DE69735901T2 - Verbesseringen an oder in verbindung mit diagnostischen/therapeutischen mitteln - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf diagnostische und/oder therapeutisch wirksame Mittel, insbesondere diagnostische und/oder therapeutische wirksame Mittel, die Einheiten mit einer Affinität für Stellen und/oder Strukturen innerhalb des Körpers derart eingebaut haben, dass diagnostische Bildgebung und/oder Therapie bestimmter Stellen innerhalb des Körpers verstärkt werden können. Von besonderem Interesse sind diagnostische Mittel zur Verwendung in Ultraschallbildgebung, die im folgenden als zielausgerichtete Ultraschallkontrastmittel bezeichnet werden.
  • Es ist gut bekannt, dass Ultraschallbildgebung ein möglicherweise wertvolles Diagnosewerkzeug umfasst, zum Beispiel in Studien des vaskulären Systems, insbesondere in der Kardiographie, und der Gewebe-Mikrovaskulatur. Eine Vielfalt von Kontrastmitteln wurde vorgeschlagen, um die so erhaltenen akustischen Bilder zu verstärken, einschließlich die Suspensionen von Feststoffteilchen, emulgierten Flüssigkeitströpfchen, Gasbläschen und eingekapselten Gasen oder Flüssigkeiten. Es ist allgemein anerkannt, dass Kontrastmittel niedriger Dichte, die leicht komprimierbar sind, besonders in Bezug auf die akustische Rückstreuung, die sie erzeugen, wirksam sind, und beträchtliches Interesse wurde deshalb bei der Herstellung von Gas enthaltenden und Gas erzeugenden Systemen gezeigt.
  • Gas enthaltende Kontrastmedien sind auch als wirksam in der Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung bekannt, z.B. als Suszeptibilitätskontrastmittel, die zum Reduzieren MR-Signalintensität wirken werden. Sauerstoff-enthaltende Kontrastmedien repräsentieren auch möglicherweise nützliche paramagnetische MR-Kontrastmittel.
  • Außerdem wurde im Gebiet der Röntgenstrahlungsbildgebung beobachtet, dass Gase, wie Kohlendioxid als negative orale Kontrastmittel oder intravaskuläre Kontrastmittel verwendet werden können.
  • Die Verwendung von radioaktiven Gasen, z.B. radioaktive Isotope von inerten Gasen, wie Xenon, wurde auch vorgeschlagen in der Szintigraphie, zum Beispiel für Bloodpool-Bildgebung.
  • Zielausgerichtete Ultraschallkontrastmittel können betrachtet werden als umfassend (i) eine Reportereinheit, die zu Wechselwirkung mit Ultraschallstrahlung fähig ist, um ein detektierbares Signal zu erzeugen; (ii) einen oder mehreren Vektoren, mit einer Affinität für besondere Zielstellen und/oder Strukturen innerhalb des Körpers, z.B. für spezifische Zellen von Gebieten der Pathologie; und (iii) einen oder mehrere Linker, die den Reporter und den (die) Vektor(en) verbinden, im Falle, dass diese nicht direkt verbunden sind.
  • Die Moleküle und/oder Struktur, für die beabsichtigt ist, dass das Kontrastmittel an sie bindet, werden im Folgenden als das Ziel bezeichnet. Um spezifische Bildgebung einer ausgewählten Region/Struktur im Körper zu erhalten, muss das Ziel in dieser Region/Struktur vorhanden und verfügbar sein. Idealerweise wird es nur in der Region von Interesse exprimiert werden, aber üblicherweise wird es auch an anderen Stellen im Körper vorhanden sein, was mögliche Hintergrundprobleme erzeugt. Das Ziel kann entweder eine definierte molekulare Spezies (d.h. ein Zielmolekül) oder ein unbekanntes Molekül oder eine komplexere Struktur (d.h. eine Zielstruktur) sein, die im abzubildenden Gebiet vorhanden ist, und die spezifisch oder selektiv an ein gegebenes Vektormolekül zu binden fähig ist.
  • Der Vektor wird an die Reportereinheit gebunden, um diese Einheiten an die abzubildende Region/Struktur zu binden. Der Vektor kann spezifisch an ein ausgewähltes Ziel binden oder kann nur selektiv binden, mit einer Affinität auch für eine begrenzte Anzahl anderer Moleküle/Strukturen, was wieder mögliche Hintergrundprobleme erzeugt.
  • Es gibt einen begrenzten Umfang des Stands der Technik, der sich auf zielausgerichtete Ultraschallkontrastmittel bezieht. So ist zum Beispiel US-A-5531980 auf Systeme gerichtet, in denen der Reporter eine wässrige Suspension von Luft- oder Gas mikrobläschen umfasst, die durch einen oder mehr film-bildenden oberflächenaktive Mittel stabilisiert ist, die zumindest teilweise in lamellarer oder laminarer Form vorhanden sind, wobei das (die) oberflächenaktive Mittel an einen oder mehrere Vektoren gebunden ist (sind), die „bioaktive Spezies, entworfen für spezifische Zielausrichtungszwecke" umfassen. Es wird angegeben, dass die Mikrobläschen nicht direkt durch oberflächenaktives Material eingekapselt sind, sondern dass dies eher in flüssigkeitsgefüllte Liposomen eingebaut ist, die die Mikrobläschen stabilisieren. Es wird anerkannt werden, dass lamellares oder laminares oberflächenaktives Material, wie Phospholipide, die in derartigen Liposomen vorhanden sind, unvermeidbar in der Form einer oder mehrerer Lipidbischichten vorhanden sein werden, wobei die lipophilen Schweife „Rücken-an-Rücken" und die hydrophilen Köpfe sowohl innerhalb als auch außerhalb vorliegen (vgl. z.B. Schneider, M. bei „Liposomes as drug carriers: 10 years of research" in Drug targeting, Nyon, Schweiz, 3.–5. Oktober 1984, Buri, P. and Gumma, A. (Ed), Elsevier, Amsterdam 1984).
  • EP-A-0727225 beschreibt zielausgerichtete Ultraschallkontrastmittel, in denen der Reporter eine Chemikalie mit ausreichendem Dampfdruck derart umfasst, dass ein Anteil davon ein Gas bei Körpertemperatur des Subjektes ist. Diese Chemikalie steht in Zusammenhang mit einem oberflächenaktiven Mittel oder Albuminträger, der einen protein-, peptid-, oder kohlenhydratbasierenden Zelladhäsionsmolekülliganden als Vektor umfasst. Die Rezeptoreinheiten in derartigen Kontrastmitteln entsprechen den Phasenverschiebungs-Kolloid-Systemen, die WO-A-9476739 beschrieben sind; es wird nun anerkannt, dass die Verabreichung derartiger Phasenverschiebungs-Kolloide zur Erzeugung Mikrobläschen führen kann, die unkontrolliert wachsen, möglicherweise in dem Ausmaß, in dem sie möglicherweise gefährliche Embolisierung verursachen von zum Beispiel der Myocardvaskulatur und dem Gehirn (vgl. z.B. Schwarz, Advances in Echo-Contrast [1994 (3)], Seiten 48–49).
  • W-A-9320802 schlägt vor, dass gewebespezifische Ultraschallbildgebungsverstärkung erreicht werden kann, unter Verwenden akustisch reflektierender oligolamelllarer Liposomen, die an gewebespezifischen Liganden konjugiert sind, wie Antikörpern, Peptiden, Lektinen etc.. Die Liposome werden frei gewählt um frei von Gas zu sein, und werden so nicht die vorteilhaften echogenen Eigenschaften von auf Gas basierenden Ultraschallkontrastmitteln besitzen. Weitere Bezugnahmen auf diese Technologie, z.B. beim Zielausrichten auf Fibrin, Thrombi und atherosklerotische Gebiete werden in den Publikationen von Alkanonyuksel, H. et al. In J. Pharm. Sci (1096) 85 (5), 486–490; J. Am. Coll. Cardiol. (1996) 27 (2) Suppl A, 298A; and Circulation, 68 Sci. Sessions, Anaheim 13.–16. November 1995.
  • Es gibt auch eine Anzahl von Veröffentlichungen betreffend Ultraschallkontrastmittel, die sich darauf beziehen, auf möglichen Gebrauch von monoclonalen Antikörpern als Vektoren überzugehen, ohne ein signifikant praktisches Detail anzugeben und/oder auf Reporter überzugehen, die Materialien umfassen, die durch das retikuloendotheliale System aufgenommen werden können und dadurch eine Bildverstärkung von Organen, wie die Leber erlauben – siehe zum Beispiel WO-A-9300933, WO-A-9401140, WO-A-9408627, WO-A-9428874, US-A-5088499, US-A-5348016 und US-A-5469854. Im Allgemeinen ist beabsichtigt, dass diese zielausgerichteten Kontrastmittel des Stands der Technik den Kontrast an spezifischen Stellen im Körper verstärken, zum Beispiel Tumorzellen, durch Verwenden eines Vektors, um stark an ein Ziel zu binden, um eine Konzentration an den Zielstellen zu erreichen. Im Gegensatz zu diesem Prinzip der Verwendung eines Vektors, um mit hoher Affinität an ein Ziel zu binden, basiert die vorliegende Erfindung teilweise auf der Erkenntnis, dass diagnostische und/oder therapeutisch wirksame Mittel mit günstigeren Eigenschaften erhalten werden können, durch Verwenden von mehrfachen Arten von Vektor-Ziel-Wechselwirkungen (z.B. umfassend Mittel, die mit einer Mehrzahl von verschiedenen Vektoren und/oder mit mehr als einem Vektor in Verbindung stehen, die eine Affinität für verschiedene Ziele auf denselben oder verschiedenen Zelltypen besitzen). Auf diese Weise kann das Binden von Gas enthaltenden und Gas erzeugenden diagnostischen und/oder therapeutischen Mitteln z.B. durch Bilden mehrfacher Bindungspaare zwischen einem Vektor mit einer Spezifität für mehr als einen Rezeptor oder zwischen mehr als einen Vektor mit einer Affinität für einen oder mehreren Typen von Ziel erhalten werden, wobei entweder niedrige oder hohe Affinitäten vorhanden sind. Derartiges mehrfaches Binden des Vektor-konjugierten Mittels an ein oder mehrere Zielmoleküle/-strukturen kann zu vorteilhaften Zielausrichtungseigenschaften führen, zum Beispiel durch Verstärken der Zielspezifität und/oder durch Unterscheiden von Wechselwirkungen an einem erwünschten Zielgebiet von Hintergrundwechselwirkungen mit niedrigeren Gehalten von Molekülen/Strukturen, die dem Ziel ähnlich sind, das irgendwo im Körper exprimiert wird.
  • Es ist gut bekannt, einen Vektor zu verwenden, der mit einer hohe Affinität an ein Ziel bindet. Die vorliegende Erfindung basiert jedoch auf der Erkenntnis, dass das erwünschte Binden von Gas enthaltenden und Gas erzeugenden diagnostischen und/oder therapeutischen Mitteln erhalten werden kann durch Bilden mehrfacher Bindungspaare mit einer geringen Affinität zwischen einem Typ von Vektor und einem Typ von Ziel, oder durch Bilden mehrfacher Bindungspaare zwischen einem oder mehreren Typen von Vektoren und einem oder mehreren Typen von Ziel mit entweder niedrigen oder hohen Affinitäten. So kann mehrfaches Binden des Vektor-konjugierten Mittels an ein oder mehrere Zielmoleküle/-strukturen vorteilhafte Zielausrichtungseigenschaften besitzen, zum Beispiel bei verstärkender Zielspezifität und/oder beim Unterscheiden von Wechselwirkungen an einem erwünschten Zielgebiet von Hintergrundwechselwirkungen mit niedrigeren Gehalten von Molekülen/Strukturen, die einem Ziel ähnlich sind, das irgendwo im Körper exprimiert wird.
  • So wird gemäß eines Aspektes der vorliegenden Erfindung ein zielbares, diagnostisches und/oder therapeutisch wirksames Mittel bereitgestellt, z.B. ein Ultraschallkontrastmittel, umfassend eine Suspension in einer wässrigen Trägerflüssigkeit, zum Beispiel einer injizierbaren Trägerflüssigkeit, eines Reporters, umfassend ein Gas enthaltendes oder Gas erzeugendes Material, wobei der Reporter an mehr als einen Vektor konjugiert ist, und wobei die Vektoren eine Affinität für verschiedene Ziele auf denselben oder verschiedenen Zelltypen besitzen.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung basiert auf der zusätzlichen Erkenntnis, dass begrenzte Adhäsion an Ziele eine hochnützliche Eigenschaft ist, für diagnostische und/oder therapeutische wirksame Mittel ist, wobei die Eigenschaft erreicht werden kann unter Verwenden von Vektoren, die eine temporäre Retention eher als eine fixierte Adhäsion an ein Ziel ergeben. So können derartige Mittel, eher, als fest an spezifischen Stellen zurückgehalten zu werden, zum Beispiel effektiv eine Form von verzögerten Fluss entlang des vaskulären Endotheliums aufgrund ihrer transienten Wechselwirkung mit endothelialen Zellen zeigen. Derartige Mittel können so an den Wänden von Blutgefäßen konzentriert werden, im Falle von Ultraschallkontrastmitteln, die eine verbesserte Echogenizität davon relativ zum Volumen des Blutstroms bereitstellen, dem anatomische Merkmale fehlen. Sie können deshalb eine verstärkte Bildgebung des Kapilarsystems, einschließlich der Mikrovaskolatur erlauben, und können so die Unterscheidung zwischen normal und unangemessen durchbluteten Gewebe vereinfachen, z.B. im Herz, und können auch bei der Sichtbarmachung von Strukturen, wie Kupfferzellen, Thrombi- und atherosklerotische Läsionen oder zum Sichtbarmachen von neovaskularisierten und entzündetem Gewebegebieten nützlich sein. Die vorliegende Erfindung ist gut geeignet, um Änderungen abzubilden, die in normalen Blutgefäßen auftreten, die in Gebieten von Gewebenekrose positioniert sind.
  • Es wird anerkannt werden, dass Bindungsaffinitäten von den Anzahlen von Wechselwirkungen, wie auch ihrer Stärke abhängen. Die Dichte der Vektormoleküle an der Oberfläche der Reportereinheiten kann deshalb ausgewählt werden, um so annähernd den Grad der Wechselwirkungen zwischen besonderen Mitteln und Zielen einzustellen.
  • Der Begriff Mehrfach-Spezifität wird auch verwendet, um eine injizierbare Trägerflüssigkeit von Gas enthaltendem oder Gas erzeugendem Material zu beschreiben, das aus mehr als einem Vektor mit einer Spezifität für einen oder mehrere zelluläre Oberflächenrezeptoren besteht, während es zur selben Zeit ein zweites Element mit einer Spezifität für ein Substrat oder Rezeptorsystem aufweist, bei dem ein daran Binden eine therapeutische Antwort induziert. So sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung mehrfach-spezifische Bildgebungsmittel enthalten, umfassend Zielausrichtungsvektoren, wie der anti-Fibrin-Antikörper beschrieben von Lanza et al. (Circulation, (1996) 94 (12), Seiten 3334), Annexin V-atherosklerotische Plaque-bindende Peptide, wie YRALVDTLK, oder beliebige andere Vektoren, die dafür bekannt sind, dass sie mit Fibrin-Klumpen zusammengehen, in Kombination mit einem Arz neimittel oder Enzym mit fibrinolytischer Wirksamkeit wie Streptokinase, Plasminogenaktivator (tPA), Urokinase (uPA) oder Prourokinase (scuPA), was zu einem lokalisierten therapeutischen Antithromboseeffekt führt. Diese Erfindung erstreckt sich auch darauf, Vektoren mit einer gestiegenen Spezifität für Tumorzellen in Kombination mit Vektoren oder Arzneimittelmolekülen zu umfassen, die als chemotherapeutische Mittel fungieren, die zum inhibieren des Tumorwachstums fähig sind.
  • Es ist gut bekannt, dass viele, falls nicht alle Zielmoleküle nicht ausschließlich an Zielstellen exprimiert werden; eine übliche Situation ist, dass derartige Moleküle durch Zielzellen oder bei einer Zielstruktur überexprimiert werden, aber auch bei niedrigeren Gehalten irgendwo in dem Körper. Die Verwendung von Reportern, die eine Vielzahl von Vektoren mit relativ niedriger Affinität für das Ziel tragen, kann in dieser Situation vorteilhaft sein, da der Reporter dann dazu neigen wird, sich in Regionen einer hohen Zieldichte zu konzentrieren, die eine mehrfache (und deshalb starke) Bindung an den Reporter erlaubt (z.B. ein Gas enthaltendes Mittel, das die Vektoren Folsäure und Glutathion für mehrfach-spezifisches Binden an Folsäurerezeptoren bzw. Glutathion-S-Trasferase-Rezeptoren bindet, die wie Tumorzellen überexprimiert sind). Gebiete einer niedrigen Zieldichte werden andererseits keine ausreichende Wechselwirkung mit derartigen Vektoren niedriger Affinität bereitstellen, um an das Ziel zu binden. In derartigen Ausführungsformen der Erfindung können Vektoren niedriger Affinität so angesehen werden, dass sie eine Assoziationskonstante Ka für eine Wechselwirkung mit einem/einer Zielmolekül oder -struktur von weniger als 108 M–1, z.B. weniger als 107 M–1, bevorzugt weniger als 106 M–1 aufweisen. Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung basiert daher auf der Erkenntnis, dass das erwünschte Binden von Gas enthaltenden und Gas erzeugenden diagnostischen und/oder therapeutischen Mitteln erhalten werden kann durch Bilden von Bindungspaaren mit einer geringen Affinität zwischen mehr als einem Typ von Vektor und einem oder mehreren Typen des Ziels. Mehrfache Vektoren können deshalb verwendet werden, um die Spezifität zu vergrößern, so dass der Reporter nur an Zielzellen oder -strukturen binden wird, die eine besondere Kombination von Zielmolekülen exprimieren.
  • Es kann auch nützlich sein, eine Mehrzahl von Vektoren auszuwählen, die an verschiedene Teile, z.B. Epitope, einer Zielstruktur binden, um eine vergrößerte Bindungstärke zu ergeben. Dies kann besonders vorteilhaft sein, wenn die Zieldichte gering ist.
  • Produkte, die zwei oder mehrere Vektoren mit verschiedenen Spezifitäten umfassen, d.h. die an verschiedene Zielmoleküle auf verschiedenen Zellen binden, können vorteilhafterweise als Mittel eines „allgemeinen Zwecks" zur Detektion eines Bereichs von Krankheiten verwendet werden, z.B. verschiedene Formen von Krebs. So kann kann zum Beispiel die Verwendung derartiger Mittel die Detektion von Metastasen ermöglichen, die oft heterogen in Bezug auf die Expression von Zielmolekülen (d.h. Antigenen) sind.
  • Innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung wird die Reportereinheit üblicherweise an den Vektoren gebunden bleiben. In einem anderen Typ der Zielausrichtungsprozedur, manchmal genannt Pre-Targeting, wird der Vektor (oft ein monoklonaler Antikörper) allein verabreicht; nachfolgend wird der Reporter verabreicht, gekoppelt an eine Einheit, die zum spezifischen Binden des Vektormoleküls fähig ist, (wenn der Vektor ein Antikörper ist, kann der Reporter an ein Immunoglobulin-bindendes Molekül, wie Protein A oder ein Anti-Immunoglobulin-Antikörper gekoppelt werden). Ein Vorteil dieses Protokolls ist, dass Zeit ermöglicht wird für die Eliminierung der Vektormoleküle, die nicht ihre Ziele binden, im wesentlichen unter Verringern der Hintergrundprobleme, die mit dem Vorhandensein eines Überschusses des Reporter-Vektor-Konjugats verbunden sind. Innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung kann das Pre-Targeting mit einem spezifischen Vektor in Betracht gezogen werden, gefolgt von Reportereinheiten, die an andere Vektoren und eine Einheit gekoppelt sind, die den ersten Vektor binden.
  • Innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung, ist es in einigen Fällen und insbesondere für Bewertung der Blutperfusionsgeschwindigkeiten in definierten Gebieten, zum Beispiel in Myocard, von Interesse, die Geschwindigkeit zu messen, bei der Ultraschallkontrastmittel, die an das Ziel gebunden sind, ersetzt oder vom Ziel freige setzt werden. Dies kann erreicht werden in einer gesteuerten Art durch nachfolgende Verabreichung eines Vektors oder eines anderen Mittels, das zum Ersetzen oder Freisetzen des Kontrastmittels vom Ziel fähig ist.
  • Vektoren, die gemäß der Erfindung nützlich sind, umfassen Liganden für Zelladhäsionsproteine, wie auch Zelladhäsionsproteine selbst, wo diese entsprechende Liganden auf endothelialen Zelloberflächen besitzen. Beispiele von Zelladhäsionsproteinen umfassen Integrine, von denen die meisten die Arg-Gly-Asp (RGD)-Aminosäuresequenz binden. Falls erwünscht, können die Vektoren auf spezifische Zelladhäsionsproteine zielausgerichtet werden, die hauptsächlich auf aktivierten endothelialen Zellen exprimiert werden, wie sie an oder in der Nähe von Stellen der Entzündung oder anderen pathologischen Antworten gefunden werden. Andere Vektoren, die verwendet werden können, umfassen Proteine und Peptide, die an Zelloberflächen-Proteoglycane binden, die Komplexe von Proteinen und sulfatierten Polysacchariden sind, die auf den meisten Zellen gefunden werden, einschließlich endothelialen Zellen. Derartige Proteoglycane tragen zur negativen Oberflächenladung aller nukleierten Zellen von Wirbeltieren bei; diese Ladung kann auch gemäß der Erfindung durch Verwendung positiv geladener Vektoren ausgenutzt werden, z.B. umfassend kationische Lipide, die elektrostatisch mit der endothelialen Oberfläche wechselwirken werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist zum Beispiel, wo Vektoren an den Reporter gebunden oder nicht-kovalent in den Reporter auf eine Weise eingeschlossen werden, wo die Vektoren nicht leicht den Zielen oder Rezeptoren ausgesetzt werden. Vergrößerte Gewebespezifität kann deshalb erreicht werden durch Anwenden eines zusätzlichen Prozesses, um die Vektoren freizulegen, z.B. das Mittel wird nach der Verabreichung äußerem Ultraschall ausgesetzt, um die Diffundierbarkeit der Einheiten, die die Vektoren enthalten, zu ändern.
  • Der Reporter kann in einer beliebig geeigneten Form vorliegen, z.B. kann er eine beliebig geeignete Gas enthaltende oder Gas erzeugende Ultraschallkontrastmittelformulierung sein. Repräsentative Beispiele derartiger Formulierungen umfassen Mik robläschen aus Gas, stabilisiert (z.B. mindestens teilweise eingekapselt) durch eine Koaleszenz-widerstandsfähige Oberflächenmembran (zum Beispiel Gelatine, z.B. wie beschrieben in WO-A-8002365), ein filmbildendes Protein (z.B. ein Albumin, wie menschliches Serumalbumin, z.B. wie beschrieben in US-A-4718433, US-A-4774958, US-A-4844882, EP-A-0359246, WO-A-9112823, WO-A-9205806, WO-A-9217213, WO-A-9406477 oder WO-A-9501187), ein Polymermaterial (zum Beispiel ein synthetisches bioabbaubares Polymer, wie beschrieben in EP-A-0398935, eine elastische synthetische Grenzflächen-Polymermembran, wie beschrieben in EP-A-0458745, ein mikroteilchenförmiges bioabbaubares Polyaldehyd, wie beschrieben in EP-A-0441468, ein mikroteilchenförmiges N-Dicarbonsäurederivat eines polyaminosäurepolyzyklischen Imids, wie beschrieben in EP-A-0458079, oder ein bioabbaubares Polymer, wie beschrieben in WO-A-9317718 oder WO-A-9607434), ein nicht-polymeres und nicht-polymersierbares Wand-bildendes Material (zum Beispiel wie beschrieben in WO-A-9521631), oder ein oberflächenaktives Mittel (zum Beispiel ein oberflächenaktives Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Block-Copolymer-Mittel, wie ein Pluronic, ein oberflächenaktives Polymer-Mittel, wie beschrieben in WO-A-9506518, oder ein filmbildendes oberflächenaktives Mittel, wie ein Phospholipid, z.B. wie beschrieben in WO-A-9211873, WO-A-9217212, WO-A-9222247, WO-A-9428780 oder WO-A-9503835).
