CZ149599A3 - Diagnostický a/nebo léčebný prostředek - Google Patents

Abstract

Diagnostický a/nebo léčebný prostředek s možností zacíleníje ve vodnémkapalnémnosnémprostředí tvořen suspenzí reportem s obsahemplynu nebo vytvářející plyn, přičemž prostředekje schopen vytvořit nejméně dva typy vazných párů s cílovou strukturou amateriál, obsahující nebo vytvářející plynje konjugován s nejméně dvěmavektory nebo sjednímvektorem, schopnýmvazby na nejméně dvě vaznámísta

Description

Oblast techniky

Vynález se týká diagnostických a/nebo léčebných prostředků, zvláště takových, které obsahují skupiny s afinitou pro místa a/nebo struktury v organismu, takže mohou zlepšit podmínky při diagnostickém zobrazování a/nebo při léčebných zákrocích v organismu. Vynález se zvláště týká zlepšených diagnostických prostředků pro zobrazování ultrazvukem.

Dosavadní stav techniky

Je známoj že zobrazování ultrazvukem je diagnosticky velmi cenné například při sledování cévního systému, zejména v kardiografii a při sledování zásobení tkání. Byla již navrhována celá řada kontrastních prostředků za účelem zvýraznění takto získaného obrazu včetně suspenzí pevných částic, emulgovaných kapalných částic, bublinek v plynu a zapouzdřených plynů nebo kapalin. Obecně je uznáváno, že kontrastní prostředky s nízkou hustotou, které jsou snadno stlačitelné jsou zvláště účinné při odrazu zvuku. Z tohoto důvodu je věnován velký zájem přípravě systémů, které obsahují plyn nebo které plyn vytvářejí.

Je také známo, že kontrastní prostředky s obsahem plynů je možno využít i při zobrazování pomocí magnetické rezonance MR, například jako kontrastní prostředky, které sníží intanzitu signálu MR. Potenciálně použitými kontrastními látkami pro paramagnetickou MR jsou také prostředky s obsahem kyslíku.

Mimoto bylo při zobrazování pomocí rtg-záření pozorováno, že je možno použít plyny, například oxid uhličitý,

jako negativní perorální kontrastní prostředky nebo jako nitrožilně podávané kontrastní prostředky.

Použití radioaktivních plynů, například radioaktivních isotopů inertních plynů, například xenonu bylo rovněž navrhováno pro sclntigrafii, například při zobrazování cév.

Cílené kontrastní prostředky pro zobrazování ultrazvukem jsou takové prostředky, které obsahují i) reportérovou skupinu, schopnou interakce se zvukovými vlnami za vzniku rozlišitelného signálu, ii) jeden nebo větší počet vektorů s afinitou pro určité cílové místo a/nebo cílovou struktu ru v organismu, například pro specifické buňky nebo pathologicky změněné oblasti a iii) nejméně jeden spojovník, spojující reportérovou skupinu a vektor nebo vektory v případě, že nejsou spojeny přímo.

Molekuly a/nebo struktury, na něž se má kontrastní pro středek vázat, jsou označovány jako cílové struktury. Aby by lo možno specificky zobrazit určitou vybranou oblast nebo strukturu v organismu, musí být v této oblasti přítomna cílová struktura pro tento prostředek. V ideálním případě dochází k expresi takové struktury pouze v oblasti, která má být zobrazena, obvykle však bude taková struktura přítomna i jinde v organismu, čímž mohou vznikat problémy. Cílová struktura může být tvořena definovaným druhem cílových molekul nebo neznámými molekulami nebo složitější strukturou, přítomnou v oblasti zobrazování a má se specificky nebo selektivně vázat na molekulu použitého vektoru.

Vektor je spojen s reportérovou skupinou tak, aby se tyto skupiny mohly vázat na zobrazenou oblast nebo strukturu Vektor se může specificky vázat na cílovou strukturu nebo se váže pouze selektivně a může mít afinitu také pro omezené množství jiných molekul nebo struktur, čímž opět vznikají problémy.

• · · · · · • 0 • · · ·

-3 Existuje omezené množství údajů, které se týkají známých kontrastních prostředků pro cílené zobrazování ultrazvukem. Například US 5 531 980 popisuje systémy, v nichž reportér je tvořen vodnou suspenzí mikrobublinek vzduchu nebo plynu, stabilizovanou nejméně jedním smáčedlem, vytvářejícím film a přítomný alespoň z části v lamelární nebo laminární formě, přičemž toto smáčedlo je vázáno na jeden nebo větší počet vektorů, tvořených bioaktivními materiály pro specifické zacílení prostředku. Uvádí se, že mikrobublinky nejsou přímo zapouzdřeny ve smáčedle, nýbrž smáčedlo se spíše nachází v liposomech, naplněných kapalinou, které stabilizují mikrobublinky. Je zřejmé, že lamelární nebo laminární smáčedlo, například fosfolipid bude nezbytně přítomno ve formě jedné nebo většího počtu lipidových dvojvrstev s lipofilními zakončeními a hydrofilním koncem na opačné straně, jak je popsáno v Schneider Μ., Liposomes as drug carriers: 10 years of research, Drug targeting, Nyon, Švýcarsko, 3. až 5. října 1984, Buri P. a Gumma A., (ed.), Elsevier, Amsterdam 1984.

V EP 727 225 se popisuje cílené kontrastní činidlo pro zobrazování ultrazvukem, v němž je reportér tvořen chemickou látkou s dostatečným tlakem par, takže část této látky se nachází při teplotě organismu ve formě plynu. Tato chemická látka je spojena s nosičem typu smáčedla nebo albuminu, jako vektor je použita molekula typu bílkoviny, peptidů nebo uhlohydrátů. Receptorové skupiny v těchto kontrastních látkách odpovídají posunu fáze koloidních systémů, popsanému v mezinárodní přihlášce WO 94/16 739. Nyní bylo zjištěno, že při podávání koloidů s posunem fáze může dojít ke vzniku mikrobublinek, které mohou neřízené růst do té míry, že dojde k nebezpečné embolizaci například v srdečních nebo mozkových cévách, jak bylo popsáno v Schwarz, Advances in Echo-Contrast, 1994, (3), str. 48 až 49.

• · • · • ·

- 4 • ······ · ··· ··· ·· ·· ·· ··

V mezinárodní patentové přihlášce WO 93/20 802 se navrhuje dosáhnout zlepšení obrazu při zobrazování ultrazvukem s použitím oligolamelárních liposomů, konjugovaných se specifickými vaznými látkami pro určité tkáně, například protilátkami, peptidy, lektiny a podobně pro lepší odraz zvuku. Liposomy se volí tak, aby byly prosté plynu a neměly tedy výhodné echogenní vlastnosti. Další údaje o této technologii, například při zacílení na fibrin, thromby a atherosklerotické oblasti je možno nalézt v publikacích Alkanonyuksel H. a další, J. Pharm. Sci., 1996, 85(5), 486 až 490, J. Am. Coll. Cardiol., 1996,27(2) Suppl. A, 298A a Circulation, 68 Sci. Sessions, Anaheim 13. až 16. listopadu 1995.

Existuje také řada publikací, týkajících se kontrastních prostředků k zobrazování ultrazvukem a uvádějících možnost použití monoklonálních protilátek jako vektorů, aniž by však byly uváděny praktické podrobnosti a/nebo reportérové materiály, které by mohly být přijímány retikuloendotheliálním systémem a tak umožnit zlepšené zobrazování některých orgánů, například jater. Tyto údaje byly uvedeny zejména ve WO 93/00933, WO 94/01140, WO 94/08627, WO 94/28874, US č.

088 499, US 5 348 016 a US 5 469 854. V těchto publikacích mají cílené kontrastní prostředky zlepšit kontrast na specifických místech organismu, například v nádorových buňkách použitím vektoru, který se silně váže na jedno cílovou strukturu a koncentruje se v ní. Na rozdíl od tohoto principu použití jediného vektoru s vysokou afinitou pro jediný cíl by měl být vynález z části založen na poznatku, že je možno získat diagnostické a/nebo léčebné prostředky s příznivějšími vlastnostmi při použití různých interakcí mezi vektorem a cílovou strukturou. Mělo by například možno použít prostředky s větším počtem různých vektorů a/nebo s vektory s afinitou pro různé cílové struktury u buněk téhož nebo odlišných typů. Vazby diagnistického a/nebo léčebného prostředku s obsahem • · • · · · • ·

plynu nebo tvořícího plyn je například možno dosáhnout tvorbou mnohočetných vazných párů mezi jediným vektorem se specifičností pro více než jeden receptor nebo mezi více než jedním vektorem s afinitou pro jeden nebo více typů cílových struktur při vysoké nebo nízké afinitě. Taková mnohočetná vaz ba prostředku, konjugovaného s vektorem na jednu nebo větší počet cílových struktur může mít za následek velmi výhodné zacílení například zvýšením specifičnosti pro cílovou strukturu a/nebo možností rozeznat interakce v požadované cílové oblasti od pozadí s menším množstvím struktur, podobných cílové struktuře kdekoliv v organismu.

Je známo použít vazbu vektoru s vysokou afinitou pro jednu cílovou strukturu. Vynález je však založen na zjištění, že požadované vazby diagnostických a léčebných prostředků s obsahem plynu nebo tvořících plyn je možno dosáhnout tvorbou mnohočetných vazných párů při nízké afinitě mezi jedním typem vektoru a jedním typem cílové struktury nebo tvorbou mnohočetných vazných párů mezi jedním nebo více typy vektoru a jedním nebo více typy cílové struktury při nízké nebo vysoké afinitě. Tato mnohočetná vazba prostředku, konjugovaného s vektorem na jednu nebo větší počet cílových molekul nebo struktur může být výhodným způsobem zacílení například zvýšením specifičnosti cílové struktury a/nebo odlišení interakce v určité cílové oblasti od pozadí s nižším obsahem struktur, podobných cílové struktuře kdekoliv v organismu.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří diagnostický a/nebo léčebný prostředek s možností zacílení, například kontrastní prostředek pro zobrazování ultrazvukem, prostředek je tvořen suspenzí ve vodné nosné kapalině, například pro injekční podání, obsahující materiál s obsahem reportéru a plynu nebo tvořícího plyn, přičemž tento prostředek vytváří nejméně • · • · • ·

- 6 BBB · Β · ΒΒΒΒ • ΒΒΒ Β ΒΒΒΒ Β ΒΒ · • ΒΒΒ Β Β Β Β ΒΒΒ ·ΒΒ

Β Β Β Β Β Β Β Β • ΒΒΒ ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ dva typy vazných párů, například konjugované na nejméně dva vektory nebo na jeden vektor, schopný se vázat na nejméně dvě vazná místa.

V jednom z výhodných provedení vynálezu je prostředek založen na dalším zjištění, že omezené přilnutí k cílovým strukturám je velmi vhodnou vlastností diagnostických a/nebo léčebných prostředků, přičemž této vlastnosti je možno dosáhnout při použití vektorů, které jsou schopné dočasné vazby spíše než trvalé fixace na cílovou strukturu. To znamená, že takové prostředky nejsou fixně vázány na specifických místech, nýbrž může jít například o zpomalený průchod podél cévního endothelu vzhledem k přechodné interakci s buňkami této struktury. Takové prostředky se tedy mohou koncentrovat u stěn krevních cév a mohou zlepšit zobrazování těchto cév v určitých orgánech. Tímto způsobem může dojít ke zlepšenému zobrazení kapilárního systému a tím k usnadnění rozlišení mezi normální a nedostatečně zásobenou tkání, například v srdečním svalu a mimoto může také jít ke zviditelnění některých struktur, jako jsou Kupfférový buňky, thromby, atherosklerotická poškození nebo oblasti zánětlivé tkáně a tkáně s nově vytvořenými cévami v případě nádoru. Prostředek podle vynálezu je také schopen zobrazit změny cév, k nimž dochází v oblasti nekrosy tkáně.

Je zřejmé, že afinita vazby závisí na počtu interakcí i na síle těchto interakcí. Je proto možné volit hustotu molekul vektoru na povrchu reportérových jednotek tak, aby byl upraven příslušný stupeň interakce mezi prostředkem a cílovou strukturou.

Pojem mnohočetné specifičnosti je užíván také k popisu injekční nosné kapalině pro materiál s obsahem plynu nebo tvořící plyn a složený z jednoho nebo většího počtu vektorů se specifičností pro jeden nebo větší počet receptorů • · · · • · · · • · Β · na povrchu buněk a současně s obsahem druhého prvku se specifičností vazby na substrát nebo receptorový systém, na němž vyvolává léčebnou odpověH. Do rozsahu vynálezu tedy spadají prostředky pro zobrazování s vícenásobnou specifičností, tvořenou vektorem pro zacílení prostředku, například protilátkou proti fibrinu podle publikace Lanza a další, Circulation, 1996, 94 (12), str. 3334 annexinem V jako peptidem, schopný vazby na atherosklerotické pláty, například YRALVDTLK nebo jiným vektorem, o němž je známo, že se váže na sraženiny fibrinu, v kombinaci s chemickou látkou nebo enzymem s fibrinolytickým účinkem, například streptokinázou, aktivátorem plasminogenu tPA, urokinázou uPA nebo prourokinázou scuPA, čímž je možno dosáhnout místního léčebného antithrombotického účinku. Vynález zahrnuje také vektory se zvýšenou specifičností pro nádorové buňky v kombinaci s vektory nebo molekulami chemických látek, schopných vyvolat inhibici nádorového růstu.

Je známo, že k expresi celé řady a možná všech cílových molekul nedochází výlučně na cílových místech. Běžně dochází k tomu, že exprese těchto molekul je vysoká u cílových buněk, avšak současně dochází k nižší úrovni exprese těchto látek kdekoliv v organismu. Použití reportérů, nesoucích větší počet vektorů s poměrně nízkou afinitou pro cílovou strukturu může být v této situaci výhodné vzhledem k tomu, že reportér bude mít tendenci se koncentrovat v oblastech s vysokou hustotou cílových struktur, což dovolí mnohočetnou a tedy silnou vazbu na reportér, může jít například o prostředek s obsahem plynu, obsahující vektor pro kyselinu listovou a glutathion k zajištění mnohočetné specifické vazby na receptory kyseliny listové a receptory glutathion-S-transferázy, k jejichž vysoké expresi dochází u nádorových buněk. Na druhé straně oblasti s nízkou hustotou cílových struktur nezajistí dostatečnou interakci s vektory s nízkou afinitou vazby na cílovou strukturu. V těchto

99

999 9 · 9 9999

9999 9 9999 9 99 9

999 99 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 ·· ·9 ··

- 8 provedeních vynálezu mají vektory s nízkou afinitou asociační konstantu K pro Interakci s cílovou molekulou nebo struka Q turou nižší než 10° M ^x, například nižší než 10⁷ Μ , s vý6 —1 hodou nižší než 10 M^_ . Další provedení podle vynálezu je tedy založeno na zjištění, že požadované vazby diagnostického a/nebo léčebného prostředku s obsahem plynu nebo tvořícího plyn je možno dosáhnout tvorbou vazných párů s nízkou afinitou mezi více než jedním typem vektoru a více než jedním typem cílové struktury. Ke zvýšení specifičnosti je tedy možno použít vícenásobných vektorů tak, že se reportér bude vázat pouze na cílové buňky nebo struktury, u nichž dochází k expresi určité kombinace cílových molekul.

Může také být užitečné volit řadu vektorů, schopných se vázat na určité části, například epitopy cílové struktury za vzniku vyšší vazné síly. To může být zvláště výhodné při malé hustotě cílových struktur.

S výhodou je možno užít výrobky, obsahující dva nebo více vektorů s různou specifičností, to znamená se schopností vazby na odlišné cílové molekuly různých buněk, tímto způsobem je možno zajistit detekci například různých forem zhoubných nádorů. Zejména je možno zajistit detekci metastáz, které jsou často heterogenní, pokud jde o expresi cílových molekul, zvláště antigenů.

Podle vynálezu bude reporterová jednotka obvykle stále vázána na vektory. U jiného typu cílení, který se někdy nazývá předběžné cílení, se vektor, často monoklonální protilátka, podává samostatně a pak se podá reportér, vázaný na skupinu, schopnou specifické vazby na molekulu vektoru, například v případě, že vektor je protilátka, může být reportér vázán na molekulu, schopnou vazby na imunoglobulin, například bílkovinu A nebo protilátku proti imunoglobulinu. Výhoda • · φφφφ ·· φ φ φ φ ·· • φ φ φ φ · «φφφ φφφφ · φ φφφ φ φφ φ φ φφφ φφ φφ φφφ φφφ φ ΦΦΦΦΦ φ φ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφ

- 9 tohoto postupu spočívá v tom, že je k dispozici dostatek času pro odstranění molekul vektoru, nenavázaných na cílové struktury, čímž je možno podstatně zmenšit problémy, spojené s pozadím, které vznikají zejména v přítomnosti přebytku kon jugátu reportéru a vektoru. I v souvislosti s vynálezem je možno použít předběžné cílení při použití specifického vektoru, následovaného podáním reportérových jednotek, vázaných na další vektor a na skupinu, která se váže na první vektor.

V některých případech a zvláště pri stanovení stupně prokrvení v určitých oblastech, zvláště v srdečním svalu je zapotřebí měřit rychlost, s níž se kontrastní prostředek váže na cílovou strukturu nebo se z ní uvolní. Toho je možno dosáhnout řízeným způsobem podávání vektoru nebo jiného činidla, schopného nahradit nebo uvolnit kontrastní činidlo z cílové struktury.

Vektory, použitelné podle vynálezu zahrnují vazné látky pro bílkoviny, schopné lnout k buněčným stěnám, tyto bílkoviny jako takové a podobně. Jako příklady bílkovin schopných přilnout k buňkám je možno uvést integriny, z nichž se většina váže na sekvenci aminokyselin Arg-Gly-Asp, RGD. V případě potřeby je možno vektor zacílit na specifické bílkoviny tohoto typu, k jejichž expresi dochází převážně na akti vovaných endotheliálních buňkách, tak jak se vyskytují v místě zánětu nebo jiné pathologické odpovědi. Další použitelné vektory zahrnují bílkoviny a peptidy, schopné se vázat na proteoglykany povrchu buněk, které jsou komplexy bílkovin a sulfatovaných polysacharidu a vyskytují se u většiny buněk včetně endothelu. Proteoglykany přispívají k negativnímu povrchovému náboji všech buněk s jádry u obratlovců. Tento náboj j^e podle vynálezu možno využít použitím pozitivně nabitých vektorů, například obsahujících kationtové lipidy, které mohou vstoupit do elektrostatické interakce s povrchem endotheliálních buněk.

• *

- 10 • · · 0-0 · » · · · • · · · · 0··· · 0 · · • ··· · · · · ······ • · · · · · · · ···· ··· ·· ·· ·· ··

Podle dalšího provedení vynálezu může být vektor připojen k reportéru nebo nekovalentně spojen s reportérem tak, že vektor není okamžitě dostupný pro cílové struktury nebo receptory. Zvýšené specifičnosti pro tkáně je tedy možno dosáhnout použitím dalšího postupu spřístupnění vektoru, například je možno prostředek po podání vystavit působení zevního ultrazvuku ke změně difuzibility skupin, obsahujících vektor.

Reportér může mít jakoukoliv vhodnou formu, může jít o jakoukoliv kontrastní látku, obsahující nebo vytvářející plyn. Jako příklad je možno uvést mikrobublinky plynu, stabilizované, například alespoň částečně zapouzdřené povrchovou membránou například z želatiny podle WO 80/02365, dále může jít o bílkovinu, schopnou vytvořit film, jako albumin, například lidský sérový albumin, popsaný například v US 4 718 433, US 4 774 958, US 4 844 882, EP 359 246, WO 91/12 823, WO 92/05 806, WO 92/17 213, WO 94/06 477 nebo WO 95/01 187, dále o polymerní materiál, například syntetický biologicky degradovatelný polymer podle EP 398 935, o elastickou syntetickou polymerní membránu podle EP 458 745, o biologicky degradovatelný polyaldehyd ve formě mikročástic podle EP 441 468 o mikročásticový derivát N-dikarboxylové kyseliny s polyaminokyselinou nebo polycyklickým imidem podle EP 458 079, biologicky degradovatelný polymer podle WO 93/17 718 nebo WO 96/07 434, dále může jít o nepolymerní a nepolymerovatelný materiál pro tvorbu stěn, popsaný například ve WO 95/21 631, o smáčedlo, například sledový kopolymer polyoxyethylenu a polyoxypropylenu, například typu Pluronic, o polymerní smáčedlo podle WO 95/06 518 nebo o smáčedlo, schopné vytvářet film, jako fosfolipid, popsaný například ve WO 92/11 873,

WO 92/17 212, WO 92/22 247, WO 94/28 780 nebo WO 95/03 835.

- 11 ·· ·· » · · » · · · · > « · 4

Dalšími použitelnými kontrastními prostředky s obsahem plynu jsou pevné systémy, obsahující plyn, například mikročástice a zvláště shluky mikročástic se zapouzdřeným plynem nebo jinak spojenými s plynem, například adsorbovaným plynem na povrchu částic a/nebo obsaženým v dutinách nebo pórech, například podle EP 122 624, EP 123 235, EP 365 467, WO 92/21 382, WO 93/00930, WO 93/13 802, WO 93/13808 nebo WO 93/13 809. Je zřejmé, že echogenita takových mikročásticových prostředků je přímo odvozena od obsaženého plynu nebo od plynu, například v mikrobublinkách, uvolněného z pevného materiálu například po rozpuštění mikročástic.

Mikrobublinky plynu a mikročástice dalších materiálů, obsahujících plyn mají s výhodou počáteční střední průměr nejvýše 10 mikrometrů, například 7 mikrometrů nebo nižší tak, aby mohly volně procházet plicním systémem, například po podání nitrožilní injekcí.

V případě, že se podle vynálezu podávají prostředky s obsahem fosfolipidů, například ve formě mikrobublinek plynu, stabilizovaných fosfolipidem, je možno jako příklady fos£olipidů uvést lecithiny, to znamená fosfatidylcholiny, jako přírodní lecithiny z vaječného žloutku nebo sojových bobů a syntetické nebo polosyntetické lecithiny jako jsou například dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin nebo distearoylfosfatidylcholin, fosfatidové kyseliny, fosfatidylethanoaminy, fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, cardiolipiny, sfingomyeliny, fluorované analogy svrchu uvedených látek a směsi uvedených látek s dalšími lipidy, například s cholesterolem. Použití fosfolipidů, které převážně, to znamená nejméně ze 75 % obsahují molekuly, nesoucí náboj, například negativní náboj, například přírodně se vyskytující sojové nebo vaječné fosfolipidy, semisyntetické, například částečně nebo plně hydrogenované a syntetické fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidyl4 4 4 4

4 4 4

4 4 4

- 12 ·· 4444 44 44

4 4 4 4 4

4444 4 4444 inositoly, fosfatidové kyseliny a/nebo cardlollpiny může být zvláště výhodné.

Jako příklady dalších lipidů, které je možno využít pro přípéravu kontrastních prostředků s obsahem plynu je možno uvést mastné kyseliny, kyselinu stearovou, kyselinu palmitovou, kyselinu 2-n-hexadecylstearovou, kyselinu olejovou a další kyseliny, obvykle obsažené v lipidových strukturách. Tyto lipidové struktury jsou zvláště zajímavé v tom případě, že jsou vázány amidovou vazbou na aminokyseliny, které obsahuji jednu nebo větší počet aminoskupin. Výsledné aminokyseliny, modifikované lipidem, například dipalmitoyllysin nebo kyselina distearoyl-2,3-diaminopropionová jsou považovány za cenné prekursory pro vazbu na vazná místa a konjugaci s jedním nebo větším počtem molekul vektoru.

Další provedení vynálezu se týká výroby lipopeptidových struktur, které obsahují lipidový reportér, vázaný na spojovníkovou část, například PEG, polyaminokyselinu, alkylhalogenid a podobně. Spojovník je při tom opatřen funkčními skupinami pro zajištění vazby na jednu nebo větší počet molekul vektoru. Zvláště výhodné je zařazení spojovníkového prvku, nesoucího kladný náboj, například může jít o dva nebo větší počet lysinových zbytků pro zakotvení reporterového prvku v mikrobublinkách elektrostatickou interakcí s negativně nabitou membránou. Mnohocetného specifického zacílení je možno dosáhnout míšením a dopováním fosfolipidových struktur s obsahem plynu s jednou nebo větším počtem cílených lipopeptidových sekvencí. Vícenásobné specifičnosti je možno dosáhnout také tak, že se na rozvětvený lysin jako na jádro naváže více než jeden vektor, například podle publikace Tam a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1989, 86, 9084 nebo tak, že se začlení větší počet vektorů do lineární sekvence. Mnohonásobné specifičnosti je možno dosáhnout také

- 13 při použití lipopepticů nebo fosfolipidů s kombinačními baňkami, syntetizovaných chemickou syntézou podle publikace Lowe, Combinatorial Chemistry, Chemical Society Reviews, 1995, 309 až 317.

Do rozsahu vynálezu spadají také mikrobublinky s obsahem funkčních skupin, které nesou jednu nebo větší počet reaktivních skupin pro nespecifickou reakci s molekulami receptoru, uloženými na povrchu buněk. Mikrobublinky s obsahem thiolové skupiny se například mohou vázat na receptory na povrchu buněk výměnou disulfidu. Reverzibilní povaha této kovalentní vazby znamená, že proud bublinek je možno řídit změnami redox potenciálu v okolí. Podobně aktivované mikrobublinky s membránami s obsahem aktivních esterů, například N-hydroxysukcinimidových esterů je možno využít k modifikaci aminoskupin, nacházejících se na povrchu celé řady buněk.

Jako příklady materiálů ve formě mikročástic s obsahem plynu, použitelných pro účely vynálezu je možno uvést uhlohydráty, například hexosy, jako je glukosa, fruktosa nebo galaktosa, disacharidy, jako jsou sacharosa, laktosa nebo maltosa, pentosy, jako je arabinosa, xylosa nebo ribosa, alfa-, beta- a gamma-cyklodextriny, pólysacharidy, jako jsou škrob, škrob s obsahem hydroxyethylových skupin, amylosa, amylopektin, glykogen, inulin, pulullan, dextran, karboxymethyldextran, dextranfosfát, ketodextran, aminoethyldextran, algináty, chitin, chitosan, kyselina hyaluranová nebo heparin a také alkoholy, odvozené od cukrů, například alditoly, jako mannitol nebo sorbitol, anorganické soli, například chlorid sodný, organické soli, jako citronan sodný, octan sodný nebo vinan sodný, rtg-kontrastní látky, například běžně dodávané kontrastní látky na bázi karboxylových kyselin a amidů neiontového typu, typicky obsahující nejméně jednu2,4,6-trijodfenylovou skupinu, obsahující další substituenty, jako jsou karboxylová skupina, karbamoyl, N-alkyl• · φ φ

- 14 φφ φφφφ • · ΦΦΦ· φφ φφ φφ • φ · « φ φφφφ φ φφφφφ φ φ φφ φφ φφ φφ karbamoyl, N-hydroxyalkylkarbamoyl, acylaminoskupina, Ν-alkylacylaminoskupina nebo acylaminomethyl v poloze 3 a/nebo 5, jde tedy o metrizovou kyselinu, diatrizovou kyselinu, jodthalamovou nebo ioxaglovou kyselinu, iohexol, iopentol, iopamidol, iodixanol, iopromid, metrisamid, iodipamid, megluminiodipamid, megluminacetrizoát a meglumindiatrizoát, dále může jít také o polypeptidy a bílkoviny, jako jsou želatina nebo albumin, například lidský sérový albumin.

