DE69831755T2

DE69831755T2 - Optoakustische kontrastmittel und anwendungsverfahren

Info

Publication number: DE69831755T2
Application number: DE69831755T
Authority: DE
Inventors: C. Evan UNGER; Yunqiu Wu
Original assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Current assignee: CEREVAS THERAPEUTICS, INC., REDMOND, WASH., US
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2018-12-18
Also published as: EP1039834B1; WO1999030620A1; EP1039834A4; US6123923A; DE69831755D1; AU1931899A; EP1039834A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein optoakustische Kontrastmittel und Verfahren für diagnostische und therapeutische Bilddarstellung mithilfe optoakustischer Kontrastmittel.
Hintergrund der Erfindung
Optische Bilddarstellung und akustische Bilddarstellung (z. B. Ultraschall) sind als separate Modalitäten zur diagnostischen Bilddarstellung verwendet worden. Sowohl die optische Bilddarstellung als auch die akustische Bilddarstellung haben jedoch Einschränkungen. Beispielsweise ist die optische Bilddarstellung durch relativ schlechte Durchdringbarkeit und Diffusion eingeschränkt, während die Ultraschallbilddarstellung durch ihre räumliche Auflösung und Kontrastauflösung zur Definition der Physiologie von Bildern eingeschränkt ist.
Dokument WO-A-98/51 284 (welche den Stand der Technik nach Artikel 54(3) EPC darstellt) offenbart Verfahren, welche die Schritte des Verabreichens einer Vesikelzusammensetzung umfassen, die ein Gas oder einen Gasvorläufer umfassen, welche eine fluorierte Verbindung, ein stabilisierendes Material und ein photoaktives Mittel umfassen, wobei Ultraschall angewandt wird, um das photoaktive Mittel an einen Bereich des Patienten abzugeben, und wobei Lichtenergie angewandt wird, um das photoaktive Mittel zu aktivieren.
Es werden neue und verbesserte Kontrastmittel und Verfahren der Bilddarstellung benötigt, um die Einschränkungen des Standes der Technik zu überwinden. Die vorliegende Erfindung spricht diese sowie andere wichtige Ziele an.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist in Anspruch 1 definiert, welcher im Speziellen Verfahren zum Abgeben photoaktiver Mittel an einen Bereich eines Patienten betrifft, die das Verabreichen einer Zusammensetzung an den Patienten, welche ein stabilisierendes Material und ein photoaktives Mittel umfasst, das Anwenden von Ultraschall zum Abgeben des photoaktiven Mittels an den gewünschten Bereich und das Anwenden von Lichtenergie zum Aktivieren des photoaktiven Mittels umfassen, wobei die Lichtenergie intravaskulär über einen Katheter angewandt wird. Falls gewünscht, kann das Verfahren des Weiteren das Überwachen des Ortes der Zusammensetzung durch Ultraschallbilddarstellung und/oder optische Bilddarstellung umfassen, um den Ort der Zusammensetzung festzustellen, bevor Ultraschall angewandt wird, um das photoaktive Mittel an den gewünschten Region abzugeben. Die Zusammensetzungen können eine große Vielzahl zusätzlicher Bestandteile umfassen, einschließlich beispielsweise eines oder mehrere Gase, Gasvorläufer, Flüssigkeiten, Öle, stabilisierende Materialien, diagnostische Mittel, photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung offensichtlicher.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die chemische Struktur photoaktiver Mittel, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
2 zeigt die chemische Struktur photoaktiver Mittel, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
3 ist eine Ausführungsform einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, wobei photoaktive Mittel in der Membran/den Membranen oder der Wand/den Wänden des Vesikels eingeschlossen sind.
4 ist eine Ausführungsform einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, wobei photoaktive Mittel in einer öligen hydrophoben Hülle (1) in die Vesikel eingeschlossen sind, und wobei eine Gasphase (2) im Inneren des Vesikels eingeschlossen ist.
5 ist eine Ausführungsform einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, wobei photoaktive Mittel in festen Matrizen (2) in die Zusammensetzung eingeschlossen sind. In den Zwischenräumen der Zusammensetzung kann auch Gas (3) vorhanden sein. Die Zusammensetzung kann wahlweise einen Film eines Tensids, ein Film bildendes Material oder ein Polymer an der Oberfläche (1) umfassen, um die Stabilität des Gases (3) in Verbindung mit den festen Matrizen (2) zu erhalten. Die Zusammensetzung kann auch wahlweise einen Zielliganden (4) umfassen.
6 ist eine Ausführungsform einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die photoaktive Mittel und eine Mehrzahl von Zielliganden (1, 2, 3) umfassen, welche der Zusammensetzung zelluläres und gewebespezifisches Targeting verleihen.
7 ist eine Ausführungsform einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die einen Bereich zum Einschließen photoaktiver Mittel (2), eines Gases (3) und von Zielliganden umfasst, die kovalent mit Lipiden (1) konjugiert sind, welche der Zusammensetzung zelluläres und gewebespezifisches Targeting verleihen.
8 veranschaulicht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der optoakustische Kontrastmittel für oberflächliche oder externe Therapie verwendet werden, d. h. bei welcher sich der kombinierte Ultraschallüberträger/optische Überträger und Scanner (2) außerhalb des Körpers befinden und bei welcher sich der zu behandelnde Bereich des Patienten (1) im Innern des Körpers befindet. Die kombinierten Ultraschallüberträger und optischen Überträger und Scanner (2) sind mit der Ultraschallausrüstung und optischen Ausrüstung (3) verbunden.
9 veranschaulicht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der optoakustische Kontrastmittel bei der interstitiellen oder chirurgischen Therapie verwendet werden, d. h. bei der die kombinierten Ultraschallüberträger und optischen Überträger und Scanner (1) chirurgisch in den Körper eingebettet sind und bei welcher sich der zu behandelnde Bereich des Patienten (1) im Innern des Körpers befindet. Das Glasfaserbündel für das endoskopische oder chirurgische Einsetzen (3) verläuft aus dem Körper heraus zu der Ultraschallausrüstung und optischen Ausrüstung (3).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie oben und in der gesamten Offenbarung verwendet, haben die folgenden Begriffe, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Bedeutungen.
„Lipid" betrifft eine natürlicherweise vorkommende, synthetische oder halbsynthetische (d. h, modifizierte natürliche) Verbindung, die im Allgemeinen amphipathisch ist. Die Lipide umfassen typischerweise einen hydrophilen Bestandteil und einen hydrophoben Bestandteil. Geeignete Lipide enthalten beispielsweise Fettsäuren, Neutralfette, fluorierte Lipide, Phosphatide, Öle, fluorierte Öle, Glykolipide, oberflächenaktive Mittel (Tenside und fluorierte Tenside), aliphatische Alkohole, Wachse, Terpene und Steroide. Der Begriff halbsynthetisch (d. h. modifiziert natürlich) beschreibt eine natürliche Verbindung, die auf eine Weise chemisch modifiziert worden ist.
„Tensid" betrifft ein oberflächenaktives Mittel, das eine Verbindung ist, welche die Oberflächenspannung verändert. Oberflächenaktive Mittel enthalten beispielsweise Detergenzien, Benetzungsmittel, Dispersionsmittel, Schaum bildende Mittel und Emulgatoren. Bevorzugte Beispiele von Tensiden sind hydrophobe Verbindungen, einschließlich Phospholipide, Öle, fluorierte Öle und fluorierte Tenside. „Fluorierte Tenside" bezieht sich auf ein Tensid, bei dem mindestens ein Wasserstoffatom des Tensids durch ein Fluoratom ersetzt ist.
„Polymer" oder „polymerisch" bezieht sich auf Moleküle, die aus der chemischen Verbindung von zwei oder mehr Wiederholungseinheiten gebildet sind. Der Begriff „Polymer" kann beispielsweise Dimere, Trimere und Oligomere umfassen. Das Polymer kann synthetisch, natürlich vorkommend oder halbsynthetisch sein. Das Polymer kann ein „fluoriertes Polymer" sein, in dem mindestens ein Wasserstoffatom des Polymers durch ein Fluoratom ersetzt ist. „Polymer" betrifft vorzugsweise Moleküle, die 10 oder mehr Wiederholungseinheiten umfassen.
