CN105833299A - 用于动脉粥样硬化易损斑块诊断的MRI/optical双模态纳米探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明设计一种医学诊断试剂中的分子探针，尤其是涉及一种用于动脉粥样硬化易损斑块诊断的靶向MRI/optical双模态纳米探针的制备方法，该探针由OPN抗体和二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒缩合而成，OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应稳定连接。本发明提供用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针及其制备方法，其将丰富动脉粥样硬化斑块的诊断方法，通过MRI/optical双模态成像技术，识别易损斑块，从而早期预防心血管事件。本发明具有安全可靠的特点，提高了诊断的敏感性和特异性。

Description

用于动脉粥样硬化易损斑块诊断的MRI/optical双模态纳米探针的制备方法
技术领域
本发明设计一种医学诊断试剂中的分子探针，尤其是涉及一种用于动脉粥样硬化易损斑块诊断的靶向MRI/optical双模态纳米探针的制备方法。
背景技术
心血管疾病一直是世界上工业化及发展中国家人群的主要致死原因，而在我国，随着快速城市化、老龄化和生活方式的改变，心血管疾病已悄然成为我国居民的头号杀手。据估计，我国有心血管病患者2.9亿，脑卒中至少700万，心肌梗死250万，2013年由急性心梗导致的住院费用达114.7亿元。从这些令人震惊的数字中，我们看到如何更早的识别并预防心肌梗死是亟待解决的难题。
病理学研究证实，急性心梗通常是由于动脉粥样硬化斑块的破裂或侵蚀造成的，我们称这类斑块为“易损斑块”。临床上常用的冠脉造影、血管内超声(IVUS)、光学相干断层显像(OCT)等技术由于其有创、价格昂贵且无法全面地预测斑块的风险性，应用受到了限制。而分子影像是一种无创的成像手段，在成像介质的帮助下能够有效的识别斑块的生物学特征，从分子水平对斑块进行分析，从而成为极具希望的诊断方法。作为成像的介质，纳米材料因具有多种优点而优于其它很多材料。例如：纳米颗粒的大小与生物大分子如蛋白的大小相近；纳米颗粒的材料组成可以有多种，如脂质、金属等；纳米颗粒的制作过程可以被严格控制，进而影响在体的功能；纳米颗粒的表面积/体积比较大，可以在表面修饰很多分子如：抗体，siRNA等，从而协助研究。
有关分子靶点的选择已有多方面的研究，如细胞黏附分子，高密度脂蛋白等，但是对易损斑块的诊断仍达不到较理想的效果。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)与心血管疾病的关系非常密切，2003年就有临床研究表明，血清中OPN的水平与冠脉疾病的发生及发展息息相关，2006年临床研究发现OPN的含量在冠脉介入术后再狭窄患者体内较高，且已成为再狭窄的独立危险因素。这些结果说明，OPN与动脉粥样硬化疾病的发展相关。此外，OPN被认为在普通的单核细胞中不表达，但是巨噬细胞大量表达的蛋白，且能巨噬细胞的增殖和迁移，从而加重斑块的不稳定性。实验发现：不论是人类还是动物的动脉粥样硬化斑块中，OPN都是高表达的，且过表达OPN的小鼠，斑块的体积会增加，反之，OPN敲除的实验动物，斑块的体积会缩小。因此，OPN有望成为早期识别易损斑块的新靶点。
发明内容
本发明利用上述背景中技术方面的不足，提供用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针及其制备方法，其将丰富动脉粥样硬化斑块的诊断方法，通过MRI/optical双模态成像技术，识别易损斑块，从而早期预防心血管事件。
为实现上述目的，提供了一种用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针，该探针由OPN抗体和二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒缩合而成，OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应稳定连接。
