的其他物质无法取代已连接上的抗体,从而保证了特异性,保证了产品质量。
此外,一个纳米金颗粒表面可以结合多种抗体,从而可以制备成多功能的纳米金抗体复合颗粒。
【附图说明】
图1为根据本发明的纳米金靶向标记抗体造影剂的结构示意图。
图2为本发明实施例中所用纳米金粒子溶液的紫外-可见吸收光谱。
图3为纳米金粒子在与抗体连接前后的紫外可见吸收光谱。
图4为使用本发明的纳米金靶向标记抗体造影剂进行细胞内actin成像的图。
【具体实施方式】
针对现有技术中,利用静电作用力使抗体吸附于纳米金粒子表面,来合成纳米金抗体复合物的缺陷,本发明人采用了这样的技术方案。
利用一种特殊的连接子化合物,通过化学反应,以共价键的方式将抗体分子定向连接到纳米金表面。该化合物结构式如下(购自SensoPath Technologies,分子式C33H60N2O10S2,Mw 708.97):
该化合物包括聚乙二醇链一端的酰肼,酰肼可以与抗体Fc端被氧化后得到的羟基,或与抗体非Fab部分的糖基化位点上的羟基发生化学反应,进而将该化合物与抗体的Fc端或糖基化位点共价连接。由于抗体的靶向结合位点在Fab端,因此,这样的化学反应不会影响Fab端的靶向活性。
化合物第二部分为连接烷烃一端的二硫化物,二硫化物一端可以通过类似于共价键的金硫醇键,吸附于纳米金颗粒。因此,利用该连接子,可以将抗体定向连接到纳米金粒子表面,且使Fab端暴露,以靶向结合抗原。
图1示出本发明的纳米金靶向标记抗体的造影剂的结构。从图中可见,造影剂颗粒中心为纳米金粒子核。抗体通过连接子,而定向连接在纳米金粒子核的表面,抗体的Fab端暴露于外,可用来靶向结合所要成像的分子,如细胞表面或细胞内的分子。
纳米金粒子核的大小通常为10-25nm,例如本发明中使用的为10-18nm粒径的纳米金粒子溶液。
总体上,用于细胞造影的抗体主要有两种:对活细胞内部分子造影和对细胞表面分子进行造影的抗体。若只对所需的细胞进行成像,可以选用对细胞表面分子的抗体,并且抗体上连接有荧光基团。即抗体中的一种抗体用于靶向靶向结合所要成像的分子,并连接有荧光基团用于造影成像。
当需要对活细胞内部造影时,抗体包括两种,或两种以上。其中的一种抗体靶向于所要成像的细胞内分子,并连接荧光基团用于造影成像。由于是对活细胞内部进行造影,造影剂需要进入细胞,故还需要抗原穿膜肽TAT-HA2的辅助。因此,另一种抗体应还连接有抗原穿膜肽。连接抗原穿膜肽的抗体通常为抗生物素抗体。
抗体上的荧光标记可以由本领域技术人员根据所想拍照的颜色标记,以及荧光显微镜的激发波长来选择。有些市售的抗体是直接标记有荧光的,根据所选抗体及所需荧光及实验室荧光显微镜及实验需要选择。
抗体的种类可以根据需要来确定,并且可以是一种抗体,或是两种或两种以上抗体的组合,此外还可以通过调节混合抗体中每种抗体的比例,来实现更多功能。
用于细胞表面成像的抗体可以为Anti-CD3,其与T细胞表面CD3分子结合,它可以标记FITC绿色荧光标记(即,anti-CD3-FITC),或标记生物素(biotin)(即,anti-CD3-biotin)。biotin本身没有荧光,但可以与streptavidin相连,市售有标记各种荧光的streptavidin二抗用来标记连有biotin的抗体,用来荧光视踪。
用于活细胞内分子成像的抗体中,抗生物素抗体可以是anti-biotin,用来连接抗原穿膜肽;而靶向于活细胞内分子的抗体可以是anti-actin,用来与活细胞内的肌动蛋白结合,对肌动蛋白纤维成像。
此外,市售有标记好荧光的细胞内分子抗体可供选择。除针对肌动蛋白的抗体以外,还有针对各个细胞内因子等的抗体。
为了减少非特异性的影响,本发明还进一步使用末端带巯基的巯基聚乙二醇化合物,通过巯基与纳米金粒子表面形成金硫醇键,来覆盖纳米金粒子的剩余空白表面。PEG还可以提高造影剂的亲水性,使得造影剂具有良好的生物相容性。
例如,本发明可以使用分子量为5K Da的MPEG-SH,甲氧基-聚乙二醇-巯基,作为覆盖纳米金粒子表面的巯基聚乙二醇化合物。
这种定向连接方式可以大大提高抗体的利用率,每个抗体都是以定向的方式绑定于纳米金粒子上,而具有支持生物学标签的性能。因此,每个纳米金粒子上仅需要少量的抗体即可达到想要的靶向性效应,降低了对抗体浓度、使用量的需求,节约了成本,提高了抗体结合的灵敏度。
此外,由于抗体是以共价方式连接到连接子,进而与纳米金粒子相连接的,样品中的其他物质无法取代已连接上的抗体,从而保证了特异性和产品质量。
制备本发明的纳米金靶向标记抗体的造影剂可以包括以下步骤:
首先是步骤S1氧化抗体:在连接有荧光基团的抗体的溶液中添加NaIO4,室温避光孵育,之后加入磷酸盐缓冲液停止反应,得到氧化抗体溶液,其中每10-15mg抗体可以添加0.1mmol的NaIO4,以使充分氧化。孵育时间无需太久,例如可以为30分钟。
该步骤使用NaIO4氧化抗体Fc端的羟基,或是抗体非Fab端非靶位点的糖基化位点存在的羟基,以生成能够与酰肼基反应的醛基。反应可以在pH为7-8,例如为7.5的条件下进行。NaIO4可以作为溶液添加。
