CN103055329A - 用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法，其用于早期预警易损斑块的实验研究，为创新型诊断试剂的研发和推广提供实验数据支持，不仅可以有效的早期发现和预警不稳定斑块，还可以评价抗动脉粥样硬化新型药物的疗效。本发明包括以下步骤：以聚乙烯亚胺PEI的Fe₃O₄纳米颗粒PEI-Fe₃O₄-NP为载体，通过化学合成法在载体表面连接profilin-1的抗体，形成靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针PF1-PEI-Fe₃O₄-NP。

Description

用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法

一、技术领域：

本发明涉及一种医学诊断试剂中的分子探针，尤其是涉及一种用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法。

二、背景技术：

目前， 以急性心肌梗死和心源性性猝死为主的急性心血管事件已成为危害人类健康的头号杀手。据统计，全世界每年约有2千万人死于急性心血管事件。在我国，情况同样不容乐观，每年有超过70万人死于急性心肌梗死和心源性猝死，这已经成为严重威胁我国居民健康的最重要疾病之一。而大部分的急性心肌梗死和心源性性猝死是由易损斑块（vulnerable plaque）的破裂所导致的。易损斑块是指那些不稳定和有血栓形成倾向的斑块，主要包括破裂斑块、侵蚀性斑块和部分钙化结节性病变。大量的研究表明，大部分的急性心肌梗死是由于轻、中度狭窄的易损斑块的破裂、继发血栓形成所致 。易损斑块所导致的血管狭窄程度并不高，很多患者没有前驱症状，临床上很难早期诊断，危险性极高。因此，如何尽早准确的识别和诊断易损斑块，进行有效的干预成为亟待解决的问题。目前常用于斑块检测的技术包括冠脉造影、血管内超声(IVUS)、激光相干断层显像(OCT)等，这些技术属于有创性的检查，花费昂贵，限制了其在临床上的普及。

分子影像学是近些年迅猛发展的一门新兴学科。它能够在活体状态下从分子水平观察细胞的功能代谢（包括功能基因和蛋白的表达变化），以实现对疾病的早期诊断和疗效评价。与传统医学影像技术相比，它具有高特异性、高灵敏度等特点、能够通过无创的方法提供分子水平的信息。分子影像技术是综合分子生物学、化学、纳米技术、数据图像处理等多学科技术的成果，目前已广泛用于肿瘤的诊断和靶向治疗方面的研究。分子影像技术在心血管领域研究始于上世纪70年代末，Davis等利用¹¹¹In观察颈动脉粥样硬化斑块和髂动脉血栓。近年来，随着对动脉粥样硬化易损斑块的病理生理机制不断深入研究，一系列新的示踪分子被发现，并作为靶点应用于新型分子探针的研发。这些示踪靶点包括与斑块不稳定性相关的蛋白酶类（比如金属蛋白酶MMPs和组织蛋白酶类CCPs）、细胞粘附分子（比如ICAM-1、VCAM-1等）、巨噬细胞的表面受体（比如SR-A）以及ox-LDL的表面抗原（比如MDA2，E06和IK17等）。但是，目前用于研究的探针主要由以下两点不足之处，第一，探针的靶点几乎都是在易损斑块形成的中晚期才会表达增高，而在疾病的早期并无明显变化，因此很难利用这些靶向探针实现对易损斑块的早期诊断。第二，在不少研究中，探针载体的选择一种是表面未经处理的Fe₃O₄纳米颗粒，它在生物体内的稳定性差，易于积聚，并且停留时间短，观察时间短；另一种是小分子Gd试剂具有很强的肾毒性，特别是对肾功能不全患者危害尤甚，另外在体内停留时间过短，其临床注射剂量较大。因此，目前关于易损斑块诊断的探针的研制急需解决的两个问题是选择生物相容性好的载体以及灵敏度和特异性好的靶点。聚乙烯亚胺(PEI)是一种水溶性聚胺，具有较低的生物毒性，常用于基因转染和生物递送的载体。PEI修饰的磁性Fe₃O₄纳米颗粒表面拥有大量的活性氨基，可与许多配体、抗体和药物连接，同时用于诊断和治疗。