„Protein" bezieht sich auf Moleküle, die im Wesentlichen α-Aminosäuren in Peptidbindungen umfassen und vorzugsweise aus solchen bestehen. Der Begriff „Protein" umfasst globuläre Proteine wie Albumine, Globuline und Histone und fibröse Proteine wie Kollagene, Elastine und Keratine. Der Begriff „Protein" umfasst auch „Verbindungsproteine", bei denen ein Proteinmolekül mit einem Nichtproteinmolekül vereint ist, beispielsweise Nukleoproteine, Mukoproteine, Lipoproteine und Metalloproteine. Die Proteine können synthetisch, natürlich vorkommend oder halbsynthetisch sein.
„Amphiphile Einheit" oder „amphiphil" bezieht sich auf eine synthetische, halbsynthetische (d. h. modifizierte natürliche) oder natürlicherweise vorkommende Verbindung mit einem wasserlöslichen hydrophilen Anteil und einem wasserunlöslichen hydrophoben Anteil. Bevorzugte amphiphile Verbindungen haben eine polare Kopfgruppe, beispielsweise eine Phosphatidylcholingruppe, und eine oder mehrere unpolare, aliphatische Ketten, beispielsweise Palmitoylgruppen. „Fluorierte amphiphile Einheiten" bezieht sich auf eine amphiphile Verbindung, bei der mindestens ein Wasserstoffatom der amphiphilen Verbindung durch ein Fluoratom ersetzt ist. In einer bevorzugten Form sind die fluorierten amphiphilen Verbindungen polyfluoriert. „Polyfluorierte amphiphile Einheit" bezieht sich auf amphiphile Verbindungen, die zwei oder mehr Fluoratome enthalten. „Perfluorierte amphiphile Einheit" bezieht sich auf amphiphile Verbindungen, bei denen alle Wasserstoffatome durch ein Fluoratom ersetzt worden sind. „Amphipathie" bezieht sich auf die gleichzeitige Anziehung und Abstoßung eines einzelnen Moleküls oder Ions, das eine oder mehrere Gruppen enthält, welche eine Affinität für die Phase oder das Medium haben, in dem sie gelöst, emulgiert und/oder suspendiert sind, zusammen mit einer oder mehreren Gruppen, die von der beteiligten Phase oder dem beteiligten Medium abgestoßen werden.
„Vesikel" bezieht sich auf eine Einheit, die im Allgemeinen eine Wand oder eine Membran oder mehrere Wände oder Membranen aufweist, die einen oder mehrere innere Leerräume bilden. Vesikel können beispielsweise aus einem stabilisierenden Material wie einem Lipid, einem Protein, einem Polymer, einem Tensid und/oder einem Kohlenhydrat gebildet sein, einschließlich die verschiedenen hierin beschriebenen Lipide, Proteine, Polymere, Tenside und Kohlenhydrate. Die Lipide, Proteine, Polymere, Tenside und/oder anderen Vesikel bildenden stabilisierenden Materialien können natürlich, synthetisch oder halbsynthetisch sein. Bevorzugte Vesikel sind solche, die Wände oder Membranen umfassen, welche aus Lipiden gebildet sind. Die Wände oder Membranen können konzentrisch oder andersartig sein. Die stabilisierenden Verbindungen können die Form einer oder mehrerer Einzelschichten oder Doppelschichten haben. Im Fall von mehr als einer Einzelschicht oder Doppelschicht können die Einzelschichten oder Doppelschichten konzentrisch sein. Es können stabilisierende Verbindungen verwendet werden, um ein unilamellares Vesikel (bestehend aus einer Einzelschicht oder Doppelschicht) oder ein multilamellares Vesikel (bestehend aus mehr als etwa drei Einzelschichten oder Doppelschichten) zu bilden. Die Wände oder Membranen von Vesikeln können im Wesentlichen fest (einheitlich) sein oder sie können porös oder halbporös sein. Der innere Leerraum der Vesikel kann, falls gewünscht, mit einer großen Vielzahl von Materialen gefüllt sein, einschließlich beispielsweise mit Wasser, Ölen, fluorierten Ölen, Gasen, Gasvorläufern, Flüssigkeiten und fluorierten Flüssigkeiten, und/oder mit anderen Materialien. Die Vesikel können, falls gewünscht, auch ein photoaktives Mittel, ein bioaktives Mittel und/oder einen Zielliganden umfassen.
„Liposom" bezieht sich auf ein im Allgemeinen rundes oder spheroides Cluster oder Aggregat von amphipathischen Verbindungen, einschließlich Lipidverbindungen, typischerweise in der Form einer oder mehrerer konzentrischer Schichten, beispielsweise Doppelschichten. Sie können auch als Lipidvesikel oder Lipidmikrokügelchen bezeichnet sein. Die Liposomen können beispielsweise aus ionischen Lipiden und/oder nicht-ionischen Lipiden gebildet sein. Aus nicht-ionischen Lipiden formulierte Liposomen können als Niosomen bezeichnet sein. Aus zumindest teilweise aus ionischen Lipiden gebildete Liposomen können als Cochleate bezeichnet sein.
„Mizelle" bezieht sich auf kolloidale Einheiten, die aus Lipiden gebildet sind. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen Mizellen eine Einzelschicht, Doppelschicht oder eine hexagonale H-II-Phasen-Struktur.
„Aerogel" bezieht sich auf im Allgemeinen runde oder spheroidale Einheiten, die durch eine Mehrzahl kleiner interner Leerräume gekennzeichnet sind. Die Aerogele können aus synthetischen Materialien (beispielsweise einem durch Backen von Resorcinol und Formaldehyd hergestellten Schaum) sowie aus natürlichen Materialien wie beispielsweise aus Kohlenhydraten (Polysacchariden) oder Proteinen formuliert sein.
„Clathrat" bezieht sich auf einen festen, halbporösen oder porösen Partikel, das mit Vesikeln assoziiert sein kann. In einer bevorzugten Form können die Clathrate eine käfigähnliche Struktur bilden, die Kavitäten enthält, welche, falls gewünscht, einen oder mehrere an das Clathrat gebundene Vesikel umfassen. Falls gewünscht, kann mit dem Clathrat ein stabilisierendes Material assoziiert sein, um die Assoziation des Vesikels mit dem Clathrat zu fördern. Clathrate können beispielsweise aus porösen Apatiten wie Kalziumhydroxyapatit und Präzipitaten von Polymeren und Metallionen wie beispielsweise mit Kalziumsalzen präzipitierter Alginsäure formuliert sein.
Eine „fluorierte Verbindung" bezieht sich auf eine Verbindung, die mindestens ein Fluoratom enthält. Mehr bevorzugt ist die fluorierte Verbindung eine „polyfluorierte Verbindung", was sich auf eine Verbindung bezieht, die mindestens zwei Fluoratome enthält. Noch mehr bevorzugt ist die fluorierte Verbindung „perfluoriert", was vollständig fluoriert bedeutet, beispielsweise eine Verbindung, bei der alle Wasserstoffatome durch Fluoratome ersetzt sind. Die fluorierte Verbindung kann in Form eines Gases oder einer Flüssigkeit (einschließlich eines Gasvorläufers) vorliegen. Vorzugsweise ist die Flüssigkeit ein Gasvorläufer, der sich in ein Gas umwandeln kann. In dieser Erfindung können verschiedene fluorierte Verbindungen verwendet werden. Wenn die fluorierte Verbindung eine kohlenstoffbasierte Verbindung ist, enthält die fluorierte Verbindung vorzugsweise 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt 1 bis etwa 24 Kohlenstoffatome, noch mehr bevorzugt 1 bis etwa 12 Kohlenstoffatome, noch mehr bevorzugt etwa 5 bis etwa 12 Kohlenstoffatome und am meisten bevorzugt etwa 6 bis etwa 10 Kohlenstoffatome. Die Anzahl von Kohlenstoffatomen in der fluorierten Verbindung kann daher 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 Kohlenstoffatome und aufwärts sein. Alternativ kann die fluorierte Verbindung eine schwefel- oder selenbasierte fluorierte Verbindung sein, wie beispielsweise Schwefelhexafluorid oder Selenhexafluorid. Die fluorierte Verbindung kann auch beispielsweise Kohlenstoffatome aufweisen, die durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen sind, wie beispielsweise -O-Bindungen (wie bei Etherverbindungen), oder andere Substituenten wie Amine aufweisen. Bevorzugte fluorierte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind fluorierte organische Verbindungen, mehr bevorzugt Perfluorkohlenstoffe und Perfluorether.