之后,在步骤S2使抗体与连接子相连:在氧化抗体溶液中添加与抗体等摩尔量的式(I)的连接子,室温孵育,之后加入HEPES溶液停止反应,得到抗体-连接子溶液,该步骤中孵育时间可以为1小时,HEPES的浓度可以为40mM。
该步骤中,抗体的Fc端或非靶位点的糖基化位点得以与连接子共价结合。
由于此时,反应混合体系中存在有抗体、抗体-连接子、连接子,NaIO4,磷酸盐缓冲液等物质,因此,该步骤还可以包括分离提纯的操作,把未反应的连接子及盐类去掉。具体地,可以在抗体-连接子混合反应体系中加入HEPES溶液,混匀后用10MWCO 2000g 4℃过滤离心,例如10-20分钟;再用40mM的HEPES重悬余下溶液,以保证抗体-连接子溶液中抗体的浓度为100ug/ml。
此步骤主要是去除混合体系中未连接的物质。离心后,保留在超滤管中的物质即制备的抗体连接子复合物。此时用HEPES溶液重悬,尽量保留留在超滤管中的物质。保证它的浓度为100ug/ml是为了方便后续操作。在之后抗体-连接子与金颗粒连接过程中,只需保证共同孵育体系中抗体-连接子的终浓度为10ug/ml。
最后是步骤S3,连接纳米金粒子:将抗体-连接子溶液加入纳米金粒子溶液,室温震荡孵育,以使连接子的末端巯基与纳米金粒子表面通过金硫醇键结合,并且还可以随后再添加聚乙二醇-硫醇化合物,室温震荡孵育,将纳米金粒子的剩余空白表面覆盖以聚乙二醇链。最终得到纳米金靶向标记抗体造影剂的溶液。
该步骤中,此步骤中抗体-连接子溶液与胶体金溶液的体积比例可以为1:100-1:50。并且孵育时间均可以为20分钟。巯基聚乙二醇化合物的溶液的添加量可以为抗体-连接子溶液的10倍。
步骤S3也可以包括用10MWCO 2000g-2500g 4℃过滤离心,并以例如40mM的HEPES溶液重悬沉淀。最终溶液为橙红色的具有靶向功能的纳米金抗体造影剂溶液。
当需要对活细胞内部分子造影时,步骤S3还可以包括在添加巯基聚乙二醇化合物溶液并在室温震荡孵育之后,添加抗原穿膜肽-聚乙二醇混合溶液,室温震荡孵育,以使抗生物素抗体上连接抗原穿膜肽。
抗原穿膜肽-聚乙二醇混合液配制例如可以是:2ul的抗原穿膜肽溶液+98ul2%(wt/vot)PEG溶液。这里的聚乙二醇可以使用分子量为15000-20000Da的聚乙二醇。聚乙二醇溶液可以用PBS来稀释。
过滤离心之后,弃上清(保留少量粉色沉淀),用2%的PEG重悬小球状液体至1ml以得到造影剂。
本发明公开的纳米金粒子靶向结合抗体的方法,以及由此制备得到的纳米金-抗体的造影剂,可以有效地用于活细胞内造影,或细胞成像。此外,还可以通过调整纳米金粒子表面抗体的种类的量,作用药物载体,以及在免疫诊断:如胶体金试纸条,胶体金免疫荧光试纸条,胶体金抗体筛选半固体培养基,等领域具有广泛的应用。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
原料
anti-CD3-FITC抗体,购自BD公司。
抗生物素抗体anti-biotin,为小鼠糖基化抗生物素单克隆抗体,购自Jackson。
抗-肌动蛋白抗体anti-actin,使用前用荧光标记试剂盒对其进行荧光标记,用于对细胞内肌动蛋白结合,对肌动蛋白纤维成像,购自Sigma。
抗原穿膜肽:TAT-HA2,购自ANASPEC。
生物素化递呈抗原混合液:2ul 7.1uM biotinylated TAT-HA2delivery peptide溶液稀释至98ul+2ul 2%PEG溶液。
纤维母细胞:从ATCC获得。
纳米金粒子溶液
采用柠檬酸三钠还原法制备。
将49ml超纯水置于100ml烧瓶中,伴随搅拌加热至沸腾,烧瓶上加冷凝柱防止水分蒸发。取1ml 12.7mM氯金酸溶液溶于49ml超纯水中,并逐滴连续加入0.94ml 38.8mM的柠檬酸三钠溶液。
此时溶液会在30秒内变为蓝色,之后150秒内变为酒红色。继续加热5分钟,冷却至室温。产生10-18nm球状分散的纳米金粒子。
该纳米金粒子溶液的紫外-可见吸收光谱示于图2中,图中可见,在520nm附近有吸收峰,与文献报道一致。
实施例1-细胞表面造影剂
氧化抗体:将anti-CD3-FITC稀释至90ul的水中,并与10ul 1M的Na2HPO4溶液相混合,得到100ul混合抗体溶液,其中抗体总浓度为1mg/ml。添加10ul100mM NaIO4溶液,于室温黑暗孵育30分钟后,添加500ul磷酸盐缓冲液(pH为7.5)停止反应。
抗体-连接子连接:以上溶液中添加2ul 46.5mM的连接子水溶液,室温孵育60分钟后,添加1ml 40mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液,混匀后用10MWCO 2000g 4℃过滤离心10分钟,此时超滤管中还余约25%的溶液;用40mM HEPES重悬余下溶液至终体积1ml,保证抗体浓度为100ug/ml,得到抗体-连接子悬液100ug/ml。
纳米金粒子连接:将100ul抗体-连接子溶液(100ug/ml)添加至1ml纳米金粒子溶液中,室温震荡孵育20分钟;再添加100ul mPEG-SH室温震荡孵育20分钟。