国内外不少最新的研究发现，在动脉粥样硬化易损斑块，肌动蛋白结合蛋白前纤维蛋白-1（profilin-1）的表达明显增加，是动脉粥样硬化易损斑块形成的早期病理性标志之一，它本身也会进一步促进斑块的形成和发展，其机制可能与促进氧化型血脂成分的炎症应激反应有关。而profilin-1基因的缺失可以降低氧化低密度脂蛋白诱导的炎症介质的水平，改善内皮功能发挥保护作用。最新发表于《Nature cell biology》一项研究显示profilin-1的表达及磷酸化水平与内皮细胞的功能障碍和病理性的血管新生密切相关。大量的研究证实血管新生正是易损斑块形成和发展的始动因素之一，因此，profilin-1有望成为易损斑块的诊断和治疗的新靶点。

三、发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法，其用于早期预警易损斑块的实验研究，为创新型诊断试剂的研发和推广提供实验数据支持，不仅可以有效的早期发现和预警不稳定斑块， 还可以评价抗动脉粥样硬化新型药物的疗效。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：

一种用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：以聚乙烯亚胺PEI的Fe₃O₄纳米颗粒PEI-Fe₃O₄-NP为载体，通过化学合成法在载体表面连接profilin-1的抗体，形成靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针PF1-PEI-Fe₃O₄-NP。

上述步骤包括：

（1）将适量的FeCl₃和FeCl₂按照摩尔比2:1溶解到蒸馏水中，缓慢加入浓氨水将PH值调节到9.3-9.7之间，在N2的保护下高速搅拌，反应进行30min，然后用蒸馏水清洗，超声分散获得Fe₃O₄-NP；

（2）将制备好的Fe₃O₄-NP溶解于蒸馏水中，超声处理15min使得Fe₃O₄-NP完全分散于蒸馏水中，往溶液中缓慢加入70mgPEI，充分搅拌均匀后，转移至恒温37℃水浴内继续慢速搅拌24小时，然后12000 rpm/min高速离心分离出PEI修饰的Fe₃O₄-NP；

（3）1mg/ml PEI-Fe₃O₄-NP 加入0.15mg的EDC，搅拌溶解后，室温下静置5min；

（4）加入0.43mg NHS，搅拌溶解，室温下静置15min；

（5）加入66μl 0.5mol/L NaHCO₃溶液碱化纳米铁颗粒的溶液；

（6）加入profilin-1抗体，室温静置4h或4℃静置过夜;

（7）室温下，12000 rpm/min高速离心10 min，弃掉上清即未连接的抗体及PEI-Fe₃O₄-NP，沉淀再经0.9%生理盐水洗涤3遍后，收集沉淀，得到靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明基于分子影像技术平台， 选择profilin-1蛋白作为成像靶点，并利用生物相容性好的PEI（聚乙烯亚胺）修饰的Fe₃O₄纳米颗粒（10-20nm）作为载体，设计并构建的靶向profilin-1蛋白的新型MRI探针，用于早期预警易损斑块的实验研究，为创新型诊断试剂的研发和推广提供实验数据支持。本发明所设计的分子探针目前在国内外都未见报道， 属于原创型诊断试剂，利用它不仅可以有效的早期发现和预警不稳定斑块， 还可以评价抗动脉粥样硬化新型药物的疗效。

2、本发明以聚乙烯亚胺（PEI）的Fe₃O₄纳米颗粒（PEI-Fe₃O₄-NP）为载体，通过化学合成法在载体表面连接profilin-1的抗体，形成靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针（PF1-PEI-Fe₃O₄-NP）。一方面，选择PEI包裹的Fe₃O₄纳米颗粒作为载体，生物相容性好、毒性低，价格低廉、并可以在纳米粒载体表面的修饰功能基团，有利于连接靶向性配体。另一方面，由于Profiin-1蛋白在动脉粥样硬化斑块中表达明显增加，是其早期特异性的病理性标志物之一。在载体表面连接profilin-1的抗体能够增强探针的靶向性和灵敏度。

3、本发明所提供的探针载体PEI-Fe₃O₄-NP，直径在10-20nm，大小均一，分散性好。 Zeta电位为+30.5 mv， 纳米颗粒体系的稳定性较好。颗粒的饱和磁化强度为56.4emu/g，具有超顺磁性。MTT实验结果提示PEI-Fe₃O₄-NP不会明显抑制细胞的增殖能力，生物相容性较好，毒性低。利用3.0T MRI观察到探针PF1-PEI-Fe₃O₄-NP可以特异性的结合到易损斑块病变处。