其中，二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒直径在7nm左右，大小均一，Zeta电位为-39.2mv，颗粒的饱和磁化强度为51.4emu/g。
该探针的制备方法为将10mg DMSA-MNPs分散于5ml pH＝9的硼酸盐缓冲液，加入浓度均为10mg/ml的EDC 0.02ml、Sulfo-NHS 0.01ml，37℃下反应30分钟，加入2mgOPN抗体在4℃过夜；OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应稳定连接，经离心分离得到OPN靶向的MRI磁性纳米探针anti-OPN-DMSA-MNPs。
进一步的，该探针的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将2.7g FeCl3·6H2O和8.5ml油酸溶于50mL甲醛，在持续搅拌条件下，缓慢滴定含1.2g NaOH的甲醛溶液100ml，将棕褐色沉淀物用甲醇清洗后真空干燥去除溶剂；所得油酸盐可在70℃条件下溶解于十八醇，稀释至0.39mol/ml可于室温下稳定储存；
(2)取2ml该储存液加入8ml十八醇和1ml油酸，在接入氮气保护的条件下，将混合物以稳定升温速率加热至320℃后保持30分钟，加入过量乙醇冷却离心后可获得Fe3O4纳米颗粒(MNPs)；
(3)取200mg上述Fe3O4纳米颗粒溶解于20ml氯仿，加入0.1ml三乙胺后与溶解有100mg二巯基丁二酸(DMSA)的二甲基亚砜溶液20ml充分混匀；加热至60℃后持续搅拌12小时，离心后乙醇洗涤沉淀物可获得DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒(DMSA-MNPs)；
(4)取10mg上述DMSA-MNPs，分散于5ml pH＝9的硼酸盐缓冲液，加入浓度均为10mg/ml的EDC 0.02ml、Sulfo-NHS 0.01ml，37℃下反应30分钟，加入2mgOPN抗体在4℃过夜；OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应可稳定连接；
(5)室温下，12000转/分钟高速离心30分钟并通过永磁体辅助磁性分离，弃上清去除游离的OPN抗体，所得沉淀经无菌PBS清洗后超声分散重悬，即得到OPN靶向的MRI磁性纳米探针anti-OPN-DMSA-MNPs；
(6)取上述磁共振探针5mg溶于5ml纯水中，加入浓度为20mg/ml的Cy5.5-NHS的DMSO溶液100μl，反应容器用锡箔纸包裹避光，固定于翻转摇床上室温下摇晃4h；
(7)13,000rpm离心20min，用强力磁铁吸住沉淀，小心吸去上清，用去离子水清洗3-5次，所得沉淀为Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs。
另外，本发明还提供了用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针的制备方法：以OPN为靶向工具，以二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒为载体，通过OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基缩合反应合成MRI/optical双模态分子影像探针Cy5.5-anti-OPN-DMSA-Fe3O4，该探针可应用在体MRI/optical成像以评价斑块内巨噬细胞的分布和密度，借此识别不稳定斑块并评价其风险。
进一步的，包括以下步骤：
(1)将2.7g FeCl3·6H2O和8.5ml油酸溶于50mL甲醛，在持续搅拌条件下，缓慢滴定含1.2g NaOH的甲醛溶液100ml，将棕褐色沉淀物用甲醇清洗后真空干燥去除溶剂；所得油酸盐可在70℃条件下溶解于十八醇，稀释至0.39mol/ml可于室温下稳定储存；
(2)取2ml该储存液加入8ml十八醇和1ml油酸，在接入氮气保护的条件下，将混合物以稳定升温速率加热至320℃后保持30分钟，加入过量乙醇冷却离心后可获得Fe3O4纳米颗粒(MNPs)；
