CN108478817B

CN108478817B - 一种动脉粥样硬化检测试剂及其制备方法

Info

Publication number: CN108478817B
Application number: CN201810217741.3A
Authority: CN
Inventors: 刘志博; 徐扬; 何洋; 张俊
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2038-03-16
Also published as: CN108478817A

Abstract

本发明涉及一种对动脉粥样硬化斑块特异性结合的多肽衍生物，所述检测试剂能够评估动脉粥样硬化斑块脱落、引发脑卒中的风险程度。本发明还提供所述检测试剂的制备方法及用途。

Description

一种动脉粥样硬化检测试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术和临床诊断领域，特别是涉及利用多肽衍生物进行疾病的放射性检测，更具体的涉及一种动脉粥样硬化检测试剂、制备方法、应用。

背景技术

脑卒中是目前我国城乡居民主要疾病死亡构成比中最主要的原因，颈动脉粥样硬化是脑卒中的重要危险因素。颈动脉斑块脱落较其因体积大小而导致颈动脉的狭窄程度而言，在缺血性脑血管疾病中起着更关键的作用。目前评价颈动脉斑块脱落的无创性影像学方法包括颈动脉超声、超声造影、经颅多普勒超声、CT血管成像和高分辨MRI，可以从器官和组织水平观察血管的形态学改变、血流动力学改变，及动脉粥样硬化斑块的成分，然而由此评价斑块脱落的可能性并不理想。易脱落斑块在组织形态上被定义为柔软、富含脂质坏死中心、被具有巨噬细胞和T细胞浸润的薄纤维帽覆盖的斑块，这类斑块最终发生破裂脱落与局部炎性反应密切相关。

近年来有研究者尝试应用¹⁸F-FDG PET检查，将动脉粥样硬化的检查深入到了细胞水平，通过巨噬细胞摄取葡萄糖增多，代谢活性升高来反应斑块的炎症活动，然而¹⁸F-FDG在血管壁肌层和周围组织中也存在摄取，且巨噬细胞代谢活性升高也可因为大量吞噬胆固醇所致，并不一定反映斑块破裂相关的活动，易存在假阳性和假阴性。进而有研究者采用¹⁸F-NaF对动脉粥样硬化斑块的评估，研究发现斑块中微钙化、巨噬细胞、细胞凋亡、坏死均有高的¹⁸F-NaF的摄取，不能很好地反映斑块的易损性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种对动脉粥样硬化斑块特异性结合的多肽衍生物，所述检测试剂能够评估动脉粥样硬化斑块脱落、引发脑卒中的风险程度。

一方面，本发明提供一种动脉粥样硬化检测试剂，其特征在于包括式(I)的化合物，

X-linker-Y 式(I)

其中，所述的X具有式(II)所示的结构，

并且所述的Y为靶向功能的肽类衍生物。

进一步，本发明所述的动脉粥样硬化检测试剂，其中，所述的linker为Gly、pip、mini-PEG、min-PEGS、PEG2或PEG4。

更进一步，本发明所述的动脉粥样硬化检测试剂，其特征在于式(I)中所述的Y具有式(III)所示的结构，

K-K-R-P-X1-X2-X3-X4-X5-X6 式(III)

其中，X1～X6均为氨基酸或其衍生物。

更进一步，本发明所述的动脉粥样硬化检测试剂，其特征在于所述

X1为Pro或Hyp，

X2为Gly，

X3为Phe、Cha、Thi、Cpg或D-Igl，

X4为Ser，

X5为Pro、Hyp、D-Tic或D-Igl，

X6为Leu、Ile、Phe或Cpg。

第二方面，本发明提供一种用于评估动脉粥样硬化患者脑卒中风险的试剂盒，其包括上述本发明提供的检测试剂。

进一步，本发明所述的试剂盒，其中将所述检测试剂注射受试对象后进行影像学检测。

更进一步，本发明所述试剂盒，其中经过影像学检测如果信号强度越高，则发生脑卒中的风险就越高；反之，如果信号强度越低，则发生脑卒中的风险就越低。

本发明所述试剂盒也可用于评估动脉粥样硬化程度，或用于评估动脉粥样硬化斑块脱落风险。

第三方面，本发明提供一种合成式(I)化合物的方法，包括：

(1)固相合成法，在固相机制上从N端合成式(I)中的linker-Y部分；

(2)用95％TFA将合成的linker-Y部分从固相基质上切割下来，通过HPLC进行纯化；

(3)将式(IV)的化合物整合到步骤(2)纯化产物的N端；

(4)加入三氯化铝，110℃搅拌30min。

进一步，本发明所述合成式(I)化合物的方法，其特征在于：还包括可选的(5)HPLC纯化、质谱鉴定的步骤。

更进一步，本发明所述合成式(I)化合物的方法，其特征在于：还包括氟标记的步骤。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

