DE69632401T2

DE69632401T2 - Neue zielgerichtete mittel zur diagnostischen und therapeutischen verwendung

Info

Publication number: DE69632401T2
Application number: DE69632401T
Authority: DE
Inventors: C. Evan UNGER; Dekang Shen; Guanli Wu
Original assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Current assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: JPH11507638A; EP0831932A1; AU6270396A; DE69632401D1; CN1083280C; WO1996040285A1; EP0831932B1; CN1187137A; JP4215820B2; CN1397348A; EP1444991A1; ATE265863T1; AU709562B2; CA2218541A1; EP0831932A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue zielgerichtete Zusammensetzungen und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue zielgerichtete Zusammensetzungen, die gezielt auf Gewebe in dem Körper für die diagnostische Bildgebung und/oder zur Verabreichung bioaktiver Mittel gerichtet werden können.
Hintergrund der Erfindung
Eine Vielzahl von Abbildungstechniken sind zur Diagnose von Krankheiten verwendet worden. wird Dabei ist die Röntgenabbildung ben diesen Abbildungstechniken mit umfasst. Beim Röntgen reflektieren die erzeugten Abbildungen die verschiedenen Dichten von Strukturen und Geweben in dem Körper des Patienten. Zum Verbessern der diagnostischen Verwendbarkeit dieser Abbildungstechnik können Kontrastmittel für die Erhöhung der Dichte der interessierenden Gewebe in Bezug auf die umgebenden Gewebe verwendet werden. Beispiele derartiger Kontrastmittel umfassen zum Beispiel Barium und iodierte Verbindungen, die für Röntgenstrahluntersuchungen der gastrointestinalen Region verwendet werden, einschließlich der Speiseröhre, des Magens, der Gedärme und des Enddarms. Kontrastmittel können ebenfalls für Computertomographie-(CT) und Computer-unterstützte Tomographie-(CAT)Untersuchungen zur Verbesserung der Sichtbarmachung der interessierenden Gewebe, zum Beispiel des Magen-Darmtrakts verwendet werden.
Die Magnetische Resonanzabbildung (MRI) ist eine weitere Abbildungstechnik, die im Gegensatz zu Röntgenstrahlen keine ionisierende Strahlung erfordert. MRI kann zur Erzeugung von Querschnittsbildern des Körpers in einer Vielzahl von Scanning-Ebenen, wie zum Beispiel axial, koronal, sagittal oder orthogonal, verwendet werden. Die MRI verwendet ein magnetisches Feld, Radiofrequenzenergie und magnetische Feldgradienten, um Bilder des Körpers zu erzeugen. Die Kontrast- oder Signalintensitätsunterschiede zwischen Geweben reflektieren hauptsächlich die T1-(longitudinal) und T2-(transversal)Relaxationswerte und die Protonendichte, die im Allgemeinen dem Gehalt an freiem Wasser in den Geweben entspricht. Zur Veränderung der Signalintensität in einer Region eines Patienten unter Verwendung eines Kontrastmediums sind mehrere mögliche Methoden verfügbar. Ein Kontrastmedium kann zum Beispiel zur Änderung von entweder dem T1-, T2-Wert oder der Protonendichte entworfen sein.
Allgemein gesagt, erfordert die MRI die Verwendung von Kontrastmitteln. Falls die MRI ohne Verwendung eines Kontrastmittels durchgeführt wird kann die Unterscheidung des interessierenden Gewebes von den umgebenden Geweben in der resultierenden Abbildung schwierig sein. In der Vergangenheit lagen vor allem paramagnetische Kontrastmittel für die MRI im Mittelpunkt des Interesses. Paramagnetische Kontrastmittel erfordern Materialien, die ungepaarte Elektronen enthalten. Die ungepaarten Elektronen wirken als kleine Magnete innerhalb des hauptsächlichen magnetischen Feldes zum Erhöhen der longitudinalen (T1) und transversalen Relaxationsgeschwindigkeit. Paramagnetische Kontrastmittel umfassen typischerweise Metallionen, zum Beispiel Übergangsmetallionen, die eine Quelle für ungepaarte Elektronen zur Verfügung stellen. Diese Metallionen sind jedoch im Allgemeinen ebenfalls hochtoxisch. In dem Bemühen, die Toxizität zu verringern, sind die Metallionen typischerweise mit Liganden chelatisiert.
Metalloxide, vor allem Eisenoxide sind ebenfalls als MRI-Kontrastmittel verwendet worden. Obwohl kleine Eisenoxidteilchen, zum Beispiel Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als ungefähr 20 nm erwünschte paramagnetische Relaxationseigenschaften aufweisen können, beruht ihre hauptsächliche Wirkung auf ihrer Massensuszeptibilität. Nitroxide sind eine weitere Klasse von MRI-Kontrastmitteln, die ebenfalls paramagnetisch sind. Diese weisen ein relativ geringes Relaxationsvermögen auf und sind im Allgemeinen weniger wirksam als paramagnetische Ionen.
Die bestehenden MRI-Kontrastmittel leiden an einer Anzahl von Beschränkungen. Zum Beispiel kann ein erhöhtes Abbildungsrauschen bestimmten Kontrastmitteln, einschließlich Kontrastmittel, die als Chelat gebundene Metalle betreffen, zugeordnet werden. Dieses Rauschen entsteht im Allgemeinen aus inneren peristaltischen Bewegungen und Bewegungen durch die Atmung oder kardiovaskuläre Tätigkeit. Weiterhin hängt die Signalintensität für die Kontrastmittel im Allgemeinen von der Konzentration des Mittel sowie der verwendeten Pulssequenz ab. Die Absorption der Kontrastmittel kann die Interpretation der Bilder komplizieren, insbesondere in dem distalen Teil des Dünndarms, sofern nicht ausreichend hohe Konzentrationen der paramagnetischen Spezies verwendet werden. Siehe zum Beispiel Kornmesser et al., Magnetic Resonance Imaging, 6: 124 (1988).
Andere Kontrastmittel können weniger empfindlich gegen Veränderungen in der Pulssequenz sein und können für einen reproduzierbareren Kontrast sorgen. Jedoch können hohe Konzentrationen an Teilchen, wie zum Beispiel Ferrite Artefakte der magnetischen Suszeptibilität verursachen, die besonders zum Beispiel im Dickdarm, in dem die Absorption der Darmflüssigkeit stattfindet, offensichtlich sind, und das superparamagnetische Material kann angereichert werden.
Die Toxizität ist ein weiteres Problem, das mit den gegenwärtigen Kontrastmitteln, einschließlich Kontrastmittel für die MRI, verbunden ist. Zum Beispiel verursachen Ferrite nach oraler Verabreichung häufig Übelkeitssymptome, sowie Blähungen und ein vorübergehender Anstieg in Serumeisen. Das Gadoliniumion, das in Gd-DTPA komplexiert ist, ist in freier Form hoch toxisch. Die verschiedenen Umgebungen des Magen-Darmtrakts, einschließlich einer erhöhten Acidität (niedrigerer pH-Wert >) und erhöhten Basizität (höherer pH-Wert) in den Gedärmen können die Wahrscheinlichkeit einer Entkopplung und Abspaltung des freien Ions aus dem Komplex erhöhen.
Ultraschall ist eine weitere diagnostische Abbildungstechnik zur Untersuchung von verschiedenen Gebieten des Körpers, einschließlich zum Beispiel des Gefäßsystems, wie zum Beispiel das Mikrogefäßsystem des Gewebes. Ultraschall sorgt gegenüber anderen diagnostischen Techniken für gewisse Vorteile. Zum Beispiel erfordern diagnostische Techniken, die die Nuklearmedizin und Röntgenstrahlen betreffen im Allgemeinen das Aussetzen des Patienten gegenüber ionisierender Elektronenstrahlung. Eine derartige Strahlung kann eine Schädigung des subzellulären Materials, einschließlich der Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA) und Proteine verursachen. Ultraschall erfordert keine derartige potentiell schädigende Strahlung. Zusätzlich ist Ultraschall im Vergleich zu anderen diagnostischen Techniken preisgünstig, einschließlich CT und MRI, die eine aufwendige und teure Ausstattung erfordern.
Ultraschall beinhaltet das Aussetzen eines Patienten gegenüber Schallwellen. Im Allgemeinen breiten sich Schallwellen aufgrund der Absorption durch Körpergewebe aus, dringen durch das Gewebe oder reflektieren von dem Gewebe. Die Reflexion von Schallwellen von dem Gewebe weg, die im Allgemeinen als Rückstreuung oder Reflexionsvermögen bezeichnet wird, bildet die Grundlage für die Entwicklung einer Ultraschallabbildung. In diesem Zusammenhang reflektieren Schallwellen unterschiedlich von unterschiedlichen Körpergeweben. Diese differentielle Reflexion ist auf verschiedene Faktoren, einschließlich den Bestandteilen und der Dichte des speziellen beobachteten Gewebes zurückzuführen. Ultraschall betrifft den Nachweis der differentiell reflektierten Wellen, im Allgemeinen mit einem Messwandler, der Ultraschallwellen mit einer Frequenz von einem Megahertz (MHz) bis zehn MHz nachweisen kann. Die nachgewiesenen Wellen können zu einer Abbildung integriert werden, die quantitativ bestimmt wird, und die quantitativ bestimmten Wellen können zu einem Bild des untersuchten Gewebes umgewandelt werden.
Wie bei den vorstehend erörterten Techniken erfordert Ultraschall ebenfalls die Verwendung von Kontrastmitteln. Beispielhafte Kontrastmittel umfassen zum Beispiel Suspensionen fester Teilchen, emulgierte flüssige Tröpfchen und gasgefüllte Blasen. Siehe zum Beispiel Hilmann et al., U.S. Patent Nr. 4,466,442 und die veröffentlichten internationalen Patentanmeldungen WO 92/17212 und WO 92/21382. Widder et al., offenbart in der veröffentlichten Anmeldung EP-A-0324938 stabilisierte mikrobläschenartige Ultraschallabbildungsmittel, die aus Wärme-denaturierbarem bioverträglichen Protein, zum Beispiel Albumin, Hämoglobin und Collagen erzeugt wurden.
Die Qualität von Bildern, die durch Ultraschall erzeugt sind, hat sich signifikant verbessert. Dennoch gibt es einen Bedarf für weitere Verbesserung, insbesondere in Bezug auf Abbildungen, die das Gefäßssystem in Geweben mit Durchblutung durch die vaskuläre Blutversorgung, betreffen. Dementsprechend besteht ein Bedarf an verbesserten Ultraschalltechniken, einschließlich verbesserten Kontrastmitteln, die in der Lage sind, medizinisch verwendbare Abbildungen des Gefäßsystems und der Organe in Bezug auf die Gefäße zu liefern.
Die Reflexion des Schalls von einer Flüssigkeit-Gas-Grenzfläche ist äußerst wirksam. Dementsprechend sind Bläschen, einschließlich gasgefüllter Bläschen, als Kontrastmittel verwendbar. Der Ausdruck „Bläschen", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Vesikel, die im Allgemeinen durch das Vorhandensein von einer oder mehrer Membranen oder Wänden charakterisiert sind, die einen inneren Hohlraum, der mit einem Gas oder einen Vorläufer dafür gefüllt ist, umgeben. Beispielhafte Bläschen umfassen zum Beispiel Liposomen, Mizellen und dergleichen Wie nachstehend vollständiger erörtert wird, hängt die Wirksamkeit von Bläschen als Kontrastmittel von verschiedenen Faktoren ab, die zum Beispiel die Größe und/oder die Elastizität des Bläschens umfassen.
In Bezug auf die Wirkung der Bläschengröße wird die nachstehende Diskussion vorgestellt. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist das Signal, das von einem Bläschen reflektiert wird, eine Funktion des Radius (r⁶) des Bläschens (Rayleigh Streuer). Daher besitzt ein Bläschen mit einem Durchmesser von 4 Mikrometern (μm) im Frequenz bereich des diagnostischen Ultraschalls eine Streufähigkeit, die ungefähr das 64 fache eines Bläschens mit einem Durchmesser von 2 μm beträgt. Allgemein gesagt ist, daher das reflektierte Signal umso größer, je größer das Bläschen ist.
Die Bläschengröße ist jedoch durch den Durchmesser der Kapillaren, durch die die Bläschen hindurchgehen müssen, eingeschränkt. Im Allgemeinen können Kontrastmittel, die Bläschen mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm umfassen, gefährlich sein, da die Mikrogefäße verschlossen werden können. Dementsprechend ist erwünscht, dass mehr als ungefähr 99% der Bläschen in einem Kontrastmittel einen Durchmesser von weniger als 10 μm aufweisen. Der mittlere Bläschendurchmesser ist ebenfalls wichtig und sollte mehr als 1 μm betragen, wobei mehr als 2 μm bevorzugt sind. Der Volumengewichtete mittlere Durchmesser der Bläschen sollte ungefähr 7 bis 10 Mikrometer betragen.
Die Elastizität der Bläschen ist ebenfalls wichtig. Denn hochelastische Bläschen können, wenn es notwendig ist, deformieren, um sich durch die Kapillaren zu zwängen und/oder zu ermöglichen, dass das Blut um die Bläschen herum fließt. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit eines Verstopfens. Die Wirksamkeit eines Kontrastmittels, das Bläschen umfasst, ist ebenfalls von der Bläschenkonzentration abhängig. Im Allgemeinen ist das Reflexionsvermögen des Kontrastmittels umso größer je größer die Bläschenkonzentration ist.
Ein weiteres charakteristisches Merkmal, das die Wirksamkeit der Bläschen als Kontrastmittel betrifft, ist die Bläschenstabilität. Der Ausdruck „Bläschenstabilität", so wie er hier in Bezug auf gasgefüllte Bläschen verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit von Bläschen, das darin eingeschlossene Gas zu bewahren, nachdem sie einem Druck ausgesetzt wurden, der größer als der Atmosphärendruck ist. Damit sie als Kontrastmittel wirksam sind müssen die Bläschen im Allgemeinen mehr als 50% des eingeschlossenen Gases nach dem Aussetzen gegen einen Druck von 300 Millimetern (mm) Quecksilber (HG) während ungefähr einer Minute bewahren. Besonders wirksame Bläschen bewahren 75% des eingeschlossenen Gases, nachdem sie während einer Minute einem Druck von 300 mm Hg ausgesetzt wurden, wobei ein Gehalt an eingeschlossenem Gas von 90% besonders wirksame Kontrastmittel zur Verfügung stellt. Es ist ebenfalls hocherwünscht, dass nach dem Ablassen des Drucks die Bläschen zu ihrer ursprünglichen Größe zurückkehren. Dies wird im Allgemeinen als „Bläschenelastizität" bezeichnet.
Bläschen, denen die erwünschte Stabilität fehlt, liefern schlechte Kontrastmittel. Setzen zum Beispiel Bläschen das darin eingeschlossene Gas in vivo frei, nimmt das Reflexionsvermögen ab. Ähnlich wird die Größe von Bläschen, die eine geringe Elastizität besitzen, in vivo abnehmen, was ebenfalls zu einem verringerten Reflexionsvermögen führt.
Die Stabilität von Bläschen, die im Stand der Technik offenbart sind, ist im Allgemeinen zur Verwendung als Kontrastmittel unzulänglich. Zum Beispiel offenbart der Stand der Technik Bläschen, einschließlich gasgefüllter Liposomen, die Lipidenthaltende Wände oder Membranen umfassen. Siehe zum Beispiel Ryan et al., U.S. Patent Nr. 4,900,540 und 4,544,545; Tickner et al., U.S. Patent Nr. 4,276,885; Klaveness et al., WO 93/13809 und Schneider et al., EPO 0 554 213 und WO 91/15244. Lanza et al., die WO 93/20802 offenbart akustisch reflektierende oligolamellare Liposomen, die multilamellare Liposomen mit erhöhtem wässrigen Zwischenraum zwischen den Doppelschichten sind oder Liposomen aufweisen, die innerhalb der Doppelschichten auf nicht konzentrische Wiese verschachtelt sind und daher innerlich getrennte Doppelschichten enthalten. Ihre Verwendung als Ultraschallkontrastmittel zur Verbesserung der Ultraschallabbildung und bei der Überwachung eines Arzneimittels, das in einem Patienten verabreichten Liposom transportiert wird, wird ebenfalls beschrieben. D'Arrigo, U.S. Patent Nr. 4,684,479 und 5,215,680 offenbart Emulsionen von Gas in Flüssigkeit beziehungsweise Lipid-beschichtete Mikrobläschen.
Viele der im dem Stand der Technik offenbarten Bläschen wiesen eine unerwünschte schlechte Stabilität auf. Daher sind die Bläschen aus dem Stand der Technik gegen Zerbrechen in vivo anfälliger, was zum Beispiel zu der vorzeitigen Freisetzung jedes therapeutischen und/oder diagnostischen Mittels, das darin enthalten ist, führt. Verschiedene Untersuchungen wurden in dem Versuch, die Bläschenstabilität zu verbessern durchgeführt. Derartige Untersuchungen umfassten zum Beispiel die Herstellung von Bläschen, deren Membrane oder Wände Proteine, wie zum Beispiel Albumin, oder Materialien, die anscheinend über Vernetzung verstärkt wurden, umfassen. Siehe zum Beispiel Klaveness et al., WO 92/17212, worin Bläschen offenbart sind, die Proteine umfassen, die mit biologisch abbaubaren Vernetzungsmitteln vernetzt sind. Eine Darstellung wurde von Moseley et al., bei einem Napa, California Melting der Society for Magnetic Resonance in Medicine 1991 präsentiert, die in einem Abstrakt mit dem Titel „Microbubbles: A Novel MR Susceptibility Contrast Agent" zusammengefasst ist. Die von Moseley et al. beschriebenen Mikrobläschen umfassen mit einer Schale von menschlichem Albumin umhüllte Luft. Alternativ dazu können Bläschenmembranen Verbindungen umfassen, die keine Proteine sind, aber die mit biologisch verträglichen Verbindungen vernetzt sind. Siehe zum Beispiel Klaveness et al., WO 92/17436, WO 93/17718 und WO 92/21382.
Techniken aus dem Stand der Technik zum Stabilisieren von Bläschen, einschließlich der Verwendung von Proteinen in der äußeren Membran oder der Vernetzung der Membrankomponenten, leiden an verschiedenen Nachteilen. Zum Beispiel betrifft die vorstehend beschriebene Vernetzung im Allgemeinen die Verwendung neuer Materialien, einschließlich vernetzter Proteine oder anderer Verbindungen, deren metabolisches Schicksal unbekannt ist. Weiterhin erfordert das Vernetzen zusätzliche chemische Verfahrensschritte, umfassend die Isolierung und Reinigung der vernetzten Verbindungen. Überdies kann die Verwendung von Proteinen, wie zum Beispiel Albumin, in Bläschenmembranen und das Vernetzen der Bläschenmembrankomponenten den Wänden der Bläschen Steifigkeit verleihen. Dies führt zu Bläschen mit verringerter Elastizität und daher einer verringerten Fähigkeit zur Deformation und zum Durchlaufen der Kapillaren. Mit Kontrastmitteln aus dem Stand der Technik, die mit Proteinen und/oder Vernetzung zu tun haben, gibt es daher eine größere Wahrscheinlichkeit für ein Verschließen der Gefäße.
Die EP 0 727 225 offenbart Zusammensetzungen zum Erhöhen der Fähigkeit, gasförmige Mikrobläschen, die im Ultraschallkontrast verwendet werden, auf ein Ziel zu richten.
Die DE 42 32 755 betrifft Zusammensetzungen von Mikroteilchen, die aus biologisch abbaubaren Copolymeren hergestellt sind, für die therapeutische und diagnostische Verwendung, insbesondere für Ultraschalluntersuchungen.
Dementsprechend werden neue und/oder bessere stabilisierte Kontrastmittel und Verfahren zu deren Bereitstellung benötigt. Die vorliegende Erfindung betrifft diesen Sachverhalt, sowie andere wichtige Zielsetzungen.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt der Erfindung wird eine zielgerichtete Zusammensetzung, umfassend Lipidvesikel, die ein fluoriertes Gas einschließen zur Verfügung gestellt, wobei die Vesikel ein Lipid mit einem Zielliganden umfassen, wobei der Zielligand an das Lipid über eine hydrophile Polymerverknüpfungsgruppe kovalent gebunden ist, wobei der Zielligand auf Zellen oder Rezeptoren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Herzmuskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Tumorzellen und dem Glycoprotein GPIIbIIIaRezeptor, zielt und das fluorierte Gas aus der Gruppe, bestehend aus Perfluorkohlenwasserstoffen und Schwefelhexafluorid, ausgewählt ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Kontrastmittel zur diagnostischen Bildgebung, umfassend eine zielgerichtete Zusammensetzung der Erfindung, zur Verfügung gestellt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer zielgerichteten Zusammensetzung der Erfindung zur Herstellung eines Kontrastmittels für die Diag nose der Gegenwart von krankhaftem Gewebe in einem Patienten zur Verfügung gestellt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer zielgerichteten Zusammensetzung der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments für die therapeutische Verteilung in vivo eines bioaktiven Mittels zur Verfügung gestellt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer zielgerichteten Zusammensetzung der Erfindung zur Herstellung einer Formulierung für die Thrombolyse eines Gerinnsels in einer inneren Region eines Patienten zur Verfügung gestellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Wie sie vorstehend und durchwegs in der Offenbarung verwendet werden sind unter den folgenden Ausdrücken, sofern nichts anderes angegeben ist, die folgenden Bedeutungen zu verstehen.
Der Begriff „Lipid" bezieht sich auf eine synthetisch oder natürlich vorkommende Verbindung, die im Allgemeinen amphipatisch und biologisch verträglich ist. Die Lipide umfassen typischerweise eine hydrophile Komponente und eine hydrophobe Komponente. Beispielhafte Lipide umfassen zum Beispiel Fettsäuren, neutrale Fette, Phosphatide, Glycolipide, oberflächenaktive Mittel (grenzflächenaktive Mittel), aliphatische Alkohole, Wachse, Terpene und Steroide.
Der Begriff „Lipidzusammensetzung" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die eine Lipidverbindung, typischerweise in einem wässrigen Medium umfasst. Beispielhafte Lipidzusammensetzungen umfassen Suspensionen, Emulsionen und Vesikelzusammensetzungen.
Der Begriff „Lipidformulierung" bezieht sich auf eine Lipidzusammensetzung, die ebenfalls ein bioaktives Mittel umfasst.
Der Begriff „Vesikel" bezieht sich auf eine kugelförmige Einheit, die im Allgemeinen durch das Vorhandensein von einer oder mehreren Wänden oder Membranen, die eine oder mehrere innere Hohlräume bilden, charakterisiert ist. Vesikel können zum Beispiel aus Lipiden, umfassend die verschiedenen hier beschriebenen Lipide, proteinhaltige Materialien oder polymere Materialien, die natürliche, synthetische und halbsynthetische Polymere umfassen, gebildet werden. Bevorzugte Vesikel sind diejenigen, die aus Lipiden formulierte Wände oder Membranen umfassen. In diesen bevorzugten Vesikeln können die Lipide die Form einer Mono- oder Doppelschicht aufweisen und sie können zur Bildung von einer oder mehreren Mono- oder Doppelschichten verwendet werden. Im Falle von mehr als einer Mono- oder Doppelschicht können die Mono- oder Doppelschichten konzentrisch sein. Lipide können zur Bildung eines unilamellaren Vesikels (das einer Monoschicht oder Doppelschicht umfasst), eines oligolamellaren Vesikels (das ungefähr zwei oder ungefähr drei Monoschichten oder Doppelschichten umfasst) oder eines multilamellaren Vesikels (das mehr als ungefähr drei Monoschichten oder Doppelschichten umfasst) verwendet werden. Entsprechend können Vesikel, die aus Proteinen oder Polymeren hergestellt sind, eine oder mehrere konzentrische Wände oder Membranen umfassen. Die Wände oder Membranen der aus den Proteinen oder Polymeren hergestellten Vesikel können im Wesentlichen fest (einheitlich) sein oder sie können porös oder halbporös sein. Die hier beschriebenen Vesikel umfassen derartige Einheiten, die im Allgemeinen als zum Beispiel Liposomen, Mizellen, Bläschen, Mikrobläschen, Mikrokügelchen, Lipid-, Polymer- und/oder Protein-beschichtete Bläschen, Mikrobläschen und/oder Mikrokügelchen, Mikroballons, Aerogele, Clathratgebunde Vesikel und dergleichen bezeichent werden. Der innere Hohlraum der Vesikel kann mit einer Flüssigkeit (einschließlich zum Beispiel einer wässrigen Flüssigkeit), einem Gas, einem gasförmigen Vorläufer und/oder einem festen oder gelöstem Material, einschließlich zum Beispiel einem Zielliganden und/oder, je nach Wunsch, einem bioaktiven Mittel gefüllt sein.
Der Begriff „Liposom" bezieht sich auf einen allgemeinen kugelförmigen Cluster oder Aggregat amphipatischer Verbindungen, umfassend Lipidverbindungen, typischerweise in Form von einer oder mehreren konzentrischen Schichten, zum Beispiel Doppelschichten. Sie können hier ebenfalls als Lipidvesikel bezeichnet werden. Die Liposomen können zum Beispiel aus ionischen Lipiden und/oder nicht ionischen Li piden formuliert werden. Liposomen, die aus nicht ionischen Lipiden formuliert sind, können ebenfalls aus „Niosome" bezeichnet werden.
Der Begriff „Mizelle" bezieht sich auf kolloidale Einheiten, die aus Lipiden formuliert sind. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Mizellen eine Monoschicht oder eine hexagonale H2-Phasen-Konfiguration. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können die Mizellen eine Doppelschicht-Konfiguration umfassen.
Der Begriff „Aerogel" bezieht sich im Allgemeinen auf kugelförmige Einheiten, die durch eine Vielzahl kleiner inneren Hohlräume gekennzeichnet sind. Die Aerogele können aus synthetischen Materialien (zum Beispiel einen Schaum, der durch Wärmebehandlung von Resorcinol und Formaldehyd hergestellt wird), ebenso wie aus natürlichen Materialien, wie zum Beispiel Polysacchariden oder Proteinen, formuliert werden.
„Clathrat" bezieht sich auf ein festes, halbporöses oder poröses Teilchen, das mit Vesikel assoziiert werden kann. In bevorzugten Formen können die Clathrate eine Käfig-ähnliche Struktur bilden, die Hohlräume enthalten, die Vesikel umfassen. Eines oder mehrere Vesikel können an das Clathrat gebunden sein. Auf Wunsch kann ein stabilisierendes Material an das Clathrat zur Unterstützung der Verbindung des Vesikels mit dem Clathrat gebunden werden. Geeignete Materialien, aus denen Clathrate formuliert werden können umfassen zum Beispiel poröse Apatite, wie zum Beispiel Calciumhydroxyapatit und Niederschläge von Polymeren und Metallionen, wie zum Beispiel mit Calciumsalzen gefällte Alginsäure.
Die Vesikel der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise ein Gas oder einen gasförmigen Vorläufer. Der Begriff „gasgefülltes Vesikel" bezieht sich auf Vesikel, in denen ein Gas eingekapselt ist. Der Begriff „mit gasförmigem Vorläufer gefülltes Vesikel" bezieht sich auf Vesikel, in denen ein gasförmiger Vorläufer eingekapselt ist. Die Vesikel können minimal, teilweise oder im Wesentlichen vollständig mit dem Gas und/oder dem gasförmigen Vorläufer gefüllt sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können die Vesikel im Wesentlichen oder vollständig mit dem Gas und/oder dem gasförmigen Vorläufer gefüllt sein. Der Ausdruck „im Wesentlichen", wie er in Bezugnahme auf die gas- und/oder mit dem gasförmigen Vorläufer gefüllten Vesikel verwendet wird, bedeutet, dass mehr als ungefähr 50% des inneren Hohlraumvolumens des Vesikel aus einem Gas besteht. Vorzugsweise besteht mehr als ungefähr 60% des inneren Hohlraums der im Wesentlichen gefüllten Vesikel aus einem Gas, wobei mehr als ungefähr 70% bevorzugter sind. Besonders bevorzugt besteht mehr als ungefähr 80% des inneren Hohlraums der im Wesentlichen gefüllten Vesikel aus einem Gas, wobei mehr als ungefähr 90% noch bevorzugter sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen besteht mehr als ungefähr 95% des inneren Hohlraums der Vesikel aus einem Gas, wobei ungefähr 100% besonders bevorzugt sind. Obwohl dies nicht als eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung berücksichtigt wird, können die Vesikel ebenfalls auf Wunsch kein oder im Wesentlichen kein Gas oder gasförmigen Vorläufer enthalten.
Der Begriff „Vesikelzusammensetzung" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, typischerweise in einem wässrigen Medium, das Vesikel umfasst.
Der Begriff „Vesikelformulierung" bezieht sich auf eine Vesikelzusammensetzung, die ebenfalls ein bioaktives Mittel umfasst. Zur Verwendung in Vesikelformulierungen geeignete Vesikel oder Vesikelspezies umfassen zum Beispiel gasgefüllte Vesikel und mit gasförmigem Vorläufer gefüllte Vesikel.
Der Begriff „Emulsion" bezieht sich auf eine lipoide Mischung von zwei oder mehreren Flüssigkeiten und weist im Allgemeinen die Form eines Kolloids auf. Die Lipide können überall in der Emulsion heterogen dispergiert sein. Alternativ dazu können die Lipide in Form von zum Beispiel Clustern oder Schichten, einschließlich Mono- oder Doppelschichten aggregiert sein.
Der Begriff „Suspension" bezieht sich auf eine Mischung von fein verteilter Flüssigkeit oder festen Teilchen, die in einer Flüssigkeit schwimmen und die über längere Zeiträume stabil sein können.
Der Begriff „Hexagonal H II-Phasenstruktur" bezieht sich auf eine im Allgemeinen röhrenförmige Aggregation von Lipiden in flüssigen Medium, zum Beispiel wässrigen Medien, in denen das (die) hydrophile(n) Teil(e) der Lipide im Allgemeinen nach in nen in Verbindung mit einer flüssigen Umgebung innerhalb der Röhre schauen. Das (die) hydrophobe(n) Teil(e) der Lipide breitet sich im Allgemeinen nach außen radial aus und der Komplex nimmt die Gestalt einer hexagonalen Röhre an. Eine Vielzahl von Röhren sind im Allgemeinen in der hexagonalen Phasenstruktur zusammengepackt.
Der Begriff „Patient" bezieht sich auf Tiere, umfassend Säuger, vorzugsweise Menschen.
Die Begriffe „innere Region eines Patienten" und „interessierende Region" bezieht sich auf den gesamten Patienten oder auf einen speziellen Bereich oder Teil des Patienten. Innere Region eines Patienten und interessierende Bereiche können zum Beispiel Bereich, die durch die diagnostische Bildgebung abgebildet werden, und/oder Bereiche, die mit einem bioaktiven Mittel behandelt werden, umfassen. Beispielhafte derartige Bereiche umfassen zum Beispiel die Herzregion, einschließlich des Herzmuskelgewebes, sowie andere Körpergewebe, einschließlich dem Gefäßsystem und dem Kreislaufsystem und kanzerogenes Gewebe. Der Begriff „Gefäßsystem", wie er hier verwendet wird, bezeichnet die Blutgefäße im Körper oder in einem Organ oder Teil des Körpers.
Der Begriff „Bioaktives Mittel" bezieht sich auf eine Substanz, die in Verbindung mit einer Anwendung von therapeutischer oder diagnostischer Art, wie zum Beispiel in Verfahren zur Diagnose des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Krankheit in einem Patienten und/oder in Verfahren zur Behandlung einer Krankheit in einem Patienten verwendet werden kann. Der Begriff „Bioaktives Mittel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich ebenfalls auf Substanzen, die in der Lage sind, eine biologische Wirkung in vitro oder in vivo auszuüben. Die bioaktiven Mittel können neutral oder positiv oder negativ geladen sein. Beispiele geeigneter bioaktiver Mittel umfassen diagnostische Mittel, Pharmazeutika, Arzneimittel, synthetische organische Moleküle, Proteine, Peptide, Vitamine, Steroide und genetisches Material, das Nukleoside, Nukleotide und Polynukleotide umfasst.
Der Begriff „Diagnostisches Mittel" bezieht sich auf jedes Mittel, das in Verbindung mit Verfahren zur Abbildung einer inneren Region eines Patienten und/oder zum Di agnostizieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Krankheit in einem Patienten verwendet werden kann. Beispielhafte diagnostische Mittel umfassen zum Beispiel Kontrastmittel zur Verwendung in Verbindung mit Ultraschall, magnetischer Resonanzabbildung oder Computertomographie eines Patienten, umfassend zum Beispiel die hier beschriebenen die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen.
Der Begriff „Polymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die aus der chemischen Vereinigung von zwei oder mehreren Grundeinheiten gebildet sind. Dementsprechend umfasst der Ausdruck „Polymer" zum Beispiel Dimere, Trimere und Oligomere. Das Polymer kann synthetisch, natürlich vorkommend oder halbsynthetisch sein. In einer bevorzugten Form bezieht sich der Begriff „Polymer" auf Moleküle, die 10 oder mehr Grundeinheiten umfassen.
Der Begriff „Verdickungsmittel" bezieht sich auf jedes aus einer Vielzahl von im Allgemeinen hydrophilen Materialien, die, wenn sie in das Lipid und/oder in die hier beschriebenen Vesikelzusammensetzungen eingebaut werden, als Viskositätsmodifizierende Mittel, Emulgatoren und/oder Lösungsvermittler, Suspensionsmittel und Tonizität erhöhende Mittel wirken können. Es wird angenommen, dass die Verdickungsmittel in der Lage sein können, bei der Aufrechterhaltung der Stabilität der Zusammensetzungen aufgrund derartiger Eigenschaften zu helfen.
Der Begriff „Dispergiermittel" bezieht sich auf ein oberflächenaktives Mittel, das bei Zugabe zu einem Suspensionsmedium kolloidaler Teilchen, umfassend zum Beispiel bestimmte hier beschriebene Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen, die einheitliche Trennung der Teilchen unterstützen kann. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann das Dispergiermittel eine polymere Siloxanverbindung umfassen.
Der Begriff „Genetisches Material" bezieht sich im Allgemeinen auf Nukleotide und Polynukleotide, umfassend Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA). Das genetische Material kann durch synthetische chemische Methodologie, die dem Fachmann bekannt ist, oder durch die Verwendung von Rekombinationstechnologie oder durch eine Kombination aus den beiden hergestellt werden. Die DNA und RNA können gegebenenfalls nicht natürliche Nukleotide umfassen und können einzel- oder doppelsträngig sein. Der Begriff „genetisches Material" bezieht sich ebenfalls auf Sense- und Antisense-DNA und RNA, das heißt eine Nukleotidsequenz, die zu einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden in einer DNA und/oder RNA komplementär ist.
Der Begriff „Pharmazeutikum" oder „Arzneimittel" bezieht sich auf jedes therapeutische oder prophylaktische Mittel, das zur Behandlung (einschließlich der Prävention, Diagnose, Linderung oder Heilung) eines Leidens, eines Gebrechens, einer Krankheit oder Verletzung in einem Patienten verwendet werden kann. Therapeutisch verwendbare Peptide, Polypeptide und Polynukleotide können von der Bedeutung des Ausdrucks Pharmazeutikum oder Arzneimittel umfasst werden.
Der Begriff „stabilisierendes Material" bezieht sich auf eine Substanz, die biologisch verträglich ist und die in der Lage ist, die Bildung von Vesikeln in einer Lipidzusammensetzung zu fördern. Der Begriff „Stabilisierendes Material", wie hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Substanz, die biologisch verträglich ist und die in der Lage ist, die Stabilität eines Vesikels zu verbessern. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das stabilisierende Material ein Polymer. Der Begriff „Polymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die aus der chemischen Vereinigung von zwei oder mehreren Grundeinheiten gebildet werden. Demsnetsprechend umfasst der Begriff „Polymer" zum Beispiel Dimere, Trimere und Oligomere. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das stabilisierende Material ein nicht polymeres Material, umfassend zum Beispiel monomere Moleküle. Die Definition für „stabilisierendes Material" umfasst ebenfalls bestimmte der vorliegenden bioaktiven Mittel. Das stabilisierende Material kann neutral oder positiv oder negativ geladen sein. Unter den neutralen stabilisierenden Materialien sind polare Materialien bevorzugt. Im Falle der bevorzugten Ausführungsformen, die Lipide betreffen, können die stabilisierenden Materialien kovalent oder nicht kovalent mit den Lipidverbindungen verbunden sein.
Der Begriff „Vesikelstabilität" bezieht sich auf die Fähigkeit gasgefüllter Vesikel, das darin eingeschlossene Gas zu bewahren, nachdem sie während ungefähr einer Minute einem Druck von ungefähr 300 mm Hg ausgesetzt worden waren. Die Vesikelstabilität wird in Prozent (%) gemessen, wobei dies die Fraktion der Gasmenge ist, die ursprünglich in dem Vesikel eingeschlossen war und die nach Ablassen des Drucks zurückbehalten wird. Der Begriff „Vesikelstabilität" umfasst ebenfalls die Bezugnahme auf „Vesikelelasitzität", die sich auf die Fähigkeit eines Vesikels zum Zurückkehren auf dessen ursprüngliche Größe nach Ablassen des Drucks bezieht.
Der Begriff „Kovalente Assoziation" bezieht sich auf eine intermolekulare Assoziation oder Bindung, die das Teilen von Elektronen in den Bindungsorbitalen der beiden Atome betrifft.
Der Begriff „Nicht kovalente Bindung" bezieht sich auf eine intermolekulare Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren getrennten Molekülen, die mit keiner kovalenten Bindung zu tun hat. Die intermolekulare Wechselwirkung ist von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich zum Beispiel die Polarität der betroffenen Moleküle, die Ladung (positiv oder negativ), falls vorhanden, der betroffenen Moleküle und dergleichen, abhängig. Nicht kovalente Bindungen werden vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus ionischen Wechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und van-der-Waalssche Kräfte und Kombinationen davon ausgewählt.
Der Begriff „Ionische Wechselwirkung" oder „elektrostatische Wechselwirkung" bezieht sich auf eine intermolekulare Wechselwirkung zwischen zwei oder mehreren Molekülen, wobei jedes positiv oder negativ geladen ist. Daher bezieht sich der Begriff „ionische Wechselwirkung" oder „elektrostatische Wechselwirkung" zum Beispiel auf die Anziehung zwischen einem ersten positiv geladenen Molekül und einem zweiten negativ geladenen Molekül. Beispielhafte ionische oder elektrostatische Wechselwirkungen umfassen zum Beispiel die Anziehung zwischen einem negativ geladenen stabilisierenden Material, zum Beispiel einem genetischen Material, und einem positiv geladenen Lipid, zum Beispiel einem kationischen Lipid, wie zum Beispiel Lauryltrimethylammoniumbromid.
Der Begriff „Dipol-Dipol-Wechselwirkung" bezieht sich im Allgemeinen auf die Anziehung, die zwischen zwie oder mehreren polaren Molekülen vorkommen kann. Daher bezieht sich der Begriff „Dipol-Dipol-Wechselwirkung" auf die Anziehung zwischen dem ungeladenen, teilweise positiven Endes eines ersten polaren Moleküls, gewöhnlich mit δ⁺ bezeichnet, und dem ungeladenen teilweise negativen Ende eines zweiten polaren Moleküls, gewöhnlich mit δ– bezeichnet. Beispielhafte Dipol-Dipol-Wechselwirkungen sind zum Beispiel die Anziehung zwischen der elektropositiven Kopfgruppe, zum Beispiel der Cholinkopfgruppe von Phosphatidylcholin und einem elektronegativen Atom, zum Beispiel einem Heteroatom, wie zum Beispiel Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel, das in einem stabilisierenden Material, wie zum Beispiel einem Polysaccharid vorhanden ist. Der Begriff „Dipol-Dipol-Wechselwirkung" bezieht sich ebenfalls auf die intermolekulare Wasserstoffbindung, wobei ein Wasserstoffatom als Brücke zwischen elektronegativen Atomen auf getrennten Molekülen dient und wobei ein Wasserstoffatom durch eine kovalente Bindung an ein erstes Molekül und durch elektrostatische Kräfte an ein zweites Molekül gehalten wird.
Der Begriff „van-der-Waalssche Kräfte" bezieht sich auf die Anziehungskräfte zwischen unpolaren Molekülen, die durch die Quantenmechanik erklärt werden. Vander-Waalssche Kräfte werden im Allgemeinen mit momentanen Dipolmomenten, die durch benachbarte Moleküle induziert werden und die Änderungen in der Elektronenverteilung zur Folge haben, in Zusammenhang gebracht.
Der Begriff „Wasserstoffbindung" bezieht sich auf die Anziehungskraft oder Brücke, die zwischen einem Wasserstoffatom, das an ein elektronegatives Atom kovalent gebunden ist, zum Beispiel Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff und dergleichen, und einem anderen elektronegativen Atom vorkommt. Die Wasserstoffbindung kann zwischen einem Wasserstoffatom ein einem ersten Molekül und einem elektronegativen Atom in einem zweiten Molekül (intermolekulare Wasserstoffbindung) stattfinden. Die Wasserstoffbindung kann ebenfalls zwischen einem Wasserstoffatom und einem elektronegativen Atom, die beide in einem einzigen Molekül enthalten sind (intramolekulare Wasserstoffbindung), stattfinden.
Der Begriff „Hydrophile Wechselwirkung" bezieht sich auf Moleküle oder Teile von Molekülen, die im Wesentlichen mit Wasser binden, Wasser absorbieren und/oder sich in Wasser lösen können. Dies kann zum Anschwellen und/oder der Bildung reversibler Gele führen.
Der Begriff „Hydrophobe Wechselwirkung" bezieht sich auf Moleküle oder Teile von Molekülen, die nicht im Wesentlichen mit Wasser binden, Wasser absorbieren und/oder sich in Wasser lösen können.
Der Begriff „Biologisch verträglich" bezieht sich auf Materialien, die für die biologischen Funktionen im Allgemeinen nicht schädlich sind und die nicht zu irgendeinem Grad an unverträglicher Toxizität, einschließlich allergische Reaktionen und Krankheitszuständen, führen.
Der Begriff „In Kombination mit" bezieht sich auf bestimmte Ausführungsformen bezüglich dem Einbau eines Zielliganden in einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, einschließlich Lipidzusammensetzungen und Vesikelzusammensetzungen. Der Begriff „In Kombination mit" kann sich ebenfalls auf den Einbau eines bioaktiven Mittels in eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, einschließlich Lipidzusammensetzungen und Vesikelzusammensetzungen, beziehen. Das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand können mit den vorliegenden Zusammensetzungen auf jedem aus einer Vielzahl von Wegen kombiniert werden. Im Falle von Lipidzusammensetzungen kann das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand kovalent und/oder nicht kovalent mit den Lipidverbindungen oder gegebenenfalls stabilisierenden Materialien gebunden werden. Im Falle von Vesikelzusammensetzungen kann das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand innerhalb der inneren Hohlräume des Vesikels eingeschlossen sein. Das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand können ebenfalls innerhalb der Schicht(en) oder Wand(Wände) des Vesikels eingebaut sein, zum Beispiel, indem sie mit den Lipiden versetzt werden, die innerhalb der Vesikelschicht(en) oder Wand(Wände) enthalten sind. Weiterhin wird betrachtet, dass sich das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand auf der Oberfläche eines Vesikels befinden. In jedem Fall kann das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand chemisch mit den Wänden der Vesikel, umfassend zum Beispiel die inneren und/oder äußeren Oberflächen der Vesikel, wechselwirken und kann im Wesentlichen daran angehaftet bleiben. Eine derartige Wechselwirkung kann zum Beispiel die Form einer kovalenten Bindung oder nicht kovalenten Bindung annehmen. In bestimmten Ausführungsformen kann die Wechselwirkung zu einer Stabilisierung des Vesikels führen.
Der Begriff „Zielligand" bezieht sich auf jedes Material oder Substanz, die das Richten auf Gewebe und/oder Rezeptoren in vivo mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung fördern kann. Der Zielligand kann synthetisch, halbsynthetisch oder natürlich vorkommend sein. Materialien oder Substanzen, die als Zielliganden dienen können umfassen zum Beispiel, Proteine, einschließlich Antikörper, Glycoproteine und Lektine, Peptide, Polypeptide, Saccharide, einschließlich Mono- und Polysaccharide, Vitamine, Steroide, Steroidanaloga, Hormone, Cofactoren, bioaktive Mittel und genetisches Material, einschießlich Nukleoside, Nukleotide und Polynukleotide.
Der Begriff „Vorläufer" eines Zielliganden bezieht sich auf jedes Material oder Substanz, die zu einem Zielliganden umgewandelt werden kann. Eine derartige Umwandlung kann zum Beispiel mit dem Verankern eines Vorläufers an einen Zielliganden verbunden sein. Beispielhafte Zielvorläufereinheiten umfassen Maleimidgruppen, Disulfidgruppen, wie zum Beispiel ortho-Pyridyldisulfid, Vinylsulfongruppen, Azidgruppen und α-Iodacetylgruppen.
Der Begriff „Peptid" bezieht sich auf eine stickstoffhaltige Verbindung, die von ungefähr 2 bis ungefähr 100 Aminosäurereste enthalten kann.
Der Begriff „Protein" bezieht sich auf eine stickstoffhaltige Verbindung, die mehr als ungefähr 100 Aminosäurereste enthalten kann.
Der Begriff „Schicht" oder „Beschichtung" bezieht sich auf die Wechselwirkung des stabilisierenden Materials mit dem Lipid und/oder den Vesikeln und kann eine kovalente und/oder nicht kovalente Bindung betreffen.
Der Begriff „Gewebe" bezieht sich im Allgemeinen auf spezialisierte Zellen, die eine besondere Funktion ausüben können. Es versteht sich, dass sich der Begriff „Gewebe", wie er hier verwendet wird, sich auf eine individuelle Zelle oder auf eine Vielzahl oder ein Anhäufung von Zellen, zum Beispiel Membranen oder Organe, beziehen kann. Der Begriff „Gewebe" umfasst ebenfalls die Bezugnahmen auf eine abnormale Zelle oder eine Vielzahl von abnormalen Zellen. Beispielhafte Gewebe umfassen zum Beispiel Herzmuskelgewebe (das ebenfalls als Herzgewebe oder Herzmuskula tur bezeichnet wird, einschließlich Herzmuskelzellen und Herzmuskelzellen, Membrangewebe, einschließlich Endothelium und Epithelium, Laminae, Bindegewebe, einschließlich Interstitiumgewebe und Tumore.
Der Begriff „Rezeptor" bezieht sich auf eine molekulare Struktur innerhalb einer Zelle oder auf der Oberfläche der Zelle, der im Allgemeinen durch die selektive Bindung einer spezifischen Substanz gekennzeichnet ist. Beispielhafte Rezeptoren umfassen zum Beispiel Zelloberflächenrezeptoren für Peptidhormone, Neurotransmitter, Antigene, Komplementfragmente und Immunglobuline und zytoplasmatische Rezeptoren für Steroidhormone. Ein beispielhafter Rezeptor innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung ist das Glycoprotein GPIIbIIIa, das ein Plättchenintegrin ist.
Der Begriff „Endotheliale Zellen" oder „Endothelium" bezieht sich auf eine Anhäufung von Zellen und/oder Gewebe, das normale und/oder erkrankt sein kann und dass eine einzelne Schicht von abgeflachten durchsichtigen endothelialen Zellen umfasst, die von Kante zu Kante oder auf überlappende Art unter Bildung einer Membran verknüpft sind. Endotheliale Zellen werden auf den freien Oberflächen der Serummembranen als Teil der das Herz auskleidenden Membran, der Blutgefäße und Lymphgefäße, auf der Oberfläche des Gehirns und des Rückenmarks und in der vorderen Augenhöhle gefunden. Das Endothelium stammt aus den embryonischem blast und umfasst Herzgewebe, einschließlich infarziertes Herzgewebe, das Herzgefäßsystem, das periphere Gefäßsystem, wie zum Beispiel Arterien, Venen, und Kapillaren (deren Ort als zu dem Herzen peripher bezeichnet wird), Blutgerinnsel und die Region, die die atherosklerotische Plaque umgibt.
Der Begriff „Epitheliale Zellen" oder „Epithelium" bezieht sich auf eine Anhäufung von Zellen und/oder Gewebe, das normale und/oder erkrankt sein kann und das eine oder mehrere Schichten von Zellen umfassen kann, die durch eine interstitielle zementartige Substanz, die auf einer Grundmembran geträgert ist, miteinander vereinigt sind. Das Epithelium kann in verschiedene Klassen, einschließlich zum Beispiel eine einzelne Schicht von Zellen (einfaches Epithelium), mehr als eine einzelne Schicht von Zellen (geschichtetes Epithelium); und ungefähr drei oder vier Schichten von Zellen, die im Wesentlichen ohne Auftreten einer Schichtung aneinandergefügt sind. Die verschiedenen Formen des einfachen Epitheliums werden üblicherweise als schuppig, pflasterförmig, säulenförmig, glandulär, kugelförmig und/oder bewimpert bezeichnet. Das Epithelium stammt aus dem embryonischem Epiblast oder Hypoblast. Das Epithelium umfasst Herzgewebe, einschließlich infarktiertes Herzgewebe, Gewebe des Herzgefäßssystems, des peripheren Gefäßssystems, wie zum Beispiel Arterien, Venen und Kapillaren, Blutgerinnsel und die Region, die die atherosklerotische Plaque umgibt.
Der Begriff „myokardial" bezieht sich im Allgemeinen auf Herzgewebe, einschließlich von Herzmuskelzellen, myokardialen, endokardialen und epikardialen Zellen. Der Begriff „myokardial" umfasst die Bezugnahme auf infarktiertes Herzgewebe, auf das Herzgefäßsystem, das periphere Gefäßsystem, wie zum Beispiel Arterien, Venen und Kapillaren (deren Ort als zu dem Herzen peripher bezeichnet wird), Blutgerinnsel, Blutpfropfe und die Region, die die atherosklerotische Plaque umgibt.
Der Begriff „Tumorzellen" oder „Tumor" bezieht sich auf eine Anhäufung abnormaler Zellen und/oder Gewebe, das erkrankten Zuständen zugeordnet werden kann, die durch unkontrollierte Zellwucherung gekennzeichnet sind. Die Krankheitszustände können eine Vielzahl von Zelltypen, umfassend zum Beispiel endotheliale, epitheliale und myokardiale Zellen, betreffen. Unter den Krankheitszuständen sind Neoplasma, Krebs, Leukämie und Restenosis Verletzungen eingeschlossen.
Der Begriff „Alkyl" bezieht sich auf lineare, verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppen. Das Alkyl ist vorzugsweise eine lineare oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe, bevorzugter eine lineare Kohlenwasserstoffgruppe. Beispielhafte lineare und verzweigte Alkylgruppen umfassen zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl-, n-Butyl-, t-Butyl-, n-Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- und Decylgruppen. Beispielhafte cyclische Kohlenwasserstoffgruppen (das heißt, Cycloalkylgruppen) umfassen zum Beispiel Cyclopentyl-, Cyclohexyl- und Cycloheptylgruppen.
Der Begriff „Alkenyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, die mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Beispielhafte Alkenylgruppen umfassen zum Beispiel Vinyl-, Allyl-, Butenyl-, Pentenyl-, Decenyl- und Dodecenylgruppen.
Der Begriff „Alkoxy" bezieht sich auf eine Alkyl-O-Gruppe, wobei das Alkyl wie vorstehend beschrieben ist. Beispielhafte Alkoxygruppen umfassen zum Beispiel Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy und Heptoxy.
Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil Lipidvesikelzusammensetzungen. Es kann vorteilhaft sein, die Lipidzusammensetzungen bei einer Temperatur unterhalb der Phasenübergangstemperatur von Gel zu flüssigkristallin der betroffenen Lipide herzustellen. Diese Phasenübergangstemperatur ist die Temperatur, bei der sich eine Lipiddoppelschicht vom Gelzustand zu einem flüssigkristallinen Zustand umwandelt. Siehe zum Beispiel Chapman et al., J. Biol. Chem. 1974 249, 2512–2521.
Es wird im Allgemeinen angenommen, dass Vesikel, die aus Lipiden hergestellt sind, die höhere Phasenübergangstemperaturen für den Gelzustand zu dem flüssigkristallinen Zustand besitzen, dazu neigen, bei jeder gegebenen Temperatur eine höhere Undurchlässigkeit zu besitzen. Siehe Derek Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers (CRC Press, Boca Raton, FL 1990) Seite 139 für die Hauptkettenschmelzübergänge von gesättigten Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholinen. Die Phasenübergangstemperaturen von Gelzustand zu flüssigkristallinem Zustand für verschiedene Lipide werden dem Fachmann leicht offensichtlich sein und sind zum Beispiel in Gregoriadis, Hrsg., Liposome Technology, Band I, 1–18 (CRC Press, 1984) beschrieben. Die folgende Tabelle listet einige der repräsentativen Lipide und deren Phasenübergangstemperaturen auf.
TABELLE 1 Gesättigte Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine: Hauptketten-Schmelzübergangstemperaturen
Siehe zum Beispiel Derek Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers, S. 139 (CRC Press, Coca Raton, FL 1990).
Es könnte möglich sein, die Stabilität von Vesikeln durch Einbauen von mindestens einer kleineren Menge, zum Beispiel ungefähr 1 bis ungefähr 10 Mol-%, basierend auf der Gesamtmenge an verwendetem Lipid, eines negativ geladenen Lipids in die vorliegenden Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen zu vergrößern. Geeignete negativ geladenen Lipide umfassen zum Beispiel Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Fettsäuren. Ohne zu beabsichtigen, an eine beliebige oder Theorien über die Wirkung gebunden zu sein, wird angenommen, dass derartig negativ geladenen Lipide für eine zusätzliche Stabilität sorgen, indem sie der Tendenz der Vesikel zum Zerreissen durch ein Zusammenschmelzen entgegenwirken. Daher können die negativ geladenen Lipide die Herausbildung einer einheitlich negativ geladenen Schicht auf der äußeren Oberfläche des Vesikels zu bewirken, die durch eine entsprechend geladene äußere Schicht auf den anderen Vesikeln, die in der Nähe davon sind, abgestoßen werden. Auf dieses Art können die Vesikel weniger anfällig werden in Kontakt näher zueinander zu gelangen, was zu einem Zerreissen der Membran oder der Haut der entsprechenden Vesikel und zu einer Festigung der in Kontakt kommenden Vesikel in ein einzelnes größeres Vesikel führen kann. Eine Fortsetzung dieses Festigungsprozesses wird natürlich zu einem signifikanten Abbau der Vesikel führen.
Die verwendeten Lipidmaterialien, insbesondere in Verbindung mit Vesikelzusammensetzungen, sind ebenfalls flexibel. Dies bedeutet, dass im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung die Vesikel ihre Form verändern können, um zum Beispiel durcheine Öffnung mit einem Durchmesser, der kleiner als der Durchmesser des Vesikels ist, hindurchzugelangen.
Von einer breiten Vielfalt an Lipiden wird angenommen, dass sie zum Einbau in Lipidzusammensetzungen geeignet sind. Unter besonderer Bezugnahme auf Vesikelzusammensetzungen können zum Beispiel Mizellen und/oder Liposomen, alle Materialien oder Kombinationen davon, von denen dem Fachmann bekannt ist, dass sie für deren Herstellung geeignet sind, verwendet werden. Die verwendeten Lipide können entweder natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Ursprungs sein. Wie vorstehend angemerkt wurde, umfassen geeignete Lipide um Allgemeinen zum Beispiel Fettsäuren, neutrale Fette, Phosphatide, Glycolipide, aliphatische Alkohole und Wachse, Terpene und Steroide.