(3)取200mg上述Fe3O4纳米颗粒溶解于20ml氯仿，加入0.1ml三乙胺后与溶解有100mg二巯基丁二酸(DMSA)的二甲基亚砜溶液20ml充分混匀；加热至60℃后持续搅拌12小时，离心后乙醇洗涤沉淀物可获得DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒(DMSA-MNPs)；
(4)取10mg上述DMSA-MNPs，分散于5ml pH＝9的硼酸盐缓冲液，加入浓度均为10mg/ml的EDC 0.02ml、Sulfo-NHS 0.01ml，37℃下反应30分钟，加入2mgOPN抗体在4℃过夜；抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应可稳定连接；
(5)室温下，12000转/分钟高速离心30分钟并通过永磁体辅助磁性分离，弃上清去除游离的OPN抗体，所得沉淀经无菌PBS清洗后超声分散重悬，即得到OPN靶向的MRI磁性纳米探针anti-OPN-DMSA-MNPs；
(6)取上述磁共振探针5mg溶于5ml纯水中，加入浓度为20mg/ml的Cy5.5-NHS的DMSO溶液100μl，反应容器用锡箔纸包裹避光，固定于翻转摇床上室温下摇晃4h；
(7)13,000rpm离心20min，用强力磁铁吸住沉淀，小心吸去上清，用去离子水清洗3-5次，所得沉淀为Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、本发明基于分子影像技术平台，选择可识别巨噬细胞的OPN抗体为靶向分子，并利用生物相容性优良的DMSA(二巯基丁二酸)修饰的Fe3O4纳米颗粒(平均粒径7nm)作为载体，设计并构建可用于预警易损斑块的双模态分子探针。成像靶点新颖，所选择的MRI/optical成像方法基于已成熟应用于临床的影像学平台，具有安全可靠的特点，此外两种成像模态相结合可实现解剖与功能两个层面识别的互补，提高了诊断的敏感性和特异性。基于识别斑块中巨噬细胞的双模态成像方法不仅可以有效的早期识别易损斑块，还可以基于此研发抗动脉粥样硬化药物。
MRI在成像中具有较高的空间分辨率，但其敏感性较弱，对探针的识别较差，且其因操作时间长、对金属敏感等因素在临床应用上受到限制。光学成像恰恰弥补其这一劣势，其易于识别探针信号，敏感性较好，获取实验结果的速度也较快。从我们的成像结果中也可以看出，光学成像的结果相较于MRI而言更为直观。将这二者结合，能够更好地判断动脉粥样硬化斑块的所在位置。相对于PET而言，光学成像的花费小，未来临床的普及度也更大。
2、本发明以二巯基丁二酸(DMSA)修饰的Fe3O4纳米颗粒(DMSA-MNPs)为载体，通过缩合反应利用其活性羧基与OPN抗体的活性氨基稳定连接，类似的再串联上活化的Cy5.5，获得用于MRI/optical双功能分子探针。其优点在于，DMSA生物相容性好，其体内药理毒理过程明确，所构成的anti-OPN-DMSA-MNPs结构稳定，可在水溶液中保存。此外，DMSA修饰后可降低网状内皮系统，如单核细胞对磁性纳米铁颗粒的非特异吞噬，延长了探针在体循环中的存在时间，提高了探针效能。
本发明所提供的成像技术使用探针载体DMSA-MNPs，直径在7nm左右，大小均一，Zeta电位为-39.2mv，纳米颗粒体系的稳定性较好，颗粒的饱和磁化强度为51.4emu/g。斑块组织切片免疫荧光共染色显示OPN与CD68分子分布一致，证实OPN可识别斑块中巨噬细胞聚集的部位。1.0T MRI在体成像可观察到探针anti-OPN-DMSA-MNPs造成易损斑块T2信号衰减，普鲁士蓝染色在斑块组织切片中证实了磁性纳米颗粒的存在。光学成像可显示探针在动脉粥样硬化小鼠模型中各器官和组织的分布以及信号强度，其中不稳定斑块可明显显影。
附图说明
图1为透射电镜(TEM)表征DMSA-MNPs的结果图；
图2为振动样品磁强计检测DMSA-MNPs的磁化率结果图；
图3为巨噬细胞Raw264.7体外吞噬靶向探针anti-OPN-DMSA-MNPs的结果图；
图4为ApoE-/-小鼠高脂喂养四月后动脉粥样硬化模型血管大体外观及油红染色结果图；
图5为在体磁共振分子探针T2加权像成像和荧光成像结果图；
图6为体外普鲁士蓝染色和斑块部位的组化结果图。
具体实施方式
