CN106581698A - 用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态纳米探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及超声分子探针领域，尤其涉及一种用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态分子探针及其制备方法和应用。一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的荧光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，荧光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。本发明丰富动脉粥样硬化斑块的诊断方法，通过超声和荧光双模态成像技术，识别易损斑块，从而早期预防心血管事件。
Description
技术领域
本发明涉及超声分子探针领域，尤其涉及一种用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
缺血性心脏病已逐渐成为威胁人类健康的第一杀手，包括心肌梗死在内的急性冠脉事件是冠心病致死及降低公众生活质量的首要原因。而在急性冠脉事件中，易损斑块的破裂是导致急性心血管事件的主要元凶。易损斑块由薄的纤维帽、包含脂质和活化巨噬细胞的较大坏死物核心及微钙化构成，它们均为急性心血管事件最强的预测因素之一，斑块的不稳定性极易触发血栓形成进而血管闭塞和心肌梗死。动脉粥样硬化斑块进展过程中，骨桥蛋白OPN在巨噬细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞均有表达，且具有募集巨噬细胞的作用，引起坏死中心扩大，纤维帽的变薄，直到在血液的剪切力下斑块发生破裂。同时OPN基因是血管平滑肌由收缩表型向合成表型转化的标志性基因，斑块不稳定性成分微钙化中OPN也扮演着举足轻重的角色。
超声微泡造影剂是一类能显著增强超声背向散射强度的化学制剂，微泡在超声作用下发生震动，散射强超声信号，得到超声回波，从而清晰显示组织位置结构大小。由于其安全无毒无污染，可无创显影，可重复可定量，支持实时动态观察，包壳及核心均可修饰，可设计多靶点和多模式的分子探针，可包裹药物实现诊疗一体化，灵敏度高等优点，近年来在更加精细化的超声诊断及治疗中呈现出良好的应用前景。荧光染料由于其灵敏度高、操作方便、低成本、无辐射等优点逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，广泛应用于分子影像领域。靶向分子探针通常由识别基团和报告基团组成，前者决定探针的选择性和特异性，后者决定识别的灵敏度。
发明内容
本发明结合当今冠心病临床介入诊疗中血管腔内超声成像的广泛应用，利用上述背景中技术，提供用于动脉粥样硬化不稳定斑块超声荧光分子影像学成像探针及其制备方法，其将丰富动脉粥样硬化斑块的诊断方法，通过超声和荧光双模态成像技术，识别易损斑块，从而早期预防心血管事件。
一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的荧光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，荧光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。
优选的，所述抗体上的巯基与超声造影基团上的马来酰亚胺基共价连接；所述抗体的游离α氨基与荧光基团形成酰胺键共价连接。
优选的，所述抗体上的二硫键通过还原剂打开形成巯基，所述巯基与所述马来酰亚胺基形成碳硫键共价连接；所述赖氨酸的α氨基与荧光基团形成酰胺键共价连接。
优选的，所述马来酰亚胺基连接于聚乙二醇一端，聚乙二醇的聚合物分子量优选为2000Da。
优选的，所述超声造影基团带有负电荷。优选为以带负电荷的有机高分子材料为组分，更优选为新型可生物降解材料聚乳酸。
优选的，所述荧光染料为菁染料Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯或吲哚菁绿ICG。
一种制备超声荧光分子探针的方法，包括：将抗体和荧光染料与超声造影基团连接形成所述荧光分子探针，具体包括：在催化剂的存在下，分别使带有羧基的荧光染料与抗体的α氨基接触，形成酰胺键共价连接；在还原剂存在下，打开抗体的二硫键，使带有马来酰亚胺基的超声造影基团与抗体的巯基接触，形成碳硫键共价连接，得到所述荧光分子探针。