Beispielhafte Lipide, die zum Herstellen der vorliegenden Lipidzusammensetzungen verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Fettsäuren, Lysolipide, Phosphocholine, wie zum Beispiel diejenigen, die den Plättchenaktivierungsfaktoren (PAF) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) zugeordent sind, einschließlich 1-Alkyl-2-acetonyl-sn-glycero-3-phosphocholine und 1-Alkyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine, die auf Blutgerinnsel gerichtet sind; Phosphatidylcholin mit sowohl gesättigten als auch ungesättigten Lipiden, einschließlich Dioleoylphosphatidylcholin; Dimyristoylphosphatidylcholin; Dipentadecanoylphosphatidylcholin; Dilauroylphosphatidylcholin; Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC); Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Diarachidonylphosphatidylcholin (DAPC); Phosphatidylethanolamine, wie zum Beispiel Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphsophatidylethanolamin (DPPE) und Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE); Phosphatidylserin; PHosphatidylglycerole, einschließlich Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG); Phosphatidylinositol; Sphingolipide, wie zum Beispiel Sphingomyelin; Glycolipide, wie zum Beispiel Gangliosid GM1 und GM2; Glucolipide; Sulfatide; Glycosphingolipide; Phosphatidsäuren, wie zum Beispiel Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA) und Distearoylphosphatidsäure (DSPA); Palmitinsäure; Stearinsäure; Arachidoninsäure; Oleinsäure; Polymere-tragende Lipide, wie zum Beispiel Chitin, Hyaluronsäure, Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG), die ebenfalls hier als „peglylierte Lipide" bezeichnet werden, wobei bevorzugte Polymer-tragende Lipide DPPE-PEG (DPPE-PEG = umfassen, das das Lipid DPPE mit einem daran gebundenen PEG-Polymer bezeichnet, einschließlich zum Beispiel DPPE-PEG5000, das DPPE mit einem daran gebundenen PEG-Polymer bezeichnet, das ein mittleres Molekulargewicht von ungefähr 5000 aufweist; sulfonierte Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharide tragende Lipide; Cholesterin, Cholesterinsulfat und Cholesterinhalbsuccinat; Tocopherolhalbsuccinat; Lipide mit Ether- und Ester-verknüpften Fettsäuren; polymerisierte Lipide (von denen eine große Vielzahl aus dem Stand der Technik bekannt ist); Diacetylphosphat; Dicetylphosphat; Stearylamin; Cardiolipin; Phospholipide mit kurzekettigen Fettsäuren mit einem Länge von ungefähr 6 bis ungefähr 8 Kohlenstoffatomen; synthetische Phospholipide mit asymmetrischen Acylketten, wie zum Beispiel eine Acylkette mit ungefähr 6 Kohlenstoffatomen und eine andere Acylkette mit ungefähr 12 Kohlenstoffatomen; Ceramide; nicht ionische Liposomen, einschließlich Niosome, wie zum Beispiel Polyoxyethylenfettsäureester, Polyoxyethylenfettalkohole, Polyoxyethylenfettalkoholether, Polyoxyethylensorbitfettsäureester, Glycerolpolyethylenglycoloxystearat, Glycerolpolyethylenglycolricinoleat, ethoxylierte Sojabohnensterole, ethoxyliertes Riziniusöl, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymere und Polyoxyethylenfettsäurestearate; Sterol-aliphatische Säureester, einschließlich Cholesterinsulfat, Cholesterinbutyrat, Cholesterin-iso-butyrat, Cholesterinpalmitat, Cholesterinstearat, Lanosterolacetat, Ergosterolpalmitat und Phytosterol-n-nutyrat; Sterolester von Zuckersäuren, einschließlich Cholesteringlucuronid, Lanosterolglucuronid, 7-Dehydrocholesteringlucuronid, Ergosterolglucuronid, Cholesteringluconat, Lansosterolgluconat und Ergosterolgluconat; Ester der Zuckersäuren und Alkohole, einschließlich Laurylglucuronid, Stearolylglucuronid, Myristoylglucuronid, Laurylgluconat, Myristoylgluconat und Stearoylgluconat; Ester von Zuckern und aliphatischen Säuren, einschließlich Sucroselaurat, Fructoselaurat, Sucrosepalmitat, Sucrosestearat, Sucrosestearat, Glucuronsäure, Gluconsäure und Polyuronsäure; Saponine, einschließlich Sarsaspogenin, Smilagenin, Hederagenin, Oleanolsäure und Digitoxigenin; Glyceroldilaurat, Glyceroltrilaurat, Glceroldipalmitat, Glycerol und Glycerolester, einschließlich Glyceroltripalmitat, Glyceroldistearat, Glyceroltristearat, Glyceroldimyristat, Glyceroltrimyristat; langkettige Alkohole, einschließlich n-Decylalkohol, Alurylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol und n-Octadecylalkohol; 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)-1-thio-β-D-galactopyranosid; Digalactosyldiglycerid; 6-(5-Cholesten-3β-yloxyhexyl-6-amino-6-desoxy-1-thio-β-D-galactopyranosid; 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-deoxyl-1-thio-α-D-mannopyranosid; 12-(((7'-Diethylaminocumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)-octadecansäure; N-[12-(((7'- Diethylaminocumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)octadecanoyl]-2-aminopalmitinsäure; Cholesteryl(4'-trimethylammonium)butanoat; N-Succinyldioleoylphosphatidylethanolamin; 1,2-Dioleoyl-sn-glycerol; 1,2-Dipalmitoyl-sn-3-succinylglycerol; 1,3-Dipalmitoyl-2-succinylglycerol; 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerophosphoethanolamin und Palmitoylhomocystein, und/oder Kombinationen davon.
Auf Wunsch kann ein kationisches Lipid verwendet werden, wie zum Beispiel N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonium)propan (DTAP) und 1,2-Dioleoyl-3-(4'-trimethylammonium)-butanoyl-sn-glycerol (DOTB). Falls ein kationisches Lipid in den Lipidzusammensetzungen verwendet wird, kann das molare Verhältnis von kationischem Lipid zu nicht kationischem Lipid zum Beispiel von ungefähr 1 : 1000 bis ungefähr 1 : 100 betragen. Das molare Verhältnis von kationischem zu nicht kationischem Lipid kann vorzugsweise von ungefähr 1 : 2 bis ungefähr 1 : 10 betragen, wobei ein Verhältnis von ungefähr 1 : 1 bis ungefähr 1 : 2,5 bevorzugt wird. Das molare Verhältnis von kationischem Lipid zu nicht kationischem Lipid kann besonders bevorzugt ungefähr 1 : 1 betragen.
Im Falle von Lipidzusammensetzungen, die sowohl kationische als auch nicht kationische Lipid enthalten, kann eine große Vielzahl an Lipiden als das nicht kationische Lipid verwendet werden. Dieses nicht kationische Lipid umfasst vorzugsweise ein oder mehrere von DPPC, DPPE und Dioleoylphosphatidylethanolamin. Anstelle der vorstehend aufgelisteten kationischen Lipide können Lipide, die kationische Polymere tragen, wie zum Beispiel Polylysin oder Polyarginin, sowie Alkylphosphonate und Alkylphosphite ebenfalls in den Lipidzusammensetzungen verwendet werden.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Lipidzusammensetzungen Phospholipide, insbesondere ein oder mehrere von DPPC, DPPE, DPPA, DSPC, DSPE, DSPG und DAPC (20 Kohlenstoffatome).
Zusätzlich können gesättigte und ungesättigte Fettsäuren in den vorliegenden Lipidzusammensetzungen verwendet werden, sie können Moleküle umfassen, die vorzugsweise von ungefähr 12 Kohlenstoffatome bis ungefähr 22 Kohlenstoffatome in linearer oder verzweigter Form enthalten. Ebenso können Kohlenwasserstoffgruppen, bestehend aus Isopreneinheiten und/oder Pyrenylgruppen verwendet werden. Beispiele für gesättigte Fettsäuren, die geeignet sind, umfassen zum Beispiel Laurin-Myristin-, Palmitin- und Stearinsäuren. Geeignete ungesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Laurolein-, Physeterin-, Myristolein-, Palmitolein-, Petroselinin- und Oleinsäuren. Beispiele für verzweigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Isolaurin-, Isomyristin, Isopalmitin und Isostearinsäuren.
Zusätzlich zu den Lipidvesikelzusammensetzungen, die aus Lipiden formuliert sind, können die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ebenfalls Vesikel betreffen, die aus Proteinen oder deren Derivaten formuliert sind. Vesikel, die aus Proteinen formuliert sind, die zur Herstellung der zielgerichteten Vesikel der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel in Feinstein, U.S. Patent Nr. 4,572,203, 4,718,433 und 4,77,958 und Cerny et al., U.S. Patent Nr. 4,957,656 beschrieben. Andere zusätzlich zu den in den vorstehend erwähnten Patenten beschriebenen auf Proteinen basierende Vesikel würden für den Fachmann offensichtlich sein, sobald er in Besitz der vorstehenden Offenbarung ist.
Zusätzlich zu den aus Lipiden und/oder Proteinen formulierten Vesikelzusammensetzungen können die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ebenfalls Vesikel betreffen, die aus Polymeren formuliert sind, die natürlichen, halbsynthetischen (modifiziert natürlich) oder synthetischen Ursprungs sind. Der Begriff „Polymer", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Verbindung, die zwei oder mehrere monomere Grundeinheiten und vorzugsweise 10 oder mehr monomere Grundeinheiten umfasst. Der Ausdruck halbsynthetisches Polymer (oder modifiziert natürliches Polymer), wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein natürliches Polymer, das auf eine gewisse Art chemisch modifiziert worden ist. Beispielhafte natürliche Polymere, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen natürlich vorkommende Polysaccharide. Derartige Polysaccharide umfassen zum Beispiel Arabinane, Fructane, Fucane, Galactane, Galactouronane, Glucane, Mannane, Xylane (wie zum Beispiel Inulin), Levan, Fucoidan, Carrageenan, Galatocarolose, Pectinsäure, Pectine, einschließlich Amylose, Pullulan, Glycogen, Amylpectin, Cellulose, Dextran, Dextrin, Dextrose, Polydextrose, Pustulan, Chintin, Agarose, Keratan, Chondroitan, Derma tan, Hyluronsäure, Alginsäure, Xanthangummi, Stärke und verschiedene andere natürlichen Homopolymere oder Heteropolymere, wie zum Beispiel diejenigen, die ein oder mehrere der folgenden Verbindungen enthalten: Aldosen, Ketosen, Säuren oder Amine: Erythrose, Threose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose, Talose, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Psicose, Fructose, Sorbose, Tagatose, Amannitol, Sorbitol, Lactose, Sucrose, Trehalose, Maltose, Cellobiose, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin, Glucuronsäure, Gluconsäure, Glucarsäure, Galactouronsäure, Mannuronsäure, Glucosamin, Galactosamin und Neuraminsäure, und natürlich vorkommende Derivate davon. Dementsprechend umfassen geeignete Polymere zum Beispiel Proteine, wie zum Beispiel Albumin. Beispielhafte halbsynthetische Polymere umfassen Carboxymethylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylcellulose und Methoxycellulose. Beispielhafte synthetische Polymere, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind umfassen Polyethylene (wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Polyoxyethylen und Polyethylenterephthalat), Polypropylene (wie zum Beispiel Polypropylenglycol), Polyurethane (wie zum Beispiel Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylchlorid und Polyvinylpyrrolidon), Polyamide, einschließlich Nylon, Polystyrol, Polylactinsäuren, fluorierte Kohlenwasserstoffe, fluorierte Kohlenstoffe (wie zum Beispiel Polytetrafluorethylen), und Polymethylmethacrylat und Derivate davon. Bevorzugt werden biologisch verträgliche synthetische Polymere oder Copolymere, die aus Monomeren, wie zum Beispiel Acrylsäure, Methacrylsäure, Ethylenimin, Crotonsäure, Acrylamid, Ethylacrylat, Methylmethacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), Lactinsäure, Glycolsäure, ε-Caprolacton, Acrolein, Cyanoacrylat, Bisphenol A, Epichlorhydrin, Hydroxyalkylacrylate, Siloxan, Dimethylsiloxan, Ethylenoxid, Ethylenglycol, Hydroxyalkylmethacrylate, N-substituierte Acrylamide, N-substituierte Methacrylamide, N-Vinyl-2-pyrrolidon, 2,4-Pentadien-1-ol, Vinylacetat, Acrylnitril, Styrol, p-Aminosytrol, p-Aminobenzylstyrol, Natriumstyrolsulfonat, Natrium-2-sulfoxyethylmethacrylat, Vinylpyridin, Aminoethylmethacrylate, 2-Methacryloyloxytrimethylammoniumchlorid, und Polyvinyliden, so wie polyfunktionelle vernetzende Monomere, wie zum Beispiel N,N'-Methylenbisacrylamid, Ethylenglycoldimethacrylate, 2,2'-(p-Phenylendioxy)diethyldimethacrylat, Divinylbenzol, Triallylamin und Methylenbis-(4-phenylisocyanat), einschließlich Kombinationen davon, hergestellt werden. Bevorzugte Polymere umfassen Polyacrylsäure, Polyethylenimin, Polymethacrylsäure, Polymethylmethacrylat, Polysiloxan, Polydimethylsiloxan, Polylatinsäure, Poly(ε-caprolacton), Epoxidharz, Poly(ethylenoxid), Poly(ethylenglycol) und Polyamid-(Nylon)Polymere. Bevorzugte Copolymere umfassen die folgenden: Polyvinyliden-Polyacrylnitril, Polyvinyliden-Polyacrylnitril. Polymethylmethacrylat, Polystyrol-Polyacrylnitril und Poly-d-1, Lactid-Coglycolid-Polymere. Ein bevorzugtes Copolymer ist Polyvinyliden-Polyacrylnitril. Andere geeigneten biologisch verträglichen Monomere und Polymere sind für den Fachmann offensichtlich, sobald er mit Besitz der vorliegenden Offenbarung ist.
Wie vorstehend angemerkt wurde, umfassen die vorliegenden Lipidzusammensetzungen ein fluoriertes Gas, das aus der Gruppe, bestehend aus Perfluorkohlenwasserstoffen und SF₆, wie zum Beispiel ein inertes Gas, ausgewählt ist. Es wird angenommen, dass ebenfalls Mischungen aus unterschiedlichen Arten von Gasen, wie zum Beispiel Mischungen aus einem Perfluorkohlenwasserstoffgas und einer anderen Art von Gas, wie zum Beispiel Luft, in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Das Gas sorgt bei den Lipidzusammensetzungen für ein erhöhtes Reflexionsvermögen, insbesondere in Verbindung mit Vesikelzusammensetzungen, in denen das Gas innerhalb der Vesikel eingeschlossen ist. Dies kann deren Wirksamkeit als Kontrastmittel erhöhen.
Beorzugte Gase sind Gase, die inert sind und die biologisch verträglich sind, das heißt, Gase, die für die biologische Funktion nicht schädlich sind. Bevorzugte Gase umfassen diejenigen, die aus der Gruppe, bestehend aus Luft, Edelgasen, wie zum Beispiel Helium, Rubidium, hyperpolarisiertes Xenon, hyperpolarisiertes Argon, hyperpolarisiertes Helium, Neon, Argon und Xenon, Kohlenstoffdioxid, Stickstoff, Fluor, Sauerstoff, auf Schwefel basierende Gase, wie zum Beispiel Schwefelhexafluorid und Schwefeltetrafluorid, fluorierte Gase, einschließlich zum Beispiel teilweise fluorierte Gase oder vollständig fluorierte Gase. Beispielhafte fluorierte Gase umfassen Fluorkohlenstoffgase, wie zum Beispiel Perfluorkohlenwasserstoffgase und Mischungen davon. Paramagnetische Gase, wie zum Beispiel ¹⁷O₂ können ebenfalls in den Lipidzusammensetzungen verwendet werden.
Fluorierte Gase umfassen Materialien, die ein oder mehrere Fluoratome enthalten. Bevorzugt werden Gase, die mehr als ein Fluoratom enthalten, wobei Perfluorkoh lenstoffe (das heißt vollständig fluorierte Fluorkohlenstoffe) bevorzugter sind. Das Perfluorkohlenwasserstoffgas wird vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Perfluomethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorpentan, Perfluorcyclobutan und Mischungen davon, ausgewählt. Das Perfluorkohlenwasserstoffgas ist bevorzugter Perfluorpropan oder Perfluorbutan, wobei Perfluorpropan besonders bevorzugt ist. Ein weiteres bevorzugtes Gas ist Schwefelhexafluorid. Ein anderes bevorzugtes Gas ist Heptafluorpropan, einschließlich 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluorpropan und dessen Isomer, 1,1,2,2,3,3,3-Heptafluorpropan. Weitere Gase, einschließlich den vorstehend beispielhaft erläuterten, sind für den Fachmann, basierend auf der vorliegenden Offenbarung, offensichtlich.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird ein Gas, zum Beispiel Luft oder ein Perfluorkohlenwasserstoffgas, mit einem flüssigen Pefluorkohlenwasserstoff, wie zum Beispiel Perfluorpentan, Perfluorhexan, Perfluorheptan, Perfluoroctylbromid (PFOB), Perfluordecalin, Perfluordodecalin, Perfluoroctyliodid, Perfluortripropylamin und Perfluortributylamin kombiniert.
Es kann ebenfalls erwünscht sein, in die Lipidzusammensetzungen einen Vorläufer für eine gasförmigen Substanz einzubauen. Derartige Vorläufer umfassen Materialien, die in der Lage sind, in vivo in ein Gas umgewandelt zu werden. Der gasförmige Vorläufer ist vorzugsweise biologisch verträglich und das in vivo hergestellte Gas ist ebenfalls biologisch verträglich.
Unter den gasförmigen Vorläufern, die zur Verwendung in den hier beschriebenen Zusammensetzungen geeignet sind, sind Mittel, die pH-Wert-empfindlich sind. Diese Mittel umfassen Materialien, die zur Gasentwicklung in der Lage sind, zum Beispiel nachdem sie einem pH-Wert, der neutral oder sauer ist, ausgesetzt wurden. Beispiele derartiger pH-Wert-empfindlicher Mittel umfassen Salze einer Säure, die aus der Gruppe, bestehend aus anorganischen Säuren, organischen Säuren und Mischungen davon, ausgewählt sind. Kohlensäure (H₂CO₃) ist ein Beispiel einer geeigneten anorganischen Säure, und Aminomalonsäure ist ein Beispiel einer geeigneten organischen Säure. Andere Säuren, umfassend anorganische und organische Säuren, würden für den Fachmann, basierend auf der vorliegenden Offenbarung, offensichtlich sein.
Gasförmige Vorläufer, die von Salzen abgeleitet sind, werden vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallsalzen, Ammoniumsalzen und Mischungen davon, ausgewählt. Bevorzugter wird das Salz aus der Gruppe, bestehend aus Carbonat, Bicarbonat, Sesquicarbonat, Aminomalonat und Mischungen davon, ausgewählt.
Beispiele geeigneter gasförmiger Vorläufermaterialien, die von Salzen abgeleitet sind, umfassen zum Beispiel Lithiumcarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Lithiumbicarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat, Magnesiumcarbonat, Calciumcarbonat, Magnesiumbicarbonat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumsesquicarbonat, Natriumsesquicarbonat, Natriumaminomalonat und Ammoniumaminomalonat. Aminomalonat ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und dessen Herstellung ist zum Beispiel in Thanassi, Biochemistry, Band 9, Nr. 3, Seiten 525–532 (1970); Fitzpatrick et al., Inorganic Chemistry, Band 13, Nr. 3, Seiten 568–574 (1974) und Stelmashok et al., Koordinationnaya Khimiya, Band 3, Nr. 4, Seiten 524–527 (1977) beschrieben.
Zusätzlich oder anstelle der Empfindlichkeit gegen pH-Wertänderungen können die gasförmigen Vorläufermaterialien ebenfalls Verbindungen umfassen, die gegen Temperaturänderungen empfindlich sind. Beispielhafte geeignete gasförmige Vorläufer, die gegen Änderungen in der Temperatur empfindlich sind, sind Perfluorkohlenwasserstoffe. Wie dem Fachmann klar ist, kann ein spezieller Perfluorkohlenwasserstoff im flüssigen Zustand vorkommen, wenn die Lipidzusammensetzungen zuerst hergestellt werden und somit als gasförmiger Vorläufer verwendet werden. Alternativ dazu kann der Perfluorkohlenwasserstoff im gasförmigen Zustand vorkommen, wenn die Lipidzusammensetzungen hergestellt sind, und somit direkt als Gas verwendet werden können. Ob der Perfluorkohlenwasserstoff als Flüssigkeit oder Gas verwendet wird, hängt im Allgemeinen von dessen Phasenübergangstemperatur von Flüssigkeit/Gas oder dessen Siedepunkt ab. Zum Beispiel weist ein bevorzugter Perfluorkohlenwasserstoff, Perfluorpentan, eine Phasenübergangstemperatur von Flüssigkeit/gas (Siedepunkt) von 29°C auf. Dies bedeutet, dass Perfluorpentan im Allgemeinen bei Raumtemperatur (ungefähr 25°C) ein Flüssigkeit ist, jedoch innerhalb des menschlichen Körpers, dessen normale Temperatur ungefähr 37°C beträgt und die über der Übergangstemperatur von Perfluorpentan liegt, zu einem Gas umge wandelt wird. Somit ist Perfluorpentan unter normalen Umständen ein gasförmiger Vorläufer. Als weiteres Beispiel gibt es Homologe von Perfluorpentan, nämlich Perfluorbutan und Perfluorhexan. Der Flüssigkeit/Gas-Übergang von Perfluorbutan liegt bei 4°C und der von Perfluorhexan bei 57°C. Daher kann Perfluorbutan als gasförmiger Vorläufer verwendbar sein, obwohl eher als Gas, wohingegen Perfluorhexan aufgrund seines relativ hohen Siedepunktes als gasförmiger Vorläufer verwendbar sein kann. Wie dem Fachmann bekannt ist, kann der effektive Siedepunkt einer Substanz in Zusammenhang mit dem Druck, dem die Substanz ausgesetzt wird, gebracht werden. Diese Beziehung kann durch das Beispiel des idealen Gasgesetzes erläutert werden: PV = nRT, Wobei P der Druck ist, V das Volumen ist, n die Anzahl Mole einer Substanz ist, R die Gaskonstante ist und T die Temperatur ist. Das ideale Gasgesetz zeigt an, dass mit zunehmendem Druck der effektive Siedepunkt ebenfalls zunimmt. Umgekehrt nimmt der effektive Siedepunkt mit abnehmendem Druck ab.
Eine große Vielzahl von Materialien können als gasförmige Vorläufer in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden. Es ist nur erforderlich, dass das Material in der Lage ist, eine Phaseübergang zur Gasphase zu durchlaufen, nachdem sie die geeignete Temperatur durchschreiten. Geeignete gasförmige Vorläufer umfassen zum Beispiel Hexafluoraceton, Isopropylacetylen, Allen, Tetrafluorallen, Bortrifluorid, 1,2-Butadien, 2,3-Butadien, 1,3-Butadien, 1,2,3-Trichlor-2-fluor-1,3-butadien, 2-Methyl-1,3-butadien, Hexafluor-1,3-butadien, Butadiin, 1-Fluorbutan, 2-Methylbutan, Perfluorbutan, 1-Buten, 2-Buten, 2-Methyl-1-buten, 3-Methyl-1-buten, Perfluor-1-buten, Perfluor-2-buten, 4-Phenyl-3-buten-2-on, 2-Methyl-1-buten-3-in, Butylnitrat, 1-Butin, 2-Butin, 2-Chlor-1,1,1,4,4,4-hexafluorbutin, 3-Methyl-1-butin, Perfluor-2-butin, 2-Brombutyraldehyd, Carbonylsulfid, Crotonnitril, Cyclobutan, Methylcyclobutan, Octafluorcyclobutan, Perfluorcyclobuten, 3-Chlorcyclopenten, Perfluorcyclopentan, Octafluorcyclopenten, Cyclopropan, Perfluorcyclopropan, 1,2-Dimethylcyclopropan, 1,1-Dimethylcyclopropan, 1,2-Dimethylcyclopropan, Ethylcyclopropan, Methylcyclopropan, Diacetylen, 3-Ethyl-3-methyldiaziridin, 1,1,1-Trifluordiazoethan, Dimethylamin, Hexafluordimethylamin, Dimethylethylamin, Bis(dimethylphosphin)amin, Perfluorhexan, Perfluorheptan, Perfluoroctan, 2,3-Dimethyl-2-norbornan, Perfluordimethylamin, Dimethyloxoniumchlorid, 1,3-Dioxolan-2-on, 4-Methyl-1,1,1,2-tetrafluorethan, 1,1,1-Trifluorethan, 1,1,2,2-tetrafluorethan, 1,1,2-Trichlor-1,2,2-trifluorethan, 1,1-Dichlorethan, 1,1-Dichlor-1,2,2,2-tetrafluorethan, 1,2-Difluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2,2-pentafluorethan, 2-Chlor-1,1-difluorethan, 1,1-Dichlor-2-fluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2-tetrafluorethan, 2-Chlor-1,1-difluorethan, Chlorethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortrifluorethan, Fluorethan, Perfluorethan, Nitropentafluorethan, Nitrosopentafluorethan, Perfluorethylamin, Ethylvinylether, 1,1-Dichlorethan, 1,1-Dichlor-1,2-difluorethan, 1,2-Difluorethan, Methan, Trifluormethansulfonylchlorid, Trifluormethansulfonylfluorid, Bromdifluornitrosomethan, Bromfluormethan, Bromchlorfluormethan, Bromtrifluormethan, Chlordifluornitromethan, Chlordinitromethan, Chlorfluormethan, Chlortrifluormethan, Chlordifluormethan, Dibromdifluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlorfluormethan, Difluormethan, Difluoriodmethan, Disilanmethan, Fluormethan, Iodmethan, Iodtrifluormethan, Nitrotrifluormethan, Nitrosotrifluormethan, Tetrafluormethan, Trichlorfluormethan, Trifluormethan, 2-Methylbutan, Methylether, Methylisopropylether, Methyllactat, Methylnitrit, Methylsulfid, Methylvinylether, Neopentan, Distickstoffoxid, 1,2,3-Nonadecantricarbonsäure-2-hydroxytrimethylester, 1-Nonen-3-in, 1,4-Pentadien, n-Pentan, Perfluorpentan, 4-Amino-4-methylpentan-2-on, 1-Penten, 2-Penten (cis und trans), 3-Brompent-1-en, Perfluorpent-1-en, Tetrachlorphthalsäure, 2,3,6-Trimethylpiperidin, Propan, 1,1,1,2,2,3-Hexafluorpropan, 1,2-Epoxypropan, 2,2-Difluorpropan, 2-Aminopropan, 2-Chlorpropan, Heptafluor-1-nitropropan, Heptafluor-1-nitrosopropan, Perfluorpropan, Propen, Hexafluorpropan, 1,1,1,2,3,3-Hexafluor-2,3-dichlorpropan, 1-Chlorpropan, Chlorpropan-(trans), 2-Chlorpropan, 3-Fluorpropan, Propin, 3,3,3-Trifluorpropin, 3-Fluorstyrol, Schwefel-(di)-decafluorid (S₂F₁₀), 2,4-Diaminotoluol, Trifluoracetonitril, Trifluormethylperoxid, Trifluormethylsulfid, Wolframhexafluorid, Vinylacetylen und Vinylether.
Perfluorkohlenwasserstoffe sind sowohl bevorzugte Gase als auch bevorzugte gasförmige Vorläufer zur Verwendung in Verbindung mit den Zusammensetzungen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Von derartigen Perfluorkohlenwasserstoffen werden gesättigte Perfluorkohlenwasserstoffe, ungesättigte Perfluorkohlenwasserstoffe und cyclische Perfluorkohlenwasserstoffe umfasst. Die gesättigten Perfluorkohlenwasserstoffe, die normalerweise bevorzugt werden, weisen die Formel C_nF_2n+2 auf, wobei n von 1 bis ungefähr 12, vorzugsweise ungefähr 2 bis ungefähr 10, bevorzugter ungefähr 3 bis ungefähr 8 und besonders bevorzugt ungefähr 3 bis ungefähr 6 ist. Geeignete Perfluorkohlenwasserstoffe umfassen zum Beispiel Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluorpentan, Perfluorhexan, Perfluorheptan, Perfluoroctan und Perfluornonan. Der Perfluorkohlenwasserstoff wird vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluorpentan, Perfluorhexan und Perfluoroctan, ausgewählt, wobei Perfluorpropan besonders bevorzugt wird. Cyclische Perfluorkohlenwasserstoffe, die die Formel C_nF_2n aufweisen, wobei n von 3 bis 8, vorzugsweise 3 bis 6 ist, können ebenfalls bevorzugt werden und umfassen zum Beispiel Hexafluorcyclopropan, Octafluorcyclobutan und Decafluorcyclopentan.
Zusätzlich zu den Perfluokohlenwasserstoffen kann es erwünscht sein, stabile Fluorkohlenwasserstoffe zu verwenden, die nicht vollständig fluoriert sind. Derartige Fluorkohlenwasserstoffe umfassen Heptafluorpropan, zum Beispiel 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluorpropan und dessen Isomer, 1,1,2,2,3,3,3-Heptafluorpropan.
Die gasförmigen Vorläufermaterialien können ebenfalls photoaktivierte Materialien, wie zum Beispiel Diazoniumion und Aminomalonat sein. Wie nachstehend vollständiger erörtert wird können bestimmte Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen und insbesondere Vesikelzusammensetzungen so formuliert werden, dass am Zielgewebe oder durch die Wirkung von Schall auf die Lipidzusammensetzung Gas gebildet wird. Beispiele für gasförmige Vorläufer sind zum Beispiel in den U.S. Patenten mit den Nummern 5,088,499 und 5,149,319 beschrieben. Zusätzlich zu den vorstehend anhand von Beispielen erörterten gasförmigen Vorläufern werden weitere für den Fachmann, basierend auf der vorliegenden Offenbarung, offensichtlich sein.
Die gasförmigen Substanzen und/oder gasförmigen Vorläufer werden vorzugsweise in die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen ohne Rücksicht auf die physikalische Natur der Zusammensetzung eingebaut. Daher wird angenommen, dass die gasförmigen Substanzen und/oder Vorläufer dazu zum Beispiel in Lipidzusammensetzungen, in denen die Lipide zufällig aggregiert sind, sowie in Vesikelzusammensetzungen, einschließlich von Vesikelzusammensetzungen, die aus Lipiden formuliert sind, wie zum Beispiel Mizellen und Liposomen, eingeschlossen werden können. Das Einschließen der gasförmigen Substanzen und/oder deren Vorläufer in die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen kann durch Verwenden jedes Verfahrens aus einer Reihe von Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel kann im Falle von auf Lipiden basierenden Vesikeln die Bildung gasgefüllter Vesikel durch Schütteln oder ansonsten Rühren einer wässrigen Mischung, die ein Gas oder einen gasförmigen Vorläufer und ein oder mehrere Lipide umfasst, erreicht werden. Dies fördert die Bildung stabilisierter Vesikel in denen Gas oder ein Gas-Vorläufer eingeschlossen ist.
Zusätzlich kann ein Gas direkt in eine wässrige Mischung aus Lipid- und/oder vesikelbildenden Verbindungen eingeblasen werden. Alternativ dazu kann ein Gaseinströmungsverfahren verwendet werden, wie es zum Beispiel in den U.S. Patenten mit den Nummern 5,352, 435 und 5,228,446 offenbart ist. Geeignete Verfahren zum Einblasen des Gases oder des Gasvorläufers in kationischen Lipidzusammensetzungen sind ebenfalls in dem U.S Patent Nr. 4,865,836 offenbart. Weitere Verfahren würden für den Fachmann, basierend auf der vorliegenden Offenbarung, offensichtlich sein. Das Gas kann in die Lipid und/oder Vesikelzusammensetzungen vorzugsweise nach oder während der Zugabe des stabilisierenden Materials und/oder während der Bildung der Vesikel eingeströmt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die gasförmigen Substanzen und/oder gasförmigen Vorläufermaterialien in Vesikelzusammensetzugnen eingeschlossen, wobei Mizellen und Liposomen bevorzugt sind. Wie nachstehend ausführlich erörtert ist, sind Vesikel, in denen ein Gas oder ein gasförmiger Vorläufer oder beide eingekapselt sind, darin vorteilhaft, dass sie für ein verbessertes Reflexionsvermögen in vivo sorgen.
Wie nachstehend vollständiger erörtert wird, wird bevorzugt, dass die Lipidzusammensetzungen und besonders die Vesikelzusammensetzungen, aus Lipiden und gegebenenfalls stabilisierenden Verbindungen zur Förderung der Bildung stabiler Vesikel formuliert werden. Zusätzlich wird ebenfalls bevorzugt, dass die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen ebenfalls ein hochstabiles Gas umfassen. Der Begriff „hochstabiles Gas" bezieht sich auf ein Gas, das in wässrigen Medien eine eingeschränkte Löslichkeit und Diffusionsvermögen aufweist. Beispielhafte hochstabile Gase umfassen Perfluorkohlenwasserstoffe, da sie in wässrigen Medien im Allgemeinen weniger diffusionsfähig und relativ unlöslich sind. Dementsprechend kann ihre Verwendung die Bildung hochstabiler Vesikel fördern.
In bestimmten Ausführungsformen kann es erwünscht sein, eine fluorierte Verbindung, insbesondere eine Perfluorkohlenwasserstoffverbindung, zu verwenden, die bei der Verwendungstemperatur der Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen, einschließlich zum Beispiel der in vivo Temperatur des menschlichen Körpers im flüssigen Zustand vorliegend kann, um die Stabilität der Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen und insbesondere der gasgefüllten Vesikel zu unterstützen oder zu erhöhen. Geeignete fluorierte Verbindungen umfassen zum Beispiel fluorierte grenzflächenaktive Stoffe, wie zum Beispiel grenzflächenaktive Stoffe, die als ZONYL^® grenzflächenaktive Stoffe (die DuPont Company, Wilmington, DE) handelsüblich sind, sowie flüssige Perfluorkohlenwasserstoffe, wie zum Beispiel Perfluoroctylbromid (PFOB), Perfluordecalin, Perfluordodecalin, Perfluoroctyliodid, Perfluortripropylamin und Perfluortributylamin. Im Allgemeinen werden Perfluorkohlenwasserstoffe, die ungefähr sechs oder mehr Kohlenstoffatome umfassen, bei normaler menschlicher Körpertemperatur Flüssigkeiten sein. Unter diesen Perfluorkohlenwasserstoffen werden Perfluoroctylbromid und Perfluorhexan, die bei Raumtemperatur Flüssigkeiten sind, bevorzugt. Das Gas, das vorhanden ist, kann zum Beispiel Stickstoff oder Perfluorpropan sein, oder es kann von einem gasförmigen Vorläufer stammen, der ebenfalls ein Perfluorkohlenwasserstoff, zum Beispiel Perfluorpentan, sein kann. Im letztgenannten Fall können die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen aus einer Mischung von Perfluorkohlenwasserstoffen, die für die angegebenen Beispiel Perfluorpropan (Gas) oder Perfluorpentan(gasförmiger Vorläufer) und Pelfluoroctylbromid (Flüssigkeit) wären, hergestellt werden. Obwohl keine Bindung an jegliche Theorie oder Theorien über die Wirkung beabsichtigt ist, wird angenommen, dass im Falle der Vesikelzusammensetzungen, die flüssige fluorierte Verbindung an der Grenzfläche zwischen Gas und der Membran- oder Wandoberfläche des Vesikel gelegen sein kann. Daher könnte sich eine weitere stabilisierende Schicht der flüssigen fluorierten Verbindung auf der inneren Oberfläche der stabilisierenden Verbindung, zum Beispiel ein zur Bildung der Vesikel verwendetes biologisch verträgliches Lipid, gebildet haben und diese Perfluorkohlenwasserstoffschicht kann ebenfalls verhindern, dass das Gas durch die Vesikelmembran diffundiert. Ein gasförmiger Vorläufer innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung ist bei der Herstellungs- und/oder Lagerungstemperatur eine Flüssigkeit, jedoch wird er mindestens zum Zeitpunkt der Verwendung oder während der Verwendung ein Gas.
Auf diese Weise wurde entdeckt, dass eine flüssige fluorierte Verbindung, wie zum Beispiel ein Perfluorkohlenwasserstoff bei Kombination mit einem Gas oder gasförmigen Vorläufer, die üblicherweise zur Herstellung der hier beschriebenen Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen verwendet werden, einen zusätzliches Grad an Stabilität verleihen kann, der anderweitig nicht mit dem Gas oder dem gasförmigen Vorläufer allein erhalten werden kann. Es liegt daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Gas oder einen gasförmigen Vorläufer, wie zum Beispiel einen gasförmigen Perfluorkohlenwasserstoff-Vorläufer, zum Beispiel Perfluorpentan, zusammen mit einem Perfluorkohlenwasserstoff, der nach Verabreichung an einen Patienten flüssig bleibt, das heißt, dessen Phasenübergangstemperatur von Flüssigkeit zu Gas über der Körpertemperatur des Patienten liegt, zum Beispiel Perfluoroctylbromid, zu verwenden. Perfluorierte grenzflächenaktive Stoffe, wie zum Beispiel ZONYL^® fluorierte grenzflächenaktive Stoffe, können zum Stabilisieren der Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen und zum beispielsweise als eine Beschichtung für Vesikel zu wirken, verwendet werden. Bevorzugte perfluorierte grenzflächenaktive Stoffe sind die teilweise grenzflächenaktiven fluorierten Posphocholinverbindungen. In diesen bevorzugten fluorierten grenzflächenaktiven Stoffen können die zweifachen Alkylverbindungen am Ende der Alkylketten fluoriert sein und die nächstgelegenen Kohlenstoffatome können hydriert sein. Diese fluorierten grenzflächenaktiven Phosphocholinverbindungen können zur Herstellung der zielgerichteten Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In Verbindung mit den die Vesikelzusammensetzungen betreffenden Ausführungsformen kann die Größe der Vesikel für die spezielle beabsichtigte Endverwendung, zum Beispiel für die diagnostische und/oder therapeutische Verwendung, angepasst werden. Die Größe der Vesikel kann vorzugsweise im Bereich von ungefähr 30 Nanometern (nm) bis ungefähr 100 Mikrometern (μm) im Durchmesser liegen und kann innerhalb aller Kombinationen und Subkombinationen der bereiche darin liegen. Bevorzugter weisen die Vesikel Durchmesser von ungefähr 100 nm bis ungefähr 10 μm auf, wobei Durchmesser von ungefähr 200 nm bis ungefähr 7 μm bevorzugter sind. In Zusammenhang mit den speziellen Verwendungen, zum Beispiel der intravaskulären Verwendung, einschließlich der magnetischen Resonanzabbildung des Gefäß systems, kann es bevorzugt sein, dass der Durchmesser der Vesikel nicht größer als ungefähr 30 μm ist, wobei kleinere Vesikel bevorzugt sind, zum Beispiel Vesikel mit einem Durchmesser von nicht mehr als ungefähr 12 μm. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann der Durchmesser der Vesikel ungefähr 7 μm oder weniger betragen, wobei Vesikel mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 5 μm oder weniger bevorzugter sind, und Vesikel mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 3 μm oder weniger sogar besonders bevorzugt sind. Es wird angenommen, dass diese kleineren Vesikel kleinere vaskuläre Kanäle, wie zum Beispiel das Mikrogefäßsystem, durchtränken können, während gleichzeitig genügend Zwischenraum oder Raum innerhalb des vakulären Kanals zur Verfügung gestellt wird, damit rote Blutzellen an den Vesikeln vorbei gleiten können.
Die Größe der gasgefüllten Vesikel kann auf Wunsch durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich zum Beispiel Schütteln, Mikroemulgieren, Verwirbeln, Extrusion, Filtration, Beschallung, Homogenisierung, wiederholte Gefrier- und Tauzyklen, Extrusion unter Druck durch Poren mit definierter Größe und ähnliche Verfahren, angepasst werden.
Wie vorstehend angemerkt wurde, können die hier verwendeten Zusammensetzungen ebenfalls in Bezug auf ihre Herstellung, Bildung und Verwendung, gasförmige Vorläufer umfassen, die aktiviert werden können, um aus einem flüssigen oder festen Zustand in einen gasförmigen Zustand durch Temperatur, pH-Wert, Licht und Energie (wie zum Beispiel Ultraschall) zu wechseln. Die gasförmigen Vorläufer können in ein Gas überführt werden, indem die Vorläufer unter verringertem Druck gelagert werden. Zum Beispiel kann ein unter verringertem Druck gelagertes Glasfläschchen einen Kopfraum mit Perfluorpentan- oder Perfluorhexangas erzeugen, die zur Erzeugen eines vor der Injektion vorgeformten Gases verwendbar sind. Die gasförmigen Vorläufer können vorzugsweise durch Temperatur aktiviert werden. Nachstehend ist eine Tabelle aufgeführt, die eine Reihe von gasförmigen Vorläufern, die bei Temperaturen, die relativ nahe der Körpertemperatur (37°C) oder unterhalb liegen, Phasenübergänge von flüssigen zu gasförmigen Zuständen durchlaufen, und die Größe der emulgierten Tröpfchen, die zur Bildung eines Vesikels mit einer maximalen Größe von 10 μm erforderlich wären, aufgelistet.
TABELLE 2 Physikalische Charakteristiken gasförmiger Vorläufer und Durchmesser der emulgierten Tröpfchen unter Bildung eins Vesikels von 10 μm*
Wie schon angegeben werden die Perfluorkohlenwasserstoffe zur Verwendung als Gas oder gasförmige Vorläufer, so wie als zusätzliche stabilisierende Komponenten bevorzugt.
Wie vorstehend angemerkt, wird bevorzugt, die Verwendbarkeit der Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen, besonders die aus Lipiden formulierten Vesieklzusammensetzungen unter Verwendung von Gasen mit eingeschränkter Löslichkeit zu optimieren. Der Ausdruck „eingeschränkte Löslichkeit bezieht sich auf die Fähigkeit des Gases aufgrund dessen Löslichkeit in dem umgebenden wässrigen Medium aus den Vesikeln zu diffundieren. Eine größere Löslichkeit in dem wässrigen Medium führt zu einem Gradienten für das Gas in dem Vesikel, so dass das Gas eine Tendenz zum Diffundieren aus den Vesikeln aufweisen kann. Andererseits verringert eine geringere Löslichkeit in dem wässrigen Milieu, den Gradienten zwischen dem Vesikel und der Grenzfläche, so dass die Diffusion des Gases aus dem Vesikel erschwert werden kann. Das in dem Vesikel eingeschlossene Gas weist vorzugsweise eine Löslichkeit auf, die geringer als die von Sauerstoff ist, das heißt, ungefähr 1 Teil Gas in ungefähr 32 Teilen Wasser. Siehe Matheson Gas Data Book, 1966, Matheson Company Inc. Bevorzugter besitzt das in dem Vesikel eingeschlossene Gase eine Löslichkeit in Wasser, die geringer als die von Luft ist, und noch bevorzugter besitzt das in dem Vesikel eingeschlossene Gas eine Löslichkeit in Wasser, die geringer als die von Stickstoff ist.
Es kann erwünscht sein, in bestimmten Ausführungsformen Vesikel aus im Wesentlichen undurchlässigem polymeren Material zu formulieren. In diesen Ausführungsformen ist es im Allgemeinen nicht notwendig ein Gas zu verwenden, das auch sehr unlöslich ist. Zum Beispiel können stabile Vesikelzusammensetzungen, die im Wesentlichen undurchlässige polymere Materialien umfassen, mit Gasen formuliert werden, die höhere Löslichkeiten aufweisen, zum Beispiel Luft oder Stickstoff.
Zusätzlich oder anstelle des Lipids, der proteinhaltigen und/oder vorstehend erörterten polymeren Verbindungen können die hier beschriebenen Zusammensetzungen ein oder mehrere stabilisierende Materialien aufweisen. Beispielhafte derartige Materialien können verwendet werden, um die Bildung von Vesikeln wünschenswert zu unterstützen und/oder um sicherzustellen, dass das die Gase oder gasförmigen Vor läufer im Wesentlichen eingeschlossen sind. Sogar für relativ unlösliche nicht diffusionsfähige Gase, wie zum Beispiel Perfluorpropan oder Schwefelhexafluorid, können verbesserte Vesikelzusammensetzungen erhalten werden, wenn ein oder mehrere stabilisierende Materialien bei der Bildung der Gas und mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel verwendet werden. Diese Verbindungen können helfen, die Stabilität und die Unversehrtheit der Vesikel im Hinblick auf ihre Größe, Form und/oder andere Eigenschaften zu verbessern.
Der Begriff „stabil" oder „stabilisiert", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die Vesikel gegen Zersetzung, einschließlich zum Beispiel der Verlust der Vesikelstruktur oder des eingekapselten Gases oder gasförmigen Vorläufers, über eine nützliche Zeitdauer im Wesentlichen beständig sind. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vesikel weisen typischerweise eine wünschenswerte Lagerbeständigkeit auf, wobei häufig mindestens ungefähr 90 Volumen-% ihrer ursprünglichen Struktur über eine Zeitdauer von mindestens ungefähr zwei oder drei Wochen unter normalen Umgebungsbedingungen beibehalten wird. In einer bevorzugten Form sind die Vesikel wünschenswerterweise über eine Zeitdauer von mindestens ungefähr 1 Monat, bevorzugter mindestens ungefähr 2 Monaten, bevorzugter mindestens ungefähr 6 Monaten, noch bevorzugter ungefähr achtzehn Monaten und besonders bevorzugt bis zu ungefähr 3 Jahren stabil. Die hier bechriebenen Vesikel, einschließlich den mit Gas und gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikeln, können ebenfalls sogar unter nachteiligen Bedingungen, wie zum Beispiel Temperaturen und Drucke, die über oder unter denjenigen liegen, die man unter normalen Umgebungsbedinungen erfährt, stabil sein.
Die Stabilität der hier beschriebenen Vesikel kann mindestens zum Teil auf die Materialien, aus denen die Vesikel hergestellt sind, einschließlich zum Beispiel die vorstehend beschriebenen Lipide, Polymere und/oder Proteine, zurückgeführt werden und es ist häufig nicht notwendig zusätzliche stabilisierende Materialien zu verwenden, obwohl dies optional ist und dies bevorzugt werden kann. Derartige zusätzliche stabilisierende Materialien und ihre Charakteristika werden nachstehend vollständiger beschrieben.
Die Materialien, aus denen die Vesikel zusammengesetzt sind, sind vorzugsweise biologisch verträgliche Lipide, Proteine oder Polymermaterialien und von diesen werden biologisch verträgliche Lipide bevorzugt. Zusätzlich, aufgrund der Einfachheit der Formulierung, einschließlich der Fähigkeit zur Herstellung von Vesikel unmittelbar vor der Verabreichung, können diese Vesikel praktischerweise vor Ort hergestellt werden.
Die biologisch verträglichen Polymere, die als stabilisierende Materialien zur Herstellung der mit Gas und gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel verwendbar sind, können natürlichen, halbsynthetischen (modifiziert natürlich) oder synthetischen Ursprungs sein. Der Begriff Polymer, wie er nachstehend verwendet wird, bezeichnet eine Verbindung, die zwei oder mehreren Grundeinheiten und vorzugsweise 10 oder mehr monomere Grundeinheiten umfasst. Der Begriff „halbsynthetisches Polymer" (oder modifiziertes natürliches Polymer), wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein natürliches Polymer, das chemisch auf eine gewisse Art modifiziert worden ist. Beispielhafte natürliche Polymere, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen natürlich vorkommende Polysaccharide. Derartige Polysaccharide umfassen zum Beispiel Arabinane, Fructane, Fucane, Galactane, Galacturonane, Glucane, Mannane, Xylane (wie zum Beispiel Inulin), Levan, Fucoidan, Carrageenan, Galatocarolose, Pectinsäure, Pectine, einschließlich Amylose, Pullulan, Glycogen, Amylopectin, Cellulose, Dextran, Dextrin, Dextrose, Polydextrose, Pustulan, Chitin, Agarose, Keratan, Chondroitan, Dermatan, Hyaluronsäure, Alginsäure, Xanthangummi, Stärke und verschiedene andere natürlichen Homopolymere oder Heteropolymere, wie zum Beispiel diejenigen, die ein oder mehrere der folgenden Verbindungen enthalten: Aldosen, Ketosen, Säuren oder Amine: Erythrose, Threose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose, Talose, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Psicose, Fructose, Sorbose, Tagatose, Mannitol, Sorbitol, Lactose, Sucrose, Trehalose, Maltose, Cellobiose, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin, Glucuronsäure, Gluconsäure, Glucarsäure, Galacturonsäure, Mannuronsäure, Glucosamin, Galactosamin und Neuraminsäure, und natürlich vorkommende Derivate davon. Dementsprechend umfassen geeignete Polymere zum Beispiel Proteine, wie zum Beispiel Albumin. Beispielhafte halbsynthetische Polymere umfassen Carboxymethylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Hydro xypropylmethylcellulose, Methylcellulose und Methoxycellulose. Beispielhafte synthetische Polymere, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Polyethylene (wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Polyoxyethylen und Polyethylenterephthalat), Polypropylene (wie zum Beispiel Polypropylenglycol), Polyurethane (wie zum Beispiel Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylchlorid und Polyvinylpyrrolidon), Polyamide, einschließlich Nylon, Polystyrol, Polylactinsäuren, fluorierte Kohlenwasserstoffe, fluorierte Kohlenstoffe (wie zum Beispiel Polytetrafluorethylen), und Polymethylmethacrylat und Derivate davon. Verfahren zur Herstellung der Vesikel, die Polymere als stabilisierende Verbindungen verwenden, sind für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist, wenn die vorliegenden Offenbarung mit der aus dem Stand der Technik bekannten Information, wie zum Beispiel diejenige, die von Unger, U.S. Patent Nr. 5,205,290 beschrieben ist und auf die Bezug genommen wird, verknüpft wird.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls Vesikel betreffen, die drei Komponenten umfassen: (1) ein neutrales Lipid, zum Beispiel ein nicht ionisches oder zwitterionisches Lipid, (2) ein negativ geladenes Lipid und (3) ein Lipid, das ein stabilisierendes Material, zum Beispiel ein hydrophiles Polymer trägt. Die Menge an negativ geladenem Lipid wird vorzugsweise mehr als 1 Mol-% bezüglich des gesamten vorhandenen Lipids betragen und die Menge an Lipid, das ein hydrophiles Polymer trägt, wird mehr als ungefähr 1 Mol-% bezüglich des gesamten vorhandenen Lipids betragen. Beispielhafte und bevorzugte negativ geladene Lipide umfassen Phosphidsäuren. Das ein hydrophiles Polymer tragende Lipid wird wünschenswerterweise ein Lipid sein, das mit dem Polymer kovalent verknüpft ist, und das Polymer wird vorzugsweise ein massegemitteltes Molekulargewicht von ungefähr 400 bis ungefähr 100000 aufweisen. Geeignete hydrophile Polymere werden vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglycol (PEG), Polypropylenglycol, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon und Copolymeren davon ausgewählt, wobei PEG-Polymere bevorzugt sind. Das PEG-Polymer weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von ungefähr 1000 bis ungefähr 7500 auf, wobei Molekulargewichte von ungefähr 2000 bis ungefähr 5000 bevorzugter sind. Das PEG oder andere Polymer kann an das Lipid, zum Beispiel DPPE, durch eine kovalente Bindung, wie zum Beispiel eine Amid-, Carbamat- oder Aminbindung gebunden sein. Zusätzlich kann das PEG oder andere Polymer an einen Zielliganden oder andere Phospholipide durch eine kovalente Bindung, einschließlich zum Beispiel Amid-, Ester-, Ether-, Thioester, Thioamid- oder Disulfidbindungen, gebunden sein. Ist das hydrophile Polymer PEG, wird ein Lipid, das ein derartiges Polymer trägt als „pegyliert" bezeichnet. In einer bevorzugten Form kann das ein hydrophiles Polymer tragende Lipid DPPE-PEG, einschließlich zum Beispiel DPPE-PEG5000, sein, das sich auf DPPE bezieht, das ein daran gebundenes Polyethylenglycopolymer mit einem mittleren massegemittelten Molekulargewicht von ungefähr 5000 aufweist (DPPE-PEG-5000). Ein weiteres geeignetes pegyliertes Lipid ist Distearoylphosphatidylethanolamin-Polyethylenglycol 5000 (DSPE-PEG5000).
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Lipidzusammensetzungen ungefähr 77,5 Mol-% DPPC, 12,5 Mol-% DPPA und 10 Mol-% DPPE-PEG5000 umfassen. Ebenfalls bevorzugt werden Zusammensetzungen, die ungefähr 80 bis ungefähr 90 Mol-% DPPC, ungefähr 5 bis ungefähr 15 Mol-% DPPA und ungefähr 5 bis ungefähr 15 Mol-% DPPE-PEG5000 umfassen. Besonders bevorzugt werden Zusammensetzungen, die DPPC, DPPA und DPPE-PEG5000 in einem Verhältnis in Mol-% von 82 10 : 8 enthalten. DPPC ist im Wesentlichen neutral, da der Phosphatidylteil negativ geladen ist und der Cholinteil positiv geladen ist. Folglich kann DPPS, das negativ geladen ist, zum Erhöhen der Stabilisierung entsprechend dem vorstehend beschriebenen Mechanismus, zugegeben werden. DPPE-PEG stellt ein pegyliertes Material, das an die Lipidmembran oder Haut des Vesikels durch die DPPE-Einheit gebunden ist zur Verfügung, wobei die PEG-Einheit frei die Vesikelmembran oder Haut umgeben kann und dadurch für verschiedene enzymatische und andere endogene Mittel im Körper, deren Funktion der Abbau derartiger Fremdmaterialien ist, eine physikalische Barriere bildet. Das DPPE-PEG kann mehrere Vesikel mit kleinerer Größe zur Verfügung stellen, die bei Kombination mit anderen Lipiden, wie zum Beispiel DPPC und DPPA in den angegebenen Verhältnissen, sicher gegen Druck stabil sind. Es wird ebenfalls die Thorie vertreten, dass das pegylierte Material aufgrund dessen Ähnlichkeit mit Wasser in der Lage ist, die Wirkung der Makrophagen auf das menschliche Immunsystem zu vereiteln, die andernfalls dazu neigen, das Fremdobjekt zu umgeben und zu entfernen. Dies führt zu einer Zunahme in der Zeitdauer, während der die stabilisierten Vesikel als diagnostische bildgebende Kontrastmittelmedien wirken können.
Die Vesikelzusammensetzungen können zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen aus weiteren Materialien hergestellt werden, vorausgesetzt, dass die so hergestellten Vesikel den Stabilitäts- und anderen hier ausgeführten Kriterien genügen. Diese Materialien können grundlegend und fundamental sein und die Grundlage für das Erzeugen oder Errichten der stabilisierten mit Gas oder gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel sein. Andererseits können sie Hilfsstoffe sein und behilfliche oder ergänzende Mittel wirken, die das Funktionieren des stabilisierenden Grundmaterials oder Materialien erhöhen, oder sie können zu einer gewissen gewünschten Eigenschaft zusätzlich zu derjenigen beitragen, die durch das stabilisierende Grundmaterial gewährt wird.
Es ist jedoch nicht immer möglich zu bestimmen, ob ein gegebenes Material ein grundlegendes oder ein Hilfsmittel ist, da das Funktionieren des fraglichen Materials empirisch bestimmt wird, beispielsweise durch die Ergebnisse, die in Bezug auf die Herstellung von stabilisierten Vesikeln erzeugt wurden. Als Beispiele, wie diese Grund- und Hilfsmaterialien wirken können, wurde beobachtet, dass die einfache Kombination eines biologisch verträglichen Lipids mit Wasser oder Salzlösung nach einer Behandlung im Autoklaven unter Schütteln häufig eine trübe Lösung ergibt. Eine derartige trübe Lösung kann als Kontrastmittel wirken, jedoch ist sie ästhetisch unangenehm und kann eine Instabilität in Form von ungelösten oder nicht dispergierten Lipidteilchen zur Folge haben. Trübe Lösungen können ebenfalls unerwünscht sein, wenn die ungelöste aus Partikeln bestehende Materie einen Durchmesser von mehr als ungefähr 7 μm und insbesondere von mehr als ungefähr 10 μm aufweist. Herstellungsschritte, wie zum Beispiel die sterile Filtration kann mit Lösungen, die ungelöste aus Partikeln bestehende Materie enthalten, ebenfalls problematisch sein. Daher kann Propylenglycol zugegeben werden, um diese Trübung zu entfernen, indem es die Dispersion oder Auflösung der Lipidteilchen erleichtert. Propylenglycol kann ebenfalls als ein Benetzungsmittel wirken, dass die Vesikelbildung und Stabilisierung verbessert, indem es die Oberflächenspannung auf der Vesikelmembran oder Haut erhöht. Es ist möglich, dass Propylenglycol ebenfalls als eine zusätzliche Schicht wirken kann, die die Membran oder Haut des Vesikels bedeckt, wodurch für eine zusätzliche Stabilisierung gesorgt wird. Als Beispiele für derartige weitere Grund- oder Hilfsmaterialien gibt es herkömmliche grenzflächenaktive Stoffe, die verwendet werden können; siehe D'Arrigo U.S. Patent Nr. 4,684,479 und 5,215,680.
Zusätzliche stabilisierende Hilfs- und Grundmaterialien umfassen derartige Mittel, wie Erdnussöl, Canolaöl, Olivenöl, Safloröl, Maiskeimöl oder jedes andere Öl, von dem bekannt ist, dass es im Allgemeinen aufnehmbar ist, was zur Verwendung als eine stabilisierende Verbindung entsprechend der Lehren hierin geeignet ist. Verschiedene stabilisierende Hilfs- und Grundmaterialien sind zum Beispiel in der U.S. Anmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen 08/444,574, angemeldet am 19. Mai 1995, offenbart, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Außerdem können Verbindungen, die zur Herstellung gemischter Mizellensysteme verwendet werden, zur Verwendung als stabilisierende Grund- oder Hilfsmaterialien geeignet sein, und diese umfassen zum Beispiel Lauryltrimethylammoniumbromid (dodecyl-), Cetyltrimethylammoniumbromid (Hexadecyl-), Myristyltrimethylammoniumbromid (Tetradecyl-), Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (wobei Alkyl C₁₂, C₁₄ oder C₁₆ ist), Benzyldimethyldodecylammoniumbromid/chlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumbromid/chlorid, Benzyldimethyltetradecylammoniumbromid/chlorid, Cetyldimethylethylammoniumbromid/chlorid oder Cetylpyridiniumbromid/chlorid.
Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten mit Gas oder einem gasförmigen Vorläufer gefüllten Vesikel entsprechend der Größe, Löslichkeit und Wärmestabilität kontrolliert werden können, indem unter den verschiedenen hier beschriebenen zusätzlichen oder stabilisierenden Hilfsmaterialien ausgewählt wird. Diese Materialien können diese Parameter der Vesikel, insbesondere der aus Lipiden formulierten Vesikel, nicht nur durch ihre physikalische Wechselwirkung mit den Membranen, sondern ebenfalls durch ihre Fähigkeit die Viskosität und Oberflächenspannung der Oberfläche der mit Gas oder gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel beeinflussen. Dementsprechend können die mit Gas und gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorteilhaft modifiziert und weiter stabilisiert werden durch beispielsweise die Zugabe von einem oder mehreren aus einer großen Vielzahl von (a) Viskositätsmodifikatoren, einschließlich zum Beispiel Kohlenhydrate und deren phosphorylierte und sulfonierte Derivate; Polyether, vorzugsweise mit Molekulargewichtsbereichen zwischen 400 und 100000; und Di- und Trihydroxyalkanen und deren Polymere, vorzugsweise mit Molekulargewichtsbereiche zwischen 200 und 50000; (b) Emulgatoren und/oder Lösungsvermittler, einschließlich zum Beispiel Akazie, Cholesterin, Diethanolamin, Glycerylmonostearat, Lanolinalkohole, Lecithin, Mono- und Digylceride, Monoethanolamin, Oleinsäure, Oleylalkohol, Poloxamer, zum Beispiel Poloxamer 188, Poloxamer 184 und Poloxamer 181, Polyoxyethylen 50-Stearat, Polyoxy 35-Rizinusöl, Polyoxy 10-Oleylether, Polyoxyl 29-cetostearylether, Polyoxyl 40-stearat, Polysorbat 20, Polysorbat 40, Polysorbat 60, Polysorbat 80, Propylenglycoldiacetat, Propylenglycolmonostearat, Natriumlaurylsulfat, Natriumstearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonooleat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Stearinsäure, Trolamin und Emulgatorwachs; (c) Suspensionsmittel und/oder Viskosität erhöhende Mittel, einschließlich zum Beispiel Akazie, Agar, Alginsäure, Aluminiummonostearat, Bentonit, Magma, Carbomer 934P, Carboxymethylcellulose, Calcium und Natrium und Natrium 12, Carrageenan, Cellulose, Dextran, Gelatin, Guar Gum, Johannisbrotgum, Veegum, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Magnesiumaluminiumsilicat, Zeolite^®, Methylcellulose, Pectin, Polyethylenoxid, Povidon, Propylenglycolalginat, Siliziumdioxid, Natriumalginat, Tragantgummi, Xanthangummi, α-d-Gluconlacton, Glycerol und Mannitol; (d) synthetische Suspensionsmittel, wie zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA), Polypropylenglycol (PPG) und Polysorbat; Und (e) die Tonizität erhöhende Mittel, die stabilisieren und Tonizität hinzufügen, einschließlich zum Beispiel Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Sucrose, Propylenglycol und Glycerol.