  • Andere nützliche Gas enthaltende Kontrastmittelformulierungen umfassen Gas enthaltende Feststoffsysteme, zum Beispiel Mikroteilchen (insbesondere Aggregate von Mikroteilchen), die Gas darin enthalten oder auf andere Weise damit in Verbindung stehen (zum Beispiel durch auf deren Oberfläche absorbiert sein und/oder enthalten sein innerhalb von Hohlräumen, Cavitäten oder Poren darin, z.B. wie beschrieben in EP-A-0122624, EP-A-0123235, EP-A-0365467, WO-A-9221382, WO-A-9300930, WO-A-9313802, WO-A-9313808 oder WO-A-9313809). Es wird anerkannt werden, dass die Echogenizität derartiger mikroteilchenförmiger Kontrastmittel direkt von dem enthaltenden/damit in Verbindung stehenden Gas und/oder von Gas (z.B. Mikrobläschen), die aus dem Feststoffmaterial freigesetzt werden (z.B. bei Auflösung der mikroteilchenförmigen Struktur), abgeleitet werden kann.
  • Gas-Mikrobläschen und andere Gas enthaltende Materialien, wie Mikroteilchen, besitzen bevorzugt eine anfängliche durchschnittliche Größe, die nicht 10 μ (z.B. 7 μ oder weniger) überschreitet, um ihre freie Passage durch das pulmonare System, nach der Verabreichung, z.B. durch intravenöse Injektion, zu ermöglichen.
  • Wo Phospholipid enthaltende Zusammensetzungen gemäß der Erfindung eingesetzt werden, z.B. in der Form von Phospholipid stabilisierten Mikrobläschen, umfassen repräsentative Beispiele für nützliche Phospholipide Lecithine (d.h. Phosphatidylcholine), zum Beispiel natürliche Lecithine wie Eidotter-Lecithin oder Soyabohnenlecithin und synthetische oder halbsynthetische Lecithine, wie Dimyristoylphosphatdiylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin oder Distearoylphosphatidylcholin; Phosphatidsäuren; Posphatidylethanolamine; Phosphatidylserine; Phosphatidylglycerole; Phosphatidylinositole; Cardiolipine; Sphingomyeline; fluorierte Analoga eines beliebigen des Vorstehenden; Mischungen eines beliebigen des Vorstehenden und Mischungen mit anderen Lipiden, wie Cholesterin. Die Verwendung von Phospholipiden, umfassend vorwiegend (z.B. mindestens 75%) Moleküle, die individuell eine Netto-Gesamtladung tragen, z.B. negative Ladung, zum Beispiel wie in natürlich auftretenden (z.B. Soyabohnen- oder Eidotter-abgeleiteten), halbsynthetischen (z.B. teilweise oder vollständig hydrierten) und synthetischen Phosphatidylserinen, Phosphortidylglycerolen, Phosphatidylinositolen, Phosphatidsäuren, und/oder Cardiolipinen, kann besonders vorteilhaft sein.
  • Andere beispielhafte Lipide, die zum Herstellen von Gas enthaltenden Kontrastmitteln verwendet werden können, umfassen Fettsäuren, Stearinsäure, Palmitinsäure, 2-n-Hexadecylstearinsäure, Ölsäure und andere Säuren, die Lipidstrukturen enthalten. Diese Lipidstrukturen werden als besonders interessant betrachtet, wenn sie durch Amidbindungsbildung an Aminosäuren gekoppelt sind, die eine oder mehrer Aminogruppen enthalten. Die resultierenden Lipid-modifzierten Aminosäuren (z.B. Dipalmitoyllysin, Distearoyl-2,3-diaminopropionsäure) werden als nützliche Vorläufer für das Binden von funktionalisierten Spacerelementen betrachtet, die Kopplungsstellen für die Konjugation eines oder mehrerer Vektormoleküle bieten.
  • Eine weitere Erweiterung dieser Erfindung bezieht sich auf die Synthese von Lipopeptidstrukturen, die einen Lipidreporter umfassen, der an ein Linkerteil gebunden ist (z.B. PEG, Polyaminosäure, Alkylhalogenid etc.), wobei der Linker geeigneterweise zum Koppeln an einen oder mehrere Vektormoleküle funktionalisiert ist. Besonders bevorzugt ist der Einbau eines positiv geladenen Linkerelementes (z.B. zwei oder mehr Lysinreste), zum Verankern des Reporterelementes im Mikrobläschen durch elektrostatische Wechselwirkung mit der negativ geladenen Membran. Mehrfach spezifisches Zielausrichten ist erreichbar durch Mischen und „Dotieren" von Gas enthaltenden Phospholipidstrukturen mit einer oder mehreren zielausgerichteten Lipopeptidsequenzen. Mehrfach-Spezifität kann auch erreicht werden durch Anbauen von mehr als einem Vektor an eine verzweigte Lysin-Kernstruktur, wie jene, die von Tam et al. beschrieben ist (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 9084), oder durch Einbauen mehrfacher Vektoren in eine lineare Sequenz. Mehrfachspezifität kann auch erreicht werden unter Verwenden von Lipopeptiden oder Phospholipiden, die kombinatorische Bibliotheken enthalten, die durch chemische Synthese synthetisiert sind, wie beschrieben von Lowe (Combinatorial Chemistry, Chemical Society Reviews, 1995, 309–317).
  • Auch innerhalb des Umfangs dieser Erfindung sind funktionalisierte Mikrobläschen, die eine oder mehrere reaktive Gruppen für nicht-spezifische Reaktion mit Rezeptormolekülen tragen, die auf Zelloberflächen lokalisiert sind. Mikrobläschen, die zum Beispiel eine Thioleinheit umfassen, können an Zelloberflächenrezeptoren über Disulfid-Austauschreaktionen binden. Die reversible Natur dieser kovalenten Bindung bedeutet, dass Bläschenfluss durch Ändern der Redox-Umgebung gesteuert werden kann. Auf ähnliche Weise können „aktivierte" Mikrobläschen von Membranen, die aktive Ester umfassen, wie N-Hydroxysuccinimidester, verwendet werden, um Aminogruppen zu modifizieren, die auf einer Mehrzahl von Zelloberflächenmolekülen gefunden werden.
  • Repräsentative Beispiele Gas enthaltender mikroteilchenförmiger Materialien, die gemäß der Erfindung nützlich sein können, umfassen Kohlenhydrate (zum Beispiel Hexosen, wie Glucose, Fructose oder Galactose; Disaccharide wie Saccharose, Lac tose oder Maltose; Pentosen, wie Arabinose, Xylose oder Ribose; α-, β- und γ-Cyclodextrine; Polysaccharide, wie Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Amylopectin, Glycgen, Inulin, Pulullan, Dextran, Carboxymethyldextran, Dextranphosphat, Ketodextran, Aminoethyldextran, Alignate, Chitin, Chitosan, Hyaluronsäure oder Heparin; und Zucker-Alkohole, einschließlich Alditole, wie Manitol oder Sorbitol), anorganische Salze (z.B. Natriumchlorid), organische Salze (z.B. Natriumcitrat, Natriumacetat oder Natriumtartrat), Röntgenstrahlungs-Kontrastmittel (z.B. beliebige der kommerziell erhältlichen Carbonsäure- oder nicht-ionischen Amid-Kontrastmittel, die typischerweise mindestens eine 2,4,6-Trijodphenylgruppe enthalten, die Substituenten aufweist, wie Carboxyl, Carbamoyl, N-Alkylcarbamoyl, N-Hydroxyalkylcarbamoyl, Acylamino, N-alkylacylamino oder Acylaminomethyl an den 3- und/oder 5-Positionen, wie in Metrizoesäure, Diatrizoesäure, Iothalaminsäure, Ioxaglinsäure, Iohexol, Iopentol, Iopamidol, Iodixanol, Iopromid, Metrizamid, Iodipamid, Megluminiodipamid, Meglumin-acetrizoat und Meglumin-diatrizoat), und Polypeptide und Proteine (z.B. Gelatine oder Albumin, wie menschliches Serumalbumin).
  • Ein beliebiges biokompatibles Gas kann im Reporter vom Kontrastmitteln gemäß der Erfindung vorhanden sein, wobei der Begriff „Gas", wie hier verwendet, beliebige Substanzen (einschließlich Mischungen) im wesentlichen oder vollständig in gasförmiger (einschließlich dampfförmiger) Form bei der normalen Menschenkörper-Temperatur von 37°C umfasst. Das Gas kann so, zum Beispiel, umfassen, Luft; Stickstoff; Sauerstoff; Kohlendioxid; Wasserstoff; ein inertes Gas, wie Helium, Argon, Xenon oder Krypton; ein Schwefelfluorid, wie Schwefelhexafluorid, Dischwefeldecafluorid, oder Trifluormethylschwefelpentafluorid; Selenhexafluorid, ein gegebenenfalls halogeniertes Silan, wie Methylsilan oder Dimethylsilan; ein Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts (z.B. enthaltend bis zu 7 Kohlenstoffatome), zum Beispiel ein Alkan, wie Methan, Ethan, ein Propan, ein Butan, oder ein Pentan, ein Cycloalkan, wie Cyclopropan, Cyclobutan oder Cyclopentan, ein Alken, wie Ethylen, Propen, Propadien oder ein Buten, oder ein Alkin wie Acetylen oder Propin; einen Ether, wie Dimethylether; ein Keton; ein Ester; einen halogenierten Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts (z.B. der bis zu 7 Kohlenstoffatomen enthält); oder eine Mischung der beliebigen der Vorstehenden. Vorteilhafterweise sind mindestens einige der Halogenatome in halogenierten Gasen Fluoratome; so können zum Beispiel biokompatible halogenierte Kohlenwasserstoff-Gase ausgewählt sein aus: Bromchlordifluormethan, Chlordifluormethan, Dichlordifluormethan, Bromtrifluormethan, Chlortrifluormethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortetrafluorethan, Chlortrifluorethylen, Fluorethylen, Ethylfluorid, 1,1-Difluorethan und Perfluorkohlenstoffe, z.B. Perfluoralkane wie Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropane, Perfluorbutane (z.B. Perfluor-n-butan, gegebenenfalls in Zumischung mit anderen Isomeren, wie Perfluor-isobutan), Perfluorpentane, Perfluorhexane und Perfluorheptane; Perfluoralkene wie Perfluorpropen, Perfluorbutene (z.B. Perfluorbut-2-en) und Perfluorbutadien; Perfluoralkine wie Perfluorbut-2-in; und Perfluorcycloalkane, Perfluorcyclobutan, Perfluormethylcyclobutan, Perfluordimethylcyclobutane, Perfluortrimethylcyclobutane, Perfluorcyclopentan, Perfluormethylcyclopentan, Perfluordimethylcyclopentane, Perfluorcyclohexan, Perfluormethylcyclohexan und Perfluorcycloheptan. Andere halogenierte Gase umfassen Methylchlorid, fluorierte (z.B. perfluorierte) Ketone, wie Perfluoraceton und fluorierte (z.B. perfluorierte) Ether wie Perfluordiethylether. Die Verwendung von perfluorierten Gasen, zum Beispiel Schwefelhexafluorid und Perfluorkohlenstoffe wie Perfluorpropan, Perfluorbutane und Perfluorpentane können besonders vorteilhaft in Hinblick auf die erkannte hohe Stabilität im Blutstrom von Mikrobläschen, die derartige Gase enthalten, sein.
  • Der Reporter kann durch einen beliebigen günstigen Prozess erzeugt sein, zum Beispiel durch Erzeugen von Gas enthaltenden oder Gas erzeugenden Formulierungen. Repräsentative Beispiele umfassen die Herstellung einer Suspension von Gasmikrobläschen durch in Kontakt Bringen eines oberflächenaktiven Mittels mit Gas und sie Mischen bei Vorhandensein eines wässrigen Trägers, wie beschrieben in WO 9115244; oder durch Atomisieren einer Lösung oder Dispersion eines Wand-bildenden Materials bei Vorhandensein eines Gases, um hohle Mikrokapseln zu erhalten, wie beschrieben in EP 512693A1 ; Herstellung von festen Mikrokugeln durch einen doppelten Emulgierprozess, wie beschrieben in US 5648095 ; oder einen Prozess zum Bilden hohler Mikrokapseln durch Sprühtrocknen wie beschrieben in EP 681843A2 ; oder Herstellen von Gas-gefüllten Liposomen durch Schütteln einer wässrigen Lösung, die ein Lipid umfasst, bei Vorhandensein eines Gases, wie beschrieben in US 5469854 .
  • Ein geeigneter Prozess zum Binden des erwünschten Vektors an den Reporter umfasst eine Oberflächenmodifikation des vorgeformten Reporters, mit einem geeigneten Linker, unter Einsetzen reaktiver Gruppen auf der Oberfläche von sowohl dem Reporter als auch dem Vektor. Es kann besonders vorteilhaft sein, das Reportermaterial mit der Vektor-enthaltenden Substanz in einem beliebigen Schritt des Prozesses physikalisch zu mischen. Ein derartiger Prozess wird zum Einbau oder zu einer Bindung des Vektors an den Reporter führen. Ein optionaler Prozessschritt kann den Überschuss des Vektors, der nicht an den Reporter gebunden ist, entfernen durch Waschen der Gas enthaltenden Teilchen nach der Trennung, zum Beispiel Flotation. Ein bevorzugter Aspekt ist die Verwendung von Lipopeptidstrukturen, die funktionelle Gruppen eingebaut haben, wie Thiol, Maleimidbiotin etc., die, falls erwünscht, mit anderen Reportermolekülen vor der Bildung von Gas enthaltenden Mitteln vorgemischt werden können. Die Bindung von Vektormolekülen kann ausgeführt werden unter Verwenden der unten aufgelisteten Linker-Reagenzien.
  • Binden einer Reportereinheit an erwünschte Vektoren kann erreicht werden durch kovalente und nicht-kovalente Mittel, üblicherweise beinhaltend eine Wechselwirkung mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die auf dem Reporter und/oder Vektoren lokalisiert sind. Beispiele chemisch reaktiver funktioneller Gruppen, die für diesen Zweck eingesetzt werden können, umfassen Amino-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Carboxyl- und Carbonylgruppen, wie auch Kohlenhydratgruppen, vicinale Diole, Thioether, 2-Aminoalkohole, 2-Aminothiole, Guanidinyl-, Imidazolyl- und Phenolgruppen.
  • Kovalentes Koppeln von Reporter und Vektoren kann deshalb bewirkt werden unter Verwenden von verbindenden Mitteln, die reaktive Einheiten enthalten, die zur Reaktion mit derartigen funktionellen Gruppen fähig sind. Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Sulfhydryl-Gruppen fähig sind, umfassen α-Haloacetyl-Verbindungen des Typs X-CH2-CO- (wobei X = Br, Cl oder I), die eine besondere Reaktivität für Sulfhydrylgruppen zeigen, die aber auch verwendet werden können, um Imidazolyl-, Thioether-, Phenol- und Aminogruppen zu modifizieren, wie beschrieben von Gurd, F. R. N. in in Methods Enzymol. (1967) 11, 532. N-Maleimid-Derivate werden auch als selektiv gegenüber Sulfhydryl-Gruppen betrachtet, aber können zusätzlich beim Koppeln an Aminogruppen unter bestimmten Bedingungen nützlich sein. N-Maleimide können in verbindende Systeme für Reporter-Vektor-Konjugation eingebaut werden, wie beschrieben von Kitagawa, T. et al. in Chem. Pharm. Bull. (1981) 29, 1130 oder können als Polymer-Vernetzer für Bläschenstabilisierung verwendet werden, wie beschrieben von Kovacic, P. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1959) 81, 1887. Reagenzien, wie 2-Iminothiolan, zum Beispiel wie beschrieben von Traut, R. et al. in Biochemistry (1973) 12, 3266, die eine Thiolgruppe durch Umwandlung einer Aminogruppe einführen, können als Sulfhydryl-Reagenzien betrachtet werden, falls das Binden durch die Bildung von Disulfidbrücken erfolgt. Derartige Reagenzien, die reaktive Disulfidbindungen in entweder dem Reporter oder die Vektoren einführt, kann nützlich sein, da das Verbinden durch Disulfidaustausch zwischen dem Vektor und dem Reporter herbeigeführt werden kann; Beispiele derartiger Reagenzien umfassen umfassen Ellman's Reagent (DTNB), 4,4'-Dithiodipyridin, Methyl-3-nitro-2-pyridyldisulfid und Methyl-2-pyridyldisulfid (beschrieben von Kimura, T. et al. in Analyt. Biochem. (1982) 122, 271).
  • Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Aminogruppen fähig sind, umfassen alkylierende und acylierende Mittel. Repräsentative alkylierende und acylierende Mittel umfassen:
    • i) α-Haloacetylverbindungen, die eine Spezifität gegenüber Aminogruppen in Abwesenheit reaktiver Thiolgruppen zeigen und vom Typ X-CH2-CO (wobei X = Cl, Br oder I) sind, z.B. wie beschrieben von Wong, Y-H. H. in Biochemistry (1979) 24, 5337;
    • ii) N-Maleimide-Derivate, die mit Aminogruppen entweder durch eine Michael-Typ-Reaktion oder durch Acylierung durch Addition an die Ring-Carbonylgruppe reagieren können, wie beschrieben von Smyth, D. G. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1960) 82, 4600 und Biochem. J. (1964) 91, 589;
    • iii) Arylhalogenide, wie reaktive nitrohaloaromatische Verbindungen;
    • iv) Alkylhalogenide, wie beschrieben von McKenzie, J. A. et al. in J. Protein Chem. (1988) 7, 581;
    • v) Aldehyde und Ketone, die zur Schiff-Basen-Bildungen mit Aminogruppen fähig sind, wobei die gebildeten Adducte üblicherweise durch Reduktion stabilisiert werden, um ein stabiles Amin zu ergeben;
    • vi) Epoxid-Derviate, wie Epichlorhydrin und Bisoxirane, die mit Amino-, Sulfhydryl- oder Phenolhydroxyl-Gruppen reagieren können;
    • vii) Chlor-enthaltende Derivate von s-Triazine, die sehr reaktiv gegenüber Nucleophilen, wie Amino-, Sulfhydryl- und Hydroxy-Gruppen sind;
    • viii) Aziridine, die auf s-Triazin-Verbindungen basieren, die oben detailliert beschrieben sind, z.B. wie beschrieben von Ross, W. C. J. in Adv. Cancer Res. (1954) 2, 1, die mit Nucleophilen, wie Aminogruppen reagieren durch Ringöffnung;
    • ix) Quadratsäure-Diethylester, wie beschrieben von Tietze, L. F. in Chem. Ber. (1991) 124, 1215; und
    • x) A-Haloalkylether, die reaktivere Alkylierungsmittel sind, als normale Alkylhalogenide, wegen der Aktivierung, die vom Ether-Sauerstoffatom verursacht wird, z.B. wie beschrieben von Benneche, T. et al. in Eur. J. Med. Chem. (1993) 28, 463.
  • Repräsentative Amino-reaktive acylierende Mittel umfassen:
    • i) Isocyanate und Isothiocyanate, insbesondere aromatische Derivate, die stabile Harnstoff- bzw. Thioharnstoff-Derivate bilden und für Proteinvernetzung benutzt worden sind, wie beschrieben von Schick, A. F. et al. in J. Biol. Chem. (1961) 236, 2477;
    • ii) Sulfonylchloride, die beschrieben worden sind von Herzig, D. J. et al. in Biopolymers (1964) 2, 349 und die für die Einführung einer fluoreszierenden Reportergruppe in den Linker nützlich sind;
    • iii) Säurehalogenide;
    • iv) Aktive Ester, wie Nitrophenylester oder N-Hydroxysuccinimidylester;
    • v) Säureanhydride, wie gemischte, symmetrische oder N-Carboxyanhydride;
    • vi) Andere nützliche Reagenzien für Amidbindungsbildung, wie beschrieben von Bodanksky, M. et al. in ,Principles of Peptide Synthesis' (1984) Springer-Verlag;
    • vii) Acylazide, z.B. bei denen die Acidgruppe aus einem vorgeformten Hydrazit-Derivat unter Verwendung von Natriumnitrit gebildet wird, z.B wie beschrieben von Wetz, K. et al. in Anal. Biochem. (1974) 58, 347;
    • viii) Azlactone, die an Polymere gebunden sind, wie Bisacrylamide, z.B. wie beschrieben von Rasmussen, J. K. in Reactive Polymers (1991) 16, 199; und
    • ix) Imidoester, die stabile Amidine bei der Reaktion mit Aminogruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Hunter, M. J. und Ludwig, M. L. in J. A. Chem. Soc. (1962) 84, 3491.
  • Carbonylgruppen, wie Aldehydfunktionen können mit schwachen Proteinbasen bei einem derartigen pH umgesetzt werden, dass die nukleophilen Protein-Seitenkettenfunktionen protoniert werden. Schwache Basen umfassen 1,2-Aminothiole, wie jene, die in N-terminalen Cysteinresten gefunden werden, die selektiv stabile 5-gliedrige Thiazolidin-Ringe mit Aldehydgruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Ratner, S. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1937) 59, 200. Andere schwache Basen, wie Phenylhydrazone, können verwendet werden, z.B. wie beschrieben von Heitzmann, H. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71, 3537.
  • Aldehyde und Ketone können auch mit Aminen umgesetzt werden, um Schiff-Basen zu bilden, die vorteilhafterweise durch reduktive Aminierung stabilisiert werden können.
  • Alkoxylamino-Einheiten reagieren leicht mit Ketonen und Aldehyden, um stabile Alkoxamine herzustellen, z.B. wie beschrieben von Webb, R. et al. in Bioconjugate Chem. (1990) 1, 96.
  • Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Carboxylgruppen fähig sind, umfassen Diazo-Verbindungen, wie Diazoacetatester und Diazoacetamide, die mit hoher Spezifität reagieren, um Estergruppen zu erzeugen, z.B. wie beschrieben von Herriot, R. M. in Adv. Protein Chem. (1947) 3, 169. Carbonsäure modifizierende Mittel, wie Carbodiimide, die durch O-Acylharnstoff-Bildung gefolgt von Amidbindungs-Bildung reagieren, können auch nützlicherweise eingesetzt werden; das Binden kann durch Addition eines Amins vereinfacht werden oder kann zu einer direkten Vektor-Rezeptor-Kopplung führen. Nützliche wasserlösliche Carbodiimide umfassen 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide (CMC) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), z.B. wie beschrieben von Zot, H. G. und Puett, D. in J. Biol. Chem. (1989), 264, 15552. Andere nützliche Carbonsäure modifizierende Reagenzien umfassen Isoxazolium-Derivate, wie Woodwards Reagenz K; Chloroformiate, wie p-Nitrophenyl-chloroformiat; Carbonyldiimidazole, wie 1,1'-Carbonyldiimidazol; und N-Carbalkoxydihydrochinoline, wie M-(Ethoxycarbonyl)-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin.
  • Andere möglicherweise nützliche reaktive Einheiten umfassen vicinale Dione, wie p-Phenylendiglyoxal, die zum Reagieren mit Guanidyl-Gruppen verwendet werden können, z.B. wie beschrieben von Wagner et al. in Nucleic acid Res. (1978) 5, 4065; und Diazonium-Salze, die elektrophile Substitutionsreaktionen durchlaufen können, z.B. wie beschrieben von Ishizaka, K. und Ishizaka T. in J. Immunol. (1960) 85, 163. Bis-diazonium-Verbindungen werden leicht durch Behandlung von Aryldiaminen mit Natriumnitrit in sauren Lösungen hergestellt. Es wird anerkannt werden, dass funktionelle Gruppen im Reporter und/oder Vektor, falls erwünscht, in andere funktionelle Gruppen von der Reaktion umgewandelt werden können, z.B. um zusätzliche Reaktivität oder Selektivität zu verleihen. Beispiele für Verfahren, die für diesen Zweck nützlich sind, umfassen die Umwandlung von Aminen zu Carbonsäuren unter Verwenden von Reagenzien, wie Dicarbonsäureanhydride; die Umwandlung von Ami nen in Thiole unter Verwenden von Reagenzien, wie N-Acetylhomocysteinthiolacton, S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid, 2-Iminothiolan- oder Thiol-enthaltende Succinimidyl-Derivate; die Umwandlung von Thiolen in Carbonsäuren unter Verwenden von Reagenzien, wie α-Haloacetate; die Umwandlung von Thiolen in Amine unter Verwenden von Reagenzien, wie Ethylenimin oder 2-Bromoethylamin; die Umwandlung von Carbonsäuren in Amine unter Verwenden von Reagenzien, wie Carbodiimide, gefolgt von Diaminen; und die Umwandlung von Alkoholen in Thiole unter Verwenden von Reagenzien, wie Tosylchlorid, gefolgt von Umesterung mit Thioacetat und Hydrolyse zum Thiol mit Natriumacetat.
