CN111317831A - 一种用于川崎病冠脉炎ct成像的纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用，该纳米探针为骨桥蛋白靶向的纳米探针anti‑OPN‑PEG‑Au，是由骨桥蛋白抗体和SH‑PEG‑COOH修饰的纳米金颗粒缩合而成，骨桥蛋白抗体的活性氨基与SH‑PEG‑COOH修饰的纳米金颗粒表面的活性羧基缩合相连。通过本发明所述制备方法制作的纳米探针可实现川崎病冠脉炎的在体成像，因此在冠脉瘤的预警方面具有良好的应用前景。同时制备简单，易于实现工业化生产。

Description

一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于医学诊断试剂技术领域，涉及一种医学诊断试剂中的分子探针及其制备方法，尤其是一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

川崎病(Kawasaki disease，KD)好发于6个月到5岁以下儿童，是危害较大且影响深远的血管炎症性疾病。它主要侵犯中、小动脉的血管壁，以冠状动脉为著，成为当今威胁儿童生命的主要心血管疾病。在川崎病所导致的众多心血管并发症中，冠脉损害事件的发生率和致死率占据榜首，而其中，由以冠状动脉瘤带来的后果最为严重。研究显示，在得不到及时治疗的情况下，约20％患儿会有冠状动脉瘤的形成，且有0.5％-1％的患儿会发生直径超过8mm的巨大动脉瘤，巨大动脉瘤一旦形成，康复概率微乎其微，导致缺血性心脏病、心肌梗死甚至猝死等严重后果。即便没有形成巨大动脉瘤，一旦冠脉血管壁发生病理改变，就有可能进而影响心肌功能。越来越多的病案报道了因为幼时的川崎病冠脉炎诱导的心肌炎以及成年后的心肌纤维化，并且一项针对60名因川崎病发生心梗的患者生存结局的研究显示，幸存的患者在10年后为84.6％，20年为79.4％，30年为62.7％。这些数据一方面证实了血管病变对于临床结局的重要性，另一方面也提醒我们：儿童时期因川崎病对冠脉血管壁产生的病理改变会一直伴随到成年，甚至引起严重后果。

临床上目前可用于诊断动脉瘤的手段包括：超声心动图、冠脉造影、多层螺旋CT等，其中对于儿童这一特殊群体，超声心动图是最常用的检测方法。但这些检查往往只能诊断出已形成的动脉瘤，而对于形成动脉瘤前的血管相关病变无法识别。因此，如何有效的识别导致动脉瘤形成的血管病变，实现早期预警，是目前儿童川崎病相关研究中亟待解决的难题。

川崎病的病理过程主要分为以下几个阶段：首先是病变初期的起始于血管腔内的急性血管炎，可见以中性粒细胞为代表的炎性细胞浸润，但未及全层。然后是淋巴细胞、巨噬细胞等，在被激活的同时会分泌炎症因子和蛋白酶如：弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶等，引起胶原蛋白的降解和弹性纤维层的断裂等，进而引发动脉瘤。与之紧密联系的是肌纤维细胞的增殖，由血管外膜的成纤维细胞、血管中膜的肌纤维细胞等细胞表型转化后形成的肌纤维细胞大量增殖，形成血栓和肉芽，造成冠脉部分或完全阻塞，引发心梗。其中以巨噬细胞为代表的炎症细胞的激活和以肌细胞的增殖分化这两个过程是川崎病发生动脉瘤以及造成严重后果的重要病理机制，且这两个过程联系紧密。申请人课题组在前期研究中(Qiao R,Qiao H,Zhang Y et al.Molecular Imaging of Vulnerable AtheroscleroticPlaques in Vivo with Osteopontin-Specific Upconversion Nanoprobes.ACSNano.2017Feb28；11(2):1816-1825.)发现：血管壁发生巨噬细胞浸润时，骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达量较高，血管壁胶原蛋白的含量也较低；反之，当血管壁的巨噬细胞浸润较少时，OPN表达量较低，而胶原蛋白的含量较高。预示着，血管壁的巨噬细胞聚集会诱导OPN的分泌。但是，当前还未有关于OPN能够作为靶向川崎病冠脉炎血管病变相关的纳米探针的任何报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用，该制备方法操作简单，经本发明制得的纳米探针能够实现川崎病冠脉炎的在体成像，稳定性好，识别效能高。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针，该纳米探针为骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au，是由骨桥蛋白抗体和SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒缩合而成，骨桥蛋白抗体的活性氨基与SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒表面的活性羧基缩合相连。