用10MWCO 2500g 4℃离心30分钟,弃去上清液,保留少量粉色沉淀;用2%的PEG重悬小球状液体至1ml,最终得到橙红色、具有靶向功能的纳米金抗体造影剂溶液。此为靶向于细胞表面分子的造影剂。
实施例2-活细胞内分子造影剂
氧化抗体:将小鼠糖基化抗生物素单克隆抗体与抗-肌动蛋白抗体按照1:1的比例混合稀释至90ul的水中,并与10ul 1M的Na2HPO4溶液相混合,得到100ul混合抗体溶液,其中抗体总浓度为1mg/ml。添加10ul 100mM NaIO4溶液,于室温黑暗孵育30分钟后,添加500ul磷酸盐缓冲液(pH为7.5)停止反应。
抗体-连接子连接:以上溶液中添加2ul 46.5mM的连接子水溶液,室温孵育60分钟后,添加1ml 40mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液,混匀后用10MWCO 2000g 4℃过滤离心10分钟,此时超滤管中还余约25%的溶液;用40mM HEPES重悬余下溶液至终体积1ml,保证抗体浓度为100ug/ml,得到抗体-连接子悬液100ug/ml。
纳米金粒子连接:将100ul抗体-连接子溶液(100ug/ml)添加至1ml纳米金粒子溶液中,室温震荡孵育20分钟;再添加100ul mPEG-SH室温震荡孵育20分钟。
为得到靶向于活细胞内分子的造影剂,可进一步将加入到生物素化TAT-HA2递呈肽溶液中,室温孵育20分钟;加入100ul的TAT-HA2-PEG混合液,室温孵育20分钟。
用10MWCO 2500g 4℃离心30分钟,弃去上清液,保留少量粉色沉淀;用2%的PEG重悬小球状液体至1ml,最终得到橙红色、具有靶向功能的纳米金抗体造影剂溶液。
TAT-HA2-PEG混合液如下配制:2ul的TAT-HA2溶液+98ul 2%(wt/vot)PEG溶液。其中PEG的分子量为15000-20000Da,并用PBS稀释至2%的浓度。
质量控制
抗体与纳米金粒子连接后,紫外-可见吸收峰与纳米金粒子相比有约3nm的红移,如图3所示。未连接抗体时,纳米金粒子溶液的吸收峰位于519nm处;连接抗体后,溶液的吸收峰位于525nm处。
若在约600nm处有吸收峰指示溶液中有聚集体,液体由红色变为蓝灰色,不可再使用。
细胞造影
图4所示为使用本发明实施例2制备得到的活细胞内分子造影剂在暗视野下对纤维母细胞靶向激动蛋白成像的图像。蓝色为细胞核,金色点状为本发明的纳米金粒子靶向标记抗体的细胞造影剂。可见本发明的造影剂进入活细胞内部,并于活细胞内的肌动蛋白稳定结合。
以上所述本发明的具体实施方式,并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形,均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种纳米金靶向标记抗体的造影剂,包括:
纳米金粒子核;
包覆纳米金粒子核并且Fab端暴露的一种或多种抗体,其中的一种抗体靶向于所要成像的分子并连接有荧光基团;
通过金硫醇键连接到纳米金粒子核表面的巯基聚乙二醇化合物;以及
具有下式I结构的连接子,
其中,所述连接子的巯基端通过金硫醇键吸附到纳米金粒子核表面,并且所述连接子的酰肼端与抗体的Fc端或非靶位点的糖基化位点共价连接。
2.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂,其特征在于,所述纳米金粒子的粒径为10-25nm。
3.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂,其特征在于,所要成像分子为细胞表面分子,并且所述抗体为一种。
4.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂,其特征在于,所要成像的分子为活细胞内分子,并且所述抗体有两种以上,其中的另一种抗体为抗生物素抗体,所述抗生物素抗体上还连接有抗原穿膜肽。
5.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体造影剂,其特征在于,所述巯基聚乙二醇化合物是分子量为5k Da的甲氧基-聚乙二醇-巯基。
6.一种制备权利要求1-5中任一项所述的纳米金靶向标记抗体的造影剂的方法,包括以下步骤:
S1氧化抗体:在抗体溶液中添加NaIO4,室温避光孵育,之后加入磷酸盐缓冲液停止反应,得到氧化抗体溶液,其中每10-15mg抗体添加0.1mmol的NaIO4;
S2使抗体与连接子相连:在氧化抗体溶液中添加与抗体等摩尔量的式I的连接子,室温孵育,之后加入HEPES溶液停止反应,得到抗体-连接子溶液;