„Gasgefülltes Vesikel" bezieht sich auf ein Vesikel mit einem darin verkapselten Gas. „Mit einem Gasvorläufer gefülltes Vesikel" bezieht sich auf ein Vesikel mit einem darin verkapselten Gasvorläufer. Die Vesikel können minimal, partiell, substanziell oder vollständig mit dem Gas und/oder dem Gasvorläufer gefüllt sein. Der Begriff „substanziell", wie in Bezug auf das mit Gas und/oder Gasvorläufer gefüllten Vesikel verwendet, bedeutet, dass mehr als etwa 30% des inneren Leerraums des im Wesentlichen gefüllten Vesikels ein Gas und/oder einen Gasvorläufer umfasst. Vorzugsweise umfassen mehr als etwa 40%, etwa 50% oder etwa 60% des inneren Leerraums der im Wesentlichen gefüllten Vesikel ein Gas und/oder einen Gasvorläufer, wobei mehr als etwa 70% oder etwa 75% mehr bevorzugt sind. Noch mehr bevorzugt umfassen mehr als etwa 80%, etwa 85% oder etwa 90% des inneren Leerraums der im Wesentlichen gefüllten Vesikel ein Gas und/oder einen Gasvorläufer. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen mehr als etwa 95% oder etwa 99% des inneren Leerraums der Vesikel ein Gas und/oder einen Gasvorläufer, wobei etwa 100% besonders bevorzugt sind. Alternativ können die Vesikel kein oder im Wesentlichen kein Gas oder keinen oder im Wesentlichen keinen Gasvorläufer enthalten.
„Emulsion" bezieht sich auf eine Mischung von zwei oder mehr im Allgemeinen nicht mischbaren Flüssigkeiten und hat im Allgemeinen die Form eines Kolloids. Die Mischung kann beispielsweise aus Lipiden bestehen, die in der Emulsion homogen oder heterogen verteilt sind. Alternativ können die Lipide in Form von beispielsweise Clustern oder Schichten, einschließlich Einzelschichten oder Doppelschichten, aggregiert sein.
„Suspension" oder „Dispersion" bezieht sich auf eine Mischung, vorzugsweise fein verteilt, von zwei oder mehreren Phasen (fest, flüssig oder gasförmig), wie beispielsweise flüssig in flüssig, fest in fest, gasförmig in flüssig und dergleichen, die über längere Zeiträume stabil bleiben können.
„Hexagonale H-II-Phasenstruktur" bezieht sich auf eine im Allgemeinen rohrförmige Aggregation von Lipiden in flüssigen Medien, beispielsweise wässrigen Medien, in denen der hydrophile Anteil (die hydrophilen Anteile) der Lipide im Allgemeinen nach innen zeigt, in Assoziierung mit einer wässrigen Flüssigumgebung im Inneren der Röhre. Der hydrophobe Anteil (die hydrophoben Anteile) der Lipide verlaufen im Allgemeinen nach außen und der Komplex nimmt die Form einer hexagonalen Röhre an. Im Allgemeinen ist in der hexagonalen Phasenstruktur eine Mehrzahl von Röhren zusammengepackt.
„Patient" bezieht sich auf Tiere, einschließlich Säugetiere, vorzugsweise Menschen.
„Bereich eines Patienten" oder „Region eines Patienten" bezieht sich auf einen bestimmten Bereich oder Teil des Patienten und in manchen Fällen auf Bereiche im gesamten Patienten. Beispiele solcher Bereiche/Regionen sind der pulmonale Bereich, der gastrointestinale Bereich, der kardiovaskuläre Bereich (einschließlich Herzmuskelgewebe), der renale Bereich sowie andere Körperbereiche, Gewebe, Lymphozyten, Rezeptoren, Organe und dergleichen, einschließlich das Gefäßsystem und das Blutkreislaufsystem sowie erkranktes Gewebe, einschließlich Krebsgewebe. Der „Bereich eines Patienten" oder die „Region eines Patienten" ist vorzugsweise intern, kann aber auch extern sein. Der Begriff „Gefäßsystem" bezeichnet Blutgefäße, einschließlich Arterien, Venen und dergleichen. Der Begriff „gastrointestinaler Bereich" umfasst den Bereich, der von Ösophagus, Magen, Dünn- und Dickdarm und Rektum definiert ist. Der Begriff „renaler Bereich" bezeichnet den Bereich, der von den Nieren und dem Gefäßsystem, das direkt zu und von den Nieren verläuft, definiert ist und enthält die abdominale Aorta. „Bildlich darzustellender Bereich", „Bereich eines Patienten" oder „Bilddarstellungsbereich" bezeichnet einen Bereich eines Patienten, in dem diagnostische Bilddarstellung gewünscht ist oder in dem eine Abgabe eines therapeutischen Wirkstoffes gewünscht ist.
„Optoakustisches Kontrastmittel" bezieht sich auf die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, solche, die ein stabilisierendes Material und ein photoaktives Mittel umfassen. „Optoakustisches Kontrastmittel" bezieht sich auf beispielsweise auf Abgabevehikel, Vesikel, Liposomen, Mizellen, Emulsionen, Suspensionen, Dispersionen, Aerogele, Clathrate, hexagonale H-II-Phasenstrukturen und dergleichen. Solche Kontrastmittel sind in der Lage, sowohl durch optische als auch durch akustische Bilddarstellung ein Bild zu liefern.
„Optische Bilddarstellung" bezieht sich auf die Herstellung sichtbarer Darstellungen von Gewebe oder Bereichen eines Patienten, die hergestellt werden, indem diese Gewebe oder Bereiche eines Patienten mit elektromagnetischer Energie im Spektralbereich zwischen Ultraviolett und Infrarot bestrahlt werden und die als Resultat der Bestrahlung produzierte, entweder reflektierte, gestreute, absorbierte und/oder fluoreszierende Energie analysiert wird. Beispiele optischer Bilddarstellung umfassen, jedoch nicht ausschließlich, sichtbare Fotografie und Varianten davon, ultraviolette Bilder, Infrarotbilder, Fluorimetrie, Holografie, sichtbare Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie. Spektrophotometrie, Spektroskopie, Fluoreszenzpolarisierung und dergleichen.
„Akustische Bilddarstellung" bezieht sich auf die Herstellung sichtbarer Darstellungen von Gewebe oder Bereichen eines Patienten, die hergestellt werden, indem diese Gewebe oder Bereiche eines Patienten mit Schallenergie bestrahlt werden und die als Resultat der Bestrahlung produzierte, entweder reflektierte, gestreute, absorbierte und/oder fluoreszierende Energie analysiert wird. Beispiele akustischer Bilddarstellung umfassen beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, Ultraschallbilddarstellung.
„Abgabevehikel" oder „Vehikel" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, Substanz oder ein Material, die oder das ein photoaktives Mittel, ein bioaktives Mittel und/oder einen Zielliganden in vivo oder in vitro transportieren oder tragen kann. Geeignete Abgabevehikel umfassen beispielsweise stabilisierende Materialien, Vesikel, Liposomen, Mizellen, Aerogele, Clathrate, mit Gas und/oder Gasvorläufer gefüllte Vesikel, Emulsionen, Suspensionen, Dispersionen, hexagonale H-II-Phase-Strukturen, Cochleate und dergleichen.
„Photoaktives Mittel" bezieht sich auf jede Verbindung oder jedes Material, die oder das in Licht aktiv ist oder die oder das auf Licht reagiert, einschließlich beispielsweise Chromophore (z. B. Material, das Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbiert), Fluorophore (z. B. Material, das Licht einer bestimmten Wellenlänge abgibt), Photosensitivatoren (z. B. Material, das in vivo oder in vitro Nekrose von Gewebe und/oder Zelltod verursachen kann), fluoreszierende Materialien, phosphoreszierende Materialien und dergleichen, die in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen verwendet werden können. „Licht" bezieht sich auf alle Quellen von Licht, einschließlich auf den ultravioletten (UV) Bereich, den sichtbaren Bereich und/oder den Infrarot(IR)-Bereich des Spektrums.
„Bioaktives Mittel" bezieht sich auf eine Substanz, die in Verbindung mit einer Anwendung verwendet werden kann, die therapeutisch oder diagnostisch ist, beispielsweise bei Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer Krankheit bei einem Patienten und/oder Verfahren für die Behandlung einer Krankheit bei einem Patienten. „Bioaktives Mittel" bezieht sich auf Substanzen, die in vitro und/oder in vivo eine biologische Wirkung ausüben können. Die bioaktiven Mittel können neutral, positiv oder negativ geladen sein. Geeignete bioaktive Mittel umfassen beispielsweise Pro-Pharmaka, diagnostische Mittel, therapeutische Mittel, pharmazeutische Mittel, Wirkstoffe, synthetische organische Moleküle, Proteine, Peptide, Vitamine, Steroide, Steroidanaloga und genetisches Material, einschließlich Nukleoside, Nukleotide und Polynukleotide.