(1)本发明所述检测试剂对动脉粥样硬化形成的炎症斑块具有高结合亲和力，注射后能够特异性的靶向动脉粥样硬化的斑块炎症病灶，结合医学影像检测能够迅速作出诊断，提高诊断的灵敏性和特异性。

(2)本发明所述检测试剂能够鉴别动脉粥样硬化的风险程度，研究表明本发明检测试剂对于临床上高风险性的、炎症程度高的、易脱落血管内病灶的结合亲和力远远高于低风险性的、炎症程度低的、不易脱落血管内病灶的结合亲和力。

(3)本发明所述检测试剂安全性高、稳定性好，在体内不易降解，体内注射后不产生对人体有害的有毒代谢产物。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1A和图1B，稳定性检测，其中：

图1A为血液中的放射活性；

图1B为小鼠体内的放射活性。

图2A和图2B，对小鼠动脉粥样硬化斑块的特异性结合，其中：

图2A为对照组，低危险性(不易脱落)动脉粥样硬化组；

图2B为实验组，高危险性(易脱落)动脉粥样硬化组。

图3：小鼠炎症模型中对炎症病灶的成像：炎症程度高的区域有高放射信号。

图4：恒河猴动脉粥样硬化斑块的鉴定：

a为恒河猴侧位PET/CT成像图；

b为副主动脉成像图，矢状面、横断面、冠状面；

c为股动脉成像图矢状面、横断面、冠状面；

d为关节成像图矢状面、横断面、冠状面。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

根据本发明的实施方式，提出一种对动脉粥样硬化斑块特异性结合的多肽衍生物，所述检测试剂能够评估动脉粥样硬化斑块脱落、引发脑卒中的风险程度。

实施例一、多肽衍生物类动脉粥样硬化检测试剂的合成

以本发明一个具体的检测试剂化合物为例，其合成步骤如下：

(1)利用固相合成方法在2-氯三苯甲基氯树脂上合成Fmoc保护的衍生多肽序列(Fmoc-Pip-Lys(Boc)-Lys-(Boc)-Arg(Pbf)-Pro-Hyp(tBu)-Gly-Cpg-Ser(tBu)-D-Tic-Cpg)。用20％哌啶/DMF处理树脂以除去Nα-Fmoc保护基团。用5mL N-甲基-2-吡咯烷酮中的N，N'-二异丙基碳化二亚胺(3当量)活化4-(溴甲基)苯乙酸(3当量)，然后偶联到N-末端。随后，通过在5mL的N-甲基-2-吡咯烷酮中的仲胺烷基化将1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-双(乙酸叔丁酯)(3当量)偶联至多肽序列。用95％TFA将多肽从树脂上切割下来，使用HPLC对合成的多肽进行纯化。

(2)取步骤(1)HPLC纯化后的多肽6.4mg加入0.3mL pH 7.0，0.002M的醋酸钠缓冲溶液中，加入1.5mg三氯化铝，混匀，110℃震荡30min。上样HPLC纯化，流速4.5mL/min，取洗脱峰进行ESI-MS检测，出峰位置在876.7。

(3)对上述多肽衍生物进行¹⁸F放射性标记，取步骤(2)纯化后的多肽20μg溶于10μLpH 4.4，2mM的醋酸钠缓冲溶液，加入110μL乙醇和10mCi 100μL ¹⁸F-NaF溶液，混匀105℃震荡15min，反应产物过Al柱。即得到具有放射活性的多肽衍生物。

实施例二、稳定性分析

稳定性是体内诊断试剂的重要指标，将实施例一制备获得的检测试剂在磷酸盐缓冲液和小鼠血清中37℃孵育5、15、30、60、120分钟，结束时用70％乙腈淬灭并离心20分钟，用放射性HPLC测定多肽的稳定性。所述多肽在磷酸盐缓冲液和小鼠血清中的稳定性可至少保持两个半衰期，说明该多肽有很好的稳定性。

实施例三、对动脉粥样硬化易脱落斑块的特异性鉴别

高脂饲料喂养ApoE基因敲除小鼠是常见的构建动脉粥样硬化模型的方法。ApoE-/-小鼠喂养高脂饲料40周后，常规方法鉴别高危动脉粥样硬化(易脱落、钙化低)个体和低危动脉粥样硬化(不易脱落、钙化高)个体。通过尾静脉注射实施例一制备获得的检测试剂7.4MBq，20分钟后进行PET/CT成像。图3给出了CT和PET/CT成像结果，表明该多肽在易脱落斑块处有高放射信号，而在CT可见的钙化斑块处几乎没有放射信号，实现了对动脉粥样硬化易脱落斑块的特异性鉴别。