Wie vorstehend angemerkt ist, umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weiterhin einen Zielliganden. Die Zielliganden sind vorzugsweise an die Lipidverbindungen, Proteine, Polymere und/oder Vesikel kovalent oder nicht kovalent gebunden. Daher kann im Falle von Lipidzusammensetzungen der Zielligand zum Beispiel über eine kovalente oder nicht kovalente Bindung an mindestens eines der in die Zusammensetzungen eingebauten Lipide gebunden sein. Im Falle von Vesikeln, die aus Substanzen formuliert sind, die andere als Lipide sind, zum Beispiel Clathrate, Aerogele und Albuminvesikel, kann der Zielligand vorzugsweise kovalent oder nicht kovalent an eines oder mehrere der in die Vesikelwände eingebauten Materialien gebunden sein. Es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass der Zielligand an das Lipid und/oder die Vesikel kovalent gebunden ist. Im Falle von Lipidzusammensetzungen, die Cholesterin umfassen, ist der Zielligand vorzugsweise an das Cholesterin im wesentlichen nur kovalent gebunden, und/oder der Zielligand ist kovalent an eine Komponente der Zusammensetzung, zum Beispiel ein weiteres Lipid, wie zum Beispiel Phospholipid, das ein anderes als Cholesterin ist, kovalent gebunden.
Aug Wunsch kann der Zielligand ebenfalls an andere stabilisierende Materialien, zum Beispiel biologisch verträgliche Polymere, die in den Zusammensetzungen vorhanden sein können, gebunden sein. Die Zielliganden, die in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingebaut sind, sind vorzugsweise Substanzen, die zum Zielen auf Rezeptoren und/oder Geweben in vivo in der Lage sind. In Bezug auf das Zielen auf Gewebe, wie vorstehend angemerkt wurde, sind die Zielliganden wünschenswerterweise in der Lage auf das Herzgewebe, einschließlich von Herzmuskelzellen und Membrangeweben, einschließlich Endothel- und Epithelzellen zu zielen. Im Falle von Rezeptoren sind die Zielliganden wünschenswerterweise in der Lage auf GPIIbIIIa-Rezeptoren zu zielen. Es wird angenommen, dass bevorzugte Zielliganden zur Verwendung in Zielgeweben und/oder Rezeptoren, einschließlich den vorstehend beispielhaft erörterten Geweben und Rezeptoren, aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Peptiden, Sacchariden, Steroiden, Steroidanaloga, bioaktive Mittel und genetisches Material, einschließlich zum Beispiel Antikörper, Glycoproteine und Lectine, ausgewählt, wobei Peptide bevorzugt sind. Ein Beispiel eines Proteins, das zur Verwendung als ein Zielligand bevorzugt ist, ist Protein A, da ein Protein ist, das von den meisten Staphylococcus aureus Stämmen erzeugt wird. Protein A ist zum Beispiel von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) kommerziell erhältlich Protein A kann dann zum Binden einer Vielzahl von IgG-Antikörpern verwendet werden. Allgemein gesagt, umfassen Peptide, die insbesondere als Zielliganden verwendbar sind, natürliche, modifiziert natürliche oder synthetische Peptide, die zusätzliche Wege für die Beständigkeit gegen Abbau durch vaskulär zirkulierende Esterasen, Amidase oder Peptidase einbauen. Ein sehr brauchbares Verfahren zur Stabilisierung von Peptideinheiten umfasst die Verwendung von Ringschlußtechniken. Als Beispiel dafür kann der Ringschluß von Ende zu Ende, wobei das Carboxyende kovalent an das Aminende über eine Amidbindung gebunden wird, für die Hemmung des Peptidabbaus und für eine Zunahme der Kreislaufhalbwertszeit verwendbar sein. Weiterhin ist ein Ringschluss von Seitenkette zu Seitenkette ebenfalls besonders verwendbar, um Stabilität zu induzieren. Zusätzlich kann ein Ringschluß von Ende zu Seitenkette ebenfalls eine brauchbare Modifikation sein. Zusätzlich kann die Substitution einer D-Aminosäure gegen eine L-Aminosäure in einer strategischen Region des Peptid eine Beständigkeit gegen biologischen Abbau bieten. Geeignete Zielliganden und Verfahren zu deren Herstellung werden für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich sein, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist.
In Zusammenhang mit dem Zielen auf endotheliale Zellen umfassen geeignete Zielliganden zum Beispiel einen oder mehrere der folgenden Wachstumsfaktoren, einschließlich zum Beispiel der grundlegende Fibroblast Wachstumsfaktor (bFGF), der saure Fibroblast Wachstumsfaktor (aFGF), der transformierende Wachstumsfaktor-alpha (TGT-α), der transformierende Wachstumsfaktor-beta (TGT-β), der von Plättchen stammende endotheliale Zellwachstumsfaktor (PD-ECGF), der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) und der menschliche Wachstumsfaktor (HGF); Angiogenin; Tumornekrosefaktoren, einschließlich Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und Tumornekrosefaktor-beta (TNF-β); Kupfer-enthaltendes Polyribonukleotidangiotropin mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4500, so wie die nicht-Peptid angiogene Faktoren mit niedrigem Molekulargewicht, wie zum Beispiel 1-Butyrylglycerol; die Prostaglandine, einschließlich zum Beispiel Prostaglandin E₁ (PGE₁) und Prostaglandin E₂ (PGE₂); Nicotinamid; Adenosin; Dipyridamol; Dobutamin; Abbauprodukte der Hyluronsäure, wie zum Beispiel Abbauprodukte die aus der Hydrolyse der β-Bindungen resultieren, einschließlich Hyalobiuronsäure; Angiogenese Inhibitoren, einschließlich zum Beispiel Collagenaseinhibitoren, Minocyclin; Medroxyprogesteron; mit 6-O-Sulfat und 6-O-Carboxymethylgruppen chemisch modifiziertes Chitin; Angiostatinsteroide, wie zum Beispiel Tetrahydrocortisol; und Heparin, einschließlich Heparinfragmente, wie zum Beispiel Fragmente mit einem Molekulargewicht von ungefähr 6000, die Steroiden beigemengt sind, wie zum Beispiel Cortison oder Hydrocortison; Angiogeneseinhibitoren, einschließlich Angioinhibin (AGM-1470 – ein Angiostatinantibiotikum); Plättchenfaktor 4; Protamin; Sulfatpolysaccharidpeptidoglycankomplexe, die aus den bakteriellen Wand einer Arthobacter Spezies stammen; von Pilzen stammende Angiogeneseinhibitoren, wie zum Beispiel das aus Aspergillus fumigatus stammende Fumagillin; D-Penicillamin; Goldthiomalat; Thrombospondin; Vitamin D₃-Analoga, einschließlich zum Beispiel 1-α, 25-Dihydroxyvitamin D₃ und ein synthetisches Analogon 22-Oxa-1-α, 25-dihydroxyvitamin D₃; α-Interferon; Cytokine, wie zum Beispiel Interleukine, einschließlich zum Beispiel Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-8 (IL-8); Granulozytmakrophagankolonie stimulierender Faktor (GMCSF); Heparin, einschließlich Heparinfragmente oder He parinanaloga mit niedrigem Molekulargewicht; einfache sulfatisierte Polysaccharide, wie zum Beispiel Cyclodextrine, einschließlich α-, β- und γ-Cyclodextrin; Tetradecasulfat; Transferrin; Ferritin; Plättchenfaktor 4; Protamin; an Kupfer komplexiertes Gly-His-Lys; Ceruloplasmin; (12R)-Hydroxyeicosatrienosäure; Okadasäure; Lectine; Antikörper; CD11a/CD18; und Very Late Activation Integrin-4 (VLA-4).
Endotheliale Leukozytenadhäsionsmoleküle (ELAMs) sind Antigene, die durch endotheliale Zellen unter Belastungsbedingungen exprimiert werden, die dann die Wanderung der Leukozyten durch das Endothelium, das das Gefäßsystem auskleidet, in die umgebenden Gewebe erleichtert. Die überraschende Entdeckung besteht ebenfalls darin, dass dieselben endothelialen Leukozytenadhäsionsmoleküle vorteilhaft als Rezeptoren zum Zielen der Vesikel genutzt werden können. Diese endothelialen Zelladhäsionsmoleküle gehören zu eine als Selectine bekannten Familie, in der die bekannten Mitglieder, wie zum Beispiel GMP-140, sich alle an der endothelialen Lykozytenadhäsion beteiligen und umfassen ELAM-1, LAM-1 und das Granulum-Membranprotein 140 (GMP-140), das ebenfalls als Plättchenaktivierungs-abhängiges Granulum-externes Membranprotein (PADGEM) bekannt ist, VCAM-1/INCAM-110 (vaskuläres Adhäsionsmolekül/induzierbares Adhäsionsmolekül) und ICAM-1 (intrazelluläres Adhäsionsmolekül). Die Cadherinfamilie der Zelladhäsionsmoleküle kann ebenfalls als Zielliganden verwendet werden, einschließlich zum Beispiel den E-, N- und P-Cadherinen, Cadherin-4, Cadherin-5, Cadherin-6, Cadherin-7, Cadherin-8, Cadherin-9, Cadherin-10 und Cadherin-11, und besodners bevorzugt Cadherin C-5. Weiterhin können auf Cadherine gerichtete Antikörper, wie zum Beispiel der monoklonale Antikörper Ec6C10 zum Erkennen der Cadherine, die durch spezifische endotheliale Zellen lokal exprimiert werden, verwendet werden.
Eine große Vielzahl verschiedener Zielliganden kann zum Binden an die zytoplasmatischen Domainen der ELAM-Moleküle ausgewählt werden. Diesbezügliche Zielliganden können Lectine, eine große Vielzahl von Kohlenhydraten oder Zuckereinhiten, Antikörper, Antikörperfragmente, Fab-Fragmente, wie zum Beispiel Fab'2 und synthetische Peptide, einschließlich zum Beispiel Arginin-Glycin-Asparaginsäure (R-G-D), die auf die Wundheilung gerichtet sind, umfassen. Während viele dieser Materialien aus natürlichen Quellen stammen können, können manche durch molekularbiologische Rekombinationstechniken synthetisiert werden und andere können syn thetischen Ursprungs sein. Peptide können durch eine Vielzahl verschiedener chemischen Kombinationstechniken, wie sie inzwischen aus dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Zielliganden, die von ursprünglich menschlichen Leukozyten stammen oder modifiziert sind, wie zum Beispiel CD11a/CD18; und Leukozytenzelloberflächengylcoprotein (LFA-1), können ebenfalls verwendet werden, da von diesen bekannt ist, dass sie an den endothelialen Zellrezeptor ICAM-1 binden. Das Zytokin induzierbare Mitglied der Immunglobulinüberfamilie, VCAM-1, die mononuklear Leukozyten-selektiv ist, kann ebenfalls als Zielligand verwendet werden. Von menschlichen Monozyten stammendes VLA-4 kann ebenfalls zum zielen auf VCAM-1 verwendet werden. Antikörper und andere Zielliganden können zu Zielen auf Endoglin, das ein endothelialer Zellvermehrungsmarker ist, verwendet werden. Endoglin wird auf endothelialen Zellen in verschiedenartigen festen Tumoren hochreguliert. Ein Zeilligand, der zum Zielen auf Endoglin verwendet werden kann, ist der Antikörper TEC-11. R. E. Thorpe und F. J. Burrows, Breast Cancer Research and Treatment, Band 36, Seiten 237–51 (1995).
Die endotheliale Zellaktivierung in der Atheroskleroseumgebung wird in dieser Erfindung zum Zielen der Zusammensetzungen auf Regionen der Arterienverkalkung, umfassend zum Beispiel atherosklerotische Plaque. Ein derartiges Ziel, das verwendet werden kann, ist das induzierbare mononukleare Leukozyten-endotheliale Adhäsionsmolekül, das von Rb1/9 als ATHERO-ELAM erkannt wird. Die monoklonalen Antikörper, H4/18 und H18/7 können zu Zielen auf endotheliale Zelloberflächenantigene, die durch Zytokinmediatoren induziert werden, verwendet werden. Als eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden gasgefüllte Vesikel auf atherosklerotische Plaque gerichtet, um nicht invasiv erkrankte Blutgefäße nachzuweisen, bevor eine schwerer Schädigung stattfindet, zum Beispiel vor einem Schlag oder einem Herzmuskelinfarkt, so dass ein geeignetes medizinisches oder chirurgisches Eingreifen ausgeführt werden kann. ATHERO-ELAM ist ein bevorzugtes Ziel und Liganden, wie zum Beispiel Antikörper, Peptide oder Lectine oder Kombinationen davon können zum Zielen auf dieses Zelloberflächenepitop, das auf endothelialen Zellen im Zusammenhang mit der Atheroskklerose exprimiert wird, verwendet werden. Alternativ dazu können Lipoproteine oder Lipoproteifragmente, die aus Lipoproteinen mit niedriger oder hoher Dichte stammen, als Zielliganden verwendet werden. Weiterhin kann Cholesterin zum Zielen auf die endothelialen Zellen und zum Lokalisieren der Lipide, Vesikel und dergleichen an Regionen der atherosklerotischen Plaque verwendet werden. In Ausführungsformen, die die Verwendung von Cholesterin als Zielligand betreffen, ist das Cholesterin vorzugsweise nicht mit anderen chemischen Gruppen, Einheiten, Liganden und dergleichen modifiziert (nicht derivatisiert).
Ein auf das thrombotische Material in der Plaque gerichteter Zielligand kann zum unterschieden zwischen aktiven und inaktiven Regionen de atherosklerotischen Plaque verwendet werden. Aktive Plaque in dem Prozess zur Erzeugung von Blutpfropfen sind gefährlicher als diese Plaques und können schließlich zum Verstopfen eines Gefäßes oder zu einer Embolie führen. Diesbezüglich können zusätzlich zu Heparinfragmenten mit niedrigem Molekulargewicht andere Zielliganden, wie zum Beispiel Antifibrinantikörper, Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Anti-Htrombinantikörper und Fibrinantikörper die auf Plättchenaktivierungsgruppen gerichtet sind, zum Zielen auf aktive Plaque mit sich entwickelnden Klümpchen verwendet werden. Besonders bevorzugte Zielliganden sind diejenigen, die auf ein Plasmamembran gebundenes GPIIbIIIa in aktivierten Plättchen zusätzlich zum Zielen auf P-Selectin, zielen, und einen Antikörper oder ein assoziiertes Antikörperfragment, das auf GPIIbIIIa gerichtet ist. Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls zum Nachweis von Regionen eines akuten Herzmuskelinfarkts geeignet.
Praktischerweise kann durch Binden von Anti-Myosin-(insbesondere Cardiomyosin)Antikörper oder Anti-Actinantikörper an die Lipide, Polymere oder stabilisierenden Materialien infarzierte Herzmuskulatur durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Zum Zielen auf Granulierungsgewebe (Wundheilung) können viele der vorstehenden Zielliganden verwendbar sein. Das Wundheilungstripeptid, Arginin, Glycin-Asparaginsäure (RGD) kann ebenfalls diesbezüglich als Zielligand verwendet werden.
Entsprechend den vorstehend erörterten endothelialen Zellen kann eine große Vielzahl von Peptiden, Proteinen und Antikörper als Zielliganden zum Zielen auf epitheliale Zellen verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Peptid, einschließlich synthetische, halbsynthetische oder natürlich vorkommende Peptide mit hoher Affinität für den Zielrezeptor der epithelialen Zelle ausgewählt werden, wobei synthetische Pepti de bevorzugter sind. In Zusammenhang mit diesen bevorzugten Ausführungsformen werden Peptide mit von ungefähr 5 bis ungefähr 15 Aminosäureresten bevorzugt. Antikörper können als ganze Antikörper oder Antikörperfragmente, zum Beispiel Fab oder Fab'2 entweder natürlichen oder rekombinanten Ursprungs verwendet werden. Die Antikörper natürlichen Ursprungs können tierischen oder menschlichen Ursprungs oder chimär (Maus/Mensch) sein. Menschliche rekombinante oder chimäre Antikörper werden bevorzugt und Fragmente werden gegenüber einem ganzen Antikörper bevorzugt.
Beispiele für monoklonale Antikörper, die als Zielliganden in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden können, umfassen CALAM 27, das durch Immunisieren von BALB/c Mäusen mit ganzen menschlichen squamösen Zellkarzinomen der Zunge und durch Bilden von Hybridomen durch Kreuzen von extrahierten Milzzellen mit denjenigen einer NS1 syngenetischen Mylomzellinie, gebildet wird. Gioanni, J. et al., Cancer Research, Band 47, Seiten 4417–4424 (1987). CALAM 27 ist auf die Oberflächenepitope von sowohl normalen als auch bösartigen epithelialen Zellen gerichtet. Normale Lymphknoten enthalten im Allgemeinen keine Zellen, die diese Epitope exprimieren. Siehe Cancer Research, Band 47, Seiten 4417–4424 (1987). Dementsprechend können Lipid und/oder Vesikelzusammensetzungen, die diesen Antikörper umfassen, zum Zielen auf Metastasen in den Lymphknoten verwendet werden. Der monoklonale Antikörper 3C2 kann als Zielligand zum Zielen auf bösartige epitheliale Zellen von schweren Eierstockkarzinomen und endometrioiden Karzinomen verwendet werden. Ein weiterer beispielhafter Zielligand ist Mab 4D7 (siehe Cancer Research, Band 45, 2358–2362, 1985), der zum Zielen auf muzinöse Karzinome, endometrioide Karzinome und mesonephroide Karzinoe verwendet werden kann. Zum Zielen auf squamöse Zellkarzinome bei Kopf- und Halskrebs, kann Mab E48 (Biological Abstract, Band 099 Ausgabe 066 Ref. 082748) als Zielligand verwendet werden. Zum Zielen auf bösartige Melanome, kann der monoklonale Antikörper 225.28s (Pathol. Biol. Band 38 (8), Seiten 866–869, 1990) verwendet werden.
Zielliganden können zum Zielen auf Antigene, einschließlich Antigene, die mit Brustkrebs im Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor, erbB2/HER-2 und die einem Tumor zugeordneten Carbohydratantigene, ausgewählt werden (Cancer, Band 74(3) Seiten 1006–12 (1994)). CTA 16.88, das zu den Cytokeratinen 8, 18 und 19 homolog ist, wird durch die meisten epitheliale abstammenden Tumore exprimiert, einschließlich Karzinome des Kolons, der Bauchspeicheldrüse, der Brust, des Eierstocks und der Lunge. Daher können Antikörper, die auf diese Cytokeratine, wie zum Beispiel 16.88 (IgM) und 88BV59 (IgG3k), gerichtet sind, die verschiedene Epitope auf CTA 16.88 erkennen (Semin. Nucl. Med., Band 23(2), Seiten 165–79 (1993)) als Zielliganden verwendet werden. Zum Zielen auf Kolonkrebs können Anti-CEA IgG Fab'-Fragmente als Zielliganden verwendet werden. Chemisch konjugierte bispezifische Antizellenoberflächenantigen, Anti-Hapten Fab'-Fab-Antikörper können ebenfalls als Zielliganden verwendet werden. Die MG-Reihe monoklonaler Antikörper kann zum Zielen auf zum Beispiel Magenkrebs (Chin. Med. Sci. J., Band 6(1), Seiten 56–59 (1991)) ausgewählt werden.
Es gibt eine Vielzahl von Zelloberflächenepitopen auf epithelialen Zellen, für die Zielliganden ausgewählt werden können. Zum Beispiel wurde der menschliche Proteinpapillomavirus (HPV) mit gutartigen und bösartigen epithelialen Wucherungen in der Haut und Schleimhaut in Verbindung gebracht. Auf zwei HPV-onkogene Proteine, E6 und E7 kann gezielt werden, da diese in bestimmten epithelial abstammenden Krebsen, wie zum Beispiel Gebärmutterhalskarzinome, exprimiert werden, Siehe Curr. Opin. Immunol. Band 6(5), Seiten 746–54 (1994) Membranrezeptoren für Peptidwachstumsfaktoren (PGF-R), die mit der Krebszellenwucherung zu tun haben, können ebenfalls als Tumorantigene ausgewählt werden. Anticancer Drugs, Band 5(4), Seiten 379–93 (1994). Ebenfalls können der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und Interleukin-2 mit geeigneten Zielliganden, einschließlich Peptiden, die an diese Rezeptoren binden, zielgerichtet werden. Auf bestimmte Melanomen zugeordnete Antigene (MAA), wie zum Beispiel der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und Adhäsionsmoleküle (Tumor Biol., Vol. 15(4) Seiten 188–202 (1994)), die durch bösartige Melanomzellen exprimiert werden, kann mit den hier zur Verfügung gestellten Zusammensetzungen gezielt werden. Das mit dem Tumor verbundene Antigen FAB-72 auf der Oberfläche der Karzinomzellen kann ebenfalls als Ziel ausgewählt werden.
Eine große Vielzahl von Zielliganden kann zum Zielen auf Herzmuskelzellen ausgewählt werden. Beispielhafte Zielliganden umfassen zum Beispiel Anticariomyosinantikörper, der polyklonale Antikörper, Fab'2-Fragmente umfassen kann, oder der menschlichen Ursprungs, tierischen Ursprungs, zum Beispiel Mausursprungs oder chimären Ursprungs ist. Zusätzliche Zielliganden umfassen Dipyridamol; Digitalis; Nifedipin; Apolipoprotein; Lipoproteine mit niedriger Dichte (LDL), einschließlich α-LDL, vLDL und Methyl-LDL; Ryanodin; Endothelin; Komplementrezeptortyp 1; IgG-Fc; beta 1 adrenergisch; Dihydropyridin; Adenosin; Mineralcorticoid; Nicotinacetylcholin und Muscarinacetylcholin; Antikörper gegen menschlichen alpha 1 adrenergischen Rezeptor; bioaktive Mittel, wie zum Beispiel Arzneimittel, einschließlich das alpha 1-Antagonistenprazosin; Antikörper gegen den anti-beta-Rezeptor; Arzenimittel, die an den anti-beta-Rezeptor binden; anti-kardiale RyR-Antikörper; Endothelin-1, da ein von endothelialen Zellen stammendes Vasoconstrictorpeptid ist, das eine starke positive inotrope Wirkung auf das Herzgewebe ausübt (Endothelin-1 bindet an kardiale Sarcolemmalvesikel); monoklonale Antikörper, die gegen den T-Zellenrezeptor alpha-beta-Rezeptor erzeugt werden können und dabei zur Erzeugung von Zielliganden verwendet werden können; der Komplementinhibitor sCR1; Arzneimittel, Peptide oder Antikörper, die gegen den Dihydropyridinrezeptor erzeugt werden; gegen den Antiinterleukin 2-Rezeptor gerichtete monoklonale Antikörperkönnen als Zielliganden verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen auf Herzmuskelgewebegebiete zu richten, die diesen Rezeptor exprimieren und die bei einem Entzündungszustand hochreguliert werden können; Cyclosporin, um entsprechend die Zusammensetzungen auf Gebiete entzündeten Herzmuskelgewebes zu richten; Methyisobutylisonitril; Lectine, die an spezifische Zucker auf Membranen der Herzmuskelzellen und kardialen endothelialen Zellen binden; Adrenomedullin (ADM), das ein endogenes hypotensives und vasorelaxierendes Peptid ist; atriales natriuretisches Peptid (ANP); C-Typ natriuretisches Peptid (CNP), das ein Peptid endothelialen Zellursprungs mit 22 Aminosäuren ist und strukturell mit dem atrialen natriuretischen Peptid verwandt ist, jedoch gentisch davon verschieden ist, und vasoaktive und antimitogene Amtivität besitzt; Vasonatrinpeptid (VNP), das ein Chimäres des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) und des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) ist und 27 Aminosäuren umfasst; Thrombin; vom Endothelium stammender Relaxationsfaktor (EDRF); neutrale Endopeptidase 1(NEP-1); Konkurrenzinhibitoren zu EDRF, einschließlich zum Beispiel NG-Monomethyl-L-arginin (L-NMMA); Kaliumkanalantagonisten, wie zum Beispiel Charybdotoxin und Glibenclamid; Antiherzantikörper, die in Patienten mit idiopathischer dilatierter Kardiomyopathie identifiziert werden können, die jedoch vorzugsweise keine Cytolyse in der Herzmuskulatur hervorrufen; gegen den Adeninnukleotidtranslokator gerichtete Antikörper, die verzweigtkettige Ketosäuredehydrogenase oder kardiales Myosin; spezifische Antagonisten für den Endothelin-A-Rezeptor, der als BQ-123 bezeichnet werden kann, und Antikörper gegen den Angiotensin 11-Rezeptor.
Zwei der Hauptantigene des Herzsarkolems sind Calcium-bindende Glycoproteine, die mit dem Dihydropyridinrezeptor zusammen reinigen. Antiseren, einschließlich polyklonaler oder monoklonale Antikörper, können gegen gereinigtes Sarkolemm. hervorgerufen werden. Diese Antikörper können ebenfalls als zielgerichtete Liganden verwendet werden. Gereinigte Fraktionen der Calcium-bindenden Glycoproteine können aus den Plasmamembranen des Sarkolemms isoliert werden und dann zum Erzeugen von Antikörpern verwendet werden. ANP, das, wie vorstehend angemerkt wurde, als Zielligand verwendet werden kann, kann aus Kulturen menschlicher aortaler endothelialer Zellen erhalten werden. ANP ist im Allgemeinen im Endothelium lokalisiert, jedoch kann es ebenfalls an dem endothelialen oder Herzmuskelgewebe lokalisiert sein. ANP kann zum Beispiel unter Verwendung von Rekombinationstechniken, sowei durch Synthese des Peptids unter Verwendung von Peptidsynthesetechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden. Es ist ebenfalls möglich, einen entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörper zu verwenden, der auf ANP gerichtet ist. Ähnlich kann ein auf ANP gerichtetes Peptid verwendet werden, um auf endotheliale und/oder Herzmuskelzellen zu zielen. Sowohl β- als auch α-Formen des atrialen natriuretischen Faktors können als mögliche Zielliganden verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen auf das Herzmuskelgewebe zu richten.
Ein große Vielzahl von Zielliganden kann verwendet werden, um die vorliegenden Lipidzusammensetzungen und insbesondere die Vesikelzusammensetzungen auf den GPIIbIIIa.-Rezeptor zu richten. Zusammensetzungen, die auf den GPIIbIIIa-Rezeptor gerichtet sind, sind zum Zielen auf vaskuläre Thrombosen oder Gerinnsel äußerst brauchbar und sind zum Diagnostizieren sowie zum Behandlen derartiger Gerinnsel brauchbar. Derartige Zielliganden umfassen zum Beispiel Peptide, wie zum Beispiel Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS), Gly-ARg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP) und Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP). Pentapeptide, die die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD) enthalten, sind ebenfalls verwendbar, einschließlich zum Beispiel G4120, das ein cycli sches die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp (RGD) enthaltendes Peptid ist. Ebenfalls verwendbar sind Peptide, die von dem menschlichen Gerinnungsfaktor XIIIA stammen, einschließlich zum Beispiel Fragmente, wie zum Beispiel NKLIVRRGQSFYVQIDFSRPYDPRRDLFRVEYVIGRYPQENKGTYIPVPIVSELQSG KWGAKIVMREDRSVRLSIQSSPKCIVGKFRMYVAVWTPYGVLRTSRNPETDTYIL FNPWCEDDAVYLDNEKEREEYVLNDIGVIFYGEVNDIKTRSWSYGQF-R', wobei R' -CONH₂ oder -NH₂ ist. Weiterhin Peptide, die Fragmente des Faktor XIIIA-Fragments sind, die in ihrer Sequenz die Sequenz NKLIVRRGOSFYVQIDFSRPYDPRRD oder DDAVYLDNEKERREYVLNDIGVIFYGEVNDIKTRSWSYGQF umfassen.
Weitere Peptide, die als Zielliganden zum Zielen auf den GPIIbIIIa-Rezeptor verwendbar sind, umfassen zum Beispiel Peptide, umfassend die Tripeptidsequenz Arginin-Tyrosin-Asparaginsäure (Arg-Tyr-Asp; ebenfalls mit RGD abgekürzt), an von dem Amino- zu Carboxyende gebunden sind und die an die Bindungsregion von GPIIbIIIa auf aktivierten Plättchen binden können. Beispielhafte derartige Peptide umfassen zum Beispiel Peptid mit der Allgemeinen Formel R¹-(X¹)_n-Arg-Tyr-Asp-(Y)_o-(X²)_m-R², wobei jedes von X¹, X² und Y unabhängig voneinander ein oder mehrere Aminosäurereste sein kann, obwohl in bestimmten Fällen bevorzugt wird, dass Y ein anderer als ein Serin- oder Alaninrest ist, und jedes von m, n und o unabhängig voneinander 0 oder 1 sein kann, vorausgesetzt, in bestimmten Fällen, dass wenn m 1 ist, dann o 1 ist, und R¹ eine geschützte oder ungeschützte endständige Carboxygruppe ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X¹ das Peptid Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr und X² ist das Peptid Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr. Verwendbare Peptide umfassen Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr und Ala-Arg-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr.
Peptide, die ebenfalls verwendet werden können, umfassen eine Bibliothek von Hexapeptiden, die von Cysteinresten flankiert werden (in der Lage, cyclische Disulfide zu bilden) und cyclische, Disulfid-gebundene Formen von Peptiden mit der Sequenz Arg-Gyl-Asp oder Lys-Gly-Asp, sowie die Carboxyl-endständigen abgeleiteten Peptide, REYVVMWK. In dieser Hinsicht sind ebenfalls bestimmte Matrixglycoproteine, wie zum Beispiel Thrombospondin verwendbar. Mitglieder der Serpinfamilie der Se rinproteaseinhibitoren, wie zum Beispiel Plasminogenaktivatorinhibitor-Typ 1 (PAI-1) sind weitere verwendbare Liganden.
Allgemein gesagt wird bevorzugt als Zielliganden für den GPIIbIIIa-Rezeptor ein Peptid mit von ungefähr 3 bis ungefähr 20 Aminosäuren zu verwenden, wobei Peptide mit von ungefähr 4 bis ungefähr 15 Aminosäuren bevorzugter sind. Besonders bevorzugt können Zielliganden für den GPIIbIIIa-Rezeptor Peptide umfassen, die von ungefähr 4 bis ungefähr 8 Aminosäuren aufweisen, wobei Peptide mit von ungefähr 4 bis ungefähr 6 Aminosäuren oder ungefähr 5 Aminosäuren besonders bevorzugt sind. Auf Wunsch können die Peptide zum Beispiel durch (1) kovalente Bindungen von Seitenkette zu Seitenkette, einschließlich zum Beispiel durch die Bildung einer Disulfidbindung über die Oxidation von zwei Thiol-enthaltenden Aminosäuren oder Analoga davon, einschließlich zum Beispiel Cystein oder Penicillamin; (2) kovalente Bindungen von Ende zu Seitenkette, einschließlich zum Beispiel durch die Verwendung des Aminoendes der Aminosäuresequenz und einer Seitenketten-Carboxylatgruppe, wie zum Beispiel eine nicht kritische Glutaminsäure oder Asparaginsäuregruppe, zyklisiert werden. Alternativ dazu kann die kovalente Bindung von Ende zu Seitenkette das Carboxylatende der Aminosäuresequenz und eine Seitenketten-Amino-, Amidin-, Guanidin- oder andere Gruppe in der Seitenkette, die ein nukleophiles Stickstoffatom enthält betreffen, wobei derartige Seitenketten zum Beispiel Lysin, Arginin, Homoarginin, Homolysin oder dergleichen umfassen; (3) kovalente Bindungen von Ende zu Ende, die kovalente Amidbindungen oder dergleichen sind. Derartige Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Zusätzlich kann ein „Pseudoringschluß" verwendet werden, wobei der Ringschluß über nicht kovalente Wechselwirkungen, wie zum Beispiel elektrostatische Wechselwirkungen, die eine Faltung der Sekundärstruktur unter Bildung einer Art einer cyclischen Einheit, stattfindet. Es wird angenommen, dass Metallionen bei dem Herbeiführen der Bildung eines „Pseudoringschlusses" helfen. Diese Art der Pseudoringschlussbildung könnte zu den „Zink-Fingern" analog sein. Wie dem Fachmann bekannt ist, betreffen Zink-Finger die Bildung einer Region in Form einer Schleife (die Finger) zwischen einem Zinkion (Zn₂₊) und Cystein, Penicillamin und/oder Homocystein, aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen. Im Falle von Homocystein würde die RGD-Sequenz an der Spitze des Finger liegen. Natürlich ist erkannt worden, dass im Zusammenhang der vorligenden Erfindung jede Art eines stabilisierenden Ringschlusses geeignet ist, solange der erkennende und bindende Peptidligand, wie zum Beispiel RGD, die richtige Konformation und/oder Topographie beibehalten, um an den passenden Rezeptor in Gerinnseln mit einer vernünftigen Michaelis-Menten-Konstante (km) oder Bindungskonstante zu binden. Der Begriff „Konformation", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf den dreidimensionalen Aufbau des Grundgerüsts des Peptids, Peptoids oder Pseudopeptids, und der Begriff „Topographie", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf den dreidimensionalen Aufbau der Seitenkette des Peptids, Peptoids oder Pseudopeptids.
Weitere geeignete Zielliganden umfassen die folgenden Verbindungen: Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Phe-Gly-Cys-CoNH₂; Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-CONH₂; Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-Asn-Cys-CONH₂; Ac-Cys-Asn-Thr-Leu-Lys-Gly-Asp-Cys-CONH₂; Ac-Cys-Asn-Trp-Lys-Arg-Gly-Asp-Cys-CONH₂ und Ac-Cys-N-Methyl-Arg-Gly-Asp-Pen-CON₂, wobei „Pen" sich auf Penicillamin (β,β-Dimethylcystein) bezieht.
Weitere Verbindungen, die als Zielliganden verwendet werden können, umfassen Peptide oder deren Derivate, die durch die Formel A-B-Arg-Gly-Asp-C-D dargestellt sind, wobei:
A Prolin, Thioprolin, Hydroxyprolin, Dehydroprolin, 2-Oxo-4-thiazolidincarbonsäure, N-Alkylglycin oder ein Aminsäurederivat mit der Formel
Tryptophan oder ein Tryptophanderivat mit der Formel
Pyroglutaminsäure oder 2-Azetidinon-4-carbonsäure ist
B Serin, Glycin, Valin, Alanin, Threonin oder β-Alanin ist;
C eine Aminosäuregruppe mit einer hydrophoben funktionellen Gruppe ist; und
D Hydroxy oder Amino ist;
wobei:
R₁ Wasserstoff, -(CH₂)-CH₃ oder -CO-(CH₂)_pCH₃ ist,
R₂ Wasserstoff oder Alkyl ist,
R₃ Wasserstoff oder Alkoxy ist,
R₄ Wasserstoff oder Alkyl ist,
R₅ Wasserstoff, Amino oder Acylamino ist,
m eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist,
p eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, und
q eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist.
Ein weiterer Zielligand, der zur Verwendung in Verbindung mit den vorliegenden Zusammensetzungen geeignet sein kann, ist ein Peptid, ein Peptidderivat oder ein Salz davon mit der Formel A-B-Arg-Gly-Asp-C-D wobei:
A Arotsäure oder Hydroorotäure ist,
B eine Aminosäure ist,
C eine Aminosäure mit einer hydrophoben funktionellen Gruppe ist, und
D Hydroxy oder Amino ist.
Bei den vorstehenden Verbindungen sind Beispiele für Aminosäuren mit hydrophoben funktionellen Gruppen in der Definition con „c" Tryptophan und Phenylalanin.
Verschiedene Peptide, die zur Verwendung als Zielliganden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, insbesondere zum Zielen auf GPIIbIIIa, geeignet sein könnten, sind zum Beispiel von Sato et al., in dem U.S. Patent Nr. 5,498,601 und in den folgenden veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen: 0 368 486 A2, 0 382 451 A2 und 0 422 938 B offenbart. Zusätzlich zu den vorstehenden, beispielhaft erörterten Zielliganden, würden weitere Zielliganden, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, für den Fachmann offensichtlich sein, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist. Weitere geeignete Zielliganden umfassen zum Beispiel konjugierte Peptide, wie zum Beispiel Glycokonjugate und Lectine, die an Zuckereinheiten gebundene Peptide sind. Die Zusammensetzungen können einen einzelnen Zielliganden, sowie zwei oder mehrere verschiedene Zielliganden umfassen.
Die vorstehenden bevorzugten Ausführungsformen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden aus verschiedenen Gründen, einschließlich der Einfachheit der Synthese, der diagnostischen Wirksamkeit, der erhöhten biologischen Verträglichkeit und/oder der verbesserten Wirksamkeit für das gerichtete Zielen.
Der Zielligand kann in die vorliegenden Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Wegen eingebaut werden. Allgemein gesagt, kann der Zielligand in die vorliegenden Zusammensetzungen eingebaut werden, indem oder kovalent oder nicht kovalent an eines oder mehrere Materialien, die in den Zusammensetzungen enthalten sind, einschließlich zum Beispiel die Lipide, Proteine, Polymere und/oder stabilisierende Hilfsmaterialien, gebunden wird. In einer bevorzugten Form ist der Zielligand an eines oder mehrere der vorstehend erwähnten Materialien, die in den vorliegenden Zusammensetzungen enthalten sind, kovalent gebunden. Wie vorstehend angemerkt wurde, umfassen die bevorzugten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Lipid, Protein oder Polymerverbindungen. In diesen Zusammensetzungen sind die Zielliganden vorzugsweise kovalent an die Lipid, Protein oder Polymerverbindungen gebunden.
Beispielhafte kovalente Bindungen, durch die die Zielliganden an die Vesikel gebunden sind, umfassen zum Beispiel Amid (-CONH-); Thioamid (-CSNH-); Ether (ROR', wobei R und R' gleich oder verschiedenen sein können und anders als Wasserstoff sind); Ester (-COO-); Thioester (-COS-); -O-; -S-; -S_n-, wobei n größer als 1, vorzugsweise ungefähr 2 bis ungefähr 8 und bevorzugter ungefähr 2 ist; Carbamate; -NH-; -NR-, wobei R Alkyl, zum Beispiel Alkyl mit von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist; Urethan; und substituiertes Imidat; und Kombinationen von zwei oder mehreren davon. Kovalente Bindungen zwischen Zielliganden und zum Beispiel Lipiden können durch die Verwendung von Molekülen erreicht werden, die als Spacer zur Erhöhung der Konformations- und topographischen Flexibilität des Liganden wirken können. Beispiele für derartige Spacer umfassen zum Beispiel Succinsäure, 1,6-Hexandisäure, 1,8-Octandisäure und dergleichen, sowie modifizierte Aminosäure, wie zum Beispiel 6-Aminohexandisäure, 4-Aminobutansäure und dergleichen. Zusätzlich kann in Falle von Zielliganden, die Peptideinheiten umfassen, die Vernetzung von Seitenkette zu Seitenkette mit einer Vernetzung von Seitenkette zu Ende und/oder Ende zu Ende ergänzt werden. Ebenfalls können kleine Spacermoleküle, wie zum Beispiel Dimethylsuberimidat zum erreichen der entsprechenden Ziele verwendet werden. Die Verwendung von Mitteln, einschließlich denjenigen, die in Reaktionen vom Schiffsche Basetyp verwendet werden, wie zum Beispiel Glutaraldehyd kann ebenfalls verwendet werden. Die Schiffsche Base-Bindungen, die reversible Bindungen sein können, können durch die Verwendung reduktiver Aminierungsverfahren zu dauerhafteren kovalenten Bindungen gemacht werden. Dies kann zum Beispiel chemische Reduktionsmittel, wie zum Beispiel Lithiumaluminiumhydrid-Reduktionsmittel oder deren mildere Analoga, einschließlich Lithiumaluminiumdiisobutylhydrid (DIBAL), Natriumborhydrid (NaBH₄) oder Natriumcyanoborhydrid (NaBH₃CN) erfordern.
Die kovalente Bindung der Zielliganden an die Materialien in den vorliegenden Zusammensetzungen, einschließlich den Lipiden, Proteinen und/oder Polymeren, kann unter Verwendung organischer Synthesetechniken erreicht werden, die basierend auf der vorliegenden Offenbarung für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich wären. Zum Beispiel können die Zielliganden an die Materialien, einschließlich den Lipiden, durch die Verwendung gut bekannter Kopplungs- oder Aktivierungsmittel gebunden werden. Wie dem Fachmann bekannt ist, sind Aktivierungsmittel im Allgemeinen elektrophil. Diese Elektrophilie kann zum Erzeugen der Bildung einer kovalenten Bindung verwendet werden. Beispielhafte Aktivierungsmittel, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Carbonyldiimidazol (CDI), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), Methylsulfonylchlorid, Castros Reagenz und Diphenylphosphorylchlorid.
Die kovalenten Bindungen können mit einer Vernetzung und/oder Polymerisation verbunden sein. Eine Vernetzung bezieht sich vorzugsweise auf die Bindung von zwei Ketten von Polymermolekülen durch Brücken, die entweder aus einem Element, einer Gruppe, oder einer Verbindung, die bestimmte Kohlenstoffatome der Kette durch kovalente chemische Bindungen verknüpft, zusammengesetzt sind. Zum Beispiel kann die Vernetzung in Polypeptiden auftreten, die durch die Disulfidbindungen des Cysteinrests verknüpft sind. Vernetzung kann zum Beispiel durch (1) Zugeben einer chemischen Substanz (Vernetzungsmittel) und Aussetzen der Mischung gegenüber Wärme oder (2) Aussetzen eines Polymers einer Hochenergiestrahlung, erreicht werden. Eine Vielzahl von Vernetzungsmitteln oder „Halteseilen" mit unterschiedlichen Längen und/oder Funktionalitäten wird zum Beispiel in R. L. Lunbland, Techniques in Protein Modification, CRC Press, Inc., Ann Arbor, MI, Seiten 249–68 (1995) beschrieben. Beispielhafte Vernetzungsmittel umfassen zum Beispiel 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), Dimethylsuberimidat und davon deren Variationen, basierend auf der Kohlenwasserstofflänge, und Bis-N-maleimido-1,8-octan.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen können die Zielliganden an die Lipide, Proteine oder Polymere oder andere stabilisierende Materialien über eine Kopplungsgruppe gebunden oder mit diesen verknüpft sein. Eine Vielzahl von Kopplungsgruppen sind verfügbar und wären für den Fachmann offensichtlich, sobald er in Besitz der vorliegenden Offenbarung ist. Die Kopplungsgruppe umfasst vorzugsweise ein hydrophiles Polymer. Geeignete hydrophile Kopplungspolymere umfassen zum Beispiel Polyalkylenoxide, wie zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG) und Polypropylenglycol (PPG), Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylmethylether, Polyacrylamide, wie zum Beispiel Polymethacrylamide, Polydimethylacrylamide und Polyhydroxypropylmethacrylamide, Polyhydroxyethylacrylate, Polyhydroxypropylmethacrylate, Polymethyloxazoline, Polyethyloxazoline, Polyhydroxyethyloxazoline, Polyhydroxypropyloxazoline, Polyvinylalkohole, Polyphosphazene, Poly(hydroxyalkylcarbonsäuren), Polyoxazolidine und Polyaspartamid. Die hydrophilen Polymere sind vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus PEG, PPG, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon und Copolymeren davon, ausgewählt, wobei PEG- und PPG-Polymere bevorzugter sind und PEG-Polymere besonders bevorzugt sind. Daher kann in Ausführungsformen, die Lipidzusammensetzungen betreffen, die Polymere-tragende Lipide umfassen, einschließlich zum Beispiel DPPE-PEG, der Zielligand direkt mit dem Polymer ver knüpft sein, das an das Lipid gebunden ist, um zum Beispiel ein Konjugat aus DPPE-PEG-TI zur Verfügung zu stellen, wobei TL- der Zielligand ist. Daher kann unter Verwendung des Beispiels DPPE-PEG, wie zum Beispiel DPPE-PEG5000, das vorstehend erwähnte Konjugat als DPPE-PEG5000-TL dargestellt werden. Das als Kopplungsgruppe verwendete hydrophile Polymer ist vorzugsweise ein bifunktionelles Polymer, zum Beispiel bifunktionelles PEG, wie zum Beispiel Diamino-PEG. In diesem Fall ist ein Ende der PEG-Gruppe zum Beispiel an die Lipidverbindung gebunden und ist mit dem freien Ende an den Zielliganden über eine Amidbindung gebunden. Ein hydrophiles Polymer, zum Beispiel PEG, das an einem Ende durch eine enständige Carboxylatgruppe und am anderen Ende durch eine endständige Aminogruppe substituiert ist, kann ebenfalls verwendet werden. Diese letztgenannten bifunktionelle hydrophilen Polymere können bevorzugt werden, da sie verschiedene Ahnlichkeiten mit den Aminosäuren besitzen.
Zum Verknüpfen des Zielliganden mit dem Lipid unter Verwendung von Kopplungsgruppen mit zwei einmalig vorhandenen endständigen funktionellen Gruppen kann eine Standardpeptidmethodologie verwendet werden. Bifunktionelle hydrophile Polymere und besonders bifunktionelle PEGs können unter Verwendung von organischen Standardsynthesemethodologien synthetisiert werden. Zusätzlich sind viele dieser Materialien handelsüblich. Zum Beispiel ist α-Amino,ω-Carboxy-PEG kommerziell von Shearwater Polymers (Huntville, AL) erhältlich. Ein Vorteil in der Verwendung eines PEG-Materials als die Kopplungsgruppe besteht darin, dass die Größe des PEGs so variiert werden kann, dass die Anzahl monomerer Untereinheiten von Ethylenglycol nur so wenig wie zum Beispiel ungefähr 5 oder so viel wie zum Beispiel ungefähr 500 oder sogar mehr sein kann. Dementsprechend kann auf Wunsch die „Seillänge" oder Länge der Verknüpfung variiert werden. Dies kann abhängig von zum Beispiel dem speziell verwendeten Zielliganden von Bedeutung sein. Zum Beispiel kann ein Zielligand, der ein großes Proteinmolekül umfasst, eine kürzere Seillänge erfordern, so dass er ein Membran-gebundenes Protein simuliert. Eine kurze Seillänge würde ebenfalls einem Vesikel gestatten, in nächster Nähe zu der Zelle zu bleiben. Dies kann vorteilhaft in Verbindung mit Vesikeln verwendet werden, die ebenfalls ein bioaktives Mittel umfassen, indem die Konzentration des bioaktiven Mittels, das an die Zelle abgegeben wird, vorteilhaft erhöht werden kann.
Eine weitere Kopplungsgruppe, die eine kurze Kettenlänge zur Verfügung stellt ist Glyceraldehyd. Glyceraldehyd kann zum Beispiel an DPPE über eine Schiffsche Base Reaktion gebunden werden. Anschließend kann eine Umlagerung eine im Wesentlichen kurze Kopplungsgruppe zur Verfügung stellen. Das β-Carbonyl der Schiffschen Base kann dann mit einem Lysin oder Arginin des Zielproteins oder Peptid unter Bildung des zielgerichteten Lipids reagieren.
Insbesondere können die in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendeten Verbindungen, einschließlich Lipide, Proteine und/oder Polymere, verschiedene funktionelle Gruppen, wie zum Beispiel Hydroxy-, Thio- und Amingruppen enthalten, die mit einer Carbonsäure oder einem Carbonsäurederivat des hydrophilen Polymerlinkers unter Verwendung geeigneter Kopplungsbedingungen, die für den Fachmann offensichtlich wären, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist. reagieren können. Nachdem die Carbonsäuregruppe (oder ein Derivat davon) mit der funktionellen Gruppe, zum Beispiel Hydroxy-, Thio- oder Amingruppe unter Bildung einer Ester-, Thioester- oder Amidgruppe reagiert hat, kann jede geschützte funktionelle Gruppe unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt wären, entschützt werden. Der Begriff Schutzgruppe, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Einheit, die zum Blockieren der Reaktion einer funktionellen Gruppe verwendet werden kann, und die auf Wunsch entfernt werden kann, um die funktionelle Gruppe wieder zur Verfügung zu stellen. Es kann jede aus einer Vielzahl von Schutzgruppen verwendet werden und diese werden in Abhängigkeit zum Beispiel ob die zu schützende Gruppe eine Amin-, Hydroxyl- oder Carboxyleinheit ist, variieren. Ist die funktionelle Gruppe eine Hydroxylgruppe, umfassen geeignete Schutzgruppen zum Beispiel bestimmte Ether, Ester und Carbonate. Derartige Schutzgruppen sind zum Beispiel in Greene, TW und Wuts, PGM „Protective Groups in Organis Synthesis" John Wiley, New York, 2. Auflage (1991), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird, beschrieben. Beispielhafte Schutzgruppen für Amingruppen umfassen zum Beispiel t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), o-Nitrobenzyloxycarbonyl und Trifluoracetat (TFA).
Amingruppen, die zum Beispiel auf einem Grundgerüst eines Polymers, da in dem Vesikel enthalten ist, vorhanden sein können, können an Amingruppen auf einem hydrophilen Kopplungspolymer unter Bildung einer Schiffschen Base, zum Beispiel unter Verwendung von Kopplungsmitteln, wie zum Beispiel Glutaraldehyd, gekoppelt werden. Ein Beispiel für dieses Koppeln ist von Allcock et al., Macromolecules Band 19(6), Seiten 1502–1508 (1986) beschrieben. Falls zum Beispiel Vesikel aus Polylysin formuliert sind, können freie Aminogruppen auf der Oberfläche der Vesikel ausgesetzt werden und diese freien Aminogruppen können, wie vorstehend beschrieben ist, aktiviert werden. Die aktivierten Aminogruppen können wiederum zum Koppeln eines funktionalisierten hydrophilen Polymers, wie zum Beispiel α-Amino-ω-Hydroxy-PEG, wobei die ω-Hydroxygruppe mit einer Carbonatgruppe geschützt wurde, verwendet werden. Nach Beendigung der Reakton kann die Carbonatgruppe abgespalten werden, wobei ermöglich wird, dass die endständige Hydroxygruppe für die Reaktion zu einem geeigneten Zielliganden aktiviert wird. In bestimmten Ausführungsformen kann die Oberfläche eines Vesikel, zum Beispiel durch Ersetzen von Chloratomen durch Chlor-enthaltende Phosphazenreste, wie zum Beispiel Polydichlorphosphazin, aktiviert werden. Nachfolgende Addition eines Zielliganden und Abschrecken der restlichen Chloridgruppen mit Wasser oder wässrigem Methanol wird das gekoppeltes Produkt ergeben.
Zusätzlich kann Poly(Diphenoxyphosphazen) synthetisiert (Allock et al., Macromelecules Band 19(6), Seiten 1502–1508 (1986)) und zum Beispiel auf DPPE immobilisiert werden, gefolgt von Nitrierung der Phenoxyeinheiten durch Zugabe einer Mischung aus Salpetersäure und Essigsäureanhydrid. Die folgenden Nitrogruppen können dann zum Beispiel durch (1) Behandlung mit Cyanogenbromid in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 11), gefolgt von der Zugabe eines Zielliganden, der eine freie Aminoeinheit zur Erzeugung eines gekoppelten Harnstoffanalogons enthält, (2) Bildung eines Diazoniumsalzes unter Verwendung von Natriumnitrit/HCl, gefolgt von der Zugabe des Zielliganden unter Bildung eines gekoppelten Liganden, und/oder (3) Verwenden eines Dialdehyds, zum Beispiel Glutaraldehyd, wie vorstehend beschrieben, unter Bildung einer Schiffschen Base aktiviert werden. Nach Verknüpfen des DPPEs mit dem hydrophilen Polymer und dem Zielliganden können die Vesikel unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren formuliert werden.
Aldehydgruppen auf Polymeren können mit Amines, wie vorstehend beschrieben, unter Bildung einer Schiffschen Basen gekoppelt werden. Ein Beispiel für dieses Kopplungsverfahren ist in Allcock und Austin Macromolecules Band 14 Seite 1616 (1981) beschrieben.
In den vorstehenden Verfahren wird das Polymer oder das Ende des Lipids, zum Beispiel Phosphatidylglycerol oder Phosphatidylethanolamin, vorzugsweise aktiviert und an den hydrophilen Polymerlinker gekoppelt, dessen Ende auf geeignete Weise blockiert worden ist. Als Beispiel für diese Strategie kann α-Amino,ω-Carboxy-PEG-4000 mit einer t-Boc-geschützten endständigen Aminogruppe und einem freien Carboxylatende mit 1,1'-Carbonyldiimidazol in Gegenwart von Hydroxybenzotriazol in N-Methylpyrrolidon aktiviert werden. Nach Zugabe von Phosphatidylethanolamin kann die t-Boc-Gruppe unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) entfernt werden, wobei das freie Amin zurückbleibt. Dann kann das Amin mit einem Zielliganden, der zum Beispiel ein Peptid, ein Protein, ein Alkaloid oder eine andere Einheit umfasst, durch eine entsprechende Aktivierung des Liganden umgesetzt werden, um das Lipid-Linker Zielligandkonjugat zur Verfügung zu stellen. Andere zusätzlich zu den vorstehenden beispielhaft erörterten Strategien können zum Herstellen der Lipid-Linker-Zielligand-Konjugate verwendet werden. Allgemein gesagt, verwenden diese Verfahren synthetische Strategien, die im Allgemeinen dem Fachmann in der organischen Synthesechemie bekannt sind.
Wie dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, umfassen Immunglobuline typischerweise eine flexible Region, die als „Gelenkt"-Region identifiziert wird. Sihe zum Beispiel „Concise Encyclopedia of Biochemistry", zweite Ausgabe, Walter de Gruyter Co., Seiten 282–283 (1988). Fab'-Fragmente können an Lipide, Polymer, Proteine und/oder Vesikel unter Verwendung wohl definierter Stellen der Tiole der Gelenkregion gebunden werden. Dies ist zum Koppeln der Fab'-Fragmente eine bevorzugte Region, da die mögliche Bindungsstelle von der Antigenerkennungsstelle entfernt ist. Allgemein gesagt, kann es schwierig sein, die h'Thiole der Gelenkgruppe zu verwenden, außer sie wurden angemessen hergestellt. Insbesondere, wie durch Shahinian und Salvias (Biochimica et Biophysica Acta, Band 1239 (1995) 157–167) ausgeführt wurde, kann es von Bedeutung sein, die Thiolgruppen so zu reduzieren, dass sie zur Kopplung an zum Beispiel Maleimid-derivatisierte Kopplungsgruppen verfügbar sind. Beispiele für allgemein verwendete Reduktionsmittel sind Ethandithio, Mercaptoethano, Mercaptoethylamin oder das üblichere verwendete Dithiotheritol, das im Allgemeinen als Cleland-Reagenz bezeichnet wird. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass bei Verwendung bestimmter Reduktionsmittel, wie zum Beispiel Dithiotheritol, Vorsicht ausgeübt werden sollte, da eine Überreduktion resultieren könnte. Eine Unterscheidung kann bei der Verwendung von Reduktionsmitteln im Zusammenhang mit Proteinen, deren Aktivität oder Bindungsvermögen aufgrund Überreduktion und nachfolgender Denaturierung oder Konformationsänderung wirkungslos werden kann, notwendig sein. Siehe zum Beispiel Shahinian, S. und Salvias, J. R. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 157–167.
F(ab')₂-Antikörperfragmente können durch Inkubieren der Antikörper mit Pepsin (60 μg/ml) in 0,1 M Natriumacetat (pH-Wert 4,3) während 4 h bei 37°C hergestellt werden. Der Verdau kann durch Zugeben von 2 M Tris (pH-Wert 8,8) auf eine Endkonzentration von 80 mM beendet werden. Die F(ab')₂-Fragmente kann dann durch Zentrifugerien (10000 × g 30 Min. 4°C) erhalten werden. Der Überstand kann dann bei 4°C gegen 150 mM NaCl, 20 mM Phosphat bei pH-Wert 7,0 dialysiert werden. Dies kann dann auf einer Säule von Protein A-Sepharose CL-4B zum Entfernen jeglichen unverdauten IgGs chromatographiert werden. Dann können die Fab'-Fragmente durch umfassendes Entgasen der Lösungen und Spülen mit Stickstoff vor Verwendung hergestellt werden. Die F(ab')₂-Fragmente können mit einer Konzentration von 5 mg/ml zur Verfügung gestellt und unter Argon in 30 mM Cystein reduziert werden. Alternativ dazu kann Cysteamin verwendet werden. 100 mM Tris, pH-Wert 7,6 kann als Puffer während 15 Min bei 37°C verwendet werden. Die Lösungen können dann zweifach mit einem gleichen Volumen des geeigneten experimentellen Puffers verdünnt werden und durch eine 0,4 ml Drehsäule auf Bio-Gel P-6DG gedreht werden. Die resultierenden Fab'-Fragmente können in ihrer Kupplung an Maleimidlinker wirksamer sein. Es ist ebenfalls zu beachten, dass dasselbe Verfahren mit anderen Macromolekülen, die Cysteinreste zum Koppeln an beispielsweise Maleimidspacer enthalten, verwendet werden kann. Ebenfalls können Peptide verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten einen Cysteinrest. Falls die Peptide nicht frisch hergestellt wurden und es eine Möglichkeit für Oxidation der Cysteinreste innerhalb der Peptidstruktur gibt, kann es notwendig sein, die Thiolgruppe unter Verwendung der vorstehend ausgeführten Methode zu regenerieren.
Weitere Linker würden andere Derivate von Lipiden umfassen, die zum Koppeln an einen bifunktionellen Spacer verwendbar sind. Zum Beispiel kann Phosaphtidylethanolamin (PE) an ein bifunktionelles Mittel gekoppelt werden. Zum Beispiel können unter anderem 4-(p-Maleimidophenyl)butyrat (SMPB) und 4-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), N-Succinimidyl-trans-4-(N-maleimidylmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) und N-Succinimidyl-3-maleimidylbenzoat (SMB) zur Herstellung von zum Beispiel den funktionalisierten Lipiden NPB-PE und PDP-PE verwendet werden.