四、附图说明：

图1 为透射电镜（TEM）观察PEI-Fe₃O₄-NP的外观结果图；

图2为Mastersizer 3000粒度分析仪观察PEI-Fe₃O₄-NP的粒径分布结果图；

图3为振动样品磁强计检测PEI-Fe₃O₄-NP的磁化率结果图；

图4为体外MTT实验检测PEI-Fe₃O₄-NP对细胞增殖的影响结果图；

图5为紫外分光光度分析结果图；

图6为vevo2100小动物超声结果图；

图7为血管壁组织油红染色结果图；

图8为profilin-1免疫荧光染色结果图。

五、具体实施方式：

本发明为一种用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法，包括以下步骤：以聚乙烯亚胺PEI的Fe₃O₄纳米颗粒PEI-Fe₃O₄-NP为载体，通过化学合成法在载体表面连接profilin-1的抗体，形成靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针PF1-PEI-Fe₃O₄-NP。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

1、将适量的FeCl₃和FeCl₂按照摩尔比2:1溶解到蒸馏水中，缓慢加入浓氨水将PH值调节到9.3-9.7之间，在N2的保护下高速搅拌，反应进行30min，然后用蒸馏水清洗，超声分散获得Fe₃O₄-NP

2、将制备好的Fe₃O₄-NP溶解于蒸馏水中，超声处理15min使得Fe₃O₄-NP完全分散于蒸馏水中，往溶液中缓慢加入70mgPEI，充分搅拌均匀后，转移至恒温水浴（37℃）内继续慢速搅拌24小时，然后12000 rpm/min高速离心分离出PEI修饰的Fe₃O₄-NP；

3、1mg/ml PEI-Fe₃O₄-NP 加入0.15mg的EDC，搅拌溶解后，室温下静置5min；

4、加入0.43mg NHS，搅拌溶解，室温下静置15min；

5、加入66μl 0.5mol/L NaHCO₃溶液碱化纳米铁颗粒的溶液；

6、加入profilin-1抗体，室温静置4h或4℃静置过夜;

7、室温下，12000 rpm/min高速离心10 min，弃掉上清（未连接的抗体及PEI-Fe₃O₄-NP），沉淀再经0.9%生理盐水洗涤3遍后，收集沉淀，得到靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针。

靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针鉴定：

1、透射电镜（TEM）观察PEI-Fe₃O₄-NP的外观

将PEI-Fe₃O₄-NP 1mg，用生理盐水稀释至质量浓度为0.05-0.1%，100w超声分散10min后将其滴加在铜网上，空气中常温干燥后于透射电镜下观察PEI-Fe₃O₄-NP的形态。观察结果如图1所示，PEI-Fe₃O₄-NP大小均一，呈球形，分散性好，仅有少量聚集现象，直径大概为10-20nm左右。

2、Mastersizer 3000粒度分析仪观察PEI-Fe₃O₄-NP的粒径分布

采用Mastersizer 3000型激光粒径仪对PEI-Fe₃O₄-NP进行粒径分析。观察结果如图2所示，PEI-Fe₃O₄-NP的粒径分布在5-25nm之间。Zeta电位为+30.5mv，体系较稳定，不容易发生集聚现象。

3、振动样品磁强计检测PEI-Fe₃O₄-NP的磁化率

磁化率的大小反映了PEI-Fe₃O₄-NP的磁响应能力，外加磁场一定时，磁化率越大说明颗粒具有越高的磁响应能力。利用振动样品磁强计检测PEI-Fe₃O₄-NP获得样品的磁化曲线。结果如图3所示，随着外加磁场磁化强度的增加，磁化强度值增大，两者呈非线性关系。当外加磁场增大到一定值时，继续增大外加磁场强度，磁化强度值保持不变，此时达到磁饱和，测得样品PEI-Fe₃O₄-NP的饱和磁化强度为56.4emu/g Fe，磁化曲线为一条过原点的单一曲线，说明当外加磁场为0时，PEI-Fe₃O₄-NP几乎没有剩磁，具有超顺磁性。

4、体外MTT实验检测PEI-Fe₃O₄-NP对细胞增殖的影响

 将单核巨噬细胞 ( RAW 264.7) 培养24小时后，接种于96孔培养板，分别加入Fe₃O₄-NP和PEI-Fe₃O₄-NP并调节纳米颗粒的终浓度为0、2.5、5、10、50、100、250和500μg/ml， 进行MTT检测。结果如图4所示：纳米颗粒终浓度为100、250和500μg/ml时，PEI-Fe₃O₄-NP干预组，细胞的增值能力明显高于Fe₃O₄-NP组（* p<0.05）。