优选的，所述催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
具体包括以下步骤：
(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；
(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；
(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；
(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取500ulMES缓冲液(pH5.5)溶解,将所得EDC溶液、NHS溶液、上步所得PLA微泡悬液加入烧瓶中，用MES缓冲液定量至5ml反应体系，室温反应1小时活化微泡表面羧基，后用1×PBS缓冲液10000g 5min离心重悬清洗3次；
(5)以与聚乳酸摩尔比为1:3的比例计算所需NH2-PEG-mal(MW2000)的质量并称重，取500ul1×PBS溶解，将所得NH2-PEG-mal溶液、上步所得PLA微泡悬液置于烧瓶中，用1×PBS缓冲液定量至5ml反应体系，室温搅拌过夜后置于4℃冰箱备用；
(6)取50ul Cy5.5标记的抗体(1mg/ml)加入450ul 10×PBS缓冲液，得到总液量加入等体积的TCEP(10×PBS溶解50mmol/L)室温反应30min打开抗体二硫键，得到游离巯基；
(7)将(6)步骤所得具有游离巯基的抗体用50k超滤管6000r/min 10min/次Tris缓冲液超滤2次除去TCEP；(5)步骤所得PLA-PEG-mal加入Tris缓冲液10000g 15℃5min/次离心重悬2次，与抗体置于西林瓶中锡纸包裹避光搅拌过夜，所得产物1×PBS离心重悬得到Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB；
其中荧光染料Cy5.5与抗体的连接方法如下：
1)将抗体原液(1mg/ml)50ul加入0.5ml 100k超滤管中，1×PBS补足500ul，6000g离心10分钟除去抗体储存液中的BSA，荧光染料Cy5.5，SE用DMSO溶解至浓度为1mg/ml；
2)优选Cy5.5与抗体摩尔投料比为20:1，所得F/P＝4.6:1；用50k超滤管将步骤1所得抗体超滤入碱性PB缓冲液(pH＝8.5)中，PB缓冲液补至900ul，加入14ul Cy5.5，SE(DMSO)，DMSO总量补至100ul，锡纸避光室温搅拌过夜；
3)步骤2)所得反应体系用1×PBS缓冲液50k超滤管超滤离心(6000r/min 10min)清洗，直至超滤所得废液完全无色透明。
本发明提供了一种用于动脉粥样硬化不稳定斑块超声荧光分子影像学成像探针，该探针由OPN抗体和聚乙二醇(PEG)修饰的聚乳酸(PLA)微泡缩合而成，OPN抗体的巯基与纳米颗粒表面PEG的马来酸亚胺基通过碳硫键稳定连接。
其中，聚乙二醇(PEG)修饰的PLA微泡直径在250nm左右，大小均一，Zeta电位为-20mv。
该用于动脉粥样硬化不稳定斑块超声荧光分子影像学成像探针探针的制备方法为：将100mg PLA和100ul全氟溴辛烷(PFOB)分散于3.5ml二氯甲烷制得油相，滴入20ml聚乙烯醇水溶液中，置1.27cm钛合金探头下冰浴超声2min得到乳剂；
加入与聚乳酸摩尔比为1:500的EDC、NHS，37℃下反应1小时，加入与聚乳酸摩尔比为1:3的NH2-PEG-MAL，常温搅拌过夜；
OPN抗体经TECP打开二硫键后与聚乳酸微泡表面PEG的马来酰亚胺基通过碳硫键稳定连接，经离心分离得到OPN靶向的超声探针Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB NPs。
进一步的，该探针的制备方法具体包括如下步骤：
(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；
(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；
(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；
(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取500ulMES缓冲液(pH5.5)溶解,将所得EDC溶液、NHS溶液、上步所得PLA微泡悬液加入烧瓶中，用MES缓冲液定量至5ml反应体系，室温反应1小时活化微泡表面羧基，后用1×PBS缓冲液10000g 5min离心重悬清洗3次；