Das freie Ende der hydrophilen Spacer, wie zum Beispiel Polyethylengylcolethylamin, das eine reaktive Gruppe, wie zum Beispiel eine Amin- oder Hydroxylgruppe enthält, könnte zum Binden an einen Cofaktor oder anderen Zielliganden verwendet werden. Zum Beispiel kann Polyethylenglycolethylamin mit N-Succinimidylbiotin oder p-Nitrophenylbiotin umgesetzt werden, um auf dem Spacer eine verwendebare Kopplungsgruppe einzuführen. Zum Beispiel kann Biotin an den Spacer gekoppelt werden und dies wird leicht nicht kovalent an Proteine binden. Als Beispiel kann MPB-PEG-DPPE folgendermaßen synthetisiert werden. DPPE-PEG mit einer freien Aminogruppe an dem PEG-Ende wird wie vorstehend beschrieben zur Verfügung estellt. Dann kann die Synthese von SMPB-PEG-DPPE mit 1 Äquivalent Triethylamin in Choroform mit einem molaren Verhältnis von BPPB : DPPE-PEG von 1 : 5 ausgeführt werden. Nach 3 Stunden werden die Reaktionsmischungen zur Trockene unter Argon eingedampft. Überschüssiges nicht umgesetztes SMPB und bedeutendere Nebenprodukte werden durch präparative Dünnschichtchromatographie (TLC, Silikagel, entwickelt mit 50% Aceton in Chloroform) entfernt. Der obere Teil der Lipidbande kann aus dem Silika mit ungefähr 20–30% Methanol in Chloroform (V : V) extrahiert werden, was zur der Isolierung von reinem intaktem MPB-PEG-DPPE führt. Dann kann Streptavidin an Proteine so gekoppelt werden, dass die Proteine wiederum an das MPG-PEG-DPPE gekoppelt werden können. Kurz gesagt, SPDP würde mit Streptavidin bei Raumtemperatur während 30 Minuten inkubiert werden und zum Entfernen von nicht umgesetzten SPDP würde Chromtographie angewandt werden. Dithiothreitol (DTT) wurde zu der Reaktionsmischung zugegeben und 10 Minuten später 2-Thiopyridon mit einer Konzentration von 343 nM. Der Rest des Reaktionsgemisches wird mit DTT (25 mM während 10 Min) reduziert. Das thiolierte Produkt wird durch Gelausschluß isoliert. Dann können die resultierenden mit Streptavidin markierten Proteine zum Binden an die biotinylierten Spacer, die an den Lipideinheiten befestigt sind, verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden zielgerichtete Verbindungen, nämlich zielgerichtete Lipide, Proteine und Polymere in Zusammensetzungen eingebaut, die zur Bildung zielgerichteter Vesikel, einschließlich zum Beispiel zielgerichtete Mizellen, zielgerichtete Liposomen, zielgerichtete Albuminbeschichtete Mikrokügelchen und/oder zielgerichtete Polymer-beschichtete Mikrokügelchen, verwendet werden. Der Zielligand, der an die Verbindungen gebunden ist, aus denen die Vesikel hergestellt sind, kann zum Beispiel von der Oberfläche des Vesikels nach außen hin gerichtet sein. Daher wird ein zielgerichtetes Vesikel, das zum Zielen auf Rezeptoren und Gewebe verwendet werden kann, zur Verfügung gestellt.
In bestimmten Ausführungsformen können die Zielliganden in die vorliegenden Zusammensetzungen über nicht kovalente Verbindungen eingeschlossen werden. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist eine nicht kovalente Verbindung im Allgemeinen eine Funktion einer Vielzahl von Faktoren, umfassen zum Beispiel die Polarität der betreffenden Moleküle, die Landung (positiv oder negativ), sofern vorhanden, der betreffenden Moleküle, das Ausmaß der Wasserstoffbindung durch das molekulare Netzwerk und dergleichen. Nicht kovalente Bindungen werden vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus ionischer Wechselwirkung, Dipol-Dipol-Wechselwirkung, Wasserstoffbindungen, hydrophile Wechselwirkungen, van-der-Waalssche Kräfte und alle Kombinationen davon, ausgewählt. Nicht kovalente Bindungen können zum Binden des Zielliganden an das Lipid, oder direkt an die Oberfläche des Vesikels verwendet werden. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz Gly-Gly-His an die Oberfläche eines Vesikels, vorzugsweise über einen Linker, wie zum Beispiel PEG, gebunden werden und Kupfer, Eisen oder das Vanadylion können dann zugegeben werden. Proteine, wie zum Beispiel Antikörper, die Histidinreste enthalten, können dann an das Vesikel über eine ionische Brücke mit dem Kupferion binden, wie in dem U.S. Patent Nr. 5,466,467, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird, beschrieben ist. EIN Beispiel für eine Wasserstoffbindung betrifft Cardiolipinlipide, die in die Lipidzusammensetzungen eingeschlossen werden können.
In der vorliegenden Erfindung, die Vesikelzusammensetzungen betrifft, können Änderungen zum Beispiel in dem pH-Wert und/oder der Temperatur in vivo verwendet werden, eine Änderung in dem Ort in den Zielliganden, zum Beispiel von einem Ort innerhalb des Vesikels zu einem Ort außerhalb der äußeren Vesikelwand, zu fördern. Dies kann das Binden der Zielliganden an Zielstellen, zum Beispiel Rezeptoren, wie zum Beispiel den GPIIbIIIa-Rezeptor, und Gewebe, einschließlich Herzmuskel-, endotheliale und epitheliale Zellen, fordern, da der Zielligand eine größere Wahrscheinlichkeit aufweist, sich den Zielstellen auszusetzen. Zusätzlich kann Hochenergieultraschall zum Fördern des Zerreißens der Vesikel verwendet werden. Dies kann ebenfalls den Zielliganden für die gewünschte Bindungsstelle freigeben.
Wie vorstehend angemerkt wurde sind die vorliegenden Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen erwünscht in einer wässrigen Umgebung formuliert. Dies kann das Lipid aufgrund dessen hyrophober/hydrophiler Natur veranlassen, Vesikel zu bilden, die die stabilste Konfiguration, die ein einer derartigen Umgebung erreicht werden kann, einnehmen. Die Verdünnungsmittel, die zum Erzeugen einer derartigen wässrigen Umgebung verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Wasser, einschließlich entionisiertes Wasser oder Wasser, das ein oder mehrere gelöste Stoffe, wie zum Beispiel Salze, die vorzugsweise nicht die Bildung und/oder Stabilität der Vesikel oder deren Verwendung als diagnostische Mittel, wie zum Beispiel Ultraschallkontrastmittel, MRI-Kontrastmittel oder CT-Kontrastmittel, stören, und normale Salzlösung und physiologische Salzlösung enthält.
Die Lipid-, Vesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zusätzliche Kontrastmittel, einschließlich herkömmliche Kontrastmittel umfassen, die zum Erhöhen ihrer Wirksamkeit als Kontrastmittel zur diagnostischen Bildgebung dienen.
Dementsprechend liegt es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, Vesikelzusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die flexible Vesikel, zum Beispiel aus Lipiden formulierte Vesikel, oder unflexible Vesikel, zum Beispiel aus Polymethylmethacrylat hergestellte Vesikel, umfassen.
Es wird angenommen, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung insbesondere in Zusammenhang mit Ultraschall, einschließlich für diagnostischen und therapeutischen Ultraschall, verwendbar sind. Die Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen für Ultraschall wird durchwegs in der vorliegenden Offenbarung beschrieben.
Wie vorstehend angemerkt wurde können die vorliegenden Zusammensetzungen ebenfalls in Zusammenhang mit der Comoputertomographie-(CT)Abbildung verwendet werden. Die CT leidet an verschiedenen Nachteilen und ist im Allgemeinen im Vergleich mit den vorstehend erörterten Diagnosetechniken weniger wirksam. Falls eine ausreichend hohe Konzentration der vorliegenden Kontrastmedien und insbesondere gasgefüllte Vesikelzusammensetzungen an die interessierende Region, zum Beispiel ein Blutgerinnsel, abgegeben wird, kann dennoch das Gerinnsel auf CT-Abbildungen aufgrund einer Abnahme in der Gesamtdichte des Gerinnsels nachgewiesen werden. Im Allgemeinen könnte eine Konzentration von ungefähr 1/10 von 1% gasgefüllter Vesikel oder mehr (auf Basis des Volumens) benötigt werden, die an die interessierende Region abgegeben wird, einschließlich an das vorstehend erwähnte Blutgerinnsel, damit sie durch CT nachgewiesen werden kann.
Beispielhafte paramagnetische Kontrastmittel, die zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen geeignet sind, umfassen zum Beispiel stabile freie Radikale, wie zum Beispiel stabile Nitroxide, so wie Verbindungen, die Übergangselemente, Elemente der Lanthaniden und Actiniden umfassen, die auf Wunsch in Form eines Salzes vorliegende können oder kovalent oder nicht kovalent an komplexbildende Mittel, einschließlich lipophile Derivate davon, oder an proteinhaltige Makromoleküle gebunden sein können.
Bevorzugte Übergangselemente, Elemente der Lanthaniden und Actiniden umfassen zum Beispiel Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(II), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) und Dy(III). Bevorzugtere Elemente können Gd(III), Mn(II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Eu(III) und Dy(III), insbesondere Mn(II) und Gd(III) sein.
Die vorstehenden Elemente können auf Wunsch in Form eines Salzes, einschließlich eines anorganischen Salzes, wie zum Beispiel Mangansalz, zum Beispiel Manganchlorid, Mangancarbonat, Manganacetat, und eines organischen Salzes, wie chlorid, Mangancarbonat, Manganacetat, und eines organischen Salzes, wie zum Beispiel Mangangluconat und Manganhydroxylapatit, vorliegen. Weitere beispielhafte Salze umfassen Eisen, zum Beispiel Eisensulfide und Eisensalze, wie zum Beispiel Eisenchlorid.
Diese Elemente können ebenfalls auf Wunsch zum Beispiel über eine kovalente oder nicht kovalente Bindung an komplexbildende Mittel, einschließlich lipophile Derivate davon, oder an proteinhaltige Makromoleküle gebunden werden. Bevorzugte komplexbildende Mittel umfassen zum Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N',N'''-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclodeodecyn-N,N',N'''-triessigsäure (DOTA), 3,6,9-Triaza-12-oxa-3,6,9-tricarboxymethylen-10-carboxy-13-phenyltridecansäure (B-19036), Hydroxybenzylethylendiamindiesseigsäure (HBED), N,N'-Bis(pyridoxyl-5-phosphat)ethylendiamin-N,N'-diacetat (DPDP), 1,4,7-Triazacyclononan-N,N',N''-triessigsäure (NOTA), 1,4,6,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TETA), Kryptanden (makrocyclische Komplexe) und Desferrioxamin. Bevorzugtere komplexbildende Mittel sind EDTA, DTPA, DOTA, DO3A und Kryptanden, besonders bevorzugt ist DTPA. Bevorzugte lipophile Komplexe umfassen alkylierte Derivate der komplexbildenden Mittel EDTA, DOTA, zum Beispiel N,N'-Bis(Carboxydecylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropyl)ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-DDP); N,N'-Bis(carboxyoctadecylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropyl)ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-ODP); N,N'-Bis(carboxylaufylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropyl)ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-LDP) und dergleichen, einschließlich denjenigen die in dem U.S Patent Nr. 5,312,617 beschrieben sind, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird. Bevorzugte proteinhaltige Makromoleküle umfassen zum Beispiel Albumin, Collagen, Polyarginin, Polylysin, Polyhistidin, γ-Globulin, wobei Albumin, Polyarginin, Polylysin und Polyhistidin bevorzugter sind.
Geeignete Komplexe umfassen daher Mn(II)-DTPA, Mn(II)-EDTA, Mn(II)-DOTA, Mn(II)-DO3A, Mn(II)-Kryptanden, Gd(III)-DTPA, Gd(III)-DOTA, Gd(III)-DO3A, Gd(III)-Kryptanden, Cr(III)-EDTA, Cu(II)-EDTA oder Eisendesferrioxamin, insbesondere Mn(II)-DTPA oder Gd(III)-DTPA.
Nitroxide sind paramagnetische Kontrastmittel, die sowohl die T1- als auch T2-Relaxationsraten bei der MRI aufgrund des Vorhandenseins eines ungepaarten Elektrons in dem Nitroxidmolekül erhöhen. Wie dem Fachmann bekannt ist, kann die paramagnetische Wirksamkeit einer gegebenen Verbindung als ein MRI-Kontrastmittel zumindest teilweise zu der Anzahl ungepaarter Elektronen in dem paramagnetischen Kern oder Molekül, und insbesondere zu dem Quadrat der Anzahl ungepaarter Elektronen in Beziehung gesetzt werden. Zum Beispiel weist Gadolinium sieben ungepaarte Elektronen auf, wohingegen ein Nitroxidmolekül nur ein ungepaartes Elektron aufweist. Daher ist Gadolinium im Allgemeinen ein viel stärkeres MRI-Kontrastmittel als Nitroxid. Jedoch verleiht die effektive Korrelationszeit, ein weiterer wichtiger Parameter zum Bewerten der Wirksamkeit des Kontrastmittels, den Nitroxiden ein mögliches erhöhtes Relaxationsvermögen. Wird die Taumelgeschwindigkeit zum Beispiel durch Binden des paramagnetischen Kontrastmittels an ein großes Molekül, verlangsamt, wird es langsamer taumeln und dadurch wirksamer Energie zum Beschleunigen der Relaxation der Wasserprotonen übertragen. In Gadolinium jedoch ist die Elektronenspinrelaxationszeit sehr schnell und wird das Ausmaß, indem die langsame Rotationskorrelationszeit das Relaxationsvermögen erhöhen kann, begrenzen. Für Nitroxide sind jedoch die Elektronenspinkorrelationszeiten vorteilhafter und gewaltige Zunahmen im Relaxationsvermögen können durch Verlangsamung der Rotationskorrelationszeiten dieser Moleküle erreicht werden. Die gasgefüllten Vesikel der vorliegenden Erfindung sind zum Erreichen der Ziele der verlangsamten Rotationskorrelationszeiten und der resultierenden Verbesserung im Relaxationsvermögen ideal. Obwohl keine Bindung an jegliche spezielle Theorie über den Vorgang beabsichtigt ist, wird angenommen, dass die resultierenen Korrelationszeiten optimiert werden können, da die Nitroxide so ausgelegt werden können, dass sie die äußeren Begrenzungen der Vesikel bedecken, zum Beispiel durch Herstellen der Alkylderivate davon. Überdies kann das resultierende Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung als eine magnetische Kugel, eine geometrische Konfiguration, die das Relaxationsvermögen maximiert, angesehen werden.
Auf Wunsch können die Nitroxide alkyliert oder anderweitig derivatisiert werden, wie zum Beispiel die Nitroxide 2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, freies Radikal und 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy, freies Radikal (TMPO).
Beispielhafte superparamagnetische Kontrastmittel, die zur Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Metalloxide und Sulfide, bei denen eine magnetische Domäne auftritt, ferro- oder ferrimagnetische Verbindungen, wie zum Beispiel reines Eisen, magnetisches Eisenoxid, wie zum Beispiel Magnetit, γ-Fe₂O₃, Fe₃O₄, Manganferrit, Cobaltferrit und Nickelferrit. Paramagnetische Gase können ebenfalls in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden, wie zum Beispiel Sauerstoff-17-Gas (¹⁷O₂). Zusätzlich können ebenfalls hyperpolarisiertes Xenon-, Neon- oder Heliumgas verwendet werden. Dann kann die magnetische Resonanzabbildung des ganzen Körpers angewandt werden, um den Körper schnell zu Beispiel auf Thrombose zu screenen und Ultraschall kann auf Wunsch zur Hilfe bei der Thrombolyse angewandt werden.
Die Kontrastmittel, wie zum Beispiel die vorstehend beschriebenen paramagnetischen und superparamagnetischen Kontrastmittel, können als Komponente innerhalb der Lipid und/oder Vesikelzusammensetzungen verwendet werden. Im Falle der Vesikelzusammensetzungen können die vorstehend erwähnten Kontrastmittel innerhalb deren innerem Hohlraum eingeschlossen werden, als Lösung mit den Vesikeln verabreicht werden, mit beliebigen zusäztlichen stabilisierenden Materialien eingebaut werden oder auf die Oberfläche oder Membran des Vesikels beschichtet werden.
Auf Wunsch können die paramagnetischen oder superparamagnetischen Mittel als alkylierte oder andere Derivate, die in den Zusammensetzungen, insbesondere den Lipidwänden der Vesikel, eingeschlossen sind, abgegeben werden. Insbesondere können die Nitroxide 2,2,5,5-Tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, freies Radikal und 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy, freies Radikal, Addukte mit langkettigen Fettsäuren an den Ringpositionen, die nicht von Methylgruppen besetzt sind, über eine Vielzahl von Bindungen, einschließlich zum Beispiel eine Acetyloxybindung, bilden. Derartige Addukte sind zum Einbauen in das Lipid und/oder die Vesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sehr zugänglich.
Es können Mischungen von jedem einzelnen oder mehreren der paramagnetischen Mittel und/oder superparamagnetischen Mittel in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden. Die paramagnetischen und superparamagnetischen Mittel können auf Wunsch ebenfalls getrennt zusammen verabreicht werden.
Die Lipidvesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können nicht nur als wirksame Träger der vorstehend beschriebenen superparamagnetischen Verbindungen dienen, sondern können ebenfalls die Wirkung der Suszeptibilität der Kontrastmittel verbessern. Superparamagnetische Kontrastmittel umfassen Metalloxide, insbesondere Eisenoxide, jedoch einschließlich Maganoxide, und als Eisenoxide, die variierende Mengen Mangan, Cobalt und Nickel enthalten, bei denen eine magnetische Domäne auftritt. Diese Mittel sind Nano- oder Mikroteilchen und weisen sehr hohe Massensuszeptibilitäten und transversale Relaxationsraten auf. Die größeren Teilchen, zum Beispiel Teilchen mit Durchmessern von ungefähr 100 nm, weisen im Vergleich zu dem R1-relaxationsvermögen ein viel höheres R2-Relaxationsvermögen auf. Die kleineren Teilchen, zum Beispiel Teilchen mit Durchmesser von ungefähr 10 bis ungefähr 15 nm weisen ein etwas niedrigeres R2-Relaxationsvermögen, jedoch viel ausgeglichenere R1- und R2-Werte auf. Viel kleinere Teilchen, zum Beispiel monokristalline Eisenoxidteilchen mit Durchmessern von ungefähr 3 bis ungefähr 5 nm weisen ein geringeres R2-Relaxationsvermögen, jedoch wahrscheinlich die am besten ausgeglichenen R1 und R2-Relaxationsraten auf. Ferritin kann ebenfalls so formuliert werden, dass es einen Kern mit einem superparamagnetischen Eisen mit sehr hoher Relaxationsrate einschließt. Es wurde entdeckt, dass die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen, insbesondere die Vesikelzusammensetzungen, einschießlich gasgefüllter Vesikel die Leistungsfähigkeit und Sicherheit dieser auf herkömmlichem Eisenoxid basierenden MRI-Kontrastmittel erhöht.
Die Eisenoxide können einfach in die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen eingeschlossen werden. Im Falle von aus Lipiden formulierten Vesikelzusammensetzungen können die Eisenoxide in die Wände der Vesikel eingebaut werden, indem sie zum Beispiel auf die Oberflächen der Vesikel adsorbiert werden, oder im Inneren der Vesikel, wie in dem U.S. Patent 5,088,499 beschrieben ist, eingeschlossen werden.
Ohne an eine beliebige spezielle Theorie oder Theorien über den Vorgang gebunden zu sein wird angenommen, dass die Vesikel der vorliegenden Erfindung die Leistungsfähigkeit der superparamagnetischen Kontrastmittel durch mehrere Mechanismen erhöhen. Es wird angenommen, dass erstens die Vesikel eine Zunahme in der scheinbaren magnetischen Konzentration der Eisenoxidteilchen bewirken. Ebenfalls wird angenommen, dass die Vesikel die scheinbare Rotationskorrelationszeit der MRI-Kontrastmittel, einschließlich der paramagnetischen und superparamagnetischen Mittel, erhöhen, so dass die Relaxationsraten erhöht sind. Zusätzlich scheinen die Vesikel die scheinbare magnetische Domäne des Kontrastmittels entsprechend auf die hier nachstehend beschriebene Art zu erhöhen.
Bestimmte Vesikel der vorliegenden Erfindung uns insbesondere aus Lipiden formulierte Vesikel können als flexible kugelförmige Domänen mit unterschiedlicher Suszeptibilität aus dem Suspensionsmedium, einschließlich zum Beispiel die wässrige Suspension des Kontrastmedium oder Blut oder andere Körperflüssigkeiten, zum Beispiel im Falle einer intravaskulären Injekton oder Injektion in andere Stellen des Körpers, angesehen werden. Im Falle von Ferriten oder Eisenoxidteilchen sollte beachtet werden, dass der durch diese Mittel bereitgestellte Kontrast von der Teilchengröße anhängt. Dieses Phänomen ist sehr üblich und wird häufig als die „Sekulär"-Relaxation der Wassermoleküle bezeichnet. In physikalischeren Worten beschrieben ist dieser Relaxationsmechanismus von der effektiven Größe des molekularen Komplexes, in dem ein paramagnetisches Atom, oder paramagnetisches Molekül oder Moleküle ruhen kann, abhängig. Eine physikalische Erklärung kann mit den folgenden Solomon-Bloembergen-Gleichungen beschrieben werden, die die paramagnetischen Beiträge als Funktion der T₁- und T₂-Relaxationszeiten eines Spin ½ Kerns mit dem gyromagnetischen Verhältnis g, das durch ein paramagnetisches ion gestört ist, definiert: 1/T1M = (2/15)S(S + 1)γ2g2β2/r6[3τc(1 + ωl 2τc2) + 7τc/(1 + ωs 2τc 2)] + (2/3)S(S + 1)A2/h2[τe/1 + ωs 2τe 2)]und 1/T2M = (1/15)S(S + 1)γ2g2β2/r6[4τc + 3τc/(1 + ωl 2τc 2) + 13τc/(1 + ωs 2τc 2)] + (1/3)S(S + 1)A2/h2[τe/1 + ωs 2τe 2)]wobei
S die Elektronenspinquantenzahl ist,
g der elektronsiche g Faktor ist,
β das Bohrsche Magneton ist,
ω_l und ω_s (657ω_l) die Lamorwinkelpräzessionsfrequenzen für die Kernspins und Elektronenspins sind,
r der Eisen-Kern-Abstand ist,
A die Hyperfeinkopplungskonstante ist,
τ_c und τ_e die Korrelationszeiten für die dipolaren beziehungsweise skalaren Wechselwirkungen sind, und
h das Planksche Wirkungsquantum ist.
Siehe zum Beispiel Solomon, I. Phys. Rev. Band 99, Seite 559 (1955) und Bloembergen, N. J. Chem. Phys. Band 27, Seiten 575, 595 (1957).
Wenige große Teilchen können hauptsächlich aufgrund der größeren Korrelationszeit eine viel größere Wirkung als eine große Zahl viel kleinerer Teilchen aufweisen. Sollte man die Eisenoxidteilchen jedoch sehr groß herstellen, kann dies zu einer erhöhten Toxizität führen und die es kann eine Lungenembolie stattfinden oder das komplementäre Kaskadensystem kann aktiviert werden. Weiterhin wird angenommen, dass die Gesamtgröße des Teilchens nicht so wichtig wie der Durchmesser des Teilchens an seiner Kante oder die äußere Oberfläche ist. Die Domäne der Magnetisierung oder der Suszeptibilitätseffekt nimmt ausgehend von der Oberfläche des Teilchens exponentiell ab. Allgemein gesagt, zeigt im Fall des dipolaren (durch den Raum) Relaxationsmechanismus dieser exponentielle Abfall eine r⁶-Abhängigkeit für eine paramagnetische Dipol-Dipol-Wechselwirkung. Genau gesagt, wird ein Wassermolekül, das 4 'ngström von einer paramagnetischen Oberfläche entfernt ist, 64 mal weniger beeinflusst als ein Wassermolekül, das 2 'ngström von derselben paramagnetischen Oberfläche entfernt ist. Die ideale Situation in Bezug auf die Maximierung der Kontrastwirkung wäre die Herstellung von Eisenoxidteilchen, die hohl, flexibel und so groß wie möglich sind. Bis jetzt ist es nicht möglich gewesen, dies zu erreichen, und es wird angenommen, dass ebenfalls bis jetzt die Vorteile nicht erkannt worden sind. Durch Beschichten der inneren oder äußeren Oberflächen der Vesikel mit den Kontrastmitteln kann die Wirksamkeit der Kontrastmittel stark erhöht werden, obwohl die einzelnen Kontrastmittel, zum Beispiel Eisenoxidnanoteilchen oder paramagnetische Ionen relativ kleine Strukturen aufweisen. Dabei können die Kontrastmittel als eine effektiv viel größere Kugel wirken, wobei die effektive Domäne der Magnetisierung durch den Durchmesser des Vesikels bestimmt wird und an der Oberfläche des Vesikels maximal ist. Diese Mittel bieten den Vorteil der Felxibilität, nämlich der Nachgiebigkeit. Während starre Vesikel in den Lungen oder anderen Organen stecken bleiben und toxische Reaktionen verursachen können, gleiten diese flexiblen Vesikel viel leichter durch die Kapillaren.
Im Gegensatz zu den vorstehend beschriebenen flexiblen Vesikel kann es unter bestimmten Umständen erwünscht sein, Vesikel aus im Wesentlichen undurchlässigen polymeren Materialien, umfassend zum Beispiel Polymethylmethacrylat, zu formulieren. Dies würde im Allgemeinen zu der Bildung von Vesikeln führen, die im Wesentlichen undurchlässig und relativ unelastisch und zerbrechlich wären. In Ausführungsformen, die diagnostische Bildgebung, zum Beispiel Ultraschall, betreffen würden Kontrastmittel, die derartig zerbrechliche Vesikel umfassen, im Allgemeinen nicht für das gewünschte Reflexionsvermögen sorgen, das die flexiblen Vesikel liefern. Durch Erhöhen der Leistungsabgabe des Ultraschalls kann ein Zerreisen der zerbrechlichen Mikrokügelchen bewirkt werden, wobei akustische Emissionen verursacht werden, die durch einen Ultraschallwandler nachgewiesen werden können.
Im Zusammenhang mit den diagnostischen und therapeutischen Aspekten der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls die nuklearmedizinische Abbildung (NMI) verwendet werden. Zum Beispiel kann die NMI zum Nachweisen radioaktiver Gase, wie zum Beispiel Xe¹²³, die zusätzlich oder anstelle der vorstehend erörterten Gasen in die vorliegenden Zusammensetzungen eingebaut werden können, verwendet werden. Derartige radioaktive Gase können zur Verwendung zum Nachweis von beispielsweise einer Thrombose innerhalb der Vesikel eingeschlossen werden. Vorzugsweise werden bifunktionelle Chelatderivate in die Wände der Vesikel eingebaut und die resultierenden Vesikel können sowohl in der NMI als auch für den Ultraschall verwendet werden. In diesem Fall können hochenergetische qualitativ hochwertige Isotope zur nuklearmedizinischen Abbildung, wie zum Beispiel Technetium^99m oder Indium¹¹¹ in die Wände der Vesikel eingebaut werden. Dann können Gammastrahlung abtastende Kameras für den ganzen Körper verwendet werden, um schnell die Regionen der Vesikelaufnahme in vivo zu lokalisieren. Auf Wunsch kann ebenfalls Ultraschall verwendet werden, um das Vorhandensein von zum Beispiel einem Ge rinnsel innerhalb der Blutgefäße zu bestätigen, da im Allgemeinen Ultraschall eine verbesserte Auflösung im Vergleich zu nuklearmedizinischen Techniken liefert. NMI kann ebenfalls zu Screening des gesamten Körpers des Patienten zum Nachweisen von Bereichen mit vaskulärer Thrombose verwendet werden, und Ultraschall kann auf diese Bereich lokal angewandt werden, um ein Zerreißen der Vesikel zu unterstützen und um das Gerinnsel zu behandeln.
Für die optische Bildgebung können optisch aktive Gase, wie zum Beispiel Argon oder Neon in die vorliegenden Zusammensetzungen eingeschlossen werden. Zusätzlich können ebenfalls optisch aktive Materialien, zum Beispiel Fluoreszenzmaterialien, einschließlich Prophyrinderivate, verwendet werden. Die Elastographie ist eine Abbildungstechnik, die im Vergleich zu Ultraschall, der Frequenzen von mehr als 1 MHz erfordern kann, im Allgemeinen Schall mit viel niedrigerer Frequenz, zum Beispiel ungefähr 60 kHz, verwendet. Bei der Elastographie wird die Schallenergie im Allgemeinen auf das Gewebe angewandt und die Elastizität des Gewebes kann dann bestimmt werden. In Zusammenhang mit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die hochelastische Vesikel betreffen, erhöht die Ablagerung derartiger Vesikel auf zum Beispiel ein Gerinnsel die lokale Elastizität des Gewebes und/oder des Raumes, der das Gerinnsel umgibt. Diese erhöhte Elastizität kann dann mit der Elastographie nachgewiesen werden. Auf Wunsch kann die Elastographie in Verbindung mit anderen Abbildungstechniken, wie zum Beispiel MRI und Ultraschall, verwendet werden.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten diagnostischen Abbildungstechniken und der Thrombolyse von Gerinnseln, kann die vorliegende Erfindung bei einer Vielzahl von therapeutischen Behandlungsmodalitäten verwendet werden. Zum Beispiel können bioaktive Mittel, zum Beispiel Arzneimittel in die vorliegenden Zusammensetzungen eingeschlossen werden. Verwendbare Arzneimittel umfassen zum Beispiel Heparinsulfat, Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase, Urokinase und Hirudin. In Verbindung mit therapeutischen Anwendungen können ebenfalls komplementäre Mittel verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Dihydroergotamin, das mit Heparinsulfat zur Verringerung der Venostase verwendet werden kann. Zusätzlich kann Warfarin als ein Zusatz zur Antikoagulationstherapie verwendet werden. Im Falle von Vesikelzusammensetzungen kann das genetische Material in die Wände der Vesikel oder innerhalb des gasgefüllten Hohlraums der Vesikel eingeschlossen werden. Die kann praktischerweise bei Verwendung von kationischen Lipiden in den Vesikelwänden ausgeführt werden. Gene, wie zum Beispiel der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor oder auf den grundlegenden Fiblroblastwachstumsfaktor gerichtete Antisense-Genfragmente können verwendet werden. Diese Erfindung kann zur Behandlung einer zugrunde liegenden Atherosklerose oder zum Verringern der Tendenz zu einer fibrointimalen Hyperplasie verwendbar sein.
Die Lipid-, Vesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von jeder aus einer Vielzahl geeigneter Verfahren hergestelltes erden. Diese sind nachstehend für die Ausführungsformen, die Lipidzusammensetzungen und ein Gas, einschließlich gasgefültler Vesikel, betreffen und für die Ausführungsformen, die Lipidzusammensetzungen und einen gasförmigen Vorläufer, einschließlich mit einem gasförmigen Vorläufer gefüllte Vesikel, betreffen, obwohl Zusammensetzungen, die sowohl ein Gas als auch einen gasförmigen Vorläufer einen Teil der vorleigenden Erfindung bilden, getrennt beschrieben.
Ein Zielligand kann an das mit Gas oder gasförmigem Vorläufer gefüllte Vesikel gebunden werden, indem er an ein oder mehrere Materialien bindet, die in den aus diesen Materialien hergestellten Zusammensetzungen verwendet werden, einschließlich Lipide, Proteine, Polymere und/oder stabilisierende Hilfsmaterialien, wie vorstehend beschrieben wurde.
Eine große Vielzahl von Verfahren sind für die Herstellung der Zusammensetzungen, einschließlich den Vesikelzusammensetzungen, wie zum Beispiel Mizellen und/oder Liposomen, verfügbar. Dies Verfahren umfassen zum Besipiel Schütteln, Trocknen, Einleitung von Gas, Sprühtrocknen und dergleichen. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Vesikelzusammensetzungen sind zum Beispiel in dem U.S Patent Nr. 5,469,854 beschrieben. Wie vorstehend angemerkt wurde, werden die Vesikel vorzugsweise aus Lipiden, die im Gelzustand bleiben, hergestellt.
Unter spezieller Bezugnahme auf die Herstellung von Mizzelenzusammensetzungen wird die folgende Diskussion zur Verfügung gestellt. Mizellen können unter Verwendung von jedem aus einer Vielzahl herkömmlicher Mizellenherstellungsverfahren, die für den Fachmann offensichtlich sind, hergestellt werden. Diese Verfahren betreffen typischerweise die Suspension der Lipidverbindung in einem organischen Lösungsmittel, das Verdampfen des Lösungsmittels, die Resuspension in einem wässrigen Medium, die Beschallung und Zentrifugation. Die vorstehenden Verfahren, sowie andere werden zum Beispiel in Canfield et al., Methods in Enzymology, Band 189, Seiten 418–422 (1990); El-Gorab et al., Biochem. Biophys. Acta, Band 306, Seiten 58–66 (1973); Colloidal Surfactant, Shinoda, K., Nakagana, Tamamushi und Isejufa, Academic Press, NY (1963) (insbesondere „The Formation of Micelles", Shinoda, Kapitel 1, Seiten 1–88); Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems, Fendler and Fendler, Academic Press, NY (1975) diskutiert.
Wie vorstehend angemerkt wurde, können die Vesikelzusammensetzungen Liposomen umfassen. In jedem gegebenen Liposom kann (können) die Lipidverbindung(en) in Form einer Monoschicht oder Doppelschicht vorliegen und die Mono- oder Doppelschicht-Lipide können zur Bildung von einer oder mehreren Mono- oder Doppelschichten verwendet werden. Im Falle von mehr als einer Mono- oder Doppelschicht sind die Mono- oder Doppelschichten im Allgemeinen konzentrisch. Daher können die Lipide zur Bildung von unilammelaren Liposomen (die aus einer Monoschicht oder Doppelschicht bestehen) oder multilamellaren Liposomen (die aus mehr als drei Monoschichten oder Doppelschichten bestehen) verwendet werden.
In Verbindung mit der Herstellung der Liposomenzusammensetzungen ist eine große Vielzahl von Verfahren verfügbar. Dementsprechend können die Liposomen unter Verwendung von jeder aus einer Vielzahl herkömmlicher Liposomenherstellungstechniken, die für den Fachmann offensichtlich sind, hergestellt werden. Diese Techniken umfassen zum Beispiel Lösungsmitteldialyse, French press, Extrusion (mit oder ohne Gefrieren-Tauen), Umkehrphasenverdampfung, einfache Gefrier-Tau-Technik, Beschallung, Chelatdialyse, Homogenisierung, Lösungsmittelinfusion, Mikroemulgierung, spontane Bildung, Lösungsmittelverdampfung, Lösungsmitteldialyse, French pressure Zelltechni, kontrollierte Detergensdialyse und weitere, wobei jede Technik die Herstellung der Vesikel auf verschiedene Arten betrifft. Siehe zum Beispiel Madden et al., Chemistry and Physics of Lipids, 1990 53, 37–46. Geeignete Gefrier-Tau-Techniken sind zum Beispiel in der internationalen Anmeldung mit der Anmeldenr. PCT/US89/05040, eingereicht am 8. November 1989, beschrieben. Verfah ren, die Gefrier-Tau-Techniken betreffen, werden im Zusammenhang mit der Herstellung von Liposomen bevorzugt. Die Herstellung der Liposomen kann in einer Lösung, wie zum Beispiel in einer wässrigen Salzlösung, wässrigen Phosphatpufferlösung oder sterilem Wasser, ausgeführt werden. Die Liposomen können ebenfalls durch verschiedene Verfahren, die Schütteln oder Verwirbeln betreffen, hergestellt werden. Dies kann zum Beispiel durch die Verwendung einer mechanischen Schüttelvorrichtung, wie zum Beispiel ein Wig-L-Bug^TM (Crecent Dental, Lyons, IL), ein Mixomat, vertrieben von Degussa AG, Frankfurt, Deutschland, ein Capmix, vertrieben von Espe Fabrik Pharmazeutischer Präparate GmbH & Co., Seefeld, Oberay Deutschland, ein Silamat Plus, vertrieben von Vivadent, Liechtenstein oder ein Vibros, vertrieben von Quayle Dental, Sussex, England, erreicht werden. Ein herkömmliches Mikroemulgatorgerät, wie zum Beispiel Microfluidizer^TM (Microfluidics, Woburn, MA) kann ebenfalls verwendet werden.
Zum Herstellen der gasgefüllten Vesikel kann Sprühtrocknen verwendet werden. Bei Verwendung dieses Verfahrens können die Lipide in einer wässrigen Umgebung vorgemischt werden und dann zur Herstellung der gasgefüllten Vesikel sprühgetrocknet werden. Die Vesikel können unter einem Kopfraum mit einem gewünschten Gas gelagert werden.
Viele Liposomenherstellungstechniken, die zur Verwendung bei der Herstellung der Vesikelzusammensetzungen angepasst werden können, werden zum Beispiel in dem U.S. Patent Nr. 4,728,578; U.K. Patentanmeldung GB 2193095 A; U.S: Patent Nr. 4,728,575; U.S. Patent Nr. 4,737,323; Internationale Patentanmeldung mit der Anmeldenr. PCT/US85/01161; Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, Band 858, Seiten 161–168 (1986); Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, Band 812, Seiten 55–65 (1^985); U.S. Patent Nr. 4,533,254; Mayhew et al., Methods in Enzymology, Band 149, Seiten 64–77 (1987); Mayhew et al., Biochimica et Biophysica Acta, Band 755, Seiten 169–74 (1984); Cheng et al., Investigative Radiology, Band 22, Seiten 47–55 (1987); Internationale Anmeldung mit der Anmeldenr. PCT/US89/05040; U.S. Patent Nr. 4,162,282; U.S. Patent Nr. 4,310,505; U.S. Patent Nr. 4,921,706 und Liposome Technology, Gregoriadis, G. Herausg. Band I, Seiten 29–31, 51–67 und 79–108 (CRC Press Inc., Boca Raton, FL 1984)
Die ein Gas umfassende Lipidzusammensetzungen können durch Rühren einer wässrigen Lösung, die auf Wunsch ein stabilisierendes Material enthält, in Gegenwart eines Gases hergestellt werden. Der Begriff „Rühren", wie er hier verwendet wird, bedeutet jede Schüttelbewegung einer wässrigen Lösung, so dass das Gas aus der lokalen Umgebung der wässrigen Lösung zugeführt wird. Dieses Rühren wird vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb der Phasenübergangstemperatur von Gel- zu flüssiger Phase durchgeführt. Das mit dem Rühren der Lösungen verbundene Schütteln weist vorzugsweise eine Kraft auf, die ausreicht, um zu der Bildung einer Lipidzusammensetzung, einschließlich Vesikelzusammensetzungen und insbesondere Vesikelzusammensetzungen, die gasgefüllte Vesikel umfassen, zu führen. Das Schütteln kann aus Wirbeln, wie zum Beispiel Verwirbeln, einer Bewegung von Seite zu Seite oder einer Auf- und Abbewegung bestehen. Unterschiedliche Bewegungsarten können kombiniert werden. Das Schütteln kann ebenfalls durch Schütteln des Behälters, der die wässrige Lipidlösung enthält, oder durch Schütteln der wässrigen Lösung innerhalb des Behälters ohne Schütteln des Behälters selbst stattfinden.
Das Schütteln kann manuell oder maschinell stattfinden. Mechanische Schüttelvorrichtungen, umfassend zum Beispiel einen Schütteltisch, wie zum Beispiel ein VWR Scientific (Cerritos, CA) Schütteltisch, sowie jede der vorstehend beschriebenen Schüttelvorrichtungen, wobei der Capmix (Espe Fabrik Pharmazeutischer Präparate GmbH) & Co., Seefeld, Oberay, Deutschland) bevorzugt wird, können verwendet werden. Es wurde festgestellt, dass bestimmte Schüttel- oder Verwirbelungsweisen verwendet werden können, um die Vesikel innerhalb eines bevorzugten Größenbereiches herzustellen. Schütteln wird bevorzugt und es wird bevorzugt, dass das Schütteln unter Verwendung der Espe Capmix mechanischen Schüttelvorrichtung ausgeführt wird. Gemäß dieses bevorzugten Verfahrens wird es bevorzugt, dass zur Erzeugung der Lipidzusammensetzungen und insbesondere der Vesikelzusammensetzungen eine Hin- und Herbewegung verwendet wird. Es wird besonders bevorzugt, dass die Bewegung eine Hin- und Herbewegung in Form eines Bogens ist. Es wird angenommen, dass die Geschwindigkeit der Hin- und Herbewegung, so wie deren Bogen, insbesondere in Verbindung mit der Bildung der Vesikel wichtig ist. Die Anzahl der Hin- und Herbewegungen oder Oszillationen mit je einem vollen Zyklus beträgt von ungefähr 1000 bis ungefähr 20000 pro Minute. Bevorzugter beträgt die Anzahl der Hin- und Herbewegungen oder Oszillationen von ungefähr 2500 bis unge fähr 8000, wobei Hin- und Herbewegungen von ungefähr 3300 bis ungefähr 5000 besonders bevorzug werden. Natürlich kann die Zahl der Oszillationen von der Masse der gerührten Inhalte abhängig sein. Allgemein gesagt, erfordert eine größere Masse weniger Oszillationen. Ein weiteres Mittel zum Erzeugen des Schüttelns umfasst die Wirkung von Gas, das mit hoher Geschwindigkeit oder unter hohem Druck ausgestroßen wird.
Es ist ebenfalls verständlich, dass mit einem größeren Volumen an wässriger Lösung die Gesamthöhe der Kraft vorteilsweise entsprechend erhöht wird. Starkes Schütteln ist durch mindestens 60 Schüttelbewegungen pro Minute charakterisiert und wird bevorzugt. Bevorzugter ist Verwirbeln mit ungefähr 60 bis ungefähr 300 Umdrehungen pro Minute. Verwirbeln mit ungefähr 300 bis ungefähr 1800 Umdrehungen pro Minute wird besonders bevorzugt.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen einfachen Schüttelverfahren können sorgfältiger ausgearbeitete Verfahren angewandt werden. Derartige sorgfältig ausgearbeitete Verfahren umfassen zum Beispiel flüssigkristalline Schüttelverfahren unter Gaseinleitung und Vakuumtrocknungsverfahren unter Gaseinleitung, wie diejenigen, die in der U.S. Anmeldung mit der Anmeldenr. 08/076,250, eingereicht am 11. Juni 1993, beschrieben sind. Obwohl jede Techniken aus einer Zahl variierender Techniken verwendet werden kann, werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vesikelzusammensetzungn vorzugsweise unter Verwendung eines Schüttelverfahrens hergestellt. Die Schütteltechnik betrifft vorzugsweise das Rühren mit einer mechanischen Schüttelvorrichtung, wie zum Beispiel ein Espe Capmix (Seefeld, Oberay Deutschland) unter Verwendung von zum Beispiel den in der U.S. Anmeldung mit der Anmeldenr. 160,232, eingereicht am 30. November 1993, veröffentlichten Techniken.
Die Größe der gasgefüllten Vesikel kann auf Wunsch durch eine Vielzahl von Verfahren, umfassend zum Beispiel die Mikroemulgierung, Verwirbeln, Extrusion, Filtration, Beschallung, Homogenisierung, wiederholte Gefrier- und Tauzyklen, Extrusion unter Druck durch Poren mit definierter Größe und ähnliche Verfahren, angepasst werden. Gasgefüllte Vesikel, die gemäß den hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, können eine Größe im Bereich von weniger als ungefähr 1 μm bis mehr als un gefähr 100 μm aufweisen. Nach den Extrusions- und Sterilisationsverfahren, die nachstehend genau erörtert werden, sorgt weiterhin Rühren oder Schütteln für Vesikelzusammensetzungen, im wesentlichen keine oder eine minimale restliche wasserfreie Lipidphase im Rückstand der Lösung liefert. (Bangham, A. D., Standish, M. M. & Watkins, J. C., J. Mol. Biol. Band 13, Seiten 238–252 (1965). Auf Wunsch können die Vesikel der vorliegenden Erfindung so wie sie gebildet wurden, ohne einen Versuch einer weiteren Modifikation von deren Größe, verwendet werden. Zur intravaskulären Verwendung weisen die Vesikel vorzugsweise Durchmesser von weniger als ungefähr 30 μm und bevorzugter von weniger als ungefähr 12 μm auf. Zur zielgerichteten intravaskulären Verwendung, umfassend zum Beispiel das Binden an bestimmte Gewebe, wie zum Beispiel kanzerogenes Gewebe, können die Vesikel signifikant kleiner sein, zum Beispiel einen Durchmesser von ungefähr weniger als 100 nm aufweisen. Zur enterischen oder gastrointestinalen Verwendung können die Vesikel signifikant größer sein, zum Beispiel bis zu einer Größe von einem Millimeter. Die Vesikel werden vorzugsweise so dimensioniert, dass die Durchmesser von ungefähr 2 μm bis ungefähr 10 μm aufweisen.
Die gasgefüllten Vesikel könne durch ein einfaches Extrusionsverfahren durch Filter dimensioniert werden, wobei die Filterporengröße die Größenverteilung der resultierenden gasgefüllten Vesikel regelt. Durch Verwendung von zwei oder mehreren hintereinander geschalteten oder gestapelten Sätzen von Filtern, zum Beispiel ein 8 μm Filter auf einen 10 μm Filter folgend, können die gasgefüllten Vesikel so ausgewählt werden, dass sie eine sehr enge Größenverteilung um ungefähr 7 bis 9 μm herum aufweisen. Nach Filtration können diese gasgefültlen Vesikel für mehr als 24 Stunden stabil beliben.
Der Dimensionierungs- oder Filtrationsschritt kann durch Verwendung von zum Beispiel einem Filtersystem ausgeführt werden, wenn die Zusammensetzung vor der Verwendung aus einem sterilen Fläschchen entnommen wird, oder bevorzugter kann das Filtersystem in eine Spritze während der Verwendung eingebaut sein. Das Verfahren zum Dimensionieren der Vesikel wird dann die Verwendung einer Sprite, umfassend einen Zylinder, mindestens einen Filter und eine Nadel, umfassen und wird durch einen Extraktionsschritt ausgeführt, der das Extrudieren der Vesikel aus dem Zylinder durch den Filter, der in der Spritze zwischen dem Zylinder und der Nadel eingebaut ist, unter Dimensionierung der Vesikel bevor sie einem Patienten verabreicht werden, umfasst. Der Extraktionsschritt kann ebenfalls das Ziehen der Vesikel in die Spritze umfassen, wobei der Filter auf dieselbe Weise zum Dimensionieren der Vesikel bei Eintritt in die Spritze funktioniert. Eine weitere Alternative besteht darin, eine derartige Spritze mit Vesikel zu füllen, die schon durch andere Mittel dimensioniert worden sind, wobei in diesem Fall der Filter nun das bewirkt, dass sichergestellt wird, dass nur Vesikel innerhalb des gewünschten Größenbereichs oder mit der gewünschten maximalen Größe nachfolgend durch Extrusion aus der Spritze verabreicht werden.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können die Vesikelzusammensetzungen vor dem Schütteln hitzesterilisiert oder filtersterilisiert und durch einen Filter extrudiert werden. Allgemein gesagt, können Vesikelzusammensetzungen, die ein Gas umfassen, hitzesterilisiert werden und Vesikelzusammensetzungen, die gasförmige Vorläufer umfassen, können filtersterilisiert werden. Sobald die gasgefüllten Vesikel gebildet sind, können sie, wie vorstehend beschrieben ist, zum Dimensionieren filtriert werden. Das Durchführen dieser Schritte vor der Bildung der mit Gas oder gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel stellt sterile gasgefüllte Vesikel zur Verfügung, die fertig zur Verabreichung an einen Patienten sind. Zum Beispiel kann ein Mischbehälter, wie zum Beispiel ein Fläschchen oder eine Spritze mit einer filtrierten Lipidzusammensetzung gefüllt sein und die Zusammensetzung kann innerhab des Mischbehälters, zum Beispiel durch Behandlen mit einem Autoklaven, sterilisiert werden. In die Zusammensetzung kann Gas eingeleitet werden, um gasgefüllte Vesikel durch Schütteln des sterilen Behälters zu bilden. Der sterile Behälter ist vorzugsweise mit einem Filter ausgestattet, der so angeordnet ist, dass die gasgefüllten Vesikel vor dem Kontakt mit einem Patienten durch den Filter hindurchgehen.
Der Schritt des Extrudierens der Lösung der Lipidverbindung durch einen Filter verringert die Menge an nicht hydratisiertem Material, indem jegliche getrockneten Materialien zerbrochen werden und eine größere Oberfläche der Hydratation ausgesetzt wird. Der Filter weist vorzugsweise eine Porengröße von ungefähr 0,1 bis 5 μm, bevorzugter ungefähr 0,1 bis ungefähr 4 μm, noch bevorzugter ungefähr 0,1 bis ungefähr 2 μm und besonders bevorzugt ungefähr 1 μm auf. Nicht hydratisierte Verbin dung, die im Allgemeinen unerwünscht ist, erscheint als amorphe Brocken von nicht einheitlicher Größe.
Der Sterilisationsschritt sorgt für eine Zusammensetzung, die ohne weiteres einem Patienten zur diagnostischen Bildgebung, umfassend zum Beispiel Ultraschall oder CT, verabreicht werden kann. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die Sterilisation durch Hitzesterilisation, vorzugsweise durch Behandeln der Lösung mit einem Autoklaven bei einer Temperatur von mindestens ungefähr 100°C und bevorzugter durch Behandeln im Autoklaven bei ungefähr 100°C bis ungefähr 130°C, noch bevorzugter bei ungefähr 110°C bis ungefähr 130°C, weiterhin bevorzugter bei ungefähr 120°C bis ungefähr 130°C und besonders bevorzugt bei ungefähr 130°C, ausgeführt werden. Das Erhitzen findet vorzugsweise während mindestens ungefähr 1 Minute, bevorzugter ungefähr 1 bis ungefähr 30 Minuten, noch bevozugter ungefähr 10 bis ungefähr 20 Minuten und besonders bevorzugt während ungefähr 15 Minuten statt.
Auf Wunsch können die Extrusions- und Erhitzungsschritte, wie sie vorstehend ausgeführt sind, umgekehrt werden oder es nur einer der beiden Schritte verwendet werden. Andere Sterilisationswege könne verwendet werden, umfassend zum Beispiel Bestrahlen durch Gammastrahlung.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Ausführungsformen können Vesikel, die gasförmige Vorläufer enthalten, formuliert werden, die nach Aktivierung zum Beispiel durch Aussetzen einer erhöhten Temperatur, variierendem pH-Wert oder Licht einen Phasenübergang von zum Beispiel einer Flüssigkeit, umfassend einer in einem Vesikel eingeschlossenen Flüssigkeit, zum einem Gas, das sich unter Erzeugung der hier beschriebenen gasgefüllten Vesikel ausdehnt, erfahren. Diese Technik ist ausführlich in den Patentanmeldungen mit den Anmeldenummern 08/160,232, eingereicht am 30 November 1993 und 08/159,687, eingereicht am 30 November 1993, beschrieben.
Das bevorzugte Verfahren zum Aktivieren des gasförmigen Vorläufers besteht in dem Aussetzen gegenüber erhöhter Temperatur. Die Aktivierungs- oder Übergangstemperatur und ähnliche Ausdrücke beziehen sich auf den Siedepunkt des gasförmigen Vorläufers und ist die Temperatur, bei der der Phasenübergang des gasförmigen Vorläufers von Flüssigkeit zu Gas stattfindet. Verwendbare gasförmigen Vorläufer sind diejenigen Materialien, die Siedepunkte im Bereich von ungefähr –100°C bis ungefähr 70°C aufweisen. Die Aktivierungstemperatur ist für jeden gasförmigen Vorläufer besonders. Eine Aktivierungstemperatur von ungefähr 37°C oder von ungefähr der menschlichen Körpertemperatur wird für die gasförmigen Vorläufer im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Daher wird in einer bevorzugten Form ein flüssiger gasförmiger Vorläufer bei ungefähr 37°C oder weniger aktiviert, wobei er ein Gas wird. Der gasförmige Vorläufer kann zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung in flüssiger Phase oder gasförmiger Phase vorliegen.
Die Verfahren zum Herstellen der mit dem gasförmigen Vorläufer gefüllten Vesikel können unterhalb des Siedepunktes des gasförmigen Vorläufers ausgeführt werden, so dass eine Flüssigkeit, zum Beispiel in ein Vesikel eingebaut ist. Zusätzlich können die Verfahren am Siedepunkt des gasförmigen Vorläufers so ausgeführt werden, dass ein Gas zum Beispiel in ein Vesikel eingebaut wird. Für gasförmige Vorläufer mit Siedepunkten bei niedriger Temperatur können flüssige Vorläufer unter Verwendung einer Mikroverflüssigungsvorrichtung, die bei niedriger Temperatur, stark abgekühlt worden ist, emulgiert werden. Dies Siedepunkte können ebenfalls unter Verwendung von Lösungsmitteln in flüssigen Medien zur Verwendung eines Vorläufers in flüssiger Form abgesenkt werden. Weiterhin können die Verfahren durchgeführt werden, bei denen die Temperatur bei dem Verfahren durchgehend erhöht wird, wobei das Verfahren mit einem gasförmigen Vorläufer als Flüssigkeit beginnt und mit einem Gas endet.
Der gasförmige Vorläufer kann so ausgewählt werden, dass er in situ das Gas in dem Gewebe oder der Flüssigkeit, auf die gezielt wird, bei Eintritt in vivo in den Patienten oder das Tier bildet, vor Verwendung während der Lagerung oder während der Herstellung. Die Verfahren zur Herstellung der Temperatur-aktivierten mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel können bei einer Temperatur unterhalb des Siedepunktes des gasförmigen Vorläufers ausgeführt werden. In dieser Ausführungsform ist der gasförmige Vorläufer innerhalb eines Vesikels so eingeschlossen, dass der Phasenübergang nicht während der Herstellung stattfindet. Stattdessen werden die mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel in der flüssigen Phase des gasförmigen Vorläufers hergestellt. Die Aktivierung des Phasenübergangs findet immer dann statt, wenn man die Temperatur den Siedepunkt des Vorläufers überschreiten lässt. Bebfalls kann die Größe der Vesikel beim Erlangen des gasförmigen Zustands bestimmt werden, indem man die Menge der Flüssigkeit in einem Tröpchen des flüssigen gasförmigen Vorläufers kennt. Alternativ dazu können die gasförmigen Vorläufer zum Erzeugen stabiler gasgefüllter Vesikel verwendet werden, die vor Verwendung vorgebildet werden. In dieser Ausführungsform wird der gasförmige Vorläufer in einen Behälter gegeben, der eine Lipidzusammensetzung bei einer Temperatur unterhalb der Phasenübergangstemperatur von Flüssigkeit zu Gas des entsprechenden gasförmigen Vorläufers enthält. Wird die Temperatur erhöht und eine Emulsion zwischen dem gasförmigen Vorläufer und der flüssigen Lösung gebildet, erfährt der gasförmige Vorläufer einen Übergang von dem flüssigen zum gasförmigen Zustand. Als Ergebnis dieses Erwärmens und der Gasbildung verdrängt das Gas die Luft in dem Kopfraum über der flüssigen Mischung, so dass sich gasgefüllte Vesikel bilden, in die das Gas des gasförmigen Vorläufers, Gas aus der Umgebung (zum Beispiel Luft) einschließen, oder die den gasförmigen Vorläufer im gasförmigen Zustand und Luft aus der Umgebung zusammen einschließen. Dieser Phasenübergang kann zum optimalen Mischen und zur Bildung des Kontrastmittels verwendet werden. Zum Beispiel kann der gasförmige Vorläufer, zum Beispiel Perfluorbutan in die Lipidvesikel eingeschlossen werden und wen die Temperatur über den Siedepunkt von Perfluorbutan (4°C) erhöht wird, wird Perfluorbutan in die Vesikel eingeschlossen.
Dementsprechend können die gasförmigen Vorläufer so ausgewählt werden, dass sie gasgefüllte Vesikel in vivo bilden oder sie können so ausgelegt werden, dass sie gasgefüllte Vesikel in situ während des Herstellungsverfahren, bei der Lagerung oder zu einer beliebigen Zeit vor der Verwendung, erzeugen. Zum Aktivieren der zielgerichteten gasgefüllten Vesikel aus den temperaturempfindlichen gasförmigen Vorläufer vor der intravenösen Injektion kann ein Wasserbad, eine Beschallungsvorrichtung oder hydrodynamische Aktivierung durch Zurückziehen des Kolbens einer Spritze gegen einen Sperrhahn verwendet werden.
Als weitere Ausführungsform dieser Erfindung kann durch Vorbilden des gasförmigen Vorläufers im flüssigen Zustand in einer wässrigen Emulsion die maximale Größe des Vesikels unter Verwendung des idealen Gasgesetztes abgeschätzt werden, so bald der Übergang in den gasförmigen Zustand bewirkt worden ist. Zum Zwecke der Herstellung der gasgefüllten Vesikel aus gasförmigen Vorläufern wird angenommen, dass die Gasphase sofort gebildet wird und im Wesentlichen keine Verarmung an Gas in dem neu gebildeten Vesikel aufgrund der Diffusion in die Flüssigkeit, die im Allgemeinen wässriger Natur ist, auftritt. Daher wäre man ausgehend von einem bekannten Flüssigkeitsvolumen in der Emulsion in der alge, eine pbere Grenze für die Größe der gasgefüllten Vesikel vorherzusagen.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Mischung aus einer Lipidverbindung und einem gasförmigem Vorläufer, enthaltend flüssige Tröpfchen mit definierter Größe, so formuliert werden, dass bei Erreichen einer spezifischen Temperatur, zum Beispiel den Siedepunkt des gasförmigen Vorläufers, die Tröpfchen sich in die gasgefüllten Vesikel mit definierter Größe ausdehnen. Die definierte Größe stellt eine Obergrenze für die tatsächliche Größe dar, weil das ideale Gasgesetz nicht derartige Faktoren, wie die Gasdiffusion in die Lösung, Verlust von Gas an die Atmosphäre und die Wirkungen eines erhöhten Drucks, berücksichtigt.
Das ideale Gasgesetz, das zum Berechnen der Zunahme des Volumens der Gasbläschen beim Übergang vom flüssigen zu dem gasförmigen Zustand verwendet werden kann, ist wie folgt: PV = nRTwobei
P der Druck in Atmosphären (atm) ist;
V das Volumen in Liter (l) ist;
N die Anzahl Mole des Gases ist;
T die Temperatur in Grad Kelvin (K) ist und
R die ideale Gaskonstante (22,4 l atm/K Mol) ist.
Mit Kenntnis des Volumens, der Dichte und Temperatur der Flüssigkeit in der Mischung von Flüssigkeiten, kann die Menge zum Beispiel in Mol und das Volumen des flüssigen Vorläufers berechnet werden, die bei Umwandlung in ein Gas sich in Vesikel mit bekanntem Volumen ausdehnen. Das berechnete Volumen wird eine Obergrenze für die Größe der gasgefüllten Vesikel widerspiegeln, unter der Annahme ei ner sofortigen Ausdehnung in ein gasgefülltes Vesikel und vernachlässigbarer Difussion des Gases über die Zeit der Ausdehnung.
Daher kann zur Stabilisierung des Vorläufers im flüssigen Zustand in einer Mischung, in der das Vorläufertröpfchen kugelförmig ist, das Volumen des Vorläufertröpfchens durch die folgende Gleichung bestimmt werden: Volumen (kugelförmiges Vesikel) = 4/3πr3 wobei
r der Radius der Kugel ist.
Daher kann sobald das Volumen vorhergesagt ist und die Dichte der Flüssigkeit bei der gewünschten Temperatur bekannt ist, die Menge des flüssigen gasförmigen Vorläufers in dem Tröpfchen bestimmt werden. Beschreibender ausgedrückt, kann Folgendes angewandt werden: VGas = 4/3π(rGas)3 mit dem idealen Gasgesetz PV = nRTergibt die Substitution VGas = nRT/PGas oder