  • Vektor-Reporter-Kopplung kann auch bewirkt werden unter Verwenden von Enzymen, wie Null-Längen-Vernetzungsmittel; so wurden z.B. Transglutaminase, Peroxidase und Xanthinoxidase zum Herstellen vernetzter Produkte verwendet. Reverse Proteolyse kann auch zum Vernetzen durch Amidbindungs-Bildung verwendet werden.
  • Nicht-kovalente Vektor-Reporter-Kopplung kann z.B. durch elektrostatische Ladungs-Wechselwirkungen bewirkt werden, z.B. zwischen einem Polylysinyl-funktionalisiertem Reporter und einem Polyglutamyl-funktionalisiertem Vektor, durch Chelatierung in der Form von stabilen Metallkomplexen oder durch Hochaffinitäts-Bindungs-Wechselwirkung, wie Avidin/Biotin-Bindung. Polylysin, das nicht-kovalent auf einer negativ geladenen Membranoberfläche geschichtet ist, kann auch nicht-spezifisch die Affinität eines Mikrobläschens für eine Zelle durch Ladungswechselwirkungen vergrößern.
  • Alternativ können Vektoren an eine Protein- oder Peptidsequenz gekoppelt werden, die dafür bekannt ist, Phospholipide zu binden. In vielen Fällen kann ein einzelnes Molekül Phospholipid an ein Protein, wie eine Translokase binden, während andere Proteine an Oberflächen binden können, die hauptsächlich aus Phospholipid-Kopfgruppen bestehen, und so zum Binden von Vektoren an Phospholipid-Mikrokügelchen verwendet werden können; ein Beispiel eines derartigen Proteins ist β2-Glykoprotein I (Chonn, A., Semple, S. C. und Cullis, P. R., Journal of Biological Chemistry (1995) 270, 25845–25849). Phosphatidylserin-bindende Proteine wurden beschrieben, z.B. von Igarashi, K. et al. in Journal of Biological Chemistry 270 (49), 29075–29078. Annexine sind eine Klasse von Phospholipid bindenden Proteinen, von denen viele besonders begierig an Phosphatidylserin binden (Überblick in Raynal, P. und H. B. Pollard. Annexins: the problem of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calcium- and phospholipid-binding proteins". Biochim. Biophys. Acta 1197: 63–93). Ein Konjugat eines Vektors mit einem derartigen Phosphatidylserin-bindenden Protein kann deshalb zum Binden des Vektors an Phosphatidylserin-eingekapselte Mikrobläschen verwendet werden. Wenn die Aminosäuresequenz eines bindenden Proteins bekannt ist, kann der Phospholipid-bindende Teil synthetisiert oder isoliert werden und für die Konjugation mit einem Vektor verwendet werden, und so die biologische Aktivität vermeiden, die irgendwo im Molekül lokalisiert sein kann.
  • Es ist auch möglich, Moleküle zu erhalten, die spezifisch an die Oberfläche (oder in die „Membran") von Mikrokügelchen binden, durch direktes Screenen von molekularen Bibliotheken auf Mikrokügelchen-bindende Moleküle. Zum Beispiel können Phagen-Bibliotheken, die kleine Peptide zeigen, für eine derartige Selektion verwendet werden. Die Selektion kann erfolgen durch einfach Mischen der Mikrokügelchen und der Phagen-Display-Bibliothek, und Eluieren der Phagen, die an die flotierenden Mikrokügelchen binden. Falls erwünscht, kann die Selektion ausgeführt werden unter „physiologischen Bedingungen" (z.B. im Blut), um Peptide zu eliminieren, die mit Blutkomponenten kreuzreagieren. Ein Vorteil dieses Typs der Selektionsprozedur ist, dass nur bindende Moleküle, die nicht die Mikrokügelchen destabilisieren, ausgewählt werden sollten, da nur bindende Moleküle, die an intakte flotierende Mikrokügelchen binden, nach oben steigen werden. Es kann auch möglich sein, etwas „Spannung" während der Selektionsprozedur (z.B. Druck) einzuführen, um sicherzustellen, dass destabilisierende bindende Einheiten nicht selektiert werden. Außerdem könnte die Selektion unter Scher-Bedingungen durchgeführt werden, z.B. durch zuerst Reagierenlassen der Phagen mit den Mikrokügelchen und dann Durchlaufenlassen der Mikrokügelchen durch eine Oberfläche, die mit Anti-Phagen-Antikörpern bedeckt sind, unter Flussbedingungen. Auf diese Weise kann es möglich sein, Binder zu selektieren, die Scher-Bedingungen, die in vivo vorhanden sind, widerstehen. Bindende Einheiten, die auf diese Weise identifiziert werden, können chemisch über Peptidsynthese, oder auf dem DNA-Niveau für rekombinante Vektoren) an ein Vektormolekül gekoppelt werden, das ein allgemeines Werkzeug zum Binden eines beliebigen Vektormoleküls an die Mikrokügelchen darstellt.
  • Ein Vektor, der einen Peptid- oder Lipopeptid-Linker umfasst oder daran gekoppelt ist, der ein Element enthält, das zum Vermitteln einer Membraninsertion fähig ist, kann auch nützlich sein. Ein Beispiel ist beschrieben von Leenhouts, J. M. et al. in Febs Letters (1995) 370 (3), 189–192. Nicht-bioaktive Moleküle, die aus bekannten Membraninsertions-Anker/Signalgruppen bestehen, können auch als Vektoren für bestimmte Anwendungen verwendet werden, wobei ein Beispiel das hydrophobe H1-Segment der Na,K-ATPase-α-Untereinheit ist, die von Xie, Y. und Morimoto, T. in J. Biol. Chem. (1995) 270 (20), 11985–11991 beschrieben ist. Die Ankergruppe kann auch Fettsäure(n) oder Cholesterin sein.
  • Koppeln kann auch bewirkt werden unter Verwenden von Avidin oder Streptavidin, die vier Hochaffinitäts-Bindungsstellen für Biotin besitzen. Avidin kann deshalb zum Konjugieren des Vektors an den Reporter verwendet werden, falls sowohl der Vektor als auch der Reporter biotinyliert sind. Beispiele werden beschrieben von Bayer, E. A. und Wilchek, M. in Methods Biochem. Anal. (1980) 26,1. Dieses Verfahren kann auch erweitert werden, um das Binden von Reporter an Reporter zu umfassen, ein Prozess, der die Bläschen-Assoziation und eine nachfolgend möglicherweise vergrößerte Echogenizität fördert.
  • Nicht-kovalentes Koppeln kann auch die bifunktionelle Natur von bispezifischen Immunoglobulinen nutzen. Diese Moleküle können spezifisch zwei Antigene binden und sie so verbinden. Zum Beispiel können entweder bispezifisches IgG oder chemisch entworfene bispezifische F(ab)'2-Fragmente als verbindende Mittel verwendet werden. Es wurde auch berichtet von heterobifunktionellen bispezifischen Antikörpern für das Binden zweier verschiedener Antigene, z.B. wie beschrieben von Bode, C. et al. in J. Biol. Chem. (1989) 264, 944 und von Staerz, U. D. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 1453. Auf ähnliche Weise kann ein beliebiger Reporter und/oder Vektor, der zwei oder mehr antigene Determinanten enthält (z.B. wie beschrieben von Chen, Aa et al. in Am. J. Pathol. (1988) 130, 216), Antikörpermoleküle vernetzen und zur Bildung von vernetzten Multi-Bläschen-Vereinigungen möglicherweise vergrößerter Echogenizität führen.
  • Sogenannte Null-Längen-verbindende Mittel, die ein direktes kovalentes Verknüpfen zweier reaktiver chemischer Gruppen ohne Einführen zusätzlichen verbindenden Materials induzieren (z.B. wie bei der Amidbindungs-Bildung, die unter Verwenden von Carbodiimiden oder enzymatisch induziert ist), können, falls erwünscht, gemäß der Erfindung verwendet werden, wie viele Reagenzien, wie Biotin/Avidin-Systeme, die nicht-kovalentes Reporter-Vektor-Binden induzieren, und Mittel, die hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen induzieren.
  • Am häufigsten wird jedoch das verbindende Mittel zwei oder mehr reaktive Einheiten umfassen, z.B. wie oben beschrieben, die durch ein Spacerelement verbunden sind. Das Vorhandensein eines derartigen Spacers erlaubt bifunktionellen Linkern, mit spezifischen funktionellen Gruppen innerhalb eines Moleküls oder zwischen zwei verschiedenen Molekülen zu reagieren, was zu einer Bindung zwischen diesen zwei Komponenten und Einführen extrinsischen, vom Linker abgeleiteten Materials in das Reporter-Vektor-Konjugat führt. Die reaktiven Einheiten in einem verbindenden Mittel können dieselben (homobifunktionelle Mittel) oder verschieden (heterobifunktionelle Mittel oder, wo mehrere unähnliche reaktive Einheiten vorhanden sind, heteromultifunktionelle Mittel) sein, was eine Vielfalt von möglichen Reagenzien bereitstellt, die das kovalente Binden zwischen beliebigen chemischen Spezien herbeiführen kann, entweder intramolekular oder intermolekular.
  • Die Natur extrinsischen Materials, das durch das verbindende Mittel eingeführt wird, kann einen entscheidenden Einfluss auf die Zielausrichtungsfähigkeit und allgemeine Stabilität des Endprodukts besitzen. So kann es erwünscht sein, labile Bindungen einzuführen, z.B. die Spacerarme enthalten, die bioabbaubar oder chemisch empfindlich sind oder die Stellen enzymatischer Spaltung einbauen. Alternativ kann der Spacer polymere Komponenten umfassen, z.B. um als oberflächenaktive Mittel zu wirken und die Bläschenstabilität zu verstärken. Der Spacer kann auch reaktive Einheiten enthalten, z.B. wie oben beschrieben, um das Oberflächen-Vernetzen zu verstärken, oder er kann ein Tracerelement, wie eine fluoreszierende Sonde, einen Spinmarker oder radioaktives Material enthalten.
  • Spacerlemente können typischerweise aus aliphatischen Ketten bestehen, die die reaktiven Einheiten des Linkers durch Entfernungen zwischen 5 und 30 Å trennen. Sie können auch makromolekulare Strukturen umfassen, wie Polyethylenglycole. Derartige polymere Strukturen, im folgenden als PEGs bezeichnet, sind einfache neutrale Polyether, denen viel Aufmerksamkeit in biotechnischen und biomedizinischen Anwendungen gegeben wurde (siehe z.B. Milton Harris, J. (Hsg.) „Poly(ethylene glycol) chemistry, biotechnical and biomedical applications" Plenum Press, New York, 1992). PEGs sind in den meisten Lösungsmitteln, einschließlich Wasser, löslich und sind in wässrigen Umgebungen stark hydratisiert, wobei zwei oder drei Wassermoleküle an jedes Ethylenglykolsegment gebunden sind; dies besitzt den Effekt des Verhinderns einer Adsorption entweder von anderen Polymeren oder von Proteinen an PEG-modifizierte Oberflächen. PEGs sind als nicht-toxisch und als aktive Proteine oder Zellen nicht schädigend bekannt, während kovalent gebundene PEGs dafür bekannt sind, dass sie nicht-immunogen und nicht-antigen sind. Außerdem können PEGs auf einfache Weise modifiziert und gebunden werden an andere Moleküle mit nur einem kleinen Effekt auf ihre Chemie. Ihre vorteilhafte Löslichkeit und die biologischen Eigenschaften sind offenbar von den vielen möglichen Verwendungen von PEGs und Copolymeren davon, einschließlich Blockcopolymeren, wie PEG-Polyurethanen und PEG-Polypropylenen.
  • Geeignete Molekulargewichte für PEG-Spacer, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können z.B. zwischen 120 Dalton und 20 kDalton betragen.
  • Der Hauptmechanismus zur Aufnahme von Teilchen durch die Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) ist die Opsonisation durch Plasmaproteine im Blut; diese markieren Fremdteilchen, die dann vom RES aufgenommen werden. Die biologi schen Eigenschaften von PEG-Spacerelementen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können zum Vergrößern der Kontrastmittel-Zirkulationszeit verwendet werden, auf eine ähnliche Weise zu jener, die für PEGylierte Liposomen beobachtet wird (siehe z.B. Klibanov A. L. et al. in FEBS Letters (1990) 268, 235–237 und Blume, G. und Cevc, G. in Biochim. Biophys. Acta (1990) 1029, 91–97).
  • Andere möglicherweise nützliche Proteinmodifikationen, die an Vektoren ausgeführt werden können, umfassen teilweise oder vollständige Deglycosidierung durch Neuraminidase, Endoglycosydasen oder Periodat, da die Deglycosidierung oft zu einer geringeren Aufnahme durch die Leber, Niere, Makrophagen etc. führt, wohingegen Neo-Glycosilierung von Proteinen oft zu einer vergrößerten Aufnahme durch die Leber und Makrophagen führt; Herstellung von verkürzten Formen durch proteolytische Spaltung, was zu einer verringerten Größe und einer kürzeren Lebenszeit im Kreislauf führt; und Kationisierung, z.B. wie beschrieben von Kumagi et al. in J. Biol. Chem. (1987) 262, 15214–15219; Triguero et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 4761–4765; Pardridge et al. in J. Pharmacol. Exp. Therap. (1989) 251, 821–826 und Partridge und Boado, Febs Lett. (1991) 288, 30–32.
  • Vergrößerte Kopplungs-Wirksamkeit an Gebiete von Interesse kann auch erreicht werden unter Verwenden von Antikörpern, die an die Termini von PEG-Spacern gebunden sind (vgl. z.B. Maruyama, K. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1234, 74–80 und Hansen, C. B. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1239, 133–144).
  • In einigen Fällen wird es als vorteilhaft betrachtet, eine PEG-Komponente als einen Stabilisator in Zusammenhang mit einem Vektor oder Vektoren oder direkt am Reporter im selben Molekül einzuschließen, wobei das PEG nicht als ein Spacer dient.
  • Andere repräsentative Spacerelemente umfassen Polysaccharide des Strukturtyps, wie Polygalakturonsäure, Glykosaminoglykane, Heparinoide, Zellulose und marine Polysaccharide, wie Alginate, Chitosane und Carrageenans; Polysaccharide des Speichertyps, wie Stärke, Glykogen, Dextran und Aminodextrane; Polyaminosäuren und Methyl- und Ethylester davon, wie in Homo- und Copolymeren von Lysin, Gluta minsäure und Asparaginsäure; und Polypeptide, Oligonukleotide und Oligosaccharide, die Enzymspaltungsstellen enthalten können oder nicht.
  • Im allgemeinen können Spacerelemente spaltbare Gruppen enthalten, wie vicinale Glykol-, Azo-, Sulfon-, Ester-, Thioester- oder Disulfidgruppen. Spacer, die bioabbaubare Methylendiester- oder Diamidgruppen der Formel -(Z)m.Y.X.C.(R1R2).X.Y.(Z)n- enthalten [wobei X und Z ausgewählt sind aus -O-, -S-, und -NR- (wobei R für Wasserstoff oder eine organische Gruppe steht); jedes Y eine Carbonyl-, Thiocarbonyl-, Sulfonyl-, Phosphoryl- oder eine ähnliche säurebildende Gruppe ist: m und n jeweils für 0 oder 1 stehen; und R1 und R2 jeweils für Wasserstoff, eine organische Gruppe oder eine Gruppe -X.Y.(Z)m- stehen, oder zusammen eine divalente organische Gruppe bilden], können auch nützlich sein, wie z.B. diskutiert in WO-A-9217436, wobei derartige Gruppen auf einfache Weise bei Vorhandensein von Esterasen bioabbaubar sind, z.B. in vivo, aber bei Abwesenheit derartiger Enzyme stabil sind. Sie können deshalb vorteilhafterweise an therapeutische Mittel gebunden werden, um die langsame Freisetzung davon zu ermöglichen.
  • Poly[N-(2-hydroxyethyl)methacrylamide] sind möglicherweise nützliche Spacermaterialien aufgrund ihres geringen Grades der Wechselwirkung mit Zellen und Geweben (siehe z.B. Volfová, I., Rihová, B. und V. R. und Vetvicka, P. in J. Bioact. Comp. Polymers (1992) 7, 175–190). Die Arbeit mit einem ähnlichen Polymer, das hauptsächlich aus dem nahe verwandten 2-Hydroxypropylderivat besteht, zeigte, dass es durch das mononukleare Phagocyten-System nur in einem ziemlich geringen Ausmaß endozytosiert wurde (siehe Goddard, P., Williamson, I., Bron, J., Hutchkinson, L. E., Nicholls, J. und Petrak, K. in J. Bioct. Compat. Polym. (1991) 6, 4–24.).
  • Andere möglicherweise nützliche polymere Spacermaterialien umfassen:
    • i) Copolymere von Methylmethacrylat mit Methacrylsäure; diese können erodierbar sein (siehe Lee, P. I. in Pharm. Res. (1993) 10, 980) und die Carboxylatsubstituenten können einen höheren Grad des Quellens verursachen, als mit neutralen Polymeren;
    • ii) Blockcopolymere von Polymethacrylaten mit bioabbaubaren Polyestern (siehe z.B. San Roman, J. und Guillen-Garcia, P. in Biomaterials (1991) 12, 236–241);
    • iii) Cyanoacrylate, d.h. Polymere von Estern von 2-Cyanoacrylsäure – diese sind bioabbaubar und wurden in der Form von Nanopartikeln für selektive Arzneimittelverabreichung verwendet (siehe Forestier, F., Gerrier, P., Chaumard, C., Quero, A. M., Courvreur, P. und Labarre, C. in J. Antimicrob. Chemoter. (1992) 30, 173–179);
    • iv) Polyvinylalkohole, die wasserlöslich sind und allgemein als biokompatibel betrachtet werden (siehe z.B. Langer, R. in J. Control. Release (1991) 16, 53–60);
    • v) Copolymere von Vinylmethylether mit Maleinsäureanhydrid, die als bioerodierbar genannt worden sind (siehe Finne, U., Hannus, M. und Urtti, A. in Int. J. Pharm. (1992) 78, 237–241);
    • vi) Polyvinylpyrrolidone, z.B. mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 25000, die schnell durch die Nieren gefiltert werden (siehe Hespe, W., Meier, A. M. und Blankwater, Y. M. in Arzneim.-Forsch./Drug Res. (1977) 27, 1158–1162);
    • vii) Polymere und Coplymere von kurzkettigen aliphatischen Hydroxysäuren, wie Glykol-, Milch-, Butter-, Valerian- und Capronsäuren (siehe z.B. Carli in Chim. Ind. (Mailand) (1993) 75, 494–9), einschließlich Copolymere, die aromatische Hydroxysäuren eingebaut haben, um ihre Abbaugescüwindigkeit zu vergrößern (siehe Imasaki, K., Yoshida, M. Fukuzaki, H., Asano, M., Kumakura, M., Mashimo, T., Yamanaka, H. und Nagai. T. in Int. J. Pharm. (1992) 81, 31–38);
    • viii) Polyester, die aus alternierenden Einheiten von Ethylenglykol und Terephthalsäure bestehen, z.B. DacronR, die nicht abbaubar, aber hoch biokompatibel sind;
    • ix) Blockcopolymere, die bioabbaubare Segmente aliphatischer Hydroxysäurepolymere umfassen (siehe z.B. Younes, H., Nataf, P. R. Cohn, D., Appelbaum, Y. J., Pizov G. und Uretzky, G. in Biomater. Artif. Cells Artif. Organs (1988) 16, 705–719), z.B. in Zusammenhang mit Polyurethanen (siehe Kobayashi, H., Hyon, S. H. und Ikada, Y. in „Water-curable and biodegradable prepolymers"-J. Biomed. Mater. Res. (1991) 25, 1481–1494);
    • x) Polyurethane, von denen bekannt ist, dass sie in Implantaten gut toleriert werden und die mit flexiblen „weichen" Segmenten kombiniert werden können, z.B. umfassend Poly(tetramethylenglykol), Poly(propylenglykol) oder Poly(ethylenglykol) und aromatische „harte" Segmente, z.B. umfassend 4,4'-Methylenbis(phenylenisocyanat) (siehe z.B. Ratner, B. D., Johnston, A. B. und Lenk, T. J. in J. Biomed. Mater. Res: Applied Biomaterials (1987) 21, 59–90; Sa Da Costa, V. et al. in J. Coll. Interface Sci (1981) 80, 445–452 und Affrossman, S. et al. in Clinical Materials (1991) 8, 25–31);
    • xi) Poly(1,4-dioxan-2-one), die als bioabbaubare Ester im Hinblick auf ihre hydrolysierbaren Esterbindungen betrachtet werden können (siehe z.B. Song, C. X., Cui, C. M. und Schindler, A. in Med. Biol. Eng. Comput. (1993) 31, S147–150), und die Glykolideinheiten umfassen können, um ihre Absorbierbarkeit zu verbessern, (siehe Bezwada, R. S., Shalaby, S. W. und Newman, H. D. J. in Agricultural and synthetic polymers: Biodegradability and utilization (1990) (Hsg. Glass, J. E. und Swift, G.), 167m174 – ACS symposium Series, #433, Washington D. C., U.S.A. – American Chemical Society);
    • xii) Polyanhydride, wie Copolymere von Sebacinsäure (Oktandisäure) mit Bis(4-carboxy-phenoxy)propan, für die in Kaninchenstudien (siehe Brem, H., Kader, A., Epstein, J. I., Tamargo, R. J., Domb, A., Langer, R. und Leong, K. W. in Sel. Cancer Ther. (1989) 5, 55–65) und Rattenstudien (siehe Tamargo, R. J., Epstein, J. I., Reinhard, C. S., Chasin, M. und Brem, H. in J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23, 253–266) gezeigt wurde, dass sie für die gesteuerte Freisetzung von Arzneimitteln im Gehirn ohne evidente toxische Effekte nützlich sind;
    • xiii) bioabbaubare Polymere, die ortho-Estergruppen enthalten, die für eine gesteuerte Freisetzung in vivo eingesetzt worden sind (siehe Maa, Y. F. und Heller, J. in J. Control. Release (1990) 14, 21–28); und
    • xiv) Polyphosphazene, die anorganische Polymere sind, die aus alternierenden Phosphor- und Stickstoffatomen bestehen (siehe Crommen, J. H., Vandorpe, J. und Schacht, E. H. in J. Control. Release (1993) 24, 167–180).
  • Die folgenden Tabellen listen verbindende Mittel und Mittel für die Proteinmodifikation auf, die beim Herstellen von zielbaren Mitteln gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sein können.
  • Heterobifunktionelle verbindende Mittel
    Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Homobifunktionelle verbindende Mittel
    Figure 00300002
  • Figure 00310001
  • Biotinylierungs-Mittel
    Figure 00310002
  • Mittel für die Proteinmodifikation
    Figure 00310003
  • Figure 00320001
  • Verbindende Mittel, die gemäß der Erfindung verwendet werden, werden im allgemeinen das Binden des Vektors an den Reporter oder des Reporters an den Reporter mit einigem Grad an Spezifität herbeiführen, und können auch zum Binden eines oder mehrerer therapeutisch wirksamer Mittel verwendet werden.
  • Ultraschallbildgebungsmodalitäten, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen zwei- und drei-dimensionale Bildgebungstechniken, wie B-Modus-Bildgebung (z.B. unter Verwenden der zeitvariierenden Amplitude der Signal-Hüllkurve, die aus der Grundfrequenz des emittierten Ultraschallpulses erzeugt wird, aus Unterschwingungen oder Oberschwingungen davon oder aus der Summen- oder Differenzfrequenz, die vom emittierten Puls und derartigen Schwingungen abgeleitet werden, wobei die aus der Grundfrequenz oder der zweiten harmonischen Schwingung davon erzeugten Bilder bevorzugt sind), Farb-Doppler-Bildgebung und Doppler-Amplituden-Bildgebung und Kombinationen der zwei letzteren mit einer beliebigen der oben genannten Modalitäten (Techniken). Überraschenderweise wurden die Signale der zweiten harmonischen Schwingung aus zielausgerichteten Monolagen-stabilisierten Mikrokügelchen als ausgezeichnet befunden, wenn sie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Um die Effekte der Bewegung zu reduzieren, können aufeinanderfolgende Bilder von Geweben, wie das Herz oder die Niere, mit Hilfe geeigneter Synchronisationstechniken gesammelt werden (z.B. EKG-Gating oder die Atmungsbewegung des Subjekts). Die Messung von Änderungen in der Resonanzfrequenz oder Frequenzabsorption, die eingefangene oder verzögerte Mikrobläschen begleiten, können auch nützlicherweise durchgeführt werden, um das Kontrastmittel zu detektieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Werkzeug für die therapeutische Arzneimittelverabreichung in Kombination mit Vektor-vermittelter Ausrichtung des Produktes auf die erwünschte Stelle bereit. Mit „therapeutisch" oder „Arzneimittel" ist ein Mittel mit einem günstigen Effekt auf eine spezifische Krankheit in einem lebenden Menschen oder nicht-menschlichen Tier gemeint. Während Kombinationen von Arzneimitteln und Ultraschallkontrastmitteln in z.B. WO-A-9428873 und WO-A-9507072 vorgeschlagen wurden, fehlen diesen Produkten Vektoren mit einer Affinität für bestimmte Stellen und zeigen dadurch eine vergleichsweise geringe spezifische Retention an erwünschten Stellen vor oder während der Arzneimittelfreisetzung.