V kontrastních prostředcích podle vynálezu může být obsažen jakýkoliv biokompatibilní plyn. Pod tímto pojmem se v průběhu přihlášky rozumí jakákoliv látka včetně směsí látek, které jsou v podstatě nebo úplně v plynné formě včetně formy par při běžné teplotě lidského organismu, 37 °C. Plynem tedy může být například vzduch, dusík, kyslík, oxid uhličitý, vodík, inertní plyn, jako helium, argon, xenon nebo krypton, fluorid sírový, jako hexafluorid sírový, dekafluorid dvojsírový nebo pentafluorid trifluormethylsíry, fluorid selenový a případně halogenované silany, jako methylsilan nebo dimethylsilan, uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností, například o až 7 atomech uhlíku, například alkany, jako methan, ethan, propan, butan nebo pentan, cykloalkany, jako cyklopropan, cyklobutan nebo cyklopentan, alkeny, jako ethylen, propen, propadien nebo buten nebo alkiny, jako acetylen nebo propin, ethery, jako dimethylether, ketony, estery, halogenované uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností, například až o 7 atomech uhlíku, nebo může jít o směs svrchu uvedených látek. S výhodou jsou alespoň některými atomy halogenu v halogenovaných plynech atomy fluoru. Biologicky kompatibilní halogenované uhlovodíky je možno volit například ze skupiny: bromchlordifluormethan, chlordifluormethan, dichlordifluormethan, bromtrifluormethan, chlortrifluormethan, chlorpentafluorethan, dichlortetrafluorethan, chlortrifluorethylen, fluorethylen, ethylfluorid, 1,1-difluorethan a také perfluorované uhlovodíky, například perfluoralkany, jako jsou • ft ···· ftft ·· ·· ·· • · · ftftft « ·· · • ··· · · ft·* · » * ·

- 15 • · · · · · · • ft ftft ftft ·· perfluormethan, perfluorethan, perfluorpropany, perfluorbutany, například perfluor-n-butan, popřípadě ve směsi s dalšími isomery, například s perfluorisobutanem, perfluorpentany, perfluoralkeny, například perfluorpropen, perfluorbuteny, například perfluorbut-2-en a perfluorbutadien, perfluoralkiny, jako perfluorbut-2-in a perfluorcykloalkany, například perfluorcyklobutan, perfluormethylcyklobutan, perfluordimethylcyklobutany, perfluortrimethylcyklobutany, perfluorcyklopentan, perfluormethylcyklopentan, perfluordimethyl cyklopentany, perfluorcyklohexany, perfluormethylcyklohexan a perfluorcykloheptan. Další halogenované plyny zahrnují methylchlorid, fluorované, například perfluorované ketony, jako jsou perfluoraceton a také fluorované, například perfluorované ethery, jako perfluordiethylether. Použití perfluorovaných plynů, například fluoridu sírového a perfluorovaných uhlovodíků, například perfluorpropanu, perfluorbutanu a perfluorpentanu, může být zvláště výhodné vzhledem k uznávané vysoké stálosti mikrobublinek s obsahem těchto plynů v krevním řečišti.

Reportér je možno připravit jakýmkoliv vhodným způsobem pro výrobu prostředků s obsahem plynu nebo prostředku, vytvářejících plyn. Jako příklad je možno uvést přípravu suspenze mikrobublinek plynu tak, že se uvede do styku smáčedlo a plyn, a tyto složky se mísí v přítomnosti vodného nosného prostředí způsobem podle mezinárodní patentové přihlášky WO 91/15 244, nebo se atomizuje roztok nebo disperze materiálu pro tvorbu stěn v přítomnosti plynu k získání dutých mikrokapslí způsobem podle EP 512 693, nebo se připraví pevné mikrokuličky dvojitým emulgováním podle US 5 648 095 nebo se vytvoří duté mikrokapsle sušením rozprašováním podle EP 681 843, nebo se připraví liposomy, vyplněné plynem třepáním vodného roztoku s obsahem lipidu v přítomnosti plynu podle US 5 469 854.

9*99

- 16 • 9 99

9 9

9 999 • 9 9 9

9 9 9

99

9 9 9 » 9 9 9 • 9 9 · ··* 9 9 9 9

9 « ·

Vhodným způsobem spojení požadovaného vektoru k reportéru je například modifikace povrchu předem připraveného reportéru při použití vhodného spojovníku a reaktivních skupin na povrchu reportéru i vektoru. Může být zvláště výhodné fyzikálně smísit reporterový materiál s materiálem, obsahujícím vektor v jakémkoliv stupni postupu. Takový postup povede k začlenění nebo k vazbě vektoru na reportér. Po ukončení postu pu je popřípadě možno odstranit přebytek vektoru, nenavázaný na reportér promytím částic s obsahem plynu po jejich oddělení, například flotaci. Ve výhodném provedení se užijí lipopep tidové struktury s funkčními skupinami, například thiolovými skupinami, maleimidovými skupinami nebo zbytky biotinu a podobně, tyto látky je možno popřípadě předem smísit s dalšími reportérovými molekulami před tvorbou výsledného prostředku s obsahem plynu. Spojeni molekul vektoru je možno uskutečnit při použití spojovníků, které budou dále uvedeny.

Vazba reportérové jednotky na požadované vektory se pro vádí kovalentním nebo nekovalentním způsobem a obvykle zahrnuje interakci s jednou nebo větším počtem funkčních skupin, uložených na reportéru a/nebo na vektorech. Jako příklad chemicky reaktivních funkčních skupin, vhodných k tomuto účelu je možno uvést aminoskupiny, hydroxylové, sulfhydrylové, karboxylové a karbonylové skupiny a také zbytky uhlohydrátů, dioly s hydroxyskupinami na sousedních atomech uhlíku, thioethery, 2-aminoalkoholy, 2-aminothioly, guanidinyl, imidazolyl a fenolové skupiny.

Kovalentní vazba reportéru a vektorů může tedy být usku tečněna při použití vazných činidel, obsahujících reaktivní skupiny, schopné reakce s uvedenými funkčními skupinami. Jako příklady reaktivních skupin, schopných reakce se sulfhydrylovými skupinami je možno uvést alfa-halogenacetylové ·· BBBB BB »· ·· BB

BBB · · · · * » · • BBB · · ··· · · · · • ··· · · · · BBB ··· • BBBBB · ·

ΒΒΒΒ ··· BB ·· ·· ··

- 17 sloučeniny typu X-CH^CO-, kde X znamená atom bromu, chloru nebo jodu, tyto látky mají zvláštní reaktivitu pro sulfhydrylové skupiny, je však možno je použít také k modifikaci imidazolylových skupin, thioetherových skupin, fenolových skupin a aminoskupin podle publikace Gurd F.R.N., Methods Enzymol., 1967, 11, 532. N-maleimidové deriváty se rovněž považují za selektivní látky pro sulfhydrylové skupiny, mimoto je však v některých případech možno je za určitých podmínek použít pro vazbu na aminoskupiny. N-maleimidy je možno začlenit do vazných systémů pro konjugaci reportéru a vektorů způsobem podle publikace Kitagawa T. a další, Chem. Pharm. Bull., 1981, 29, 1130 nebo mohou být použity k zesítění polymerů ke stabilizaci bublinek způsobem podle publikace Kovacic P. a další, J. Am. Chem. Soc., 1959, 81, 1887. Reakční činidla typu 2-iminothiolanu, popsaná například v publikaci Traut R. a další, Biochemistry, 1973, 12, 3266, která zavádějí thiolovou skupinu přes přeměnu aminoskupiny je možno považovat za reakční činidla pro sulfhydrylové skupiny v případě, že k vazbě dochází tvorbou disulfidových můstků. To znamená, že jsou použitelná reakční činidla, sloužící k zavedení reaktivních disulfidových vazeb do reportéru nebo vektoru vzhledem k tomu, že k tvorbě dochází výměnou disulfidu mezi vektorem a reportérem. Jako příklady vhodných reakčních činidel je možno uvést Ellmanovo reakční činidlo DTNB, 4,4^x-dithiodipyridin, methyl-3-nitro-2-pyridyldisulfid a methyl-2-pyridyldisulfid, popsané v publikaci Kimura T. a další, Analyt. Biochem., 1982, 122, 271.

Jako příklady reaktivních skupin, schopných reakce s aminoskupinami je možno uvést alkylační a acylační činidla.

Z alkylačních činidel je možno uvést například látky z následujících skupin:

i) alfa-halogenacetylové sloučeniny se specifičností vzhle dem k aminoskupinám v nepřítomnosti reaktivních thiolových ·· 0000

0

0

skupin typu X-CH^CO-, kde X znamená atom chloru, bromu nebo jodu, tak jak byly popsány například v publikaci Wong Y.H.H., Biochemistry, 1979, 24, 5337, ii) N-maleimidové deriváty, které mohou reagovat s aminoskupinami reakcí Michaelova typu nebo acylací na karbonylové skupině kruhu způsobem podle publikace Smyth D. G. a další,

J. Am. Chem. Soc., 1960, 82, 4600 a Biochem. J., 1964, 91, 589, iii) arylhalogenidy, například reaktivní nitrohalogenaromatické sloučeniny, iv) alkylhalogenidy, například popsané v publikaci McKenzie J. A. a další, J. Protein Chem., 1988, 7, 581,

v) aldehydy a ketony, schopné tvorby Schiffovy baze s aminoskupinami, přičemž adiční produkty jsou obvykle stabilizovány redukcí za vzniku stálého aminu, vi) epoxidové deriváty, například epichlorhydrin a bisoxirany, které mohou reagovat s aminoskupinami, sulfhydrylovými skupinami nebo fenolovými hydroxyskupinami, vii) deriváty s-triazinů s obsahem chloru, které jsou velmi reaktivní vzhledem k nukleofilním skupinám, jako je aminoskupina, sulfhydrylová skupina a hydroxyskupina, viii) aziridiny na bázi svrchu uvedených s-triazinových sloučenin, popsané například v publikaci Ross W.C.J., Adv. Cancer Res., 1954, 2, 1, které reagují s nukleofily, například aminoskupinami za otevření kruhu, ix) diethylestery kyseliny squarové, popsané v publikaci Tietze L. F., Chem. Ber., 1991, 124, 1215 a

x) alfa-halogenalkylethery, které jsou reaktivnějšími alkylačními činidly než normální alkylhalogenidy vzhledem k aktivaci, způsobené přítomností atomu kyslíku etherové skupiny,

Β Β ΒΒΒΒ

Β ·

- 19 tyto látky byly popsány v publikaci Benneche T. a další, Eur. J. Med. Chem., 1993, 28, 463.

Jako příklady aminoreaktivních acylačních činidel je možno uvést:

i) isokyanáty a isothiokyanáty, zvláště aromatické deriváty, tvořící stálé deriváty močoviny a thiomočoviny a obvykle užívané pro zesítění bílkovin podle publikace Schick A. F.

a další, J. Biol. Chem., 1961, 236, 2477, ii) sulfonylchloridy, popsané v publikaci Herzig D. J. a další, Biopolymers, 1964, 2, 349, použitelné pro zavedení fluorescenční reportérové skupiny do spojovníku, iii) halogenidy kyselin, iv) aktivní estery, například nitrofenylestery nebo N-hydroxysukcinimidylestery,

v) anhydridy kyselin, například směsné nebo symetrické anhydridy nebo N-karboxyanhydridy, vi) další činidla, použitelná pro tvorbu amidové vazby, popsaná v publikaci Bodansky M. a další, Principles of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, vil) acylazidy, například takové, v nichž je azidová skupina vytvořena z předem přítomného hydrazidového derivátu při použití dusitanu sodného způsobem podle publikace Wetz K. a dál ší, Anal. Biochem., 1974, 58, 347, viii) azlaktony, vázané na polymery, například bis-akrylamid podle publikace Rasmussen J. K., Reactive Polymers, 1991, 16, 199 a ix) imidoestery, tvořící stálé amidiny reakcí s aminoskupinami, například podle publikace Hunter M.J. a Ludwig M.L.,

J. Am. Chem. Soc., 1962, 84, 3491.

• · · · · · • · ·· ·· • ·

Karbonylové skupiny, například aldehydové funkce mohou reagovat se slabými bázemi typu bílkovin například při pH, při němž dochází k protonaci nukleofilních bílkovinných funkcí na postranní řetězce. Slabé baze zahrnují 1,2-aminothioly, nacházející se například na N-terminálním cysteinovém zbytku, tyto skupiny selektivně tvoří stálé 5-členné thiazolidinové kruhy s aldehydovými skupinami, například podle publikace Ratner S. a další, J. Am. Chem. Soc., 1937, 59, 200. Je také možno použít další slabé baze, jako fenylhydrazonu, popsané v publikaci Heitzman H. a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1974, 71, 3537.

Aldehydy a ketony mohou rovněž reagovat s aminy za vniku Schiffových baží, které je možno s výhodou stabilizovat reduktivní aminací. Alkoxyaminoskupiny snadno reagují s ketony a aldehydy za vzniku stálých alkoxaminů, například podle publikace Webb R. a další, Bioconjugate Chem., 1990, 1, 96.

Příklady reaktivních skupin, schopných reakce s karboxylovými skupinami zahrnují diazosloučeniny, například estery typu diazoacetátu a diazoacetamidy, které reagují velmi specificky za vzniku esterových skupin, například podle publikace Herriot R. Μ., Adv. Protein Cgem., 1947, 3, 169. Reakční činidla, modifikující karboxylové kyseliny, například karbodiimidy, reagující přes 0-acylmočovinu s následnou tvorbou amidové vazby je rovněž možno použít. Vazba může být usnadněna přidáním aminu nebo může dojít k přímé vazbě vektoru na receptor. Jako použitelné ve vodě rozpustné karbodiimidy lze uvést l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-4-ethyl)karbodiimid CMC, l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid EDC, popsané v publikacei Zot H. G. a Puett D., J. Biol. Chem., 1989, 264, 15552. Další použitelná reakční činidla, modifikující karboxylovou kyselinu zahrnují isoxazoliové deriváty, jako Woodwardovo reakční činidlo K, chlormravenčany, jako p-nitrofenyl chlormravenčan, karbonyldiimidazoly, jako 1,1-karbony1• · ····

diimidazol a 'N-karbaalkoxydihydrochinoliny, například N-(ethoxykarbonyl)-2-ethoxy-l, 2-dihydrochinolin.

Další potenciálně použitelné reaktivní skupiny zahrnují diony s ketonovými skupinami na sousedních atomech uhlíku, například p-fenylendiglyoxal, tyto látky je možno použít k reakci s guanidinylovými skupinami, například podle publikace Wagner a další, Nucleic acid Res., 1978, 5, 4065 a diazoniové soli, schopné elektrofilních substitučních reakcí například podle publikace Ishizaka K. a Ishizaka T., J. Immunol. 1960, 85, 163. Bís-diazolyové sloučeniny se snadno připraví působením aryldiaminů na dusitan sodný v kyselém roztoku. Je zřejmé, že funkční skupiny v reportéru a/nebo vektoru je v případě potřeby možno přenést na jiné funkční skupiny před reakcí, například k dosažení další reaktivity nebo selektivity Příkladem postupů, vhodných k tomuto účelu mohou být přeměna aminů na karboxylové kyseliny působením například anhydridu bikarboxylových kyselin, přeměny aminů na thioly, například při použití N-acetylhomocysteinthiolaktonu, anhydridu kyseliny S-acetylmerkaptojantarové, 2-iminothiolanu nebo sukcinimidylových derivátů s obsahem thiolových skupin, přeměna thiolů na karboxylové kyseliny, například při použití alfa-halogenacetátů, přeměna thiolů na aminy, například při použití ethyleniminu nebo 2-bromethylaminu, přeměna karboxylových kyseliny na aminy, například působením karbodiimidů a pak diaminů a přeměna alkoholů na thioly, například působením tosylchloridu s následnou transesterifikací thioacetátem a hydrolýzou na thiol působením octanu sodného.

Vazbu vektoru na receptor je rovněž možno uskutečnit při použití enzymů jako činidel pro zesítění s nulovou délkou. K získání zesítěných produktů byly použity například enzymy transglutamináza, peroxidáza a xantinoxidáza. Obdobně je možno použít proteolýzu k zesítění tvorbou amidových vazeb.

9

- 22 Nekovalentní spojení vektoru a receptorů je například možno uskutečnit interakcí elektrostatických nábojů, například mezi reportérem s polylysinylovými funkčními skupinami a vektorem s polyglutamylovými funkčními skupinami, chelatací ve formě stálých komplexů kovů nebo afinitní vazbou, například vazbou typu avidin/biotin. Pólylysin, nekovalentně vázaný na negativně nabitý povrch membrány může také nespeci ficky zvýšit afinitu mikrobublinek pro interakce s nabitým povrchem buněk.

Je také možno vektory vázat na sekvenci bílkoviny nebo peptidu, schopnou vázat fosfolipidy. V řadě případů je možno navázat na bílkovinu jedinou molekulu fosfolipidu, například v případě translokázy, kdežto v dalších možných případech se mohou bílkoviny vázat na povrchy, tvořené převážně jedním ze zakončení fosfolipidových skupin a tak mohou být použity k vazbě vektorů na fosfolipidové kuličky. Jedním příkladem takové bílkoviny je beta2-glykoprotein I podle publikace Chonn A., Semple S. C. a Cullis P. R., Journal fo Biological Chemistry, 1995, 270, 25845 až 25849. Byly popsány také bílkoviny, schopné vázat fosfatidylserin, například v publikaci Igarashi K. a další, Journal of Biological Chemistry, 270, (49), 29075 až 29078. Annexiny jsou skupinou fosfolipidů, schopných vázat bílkoviny. Řada z nich se váže zejména na fosfatidylserin podle publikace Raynal P. a Η. B. Pollard. Annexins: the problém of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calsium- and phospholipid-binding proteins, Biochim. Biophys. Acta, 1197, 63 až 93. Konjugát vektoru s takovou bílkovinou, schopnou vázat fosfatidylserin je tedy možno použít ke spojení vektorů s mikrobublinkami, zapouzdřenými ve fosfatidylserinu. V případě, že sekvence aminokyselin vazné bílkoviny je známá, je možno syntetizovat nebo izolovat část pro vazbu fosfolipidu a užít ji pro konjugasti s vektorem, čímž je možno se vyvarovat biologické účinnosti, která může být spojena s jinými částmi molekuly.

- 23 Je také možno získat molekuly se specifickou vazbou na povrch mikrokuliček nebo na jejich membránu přímým sledováním molekulárních bank pro molekuly pro vazbu na mikrokuličky. Pro takovou selekci je například možno použít banky fágů s obsahem malých peptidů. Výběr je možno jednoduše usku tečnit tak, že se mikrokuličky smísí s bankou fágů a oddělí se fágy, vázané na mikrokuličky. V případě potřeby je tento postup možno uskutečnit za fyziologických podmínek, například v krvi k vyloučení peptidů se zkříženou reakcí se složkami krve. Výhoda tohoto typu selekce spočívá v tom, že jsou vybírány pouze molekuly, které nedestabilizují mikrokuličky vzhledem k tomu, že budou izolovány pouze molekuly, vázané na neporušené mikrokuličky. V průběhu tohoto výběru je také možné na krátkou dobu zavést pro mikrokuličky nepříznivé pod minky, například zvýšit tlak tak, aby skutečně nedošlo k selekci molekul, destabilizujících mikrokuličky. Mimoto je mož no výběr provádět za střihového namáhání, například tak, že se nejprve nechá směs fágů reagovat s mikrokuličkami a pak se mikrokuličky nechají procházet po porvchu s povlakem protilátek proti fágu. Tímto způsobem může být možno vybrat vazné látky, odolávající obdobným podmínkám in vivo. Vazné skupiny, identifikované tímto způsobem je možno vázat na molekulu vektoru chemicky pomocí syntézy peptidů nebo při použití rekombinantních vektorů a tak získat obecný prostředek pro spojení jakékoliv molekuly vektoru s mikrokuličkami.

Vektor, který obsahuje nebo je vázán na peptidový nebo lipopeptidový spojovník s obsahem prvku pro zprostředkování spojení s membránou je také použitelný. Příklad takového vektoru je popsán například v publikaci Leenhouts J. M. a další, Febs Letters, 1995, 370(3), 189 až 192. Pro některé účely je také možno použít biologicky neaktivní molekuly, tvořené známými skupinami pro zakotvení do membrán, jde ······ «· ·· ·< ··

9 9 9 · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 ·

- 24 například o hydrofobní segment H1 z enzymu Na,K-ATPázy, zejména o jeho podjednotku alfa, popsanou v publikaci Xie Y. a Morimoto T., J. Biol. Chem., 1995, 270(20), 11985 až 11991. Zakotvující skupinou může také být zbytek mastné kyseliny nebo cholesterol.

Vazba může být také uskutečněna s použitím avidinu nebo streptavidinu, které mají čtyři vazná místa s vysokou afinitou pro biotin. Avidin je proto možno použít ke spojení vektoru s reportérem v případě biotinylace obou těchto látek. Příklady jsou uvedeny v publikaci Bayer E. A. a Wilchek Μ., Methods Biochem. Anal., 1980, 26, 1. Postup je možno rozšířit také na vazbu reportéru na reportér, jde o postup, který může zlepšit shlukování bublinek a tím dále potenciálně zvýšit kontrast zobrazení.

Nekovalentní vazbu je možno uskutečnit také s využitím bifunkčni povahy bis-specifických imunoglobulinů. Tyto molekuly se mohou specificky vázat na dva antigeny, čímž je spojí. Jako vazné činidlo tohoto typu je možno užít například bispecifický IgG nebo chemicky pozměněný bispecifický fragment F(ab)^>2. Byly také uváděny heterobifunkční bispecifické protilátky pro vazbu dvou odlišných antigenů, například podle publikace Bode C. a další, J. Biol. Chem., 1989, 944 a Staerz U. D. a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1986,

83, 1453. Obdobně jakýkoliv reportér a/nebo vektor, obsahující nejméně dvě antigenní determinanty, například podle publikace Chen Aa. a další, Am. J. Pathol., 1988, 130, 216 může zesítit molekuly protilátek a tím vytvořit zesítěné shluky většího počtu bublinek se zvýšením kontrastu obrazu.

Tak zvaná vazná činidla s nulovou délkou, která vyvolávají přímé kovalentní spojení dvou reaktivních chemických skupin bez zavedení dalšího materiálu pro spojení, tak jak ·♦ ··» · » · · • · · ♦ • ·

- 25 je tomu například při tvorbě amidových vazeb s použitím karbodiimidů nebo enzymů je rovněž možno v některých případech použít stejně jako různá další činidla jako biotin/. avidin, vyvolávající nekovalentní spojení reportem a vektoru a také činidla, vyvolávající hydrofobní nebo elektrostatické interakce.

Nejčastěji však bude vazné činidlo obsahovat nejméně dvě reaktivní skupiny, spojené spojovacím prvkem, tak jak bylo svrchu popsáno. Přítomnost takového spojovacího prvku dovoluje reakci bifunkčních spojovníků se specifickými funkčními skupinami v molekule nebo ve dvou odlišných molekulách, čímž vzniká vazba mezi oběma složkami a do konjugátu reportem a vektoru je zaveden materiál, odvozený od spojovníku. Reaktivní skupiny ve vazném činidle mohou být stejné v homobifunkčních činidlech nebo různé v heterobifunkčních činidlech nebo v heteromultifunkčních činidlech v případě, že je přítomno několik různých reaktivních skupin.

Tím vzniká velká řada potenciálních činidel pro kovalentní spojení mezi jakýmikoliv chemickými látkami intramolekulárně nebo intermolekulárně.

Povaha cizorodého materiálu, zavedeného spojovníkem může mít zásadní vliv na schopnost zacílení a obecně na stálost výsledného produktu. Může být například žádoucí uskutečnit labilní spojení, například obsahující biologicky degradovatelná místa nebo místa, citlivá na působení chemických látek, například enzymů. Mohou být zahrnuty také polymerní složky, působící například jako smáčedla ke zvýšení stálosti bublinek. Tento materiál může také obsahovat reaktivní skupiny, například k usnadnění zesítění nebo fluorescenční sondy nebo radioaktivní látky.

• · · ·

- 26 Spojovací prvky budou v typických případech tvořeny alifatickými řetězci, účinně oddělujícími reaktivní skupiny spojovníků na vzdálenost 5 až 30 &. Mohou také obsahovat makromolekulám! struktury, například polyethylenglykoly PEG. Jde o jednoduché neutrální polyethery, užívané pro biotechnické a lékařské aplikace a podrobně popsané například v publikaci Milton Harris J., (ed), Polyethylene glycol chemistry, biotechnlcal and biomedical applications, Plenům Press, New York, 1992. Tyto látky jsou rozpustné ve většině rozpouštědel včetně vody a jsou ve vodném prostředí vysoce hydratovány sa vazby dvou nebo tří molekul vody na každý seg ment ethylenglykolu. Tím se brání adosrpci dalších polymerů nebo bílkovin na povrchy, modifikované PEG. PEG jsou netoxic ké a nepoškozují bílkoviny nebo buňky, kovalentně vázané lát ky tohoto typu nevyvolávají tvorbu antigenů ani reakci imunitního systému. Mimoto je možno je snadno modifikovat a vázat na další molekuly bez velkých modifikací. Výhodná rozpustnost a biologické vlastnosti těchto látek jsou zřejmé z jejich širokého použití včetně tvorby sledových kopolymerů, jako PEG-polyurethanů a PEG-polypropylenů.

Molekulová hmotnost spojovacích prvků typu PEG může být například v rozmezí 120 až 20 000.

Hlavním mechanismem pro příjem částic buňkami retikulo endotheliálního systému RES je opsonisace plasmatickými bílkovinami v krvi. Dochází k označení cizorodých částic, které jsou pak přijímány RES. Biologické vlastnosti PEG, použitých jako spojovacích prvků mohou sloužit k prodloužení doby cirkulace kontrastního prostředku podobně jako v případě liposo mů s obsahem PEG podle publikací Klibanov A. L. a další,

FEBS Letters, 1990, 268, 235 až 237 a Blume G. a Cevc G., Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1029, 91 až 97.

• · MM • 0

Další potenciálně vhodné modifikace bílkovin, které mohou být provedeny ve vektorech, zahrnují částečnou nebo úplnou deglykosidaci působením neuraminidázy, endoglykosidázy nebo jodistanu, vzhledem k tomu, že po této reakci dochází k nižšímu příjmu v játrech, slezině, příjmu makrofágy a podobně, kdežto po opětné glykosylaci bílkovin často dochází ke zvýšení příjmu játry a makrofágy. Příprava zkrácených forem bílkovin pomocí štěpení vede ke snížení velikosti bílkoviny a zkrácení poločasu v krevním oběhu a také ke tvorbě kationtů podle publikací Kumagi a další, J. Biol. Chem., 1987, 262, 15214 až 15219, Triguero a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1989, 86, 4761 až 4765, Pardridge a další, J. Pharmacol. Exp. Therap., 1989, 251, 821 až 826 a Pardridge a Boado, Febs Lett., 1991, 288, 30 až 32.