(A) n = 4/3[πrGas 3]P/RT Menge n = 4/3[πrGas 3P/RT]·MWn Umformung zurück in ein Volumen der Flüssigkeit
(B) VFlüss. = [4/3[πrGas 3]P/RT]·MWn/Dwobei D die Fichte des Vorläufers ist. Auflösung nach dem Durchmesse des flüssigen Tröpfchens
(C) Durchmesser/2 = [3/4π[4/3·[πrGas 3]P/RT]MWn/D]1/3 welches sich zurückführen lässt auf Durchmesser = 2[[rGas 3]P/RT[MWn/D]]1/3.

Als weiteres Mittel zur Herstellung von Vesikeln mit der gewünschten Größe zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung, und unter Kenntnis des Volumens und insbesondere des Radius der Flüssigkeitströpfchen, können geeigne te dimensionierte Filter verwendet werden, um die gasförmigen Vorläufertröpfchen in Kugeln mit geeignetem Durchmesser zu dimensionieren.
Ein repräsentativer gasförmiger Vorläufer kann zum Bilden eines Vesikeln mit definierter Größe, zum Beispiel 10 μm Durchmesser, verwendet werden. In diesem Beispiel wird das Vesikel im Blutstrom eines Menschen gebildet, wobei daher die typische Temperatur 37°C oder 310 K wäre. Bei einem Druck von 1 Atmosphäre und unter Verwendung der Gleichung in (A), wären 7,54 × 10^–17 Mol des gasförmigen Vorläufers erforderlich um das Volumen eines Vesikels mit einem Durchmesser von 10 μm zu füllen.
Unter Verwendung der vorstehend berechneten Menge an gasförmigem Vorläufer und 1-Fluorbutan, das ein Molekulargewicht von 76,11, einen Siedepunkt von 32,5°C und eine Dichte von 0,7789 g/ml bei 20°C aufweist, sagen weitere Berechnungen voraus, das 5,74 × 10^–5 g dieses Vorläufers für eine 10 μm Vesikel erforderlich sind. Weitere Extrapolation und mit Kenntnis der Dichte, sagt Gleichung (B) weiterhin voraus, dass 8,47 × 10^–6 ml an flüssigem Vorläufer notwendig sind, um eine Vesikel mit einem oberen Grenzwert von 10 μm zu bilden.
Schließlich wird unter Verwendung von Gleichung (C) eine Mischung, zum Beispiel eine Emulsion, die Tröpfchen mit einem Radius von 0,0272 μm oder einem entsprechenden Durchmesser von 0,0544 μm enthält, zur Herstellung eines mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikels mit einem oberen Grenzwert eines 10 μm Vesikels gebildet.
Eine Emulsion dieser speziellen Größe könnte einfach durch Verwendung eines geeignet dimensionierten Filters erreicht werden. Außerdem, wie durch die Größe des zur Bildung von Tröpfchen definierter Größe des gasförmigen Vorläufers notwendigen Filters ersichtlich ist, würde die Größe des Filter ebenfalls genügen, um alle möglichen bakteriellen Verunreinigungen zu entfernen und er kann daher ebenso für die sterile Filtration verwendet werden.
Diese Ausführungsform zur Herstellung gasgefüllter Vesikel kann auf alle gasförmigen Vorläufer, die mittels Temperatur aktiviert werden, angewandt werden. Tatsäch lich gestattet ein Absenken des Gefrierpunktes des Lösungsmittelsystems die Verwendung gasförmiger Vorläufer, die bei Temperaturen von weniger als 0°C Phasenübergänge von Flüssigkeit zu Gas erfahren würden. Das Lösungsmittelsystem kann so ausgewählt werden, dass es ein Medium zur Suspension des gasförmigen Vorläufers zur Verfügung stellt. Zum Beispiel zeigt 20% Propylenglycol, der in gepufferter Salzlösung mischbar ist, eine Gefrierpunkterniedrigung gut unterhalb des Gefrierpunktes von nur Wasser. Durch Erhöhen der Menge an Propylenglycol oder Zugeben von Materialien, wie zum Beispiel Natriumchlorid kann der Gefrierpunkt noch weiter erniedrigt werden.
Die Auswahl des geeigneten Lösungsmittelsystems kann ebenfalls durch physikalische Verfahren bestimmt werden. Werden feste oder flüssige Substanzen, die hier als gelöste Stoffe bezeichnet werden, in einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel auf Wasser basierende Puffer gelöst, wird der Gefrierpunkt in einer Höhe erniedrigt, die von der Zusammensetzung der Lösung abhängt. Man kann daher, entsprechend der Definition von Wall, die Gefrierpunkterniedrigung des Lösungsmittels durch die folgende Gleichung ausdrücken: Lnxa = In(1 – xb) = ΔHSmp/R(1/T0 – 1/T)wobei
xa der Molbruchteil des Lösungsmittel ist;
xb der Molbruchteil des gelösten Stoffes ist;
ΔH_Smp die Schmelzenthalpie des Lösungsmittels ist und
T₀ der normale Gefrierpunkt des Lösungsmittels ist.
Der normale Gefrierpunkt des Lösungsmittels kann durch Lösen der Gleichung erhalten werden. Falls x_b bezüglich x_a relativ klein ist, dann die vorstehenden Gleichung folgendermaßen umgeschrieben werden: Xb = ΔHSmp/R[T – T0/T0T] = ΔHSmpΔT/RT0 2
Die vorstehende Gleichung setzt voraus, dass die Änderung der Temperatur ΔT klein im Vergleich zu T₂ ist. Diese Gleichung kann weiterhin vereinfacht werden, indem die Konzentration des gelösten Stoffes bezüglich der Molalität, m (Mol des gelösten Stoffes pro Tausend Gramm Lösungsmittel) ausgedrückt wird. Die Gleichung kann daher folgendermaßen umgeschrieben werden. Xb = m/[m + 1000/ma] = mMa/1000 wobei Ma das Molekulargewicht des Lösungsmittels ist.
Daher ergibt die Substitution des Bruchteils x_b: ΔT = [MaRT0 2/1000ΔHSmp]moder ΔT = Kfm,wobei Kf = MaRT0 2/1000ΔHSmp ist
K_f ist der molale Gefrierpunkt und ist gleich 1,86 Grad pro molaler Konzentrationseinheit für Wasser bei einem Druck von einer Atmosphäre. Die vorstehende Gleichung kann zur genauen Bestimmung des molalen Gefrierpunktes von Lösungen der mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel verwendet werden. Dementsprechend kann die vorstehende Gleichung zum Schätzen der Gefrierpunkterniedrigungen und zum Bestimmen der geeigneten Konzentrationen an flüssigen oder festen gelösten Stoffen, die zum Erniedrigen der Gefriertemperatur des Lösungsmittels auf einen geeigneten Wert notwendig sind, angewandt werden.
Verfahren zum Herstellung der Temperatur-aktivierten mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel umfassen:

(a) Verwirbeln und/oder Schütteln einer wässrigen Mischung aus gasförmigem Vorläufer und zusätzlichen Materialien, wie erwünscht ist, umfassend zum Beispiel stabilisierende Materialien, Verdickungsmittel und/oder Dispergiermittel. Wahlweise Variationen dieses Verfahren umfassen das Behandeln mit einem Autoklaven vor dem Verwirbeln oder Schütteln; das Erhitzen einer wässrigen Mischung gasförmiger Vorläufer; das Entlüften des die Mischung/Suspension enthaltenden Behälters; das Schütteln oder das Gestatten, dass das mit gasförmigem Vorläufer gefüllte Vesikel sich spontan bildet und das Abkühlen der Suspension der mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel; und das Extrudieren einer wässrigen Suspension von gasförmigem Vorläufer durch ein Filter mit ungefähr 0,22 μm. Alternativ dazu kann das Filtrieren während der in vivo Verabreichung der Vesikel so durchgeführt werden, das ein Filter von ungefähr 0,22 μm verwendet wird.
(b) Mikroemulgierung, wobei eine wässrige Mischung des gasförmigen Vorläufers durch Rühren emulgiert wird und zur Bildung von zum Beispiel Vesikeln vor Verabreichung an einen Patienten erhitzt wird;
(c) Erhitzen eines gasförmigen in einer Mischung unter oder ohne Rühren, wobei die weniger dichten mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel durch Ausdehnen und Verdrängen von anderen Vesikeln in dem Behälter auf die Oberfläche der Lösung schwimmen und der Behälter zum Abblasen von Luft entlüftet wird, und
(d) Verwenden eines abgedichteten Behälters in dem der vorstehenden Verfahren, zum Aufnehmen der wässrigen Suspension des gasförmigen Vorläufers und Aufbewahren der Suspension bei einer Temperatur unterhalb der Phasenübergangstemperatur des gasförmigen Vorläufers, gefolgt von Behandlung mittels einem Autoklaven, um die Temperatur auf einer Wert über der Phasenübergangstemperatur zu erhöhen, gegebenenfalls unter Schütteln oder Gestatten, dass sich die mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel spontan bilden, wobei der ausgedehnte gasförmige Vorläufer in dem abgedichteten Behälter den Druck in dem Behälter erhöht, und Abkühlen der Suspension gasgefüllter Vesikel, worauf ebenfalls Schütteln stattfinden kann.