  • Therapeutische Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können im Inneren der Mikrobläschen eingekapselt oder gebunden an oder eingebaut werden in den stabilisierenden Membranen. So kann die therapeutische Verbindung an einen Teil der Membran gebunden werden, z.B. durch kovalente oder ionische Bindungen, oder kann physikalisch in das einkapselnde Material gemischt werden, insbesondere, falls das Arzneimittel eine dem Membranmaterial ähnliche Polarität oder Löslichkeit hat, um es so davon abzuhalten, aus dem Produkt auszulaufen, bevor beabsichtigt ist, dass es im Körper wirkt. Die Freisetzung des Arzneimittels kann lediglich durch benässenden Kontakt mit Blut nach der Verabreichung oder als eine Konsequenz anderer innerer oder äußerer Einflüsse initiiert werden, z.B. Auflösungsprozesse, die durch Enzyme oder die Verwendung von Ultraschall katalysiert werden. Die Zerstörung von Gas enthaltenden Mikroteilchen unter Verwenden von äußerem Ultraschall ist ein gut bekanntes Phänomen in bezug auf Ultraschallkontrastmittel, z.B. wie beschrieben in WO-A-9325241; die Geschwindigkeit der Freisetzung kann abhängig vom Typ der therapeutischen Anwendung variiert werden unter Verwenden einer spezifischen Menge Ultraschallenergie vom Transducer.
  • Das Therapeutikum kann kovalent an die einkapselnde Membranoberfläche unter Verwenden eines geeigneten verbindenden Mittels gebunden werden, z.B. wie hier beschrieben. So kann man z.B. anfänglich ein Phospholipid- oder Lipopeptidderivat herstellen, an das das Arzneimittel durch einen bioabbaubaren oder selektiv spaltbaren Linker gebunden wird, gefolgt durch Einbau des Materials in das Mikrobläschen. Alternativ werden zum Lipid gemachte Arzneimittel-Moleküle, die keine Verarbeitung erfordern, um ein wirksames Arzneimittel freizusetzen, direkt in die Membran eingebau. Das wirksame zum Lipid gemachte Arzneimittel kann durch Vergrößern der Stärke des Ultraschallstrahles freigesetzt werden.
  • Beispielhafte Arzneimittelverabreichungssysteme, die zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen geeignet sind, umfassen beliebige bekannte therapeutische Arzneitmittel oder wirksame Analoga davon, die Thiolgruppen enthalten, die an Thiol enthaltende Mikrobläschen unter oxidativen Bedingungen gekoppelt werden, was Disulfidbrücken ergibt. In Kombination mit einem Vektor oder Vektoren wird den Arzneimittel/Vektor-modifizierten Mikrobläschen ermöglicht, im Zielgewebe zu akkumulieren. Die Verabreichung eines Reduktionsmittels, wie reduziertes Glutathion setzt dann das Arzneimittelmolekül von dem zielausgerichteten Mikrobläschen in der Nachbarschaft der Zielzelle frei, was die lokale Konzentration des Arzneimittels vergrößert und den therapeutischen Effekt verstärkt. Das Produkt kann auch hergestellt werden ohne das Therapeutikum, falls erwünscht. Das Arzneimittel kann dann gekoppelt oder geschichtet werden, auf den Mikrobläschen vor der Verwendung. So könnte zum Beispiel ein Therapeutikum zu einer Suspension von Mikrobläschen in wässrigen Medien zugegeben und geschüttelt werden, um das Therapeutikum an die Mikrobläschen zu binden oder anhaften zu lassen.
  • Andere Arzneimittelverabreichungssysteme umfassen Vektor-modifizierte Phospholipidmembranen, die mit Lipopeptidstrukturen dotiert sind, die eine Poly-L-Lysin- oder Poly-D-Lysin-Kette in Kombination mit einem Zielausrichtungsvektor umfassen. Angewandt auf Gentherapie/Gegensinn-Technologien mit besonderer Betonung auf Rezeptor-vermittelter Arzneimittelverabreichung wird der Mikrobläschen-Träger mit DNA oder RNA über elektrostatische Wechselwirkung mit dem Polykation kondensiert. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, dass der Vektor, oder die Vektoren, die für die zielausgerichtete Verabreichung verwendet werden, nicht direkt an die Polylysin-Trägereinheit gebunden sind. Die Polylysinkette wird auch fester in die Mikrobläschen-Membran aufgrund des Vorhandenseins der Lipidketten verankert. Die Verwendung von Ultraschall, um die Effektivität der Verabreichung zu vergrößern, wird auch als nützlich betrachtet.
  • Alternativ werden freie Polylysin-Ketten zuerst mit Arzneimittel- oder Vektormolekülen modifiziert, und dann auf die negative Oberfläche zielausgerichteter Mikrobläschen kondensiert.
  • Repräsentative und nicht-beschränkende Beispiele von Arzneimitteln, die gemäß der Erfindung nützlich sind, umfassen antineoplastische Mittel, wie Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Busulfan, Chlorambucil, Spiroplatin, Cisplatin, Carboplatin, Methotrexat, Adriamycin, Mitomycin, Bleomycin, Cytosinarabinosid, Arabinosyladenin, Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazin, Dactinomycin (Antinomycin D), Daunorubicin, Doxorubicinhydrochlorid, Taxol, Plicamycin, Aminoglutethimid, Estramustin, Flutamid, Leuprolid, Megestrolacetat, Tamoxifen, Testolacton, Trilostan, Amsacrin (m-AMSA), Asparaginase (L-Asparaginase), Etoposid, Interferon a-2a und -2b, Blutprodukte, wie Hematoporphyrine oder Derivate der vorstehenden; Modifizierer der biologischen Antwort, wie Muramylpeptide; Antipilzmittel, wie Ketoconazol, Nystatin, Griseofulvin, Flucytosin, Miconazol oder Amphotericin B; Hormone oder Hormonanaloga, wie das Wachstumshormon, Melanocyten-stimulierendes Hormon, Estradiol, Beclomethasondipropionat, Betamethason, Kortisonacetat, Dexamethason, Flunisolid, Hydrocortison, Methylprednisolon, Paramethasonacetat, Prednisolon, Prednison, Triamcinolon oder Fludrocortisonacetat; Vitamine, wie Cyanocobalamin oder Retinoide; Enzyme, wie alkalische Phosphatase oder Mangansuperoxid-Dismutase; antiallergische Mittel, wie Amelexanox; Inhibitoren des Gewebefaktors, wie monoklonale Antikörper und Fab-Fragmente davon, synthetische Peptide, Nicht-Peptide und Verbindungen, die die Gewebefaktorexpression herabregulieren; Inhibitoren von Blutplättchen, wie GPIa, GPIb und GPIIb-IIIa, ADP-Rezeptoren, Thrombin-Rezeptoren, von-Willebrand- Faktor, Prostaglandine, Aspirin, Ticlopidin, Clopigogrel und Reopro; Inhibitoren von Koagulationsprotein-Zielen, wie FIIa, FVa, FVIIa, FVIIIa, FIXa, FXa, Gewebefaktor, Heparine, Hirudin, Hirolog, Argatroban, DEGR-rFVIIa und Annexin V: Inhibitoren der Fibrin-Bildung und Promotoren der Fibrinolyse, wie t-PA, Urokinase, Plasmin, Streptokinase, rt-Plasminogen-Aktivator und rStaphylokinase; antiangiogene Faktoren, wie Medroxyprogesteron, Pentosanpolysulfat, Suramin, Taxol, Thalidomid, Angiostatin, Interferon-alpha, Metalloproteinase-Inhibitoren, Plättchenfaktor 4, Somatostatin, Thromobospondin; Kreislauf-Arzneimittel, wie Propranolol; metabolische Potentiatoren, wie Glutathion; Antituberkulosemittel, wie p-Aminosalicylsäure, Isoniazid, Capreomycinsulfat, Cyclosexin, Ethambutol, Ethionamid, Pyrazinamid, Rifampin oder Streptomycinsulfat; antivirale Mittel, wie Acyclovir, Amantadin, Azidothymidin, Ribavirin oder Vidarabin; Blutgefäß erweiternde Mittel, wie Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Erythritoltetranitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglycerin oder Pentaerythritoltetranitrat; Antibiotika, wie Dapson, Chloramphenicol, Neomycin, Cefaclor, Cefadroxil, Cephalexin, Cephradin, Erythromycin, Clindamycin, Lincomycin, Amoxicillin, Ampicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Dicloxacillin, Cyclacillin, Picloxacillin, Hetacillin, Methicillin, Nafcillin, Penicillin, Polymyxin oder Tetracyclin; entzündungshemmende Mittel, wie Diflunisal, Ibuprofen, Indomethacin, Meclefenamate, Mefenamsäure, Naproxen, Phenylbutazon, Piroxicam, Tolmetin, Aspirin oder Salicylate; Protozoen vernichtende Mittel, wie Chlorochin, Metronidazol, Chinin oder Megluminantimonat; Antirheumatika, wie Penicillamin; Narkotika, wie Paregoric; Opiate, wie Kodein, Morphin oder Opium; Herz-Glycoside, wie Deslanesid, Digitoxin, Digoxin, Digitalin oder Digitalis; neuromuskuläre Blocker, wie Atracuriummesylat, Gallamintriethiodid, Hexafluoreniumbromid, Metocuriniodid, Pancuroniumbromid, Succinylcholinchlorid, Tubocurarinchlorid oder Vecuroniumbromid; Sedativa, wie Amobarbital, Amobarbitalnatrium, Aprobarbital, Butabarbitalnatrium, Chloralhydrat, Ethchlorvynol, Ethinamat, Flurazepamhydrochlorid, Glutethimid, Methotrimeprazinhydrochlorid, Methyprylon, Midazolamhydrochlorid, Paraldehyd, Pentobarbital, Secobarbitalnatrium, Talbutal, Temazepam oder Triazolam; Lokalanästhetika, wie Bupivacain, Chloroprocain, Etidocain, Lidocain, Mepivacain, Procain oder Tetracain; allgemeine Anästhetika, wie Droperidol, Etomidat, Fentanylcitrat mit Droperidol, Ketaminhydrochlorid, Methohexital-Natrium oder Thiopental und pharmazeutisch annehmbare Salze (z.B. Säureadditionssalze, wie das Hydrochlorid oder Hydrobromid oder Basensalze, wie Natrium-, Kalzium- oder Magnesium-Salze) oder Derivate (z.B. Acetate) davon. Andere Beispiele von Therapeutika umfassen genetisches Material, wie Nukleinsäuren, RNA und DNA natürlichen oder synthetischen Ursprungs, einschließlich rekombinanter RNA und DNA. Bestimmte DNA-codierende Proteine können bei der Behandlung vieler verschiedener Typen von Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel können Tumornekrosefaktor- oder Interleukin-2-Gene bereitgestellt werden, um fortgeschrittene Krebsarten zu behandeln; Thymidinkinase-Gene können bereitgestellt werden, um Ovarkrebs oder Hirntumoren zu behandeln; Interleukin-2-Gene können bereitgestellt werden, um Neuroblastome, maligne Melanome oder Nierenkrebs zu behandeln; und Interleukin-4-Gene können zum Behandeln von Krebs bereitgestellt werden.
  • Lipophile Derivate von Arzneimitteln, die an die Mikrobläschenmembran durch hydrophobe Wechselwirkungen gebunden sind, können therapeutische Effekte als Teil des Mikrobläschens oder nach der Freisetzung des Mikrobläschens zeigen, z.B. durch Verwendung von Ultraschall. Falls das Arzneimittel nicht die erwünschten physikalischen Eigenschaften besitzt, kann eine lipophile Gruppe eingeführt werden zum Verankern des Arzneimittels an der Membran. Bevorzugt sollte die lipophile Gruppe auf eine Weise eingeführt werden, die nicht die in vivo-Leistungsfähigkeit des Moleküls beeinflusst, oder die lipophile Gruppe kann abgespalten werden unter Freisetzen des aktiven Arzneimittels. Lipophile Gruppen können durch verschiedene chemische Mittel eingeführt werden, abhängig von funktionellen Gruppen, die im Arzneimittelmolekül verfügbar sind. Kovalentes Koppeln kann bewirkt werden unter Verwenden funktioneller Gruppen im Arzneimittelmolekül, das zum Reagieren mit annähernd funktionalisierten lipophilen Verbindungen fähig ist. Beispiele lipophiler Einheiten umfassen verzweigte und unverzweigte Alkylketten, cyclische Verbindungen, aromatische Reste und kondensierte aromatische und nicht-aromatische cyclische Systeme. In einigen Fällen wird die lipophile Einheit aus einem auf geeignete Weise funktionalisierten Steroid bestehen, wie Cholesterin oder eine verwandte Verbindung. Beispiele funktioneller Gruppen, die besonders für die Derivatisierung geeignet sind, umfassen nukleophile Gruppen, wie Amino-, Hydroxy- und Sulfhydryl-Gruppen. Geeignete Prozesse für die lipophile Derivatisierung eines beliebigen Arzneimittels, das eine Sulfhydryl-Gruppe enthält, wie Captopril, können eine direkte Alkylierung umfassen, z.B. die Reaktion mit einem Alkylhalogenid unter basischen Bedingungen und eine Thiolester-Bildung durch Reaktion mit einer aktivierten Carbonsäure. Repräsentative Beispiele der Derivatisierung eines beliebigen Arzneimittels mit Carboxylfunktionen, z.B. Atenolol oder Chlorambucil umfassen Amid- und Esterbildung durch entsprechendes Koppeln mit Aminen bzw. Alkoholen, die geeignete physikalische Eigenschaften besitzen. Ein bevorzugter Aspekt ist, die Bindung von Cholesterin an eine therapeutische Verbindung durch Bilden einer abbaubaren Esterbindung.
  • Eine bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Angiogenese, die die Bildung neuer Blutgefäße durch Verzweigung von vorhandenen Gefäßen ist. Der primäre Stimulus für diesen Prozess kann eine unangemessene Versorgung von Zellen in einem Gewebe mit Nahrungsmitteln und Sauerstoff (Hypoxie) sein. Die Zellen können durch Sekretieren angiogener Faktoren antworten, von denen es viele gibt; ein Beispiel ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor. Diese Faktoren initiieren die Sekretion proteolytischer Enzyme, die die Proteine der Basalmembran abbauen, wie auch Inhibitoren, die die Wirkung dieser möglicherweise schädlichen Enzyme begrenzen. Der kombinierte Effekt des Verlusts der Bindung und der Signale von den Rezeptoren für angiogene Faktoren ist es, die endothelialen Zellen zu veranlassen, sich zu bewegen, zu vervielfachen und sich selbst umzuordnen, und schließlich eine Basalmembran um die neuen Gefäße zu synthetisieren.
  • Tumore müssen Angiogenese initiieren, wenn sie eine Millimeter-Größe erreichen, um ihre Wachstumsgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten. Da die Angiogenese von charakteristischen Änderungen in den endothelialen Zellen und ihrer Umgebung begleitet ist, ist dieser Prozess ein aussichtsreiches Ziel für eine therapeutische Intervention. Die Transformationen, die die Angiogenese begleiten, sind auch für eine Diagnose sehr vielversprechend, wobei ein bevorzugtes Beispiel die maligne Erkrankung ist, aber das Konzept ist auch vielversprechend bei der Entzündung und einer Vielfalt von Entzündungs-bezogenen Erkrankungen. Diese Faktoren sind auch in die Re-Vaskularisierung von von einem Infarkt betroffenen Teilen des Myokards involviert, die auftritt, wenn eine Stenose innerhalb einer kurzen Zeit aufgelöst wird.
  • Eine Anzahl bekannter Rezeptoren/Ziele, die mit Angiogenese in Verbindung stehen, sind in den nachfolgenden Tabellen angegeben. Unter Verwenden der Zielausrichtungs-Prinzipien, die in der vorliegenden Offenbarung beschrieben sind, kann Angiogenese durch die Mehrzahl der in der Medizin in Gebrauch stehenden Bildgebungsmodalitäten detektiert werden.
  • Kontrast-verstärkter Ultraschall kann zusätzliche Vorteile besitzen, wobei das Kontrastmedium Mikrokügelchen sind, die auf das Innere der Blutgefäße beschränkt sind. Sogar falls die Zielantigene auf vielen Zelltypen gefunden werden, werden die Mikrokügelchen exklusiv an endotheliale Zellen binden.
  • Sogenannte Pro-Drugs können auch in Mitteln gemäß der Erfindung verwendet werden. Derartige Arzneimittel können derivatisiert werden, um ihre physiko-chemischen Eigenschaften zu ändern und sie für das Einschließen in den Reporter anzupassen; derartige derivatisierte Arzneimittel können als Pro-Drugs betrachtet werden, und sind üblicherweise inaktiv, bis die Spaltung der derivatisierenden Gruppe die aktive Form des Arzneimittels regeneriert.
  • Durch Zielausrichten Gas-gefüllter Mikrobläschen, die ein Pro-Drug-aktivierendes Enzym enthalten, auf pathologische Gebiete, kann man die Zielausrichtung des Enzyms abbilden, wodurch es möglich gemacht wird, sich ein Bild zu machen, wenn die Mikrobläschen genau auf das pathologische Gebiet zielausgerichtet werden und zur selben Zeit von Nicht-Zielgebieten verschwunden sind. Auf diese Weise kann man die optimale Zeit für die Injektion eines Pro-Drugs in individuelle Patienten bestimmen.
  • Eine andere Alternative ist es, das Pro-Drug, ein das Pro-Drug aktivierendes Enzym und einen Vektor in demselben Mikrobläschen in einem System einzubauen, in dem das Pro-Drug nur nach einigem externem Stimulus aktiviert werden wird. Ein derartiger Stimulus kann z.B. sein eine Tumor-spezifische Protease, wie oben beschrieben, oder Platzenlassen der Mikrobläschen durch äußeren Ultraschall, nachdem die erwünschte Zielausrichtung erreicht worden ist.
  • Therapeutika können auf einfache Weise gemäß der Erfindung an erkrankte oder nekrotische Gebiete verabreicht werden, einschließlich dem Herz und der allgemeinen Vaskulatur oder an die Leber, Milz, Nieren und andere Bereiche, wie das lymphatische System, Körperhöhlen oder das gastrointestinale System.
  • Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung können zur zielausgerichteten therapeutischen Verabreichung entweder in vivo oder in vitro verwendet werden. Im letzteren Kontext können die Produkte in in vitro-Systemen, wie Kits für eine Diagnose verschiedener Krankheiten oder eine Charakterisierung verschiedener Komponenten im Blut oder in Gewebeproben nützlich sein. Techniken, die jenen ähnlich sind, die zum Binden bestimmter Blutkomponenten oder Zellen an Polymerteilchen (z.B. monodisperse magnetische Teilchen) in vitro verwendet werden, um sie von einer Probe zu trennen, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, unter Verwenden der niedrigen Dichte der Reportereinheiten in Mitteln der vorliegenden Erfindung, um die Trennung des Gas enthaltenden Materials durch Flotation und wiederholtes Waschen zu bewirken.
  • Vektoren, die nützlich beim Erzeugen von mehrfach-spezifischen, zielbaren Kontrastmitteln gemäß der Erfindung eingesetzt werden können, umfassen die folgenden:
    • i) Antikörper, die als Vektoren für einen weiten Bereich von Zielen verwendet werden können, und die vorteilhafte Eigenschaften besitzen, wie eine sehr hohe Spezifität, hohe Affinität (falls erwünscht), die Möglichkeit des Modifizierens der Affinität wie notwendig etc. Ob Antikörper bioaktiv sein werden oder nicht, wird von der spezifischen Vektor/Ziel-Kombination abhängen. Sowohl konventionelle als auch genetisch konstruierte Antikörper können eingesetzt werden, wobei die Letzteren das Konstruieren von Antikörpern für besondere Notwendigkeiten erlaubt, z.B. im Hinblick auf die Affinität und Spezifität. Die Verwendung von menschlichen Antikörpern kann bevorzugt sein, um mögliche Immunreaktionen gegen das Vektormolekül zu vermeiden. Eine weitere nützliche Klasse von Antikörpern umfasst sogenannte bi- und multi-spezifische Antikörper, d.h. Antikörper mit einer Spezifität für zwei verschiedene Zielmoleküle in einem Antikörpermolekül. Derartige Antikörper können z.B. beim Fördern der Bildung von Bläschenclustern nützlich sein, und können auch für verschiedene therapeutische Zwecke verwendet werden, z.B. zum Tragen toxischer Einheiten zum Ziel. Verschiedene Aspekte von bispezifischen Antikörpern werden beschrieben von McGuiness, B. T. et al. in Nat. Biotechnol. (1996) 14, 1149–1154; von George, A. J. et al. in J. Immunol. (1994) 152, 1802–1811; von Bonardi et al. in Cancer Res. (1993) 53, 3015–3021; und von French R. R. et al. in Cancer Res. (1991) 51, 2353–2361.
    • ii) Zelladhäsionsmoleküle, ihre Rezeptoren, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Peptidhormone und Stücke davon. Derartige Vektoren beruhen auf normalen biologischen Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Zielmolekül-Rezeptoren und werden so in vielen Fällen eine biologische Antwort beim Binden mit den Zielen erzeugen und so bioaktiv sein; dies kann eine relativ unsignifikante Angelegenheit mit Vektoren sein, die auf Proteoglykane zielausgerichtet sind.
    • iii) Nicht-Peptid-Agonisten/Antagonisten oder nicht-bioaktive Binder von Rezeptoren für Zelladhäsionsmoleküle, Cytokine, Wachstumsfaktoren und Peptidhormone. Diese Kategorie kann nicht-bioaktive Vektoren umfassen, die weder Agonisten noch Antagonisten sein werden, die aber nichtsdestotrotz eine wertvolle Zielausrichtungs-Fähigkeit zeigen.
    • iv) Oligonukleotide und modifizierte Oligonukleotide, die DNA oder RNA durch Watson-Crick oder andere Typen der Basenpaarung binden. DNA ist üblicherweise nur im extrazellulären Raum als eine Konsequenz der Zellzerstörung vorhanden, so dass derartige Oligonukleotide, die üblicherweise nicht bioaktiv sein werden, beim z.B. Zielausrichten auf nekrotische Regionen nützlich sein können, die mit vielen verschiedenen pathologischen Zuständen assoziiert sind. Oligonukleotide können auch gestaltet sein, um an spezifische DNA- oder RNA-bindende Proteine zu binden, z.B. Transkriptionsfaktoren, die sehr oft stark überexprimiert sind oder in Tumorzellen oder in aktiven Immun- oder endothelialen Zellen aktiviert sind. Kombinatorische Bibliotheken können verwendet werden, um Olikonukleotide zu selektieren, die spezifisch an beliebige mögliche Zielmoleküle (von Proteinen bis Koffein) binden, und die deshalb als Vektoren zum Zielausrichten eingesetzt werden können.
    • v) DNA-bindende Arzneimittel können sich den Oligonukleotiden ähnlich verhalten, können aber eine biologische Aktivität und/oder toxische Effekte zeigen, falls sie von Zellen aufgenommen werden.
    • vi) Verschiedene kleine Moleküle, einschließlich bioaktive Verbindungen, die dafür bekannt sind, dass sie an biologische Rezeptoren verschiedener Arten binden. Derartige Vektoren oder ihre Ziele können verwendet werden, um nicht-bioaktive Verbindungen zu erzeugen, die an dieselben Ziele binden.
    • vii) Vektormoleküle können ausgewählt werden aus kombinatorischen Bibliotheken, ohne notwendigerweise das genaue molekulare Ziel zu kennen, durch funktionelles Selektieren (in vitro, ex vivo oder in vivo) nach Molekülen, die an den/die abzubildende Region/Struktur binden.