S3连接纳米金粒子:将抗体-连接子溶液加入纳米金粒子溶液,室温震荡孵育,添加巯基聚乙二醇化合物溶液,室温震荡孵育,得到纳米金靶向标记抗体造影剂的溶液。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤S1中,抗体溶液的pH为7-8。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤S2还包括用10MWCO2000g 4℃过滤离心,并以HEPES溶液重悬余下溶液,以保证抗体-连接子溶液中抗体的浓度为100ug/ml。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,当所要成像的分子为细胞内分子时,步骤S3还包括:在添加巯基聚乙二醇化合物溶液并在室温震荡孵育之后,添加抗原穿膜肽-聚乙二醇混合溶液,室温震荡孵育。
10.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤S3还包括用10MWCO2000g-2500g 4℃过滤离心,并以HEPES溶液重悬沉淀。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210572229.3A CN103901191A (zh) | 2012-12-25 | 2012-12-25 | 纳米金靶向标记抗体的造影剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210572229.3A CN103901191A (zh) | 2012-12-25 | 2012-12-25 | 纳米金靶向标记抗体的造影剂及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103901191A true CN103901191A (zh) | 2014-07-02 |
Family
ID=50992649
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210572229.3A Pending CN103901191A (zh) | 2012-12-25 | 2012-12-25 | 纳米金靶向标记抗体的造影剂及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103901191A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104714018A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-06-17 | 武汉华美生物工程有限公司 | 胶体金微孔法检测试剂盒及其制备方法 |
CN107469093A (zh) * | 2017-09-05 | 2017-12-15 | 南方医科大学南方医院 | 纳米金‑meca‑79杂化物造影剂 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005016115A2 (en) * | 2003-01-23 | 2005-02-24 | Montana State University | Biosensors utilizing dendrimer-immobilized ligands and their use thereof |
CN101241128A (zh) * | 2008-03-18 | 2008-08-13 | 上海大学 | 黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法 |
CN101535244A (zh) * | 2005-11-23 | 2009-09-16 | 文塔納医疗系统公司 | 分子缀合物 |
-
2012
- 2012-12-25 CN CN201210572229.3A patent/CN103901191A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005016115A2 (en) * | 2003-01-23 | 2005-02-24 | Montana State University | Biosensors utilizing dendrimer-immobilized ligands and their use thereof |
CN101535244A (zh) * | 2005-11-23 | 2009-09-16 | 文塔納医疗系统公司 | 分子缀合物 |
CN101241128A (zh) * | 2008-03-18 | 2008-08-13 | 上海大学 | 黄曲霉毒素免疫亲和柱的制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
AILI ZHANG ET AL.: "Gold nanoclusters as contrast agents for fluorescent and X-ray dual-modality imaging", 《JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE》, vol. 372, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 239 - 244, XP028461935, DOI: doi:10.1016/j.jcis.2012.01.005 * |