Gefriertrocknen ist zum Entfernen von Wasser und organischen Materialien vor dem Einleitungsverfahren unter Schütteln verwendbar. Trocknende Einleitungsverfahren können zum Entfernen von Wasser aus den Vesikeln verwenet werden. Durch vorheriges Einschließen des gasförmigen Vorläufers in die getrockneten Vesikel (das heißt vo dem Trocknen) kann der gasförmige Vorläufer nach Erwärmen unter Auffüllen der Vesikel sich ausdehnen. Gasförmige Vorläufer können ebenfalls zum Füllen getrockneter Vesikel verwendet werden, nachdem sich einem Vakuum ausgesetzt worden waren. Da die getrockneten Vesikel bei einer Temperatur, die unterhalb ihrer Temperatur von Gelzustand zu flüssigkristallinem Zustand liegt, kann die Trocknungskammer langsam mit dem gasförmigen Vorläufer in seinem gasförmigen Zustand gefüllt werden. Zum Beispiel kann Perfluorbutan zum Füllen getrockneter Vesikel bei Temperatur von mehr als 4°C (der Siedepunkt von Perfluorbutan) verwendet werden.
Bevorzugte Verfahren zum Herstellung der mit Temperatur-aktiviertem gasförmigen Vorläufer gefüllten Vesikel umfassen Schütteln einer wässrigen Lösung die eine Li pidverbindung in Gegenwart eines gasförmigen Vorläufers bei einer Temperatur unterhalb der Phasenübergangstemperatur des gasförmigen Vorläufers von flüssigem Zustand zu gasförmigem Zustand aufweist. Dies wird vorzugsweise bei einer Temperatur durchgeführt, die unterhalb der Phasenübergangstemperatur des Lipids von Gelzustand zu flüssigkristallinem Zustand liegt. Dann wird die Mischung auf eine Temperatur erwärmt, die über der Phasenübergangstemperatur des gasförmigen Vorläufers von flüssigem Zustand zu gasförmigem Zustand liegt, wodurch bewirkt wird, dass der Vorläufer verdampft und expandiert. Dann wird das Erwärmen unterbrochen und man lässt die die Temperatur der Mischung auf einen Wert fallen, der unterhalb der Phasenübergangstemperatur des gasförmigen Vorläufers von flüssigem Zustand zu gasförmigem Zustand liegt. Dann kann ein Schütteln der Mischung während des Erwärmungsschritts oder anschließend nachdem man die Mischung abkühlen ließ, stattfinden.
Weitere Verfahren zum Herstellung von mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikeln kann ein Schütteln einer wässrigen Lösung von zum Beispiel einem Lipid und einem gasförmigem Vorläufer, und das Trennen der resultierenden mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel betreffen.
Herkömmliche wässrig gefüllte Liposomen aus dem Stand der Technik werde routinemäßig bei einer Temperatur gebildet, die über der Phasenübergangstemperatur der zu deren Herstellung verwendeten Lipide liegt, da sie flexibler sind und daher in biologischen Systemen in dem flüssigkristallinem Zustand verwendbar sind. Siehe zum Beispiel Szoka und Paphadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. 1978, 75, 4194–4198. Im Gegensatz dazu sind die gemäß den hier beschriebenen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen hergestellte Lipide mit gasförmigem Vorläufer gefüllt, der eine größere Flexibilität verleiht, das die gasförmigen Vorläufer nach Gasbildung kompressibler willfähriger sind, als eine wässrige Lösung.
Die von der vorliegenden Erfindung betrachteten Verfahren stellen zum Schütteln eine wässrige Lösung, umfassend ein Lipid, in Gegenwart eines Temperatur-aktivierbaren gasförmigen Vorläufers zur Verfügung. Das Schütteln weist vorzugsweise eine ausreichende Kraft auf, so dass innerhalb einer kurzen Zeitdauer, wie zum Beispiel ungefähr 30 Minuten und vorzugsweise innerhalb von ungefähr 20 Minuten und bevorzugter innerhalb von 10 Minuten, ein Schaum gebildet wird. Das Schütteln kann Mikroemulgieren, Mikroverflüssigen, Herumwirbeln (wie zum Beispiel Verwirbeln), eine Bewegung von Seite zu Seite oder eine Auf- und Abbewegung betreffen. Im Falle der Zugabe des gasförmigen Vorläufers im flüssigen Zustand kann zusätzlich zu den vorstehend ausgeführten Schüttelverfahren eine Beschallung verwendet werden. Weiterhin können unterschiedliche Bewegungsarten kombiniert werden. Das Schütteln kann ebenfalls durch Schütteln des Behälters, der die wässrige Lipidlösung enthält, oder durch Schütteln der wässrigen Lösung innerhalb des Behälters ohne Schütteln des Behälters selbst stattfinden. Das Schütteln kann weiterhin manuell oder maschinell stattfinden. Mechanische Schüttelvorrichtungen, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel die vorstehend beschriebenen mechanischen Schüttelvorrichtungen, wobei ein Espe Capmix (Seefeld, Oberay, Deutschland) bevorzugt wird. Ein weiteres Mittel zum Erzeugen des Schüttelns umfasst die Wirkung eines gasförmigen Vorläufers, der mit hoher Geschwindigkeit oder unter hohem Druck ausgestoßen wird.
Entsprechend den hier beschriebenen Verfahren kann ein Gas, wie zum Beispiel Luft ebenfalls durch die lokale Umgebungsatmosphäre zur Verfügung gestellt werden. Die lokale Umgebungsatmosphäre kann die Atmosphäre innerhalb eines abgedichteten Behälters, sowie die äußere Umgebung umfassen. Alternativ dazu kann zum Beispiel ein Gas in den Behälter mit der wässrigen Lipidlösung oder in die wässrige Lipidlösung selbst eingespritzt oder anderweitig dazu gegeben werden, um ein Gas zur Verfügung zu stellen, das ein anderes als Luft ist. Gase, die leichter als Luft sind, werden im Allgemeinen in einen dicht verschlossenen Behälter gegeben, während Gase die schwerer als Luft sind zu einem dicht verschlossenen oder nicht verschlossenen Behälter gegeben werden. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung das gleichzeitige Einschliessen von Luft und/oder anderen Gasen zusammen mit den gasförmigen Vorläufern.
Daher können die mit gasförmigem Vorläufer gefüllten Vesikel im Wesentlichen in derselben Weise verwendet werden, wie die hier beschriebenen gasgefüllten Vorläufer, sobald sie durch Aufbringen auf die Gewebe eines Wirts aktiviert sind, wobei derartige Faktoren, wie Temperatur oder pH-Wert verwendet werden können, um das Gas zu erzeugen. Es wird bevorzugt, dass die gasförmigen Vorläufer Phasenübergänge von flüssigen zu gasförmigen Zuständen in der Nähe der normalen Kör pertemperatur des Wirts durchmachen und, dass sie dabei, zum Beispiel durch die in vivo Temperatur des Wirts, aktiviert werden, damit sie darin den Übergang in die Gasphase erfahren. Alternierend kann eine Aktivierung vor der intravenösen Injektion, zum Beispiel durch thermische, mechanische oder optische Mittel verwendet werden. Diese Aktivierung kann dort auftreten, wo zum Beispiel das Wirtsgewebe menschliches Gewebe mit einer normalen Temperatur von ungefähr 37°C ist und die gasförmigen Vorläufer machen Phasenübergänge von flüssigen zu gasförmigen Zuständen in der Nähe von 37°C durch.
Wie vorstehend angemerkt wurde, können die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen durch einen Autoklaven oder sterile Filtraton sterilisiert werden, wenn diese Verfahren vor dem Einleitungsschritt oder vor der Temperatur-vermittelten Umwandlung der temperaturempfindlichen gasförmigen Vorläufer innerhalb der Zusammensetzung durchgeführt werden. Alternativ dazu können ein oder mehrere antibakterielle Mittel und/oder Konservierungsstoffe in die Formulierung der Zusammensetzungen eingeschlossen werden, wie zum Beispiel Natriumbenzoat, quartäre Ammoniumsalze, Natriumazid, Methylparaben, Propylparaben, Sorbinsäure, Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Chlorbutanol, Dehydroessigsäure, Ethylendiamin, Monothioglycerol, Kaliumbenzoat, Kalium metabisulfid, Kaliumsorbat, Natriumbisulfit, Schwefeldioxid und organische Quecksilbersalze. Eine derartige Sterilisation, die ebenfalls durch andere herkömmliche Mittel erreicht werden kann, wird dann notwendig sein, wenn die stabilisierten Vesikel zum Abbilden unter invasiven Umständen, zum Beispiel intravaskulär oder intraperitoneal, verwendet werden. Das geeignete Sterilisationsmittel wird für den Fachmann, basierend auf der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein.
Vesikelzusammensetzungen, die Vesikel umfassen, die aus Proteinen (ebenfalls als Protein-eingekapselte Mikrobläschen bezeichnet) formuliert sind, wie zum Beispiel Albuminvesikel, können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, wie für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich ist, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist. Geeignete Verfahren umfassen diejenigen, die zum Beispiel in Feinstein, U.S Patent Nr. 4,572,203, 4,718,433 und 4,774,958 und Cerny et al., U.S Patent Nr. 4,957,656 beschrieben sind. Die in den vorstehend erwähnten Patenten zur Herstellung von Protein-basierenden Vesikeln beschriebenen Verfahren umfassen Verfahren, die die Beschallung einer Proteinlösung betreffen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Ausgangsmaterial eine wässrige Lösung eine durch Hitze denaturierbaren wasserlöslichen biologisch verträglichen Proteins sein. Das einkapselnde Protein ist vorzugsweise wärmeempfindlich, so dass es durch Erwärmen während Beschallung teilweise unlöslich gemacht werden kann. Geeignete wärmeempfindliche Proteine umfassen zum Beispiel Albumin. Hämoglobin, Collagen und dergleichen. Das Protein ist vorzugsweise ein menschliches Protein, wobei menschliches Serumalbumin (HSA) besonders bevorzugt ist. HSA ist als sterile 5% wässrige Lösung, die zur Verwendung in der Herstellung der Protein-basierenden Vesikel geeignet ist, handelsüblich. Natürlich wäre es für den Durchschnittsfachmann offensichtlich, dass andere Albuminkonzentrationen, sowie auch andere Proteine, die durch Wärme denaturierbar sind, zur Herstellung der Vesikel verwendet werden können. Allgemein gesagt, kann die HSA-Konzentration variieren und kann im Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 25 Gewichts-%, und in allen darin liegenden Kombinationen und Subkombinationen von Bereichen liegen. Es kann im Zusammenhang mit bestimmten Verfahren zur Herstellung Protein-basierender Vesikel bevorzugt sein, das Protein in Form einer verdünnten wässrigen Lösung zu verwenden. Für Albumin kann es bevorzugt sein, eine wässrige Lösung, die von ungefähr 0,5 bis ungefähr 7,5 Gewichts-% Albumin enthält, zu verwenden, wobei Konzentrationen von weniger als ungefähr 5 Gewichts-% bevorzugter sind, zum Beispiel von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3 Gewichts-%.
Die Protein-basierenden Vesikel können unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gerätes hergestellt werden. Zum Beispiel können im Zusammenhang mit einem Einspeisungsbetrieb bei der Herstellung, wie zum Beispiel in Cerny, et al., U.S. Patent Nr. 4,957,656 offenbart ist, Edelstahlbehälter, die von Walker Stainless Equipment Co. (New Lisbon, WI) kommerziell erhältlich sind, und Prozessfilter, die von Millipore (Bedford, MA) kommerziell erhältlich sind, verwendet werden.
Der Beschallungsbetrieb kann sowohl einen Wärmeaustauscher als auch einen Strom durch den Beschallungsbehälter aufeinanderfolgend verwenden. Das Wärmeaustauschergerät von dieser Art kann von ITT Standard (Buffalo, NY) erhalten werden. Der Wärmeaustauscher erhält die Betriebstemperatur für den Beschallungsvorgang, wobei die Temperatur im Bereich von ungefähr 65°C bis ungefähr 80°C in Abhängigkeit von dem Aufbau der Medien, gesteuert wird. Die Vibrationsfrequenz des Beschallungsgeräts kann über einen großen Bereich variieren, zum Beispiel von ungefähr 5 bis ungefähr 40 Kilohertz (kHz), wobei die Mehrheit der handelsüblichen Beschallungsvorrichtungen bei ungefähr 10 oder 20 kHz betrieben werden. Ein geeignetes Beschallungsgerät umfasst zum Beispiel ein Sonics & Materials Vibra-Cell, ausgestattet mit einem Schalltrichter mit flachen Ende, der kommerziell von Sonics & Materials, Inc. (Danbury, CT) erhältlich ist. Die auf den Schalltrichter angewandte Leistung kann über die Leistungseinstellungen, die von dem Hersteller auf einer Skala von 1 bis 10 liegen, wie bei dem Sonics & Materials Vibra-Cell Model VL1500, variiert werden. Eine dazwischen liegende Leistungseinstellung, zum Beispiel von 5 bis 9, kann verwendet werden. Es wird bevorzugt, dass die Vibrationsfrequenz und die gelieferte Leistung ausreichend sind, um eine Kavitation in der beschallten Flüssigkeit zu erzeugen. Die Zufuhrfließgeschwindigkeiten können im Bereich von ungefähr 50 ml/min bis ungefähr 1000 ml/min und in allen darin liegenden Kombinationen und Subkombinationen von Bereichen liegen. Die Verweilzeiten in dem Beschallungsgefäß können im Bereich von ungefähr 1 Sekunde bis ungefähr 4 Minuten, und Zugabegeschwindigkeiten des gasförmigen Fluids können im Bereich von ungefähr 10 Kubikzentimeter (cc) pro Minute bis ungefähr 100 cc/min, oder 5% bis 25% der Zufuhrfließgeschwindigkeit in allen darin liegenden Kombinationen und Subkombinationen von Bereichen liegen.
Es kann bevorzugt sein, die Beschallung so auszuführen, dass ein Aufschäumen und insbesondere ein kräftiges Aufschäumen der Lösung erzeugt wird. Allgemein gesagt, sind ein kräftiges Aufschäumen und eine Aerosolbildung wichtig, um ein Kontrastmittel mit erhöhter Konzentration und Stabilität zu erhalten. Zur Unterstützung der Schaumbildung kann der Leistungseingang in den Schalltrichter erhöht werden und das Verfahren kann unter milden Druck, zum Beispiel ungefähr 1 bis ungefähr 5 psi, betrieben werden. Die Schaumbildung kann leicht durch das trübe Aussehen der Lösung und durch den erzeugten Schaum nachgewiesen werden.
Geeignete Verfahren zur Herstellung Protein-basierender Vesikel können ebenfalls eine physikalische oder chemische Veränderung de Proteins oder des Proteinderivats in wässriger Lösung zum Denaturieren oder Fixieren des Materials betreffen. Zum Beispiel können Protein-basierende Vesikel aus einer 5% wässrigen HSA-Lösung durch Erwärmen nach oder während der Bildung des Kontrastmittels über Beschallung hergestellt werden. Eine chemische Veränderung kann das chemische Denaturieren oder Fixieren durch Binden des Proteins mit einem difunktionellen Aldehyd, wie zum Beispiel Glutaraldehyd betreffen. Zum Beispiel können die Vesikel mit 0,25 Gramm 50% wässrigem Glutaraldehyd pro Gramm Protein bei einem pH-Wert von 4,5 während 6 Stunden umgesetzt werden. Der nicht umgesetzte Glutaraldehyd kann dann von dem Protein abgewaschen werden.
In jeder der vorstehend beschriebenen Techniken zur Herstellung der Protein-basierenden Vesikel können die Zielliganden mit den Proteinen vor, während oder nach Bildung der Vesikel eingebaut werden, wie es für den Durchschnittsfachmann offensichtlich wäre, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist.
Vesikelzusammensetzungen, die aus Polymeren fomulierte Vesikel umfassen, können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, wie es für den Fachmann leicht offensichtlich wäre, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist. Beispielhafte Verfahren umfassen zum Beispiel die Grenzflächenpolymerisation, Phasentrennung und Koazervation, zentrifugale Herstellung mit mehreren Auslassen und Lösungsmittelverdampfung. Geeignete Verfahren, die verwendet werden könne oder die gemäß der vorliegenden Offenbarung zur Herstellung von Vesikeln aus Polymeren modifiziert werden können, umfassen diejenigen Verfahren, die in Garner et al., U.S. Patent Nr. 4,179,546, Garner, U.S. Patent Nr. 3,945,956, Cohrs et al., U.S. Patent Nr. 4,108,806, Japan Kokai Tokkyo Koho 62 286534, britisches Patent Nr. 1,044,680, Kenaga et al., U.S. Patent Nr. 3,293,114, Morehouse et al., U.S. Patent Nr. 3,401,475, Walters, U.S. Patent Nr. 3,479,811, Walters et al., U.S. Patent Nr. 3,488,714, Morehouse et al., U.S. Patent Nr. 3,615,972, Baker et al., U.S. Patent Nr. 4,549,892, Sands et al., U.S. Patent Nr. 4,540,629, Sands et al., U.S. Patent Nr. 4,421,562, Sands, U.S. Patent Nr. 4,420,442, Mathiowitz et al., U.S. Patent Nr. 4,898,734, Lencki et al., U.S. Patent Nr. 4,822,534, Herbig et al., U.S. Patent Nr. 3,732,172, Himmel et al., U.S. Patent Nr. 3,594,326, Sommerville et al., U.S Patent Nr. 3,015,128, Deasy, Microencapsulation and Related Drug Processes, Band 20, Kapitel 9 und 10, Seiten 195–240 (Marcel dekker, Inc. N.Y., 1984), Chang et al., Canadian J. of Physiology and Pharmacology, Band 44, Seiten 115–129 (1966), und Chang, Science, Band 146, Seiten 524–525 (1964) offenbart sind.
Gemäß einem bevorzugten Syntheseprotokoll können die Vesikel unter Verwendung eines Wärmeausdehnungsverfahrens, wie zum Beispiel das von Garner et al., U.S. Patent Nr. 4,179,546, Garner, U.S. Patent Nr. 3,945,956, Cohr et al., U.S. Patent Nr. 4,108,806, britisches Patent Nr. 1,044,680 und Japan Kokai Tokkyo Koho 62 286534 beschriebene Verfahren. Im Allgemeinen kann das Wärmeausdehnungsverfahren durch Herstellung von Vesikel eines ausdehnbaren Polymers oder Copolymers, die in ihrem Hohlraum (Kavität) eine leicht flüchtige Flüssigkeit (gasförmigen Vorläufer) enthalten können, ausgeführt werden. Das Vesikel wird dann erwärmt, wobei das Weichmachen des Vesikels und die Umwandlung der leicht flüchtigen Flüssigkeit in ein Gas bewirken, dass das Vesikel sich bis auf das Mehrfache seiner ursprünglichen Größe ausdehnt. Wenn die Wärme entfernt wird bewahrt das thermoplastische Polymer zumindest etwas von seiner ausgedehnten Gestalt. Die durch dieses Verfahren hergestellten Vesikel neigen dazu, von besonders geringer Dichte zu sein, und werden daher bevorzugt. Das vorstehend beschriebene Verfahren ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und kann als Wärmeausdehnungsverfahren zur Herstellung von Vesikeln mit geringer Dichte bezeichnet werden.
Die in den Wärmeausdehnungsverfahren verwendbaren Polymere sind für den Fachmann leicht offensichtlich und umfassen thermoplastische Polymere oder Copolymere, einschließlich Polymere oder Copolymere von vielen der vorstehend beschriebenen Monomeren. Bevorzugte Polymere und Copolymere der vorstehend beschriebenen umfassen die folgenden Copolymere: Polyvinyliden-Polyacrylnitril, Polyvinyliden-Polyacrylnitril-Polymethylmethacrylat, und Polystyrol-Polyacrylnitril. Das besonders bevorzugte Copolymer ist Polyvinyliden-Polyacrylnitril.
Leicht flüchtige Flüssigkeiten, die in dem Wärmeausdehnungsverfahren verwendbar sind, sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt und umfassen aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie zum Beispiel Ethan, Ethylen, Propan, Propen, Butan, Isobutan, Neopentan, Acetylen, Hexan, Heptan, Chlorfluorkohlenstoffe, wie zum Beispiel CCl₃F, CCl₂F₂, CClF₃, CClF₂-CClF₂, Chlorheptafluorcyclobutan und 1,2-Dichlorhexafluorcyclobutan; Tetrakylsilane, wie zum Beispiel Tetramethylsilan, Trimethylethylsilan, Trimethylisopropylsilan und Trimethyl-n-propylsilan; sowie Perfluorkohlenwasserstoffe, einschließlich den vorstehend beschriebenen Perfluorkohlenwasserstoffen. Im Allgemeinen ist es wichtig, dass die leicht flüchtige Flüssigkeit für das verwendete Polymer oder Copolymer kein Lösungsmittel ist. Es wird ebenfalls bevorzugt, dass die leicht flüchtige Flüssigkeit einen Siedepunkt aufweist, der unterhalb des Erweichungspunktes des betroffenen Polymers oder Copolymers liegt. Die Siedepunkte der verschiedenen leicht flüchtigen Flüssigkeiten und Erweichungspunkte der verschiedenen Polymere und Copolymere sind für den Fachmann leicht feststellbar und geeignete Kombinationen von Polymeren oder Copolymeren und leicht flüchtigen Flüssigkeiten werden für den Fachmann leicht offensichtlich sein. Als Anhaltspunkt und wie ein Fachmann erkennen würde, nimmt im Allgemeinen mit zunehmender Länge der Kohlenstoffkette der leicht flüchtigen Flüssigkeit der Siedepunkt der Flüssigkeit ebenfalls zu. Benfalls kann mildes vorheriges Erwärmen der Vesikel in Wasser in Gegenwart von Wasserstoffperoxid vor dem definitivem Erwärmen und der Ausdehnung häufig die Vesikel vorher weich machen, um eine einfacher verlaufende Ausdehnung zu gestatten.
Zum Beispiel kann zum Herstellen von Vesikeln aus synthetischen Polymeren Vinyliden und Acrylnitril in einem Medium einer Isobutanflüssigkeit unter Verwendung von einer oder mehreren der vorstehenden modifizierten oder nicht modifizierten Verfahren aus der Literatur copolymerisiert werden, so dass Isobutan innerhalb der Vesikel eingeschlossen wird. Werden derartige Vesikel dann auf eine Temperatur von ungefähr 80°C bis ungefähr 120°C erwärmt, dehnt sich das Isobutangas aus, das wiederum die Vesikel ausdehnt. Nach Entfernen der Wärme bleiben die ausgedehnte Polyvinyliden und Acrylnitril-Copolymer-Vesikel im Wesentlichen in ihrer ausgedehnten Anordnung fixiert. Die reslutlierenden Vesikel mit geringer Dichte sind sowohl trocken als auch in einem wässrigen Medium suspendiert äußerst stabil. Isobutan wird hier bloß als erläuternde Flüssigkeit verwendet, wobei verständlich ist, dass weitere Flüssigkeiten, die Flüssigkeit/Gas-Übergänge bei Temperaturen durchmachen, die für die Synthese dieser Vesikel und zur Bildung von Vesikeln mit sehr geringer Dichte bei Erwärmen verwendbar sind, gegen Isobutan substituiert werden können. Entsprechend können andere Monomere als Vinyliden und Acrylnitril zur Herstellung der Vesikel verwendet werden.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die Vesikel, die aus synthetischen Polymeren formuliert sind und die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, von Expancel, Nobel Industries (Sundvall, Swe den), einschließlich EXPANCEL 551 DE^TM Mikrokügelchen, kommerziell erhältlich. Die EXPANCEL 551 DE^TM Mikrokügelchen bestehen aus einem Copolymer aus Vinyliden und Acrylnitril, das darin eingekapselt flüssiges Isobutan aufweist. Derartige Mikrokügelchen werden als eine trockene Zusammensetzung vertrieben und weisen eine Größe von näherungsweise 50 Mikrometer auf. Die EXPANCEL 551 DE^TM Mikrokügelchen weisen ein spezifisches Gewicht von nur 0,02 bis 0,05 auf, das zwischen einem fünfzehntel und einem zwanzigstel der Dichte von Wasser liegt.
In jeder der vorstehend beschriebenen Techniken zur Herstellung der Polymer-basierenden Vesikel können die Zielliganden mit den Polymeren vor, während oder nach Bildung der Vesikel eingebaut werden, wie es für den Durchschnittsfachmann offensichtlich wäre, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist.
Wie bei der Herstellung der Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen ist eine große Vielzahl von Techniken zur Herstellung der Lipidformulierungen verfügbar. Zum Beispiel können die Lipid- und/oder Vesikelformulierungen aus einer Mischung von Lipidverbindungen, bioaktivem Mittel und Gas oder gasförmigem Vorläufer hergestellt werden. In diesem Fall werden Lipidzusammensetzungen wie vorstehend beschrieben hergestellt, wobei die Zusammensetzungen ebenfalls ein bioaktives Mittel umfassen. Daher können zum Beispiel Mizellen in Gegenwart eines bioaktiven Mittels hergestellt werden. Im Zusammenhang mit Lipidzusammensetzungen, die ein Gas umfassen, kann die Herstellung zum Beispiel das Einblasen eines Gases direkt in eine Mischung der Lipidverbindungen und ein oder mehrere zusätzliche Materialien betreffen. Alternativ dazu können die Lipidzusammensetzungen aus den Lipidverbindungen und einem Gas oder einem gasförmigen Vorläufer vorher gebildet werden. Im letzteren Fall wird dann das bioaktive Mittel vor Verwendung zu der Lipidzusammensetzung gegeben. Zum Beispiel kann eine wässrige Mischung aus Liposomen und einem Gas hergestellt werden, zu der das bioaktive Mittel zugegeben wird und die gerührt wird, um die Liposomenformulierung zur Verfügung zu stellen. Die Liposomenformulierung kann leicht isoliert werden, da die mit Gas und/oder dem bioaktiven Mittel gefüllten Liposomenvesikel im Allgemeinen oben auf der wässrigen Lösung schwimmen. Überschüssiges bioaktives Mittel kann aus der restlichen wässrigen Lösung rückgewonnen werden.
Wie der Fachmann erkennen wird, kann jede der Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen und/oder Lipid- und/oder Vesikelformulierungen zur Lagerung gefriergetrocknet werden und zum Beispiel mit einem wässrigen Medium (wie zum Beispiel steriles Wasser, phosphatgepufferte Lösung oder wässrige Salzlösung) mit Hilfe von kräftigem Rühren wiederhergestellt werden. Zum Verhindern eines Zusammenklebens oder Verschmelzens der Lipide und/oder Vesikel als Ergebnis der Gefriertrocknung, kann es nützlich sein, Zusatzstoffe einzufügen, die das Auftreten eines derartiges Verschmelzen oder Zusammenklebens verhindern. Zusatzstoffe, die verwendbar sein können, umfassen Sorbitol, Mannitol, Natriumchlorid, Glucose, Trehalose, Polyvinylpyrrolidon und Poly(ethylenglycol) (PEG), zum Beispiel PEG 400. Diese und andere Zusatzstoffe sind in der Literatur, wie zum Beispiel in der U.S. Pharmakopöe, USP XXII, NF XVII, The United States Pharmacopeia, The National Formulary, Unites States Pharmacopeial Convention Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852 beschrieben. Gefriergetrocknete Präparate weisen im Allgemeinen den Vorteil einer größeren Lagerbeständigkeit auf.
Wie vorstehend erörtert ist, sind die Zusammensetzungen der vorliegenen Erfindung als Kontrastmittel zur diagnostischen Bildgebung, einschließlich zum Beispiel Ultraschallabbildung (US), Coputertomographie-(CT)Abbildung, einschließlich CT-Angiographie-(CTA)Abbildung, magnetische Resonanz-(MR)Abbildung, magnetische Resonanzangiographie (MRA), kernmedizinische optische Abbildung und Elastographie verwendbar
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Abbilden von einer oder mehreren Regionen eines Patienten. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von erkranktem Gewebe in einem Patienten. Diese Verfahren betreffen die Verabreichung eines Kontrastmediums in Form einer Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzung an einen Patienten. Der Patient wird unter Verwendung der diagnostischen Bildgebung, umfassend zum Beispiels die Ultraschallabbildung, abgetastet, um sichtbare Bilder einer inneren Region eines Patienten zu erhalten. Die Verfahren sind besonders verwendbar, um Abbildungen der Herzregion, der Magen-Darm-Region oder des Lymphsystems zur Verfügung zu stellen, sie können jedoch ebenfalls bereiter zum Abbilden anderer inneren Regionen des Patienten, einschließlich zum Beispiel des Gefäßsystems, verwendet werden. Der Begriff „Magen-Darm-Region" oder Magen-Darm-Trakt", wie er hier verwendet wird, umfasst die Region eines Patienten die durch die Speiseröhre, den Magen, den Dünn- und Dickdarm und den Enddarm definiert ist. Die vorliegenden Verfahren können ebenfalls im Zusammenhang mit der Abgabe eines bioaktiven Mittels an eine innere Region eines Patienten verwendet werden.
Wie der Fachmann erkennen würde, kann die Verabreichung des Lipids und/oder der Vesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Arten, nämlich parenteral, oral oder intraperitoneal ausgeführt werden. Die parenterale Verabreichung, die bevorzugt wird, umfasst die Verabreichung über folgende Wege: intravenöse, intramuskulär, interstitiell, Intraarteriell, subkutan, intraokular, intrasynovial, transepithelial, einschließlich transdermal, pulmonal über Inhalation, ophthalmisch, sublingual und bukkal, topisch, einschließlich ophthalmisch, dermal, Okular, rectal und nasale Inhalation über Einblasung. Die intravenöse Verabreichung wird unter den Wegen der parenteralen Verabreichung bevorzugt. Die zu verabreichende verwendbare Dosierung und die spezielle Art der Verabreichung wird von dem Alter, dem Gewicht und dem speziellen Säuger und dessen abzutastender Region und von dem verwendeten speziellen Kontrastmittel abhängen. Typischerweise wird die Dosierung bei niedrigeren Gehalten begonnen und erhöht, bis die gewünschte Kontrasterhöhung erreicht ist. Verschiedene Kombinationen der Lipidzusammensetzungen können zum Ändern der Eigenschaften, wie erwünscht, einschließlich der Viskosität, Osmolarität oder Schmackhaftigkeit verwendet werden. Beim Ausführen der Abbildungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann das Kontrastmedium alleine oder in Kombination mit diagnostischen, therapeutischen oder anderen Mitteln verwendet werden. Derartige andere Mittel umfassen Arzneimittelträger, wie zum Beispiel Geschmacks- oder färbende Materialien. CT-Abbildungstechniken, die verwendet werden, sind herkömmliche und sind zum Beispiel in Computed Body Tomography, Lee, J. K. T., Sagel, S. S. und Stanley, R. J., Herausg. 1983, Ravens Press, New York, N.Y., insbesondere in den ersten zwei Kapiteln davon mit den Titeln „Physical Principles and Instrumentation", Ter-Pogpssian, M. M. m und „Techniques", Aronberg, D. J. beschrieben.
Im Falle von diagnostischen Anwendungen, wie zum Beispiel Ultraschall und CT, wird die Energie, wie zum Beispiel die Ultraschallenergie, mindestens auf einen Teil des Patienten zum Abbilden des Zielgewebes angewandt. Dann wird eine sichtbare Abbildung einer inneren Region eines Patienten erhalten, so dass das Vorhandensein oder die Abwesenheit von erkranktem Gewebe festgestellt werden kann. In Bezug auf Ultraschall sind Ultraschallabbildungstechniken, umfassend die Abbildung der zweiten harmonischen Oberwelle und Abbilden unter Ausblenden, aus dem Stand der Technik gut bekannt und sind zum Beispiel in Uhlendorf, „Physics of Ultrasound Contrast Imaging: Scattering in the Linear Range", IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control, Band 14(1), Seiten 80–79 (1994) und Sutherland, et al., „Color Doppler Mycardial Imaging: A New Technique fort he Assessment of Myocardial Function", Journal of the American Society of Echocardiography, Band 7(5), Seiten 441–458 (1994).
Ultraschall kann sowohl für diagnostische als auch therapeutische Zwecke verwendet werden. Beim diagnostischen Ultraschall können Ultraschallwellen oder eine Folge von Ultraschallpulsen mit einem Meßwandler angewandt werden. Der Ultraschall ist im Allgemeinen eher gepulst als kontinuierlich, obwohl er auf Wunsch kontinuierlich sein kann. Daher betrifft der diagnostische Ultraschall im allgemeinen die Anwendung eines Pulses von Echos, nach denen, während einer Abhörzeit, der Ultraschallwandler die reflektierten Signale empfängt. Der zweite harmonische Oberwellenmodus kann vorteilhaft verwendet werden, wobei die 2x Frequenz empfangen wird, wobei x die einfallende Frequenz ist. Dies kann dazu dienen, das Signal aus dem Hintergrundsmaterial zu verringern und das Signal von dem Messwandler unter Verwendung der zielgerichteten Kontrastmedien der vorliegenden Erfindung, die auf die gewünschte Stelle, zum Beispiel Blutgerinnsel, gerichtet werden können, zu erhöhen. Andere Signale harmonischer Oberwellen, wie zum Beispiel die Signale von ungeraden harmonischen Oberwellen, zum Beispiel 3x oder 5x, würden unter Verwendung dieses Verfahrens entsprechend empfangen werden. Die Signale subarmonischer Oberwellen, zum Beispiel x/2 und x/3 können ebenfalls empfangen werden und so verarbeitet werden, dass sie eine Abbildung erzeugen.
Zusätzlich zu den gepulsten Verfahren kann Ultraschall mit kontinuierlichen Wellen, zum Beispiel, Leistungs-Doppler angewandt werden. Dies ist besonders verwendbar, wenn starre Vesikel, zum Beispiel Vesikel, die aus Polymethylmethacrylat formuliert sind, verwendet werden. In diesem Fall kann die relativ höhere Energie des Leistungs-Dopplers die Resonanz der Vesikel bewirken und dadurch der Zerreißen fördern. Dies kann eine akustische Emission erzeugen, die im subharmonischem oder ultraharmonischem Bereich liegt oder in manchen Fällen dieselbe Frequenz, wie der angewandte Ultraschall aufweist. Es wird angenommen, dass es ein Spektrum akustischer Signaturen gibt, die in diesem Prozess freigesetzt werden und der so verwendete Messwandler die akustischen Emissionen empfangen kann, um zum Beispiel das Vorhandensein eines Gerinnsels nachzuweisen. Zusätzlich kann das Verfahren zum Zerreißen des Vesikels verwendet werden, um kinetische Energie auf die Oberfläche von zum Beispiel einem Gerinnsel, zur Unterstützung der Gerinnselauflösung, zu übertragen. Daher kann eine therapeutische Thrombolyse während einer Kombination aus diagnostischem und therapeutischem Ultraschall erreicht werden. Es kann ebenfalls Spektral-Doppler verwendet werden. Im Allgemeinen sind die Energiemengen aus dem diagnostischen Ultraschall nicht ausreichend, um das Zerreißen von Vesikeln zu fördern und die Freisetzung und die zelluläre Aufnahme der bioaktiven Mittel zu erleichtern. Wie vorstehend angemerkt wurde, kann der diagnostische Ultraschall die Anwendung von einem oder mehreren Schallpulsen betreffen. Pausen zwischen den Pulsen gestatten das empfangen der reflektierten Schallsignale und deren Analyse. Die beim diagnostischen Ultraschall verwendte begrenzte Anzahl von Pulsen schränkt die wirksame Energie, die an das Gewebe, das untersucht wird, abgegeben wird, ein.
Hochenergetischer Ultraschall, zum Beispiel Ultraschall, der durch ein therapeutisches Ultraschallgerät erzeugt wird, ist im Allgemeinen in der Lage, das Zerreißen der Vesikelspezies zu bewirken. Im Allgemeinen verwenden Vorrichtungen für therapeutischen Ultraschall Betriebsarten von ungefähr 10 bis ungefähr 100%, in Abhängigkeit von der Fläche des mit Ultraschall zu behandelnden Gewebes. Flächen des Körpers, die im Allgemeinen durch größere Mengen an Muskelmasse charakterisiert sind, zum Beispiel, Hintern und Oberschenken, sowie mit Blutgefäßen stark versorgte Gewebe, wie zum Beispiel Herzgewebe, können eine höhere Betriebsart, zum Beispiel bis zu ungefähr 100% erfordern.
Beim therapeutischen Ultraschall wird Ultraschallwelle mit kontinuierlichen Wellen verwendet, um höhere Energiemengen abzugeben. Zum Zerreißen der Vesikel wird Ultraschall mit kontinuierlichen Wellen bevorzugt, obwohl die Schallenergie ebenfalls gepulst werden kann. Falls gepulste Schallenergie verwendet wird, wir der Schall im Allgemeinen in Echofolgenabschnitten mit ungefähr 8 bis ungefähr 20 oder mehr Pulsen gleichzeitig gepulst werden. Vorzugsweise weisen die Echofolgenabschnitte ungefähr 20 Pulse gleichzeitig auf. Zusätzlich kann die Grequenz des verwendeten Schalls von ungefähr 0,025 bis ungefähr 100 Megahertz (MHz) variieren. Im Allgemeinen liegt die Frequenz für therapeutischen Ultraschall vorzugsweise im Bereich zwischen ungefähr 0,75 und ungefähr 3 MHz, wobei von ungefähr 1 und ungefähr 2 MHz bevorzugter wird. Zusätzlich können die Energiemengen von ungefähr 0,5 Watt (W) pro Quadratzentimeter (cm²) bis ungefähr 5,0 W/cm² variieren, wobei Energiemengen von ungefähr 0,5 bis ungefähr 2,5 W/cm² bevorzugt werden. Die Energiemengen für eine therapeutischen Hyperthermie betreffenden Ultraschall betragen im Allgemeinen von ungefähr 5 W/cm² bis ungefähr 50 W/cm². Für sehr kleine Vesikel, zum Beispiel Vesikel mit einem Durchmesser von weniger als ungefähr 0,5 μm werden im Allgemeinen höhere Schallfrequenzen bevorzugt. Dies ist daher, weil die kleineren Vesikel in der Lage sind, Schallenergie wirksamer bei höheren Schallfrequenzen zu absorbieren. Werden sehr hohe Frequenzen verwendet, zum Beispiel von mehr als ungefähr 10 MHz, wird die Schallenergie im Allgemeinen in die Flüssigkeiten und Gewebe nur bis zu einer begrenzten Tiefe eindringen. Daher kann die äußere Anwendung von Schallenergie für Haut und andere oberflächlichen Gewebe geeignet sein. Es ist jedoch im Allgemeinen für tiefe Strukturen notwendig die Ultraschallenergie so zu bündeln, dass sie vorzugsweise direkt auf eine Zone innerhalb einer Brennpunktzone gerichtet ist. Alternativ dazu kann die Ultraschallendergie über interstitielle Sonden, intravaskuläre Ultraschallkatheter oder endoluminale Katheter angewandt werden. Derartige Sonden oder Katheter können zum Beispiel in der Speiseröhre zur Diagnose und/oder zur Behandlung von Speiseröhrenkarzinomen verwendet werden. Zusätzlich zu den vorstehend erörterten therapeutischen Verwendungen können die vorliegenden Zusammensetzungen in Verbindung mit Speiseröhrenkarzinomen oder in den Herzkranzarterien zur Behandlung von Atheroklerose, sowie für die beschriebenen therapeutischen Verwendungen, die zum Beispiel in dem U.S Patent Nr. 5,149,319 beschrieben sind, verwendet werden.
Es kann eine therapeutische Ultraschallvorrichtung verwendet werden, die zwei Ultraschallfrequenzen verwendet. Die erste Frequenz kann x sein und die zweite Frequenz kann 2x sein. In einer bevorzugten Ausführungsform würde die Vorrichtung so ausgelegt sein, dass die Brennpunktzonen der ersten und zweiten Frequenzen in einer einzelnen Brennpunktzone zusammenlaufen. Die Brennpunktzone der Vorrichtung kann dann auf die zielgerichteten Zusammensetzungen, zum Beispiel auf die zielgerichteten Vesikelzusammensetzungen innerhalb des Zielgewebes, gerichtet werden. Diese Ultraschallvorrichtung kann eine Therapie mit der zweiten harmonischen Oberwelle zur Verfügung stellen mit einer gleichzeitigen Anwendung der x und 2x Frequenzen der Ultraschallenergie. Es wird angenommen, dass im Falle von Vesikel betreffendem Ultraschall diese zweite harmonische Oberwellentherapie ein verbessertes Zerreißen der Vesikel im Vergleich zur Ultraschallenergie, die eine einzelne Frequenz betrifft, liefert. Ebenfalls wird angenommen, dass der bevorzugte Frequenzbereich innerhalb der fundamentalen harmonischen Frequenzen der Vesikel liegen kann. Mit dieser Vorrichtung kann ebenfalls eine niedrigere Energie verwendet werden. Eine Ultraschallvorrichtung, die im Zusammenhang mit der vorstehend erwähnten zweiten harmonischen Oberwellentherapie verwendet wird, ist zum Beispiel von Kawabata, K. et al., Ultrasonics Sonochemistry, Band 3, Seiten 1–5 (1996) beschrieben.
Die zur Bildung eines gewünschten stabilen Vesikelgehalts erforderliche Lipidkonzentration wird in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Lipid variieren und kann ohne weiteres durch Routineexperimente bestimmt werden. Zum Beispiel beträgt in bevorzugten Ausführungsformen die Konzentration an 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), das zur Bildung stabilisierter Vesikel gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ungefähr 0,1 mg/ml bis ungefähr 30 mg/ml Salzlösung, bevorzugter von ungefähr 0,5 mg/ml bis ungefähr 20 mg/ml Salzlösung und besonders bevorzugt von ungefähr 1 mg/ml bis ungefähr 10 mg/ml Salzlösung. Die Konzentration an Distearylphosphatidylcholin (DSPC), das in bevorzugten Ausführungsformen verwendet wird, beträgt ungefähr 0,1 mg/ml bis ungefähr 30 mg/ml Salzlösung, bevorzugter von ungefähr 0,5 mg/ml bis ungefähr 20 mg/ml Salzlösung und besodners bevorzugt von ungefähr 1 mg/ml bis ungefähr 10 mg/ml Salzlösung. Die Menge der Zusammensetzunge, die einem Patienten verabreicht wird, kann variieren. Typischerweise kann die intravenöse Dosis weniger als ungefähr 10 ml für einen Patienten mit 70 kg betragen, wobei geringere Dosen bevorzugt sind.
Zusätzlich zu den vorstehend offenbarten Verfahren umfasst eine weitere Ausführungsform zur Herstellung eines zielgerichteten Kontrastmediums das Kombinieren von mindestens einem biologisch verträglichen Lipid und einem gasförmigen Vorläufer; das Rühren, bis gasgefüllte Vesikel gebildet sind, das Zugeben eine Zielliganden zu den gasgefüllten Vesikeln, so dass der Zielligand an das gasgefüllte Vesikel über eine kovalente Bindung oder nicht kovalente Bindung bindet; und das Rühren, bis ein Kontrastmittel resultiert, das gasgefüllte Vesikel und einen Zielliganden umfasst. Der gasförmige Vorläufer kann bis zum Zeitpunkt der Verwendung eher ein gasförmiger Vorläufer bleiben, als dass gerührt wird, bis gasgefüllte Vesikel vor Zugeben des Zielliganden gebildet werden. Das heißt, der gasförmige Vorläufer wird zum Herstellen des Kontrastmediums verwendet und der Vorläufer wir in vivo, zum Beispiel zum Beispiel über die Temperatur, aktiviert.
Alternativ dazu kann ein Verfahren zum Herstellen eines auf endotheliale Zellen gerichteten Kontrastmediums das Kombinieren von mindestens einem biologisch verträglichen Lipid und einem Zielliganden, so dass der Zielligand an das Lipid über eine kovalente Bindung oder nicht kovalente Bindung bindet, das Zugeben eines gasförmigen Vorläufers und das Rühren bis ein Kontrastmedium resultiert, das gasgefüllte Vesikel und einen Zielliganden umfasst, umfassen. Zusätzlich kann der gasförmige Vorläufer zugegeben werden ein bis zum Zeitpunkt der Verwendung ein gasförmiger Vorläufer bleiben. Das heißt, der gasförmige Vorläufer wird zum Herstellen des Kontrastmediums, das mit gasförmigem Vorläufer gefüllte Vesikel und einen Zielliganden aufweist, der zur in vivo Verwendung resultiert, verwendet.
Alternativ dazu können die gasförmigen Vorläufer zum Erzeugen stabiler gasgefüllter Vesikel mit Zielliganden verwendet werden, die vor Verwendung vorher gebildet sind. In der vorliegenden Ausführungsform werden der gasförmige Vorläufer und der Zielligand in einen Behälter gegeben, der ein Suspensions- und/oder stabilisierendes Medium bei einer Temperatur unterhalb der Phasenübergangstemperatur von flüssiger zur Gasphase des entsprechenden gasförmigen Vorläufers enthält. Wird dann die Temperatur überschritten und zwischen dem gasförmigen Vorläufer und der flüssigen Lösung eine Emulsion gebildet, macht der gasförmige Vorläufer einen Übergang von flüssigem zu gasförmigem Zustand durch. Als Ergebnis dieses Erwärmens und der Gasbildung verdrängt das Gas die Luft in dem Kopfraum über der flüssigen Suspension, um gasgefüllte Lipidkügelchen zu bilden, die das Gas des gasförmigen Vorläufers, umgebendes Gas, zum Beispiel Luft, oder gasförmigen Vorläufer im Gaszustand und umgebende Luft zusammen einschließen. Dieser Phasenübergang kann zum optimalen Mischen und Stabilisieren des Kontrastmediums verwendet werden. Zum Beispiel kann der gasförmige Vorläufer, Perfluorbutan, in die biologisch verträgliche Lipid- oder andere stabilisierende Verbindung eingeschlossen werden und wenn die Temperatur über 4°C (Siedepunkt von Perfluorbutan) ansteigt, resultiert Fluorbutangas, das von der stabilisierenden Verbindung eingeschlossen ist. Als zusätzliches Beispiel kann der gasförmige Vorläufer Fluorbutan in einer wässrigen Suspension suspendiert werden, die Emulgator und stabilisierende Mittel, wie zum Beispiel Glycerol oder Propylenglycol enthält, und auf einer kommerziellen Wirbelvorrichtung verwirbelt werden. Das Wirbeln beginnt bei einer Temperatur, die ausreichend niedrig ist, so dass der gasförmige Vorläufer flüssig ist, und wird fortgeführt, wobei die Temperatur der Probe über die Phasenübergangstemperatur vom flüssigen zu gasförmigen Zustand hinweg ansteigt. Bei diesem Verfahren geht der Vorläufer während des Mikroemulgierungsverfahrens in den gasförmigen Zustand über. In Gegenwart der geeigneten stabilisierenden Mittel resultieren überraschen stabile gasgefüllte Vesikel und Zielliganden.
Dementsprechend können die gasförmigen Vorläufer so ausgewählt werden, dass sie ein gasgefülltes Vesikel in vivo bilden oder so ausgelegt werden, dass sie gasgefüllte Vesikel in situ während des Herstellungsverfahrens, bei der Lagerung oder zu irgendeinem Zeitpunkt vor der Verwendung erzeugen.
Für den Fachmann wird es verständlich sein, sobald er im Besitz der vorliegenden Offenbarung ist, dass die Lipide, Proteine, Polymere und andere stabilisierenden Verbindungen, die als Ausgangsmaterialien oder Vesikelendprodukte verwendet werden, manipuliert werden können, bevor sie den in der vorliegenden Erfindung betrachteten Verfahren unterzogen werden oder nachdem sie diesen unterzogen worden sind. Zum Beispiel kann die stabilisierende Verbindung, wie zum Beispiel ein biologisch verträgliches Lipid hydriert und dann gefriergetrocknet werden, durch Gefrier- und Tauzyklen verarbeitet, oder einfach hydriert werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Lipid hydriert und dann gefriergetrocknet, oder hydriert, dann durch Gefrier- und Tauzyklen verarbeitet und dann gefriergetrocknet, bevor mit gasförmigem Vorläufer gefüllte Vesikel gebildet werden.
Gemäß den in der vorliegenden Erfindung betrachteten Verfahren kann für das Vorhandensein von Gas, wie zum Beispiel und nicht beschränkt auf Luft, ebenfalls durch die lokale Umgebungsatmosphäre gesorgt werden. Die lokale Umgebungsatmosphäre kann die Atmosphäre innerhalb eines dicht verschlossenen Behälters sein oder in einem nicht verschlossenen Behälter kann sie die äußere Umgebung sein. Alternativ dazu kann zum Beispiel ein Gas in den Behälter mit der wässrigen Lipidlösung oder in die wässrige Lipidlösung selbst eingespritzt oder anderweitig zugegeben werden, um ein anderes Gas als Luft zur Verfügung zu stellen. Gase, die nicht schwerer als Luft sind, können zu einem dicht verschlossenen Behälter gegeben werden, während Gase, die schwerer als Luft sind, zu einem dicht verschlossenen oder nicht verschlossenem Behälter gegeben werden können. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung das gleichzeitige Einschließen von Luft und/oder anderen Gasen zusammen mit gasförmigen Vorläufern.
Wie schon vorstehend in dem Abschnitt beschrieben wurde, der die stabilisierende Verbindung behandelte, werden die in der vorliegenden Erfindung betrachteten bevorzugten Verfahren bei einer Temperatur ausgeführt, die unterhalb der Phasenübergangstemperatur von Gelzustand zu flüssigkristallinem Zustand des verwendeten Lipids liegt. Mit „Phasenübergangstemperatur von Gelzustand zu flüssigkristallinem Zustand" ist die Temperatur gemeint, bei der eine Lipiddoppelschicht von einem Gelzustand in einen flüssigkristallinen Zustand übergeht. Siehe zum Beispiel Chapman et al., J. Biol. Chem. 1974, 249, 2512–2521.
Daher können die vorstehend beschriebenen stabilisierten Vesikelvorläufer auf dieselbe Weise verwendet werden, wie die anderen in der vorliegenden Erfindung verwendeten stabilisierten Vesikel, sobald sie durch Aufbringung auf die Gewebe eines Wirts aktiviert worden sind, wobei derartige Faktoren, wie Temperatur der pH-Wert verwendet werden können, um die Erzeugung des Gases zu bewirken. Es wird bevorzugt, dass diese Ausführungsform eine ist, wobei die gasförmigen Vorläufer Phasenübergänge von flüssigen zu gasförmigen Zuständen in der Nähe der normalen Körpertemperatur des Wirts durchmachen und dabei durch die Temperatur der Wirtsgewebe so aktiviert werden, dass sie darin einen Übergang in die Gasphase durchmachen. Noch bevorzugter ist dieses Verfahren eines, wobei das Wirtsgewebe menschliches Gewebe ist mit einer normalen Temperatur von ungefähr 37°C und wobei die gasförmigen Vorläufer Phasenübergänge von flüssigen zu gasförmigen Zuständen in der Nähe von 37°C durchmachen.
Alle der vorstehenden Ausführungsformen, die Präparationen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten stabilisierten gasgefüllten Vesikel betreffen, könne mittels Autoklavem oder steriler Filtration sterilisiert werden, falls diese Verfahren vor entweder dem Gaseinleitungsschritt oder vor der Temperatur-vermittelten Gasumwandlung der temperaturempfindlichen gasförmigen Vorläufer innerhalb der Suspension durchgeführt werden. Alternativ dazu können ein oder mehrere antibakterielle Mittel und/oder Konservierungsstoffe in die Formulierung des Kontrastmediums, wie zum Beispiel Natriumbenzoat, alle quartären Ammoniumsalze, Natriumazid, Methylparaben, Propylparaben, Sorbinsäure, Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Chlorbutanol, Dehydroessigsäure, Ethylendiamin, Monothioglycerol, Kaliumbenzoat, Kaliummetabisulfit, Kaliumsorbat, Natriumbisulfit, Schwefeldioxid und organische Quecksilbersalze, eingeschlossen werden. Eine derartige Sterilisierung, die ebenfalls durch andere herkömmliche Mittel, wie zum Beispiel Bestrahlung, erreicht werden kann, wird notwendig sein, wenn die stabilisierten Mikrokügelchen zum Abbilden unter invasiven Umständen, zum Beispiel intravaskulär oder intraperitoneal, verwendet werden. Die geeigneten Mittel der Sterilisation werden für den Fachmann offensichtlich sein, der durch die vorliegende Beschreibung der stabilisierten gasgefültlen Vesikel und deren Verwendung unterrichtet ist. Das Kontrastmedium wird m Allgemeinen als eine wässrige Suspension gelagert, jedoch kann das Kontrastmedium im Falle getrockneter Vesikel oder getrockneter lipidischer Kügelchen als ein getrocknetes Pulver gelagert werden, das zur Wiederherstellung vor der Verwendung bereit ist.
Die neuen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung und insbesondere die Vesikelzusammensetzungen, sind als Kontrastmedien in der diagnostischen Bildgebung verwendbar und ebenfalls zur Verwendung in allen Bereichen geeignet, in denen die diagnostische Bildgebung verwendet wird. Die stabilisierten Vesikel sind jedoch besonders für die Abbildung der Durchblutung verwendbar.
Die diagnostische Bildgebung ist ein Mittel zum Sichtbarmachen der inneren Körperregionen eines Patienten. Die diagnostische Bildgebung umfasst zum Beispiel Ultraschall (US), Magnetische Resonanzabbildung (MRI), magnetische Kernresonanz (NMR), Computertomographie (CT), Elektronenspinresonanz (SER); Kernmedizin, wenn das Kontrastmedium ein radioaktives Material umfasst, und optische Bildgebung, insbesondere mit einem fluoreszierenden Kontrastmittel. Die diagnostische Bildgebung umfasst ebenfalls das Fördern des Zerreißens der Vesikel durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel kann Ultraschall zum Sichtbarmachen der Vesikel und zum Nachweisen der Lokalisierung der Vesikel in bestimmten Geweben verwendet werden. Zusätzlich kann Ultraschall zum Fördern des Zerreißens der Vesikel verwendet werden, sobald die Vesikel das beabsichtigte Ziel, umfassend Zielgewebe und/oder Zielrezeptor erreichen, wobei sie ein bioaktives Mittel und/oder diagnostisches Mittel freisetzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen einer zielgerichteten Zusammensetzung entsprechend der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Kontrastmittels zum Abbilden eines Patienten und/oder zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von erkranktem Gewebe in einem Patienten. Das Abbildungsverfahren kann durch Verabreichen eines Kontrastmediums der Erfindung an einen Patienten und dann Abtasten des Patienten unter Verwendung von zum Beispiel Ultraschall, Computertomptgraphie und/oder magnetischer Resonanzabbildung, zum Erhalten sichtbarer Bilder einer inneren Region eines Patienten und/oder von jedem erkrankten Gewebe in dieser Region, ausgeführt werden. Region eines Patienten bedeutet der ganze Patient oder ein spezielles Gebiet oder ein Teil des Patienten. Das Kontrastmedium kann insbesondere zum Bereitstellen von Abbildungen von Gewebe, wie zum Beispiel Herzmuskel-, endotheliales und/oder epitheliales Gewebe, sowie Magne-Darm- und kardiovaskuläre Regionen verwendbar sein, jedoch kann es ebenfalls breiter verwendet werden, wie zum Beispiel bei der Abbildung des Gefäßsystems oder auf andere Arten, wie sie für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich sind. Der Begriff kardiovaskuläre Region, wie er hier verwendet wird, bezeichnet die Region des Patienten, die durch das Herz und das Gefäßsystem, das direkt zum Herzen hin und davon weg führt, definiert ist. Der Begriff Gefäßsystem, wie er hier verwendet wird, bezeichnet die Blutgefäße (Arterien, Venen, usw.) im Körper oder in einem Organ oder Teil des Körpers. Der Patient kann jede Art von Säuger sein, jedoch ist er besonders bevorzugt ein Mensch.
Erkranktes Gewebe umfasst zum Beispiel endotheliales Gewebe, das aus dem Gefäßsystem, das das erkrankte Gewebe unterhält, resultiert. Als ein Ergebnis liefert die Lokalisierung und Sichtbarmachung von endothelialem Gewebe einer Region eines Patienten, die unter normalen Umständen nicht mit endothelialiem Gewebe verbunden ist, ein Anzeichen für erkranktes Gewebe in der Region.
Bei der Ausführung der Verwendungen der magnetischen Resonanzabbildung kann das Kontrastmedium allein oder in Kombination mit anderen diagnostischen, therapeutischen oder anderen Mitteln verwendet werden. Derartige andere Mittel umfassen Arzneimittelträger, wie zum Beispiel Geschmacks- und färbende Materialien. Die magnetische Resonanzabbildungstechniken, die verwendet werden, sind herkömmliche und werden zum Beispiel von D. M. Kean und M. A. Smith, Magnetic Resonance Imaging: Principles and Application, (William und Wilkins, Baltimore 1986) beschrieben. Betrachtete MRI-Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf magnetische Kernresonanz (NMR) und Elektronenspinresonanz (ESR). Die bevorzugte Abbildungsmodalität ist NMR.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen dargelegt: Beispiele 1 bis 8, 13 bis 15, 20 bis 22, 27, 28, 42, 43 bis 45 und 47 und 48 sind tatsächliche Beispiele und die Beispiele 9 bis 12, 16 bis 19, 23 bis 26, 29 bis 41 und 49 bis 59 sind prophetische Beispiele. Beispiel 46 ist sowohl (zum Teil) wirklich als auch (zum Teil) prophetisch.
BEISPIELE
Beispiel 1
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von N,N'-Bis(hexadecylaminocarbonylmethylen)-(β-N,N,N-trimethylammoniumethylaminocarbonylmethylen)-N,N'-dimethyl-N,N'- ethylendiamintetraiodid (EDTA-HA-TMA-tetraiodid), das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von N,N'-Bis(hexadecylaminocarbonylmethylen)-ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (EDTA-HA)
Ethylendiamintetraessigsäuredianhydrid (2,56 g, 0,01 mol) in trockenem Methanol (30 ml) und Hexadecylamin (4,82 g, 0,02 mol) in trockenem Methanol (60 ml) wurden kombiniert und bei 50°C während 6 Stunden gerührt. Der resultierende weiße Feststoff wurde durch Filtration isoliert und bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet, woraus sich 3,43 g (64%) EDTA-HA ergaben.
IR: 3320 cm^–1 für OH, 1670 cm^–1 für C=O (Carbonyl).
B. Herstellung von N,N'-Bis(hexadecylaminocarbonylmethylen)-N,N'-β-N,N-dimethylaminoethylaminocarbonylmethylen)ethylendiamin (EDTA-HA-DMA)
Zu einer gekühlten (5°C) Lösung aus EDTA-HA aus Schritt A (3,69 g, 0,05 mol), N,N-Dimethylethylendiamin (0,88 g, 0,01 mol) und CHCl₃ (100 ml) wurde eine Lösung aus DCC (2,227 g, 0,011 mol) und CHCl₃ (20 ml) tropfweise zugegeben. Die resultierende Emulsion wurde bei Raumtemperatur während ungefähr 24 Stunden gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde mit 0,5% Essigsäure (100 ml) zum Zersetzen von jeglichem DCC gewaschen. Eine weiße milchige Lösung, die sich in zwei Schichten trennte, wurde beobachtet. Die untere organische Schicht wurde über Nacht (Na₂SO₄) getrocknet und im Vakuum eingeengt, um 3,81 g EDTA-HA-DMA als weicher Feststoff zu liefern.
IR: 3280 cm^–1, 2900 cm^–1, 1640 cm^–1, 1530 cm^–1
C. Herstellung von EDTA-HA-TMA-tetraiodid
EDTA-HA-DMA aus Schritt B (4,22 g, 4,77 mol), Iodmethan (3,41 g, 24 mmol) und Ethanol (30 ml) wurden kombiniert und unter Rückfluß während 2 Stunden erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und der Rückstand über Nacht gefriergetrocknet. 4,98 g des Titelprodukts (EDTA-HA-TMA-tetraiodid) wurden als gelber Feststoff erhalten.
IR: 3260 cm^–1, 1650 cm^–1
Beispiel 2
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von N,N'-Bis(hexadecyloxycarbonylmethylen)-N-(β-N,N,N-trimethylammoniumethylaminocarbonylmethylen)-N-methyl-N'- (carboxymethylen)ethylendiamindiiodid (EDTA-HA-DMA-diiodid), das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von N,N'-Bis(hexadecyloxycarbonylmethylen)-ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (EDTA-HAL)
Hexadecylalkohol (4,84 g, 0,02 mol), trockenes Dimethylformamid (20 ml), trockenes Triethylamin (3,3 g) und Ethylendiamintetraessigsäuredianhydrid (2,56 g, 0,01 mol) wurden kombiniert und bei 50°C während 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in kaltes Wasser (200 ml) geschüttet und die resultierende wässrige Mischung wurde mit HCl angesäuert. Der resultierende weiße Niederschlag wurde durch Filtration isoliert und der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen. Umkristallisieren des weißen Feststoffs aus Ethanol ergab 7 g EDTA-HAL. Smp. 103°C.
B. Herstellung von N,N'-Bis(hexadecyloxycarbonylmethylen)-N-(β-N-dimethylaminoethylaminovarbonyl)-N_-Essigsäure (EDTA-HAL-DMA)
Zu einer gekühlten (5°C) Lösung aus EDTA-HAL aus Schritt A (3,70 g, 0,005 mol), N,N-Dimethylethylendiamin (1,598 g, 0,0175 mol) und CHCl₃ (100 ml) wurde eine Lösung aus DCC (3,60 g, 0,075 mol) in CHCl₃ (20 ml) tropfweise zugegeben. Es bildete sich ein Niederschlag und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während ungefähr 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde mit 0,5% Essigsäure (100 ml) zum Zersetzen von jeglichem überschüssigen DCC gewaschen. Eine weiße milchige Lösung bildete sich, die sich in zwei Schichten trennte. Die untere organische Schicht wurde getrocknet und im Vakuum eingeengt, um 3,85 g EDTA-HAL-DMA als eine viskose Flüssigkeit zu ergeben.
C. Herstellung von EDTA-HAL-DMA-diiodid
EDTA-HAL-DMA aus Schritt B (2,36 g, 0,0027 mol), Iodmethan (3,81 g) und Ethanol (50 ml) wurden kombiniert und unter Rückfluß während 2 Stunden erhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand über Nacht gefriergetrocknet. 2,96 g der Titelverbindung (EDTA-HAL-DMA-diiodid) wurden als gelblicher Feststoff erhalten.
Beispiel 3
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von N,N'-Bis(hexadecylaminocarbonylmethylen)-N-(β-N,N,N-trimethylammoniumethylaminocarbonylmethylen)-N-methyl-N'-(carboxymethylen)ethylendiamindiiodid (EDTA-HAL-DMA-diiodid), das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von N,N'-Bis(hexadecylaminocarbonylmethylen)ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (EDTA-HA)
Hexadecylamin (4,82 g, 0,02 mol), in trockenem Methanol (60 ml) wurde zu einer Suspension aus Ethylendiamintetraessigsäuredianhydrid (2,56 g, 0,01 mol) in trockenem Methanol (30 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei 50°C während 6 Stunden gerührt. Der resultierende weiße feste Niederschlag wurde durch Filtration isoliert und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, woraus sich 3,43 g (64%) EDTA-HA ergaben. SMP. 156–158°C.
IR: 3320 cm^–1 für OH; 1670 cm^–1 für -C(=O)-.
B. Herstellung von N,N'-Bis(hexadecylaminocarbonylmethylen)-N,N'-bis(β-N,N-dimethylaminoethylaminocarbonylmethylen)ethylendiamin (EDTA-HA-DMA)
Zu einer gekühlten (5°C) Lösung aus EDTA-HA aus Schritt A (3,69 g, 0,005 mol), N,N-Dimethylethylendiamin (0,88 g, 0,01 mol) und CHCl₃ (100 ml) wurde eine Lösung aus 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (2,227 g, 0,011 mol) in CHCl₃ (20 ml) tropfweise zugegeben. Ein Niederschlag wurde beobachtet und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während ungefähr 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde mit 0,5% Essigsäure (100 ml) zum Zersetzen von jeglichem überschüssigen DCC gewaschen. Eine weiße milchige Lösung bildete sich, die sich in zwei Schichten trennte. Die untere organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum eingeengt, um 3,81 g EDTA-HA-DMA als einen wichen Feststoff zu ergeben.
IR: 3280 cm^–1; 2900 cm^–1; 1640 cm^–1; 1530 cm^–1
C. Herstellung von EDTA-HA-DMA-diiodid
Eine Lösung aus EDTA-HA-DMA aus Schritt B (4,2 g, 4,77 mmol), Iodmethan (3,41 g, 24 mmol) und Ethanol (30 ml) wurden unter Rückfluß während 2 Stunden erhitzt. Die ethanolische Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand über Nacht gefriergetrocknet. 3,98 g der Titelverbindung (EDTA-HA-DMA-diiodid) wurden als gelblicher Feststoff erhalten.
IR: 3260 cm^–1; 1650 cm^–1
Beispiel 4
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von DPGS-PEG-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von N-(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-succinyl)succinimid (N-DPGS-succinimid)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus DCC und Acetonitril (10 ml) wurde eine Lösung aus 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-succinat (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) (66,8 mg,), N-Hydroxysuccinimid (11,5 mg), Dimethylaminopyridin (DMAP) (2 mg) und Acetonitril (40 ml) tropfweise gegeben. Die Reaktionsmischung wurde während 5 Stunden gerührt und der resultierende Feststoff wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, um 78 mg N-DPGS-succinimid als ein weißes Produkt zu liefern.
B. Herstellung von 3-ω-Carboxypolyethylengylcoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω-carboxy-PEG)
Zu einer gekühlten Lösung (0 bis 5°C) aus ω-Amino-ω'-carboxypolyethylenglycol (Sheannrater Polymers, Huntsville, AL) (0,3 g) und Triethylamin (40 mg) in CHCl₃ (20 ml) wurde eine Lösung aus N-DPGS-Succinimid aus Schritt A (78 mg) in CHCl₃ (10 ml) tropfweise zugegeben. Die resultierende Lösung wurde während ungefähr 5 Stunden bei 10°C gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde in Eiswasser geschüttet und mit 10% HCl auf einen pH-Wert von weniger als 3 neutralisiert. Die organische Schicht wurde isoliert, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Filtration und Einengen im Vakuum lieferten 0,34 g DPGS-ω-carboxy-PEG als einen weißen Feststoff.
C. Herstellung von 3-Succinamoyloxycarbonylpolyethylengylcoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus DCC (12 mg) in Acetonitril (10 ml) wurde eine Lösung aus DPGS-ω-carboxy-PEG aus Schritt B (200 mg), N-Hydroxysuccinimid (6 mg) und Dimethylaminopyridin (2 mg) gegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wurde während 5 Stunden gerührt. Der weiße Feststoff, der gebildet wurde, wurde aus der Reaktionsmischung durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt. DPGS-ω-carboxy-PEG-succinat wurde als ein weißer Feststoff (200 mg) erhalten.
D. Herstellung des DPGS-PEG-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Cal-Konjugats
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung des Peptids Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (5 mg) in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,5 (20 ml) wurde eine Lösung aus DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid aus Schritt C (40 mg) in Acetonitril (0,1 ml) gegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur während ungefähr 58 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum eingeengt und das Mineralsalz wurde durch eine Membran mit einer Molekulargewichtsobergrenze von ungefähr 1000 dialysiert und auf einer Gefriertrockenapparat getrocknet. Die Titelverbindung (DPGS-PEG-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val) wurde als ein weißer Feststoff (24 mg) erhalten.
Beispiel 5
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von DPPE-PEG-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), das die folgende Formel aufweist.
wobei „Peptid„ Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val ist
A. Herstellung von ω,ω'-Dimethylencarboxypolyethylenglycolanhydrid
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus Chlorsulfonylisocyanat (14,2 mg) in CHCl₃ (5 ml) wurde eine Lösung aus ω,ω'-Dimethylencarboxypolyethylenglycol (0,34 g) und Triethylamin (20 mg) in CHCl₃ (20 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und in Eiswasser geschüttet. Die organische Schicht wurde isoliert und getrocknet (Na₂SO₄). Filtration und Einengen der organischen Schicht im Vakuum ergab die Anhydrid-Titelverbindung als einen weißen Feststoff (0,2 g).
B. Herstellung von 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin-N-carbonylmethylen-ω'-carboxy-polyethylenglycol (DPPE-ω-carboxy-PEG)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung der Anhydridverbindung aus Schritt A (0,3 g) in CHCl₃ (10 ml) wurde eine Lösung aus DPPE (0,07 g) und Triethylamin (0,05 g in CH₂Cl₂ (15 ml) gegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, in Eiswasser geschüttet und mit 10% HCl auf einen pH-Wert von weniger als 3 neutralisiert. Die organische Schicht wurde isoliert und getrocknet (Na₂SO₄). Filtration und Einengen der organischen Schicht im Vakuum lieferten 0,45 g DPPE-ω-carboxy-PEG als einen dunkelweißen Feststoff.
C. Herstellung von 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin-N-cabonylmethylenpolyethylenglycolsuccinimid (DPPE-ω-carboxy-PEG-succinimid)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus DCC (3 mg) in Acetonitril (2 ml) wurde eine Lösung aus DPPE-ω-carboxy-PEG aus Schritt B (60 mg), N-Hydroxysuccinimid (1,8 mg) und Dimethylaminopyridin (0,2 mg) in Acetonitril (6 ml) gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 3 Stunden bei 0 bis 5°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff, der sich gebildet hatte, wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vacuum eingeengt, um 60 mg DPPE-ω-carboxy-PEG-succinimid zu liefern.
D. Herstellung des DPPE-PEG-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val-Konjugats
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val (5 mg) in einer pufterlösung bei einem pH-Wert von 8m5 wurde DPPE-ω-carboxy-PEG-succinimid (40 mg) in Acetonitril (10 ml) tropfweise gegeben. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur während ungefähr 48 Stunden gerührt. Das Acetonitril wurde im Vakuum entfernt und das Mineralsalz wurde durch eine Membran mit einer Molekulargewichtsobergrenze von ungefähr 1000 heraus dialysiert. Gefriertrocknung ergab 35 mg der Titelverbindung (DPPE-PEG-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val) als einen weißen Feststoff.
Beispiel 6
Zu einer Lösung aus Salzlösung, Propylenglycol und Glycerol (8 : 1 : 1) wurde DPPE, DPPE-PEG5000 und DPPA in einem molaren Verhältnis von 82 : 8 : 10 gegeben. Die resultierende Mischung auf ungefähr 45°C erhitzt und filtriert (0,22 μm). Die filtrierte Mischung wurde in ein Fläschchen gegeben und man ließ sie auf Raumtemperatur abkühlen. Das Glasfläschchen wurde zum Evakuieren jeglichen Gases unter Vakuum gesetzt, worauf das Glasfläschchen mit PFP unter Druck gesetzt wurde. Dann wurde das Glasfläschchen dicht verschlossen, auf eine Schüttelvorrichtung gesetzt und bei Raumtemperatur geschüttelt, um eine Lösung aus PFP-gefüllten Vesikeln mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 2,5 μm zu liefern.
Beispiel 7
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung zielgerichteter Vesikel innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
GPIIbIIIa-bindendes Peptid (Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ) wurde kovalent an DPPE-PEG 3400 unter Verwendung des vorstehend in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens gebunden. Dieses Peptidkonjugat wurde dann mit einer getrockneten Lipidmischung aus DPPC (82 Mol-%), DPPE-PEG5000 (8 Mol-%) und DPPA (8 Mol-%) kombiniert. Diese Mischung wurde hydriert und auf einem Labconco Lyph-Lock 12 Gefriertrockenapparat (Kansas Cityl, MO) gefriergetrocknet. Das gefirergetrocknete Material wurde in normaler Salzlösung : Propylenglycol : Glycerol mit 8 : 1 : 1 und mit einer Konzentration von 1 mg/l resuspendiert. Aliquoten dieser Mischung wurden in 2 ml Wheaton-Glasfläschchen (Millville, NJ) gegeben, mit einem deckel verschlossen und der Kopfraum wurde durch Perfluorbutangas (Flura, Newport, TN) ersetzt. Die Glasfläschchen wurden geschüttelt, um eine Vesikelzusammensetzung, die auf den GPIIbIIIa-Rezeptor gerichtet ist, zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 8
Dieses Beispiel umfasst eine Beschreibung von Peptidbindungsexperimenten unter Verwendung der in den Beispielen 6 und 7 hergestellten Vesikelzusammensetzungen.
Nicht mit Heparin behandeltes menschliches Blut wurde in Vacutainer röhrchen (Becton Dickinson, Rutherford, NJ) gegeben und man ließ es gerinnen. Das Gerinnsel wurde durch Zentrifugieren in einer Beckman TH-6 Zentrifuge (Palo Alto, CA) gesammelt. Dann wurde das Gerinnsel auf positiv geladene Mikroskopie-Objektträger (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) gesetzt. Neun Objektträger wurde mit geronnenem Blut beschichtet. Sechs unbeschichtete Objektträger wurden ebenfalls als Kontrolluntersuchungen verwendet. Dann wurden Bindungsuntersuchungen durch Aufbringen der Vesikelzusammensetzungen aus den Beispielen 6 und 7 (200 μl) auf die vorstehend erwähnten Objektträger folgendermaßen durchgeführt: (A) nur Blutgerinnsel (Kontrolle) (B) Vesikelzusammensetzung aus Beispiel 6 ohne Blutgerinnsel; (C) Vesikelzusammensetzung aus Beispiel 6 mit Blutgerinnsel; (D) Vesikelzusammensetzung aus Beispiel 7 ohne Blutgerinnsel und (E) Vesikelzusammensetzung aus Beispiel 3 mit Blutgerinnsel. Die Objektträger wurden während 20 Minuten inkubiert und dann wurde ungebundenes Material unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung abgewaschen. Die Objektträger wurden dann unter Verwendung eines Nikon Diaphot (Tokyo, Japan) Mikroskops beobachtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle ausgeführt: TABELLE 3