优选地，所述的SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒的平均直径为15nm，大小均一，Zeta电位为-32.8mv，颗粒的最大吸收为521nm。

本发明还公开了一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

1)在Au纳米颗粒中加入SH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团；

2)将偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒加入2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)中，然后加入骨桥蛋白抗体，37℃摇床吸附处理1h后加入EDC，于37℃摇床振荡过夜，经离心分离，制得骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au。

优选地，所述的Au纳米颗粒为平均粒径为15nm的Au纳米颗粒。

进一步优选地，平均粒径为15nm的Au纳米颗粒的制备方法如下：用250mL的圆底三颈瓶称取192mL H₂O，加入2mL 1％HAuCl₄，搅拌650rpm，加热煮沸，冷凝回流，加入6mL 1％柠檬酸钠，继续搅拌反应15min。

优选地，步骤1)中，Au纳米颗粒与SH-PEG-COOH的用量比为200mL：160mg；制得的表面带有羧基官能团的Au纳米颗粒的浓度为1mg/mL。

具体地，步骤1)的制备过程如下，在200mL 15nm Au纳米颗粒中加入160mg SH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团。将修饰上SH-PEG-COOH的15nm Au纳米粒子用100KD的超滤管超滤浓缩纯化，最后定容于10mL，使得Au纳米粒子的浓度为1mg/mL，并且过0.22μm滤膜除菌。

优选地，步骤2)中，反应用量配比为：

按照每4mL偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒中加入4mL 100mM MES，加入1mg骨桥蛋白抗体，加入160μL的EDC；

其中，骨桥蛋白抗体的浓度为30mg/mL；EDC的浓度为240mg/mL。

具体地，步骤2)的制备过程如下，取4mL偶联SH-PEG-COOH的15nm Au纳米颗粒(1mg/mL)加入4mL 100mM MES，pH＝4.8，加入1mg OPN抗体(30mg/mL，33μL),于37℃摇床吸附1h，加入EDC 240mg/mL,160μL，于37℃摇床振荡过夜。将反应过夜的15nm Au纳米颗粒采用22000g离心30min，去除上清，用0.02M PBS清洗2遍，分散在含有BSA的抗体金纳米粒子保存液中，保存液中含有的BSA会进一步对偶联EGFR抗体的Au棒表面非特异性吸附位点进行封闭。

本发明还公开了上述用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的应用，所述纳米探针用于川崎病冠脉炎的成像，具体通过选取与冠脉炎血管病变密切相关的关键分子OPN，从分子水平识别病变部位。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的纳米探针，基于分子影像技术平台，选择与川崎病冠脉炎关系密切的OPN抗体为靶向分子，并利用生物相容性优良的SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒作为载体，设计并构建可用于预警川崎病冠脉炎的的CT探针。该纳米探针成像靶点新颖，所选择的CT成像方法基于已成熟应用于临床的影像学平台，具有安全可靠的特点。基于识别血管病变部位的CT成像方法可以有望实现对对川崎病冠脉瘤形成的预警。

本发明以SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒为载体，通过缩合反应利用其活性羧基与OPN抗体的活性氨基稳定连接，获得用于CT成像的分子探针。其优点在于，PEG生物相容性好，其体内药理毒理过程明确，所构成的anti-OPN-PEG-Au结构稳定，可在水溶液中保存，毒性实验结果显示其较为安全，能够用于动物实验。此外，PEG修饰后可降低网状内皮系统，如单核细胞对磁性纳米铁颗粒的非特异吞噬，延长了探针在体循环中的存在时间，提高了探针效能。