LAKSHMINARAYANA POLAVARAPU ET AL.: "Biocompatible glutathione capped gold clusters as one- and two-photon excitation fluorescence contrast agents for live cells imaging", 《NANOSCALE》, vol. 3, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 429 - 434 * |
MATTI M. VAN SCHOONEVELD ET AL.: "A fluorescent, paramagnetic and PEGylated gold/silica nanoparticle for MRI, CT and fluorescence imaging", 《CONTRAST MEDIA MOL.IMAGING》, vol. 5, 7 May 2010 (2010-05-07), pages 231 - 236 * |
S KUMAR ET AL.: "Directional conjugation of antibodies to nanoparticles for synthesis of multiplexed optical contrast agents with both delivery and targeting moieties", 《NATURE PROTOCOLS》, vol. 3, no. 2, 7 February 2008 (2008-02-07), pages 314 - 320, XP 008102097, DOI: doi:10.1038/NPROT.2008.1 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104714018A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-06-17 | 武汉华美生物工程有限公司 | 胶体金微孔法检测试剂盒及其制备方法 |
CN107469093A (zh) * | 2017-09-05 | 2017-12-15 | 南方医科大学南方医院 | 纳米金‑meca‑79杂化物造影剂 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Upconversion nanoprobes for biodetections | |
Mickert et al. | Measurement of sub-femtomolar concentrations of prostate-specific antigen through single-molecule counting with an upconversion-linked immunosorbent assay | |
Luo et al. | Fluorescent silicon nanoparticles-based ratiometric fluorescence immunoassay for sensitive detection of ethyl carbamate in red wine | |
Gong et al. | Ag/SiO2 core-shell nanoparticle-based surface-enhanced Raman probes for immunoassay of cancer marker using silica-coated magnetic nanoparticles as separation tools | |
Wang et al. | An overview for the nanoparticles‐based quantitative lateral flow assay | |
Goryacheva et al. | Nanosized labels for rapid immunotests | |
Xu et al. | Metal-enhanced fluorescent dye-doped silica nanoparticles and magnetic separation: A sensitive platform for one-step fluorescence detection of prostate specific antigen | |
Yan et al. | Dye-doped nanoparticles for bioanalysis | |