Bindungsuntersuchung Bindung

(A) keine

(B) keine

(C) keine

(D) keine

(E) ja
Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich ist, wurde eine Bindung nur mit der in Beispiel 7 hergestellten Vesikelzusammensetzung, die das auf GPIIbIIIa zielgerichtete Peptid enthält, beobachtet.
Beispiel 9
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von Vesikeln basierend auf menschlichem Serumalbumin, das auf den GPIIbIIIa-Rezeptor zielgerichtete Liganden trägt.
In einen Behälter wird eine Suspension aus 5% menschlichem Serumalbumin eingeführt. Die Suspension wird unter Vakuumbedingungen entgast und ein Kopfraum mit Perfluorpropangas wird, wie in der veröffentlichten internationalen Anmeldung WO 95/29705, auf deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird, beschrieben ist, eingeführt. Die resultierenden gasgefüllten Albuminvesikel werden von jeglichem freien Albumin durch wiederholtes Waschen mit normaler Salzlösung getrennt. Die gasgefüllten Vesikel werden in einer Mischung aus normaler Salzlösung : Propylenglycol : Glycerol (6 : 2 : 2, v : v : v) resuspendiert und die Suspension wird vorsichtlig gemischt. Zu dieser Suspension wird 1 Gewichts-% Glutaraldehyd und 1 Gewichts-% des Peptids Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val gegeben, was zu vernetzten Perfluorpropanvesikeln führt, die das GPIIbIIIa-bindende Peptid tragen.
Beispiel 10
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von Vesikeln, die durch polymerisierbare Acryloyl/Styryl-Lipidanaloga bindende Zielliganden, die auf den GPIIbIIIa-Rezeptor gerichtet sind, stabilisiert sind.
12-Hydroxydodecansäure wird mit Methacryloylchlorid verestert und der Ester wird zu einem Anhydrid umgewandelt, wobei 12-(Methacryloyloxy)dodecansäureanhydrid zur Verfügung gestellt wird. Aus ei-Lecithin stammendes L-alpha-Glycerophosphocholin wird mit dem 12-(Methacryloyloxy)dodecansäureanhydrid acyliert, woraus sich Bis[12-(Methacryloyl)oxydodecanoyl]-L-alpha-phosphatidylcholin (1) ergibt. Die Verbindung (1) wird enzymatisch mit Phospholipase A₂, die aus dem rohen Klapperschlagengift (Crotalus adamanteus) stammt, hydrolysiert, gefolgt von Acylierung mit Palmitoylanhydrid, um 1-[2-(Methacryloyloxy)dodecanoyl]-2-palmitoyl-L-alpha-phosphatidylchoin (2) zu liefern. Ähnliche Verfahren werden zum Umsetzen von Dipalmitoyl-L-alpha-phosphatidylcholin in 1-Palmitoyl-2-[12-(methacryloyloxy)dodecanoyl]-L-alpha-phosphatidylcholin (3) verwendet.
Zu einer Lösung aus DPPE-PEG 5000 (1,8 mg/ml) und 10 Gewichts-% DPPE-PEG 5000, markiert mit GPIIbIIIa-bindenden Peptid (Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), das unter Verwendung des vorstehend in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens hergestellt wird, in normaler Salzlösung wird die vorstehend hergestellte Verbindung (3) gegeben. Ein Aliquot dieser Lösung wird in ein steriles 3 ml Glasfläschchen gegeben. Der Kopfraum des Glasfläschchens wird evakuiert und eine Mischung aus Stickstoff und Perfluorethangas (20 : 80, v/v) wird in den Kopfraum des Glasfläschchens bis zu Umgebungsdruck gefüllt. Das Glasfläschchen wird auf einem ESPE Capmix (Seefeld, Oberay Deutschland) bei Raumtemperatur während ungefähr 1 Minute geschüttelt. Die Vesikelzusammensetzung wird bestrahlt (254 nm), um polymerisierte gasgefüllte Vesikel, die das GPIIbIIIa-bindende Peptid tragen, zur Verfügung zu stellen. Der mittlere Durchmesser der Vesikel wird ungefähr 3 μm betragen.
Beispiel 11
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von synthetischen Polybis(carboxylatphenoxy)phosphazen) (PCPP) gasgefüllten Vesikeln, die auf den GPIIbIIIa-Rezeptor gerichtet sind.
PCPP-PEG2000-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val wird unter Verwendung des vorstehend in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens hergestellt. PCPP-Vesikel werden dann entsprechend der Beschreibung in dem U.S Patent Nr. 5,487,390, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird, hergestellt. Die PCPP-Vesikel (100 mg) werden zu 1 ml einer Na₂CO₃-Lösung (30 mg/ml) gegeben und werden unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird mit phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) verdünnt, um eine Polymerendkonzentration von 2,5% (w/v) und einen Lösungs-pH-Wert von 7,4 zu liefern. Der pH-Wert wird bei Bedarf mit 1 N HCl eingestellt.
Eine Lösung von PCPP (2,5% w/v), die 0,2% Tween 20 enthält; wird mit Perfluorpropangas in einer Kolloidmühle zur Herstellung einer gashaltigen PCPP-Lösung, die über mehrere Stunden stabil ist, gemischt. Zehn Mol-% des in der lösung verwendeten PCPPs wird PCPP-PEG2000-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val. Die gashaltige Lösung wird aus einer Spritzenpump mit 150 μl/min in eine Luft-Zerstäubungssvorrichtung unter einer Atmosphäre von Perfluorpropangas extrudiert und in eine Schale, die 250 ml einer 7,5% CaCl₂-Lösung, enthaltend 0,5% Tween 20, enthält, gesprüht. Bei Kontakt mit der CaCl₂-Lösung wird PCPP durch die zweiwertigen Calciumionen unter Herstellung einer relativ homogenen Population kugelförmiger Gelvesikel, die auf GPIIbIIIa gerichtet und mit Perfluorpropan gefüllt sind, vernetzt. Das Vorhandensein von eingeschlossenem Perfluorpropan wird durch Beobachten der Vesikel unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops gezeigt.
Beispiel 12
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von Vesikeln, die auf den GPIIbIIIa-Rezeptor gerichtet sind und die aus einem fluorierten Lipid formuliert sind.
Die Aminogruppe in α-Amino,ω-carboxy-PEG3400 (Shearwater Polymer, Huntsville, AL) wird durch Lösen von einem Äquivalent des α-Amino,ω-carboxy-PEG3400 in einer Lösung von Wasser : Dioxan (1 : 1, v : v) geschützt. Zu dieser rührenden Lösung wird ein Moläquivalent von jeweils t-Boc-anhydrid (Bachem, Gardena, CA) und Triethylamin (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) gegeben. Die resultierende Lösung wird über Nacht gerührt und im Vakuum zum Entfernen des leicht flüchtigen Dioxans eingeengt. Zu dem eingeengten Material werden zehn Volumenäquivalente, bezogen auf Wasser, von Ethylacetat gegeben und die resultierende Mischung wird mit einem Eisbad gekühlt. Der pH-Wert der Mischung wird mit wässriger 2 N Schwefelsäure auf pH-Wert 2 eingestellt und die niedrigere wässrige Schicht wird unter Verwendung eines Scheidetrichters entfernt. Die Ethylacetatschicht wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und im Vakuum eingeengt, woraus sich ein Sirup ergab.
Das t-BOC-α-amino,ω-carbonyl PEG3400, ein Moläquivalent Diisopropylcarbodiimid (DIC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und trockener DMF werden kombiniert.
Die Lösung wird gerührt und jeweils ein Äquivalent von Diisopropylethylamin (DIEA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 1,2-Di-(15,16,17,18-nonafluor)stearoylphosphatidylethanolamin (Fluor-DSPE) werden zugegeben. Die resultierende Lösung wird während 2 Stunden gerührt und im Vakuum eingeengt. Das Fluor-DSPE-t-BOC-α-amino,ω-amido PEG3400 wird in einer Lösung aus Trifluoressigsäure und CH₂Cl₂ (4 : 6, v : v) suspendiert, gefolgt von weiterem Rühren während 20 Minuten. Dann wird die Lösung mit DIEA neutralisiert und im Vakuum eingeengt. Das Produkt wird in CH₂Cl₂ resuspendiert und wässrige HCl wird bis zu einem pH-Wert von ungefähr 2 zugegeben. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und der pH-Wert auf wieder auf einen pH-Wert von 10 mit 1,0% NaOH eingestellt. Zu der wässrigen Mischungen wird Ethylacetat zugegeben, das abgetrennt, mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und (MgSO₄) getrocknet wird. Filtration und Einengen im Vakuum wird das Fluor-DSPE-α-amino,ω.amido-PEG3400 als gelbes Öl zur Verfügung stellen.
Das vorstehend erhaltene gelbe Öl, ein Äquivalent N-Bromsuccinimid (NBS) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) und DMF werden kombiniert. Die resultierende Mischung wird während 3 Stunden gerührt und im Vakuum über Nacht eingeengt. Das eingeengte Material wird in phosphatgepufferter Salzlösung bei einem pH-Wert von 7 suspendiert. Das Peptid Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS), das auf den GPIIbIIIa-Rezeptor zielt, wird zu der Suspension gegeben. Nach Rühren über Nacht wird die Reaktionsmischung mit einem Amicon Filterkonzentrationsapparat (Amicon, Beverly, MA) auf ein Volumen von 300 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wird durch Größenausschlußchromatographie gereinigt, woraus sich Fluor-DSPE-α-amino,ω.amido-PEG3400-Arg-Gly-Asp-Ser ergibt. Dieses Produkt wird zu einer Mischung aus DPPC und DPPA gegeben, um DPPC : Fluor-DSPE : DPPA mit einem Verhältnis von 40 : 54 : 6, w : w : w zur bereitzustellen. Diese Lipidmischung wird zu einem Verdünnungsmittel, umfassend normale Salzlösung : Glycerol : Propylenglycol (8 : 1 : 1, v : v : v), gegeben, um eine Lipidendkonzentration von 1 mg/ml Verdünnungsmittel bereitzustellen. Ein Aliquot dieser Lösung wird in ein 2 ml Glasfläschchen (Wheaton Industries, Chicago, IL) eingeführt und der Kopfraum wird mit Perfluorpropan gefüllt. Das Glasfläscchen wird auf einem ESPE Capmix (ESPE, Seefeld, Deutschland) mit 4300 Upm während 1 Minute gerührt, um die auf den GPIIbIIIa-Rezeptor gerichteten fluorierten Vesikel zu ergeben.
Beispiel 13
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von N-(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-succinyl)-PEG-Protein A-Konjugat, das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von N-DPGS-succinimid
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-2-succinat (66,8 mg), N-Hydroxysuccinimid (11,5 mg), DMAP (2 mg) und Acetonitril (40 ml) in einem 100 ml Rundkolben wurde eine Lösung aus DCC (20,6 mg) in Acetonitril (10 ml) tropfweise zugegeben. Die resultierende Mischung wurde während 5 Stunden gerührt. Das feste Material, das sich während der Reaktion (Dicyclohexylharnstoff) bildete, wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, woraus sich 78 mg N-DPGS-succinimid als ein weißes Produkt ergaben.
B. Herstellung von 3-ω-Carboxy-polyethylenglycoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω.carboxy-PEG)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung von N-DPGS-succinimid aus Schritt A (78 mg) und CHCl₃ (10 ml) (Mallinckrodt, St. Louis, Mo.) in einem 100 ml Rundkolben wurde eine Lösung aus ω-Amino-ω'-carboxypolyethylenglycol (0,3 g) und Triethylamin (40 mg) in CHCl₃ (20 ml) tropfweise zugegeben. Die resultierende Mischung wurde während 5 Stunden bei 10°C gerührt. Nach Rühren über Nacht wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser geschüttet und mit 10% HCl auf einen pH-Wert von ungefähr 3 oder weniger neutralisiert. Die untere organische Schicht wurde unter Verwendung eines Scheidetrichters entfernt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde gesammelt und getrocknet (NaSO₄). Filtration und Einengen im Vakuum ergaben 0,34 g DPGS-ω-carboxy-PEG als einen weißen Feststoff.
C. Herstellung von 3-Succinamoyloxycarbonylpolyethylenglycoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus DPGS-ω-carboxy-PEG (200 mg) aus Schritt B, N-Hydroxysuccinimid (6 mg), DMAP (2 mg) und Acetonitril (40 ml) in einem 250 ml Rundkolben wurde eine Lösung aus DCC (12 mg) in Acetonitril (10 ml) tropfweise zugegeben. Die resultierende Mischung wurde während 5 Stunden gerührt und der weiße Feststoff, der sich bildete (Dicyclohexylharnstoff), wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, woraus sich 200 mg DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid als ein weißer Feststoff ergaben.
D. Herstellung von DPG-PEG-Protein A-Konjugat
Zu einer gekühlten (5 bis 10°C), gerührten Lösung aus Protein A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (20 mg) in wässrigem Puffer (20 ml) bei einem pH-wert von 8,5 wurde eine Lösung aus DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid aus Schritt C (4 mg) und Acetonitril (10 ml) tropfweise zugegeben. Die Temperatur der resultierenden Mi schung wurde auf Raumtemperatur äquilibriert und die Reaktionsmischung wurde während ungefähr 48 Stunden gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum eingeengt und die restlichen Salze wurde unter Verwendung einer Dialysetasche mit einer Molekulargewichtsobergrenze von ungefähr 3500 unter Äquilibrieren gegen Wasser herausdialysiert. Die resultierende dialysierte Lösung wurde gefroren und gefriergetrocknet, woraus sich 12 mg des Titelmaterials (DPGS-PEG-Protein A-Konjugat) als ein weißer Feststoff ergaben.
Beispiel 14
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung des DPPE-PEG-Protein A-Konjugats, das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von ω,ω'-Dimethylencarboxypolyethylenglycolanhydrid
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus ω,ω'-Dimethylencarboxypolyethylenglycol (0,34 g) und CHCl₃ (20 ml) in einem 100 ml Rundkolben wurde eine Lösung aus DCC (0,02 g) CHCl3 (5 ml) gegeben. Diese Lösung wurde über Nacht gerührt, und der resultierende weiße feste Niederschlag (Dicyclohexylharnstoff) wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, um 0,3 g Anhydrid als einen weißen Feststoff zur Verfügung zu stellen.
B. Herstellung von 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin-N-carbonylmethylen-ω'-carboxypolyethylenglycol (DPPE-ω-carboxy-PEG)
Zu einer gekühlten (0 bis 510°C) Lösung aus Anhydrid aus Schritt A (0,3 g) und CH₂Cl₂ (10 ml) in einem 100 ml Rundkolben wurde eine Lösung aus DPPE (0,07 g) und Triethylamin (0,05 g) in CH₂Cl₂ (15 ml) gegeben. Nach Rühren über Nacht wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser geschüttet und mit 10% HCl auf einen pH-Wert von ungefähr 3 oder weniger angesäuert. Die untere organische Schicht wurde dann unter Verwendung eines 250 ml Scheidetrichter abgetrennt und getrocknet (NaSO₄). Filtration und Einengen der CH₂Cl₂-Lösung im Vakuum ergab 0,45 g DPPE-ω-carboxy-PEG als einen schmutzig weißen Feststoff.
C. Herstellung von 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethylamin-N-carbonylmethylenpolyethylenglycolsuccinimid (DPPE-ω-carboxy-PEG-succinimid)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus DCC (3 mg) und Acetonitril (2 ml) wurde eine Lösung aus DPPE-ω-carboxy-PEG aus Schritt B (60 mg), N-Hydroxysuccinimid (1,8 mg) und DMAP (0,2 mg) in Acetonitril (6 ml) gegeben. Nach Rühren während 3 Stunden bei 0 bis 5°C wurde die Temperatur der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur äquilibriert. Nach Rühren über Nacht wurde der weiße feste Niederschlag, der gebildet worden war (Dicyclohexylharnstoff), durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, woraus sich 60 mg DPPE-ω-carboxy-PEG-succinimid ergaben.
D. Herstellung des DPPE-PEG-Protein A-Konjugats
Zu einer gekühlten (5 bis 1°C) Lösung von Protein A (20 mg) in 15 ml wässrigem Puffer (15 ml) bei einem pH-Wert von 8,5 wurde DPPE-ω-carboxy-PEG-succinimid aus Schritt C (4 mg) in Acetonitril (8 ml) tropfweise zugegeben. Die Temperatur der Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur äquilibriert und Rühren wurde während 48 Stunden fortgesetzt. Die Mischung wurde im Vakuum eingeengt und die zurückbleibenden Salze wurden gegen Wasser unter Verwenden einer Dialysemembran mit einer Molekulargewichtsobergrenze von ungefähr 3500 dialysiert. Die wässrige dialysierte Probe wurde gefriergetrocknet, woraus sich 15 mg des Titelprodukts (DPPE-PEG-Protein A-Konjugat) als ein weißer Feststoff ergaben.
Beispiel 15
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung und Verwendung einer zielgerichteten Vesikelzusammensetzung zur Zielen auf epitheliale Zellen.
A. Herstellung der Vesikelzusammensetzung
Das DPGS-PEG-Protein A-Konjugatprodukt aus Beispiel 13 (1 Gewichts-%) wurde mit einer getrockneten Lipidmischung aus DPPC (82 Mol-%), DPPA (10 Mol-%) und DPPE (8 Mol-%) kombiniert. Diese trockene Lipidmischung wurde hydriert und auf einem Labonco (Kansas City, MO) Lyph-Lock 12 Gefriertrockenapparat gefriergetrocknet. Die gefriergetrocknete Mischung wurde in normaler Salzlösung_Propylenglycol_Glycerol (8 : 1 : 1) bei einer Lipidkonzentration von 1 mg/ml resuspendiert. Die Mischung wurde in Aliquoten in 2 ml Wheaton Glasfläschchen (Millville, NJ) gegeben. Die Glasfläschchen wurden mit einem Deckel verschlossen und der Kopfraum in den Glasfläschchen wurde durch Perfluorbutangas (Flura, Newport, TN) ersetzt. Dann wurden die Glasfläschchen während einer Minute auf einem Espe Capmix^® (Seefeld, Deutschland) zum Bereitstellen der gasgefültlen Vesikel geschüttelt. Kaninchen-Anti-Keratin-Antikörper (Calbiochem, San Diego, CA) (100 μl) wurde zu einer Probe der Glasfläschchen gegeben und diese Glasfläschchen wurden zum Mischen des Antikörpers mit den gasgefüllten Vesikeln umgekehrt. Die Glasfläschchen wurden bei Raumtemperatur während ungefähr 1 Stunde inkubiert.
Ein Bicinchoninsäureproteinassay (Pierce, Rockford, IL) wurde mit den Vesikelzusammensetzungen sowohl vor als nach dem Waschen mit PBS durchgeführt. DIESER Assay zeigte, dass der Anti-Keratin-Antikörper an die Vesikel über Protein A gebunden war und während des Waschens gebunden blieb.
B. B. Experimente mit den Vesikelzusammensetzungen bezüglich des gerichteten Zielens
HeLa-Zellen (eine epitheliale zervikale Krebszellinie, die Keratin exprimiert) wurde in Gewebekulturröhrchen mit flachen Seiten (Nunc, Roskilde, Dänemark) in EMEM-Medien (Cellgro, Washington, DC) ausgestrichen. Die Zellen wurden über Nacht vermehrt und Aliquoten der Vesikelzusammensetzungen wurden zu jedem Röhrchen gegeben. Die verwendeten Vesikelzusammensetzungen waren: (i) Vesikel aus Beispiel 6, (ii) in Schritt A hergestellte Vesikel, die keinen Kaninchen-Anti-Keratin-Antikörper enthielten, und (iii) in Schritt A hergestellte Vesikel, die Kaninchen Anti-Keratin-Antikörper enthielten. Nur die Vesikel in (iii), die den Antikörper umfassten banden an die HeLa-Zellen.
Beispiel 16
Ein pegyliertes Lipid wird aus Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) und α-Amino,ω-carboxy-PEG3400 (Sheannrater Polymer, Huntsville AL) hergestellt. Die Aminogruppe wird durch Kombinieren in Wasser Dioxan (1 : 1, v : v) von α-Amino-ω-amido-PEG und je einem Moläquivalent von t-Boc-anhydrid (Bachem, Gardena, CA) und Triethylamin (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI). Die resultierende Lösung wird über Nacht gerührt und das Dioxan wird im Vakuum entfernt. Zu dem wässrigen Rückstand werden zehn Volumenäquivalente, bezogen auf Wasser, von Ethylacetat (Mallincrodt, St. Louis, MO) gegeben und diese Mischung wird in einem Eisbad abgekühlt. Der pH-Wert wird mit wässriger Schwefelsäure (2 N) auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und die wässrige Schicht wird unter Verwendung eines Scheidetrichters abgetrennt. Die Ethylacetatschicht wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt, um einen Sirup zu ergeben.
Das gelbliche Öl, DSPE-t-Boc-α-amino,ω-amido-PEG3400, ein Moläquivalent Diisopropylcarbodiimid (DIC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und trockener Dimethylformamid (DMF) werden kombiniert. Die Lösung wird gerührt und je ein Moläquivalent von Diisopropylethylamin (DIEA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und Hydroxylbenzotriazol (BOBT) werden zugegeben. Die Lösung wird während zwei Stunden gerührt und im Vakuum eingeengt. Der eingeengte Rückstand DSPE-t-BOC-α-amino,ω-amido-PEG3400 wird mit Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (4 : 6, v : v) kombiniert und die resultierende Mischung wird weitere 20 Minuten gerührt. Die Lösung wird mit DIEA neutralisiert und im Vakuum eingeengt. Dieser Rückstand wird in Methylenchlorid resuspendiert und wässrige Salzsäure wird zugegeben, bis ein pH-Wert von 2 erhalten wird. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und der pH-Wert wird mit 1% NaOH auf einen pH-Wert von 10 eingestellt. Zu dieser wässrigen Mischung wird Ethylacetat zugegeben, das abgetrennt, mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO₄) wird. Die Ethylacetatlösung wird im Vakuum eingeengt, woraus sich ein gelbes Öl ergibt.
Zu einer Lösung des gelben Öls, DSPE-α-amino,ω-amido-PEG3400 in DMF wird ein Äquivalent N-Bromsuccinimid (NBS) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) gegeben. Nach Rühren während 3 Stunden wird die Reaktionsmischung über Nacht im Vakuum eingeengt. Zu einer Suspension des resultierenden eingeengten Rückstands wird in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) bei einem pH-Wert von ungefähr 7 Anti-embryonales Karzinom-Antigen (Anti-CEA) gegeben, das ein monoklonaler Antikörper von chimärem Maus/Mensch Ursprung ist. Nach Rühren über Nacht wird die Lösung mit einem eingeengt Amicon Filterkonzentrationsapparat (Amicon, Beverly, MA) auf ein Volumen von 300 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wird durch Größenausschlußchromatographie gereinigt, woraus sich das Endprodukt ergibt.
Beispiel 17
Eine Vesikelformulierung wird durch Wiederholen von Beispiel 6 hergestellt, außer, dass vor der Vesikelbildung ungefähr 1 Nanomol des rekombinanten menschlichen Wachstumshormons zu der Lipidzusammensetzung gegeben wird.
Beispiel 18
Beispiel 17 wird wiederholt, außer, dass DPPA gegen das kationische Lipid Dipalmitoylphsophocholin (Avati) ersetzt wird und DPPC gegen das neutrale Lipid DPPE ersetzt wird. Dies wird kationische Vesikel zur Verfügung stellen, an die bioaktive Mittel, insbesondere genetisches Material, wie zum Beispiel das Gen für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), binden können. Der Einbau eines Zielliganden, wie zum Beispiel ein anti-myokardiales AntikörperLipid-konjugat, wird zielgerichtete Vesikel, die auf das infarzierte und/oder ischämische Gewebe gerichtet werden können, zur Verfügung stellen. Ein Burst von Hochenergieultraschall, zum Beispiel 1 MHz kontinuierliche Welle 200 mW, kann mit variierender Pulsdauer angewandt werden, um das Zerreißen der Vesikel zu fördern. Als ein Ergebnis kann der VEGF direkt an das infarzierte und/oder ischämische Gewebe abgegeben werden.
Beispiel 19
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung einer Vesikelzusammensetzung, die auf Neuroendokrintumore der Bauchspeicheldrüse gerichtet ist.
Beispiel 16 wird wiederholt, abgesehen davon, dass Somatostatinpeptid anstelle von Anti-CEA verwendet wird. Ein therapeutisches Anti-Krebsmittel, Streptozocin wird ebenfalls in die Vesikelzusammensetzung eingebaut. Die resultierende Vesikelzusammensetzung wird intravenös in einen Patienten injiziert, bei dem ein Neuroendocrintumor diagnostiziert worden ist. Die Vesikel werden vorzugsweise in der Region der Bauchspeicheldrüse in der Nähe des Tumors absorbiert, wodurch eine erhöhte Abgabe des Anti-Krebsmittels an den Tumor resultiert.
Beispiel 20
Beispiel 15 wurde wiederholt, abgesehen davon, dass zusätzlich zu den HeLa-Zellen die zielgerichteten Vesikel ebenfalls zu einer epithelialen Zelllinie, umfassend normale Mausleberzellen, gegeben wurden. Nur die Vesikel, die die Antikörper enthielten, wurden and die Leberzellen gebunden.
Beispiel 21
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung und Verwendung einer Vesikelzusammensetzung, die auf myokardiale Zellen (Herzmuskelzellen) gerichtet ist.
A. Herstellung der zielgerichteten Vesikel
Beispiel 15 wurde wiederholt, abgesehen davon, dass Kaninchen-Anti-Keratin-Antikörper gegen Kaninchen-Anti-Mensch-Skelettmyosin-Antikörper (Biomakor^TM, Kiryat Weizmann, Rehovot, Israel) (100 μl) ersetzt wurde.
B. Zielen auf myokardiale Zellen
Ratten-Herzmyoblasten (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurde in Gewebekulturröhrchen mit flachen Seitenn (Nunc, Roskilde, Dänemark) in EMEM-Medien (Cellgro, Washington, DC) ausgestrichen. Die Zellen wurden über Nacht vermehrt und zu jedem Röhrchen wurden Aliquoten der Vesikelzusammensetzungen gegeben. Die verwendeten Vesikelzusammensetzungen waren (i) Vesikel aus Beispiel 6, (ii) in Schritt A hergestellte Vesikel, die keinen Kaninchen-Anti-Myosin-Antikörper enthielten, und (iii) in Schritt A hergestellte Vesikel, die Kaninchen Anti-Myosin-Antikörper enthielten. Nur die Vesikel in (iii), die den Antikörper umfassten, banden an die Myoblastzellen.
Beispiel 22
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung und Verwendung einer Vesikelzusammensetzung, die auf myokaridale Zellen (Herzmuskelzellen) gerichtet ist.
A. Herstellung der zielgerichteten Vesikel
Beispiel 15 wurde wiederholt, abgesehen davon, dass Kaninchen-Anti-Keratin-Antikörper gegen Kaninchen-Anti-Myosin (Skelett) Antikörper (Accurate Chemical, Westburyl, NY) (100 μl) ersetzt wurde.
B. Zielen auf myokardiale Zellen
H9C2, eine Ratten Herzmuseklzellline, die kardiales Myosin exprimiert, wurde verwendet (Skelettmuskelmyosin und akrdiales Muskelmyosin sind im Wesentlichen ähnlich). Die Kontrollzelllinie war INT407, die eine menschliche intestinale Zelllinie ist. Die Zellen wurden in Gewebekulturröhrchen mit flachen Seiten (Nunc, Roskilde, Dänemark) in EMEM-Medien (Cellgro, Washington, DC) ausgestrichen. Die Zellen wurden über Nacht vermehrt und Aliquoten der Vesikelzusammensetzungen wurden zu jedem Röhrchen gegeben. Die verwendeten Vesikelzusammensetzungen waren: (i) Vesikel aus Beispiel 6, (ii) in Schritt A hergestellte Vesikel, die keinen Kaninchen-Anti-Myosin-Antikörper enthielten, und (iii) in vorstehendem Schritt A hergestellte Vesikel, die Kaninchen Anti-Myosin-Antikörper enthielten. Drei experimentelle Zelltypen wurden verwendet: (a) INT407, (b) H9C2 und (c) H9C2, die 10% Glucose während 10 Minuten zum Schocken der Zellen ausgesetzt wurden und die Poren öffnet, wobei das Binden des Antimyosins an das zytoplasmatische Myosin gestattet wird. Mit den Vesikelzusammensetzungen (i) oder (ii) wurde in jeder der Zellarten (a), (b) oder (c) kein Binden beobachtet. Die Vesikelzusammensetzung (iii) band ebenfalls nicht an Zelltyp (a). Etwas Binden der Vesikelzusammensetzung (iii) an Zelltyp (b) wurde beobachtet, wohingegen ein beträchtliches Binden der Vesikelzusammensetzung (iii) an Zelltyp (c) beobachtet wurde.
Beispiel 23
Dipyridamol (siehe zum Beispiel The Merck Index, 10. Ausgabe, S. 489 (1983)) ist im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung darin ein bioaktives Mittel, dass es ein Koronarvasodilator ist. Dipyridamol ist ebenfalls ein Zielligand im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, da es an einen oder mehrere Rezeptoren im Herzgewebe binden kann, und ebenfalls an Phospholipide gebunden werden kann, um Membran kompatible Derivate zur Verfügung zu stellen. Insbesondere wird N-Succinyl-DPPE an Dipyridamol unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und einem Katalysator als Kondensationsmittel zum Bilden von N-Dipyridamolylsuccinat-DPPE binden. Dieses Lipid gebundene Dipyridamolderivat wird in einer Lipidzusammensetzung zur Herstellung der Vesikel zum Zielen auf Herzgewebe verwendet werden.
Beispiel 24
Ein Ballonkatheter wird perkutan über einen femoralen arteriellen Zugang in die linke Circumflex-Koronararterie eines Labortieres gesetzt. Der Ballon wird über eine Zeitdauer von drei Stunden aufgeblasen, wobei er eine Blutfluß zu anterolateralen Herzmuskulatur verhindert und zu einem myokardialen Infarkt führt. Die Exhodardiographie wird mit einem 5 MHz Messwandler durchgeführt und wird eine anhaltende Abnormalität der Wandbewegung, sowie ein myokardiales Dünnerwerden der anterolateralen Wand der linken Herzkammer offenbaren. Der Ballon wird entleert und eine Dosis von 30 μl/kg mit Anticardiomyosin-Antikörper markierte Vesikel, die ähnlich zu denjenigen sind, die zum Beispiel in Schritt A von Beispiel 22 hergestellt wurden, und die mit Dodecafluorpentangas gefüllt sind, werden intravenös injiziert. Die Echocarkiographie wird dreißig Minuten nach der Injektion durchgeführt. Die Abbildung wird einen Bereich mit erhöhtem Echovermögen in der anterolateralen Wand zeigen, die der Region des Infarkts entspricht. Die Peripherie des Infarkts (wiederdurchblutete Region) erscheint am hellsten mit einer geringeren Intensität in Zentrum (Region einer anhaltenden Abwesenheit der Durchblutung). Im Vergleich dazu, ist die zentrale ventrikuläre Kavität relativ dunkel, wobei die Mehrheit der Vesikel zu diesem Zeitpunkt verschwunden sind.
Beispiel 25
Ein an Brustschmerzen leidender Patient wird in der Notfallaufnahme eines krankenhauses aufgenommen. Eine Ultraschalluntersuchung wird durchgeführt werden und wird eine Abnormalität in der Wandbewegung der vorderen Wand der linken Herzkammer anzeigen. Dem Patienten wird eine Dosis von 5 μl/kg mit Anticardiomyosin-Antikörper markierte Vesikel, die ähnlich zu denjenigen sind, die zum Beispiel in Schritt A von Beispiel 22 hergestellt wurde, die mit Perfluorbutangas gefüllt sind, verabreicht. Zehn Minuten nach Verabreichung wird die Ultraschallabbildung wiederholt und wird einen Bereich mit erhöhtem Echovermögen in der vorderen Wand der linken Herzkammer zeigen. Dieses wird die Diagnose eines myokardialen Infarkts bestätigen und der Patient wird mit Gewebeplasminogenaktivator behandelt werden.
Beispiel 26
Ein Patient wird sich einer Belastungsechokardiographieuntersuchung unterziehen, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Koronararterienerkrankung zu diagnostizieren. Während der Peakübung wird dem Patienten 5 μg/kg Perfluorpropan-gefüllte Vesikel, die mit Dipyridamol, entsprechend der Beschreibung in vorstehendem Beispiel 23 markiert sind, verabreicht. Das Dipyridamol wird mit den Vesikel durch die Verwendung von (a) einer bifunktionellen Bindungsgruppe, (b) eines Moleküls mit kleiner Ausdehnung, (c) einer Schiffschen Base mit oder ohne reduktive Aminierung oder (d) eines Maleimidyllinkers kombiniert. Die Vesikel werden an die durchbluteten Regionen der Herzmuskulatur binden. Nach Verschwinden der Vesikel, das ungefähr 5 Minuten braucht, werden die markierten Vesikel innerhalb der Herzmuskulatur weiterhin vorhanden sein. Eine verzögerte Abbildung wird die ischämische Herzmuskulatur, die durch die Koronararterienerkrankung (CAD) beeinflusst ist, zeigen, da eine hypointensive Region von einer hellen normal durchbluteten Herzmuskulatur umgeben ist. Die Abwesenheit jeglicher merklicher Hintergrundvesikel innerhalb der Herzkammern beseitigt das Problem einer Schattenbildung und erleichtert das Erstellen der CAD-Diagnose.
Beispiel 27
Dieses Beispiel zeigt die Expression eines Proteins, auf die unter Verwendung einer Vesikelzusammensetzung und Verfahren innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung gezielt wird.
Drei Sprague-Dawley-Ratten, die hier als Ratten (A), (B) und (C) gekennzeichnet sind, wurden mit Ketaminacepromazin betäubt. pSVβ-gal, ein Plasmid, das das β-Galactodisasegen mit dem SV40-Promotor und Verstärkergenen enthielt, wurde mit der in Beispiel 2 hergestellten kationischen Lipidverbindung kombiniert. Die Mischung aus Plasmid und kationischer Lipidverbindung wurde während 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. cGMP und das resultierende inkubierte Material wurden dann zu einer Mischung aus DPPC, DPPA und DPPE-PEG5000 mit dem entsprechenden molaren Verhältnis von 82 : 10 : 8 in normaler Salzlösung : Glycerol.Propylenglycol (8 : 1 : 1) gegeben. Die Vesikel wurden durch Schütteln der resultierenden Mischung auf einem WIG-L-BUG^TM während einer Minute bei 3200 Upm hergestellt. Die resultierende Vesikelzusammensetzung wurde in die Ratten (A), (B) und (C) injiziert. Die Dosierungen waren die Folgenden.
Während der Injektion der Vesikelzusammensetzung wurden die Ratten (B) und (C) der Ultraschallenergie aus einer therapeutischen Ultraschallvorrichtung (1,0 MHz, Rich-Mar Modell 25, Rich-Mar Corporation, Inola, OL) ausgesetzt. Der Ultraschall wurde während der Injektion und während einer Minute nach dem Einspülen auf das Innere des linken Hinterbeines gerichtet. Die Ratte (A) erhielt keine Ultraschallbehandlung. Nach 48 Stunden wurden die Ratten durch Erstickung mit CO₂ schmerzlos abgetötet. Der linke und rechte Beinmuskel und die Haut wurden von jeder Ratte entfernt. Die Herzen, Leber und Nieren wurden ebenfalls entfernt. Die geschnittenen Gewebe wurden während 72 Stunden in 2% Formalin fixiert. Nach dem Fixieren wurde das Vorhandensein von β-Glactosidaseaktivität durch Tränken des Gewebes in einer Lösung untersucht, die X-gal, Kaliumferrocyanid und Kaliumferricyanid enthielt. Die Gewebe wurden gefärbt, untersucht und photographiert. Eine Expression wurde breit dispergiert überall in den Beingeweben, besonderes in den endothelialen Zellen, Muskel und Haut in der Ratte (A) gesehen. Die Untersuchung der aus der Ratte (B) geschnittenen Gewebe zeigte eine Expression in ähnlichen Zelltypen, jedoch nur an der Stelle der Ultraschallanwendung. Die Ratte (C) zeigte eine Punktexpression in dem Zielbein und eine dispergierte Expression in dem Bein, auf das nicht gezielt wurde.
Beispiel 28
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung verschiedener Lipidzusammensetzungen. DPPC, DPPA und DPPE-PEG5000 wurden in einem entsprechendem Molverhältnis von 81 : 10 : 8 gemischt. Diese Lipidmischung wird hier als Zusammensetzung (A) bezeichnet. Ein Teil der Zusammensetzung (A) wurde mit der in Beispiel 2 hergestellten Lipidverbindung in einem Verhältnis von 10 : 1 (w/w) in destilliertem entionisiertem Wasser gemischt. Diese letztere Mischung wird hier als Zusammensetzung (B) bezeichnet. Die Zusammensetzungen (A) und (B) wurden in 1 ml Serumglasfläschchen eingeführt. Die Fläschchen wurden mit einer Sargent Welch Vakuumpumpe (Skokie, IL) evakuiert und die Kopfräume wurden gegen Perfluorpropangas (Flura Chemical Corp, Newport, TN) ersetzt. Die Glasfläschchen wurden mit einer Crescent Dental WIG-L-BUG^TM 3110B (Lyons, IL) mechanischen Schüttelvorrichtung geschüttelt. Nach dem Schütteln wurde zu einem Teil der Glasfläschchen Heparin (Elkin Sinns Inc., Cherry Hill, NJ) in einem ungefähren Verhältnis von Lipid zu Heparin mit 5 : 1 gegeben. Die Mischung aus Heparin und Zusammensetzung (A) wird hier als Zusammensetzung (C) bezeichnet. Die Mischung aus Heparin und Zusammensetzung (B) wird hier als Zusammensetzung (D) bezeichnet.
Dann wurde der rekombinante menschliche grundlegende Fibroblastwachstumsfaktor (BFGF) (Sigma, St. Louis, MO) zu den Zusammensetzungen (A), (B), (C) und (D) gegeben, die hier entsprechend als Zusammensetzungen (E), (F), (G) und (H) bezeichnet werden. Der BFGF wurde zu den Zusammensetzungen, die Heparin enthielten (Zusammensetzung (C) und (D)), in einem molaren Verhältnis von 5 : 1 (BFGF : Heparin) gegeben. Von mindestens je drei Proben von der Zusammensetzung (A) bis (H) wurde unter Verwendung eines Accusizer 770 (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) die Größe bestimmt. Die Größenbestimmung zeigte keine Unterschiede in den Größen der Vesikel in den Zusammensetzungen (A) bis (G). Jedoch wiesen die Vesikel in Zusammensetzung (H). die das kationische Lipid, Heparin und BFGF enthielt, ein kleinere mittlere Größe auf.
Die Zusammensetzungen (E) bis (H) wurden dann unter Verwendung eines nativen Polyacrylamidgels (Proteingel PAGE Mischung, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) zum Identifizieren der Bindungseigenschaften von Heparin und BFGF analysiert. Man ließ das Gel auf einem Hoefer SE400 Gelplattengerät (Hoefer Scientific, San Francisco, CA) laufen. Das Gel lief bei einem konstanten Strom unter Verwendung einer Elektrophorese-Stromversorgung (MBP300, IBI, Rochester, NY). Dann wurde das Gel unter Verwendung eines schnellen Coomassieblau-(Eastman Kodak, Rochester, NY)Färbeverfahrens gefärbt und visuell analysiert. Die Gelelektrophorese betätigte, dass in Zusammensetzung (H) das Vorhandensein des kationischen Lipids die Bindung von Heparin sowie die von BFGF verstärkte. Es wird angenommen, dass das Heparin, das anionisch ist, an das kationische Lipid bindet, dass das Heparin, das anionisch ist, an das kationische Lipid bindet, und dass BFGF, das kationisch ist, an das Heparin bindet. BFGF in Zusammensetzungen, die kein Heparin und kationisches Lipid enthalten, wandert während der Elektrophorese.
Beispiel 29
Beispiel 16 wird wiederholt, abgesehen davon, dass der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) anstelle des Anti-CEA-Antigens verwendet wird.
Beispiel 30
DPPC, DPPA und DPPE-PEG5000 werden in einem molaren prozentualen Verhältnis von 82 : 10 : 8 in Salzlösung : Propylenglycol : Glycerol (8 : 1 : 1, w/w/w) gemischt. Die Gesamtkonzentration an Lipiden in der Lösung wird 1 mg/ml betragen. Das rekombinante menschliche Wachstumshormon wird zu dieser Mischung ineiner Konzentration von 10 Gewichts-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lipide, gegeben. Ein Aliquot (1,5 ml) dieser Mischung wird in ein Glasfläschchen mit einem Volumen von 3 ml gegeben und der Kopfraum des Glasfläschchens wird gegen Perfluorpropangas ausgetauscht. Das Glasfläschchen wird dicht verschlossen und geschüttelt, wodurch gasgefüllte Vesikel resultieren, die an das menschliche Wachstumshormon binden und die zum Zielen auf endotheliale Zelle verwendbar sind. Der mittlere Durchmesser der Vesikel wird ungefähr 3 μm betragen.
Beispiel 31
Distearoylphosphtidylglycerol (DSPG) und DPPE-PEG5000 werden in sterilem Wasser in einem molaren Verhältnis von 92 : 8 kombiniert. Die Lipidkonzentration wird ungefähr 1 mg/ml betragen. Chitosan wird mit 10 Mol-%, bezogen auf das Gewicht des grundlegenden Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF) unter Verwendung von Amidbindungen zum Binden der Amingruppen des Chitosans an die Carboxyleinheiten des bFGF derivatisiert. Das derivatisierte Chitosan wird zu der Lipidsuspension in einer Menge gegeben, die eine im Wesentlichen äquivalente Konzentration der kationischen Gruppen in dem Chitosan und anionischen Gruppen in dem DSPG liefert. Ein Aliquot dieser Mischung (1,5 ml) wird in ein 3 ml Glasfläschchen gegeben und der Kopfraum wird gegen Perfluorbutan ersetzt. Das Glasfläschchen wird dicht verschlossen und auf einem ESPE Capmix (Seefeld, Deutschland) geschüttelt, um gasgefüllte Vesikel, die zum Zielen auf endotheliale Zellen verwendbar sind, zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 32
Ein pegyliertes Lipid wird aus DSPE und α,ω-Bis(carboxymethyl)-PEG2000 (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) hergestellt, um MeO₂C-PEG-DSPE zur Verfügung zu stellen. Dieses Lipid wird durch Säulenchromatographie (Silikagel) gereinigt, um die freie Säure (HO₂C-PEG-DSPE) zur Verfügung zu stellen, worauf VEGF an die freie Carboxylgruppe gebunden wird. DPPC, DSPA, DSPE-PEG und DSPE-PEG-VEGF werden in einem molaren Verhältnis von 82 : 10 : 6 : 2 in Salzlösung : Glycerol : Propylenglycol (8 : 1 : 1, w/w/w) bei einer Gesamtlipidkonzentration von 1,5 mg/ml kombiniert. Ein Aliquot dieser Mischung (1,5 ml) wird in ein steriles 3 ml Glasfläschchen gegeben und der Kopfraum des Glasfläschchens wird gegen Perfluorpentangas bei 30°C ersetzt und das Glasfläschchen wird dicht verschlossen. Das Glasfläschchen wird bei 30°C während ungefähr 90 Sekunden mit 3200 Upm auf einem ESPE Capmix (Seefeld, Deutschland) geschüttelt, woraus mit Perfluorpentangas gefüllte zielgerichtete Vesikel resultieren.
Beispiel 33
DSPC, Cholesterol und DPPA wird in einem molaren prozentualen Verhältnis von 65 : 27 : 8 in einer Lösung aus Salzlösung : Propylenglycol : Glycerol (8 : 1 : 1 w/w/w) kombiniert Die Gesamtlipidkonznetration wird 5 mg/ml sein. Ein Aliquot dieser Mischung (1,5 ml) wird in ein steriles Glasfläschchen gegeben werden und der Kopfraum gegen mit Perfluorbutangas ersetzt. Das Glasfläschchen wird dicht verschlossen und während ungefähr 5 Minuten auf einem ESPE Capmix (Seefeld, Deutschland) geschüttelt, um eine Vesikelzusammensetzung innerhalb des Umfangs der Erfindung zur Verfügung zu stellen. Einem Watanabikaninchen, das mit einer hoch cholesterinhaltigen Kost gefüttert worden war, wird intravenös eine Dosis von 0,10 ml/kg der Vesikelzusammensetzung verabreicht. Die Ultraschallabbildung wird ungefähr 25 Minuten nach Verabreichung durchgeführt und wird zeigen, dass die Vesikel sich in Regionen endothelialer Zellen, die von atherosklerotischer Plaque befallen sind, anhäuften. Dies wird veranschaulichen, dass die Vesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen atheroklerotischer Regionen endothelialer Zellen verwendbar sind.
Beispiel 34
Beispiel 33 wird wiederholt, abgesehen davon, dass unter den verwendeten Lipiden Cholesterolamin sein wird, das kovalent über eine Amidbindung an DPPE-PEG-carboxylat gebunden ist. Die Lipidmischung wird dann DPPC, DPPE-PEG5000, DPPE-PEG-Cholesterolamin und DPPA umfassen, die in einem molaren prozentualen Verhältnis von 82 : 7 : 1 : 10 kombiniert werden.
Beispiel 35