本发明为用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针的制备方法，包括以下步骤：以OPN为靶向工具，以二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒为载体，通过缩合反应化学合成MRI/optical双模态分子影像探针Cy5.5-anti-OPN-DMSA-Fe3O4，可应用在体MRI/optical成像以评价斑块内巨噬细胞的分布和密度，借此识别不稳定斑块并评价其风险。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明实施例中所需要的材料、试剂均可市场购得。
实施例1
(1)将2.7g FeCl3·6H2O和8.5ml油酸溶于50mL甲醛，在持续搅拌条件下，缓慢滴定含1.2g NaOH的甲醛溶液100ml，将棕褐色沉淀物用甲醇清洗后真空干燥去除溶剂。所得油酸盐可在70℃条件下溶解于十八醇，稀释至0.39mol/ml可于室温下稳定储存。
(2)取2ml该储存液加入8ml十八醇和1ml油酸，在接入氮气保护的条件下，将混合物以稳定升温速率加热至320℃后保持30分钟，加入过量乙醇冷却离心后可获得Fe3O4纳米颗粒(MNPs)。
(3)取200mg上述Fe3O4纳米颗粒溶解于20ml氯仿，加入0.1ml三乙胺后与溶解有100mg二巯基丁二酸(DMSA)的二甲基亚砜溶液20ml充分混匀。加热至60℃后持续搅拌12小时，离心后乙醇洗涤沉淀物可获得DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒(DMSA-MNPs)。
(4)取10mg上述DMSA-MNPs，分散于5ml pH＝9的硼酸盐缓冲液，加入浓度均为10mg/ml的EDC 0.02ml、Sulfo-NHS 0.01ml，37℃下反应30分钟，加入2mgOPN抗体在4℃过夜。抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应可稳定连接。
(5)室温下，12000转/分钟高速离心30分钟并通过永磁体辅助磁性分离，弃上清去除游离的OPN抗体，所得沉淀经无菌PBS清洗后超声分散重悬，即得到OPN靶向的MRI磁性纳米探针anti-OPN-DMSA-MNPs。
(6)取上述磁共振探针5mg溶于5ml纯水中，加入浓度为20mg/ml的Cy5.5-NHS的DMSO溶液100μl，反应容器用锡箔纸包裹避光，固定于翻转摇床上室温下摇晃4h。
(7)13,000rpm离心20min，用强力磁铁吸住沉淀，小心吸去上清，用去离子水清洗3-5次，所得沉淀为Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs。
MRI/optical双模态分子探针表征鉴定及在体成像：
1.透射电镜(TEM)对DMSA-MNPs表征
用生理盐水将DMSA-MNPs稀释至质量浓度小于0.1％，将其滴加在铜网上，烘干后使用透射电镜观察DMSA-MNPs的形态。结果如图1所示：所得DMSA-MNPs粒径较为均一，平均粒径约为7nm左右。
2.振动样品磁强计检测DMSA-MNPs的磁化率
磁化率反应了DMSA-MNPs的磁响应能力，其受Fe3O4纳米颗粒结构和表面修饰物的影响，当加大DMSA投料比例以增加纳米颗粒表面功能集团数目时，DMSA-MNPs的磁响应能力下降。使用振动样品检测可获得DMSA-MNPs的磁化曲线。结果如图2所示，随着外加磁场的增强，磁化强度值非线性增大，本样品饱和磁化强度为51.4emu/g，磁化曲线为一条过原点的单一曲线，显示DMSA-MNPs具有超顺磁性，可缩短磁共振T2弛豫时间，减弱T2信号强度。
3.巨噬细胞(RAW264.7)体外吞噬靶向探针Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs
将巨噬细胞以1×105密度接种于数块24孔板，待细胞贴壁后用ox-LDL(50μg/ml)刺激细胞24小时诱导泡沫细胞形成，之后向各孔分别加入Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs和DMSA-MNPs,调整终浓度为0.03mg/ml于细胞培养箱中共培养12小时。1640培养及洗涤数次去除游离纳米颗粒后使用4％多聚甲醛固定5分钟，普鲁士蓝染色10分钟后比较不同分组对两种纳米颗粒的吞噬摄取。结果如图3所示，ox-LDL刺激组细胞内Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs纳米颗粒含量显著高于其它组(P<0.05)，显示OPN抗体可增强泡沫细胞对Fe3O4纳米的摄取。