Chen et al. | Sensitized luminescent terbium nanoparticles: preparation and time-resolved fluorescence assay for DNA | |
Wu et al. | Magnetic nanobead-based immunoassay for the simultaneous detection of aflatoxin B1 and ochratoxin A using upconversion nanoparticles as multicolor labels | |
Coto-García et al. | Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics | |
Tan et al. | Bionanotechnology based on silica nanoparticles | |
Arai et al. | Exploring the use of upconversion nanoparticles in chemical and biological sensors: from surface modifications to point-of-care devices | |
Xu et al. | Salt-induced gold nanoparticles aggregation lights up fluorescence of DNA-silver nanoclusters to monitor dual cancer markers carcinoembryonic antigen and carbohydrate antigen 125 | |
Bai et al. | A sensitive lateral flow test strip based on silica nanoparticle/CdTe quantum dot composite reporter probes | |
Miao et al. | A homogeneous and “off–on” fluorescence aptamer-based assay for chloramphenicol using vesicle quantum dot-gold colloid composite probes | |
Cao et al. | Cross-talk-free simultaneous fluoroimmunoassay of two biomarkers based on dual-color quantum dots | |
Huang et al. | Improving the performance of upconversion nanoprobe-based lateral flow immunoassays by supramolecular self-assembly core/shell strategies | |
Bu et al. | Multifunctional bacteria-derived tags for advancing immunoassay analytical performance with dual-channel switching and antibodies bioactivity sustaining | |
Fang et al. | Tuning surface states to achieve the modulated fluorescence of carbon dots for probing the activity of alkaline phosphatase and immunoassay of α-fetoprotein | |
CN109724949B (zh) | 一种用于肿瘤标志物可视化检测的柔性杂化膜的制备方法 | |
Lv et al. | Silica-encapsulated quantum dots for highly efficient and stable fluorescence immunoassay of C-reactive protein | |
Su et al. | Nano-labeled materials as detection tags for signal amplification in immunochromatographic assay | |
KR102257511B1 (ko) | 자성-광학 복합 나노구조체 | |
Liu et al. | QD-Biopolymer-TSPP assembly as efficient BiFRET sensor for ratiometric and visual detection of zinc ion |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140702 |