    • viii) Verschiedene kleine Moleküle, einschließlich bioaktive Verbindungen, die dafür bekannt sind, dass sie biologische Rezeptoren verschiedener Arten binden. Derartige Vektoren oder ihre Ziele können zum Erzeugen nicht-bioaktiver Verbindungen, die an dieselben Ziele binden, verwendet werden.
    • ix) Proteine oder Peptide, die an Glucosaminoglykan-Seitenketten binden, z.B. Heparansulfat, einschließlich Glucosaminoglykan-bindende Teile größerer Moleküle, da das Binden an solche Glucosaminoglykan-Seitenketten nicht zu einer biologischen Antwort führt. Proteoglykane werden nicht auf roten Blutzellen gefunden, was so eine unerwünschte Adsorption an diese Zellen eliminiert.
  • Andere Peptidvektoren und Lipopeptide davon von besonderem Interesse für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung werden unten aufgelistet: Peptide, die atherosklerotische Plaques binden, wie YRALVDTLK, YAKFRETLEDTRDRMY und RALVDTEFKVKQEAGAK; einen Thrombus bindende Peptide, wie NDGDFEEIPEEYLQ und GPRG, Plättchen bindende Peptide, wie PLYKKIIKKLLES; und Cholecystokinin, α-Melanocyt-stimulierendes Hormon, wärmestabiles Enterotoxin 1, vasoaktives intestinales Peptid, synthetisches alpha-M2-Peptid vom dritten Schwerketten-Komplementäts-bestimmenden Bereich und Analoga davon für Tumor-Zielausrichtung.
  • Die folgenden Tabellen identifizieren verschiedene Vektoren, die auf besondere Typen von Zielen zielausgerichtet werden können, und angezeigte Gebiete der Verwendung für die zielbaren Ultraschallkontrastmittel gemäß der Erfindung, die derartige Vektoren enthalten.
  • Protein- und Peptidvektoren – Antikörper
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Protein- und Peptidvektoren – Zelladhäsionsmoleküle etc.
    Figure 00460001
  • Vektoren, umfassend Cytokine/Wachstumsfaktoren/Peptidhormone und Fragmente davon
    Figure 00470001
  • Verschiedene Protein- und Peptidvektoren
    Figure 00480001
  • Vektoren, umfassend Nicht-Peptid-Agonisten/Antagonisten von Cytokine/Wachstumsfaktoren/Peptidhormonen/Zelladhäsionsmolekülen
    Figure 00490001
  • Vektoren, umfassend anti-angiogene Faktoren
    Figure 00500001
  • Vektoren, umfassend angiogene Faktoren
    Figure 00510001
  • Vektormoleküle mit Ausnahme von erkannten angiogenen Faktoren mit bekannter Affinität für Rezeptoren, die mit Angiogenese assoziiert sind
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Rezeptoren/Ziele, die mit Angiogenese in Zusammenhang stehen
    Figure 00530002
  • Figure 00540001
  • Oligonukleotid-Vektoren
    Figure 00550001
  • Modifizierte Oligonukleotid-Vektoren
    Figure 00560001
  • Nucleosid- und Nucleotid-Vektoren
    Figure 00560002
  • Rezeptoren, die DNA-bindende Arzneimittel umfassen
    Figure 00560003
  • Rezeptoren, umfassend Protease-Substrate
    Figure 00570001
  • Rezeptoren, umfassend Protease-Inhibitoren
    Figure 00570002
  • Vektoren von kombinatorischen Bibliotheken
    Figure 00570003
  • Figure 00580001
  • Kohlenhydrat-Vektoren
    Figure 00580002
  • Lipid-Vektoren
    Figure 00580003
  • Kleine Molekülvektoren
    Figure 00590001
  • Bezugnahmen auf die vorstehenden Tabellen
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  • Die folgendenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen des Konzepts mehrfacher Rezeptor-Spezifität. Andere Kombinationen von Vektoren, Spacern und Reportern und Konjugations-Technologien, die zu Mehrfach-Vektor-Einbau führen, werden auch als für diese Erfindung relevant betrachtet. Eine Bestätigung der mikroteilchenförmigen Natur der Produkts wird unter Verwenden einer Mikroskopie ausgeführt, wie beschrieben in WO-A-9607434. Ultraschallübertragungs-Messungen können ausgeführt werden unter Verwenden eines Breitband-Transducers, um Mikrobläschen-Suspensionen von Produkten anzuzeigen, was verglichen mit einem Standard eine vergrößerte Schallstrahl-Abschwächung ergibt. Durchflusszytometrie-Analyse von Produkten kann verwendet werden, um das Binden von Antikörpern daran zu bestätigen. Die Fähigkeit von zielausgerichteten Mitteln, um spezifisch an Zellen zu binden, die ein Ziel exprimieren, kann studiert werden durch Mikroskopie und/oder unter Verwenden einer Flusskammer, die immobilisierte Zellen enthält, zum Beispiel unter Einsetzen einer Population von Zellen, die die Zielstruktur exprimieren und einer weiteren Population von Zellen, die nicht das Ziel exprimieren. Radioaktives, fluoreszierendes oder enzym-markiertes Streptavidin/Avidin kann verwendet werden, um eine Biotin-Bindung zu analysieren.
  • Beispiel 1 – Herstellung und biologische Bewertung von mehrfach-spezifschen Gas enthaltenden Mikrobläschen von DSPS ,dotiert' mit einem Lipopeptid, das aus einem Heparin-Sulfat-Bindungspeptid auf (KRKR) und einem Fibronectinpeptid (WOPPRARI) besteht.
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen gerichtet, die mehrfache peptidische Vektoren umfassen, die in einer linearen Sequenz angeordnet sind.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronectinpeptid (WOPPRARI) besteht
    Figure 00640001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ile-Wang-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und die Palmitinsäure wurden voraktiviert unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials durch präparative HPLC (VYDAC 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 16 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01%, TFA/Wasser: Säule – VYDAC 218TP54: Detektion – UV 260 und Fluoreszenz, Ex280, Em350 – Produktretentionszeit = 19,44 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwendung von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2198, gefunden bei 2199.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit einem mehrfach-spezifischen Lipopeptid, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und Fibronectinpeptid (WOPPRARI) besteht
  • DSPS (Avanti 4,5 mg) und Lipopeptid von (a) (0,5 mg) wurden in jedes von zwei Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurden zu jedem Fläschchen gegeben. Die Mischungen wurden auf 80°C fünf Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und die Kopfräume mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden geschüttelt und die Mikrobläschen über Nacht gerollt. Die Bläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler (Größe: 1–3 Mikron (87%), 3–5 Mikron (11,5%)) und akustische Dämpfung (Frequenz bei maximaler Dämpfung: 3,5 MHz) analysiert. Die Mikrobläschen waren bei 120 mm Hg stabil.
  • MALDI-Massenspektralanalyse wurde verwendet, um den Einbau in DSPS-Mikrobläschen zu bestätigen, wie folgt: ca. 0,05–0,1 ml der Mikrobläschen-Suspension wurde in ein sauberes Fläschchen übertragen und 0,05–0,1 ml Methanol wurde zugegeben. Die Suspension wurde für 30 Sekunden beschallt und die Lösung wurde durch MALDI-MS analysiert. Positiver Modus ergab M + H bei 2200, erwartet für Lipopeptid, 2198.
  • c) In-vitro-Studie von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit einem mehrfach-spezifischen Lipopeptid, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronectin-Peptid (WOPPRARI) besteht: Binden an endotheliale Zellen unter Fließ-Bedingungen
  • Die menschliche endotheliale Zelllinie ECV 304, erhalten aus einer normalen Nabelschnur (ATCC CRL-1998), wurde in 260 ml Nunc-Kultur-Kolben (Chutney 153732) in RPMI 1640-Medium (Bio Whittaker) kultiviert, zu dem L-Glutamin 200 mM, Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml und 10.000 μg/ml) und 10% fötales Rinderserum zugegeben wurden.
  • Die Zellen wurden mit einem Split-Verhältnis von 1:5 bis 1:7 subkultiviert, wenn sie eine Konfluenz erreicht hatten.
  • Deckgläser, 22 mm im Durchmesser (BDH, Kat. Nr. 406/0189/40), wurden sterilisiert und auf dem Boden von 12 Well-Kulturplatten (Costar) angeordnet, bevor Zellen in 0,5 ml Complete-Medium mit Serum oberhalb der Platten zugegeben wurden.
  • Wenn die Zellen eine Konfluenz erreichten, wurden die Deckgläser in einer zugeschnittenen Fließ-Kammer angeordnet. Die Kammer besteht aus einem Graben, der in eine Glasplatte eingeschnitten worden war, auf der das Deckglas mit den Zellen angeordnet wurde, wobei die Zellen dem Graben gegenüber lagen, um so einen Fließkanal zu bilden. Ultraschall-Mikrobläschen aus Abschnitt (b) wurden aus einem Reservoir, das bei 37°C gehalten wurde, durch die Fließ-Kammer durchgeleitet und zum Reservoir zurückgeleitet, unter Verwenden einer peristaltischen Pumpe. Die Fließgeschwindigkeit wurde eingestellt, um physiologisch relevante Scher-Raten zu simulieren. Die Fließ-Kammer wurde unter einem Mikroskop angeordnet und die Wechselwirkung zwischen den Mikrobläschen und den Zellen wurde direkt angesehen. Eine Kamera, die auf dem Mikroskop befestigt war, war mit einem Farbvideodrucker und einem Monitor verbunden.
  • Eine allmähliche Akkumulierung der Mikrobläschen auf den Zellen fand statt, was von der Fließgeschwindigkeit abhängig war. Bei weiterer Erhöhung der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen vom Deckglas abgelöst zu werden, aber die Mikrobläschen blieben noch an die Zellen gebunden. Kontrollbläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen und verschwanden von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • d) In-vivo-Experiment in einem Hund
  • Fall 1)
  • Ein Mischlingshund von 22 kg wurde anästhesiert mit Pentobarbital und mechanisch beatmet. Die Brust wurde durch eine Mittellinien-Sternotomie geöffnet, der vordere Herzbeutel wurde entfernt und ein 30 mm-Gel-Silikon-Kautschuk-Spacer wurde zwischen dem Herz und einem P5-3-Transducer eines ATL HDI-3000 Ultraschallscanners eingesetzt. Der Scanner wurde eingesetzt zur diskontinuierlichen Kurzachsen-Bildgebung einmal in jeder End-Systole durch verzögertes EGC-Triggern.
  • Ein Nettovolumen von 2 ml Mikrobläschen von (b) wurde als ein schneller intravenöser Bolus injiziert. 3 Sekunden später wurde gesehen, dass das abgebildete rechte Ventrikel Kontrastmaterial enthielt, und weitere 3 Sekunden später wurde das linke Ventrikel auch gefüllt und ein transienter Dämpfungsschatten, der die Sicht der hinteren Teile des linken Ventrikels verschleierte, wurde beobachtet. Ein wesentlicher Anstieg in der Helligkeit des Myocard wurde auch in den Teilen des Herzens, die distal zum linken Ventrikel waren, gesehen, wenn der Dämpfungsschatten abklang.
  • Nach dem Durchlaufen des anfänglichen Bolus wurde der Ultraschall-Scanner auf kontinuierliche Hochbildfrequenz-Hochleistungs-Power-Bildgebung gesetzt, eine Prozedur, die dafür bekannt ist, dass sie die Zerstörung von Ultraschallkontrastmittel-Mikrobläschen in den abgebildeten Geweberegionen verursacht. Nach ein paar Sekunden wurde der Scanner auf seine anfängliche Einstellung zurückgestellt. Das Myocard war dann dunkler und näher am Untergrundswert. Das Bewegen des abgebildeten Stückes zu einer neuen Position führte zu einem Wiederauftauchen von Kontrasteffekten; Bewegen des Stückes zurück zur anfänglichen Position resultierte wieder in einer Gewebehelligkeit wieder nahe der Untergrundslinie.
  • Fall 2) [vergleichend]
  • Ein Nettovolumen von 2 ml Mikrobläschen, hergestellt auf eine Weise identisch zu (b) oben, mit der Ausnahme, dass kein Lipopeptid in dem Präparat enthalten war, wurde injiziert, unter Verwenden derselben Bildgebungsprozedur wie oben. Die Myocard-Echoverstärkung war viel weniger intensiv und von kürzerer Dauer als jene, die im Fall 1 beobachtet wurde. Bei Abschluss der linksventrikulären Dämpfungsphase gab es auch einen fast vollständigen Verlust der Myocard-Kontrasteffekte, und ein Myocard-Echo-Anstieg im hinteren Teil des linken Ventrikels, die im Fall 1 bemerkt wurden, wurden nicht beobachtet.
  • Beispiel 2 – Mehrfachspezifische Gas enthaltende Mikrobläschen aus DSPS ,dotiert' mir RGDC-Mal-PEG2000-DSPE und einem Lipopeptid, bestehend aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronectinpeptid (WOPPRARI)
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen, die mehrfache peptidische Vektoren umfassen.
  • a) Synthese von 3-Maleimidopropionylamido-PEG2000-Acyldistearoylphosphatidylethanolamin (PE-PEG-MAL).
  • Eine Mischung von Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), (37,40 mg, 0,005 mmol), N-Hydroxysuccinimido-PEG2000-Maleimid, NHS-PEG-MAL, (100 mg, 0,25 mmol) und Triethylamin (35 μl, 0,25 mmol) in einer Lösung von Chloroform/Methanol (3:1) wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel unter verringerten Druck wurde der Rückstand durch Flash-Chromatographie (Chloroform/Methanol, 8:2) gereinigt. Das Produkt wurde als ein weisses Wachs erhalten, 92 mg (66%) und die Struktur wurde verifiziert durch NMR und Maldi-MS.
  • b) Synthese von RGDC
  • Das RGDC-Peptid wurde auf einem automatisierten ABI 433A-Peptidsynthetisierer (0,25 mmol Maßstab, Fmoc-Cys(Trt)-Wang-Harz (Novabiochem)) synthetisiert. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU aktiviert. Das rohe Peptid wurde aus dem Harz entfernt und gleichzeitig in TFA entschützt, das 5% EDT, 5% Phenol und 5% Wasser enthielt. Nach dem Verdampfen der überschüssigen Spaltungslösung wurde das Peptid ausgefällt und mehrere Male mit Diethylether verrieben vor dem Trocknen an Luft. Das rohe Peptid wurde durch präparative hplc gereinigt und Fraktionen, die reines Produkt enthielten, wurden kombiniert und gefriergetrocknet. Die Endcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von analytischer hplc und MALDI-MS.
  • c) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt von Phosphatidylserin und „dotiert" mit RGDC-Mal-PEG3400-DSPE und einem Lipopeptid, umfassend ein Heparinsulfat-bindendes Peptid (KRKR) und Fibronectinpeptid (WOPPRARI).
  • DSPS (Avanti, 5.0 mg), Lipopeptid (0,5 mg) aus Beispiel 1a) und PE-PEG-MAL (0,5 mg) aus dem Abschnitt a) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglycol/2,4% Glycerol wurde zugegeben. Die Mischung wurde beschallt für 3–5 Minuten, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt, dann durch ein 4,5-Mikron-Filter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Mikrobläschen bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Das unten Schwimmende wurde mit 1 ml PBS, das 1 mg des Peptids RGDC enthielt, ausgetauscht und der pH auf 8 eingestellt. Die Konjugationsreaktion lies man 2 Stunden lang fortschreiten. Die Bläschen wurden in PBS, dann mit Wasser gewaschen, bis das gesamte nicht umgesetzte RGDC aus dem unten Schwimmenden entfernt worden war, wie beobachtet durch MALDI-MS. Die Mikrobläschen wurden weiter analysiert durch einen Coulter-Zähler (98% zwischen 1 und 7 Mikron).
  • d) In-Vitro-Bindungsassay
  • Das Binden der Mikrobläschen an endotheliale Zellen wurde ausgeführt unter Fließbedingungen unter Verwenden des In-Vitro-Assays, der in Beispiel 1c) beschrieben ist. Eine allmähliche Akkumulierung der Mikrobläschen an die Zellen fand statt, was von der Fließgeschwindigkeit abhängig war. Kontroll-Bläschen, die die Vektoren nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen an und lösten sich von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 3 – Herstellung von Mehrfach-spezifischen Gas gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und thioliertem Anti-CD62-Mal-PEG2000-PE und thioliertem Anti-ICAM-1-Mal-PEG2000-PE
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen, die mehrfache Antikörper-Vektoren für zielgerichtete Ultraschallbildgebung umfassen.
  • a) Herstellung von Gas enthaltenden Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und PE-PEG2000-Mal
  • DSPS (Avanti, 4,5 mg) und PE-PEG2000-Maleimid aus Beispiel 2(a) (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch ein 4,5-Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Mikrobläschen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
  • b) Thiolierung von Anti-CD62- und Anti-ICAM-1-Antikörpern
  • Zu 0,3 mg von jeweils Anti-CD62- und Anti-ICAM-1-Antikörpern, aufgelöst in PBS-Puffer (pH 7, 0,5 ml) wurde Trauts Reagenz gegeben und die Lösungen wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Überschüssiges Reagenz wurde von dem modifizierten Protein auf einer NAP-5-Säule (Pharmacia) getrennt.
  • c) Konjugation thiolierter Anti-CD62- und Anti-ICAM-1-Antikörper an Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und DSPE-PEG2000-Mal
  • 0,5 ml des gemischten thiolierten Antikörper-Präparats von (b) wurde zu einer aliquoten Menge Mikrobläschen von (a) gegeben und man ließ die Konjugationsreaktion 30 Minuten lang auf einem Rollentisch fortschreiten. Nach der Zentrifugation bei 2000 Upm für 5 Minuten wurde das unten Schwimmende entfernt. Die Mikrobläschen wurden weitere 3 Male mit Wasser gewaschen.
  • Die PEG-Spacerlänge kann variiert werden, um längere, z.B. PEG3400- und PEG5000-, kürzere, z.B. PEG600- oder PEG800-, Ketten zu enthalten. Eine Zugabe eines dritten Antikörpers, wie ein thiolierter Anti-CD34, ist auch möglich.
  • Beispiel 4 – Zielausgerichtete mehrfach-spezifische Gas enthaltende Mikrobläschen, umfassend DSPS, nicht kovalent beschichtet mit Polylysin und einem Fusionspeptid, umfassend eine PS-bindende Komponente und eine Fibronektin-Peptid-Sequenz NH2F.N.F.R.L.K.A.G.O.K.I.R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I.OH
  • a) Synthese von PS-bindendem/Fibronektinfragment-Fusions-Peptid NH2F.N.F.R.L.K.A.G.O.K.I.R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I.OH
  • Das Peptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ile-Wang-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und den Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Phenol, 5% EDT und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 302 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 25 mg des rohen Materials durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 20 bis 40% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 10 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 20 bis 50% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 und 260 nm – Produktretentionszeit = 12,4 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie; erwartet M + H bei 2856, gefunden bei 2866.
  • b) Herstellung von Mikrobläschen aus DSPS, die nicht kovalent beschichtet sind mit Polylysin und dem PS-bindenden/Fibronektinfragment-Fusions-Peptid NH2F.N.F.R.L.K.A.G.O.K.I.R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I.OH
  • DSPS (5 mg, Avanti) wurde in ein sauberes Fläschchen zusammen mit Poly-L-Lysin (Sigma 0,2 mg) und dem Peptid von (a) oben (0,2 mg) eingewogen. Zu dem Fläschchen wurden 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt. Die Probe wurde auf Raum temperatur abgekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Nach dem ausführlichen Waschen mit Wasser, PBS und Wasser wurde die schließliche Lösung auf den Polylysin- und Peptidgehalt unter Verwenden von MALDI MS untersucht. Es wurde kein Polypeptidmaterial in der schließlichen Waschlösung beobachtet.
  • Acetonitril (0,5 ml) wurde dann zugegeben und die Mikrobläschen wurden durch Beschallung zerstört. Analyse der resultierenden Lösung auf Polylysin und PS-bindendes/Fibronektin-Fusions-Peptid wurde dann ausgeführt unter Verwenden von MALDI MS. Die Ergebnisse waren wie folgt:
  • Figure 00730001
  • Das Spacer-Element, das innerhalb des PS-bindenden/Fibronektin-Fusions-Peptids (-GGG-) enthalten ist, kann auch durch andere Spacer ersetzt werden, wie PEG2000 oder Polyalanin (-AAA-). Eine Form von Pre-Targeting kann auch eingesetzt werden, wodurch dem DSPS-bindenden/Fibronektin-Fragment-Fusions-Peptid zuerst ermöglicht wird, mit Zellen über Fibronektinpeptid-Bindung zu assoziieren. Diesem folgt eine Verabreichung von PS-Mikrobläschen, die dann an das PS-bindende Peptid binden.
  • Beispiel 5 – Mehrfach-spezifische Gas enthaltende Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-PEG3400-Alanyl-Cholesterin und funktionalisiert mit Streptavidin/Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH) und Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendem Peptid (Biotin-GPRPPERHOS.NH2)
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Ultraschallmikrobläschen, wodurch Streptavidin als ein Linker zwischen biotinylierten Reporter(n) und Vektor(en) verwendet wird.
  • a) Synthese von Biotin-PEG3400-β-Alanin-Cholesterin
  • Zu einer Lösung von Cholesteryl-β-Alaninhydrochlorid (15 mg, 0,03 mmol) in 3 ml Chloroform/nassem Methanol (2,6:1) wurde Triethyl-amin (42 ml, 0,3 mmol) gegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und eine Lösung von Biotin-PEG3400-NHS (100 mg, 0,03 mol) in 1,4-Dioxan (1 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden wurde die Mischung zum Trocknen verdampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie gereinigt, um weiße Kristalle zu ergeben; Ausbeute 102 mg (89%). Die Struktur wurde durch MALDI-MS und NMR verifiziert.
  • b) Synthese von biotinyliertem Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)
  • Das Peptid wurde synthetisiert auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer, ausgehend von Fmoc-Trp(Boc)-Wang-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und den Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 75 mg ergab. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 20 mg des rohen Materials durch präparative HPLC (Vydax 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 30 bis 80% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) und einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung der reinen Fraktionen wurden 2 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 30–80% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54; Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 12,6 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1077, gefunden bei 1077.
  • c) Synthese des Biotinyl-Fibrin-Anti-polymerisierenden Peptids (Biotin-GPRPPERHOS.NH2)
  • Dieses Peptid wurde synthetisiert und gereinigt unter Verwenden von Protokollen, die jenen, die in (b) oben beschrieben sind, ähnlich sind. Das reine Produkt wurde durch HPLC und MALDI MS charakterisiert.
  • d) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-PEG3400-β-Alanin-Cholesterin
  • DSPS (Avanti, 4,5 mg) und Biotin-PEG3400-β-Alanin-Cholesterin von (a) (0,5 mg) wurden in ein Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer für 45 Sekunden geschüttelt und das Fläschchen wurde über Nacht gerollt. Die Mikrobläschen-Suspension wurde mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler und eine akustische Dämpfung analysiert.
  • e) Konjugation mit Fluorescein-markiertem Streptavidin und biotinylierten Peptiden des Abschnitts (b) und (c)
  • Zu dem Mikrobläschen-Präparat von (d) wurde Fluorescein-konjugiertes Streptavidin (0,2 mg), aufgelöst in PBS (1 ml), gegeben. Die Bläschen wurden auf einem Rollentisch 3 Stunden lang bei Raumtemperatur angeordnet. Nach ausführlichem Waschen mit Wasser und Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie wurden die Mikrobläschen in 1 ml PBS, das Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (0,5 mg) und Biotinyl-Fibrin-anti- polymerisierendes Peptid (0,5 mg) von den Abschnitten (b) beziehungsweise (c) enthielt, für zwei Stunden inkubiert. Ausführliches Waschen der Mikrobläschen wurde ausgeführt, um nicht-konjugiertes Peptid zu entfernen.
  • Beispiel 6 – Mehrfach-spezifische Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und einem biotinylierten Lipopeptid, das verwendet wird, um ein Streptavidin-„Sandwich" mit einer Mischung von Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH) und Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierenden Peptid (Biotin-GPRPPERHOS.NH2) herzustellen
  • a) Synthese des Lipopeptids Dipalmitoyl-lysinyl-tryptophanyl-lysinyl-lysinyl-lysinyl(biotinyl)-glycin
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptid Synthetisierer ausgehend von Fmoc-Gly-Wang-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen synthetisieren. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids von dem Harz und der Seitenketten-Schutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Reinigung durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 70–100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyphilisierung 14 mg des rohen Materials (analytische HPLC; Gradient 70–100% B wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser:Säule-Vydac218TP54:Detektion-UV260 und Fluoreszenz, Ex280m, Em350 – Produktretentionszeit = 22 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt, unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie; erwartet M + H bei 1478, gefunden 1471.