(5)以与聚乳酸摩尔比为1:3的比例计算所需NH2-PEG-mal(MW2000)的质量并称重，取500ul1×PBS溶解，将所得NH2-PEG-mal溶液、上步所得PLA微泡悬液置于烧瓶中，用1×PBS缓冲液定量至5ml反应体系，室温搅拌过夜后置于4℃冰箱备用；
(6)取50ul Cy5.5标记的抗体(1mg/ml)加入450ul 10×PBS缓冲液，得到总液量加入等体积的TCEP(10×PBS溶解50mmol/L)室温反应30min打开抗体二硫键，得到游离巯基；
(7)将(6)步骤所得具有游离巯基的抗体用50k超滤管6000r/min 10min/次Tris缓冲液超滤2次除去TCEP；(5)步骤所得PLA-PEG-mal加入Tris缓冲液10000g 15℃5min/次离心重悬2次，与抗体置于西林瓶中锡纸包裹避光搅拌过夜，所得产物1×PBS离心重悬得到Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB；
其中荧光染料Cy5.5与抗体的连接方法如下：
1)将抗体原液(1mg/ml)50ul加入0.5ml 100k超滤管中，1×PBS补足500ul，6000g离心10分钟除去抗体储存液中的BSA，荧光染料Cy5.5，SE用DMSO溶解至浓度为1mg/ml；
2)优选Cy5.5与抗体摩尔投料比为20:1，所得F/P＝4.6:1；用50k超滤管将步骤1所得抗体超滤入碱性PB缓冲液(pH＝8.5)中，PB缓冲液补至900ul，加入14ul Cy5.5，SE(DMSO)，DMSO总量补至100ul，锡纸避光室温搅拌过夜；
3)步骤2)所得反应体系用1×PBS缓冲液50k超滤管超滤离心(6000r/min 10min)清洗，直至超滤所得废液完全无色透明。
另外，本发明还提供了用于动脉粥样硬化易损斑块ultrasound/optical双模态分子影像学成像探针的制备方法：以OPN为靶向工具，以聚乙二醇(PEG)修饰的PLA微泡为载体，通过TCEP打开OPN抗体的二硫键得到的游离巯基与纳米颗粒表面PEG的马来酰亚胺基缩合反应合成ultrasound/optical双模态分子影像探针Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB，该探针可应用在体ultrasound/optical成像以评价斑块内巨噬细胞的分布和密度，借此识别不稳定斑块并评价其风险。
进一步的，包括以下步骤：
(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；
(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；
(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；
(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取500ulMES缓冲液(pH5.5)溶解,将所得EDC溶液、NHS溶液、上步所得PLA微泡悬液加入烧瓶中，用MES缓冲液定量至5ml反应体系，室温反应1小时活化微泡表面羧基，后用1×PBS缓冲液10000g 5min离心重悬清洗3次；
(5)以与聚乳酸摩尔比为1:3的比例计算所需NH2-PEG-mal(MW2000)的质量并称重，取500ul1×PBS溶解，将所得NH2-PEG-mal溶液、上步所得PLA微泡悬液置于烧瓶中，用1×PBS缓冲液定量至5ml反应体系，室温搅拌过夜后置于4℃冰箱备用；
(6)取50ul Cy5.5标记的抗体(1mg/ml)加入450ul 10×PBS缓冲液，得到总液量加入等体积的TCEP(10×PBS溶解50mmol/L)室温反应30min打开抗体二硫键，得到游离巯基；
(7)将(6)步骤所得具有游离巯基的抗体用50k超滤管6000r/min 10min/次Tris缓冲液超滤2次除去TCEP；(5)步骤所得PLA-PEG-mal加入Tris缓冲液10000g 15℃5min/次离心重悬2次，与抗体置于西林瓶中锡纸包裹避光搅拌过夜，所得产物1×PBS离心重悬得到Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB；
其中荧光染料Cy5.5与抗体的连接方法如下：
1)将抗体原液(1mg/ml)50ul加入0.5ml 100k超滤管中，1×PBS补足500ul，6000g离心10分钟除去抗体储存液中的BSA，荧光染料Cy5.5，SE用DMSO溶解至浓度为1mg/ml；