进一步地，本发明所提供的纳米探针的载体PEG-Au，直径在15nm左右，大小均一，Zeta电位为-32.8mv，纳米颗粒体系的稳定性较好，在体CT成像可观察到探针标识部位的高信号点。

附图说明

图1为本发明的探针构建示意图；

图2为本发明的透射电镜(TEM)表征2.15nm的PEG-Au的结果图；

图3为本发明的紫外可见分光光度计检测探针的光谱结果图；

图4为探针水合粒径结果图；其中，(a)为PEG化Au水动力尺寸图；(b)为PEG化Au纳米粒子修饰OPN抗体后的水动力尺寸图；

图5为探针Zeta电位结果图；其中，(a)为PEG化Au的Zeta电位图；(b)为PEG化Au纳米粒子修饰OPN抗体后的Zeta电位图；

图6为探针细胞毒性检测结果图；其中，(a)为MTT结果；(b)、(c)、(d)、(e)和(f)为不同浓度探针的流式结果；

图7为anti-OPN-PEG-Au探针在体CT成像结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1，为本发明的纳米探针的构建示意图。包括：

1)在Au纳米颗粒中加入SH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团；

2)将偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒加入MES中，然后加入骨桥蛋白抗体，37℃摇床吸附处理1h后加入EDC，于37℃摇床振荡过夜，经离心分离，制得骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au。

实施例1

(1)用250mL的圆底三颈瓶称取192mL H₂O，加入2mL 1％HAuCl₄，搅拌650rpm，加热煮沸，冷凝回流，加入6mL 1％柠檬酸钠，继续搅拌反应15min。

(2)在200mL 15nm Au纳米颗粒中加入160mg SH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团。将修饰上SH-PEG-COOH的15nm Au纳米粒子用100KD的超滤管超滤浓缩纯化，最后定容于10mL，使得Au纳米粒子的浓度为1mg/mL，并且过0.22μm滤膜除菌。

(3)取4mL偶联SH-PEG-COOH的15nm Au纳米颗粒(1mg/mL)加入4mL 100mM MES，pH＝4.8，加入1mg OPN抗体(30mg/mL，33μL),于37℃摇床吸附1h，加入EDC 240mg/mL,160μL，于37℃摇床振荡过夜。将反应过夜的15nm Au纳米颗粒采用22000g离心30min，去除上清，用0.02M PBS清洗2遍，分散在含有BSA的抗体金纳米粒子保存液中，保存液中含有的BSA会进一步对偶联抗体的Au棒表面非特异性吸附位点进行封闭。

对上述实施例制得的探针表征鉴定及在体成像，结果如下：

1、透射电镜(TEM)对PEG-Au表征

用生理盐水将PEG-Au稀释至质量浓度小于0.1％，将其滴加在铜网上，烘干后使用透射电镜观察PEG-Au的形态。结果如图2所示：所得PEG-Au粒径较为均一，平均粒径约为15nm左右。

2、紫外分光光度计检测探针的光谱

纳米颗粒的荧光光谱：将样品用去离子水稀释调整至适当浓度，使用紫外可见分光光度计检测，结果如图3；

3、纳米颗粒的水合粒径和Zeta电位

将样品用去离子水稀释至适量浓度，用Malvern粒径分析仪检测纳米颗粒水动力学粒径分布和Zeta电位，结果如图4，图5。

从图4中可以看出，与PEG化Au纳米粒子的水动力尺寸相比，进一步偶联OPN抗体水化层反而变小(OPN：50.42nm；PEG-Au：57.9nm)，这可能是和抗体的亲疏水与羧基的亲水性相比发生改变有关。

从图5中可以看出，修饰了SH-PEG-COOH金纳米粒子在偶联OPN抗体后的表面电荷由-32.8mV上升到-7.65mV。SH-PEG-COOH通过和抗体表面的氨基发生偶联，消耗了大量的羧基，表面电荷改变。