„Therapeutisches Mittel", „pharmazeutisches Mittel" oder „Wirkstoff" bezieht sich auf jedes therapeutische oder prophylaktische Mittel, das bei der Behandlung (einschließlich der Prävention, Diagnose, Linderung oder Heilung) von Beschwerden, eines Gebrechens, einer Kondition, Krankheit oder Verletzung bei einem Patienten verwendet werden kann. Die Bedeutung des Begriffs „pharmazeutisch" oder „Wirkstoff" kann auch therapeutisch nützliche Peptide, Polypeptide, und Polynukleotide umfassen.
„Diagnostisches Mittel" bezieht sich auf jede Substanz, die in Verbindung mit den Verfahren zur Bilddarstellung eines inneren Bereichs eines Patienten und/oder zur Diagnostizierung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer Krankheit oder eines erkrankten Gewebes bei einem Patienten verwendet werden kann. Diagnostische Mittel umfassen beispielsweise Kontrastmittel zur Verwendung in Verbindung mit Ultraschallbilddarstellung, optischer Bilddarstellung, Magnetresonanzbilddarstellung (MRI), kernmagnetische Resonanz (NMR), Computertomografie (CT), Elektronenspinresonanz (ESR), nuklearmedizinische Bilddarstellung, Elastografie, Hochfrequenz (HF), Mikrowellenlaser und dergleichen. Diagnostische Mittel können auch alle anderen Mittel umfassen, die geeignet sind, um die Diagnose einer Krankheit oder eines anderen Zustands eines Patienten zu ermöglichen, unabhängig davon, ob Bilddarstellungsverfahren eingesetzt werden oder nicht.
„Zielligand" bezieht sich auf jedes Material oder jede Substanz, die das Targeting von Geweben und/oder Rezeptoren in vivo und/oder in vitro mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung fördern. Der Zielligand kann synthetisch, halbsynthetisch oder natürlich vorkommend sein. Materialien oder Substanzen, die als Zielliganden dienen können, umfassen beispielsweise Proteine, einschließlich Antikörper, Antikörperfragmente, Hormone, Hormonanaloga, Glycoproteine und Lektine, Peptide, Polypeptide, Aminosäuren, Zucker, Saccharide, einschließlich Monosaccharide und Polysaccharide, Kohlenhydrate, Vitamine, Steroide, Steroidanaloga, Hormone, Cofaktoren und genetisches Material, einschließlich Nukleotide, Nukleotide, Nukleotidsäurekonstrukte und Polynukleotide. Ein „Vorläufer" eines Zielliganden bezieht sich auf jedes Material oder jede Substanz, das oder die in einen Zielliganden umgewandelt werden kann. Solche Umwandlungen können beispielsweise das Verankern eines Vorläufers an einen Zielliganden enthalten. Beispielhafte Zielvorläufereinheiten umfassen Maleimidgruppen, Disulfidgruppen, wie beispielsweise ortho-Pyridyldisulfid, Vinylsulfongruppen, Azidgruppen und α-Iodacetylgruppen.
„Genetisches Material" bezieht sich im Allgemeinen auf Nukleotide und Polynukleotide, einschließlich Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA). Das genetische Material kann durch aus dem Stand der Technik bekannte chemische Syntheseverfahren oder durch Anwendung von Rekombinationstechnologie oder eine Kombination davon hergestellt werden. Die DNA und RNA kann wahlweise nicht-natürliche Nukleotide umfassen und kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. „Genetisches Material" bezieht sich auch auf Sense- und Anti-Sense-DNA und -RNA, die Nukleotidsequenzen sind, welche zu bestimmten Sequenzen von Nukleotiden in DNA und/oder RNA komplementär sind.
„Stabilisierendes Material" oder „stabilisierende Verbindung" bezieht sich auf jedes Material, das die Stabilität von Zusammensetzungen verbessern kann, welche die hierin beschriebenen photoaktiven Mittel, Gase, Gasvorläufer, Flüssigkeiten, bioaktiven Mittel und/oder Zielliganden enthält, einschließlich beispielsweise Mischungen, Suspensionen, Emulsionen, Dispersionen, Vesikel oder dergleichen. Die verbesserte Stabilität umfasst beispielsweise die Erhaltung eines relativ ausgeglichenen Zustandes und lässt sich durch erhöhten Widerstand der Zusammensetzung gegenüber Zerstörung, Zerfall, Abbau und dergleichen veranschaulichen. Im Falle von bevorzugten Ausführungsformen, die mit photoaktiven Mitteln, Gasen, Gasvorläufern, Flüssigkeiten, bioaktiven Mitteln und/oder Zielliganden gefüllte Vesikel umfassen, können die stabilisierenden Verbindungen dazu dienen, die Vesikel entweder zu formen oder die Vesikel zu stabilisieren, und auf jeden Fall dazu dienen, das Entweichen von photoaktiven Mitteln, Gasen, Gasvorläufer, bioaktiver Mittel und/oder von Zielliganden aus den Vesikeln zu minimieren oder im Wesentlichen (einschließlich vollständig) zu verhindern, bis eine Freisetzung gewünscht ist, wobei mehr als etwa 50% in den Vesikeln eingeschlossen bleibt, bis eine Freisetzung gewünscht ist, vorzugsweise bleiben mehr als etwa 60%, etwa 70%, etwa 80% oder etwa 85% in den Vesikeln eingeschlossen, bis eine Freisetzung gewünscht ist, wobei mehr als 90% noch mehr bevorzugt ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen bleiben mehr als etwa 95%, etwa 99% oder etwa 100% der photoaktiven Mittel, Gase, Gasvorläufer, bioaktiven Mittel und/oder Zielliganden eingeschlossen, bis eine Freisetzung gewünscht ist. Beispielhafte stabilisierende Materialien umfassen Lipide, Proteine, Polymere, Kohlenhydrate und Tenside. Die resultierende Mischung, Suspension, Emulsion oder dergleichen kann Wände (z. B. Filme, Membranen und dergleichen) um das photoaktive Mittel, den Zielliganden, das bioaktive Mittel, die Gase und/oder Gasvorläufer herum umfassen oder kann, falls gewünscht, im Wesentlichen frei von Wänden oder Membranen sein. Das stabilisierende Material kann, falls gewünscht, Tröpfchen bilden. Das stabilisierende Material kann auch Salze und/oder Zucker umfassen. In anderen Ausführungsformen können die stabilisierenden Materialien im Wesentlichen (einschließlich vollständig) vernetzt sein. Das stabilisierende Material kann neutral, positiv oder negativ geladen sein.
„Tröpfchen" bezieht sich auf eine runde oder sphäroide Einheit, die im Wesentlichen flüssig sein kann oder die flüssig und fest, fest und gasförmig, flüssig und gasförmig oder flüssig, fest und gasförmig umfassen kann. Feste Materialien in einem Tröpfchen können beispielsweise Partikel, Polymere, Lipide, Proteine oder Tenside sein.