  • b) Herstellung von Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit der biontinylierten Lipopeptidsequenz aus Abschnitt a)
  • DSPS (Avanti, 4,5 mg) und das Lipopeptid von a) (0,5 mg) wurden in jeweils 2 Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglycol/2,4% Glycerol wurde in jedes Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die gebildeten Mikrobläschen über Nacht gerollt. Die Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler und akustischer Abschwächung analysiert. MALDI-Massenspektralanalyse wurde verwendet, um den Einbau in DSPS-Mikrobläschen zu bestätigen, wie in Beispiel 1b) beschrieben ist.
  • c) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und einem biotinylierten Lipopeptid und funktionalisiert mit Streptavidin/Biotinyl-Endothelin-1 Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)/Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendem Peptid (Biotin-GPRPPERHOS.NH2)
  • Das Mikrobläschen-Präparat von b) oben wurde auf eine Weise behandelt, die zu jener, die im Beispiel 5, Abschnitt e) beschrieben ist, analog ist.
  • Beispiel 7 – Mehrfach-spezifische Gas-gefüllte Mikrobläschen eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-DPPE, verwendet, um ein Streptavidin-„Sandwich" mit einer Mischung von Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH) und Biotinyl-Fibrin-Anti-polymerisierendem Peptid (Biotin-GPRPERHOS.NH2) herzustellen
  • a) Herstellung von Biotin-enthaltenden Mikrobläschen
  • Zu einer Mischung von Phosphatidylserin (5 mg, Avanti) und Biotin-DPPE (0,6 mg, Pierce) in einem sauberen Fläschchen wurde 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Der Kopfraum wurde dann mit Perfluorbutan gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt. Nach der Zentrifugation wurde das unten Schwimmende entfernt und die Mikrobläschen wurden ausführlich mit Wasser gewaschen.
  • b) Konjugation von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-DPPE, mit Streptavidin und einer Mischung von Biotinyl-Endothelin-1 (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH) und Biotinyl-Fibrin-Anti-polymerisierendem Peptid (Biotin-GPRPPERHOS.NH2)
  • Man folgte der in Beispiel 5), Abschnitt e) im Detail ausgeführten Prozedur.
  • Beispiel 8 – Mehrfach-spezifische Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin, Streptavidin-Succ-PEG-DSPE und einer Mischung von biotinyliertem menschlichen Endothelium-IgG-Antikörper und biotinyliertem Transferrin
  • a) Synthese von Succ-PEG3400-DSPE
  • NH2-PEG3400-DSPE wird carboxyliert unter Verwenden von Bernsteinsäureanhydrid, z.B. durch ein Verfahren, dass jenem ähnlich ist, das von Nayar, R. und Schroit, A. J. in Biochemistry (1984) 24, 5967–71 beschrieben ist.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE
  • Zu einer Mischung (5 mg) Phosphatidylserin (90–99,9 mol%) und Succ-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt.
  • c) Koppeln von Streptavidin an Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE
  • Streptavidin wird kovalent an Succ-PEG3400-DSPE in die Membran durch Standardkopplungsverfahren unter Verwenden eines wasserlöslichen Carbodiimids gebunden. Die Probe wird auf einem Rollentisch während der Reaktion angeordnet. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt. Die Funktionalität des gebundenen Streptavidins wird durch Binden analysiert, z.B. an fluoreszierend markiertes Biotin, biotinylierte Antikörper (detektiert mit einem fluoreszierend markierten Sekundärantikörper) oder biotinylierte und Fluoreszenz- oder radioaktiv markierte Oligonukleotide. Eine Analyse wird durch Fluoreszenzmikroskopie oder Szintillationszählung ausgeführt.
  • d) Herstellung mehrfach-spezifischer Gas-gefüllter Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Streptavidin-Succ-PEG3400-DSPE, das nicht kovalent mit biotinyliertem menschlichen Transferrin und menschlichem Endothelium-IgG-Antikörper funktionalisiert ist
  • Mikrobläschen aus Abschnitt c), werden in einer Lösung inkubiert, die menschliches Transferrin und menschlichen Endothelium-IgG-Antikörper enthielt, die unter Verwenden des von Bayer et al., Meth. Enzymol., 62, 308 beschriebenen Verfahrens biotinyliert sind. Die Vektor-beschichteten Mikrobläschen werden wie oben beschrieben gewaschen.
  • Beispiel 9 – Mehrfach-spezifische Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin/Streptavidin-Succ-PEG-DSPE und den Oligonukleotiden Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und Biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT
  • a) Synthese von Succ-PEG3400-DSPE
  • Beschrieben in Beispiel 8a).
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE
  • Beschrieben in Beispiel 8b).
  • c) Koppeln von Streptavidin an Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE
  • Beschrieben in Beispiel 8c).
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin/Streptavidin-Succ-PEG-DSPE und den Oligonukleotiden Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und Biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT
  • Mikrobläschen des Abschnitts c) werden in einer Lösung inkubiert, die eine Mischung aus Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und Biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT enthielt. Die Oligonukleotid-beschichteten Mikrobläschen werden wie oben beschrieben gewaschen. Binden des Olifonukleotids an die Bläschen wird detektiert z.B. durch Verwenden von fluoreszierend markierten Oligonukleotiden zur Bindung an die Bläschen, oder durch Hybridisieren des gebundenen Oligonukleotids an ein markiertes (Fluoreszenz oder Radioaktivität) komplementäres Oligonukleotid. Die Funktionalität der Oligonukleotid-tragenden Mikrobläschen wird analysiert, z.B. durch Hybridisieren der Bläschen mit immobilisierten DNA-enthaltenden Sequenzen, die dem gebundenen Oligonukleotid komplementär sind.
  • Andere nützliche Beispiele umfassen ein Oligonukleotid, das ribosomaler DNA komplementär ist (von der es viele Kopien pro haploidem Genom gibt) und ein Oligonukleotid, das einem Onkogen komplementär ist (z.B. ras, von dem es eine Kopie pro haploidem Genom gibt), wird verwendet.
  • Beispiel 10 – Mehrfach-spezifische Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin, kovalent funktionalisiert mit den Fibronektin- und Transferrinproteinen
  • a) Mikrobläschen-Herstellung
  • DSPS (Avanti, 4,5 mg) und DSPE (Avanti, 1,0 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 min lang erwärmt, dann durch ein 4,5 Micron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Mikrobläschen zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen, dann in 0,1 M Natriumboratpuffer pH 9 resuspendiert.
  • b) Modifikation von Fibronektin/Transferrin
  • Fibronektin (0,5 mg) und Transferrin (1,3 mg) wurden in PBS gemischt, und eine Lösung, die NHS-Fluorescein in DMSO enthielt, zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt, dann wurde das Protein auf einer Superdex 200-Säule gereinigt. Die Fluoreszein-markierte Proteinmischung in Phosphatpuffer pH 7,5 wurde gefriergetrocknet.
  • c) Mikrobläschenmodifikation
  • Das gefriergetrocknete Produkt von b) wurde in 0,5 ml Wasser wieder aufgelöst und zu der mit Fluorescein markierten Fibronektin/Transferrin-Mischung wurde 0,1 mmol des Vernetzers SDBP (Pierce) gegeben. Die Lösung wurde auf Eis 2 h lang inkubiert, auf eine NAP-5-Säule geladen und mit PBS eluiert. Dazu wurde 1 ml der Mikrobläschensuspension aus a) gegeben und man ließ die Inkubation 2 h lang bei Raumtemperatur auf einem Rollentisch fortschreiten. Nicht umgesetztes Material wurde entfernt durch Ermöglichen der Mikrobläschen, zu flotieren, dann Ersetzen des Puffers mit Wasser, dieser Prozess wurde dreimal wiederholt.
  • Beispiel 11) Herstellung von mehrfach-spezifischen hohlen Polymerteilchen, die Avidin in der Polymerwand konjugiert mit dem Oligonukleotidbiotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT und dem Endothelin-1-Peptid Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH eingebaut haben
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung polymerer Ultraschallkontrastmittel, umfassend mehrfache Vektoren, die an nicht-oberflächenaktive Mittel gebunden sind, für Zielausrichtungs-/therapeutische Anwendungen.
  • a) Herstellung von Polymerteilchen, die Avidin in der Polymerwand eingebaut haben.
  • Hohle Polymerteilchen aus P73 (wie beschrieben in Patent WO 96/07434), die Avidin enthielten, wurden durch ein Verfahren hergestellt, das das Gefriertrocknen einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltete, unter Verwenden der folgenden Prozedur: eine Öl-Lösung wurde hergestellt durch Auflösen von 0,25 g des bioabbaubaren Polymers P73 [Poly(ethyliden-bis-(16-hydroxyhexadecanoat)co(adipinsäure)] in 5 ml Camphen bei 60°C. Zu 0,2 ml der Öl-Lösung wurde 2 mg Avidin gegeben. Eine wässrige Lösung wurde dann hergestellt durch Auflösen von 0,4 g des Polymers, a-(16-Hexadecanoyloxyhexadecanoyl)-w-methoxypolyoxyethylenester, in 20 ml Wasser bei 60°C. Die Öl-Lösung (0,2 ml) wurde dann mit der wässrigen Lösung (0,8 ml) in einem Vibromixer (Capmix) 15 Sekunden lang gemischt, um die Öl-in-Wasser-Emulsion zu bilden. Die Emulsion wurde in Trockeneis und Methanol gefroren, dann bei einem Druck von 200 mTorr 24 h lang getrocknet, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen. Das Pulver wurde als eine Suspension von hohlen Teilchen durch Zugabe von 1,0 ml Wasser verdünnt. Das resultierende Ultraschallkontrastmittel wurde durch Mikroskopie-Beobachtung, Coulter-Größenverteilung, akustische Abschwächung und Widerstand gegenüber äußerem Druck bestätigt.
  • b) Synthese von Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH
  • Beschrieben in Beispiel 5b).
  • c) Konjugation von Polymerteilchen, die Avidin eingebaut haben
  • Die Teilchen von a) wurden zentrifugiert und der Überstand durch 1 ml PBS-Puffer, pH 7,5 ersetzt, der 0,2 mg Biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT und 0,2 mg Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH von b) oben enthielt. Nach der Inkubation für 24 h wurden die Teilchen mit PBS und Wasser gewaschen.
  • Beispiel 12 – Funktionalisierung von Gas-gefüllten Albumin-Mikrokügelchen (GAM) mit Biotin für mehrfach-spezifisches Zielausrichten
  • a) Herstellung von biotinylierten Albumin-Mikrokügelchen
  • Eine homogene Suspension von GAM (6 × 108 Teilchen/ml) in 5 mg/ml Albumin wurde verwendet, wobei alle Manipulationen bei Raumtemperatur ausgeführt wurden. Zwei aliquote Mengen von 10 ml wurden zentrifugiert (170 × g, 5 Minuten), um die Flotation der Mikrokügelchen zu fördern und 8 ml des darunterliegenden unten Schwimmenden wurde entfernt durch sorgfältiges Absaugen und ersetzt durch ein gleiches Volumen einer Luft-gesättigten, mit Phosphat gebufferten Salzlösung, wobei die Präparate 15 bis 20 Minuten lang rotiert wurden, um die Mikrokügelchen wieder zu suspendieren. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt, wonach nur vernachlässigbare Mengen freien, nicht-Mikrokügelchen-assoziiertem Albumins als verbleibend angenommen wurden. 50 μl NHS-Biotin (10 mM in Dimethylsulfoxid) wurde zugegeben zu einer der aliquoten Mengen (Endkonzentration 50 μM); die andere aliquote Menge (Kontrolle) erhielt 50 μl Dimethylsulfoxid. Die Röhrchen, die die Pro ben enthielten, wurden eine Stunde lang rotiert, wonach 20 μl-Portionen 50%-igem wässrigen Glutaraldehyds zu jedem Röhrchen gegeben wurde, um die Mikrokügelchen zu vernetzen. Nach der Rotation für eine weitere Stunde wurden die Röhrchen vertikal über Nacht positioniert, um die Flotation der Mikrokügelchen zu ermöglichen. Am nächsten Tag wurden die Suspensionen zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen, die 1 mg/ml menschliches Serumalbumin (PBS/HSA) enthielt und wurden in PBS/HSA resuspendiert, nach der letzten Zentrifugation.
  • Um das Vorhandensein von Mikrokügelchen-assoziiertem Biotin zu bestimmen, wurde Streptavidin, das an Meerrettichperoxidase (strep-HRP) konjugiert war, zu beiden Suspensionen gegeben, und die Röhrchen wurden 1 h lang rotiert, um eine Reaktion zu ermöglichen. Die Mikrokügelchen wurden dann dreimal gewaschen, in 100 mM Citratphosphatpuffer (pH 5) resuspendiert, der 0,1 mg/ml Phenylendiamindihydrochlorid und 0,01% Wasserstoffperoxid enthielt, und rotiert für 10 min. Die Entwicklung einer gelb-grünen Farbe zeigte das Vorhandensein des Enzyms an. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
    Probe Farbentwicklung
    Biotinylierte Kügelchen + strp-HRP 2+
    Kontroll-Kügelchen + strp-HRP +
  • Dies bestätigt, dass die GAM biotinyliert waren.
  • b) Mehrfach-spezifische Gas enthaltende Mikrokügelchen
  • Die biotinylierten Mikrokügelchen werden dann verwendet, um mehrfach-spezifische Zielausrichtungsprodukte auf eine Weise herzustellen, die analog ist zu jener, die in den Beispielen 5), 6) und 7) veranschaulicht ist.
  • Beispiel 13 – Mehrfach-spezifische Gas enthaltende Mikrobläschen von DSPS, funktionalisiert mit Heparinsulfat-bindendem Peptid/Fibronektinpeptid/RGD-Peptid und Fluorescein
  • a) Synthese eines Lipopeptids, das die RGD-Sequenz und eine Fluorescein-Reportergruppe enthält: Dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Lys[acetyl-Ara-Gly-Asp-Lys(fluorescein)Gly.OH
    Figure 00850001
  • Das Lipopeptid wurde wie in Beispiel 1) beschrieben unter Verwenden kommerziell erhältlicher Aminosäuren und Polymere synthetisiert. Das Lipopeptid wurde vom Harz in TFA, das 5% Wasser, 5% Phenol und 5% EDT enthielt, 2 Stunden lang gespalten. Nach dem Verdampfen in vacuo wurde das rohe Produkt ausgefällt und mit Diethylether verrieben. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 60 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung von 10 mg reinem Material (analytische HPLC, Gradient 60–100% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion-UV 260-Produktretentionszeit = 20–22 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1922, gefunden bei 1920.
  • b) Synthese eines Lipopetids, das eine Heparinsulphat-bindende Sequenz und ein Fibronektinpeptid enthält
  • Die Synthese und Reinigung wurde ausgeführt wie beschrieben in Beispiel 1(a).
  • c) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas enthaltenden Mikrobläschen von DSPS funktionalisiert mit einem Heparinsulphat-bindenden Peptid, einem Fibronektin-Peptid, Acetyl-RGD-Peptid und Fluorescein
  • DSPS (Avanti 4 mg), das Lipopeptid von (a) (0,5 mg, 0,2 mmol) und das Lipopeptid von (b) (0,5 mg) wurden in jeweils zwei Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zu jedem Fläschchen gegeben. Die Mischungen wurden auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und die Kopfräume wurden mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die gebildeten Mikrobläschen über Nacht gerollt. Die Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch MALDI-Massenspektrometrie wie in Beispiel 1(b) beschrieben analysiert. Die Mikrobläschen wurden durch Mikroskopie untersucht und es wurde gesehen, dass sie einen Größenbereich zwischen 1 und 5 Mikron besaßen. Außerdem waren die Mikrobläschen fluoreszierend.
  • Beispiel 14 – Mehrfach-spezifische, Gas enthaltende Mikrobläschen, umfassend DSPS das kovalent mit CD71 FITC-markiertem Anti-Transferin-Rezeptor-Antikörper modifiziert ist und mit einem Lipopeptid mit einer Affinität für endotheliale Zellen „dotiert" ist
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von auf mehrere Vektoren zielausgerichtete Ultraschallmittel gerichtet.
  • a) Synthese eines Endothelial-Zellen-bindenden Lipopeptids: 2-n-Hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2
  • Das unten gezeigte Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer ausgehend von einem Rink-Amidharz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen synthetisiert.
  • Figure 00870001
  • Alle Aminosäuren und 2-n-Hexadecylstearinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% EDT und 5% H2O enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials durch HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 50 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 10 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 90–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2369, gefunden bei 2373.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einem Endothelial-Zellen-bindenden Peptid und PE-PEG2000-Mal „dotiert" ist
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid von (a) (0,5 mg) zusammen mit PE-PEG2000-Maleimid aus Beispiel 2 (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch ein 4,5 Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Mikrobläschen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
  • c) Thiolierung von FITC-markiertem Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörper
  • FITC-markierter CD71-Anti-Transferrin-Rezeptor Ab (100 mg/ml Becton Dickinson), 0,7 ml, in PBS, wurde mit Trauts Reagenz (0,9 mg, Pierce) bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt. Überschüssiges Reagenz wurde vom modifizierten Protein auf einer NAP-5-Säule (Pharmacia) getrennt.
  • d) Konjugation von thioliertem FITC-markiertem Anti-Transferrin-Rezeptor-Anitkörper an Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einem Endothelial-Zellen-bindenden Lipopeptid und DSPE-PEG2000-Mal „dotiert" ist
  • Eine aliquote Menge von 0,5 ml der Proteinfraktion (2 ml insgesamt) von (c) oben wurde zu den Mikrobläschen von (b) gegeben und man ließ die Konjugationsreaktion 10 Minuten lang auf einem Rollentisch fortschreiten. Nach der Zentrifugation bei 1000 Upm für 3 Minuten wurde die Proteinlösung entfernt und die Konjugation zweimal mehr mit aliquoten Mengen von 1 ml beziehungsweise 0,5 ml der Proteinlösung wiederholt. Die Bläschen wurden dann viermal in destilliertem Wasser gewaschen und eine Probe wurde auf das Vorhandensein von Antikörper durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie analysiert. Eine fluoreszierende Population von > 92% wurde beobachtet.
  • Figure 00880001
    Durchflusszytometrievergleich von Mikrobläschen von DSPS (linke Kurve) einer negativen Kontrolle mit Bläschen, die mit CD71 FITC-markiertem Anti-Transferrin-Antikörper (gefüllte Kurve, rechts) konjugiert waren, was zeigt, dass 92% der Population fluoresziert.
  • Der Einbau in die Mikrobläschen aus Lipopeptid wurde durch MALDI-Massenspektrometrie bestätigt, wie beschrieben in Beispiel 1(b).
  • Beispiel 15: Herstellung von mehrfach-spezifischen Transferrin/Avidin-beschichteten, Gas-gefüllten Mikrobläschen für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen, die Vektoren für zielausgerichteten/zielausgerichtete Ultraschall/Therapie enthielten.
  • a) Synthese eines Thiol-funktionalisierten Lipidmoleküls: Dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys.OH
    Figure 00890001
  • Die oben gezeigte Lipidstruktur wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Wang-Harz, in einem 0,25 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU-Kopplungschemie voraktiviert.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und die Entschützung von Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% EDT und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 250 mg ergab. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg rohen Materials durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 50 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 24 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1096, gefunden bei 1099.
  • b) Herstellung von Gas enthaltenden Mikrobläschen, umfassend DSPS, „dotiert" mit einer Thiol-enthaltenden Lipidstruktur
  • DSPS (Avanti 4,5 mg) und die Lipidstruktur aus (a) oben (0,5 mg) wurden in ein sauberen Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung, die 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin in Wasser enthielt, wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und durch ein 40 Mikron-Filter filtriert, während sie noch heiß war. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann auf einem Rollentisch über Nacht angeordnet. Die Bläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und auf Thiol-Gruppen-Einbau unter Verwenden von Ellmanns Reagenz analysiert.
  • c) Modifikation von Transferrin und Avidin mit Fluorescein-NHS und Sulfo-SMPB
  • Zu einer Mischung von 2 mg Transferrin (Holo, menschlich, Alpha Therapeutic Corp) und 2 mg Avidin (Sigma) in PBS (1 ml) wurden 0,5 ml DMSO-Lösung gegeben, die 1 mg Sulfo-SMPB (Pierce) und 0,5 mg Fluorescein-NHS (Pierce) enthielt. Die Mischung wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und man ließ sie dann durch eine Sephadex 200-Säule unter Verwenden von PBS als Eluenten laufen. Die Proteinfraktion wurde gesammelt und bei 4°C vor der Verwendung gelagert.
  • d) Mikrobläschen-Konjugation mit modifiziertem Transferrin/Avidin
  • Zu den Thiol-enthaltenden Mikrobläschen aus (b) wurde 1 ml der modifizierten Transferrin/Avidin-Protein Lösung aus (c) gegeben. Nach dem Einstellen des pH der Lösung auf 9 ließ man die Konjugationsreaktion 2 Stunden lang bei Raumtemperatur voranschreiten. Nach ausführlichen Waschen mit entionisiertem Wasser wurden die Mikrobläschen durch einen Coulter-Zähler (81% zwischen 1 und 7 Mikron) und Fluoreszenzmikroskopie (hoch fluoreszente Mikrobläschen wurden beobachtet) analysiert.
  • Beispiel 16: Herstellung von funktionalisierten Gas-gefüllten Mikrobläschen für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen mit einer reaktiven Gruppe auf der Oberfläche für nicht-spezifische Zielausrichtung, hauptsächlich nutzend Disulfid-Austauschreaktionen, um die Bindung an eine Vielzahl von zellulären Zielen zu bewirken.
  • DSPS (Avanti, 5,0 mg) und die Thiol enthaltende Lipidstruktur von Beispiel 15a) (1,0 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung, die 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin im Wasser enthielt, wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und durch ein 40 micron-Filter filtriert, während sie noch heiß war. Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann auf einem Rollentisch über Nacht angeordnet. Die Bläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und auf Thiol-Gruppen-Einbau unter Verwenden von Ellmanns Reagenz analysiert.
  • Beispiel 17 – Mehrfach-spezifische Gas enthaltende Mikrobläschen, umfassend DSPS ein Lipopeptid für Endothelial-Zellen-Zielausrichtung und ein Captopril-enthaltendes Molekül
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von Ultraschallmitteln für kombinierte Zielausrichtungs- und therapeutische Anwendungen gerichtet.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, das mit Captopril funktionalisiert ist
    Figure 00920001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde unter Verwenden einer manuellen Vorrichtung zum Durchperlenlassen von Stickstoff synthetisiert, ausgehend von mit Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz (Novabiochem) in einem 0,125 mmol-Maßstab. Alle Aminosäuren wurden von Novabiochem und Palmitinsäure von Fluka erworben. Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Bromessigsäure wurde durch die Seitenkette von Lys als ein symmetrisches Anhydrid unter Verwenden einer DIC-Voraktivierung gekoppelt. Captopril (Sigma), aufgelöst in DMF, wurde auf der Festphase unter Verwenden von DBU als eine Basis eingeführt.
  • Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% EDT, 5% Wasser und 5% Ethylmethylsulfid enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt. Eine aliquote Menge von 10 mg des rohen Materials wurde durch präparative Flüssigkeitschromatographie (Vydac 218TP1022-Säule) unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten gereinigt (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril), bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min.
  • Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 2 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Min; Säule Vydac 218TP54; Detektion UV 214 nm; Retentionszeit 26 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei 1265 ergab, wie erwartet.
  • b) Synthese eines Lipopeptids mit einer Affinität für endotheliale Zellen: Digalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Ile-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH2
    Figure 00930001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer ausgehend von einem Rink-Amid-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol Aminosäure-Kartuschen synthetisiert. Alle Aminosäuren und Palmitinsäuren wurden voraktiviert unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 160 mg ergab. Die Reinigung durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) einer aliquoten Menge von 35 mg rohen Materials wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 20 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion – UV 214 und 260 nm – Produktretentionszeit = 16 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2050, gefunden bei 2055.
  • c) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid für Endothelial-Zellen-Zielausrichtung und ein Captopril-enthaltendes Molekül für Arzneimittelverabreichung
  • DSPS (Avanti, 4,5 mg), das Produkt von (a) (0,5 mg) und das Produkt von (b) (0,5 mg) wurden in ein Fläschchen eingewogen und 1,0 mg einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde in jedes Fläschchen zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden zuerst in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann eine Stunde lang gerollt, gefolgt von ausführlichem Waschen mit entionisiertem Wasser. Es wurden keine detektierbaren Gehalte von Ausgangsmaterial in der schließlichen Waschlösung gefunden, wie durch MALDI MS bewiesen.