Zvýšené účinnosti vazby na oblasti zájmu je také možno dosáhnout použitím protilátek, vázaných na konce spojovacích prvků typu PEG podle publikace Maruyama K. a další, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1234, 74 až 80 a Hansen C. B. a další, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1239, 133 až 144.

V některých případech se považuje za výhodné použít složku PEG jako stabilizátor ve spojení s vektorem nebo vek tory nebo přímo s reportérem v téže molekule v případě, že PEG není obsažen jako spojovací prvek.

Dalšími spojovacími prvky mohou být některé typy póly sacharidů, jako kyselina polygalakturonová, glykosaminoglykany, heparinoidy, celulosa a polysacharidy z mořských živo čichů, jako chitosany, algináty a carrageenany, zásobní polysacharidy, jako škrob, glykogen, dextran a aminodextrany, polyaminokyseliny a jejich methyl- a ethylestery, jako homo a kopolymery lysinu, kyseliny glutamové nebo asparagové a také polypeptidy, oligonukleotidy a oligosacharidy, popřípadě obsahující místa štěpení různými enzymy.

Obecně mohou spojovací prvky obsahovat štěpitelné skupiny, jako glykolové skupiny, azoskupiny, zbytky sulfonů, esterů, thioesterů a disulfidové skupiny. Spojovací řetězce mohou také obsahovat biologicky degradovatelné methylendiesterové nebo diamidové skupiny obecného vzorce

-(Z)_m.Y.X.C(R¹R²).X.Y.(Z)_nkde

X a Z se volí ze skupiny -0-, -S- a -NR-, kde R znamená atom vodíku nebo organickou skupinu,

Y nezávisle znamená karbonyl, thiokarbonyl, sulfonyl, fosforyl nebo obdobnou skupinu pro tvorbu kyseliny, man znamenají celé číslo 0 nebo 1,

2

R a R znamenají atom vodíku, organickou skupinu nebo skupinu -X.Y.(Z)_m- nebo společně tvoří dvojvaznou organic kou skupinu.

Jak bylo uvedeno například v mezinárodní patentové při hlášce WO 92/17436, jsou takové skupiny snadno biologicky degradovatelné v přítomnosti esteráz, například in vivo, avšak v nepřítomnosti takových enzymů jsou stálé a je proto s výhodou možno je použít v léčebných prostředcích ke zpomalenému uvolnění účinné složky.

Poly/N-(2-hydroxyethyl)methakrylamidy/ jsou potenciálně použitelné spojovací skupiny vzhledem k nízkému stupni in terakce s buňkami a tkáněmi, jak bylo popsáno v publikaci Volfová I., Říhová B. a Větvička P., J. Bioact. Comp. Polymers, 1992, 7, 175 až 190. Práce s podobným polymerem, tvořeným převážně příbuzným 2-hydroxypropylovým derivátem proká žaly, že docházelo k endocytoze mononukleárním fagocytárním • ·

- 29 ·· ···· • · • · · ·

systémem jen v poměrně malém rozsahu, jak bylo popsáno v publikaci Goddard P., Williamson I., Bron J., Hutchkinson L. E., Nicholls J. a Petrák K., J. Bioct, Compat. Polym., 1991, 6, až 24.

Další potenciálně použité polymerní materiály pro spojovací skupiny zahrnují následující látky:

i) kopolymery methakrylátu s methakrylovou kyselinou, popsané v publikaci Lee Ρ. I., Pharm. Res., 1993, 10, 980, jejich karboxylátové substituenty však mohou vyvolat vyšší bobt nání než při použití neutrálních polymerů, ii) sledové kopolymery polymethakrylátů s biologicky degradovatelnými polyestery podle publikace San Roman J. a Guillen -Garcia P., Biomaterials, 1991, 12, 236 až 241, iii) kyanoakryláty, to znamená polymery esterů kyseliny 2-kyanoakrylové, jde o biologicky degradovatelné látky, užívané ve formě nanočástic pro selektivní aplikaci účinných látek podle publikace Forestier F., Gerrier P., Chaumard C., Quero A. Μ. , Couvreur P. a Labarre C., J. Antimicrob. Chemoter. , 1992, 30, 173 až 179, iv) polyvinylalkoholy, které jsou ve vodě rozpustné a jsou obecně považovány za biokompatibilní podle publikace Langer R., J. Control. Release, 1991, 16, 53 až 60,

v) kopolymery vinylmethyletheru s anhydridem kyseliny maleinové, které jsou v biologickém prostředí narušovány podle publikace Finne U., Hannus M. a Urtti A., Int. J. Pharm., 1992, 78, 237 až 241, vi) polyvinylpyrolidony, například s molekulovou hmotností nižší než 25 000, které jsou rychle filtrovány v ledvinách podle publikace Hespe W., Meier A. M. a Blankwater Y. Μ., Arzeim. Forsch./Drug Res., 1977, 27, 1158 až 1162,

- 30 ·· ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ » · · Β · Β ΒΒΒΒ ···· Β Β Β Β Β Β ΒΒ Β • ΒΒΒΒ vii) polymery a kopolymery alifatických hydroxykyselin s krátkým řetězcem , například kyseliny glykolové, mléčné, máselné, valerové a kapronové podle publikace Carli F., Chim. Ind. (Milan), 1993, 75, 494 až 499, včetně kopolymerů s obsahem aromatických hydroxykyselin ke zvýšení rychlosti degradace podle publikace Imasaki K., Yoshida M., Fukuzaki Η.,

Asano Μ. , Kumakura Μ., Mashimo T., Yamanaka H. a Nagai T.,

Int. J. Pharm., 1992, 81, 31 až 38, viii) polyestery, tvořené střídajícími se jednotkami ethylen£ hlykolu a kyseliny tereftalové, například Dacron , tyto látky nejsou degradovatelné, jsou však vysoce biokompatibilní, ix) sledové kopolymery, obsahující biologicky degradovatelné segmenty polymerů alifatických hydroxykyselin podle publikace Younes H., Nataf P. R. , Cohn D., Appelbaum Y. J., Pizov G. a Uretzky G., Biomater. Artif. Cells Artif. Organs, 1988, 16, 705 až 719, například ve spojení s polyurethany podle publikace Kobayashi H. Hyon S. H. a Ikada Y., Water-curable and biodegradable propolymers, J. Biomed. Mater. Res., 1991, 25, 1481 až 1494,

x) polyurethany, dobře snášené v implantátech a kombinovatelné s měkkými segmenty, například obsahující polytetramethylenglýko1, polypropylenglykol nebo polyethylenglykol a aromatickými tvrdými segmenty, například obsahující 4,4*-methylenbisfenylenisokyanát podle publikace Ratner B. D., Johnston A. B. a Lenk T. J., J. Biomed. Mater. Res.: Applied Biomaterials, 1987, 21, 59 až 90, Sa Da Costa V. a další,

J. Coli. Interface Sci., 1981, 80, 445 až 452 a Affrossman S. a další, Clinical Materials, 1991, 8, 25 až 31, xi) poly-l,4-dioxan-2-ony, kreré mohou být považovány za biologicky degradovatelné estery vzhledem k jejich hydrolyzovatelným esterovým vazbám podle publikace Song C. X., Cui X. M. a Schindler A., Med. Biol. Eng. Comput., 1993, 31, 147 až 150 a které mohou obsahovat glykolidové jednotky ke zvýšení

- 31 99 999· 99 ·· ·· ·· • 9 · ··· · · · · • 9 99 · 9 9 9 9 · · · ·

9 9 9 9 9 9 9 *·· ·99 99 99 99 ·« jejich vstřebatelnosti, jak je popsáno v publikaci Bezwada R. S., Shalaby S. W. a Newman H.D.J., Agricultural and synthetic polymers: Biodegradability and utilization, 1990, ed. Glass J. E. a Swift G., 167 až 174 - ACS symposium Series, 433, Washington D. C., USA - American Chemical Society, xii) polyanhydridy, například kopolymery kyseliny sebakové s bis(4-karboxyfenoxy)propanem, které byly zkoušeny na králících podle publikace Brém H., Kadeř A., Epstein J. I., Tamargo R. J., Domb A., Langer R. a Leing K. W., Sel. Cancer Ther, 1989, 5 55 až 65 a na krysách podle publikace Tamargo R. J., Epstein J. I., Reinhard C. S., Chasin M. a Brém H.,

J Biomed. Mater. Res., 1989, 23, 253 až 266 jako látky pro řízené uvolnění účinných látek v mozku bez toxických účinků, xiii) biodegradovatelné polymery s obsahem orthoesterových skupin, užívané pro řízené uvolnění in vivo podle publikace Maa Y. F. a Heller J., J. Control.Release, 1990, 14, 21 až 28 xiv) polyfosfazeny, které jsou anorganickými polymery, tvořenými střídajícími se atomy fosforu a dusíku a které byly popsány v publikaci Crommen J. H., Vandorpe J. a Schacht E.

H., J. Control. Release, 1993, 24, 167 až 180.

V následující tabulce jsou uvedena spojovací činidle a činidla pro modifikaci bílkovin, která je možno použít při přípravě zacílených kontrastních prostředků v souladu s řešením podle vynálezu.

·· ····

0

0 00

0

000

- 32 Heterobifunkční spojovací prostředky

0 0

spojovací	reaktivita 1	reaktivita 2 poznámky
prostředek
ABH	uhlohydrát	fotoreaktivní
ANB-NOS	-nh,	fotoreaktivní
APDP (1)	-SH	fotoreaktivní jodovatelný di-

sulfidový spojovník

APG	-nh.	fotoreaktivní reaguje selektivně
s Arg při pH	7-8
ASIB (1)	-SH	fotoreaktivní	jodovátélný
ASBA (1)	-COOH	fotoreaktivní	jodovátélný
EDC	-nh.	-COOH	spojovník s nulovou délkou
GMBS	-NH,	-SH
sulfo-GMBS	-NH,	-SH	rozpustný ve	vodě
HSAB	-nh2	fotoreaktivní
sulfo-HSAB	-nh2	fotoreaktivní	rozpustný ve	vodě
MBS	-nh2	-SH
sulfo-HBS	-NH2	-SH	rozpustný ve	vodě
m2c2h	uhlohydrát	-SH
MPBH	uhlohydrát	-SH
NHS-ASA (1)	-nh2	fotoreaktivní	jodovatělný
sulfo-NHS-ASA(l)	-NH2	fotoreaktivní	rozpustný ve	vodě,

jdodovatelný

sulfo-NHS-LC-		rozpustný ve vodě,
ASA (1)	-nh2	fotoreaktivní jodovatelný

• 9 9999 99 99 99 99 • · * 9 ♦ · 9 9 9 9 ♦ ♦ ·· 9 9 9 9 9 9 99 9 • 999 99 99 999 999

99999 9 9 •999 999 99 99 99 99

- 33 PDPH uhlohydrát -SH disulfidový spojovník

PNP-DTP	-nh2	fotoreaktivní
SADP	-nh2	fotoreaktivní	disulfidový spojovník
sulfo-SADP	-nh2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný disulfidový spojovník
SAED	-nh2	fotoreaktivní	disulfidový spojovník
SAND	-nh2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný disulfidový spojovník
SANPAH	-nh2	fotoreaktivní
sulfo-SANPAH	-nh2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný
SASD (1)	-NH2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný jodovatelný disul fidový spojovník
SIAB	-nh2	-SH
sulfo-SIAB	-NH2	-SH	ve vodě rozpustný
SMCC	-NH2	-SH
sulfo-SMCC	-nh2	-SH	ve vodě rozpustný
SMPB	-NH2	-SH
sulfo-SMPB	-NH2	-SH	ve vodě rozpustný
SMPT	-nh2	-SH
sulfo-LC-SMPT	-NH2	-SH	ve vodě rozpustný
SPDP	-nh2	-SH
sulfO-SPDP	-nh2	-SH	ve vodě rozpustný
sulfo-LC-SPDP	-NH_	-SH	ve vodě rozpustný

*· ···· ·· ·* *· ♦ * · * * · 9 9 9 9 • * · · 9 · 99 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 99 9 9 9 9 9.9 9 0

- 34 sulfo-SAMCA (2) ^-ΝΗ2 fotoreaktivní sulfo-SAPB -ΝΗ₂ fotoreaktivní ve vodě rozpustný

Poznámka: 1) = jodovatelný,

2) = fluorescenční.

Homobifunkční spojovací prostředky

spojovací prostředek	reaktivita	poznámka
0	-nh2
BMH	-SH
BASED (1)	fotoreaktivní	jodovatelný disulfidový spojovník
BSCOES	-NH2
sulfo-BSCOES	-NH2	ve vodě rozpustný
DFDNB	-NH2
DMA	-nh2
DMP	-nh2
DMS	-nh2
DPDPB	-SH	disulfidový spojovník
DSG	-NH2
DSP	-nh2	disulfidový spojovník
DSS	-nh2
DST	-NH2
sulfo-DST	-nh2	ve vodě rozpustný
DTBP	-nh2	disulfidový spojovník

·· ··«· ·· ·· ·· *·♦ ·»· t · ·1 *· ··· · · ··· · tttt · • ····· · tt ···· ··· ♦· «· ·· ·«

DTSSP	-nh,	disulfidový spojovník
EGS	-nh2
sulfO-EGS	-nh,	ve vodě rozpustný
SPBP	-nh2

Biotinylovaná činidla
činidlo	reaktivita	poznámka
biotin-BMCC	-SH
biotin-DPPEX		příprava biotinylovaných liposomů
biotin-LC-DPPEX		příprava biotinylovaných liposomů
biotin-HPDP	-SH	disulfidový spojovník
biotin-hydrazid	uhlohydrát
b i o t in-LC-hydraz i d	uhlohydrát
jodacetyl-LC-biotin	-nh2
NHS-iminobiotin	-NH,	snížená afinita pro avidin
NHS-SS-biotin	-NH,	disulfidový spojovník
fo toakt ivovatelný	nukleové
biotin	kyseliny
sulfo-NHS-biotin	-NH,	ve vodě rozpustný
sulfo-NHS-LC-biotin	-NH,

Poznámka: DPPE = dipalmitoylfosfatidylethanolamin

LC = dlouhý řetězec ·· ···· » · · • · · ·

Činidla pro modifikaci bílkovin

činidlo	reaktivita	funkce
Ellmanovo činidlo	-SH	kvantifikuje/ detekuje/chrání
DTT	-S.S-	redukce
2-merkaptoethanol	-S.S-	redukce
2-merkaptoamin	-S.S-	redukce
Trautovo činidlo	-nh2	zavádí -SH
ŠATA	-nh2	zavádí chráněnou skupinu SH
AMCA-NHS	-NH2	fluorescenční značení
AMCA-hydrazid	uhlohydrát	fluorescenční značení
AMCA-HPDP	-S.S-	fluorescenční značení
SBF-chlorid	-S.S-	fluorescenční detekce skupin -SH
N-ethylmaleimid	-S.S-	blokuje -SH
NHS-acetát	-nh2	blokuje a acetyluje skupiny -NH2
anhydrid kyseliny citrakonové	-nh2	reversibilně blokuje a zavádí negativní náboje
DTP A	-nh2	zavádí chelatační látku
BNPS-skatol	tryptofan	štěpí tryptofanový zbytek
Bolton-Hunter	-NH2	zavádí jodovátélnou skupinu

► φφφφ • φ φ φφφ » φ φ • φ φ • φφ « φφφ

- 37 Spojovací prostředky, použité v rámci vynálezu budou obvykle spojovat vektor s reportérem nebo reportér s reportérem s určitou specifičností a rovněž je možno tyto prostředky užít k navázání jednoho nebo většího počtu látek s léčebným účinkem.

Zařízení pro zobrazování ultrazvukem, použitelná v souvislosti s vynálezem zahrnují dvojrozměrné a trojrozměrné zobrazovací postupy, například zobrazování pomocí B-postupů s amplitudou signálu, která se mění v čase, signál je vytvářen ze základní frekvence vysílaného ultrazvukového pulsu od subharmonické nebo vyšší harmonické nebo ze součtu nebo rozdílu frekvencí, odvozených od vysílaného pulsu a takových harmonických, přičemž obrazy, vytvořené ze základní frekvence nebo její druhé harmonické jsou výhodnější. Je možno použít také barevného Dopplerova zobrazování a kombinace obou postupů. Bylo neočekávaně zjištěno, že druhé harmonické signály ze zacílených mikrokuliček byly velmi kvalitní. Aby bylo možno snížit účinek pohybu, je možno vytvářet postupné obrazy tkání, například srdce nebo ledvin při použití vhodné sinchronizační techniky, například spojením s ECG nebo s ohledem na dýchací pohyby zobrazovaného jedince. Měření změn rezonanční frekvence nebo ztráty odrazu frekvence, které doprovázejí zastavené nebo zpožděné mikrobublinky jsou rovněž použitelné pro detekci přítomnosti kontrastního prostředku.

Vynález dává k dispozici také prostředek pro aplikaci látek s léčebným účinkem v kombinaci se směrováním produktu pomocí vektoru na požadované místo. Pod pojmem látka s léčebným účinkem se rozumí látka, která má příznivý účinek na určité onemocnění u člověka nebo jiného organismu. Kombinace takových látek s kontrastním prostředkem pro zobrazování ultra zvukem již byly navrhovány například ve WO 94/28 873 nebo WO 95/07072, materiály, použité v těchto přihláškách však • · • · · · • ·

- 38 neobsahovaly vektory s afinitou pro určité místo a docházelo proto k jejich poměrně nízkému zachycení na požadovaných místech v průběhu uvolnění účinných látek.

Látky s léčebným účinkem, užité v souvislosti s vynálezem mohou být zapouzdřeny uvnitř mikrobublinek nebo spojeny s jejich stěnami. Účinná látka může být vázána na část stěny bublinek například kovalentní nebo iontovou vazbou nebo může být fyzikálně smísena se zapouzdřeným materiálem, zvláště v případě, že má taková látka obdobnou polaritu nebo rozpustnost jako materiál membrány, tak, aby nedocházelo k výstupu produktu z mikrobublinky před místem určení. Uvolněním účinné látky může být zahájeno jednoduchým smočením krví po podání nebo v důsledku jiného popudu, například rozpouštěním, katalyzovaným enzymy nebo působením ultrazvuku. Destrukce mikročástic s obsahem plynu ultrazvukem z vnějšího prostředí je známým jevem u kontrastních prostředků a bylo popsáno například ve WO 93/25 241. Rychlost uvolnění účinných látek se může měnit v závislosti na způsobu podání a na použitém množství energie ultrazvuku.

Látka s léčebným účinkem může být kovalentně vázána na povrch membrány například svrchu uvedeným způsobem. Je tedy možno postupovat například tak, že se připraví fosfolipidový nebo lipopeptidový derivát, na nějž se naváže účinná látka pomocí biologicky degradovatelného nebo selektivně štěpitelného spojovníku, načež se tento materiál začlení do materiálu pro tvorbu mikrobublinek. Do membrány je možno přímo začlenit také lipidované molekuly účinné látky, které nevyžadují další zpracování pro uvolnění účinné složky. Takový derivát účinné látky může být uvolněn pouze zvýšením intenzity ultrazvuku.

Jako příklad systému pro aplikaci účinných látek podle vynálezu je možno uvést jakoukoliv známou účinnou látku nebo φ φ φ φ > φ φ φ » φ φ φ

- 39 • · φφφφ » φ φ její účinný analog s obsahem thiolové skupiny, tyto látky jsou vázány na mikrobublinky s obsahem thiolových skupin za oxidativních podmínek a za vzniku disulfidových můstků. V kombinaci s vektorem nebo vektory se pak mohou mikrobublinky, modifikované tímto způsobem hromadit v cílové tkáni. Podáním redukčního činidla, například redukovaného glutathionu je pak možno uvolnit molekulu účinné látky z mikrobublinky v blízkosti cílových buněk a tak zvýšit místní koncentraci účinné látky a zvýšit také léčebný účinek. Produkt může být také připraven bez účinné látky a teprve potom může být účinná látka navázána na mikrobublinky nebo na ně uložena jako povlak. Je například možno přidat účinnou látku k suspenzi mikrobublinek ve vodném prostředí a protřepáváním spojit bublinky s účinnou složkou.

Další systémy pro aplikaci účinné látky na určené místo zahrnují vektorem modifikované fosfolipidové membrány, dopované lipopeptidovými strukturami, obsahujícími poly-L-lysin nebo poly-D-lysin v kombinaci s vektorem. Při použití v genové therapii se zvláštním důrazem na spojení účinné látky s receptorem je možno mikrobublinky jako nosič kondenzovat s DNA nebo RNA elektrostatickou interakcí s polykationtem. Tento postup má tu výhodu, že vektor nebo vektory, užité pro zacílení mikrobublinek nejsou přímo spojeny s nosnou polylysinovou skupinou, polylysinový řetězec je také pevněji zakotven v membráně mikrobublinek vzhledem k přítomnosti lipidového řetězce. Za užitečné se také považuje použití ultrazvuku ke zvýšení účinnosti zacílení.

Je také možno nejprve modifikovat volné polylysinové řetězce molekulami účinné látky nebo vektoru a pak je kondenzovat s negativním povrchem mikrobublinek, zacílených na cílové struktury v organismu.

• · · · · · » · · • · · ·

- 40 Jako příklady látek, které je možno aplikovat při využití vynálezu, je možno uvést protinádorové látky, jako vinkristin, vinblastin, vindesin, busulfan, chlorambucil, spiroplatin, cisplatin, carboplatin, methotrexat, adriamycin, mitomycin, bleomycin, cytosin arabinosid, arabinosyladenin, merkaptopurin, mitotan, prokarbazin, daktinomycin (aktinomycin D), daunorubicin, doxorubicinhydrochlorid, taxol, plikamycin, aminoglutethimid, estramustin, flutamid, leuprolid, megestrolacetát, tamoxifen, testolakton, trilostan, amsakrin (m-AMSA), aspargináza (L-asparagináza), etoposid, interferon alfa, 2a a 2b, krevní produkty, jako hematoporfytiny a jejich deriváty, dále může jít o látky, modifikující biologickou odpověď, jako jsou moramylpeptidy, antifungální látky, jako ketoconazol, nistatin, griseofulvin, flucytosin, miconazol nebo amfotericin B, hormony nebo jejich analogy, jako růstový hormon, hormon, stimulující melanocyty, estradiol, beclomethasondipropionát, betamethason, kontisonacetát, dexamethason, flu-nisolid, hydrokortizon, methylprednisolon, paramehasonacetát, prednisolon, prednison, triamcilonol nebo fluorokortisonacetát, vitaminy, jako kyanokobalamin nebo retioidy, enzymy, jako jsou alkalická fosfatáza nebo dismutáza peroxidu manganu, antialergické látky, jako jsou amelexanox, inhibitory tkáňových faktorů, jako monoklonální protilátky a jejich fragmenty Fab, syntetické peptidy, nepeptidové látky a sloučeniny, řídící expresi tkáňových faktorů, inhibitory shlukování krevních destiček, jako jsou GPIa, GPIb a GPIIb-IIIa, receptory ADP, receptory thrombinu, von Willebrandův faktor, prostaglandiny, aspirin, ticlopidin, clopigogrel a repro, inhibitory koagulace bílkovin, jako jsou Fila FVa, FVIIa, FVIIIa, FIXa, tkáňový faktor, hepatiny, hirudin, hirulog, argatroban, DEGR-rFVIIa a annexin V, inhibitory tvorby fibrinu a promotory fibrinolýzy, jako jsou t-PA, urokináza, plamin, streptokináza, rt-aktivátor plasminogenu a r-stafylokináza, antiangiogenní faktory, jako jsou medroxyprogesterol, pentosanpolysulfát, suramin, taxol, thalidomid, angiostatin, interferon-alfa, ·· ····

- 41 inhibitory metaloproteinázy, faktor 4 krevních destiček, somatostatin, thrmbospondin, látky, upravující krevní oběh, jako propranolol, potenciátory metabolismu, jako glutathion, antituberkulotické látky, jako kyselina p-aminosalicylová, isoniazid, capreomycinsulfát, cyklosexin, ethambutol, ethionamid, pyrazinamid, rifampin nebo streptomycinsulfát, protivirové látky, jako acyclovir, amantadin, azidothymidin, ribavirin nebo vidarabin, látky, rozšiřující cévy, jako diltiazem, nifedipin, verapamil, erythriroltetranitrát, isosorbit dinitrát, nitroglycerin nebo pentaerythritoltetranitrát, antibiotika, jako dapson, chloramfenikol, neomycin, cefaclor, cefadroxil, cefalexin, cefradin, erythromycin, clindamycin, linkomycin, amoxicillin, ampicillin, bakampicillin, carbenicillin, dicloxacilin, cyclacillin, pokloxacillin, hetacillin, methicillin, nafcillin, penicillin, polymyxin nebo tetracyklin, protízánětlivé látky, jako diflunisal, ibuprofen, indomethacin, mclefenemát, kyselina mefenamová, naproxen, fenylbutazon, piroxikam, tolmetin, aspirin nebo salicyláty, látky, účinné proti prvokům, jako chlorochin, metronidazol, chinin nebo megluminantimonát, antirheumatické látky, jako penicilamin, narkotika, jako paregoric, opiáty, jako kodein, morfin nebo opium, srdeční glykosidy, jako deslanesid, digitoxin, digoxin, digitalin nebo digitalis, blokátory nervosvalového přenosu, jako atracuriummesylát, gallamintriethiodid, hexafluoreniumbromid, metocurinjodid, pancuroniumbromid, sukcinylcholinchlorid, tubokurarinchlorid nebo vecuroniumbromid, sedativa, jako amobarbital, sodná sůl amobarbitalu, apropbarbítal, sodná sůl butabarbitalu, chloralhydrát, ethchlorvynol, ethinamát, flurazepamhydrochlorid, glutethimid, methotrimeprazinhydrochlorid, methyprylon, midazolamhydrochlorid, paraldehyd, pentobarbital, sodná sůl sekobarbitalu, talbutal, temazepam nebo triazolam, místní anestetika, jako bupivakain, chlorprokain, etidokain, lidokain, mepivakain, prokain nebo tetrakain, celková anestetika, jako droperidol, etomidát, fentanylcitrát s droperidolem, ketaminhydrochlorid, sodná sůl methohexitalu • · • · • · ·

- 42 nebo thiopental a farmaceuticky přijatelné soli, například adiční soli s kyselinami, jako hydrochloridy nebo hydrobromidy nebo soli s bázemi, například soli sodné, vápenaté nebo hořečnaté nebo jiné deriváty těchto látek, například acetáty. Dalším příkaldem látek s léčebným účinkem mohou být genetické materiály, jako ňukleové kyseliny, RNA a DNA přírodního nebo syntetického původu včetně rekombinantní RNA a DNA. Kódová DNA pro určité bílkoviny může být užita k léčení různých typů onemocnění. Je například možno použít geny pro faktor nekrosy nádorů nebo pro interleukin-2 k léčení pokročilých nádorů, geny pro thymidinkinázy je možno užít k léčení nádorů vaječníků nebo mozku, geny pro interleukin-2 je možno užít při léčení neuroblastomu, zhoubného melanomu nebo nádoru ledvin a geny pro interleukin-4 je možno obecně užít k léčení různých typů zhoubných nádorů.