„Vernetzung", „vernetzt" und „vernetzen" bezieht sich im Allgemeinen auf die Verknüpfung von zwei oder mehreren stabilisierenden Materialien, einschließlich Lipid-, Protein-, Polymer-, Kohlenhydrat- und/oder Tensidmaterialien, durch eine oder mehrere Brücken. Die Brücken können aus einem oder mehreren Elementen, Gruppen oder Verbindungen zusammengesetzt sein und im Allgemeinen dazu dienen, ein Atom eines Moleküls eines ersten stabilisierenden Materials mit einem Atom eines Moleküls eines zweiten stabilisierenden Materials zu verbinden. Die Vernetzungsbrücken können kovalente und/oder nicht-kovalente Assoziierungen umfassen. Die Brücken in den Vernetzungen können von unterschiedlichen Elementen, Gruppen und/oder Verbindungen gebildet werden, und die stabilisierenden Materialien können natürlich oder durch synthetische Mittel vernetzt werden. Vernetzung kann in der Natur beispielsweise in Material vorkommen, das aus Peptidketten formuliert ist, welche durch Disulfidbrücken von Cysteinresten verbunden sind, wie bei Keratinen, Insulinen und anderen Proteinen. Alternativ kann Vernetzung durch geeignete chemische Modifikation erreicht werden, beispielsweise durch Kombinieren einer Verbindung wie beispielsweise einem stabilisierenden Material und einer chemischen Substanz, die als ein Vernetzungsmittel dienen kann, die beispielsweise durch Aussetzen gegenüber Wärme, energiereicher Strahlung, Ultraschallstrahlung und dergleichen in Reaktion gebracht werden kann. Beispiele umfassen Vernetzen durch Schwefel, um Disulfidverknüpfungen zu bilden, Vernetzen mithilfe organischer Peroxide, Vernetzen ungesättigter Materialien mittels energiereicher Strahlung, Vernetzen mit Dimethylolcarbamat und dergleichen. Falls gewünscht, können die stabilisierenden Verbindungen im Wesentlichen vernetzt werden. Der Begriff „im Wesentlichen" bedeutet, dass mehr als etwa 50% der stabilisierenden Verbindung Vernetzungsbrücken enthalten. Falls gewünscht, enthalten mehr als etwa 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder sogar 100 der stabilisierenden Verbindungen solche Vernetzungsbrücken. Alternativ können die stabilisierenden Materialien nicht vernetzt sein, d. h., so dass mehr als etwa 50% der stabilisierenden Verbindungen keine Vernetzungsbrücken enthalten, und falls gewünscht mehr als etwa 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder sogar 100% der stabilisierenden Verbindungen keine Vernetzungsbrücken enthalten.
„Vesikelstabilität" bezieht sich auf die Fähigkeit von Vesikeln, das photoaktive Mittel, Gas, den Gasvorläufer, das bioaktive Mittel und/oder den Zielliganden darin eingeschlossen zu halten, nachdem es für etwa eine Minute einem Druck von etwa 100 Millimeter (mm) Quecksilber (Hg) ausgesetzt worden ist. Vesikelstabilität wird in Prozent (%) gemessen, wobei dies dem Bruchteil der Gasmenge entspricht, die ursprünglich in dem Vesikel eingeschlossen ist und nach Aufheben des Drucks zurück behalten wird.
Vesikelstabilität umfasst auch „Vesikelwiderstand", d. h. die Fähigkeit eines Vesikels, nach Aufheben des Drucks in seine ursprüngliche Größe zurückzukehren.
„Kovalente Assoziierung" bezieht sich auf eine intermolekulare Assoziierung oder Bindung, an welcher der Austausch von Elektronen in den Bindungsorbitalen zweier Atome beteiligt ist.
„Nicht-kovalente Assoziierung" bezieht sich auf intermolekulare Interaktion zwischen zwei oder mehreren einzelnen Molekülen, an der keine kovalente Bindung beteiligt ist. Intermolekulare Interaktion richtet sich nach verschiedenen Faktoren, einschließlich beispielsweise der Polarität der beteiligten Moleküle und der Ladung (positiv oder negativ), falls vorhanden, der beteiligten Moleküle. Nicht-kovalente Assoziierungen umfassen ionische Interaktionen, elektrostatische Interaktionen, Dipol-Dipol-Interaktionen, Van-der-Waals-Kräfte und Kombinationen davon.
„Ionische Interaktion" oder „elektrostatische Interaktion" bezieht sich auf intermolekulare Interaktion zwischen zwei oder mehreren Molekülen, von denen jedes positiv oder negativ geladen ist. Beispielsweise bezieht sich „ionische Interaktion" oder „elektrostatische Interaktion" auf die Anziehung zwischen einem ersten, positiv geladenen Molekül und einem zweiten, negativ geladenen Molekül. Ionische oder elektrostatische Interaktionen umfassen beispielsweise die Anziehung zwischen einem negativ geladenen Zielliganden, beispielsweise genetischem Material, und einem positiv geladenen Lipid, beispielsweise einem kationischen Lipid wie Lauryltrimethylammoniumbromid.
„Dipol-Dipol-Interaktion" bezieht sich im Allgemeinen auf die Anziehung, die zwischen zwei oder mehreren polaren Molekülen auftreten kann. „Dipol-Dipol-Interaktion" bezieht sich daher auf die Anziehung des ungeladenen, teilweise positiven Endes eines ersten polaren Moleküls, im Allgemeinen als δ⁺ bezeichnet, an das ungeladene, negative Ende eines zweiten polaren Moleküls, im Allgemeinen als δ^– bezeichnet. Ein Beispiel für Dipol-Dipol-Interaktionen ist die Anziehung zwischen der elektropositiven Kopfgruppe, beispielsweise der Cholinkopfgruppe von Phosphatidylcholin, und einem elektronegativen Atom, beispielsweise einem Heteroatom wie Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel, das in einem stabilisierenden Material wie beispielsweise einem Polysaccharid vorhanden ist. Dipol-Dipol-Interaktion bezieht sich auch auf intermolekulare Wasserstoffbindung, bei der ein Wasserstoffatom als eine Brücke zwischen elektronegativen Atomen auf separaten Molekülen dient und bei der ein Wasserstoffatom durch eine kovalente Bindung an einem ersten Molekül und durch elektrostatische Kräfte an ein zweites Molekül gehalten wird.
„Van-der-Waals-Kräfte" bezieht sich auf die Anziehungskräfte zwischen unpolaren Molekülen, die quantenmechanisch berechnet werden. Van-der-Waals-Kräfte sind im Allgemeinen mit kurzzeitigen Dipolmomenten verbunden, die durch benachbarte Moleküle ausgelöst werden und an denen Änderungen der Elektronenverteilung beteiligt sind.
„Wasserstoffbindung" bezieht sich auf eine Anziehungskraft oder Brücke, die zwischen einem Wasserstoffatom, das kovalent an ein elektronegatives Atom, beispielsweise Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff, gebunden ist, und einem anderen elektronegativen Atom auftreten können. Die Wasserstoffbindung kann zwischen einem Wasserstoffatom in einem ersten Molekül und einem elektronegativen Atom in einem zweiten Molekül (intermolekulare Wasserstoffbindung) auftreten. Die Wasserstoffbindung kann zwischen einem Wasserstoffatom und einem elektronegativen Atom auftreten, die beide in einem einzigen Molekül enthalten sind (intramolekulare Wasserstoffbindung).
„Hydrophile Interaktion" bezieht sich auf Moleküle oder Anteile von Molekülen, die im Wesentlichen an Wasser binden, Wasser absorbieren und/oder sich in Wasser lösen. Dies kann zu einem Quellen und/oder der Bildung reversibler Gele führen.
„Hydrophobe Interaktion" bezieht sich auf Moleküle oder Anteile von Molekülen, die im Wesentlichen nicht an Wasser binden, kein Wasser absorbieren und/oder sich nicht in Wasser lösen.
„Biokompatibel" bezieht sich auf Materialien, die für biologische Funktionen im Allgemeinen nicht schädlich sind und in keiner Weise zu einer inakzeptablen Toxizität führen, einschließlich allergene Reaktionen und Krankheitszuständen. Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen, die an Patienten verabreicht werden, sind im Allgemeinen biokompatibel.