  • MALDI-Massenspektralanalyse wurde verwendet, um den Einbau der Produkte von (a) und (b) in die Mikrobläschen zu bestätigen, wie beschrieben in Beispiel 1(b).
  • d) In-vitro-Studie von Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS umfassend ein Lipopeptid für Endothelial-Zellen-Zielausrichtung und ein Captopril-enthaltendes Molekül für therapeutische Anwendungen
  • Der in Beispiel 1(c) beschriebene in-vitro-Assay wurde verwendet, um die Zellenbindung unter Fließbedingungen zu untersuchen. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen auf den Zellen fand statt, was abhängig war von der Fließgeschwindigkeit. Bei weiterer Erhöhung der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen, vom Deckglas abgelöst zu werden, aber die Mikrobläschen waren noch an die Zellen gebunden. Kontroll-Bläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endo thelialen Zellen an, und verschwanden von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 18 – Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS, das mit einem Lipopeptid beladen ist, das ein helikales Peptid mit einer Affinität für Zellmembranen und das Peptid-Antibiotikum Polymixin-B-Sulphat umfasst
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen gerichtet, die mehrfache peptidische Vektoren umfassen, die eine kombinierte Zielausrichtungs- und eine therapeutische Anwendung besitzen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, umfassend ein helikales Peptid mit einer Affinität für Zellmembranen: Hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2
  • Beschrieben in Beispiel 14a).
  • b) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas enthaltenden Mikrobläschen
  • DSPS (Avanti, 5,0 mg), das Lipopeptid von (a) (0,3 mg) und Polymixin-B-Sulphat (Sigma, 0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde 3–5 Minuten beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch ein 4,5 Mikron-Filter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Die Mikrobläschen wurden mit Wasser gewaschen, bis kein Polymixin-b-Sulphat oder Lipopeptid im unten Schwimmenden durch MALDI-MS detektiert werden konnte. Die Mikroskopie zeigte, dass die Größenverteilung der Bläschen-Population zwischen von 1–8 Mikron lag, wie erwünscht.
  • Zu den gewaschenen Bläschen (ca. 0,2 ml) wurde Methanol (0,5 ml) gegeben und die Mischung wurden in einem Ultraschallbad 2 Minuten lang angeordnet. Nach einer Analyse durch MALDI-MS wurde gefunden, dass die resultierende klare Lösung sowohl Lipopeptid als auch Polymixin-B-Sulfat enthielt (erwartet 1203, gefunden 1207).
  • Beispiel 19 – Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit einem Lipopeptid das eine IL-1-Rezeptor-Bindungssequenz umfasst, und modifiziert mit einer verzweigten Struktur die das Arzneimittel Methotrexat enthält
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen, die mehrfache Vektoren für zielausgerichtete/therapeutische Arzneimittelfreisetzungs-Anwendungen umfassen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids umfassend ein Interleukin-1-Rezeptor-bindendes Peptid: Dipalmitoyl-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-Gly-Leu-Trp-Ara-Gly-Ala-Ala.OH
    Figure 00960001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ala-Wang-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert.
  • Die gleichzeitige Entfernung von Lipopeptid vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% H2O, 5% Anisol, 5% Phenol und 5% EDT enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 30 mg des rohen Materials durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 4 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 90–100% B über 20 Minuten, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion – UV 214 nm; Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2083, gefunden bei 2088.
  • b) Synthese einer verzweigten Methotrexat-Kernstruktur, die eine Thioleinheit enthält
    Figure 00970001
  • Die Methotrexat-Struktur wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Produktes vom Harz und die Entschützung von Schutzgruppen wurde in TFA, das 5% EDT und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 160 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 30 mg rohen Materials wurde ausgeführt durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) unter Verwenden eines Gradienten von 10 bis 30% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) und einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung der reinen Fraktionen wurden 9 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 5–50% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion-UV 214 nm – Produktretentionszeit = 9,5 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1523, gefunden bei 1523.
  • c) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas enthaltenden Mikrobläschen
  • DSPS (Avanti, 4,5 mg), Thiol enthaltendes Lipopeptid von Beispiel 15 (a) (0,5 mg) und Lipopeptid von (a) (0,2 mg) oben wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde 3 bis 5 Minuten lang beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch ein 4,5-Mikron-Filter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert, wonach das unten Schwimmende entladen wurde.
  • d) Konjugation der verzweigten Methotrexat-Struktur an thiolierte Mikrobläschen
  • Die Methotrexat-Struktur von (b) oben (0,5 mg) wurde in PBS, pH 8,0, aufgelöst. Die Lösung wurde dann zu den Thiol-enthaltenden Mikrobläschen (c) gegeben und man ließ die Disulfidbindungs-Bildung 16 Stunden lang voranschreiten. Nach einem ausführlichen Waschen mit PBS und Wasser wurden die Bläschen durch Mikroskopie und MALDI MS analysiert.
  • Es wird auch als relevant betrachtet, dass das Disulfidbindungs-Binden der Methotrexat-Strukur an die Mikrobläschen in vivo reduziert werden kann, wodurch das freie Arzneimittelmolekül freigesetzt wird. Dies in Kombination mit einem tumorspezifischen Vektor ist ein Arzneimittelverabreichungssystem. Ein physiologisch relvantes Reduktionsmittel, wie Glutathion, kann verwendet werden, um eine derartige Arzneimittelfreisetzung herbeizuführen.
  • Beispiel 20 – Herstellung von Mikrobläschen, beschichtet mit Poly-L-Lysin, das an Fluorescein-markierte DNA-Fragmente aus dem Plasmid pBR322 komplexiert ist
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen für Gentherapie/Gegensinn-Anwendungen. Es wird in Betracht gezogen, dass spezifische Zielausrichtung erreicht werden kann durch weitere Dotierung von Mikrobläschen-Membranen mit Vektor-modifizierten Lipidstrukturen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • a) Herstellung von DSPS-Gas enthaltenden Mikrobläschen
  • DSPS (Avanti, 4,5 mg) wurde in ein sauberes Fläschchen eingewogen. 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben und die Mischung wurde 2 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt. Unmittelbar nach dem Erwärmen wurde die Lösung durch ein 4 Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt. Die Bläschen wurden dann einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen und das unten Schwimmende wurde entladen. Die Mikrobläschen wurden dann in 0,5 ml Wasser resuspendiert.
  • b) Herstellung eines Poly-L-Lysin/DNA-Komplexes und Beladen von DSPS-eingekapselten Mikrobläschen
  • Zu 1 mg Poly-L-Lysin (70–150 kD) in einem sauberen Fläschchen wurden 0,1 ml eines mit Fluorescein markierten Abbaus des Plasmids pBR322 (Biorad), aufgelöst in TE-Puffer (10 mM tris-HCl, pH 8), gegeben. Die Lösung wurde auf insgesamt 0,6 ml durch Zugabe von Wasser aufbereitet und der pH wurde auf 8 eingestellt. Man ließ das Komplexieren eine Stunde lang voranschreiten, wonach 0,05 ml der Polylysin-DNA-Lösung zur Mikrobläschensuspension von (a) oben zugegeben wurde. Nach einer Stunde wurde Mikroskopie verwendet, um zu zeigen, dass die Bläschen fluoreszierten, was das Vorhandensein von DNA bestätigte.
  • Beispiel 21 – Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen, die ein verzweigtes Kernpeptid enthalten, das eine Bindungssequenz eines dabsylierten atherosklerotischen Plaques und RGDS umfasst
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von Mikrobläschen gerichtet, die eine Thiolgruppe auf der Oberfläche zur Modifikation mit Thiol-enthaltenden Vektoren für Zielausrichtungs/Arzneimittel-Verabreichung und Arzneimittel-Freisetzung aufweist.
  • a) Synthese des verzweigten Peptids Dabsyl-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Lys(NH2-Arg-Gly-Asp-Ser)-Gly-Cys.OH
    Figure 01000001
  • Das Peptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab, unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produkts von 160 mg ergab. Die Reinigung durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) einer aliquoten Menge von 30 mg rohen Materials wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 10 bis 60% B über 40 Minuten (wobei A = 0,1% TFA/Wasser und B = Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 2,5 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 10–50% B über 20 Minuten, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril und A = 0,01% TFA/Wasser: Säule – Vydac 218TP54: Detektion – UV 214 und 435 nm – Produktretentionszeit = 21 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2070, gefunden bei 2073.
  • b) Herstellung von Thiol enthaltenden, Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • Wie beschrieben in Beispiel 15a) und b).
  • c) Oxidative Kopplung thiolierter Mikrobläschen mit mehrfach-spezifischem Peptid via Disulfidbindungs-Bildung
  • Das unten Schwimmende der Mikrobläschen von (b) oben wurde entladen und mit einer Lösung des Dabsyl-Peptids von (a) (1 mg) in 0,7 ml verdünnter Ammoniaklösung (pH 8) ersetzt. Zu diesem wurden 0,2 ml einer Stammlösung gegeben, die 6 mg Kaliumferricyanat, aufgelöst in 2 ml Wasser, enthielt. Das Fläschchen wurde auf einem Rollentisch angeordnet und man ließ die Thiol-Oxidation 2 Stunden lang fortschreiten. Die Bläschen wurden dann ausführlich mit Wasser gewaschen bis das unten Schwimmende frei von Dabsyl-Peptid war, wie bewiesen durch HPLC und MALDI MS.
  • Die Detektion von Mikrobläschen-gebundenem Peptid wurde ausgeführt durch Reduktion der Disulfidbindung unter Verwenden des wasserlöslichen Reduktionsmittels Tris-(2-Carboxyethyl)-Phosphin. Nach der Reduktion wurde gefunden, dass das unten Schwimmende freies Dabsyl-Peptid enthielt, wie bewiesen durch HPLC und MALDI MS.
  • Andere physiologisch relevante Reduktionsmittel, wie reduziertes Glutathion, werden auch als zum Initiieren der Freisetzung nützlich betrachtet.
  • Beispiel 22 – Gas enthaltende Mikroteilchen, umfassend ein Polymer von Ethyliden-bis(16-hydroxyhexadecanoat) und Adipoylchlorid und Biotinamidocaproat-Ala, kovalent gebunden an das Polymer
  • a) Synthese von Z-Ala-Polymer 3-O-(Carbobenzyloxy-L-alanyl)-Polymer)
  • Das Polymer wird hergestellt aus Ethyliden-bis(16-hydroxyhexadecanoat) und Adipoylchlorid, wie beschrieben in WO-A-9607434, und eine Polymerfraktion mit dem Molekulargewicht 10000 wird gereinigt unter Verwenden von Gelpermeationchromatographie (GPC). 10 g des Materials (entsprechend 1 mmol OH-Gruppen), Z-Alanin (5 mmol) und Dimethylaminopyridin (4 mmol) werden aufgelöst in trockenem Dimethylformamid/Tetrahydrofuran und Dicyclohexylcarbodiimid wird dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wird gerührt bei Umgebungstemperatur über Nacht. Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel wird entfernt unter Verwenden von Rotationsverdampfung. Das Produkt wird gereinigt durch Chromatographie, Fraktionen, die die Titelverbindung enthalten, werden kombiniert, und das Lösungsmittel wird entfernt unter Verwenden von Rotationsverdampfung. Die Struktur des Produktes wird durch NMR bestätigt.
  • b) Synthese von Ala-Polymer(3-O-(L-Alanyl)-Polymer)
  • Z-Ala-Polymer (0,1 mmol) wird in Toluol/Tetrahydrofuran und Eisessig (15% des Gesamtvolumens) gerührt und hydriert bei Vorhandensein von 5% Palladium auf Aktivkohle für 2 Stunden. Die Reaktionsmischung wird filtriert und in vacuo konzentriert.
  • c) Synthese von Biotinamidocaproat-Ala-Polymer
  • Eine Lösung von Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester in Tetrahydrofuran wird zu H2N-Ala-Polymer gegeben, das in einer Mischung aus Tetrahydrofuran und Dimethylformamid und 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 aufgelöst ist. Die Reaktionsmischung wird auf 30°C erwärmt und kräftig gerührt; man folgt der Reaktion durch TLC bis zum Abschluss. Das Lösungsmittel wird verdampft und das rohe Produkt wird verwendet ohne weitere Reinigung.
  • d) Gas enthaltende Teilchen, umfassend Biotinamidocaproat-Ala-Polymer und PEG 10000-Methylether-16-hexadecanoyloxyhexadecanoat
  • 10 ml einer 5%-igen w/w-Lösung von Biotinamidocaproat-Ala-Polymer in (–)-Camphen, die auf 60°C gehalten wird, wird zu 30 ml einer 1%-igen wässrigen w/w-Lösung von PEG 10000-Methylether-16-hexadecanoyloxyhexadecanoat (hergestellt wie beschrieben in WO-A-9607434) bei der selben Temperatur zugegeben. Die Mischung wird emulgiert unter Verwenden eines Rotor-Stator-Mixers (Ultra Turax® T25) bei einer geringen Geschwindigkeit für mehrere Minuten und wird danach gefroren in einem Trockeneis/Methanol-Bad und lyophilisiert für 48 h, was das Titelprodukt als ein weißes Pulver ergibt.
  • e) Akustische Charakterisierung und Mikroskopie des Produkts
  • Bestätigung der mikroteilchenförmigen Natur des Produkts wird ausgeführt unter Verwenden von Lichtmikroskopie, wie beschrieben in WO-A-9607434. Ultraschall-Transmissionsmessungen unter Verwenden eines 3,5 MHz-Breitband-Transducers zeigen an, dass eine Teilchensuspension von < 2 mg/ml eine Schallstrahlabschwächung von mindestens 5 dB/cm ergibt.
  • f) Mehrfach-spezifische Mikroteilchen
  • Die biotinylierten Mikrokügelchen werden dann verwendet, um mehrfach-spezifische Zielausrichtungsprodukte herzustellen, die jenen ähnlich sind, die in den Beispielen 5), 6) und 7) veranschaulicht sind.
  • Beispiel 23 – Herstellung von mehrfach-spezifischen, Gas enthaltenden Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und Biotin-PEG3400-Acyl-Phosphatidylethanolamin und funktionalisiert mit Streptavidin, dem Oligonukleotid Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und biotinyliertem Fibrin-Anti-polimerisierendem Peptid (Biotin-GPRPPERHOS.NH2)
  • a) Synthese von Biotin-PEG3400-Acyl-Phosphatidylethanolamin
  • Eine Mischung von Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, (21,00 mg, 0,03 mmol), Biotin-PEG-CO2-NHS, (100 mg, 0,03 mmol) und Triethylamin (42 μl, 0,30 mmol) in einer Lösung von Chloroform/Methanol (3:1) wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel unter verringertem Druck wurde der Rückstand flash-chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol/Wasser, 40:8:1). Das Produkt wurde als ein gelbes Gummi 112 mg, (94%) erhalten, und die Struktur wurde durch NMR und MALDI-MS verifiziert.
  • b) Binden von Fluorescein-konjugiertem Streptavidin an Gas-gefüllte Mikrobläschen
  • Gas enthaltende Mikrobläschen wurden durch Mischen von DSPS und Biotin-PEG3400-Acyl-Phosphatidylethanolamin, wie in Beispiel 5a) beschrieben, hergestellt.
  • Die Mikrobläschensuspension wurde in aliquote Mengen von 0,2 ml unterteilt und Fluorescein-konjugiertes Streptavidin wurde wie in der Tabelle unten gezeigt zugegeben. Die Proben wurden auf einem Rollentisch 15 oder 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur vor dem Entfernen von überschüssigem Protein durch Waschen in PBS inkubiert.
  • Ergebnisse:
    Figure 01050001
  • Die Proben wurden durch Durchflusszytometrie und einem Coulter-Zähler analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle oben zusammengefasst.
  • c) Konjugation von Streptavidin-beschichteten Mikrobläschen mit dem Oligonukleotid Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und biotinyliertem Fibrin-Anti-polymerisierendem Peptid Biotin-GPRPPERHOS
  • Die Teilchen des Aliquots Nr. 6 oben wurden zentrifugiert und der Überstand wurde mit 1 ml PBS-Puffer, pH 7,5, ersetzt, enthaltend 0,2 mg Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und 0,2 mg Biotin-GPRPPERHQS (hergestellt wie in Beispiel 5 (c)). Nach der Inkubation für 24 Stunden wurden die Teilchen ausführlich mit PBS und Wasser gewaschen.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass andere biotinylierte Vektoren oder therapeutische Mittel an Streptavidin- oder Avidin-beschichtete Mikrobläschen unter Verwenden dieser Prozedur konjugiert werden können.
  • Beispiel 24) Herstellung von Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und funktionalisiert mit einem Thrombi-zielausrichtenden Lipopeptid und dem thrombolytischen Enzym-Gewebe-Plasminogenaktivator
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von auf Thrombus zielgerichteten US-Mitteln, die ein therapeutisches thrombolytisches Mittel umfassen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids mit einer Affinität für Thrombi (Dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH2)
    Figure 01060001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Rink-Amid-Harz (Novabiochem) in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert.
  • Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 80 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 20 mg des rohen Materials durch präparative HPLC (Vydac 218TP1022-Säule) wurde ausgeführt. Nach der Lyophilisierung wurden 6 mg reinen Materials erhalten. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie und analytische HPLC charakterisiert.
  • b) Modifikation des Gewebe-Plasminogenaktivators mit Sulfo-SMPB
  • Eine Lösung von 0,1 ml Amoniumcarbonat-Puffer, der 0,1 mg t-PA (Sigma) enthielt, wurde auf 0,2 ml durch die Zugabe von Wasser aufbereitet. Zu dieser Lösung wur den 0,4 mg Sulfo-SMPB (Pierce), aufgelöst in 0,05 ml DMSO, zugegeben. Die Proteinlösung wurde bei Raumtemperatur 45 Minuten lang stehen gelassen, wonach eine Reinigung auf einer Superdex 200-Säule ausgeführt wurde. Das Produkt wurde in PBS eluiert und die modifizierte Proteinfraktion wurde gesammelt.
  • c) Herstellung von Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS/Thrombi-bindendem Lipopeptid und Thiol-enthaltendem Lipopeptid und Konjugation des modifizierten Gewebe-Plasminogenaktivators
  • DSPS (Avanti, 5,0 mg) wurde in einem sauberen Fläschchen zusammen mit 0,5 mg des Lipopeptids von (a) und 0,5 mg des Thiol-enthaltenden Lipopeptids von Beispiel 15(a) eingewogen. Dazu wurden 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin gegeben und die Mischung wurde 2 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt. Unmittelbar nach dem Erwärmen wurde die Lösung durch ein 4 Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Mikrobläschen wurden zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Überstand wurde entladen und mit einer aliquoten Menge von 1 ml der Proteinlösung von (b) oben ersetzt. Man ließ die Konjugationsreaktion eine Stunde lang fortschreiten. Die Bläschen wurden zentrifugiert und das unten Schwimmende wurde mit einem weiteren ml der Proteinlösung ausgetauscht. Der Inkubationsschritt wurde wiederholt, bis die gesamte Proteinlösung aufgebraucht war. Die Mikrobläschen wurden dann ausführlich mit Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler analysiert. Die Mikrobläschen wurden in einem Flusskammer-Assay, der in Beispiel 1(c) beschrieben ist, getestet. Es wurde gefunden, dass die mit Protein modifizierten Mikrobläschen in höheren Zahlen binden als jene, die entweder Lipopeptid/DSPS oder DSPS allein enthielten.
  • Die Zielausrichtungs-/therapeutischen/Ultraschall-Wirkungen dieser Mikrobläschen wurden in Modellen einer in vitro- und in vivo-Thrombogenese bewertet.
  • Beispiel 25 – Mehrfach-spezifische, PFB-Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und einem Lipopeptid, umfassend ein Heparinsulfat-bindendes Peptid (KRKR) und ein Fibronektinpeptid (WOPPRARI) für Zielausrichtung und ein Lipopeptid, das Atenolol enthält für therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese eines Lipopeptids, bestehend aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronektinpeptid (WOPPRARI)
  • Synthese und Reinigung beschrieben in Beispiel 1a).
  • b) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasenkopplung geeignet ist
  • i) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]-phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,03 mol), Epichlorohydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurde bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-NMR (75 MHz)-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • ii) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergaben eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse verifiziert.
  • iii) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde bei 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab ein M + H bei 268, wie erwartet.
  • iv) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,6 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung von Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5) und Teile des Di-tert-butyldicarbonats wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, gegossen und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • c) Synthese eines Lipopeptids, das mit Atenolol funktionalisiert ist
    Figure 01100001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Verfahren zum Durchperlenlassen von Stickstoff synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz (Novabiochem), in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden von Aminosäuren von Novabiochem, Palmitinsäure von Fluka und der Verbindung aus (a). Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen.
  • Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Rohes Material wurde aus Ether ausgefällt und gereinigt durch präparative Flüssigkeitschromatographie (Vydac 218TP1022-Säule) unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1 TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 38 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B über 20 Minuten, A = 0–1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Säule Vydac 218TP54, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 25 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was M + H bei 1258 ergab, erwartet 1257.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, bestehend aus Heparinsulfat-bindendem Peptid (KRKR), und ein Fibronectinpeptid (WOPPRARI) und ein Lipopeptid, das Atenolol enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung aus DSPS (Avanti, 5,0 mg) Produkt aus a) und dem Produkt aus c) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Lösung wurde filtriert und dann gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von ausführlichem Waschen mit entionisiertem Wasser. Der Einbau von Atenolol enthaltendem Peptid in die Bläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS, wie beschrieben in Beispiel 1b).
  • e) In-vitro-Studie von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • Eine in-vitro-Analyse der Mikrobläschensuspension wurde ausgeführt wie beschrieben in Beispiel 1c). Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen auf den Zellen fand statt, was von der Fliessgeschwindigkeit abhängig war. Durch Vergrößern der Fliessgeschwindigkeit begannen die Zellen, sich von dem Deckglas zu lösen, wobei die Mikrobläschen immer noch an die Zellen gebunden waren. Kontrollbläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen an und verschwanden von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 26 – PFB-Gas-gefüllte Mikrobläschen aus DSPS, enthaltend ein Cholesterylester von Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf nicht-spezifische Modifikationen einer Mehrzahl von Zellrezeptoren auf endothelialen Zellen.
  • a) Synthese von Cholesteryl-4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butanoat
  • DIC (170 μl, 1,10 mmol) wurde zu einer Lösung von Chlorambucil (Sigma, 669 mg, 2,20 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt und zu einer Lösung von Cholesterin (Aldrich, 387 mg, 1,00 mmol) und DMAP (122 mg, 1,00 mmol) in Dichlormethan (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann auf 5%-iges Natriumbicarbonat gegossen. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde filtriert und das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silica, Chloroform) gereinigt, um 560 mg (83%) Ausbeute eines farblosen Öls zu ergeben. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie charakterisiert, was M + H bei 674 wie erwartet ergab. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Analyse, was Spektren in Übereinstimmung mit der Struktur ergab.
  • b) Herstellung von Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Cholesterylester von Chlorambucil für diagnostische und/oder therapeutische Anwendungen
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (Avanti, 4,5 mg) und dem Produkt aus (a) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (a) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau von Chlorambucil-Cholesterylester in die Bläschen wurde durch MALDI-MS wie folgt bestätigt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS analysiert, was einen M + H-Peak bei 668 ergab, entsprechend der Struktur aus (a).
  • In Kombination mit einem Tumor-spezifischen Vektor werden diese Mikrobläschen als als zielausgerichtete Arzneimittel-Verabreichungsmittel nützlich betrachtet.
  • Beispiel 27 – Mehrfach-spezifische, Gas-gefüllte Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Atenolol und ein Cholesterinderivat von Chlorambucil enthält, für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasenkopplung geeignet ist
  • Wie beschrieben im Beispiel 25, Abschnitt b).
  • b) Synthese eines Lipopeptids, funktionalisiert mit Atenolol
  • Wie beschrieben im Beispiel 25, Abschnitt c).
  • c) Synthese von Cholesteryl-4-[4-[bis(2-chlorethyl)aminophenyl]butanoat
  • Wie beschrieben im Beispiel 25, Abschnitt d).
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Atenolol und ein Cholesterylester von Chlorambucil enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (Avanti, 5,0 mg), dem Produkt aus (b) (0,5 mg) und dem Produkt aus (c) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Lösung wurde filtriert und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Der Einbau von Atenolol enthaltendem Lipopeptid und eines Chlorambucil-Analogons in die Bläschenmembran wurde durch MALDI-MS, wie beschrieben in Beispiel 1c), bestätigt.