实施例四、对易脱落斑块的特异性鉴别的作用机制

动脉粥样硬化中斑块脱落与脑卒中等重大疾病密切相关，由于动脉粥样硬化斑块脱落的风险可能与局部炎症相关，因此进一步研究了本发明所述多肽与动脉粥样硬化发生时局部炎症之间的关系。

首先构建小鼠肌肉炎症模型，在第0天和第4天在小鼠右后腿肌肉注射20μl松节油，在第5天进行PET/CT成像。

通过尾静脉注射实施例一制备获得的检测试剂7.4MBq，20分钟后进行PET/CT成像。成像结果显示(图3)，该试剂在小鼠局部炎症区域有特异性高摄取。将小鼠在相同时间点处死，解剖得炎症肌肉组织和正常肌肉组织，测放射性。用松节油诱导小鼠肌肉炎症模型，对小鼠进行PET/CT成像，可以看出所述检测试剂在小鼠肌肉炎症局部区域有特异性高摄取，生物分布的结果也验证了这一结论。

根据上述结果可得出以下结论，本发明所述检测试剂特异性鉴别检测动脉粥样硬化易脱落斑块(高危险性斑块)的机理在于，局部炎症及其程度的不同。动脉粥样硬化中，低危险性斑块钙化程度高、对血管内壁刺激小、局部炎症程度低，因而脱落的风险性小；高危险性斑块钙化程度低、对血管内壁刺激大、局部炎症程度高，因而脱落的风险性高。本发明检测试剂可能通过斑块钙化和炎症程度的不同，特异性鉴别其脱落风险，从而评估疾病进展和转归。

实施例五、对动脉粥样硬化危险程度的鉴别

为进一步验证本发明检测试剂对动脉粥样硬化危险程度的鉴别能力，为实现人类临床检测提供更确切的证据。在恒河猴模型中研究动脉粥样硬化危险程度的鉴别。

高脂饲料喂养恒河猴5年，建立恒河猴动脉粥样硬化模型。静脉注射实施例一制备获得的检测试剂37MBq，60分钟后进行PET/CT成像。

图4a给出恒河猴动脉粥样硬化模型的PET/CT成像结果，图4b-d图分别是该检测试剂在副主动脉、股动脉、关节处摄取情况的矢状面、横断面和冠状面。由图4可知本发明所述检测试剂在副主动脉、股动脉的高危斑块处和关节炎处都有很高的摄取，在恒河猴动物模型中进一步证实了该多肽对高危斑块的成像，也印证了其特异性鉴别检测动脉粥样硬化易脱落斑块(高危斑块)的作用机理在于对动脉粥样硬化局部炎症的鉴别。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种动脉粥样硬化检测试剂，其特征在于包括式(I)的化合物，

X-linker-Y 式(I)，

其中，所述的X具有式(II)所示的结构，

并且所述的Y为靶向功能的肽类衍生物；

其中，所述的linker为pip；

所述的Y具有式(III)所示的结构，

K-K-R-P-X1-X2-X3-X4-X5-X6 式(III)，

其中，X1～X6均为氨基酸或其衍生物；

X1为Hyp，

X2为Gly，

X3为Cpg，

X4为Ser，

X5为D-Tic，

X6为Cpg；

式(I)化合物的制备方法包括：固相合成Fmoc保护的衍生多肽序列，除去N端α-Fmoc保护基团；以N-甲基-2-吡咯烷酮中的N，N'-二异丙基碳化二亚胺活化4-(溴甲基)苯乙酸，偶联到N-端；通过N-甲基-2-吡咯烷酮中的仲胺烷基化偶联上式(IV)，

2.一种用于评估动脉粥样硬化患者脑卒中风险的试剂盒，其包括权利要求1所述的检测试剂。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其中将所述检测试剂注射受试对象后进行影像学检测。

4.如权利要求3所述试剂盒，其中经过影像学检测如果信号强度越高，则发生脑卒中的风险就越高；反之，如果信号强度越低，则发生脑卒中的风险就越低。

5.一种合成权利要求1所述式(I)化合物的方法，包括：

(1)固相合成Fmoc保护的衍生多肽序列，用哌啶/DMF除去N端α-Fmoc保护基团；

(3)以N-甲基-2-吡咯烷酮中的N，N'-二异丙基碳化二亚胺活化4-(溴甲基)苯乙酸，偶联到N-端；通过N-甲基-2-吡咯烷酮中的仲胺烷基化偶联上式(IV)，

(4)加入三氯化铝，110℃搅拌30min。

6.如权利要求5所述合成式(I)化合物的方法，其特征在于：还包括可选的(5)HPLC纯化、质谱鉴定的步骤。

7.如权利要求5所述合成式(I)化合物的方法，其特征在于：还包括氟标记的步骤。