5、紫外分光光度分析

将profilin-1抗体标记的PEI-Fe₃O₄-NP（PF1-PEI-Fe₃O₄-NP）和未标记的PEI-Fe₃O₄-NP分别进行紫外分光光度分析。结果如图5所示：profilin-1抗体标记的PEI-Fe₃O₄-NP在最大吸收波长在250-300nm左右，而未标记的PEI-Fe₃O₄-NP在此波长范围内处并无吸收峰，证实profilin-1 抗体成功连接到PEI-Fe₃O₄-NP上。

6、体内MRI成像和体外免疫荧光染色

健康雄性新西兰大白兔（n=30）， 通过球囊损伤腹主动脉+高脂高胆固醇饮食喂养16周构建兔动脉粥样硬化模型，通过vevo2100小动物超声和腹主动脉管壁组织的 油红染色确定造模成功。超声结果如图6所示，与对照组相比，实验组腹主动脉血管内膜不光滑连续，局部有斑块形成。血管壁组织油红染色结果（图7）显示，与对照组相比，实验组中腹主动脉血管管壁有大量染成红色的脂滴，提示有斑块形成。

筛选后动物随机分为①PEI-Fe₃O₄-NP实验组和②PF1-PEI-Fe₃O₄-NP实验组， 分别经耳缘静脉注射1ml不同类型的造影剂（PEI-Fe₃O₄-NP 或PF1-PEI-Fe₃O₄-NP）， 注射前和注射后4小时进行磁共振扫描。磁共振扫描采用的是3.0T MRI，扫描序列包括 T1WI SE,  T2WI TSE ( TR/TE=3000/48，filed view：8.0 cm×5.6 cm，flip angle：30° )。取腹主动脉斑块组织，4%多聚甲醛固定，进行profilin-1免疫荧光染色。

结果如图8所示：A-C:对照组，注射PF1-PEI-Fe₃O₄-NP前后，血管局部的MRI T2W1信号并无变化, 免疫荧光结果显示正常血管壁profilin-1蛋白低表达（bar=100μm）；D-F组：PEI-Fe₃O₄-NP实验组, 注射PEI-Fe₃O₄-NP前后，斑块局部MRI T2WI信号并无变化， 免疫荧光结果显示血管壁斑块内和profilin-1蛋白高表达（bar=100μm）；G-I：实验组，注射PF1-PEI-Fe₃O₄-NP后，斑块局部MRI T2WI信号明显减弱，免疫荧光结果血管壁斑块内profilin-1蛋白高表达（bar=100μm）。

Claims (2)

1.一种用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：以聚乙烯亚胺PEI的Fe₃O₄纳米颗粒PEI-Fe₃O₄-NP为载体，通过化学合成法在载体表面连接profilin-1的抗体，形成靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针PF1-PEI-Fe₃O₄-NP。

2.根据权利要求1所述的用于动脉粥样硬化易损斑块早期诊断的靶向磁性纳米探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将适量的FeCl₃和FeCl₂按照摩尔比2:1溶解到蒸馏水中，缓慢加入浓氨水将PH值调节到9.3-9.7之间，在N2的保护下高速搅拌，反应进行30min，然后用蒸馏水清洗，超声分散获得Fe₃O₄-NP；

（2）将制备好的Fe₃O₄-NP溶解于蒸馏水中，超声处理15min使得Fe₃O₄-NP完全分散于蒸馏水中，往溶液中缓慢加入70mgPEI，充分搅拌均匀后，转移至恒温37℃水浴内继续慢速搅拌24小时，然后12000 rpm/min高速离心分离出PEI修饰的Fe₃O₄-NP；

（3）1mg/ml PEI-Fe₃O₄-NP 加入0.15mg的EDC，搅拌溶解后，室温下静置5min；

（4）加入0.43mg NHS，搅拌溶解，室温下静置15min；

（5）加入66μl 0.5mol/L NaHCO₃溶液碱化纳米铁颗粒的溶液；

（6）加入profilin-1抗体，室温静置4h或4℃静置过夜；

（7）室温下，12000 rpm/min高速离心10 min，弃掉上清即未连接的抗体及PEI-Fe₃O₄-NP，沉淀再经0.9%生理盐水洗涤3遍后，收集沉淀，得到靶向profilin-1蛋白的磁性纳米探针。

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