4、纳米颗粒对原代血管外膜成纤维细胞毒性检测

4.1MTT法检测探针对细胞活性的影响：

1)选取生长状态良好的原代血管外膜成纤维细胞，用PBS缓慢将细胞吹下，将细胞沉淀移至离心管中，800r/min，离心5min；

2)弃掉上清，用细胞培养基重悬细胞，按之前所述进行细胞计数，将细胞加入96孔板(5000个/孔)，每个孔设4个副孔，置于孵箱孵育；

3)24h后向其中加入探针，浓度为15，25，50，75，100μg/ml，继续孵箱孵育24h后将孔板取出，每孔加入MTT溶液20μl(20mg MTT粉末加入4ml PBS中配制)；

4)37℃孵育4h后，小心吸去孔内液体，向每孔中加入150μl DMSO，震荡10min，使紫色结晶物充分溶解；

5)在酶联免疫仪上选择490nm波长测定各孔的吸光度，并进而计算五孔的平均值。

4.2细胞流式检测探针对细胞凋亡的影响

1)选取生长状态良好的巨噬细胞，种入6孔板(5×104个/孔)，待细胞贴壁后，加入探针(浓度为15，25，50，100μg/ml)，继续孵箱孵育24h；

2)用FITC-Annexin V和PI标记液标记细胞，流式细胞仪激发波波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI，用细胞流式软件计算阳性细胞数量。结果如图6。结果证实：即便纳米颗粒浓度达到100μg/ml，对细胞仍然未检出明显的毒性作用，说明我们构建的探针较为安全，可用于动物实验。

5、探针在体川崎病冠脉炎成像

选取5周大小雄性C57小鼠，将白色念珠菌水溶物(CAW)进行连续5天的腹腔注射，每只小鼠8mg/次。距离注射结束14天，将纳米探针经小鼠尾静脉注射(100μg/只)，注射40分钟后将小鼠麻醉，进行CT成像。参数如下：effective pixel size,29.8μm；80kVp,500μA；field of view,30.51mm×45.77mm；fly,360；binning,2。结果如图7，从图7中可出偶联OPN的探针注入后CT图像上可见亮信号点(已标识出)，暗示着对于心脏冠脉处的病变有指示作用。

综上所述，通过本发明所述制备方法制作的纳米探针可实现川崎病冠脉炎的在体成像，因此在冠脉瘤的预警方面具有良好的应用前景。同时制备简单，易于实现工业化生产。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针，其特征在于，该纳米探针为骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au，是由骨桥蛋白抗体和SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒缩合而成，骨桥蛋白抗体的活性氨基与SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒表面的活性羧基缩合相连。

2.如权利要求1所述的用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针，其特征在于，所述的SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒的平均直径为15nm，大小均一，Zeta电位为-32.8mv，颗粒的最大吸收为521nm。

3.一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在Au纳米颗粒中加入SH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团；

2)将偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒加入2-(N-吗啉)乙磺酸中，然后加入骨桥蛋白抗体，37℃摇床吸附处理1h后加入EDC，于37℃摇床振荡过夜，经离心分离，制得骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au。

4.根据权利要求3所述的用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述的Au纳米颗粒为平均粒径为15nm的Au纳米颗粒。

5.根据权利要求3所述的用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，Au纳米颗粒与SH-PEG-COOH的用量比为200mL：160mg；制得的表面带有羧基官能团的Au纳米颗粒的浓度为1mg/mL。

6.根据权利要求3所述的用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤2)中，反应用量配比为：

按照每4mL偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒中加入4mL 100mM MES，加入1mg骨桥蛋白抗体，加入160μL的EDC；

其中，骨桥蛋白抗体的浓度为30mg/mL；EDC的浓度为240mg/mL。

7.权利要求1或2所述的用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的应用，其特征在于，所述纳米探针用于川崎病冠脉炎的成像。

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