4.ApoE-/-小鼠血管大体标本及斑块病理切片组织学染色
为验证新西兰兔动脉粥样硬化模型成功建立，为在体斑块成像打下基础，处死动物后取腹主动脉进行组织学染色。如图4所示，肉眼可见血管壁有不规则白色凸起，剪开血管后进行油红染色。与正常对照组相比，模型组血管壁有明显斑块形成。取斑块病理切片行HE染色，马松染色可显示斑块中纤维化及脂质沉积成分。
5.在体对斑块optical/MRI成像和病理切片普鲁士蓝染色
将30只建模成功的ApoE-/-小鼠分为两组，以普食喂养的ApoE-/-小鼠作为对照，麻醉后分别按5mg/kg体重剂量通过尾静脉注射靶向探针Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs，于注射后24小时 使用1.0TMRI进行颈动脉磁共振扫描T2成像。注射后24小时，48小时，72小时用小动物活体成像仪行光学成像，处死动物后取颈动脉斑块，病理切片后行普鲁士蓝染色检测纳米铁颗粒。
结果如图5所示：相比普食喂养的ApoE-/-小鼠组，建模成功的ApoE-/-小鼠组注射探针24小时，MRI成像颈动脉斑块处T2信号明显减弱，注射探针24小时、48小时和72小时的光学成像结果显示动脉粥样硬化模型组小鼠颈动脉处信号明显增强。结果如图6所示：组织切片处普鲁士蓝染色可发现Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs组纳米颗粒在动脉粥样硬化模型血管壁斑块组织中沉积聚集明显高于对照组(bar＝100μm)。

Claims (6)

1.一种用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针，其特征在于：由OPN抗体和二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒缩合而成，OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应稳定连接。
2.根据权利要求1所述的用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针，其特征在于：二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒直径在7nm左右，大小均一，Zeta电位为-39.2mv，颗粒的饱和磁化强度为51.4emu/g。
3.根据权利要求1或2所述的用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针，其特征在于：该探针的制备方法为将10mg DMSA-MNPs分散于5ml pH＝9的硼酸盐缓冲液，加入浓度均为10mg/ml的EDC 0.02ml、Sulfo-NHS 0.01ml，37℃下反应30分钟，加入2mgOPN抗体在4℃过夜；OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应稳定连接，经离心分离得到OPN靶向的MRI磁性纳米探针anti-OPN-DMSA-MNPs。
4.根据权利要求3所述的用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针，其特征在于：该探针的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将2.7g FeCl3·6H2O和8.5ml油酸溶于50mL甲醛，在持续搅拌条件下，缓慢滴定含1.2g NaOH的甲醛溶液100ml，将棕褐色沉淀物用甲醇清洗后真空干燥去除溶剂；所得油酸盐可在70℃条件下溶解于十八醇，稀释至0.39mol/ml可于室温下稳定储存；
(2)取2ml该储存液加入8ml十八醇和1ml油酸，在接入氮气保护的条件下，将混合物以稳定升温速率加热至320℃后保持30分钟，加入过量乙醇冷却离心后可获得Fe3O4纳米颗粒(MNPs)；