Lipofilní deriváty účinných látek, vázané na stěnu mikrobublinky hydrofobními interakcemi mohou mít léčebný účinek jako část mikrobublinky nebo po uvolnění z mikrobublinky například působením ultrazvuku. V případě, že účinná látka nemá požadované fyzikální vlastnosti, je možno použít lipofilní skupinu k zakotvení účinné látky na membránu. Lipofilní skupina by měla být s výhodou zavedena takovým způsobem, aby nedošlo k ovlivnění účinnosti molekuly in vivo nebo je možno lipofilní skupinu odštěpit a účinnou látku uvolnit. Lipofilní skupiny je možno zavést různými chemickými prostředky v závislosti na funkčních skupinách, které jsou k dispozici v molekule účinné látky. Kovalentní vazbu je možno uskutečnit v případě, že účinná látka obsahuje funkční skupiny, schopné kovalentní reakce s lipofilními sloučeninami. Jako příklady lipofilních skupin je možno uvést přímé nebo rozvětvené alkylové řetězce, cyklické sloučeniny, aromatické zbytky a kondenzované aromatické a nearomatické cyklické systémy. V některých případech bude • 0 000· ·» *00 · 9 9 • 000 0 · ··· • 0 0 0 9 9 9 • · 0 · 0 · ···· 000 ·· 99 *· 00 • · · · • · 0 · » *·· 99 9 • 9

99

- 43 lipofilní skupina tvořena steroidem s vhodnými funkčními skupinami, například cholesterolem a příbuznými sloučeninami.

Jako příklad funkčních skupin, zvláště vhodných k tomuto účelu je možno uvést nukleofilní skupiny, jako aminoskupiny, hydroxyskupiny a sulfhydrylové skupiny. Vhodné postupy pro vytvoření lipofilního derivátu jakékoliv účinné látky, obsahující sulfhydrylovou skupinu, například captoprilu, mohou zahrnovat přímou alkylaci, například reakci s alkylhalogenidem v alkalickém prostředí a tvorbu thiolesteru reakcí s aktivovanou karboxylovou kyselinou. Jako příklad tvorby derivátu účinné látky s obsahem karboxylové funkce, jako atenololu je možno uvést tvorbu amidu a esteru vazbou aminu nebo alkoholu s požadovanými fyzikálními vlastnostmi. Výhodnou vazbou cholesterolu na účinnou látku je tvorba degradovatelné esterové vazby.

Vynález je možno účinně užít při angiogenese, to znamená tvorbě nových krevních cév rozvětvením existujících cév. Primárním popudem pro tento postup může být neadekvátní přívod živných látek nebo nedostatečný přívod kyslíku k určité tkáni. Buňky této tkáně reagují vylučováním angiogenetických faktorů, například růstového faktoru pro endothelium a tyto faktory zahájí sekreci proteolytických enzymů, které rozruší bílkoviny základní membrány a také sekreci inhibitorů, omezujících působení těchto potenciálně škodlivých enzymů. Kombinované účinky z receptorů pro angiogenetické faktory mohou způsobit pohyb a množení endotheliálních buněk s následným přeskupením těchto buněk a vytvořením základní membrány okolo nově vytvořených cév.

Rostoucí nádory musí zahájit tento angiogenetický postup při dosažení rozměru 1 mm, aby mohly udržet rychlost svého růstu. Vzhledem k tomu, že tvorba nových cév je doprovázena charakteristickými změnami endotheliálních buněk a jejich bezprostřednícho okolí, je tato tvorba cév slibným cílem pro léčebný zásah a je ji také možno poměrně snadno ftft ftftftft • · · • ftftft ft · • · • ftftft ftftft • >

• · · · • ftft

- 44 * · · · · ftftft ··· • ftftft ft * *· ·· ftft ftft diagnostikovat, například při při řade zánětlivých pochodů, tvorby nových cév po infarktu vodních cév.

nádorovém růstu, avšak také Tytéž faktory se také účastní srdečního svalu po zúžení půV následujících tabulkách bude uvedena řada systémů receptorů/cílových struktur, spojených s tvorbou nových cév. Na základě svrchu uvedených principů zacílení podle vynálezu je možno tvorbu nových cév prokázat většinou zobrazovacích postupů, současně užívaných v lékařství. Například vyšetření ultrazvukem se zesílením kontrastu může přinést další výhody v případě, že kontrastním prostředkem jsou mikrokuličky, jejichž výskyt je omezen na vnitřní prostor krevních cév. I když se v tomto případě cílové antigeny nacházejí na řadě typů buněk, mikrokuličky se budou vázat výlučně na endotheliální buňky.

V případě kontrastních látek podle vynálezu je možno využít také tak zvané prekursory účinných látek. Účinné látky mohou být derivatizovány tak, aby došlo ke změně jejich fyzikálně-chemických vlastností a k jejich vhodné úpravě pro začlenění do reportéru. Tyto látky jsou obvykle neúčinné a teprve po odštěpení skupiny, vytvářející derivát, se opět uvolní účinná forma takové látky.

Zacílením mikrobublinky s obsahem plynu a enzymu, aktivujícího prekursorovou látku do oblasti drobných změn je možno učinit cílovou tkáň viditelnou, přičemž současně nedochází k rozptýlení bublinek do necílových oblastí. Tímto způsobem je možno stanovit nejvhodnější dobu pro injekci prekursoru u jednotlivých nemocných.

Další možností je začlenit prekursor účinné látky, enzym, aktivující tento prekursor a vektor do téže mikrobublinky v systému, v němž dojde k aktivaci prekursoru až na zevní popud. Takovým popudem může být například proteáza,

0

0

000 • 0

0000 • · · • *00 • 0

0 0··· 0·0 • V 0« · 0 • ·00· • 0 0 0 • · 0 0

00 • *

0 • 00 » specifická pro určitý nádor, tak jak bylo svrchu popsáno, nebo je možno po nahromadění bublinek v určité cílové tkáni zasáhnout ultrazvukem.

Při využití vynálezu je možno snadno dopravit látky s Učebným účinkem do chorobných oblastí nebo k nekrotickým tkáním včetně srdce a cévního systému a také do jater, sleziny, ledvin a dalších oblastí, například od lymfatického systému, tělesných dutin nebo zažívací soustavy.

Produkty podle vynálezu mohou být užity pro zacílení látek s léčebným účinkem in vivo i in vitro. Pokud jde o využití in vitro, může jít o systémy pro diagnostiku různých onemocnění nebo charakterizaci různých složek ve vzorku krve nebo tkáně. Obdobným postupem může být postup, podobný vazbě některých krevních složek nebo buněk na polymerní částice, například magnetické částice in vitro k oddělení těchto částic od zbylých složek vzorků. V takovém případě je možno využít nízké hustoty reportérových jednotek v prostředcích podle vynálezu k oddělení materiálu s obsahem plynu a jeho opakovaným promytím.

Vektory, které mohou být využity při tvorbě zacílítelných kontrastních prostředků podle vynálezu s vícečetnou specifičností zahrnují následující látky:

i) Protilátky, které je možno užít jako vektory pro velmi širokou škálu cílů a které mají výhodné vlastnosti, jako vysokou specifičnost, v případě potřeby i vysokou afinitu, možnost modifikace této afinity podle potřeby a podobně. Biologická účinnost protilátky bude záviset na specifické kombinaci vektoru a cílové tkáně. Je možno užít běžných protilátek i geneticky pozměněných protilátek, přičemž v tomto druhém případě je protilátky možno upravovat pro určité »· ·· • · · • · · potřeby, například pro různou afinitu nebo specifičnost. Použití lidských protilátek je výhodnější, aby bylo možno se vyvarovat imunitních reakcí proti molekule vektoru. Další použitelnou skupinou protilátek jsou tak zvané bispecifické protilátky, to znamená protilátky se specifičností pro dvě odlišné cílové molekuly v jediné molekule protilátky. Takové protilátky je možno využít například ke tvorbě shluků bublinek, zejména pro některé léčebné účely, například pro zacílení toxických skupin na cílové tkáně. Různé bispecifické protilátky jsou popsány v publikacích McGuinness Β. T. a další, Nat. Biotechnol., 1996, 14, 1149 až 1154, George A. J. a další, J. Immunol., 1994, 152, 1802 až 1811, Bonardi a další, Cancer Res., 1993, 53, 3015 až 3021 a French R. R. a další, Cancer Res., 1991, 51, 2353 až 2361.

ii) Molekuly, schopné přilnutí k buňkám, jejich receptory, cytokiny, růstové faktory, peptidové hormony a jejich části. Vektory tohoto typu se účastní normálních biologických interakcí mezi bílkovinami na receptoru pro cílovou molekulu a budou v řadě případů vyvolávat biologickou reakci svou vazbou na cílové tkáně a budou tedy biologicky účinné. V případě vektorů se zacílením na proteoglykany budou takové účinky vektorů poměrně nevýznamné.

iii) Nepeptidové agonistické/antagonistické látky nebo vazné látky pro receptory bez biologického účinku, schopné se vázat na cytokiny, růstové faktory a peptidové hormony. Může jít i o biologicky neaktivní vektory, které nemají ani agonistický ani antagonistický účinek, avšak mohou splnit požadavek na zacílení.

iv) Oligonukleotidy a modifikované oligonukleotidy, které mohou vázat DNA nebo RNA Watson-Crickovým způsobem nebo jiným způsobem párováním baží. DNA je obvykle přítomno pouze v mimo buněčném prostoru v důskedku rozrušení buněk, takže takové ·· · · · · ·· • · · · · · • · · · · · · oligonukleotidy, které budou obvykle biologicky neoaktivní, bude možno využít například pro zacílení odumírajících tkání, spojených s celou řadou různých pathologických stavů. Oligonukleotidy mohou být také vytvořeny tak, aby se vázaly na bílkoviny, schopné specifické vazby na DNA nebo RNA, například faktory pro transkripci, k jejichž vysoké expresi nebo aktivaci velmi často dochází u nádorových buněk nebo u aktivovaných buněk imunitního systému nebo endotheliálních buněk. K získání oligonukleotidů se schopností specifické vazby na určité cílové molekuly od bílkoviny až do kofeinu a které je možno použít jako vektory pro zacílení je také možno využít kombinační banky oligonukleotidů.

v) Látky, schopné vázat DNA se mohou chovat podobně jako oligonukleotidy, avšak po příjmu do buněk mohou mít biologickou účinnost a/nebo toxické účinky.

vi) Různé malé molekuly včetně biologicky účinných sloučenin, o nichž je známo, že se mohou vázat na biologické receptory různého druhu. Takové vektory nebo jejich cílové tkáně je možno využít ke tvorbě biologicky neaktivních sloučenin schopných se vázat na tytéž cílové tkáně.

vii) Molekuly vektoru je možno vybírat z kombinačních bank, aniž by bylo zapotřebí nezbytně znát přesný molekulární cíl, je možno funkčně in vitro, ex vivo nebo in vivo vybírat molekuly, schopné se vázat na požadovanou oblast nebo strukturu.

viii) Různé malé molekuly včetně biologicky účinných látek, schopných se vázat na biologické receptory různých typů. Takové vektory nebo jejich cílové tkáně je možno využít ke tvorbě biologicky neúčinných látek, schopných se vázat na tytéž cílové tkáně.

• · ··· · • · · · » · · » · · · · ix) Bílkoviny nebo peptidy, schopné vazby na glukosaminoglukanový postranní řetězec, například haparansulfát, včetně části větších molekul, schopných se vázat na glukosoaminoglykan vzhledem k tomu, že při takové vazbě má glukosoaminoglykanové postranní řetězce, nedochází ke vzniku biologické odpovědi. Proteoglykany se nenacházejí na červených krvinkách, takže tímto způsobem je možno vyloučit nežádoucí adsopci na tento typ buněk.

Dále budou uvedeny ještě jiné pleptidové vektory a lipopeptidy pro zacílení při zobrazování pomocí ultrazvukem: může jít o peptidy,schopné se vázat na atherosklerotické pláty, jako YRALVDTLK, YAKFRETLEDTRDRMY a RALVDTEFKVEKQEAGAK, peptidy, schopné se vázat na krevní sraženiny, jako NDGDFEEIPEEYLQ a GPRG, peptidy s vazbou na destičky, jako PLYKKIIKKLLES a cholecystokinin, alfa-melanocyty stimulující hormon, enterotoxin-1,stálý za tepla, vasoaktivní peptid ze střevní sliznice, syntetický peptid alfa-M2 z determinační oblasti pro třetí dlouhý řetězec komplementu a analogy uvedených látek pro zacílení nádorů.

V následujících tabulkách jsou popsány různé receptory, které mohou být zacíleny při použití určitých typů vektorů a oblasti, zacílítelné pro zvýšení kontrastu při zobrazování ultrazvukem při použití kontrastních látek s obsahem takových vektorů.

- 49 Vektory-protilátky (bílkoviny typ vektoru receptor protilátky CD34 (obecně)

ICAM-1

ICAM-2

ICAM-3

E-selectin p-selectin

PECAM integriny, jako VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, beta^alfa?, beta^alfa₈, beta₁alfa_v, LFA-1, Mac-1, CD41a, a pod.

GlyCAM

MadCaml a peptidy) poznámky/oblast použití citace cévní choroby obecně, normální cévní stěna, například v myokardu, aktivovaný endothel, imunitní buňky

1t

II

II

II π

II

II cévní stěny v uzlinách, specifické pro uzliny

II • ·

- 50 fibrin tkáňový faktor myosin

CEA (karcinoembryonální antigen) muciny bílkovina pro odolnost proti léčivům specifický antigen prostaty

Cathepsin B receptor pro transferrin

MoAb 9.2.27

VAP-1 bílkovina pásu 3 thromby aktivovaný endothe1,nádory nekrosa, infarkt srdečního svalu nádory nádory nádory nádory prostaty nádory (k expresi proteáz specificky často dochází u různých nádorů, jednou z nich je Cathepsin B) nádory, stěna buněk cév nádory, antigeny, závislé na růstu buněk lnoucí molekula vzniká při činnosti fagocytů ·· · ··· • · • · • · • ·

	CD44	nádorová buňka
	beta2-mikro- globulin	obecně
	MHC skupina 1	obecně
protilátky	integrin alfavbeta3	nádory, angiogenese	c
protilátky	CD44	nádorové buňky	a
protilátky	beta2-mikro- globulin	obecně	b
protilátky	MHC skupina 1	obecně	b

a) Heider K. Η., Sproll M., S. Susani, E. Pezelt, P. Beaumier E. Ostermann, H. Ahorn a G. R. Adolf, 1996, Characterization a high-affinity monoclonal antibody specific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cell carcinoman, Cancer Immunology Immunotherapy, 43, 245-253.

b) I. Roitt, J. Bristoff a D. Male, 1985, Immunology, Londýn: Gower Medical Publishing, str. 4-7.

c) Stromblad S., a D. A. Cheresh., 1996, Integrins, angiogenesis and vascular cell suvival, Chemistry and Biology, 3, 881 až 885.

• · » ·· • · • · · ·

- 52 Bílkovinné a peptidové vektory - molekuly s adhesí k buňkám a podobně

typ vektoru	receptor	poznámky/použití ref.
L-selectin	CD34 MadCAMl GlyCam 1	cévní onemocnění obecně normální stěna cév,např v srdci, aktivovaný endothel, mízní uzliny
jiné selectiny	uhlohydrátové ligandy (sialyl Lewis x) heparansulfát	cévní choroby obecně, normální cévní stěna, např. v srdci, aktivovaný endothel
RGD-peptidy	integriny	angiogenese
PECAM	PECAM a další	endothel, buňky imunitního systému
integriny, jako VLA-1, VLA-2, VLA-3 VLA-4, VLA-5, VLA-6, beta^alfa?, beta^alfag, beta^alfay, LFA-1, Mac-L, CD41a a pod.	Laminin, kolagen, fibronectin, VCAM-1, thrombo- spondin, vitro- nectin a pod.	endothel, stěny buněk a pod.
receptory integrinu, jako Laminin, kolagen, fibronectin, VCAM-1, thrombo- spondin, vitro- nectin a pod.	integriny, jako buňky imunitního VLA-1, VLA-2,VLA-3, systému, buněčná VLA-4, VLA-5, stěna a pod. VLA-6, beta^alfa?, beta^alfag, beta1~ alfa^, LFA-1, Mac-1, CD41a, a pod.

·· · · ► · · 1 ► · · 4

- 53 ·· ·· > · · > · · · · » · · a molekuly s adhesí k nervovým buňkám (N-CAN) RGD-peptidy proteoglykany N-CAM (homofilní) integriny angiogenese

Vektroy, obsahující cytokiny/růstové faktory/peptidové hormony a jejich fragmenty

typ vektoru	receptor	poznámky/použití
faktor růstu epidermis	EGF-receptor nebo příbuzné receptory	nádory
faktor růstu nervových buněk	NGF-receptor	nádory
somatostatin	ST-receptor	nádory
endothelin	receptor pro endothelin	cévní stěna
Interleukin-1	IL-l-receptor	záněty, různé aktivované buňky
Interleukin-2	IL-2- receptor	II
chemikiny (20 různých cytokinů se společnými receptory)	receptory pro chemokiny, proteoglykany	záněty

• · * 0

0 00 • 0 · ·

faktor nekrosy nádorů	TNF-receptory	záněty
parathyro i dní hormon	PTH-receptory	onemocnění kostí a ledvin
morfogenetický kostní protein	BMP-receptory	kostní choroby
Calcitonin	CT-receptory	kostní choroby
faktory pro růst kolonií (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3)	odpovídající specifické receptory, proteoglykamy	endothel
růstový faktor I, podobný insulinu	IGF-1, receptor	nádory, jiné rostoucí tkáně
atriový natriuretický ANF-receptory faktor	ledviny, stěna cév
Vasopresin	receptor vassopresinu	ledviny, stěna cév
VEGF	VEGF-receptor	endothel, oblasti aangiogenese
růstový faktor fibroblastů	FGF-receptory, proteohglykany	endothel angiogenesse
růstový faktor Schwannových buněk	proteoglykany, specifcické receptory

····

Různé bílkovinné a peptidové vektory ·· ·· φφ *· * · φ · · φ φφφφ φφφφ φ φφφφ · φ φ · • φφφ φφ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφ

- 55 typ vektoru receptor poznámky/použití ref.

Streptavidin	ledvina	choroby ledvin
bakteriální bílkoviny s vazbou na fibronectin	fibronectin	cévní stěna
Fc-část protilátek	Fc-receptory	monocyty, makrofágy, játra
transferrin	receptor pro transferrin	nádory, stěna cév
streptokináza/ tkáňový aktivátor plasminogenu	thromby	thromby
plasminogen, plasmin	fibrin	thrmoby, nádory
proteinázy tukových buněk	proteoglykany
elastáza	proteoglykany
lipoprotein, lipáza	proteoglykany
koagulační enzymy	proteoglykany
mimobuněčná supe roxi di smutáze	proteoglykany

» ···· • · • · · · • · * « · ·

- 56 kofaktor II heparinu faktor přežití sítnicových buněk mozkový mitogen pro vazbu heparinu apolipoproteiny, jako apolipoprotein B apolipoprotein E proteoglykany proteoglykany specifické receptory proteoglykany specifické receptory proteoglykany, specifické receptory, jako LDL-receptor

LDL-receptor proteoglykany bílkoviny, vyvolávající adhesi, jako purpurin proteoglykany virové obalové bílkoviny, jako HIV, virus oparu mikrobiální adhesiny komplex antigenu 85 mycobacterií prekursor beta-amyloidu proteoglykany proteoglykany fibronectin, kolagen, fibrinogen, vitronectin, heparan sulfát beta-amyloid se hromadí při Alzheimerově chorobě tenascin, jako tenascin C heparansulfát, integriny

9999

99

9 9 9 9 9

9999 9 9999

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9999 999 99 99

- 57 ·· ··

Vektory, obsahující nepeptidové agonisty/antagonisty cytokinů/růstových faktorů/peptidových hormonů/molekul, adherujících k buňkám typ vektoru receptor Poznámka/použití ref

--------- - - V - ..... ..... ' ·----— · ' -------- - - - —--------------------------

antagonista endothelinu	receptor endothelinu	buněčná stěna cév
desmopressin (analog vasopressinu)	receptor vaso- pressinu	ledviny, cévní stěny
demoxytocin (analog oxytoxinu)	receptor oxytoxinu reproduktivní orgány, mléčná žláza, mozek
anglotensin II (antagonista receptoru), CV-11974, TCV-116	receptory angiotensinu II	cévní stěna, mozek, nadledvinky
nepeptidové RGD- -analogy	integriny	buňky imunitního systému, cévní stěny a pod.

• · • ·

- 58 •ft ·♦·« • ft ftft > · · » ftftftft

Vektory, obsahující antiangiogenní faktory typ vektoru cíl poznámka/použití re

......- ------------------ - - -..... - - ...

angiostatin	EC nádorů	fragment plasminogenu K
inhibitor, odvozený od chrupavky	EC nádorů	J
beta-cyklodextrin- tetradekasulfát	nádory, záněty	C
fumagillin a analogy	nádory, záněty	E
interferon-alfa	EC nádorů	K
interferon-gamma	EC nádorů	E
interleukin-12	EC nádorů	E
linomid	nádory, záněty	A
medroxyprogesteron	EC nádorů	K
inhibitory metalloproteinázy	- EC nádorů	K
pentosanpoly- sulfát	EC nádorů	K
faktor destiček 4	EC nádorů	M
somatostatin	EC nádorů	K

9«·· 99 99 99 99

9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · ···· 9 99 9 • 999 99 99 999999

99999 9 9

9999 999 99 99 »9 99

suramin	EC nádorů	K
taxol	EC nádorů	K
thalinomid	EC nádorů	K
thrombospondin	EC nádorů	K

Vektory s obsahem angiogenních faktorů typ vektoru cíl poznámka/použití ref.

kyselý růstový EC nádorů K faktor fibroblastů

adenosin	EC nádorů		K
angiogenin	EC nádorů		K
angiotensin II	EC nádorů		K
složky základní membrány	nádory	např. tenascin, kolagen IV	M
základní růstový faktor fibroblastů	EC nádorů		K
bradykinin	EC nádorů		K
peptid, příbuzný genu kaleitóninu	EC nádorů		K
růstový faktor	EC nádorů		K

epidermis «··· »· 00 00 0» • · 0 »00 »000 • 0 0 0 · · 0 ♦ · · 0 0 0 0 000 00 00 000 000 0 00000 0 0 0000 000 00 00 00 00

fibrin	nádory	K
fibrinogen	nádory	K
heparin	EC nádorů	K
histamin	EC nádorů	K
kyselina hyalu- ronová a fragmenty	EC nádorů	K
interleukin-Ialfa	EC nádorů	K
laminin, a jeho fragmenty	EC nádorů	K
nikotinamid	EC nádorů	K
faktor, aktivující destičky	EC nádorů	K
endotheliální růstový faktor, odvozený od destiček	EC nádorů	K
prostaglandiny El, E2	EC nádorů	K
spermin	EC nádorů	K
substance P	EC nádorů	K
transformuj ící růstový faktor alfa	EC nádorů	K

	·· ··»· ·» ·· »· »» ··· * · · · · · · ···· · · · ·· · · · · • ····· · · - 61 -
transformující růstový faktor beta	EC	nádorů	K
faktor nekrosy nádorů-alfa	EC	nádorů	K
vaskulární endo-	EC	nádorů	K

theliální růstový faktor pro propustnost cév vitronectin A

Molekuly vektoru, odlišné od angiogenetických faktorů se známou afinitou pro receptory, spojené s tvrbou nových cév typ vektoru cíl poznámka/použití ref.

angiopoetin	nádory, záněty		B
alfag-antiplasmin	nádory,	záněty
sloučeniny z kombinačních bank	nádory,	záněty	např. látky s vazbou na základní membránu po degradaci
endoglin	nádory,	záněty	D
endosialin	nádory,	záněty	D
endostatin (fragment kolagenu)	nádory,	záněty	M

φφ ·Φ·Φ ·· ·· φφ φφ

ΦΦΦ Φ Φ 9 ΦΦΦΦ • φφφ · e ··* · · · φ • ······· ··· »·· • φφφφφ φ φ φφφφ φφφ φφ φφ φφ ·φ

- 62 antigen, příbuzný faktoru VII fibrinopeptidy základní růstový faktor fibroblastů růstový faktor hepatocytů růstový faktor, podobný insulinu interleukiny inhibiční faktor leukemie inhibitory metalloproteinázy nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty monoklonální protilátky nádory, záněty peptidy, např. cyklický nádory, záněty rgd_dfv placentami růstový faktor placentární faktor, příbuzný proliferinu nádory, záněty nádory, záněty

D

ZC

E

I

R např. IL-8 I

A např. batimastat E např. proti angiogenetickému faktoru nebo receptoru nebo složkám fibrinolytického systému

B, Q

J

E • · · · · · • ·

44 44 44

plasminogen	nádory,	záněty		M
aktivátory plasminogenu	nádory,	záněty		D
inhibitory aktivátoru plasminogenu	nádory,	záněty		u,
látky, antagonizující faktor pro aktivaci destiček	nádory,	záněty	inhibice angio- genese	A
růstový faktor, odvozený od destiček	nádory	, záněty		E
pleiotropin	nádory,	záněty		ZA
proliferin	nádory,	záněty		E
bílkovina, příbuzná proliferinu	nádory,	záněty		E
selektiny	nádory,	záněty	např. E-selektin	D
SPARC	nádory,	záněty		M
hadí jed (s obsahem RGD)	nádory,	záněty		Q
tkáňový inhibitor metalloproteináz	nádory,	záněty	např. TIMP-2	U
thrombin	nádory,	záněty		H
tetradekapeptid,	nádory,	záněty		H

aktivující receptor thrombinu

- 64 D

ZA

99 » · · » · · · · thymidinfosforyláza faktor růstu nádorů nádory, záněty nádory, záněty

Receptory/cíle spojené s angiogenesí typ vektoru cíl poznámka/použití ref.

biglykan

CD34

CD44 kolagen typu I, IV, VI a VIII nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty dekorin nádory, záněty dermatansulfát proteoglykan dermatansulfát proteoglykan dermatansulfát proteoglykany endothelín receptory endothelinu fibronektin

Flk-1/KDR, Flt-4

FLT-1 (tyrosinkináza, podobná fms)

nádory,	záněty	X
nádory,	záněty	G
nádory,	záněty	G
nádory		P
nádory,	záněty	receptor VEGF D
nádory,	záněty	receptor VEGF-A 0

• * • ·

- 65 heparansulfát receptor růstového faktoru hepatocytů (c-met) růstový faktor, podobný nádory, záněty insulinu/receptor pro mannoso-6-fosfát integriny:

beta_o a beta_c, o o integrin alfa_vbeta₃, integrin alfagbeta^, integriny alfa^, integriny beta^, integrin akfa₂beta.j_L, integrin alfa^betag, integrin alfa₅ integrin alfa^beta^, receptory fibrinu molekula 1 a 2 pro nitrobuněčnou adhesi produkt zkráceného genu

Ly-6 nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty

P

I

R

D, P receptor lamininu podjednotka receptoru fibronektinu

P

T protein, aktivující lymfocyty N • · ·· ·· » · · 4 » · · <

• · · · • ·

metalloproteinázy matrice	nádory,	záněty		D
MHC skupina II	nádory, záněty
produkty genu	nádory,	záněty		T
osteopontin	nádory			Z
PECAM	nádory,	záněty	alias CD31	P
receptor aktivátoru plasminogenu	nádory,	záněty		ZC
receptory růstových faktorů, odvozených od destiček	nádory,	záněty		E
selektiny E a P	nádory,	záněty		D
sialyl Lewis-X	nádory,	záněty	antigeny krevních skupin	M
stresové bílkoviny včetně bílkovin tepelného šoku	nádory,	záněty	doprovodné molekuly
syndekan	nádory,	záněty		T
thrombospondin	nádory,	záněty		M
TIE-receptory	nádory,	záněty	tyrosinkinázy s oblastmi Ig a EGF	E

tkáňový faktor tkáňový inhibitor metalloproteináz receptor transformačního růstového faktoru receptor aktivátoru plasminogenu typu urokinázy molekuly, lnoucí ke stěně cév, VCAM bílkovina, příbuzná faktoru růstu cévního endothelu receptor faktoru A růstu cévního endothelu antigen, příbuzný von Willebrandovu faktoru nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty

Z např. TIMP-2 U

- 68 poznámka/použití ref.

