CN107469093A - 纳米金‑meca‑79杂化物造影剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米金‑MECA‑79杂化物造影剂。本发明所述的纳米金‑MECA‑79杂化物造影剂是通过以下步骤来制备的：羧基封端的PEG二硫醇（C‑PEG‑2S）的合成；利用柠檬酸钠还原法和配体交换反应合成C‑PEG‑2S纳米金颗粒，其大小符合纳米材料级别；通过偶联化学法把C‑PEG‑2S纳米金颗粒与MECA‑79单抗抗体连接到一起，得到纳米金‑MECA‑79杂化物造影剂。本发明所述的造影剂能够对淋巴结进行主动靶向性的结合以及高效CT成像，实现对淋巴结更清晰的CT成像，从而帮助临床医生做出更全面、准确的术前风险评估和临床决策。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤学、影像学、纳米技术等领域，涉及一种纳米金-MECA-79杂化物造影剂。
背景技术
淋巴结是哺乳动物重要的免疫器官，通过淋巴转移也是肿瘤发生转移的重要途径之一，因此对淋巴结进行成像观察，对于肿瘤是否发生淋巴转移，以及对肿瘤分期具有重要意义。淋巴结内的巨噬细胞具有显著的吞噬和清除异物的功能，病理状态下，来自身体其他部位的异物成分（包括肿瘤成分）可以通过血管进入淋巴结：随着血液循环的途径流经整个淋巴结；经过淋巴液进入淋巴结者，着床存活，逐渐增大，对周围的组织结构产生压迫或破坏，同时转移的淋巴结内的局部吞噬细胞数量将比正常区域明显减少或甚至消失。
目前临床上对于淋巴结成像主要有B超、MRI、CT、PET-CT等常用方法，这些方法各有优劣。B超是一种较早用于淋巴结转移的诊断，比较成熟的技术，对于表浅层淋巴结的成像和良恶性的判别，可以取得不错的效果，但对于深层组织的淋巴结成像，由于声波的穿透性以及周围组织吸收等问题，效果不是很理想，同时B超的结果易受操作技师的操作手法，经验等影响，具有一定的偏差。MRI具有强大的软组织成像功能，采用对比剂增强的MR淋巴管成像是一种新型无创性的检测方法，目前应用最广泛、较理想的对比剂是超顺磁性氧化铁（Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO）类对比剂，但是USPIO是通过被淋巴结髓质的吞噬细胞吞噬而显像的，属于被动靶向方式，一方面对淋巴结的特异性成像还是不够理想，另一方面可能会存在假阴性、假阳性的发生，影响诊断的正确性。CT成像因缺乏相应高效的对照剂，在目前淋巴结成像方面具有较大难度，常依赖医师的经验，同时对于粒径较小的淋巴结的判断具有较大难度。PET-CT在功能成像上具有巨大优势，对于淋巴结的良恶性判别具有较好的效果，但其因空间分辨率低等缺点，对淋巴结的成像也具有一定的局限性。同时因其价格昂贵、普及率等问题，目前在临床上难以大规模开展以及作为一种常用的常规检查手段。
L-选择素(L-selectin)存在于正常的淋巴细胞表面上，其正常功能是作为淋巴细胞到达外周淋巴结归巢的受体。淋巴结的高内皮微静脉(High Endothelial Venules)内皮细胞上、迷路及髓质中，均有L-选择素配体的高度表达，L-选择素配体的核心抗原是MECA-79，其单抗具有与L-选择素相似的作用，能高度特异性与L-选择素配体高表达区结合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米金-MECA-79杂化物造影剂，该造影剂能够对淋巴结进行主动靶向性的结合以及高效CT成像，实现对淋巴结更清晰的CT成像，从而帮助临床医生做出更全面、准确的术前风险评估和临床决策。
本发明所述的纳米金-MECA-79杂化物造影剂是通过以下步骤来制备的：A．羧基封端的PEG二硫醇（C-PEG-2S）的合成；B．利用柠檬酸钠还原法和配体交换反应合成C-PEG-2S纳米金颗粒，其大小符合纳米材料级别；C．通过偶联化学法把C-PEG-2S纳米金颗粒与MECA-79单抗抗体连接到一起，得到纳米金-MECA-79杂化物造影剂。