„In Kombination mit" bezieht sich auf den Einschluss photoaktiver Mittel, bioaktiver Mittel und/oder Zielliganden in stabilisierenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, einschließlich Emulsionen, Suspensionen, Vesikel und dergleichen. Photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden können auf verschiedene Weise mit den stabilisierenden Zusammensetzungen kombiniert werden. Beispielsweise können photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden kovalent und/oder nicht-kovalent mit den Verbindungen oder stabilisierenden Materialien assoziiert sein. Im Falle von Vesikeln können photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden im inneren Leerraum der Vesikel eingeschlossen sein. Photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden können auch in der Schicht (den Schichten) oder der Wand (den Wänden) des Vesikels integriert sein, indem sie mit stabilisierenden Materialien vermischt werden, welche die Vesikelschicht (Vesikelschichten) oder -wand (-wände) bilden oder darin enthalten sind. Darüber hinaus können sich photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden auf der Oberfläche von Vesikeln oder nicht-vesikulären stabilisierenden Materialien befinden. Photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden können gleichzeitig in dem inneren Leerraum des Vesikels eingeschlossen sein und/oder in der Schicht (den Schichten) oder der Wand (den Wänden) der Vesikel integriert sein und/oder sich an der Oberfläche von Vesikeln oder nicht-vesikulären stabilisierenden Materialien befinden. Zielliganden befinden sich vorzugsweise auf der Oberfläche von Vesikeln oder nicht-vesikulären stabilisierenden Materialien. In jedem Fall können photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden chemisch mit den Wänden der Vesikel interagieren, einschließlich beispielsweise der Innen- und/oder Außenfläche des Vesikels, und können im Wesentlich daran haften bleiben. Solche Interaktionen können beispielsweise die Form einer nicht-kovalenten Assoziation oder Bindung, ionischen Interaktionen, elektrostatischen Interaktionen, Dipol-Dipol-Interaktionen, Wasserstoffbindungen, Van-der-Waals-Kräften, kovalenter Assoziation oder Bindung, Vernetzung oder einer anderen Interaktion annehmen, wie einem Fachmann in Anbetracht der vorliegenden Offenbarung ersichtlich ist. In manchen Ausführungsformen kann die Interaktion die Stabilisierung des Vesikels bewirken. Die photoaktiven Mittel, bioaktiven Mittel und/oder Zielliganden können auch in eingeschränkter Weise mit der Innen- oder Außenfläche der Vesikel oder mit nicht-vesikulären stabilisierenden Materialien interagieren. Eine solche eingeschränkte Interaktion würde die Migration der photoaktiven Mittel, bioaktiven Mittel und/oder Zielliganden beispielsweise von der Oberfläche eines erstes Vesikels zu der Oberfläche eines zweiten Vesikels oder von der Oberfläche eines ersten nicht-vesikulären stabilisierenden Materials zu einem zweiten nicht-vesikulären stabilisierenden Material erlauben. Alternativ könnte eine solche eingeschränkte Interaktion die Migration der photoaktiven Mittel, bioaktiven Mittel und/oder Zielliganden beispielsweise aus dem Inneren der Wände eines Vesikels und/oder nicht-vesikulären stabilisierenden Materials zu der Oberfläche eines Vesikels und/oder nicht-vesikulären stabilisierenden Materials und umgekehrt oder aus dem Inneren eines Vesikels oder nicht-vesikulären stabilisierenden Materials in das Innere der Wände eines Vesikels oder nicht-vesikulären stabilisierenden Materials und umgekehrt.
„Gewebe" bezieht sich allgemein auf spezialisierte Zellen, die eine bestimmte Funktion durchführen können. Der Begriff „Gewebe" kann sich auf eine einzelne Zelle oder eine Mehrzahl oder ein Aggregat von Zellen beziehen, beispielsweise auf Membranen, Blut oder Organe. Der Begriff „Gewebe" bezieht sich auch auf eine anomale Zelle oder eine Mehrzahl anomaler Zellen, wie beispielsweise kanzeröser Zellen. Beispiele für Gewebe umfassen Herzmuskelgewebe, einschließlich Herzmuskelzellen und Kardiomyozyten, membranöses Gewebe, einschließlich Endothel und Epithel, Laminae, Bindegewebe, einschließlich interstitielles Gewebe und Tumoren.
„Intrazellulär" betrifft den Bereich innerhalb der Plasmamembran einer Zelle, einschließlich Protoplasma, Zytoplasma und/oder Nukleoplasma. „Intrazellulärer Transport/intrazelluläre Abgabe" bezieht sich auf den Transport/die Abgabe von photoaktiven Mitteln, bioaktiven Mitteln und/oder Zielliganden in den Bereich innerhalb der Plasmamembran einer Zelle. „Zelle" bezieht sich jede der kleinen protoplasmischen Massen, die organisiertes Gewebe ausmachen, umfassend eine Masse von Protoplasma, die von einer Membran umgeben ist, einschließlich nukleushaltige und nicht-nukleushaltige Zellen und Organellen. „Rezeptor" bezieht sich auf eine molekulare Struktur in einer Zelle oder auf der Oberfläche einer Zelle, die im Allgemeinen durch die selektive Bindung eines spezifischen Substrats gekennzeichnet ist. Beispielhafte Rezeptoren umfassen Zelloberflächenrezeptoren für Peptidhormone, Neurotransmitter, Antigene, Komplementfragmente, Immunoglobuline und zytoplasmatische Rezeptoren.
Die optoakustischen Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um optoakustische Bilddarstellung zu verbessern und überhaupt zu ermöglichen. Im Stand der Technik sind sowohl die optische als auch die akustische Bilddarstellung (z. B. Ultraschall) als separate Modalitäten verwendet worden. In der vorliegenden Erfindung wird Ultraschall verwendet, um optoakustische Kontrastmittel in Schwingung zu bringen, um die davon abgegebenen optischen Signale zu verändern. Durch die Verwendung von Ultraschall werden Phase, Frequenz und zeitliche Modulierung der optischen Signale verändert, um eine präzise räumliche Kartierung der Signale mithilfe optischer Bilddarstellung und Ultraschallbilddarstellung zu erlauben. Die akustische und optische Information kann integriert werden, um ein synthetisches Bild oder Hybridbild hervorzubringen, d. h. ein kombiniertes Ultraschallbild und optisches Bild.
Der Begriff „photoaktives Bild" umfasst fluoreszierende Materialien, phosphoreszierende Materialien, Photosensitivatoren, Chromophore, Fluorophore und dergleichen. Photoaktive Mittel, die für optoakustische Kontrastmittel geeignet sind, können aus Materialien ausgewählt werden, die relativ hohe molare Absorptivitäten haben, beispielsweise größer als etwa 10⁵ c^–1M^–1, mit Absorptionsmaxima vorzugsweise von etwa 500 nm bis etwa 1400 nm, mehr bevorzugt von etwa 730 nm bis etwa 1300 nm. Bei photoaktiven Materialien, die in Bilddarstellungsbereichen eines Patienten und/oder bei der Diagnostizierung des Vorhandenseins von erkranktem Gewebe bei einem Patienten verwendet wird, ist die Ausbeute an Fluoreszenzquanten ein entscheidendes Kriterium und ist vorzugsweise maximiert. Bevorzugte photoaktive Mittel sind fluorometrisch hoch aktiv und ergeben einem hohen Quantenanteil an Licht, wenn sie bei einer geeigneten Wellenlänge angeregt werden. Die photoaktiven Mittel können im UV-Bereich, im sichtbaren Bereich und/oder im IR-Bereich des Spektrums aktiv sein, vorzugsweise im IR-Bereich. Für Bilddarstellungsbereiche eines Patienten und/oder die Diagnostizierung des Vorhandenseins von erkranktem Gewebe bei einem Patienten ist das photoaktive Material vorzugsweise ein fluoreszierendes Material.
Außer für Bilddarstellungsbereiche eines Patienten und/oder die Diagnostizierung des Vorhandenseins von erkranktem Gewebe bei einem Patienten können die optoakustischen Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung für therapeutische Anwendungen verwendet werden. Optische Therapie oder Phototherapie leiden an denselben Einschränkungen wie optische Bilddarstellung, einschließlich schlechte Durchdringung und Signaldiffusion. Darüber hinaus kann ultraviolettes Licht hoher Intensität Hautschäden, Mutation und Nekrose verursachen. In der vorliegenden Erfindung wird therapeutischer Ultraschall verwendet, um die optoakustischen Kontrastmittel extern anzuregen, um ein Aufbrechen und eine Freisetzung der photoaktiven Mittel auszulösen, die in den optoakustischen Kontrastmitteln eingeschlossen sind. An der Freisetzungsstelle wird eine Strahlung geeigneter Wellenlänge angewandt, um therapeutische Photochemie auszulösen. Alternativ kann Ultraschall-induzierte Kavitation verwendet werden, um die photoaktiven Mittel zu aktivieren oder zu stimulieren. Ultraschall und Lichtenergie können auch gleichzeitig verwendet werden, um einen synergistischen Effekt hervorzurufen.