2)优选Cy5.5与抗体摩尔投料比为20:1，所得F/P＝4.6:1；用50k超滤管将步骤1所得抗体超滤入碱性PB缓冲液(pH＝8.5)中，PB缓冲液补至900ul，加入14ul Cy5.5，SE(DMSO)，DMSO总量补至100ul，锡纸避光室温搅拌过夜；
3)步骤2)所得反应体系用1×PBS缓冲液50k超滤管超滤离心(6000r/min 10min)清洗，直至超滤所得废液完全无色透明。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、本发明基于分子影像技术平台，选择可识别增殖表型血管平滑肌细胞和巨噬细胞的OPN抗体为靶向分子，并利用生物相容性优良的聚乳酸(PLA)作为载体，设计并构建可用于预警易损斑块的双模态分子探针。相较于已公开的CN 105833299A，我们观察小鼠动脉粥样硬化斑块病理切片发现OPN的表达在增殖表型的平滑肌细胞中为著，由此可根据探针密度推测斑块成分，所选择的超声成像方法基于已成熟应用于临床的影像学平台，具有安全可靠的特点，此外两种成像模态相结合可实现解剖与功能两个层面识别的互补，提高了诊断的敏感性和特异性。基于识别斑块中增殖表型的平滑肌细胞及巨噬细胞的双模态成像方法不仅可以有效的早期识别易损斑块，还可以基于此研发抗动脉粥样硬化药物。
超声在成像中具有可无创显影，支持实时动态观察，穿透性强等优点，但其因敏感性较弱，对探针的识别较差，受操作者主观判断影响大等因素在临床应用上受到限制。光学成像恰恰弥补其这一劣势，其易于识别探针信号，敏感性较好，较超声信号稳定且持久。将这二者结合，能够更好地判断动脉粥样硬化斑块的所在位置。相对于PET、MRI等成像方法而言，超声及光学成像成本低，结合临床冠心病介入手术中可微创实时指导诊治的IVUS技术，未来临床的普及度也更大。
2、本发明以聚乙二醇(PEG)修饰的PLA微泡(PLA-PFOB NPs)为载体，通过缩合反应利用其马来酰亚胺基与OPN抗体的游离巯基稳定连接，抗体表面饱和串联活化的Cy5.5，获得用于ultrasound/optical双功能分子探针。其优点在于，聚乳酸PLA是美国FDA批准可用于生物工程领域的材料，临床上已应用聚乳酸可降解支架治疗冠心病，相较于脂质包膜的易降解性，其稳定性高，抗声压能力强，在体内可降解为乳酸和羟基乙酸参与代谢，以二氧化碳和水排出体外；PFOB是有前景的人造血液材料，对急性呼吸衰竭有治疗作用，经卵磷脂类乳剂乳化后可快速排泄。所选材料生物相容性好，其体内药理毒理过程明确，所构成的anti-OPN-PEG-PLA NPs结构稳定，可在水溶液中保存。此外，PEG修饰后可降低网状内皮系统，如单核细胞对超声微泡的非特异吞噬，延长了探针在体循环时间，提高了探针效能。且PLA为理想的药物包载材料，后续开发相应探针可用于易损斑块的精准治疗，实现精准诊疗一体化。
本发明所提供的成像技术使用探针载体PEG-PLA-PFOB NPs，直径在250nm左右，大小较均一，Zeta电位为-20mv，体系分散性佳，稳定性较好。斑块组织切片免疫组织化学染色显示OPN与α-SMA及CD68分子分布一致，证实OPN可识别易损斑块的部位。细胞摄取实验显示探针敏感性及特异性佳，超声造影显示探针在动脉粥样硬化斑块部位信号可见。光学成像可显示探针在动脉粥样硬化小鼠模型中各器官和组织的分布以及信号强度，其中不稳定斑块可明显显影。
附图说明
图1 PLA微泡的构建流程图。
图2 CCK-8实验验证探针的细胞生物相容性。
图3泡沫细胞对靶向微泡的摄取与竞争抑制组及无关抗体组的半定量对照研究。
图4 PLA超声微泡的乳胶管成像。
图5小鼠动脉粥样硬化斑块的组织切片染色。
具体实施方式
本发明为用于动脉粥样硬化易损斑块ultrasound/optical双模态分子影像学成像探针的制备方法，包括以下步骤：以OPN为靶向工具，以聚乳酸(PEG)修饰的PLA-PFOB微泡为载体，通过缩合反应化学合成ultrasound/optical双模态分子影像探针Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB NPs，可应用在体ultrasound/optical成像以评价斑块内增殖表型的平滑肌细胞及巨噬细胞的分布和密度，借此识别不稳定斑块并评价其风险。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明实施例中所需要的材料、试剂均可市场购得。
实施例1
(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；