Oligonukleotidové vektory typ vektoru receptor

oligonukleotidy, komplementární např. ke genům pro RNA ribosomů, Álu-sekvence	DNA je dostupná až po nekrose	infarkt myokardu a ostatní choroby, zahrnující nekrosu
oligonukleotidy,	DNA je dostupná	nádory
komplementární ke	až po nekrose v
specifickým mutacím	oblasti chorobných
jako mutovaným	změn
onkogenům
oligonukleotidy,	DNA původce	virové nebo bakte-
komplementární k DNA	infekce	riální infekce
původce infekce
oligonukleotidy, tvo-	jako svrchu	jako svrchu
řící trojitý nebo
čtyřnásobný helix
oligonukleotidy	bílkovina s vaz-	nádory,
se sekvencí, roz-	bou na DNA, jako	aktivovaný endothel
poznávanou bílkovi-	faktory trans-	aktivované buňky
nami , schopnými	kripce, jejichž	imunitního systému
vazby na DNA nebo RNA	exprese je akti-

vována u nádorů nebo buněk endothelů/imuni tního systému

- 69 Modifikované oligonukleotidové vektory typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

fosfothioátový oligonukleotid jako pro jako pro nemodifikovaný nemodifikovaný oligonukleotid oligonukleotid

-O-methylsubstituované oligo- >

nukleotidy cirkulární oligonukleotidy oligonukleotidy s vlásenkovou strukturou pro snížení rozkladu oligonukleotidy s koncovou fosfothioátovou skupinou

2'-fluorooligonukleotidy

2*-aminooligonukleotidy látky, schopné vázat DNA, konjugované s oligonukleotidy peptidové nukleové kyseliny (PNA, oligonukleotidy s peptidovou kostrou) zvýšená afinita vazby ve srovnání s čistými oligonukleotidy zvýšená afinita vazby a stálost ve srovnání s běžnými oligonukleotidy • ΦΦΦ φ φφφφ φ φφ φ

- 70 φ φ ΦΦ·· • φ φ φ

·.·»

Nukleosidové a nukleotidové vektory typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

adenosin nebo receptory cévní stěna, srdce analogy adenosinu

ADP, UDP, UTP a další různé recep- řada tkání, jako tory nukleotidů mozek, mícha, ledviny, slezina

Receptory, obsahující látky, schopné vázat DNA typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

akridinové deriváty DNA je dostup- nádory, infarkt distamycin, netropsin, ná až po myokardu a další actinomycin D, echino- nekrose choroby s nekrosou mycin, bleomycln a pod. nebo uvolněním DNA z buněk

Receptory, obsahující substráty pro proteázu typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

peptidové nebo Cathepsin B nádory, u nichž donepeptidové sub- chází k vysoké stráty expresi proteázy, jako Cathepsinu B • « ·· • ·

- 71 • · · ·

Receptory s obsahem inhibitorů proteázy typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

peptidové nebo nepeptidové inhibitory, jako N-acetyl-Leu-Leu- -norleucinal	Cathepsin B	nádory, u nichž dochází k vysoké expresi různých proteáz, například Cathepsinu B
bestatin /(2S,3R)-3- -amino-2-hydroxy-4-fenylbutanoyl/-L-leucinhydrochlorid	aminopeptidáza	nádory, například na povrchu buněk
pefabloc, 4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoridhydrochlorid	serinproteázy	nádory, buněčné stěny a pod.
běžně dodávané inhibitory. jako kaptopril, enalapril nebo ricionopril	enzym pro přeměnu angiotensinu	endotheliální buňky
nepeptidové sloučeniny s nízkou specifičností	koagulační faktory	poranění buněčných stěn, nádory a pod.
nexiny proteáz (jejich mimobuněčné inhibitory)	proteoglykany

antithrombin proteoglykany, koagulační faktory • · · * • · · * • · · · • ·

Vektory z kombinačních bank typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

protilátky se	kterýkoliv z	jakákoliv normální
strukturou,	uvedených cílů	nebo patologická
určenou při	nebo neznámý	struktura jako
vzniku	při funkční	thromby, nádory,
	selekci	srdeční cévy

peptidy se sekvencí stanovenou v průběhu tvorby oligonukleotidy se sekvencí, stanovenou v průběhu tvorby modifikace oligonukleotidů, vytvořené jako svrchu jiné chemické látky, se strukturou, stanovenou v průběhu tvorby

Uhlohydrátové vektory typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

neoglykoproteiny makrofágy obecná aktivace/ zánět

	Β B Β B BB ·· BB BB BB • BB BBB B · · · Β Β BB Β Β Β BB B · · · • BBBBB · B - 73 -
oligosacharidy s koncovou galaktosou	receptor pro játra asialoglyko- protein
hyaluronan	aggrecan (proteoglykan), vazné bílkoviny, receptory na povrchu buněk: CD44
mannosa	mozkomíšní bariera, mozkové nádory a další choroby se změnami BBB
bakteriální	11
glykopeptidy

Lipidové vektory
typ vektoru	receptor poznámka/použití ref.

lipidy typu LDL

LDL-receptory atherosklerosa

-74 •ft ···· ft · • ftftft • ft ftft • · · • ftftft ft • · • ftft • · · • ftft ·· ftft • ft

Vektory s obsahem malých molekul typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

adrenalin beta-blokátory alfa-blokátory benzodiazepiny analogy serotoninu antihistaminy antagonisté receptorů acetylcholinu verapami1 nifedipin amilorid odpovídající receptory adrenergní beta-receptory adrenergní alfa-receptory receptory serotoninu receptory histaminu receptory acetylcholinu blokátory

Ca^⁺-kanálů blokátory

Ca^^-kanálů výměna Na⁺/H⁺ části myokardu, citlivé na beta-1-blokátory cévní stěna buněčná stěna srdeční sval srdeční sval blokování výměny v ledvinách, řízení buňkami, stumulovanými růstovými faktory ···· • ·

999

9 9 9 · · · · • · · · · · ·

9 999 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 999999

9 9 9 9 9 9 9

9 999 99 ·+ 99 99 digitalisové glykosidy

Na⁺/K⁺-ATP-ázy látky, antágonizující nebo s agonistickým účinkem na receptory thromboxanu/prostaglandinu glutathion receptory thromboxanu/ prostaglandinu srdeční sval, periferní cévy, centrální nervo vý systém cévní stěny, endothel biotin folát riboflavin methotrexát chlorambucil receptory glutathionu a leukotrienu plíce, mozek transport biotinu na povrch buněk transport folátu na povrch buněk transport riboflavinu na povrch buněk transport folátu na povrch buněk obecné transportní mechanismy nádory • 4

- 76 Literární údaje k tabulkám:

A. Aurbach W. a R. Auerbach, 1994, Angiogenesis inhibition: a review. Pharmac. Ther., 63, 265 až 311.

B. Barinaga M., 1997, Designing Therapies That Target Tumor Blood Vassels. Science, 275, leden 24), 482 až 484.

C. J. Folkman, P. B. Weisz, M.M. Joullié, W. W. Li, a

W. R. Ewing, 1989, Control of Angiogenesis With Synthetic Heparin Substitutes. Science 243, 1490 až 1493.

D. Fox S. A. a A. L. Harris, 1997, Markers of tumor angiogenesis: Clinical applications in prognosis and anti-angiogenic therapy. Investigational New Drugs 15, (1), až 28.

E. Gastl G., T. Hermann, M. Steurer, J. Zmija, E. Gunsilius,

C. Unger a A. Kraft, květen 1997, Angiogenesis as a target for tumor treatment. Oncology 54, (3), 177 až 184.

F. Griffioen A. W., M. J. H. Coenen, C. A. Damen, S. Μ. M. Hellwig, D. H. J. Venweering, W. Vooys, G. H. Blijham, a G. Groenewegen, 1. srpna 1997, CD44 is involved in tumor angiohenesis, an activation antigen on human endothelial cells. Blood 90, (3), 1150 až 1159.

G. Hlatky L., P. Hahnfeldt, a C. N. Coleman, 1996, Vascular endothelial growth factor: environmental Controls and effects in angiogenesis, Brit. J. Cancer, 74, (Suppl. XXVII): 151 až 156.

H. Maragoudakis Μ. E., E. Pipili-Synethos, E. Sakkoula,

D. Panagiotopoulos, N. Craniti a J. M. Matsoukas,

- 77 00 0000 • ·

0 0 0

0» • · ·

0 0 0 0 • 0 ··

0 0 0

0 0 0

1996, Inhibition of TRAP-induced angiogenesis by the tripeptide Phe-Pro-Arg, a thrombin-receptor-derived peptide analogue, Letters in Peptide Science, 3, 227 až 232.

I. Nguyen M., 1997, Angiogenic factors as tumor markers. Investigational New Drugs 15, (1), 29 až 37.

J. Ono Μ., H. Izumi, S. Yoshida, D. Gtot, S. Jimi, N. Kawahara, T. Shono, S. Ushiro, M. Ryuto, K. Kohno,

Y. Sáto a M. Kuwano, 1996. Angiogenesis as a new target for cancer treatment. Cancer Chemoter. Pharmacol.,

38, (Suppl), 78 až 82.

K. Passe T. J., D. A. Bluemke, a S. S. Siegelman,

June 1997, Tumor angiogenesis: Tutoriál on implications for imaging. Radiology, 203 (3), 593 až 600.

L. Saclarides T. J., únor 1997, Angiogenesis in colorectal cancer, Surgical Clinics of North America 77, (1), 253.

M. Sage E. Η. , květen 1997. Pieces of eight: Bioactive fragments of extracellular proteins as regulators of angiogenesis. Trends in Cell Biology, 7 (5), 182-186.

N. Sagi-Assif 0., A. Traister, B. Z. Katz, R. Anavi,

M. Eskenazy a I. P. Witz, 1996, TNFalfa and anti-Fas antibodies regulate Ly-6E.l expression by tumor cells:

A possible link between angiogenesis and Ly-6E.l. Immunology Letters, 54, 207 až 213.

O. Strawn L. M., G. McMahon, H. app, R. Schreck, W. R. Kuchler, Μ. P. Longhi, T. H. Hui, C. Tang, A. Levitzki,

A. Gazit, I. Chen, G. Keři, L. Orfi, W. Risau, I. Flamme, A. Ullrich, K. P. Hirth, a L. K. Shawyer, 1996.

• · • ·

- 78 • · φφφφ φ* φφ φ · • φ φ φφφ φ • φφφ φ · φφφ φ

Flk-1 as a Target for Tumor Growth Inhibition, Cancer Res.,

56, 3340 až 3545.

P. Stromblad S., a D. A. Cheresh., února 1996, Cell adhesion and angiogenesis. Trends in Cell Biology 6, (12), 462 až 468.

Q. Stromblad S. a D. A. Cheres, listopad 1996, Integrins, angiogenesis and vascular cell survival. Chemistry and Biology, 3, (11), 881 až 885.

R. Volpert 0., D. Jackson, N. Bouck a D. I. H. Linzér, prosinec 1996, The insulin-like growth factor II/mannose 6-phosphate receptor is required for proliferin-induced angiogenesis. Endocrinology, 137 (9), 3871 až 3876.

S. Yoshida 0. Μ., T. Shono, H. Izumi, T. Ishibashi. H. Suzuki, a M. Kuwano, 1997. Involvement of Interleukin-8, Vascular Endothelial Growth Factor, and Basic Fibroblast Growth Factor in Tumor Necrosis Factor Alpha-Dependent Angiogenesis. Mol. Cell. Biol., 17, 4015 až 4023

T. Zimrin A. Β., M. S. Pepper, G. A. McMahon, F. Nguyen,

R. Montesano a T. Maciag, 1996. An Antisense Oligonucleotide to the Notch Ligand Jagged Enchances Fibroblast Growth Factor-induced Angiogenesis in vitro.

J. Biol. Chem., 271, prosinec 20, 3499 až 3502.

U. Albíni A., R. Soldi, D. Giunciuglio, E. Giraudo, R. Benelli, R. Primo, D. Noonan, M. Salio, G. Camussi,

W. Rpckl a F. Bussolino, 1996. The angiogenesis induced by HIV-1- Tat protein is· mediatedyby the Flk-1/KDR receptor on vacular endothelial cells. Nátuře Medicine,

2, (12 prosinec), 1371 až 1374.

00 · 0 0 · · · ·· ···* • » 0 ·0 • 0 0 • · · » · • 0 00

V. Ferrara, 1996, The biology of vascular endothelial growth factor, Molecular, Cellular and Clinical Aspects of Angíogenesis, ed. Μ. E. Maragoudakis, New York;

Plenům Press.

X. Jackson R. L., S. J. Busch a A. J. Cardin, 1991, Glycosaminoglycans: Molecular Properties, Protein Interactions, and Role in Physiological Processes. Physiological Reviews, 71 (2), 481 až 435.

Y. Kinsella M. G., C. K. Tsoi, Η. T. Jarvelainen a Τ. N. Wight, 1997, Selective expression and processing of biglycan during migration of bovine aortic endothelial cells - The role of endogenous basic fibroblast growth factor. Journal fo Biological Chemistry, 272, 318 až 325

Z. Folkman J., 1996, Tumor angíogenesis and tissue factor. Nátuře Medicine, 2, 167 až 168.

ZA. Relf M. S., LeJeune, P. A. Scott, S. Fox, K. Smith,

R. Leek, A. Moghaddam, R. Whitehouse, R. Bicknell a A. L. Harris, 1997. Expression of the angiogenic factors vascular endothelial cell growth factor, acidic and basic fibroblast growth factor, tumor growth factor beta-1, platelet-derived endothelial cell growth factor, breast cancer and its relation to angíogenesis. Cancer Res., 57, 963 až 969.

ZB. Carmeliet P., L. Moons, M. Dewerchin, N. Mackman,

T. Luther, G. Breier, V. Ploplis, M. Muller, A. Nagy,

E. Plow, R. Gerard, T. Edgington, W. Risau, D. Collen, 1997, Ann., Ν. Y. Acad. Sci., 811, 191 až 206.

ZC. Van Hinsberg, P. Koolwijk, R. Haanemaijer, 1997,

Role of fibrin and plasminogen activators in repairassociated angiohenesis: in vitro studies with human endothelial cells, EXS 79, 391 až 411.

• ·

- 80 ·· ···· • · • ··· »· »♦ ··

9 4 9 9 9 9

9 999 9 9 9 9

999 9 9 99 *99 499

9 9 9 9 9 9 9

999 999 99 99 99 99

Passe Τ. J., D. A. Blumke a S. S. Siegelman, 1997, Radiology 203, 593 až 600.

Následující příklady slouží k ilustraci koncepce mnoho násobné specifičnosti pro různé receptory. Je samozřejmé, že by bylo možno navrhnout ještě další kombinace vektorů, vazných prvků a reportérů a také technologií, kterými by bylo možno připravit další vektory. Potvrzení mikročásticové povahy produktu je možno uskutečnit mikroskopicky podle mezinárodní patentové přihlášky WO 96/07434. Měření průchodu ultrazvuku je možno uskutečnit běžným způsobem pomocí převaděče se širokým pásmem tak, aby bylo možno identifikovat pro dukty, schopné zvýšeným způsobem zeslabit zvuk ve srovnání se standardním prostředkem. K potvrzení vazby protilátek na produkty je možno použít průtokovou cytometrickou analýzu. Schopnost cílených prostředků specificky se vázat na buňky, u nichž dochází k expresi cílové látky je možno sledovat mikroskopicky a/nebo při použití průtokové komory s obsahem imobilizovaných buněk, například při použití skupiny buněk, u nichž dochází k expresi cílové struktury a další skupiny buněk, u nichž k této expresi nedochází. K analýze vazby biotinu je možno použít streptavidin/avidin, značený radioaktivními látkami, fluorescenčními látkami nebo značený enzymatickým způsobem.

• · · · φ φ φ • · φ φ φ

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava a biologické vyhodnocení mikrobublinek plněných plynem zapouzdřených DSPS dopovaným lipopeptidem tvořeným peptidem vázajícím heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidem (WOPPRARI)

Tento příklad je zaměřen na přípravu cílených mikrobublinek obsahujících mnohotné peptidové vektory seskupené do lineárního řetězce.

část a: lipopeptid skládající se z peptidu vázajícího heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidem (WOPPRARI)

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů 433A za použití pryskyřice Fmoc-Ile-Wang (Novabiochem) v množství řádu 0.1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC (kolona Vydac 218TP54) se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 40 minut (A = 0,1%

Nlli

vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 16 mg čistého produktu. Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekcí v UV 260 a fluorescencí Ex₂₈₀, Em₃₅₀ - doba retence produktu = 19,44 minut).

Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno M+H 2198, nalezeno 2199.

část b: příprava mikrobublinek plněných plynem zapouzdřených DSPS dopovaným mnohoúčelovým lipopeptidem skládajícího se z peptidu vázajícího heparin-sulfát (KRKR) a fibronektin-peptid (WOPPRARI)

Do každé ze dvou zkumavek se přidá 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg lipopeptidu vyrobeného v části a) a do každé zkumavky se dále přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanem. Zkumavky se 45 vteřin protřepávají v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a analyzují se počítačem Coulter Counter [velikost l-3mikrony (87%), 3-5mikronů (11,5%)] a zeslabením zvukových ozev (frekvence při maximálním zeslabení: 3,5MHz). Mikrobublinky jsou stálé při tlaku 15,960 kPa (120 mmHg). Analýzou hmotového • · Β Β · · • Β ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒ

spektra MALDI se potvrdí včlenění lipopeptidu do DSPS mikrobublinek následovně: přibližně 0,05-0,1 ml suspenze mikrobublinek se přemístí do čisté zkumavky a přidá se 0,05-0,1 ml metanolu. Suspenze se 30 vteřin zpracovává působením ultrazvuku a roztok se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI - M+H 2200 (pro lipopeptid vypočteno 2198).

část c: zkouška in vitro mikrobublinek plněných plynem zapouzdřených DSPS dopovaným mnohoúčelovým lipopeptidem skládajícím se z peptidu vázajícího heparin-sulfát (RRKR) a fibronektin-peptid (WOPPRARI): vazba mikrobublinek k endoteliálním buňkám během průtoku

V 260 ml kultivační misce Nunc (chutney 153732) se na živném prostředí RPMI 1640 (Bio Whittaker), do kterého se přidá 200 mM L-glutaminu, směs 10000 U/ml penicilinu a 10000 μ9/πι1 streptomycinu a 10% fetálního hovězího séra (Hyclone Lot číslo AFE 5183), se kultivuje lidská endoteliální buněčná linie ECV 304 odvozená z normální pupeční šňůry (ATCC CRL-1998). Buňky se předem kultivují (split ratio 1:5 do 1:7) k vytvoření souvislé vrstvy. Krycí sklo o průměru 22 mm (BDH, katalogové číslo 406/0189/40) se po sterilizaci umístí na dno kultivačních misek (Costar) s 12 prohlubněmi a na ně se přidá 0,5 ml kompletního kultivačního živného prostředí se sérem. Když dojde k vytvoření souvislé vrstvy buněk

• · · · · · · ·

přemístí se krycí sklíčka do k tomu účelu zhotovené průtokové nádoby, kterou tvoří žlábek ve skleněné desce, nad kterým je umístěno krycí sklíčko s buňkami otočeným směrem do žlábku, takže vytvoří průtokový kanál. Mikrobublinky (připravené podle postupu části b) umístěné při teplotě 37°C v zásobní nádobě se za použití peristaltického čerpadla nechají procházet ze zásobní nádoby do průtokové nádoby a zpět do zásobní nádoby. Rychlost průtoku simuluje fysiologické střihové namáhání. Průtoková komora se umístí pod mikroskop, kterým se přímo sleduje interakce mezi mikrobublinkami a buňkami. Do mikroskopu zavedená kamera je spojená s barevným monitorem a tiskárnou. Míra postupného hromadění mikrobublinek na buňkách byla závislá na rychlosti průtoku. Při zvýšení průtoku docházelo k oddělování buněk z krycího sklíčka, ale mikrobublinky zůstaly vázané na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a unikaly z průtokové komory již při velmi malém průtoku.

část d: Zkouška in vivo - pokus na psovi

Případ 1

Kříženec psa o hmotnosti 22 kg se uvedl do anestezie pentobarbitalem a mechanicky se ventiloval. Hrudník byl otevřen střední sternotomií, odstranilo se přední perikardium a mezi srdce a převaděč P5-3 snímače ultrazvuku ATL HDI-3000 se umístí vložka ze silikonové pryže. OSnímač ultrazvuku se nastaví na intermitentní snímání • · • · krátké osy se zobrazením jednou na konci každé systoly při zpožděném spouštění EKG. Jako rychlá intravenózní dávka se aplikuje přesně 2 ml mikrobublinek popsaných v části b) a o tři vteřiny později zobrazovaná pravá komora obsahovala kontrastní materiál. 0 další tři vteřiny později byla také levá komora naplněna a zadní části levé komory se objevilo přechodný stín zeslabení, který činil tyto části levé komory nezřetelné. V myokardu došlo k značnému zjasnění a stín zeslabení ubývá v dolní části srdce směrem k levé komoře. Po průchodu počáteční dávky se ultrazvukový skenr nastaví na kontinuální zobrazování při vysokém výkonu. Tento postup vede ke zničení kontrastních ultrazvukových činidel a mikrobublinek v zobrazované tkáni. Po několika vteřinách se skenr nastaví zpět do počátečního nastavení. Myokard byl pak tmavší a téměř na úrovni bazálních hodnot. Posunutím zobrazení do nové polohy dojde k znovuobjevení kontrastu, přesunutím zpět do počáteční polohy dojde opět ke snížení jasnosti na bazální hodnoty.

Případ 2 (porovnávací)

Stejným způsobem jako v předchozím případu se aplikují přesně 2 ml mikrobublinek připravených podle postupu části b), přičemž přípravek neobsahoval žádný lipopeptid. Zjasnění myokardiálního UV obrazu trvalo kratší dobu a bylo mnohem méně intenzivní. Po odeznění přechodného oslabení v levé komoře došlo téměř k úplné ·· ···· ·· ·· • · · · · · • · ·· · · · · · ztrátě kontrastních účinků. Také nedošlo ke zlepšení myokardiálního echa v zadních částech levé komory uvedené v příkladě 1.

Příklad 2

Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a dopované RGDC-Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE a lipopeptidem skládajícím se z peptidu vázajícího heparin-sulfát (KRKR) a fibronektin-peptidu (WOPPRARI)

Příklad popisuje přípravu cílených mikrobublinek obsahujících mnohočetné peptidové vektory část a: PE-PEG₂₀₀₀~Mal (3-maleimidopropionylamido-PEG₂₀₀₀-acyl-distearoyl-f osf atidyl-etanolamin)

Směs 37,40 mg (0,005 mmol) distearoyl-fosfatidyl-etanolaminu (DSPE), 100 mg (0,25 mmol) N-hydroxysukcinimido-PEG₂₀₀₀-maleimidu (NHS-PEG-MAL) a 35 μΐ (0,25 mmol) trietylaminu v roztoku chloroformu a metanolu v poměru 3:1 se při teplotě místnosti míchá 24 hodin. Po odpařování za sníženého tlaku se zbytek čistí rychlou chromatografií pří eluci směsí chloroformu a metanolu v poměru 8:2. Vznikne 92 mg bílé voskovité látky s výtěžkem 66%. Struktura se ověří NMR a maldi-hmotovým spektrem.

• 9 99

část b: příprava RGDC

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Cys(Trt)-Wang pryskyřice (Novabiochem) v množství řádu 0,25 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězec ochranných skupin se provádí ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT, 5% fenolu a 5% vody. Po odpařování se několikrát sraženina peptidu rozetře s dietyleterem. Po sušení na vzduchu se surový peptid čistí preparativní HPLC, podíly obsahující čistý produkt se sloučí a lyofilizuj se. Provede se analytická HPLC a MALDI hmotová spektrometrie.

část c: Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a dopované RGDC-Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE a lipopeptidem skládajícím se z peptidu vázajícího heparin-sulfát (KRKR) a fibronektin-peptidu (WOPPRARI)

Do čisté zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS, 0,5 mg výsledného lipopeptidu části a) příkladu 1 a 0,5 mg PE-PEG-Mal (část a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 3-5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad • 0 0000 • 0 reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, vytvořené mikrobublinky se 3 minuty centrifugují rychlostí 1000 otáček za minutu a infranatant se vymění za 1 ml fosfátový pufr (PBS) obsahující 1 mg peptidu RGDC a pH se upraví na pH 8. Konjugační reakce probíhá 2 hodiny, mikrobublinky se pak promyjí PBS a vodou tak, aby při MALDI-hmotové spektrometrii nebyl v infranatantu prokázán podíl peptidu RGDC, který nepodlehl reakci. Mikrobublinky se sledují na počítači Coulter Counter (98% v rozmezí od 1 do 7 mikronů).

část d: Zkouška vazby ín vitro

Zkouškou in vitro popsanou v části c) příkladu 1 se sleduje vazebná shopnost mikrobublinek k buňkám v podmínkách průtoku. V závislosti na rychlosti průtoku docházelo k postupnému hromadění mikrobublinek na buňkách. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a již při velmi nízkém průtoku vymizely z průtokové komory.

Příklad 3

Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené DSPS, thiolovanou anti-ICAM-l-Mal-PEG₂₀₀₀-PE a thiolovanou anti-CD62-Mal-PEG₂₀₀₀-PE

Tento příklad je zaměřen na přípravu mikrobublinek

9999 • 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 · 999 9 99 9

9

- 90 _*······

9 9 9 9 ·

99 99 99 obsahujících vektory s řadou protilátek pro cílené ultrazvukové zobrazení.

část a: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené DSPS a PE-PEG₂₀₀₀-Mal

Do čisté zkumavky se umístí 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg PE-PEG₂₀₀₀-Mal (část a příkladu 2) a přidá se 1 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zahřívá na teplotu 80°C, a pak se filtruje přes filtr s velikostí ok 4,5 mikronu. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se protřepává 45 vteřin v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se třikrát promyjí destilovanou vodou.

část b: thiolace protilátek anti-CD62 a anti-ICAM-1

V 0,5 ml fosfátového pufru (PBS) o pH 7 se rozpustí 0,3 mg protilátky anti-CD62 (resp. 0,3 mg anti-ICAM-1) a do reakčních roztoků se přidá Trautovo činidlo. Roztoky se 1 hodinu míchají při teplotě místnosti. Přebytek činidla se z upraveného proteinu oddělí na NAP-5 koloně (Pharmacia).