(3)取200mg上述Fe3O4纳米颗粒溶解于20ml氯仿，加入0.1ml三乙胺后与溶解有100mg二巯基丁二酸(DMSA)的二甲基亚砜溶液20ml充分混匀；加热至60℃后持续搅拌12小时，离心后乙醇洗涤沉淀物可获得DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒(DMSA-MNPs)；
(4)取10mg上述DMSA-MNPs，分散于5ml pH＝9的硼酸盐缓冲液，加入浓度均为10mg/ml的EDC 0.02ml、Sulfo-NHS 0.01ml，37℃下反应30分钟，加入2mgOPN抗体在4℃过夜；OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应可稳定连接；
(5)室温下，12000转/分钟高速离心30分钟并通过永磁体辅助磁性分离，弃上清去除游离的OPN抗体，所得沉淀经无菌PBS清洗后超声分散重悬，即得到OPN靶向的MRI磁性纳米探针anti-OPN-DMSA-MNPs；
(6)取上述磁共振探针5mg溶于5ml纯水中，加入浓度为20mg/ml的Cy5.5-NHS的DMSO溶液100μl，反应容器用锡箔纸包裹避光，固定于翻转摇床上室温下摇晃4h；
(7)13,000rpm离心20min，用强力磁铁吸住沉淀，小心吸去上清，用去离子水清洗3-5次，所得沉淀为Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs。
5.权利要求1或2所述探针的制备方法，包括以下步骤：以OPN为靶向工具，以二巯基丁二酸(DMSA)修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒为载体，通过OPN抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基缩合反应合成MRI/optical双模态分子影像探针Cy5.5-anti-OPN-DMSA-Fe3O4，该探针可应用在体MRI/optical成像以评价斑块内巨噬细胞的分布和密度，借此识别不稳定斑块并评价其风险。
6.根据权利要求5所述的用于动脉粥样硬化易损斑块MRI/optical双模态分子影像学成像探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将2.7g FeCl3·6H2O和8.5ml油酸溶于50mL甲醛，在持续搅拌条件下，缓慢滴定含1.2g NaOH的甲醛溶液100ml，将棕褐色沉淀物用甲醇清洗后真空干燥去除溶剂；所得油酸盐可在70℃条件下溶解于十八醇，稀释至0.39mol/ml可于室温下稳定储存；
(2)取2ml该储存液加入8ml十八醇和1ml油酸，在接入氮气保护的条件下，将混合物以稳定升温速率加热至320℃后保持30分钟，加入过量乙醇冷却离心后可获得Fe3O4纳米颗粒(MNPs)；
(3)取200mg上述Fe3O4纳米颗粒溶解于20ml氯仿，加入0.1ml三乙胺后与溶解有100mg二巯基丁二酸(DMSA)的二甲基亚砜溶液20ml充分混匀；加热至60℃后持续搅拌12小时，离心后乙醇洗涤沉淀物可获得DMSA修饰的Fe3O4纳米颗粒(DMSA-MNPs)；
(4)取10mg上述DMSA-MNPs，分散于5ml pH＝9的硼酸盐缓冲液，加入浓度均为10mg/ml的EDC 0.02ml、Sulfo-NHS 0.01ml，37℃下反应30分钟，加入2mgOPN抗体在4℃过夜；抗体的活性氨基与纳米颗粒表面DMSA的活性羧基通过缩合反应可稳定连接；
(5)室温下，12000转/分钟高速离心30分钟并通过永磁体辅助磁性分离，弃上清去除游离的OPN抗体，所得沉淀经无菌PBS清洗后超声分散重悬，即得到OPN靶向的MRI磁性纳米探针anti-OPN-DMSA-MNPs；
(6)取上述磁共振探针5mg溶于5ml纯水中，加入浓度为20mg/ml的Cy5.5-NHS的DMSO溶液100μl，反应容器用锡箔纸包裹避光，固定于翻转摇床上室温下摇晃4h；
(7)13,000rpm离心20min，用强力磁铁吸住沉淀，小心吸去上清，用去离子水清洗3-5 次，所得沉淀为Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs。
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