  • e) In-vitro-Studie von mehrfach-spezifischen PFB-Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Atenolol und ein Cholesterin-Derivat von Chlorambucyl enthält, für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • Der in Beispiel 1c) beschriebene in-vitro-Assay wurde verwendet, um die zellulare Bindung unter Fließbedingungen zu bewerten. Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen auf den Zellen fand statt, was von der Fließgeschwindigkeit abhängig war. Durch Vergrößern der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen, vom Deckglas abgelöst zu werden, wobei die Mikrobläschen noch an die Zellen gebunden waren. Kontroll-Bläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen und verschwanden von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 28 – Mehrfach-spezifische, Gas-gefüllte Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Atenolol für Zell-Zielausrichtung und ein lipophiles Thiolester von Captopril für therapeutische Verwendung enthält
  • a) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasenkopplung geeignet ist
  • Wie beschrieben in Beispiel 25, Abschnitt b).
  • b) Synthese eines Lipopeptids, funktionalisiert mit Atenolol
  • Wie beschrieben in Beispiel 25, Abschnitt c).
  • c) Synthese des Cholansäurethiolesters von Captopril
  • Eine Mischung von 5-β-Cholansäure (Sigma, 361 mg, 1,00 mmol) und DIC (77 μl, 0,50 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde 10 Minuten lang gerührt und dann zu einer Lösung von Captopril (Sigma, 130 mg, 0,600 mmol) und DBU (180 μl, 1,20 mmol) in Dichlormethan (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann auf verdünnte Salzsäure gegossen. Chloroform (30 ml) wurde zugegeben.
  • Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Nach der Filtration und Konzentrierung wurde das rohe Material chromatographiert (Silica, Chloroform/Methanol/Essigsäure 95:4:1). Das Produkt wurde lyophilisiert aus einer Acetonitril/Wasser/Ethanol-Mischung. Ausbeute 137 mg (49%) cremefarbener Feststoff. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Spektroskopie. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was einen M + Na-Peak im positiven Modus bei m/z 584 ergab.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Atenolol enthält, zum Zell-Zielausrichten und ein lipophiles Thiolester von Captopril zur therapeutischen Verwendung
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (Avanti, 5,0 mg), dem Produkt aus (b) (0,5 mg) und (c) (0,5 mg) in ein Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von ausführlichem Waschen mit entionisiertem Wasser. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung von (b) und (c) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau der Verbindungen aus (b) und aus (c) in die Bläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS wie folgt. Ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was Peaks ergab, die mit den Strukturen von (b) beziehungsweise (c) in Übereinstimmung waren.
  • e) In-vitro-Studie von Gas enthaltenden Mikrobläschen aus d)
  • Der in Beispiel 1c) beschriebene in-vitro-Assay wurde verwendet, um die zelluläre Bindung unter Fließbedingungen zu bewerten. Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen auf den Zellen fand statt, was von der Fließgeschwindigkeit abhängig war. Durch Vergrößern der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen, vom Deckglas abgelöst zu werden, die Mikrobläschen waren noch an die Zellen gebunden. Kontrollbläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen an und verschwanden von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 29 – Gas-gefüllte Mikrobläschen aus Phosphatidylserin, umfassend Biotinamid-PEG-β-Ala-Cholesterin und ein Cholesterylester von Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese von Cholesteryl-N-Boc-β-alaninat
  • DIC (510 μl) wurde zu einer Lösung von Boc-β-Ala-OH (1,25 g, 6,60 mmol) in Dichlormethan (15 ml) unter einer inerten Atmosphäre gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang gerührt und dann in einen Kolben übertragen, der eine Lösung von Cholesterin (1,16 g, 3,00 mmol) und DMAP (367 mg, 3,00 mmol) in Dichlormethan (15 ml) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang gerührt und dann auf eine wässrige Lösung aus Kaliumhydrogensulfat gegossen. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit Chloroform extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit wässrigem Kaliumhydrogensulfat und Wasser gewaschen und getrocknet über MgSO4. Nach der Filtration und dem Verdampfen wurde das rohe Produkt chromatographiert (Silica, Chloroform/Methanol 99:1), um 1,63 g (97%) eines weißen Feststoffs zu ergeben. Die Struktur wurde bestätigt durch 1H-NMR (500 MHz).
  • b) Synthese von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid
  • Eine Lösung der Verbindung aus (a) (279 mg, 0,500 mmol) in 1 M Salzsäure in 1,4-Dioxan (5 ml) wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um eine quantitative Ausbeute von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid zu ergeben. Die Struktur wurde bestätigt durch 1H-NMR-(500 MHz) Analyse und durch MALDI-Massenspektrometrie, was einen M + Na-Peak bei 482 ergab, erwartet 481.
  • c) Biotin-PEG3400-β-Ala-Cholesterin
  • Zu einer Lösung von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid (15 mg, 0,03 mmol) in Chloroform/nassem Methanol (2:6:1, 3 ml) wurde Triethylamin (42 μl, 0,03 mmol) gegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und eine Lösung von Biotin-PEG3400-NHS (100 mg, 0,03 mmol) in 1,4-Dioxan (1 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für drei Stunden wurde die Mischung zum Trocknen verdampft und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt, um weiße Kristalle zu ergeben, Ausbeute: 102 mg (89%). Die Struktur wurde verifiziert durch MALDI-MS und durch NMR-Analyse.
  • d) Synthese von Cholesteryl-4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butanoat
  • DIC (170 μl, 1,10 mmol) wurde zu einer Lösung von Chlorambucil (Sigma, 669 mg, 2,20 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 0,5 Stunden lang gerührt und zu einer Lösung von Cholesterin (Aldrich, 387 mg, 1,00 mmol) und DMAP (122 mg, 1,00 mmol) in Dichlormethan (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann auf 5% Natriumbicarbonat gegossen. Die organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen und getrocknet über MgSO4. Die Lösung wurde filtriert und konzentriert und das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silica, Chloroform) gereinigt, um 560 mg (83%) Ausbeute eines farblosen Öls zu ergeben. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie charakterisiert, was M + H bei 674 wie erwartet ergab. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Analyse, was Spektren in Übereinstimmung mit der Struktur ergab.
  • e) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (Avanti, 5 mg), dem Produkt aus (c) (0,5 mg) und (d) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von ausführlichem Waschen mit entionisiertem Wasser. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (c) und (d) in der schließlichen Waschlösung.
  • Der Einbau der Verbindungen aus (c) und (d) in die Bläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS, wie beschrieben in Beispiel 1b).
  • Beispiel 30 – Gas-gefüllte Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von funktionalisierten Mikrobläschen mit nicht-spezifischer Affinität für eine Mehrzahl von Zelloberflächen-Molekülen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, das Chlorambucil enthält
    Figure 01180001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde auf einer manuellen Stickstoff-Durchperlungs-Einrichtung synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz (Novabiochem), in einem 0,125 mmol-Maßstab. Standard-Aminosäuren wurden von Novabiochem erworben und Palmitinsäure von Fluka. Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden eines Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokolls. Chlorambucil (Sigma) wurde durch die Seitenkette von Lys als ein symmetrisches Anhydrid unter Verwenden einer DIC-Voraktivierung gekoppelt.
  • Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT, 5% Wasser und 5% Ethylmethylsulfid enthielt, für 2 Stunden. Eine aliquote Menge von 10 mg des rohen Materials wurde durch präparative Flüssigkeitschromatographie (Vydac 218TP1022-Säule) gereinigt, unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 30 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril; Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute; Säule Vydac 218TP54; Detektion UV 214 nm; Retentionszeit 26,5 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei 1295 ergab, erwartet 1294.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (Avanti, 4,5 mg) und dem Produkt aus (a) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (a) in der schließlichen Waschlösung.
  • Der Einbau von Chlorambucil-enthaltendem Lipopeptid in die Bläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS wie folgt. Ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was einen M + H-Peak bei 1300, erwartet bei 1294, und einen M + Na-Peak bei 1324, erwartet bei 1317, ergab.
  • c) In-vitro-Studie von Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit einem Lipopeptid, das Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • Die Mikrobläschen wurden bewertet unter Verwenden des In-vitro-Fluss-Assays, der in Beispiel 1c) beschrieben ist. Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen an den Zellen fand statt, was von der Fließgeschwindigkeit abhängig war. Durch Vergrößern der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen, vom Deckglas abgelöst zu werden, wobei die Mikrobläschen noch an die Zellen gebunden waren. Kontrollbläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen an und verschwanden von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 31 – Gas-gefüllte Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Atenolol und ein lipophiles Derivat von Captopril für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • a) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasen-Koppeln geeignet ist
  • Wie beschrieben in Beispiel 25)b)
  • b) Synthese von N-[(S)-3-Hexadecylthio-2-methylpropionyl]prolin
  • DIEA (188 μl, 1,10 mmol) wurde zu einer Lösung von 1-Iodhexadecan (176 mg, 0,500 mmol), Captopril (120 mg, 0,0550 mmol) und DBU (165 μl, 1,10 mmol) in Tetrahydrofuran (5 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei 70°C 2 Stunden lang erwärmt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde auf Wasser gegossen, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, und organisches Material wurde in Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO4). Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5) und lyophilisiert, um 105 mg (48%) eines weißen festen Materials zu ergeben. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Analyse, und weiter charakterisiert durch MALDI-Massenspektrometrie, was ein M – H im negativen Modus bei m/z 440 ergab, wie erwartet.
  • c) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, das Atenolol und ein lipophiles Derivat von Captopril für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (Avanti, 4,5 mg) und dem Produkt aus (b) (0,5 mg) und (c) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von ausführlichem Waschen mit entionisiertem Wasser. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (b) oder (c) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau der Verbindung (b) und (c), die Lipopeptid enthielt, in die Bläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS, wie beschrieben in Beispiel 1b).
  • d) In-vitro-Studie von Gas enthaltenden Mikrobläschen aus DSPS, umfassend ein Lipopeptid, enthaltend Atenolol und ein lipophiles Derivat von Captopril für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • Die Mikrobläschen wurden bewertet unter Verwenden des In-vitro-Fluss-Assays, der in Beispiel 1c) beschrieben ist. Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen an den Zellen fand statt, was von der Fließgeschwindigkeit abhängig war. Durch Vergrößern der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen, vom Deckglas abgelöst zu werden, wobei die Mikrobläschen noch an die Zellen gebunden waren. Kontrollbläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen an und verschwanden von den Zellen unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 32 – Flotation von endothelialen Zellen durch DSPS-Mikrobläschen, umfassend ein mehrfach-spezifisches Lipopeptid, das an die endothelialen Zellen bindet
  • Dieses Beispiel wurde ausgeführt, um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung für die Trennung von Zellen verwendet werden könnte.
  • Die menschliche Endothelialzellen-Linie ECV304, erhalten aus einem normalen Nabelschnur-Stamm (ATCC CRL-1998) wurde in Nunc-Kulturkolben (chutney 153732) in RPMI-1640-Medium (Bio Whitaker) kultiviert, zu dem L-Glutamin (200 mM), Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml und 10,00 μg/ml) und 10% fötales Kälberserum (Hyclone Charge-Nr. AFE5183) gegeben wurden. Die Zellen wurden subkultiviert nach einer Trypsinisierung mit einem Split-Verhältnis von 1:5 bis 1:7, wenn die Konfluenz erreicht wurde. 2 Millionen Zellen von trypsinisierten konfluenten Kulturen wurden zu jedem Satz von fünf Zentrifugen-Röhrchen gegeben, gefolgt von entweder Kontroll-Mikrobläschen aus DSPS, Mikrobläschen aus Beispiel 1 oder Mikrobläschen aus DSPS, dotiert mit dem Endothelial-Zellen-bindenden Lipopeptid aus Beispiel 14a) bei einer Konzentration von 2, 4, 6, 8 oder 10 Millionen Bläschen pro Röhrchen. Die Zellen am Boden der Röhrchen nach der Zentrifugation bei 400 g für 5 Minuten wurden mit einem Coulter-Zähler gezählt. Es wurde gefunden, dass Binden von 4 oder mehr Mikrobläschen an eine Zelle eine Flotation herbeiführte. Außerdem wurden alle Zellen durch die Endothelial-Zellen-bindenden Lipopeptid-Bläschen flotiert, wohingegen ungefähr 50% mit den Mikrobläschen aus Beispiel 1 flotiert wurden.
  • Beispiel 33 – Gentransfer durch PFB-Gas-gefüllte Mikrobläschen
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen für Gentransfer.
  • a) Herstellung von DSPS-Lipopeptidbläschen/PFB-Gas, beschichtet mit Poly-L-Lysin
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid aus Beispiel 17 b) (0,5 mg) wurden in zwei 2 ml-Fläschchen eingewogen. In jedes Fläschchen wurde 0,8 ml Propylenglykol/Glycerin (4%) in Wasser gegeben. Jede Lösung wurde bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt und geschüttelt. Die Lösung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und die Kopfräume wurden mit Perfluorbutan gespült. Die Fläschchen wurden in einem Capmix (Espe Capmix, 4450 Schwingungen/min) 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch 5 Minuten lang angeordnet. Der Inhalt der Fläschchen wurde gemischt und die Probe wurde durch Zentrifugation bei 2000 Upm 5 Minuten lang gewaschen. Das unten Schwimmende wurde entfernt und dasselbe Volumen destilliertes Wasser wurde zugegeben. Die Waschprozedur wurde einmal wiederholt.
  • Poly-L-Lysin-HBr (Sigma, 20,6 mg) wurde in 2 ml Wasser aufgelöst, dann wurde eine aliquote Menge (0,4 ml) auf 2 ml Wasser ergänzt. Zu 1,2 ml der verdünnten Poly-L-Lysin-Lösung wurden 0,12 ml der DSPS-Lipopeptid-Bläschen-Suspension gegeben. Nach der Inkubation wurde überschüssiges Polylysin durch ausführliches Waschen mit Wasser entfernt.
  • b) Transfektion von Zellen
  • Endotheliale Zellen (ECV 304) wurden in 6 Well-Platten zu einer einförmigen subkonfluenten Schicht kultiviert. Eine Transfektionsmischung, bestehend aus 5 μg DNA (einen Enhanced Green Fluorescent Protein-Vektor von CLONTECH) und 50 μl Mikrobläschen-Suspension aus (a) in RPMI-Medium bei einem Endvolumen von 250 μl, wurde hergestellt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur steh engelassen, dann wurde 1 ml vollständiges RPMI-Medium zugegeben. Das Medium wurde aus der Zellkulturschale entfernt und die DNA-Mikrobläschen-Mischung wurde zu den Zellen gegeben.
  • Die Zellen wurden in einem Zellkulturinkubator (37°C) inkubiert.
  • c) Ultraschallbehandlung
  • Nach 15 Minuten der Inkubation wurden ausgewählte Wells kontinuierlichen Ultraschallwellen von 1 MHz, 0,5 W/cm2, 30 Sekunden lang ausgesetzt.
  • d) Inkubation und Untersuchung
  • Die Zellen wurden weiter im Zellkulturinkubator (37°C) annähernd 4½ Stunden lang inkubiert. Das Medium, das DNA-Mikrobläschen enthielt, wurde dann durch Ansaugen entfernt, und 2 ml vollständiges RPMI-Medium wurde zugegeben. Die Zellen wurden 40–70 Stunden lang vor der Untersuchung inkubiert. Das meiste des Mediums wurde dann entfernt und die Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen von Kontrollexperimenten verglichen, bei denen DNA oder DNA-Polylysin zu den Zellen gegeben wurden.

Claims (37)

  1. Zielbares diagnostisches und/oder therapeutisch wirksames Mittel, umfassend eine Suspension in einer wässrigen Trägerflüssigkeit eines Reporters, umfassend ein Gas enthaltendes oder Gas erzeugendes Material, wobei der Reporter an mehr als einen Vektor konjugiert ist, und wobei die Vektoren eine Affinität für verschiedene Ziele auf denselben oder verschiedenen Zelltypen besitzen.
  2. Mittel nach Anspruch 1, wobei das Gas umfasst Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff, ein inertes Gas, Schwefelfluorid, Selenhexafluorid, einen Kohlenwasserstoff eines niedrigen Molekulargewichts, ein Keton, einen Ester, einen halogenierten Kohlenwasserstoff eines niedrigen Molekulargewichts oder eine Mischung aus beliebigen der vorstehenden Verbindungen.
  3. Mittel nach Anspruch 2, bei dem das Gas perfluoriertes Keton, perfluorierten Ether oder Perfluorkohlenstoff umfasst.
  4. Mittel nach Anspruch 2, bei dem das Gas Schwefelhexafluorid oder ein Perfluorpropan, Perfluorbutan oder Perfluorpentan umfasst.
  5. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend Gas-Mikroblasen, die durch eine Koaleszenz-resistente Oberflächenmembran, ein Film-bildendes Protein, ein Polymermaterial, ein nicht-polymeres und nicht-polymerisierbares Wand-bildendes Material oder ein oberflächenaktives Mittel stabilisiert sind.
  6. Mittel nach Anspruch 5, bei dem das oberflächenaktive Mittel mindestens ein Phospholipid umfasst.
  7. Mittel nach Anspruch 6, bei dem mindestens 75% des oberflächenaktiven Materials Phospholipidmoleküle umfasst, die individuell eine Gesamtnettoladung tragen.
  8. Mittel nach Anspruch 7, bei dem mindestens 75% des Film-bildenden oberflächenaktiven Materials ein oder mehrere Phospholipid(e) umfasst, die ausgewählt sind aus Phosphatidylserinen, Phosphatidylglycerolen, Phosphatidylinositolen, Phosphatidsäuren und Cardiolipinen.
  9. Mittel nach Anspruch 8, bei dem mindestens 80% des Phospholipids Phosphatidylserine umfassen.
  10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das Gas enthaltende oder Gas erzeugende Material weiter Einheiten umfasst, die zum Binden an ein Rezeptorsystem fähig sind, um eine therapeutische Reaktion zu induzieren.
  11. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Vektoren ausgewählt sind aus Antikörpern; Zell-Adhäsions-Molekülen; Zell-Adhäsions-Molekülrezeptoren; Cytokinen; Wachstumsfaktoren; Peptidhormonen und Stücken davon; nicht-bioaktiven Bindemitteln von Rezeptoren für Zell-Adhäsions-Moleküle, Cytokine, Wachstumsfaktoren und Peptidhormone; Oligonukleotiden und modifizierten Oligonukleotiden; DNA-bindenden Arzneimitteln; Protease-Substraten/Inhibitoren; Molekülen, erzeugt aus kombinatorischen Bibliotheken; kleinen, bioaktiven Molekülen; und Proteinen und Peptiden, die an Zell-Oberflächen-Proteoglykane binden.
  12. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Vektoren eine Affinität für Ziele in einer solchen Stärke besitzen, dass das Mittel mit den Zielen wechselwirkt, aber sich nicht fest daran bindet.
  13. Mittel nach Anspruch 12, bei dem die Vektoren ausgewählt sind aus Liganden für Zell-Adhäsions-Proteine und Zell-Adhäsions-Proteinen, die entsprechende Liganden auf endothelialen Zelloberflächen besitzen.
  14. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Vektor oder die Vektoren derart positioniert sind, dass sie nicht einfach dem Ziel ausgesetzt werden.
  15. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Vektoren an den Reporter mittels Avidin-Biotin- und/oder Streptavidin-Biotin-Wechselwirkungen gekoppelt oder gebunden sind.
  16. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem die Vektoren kovalent oder nicht-kovalent an den Reporter gekoppelt oder gebunden sind.
  17. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem die Vektoren an den Reporter mittels elektrostatischer Ladungs-Wechselwirkung gekoppelt oder gebunden sind.
  18. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, das weiter Einheiten enthält, die radioaktiv sind oder als Röntgen-Kontrastmittel, Licht-Bildgebungssonden oder Spin-Marker wirksam sind.
  19. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter umfassend eine therapeutische Verbindung.
  20. Mittel nach Anspruch 19, bei dem die therapeutische Verbindung ein antineoplastisches Mittel, Blutprodukt, Immunmodulator, Antipilzmittel, Hormon oder Hormon-Analogon, Vitamin, Enzym, antiallergisches Mittel, Gewebefaktor-Inhibitor, Blutplättchen-Inhibitor, Koagulationsprotein-Ziel-Inhibitor, Fibrinbildungs-Inhibitor, Fibrinolyse-Promotor, antiangiogenes Mittel, Kreislauf-Arzneimittel, metabolischer Verstärker, Antituberkulosemittel, antivirales Mittel, Vasodilatator, antibiotisches Mittel, anti-inflammatorisches Mittel, Antiprotozoen-Mittel, antirheumatisches Mittel, Narkotikum, Opiat, Herzglykosid, neuromuskulärer Blocker, Sedativum, lokales Anästhetikum, allgemeines Anästhetikum oder genetisches Material ist.
  21. Mittel nach Anspruch 19 oder 20, bei dem die therapeutische Verbindung kovalent an den Reporter durch Disulfidgruppen gekoppelt oder gebunden ist.
  22. Mittel nach Anspruch 19 oder 20, bei dem eine lipophile oder lipophil derivatisierte therapeutische Verbindung an den Reporter durch hydrophobe Wechselwirkungen gebunden ist.
  23. Kombinierte Formulierung umfassend: i) eine erste verabreichbare Zusammensetzung, umfassend einen Pre-Targeting-Vektor mit einer Affinität für ein ausgewähltes Ziel; und ii) eine zweite verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Mittel einen Vektor mit einer Affinität für den Pre-Targeting-Vektor umfasst.
  24. Kombinierte Formulierung nach Anspruch 23, bei dem der Pre-Targeting-Vektor einen monoklonalen Antikörper umfasst.
  25. Kombinierte Formulierung umfassend: i) eine erste verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 22, und ii) eine zweite verabreichbare Zusammensetzung, umfassend eine Substanz, die zum Entfernen oder Freisetzen des Mittels von seinem Ziel fähig ist.
  26. Kombinierte Formulierung, umfassend: i) eine erste verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Mittel nach Anspruch 21, und ii) eine zweite verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Reduktionsmittel, das fähig ist, die Disulfidgruppen reduktiv zu spalten, die die therapeutische Verbindung und den Reporter in dem Mittel der ersten verabreichbaren Zusammensetzung koppeln oder verbinden.
  27. Verfahren zur Herstellung eines zielbaren diagnostischen und/oder therapeutisch wirksamen Mittels nach Anspruch 1, das umfasst Koppeln oder Binden von mehr als einen Vektor an einen Reporter, umfassend Gas-enthaltendes oder Gas-erzeugendes Material, wobei die Vektoren eine Affinität für verschiedene Ziele auf denselben oder verschiedenen Zelltypen besitzen.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem eine therapeutische Verbindung auch mit dem Reporter kombiniert wird.
  29. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Verwendung als ein zielbares Ultraschall-Kontrastmittel.
  30. Verfahren zum Erzeugen verstärkter Bilder eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Körpers, dem zuvor ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 22 verabreicht worden ist, wobei das Verfahren umfasst Erzeugen eines Ultraschall-, Magnetresonanz-, Röntgenstrahlungs-, radiographischen oder Licht-Bildes mindestens eines Teils des Körpers.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem dem Körper zuvor verabreicht worden ist: i) ein Pre-Targeting-Vektor mit einer Affinität für ein ausgewähltes Ziel; und danach ii) ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Mittel einen Vektor mit einer Affinität für den Pre-Targeting-Vektor umfasst.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, bei dem der Pre-Targeting-Vektor einen monoklonalen Antikörper umfasst.
  33. Verfahren nach Anspruch 31, bei dem dem Körper zuvor verabreicht worden ist: i) ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 18; und danach ii) eine Substanz, die zum Entfernen oder Freisetzen des Mittels von seinem Ziel fähig ist.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, bei dem das Mittel weiter eine therapeutische Verbindung umfasst.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem die therapeutische Verbindung kovalent an den Reporter durch Disulfidgruppen gekoppelt oder gebunden wird, und eine Zusammensetzung, umfassend ein Reduktionsmittel, das zum reduktiven Spalten der Disulfidgruppen fähig ist, nachfolgend verabreicht wird.
  36. Verfahren für eine in-vitro-Untersuchung der Zielsteuerung durch ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 22, bei dem Zellen, die ein Ziel exprimieren, fest in einer Flusskammer positioniert sind, eine Suspension des Mittels in einer Trägerflüssigkeit durch die Kammer läuft und das Binden des Mittels an die Zellen untersucht wird.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem die Fließgeschwindigkeit der Trägerflüssigkeit geregelt wird, um Scher-Raten zu simulieren, die in vivo vorgefunden werden.
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