本发明所述的纳米金-MECA-79杂化物造影剂具有以下有益效果：
（1）本发明所述的造影剂能够对淋巴结进行主动靶向性结合，特异性的CT成像，有利于临床上对淋巴结的判断，从而对疾病进行更好的评估。
（2）本发明所述的造影剂基于纳米技术，能够对粒径较小的淋巴结亦有较好的成像效果。
（3）本发明所述的造影剂采用纳米金材料，生物相容性好，对人体的危害较小。
附图说明
图1为羧基封端的PEG二硫醇（C-PEG-2S）的合成流程图。
具体实施方式：
1.制备MECA-79单抗靶向性的纳米金颗粒
1.1 羧基封端的PEG二硫醇（C-PEG-2S）的合成，如图1所示。首先将10-十一碳烯-1-醇加入到氢化钠溶液（NaH溶解在DMF）中，搅拌2小时，后转移到高压釜中，再缓慢加入过量环氧乙烷，搅拌反应96个小时，将所得溶液的PH调到3，过滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱洗脱得到化合物Ⅰ。化合物1与氯乙酸钠盐反应生成化合物Ⅱ，其与溴发生加成反应生成化合物Ⅲ，最后通过与NaSH发生置换反应生成化合物Ⅳ（C-PEG-2S）。
1.2 利用柠檬酸钠还原法，通过在加热的四氯金酸氢盐溶液中加入柠檬酸钠，制备由柠檬酸盐稳定的直径约15mm的纳米金颗粒，再通过配体交换反应将C-PEG-2S涂覆在合成好的纳米金颗粒上，从而合成C-PEG-2S金纳米颗粒。接下来对其洗涤浓缩，获取浓度高，稳定的C-PEG-2S纳米金溶液。
1.3 首先将C-PEG-2S纳米金颗粒与EDC盐酸盐和MES缓冲液（pH =5）中的NHS反应，活化C-PEG-2S纳米金颗粒上面的羧基，接下来将浓缩的活化纳米金颗粒加入到含有MECA-79单抗抗体的稀释溶液中进行抗体附着，实现把MECA-79单抗抗体与活化的纳米金颗粒连接在一起，最终合成目标造影剂。
1.4 利用激光粒度分析仪和透射电镜等现代科学仪器对制备好的MECA-79单抗的纳米金造影剂的粒径大小，外观形态及分散程度等进行测定。所制备的造影剂的形状大致规则均匀，呈球形，粒径大小应在100nm以内，符合纳米级材料的级别。动态光散射测量测定其是否具备良好的分散性。另外还对每个纳米金颗粒所包含的抗体数量进行计算，这个可以从所用抗体的总原始量与回收得到的游离抗体的量之间的差异来进行计算。此外对合成好的造影剂的生物活性进行检测，确定其是否具有良好的生物活性，以在接下来的动物实验奠定良好的基础。
2.动物实验
2.1 X射线CT实验：将制备好的造影剂通过尾静脉注射到大鼠身上，同时作为对照组，向另外的大鼠注射大小大致一样的纳米金颗粒。两组大鼠都接受参数设置一致的CT检查，首先通过直观的CT阅片，观察淋巴结的信号强弱，再通过对淋巴结的CT值的对比，判断出制备的造影剂是否具有对淋巴结有主动靶向性结合，以及靶向性的效果。
2.2病理检查：取出大鼠的腹股沟淋巴结，用戊二醛和四氧化锇固定，脱水，超薄切片，通过透射电子显微镜检查实验组和对照组的淋巴结组织中金纳米颗粒的含量。
3. 结论
3.1纳米金-MECA-79杂化物造影剂能够对淋巴结的主动靶向性，特异性成像具有良好的效果；
3.2该造影剂同时亦能够对较小的淋巴结的CT成像也起到一个较好的效果。
Claims (1)
1.一种纳米金-MECA-79杂化物造影剂，其特征在于，所述造影剂是通过以下步骤来制备的：
A．羧基封端的PEG二硫醇（C-PEG-2S）的合成；
B．利用柠檬酸钠还原法和配体交换反应合成C-PEG-2S纳米金颗粒，其大小符合纳米材料级别；
C．通过偶联化学法把C-PEG-2S纳米金颗粒与MECA-79单抗抗体连接到一起，得到纳米金-MECA-79杂化物造影剂。
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