část c: Konjugace thiolovaných protilátek anti-CD62 a anti-ICAM-1 s mikrobublinkami plněnými plynem, zapouzdřené DSPS a DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL ·· 444· ·α ·· ·· * · · ft · · ftftftft • ··· · · ftftft · · · 9 • · 4 4 4 4 4 4 ftftft 944

4 9 4 4 4 4 ft • ftftft ftft* ·· ftft ·· 99

Do podílu mikrobublinek připravených v části a) se přidá 0,5 ml smíchaných thiolovaných protilátek připravených v části b). Konjugace reakční směsi umístěné na výkyvnou třepačku probíhá 30 minut. Infranatant se během 5 minut oddělí centrifugací rychlostí 2000 otáček za minutu. Mikrobublinky se dále třikrát promyjí vodou.

Vmezeřený řetězec PEG může být delší (PEG₃₄₀₀ a PEG₅₀₀₀) nebo kratší (PEG₆₀₀ nebo PEG₈₀₀ ) řetězce. Lze přidat třetí protilátku, např. thiolovanou protilátkou anti-CD34.

Příklad 4

Cílené mikrobublinky plněné plynem tvořené DSPS potahovaným nekovalentně vázaným polylysinem a složeným peptidem tvořeným složkou vázající PS a sekvencí fibronektin-peptidu NH₂-F.N.F.R.L.K.A.G.O.K.I.R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I-OH část a: složený peptid obsahující složku vázající PS a fibronektinový fragment NH₂-F.N. F. R.L.K. A. G.O.K.I.R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I-OH

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Ile-Wang (Novabiochem) pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití

HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT a 5% vody za vzniku 302 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 25 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 20 do 40% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctová a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctová v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizací vznikne 10 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 20-50% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm a 260nm - doba retence produktu =

12,4 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2856, nalezeno 2866.

část b: mikrobublinky plněné plynem obsahující DSPS potahovaný nekovalentně vázaným polylysinem a složeným peptidem, který tvoří složka vázající PS a sekvence fibronektin-peptidu NH₂-FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI-OH

Do čisté zkumavky se naváží 5 mg DSPS (Avanti), 0,2 mg poly-L-lysinu (Sigma) a 0,2 mg peptidu připraveného v části a). Do zkumavky se dále přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5

- V3' minut zahřívá k 80°C. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se centrifugují 3 minuty frekvencí 1000 otáček za minutu. Následuje důkladné promývání vodou, PBS a vodou. Ve výsledném roztoku se pomocí MALDI hmotové spektrometrie sleduje obsah polylysínu a peptidu. Konečný promývací roztok neobsahuje žádný polypeptid. Přidá se 0,5 ml acetnitrilu a mikrobublinky se zničí působením ultrazvuku. Za použití MALDI hmotové spektrometrie se sleduje přítomnost polylysínu a složeného peptidu obsahujícího složku vázající PS a fibronektin:

	MALDI vypočteno	MALDI nalezeno
lysin	786, 914,	790, 919,
	1042, 1170	1148, 1177
vázající DSPS	2856	2866

Vmezeřený prvek (-GGG-) ve složeném peptidu obsahujícím složku vázající PS a fibronektin lze zaměnit za jiný vmezeřený prvek, jako např. PEG₂₀₀₀ nebo polyalanin (-AAA-). Metodou předběžného cílení lze nejprve složený peptid tvořený ze složky vázající PS a sekvence fibronektinu spojit s buňkami prostřednictvím peptidu vázajícího fibronektin, a následně zapojením PS mikrobublinek, které se pak vážou s peptidem vázajícím PS.

• · 9 · · · • · 9 9

9 ·

- .Μ

Příklad 5

Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotin-PEG₃₄₀₀-alanyl-cholesterolem a s navázaným streptavidin/biotinyl-endotelin-l-peptidem (biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp OH) a biotinylovaným peptidem bránícímu polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS · NH₂)

Tento příklad je zaměřen na přípravu cílených, mikrobublinek zobrazitelných ultrazvukem, zatímco streptavidin slouží jako spojovací činitel mezi biotinylovaným(i) nositelem(y) informací a vektorem(y).

část a: biotin-PEG₃₄₀₀-h-Alanin-cholesterol

Do roztoku 15 mg (0,03 mmol) cholesteryl-h-alanin-hydrochloridu (příklad 59) ve 3 ml směsi chloroformu a vodného metanolu v poměru 2,6:1 se přidá 42 ml (0,30 mmol) trietylaminu. Reakční směs se 10 minut míchá při teplotě místnosti a po kapkách se přidá roztok 100 mg (0,03 mmol) biotin-PEG₃₄₀₀-NHS v 1 ml 1,4-dioxanu. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti se směs dosucha odpaří a zbytek se čistí rychlou chromatografii za vzniku 102 mg bílých krystalů s výtěžkem 89%. Struktura produktu se ověří MALDI-hmotovou spektrometrií a NMR.

část b: biotinylovaný endotelin-l-peptid (biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp· OH)

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů • · • · • · · · · · ·« ·· • · · · · · ···· · · · ··

- 9Š’ΑΒΙ 433A za použití Fmoc-Trp(Boc)-Wang (Novabiochem) pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice se a postranního řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% anisolu a 5% vody za vzniku 75 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 20 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 30 do 80% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vzniknou 2 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 30-80% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 12,6 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1077, nalezeno 1077.

část c: biotinylovaný peptid bránící polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS -NH₂)

Tento peptid se vyrobí a čistí podle postupu uvedeného v předchozí části b). Charakteristika čistého produktu se provede HPLC a MALDI hmotovou spektrometrií.

φ φ · · · · φ φ φ φ část d: Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotin-PEG₃₄₀₀-b-Alanin-cholesterolem

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg biotin-PEG_34Q0-b-Alanin-cholesterolem (část a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavky se 45 vteřin protřepávají v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a analyzují se počítačem Coulter Counter a měřením zeslabení ultrazvukových ozev.

část e: Konjugace fluoresceinem značeného streptavidinu a biotinylovaných peptidů popsaných v částech b) a c)

Do mikrobublinek připravených v části d) se přidá roztok 0,2 mg streptavidinu konjugovaného s fluoresceinem v 1 ml PBS. V reakční směsi umístěné na výkyvné třepačce probíhá 3 hodiny konjugace při teplotě místnosti. Provede se důkladné promývání vodou a analýza fluorescenční mikroskopií. Mikrobublinky se 2 hodiny inkubují v 1 ml PBS obsahujícím 0,5 mg biotinyl-endotelin-1peptidu (část b) a 0,5 mg biotinylovaného peptidů bránícího polymeraci fibrinu (část c). Důkladným promýváním dojde k odstranění nekonjugovaného peptidů.

·· · ·«· » ·· • · • · · · · η·*

Příklad β

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotinylovaným lipopeptidem k přípravě 'sandwich' produktu se streptavídinem a se směsí biotinyl-endotelin-1-peptidu (biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH) a biotinylovaného peptidu bránícího polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS · NH₂) část a: lipopeptid dipalmitoyl-lysinyl-tryptofanyl-lysinyl-lysinyl-lysinyl(biotinyl)-glycin

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidu 433A za použití Fmoc-Gly-Wang (Novabiochem) pryskyřice v množství řádu 0.1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 40 minut (A =0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 14 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = metanol, A =

0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekcí v UV 260 a fluorescencí Ex₂₈₀,

Em₃₅₀ - doba retence produktu = 22 minut) .

Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno M+H 1478, nalezeno 1471.

část b: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS dopovaným biotinylovanou lipopeptidovou sekvencí připravenou v části a)

Do každé ze dvou zkumavek obsahujících 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg lipopeptidu vyrobeného v části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavky se 45 vteřin protřepávají v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a analyzují se počítačem Coulter Counter a zeslabením zvuku ozev. Analýzou hmotového spektra MALDI se potvrdí včlenění lipopeptidu do DSPS mikrobublinek podle postupu části b příkladu 1.

část c: Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotinylovaným lipopeptidem k přípravě ,'sandwich' produktu se streptavidinem a se směsí biotinyl-endotelin-l-peptidu (biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH) a biotinylovaného peptidu bránícího polymerací ·· ···· • · • ···

fibrinu (biotin-GPRPPERHOS· NH₂)

Mikrobublinky připravené podle postupu části b) se zpracuji podle uvedeného postupu části e) přikladu 5.

Přiklad 7

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotin-DPPE k přípravě 'sandwich' produktu se streptavidinem a se směsí biotiny1-endotelin-l-peptidu (biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH) a biotinylovaného peptidu bránícího polymerací fibrinu (biotin-GPRPPERHOS · NH₂) část a: mikrobublinky obsahující biotin

Do 5 mg směsi fosfatidylserinu (Avanti) a 0,6 mg biotin-DPPE (Pierce), která se umístí do čisté zkumavky se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem a uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle.

Po centrifugací se infranatant odstraní a mikrobublinky se promyjí důkladně vodou.

4444 » «

4 4 4

44

4 4 4 « 4 4 4

4«

4 4

- ιυο·-·· část b: Konjugace mikrobublinek plněných plynem a zapouzdřených fosfatidylserinem a biotin-DPPE se streptavidinem a se směsí biotinyl-endotelin-1-peptidu (biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp -OH) a biotinylovaný peptid bránící polymerací fibrinu (biotin-GPRPPERHOS · NH₂)

Princip přípravy produktu je popsán v části e) příkladu

5.

Příklad 8

Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, streptavidin-Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE a směsí biotinylovaného transferinu a biotinylované protilátky IgG lidského endotelu část a: Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Karboxylace NH₂-PEG₃₄₀₀-DSPE (příklad 2) za použiti anhydridu kyseliny sukcinové se provede podle postupu R.Nayara a A.J.Shroita uvedeného v Biochemistry (1985), 24, 5967-71.

část b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Do 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfatidylserinu a 10-0,1 mol% Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut

4444 • 11 • 444 4 4 4

4« • 4 4 • · ··· • 4 · 4 4

4 · 4

44

44 * 4 4 4 • 4 · ·

444 44·

4

4 4 ) na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se infranatant vymění za vodu a promývání se opakuje.

část c: vazebná reakce streptavidinu na mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Kovalentní vazba streptavidinu na Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE v membráně mikrobublinek se docílí standartními postupy za použití ve vodě rozpustného karbodiimidu. Během reakce je vzorek umístěn na výkyvné třepačce. Po centrifugaci se infranatant vymění za vodu a promývání se opakuje. Funkční skupina vázaného streptavidinu se analyzuje vazbou na fluorescenční látkou značený biotin, biotinylované protilátky (detekované fluorescenční látkou označenou sekundární protilátkou) nebo fluorescenční nebo radioaktivní látkou značený biotinylovanými oligonukleotidy. Analýza se provede fluorescenční mikroskopií nebo scintilačním počítačem.

část d: víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a směsí biotinylované IgG protilátky lidského endotelu a biotinylovaného lidského transferinu nekovaletně vázanou na streptavidin-Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE • · ···· ·· · · • · · · · · · ···· · ···· ·

- 102'

Mikrobublinky vyrobené v části c) tohoto příkladu se inkubují v roztoku obsahujícího lidský transferin a biotinylovanou endoteliální IgG protilátku podle postupu podle Bayera a spol., Meth. Enzymol., 62, 308. Vektorem potahované mikrobublinky se promývají podle shora uvedeného postupu.

Příklad 9

Víceúčelové, plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené fosfatidylserinem, streptavidin-PEG-DSPE a oligonukleotidem biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG a biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT část a: Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Syntéza je popsána v příkladě 8, části a).

část b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Příprava je popsána v části b) příkladu 8.

část c: vazebná reakce streptavidinu na mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Provedení reakce je popsáno v části c) příkladu 8.

• · • · ·· · · · · ·· • · · · · · · · · • · · · · · · · · · ··

- 103 část d: Víceúčelové, plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené fosfatidylserinem, streptavidin-PEG-DSPE a oligonukleotidem biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG a biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT

Mikrobublinky připravené podle postupu části c příkladu 9 se inkubují v roztoku směsi biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG a biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT. Oligonukleotidem potahové mikrobublinky se promyjí podle shora uvedeného postupu. Vazba oligonukleotidu na mikrobublinky se detekuje za použití fluorescenční látkou značených oligonukleotidů pro vazbu ha mikrobublinky nebo hybridizací vázaného oligonukleotidu na značený (fluorescenční nebo radioaktivní látkou) komplementární oligonukleotid. Funkční skupina oligonukleotidu vázaného na mikrobublinky se analyzuje hybridizací mikrobublinek znehybněnou DNA, která obsahuje komplementární sekvence k vázanému oligonukleotidu .

K tomu účelu je například vhodné použití oligonukleotidu komplementárního k ribozomální DNA (existuje v řadě kopií haploidního genomu) a oligonukleotidu komplementárního k onkogenu (ras-onkogen, který existuje v jediné kopii haploidního genomu).

— JiOAtur*

Příklad 10

Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a fosfatidyletanolaminem s kovalentně vázaným na fibronektinpeptid a transferinové proteiny část a: příprava mikrobublinek

Do čisté zkumavky obsahujících 4,5 mg DSPS (Avanti) a 1,0 mg DSPE (Avanti) se přidá 1 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zahřívá na teplotu 80°C, a pak se vzorek filtruje přes filtr 4,5 mikronu. Po zchlazení na teplotu místnosti se prostor nad kapalinou naplní perfluorbutanovým plynem. Zkumavka se promíchává v ponorném míchadle 45 vteřin a mikrobublinky se dvakrát promyjí destilovanou vodou opět se uvedou do suspenze v O,1M roztoku boritanu sodného o pH 9.

část b: modifikace fibronektinu a transferinu

Do směsi 0,5 mg fibronektinu a 1,3 mg transferinu v PBS se přidá roztok NHS-fluoresceinu v DMSO. Rekční směs se 1 hodinu míchá pří teplotě místnosti a protein se čistí na koloně Superdex 200. Směs proteinu značeného fluoresceinem ve fosfátovém pufru o pH 7,5 se lyofilizuje.

část c: modifikace mikrobublinek

Lyofilizovaný produkt předchozí části b) se rozpustí v • · · · φ φ φ φ φ φ φ φ

- Γ05 ·0,5 ml vody a do směsi fibronektinpeptidu a transferinu značené fluoresceinem se přidá 0,1 mmol sesíťujícího řetězce SDBP (Pierce). Reakční roztok se 2 hodiny inkubuje na ledě a na koloně NAP-5 se eluuje PBS. Přidá se 1 ml suspenze mikrobublinek připravené v části a) a inkubace nechá probíhat 2 hodiny při teplotě místnosti na výkyvné třepačce. Vznášením mikrobublinek se oddělí nezreagovaný materiál, a pak se pufr vymění za vodu a celý postup se třikrát opakuje.

Příklad 11

Víceúčelové, duté polymerni částice se začleněným avidinem do polymerni stěny konjugované s oligonukleotidem biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT a endotelin-1-peptidem biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH

Příklad je zaměřen na přípravu polymerních ultrazvuk-kontrastních činidel obsahujích mnohočetné vektory navázaných k povrchově neaktivní látce k cílení a terapeutické aplikaci.

část a: polymerni částice s včleněným avidinem do stěny polymeru

Duté polymerni částice P73 (popsané v WO 96/07434) obsahující avidin se připraví syntézou zahrnující lyofilizací v emulzi oleje ve vodě podle následujícího postupu:

Roztok oleje se připraví rozpuštěním 0,25 g polymeru P73 [kopolymerát póly(etyliden-bis-(16-hydroxyhexadekanoátu s kyselinou adipovou] podléhajícímu biologickému rozkladu v 5 ml kamfenu při teplotě 60°C. Do 0,2 ml roztoku oleje se přidají 21 ml avidinu. Vodný roztok se připraví rozpuštěním 0,4 g polymeru a-(16-hexadekanoyl-oxyhexadekanoyl)-w-metoxypolyoxyetylen-esteru ve 20 ml vody při teplotě 60°C. S 0,8 ml vodného roztoku se během 15 vteřin smíchá ve vibračním mixéru (Capmix) 0,2 ml roztoku oleje za vzniku emulze oleje ve vodě. Emulze se zmrazí v suchém ledu a metanolu a suší se 24 hodin při tlaku 26,6 kPa za odstranění přebytku rozpouštědla. Pevná látka jako prášek se uvede do suspenze dutých částic přidáním 1,0 ml vody. Vytvoření ultrazvuk-kontrastních činidel se potvrdí mikroskopickým sledováním, vyhodnocením na počítači Coulter Counter, zeslabením akustických ozev a stanovením rezistence k zevnímu tlaku.

část b: biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH

Příprava peptidu je popsána v části b) příkladu 5.

část c: konjugace polymerních částic obsahujících avidin

V části a) vytvořené částice se centrifugují a supernatant se vymění za 1 ml fosfátového pufru PBS o pH 7,5 obsahujícího 0,2 mg biotin-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT a 0,2 mg biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH (část b) . Po

- 107 ··· ··· · ··· ♦·· • · · ·· ·· ·· hodinách inkubace se částice důkladně promyjí PBS a vodou.

Příklad 12

Navázání biotinu k plynem plněným míkrokulíčkám pro víceúčelové cílení část a: příprava biotinylovaných mikrokuliček albuminu

K přípravě, která se uskutečnila při teplotě místnosti, se použila homogenní suspenze GAM (6xl0⁸ částic/ml) v 5 mg/ml albuminu. Dva 10 ml podíly se 5 minut centrifugují (170 x g), čímž se podpoří vznášení albuminových mikrobublinek. Infranatant se opatrně odstraní odsátím a nahradí se stejným objemem vzduchem nasyceného fyziologického roztoku obsahujícího fosfátový pufr a směs se nechá 15-20 minut rotovat za vytvoření suspenze mikrobublinek. Celý postup se dvakrát opakuje, takže zůstane jen zanedbatelné množství volného albuminu netvořícího mikrobublinky. Do jednoho podílu (konečná koncentrace 50μΜ) se přidá 50 μΐ 10 mM roztoku NHS-biotinu v dimetylsulfoxidu, do druhého (kontrolního) se přidá 50 μΐ dimetylsulfoxidu. Zkumavky obsahující vzorky se 1 hodinu nechají rotovat, načež se do každé zkumavky přidá 20 μΐ podíl 50% vodného roztoku glutaraldehydu, který způsobí sesíťovatění mikrobublinek. Po 1 hodině rotace se zkumavky na noc umístily svisle, aby

se umožnilo vznášení mikrobublinek. Následující den se mikrobublinky dvakrát promyjí fyziologickým roztokem obsahujícím fosfátový pufr a 1 mg/ml lidského sérového albuminu (PBS/HSA) a po poslední centrifugací se znovu se uvedou do suspenze ve směsi PBS/HSA.

K oběma suspenzím se přidá streptavidin konjugovaný s peroxidázou z křenu (strep-HRP), čímž se zjistí přítomnost biotinu zapojeného do mikrobublinek. Zkumavky, ve kterých probíhá reakce, se na 1 hodinu umístí do rotačního mixéru. Mikrokuličky se pak třikrát promyjí, uvedou se do suspenze v 100 mM pufru s citrátem a fosfátem (pH 5), který obsahuje 0,1 mg/ml fenylendiamin-dihydrochloridu a 0,01 % roztoku peroxidu vodíku a 10 minut se míchá v rotačním mixéru. Přítomnost enzymu se projeví žluto-zeleným zbarvením. Získané výsledky potvrzují, že GAM jsou biotinylované:

Vzorek zabarvení biotinylované mikrobublinky + str-HRP kontrolní mikrobublinky + str-HRP část b: Víceúčelové plynem plněné mikrobublinky

Biotinylované mikrobublinky se použijí k přípravě víceúčelových cílených produktů tak, jak je popsáno v příkladech 5), 6) a 7).

·· ···· • · • · · ·

Příklad 13

Mikrobublinky plněné plynným perfluorbutanem a zapouzdřené DSPS s navázaným peptidem vázajícím heparinsulfát, fibronektinpeptidem, RGD peptidem a fluoresceinem část a: lipopeptid obsahující sekvenci RGD a fluoresceinovou reportérovou skupinu: dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Lys-[acetyl-Arg-Gly-Asp-Lys(fluorescein)]Gly-OH

Lipopeptid se připraví podle postupu popsaného v části a) příkladu 21 za použití na trhu dostupných aminokyselin a polymerů. Lipopeptid se 2 hodiny odděluje z pryskyřice v roztoku kyseliny trifluoroctové obsahující 5% vody, 5% fenolu a 5% EDT. Surový produkt se čistí odpařováním ve vakuu za vzniku sraženiny, která se rozetře s dietyleterem. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 60 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 9 ml/min.

Po lyofilízaci vznikne 10 mg čistého produktu. Analytická HPLC: gradient 60-100% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 260 nm - doba retence produktu = 20-22 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H tc

ZI • » • · . i·!·];

1922, nalezeno 1920.

část b: lipopeptid obsahující sekvenci pro vazbu heparinsulfátu a fibronektinpeptidu

Příprava a čištění se provede podle části a) příkladu

1.

část c: Víceúčelové mikrobublinky plněné perfluorbutanem a zapouzdřené DSPS (Avanti) s navázaným peptidem vázajícím heparinsulfát, fibronektinpeptidem, acetyl-RGD peptidem a fluoresceinem

Do každé ze dvou zkumavek obsahujících 4 mg (3,9 mmol) DSPS (Avanti), 0,5 mg (0,2 mmol) výsledného lipopeptidu části b) a 0,5 mg výsledného lipopeptidu části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a analyzují se MALDI hmotovou spektrometrií popsanou v části b) příkladu 1. Analýza mikroskopií prokáže velikost mikrobublinek v rozmezí od 1 do 5 mikronů. Mikrobublinky jsou fluoreskující.

·

- |·12

Příklad 14

Mikrobublinky plněné plynem obsahující DSPS upravený kovalentní vazbou s protilátkou proti CD71 transferinovému receptoru značenou FITC a dopovaný lipopeptidem s afinitou k endoteliálním buňkám

Tento příklad vede k přípravě činidel zobrazitelných ultrazvukem a cílených mnohočetnými vektory.

část a: lipopeptid vážící se k endoteliálním buňkám: 2-n-hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH₂

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití amidové pryskyřice Rink v množství řádu 0,1 mmol a předem připravených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyseliny. Před vazebnou reakcí se všechny aminokyseliny a kyselina 2-n-hexadecylstearová aktivují použitím HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 50 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 10 mg čistého produktu.

113 z

’ i-“ .*<··· · . · >=°: ·:

• · · ·

x-:

=o • · · · • · <

• · I • · *· #· _A · · · · • ··· ··· • · »» ·· z

/

Z-Z

Z-Z

Ζ-Ϊ

Z-Z

-t ,

Z)

Z-Z

• * • · · · • · • «

Analytická HPLC: gradient 90-100% Β (B = metanol, A 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm a fluorescencí Ex₂₈₀, Em₃₅₀ - doba retence = 23 minut) .

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2369, nalezeno 2373.

část b: mikrobublinky plněné plynem a obsahující DSPS dopovaným lipopeptidem vážícího se k endoteliálním buňkám a PE-PEG₂₀₀₀-Mal

Do čisté zkumavky se přidá 4,5 mg DSPS (Avanti), 0,5 mg lipopeptidu připraveného v části a) a 0,5 mg PE-PEG₂₀₀₀-Mal (příklad 50) a do zkumavky se dále přidá 1 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném, míchadle a vytvořené mikrobublinky se třikrát promyjí destilovanou vodou.

část c: thiolace protilátky proti transferinovému receptoru značené FITC

Do 0,7 ml roztoku protilátek proti transferinovému receptoru Ab(CD71) (Becton Dickinson) značených FITC v PBS (100 mg/ml) se přidá 0,9 mg Trautova činidla.

Roztok se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti.

Přebytek činidla se z upraveného proteinu oddělí na • 9 9 · · · • · • · ♦ ·

ΝΑΡ-5 koloně (Pharmacia).

část d: Konjugace thiolovaných protilátek proti transferinovému receptoru značených FITC s mikrobublinkami plněnými plynem a obsahujícími DSPS dopovaným lipopeptidem vážícího se k endoteliálním buňkám a PE-PEG₂₀₀₀-Mal

Do mikrobublinek připravených v části b) se přidá 0,5 ml podílu proteinových frakcí (celkem 2 ml) připravených v části c) . Konjugace probíhá 10 minut v reakční směsi umístěné na výkyvné třepačce. Infranatant se oddělí centrifugací rychlostí 1000 otáček za 3 minuty. Konjugace se dvakrát opakuje s 1 ml a 0,5 ml podíly roztoku proteinu. Mikrobublinky se dále promyjí čtyřikrát destilovanou vodou. Ve vzorku se zjišťuje přítomnost protilátky průtokovou cytometrií a mikroskopií. Více než 92% buněk je fluoreskujících.

Graf č.l znázorňuje srovnání průtokové cytometrie kontrolních mikrobublinek DSPS (Avanti) (levá křivka) s bublinkami konjugovanými s protilátkou proti transferinovému receptoru CD71 značenou FITC (plná křivka vpravo) a ukazuje, že 92% populace je fluoreskuj ící.

Včlenění lipopeptidu do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií popsanou v části b) příkladu 1.

- 116 • ·♦ ·· ·· ·· « · · · · • ··· * · · · • · · · · · ··· • · · · * · ··· ·· ·· · * ·· ·· • · · · • · · · • ··· ··· • · ·· 99

·· ··*♦ • « • · • ···

-Λ,

Příklad 15

Víceúčelové plynem plněné mikrobublinky potahované transferinem a avidinem pro cílené ultrazvukové zobrazení

Příklad popisuje přípravu mikrobublinek obsahujících mnohočetné proteinové vektory pro cílené ultrazvukové vyšetření a k terapeutickým účelům.

část a: lipidová molekula s navázaným thiolem: dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys.OH

Lipidová struktura se připraví na automatickém syntezátoru peptidu ABI 433A za použití pryskyřice Fmoc-Cys(Trt)Wang (Novabiochem) v množství řádu 0,25 mmol a předem vyrobených zásobníků aminokyselin s obsahem 1 mmol. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitové se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 250 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 50 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 24 mg čistého produktu. Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný

ΦΦ φφφφ • φ ·

118.-···.

• φ φφ φφ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ ·φ φ φ φ φ * a a a φ φ φ i ΦΦΦ • ι · φ φ ··

HN

ΖΧ χζ

X' ·· · 4 4 4

4 4

4« 44

4 4 · ··♦ ·*

- 110

roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 23 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1096, nalezeno 1099.

část b: mikrobublinky plněné plynem tvořené DSPS dopovaným lipidovou strukturou obsahující thiol

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg výsledného lipopeptidu vyrobeného v části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu ve vodě. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Ještě horký se filtruje přes 40 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a začlenění thiolové skupiny se analyzuje Ellmanovým činidlem.

část c: modifikace transferinu a avidinu pomocí fluorescein-NHS a sulfo-SMPB

Do směsi 2 mg lidského transferinu (Holo, Alpha

Therapeutíc Corp) a 2 mg avidinu (Sigma) v 1 ml PBS se přidá 0,5 ml roztoku DMSO obsahujícího 1 mg sulfo-SMPB (Pierce) a 0,5 mg fluorescein-NHS (Pierce'5 . Reakční směs se 45 minut míchá při teplotě místnosti, a pak se nechá projít přes kolonu Sephadex 200 při eluci PBS.