Beispiel 33 wird wiederholt, abgesehen davon, dass die Lipidkonzentration auf ungefähr 5 mg/ml erhöht wird und das Suspensionsmedium eine Lösung aus normaler Salzlösung, Trehalose (19 mg/ml) und pluronisches F-68 (10 mg/ml) umfasst. Diese Suspension von Lipiden wird unter Verwendung einer Mikroverflüssigungsvorrichtung (Microfluidics, Newton, MA) mit 16000 psi für insgesamt zehn Durchläufe mikroemulgiert. Die resultierende Vesikelzusammensetzung wird gefriergetrocknet und im Kopfraum der gefriergetrockneten Kammer wird allmählich der Umgebungsdruck über eine Zeitdauer von 72 Stunden durch langsames Einleiten von Perfluorbutangas wiederhergestellt. Die resultierenden gasgefüllten gefriergetrockneten Vesikel werden als trockenes Pulver bis zur Verwendung gelagert.
Beispiel 36
Beispiel 35 wird wiederholt, abgesehen davon, dass die Lipidkonzentration auf ungefähr 25 mg/ml erhöht wird und das Suspensionsmedium eine Lösung aus normaler Salzsäure, Sorbitol (20 mg/ml) und pluronischem F-68 (20 mg/ml) umfassen wird. Die Lipidsuspension wird auf 4°C abgekühlt und zu dieser Mischung wird Perfluorpentan gegeben, um eine Perfluorpentankonzentration von 8 μl pro ml Lösung bereitzustellen. Diese Mischung wird eine Mikroverflüssigungsvorrichtung, die bei einer Tempe ratur von 4°C gehalten wird, 20 Durchgänge bei 16000 psi durchlaufen. Dies wird eine Vesikelzusammensetzung aus Perfluorpentan-gefüllten Vesikeln zur Verfügung stellen. Diese Zusammensetzung wird intravenös einem Patienten verabreicht und wird gasgefüllte Vesikel in vivo bilden, die zum Zielen auf endotheliale Zellen verwendbar sind. Gasgefüllte Vesikel können ebenfalls vor der intravenösen Injektion durch Erwärmen der Vesikelzusammensetzung auf ungefähr mehr als 30°C und Schütteln auf zum Beispiel einem ESPE Capmix (Seefeld, Deutschland) oder einer anderen Schüttelvorrichtung oder Amalgamierungsvorrichtung oder durch Zurückziehen des Kolbens einer Spritze, die mit der Zusammensetzung der Perfluorpentan-gefüllten Vesikel gefüllt ist, zum Erhöhen des Drucks und Umwandeln der Perfluorpentanflüssigkeit in Perfluorpentangas, erhalten werden.
Beispiel 37
12-Hydroxydodecansäure wird mit Methacryloylchlorid verestert und der Ester wird zu dem Anhydrid umgewandelt, um 12-(Methacryloyloxy)dodecansäureanhydrid zu ergeben. Aus Eilecithin stammendes L-alpha-Glycerophosphocholin wird mit dem 12-(Methacryloyloxy)dodecansäureanhydrid acyliert, woraus sich Bis[12(Methacryloyl)oxydodecanoyl]-L-alpha-phosphatidylcholin (1) ergibt. Die enzymatische Hydrolyse von (1) mit Phospholipase A₂, aus dem rohen Klapperschlangengift (Crotalus adamanfeus) stammt, wird gefolgt von der Acylierung mit Palmitoylanhydrid, woraus sich 1-[2-(Methacryloyloxy)dodecanoyl]-2-palmitoyl-L-alpha-phosphatidylcholin (2) ergibt.
Das vorstehende (2) wird mit normaler Salzsäure bei einer Lipidkonzentration von 3 mg/ml kombiniert. Zu dieser Mischung wird DSPE-PEG-VEGF mit einer Konzentration von 0,30 mg/ml gegeben. Ein Aliquot der Mischung (1,5 ml) wird in ein steriles 3 ml Glasfläschchen gegeben. Der Kopfraum des Glasfläschchens wird evakuiert und gegen Perfluorpropangas ersetzt und das Glasfläschchen wird dicht verschlossen und mit lichtundurchlässiger Folie umwickelt. Das Glasfläschchen wird während ungefähr 3 Minuten auf einem ESPE Capmix (Seefeld, Deutschland) geschüttelt, um die gasgefüllten Vesikel zur Verfügung zu stellen. Die Folie wird entfernt und die Vesikelzusammensetzung wird mit Licht (254 nm) bestrahlt, um die polymerisierten gasgefüllten Vesikel, die VEGF zum Zielen auf endotheliale Zellen tragen, zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 38
Beispiel 37 wird wiederholt, abgesehen davon, dass das Lipid (2) mit DSPE-PEG (siehe Beispiel 8) kombiniert wird. VEGF wird eher zu dieser Lipidmischung vor dem Schütteln auf dem ESPE Capmix (Seefeld, Deutschland) gemischt, als dass es kovalent an das DSPE-PEG gebunden wird. Nach der Photopolymerisaton wird das VEGF direkt in die polymeren Lipidmembranen, die die Vesikel beschichten, eingebettet.
Beispiel 39
Dieses Beispiel betrifft die breite Herstellung von Albuminvesikel, die innerlich vernetzt sind und die Oberflächen umfassen, die durch die Bindung von Polyoxy(C_1-4)alkylenketten, wie in der veröffentlichten internationalen Patentanmeldung WO 95/00126 beschrieben ist, modifiziert sind. Die Enden der Alkylenkettenmodifikatoren werden im Gegensatz zu den Enden der Alkylenketten in der WO 95/00126, die Etherketten sind, eine reaktive Gruppe enthalten. Die reaktiven Gruppen werden zum Binden an einen endothelial zielenden Liganden mit eingeschlossen.
Beispiel 39A
Eine wässrige Lösung aus 5% humanem Rinderserumalbumin (5 ml) wird in ein Ultraschallreaktionsgefäß mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/min gegeben. Die Mischung wird unter Verwendung eines Sonifier B-30 (Branson, FRG) während ungefähr 15 Minuten mit einem Energiefluß von 100 Watt/cm² beschallt. Die Temperatur wird auf 22°C durch Kühlen des Reaktionsgefäßes gehalten. Auf Wunsch kann in dieser Mischung ein bioaktives Mittel, wie zum Beispiel ein Arzneimittel, enthalten sein. Die Vernetzung wird durch Zugeben einer Lösung aus mit Glutaraldehyd gesättigtem CH₂Cl₂ (0,2 ml) zu der Albuminlösung eingeleitet. Die resultierende Mischung wird während ungefähr 1 Stunde gerührt. Nach dem Waschen mit Methanol, gefolgt von Aceton und schließlich mit n-Hexan werden die vernetzten Albuminvesikel als ein braunes Pulver erhalten, das unter Vakuum während ungefähr 24 Stunden getrocknet wird. Die Größe der resultierenden Vesikel wird durch ein Nicomps Laserlicht-Teilchenstreuungssystem bei näherungsweise 200 nm bestimmt.
Beispiel 39B
Albuminvesikel, die einen größeren Durchmesser als die Vesikel aufweisen, die in Beispiel 39A hergestellt sind, werden durch Ersetzen des Emulgierungsverfahrens mit hoher Intensität gegen einen 4 Blatt-Kreiselrührer unter Verwendung höherer Konzentrationen von Albumin, zum Beispiel von ungefähr 10 bis ungefähr 25% hergestellt. Das Vernetzen wird, wie vorstehend in Beispiel 39A beschrieben ist, ausgeführt.
Beispiel 39C
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung gasgefüllter Albuminvesikel. Albuminvesikel werden hergestellt, indem 5 ml 5% Albumin in ein steriles Glasfläschchen gegeben werden und der Kopfraum des Gasfläschchens mit Perfluorbutangas gefüllt wird. Die Glasfläschchen werden während ungefähr 5 Minuten mit 3300 Upm auf einem ESPE Capmic (Seefeld, Deutschland) geschüttelt. Das Vernetzen wird, wie vorstehend in Beispiel 39A beschrieben ist, ausgeführt.
Beispiel 39D
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung gasgefüllter Albuminvesikel. Albuminvesikel werden durch Beschallen eines Glasfläschchens hergestellt, das 5% einer Lösung aus humanem Serumalbumin und einen Kopfraum mit Perfluorpropangas enthält. Diese Beschallung wird das minimale Eintauchen der Beschallungstrichterspitze in die Flüssigkeitsgrenzfläche während ungefähr 5 Minuten bei mittlerer Leistungseinstellung (Hegt Systems Probe, Farmingdale, NY) erfordern. Die Albuminvesikel werden, wie vorstehend in Beispiel 39A beschrieben ist, vernetzt.
Beispiel 39E
Dieses Beispiel betrifft die Kopplung von heterobifunktionellem PEG an die vorstehend hergestellten Albuminvesikel.
Die ω-Carboxygruppe von α-Amino,ω-carboxy-PEG5000 (Shearwater Polymers) wird mit einer geeigneten Esterfunktionalität, zum Beispiel ein Benzylester geschützt. Die Aminogruppe des PEG wird kovalent an die Albuminvesikel gebunden, um ein Gewichtsverhältnis von Albumin zu PEG von 10 : 1 zur Verfügung zu stellen, indem die geeigneten Aminosäureeinheiten auf dem Protein, wie zum Beispiel die Asparaginsäure- oder Glutaminsäureeinheit, mit 1,1-Carbonyldiimidazol aktiviert werden. Nach dem kovalenten Binden von PEG an das Albumin über eine Amidbindung wird die Benzylestergruppe entfernt. aFGF wird an die freie Carboxylgruppe durch Aktivieren des Carboxylatendes des PEGs mit 1,1-Carbonyldiimidazol gebunden. Dies stellt den endothelial zielenden Liganden, gebunden an die Albumin Vesikel über die PEG-Linker, zur Verfügung.
Alternativ dazu kann die Kopplung durch Aktivieren der geeigneten Aminosäuren eines aFGFs, zum Beispiel Asparaginsäure oder Glutaminsäure mit Carbonyldiimidazol, gefolgt von Addition des Carboxylgruppen-geschützen α-Amino,ω-carboxy-PEGs, ausgeführt werden. Die geschützte Carboxylgruppe wird entschützt und die nicht geschützte Carboxylgruppe wird mit Carbonyldiimidazol aktiviert. Das aktivierte aFGF-PEG wird kombiniert und mit den Albuminvesikeln umgesetzt.
In die Vesikel wird durch sorgfältige Dehydratation der Vesikel unter Vakuum und allmählicher Wiederherstellung des Umgebungsdrucks unter Verwendung eines Gases, wie zum Beispiel Perfluorbutan, Gas eingeleitet. Ein oder mehrere grenzflächenaktive Stoffe, zum Beispiel pluronisches F-68 kann vor dem Dehydratations- und Gaseinleitungsschritt zugegeben werden.
Beispiel 40
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung gasgefüllter Clathrate.
Die ω-Carboxygruppe in α-Hydroxy,ω-carboxy-PEG2000 wird mit einer geeigneten Esterfunktionalität, zum Beispiel ein Benzylester, geschützt. Die geschützte Verbin dung wird mit einem Äquivalent POCl₃ in Et₃N und CHCl₃ bei 0–5°C zum Umwandeln der Hydroxygruppe in den Phosphorchloridester umgesetzt. Diese Verbindung wird dann mit NaHCO₃ im Überschuss umgesetzt, um das entsprechende Natriumphosphat (PEG-PO₄Na₂) herzustellen. Das Salz wird mit HCl, pH-Wert 3,0 unter Herstellung der entsprechenden Säure (PEG-PO₄H₂) angesäuert. Dieses Produkt wird gegen gereinigtes Wasser unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichtsobergrenze von ungefähr 100 dialysiert.
Nach der Dialyse wird das vorstehende Phosphorsäureprodukt (2 g) mit Natriumdihydrogenpyrophosphat (Na₂H₂P₂O₇) (8 g) in Wasser (100 ml) kombiniert. Diese Lösung wird in ein Buchi-Sprühtrocknungsgerät eingeführt und sprühgetrocknet. Die resultierenden Teilchen werden bei 120°C unter Vakuum während ungefähr 1 Stunde unter Herstellung der PEG-beschichteten Pyrophosphatvesikel gebacken. Diese Vesikel werden in einem wässrigen Medium resuspendiert und die Benzylschutzgruppe wird entfernt. Die entschützte Carboxylgruppe des PEGs wird mit 1,1-Carbonyldiimidazol aktiviert und die resultierende Verbindung wird an einen monoklonalen Antikörper für ELAM zum Zielen auf endotheliale Zellen gekoppelt. Zu einer wässrigen Lösung, die die zielgerichteten Vesikel enthält, wird DDPC und pluronisches F-68 gegeben, um für eine Konzentration von 1 mg/ml beziehungsweise 5 mg/ml zu sorgen. Das die Vesikel enthaltende wässrige Medium wird auf ungefähr 45°C erhitzt, vorsichtig von Hand gerührt und unter Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers unter Beibehaltung dieser Temperatur getrocknet. Das resultierende getrocknete Material wird in einen geeigneten Behälter eingeführt und gefriergetrocknet. Perfluorbutangas wird allmählich in den Kopfraum des Behälters über einen Zeitraum von ungefähr 48 Stunden eingeleitet, bis der Umgebungsdruck erreicht ist. Die resultierenden gasgefüllten Pyrophosphatclathrate werden als gefriergetrocknetes Pulver bis zur Verwendung gelagert.
Beispiel 41
Eine 0,25 M Ca⁺²-Lösung wird durch Lösen von CaCl₂H₂O (3,68 g) in destilliertem Wasser (100 ml) hergestellt. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf einen pH-Wert von 11 unter Verwendung von 0,1 M NaOH eingestellt. Eine 0,74 M Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) wird durch Lösen von 0,75 g des Salzes in destillier tem Wasser (10 ml) hergestellt. Zu dieser Lösung wird 1,75 g bifunktionelles PEG, α-Phenylcarboxyester,ω-phosphoryl-PEG5000 gegeben. Der pH-Wert wird wiederum mit 0,1 M NaOH auf einen pH-Wert von 11 eingestellt. Die Kaliumdihydrogenphosphat/PEG-Phosphatlösung wird zu einer kräftig gerührten CaCl₂-Lösung tropfweise zugegeben. Die Größe des resultierenden Niederschlags wird durch optische Einteilchengrößenbestimmung und durch optische Mikroskopie bestimmt. Der Durchmesser der Teilchen wird im Bereich von ungefähr 1 bis 2 μm sein. Die Teilchen werden filtriert und in normaler Salzlösung resuspendiert und die Phenylgruppe wird von der Carboxygruppe entfernt. Die Carboxygruppe wird mit 1,1-Carbonyldiimidazol aktiviert und dieses wird mit einem für ELAM spezifischen monoklonalen Antikörper umgesetzt. Der monoklonale Antikörper kann durch herkömmliche Techniken, entsprechend den Verfahren von Kohler und Milstein, Nature 1975, 256: 495, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird, hergestellt werden. Die Teilchen werden in einen geeigneten Behälter eingeführt und gefriergetrocknet. Der Kopfraum des Behälters wird allmählich auf Umgebungsdruck mit Perfluorpropangas äquilibriert, um die Hydroxyapatitgas-Clathrate zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 42
In vivo Experimente in Ratten wurden durchgeführt, die den hohen Wirksamkeitsgrad bei Verwendung von Ultraschallenergie zum Zielen auf spezifisches Gewebe in vivo mit Vesikelzusammensetzungen, die genetisches Material enthalten, zeigen. Das Plasmid pSV β-gal (Promega, Madison, WI), das das β-Galactosidasegen enthält, und die in Beispiel 3 hergestellte kationische Lipidverbindung wurden durch Mischen kombiniert. Die resultierende Mischung wird jeweils in drei Sprague Dawley Ratten (Ratten (A), (B) und (C)) über die Schwanzvene injiziert. Die Ratte (A) wurde keinem Ultraschall ausgesetzt. Ultraschallenergie wurde auf das Innere des Hinterbeines während der Injektion bei jeder der Ratten (B) und (C) angewandt. Nach 48 Stunden wurden die Ratten schmerzlos abgetötet und die Gewebe entfernt. Die Gewebe wurden 72 Stunden in 2% Formalin fixiert, in dünne Scheiben geschnitten und in eine X-gal-Lösung gesetzt. Nach 16 Stunden bei 37°C wurden die Gewebe untersucht. Das Gewebe von Ratte (A) wies eine blaue Farbe auf, die auf eine allgemeine Transfektion hinweist. Das Gewebe aus Ratte (B) und (C) wies nur an der Stelle eine blaue Farbe auf, an der Ultraschallenergie angewandt wurde. Dies weist darauf hin, dass die Lokalisierung der Genexpression mit den Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann.
Beispiel 43
Frisches menschliches Blut wurde auf Gazestreifen (Tillotson Health Care, Bedford, NH) aufgebracht und man ließ es gerinnen. Tygon-Rohrleitungen wurden in 1% Agarose Standpolster (Mannheim Biochemical, Indianapolis, Indiana) gegossen. Die Blutgerinnsel tragende Streifen wurden in die Tygon-Rohrleitungen eingeführt. Es wurden ebenfalls Inline-Mischungselemente (Cole-Parmer, Chicago, IL) in die Rohrleitungen eingeführt, um einen turbulenten Fluß zu erzeugen. Die phosphatgepufferte Salzlösung (Boehringer Mannheim Biochemical) wurde durch den Gazestreifen unter Verwendung einer Masterflex peristaltischen Pumpe (Cole-Parmer) gepumpt. Eine Ultraschallabbildung wurde unter Verwendung einer Acoustic Imaging 5200 Ultraschallmaschine mit einem 7,4 MHz peripheren vaskulären Messwandler (Phoenix, AZ) durchgeführt. Der Messwandler wurde an einen Ringständer fixiert und die Abbildung wurde von der Unterseite des Standpolsters ausgeführt. Nachdem ungebundenes Gerinnsel von dem Streifen abgewaschen war, wurde jeweils 1 ml einer zielgerichteten Vesikelzusammensetzung, die auf GPIIbIIIa zielt, und die Vesikelzusammensetzung von Beispiel 6 (nicht zielgerichtet) in den PBS-Strom mit einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr 2 ml/min injiziert. Man ließ die Vesikel bei dieser Geschwindigkeit während 2 Minuten binden und dann wurde die Fließgeschwindigkeit auf 6 ml/min erhöht, um ungebundene Vesikel zu entfernen. Nach dem Waschen mit 6 ml/min waren die zielgerichteten Vesikel an den Gazestreifen gebunden, während die nicht zielgerichteten Vesikel abgewaschen wurden. Die Ultraschallabbildung offenbarte ein erhöhtes Echovermögen in dem Gerinnsel mit den auf GPIIbIIIa gerichteten Vesikeln.
Eine Videodensitometrische Analyse wurde offline unter Verwendung eines Macintosh 660 AV Computers (Apple Computing, Cupertino, CA) durchgeführt. Die gesamte Gerinnselfläche wurde ausgewählt und die Videodensitometrieeinheiten wurden gemessen. Die Abbildungen wurden erfasst und unter Verwendung von Image 1.55 (National Institutes of Health, Washington, DC) analysiert. Diese Analyse betraf das Sammeln und Übereinanderlegen der vorherigen Kontrastgrundbilder mit den Kontrastbildern nachher, und das Subtrahieren des vorherigen Kontrastbildes von dem Kontrastbild nachher. Dieses Sammeln, Übereinanderlegen und Subtrahieren wurden ebenfalls vor und nach dem Waschen zum Entfernen ungebundener Vesikel durchgeführt. Die videodensitometrische Analyse wurde unter Verwendung von sowohl kontinuierlichem als auch diskontinuierlichem Ultraschall durchgeführt. Die in dieser Analyse erhaltenen Daten sind in der folgenden Tabelle ausgeführt, wobei höhere Zahlen einen verbesserten Kontrast zeigen.
TABELLE 4 Videodensitometrische Analyse zielgerichteter Vesikel Quantitative Bestimmung der Ultraschallrückstreuung
Die Untersuchung der vorstehenden Tabelle zeigt im Vergleich zu den nicht zielgerichteten Vesikeln eine erhöhte Rückstreuung von den zielgerichteten Vesikeln. T-Tests wurde ausgeführt, die im Vergleich zu den nicht zielgerichteten Vesikeln eine signifikante Zunahme in den Videodichtesignalen für die zielgerichteten Vesikel bei sowohl der kontinuierlichen als auch der diskontinuierlichen Bildgebung zeigten p < 0,01.
Beispiel 44
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von DPGS-NH-PEG-NH-maleimid, das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von Dipalmitoylglycerolsuccinatpolyethylenglycolamin (DPGS-NH-PEG-NH₂)
In einen Rundkolben (100 ml) wurde eine Lösung aus DPGS (98 mg, 0,147 mmol, 1 Äquivalent) in CH₂Cl₂ gegeben. In einen gesonderten Rundkolben (100 ml) wurde eine Lösung aus H₂N-PEG-NH₂ (PEG-diamin) (50 mg, 0,147 mmol, 1 Äquivalent) in CH₂Cl₂ gegeben. Zu der PEG-Diaminlösung wurde sofort eine Lösung aus DCC (31 mg, 0,15 mmol, 1,02 Äquivalente) in CHCl₃ (5 ml) gegeben. Die resultierende Mischung aus DCC und PEG-diamin wurde zu DPGS bei ungefähr 0 bis ungefähr 5°C tropfweise zugegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur äquilibriert. Nach Rühren während 24 Stunden wurde destilliertes entionisiertes Wasser (50 ml) zu der Reaktionsmischung gegeben und der resultierende weiße Niederschlag (Dicyclohexylharnstoff) wurde durch Filtration entfernt. Die untere organische Schicht wurde unter Verwendung eines 250 ml Scheidetrichters isoliert und getrocknet (Na₂SO₄). Die getrocknete organische Lösung wurde filtriert und CH₃CH (80 ml) wurde zu dem Filtrat gegeben. Der übrig bleibende weiße Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, woraus sich 0,44 g DPGS-NH-PEG-NH₂ als ein weißes festes Produkt ergaben.
IR: 1700 cm^–1
TLC: R_f 0,65.
B. Herstellung von DPGS-PEG-NH-PEG-NH-maleimid
In einen Rundkolben (100 ml) wurde eine Lösung aus DPGS-NH-PEG-NH₂ aus Schritt A (0,44 g, 0,13 mmol, 1 Äquivalent) in CH₂Cl₂ (10 ml) gegeben. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung aus Triethylamin (13 mg, 0,13 mmol, 1 Äquivalent) in CH₂Cl₂ gegeben. Zu dieser Mischung wurde eine Lösung aus 34,6 mg N-Maleoyl-β-alanin-N-hydroxysuccinimidester (34,6 mg) in CH₂Cl₂ (10 ml) tropfweise gegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde entionisiertes destilliertes Wasser (30 ml) zu der Reaktionsmischung gegeben und das Rühren wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt. Die untere organische Schicht wurde unter Verwendung eines Scheidetrichters isoliert und getrocknet (NaSO₄). Die organische Schicht wurde filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, woraus sich 360 mg der Titelverbindung als wachsähnlicher weißer Feststoff ergaben.
IR: 1740 cm^–1, 1670 cm^–1, 1100 cm^–1
TLC: R_f 0,75.
Beispiel 45
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin-N- carbonylethylencarbonyliminopolyethylenglycolethylaminocarbonylethylenmaleimid (DPPE-NH-PEG-NH-Maleimid), das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin-N-carbonylethylencarbonyliminopolyethylenglycolethylamin (DPPE-NH-PEG-NH₂)
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus DPPE-succinat (79 mg) und ω,ω'-diaminopolyethylenglycol (340 mg) in CH₂Cl₂ (20 ml) wurde eine Lösung aus DCC (22 mg) in CH₂Cl₂ (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde während 4 Stunden bei 0 bis 5°C gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (10 ml) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde für eine weitere Stunde gerührt. Die untere organische Schicht wurde isoliert und im Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingeengt. Der Rückstand wurde wieder in CH₃CN gelöst und der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt. Einengen der organischen Lösung im Vakuum ergab 390 mg DPPE-NH-PEG-NH-maleimid als einen weißen Feststoff.
B. Herstellung von DPPE-NH-PEG-NH-maleimid
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung aus DPPE-NH-PEG-NH₂ aus Schritt A (210 mg) und Triethylamin (20 mg) in CH₂Cl₂ (20 ml) wurde eine Lösung aus Meleimidopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester (26 mg) in CH₂Cl₂ (10 ml) gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 1 Stunde bei 0 bis 5°C gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (10 ml) wurde zugegeben und die resultierende Mischung wurde unter Rühren mit verdünnter HCl auf einen pH-Wert von 3 angesäuert. Die organische Schicht wurde isoliert, mit Wasser (10 ml) gewaschen und getrocknet (NaSO₄). Das Einengen zur Trockene im Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers stellte 210 mg der Titelverbindung (DPPE-NH-PEG-NH-maleimid) als einen weißen Feststoff zur Verfügung.
Beispiel 46
Fab' oder F(ab')₂-Fragmente wurden an gasgefüllte Vesikel über ein Lipid-PEG-maleimidlipid gebunden. Die Fab' oder F(ab')₂-Fragmente wurden als Anti-Skelettmyosin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) unter Verwendung von Fab'- und/oder F(ab')₂-Kits von Pierce (Rockford, IL) hergestellt.
Die Fab'-Fragmente wurde durch Verdauen des Antikörpers mit Papain hergestellt. Dies spaltet beide Fab'-Fragmente aus der Fc-Region des Antikörpers. Die Fc-Fragmente wurden dann an eine ProteinA-Säule gebunden und die Fab'-Fragmente wurden gesammelt. Dann wurden die Fab'-Fragmente gefriergetrocknet (Labconco Lyph-Lock 12, Kansas City, MO) und zum Binden an das Lipid-PEG-maleimidlipid präpariert.
F(ab')₂-Fragmente wurde auf ähnliche Wiese wie Fab'-Fragmente hergestellt. Jedoch wurde anstelle von Papain das Enzym Pepsin verwendet. Pepsin spaltet weiter entfernt in der Fc-Region und die zwei Fab'-Fragmente bleiben verbunden. Dann wurden die F(ab')₂-Fragmente gefriergetrocknet.
Die verschiedenen Fragmente werden mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Kopplungspuffer (150 mM NaCl, 10 mM MOPS, 0,1 mM EDTA, 50 μm DTPA, pH-Wert 6,5) (alle Materialien wurden von Sigma Chemical, St. Louis, MO, erhalten) resuspendiert. Dann wird das Lipid-PEG-maleimidlipid (0,2 bis 10 mM) zugegeben und die resultierende Mischung wird während 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Die resultierenden Produkte werden auf einem Polyacrylamidelektrophoresegel zum Bestimmen, ob die Fab'- und/oder F(ab')₂-Fragmente an das Lipid gebunden wurden, ana lysiert. Dies kann durch Beobachten der Änderungen im Molekulargewicht bestimmt werden. Dann werden die zielgerichteten Vesikel unter Verwendung von 1 Gewichts-% der Fab'- und/oder F(ab')₂-gebundenen Lipide hergestellt.
Beispiel 47
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von DPSG-NH-PEG-NH-PDP, das die folgende Formel aufweist.
Dipalmitoylglycerolsuccinatpolyethylenglycolamin (DPGS-NH-PE-NH₂) wurde unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 44, Schritt A hergestellt. DPGS-NH-PEG-NH₂ (440 mg, 0,13 mmol) und Triethylamin (13 mg, 0,13 mmol) wurden in CH₂Cl₂ (10 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung aus 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (PDP) (31 mg) in CH₂Cl₂ (10 ml) gegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde entionisiertes Wasser (30 ml) zu der Reaktionsmischung gegeben und das Rühren wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt. Die untere organische Schicht wurde unter Verwendung eines Scheidetrichters isoliert und getrocknet (Na₂SO₄). Die organische Schicht wurde filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, woraus sich 360 mg der Titelverbindung (DPGS-NH-PEG-NH-PDP) als ein wachsähnlicher weißer Feststoff ergaben.
Beispiel 48
Dieses Beispiel betrifft die Synthese von DPPE-NH-PEG-NH-PDP, das die folgende Formel aufweist.
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin-N-carbonylethylencarbonyliminopolyethylengylcolethylamin (DPPE-NH-PEG-NH₂) wurde unter Verwendung des in Beispiel 45, Schritt A beschriebenen Verfahrens hergestellt. Dieses Material (210 mg) und Triethylamin (20 mg) wurden in CH₂Cl₂ (10 ml) kombiniert. Diese Lösung wurde zu einer Lösung aus 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (PDP) (31 mg) in CH₂Cl₂ (10 ml) gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 1 Stunde bei 0 bis 5°C gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Destilliertes Wasser wurde zugegeben und die resultierende Mischung wurde mit verdünnter HCl unter Rühren auf einen pH-Wert von 3 angesäuert. Die organische Schicht wurde isoliert, mit Wasser (10 ml) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Die organische Schicht wurde filtriert und im Vakuum unter Verwendung eines Rotationsverdampfers zur Trockene eingeengt, um 210 mg der Titelverbindung (DPPE-NH-PEG-NH-PDP) als einen weißen Feststoff zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 49
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eine Lipid-hydrophiles Polymer-Proteinkonjugats innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, da die folgende Formel aufweist.
Die Verbindung von Beispiel 48 wird an Protein A durch Umsetzen eines Schwefelatoms der -S-S-Disulfidbindung in DPPE-NH-PEG-NH-PDP, eine Sulfhydrylgruppe eines Proteins, gebunden.
wobei „A" Protein A ist
Die resultierende Verbindung kann zum Bilden von Protein-tragenden Vesikeln, wie zum Beispiel Protein-tragende Liposomen verwendet werden.
Beispiel 50
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eines Lipid-hydrophiles Polymer-Proteinkonjugats innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, das die folgende Formel aufweist.
Die Verbindung von Beispiel 47 (DPGS-NH-PEG-NH-PDP) wird mit Maleimid-markiertem Protein A gekoppelt, woraus sich die vorstehende Verbindung ergibt.
Beispiel 51
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von DPGS-NH-PEG-Glucose, das die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von NH2-PEG-Glucose
2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-glucopyranosylbromid (0,6 g) wurde entsprechend dem Verfahren von C. A. A. van Broeckel und J. H. van Boom, Tetrahedron, 41, 4545 (1985) hergestellt. Das Trocknen der Mischung wurde durch die Verwendung aktivierter Molekularsiebe in DMF, gemischt mit ω-Trifluoracetylaminopolyethylenglycol (3,5 g) eingeleitet, wobei das letztere aus ω-Aminopolyethylenglycol und Triessigsäureanhydrid und Diisopropylethylamin (DIEA) (1,2 ml) hergestellt wurde. Die resultierende Lösung wurde während 4 Tagen unter Stickstoff gerührt. Die Lösung wurde mit CHCl₃ (150 ml) verdünnt und mit 10% NaHCO₃ (50 ml) und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand wurde mit Natriumcarbonat-Methano-H₂O. Lösung bei Raumtemperatur während 2 Tagen behandelt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zweimal mit CHCl₃ (100 ml) extrahiert. Die kombinierten Chloroformextrakte wurden im Vakuum eingeengt und der resultierende Rückstand wurde in Methanol gelöst und über 10% Palladium auf Kohle (0,45 g) unter einem Druck von 4 Atmosphären und bei Raumtemperatur hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, um NH₂-PEG-Glucose (3 g) als einen weißen Feststoff zur Verfügung zu stellen. Das Produkt wurde auf einer Silikagelsäule gereinigt und mit einem isokratischen Elutionsmittel aus Chloroform-Methanol-Wasser eluiert.
B. Herstellung von DPGS-NH-PEG-Glucose
NH₂-PEG-Glucose aus Schritt A (1 g), Triethylamin (0,5 g) und eine Lösung aus Acetonitril und Wasser (50 : 50) wurde kombiniert und zu einer gekühlten (0–5°C) Lösung aus DPGS-succinimid aus Beispiel 13A (0,15 g) in Acetonitril (10 ml) gegeben, Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur während zwei Tagen gerührt und das Acetonitril wurde verdampft. Der resultierende Rückstand wurde mit Wasser auf 50 ml verdünnt, durch eine 500 MWCO-Membran dialysiert und gefriergetrocknet, woraus sich die Titelverbindung (DPGS-NH-PEG-Glucose) als ein weißer Feststoff ergab.
Beispiel 52
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von DPGS-NH-PEG-NH-Mannose, die die folgende Formel aufweist.
A. Herstellung von α-Bromacetylamino-D-mannose
D-Mannosaminhydrochlorid (2,1 g), Triethylamin (3 g) und DMF (50 ml) wurden kombiniert und unter Rühren zu einer gekühlten (0–5°C) Lösung aus α-Bromacetylbromid (2 g) in CH₂Cl₂ gegeben. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur während 8 Stunden geführt und dann in Eiswasser (50 ml) geschüttet. Diese wässrige Lösung wurde während 1 Stunde gerührt und dann im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde aus einer Mischung von Wasser und Ethanolumkristallisiert, woraus sich α-Bromacetylamino-D-mannose als ein weißer Feststoff ergab.
B. Herstellung von DPGS-NH-PEG-NH-Mannose
α-Bromacetylamino-D-mannose aus Schritt A (0,3 g), DPGS-NH-PEG-NH₂ aus Beispiel 44A (4 g), Natriumcarbonat (0,2 g) und KI (20 mg) wurden in einer Mischung aus Wasser und Ethanol (1 : 1) kombiniert. Die resultierende Mischung wurde auf 40°C während 8 Stunden erhitzt. Das Ethanol wurde auf einem Rotationsverdampfer verdampft und der wässrige Rückstand wurde durch eine 500 MWCO-Membran dialysiert und gefriergetrocknet, woraus sich 4 g der Titelverbindung (DPGS-NH-PEG-NH-Mannose) als weißer Feststoff ergaben.
Die folgenden Beispiele betreffen die Herstellung zielgerichteter Vesikel.
Beispiel 53
Albuminvesikel (oder Albumin beschichtete Gasbläschen) wurden in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von mehr als 8 suspendiert. Zu dieser Suspension wurde 3-(2-pyridyl)dithiopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester (SPDP) in CH₃CN bei 0 bis 5°C gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 2 Tagen bei Raumtemperatur inkubiert und auf einer Membran mit 500 MWCO dialysiert, um Pyridyldithiopropionoyl-tragende Albuminvesikel zur Verfügung zu stellen. Dann wurde Maleimidphenylbutyrat-konjugierter Antikörper (MPB-AB) mit dem Oberflächen-modifizierten Albuminvesikeln inkubiert, um den Antikörper gebunden an Albuminvesikel zu erhalten.
Beispiel 54
Polyglutaminsäurevesikel (oder Polyglutaminsäure-beschichtete Gasbläschen) wurden in Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurde Ethyl-N,N-dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) in Wasser bei 0 bis 5°C gegeben. Die resultierende Mischung wurde vorsichtig während 4 Stunden gerührt und dann wurde eine Peptidlösung (in einem Puffer mit eine pH-Wert von 8 bis 9,5) zugegeben. Diese Mischung wurde 2 Tage bei Raumtemperatur inkubiert und auf Membranen mit 500 MWCO dialysiert, um Peptid-konjugierte Polyglutaminsäurevesikel zu ergeben.
Beispiel 55
Beispiel 53 wurde wiederholt, abgesehen davon, dass die aus einem Copolymer aus Methylcyanomethacrylat (2-Cyano-2-propensäuremethylester) und ω-Aminotetraethylenglycolylmethacrylat formulierten Vesikel gegen die Albuminvesikel ersetzt wurden.
Beispiel 56
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung eines Lipid-Polymer-Peptidkonjugats und davon zielgerichtete Vesikel.
In einen Rundkolben wurde 1 Äquivalent α-Amino,ω-carboxy-PEG4000 mit einer tert-Butyloxycarbonyl-(t-Boc)Schutzgruppe eingeführt. Dieses wurde durch die Zugabe von Carbonyldiimidazol (CDI) (1 Äquivalent) und Hydroxybenzotriazol (1 Äquivalent) in N-Methylpyrrolidon aktiviert. Zu dieser Lösung wurde das Peptid Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, das am Aminoende entschützt war, gegeben. Die resultierende Lösung wurde gerührt und periodisch bezüglichfreier Aminogruppen durch Analyse mit Methylenbau oder Ninhydrin kontrolliert. Ohne ein weiteres Anzeichen für ein freies Aminoende wurde das Entschützen der gesamten Mischung über die Zugabe von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid ausgeführt. Dann wurde freies Amin aus dem PEG durch Standardverfahren isoliert. In einen gesonderten Kolben wurde eine Lösung aus DPPE (1 Äquivalent) in DMF und Carbonyldiimidazol (1 Äquivalent) eingeführt. Das Rühren wurde während einer Stunde über Molekularsieben (4 ngström) fortgesetzt. Dann wurde zu dieser Mischung die PEG-Peptidligandmischung, gefolgt von fortgesetztem Rühren, gegeben. Die Mischung wurde dann im Vakuum getrocknet und zu einer DEAE-Sepharose-Größenausschlußsäule gegeben, wobei das DPPE-PEG-Peptidkonjugat isoliert wurde. Dann wurden gasgefüllte Vesikel aus dem DPPE-PEG-Peptid unter Verwendung von Standardmethodologie hergestellt.
Beispiel 57
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung des DPGS-PEG-cyclischen Peptids, das die folgende Formel aufweist.
Cyclische [D-2-Aminobutyryl-N-2-methyl-L-arginylglycyl-L-asparaginyl-3-(aminomethylbenzoesäure)] wurde unter Verwendung von Standardpeptidsynthesemethodologie hergestellt. Zu einer Lösung aus 66 mg dieses cyclischen Peptids in Wasser (20 ml) wurde Ethyl-N,N-dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) in Wasser (10 ml) bei 0 bis 5°C gegeben. Die resultierende Mischung wurde während 4 Stunden bei 0 bis 5°C, gefolgt von 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zu dieser Lösung wurde DPGS-NH-PEG-NH₂ aus Beispiel 44A (400 mg) in CH₃CN (10) ml bei 0 bis 5°C gegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt und der wässrige Rückstand wurde durch eine 1000 MWCO-Membran dialysiert. Gefriertrocknung stellte die vorstehende Verbindung (410 mg) als weißen Feststoff zur Verfügung.
Beispiel 58
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von Vesikel, die mit einem cyclischen Peptid zielgerichtet sind.
Zu einer Lösung aus cyclischer [D-2-Aminobutyryl-N-2-methyl-L-arginylglycyl-L-asparaginyl-3-(aminomethylbenzoesäure)] (66 mg) in Wasser (20 ml) wurde Ethyl-N,N-dimethylaminopropylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) in Wasser (10 ml) bei 0 bis 5°C gegeben. Die resultierende Mischung wurde dann zu einer Suspension von Albuminvesikeln bei 0 bis 5°C gegeben. Die resultierende Mischung wurde während zwei Tagen bei Raumtemperatur inkubiert, filtriert und unter Verwendung einer Membran mit einer MWCO von 1000 dialysiert, um Albuminvesikel, die mit einem Porphyrinzielliganden zielgerichtet sind, zur Verfügung zu stellen.
Beispiel 59
Beispiel 58 wurde wiederholt, abgesehen davon, dass die aus einem Copolymer aus Methylcyanomethacrylat (2-Cyano-2-propensäuremethylester) und ω-Aminotetraetylenglycolmethacrylat formulierten Vesikel gegen die Albuminvesikel ersetzt wurden.

Claims

Zielgerichtete Zusammensetzung, umfassend Lipidvesikel, die ein fluoriertes Gas einschließen, wobei die Vesikel ein Lipid mit einem Zielliganden umfassen, wobei der Zielligand an das Lipid über eine hydrophile Polymerverknüpfungsgruppe kovalent gebunden ist, wobei der Zielligand auf Zellen oder Rezeptoren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Herzmuskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Tumorzellen und dem Glycoprotein GPIIbIIIa Rezeptor, zielt und das fluorierte Gas aus der Gruppe, bestehend aus Perfluorkohlenwasserstoffen und Schwefelhexafluorid, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche auf Bereiche mit Arteriosklerose zielt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Arteriosklerose arteriosklerotische Plaques umfaßt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche auf einen Herzmuskelinfarkt zielt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche auf Krebszellen zielt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Lipidvesikel ein Phospholipid umfassen.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Phospholipid aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylcholinen, Phosphatidylethanol aminen und Phosphatidsäuren, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Phosphatidylcholin aus der Gruppe, bestehend aus Dioleoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearylphosphatidylcholin, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Phosphatidylcholin Dipalmitoylphosphatidylcholin ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Phosphatidylethanolamin aus der Gruppe, bestehend aus Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin, N-Succinyldioleoylphosphatidylethanolamin und 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerophosphoethanolamin, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Phosphatidylethanolamin Dipalmitoylphosphatidylethanolamin ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Phosphatidsäure Dipalmitoylphosphatidsäure ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Lipidvesikel weiter ein negativ geladenes Lipid umfassen.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das negativ geladene Lipid Phosphatidylserin ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fluorierte Gas ein Perfluorkohlenwasserstoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan und Perfluorcyclobutan, ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gas zumindestens teilweise von einer gasförmigen Vorstufe stammt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die gasförmige Vorstufe einen Siedepunkt von höher als 37°C aufweist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die gasförmige Vorstufe aus der Gruppe, bestehend aus Perfluorpentan und Perfluorhexan, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Zielligand aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Peptiden, Sacchariden, Steroiden, Steroidanaloga, bioaktiven Mitteln und genetischem Material, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der Zielligand aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Peptiden und Sacchariden, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei der Zielligand ein Peptid ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Peptid von etwa 3 bis etwa 20 Aminosäuren aufweist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das Peptid von etwa 4 bis etwa 6 Aminosäuren aufweist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei das Peptid ein Pentapeptid ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Peptid die Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp (RGD) umfaßt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei das Peptid zyklisiert ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei die Zyklisierung aus der Bildung einer Disulfidbrücke durch die Oxidation von zwei Thiol-enthaltenden Aminosäuren oder deren Analoga resultiert.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei die Thiol-enthaltenden Aminosäuren Cystein sind.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 28, wobei der Rezeptor den Glycoproteinrezeptor GPIIbIIIa umfaßt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Polymer aus der Gruppe, bestehend aus Polyalkylenoxiden, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidonen, Polyacrylamiden, Polymethacrylamiden, Polyphosphazenen, Poly(hydroxyalkylcarbonsäuren) und Polyoxazolidinen, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das hydrophile Polymer ein Polyalkylenoxid umfaßt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei das Polyalkylenoxid aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, ausgewählt ist.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei das Polyalkylenoxid Polyethylenglycol umfaßt.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiter umfassend einen wässerigen Träger.
Zielgerichtete Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Lipidvesikel aus der Gruppe, bestehend aus Mizellen und Liposomen, ausgewählt sind.
Kontrastmittel zur diagnostischen Bildgebung, umfassend eine zielgerichtete Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35.
Verwendung einer zielgerichteten Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35 zur Herstellung eines Kontrastmittels für die Diagnose der Gegenwart von krankhaftem Gewebe in einem Patienten.
Verwendung einer zielgerichteten Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35 zur Herstellung eines Medikaments für die therapeutische Verteilung in vivo eines bioaktiven Mittels.
Verwendung einer zielgerichteten Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35 für die Herstellung einer Formulierung für die Thrombolyse eines Gerinnsels in einer inneren Region eines Patienten.