(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；
(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；
(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取500ulMES缓冲液(pH5.5)溶解,将所得EDC溶液、NHS溶液、上步所得PLA微泡悬液加入烧瓶中，用MES缓冲液定量至5ml反应体系，室温反应1小时活化微泡表面羧基，后用1×PBS缓冲液10000g 5min离心重悬清洗3次；
(5)以与聚乳酸摩尔比为1:3的比例计算所需NH2-PEG-mal(MW2000)的质量并称重，取500ul1×PBS溶解，将所得NH2-PEG-mal溶液、上步所得PLA微泡悬液置于烧瓶中，用1×PBS缓冲液定量至5ml反应体系，室温搅拌过夜后置于4℃冰箱备用；
(6)取50ul Cy5.5标记的抗体(1mg/ml)加入450ul 10×PBS缓冲液，得到总液量加入等体积的TCEP(10×PBS溶解50mmol/L)室温反应30min打开抗体二硫键，得到游离巯基；
(7)将(6)步骤所得具有游离巯基的抗体用50k超滤管6000r/min 10min/次Tris缓冲液超滤2次除去TCEP；(5)步骤所得PLA-PEG-mal加入Tris缓冲液10000g 15℃5min/次离心重悬2次，与抗体置于西林瓶中锡纸包裹避光搅拌过夜，所得产物1×PBS离心重悬得到Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB；
其中荧光染料Cy5.5与抗体的连接方法如下：
1)将抗体原液(1mg/ml)50ul加入0.5ml 100k超滤管中，1×PBS补足500ul，6000g离心10分钟除去抗体储存液中的BSA，荧光染料Cy5.5，SE用DMSO溶解至浓度为1mg/ml；
2)优选Cy5.5与抗体摩尔投料比为20:1，所得F/P＝4.6:1；用50k超滤管将步骤1所得抗体超滤入碱性PB缓冲液(pH＝8.5)中，PB缓冲液补至900ul，加入14ul Cy5.5，SE(DMSO)，DMSO总量补至100ul，锡纸避光室温搅拌过夜；
3)步骤2)所得反应体系用1×PBS缓冲液50k超滤管超滤离心(6000r/min 10min)清洗，直至超滤所得废液完全无色透明。
Ultrasound/optical双模态分子探针表征鉴定、体外成像及活体组织病理：
1.CCK-8实验验证探针的细胞生物相容性
在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液培养24小时，换新鲜培养基后分别加入不同浓度梯度的PLA微泡悬液孵育6小时。1×PBS缓冲液清洗，加入新鲜培养基，每孔加入10ulCCK-8溶液，酶标仪测定450nm处吸光度。图2可见微泡悬液浓度达到0.5mg/ml时，细胞存活率大于80％。
2.泡沫细胞对靶向微泡的摄取与竞争抑制组及无关抗体组的半定量对照研究
将巨噬细胞以1×105密度接种于数块共聚焦皿中，待细胞贴壁后用ox-LDL(80μg/ml)刺激细胞24小时诱导泡沫细胞形成，之后向各皿分别设实验组(加入Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB NPs)、无关对照组(Cy5.5-anti-IgG-PEG-PLA-PFOB NPs)和竞争抑制组(加入Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB NPs+anti-OPN),调整终浓度为0.5mg/ml于细胞培养箱中培养6小时。1×PBS洗涤数次去除游离微泡后使用4％多聚甲醛固定10分钟，DAPI染色10分钟后比较不同分组的吞噬摄取结果。如图3所示，ox-LDL刺激组细胞内Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA NPs纳米颗粒含量显著高于其它组(P<0.05)。
3.PLA超声微泡的乳胶管成像
将PLA微泡稀释至4.5mg/L，置于乳胶管中，运用12MHz超声探头于PIHI模式下观察微泡成像能力。结果如图4所示，对比去离子水组，PLA微泡呈强超声信号。
4.小鼠动脉粥样硬化斑块的组织切片染色
如图5所示，取小鼠腹主动脉动脉粥样硬化标本，蜡块包埋进行HE染色及OPN、α-SMA、CD68免疫组织化学染色，可见OPN表达与斑块平滑肌细胞和巨噬细胞聚集区域吻合。
Claims (10)