ΦΦ φφφφ

- να·*·.

• Φ φφ φφ φφ φφφ φφφφ • φφφφ φ φ · φ φφφφ φ φ φφ φφ φφφφ

Proteinový podíl se sebere a skladuje se při teplotě 4

OC.

část d: konjugace mikrobublinek s modifikovanými transferinem a avidinem

Do mikrobublinek obsahujících thiol (část b) se přidá 1 ml modifikovaného proteinového roztoku transferinu a avidinu proteinu popsaného v části c). Hodnota pH se upraví na 9 a konjugace probíhá 2 hodiny při teplotě místnosti. Po důkladném promytí deionizovanou vodou se mikrobublinky analyzují na počítači Coulter Counter (81% mezi 1 a 7 mikrony) a fluorescenční mikroskopií (vysoce fluoreskující mikrobublinky).

Příklad 16

Plynem plněné mikrobublinky upravené pro cílené ultrazvukové zobrazení

Příklad popisuje přípravu mikrobublinek s reakční skupinou na povrchu k nespecifickému cílení. Vazby k většímu počtu buněčných cílů se dosáhne reakcí, při níž dojde k výměně disulfidu.

Do čisté zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS (Avanti) a 1,0 mg výsledného lipopeptidu vyrobeného v části a) příkladu 15 se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu ve vodě. Reakční směs se současně 5

9999 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 99« 9 99<· 9 99 · — 12Ů -* ···· · · ·····« ·· ·» ·· *· minut protřepává a zahřívá k 80°C. Ještě horký se filtruje přes 40 mikron filtr. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a začlenění thiolové skupiny se analyzuje Ellmanovým činidlem.

Příklad 17

Mikrobublinky plněné plynem a tvořené DSPS, lipopeptidem cíleným k endoteliálním buňkám a molekulou obsahující kaptopríl

Jde o přípravu látky zobrazitelné ultrazvukem, která je namířena k endoteliálním buňkám a má terapeutický účinek.

část a: lipopeptid s navázaným kaptoprilem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje pro výrobu dusíkatých bublinek a pryskyřice Rink Amide MBHA (Novabiochem) chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol. Při reakci.se použijí aminokyseliny z Novabiochem a kyselina palmitová z Fluka. Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA protokolů. Za použití DIC preaktivace se kyselina bromoctová váže skrze postranní řetězec Lys

• · • 4

- 123 jako symetrický anhydrid. Kaptopril (Sigma) se rozpustí v DMF a uvede se do styku s pevnou fází za použití DBU jako baze. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT, 5% vody a 5% etylmetylsulfidu. Preparativní kapalinovou chromatografií (Vydac 218TP1022) se čistí 10 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vzniknou 2 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 26 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno a nalezeno M+H 1265.

část b: lipopeptid s afinitou k endoteliálním buňkám dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Ile-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH₂

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití pryskyřice Rink amid (Novabiochem) v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a • · · · · · ·· · · ·· ··

Η.Η

ζχ

X

- 125

kyseliny palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranní řetězec ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT a 5% vody za vzniku 160 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 35 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 20 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm a 260 nm - doba retence produktu = 16 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2050, nalezeno 2055.

část c: mikrobublinky plněné plynem a tvořené DSPS lipopeptidem cíleným k endoteliálním buňkám a molekulou obsahující kaptopril pro přenos účinné látky

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg produktu části a) a 0,5 mg produktu části b) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% • 0 0 0 0 0 » · ·

126 ·· 00 • · · 0 glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a na 1 hodinu se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrii MALDI není v konečném promývacím roztoku průkazná přítomnost počátečního materiálu. Hmotovou spektrometrií MALDI se potvrdí včlenění produktu části a) a části b) do mikrobublinek popsaných v části b) příkladu 1.

část d: zkouška in vitro mikrobublinek plněných plynem tvořených DSPS, lipopeptidem cíleným k endoteliálním buňkám a molekulu obsahující kaptopril pro terapeutické aplikace

Zkouškou in vitro popsanou v části c) příkladu 1 se sleduje vazebná shopnost buněk v podmínkách průtoku. V závislosti na rychlosti průtoku docházelo k postupnému hromadění mikrobublinek na buňkách. Při dalším zvyšování průtoku, kdy docházelo k oddělení buněk od krycího sklíčka, zůstávaly mikrobublinky pevně vázány na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a již při velmi nízkém průtoku vymizely z průtokové komory.

• · • · · ·

127

Příklad 18

Mikrobublinky plněné plynem, tvořené DSPS (Avanti) s uloženým lipopeptidem tvořeným šroubovícovým peptidem s afinitou k buněčným membránám a peptidovým antibiotikem polymyxin B sulfátem

Tento příklad popisuje přípravu cílených mikrobublinek obsahujících mnohotné peptidové vektory k terapeutickému působení i za účelem cílení.

část a: Lipopeptid tvořený šroubovicovým peptidem s afinitou k endoteliálním buňkám: hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-AlaLeu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH₂

Příprava tohoto lipopeptidu je popsána v části a) příkladu 14.

část b: Víceúčelové mikrobublinky plněném plynem

Do čisté zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS (Avanti), 0,3 mg lipopeptidu části a) a 0,5 mg polymyxin B sulfátu (Sigma) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 3-5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se 3 minuty centrifugují rychlostí 1000 otáček za minutu.

•φ φφφφ

- 128 Mikrobublinky se tak dlouho promývájí vodou až hmotovou spektrometrií MALDI není v infranatantu průkazná přítomnost počátečního materiálu. Mikroskopií se potvrdilo, že se velikost mikrobublinek pohybuje v požadovaném rozmezí 1-8 mikronů.

Do přibližně 0,2 ml mikrobublinek se přidá 0,5 ml metanolu a směs se na 2 minuty umístí do ultrazvukové lázně. Výsledný čirý roztok obsahuje podle hmotového spektra MALDI lipopeptid i polymyxin B sulfát (vypočteno 1203, nalezeno 1207).

Příklad 19

Mikrobublinky plněné plynem, tvořené DSPS dopovaným lipopeptidem tvořeným sekvencí vázající IL-1 receptor a upraveným větvenou strukturou obsahující metotrexát

Tento příklad popisuje přípravu cílených mikrobublinek obsahujících mnohotné vektory k terapeutickému působení i za účelem cílení.

část a: lipopeptid tvořený peptidem vázajícím interleukin-1 receptor:

dipalmitoyl-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-GlyLeu-Trp-Arg-Gly-Ala-Ala-OH

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Ala-Wang (Novabiochem) pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených

ΒΒ ΒΒ

129

BB ΒΒΒΒ • · • · · ·

Β· BB Β Β Β

Β · · Β Β

ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ χ-ζ

I λ*

ζ-ζ

ζ-χ

ί

χ-ζ '·+>-

Χ-Ζ

ΦΦ φφφφ • · • φφφ φφ φφ φ φ φ φ φφφφ

130 • Φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování lipopeptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 30 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vzniknou 4 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 90-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm - doba retence = 23 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2083, nalezeno 2088.

část b: Struktura jádra větveného metotrexátu obsahujícího thiolovou skupinu

Metotrexát se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Cys(Trt)Tentagel pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 160 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí

- 131 • 4 4444 44 4* 44 4·

4 4 444 4 4 4 4

44*4 · 4*44 · ·· · • 444 ·· ·« 444 444

44444 4 4 • 444 444 44 44 44 44

X

• V ·* • · 0 • · ···

132

0 0 0 00 00

00 » · 0 Φ

0 0 · mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 10 do 30% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilízaci vznikne 9 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 5-50% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu =9,5 minuty). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1523, nalezeno 1523.

část c: Víceúčelové mikrobublinky plněném plynem

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti), 0,5 mg lipopeptidu obsahující thiol (část a příkladu 15) a 0,2 mg výsledného lipopeptidu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 3-5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, vytvořené mikrobublinky se 3 minuty centrifugují rychlostí 1000 otáček za minutu a infranatant se odloží.

• · · · • · · ·

- 133 část d: Konjugace větveného metotrexátu s thiolovanými mikrobublinkami

V PBS o pH 8,0 se rozpustí 0,5 mg metotrexátu části b) tohoto příkladu a roztok se přidá do mikrobublinek obsahujících thiol (část c) . K vytvoření disulfidických vazeb dochází během 16 hodin. Po promývání PBS a vodou se mikrobublinky sledují mikroskopií a MALDI hmotovou spektrometrií.

Mikrobublinky v kombinaci s tumor specifickým vektorem tvoří systém k přenosu účinné látky. Disulfidické vazby spojující metotrexát s mikrobublinkami lze in vivo rozvolnit redukcí, tak aby došlo k uvolnění molekuly účinné látky. Takovým fyziologicky vhodným redukčním činidlem je glutathion.

Příklad 20

Mikrobublinky plněné plynem potahované komplexem poly-L-lysinu a fragmentu DNA z plasmidu pBR322 označeného fluoresceinem

Tento příklad popisuje přípravu mikrobublinek určených pro genovou terapii při použití nesmyslných sekvencí. Specifické cílení lze dosáhnout dalším dopováním membrán mikrobublinek lipidovými strukturami modifikovanými vektorem tak, jak je tento postup popsán v příkladě 1.

část a: mikrobublinky plněné plynem zapouzdřené DSPS

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti) se přidá 1 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 2 minuty zpracovává ultrazvukem, a pak se 5 minut zahřívá k 80°C. Ohřátý roztok se ihned filtruje přes 4 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a infranatant se odloží. Mikrobublinky se znovu uvedou do suspenze v 0,5 ml vody.

část b: komplex poly-L-lysinu a DNA a vložení mikrobublinek zapouzdřených DSPS (Avanti)

Do čisté zkumavky obsahující 1 mg poly-L-lysinu (molekulární hmotnost 70000-150000) se přidá 0,1 ml rozštěpeného plasmidu pBR322 (Biorad) označeného fluoresceinem a rozpuštěného v pufru TE (10 mM tris-HCl, pH 8). Přidáním vody se roztok doplní do celkového objemu 0,6 ml a pH se upraví na hodnotu pH 8. Tvorba komplexu probíhá 1 hodinu, a následně se 0,05 ml roztoku komplexu polylysin-DNA přidá do shora uvedené (část a) suspenze mikrobublinek. Po 1 hodině se mikroskopií potvrdí přítomnost fluoreskujících mikrobublinek a přítomnost

DNA.

·· ·· » · · <

135 » ·· • · • · · ·

Příklad 21

Plynem plněné mikrobublinky obsahující větvený peptid tvořený dabsylovanou sekvencí vážící aterosklerotický plak a RGDS

Tento příklad popisuje přípravu mikrobublinek s thiolovou skupinou na povrchu pro modifikaci s thiol obsahujícími vektory k cílení, přenosu účinné látky a jejího uvolnění.

část a: Větvený peptid dabsyl-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Lys- (NH₂-Arg-Gly-Asp-Ser) Gly-Cys.OH

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití pryskyřice Fmoc-Cys(Trt)Tentagel v množství řádu 0,1 mmol a za použití předem vyrobených zásobníků aminokyselin s obsahem 1 mmol. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a postranního řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT a 5% vody za vzniku 160 mg surového produktu. Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 30 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 10 do 60% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = acetnitríl) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 2,5 mg čistého produktu. Analytická

136 • ·

o

COOH

φφ φφ

- 137 φφ ΦΦΦ· • φ > · · φ φ φ φφφ φ φ

HPLC: gradient 10-50% Β během 20 minut (Β = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm a 435 nm - doba retence produktu = 21 minuta).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2070, nalezeno 2073.

část b: plynem plněné mikrobublinky obsahující thiol

Příprava mikrobublinek se provede podle postupu částí a) a b) příkladu 15.

část c: Oxidační vazebná reakce thiolovaných mikrobublinek s víceúčelovým peptidem při vytvoření disulfidových vazeb

Centrifugací mikrobublinek části b) vznikne infranatant, který se odloží a vymění za roztok 1 mg dabsylpeptidu vyrobeného v části a) v 0,7 ml ředěného roztoku amoniaku (pH 8). Do této směsi se přidá 0,2 ml zásobního roztoku obsahujícího 6 mg ferokyanátu draselného ve 2 ml vody. Zkumavka se uloží na výkyvnou třepačku a oxidace thiolu se nechá 2 hodiny probíhat. Mikrobublinky se následně promyjí důkladně vodou za vzniku infranatantu, který podle HPLC a hmotového spektra MALDI neobsahuje dabsyl-peptid. Detekce mikrobublinek vázaných na peptid se provedla redukcí disulfidových vazeb za použití ve vodě rozpustného redukčního činidla tris-(2-karboxyetyl)fosfinu. Po redukci obsahoval • 9 9999 • · • · ·♦ • 9 99

9 9 9 9 9 — 138 * 9·99 infranatant podle HPLC a hmotového spektra MALDI volný dabsyl-peptid.

K počátečnímu uvolnění lze použít jiné fyziologicky vhodné redukční činidlo, jako například redukovaný glutathion.

Příklad 22

Plynem plněné mikrobublinky tvořené polymerem z etyliden-bis(16-hydroxyhexadekanoátu) a adipoylchloridu a na polymer kovalentně vázaným biotin-amidokaproát-Ala část a: Z-Ala-polymer (3-(0-(karbobenzyloxy-L-alanyl)-polymer)

Polymer se připraví z etyliden-bis(16-hydroxyhexadekanoátu) a adipoyl chloridu podle W0-A-9607434. Podíly polymeru s molekulární hmotností 10000 se čistí chromatografií na gelu (GPC). Do směsi bezvodého dimetylformamidu a tetrahydrofuranu obsahující 10 g vytvořeného materiálu (odpovídají 1 mmol OH skupin), 5 mmol Z-alaninu a 4 mmol dimetylaminopyridinu se přidá dicyklohexylkarbodiimid. Reakční směs se přes noc míchá při teplotě místnosti. Dicyklohexylurea se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odstraní rotačním odpařováním. Produkt se čistí chromatografii, podíly obsahující výslednou sloučeninu se spojí a rozpouštědlo se odstraní rotačním odpařováním. Struktura produktu se ověří NMR.

ΒΒ ΒΒ

Β Β Β Β

Β Β · ·

- 139

ΒΒ ΒΒΒΒ Β Β Β • ···

Β Β

Β Β

ϻ ·Β

Μ Β« Β Β Β

Β Β Β Β ΒΒ Β·

Β ·

ΒΒ Β· část b: Ala-polymer (3-0-(L-alanyl)-polymer)

Ve směsi toluenu a tetrahydrofuranu obsahující 15% celkového objemu ledovou kyselinu octovou se 2 hodiny hydrogenuje 0,1 mmol Z-Ala-polymeru za přítomnosti 5% roztoku paladia na aktivním uhlí. Reakční směs se filtruje a zahustí ve vakuu.

část c: biotinamidokaproát-Ala-polymer

Roztok N-hydroxysukcinimid-esteru bíotínamidokaproátu v tetrahydrofuranu se přidá do roztoku H₂N-Ala-polymeru rozpuštěného ve směsi tetrahydrofuranu, dimetylformamidu a 0.1 M pufru fosfátu sodného o pH 7,5. Reakční směs se zahřívá na 30°C a energicky se míchá. Po ukončení reakce se provede chromatografie na tenké vrstvě. Rozpouštědlo se odpaří a surový produkt se bez dalšího čištění použije v následující syntéze.

část d: plynem plněné mikrobublinky obsahující biotin-amidokaproát-Ala-polymer a PEG₁₀₀₀₀-metyleter-16-hexadekanoyloxyhexadekanoát

Do 30 ml 1% vodného roztoku PEG₁₀₀₀₀-metyleter-16-hexadekanoyl-oxyhexadekanoátu (jehož příprava je popsána v WO-A-9607434) se při teplotě 60°C přidá 10 ml 5% vodného roztoku biotin-amidokaproát-Ala-polymeru v (-)-kamfenu. Reakční směs se několikrát emulguje v mixéru s rotorem a statorem (Ultra Turax® T25) při

- 140 ΦΦ φφφφ * φ Φ ·* φ» φφ φφ • * · φ · · · • φ φφφ φ φ φ φ φφφφ φ · φφ φφ φφ φφ nízké rychlosti. Směs se následně zmrazí v lázni suchého ledu a metanolu a lyofilizuje se 48 hodin za vzniku bílého prášku výsledného produktu.

část e: Sledování produktu mikroskopií a zeslabením zvukových ozev

Sledování produktu pomocí světelné mikroskopie je popsáno ve WO-A-9607434. Měřením průchodu ultrazvuku za použití širokopásmového transduktoru při 3,5 MHz došlo v disperzi částic menší než 2 mg/ml k zeslabení zvukových ozev o více než 5 dB/cm.

část f: Víceúčelové mikročástice

Biotinylované mikrobublinky se použijí k přípravě víceúčelových cílených produktů tak, jak je popsáno v příkladech 5), 6) a 7).

Příklad 23

Plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené DSPS a biotin-PEG₃₄₀₀-acyl-fosfatidyletanolaminem a s navázaným streptavidinem, s oligonukleotidem biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG a biotinylovaným peptidem bránícímu polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS. NH₂) část a: biotin-PEG₃₄₀₀-acyl-fosfatidyletanolamin

Při teplotě místnosti se 2 hodiny míchá směs 21,00 mg

- ΐ4ϊ>:

(0,03 mmol) dipalmitoyl-fosfatidyl-etanolaminu, 100 mg (0,03 mmol) biotin-PEG-C0₂-NHS a 42 μΐ (0,30 mmol) trietylaminu v roztoku chloroformu a metanolu v poměru 3:1. Rozpouštědla se odstraní odpařováním za sníženého tlaku a zbytek se čistí rychlou chromatografií při eluci směsí metylenchloridu, metanolu a vody v poměru 40:8:1. Vznikne 112 mg žluté pryže výsledného produktu s výtěžkem 94% a struktura se ověří pomocí NMR a hmotové spektrometrie MALDI.

část b: Navázání streptavidinu konjugovaného s fluoresceinem k mikrobublinkám plněných plynem

Mikrobublinky plněné plynem se připraví smícháním DSPS a biotin-PEG₃₄₀₀-acyl-fosfatidyletanolaminu podle postupu uvedeného v předchozí části. Suspenze mikrobublinek rozdělí do 0,2 ml podílů, do kterých se přidá streptavidin konjugovaný s fluoresceinem podle níže uvedené tabulky. Vzorky se 15 nebo 30 minut inkubují na výkyvné třepačce při teplotě místnosti, a přebytek proteinu se následně odstraní promytím PBS. Vzorky se analyzují průtokovou cytometrií a počítačem Coulter Counter. Výsledky jsou přehledně uvedené v níže uvedené tabulce.

• φ φ · φ φ φ φ φ

- 142.·-···.

• φ

Podíl číslo	Množství přidaného strepta- vidinu (mg/vzorek 200:1)	Doba inkubace (při teplotě místnosti)	% fluoreskuj ícich částic	střední průměr částic v mikronech
1	0		2,0	—
2	0		—	12 (pěna)
3	0,2 (3xl0'9mmol)	30 min	00	3,9
4	0,2 (3xl0‘'8mmol)	30 min	26,2	4,2
5	10 (1,5 x 10''mmol)	15 min	30,5	nebylo analyzováno
6	20 (3xl0~7mmol)	30 min	97,9	5,2
7	40 (6xl0“'7mmol)	15 min	96,7	5,1
8 DSPS kontrola	20 (3xl0'7mmol)	15 min	0,6	3,7

část c: konjugace mikrobublinek potahovaných streptavidinem s olígonukleotidem biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG a biotinylovaným peptidem bránícím polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS . NH₂)

Částice z podílu číslo 6 ve shora uvedené tabulce se centrifugují a supernatant se vymění za 1 ml PBS pufru o pH 7,5, který obsahuje 0,2 mg biotin-GAAAGGTAGTGGGGΒΒ ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ

ΒΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒΒ

TCGTGTGCCGG a 0,2 mg biotin-GPRPPERHQS (jejichž příprava je popsána v části c) příkladu 5. Po 24 hodinách inkubace se částice důkladně promyjí PBS a vodou.

Tímto postupem lze provést konjugaci ostatních biotinylovaných vektorů a terapeutických látek s mikrobublinkami potahovanými streptavidinem nebo avidinem.

Příklad 24

Plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené DSPS a s navázaným lipopeptidem cíleným na tromby a s aktivátorem trombolitického enzymu tkáňového plasminogenu

Příklad je zaměřen na přípravu kontrastních látek pro ultrazvuk cílených na trombus a obsahujících terapeuticky výhodné trombolytické činidlo.

část a: lipopeptid s afinitou k trombům (dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu·

Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH₂)

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidu ABI 433A za použití amidové pryskyřice Rink (Novabiochem) v množství řádu 0,1 mmol a předem připravených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyseliny • ·

5-/ o

- 143.«-...· ·..·*..·

Před vazebnou reakcí se všechny aminokyseliny a kyselina palmitová aktivují použitím HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anosolu a 5% vody za vzniku 80 mg surového produktu.

Preparativní HPLC (Vydac 218TP1022) se čistí 20 mg podíl tohoto surového materiálu a po lyofilizaci vznikne 6 mg čistého produktu. Produkt se dále sleduje analytickou HPLC a MALDI hmotová spektrometrie.

část b: modifikace aktivátoru tkáňového plasminogenu použitím sulfo-SMPB

Do roztoku 0,1 ml pufru s uhličitanem amonným, obsahujícím 0,1 mg t-PA (Sigma) se do celkového objemu 0,2 ml přidá voda. Do tohoto roztoku se přidá 0,4 mg sulfo-SMPB (Pierce) rozpuštěného v 0,05 ml DMSO. Roztok proteinu se nechá 45 minut stát při teplotě místnosti, načež se provede čištění na koloně Superdex 200.

Produkt se eluuje v PBS a podíl modifikovaného proteinu se sebere.

část c: plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené DSPS, lipopeptidem vážící tromby a lipopeptidem obsahujícím thiol a konjugace modifikovaného aktivátoru tkáňového plasminogenu

Do čisté zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS (Avanti), 0,5 ·· ·« • · ·

- 140··-··· mg výsledného lipopeptidu vyrobeného v části a) a 0,5 mg lipopeptidu obsahujícího thiol (část a příkladu 15) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 2 minuty zpracovává působení ultrazvuku, pak se 5 minut zahřívá k 80°C. Ihned po zahřátí se směs filtruje přes 4 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se .45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se dvakrát promyjí deionizovanou vodou. Infranatant se odloží a vymění za 1 ml podíl roztoku proteinu připraveného v části b). Konjugace se nechá 1 hodinu probíhat, mikrobublinky se pak centrifugují a infranatant se vymění za 1 ml roztok proteinu. Inkubace se opakuje do úplného spotřebování roztoku proteinu. Mikrobublinky se důkladně promyjí vodou a analyzují se v počítači Coulter Counter. Provede se zkouška mikrobublinek v průtokové komoře tak, jak je popsána v části c) příkladu 1. Podle této zkoušky se k buňkám váže více mikrobublinek modifikovaných proteinem než mikrobublinek obsahujících lipopeptid a DSPS (Avanti) nebo mikrobublinek obsahujících pouze DSPS (Avanti).

Cílení a terapeutické a ultrazvukové vlastnosti se vyhodnotí ve zkouškách trombogeneze in vivo a in vitro.

• · ·· 4444

4

4

- 147·“····

Příklad 25

Víceúčelové plynem plněné (PFB) mikrobublinky zapouzdřené DSPS a lipopeptidem tvořeným peptidem vázajícím heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidem (WOPPRARI) pro cílené a lipopeptidem obsahujícím atenolol pro terapeutické použití část a: lipopeptid skládající se z peptidu vázajícího heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidem (WOPPRARI)

Příprava lipopeptidu je popsána v části a) příkladu 1 část b: derivát chráněného atenololu vhodného pro vazebnou reakci na pevné fázi

1. metyl-4-[ (2,3-epoxy)propoxy]fenylacetát

Reakční směs 4,98 g (0,030 mol) metyl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 μΐ (1,5 mmol) pyridinu se 2 hodiny míchá při teplotě 85°C, Reakční směs zchladí a přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý zbytek se zpracuje etylacetátem, promyje se nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem sodným Roztok se filtruje a zahustí. Vytvořený tmavý zbytek s čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při ·· ···· • · • · ·· ·· ··

I · · ( “ 148··-· ··· • · ·· eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku

2,25 g jako bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ³H (300 MHz) a ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

. metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetát

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetátu, ml (0,27 mol) isopropylaminu a 1,35 ml (74,7 mmol) vody. Reakční směs se v rotačním odpařovači zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze.

Struktura se ověří analýzou ^:H a ¹³C NMR.

3. hydrochlorid 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyseliny

Při teplotě 100°C se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje vodou a lyofilizuje se. Spektrum a ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 268 .

φ · φ

ΦΦΦ ΦΦΦ φ φ φ φ φφ

N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyloctová kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu kyseliny 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyl-etyl)amino]propoxy]fenyloctové ve 2 ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7,2 mmol) hydrogenuhličitanu sodného v 15 ml směsi vody a dioxanu v poměru 2:1. Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2 mmol) di-terc.butyl-dikarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce se sleduje chromatografii na tenké vrstvě na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Di-terc.butyldikarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Roztok se zahustí, vytvořený zbytek se zpracuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s výtěžkem 56%. Struktura se ověří analýzou ^ΤΗ a ¹³C NMR.

φφ φφ φ φ · φ φ φ φ φ • Φ Φ· φ φ φ φ φφφφ φφ φφφφ « φ • ··· φ

φφ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ část c: lipopeptid s navázaným atenololem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA (Novabiochem) chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol, aminokyselin (Novabiochem), kyseliny palmitové (Fluka) a výsledné sloučeniny části a). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Surový materiál se zpracuje eterem a sraženina se čistí preparativní kapalinovou chromatografii (Vydac 218TP1022) při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 38 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min, kolona Vydac 218TP54: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu =25 minut).

MALDI hmotová spektrometrie (ACH matrix): vypočteno M+H 1257, nalezeno 1258.

·'· ·· ·· ·· C ι· · · ··· ···« — 151 —· ··· · · ··· · · · «

-/

ΖΧ

Η

·· ···· · · · · · · ·· ··· ··· ····

část d: Víceúčelové plynem plněné (PFB) mikrobublinky zapouzdřené DSPS a lipopeptidem tvořeným peptidem vázajícím heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidem (WOPPRARI) pro cílené a lipopeptidem obsahujícím atenolol pro terapeutické použití

Do zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS (Avanti), 0,5 mg produktu části a) a 0,5 mg produktu části c) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut se současným protřepáváním k 80°C, vzorek se filtruje a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se důkladně promyjí deionizovanou vodou. Spektrometrií se potvrdí začlenění lipopeptidu obsahujícího atenolol do mikrobublinek metodou popsanou v části b) příkladu 1.

část e= analýza in vitro

Provede se zkouška mikrobublinek in vitro, která je popsána v části c) příkladu 1. Míra postupného hromadění mikrobublinek na buňkách byla závislá na rychlosti průtoku. Při zvýšení průtoku docházelo k oddělování buněk z krycího sklíčka, ale mikrobublinky zůstaly vázané na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které • · · · · · nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a unikaly z průtokové komory již při velmi malém průtoku.