Das für therapeutische Anwendungen verwendete photoaktive Mittel ist vorzugsweise ein Photosensitivator. Photosensitivatoren haben in der Krebstherapie große Hoffnungen geweckt. Siehe beispielsweise Peng et al., Ultrastructural Pathology, 20: 109 (1996), Reddi, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 37: 189 (1997), Jori, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 36: 87 (1996), Calzavara-Pinton et al., J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 36: 225 (1996), Géze et al., J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 20: 23 (1993) und Spikes, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 6: 259 (1990). Nach Anwendung des geeigneten Lichts, können sich Photosensitivatoren photochemisch (z. B. durch Photooxidation, Photoreduktion und dergleichen) in eine Form verändern, die für das umliegende Gewebe toxisch ist. Beispielsweise wird ein Tumor nach Anregung eines Photosensitivators zu einem langlebigen angeregten Singulett- und/oder Triplettzustand entweder durch die hoch reaktive Singulett-Sauerstoffart (ein Typ-II-Mechanismus) und/oder durch freie Radikalprodukte (ein Typ-I-Mechanismus), die durch Quantenenergieübertragung erzeugt werden, zerstört. Wichtige biologische Zielmoleküle der Singulett-Sauerstoffarten und/oder freien Radikalprodukte umfassen Nukleinsäuren, Enzyme und Zellmembranen. Ein sekundärer therapeutischer Effekt der vorliegenden Verfahren umfasst die Freisetzung pathophysiologischer Produkte wie beispielsweise Prostaglandine, Thromboxane und Leukotriene von Geweben, die den Effekten aktivierter Photosensitivatoren ausgesetzt sind. Einem Fachmann ist daher ersichtlich, dass ein sorgfältiges Targeting der photoaktiven Mittel von überragender Bedeutung ist, um therapeutische Wirkungen ohne Toxämien zu erreichen.
Bestrahlung der photoaktiven Mittel, einschließlich fluoreszente Materialien und therapeutische Photosensitivatoren, wird intravaskulär wahlweise mithilfe von Lichtleitern wie Glasfaseroptik angewandt. Die Wellenlänge und Intensität der anzuwendenden Bestrahlung richten sich nach den jeweiligen verwendeten photoaktiven Mitteln, da unterschiedliche photoaktive Mittel unterschiedliche optimale Reaktionswellenlängen aufweisen. Die erforderliche Wellenlänge und Intensität der Bestrahlung kann daher von einem Fachmann ausgehend von den jeweiligen verwendeten photoaktiven Mitteln einfach bestimmt werden.
Geeignete photoaktive Mittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen beispielsweise Fluoreszeine, Indocyaningrün, Rhodamin, Triphenylmethine, Polymethine, Cyanine, Fullerene, Oxatellurazole, Verdine, Rhodine, Perphycene, Sapphyrine, Rubyrine, Cholesteryl-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-dodecanoat, Cholesteryl-12-(N-methyl-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)aminododecanat, Cholesteryl-cis-parinarat, Cholesteryl-3-((6-phenyl-1,3,5-hexatrienyl)phenylpropionat, Cholesteryl-1-pyrenbutyrat, Cholesteryl-1-pyrendecanoat, Cholesteryl-1-pyrenhexanoat, 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3β-yl-cis-9-octadecenoat, 1-Pyrenylmethyl-3-(hydroxy-22,23-bisnor-5-cholenat, 1-Pyrenmethyl-3β-(cis-9-octadecenoyloxy)-22,23-bisnor-5-cholenat, Acridinorange, 10-Dodecylbromid, Acridinorange-10-nonylbromid, 4-(N,N-Dimethyl-N-tetradecylammonium)-methyl-7-hydroxycoumarin)chlorid, 5-Dodecanoylaminofluorescein, 5-Dodecanoylaminofluorescein-bis-4,5-dimethoxy-2-nitrobenzylether, 2-Dodecylresorufin, Fluoresceinoctadecylester, 4-Heptadecyl-7-hydroxycoumarin, 5-Hexadecanoylaminoeosin, 5-Hexadecanoylaminofluorescein, 5-Octadecanoylaminofluorescein, N-Octadecyl-N'-(5-(fluoresceinyl))thioharnstoff, Octadecylrhodamin-B-chlorid, 2-(3-(Diphenylhexatrienyl)-propanoyl)-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 6-N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)hexansäure, 1-Hexadecanoyl-2-(1-pyrendecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin, 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat, 12-(9-Anthroyloxy)ölsäure, 5-Butyl-4,4-difluor-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacen-3-nonansäure, N-(Lissamine^TM-Rhodamin-B-sulfonyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz, Phenylglyoxalmonohydrat, Naphthalen-2,3-dicarboxaldehyd, 8-Bromethyl-4,4-difluor-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen, o-Phthaldialdehyd, Lissamine^TM-Rhodamin-B-sulfonylchlorid, 2',7'-Difluorfluorescein, 9-Anthronitril, 1-Pyrensulfonylchlorid, 4(4-(Dihexadecylamino)-styryl)-N-methylpyridiniumiodid, Chlorine wie beispielsweise Chlorin, Chlorin e6, Bonellin, Mono-L-aspartylchlorin e6, Mesochlorin, meso-Tetraphenylisobacteriochlorin und meso-Tetraphenylbacteriochlorin, Hypocrellin B, Purpurine wie beispielsweise Octaethylpurpurin, Zink(II)etiopurpurin, Zinn(IV)etiopurpurin und Zinnethyletiopurpurin, Lutetiumtexaphyrin, Photofrin, Metalloporphyrine, Protoporphyrin IX, Zinnprotoporphyrin, Benzoporphyrin, Hämatoporphyrin, Phthalocyanine, Naphthocyanine, Merocyanine, Lanthanidkomplexe, Siliciumphthalocyanine, Zinkphthalocyanine, Aluminiumphthalocyanine, Ge-Octabutyoxyphthalocyanine, Methylpheophorbid-α-(hexylether), Porphycene, Ketochlorine, sulfonierte tetraphenylporphyrine, δ-Aminolevulinsäure, Texaphyrine, einschließlich beispielsweise 1,2-Dinitro-4-hydroxy-5-methoxybenzol, 1,2-Dinitro-4-(1-hydroxyhexyl)oxy-5-methoxybenzol, 4-(1-Hydroxyhexyl)oxy-5-methoxy-1,2-phenylendiamin und Texaphyrinmetallchelate, einschließlich die Metall Y(III), Mn(II), Mn(III), Fe(II), Fe(III) und die Lanthanidmetalle Gd(III), Dy(III), Eu(III), La(III), Lu(III) und Tb(III), Chlorophyll, Carotenoide, Flavonoide, Biline, Phytochrome, Phycobiline, Phycoerythrine, Phycocyanine, Retinolsäuren, Retinoine, Retinate oder beliebige Kombinationen der oben genannten. Ein Fachmann kann einfach erkennen oder einfach bestimmen, welche der obigen Verbindungen beispielsweise fluoreszierende Materialien und/oder Photosensitivatoren sind. Lissamine^TM ist die Marke für N-Ethyl-N-[4-[[4-[ethyl[(3-sulfophenyl)methyl]-amino]phenyl](4-sulfophenyl)-methylen]- 2,5-cyclohexadien-1-yliden]-3-sulfobenzolmethanaminiumhydroxid, Inneres Salz, Dinatriumsalz und/oder Ethyl[4-[p[ethyl(m-sulfobenzyl)amino]-α-(p-sulfophenyl)benzyliden]-2,5-cyclohexadien-1-yliden](m-sulfobenzyl)ammoniumhydroxydinneres salz-dinatriumsalz (kommerziell von Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA, erhältlich).
Andere geeignete photoaktive Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die in US-Patent Nr. 4,935,498 Beschriebenen, deren Offenbarung hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist, wie beispielsweise ein Dysprosiumkomplex von 4,5,9,24-Tetraethyl-16-(1-hydroxylhexyl)oxy-17-methoxypentaazapentacyclo-(20.2.1.1.sup.3,6.1.sup.8,11.0.sup.14,19)-heptacosa-1,3,5,7,8,11(27),12,14,16,18,20,22(25),23-tridecaen und Dysprosiumkomplex von 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropyl-6-(4,5,9,24-tetraethyl-17-methoxypentaazapentacyclo-(20.2.1.1.sup.3,6.1.sup.8,11.0.sup.14,19)-heptacosa-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18,20,22(25),23-trodecaen-16-(1-oxy)hexylphosphoramidit.
Antikörpergebundene photoaktive Mittel oder Photosensitivatoren können verwendet werden, wenn eine Immunreaktion auf das Vorhandensein des Antikörpers gewünscht ist, einschließlich die beispielsweise von Ebato et al., Anal. Chem. 66: 1683–1689 (1994) Beschriebenen.
Weitere geeignete photoaktive Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise die in US-Patent Nr. 5,214,036 (Allison et al) und 5,162,519 (Bonnett et al), in der kanadischen Patentanmeldung Nr. 2,047,969 (Madden), International Publication Nr. WO 96/23524 (Klaveness et al.), Reddi et al., Lasers in Medical Science, 5: 339 (1990), Spikes, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 6: 259 (199), Jori, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 36: 87 (1996), Géze et al., J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 20: 23 (1993), Calzavara-Pinton et al., J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 36: 225 (1996), Peng et al., Ultrastructural Pathology, 20: 109 (1996) und Reddi, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 37: 189 (1997) Beschriebenen. Einem Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung noch weitere für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete photoaktive Mittel geläufig.