1.一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的发光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，发光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。
2.根据权利要求1所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述抗体上的巯基与超声造影基团上的马来酰亚胺基共价连接；所述抗体的游离α氨基与所述发光基团形成酰胺键共价连接。
3.根据权利要求2所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述马来酰亚胺基连接于聚乙二醇一端。
4.根据权利要求1-3任一项所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述超声造影基团带有负电荷。
5.根据权利要求1-3任一项所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述发光基团为菁染料。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的超声荧光分子探针的方法，包括：将抗体和发光基团与超声造影基团连接形成所述荧光分子探针，所述方法包括：在催化剂的存在下，分别使带有羧基的发光基团与抗体的α氨基接触，形成酰胺键共价连接；在还原剂存在下，打开抗体的二硫键，使带有马来酰亚胺基的超声造影基团与抗体的巯基接触，形成碳硫键共价连接，得到所述荧光分子探针。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；
(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；
(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；
(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取500ul MES缓冲液(pH5.5)溶解,将所得EDC溶液、NHS溶液、上步所得PLA微泡悬液加入烧瓶中，用MES缓冲液定量至5ml反应体系，室温反应1小时活化微泡表面羧基，后用1×PBS缓冲液10000g5min离心重悬清洗3次；
(5)以与聚乳酸摩尔比为1:3的比例计算所需NH2-PEG-mal(MW2000)的质量并称重，取500ul1×PBS溶解，将所得NH2-PEG-mal溶液、上步所得PLA微泡悬液置于烧瓶中，用1×PBS缓冲液定量至5ml反应体系，室温搅拌过夜后置于4℃冰箱备用；
(6)取50ul Cy5.5标记的抗体(1mg/ml)加入450ul 10×PBS缓冲液，得到总液量加入等体积的TCEP(10×PBS溶解50mmol/L)室温反应30min打开抗体二硫键，得到游离巯基；
(7)将(6)步骤所得具有游离巯基的抗体用50k超滤管6000r/min 10min/次Tris缓冲液超滤2次除去TCEP；(5)步骤所得PLA-PEG-mal加入Tris缓冲液10000g 15℃5min/次离心重悬2次，与抗体置于西林瓶中锡纸包裹避光搅拌过夜，所得产物1×PBS离心重悬得到Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB；
其中荧光染料Cy5.5与抗体的连接方法如下：
1)将抗体原液(1mg/ml)50ul加入0.5ml 100k超滤管中，1×PBS补足500ul，6000g离心10分钟除去抗体储存液中的BSA，荧光染料Cy5.5，SE用DMSO溶解至浓度为1mg/ml；
2)优选Cy5.5与抗体摩尔投料比为20:1，所得F/P＝4.6:1；用50k超滤管将步骤1所得抗体超滤入碱性PB缓冲液(pH＝8.5)中，PB缓冲液补至900ul，加入14ul Cy5.5，SE(DMSO)，DMSO总量补至100ul，锡纸避光室温搅拌过夜；
3)步骤2)所得反应体系用1×PBS缓冲液50k超滤管超滤离心(6000r/min 10min)清洗，直至超滤所得废液完全无色透明。
9.权利要求1-5任一所述的超声荧光分子探针在用于动脉粥样硬化不稳定斑块检测仪器的应用。
10.如权利要求1-7任一项所述的超声荧光分子探针在生物医学研究中的应用。
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