Příklad 26

Plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS a cholesterylesterem chlorambucilu

Příklad je zaměřen na nespecifické modifikace mnohočetných buněčných receptoru na endoteliálních buněk část a: cholesteryl-4-[4-[bis(2-chlorétyl)amino]fenyl]butanoát

Do roztoku 669 mg (2,20 mmol) chlorambucilu (Sigma) v 15 ml bezvodého dichlormetanu se přidá 170 μΐ (1,10 mmol) DIC. Reakční směs se míchá 0,5 hodiny při teplotě místnosti, a pak se přidá do roztoku 387 mg (1,00 mmol) cholesterolu (Aldrich) a 122 mg (1,00 mmol) DMAP v 10 ml dichlormetanu. Reakční směs se přes noc míchá a vlije se na 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného.

Podíly se oddělí a organický podíl se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem hořečnatým. Roztok se filtruje a zahustí. Produkt se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci chloroformem za vzniku 560 mg bezbarvého oleje s výtěžkem 83%. Produkt se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 674.

- 154 Struktura se ověří ^XH (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR.

část b: plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS (Avanti) a cholesterylesterem chlorambucilu

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg výsledného produktu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem. Reakční směs se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorek se filtruje a zchladí na teplotu místnosti. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou a nepřítomnost výsledné sloučeniny části a) v konečném promývacim roztoku se potvrdí hmotovou spektrometrií MALDI. Začlenění cholesterylesteru chlorambucilu do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzuje se hmotovou spektrometrií MALDI - vrchol M+H při 668 odpovídá struktuře výsledného produktu části a) .

V kombinaci s tumor specifickým vektorem jsou tyto mikrobublinky vhodné jako cílené činidla pro přenos • · · · • ·

- 155 účinné látky.

Příklad 27

Víceúčelové, plynem plněné (PBS) mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS , lipopeptidem obsahujícím atenolol a cholesterolovým derivátem chlorambucilu část a: chráněný atenololový derivát vhodný k vazebné reakci na pevné fázi

Příprava derivátu je popsána v části b) příkladu 25.

část b: lipopeptid s navázaným atenololem

Příprava lipopeptidu je popsána v části c) příkladu 25 část c: cholesteryl-4-[4-[bis(2-chloretyl)amino]fenyl]butanoát

Příprava sloučeniny je popsána v části d) příkladu 25.

část d: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS lipopeptidem obsahujícím atenolol a cholesterylesterem chlorambucilu

Do zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS (Avanti), 0,5 mg výsledného produktu části b) a 0,5 mg výsledného produktu části c) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 • · · · · · · · • · · · · · ·

- 156 ~· minut působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorek se filtruje a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu.

Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát důkladně promyjí deionizovanou vodou. Začlenění výsledných sloučenin části c) a b) do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií podle postupu části c) příkladu 1.

část c: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 1. Míra postupného hromadění mikrobublinek na buňkách byla závislá na rychlosti průtoku. Při zvýšení průtoku docházelo k oddělování buněk z krycího sklíčka, ale mikrobublinky zůstaly vázané na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a unikaly z průtokové komory již při velmi malém průtoku.

Příklad 28

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS, lipopeptidem obsahujícím atenolol pro cílení na buňky a lipofilickým thiolesterem s kaptoprilem pro terapeutické účely.

část a: chráněný atenololový derivát vhodný k • ·· · • · · · • ·

- 157 vazebné reakci na pevné fází

Příprava derivátu je popsána v části b) příkladu 25.

část b: lipopeptid s navázaným atenololem

Příprava lipopeptidu je popsána v části c) příkladu 25.

část c: thiolester cholanové kyseliny s kaptoprilem

Reakční směs 361 mg (1,00 mmol) 5-ň-cholanové kyseliny (Sigma) a 77 μΐ (0,50 mmol) DIC v 5 ml dichlormetanu se 10 minut míchá. Směs se přidá do 130 mg (0,600 mmol) kaptoprilu (Sigma) a 180 μΐ (1,20 mmol) DBU v 10 ml dichlormetanu. Reakční směs se přes noc míchá, vlije se na zředěnou kyselinu chlorovodíkovou a přidá se 30 ml chloroformu. Podíly se oddělí, organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem hořečnatým. Po filtraci a zahuštění se surový materiál čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 95:4:1. Produkt se lyofilizuje ze směsi acetnitrilu, vody a etanolu. Vznikne 137 mg špinavě bílé pevné látky s výtěžkem 49%. Struktura se ověří ³H (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR. Hmotová spektrometrie MALDI: m/z 584.

část d: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím atenolol pro cílení na • 9

158 ·· 9··· 99 • 9 9 9

9 9· ·

buňky a lipofilickým thiolesterem s kaptoprilem pro terapeutické účely

Do zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS (Avanti), 0,5 mg výsledného produktu části c) a 0,5 mg výsledného produktu části b) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem. Reakční směs se 5 minut se protřepává a zahřívá k 80°C, a pak se zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se neprokáže det.ekovatelné množství produktů částí b) a c) v konečné prací lázni. Začlenění výsledných sloučenin částí b) a c) do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 9.0% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix) - výsledky odpovídají struktuře produktů částí b) a c).

část e: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v části c) příkladu 1. Míra postupného hromadění mikrobublinek na buňkách byla závislá na rychlosti průtoku. Při zvýšení průtoku docházelo k oddělování ί

• · • ·

- 159 buněk z krycího sklíčka, ale mikrobublinky zůstaly vázané na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a unikaly z průtokové komory již při velmi malém průtoku.

Příklad 29

Plynem plněné mikrobublinky obsahující fosfatidylserin a biotinamid-PEG-ft-Ala-cholesterol a cholesterylester ch-lorambucilu pro diagnostické a terapeutické použití část a: cholesteryl N-Boc-B-alaninát

V atmosféře inertního plynu se do roztoku 1,25 g (6,60 mmol) Boc-B-Ala-OH v 15 ml dichlormetanu se přidá 510μ1 DIC. Reakční směs se 30 minut míchá, a pak se přemístí do nádoby obsahující roztok 1,16 g (3,00 mmol) cholesterolu a 367 mg (3,00 mmol) DMAP v 15 ml dichlormetanu. Reakční směs se 2 hodiny míchá, vlije se do vodného roztoku hydrogensíranu draselného a po oddělení podílů se vodný podíl extrahuje chloroformem. Sloučené organické podíly se promyjí vodným roztokem hydrogensíranu draselného a vodou a suší se nad síranem hořečnatým. Po filtraci a odpařování se surový produkt čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu a metanolu v poměru 99:1 za vzniku 1,63 g bílé pevné látky výsledné sloučeniny s výtěžkem 97%. Struktura se ověří ¹H (500 MHz).

• 9

9

- 160 .-:.....·

99»·

9 část b: hydrochlorid cholesteryl-h-alaninátu

V 5 ml 1M roztoku kyseliny chlorovodíkové v 1,4-dioxanu se při teplotě místnosti 4 hodiny míchá 279 mg (0,500 mmol) výsledného produktu části a). Reakční směs se zahustí za vzniku kvantitativního výtěžku hydrochloridu cholesteryl-ft-alaninátu. Struktura se ověří ^XH (500 MHz) a hmotovou spektrometrií MALDI: M+Na nalezeno .482, vypočteno 481.

část c: biotin-PEG₃₄₀₀-L-Alanin-cholesterol

Do roztoku 15 mg (0,03 mmol) cholesteryl-L-alaninát-hydrochloridu ve 3 ml směsi chloroformu a vodného metanolu v poměru 2,6:1 se přidá 42 μΐ (0,30 mmol) trietylaminu. Reakční směs se 10 minut míchá při teplotě místnosti a po kapkách se přidá roztok 100 mg (0,03 mmol) biotin-PEG₃₄₀₀-NHS v 1 ml 1,4-dioxanu. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti se směs dosucha odpaří a zbytek se čistí rychlou chromatografii za vzniku 102 mg bílých krystalů s výtěžkem 89%. Struktura produktu se ověří MALDI-hmotovou spektrometrií a NMR.

část d: cholesteryl-4-[4-[bis(2-chloretyl)amino]fenyl]butanoát

Do roztoku 669 mg (2,20 mmol) chlorambucilu (Sigma) v 15 ml bezvodého dichlormetanu se přidá 170 μΐ (1,10 mmol) DIC. Reakční směs se míchá 0,5 hodiny při teplotě místnosti, a pak se přidá do roztoku 387 mg (1,00 mmol) φ φ

- 161 ·· φφφφ • φ φ φφφ

Φ · φ · φ φ φ φ φφφφ • φ φ φφ φφ cholesterolu (Aldrich) a 122 mg (1,00 mmol) DMAP v 10 ml dichlormetanu. Reakční směs se přes noc míchá a vlije se na 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného.

Podíly se oddělí a organický podíl se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem hořečnatým. Roztok se filtruje a zahustí. Produkt se čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci chloroformem za vzniku 560 mg bezbarvého oleje s výtěžkem 83%. Produkt se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 674. Struktura se.ověří ^XH (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR.

část e: plynem plněné mikrobublinky

Do zkumavky obsahující 5 mg DSPS (Avanti), 0,5 mg produktu části c) a 0,5 mg výsledného produktu části d) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem, a pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledných sloučenin částí c) ad). Začlenění výsledných sloučenin c) a d) do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií podle postupu části b) příkladu 1.

φ φ

0000 0 0 0 000

00 0 0 0 0 0 0 00

00000 φ 0 • 000 000 00 00 00 00

- 162 Příklad 30

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS (Avanti) a lipopeptidem obsahujícím derivát chlorambucilu pro diagnostické a terapeutické účely.

část a: lipopeptid obsahující derivát chlorambucilu

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc (Novabiochem) v množství řádu 0,125 mmol, odpovídajících aminokyselin (Novabiochem) a kyseliny palmitové (Fluka). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Při DIC preaktivaci se chlorambucil (Sigma) váže na Lys postranní řetězec jako symetrický anhydrid. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT, 5% etyl-metylsulfidu a 5% vody. Podíl 10 mg surového materiálu se čistí preparativní kapalinovou chromatografií (vydac 218TP1022) při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizací vznikne 30 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B =

9909

164

0000 • · • · ·· ·· «ί» «0 ·· ♦ · · 0 0 0 0 • 0 000 0 0 0 0

00000 · 0 • 00 000 *0 00 00 00

0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min, kolona Vydac 218TP54, detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 26,5 minut).

MALDI hmotová spektrometrie (ACH matrix): vypočteno M+H 1295, nalezeno 1294.

část b: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím derivát chlorambucilu pro diagnostické a terapeutické účely

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti) a 0,5 mg výsledného produktu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledné sloučeniny části a). Začlenění výsledného produktu části a) se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix): vypočteno M+H 1294, nalezeno M+H 1300, M+Na vypočteno 1317, nalezeno 1324.

- 165 část c: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v části c příkladu 1. Míra postupného hromadění mikrobublinek na buňkách byla závislá na rychlosti průtoku. Při zvýšení průtoku docházelo k oddělování buněk z krycího sklíčka, ale mikrobublinky zůstaly vázané na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a unikaly z průtokové komory již při velmi malém průtoku.

Příklad 31

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS (Avanti) a lipopeptidem obsahujícím atenolol a lipofilickým derivát kaptoprilu pro terapeutické a diagnostické účely.

část a: chráněný atenololový derivát vhodný k vazebné reakci na pevné fázi

Postup přípravy atenololového derivátu je popsán v části b) příkladu 25.

část b: N-[(S)-3-hexadecylthio-2-metylpropionyl]prolin

Do roztoku 176 mg (0,500 mmol) 1-jodhexadekanu, 120 mg (0,550 mmol) kaptoprilu a 165 μΐ (1,10 mmol) DBU v 5 ml tetrahydrofuranu se přidá 188 μΐ (1,10 mmol) DIEA.

- 166 Reakční směs se 2 hodiny zahřívá na teplotu 70°C, a pak se zahustí. Vytvořený zbytek se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický podíl se extra/huje chloroformem. Organický podíl se promyje vodou a suší se nad síranem hořečnatým. Surový produkt se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Produkt se lyofilizuje za vzniku 105 mg špinavě bílé pevné látky s výtěžkem 48%. Struktura se ověří ^XH (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR. Hmotová spektrometrie MALDI: m/z vypočteno a nalezeno 440.

část d: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím atenolol a lipofilickým derivátem kaptoprilu pro terapeutické a diagnostické účely

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS (Avanti), 0,5 mg výsledného produktu části b) a 0,5 mg výsledného produktu části c) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledných

- 167 sloučenin částí b) a c). Začlenění výsledného produktu částí b) a c) se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix)

- vrchol M+H odpovídá struktuře produktů částí b) a c).

část e: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v části c příkladu 1. Míra postupného hromadění mikrobublinek na buňkách byla závislá na rychlosti průtoku. Při zvýšení průtoku docházelo k oddělování buněk z krycího sklíčka, ale mikrobublinky zůstaly vázané na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesiy vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a unikaly z průtokové komory již při velmi malém průtoku.

Příklad 32

Mikrobublinky způsobující vznášení endoteliálních buněk, specifická vazba víceúčelového lipopeptidu mikrobublinek k endoteliálním buňkám

Příklad popisuje, jak podle současného vynálezu lze mikrobublinky použít k oddělení buněk.

V kultivačních miskách Nunc (chutney 153732) se na

168 živném prostředí RPMI 1640 (Bio Whitaker), do kterého se přidá 200 mM L-glutaminu, směs 10.000 U/ml penicilinu a 10.000 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního hovězího séra (Hyclone Lot č. AFE 5183), se kultivuje lidská endoteliální buněčná linie ECV 304 odvozená z normální pupeční šňůry (ATCC CRL-1998). Buňky se kultivují s následnou trypsinací v poměru od 1:5 do 1:7 k dosažení souvislé vrstvy. Do každé sady pěti centrifugačních zkumavek se přidají 2 miliony buněk trypsinované souvislé vrstvy buněk, a následně buď kontrolní mikrobublinky DSPS, mikrobublinky příkladu 1 nebo mikrobublinky DSPS dopované lipopeptidem k navázání k endoteliálním buňkám podle příkladu 14a), když do každé zkumavky se přidá 2, 4, 6, 8 nebo 10 milion bublinek. Po 5 minutách centrifugace rychlostí 400.g se buňky na dně zkumavek sledují počítačem Coulter Counter. Čtyři nebo více mikrobublinek navázaných na buňku způsobilo přemístění buňky k hladině tekutiny v centrifugační zkumavce. Výsledné mikrobublinky příkladu 38 způsobily vznášení všech buněk, zatímco mikrobublinky příkladu 1 způsobily vznášení buněk jen z 50%.

Příklad 33

Přenos genu plynem (PFB) plněnými mikrobublinkami

4 4

- 169

4

4 4 4 4 4 4 4 t

Příklad je zaměřen na přípravu cílených mikrobublinek pro genový přenos.

část a: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem potahovaným poly-L-lysinem

Do dvou zkumavek obsahujících 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného lipopeptidu části b) příkladu 17 se přidá 0,8 ml 4% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Roztoky se zahřívají 5 minut na teplotu 80°C, protřepávají se, zchladí se na teplotu místnosti a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem.

Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle (Espe Capmix ) při frekvenci 4450 kmitů za minutu, a pak se na 5 minut umístí na výkyvnou třepačku. Po 5 minutách centrifugace rychlostí 2000 otáček za minutu se infranatant odstraní a objem se doplní destilovanou vodou. Promývací procedura se znovu opakuj e.

Ve 2 ml vody se rozpustí 20,6 mg hydrobromidu poly-L-lysinu (Sigma), a pak se 0,4 ml podíl roztoku zpracuje 2 ml vody. Do 1,2 ml ředěného polylysinového roztoku se přidá 0,12 ml suspenze mikrobublinek tvořených DSPS a lipopeptidem. Po inkubaci se přebytek polylysinu odstraní důkladným promýváním vodou.

část b: přenos genetického materiálu do buněk

V kultivačních nádobách s 6 prohlubněmi se pěstují • · • · ·· *·♦· • · · · • ' • « ► · · · · · · endoteliální buňky ECV 304 za vzniku jedné souvislé vrstvy buněk. Připraví se směs pro přenos genetického materiálu obsahující 5 pg DNA (zeleně fluoreskující proteinový vektor (CLONTECH) a 50 μΐ suspenze mikrobublinek vyrobené v části a) v živném prostředí RPMI v množství do 250 μΐ celkového objemu. Reakční směs se nechá 15 minut stát při teplotě místnosti, a pak se přidá 1 ml kompletního živného prostředí RPMI. Živné prostředí se odstraní z kultivačních misek a k buňkám se přidá směs DNA a mikrobublinek. Buňky se inkubují v inkubátoru buněčných kultur při teplotě 37°C.

část c: působení ultrazvukem

Po 15 minutách inkubace se na vybrané prohlubně působilo 30 vteřin kontinuálním ultrazvukovým vlněním s frekvencí 1 MHz (0,5 W/cm²) .

část d: inkubace a vyhodnocení

Buňky se dále přibližně 4,5 hodiny inkubují v inkubátoru pro buněčné kultury při teplotě 37°C. Živné prostředí obsahující směs DNA a mikrobublinek se odstraní odsátím a přidají se 2 ml živného prostředí RPMI. Buňky se nejprve 40-70 hodin inkubují, živné prostředí se z větší části odstraní a buňky se sledují fluorescenční mikroskopií. Výsledky se porovnávají s výsledky kontrolních zkoušek, při kterých se do buněk přidá DNA nebo směs DNA a polylysinu.

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY ···· ···

   1. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek s možností zacílení, vyznačující se tím, že je ve vodném kapalném nosném prostředí tvořen suspenzí reportéru s obsahem plynu nebo vytvářejícího plyn, přičemž prostředek je schopen vytvořit nejméně dva typy vazných párů s cílovou strukturou a materiál, obsahující nebo vytvářející plyn je konjugován s nejméně dvěma vektory nebo s jedním vektorem, schopným vazby na nejméně dvě vazná místa.
2. 2. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje vzduch, dusík, kyslík, oxid uhličitý, vodík, inertní plyn, fluorid sírový, fluorid selenový,nízkomolekulární uhlovodík, keton, ester, halogenovaný uhlovodík s nízkou molekulovou hmotností nebo směs kterýchkoliv z uvedených plynů.
3. 3. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 2,vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje perfluorovaný keton, perfluorovaný ether nebo perfluorovaný uhlovodík.
4. 4. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 2,vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje fluorid sírový, perfluorpropan, perfluorbutan nebo perfluorpentan.
5. 5. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 4,vyznačující se tím, že obsahuje mikrobublinky plynu, stabilizované povrchovou membránou, odolnou proti splývání bublinek, bílkovinu, tvořící film, polymerní materiál, nepolymerní nebo nepolymerovatelný materiál, tvořící stěny nebo smáčedla.

   172 φφ φφφφ • φ φ φ φ φ φ φ φ · · · φ φ φ 4

   Φ Φ Φ 4
6. 6. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 5,vyznačující se tím, že smáčedlo je tvořeno nejméně jedním fosfolipidem.
7. 7. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 6,vyznačující se tím, že nejméně 75 % smáčedla je tvořeno molekulami fosfolipidu, jednotlivě nesoucími náboj.
8. 8. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 7,vyznačující se tím, že nejméně 75 % smáčedla, vytvářejícího film je tvořena nejméně jedním fosfolipidem ze skupiny fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, fosfatidové kyseliny a kardiolipiny.
9. 9. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím , že nejméně 80 % fosfolipidů je tvořeno fosfatidylseriny.
10. 10. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 9,vyznačující se tím, že materiál, obsahující nebo tvořící plyn, je konjugován s jedním nebo větším počtem vektorů pro zacílení se specifičností pro jeden nebo větší počet receptorů na povrchu buněk a dále tento vektor obsahuje skupiny, schopné vazby na receptorový systém k vyvolání léčebné odpovědi.
11. 11. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 10,vyznačující se tím, že se vektor nebo vektory volí ze skupiny protilátek, molekul, schopných adhese k buňkám, molekul receptoru, schopného adhese k buňkám, cytokinů, růstových faktorů, peptidových hoprmonů a jejich částí, biologicky neúčinných vazných prvků receptorů pro molekuly s adhesí na buňky, cytokiny, růstové faktory a peptidové hormony, oligonukleotidy a modifikované * · · · · • · • ···

    - 173 oligonukleotidy, látky, schopné vázat DNA, substráty/inhibitory proteázy, molekuly, získané z kombinačních bank, malé biologicky účinné molekuly a bílkoviny a peptidy, schopné se vázat na proteoglykany buněčného povrchu.
12. 12. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 11,vyznačující se tím, že obsahují vektor nebo vektory s takovou afinitou pro cílovou strukturu, že se prostředek dostává do interakce, avšak nedochází k pevné vazbě na cílovou strukturu.
13. 13. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 12,vyznačuj ící se tím, že se vektor nebo vektory volí z vazných látek pro bílkoviny, schopné adhese na buňky, které mají odpovídající vazné řetězce na endothelovém buněčném povrchu.
14. 14. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 13,vyznačující se tím, že vektor nebo vektory jsou uloženy tak, že nejsou přímo vystaveny cílové struktuře.
15. 15. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 14,vyznačující se tím, že vektor nebo vektory jsou vázány nebo spojeny s reportérem pomocí interakcí avidin-biotin a/nebo streptavidin-biotin.
16. 16. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 14,vyznačuj ící se tím, že vektor nebo vektory mohou být s reportérem spojeny nebo na něj vázány kovalentním nebo nekovalentním způsobem.

    • 0 ·♦··

    0 0 0 0 • 0 0 0

    000 000 • 0 0 0 • · · • 0

    174 že vektor je spojen s reportérem nebo je na něj vázán pomocí interakce elektrostatických nábojů.
17. 18. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 17, vyznačuj ícíse tím, že dále obsahuje skupiny, které jsou radioaktivní nebo účinné jako kontrastní látky pro rtg-zobrazování, jako sondy pro zobrazování světla nebo jako spinové značení.
18. 19. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 18,vyznačující se tím, že dále obsahuje léčivo.
19. 20. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 19,vyznačující se tím, že jako léčivo obsahuje antineoplastickou látku, krevní produkt, látku, modifikující biologickou odpověď, antifungální látku, hormon nebo jeho analog, vitamin, enzym, antialergickou látku, inhibitor tkáňových faktorů, inhibitor krevních destiček, inhibitor cílové koagulační bílkoviny, inhibitor tvorby fibrinu, promotor fibrinolýzy, antiangiogenní látku, látku pro ovlivnění oběhového systému, potenciátor metabolismu, antituberkulotickou nebo protivirovou látku, vasodilatační látku, antibiotikum, protizánětlivé látky, látky s účinkem proti prvokům, antirheumatické látky, narkotika, opiáty, srdeční glykosidy, blokátory nervosvalového přenosu, sedativa, místní anestetika, celková anestetika nebo genetický materiál.
20. 21. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 19 nebo 20,vyznačuj ící se tím, že léčivo je kovalentně vázáno nebo spojeno s reportérem pomocí disulfidových skupin.
21. 22. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 19 nebo 20,vyznačující se tím, že obsahuje

    99 ··««

    - 175 ·· ·· • · ·« ·· • · · I * · · · « • · · · · ··« • · · * · · «· lipofilní nebo lipofilněderivatlzované léčivo, vázané na reportér pomocí hydrofobních interakcí.
22. 23. Kombinovaný prostředek, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje

    i) první složku, tvořenou předem zacíleným vektorem s afinitou pro zvolenou cílovou strukturu a ii) druhou složku, tvořenou prostředkem podle některého z nároků 1 až 22, přičemž tento prostředek obsahuje vektor s afinitou pro předběžně zacílený vektor.
23. 24. Kombinovaný prostředek podle nároku 23, vyzná čující se tím, že jako předem zacílený vektor obsahuje monoklonální protilátku.
24. 25. Kombinovaný prostředek, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje

    i) první složku, kterou je prostředek podle některého z nároků 1 až 22 a ii) druhou složku, tvořenou látkou, schopnou odštěpit nebo uvolnit uvedený prostředek z jeho cílové struktury.
25. 26. Kombinovaný prostředek, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje

    i) první složku, tvořenou prostředkem podle nároku 21 a ii) druhou složku, obsahující redukční činidlo, schopné reduktivně štěpit disulfidové skupiny nebo spojit léčivo a reportér v první složce.
26. 27. Způsob výroby diagnostického a/nebo léčebného prostředku s možností zacílení podle nároku 1, vyzná0 0

    0 0 0

    0 ·0

    0 0 0

    0 0 0

    0 0

    - 176 00 0000 « 0 0 000 čující se tím, že se nejméně jeden vektor naváže nebó se spojí s reportérem, obsahujícím materiál s obsahem plynu nebo tvořící plyn, přičemž prostředek je schopen vytvořit s cílovou strukturou nejméně dva typy vazných párů.
27. 28. Způsob podle nároku 27,vyznačující s tím, že se na reportér naváže také léčivo.
28. 29. Použití prostředku podle některého z nároků 1 až 22, jako zacílitelného kontrastního prostředku pro zobrazování pomocí ultrazvuku.
29. 30. Způsob tvorby zlepšených obrazů lidského nebo živočišného organismu, vyznačující se tím, že se podává prostředek podle některého z nároků 1 až 22 a vytvoří se obraz pomocí ultrazvuku, magnetické resonance, rtg -záření, radiograficky nebo pomocí světla.
30. 31. Způsob podle nároku 30,vyznačuj ící s e t í m , že se

    i) nejprve podá předem zacílený vektor s afinitou pro zvolenou cílovou strukturu a pak ii) se podá prostředek podle některého z nároků 1 až 22 s obsahem vektoru s afinitou pro svrchu uvedený předem žací lený vektor.
31. 32. Způsob podle nároku 31, vyznačuj íc í se tí m , že se jako předem zacílený vektor užije monoklonální protilátka.
32. 33. Způsob podle nároku 30,vyznačující se t í m , že se ♦ 9 9999

    9 9 ♦ 9 9· • 99

    99 9 «

    9 9 9 999 9 9 9 9

    9 9 9

    99 99 • 9 9 9 • 9 9 9

    999 999

    177

    i) podá prostředek podle některého z nároků 1 až 22, ii) podá se látka, schopná odstranit nebo uvolnit podaný prostředek z jeho cílové struktury.
33. 34. Způsob podle některého z nároků 30 až 33, vyznačující se tím, že se užije prostředek, dále obsahující léčivo.
34. 35. Způsob podle nároku 34,vyznačuj ící se t í m , že se léčivo kovalentně spojí nebo váže na reportér disulfidovými skupinami a podává se prostředek, obsahující redukční činidlo, schopné reduktivně štěpit tyto disulfidové skupiny.
35. 36. Způsob sledování zacílení in vitro pomocí prostředku podle některého z nároků 1 až 22, vyznačuj ící se t í m, že se do průtokové komory pevně uloží buňky, u nichž dochází k expresi cílové struktury a komorou se nechá procházet suspenze prostředku v nosné kapalině, načež se sleduje vazba prostředku na buněčný materiál.
36. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačuj ící se tím, že se řídí rychlost průtoku nosné kapaliny k napodobení střihu, k němuž dochází in vivo.