Die photoaktiven Mittel werden in einer Menge von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 80 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-%, mehr bevorzugt etwa 1 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-%, ausgehend von dem Gewicht der Zusammensetzungen, in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet.
In einigen Ausführungsformen können die photoaktiven Mittel kovalent an die hierin beschriebenen stabilisierenden Materialien gebunden oder konjugiert sein, einschließlich an Lipide, Polymere, Proteine und Tenside, vorzugsweise Lipide oder Tenside wie beispielsweise lipidkonjugiertes Rhodamin, lipidkonjugiertes Fluoreszein, lipidkonjugiertes N-(Lissamine^®-Rhodamin-β-sulfonyl), die in 1 Beschriebenen und die von MacDonald, J. Bio. Chem. 265(23): 13533–9 (1990), Leenhouts et al., Biochim. Biophys. Acta, 1237(2): 121–6 (1995), Ahlers et al., Biophys. J., 63(3): 823–38 (1992) und Ebato et al., Anal. Chem. 66(10): 1683–9 (1994) Beschriebenen. Alternativ kann das photoaktive Mittel mit einem Lipid verestert werden, wenn sich am Ende des photoaktiven Mittels eine OH-Gruppe oder COO^–Gruppe befindet.
1 zeigt die chemischen Strukturen der folgenden photoaktiven Mittel, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Cholesteryl-1-pyrenbutyrat, Cholesteryl-1-pyrenhexanoat und Cholesteryl-1-pyrendecanoat, Cholesteryl-12-(N-methyl-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)dodecanat, Cholesteryl-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-dodecanoat, Cholesteryl-cis-parinarat, Cholesteryl-3-((6-phenyl)-1,3,5-hexatrienyl)phenylproprionat, 22-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino-23,24-bisnor-5-cholen-3β-ol, 22-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino-23,24-bisnor-5-cholen-3β-yl-cis-9-octadecenoat, 1-Pyrenmethyl-3β-hydroxy-22,23-bisnor-5-cholenat und 1-Pyrenmethyl-3β-(cis-9-octadecenoyloxy)-22,23-bisnor-5-cholenat.
2 zeigt die chemischen Strukturen der folgenden photoaktiven Mittel, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Acridinorange-10-dodecylbromid und Acridinorange-10-nonylbromid, 5-Dodecanoylaminofluorescein, 5-Hexadecanoylaminofluorescein und 5-Octadecanoylaminofluorescein, 5-Dodecanoylaminofluorescein-bis-4,5-dimethoxy-2-nitrobenzylether, 2-Dodecylresorufin, Fluorescein-octadecylester, 5-Hexadecanoylaminoeosin, Octadecylrhodamin-B-chlorid, N-Octadecyl-N'-(5-(fluoresceinyl))thioharnstoff.
3–7 zeigen beispielhaft verschiedene Ausführungsformen optoakustischer Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung. Eine oder mehrere verschiedene photoaktive Mittel können in eine vesikuläre Membran (vesikuläre Membranen) eingeschlossen sein. Optisch aktive Kontrastmittel, die außerdem akustisch hoch aktiv sind, können hergestellt werden, indem lipophile, vorzugsweise amphipathische photoaktive Mittel in die Lipidzusammensetzungen aufgenommen werden.
Die optoakustischen Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise flexibel, d. h. haben elastische Membranen, so dass die Oberflächeneigenschaften durch Ultraschall einfach moduliert werden können. Das typische lipidbasierte optoakustische Kontrastmittel ist hoch elastisch und durch Ultraschall einfach verformbar. 3 ist ein Beispiel eines optoakustischen Kontrastmittels, bei dem sich die photoaktiven Mittel in der Wand (den Wänden) des Vesikels befinden und bei dem das Innere des Vesikels ein Gas, eine Flüssigkeit, einen Gasvorläufer, Öl oder Kristalle mit darin eingeschlossenem Gas (z. B. eine feste poröse Matrix) enthält. Die Zahlen in 3 stellen die folgenden photoaktiven Mittel dar: (1) 5-Butyl-4,4-difluor-4-boro-3a,4a-diaza-s-indacen-3-nonionsäure; (2) N-(Lissamine^®-Rhodamin-B-sulfonyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glacero-3-phosphoethanolamin(triethylammoniumsalz), (3) 12-(9-Anthroyloxy)ölsäure, (4) 2-(3-(Diphenylhexatrienyl)-propanoyl)-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, (5) 5-Dodecanoylaminofluorescein, (6) 4-(4-Dihexadecylamino)styryl)-N-methylpyridiniumiodid, (7) 1-Hexadecanoyl-2-(1-pyrendecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin, (8) 1,1''-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat und (9) 6-N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)hexansäure. Für ausgewählte Anwendungen können andere Variationen optoakustischer Kontrastmittel entworfen werden.
4 ist ein Beispiel eines optoakustischen Kontrastmittels der vorliegenden Erfindung mit einer internen Ölphase (1). In das Innere der Ölphase im Innern des Vesikels kann aufgrund der Ölphase eine hohe Konzentration von hydrophoben photoaktiven Mitteln (z. B. A–I) geladen werden. Durch Verwendung einer internen Ölphase ist es möglich, ein optoakustisches Kontrastmittel mit einer höheren Konzentration an photoaktivem Mittel als in lipidbasierten Zusammensetzungen herzustellen, die unter Umständen nur eine dünne Schicht (z. B. eine Einzelschicht oder Doppelschicht) eines eine Gasphase umgebenden Lipids aufweisen. Je nach Löslichkeit der photoaktiven Mittel in der Ölphase ist es möglich, das optoakustische Kontrastmittel so zu konstruieren, dass es ein noch stärkeres optisches Signal abgibt. Die Buchstaben in 4 stellen folgende photoaktive Mittel dar: (A) Phenylglyoxalmonohydrat, (B) Naphthalen-2,3-dicarboxaldehyd, (C) 8-Brommethyl-4,4-difluor-1,3,5,7-tetramethyl-4-boro-3a,4a-diaza-s-indacen, (D) o-Phthaldialdehyd, (E) 2-(3-(Diphenylhextrienyl)propanoyl)-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, (F) Lissamine^®-Rhodamin-B-sulfonylchlorid, (G) 2',7'-Difluorfluorescein, (H) 9-Anthronitrol, (I) 1-Pyrensulfonylchlorid. Die optoakustischen Kontrastmittel, die in 2 beispielhaft dargestellt sind, können auch eine interne Gasphase (2) enthalten.
5 liefert ein Beispiel eines optoakustischen Kontrastmittels der vorliegenden Erfindung, das feste Partikel photoaktiver Mittel (2) umfasst. In dieser Ausführungsform ist die feste Matrix so konzipiert, um porös zu sein, so dass in die Leerräume, welche die festen Partikel von photoaktiven Mitteln umgeben, Gase (3) eingeschlossen werden können. Die Zusammensetzung kann wahlweise einen Film eines Tensids, ein Film bildendes Material oder ein Polymer an der Oberfläche (1) umfassen, um die Stabilität des Gases in Verbindung mit der festen porösen Matrix an photoaktivem Mittel zu erhalten. Wahlweise kann die Zusammensetzung auch Zielliganden (4) umfassen.
6 ist ein Beispiel eines optoakustischen Kontrastmittels der vorliegenden Erfindung, das photoaktive Mittel und Zieleinheiten wie Glycolipide (1), Lipoproteine (2) und Antikörper (3) umfasst. Zielgerecht transportierte/abgegebene Kontrastmittel sind für die diagnostische Bilddarstellung und zum Targeting und zum Transport/zur Abgabe therapeutischer photoaktiver Mittel geeignet. Aufgrund der Synergie optoakustischer Bilddarstellung weisen die Verfahren der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu beiden Techniken alleine (z. B. optische Bilddarstellung oder Ultraschall-Bilddarstellung) überlegene Empfindlichkeit und Kontrastschärfe auf. Durch die neue Bilddarstellungstechnik der vorliegenden Erfindung sind Empfindlichkeit und Genauigkeit zum Feststellen ausgewählter Zelle, ausgewählten Gewebes und ausgewählter subzellulärer Ziele verstärkt.
7 ist eine Ausführungsform einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die einen Bereich zum Einschließen photoaktiver Mittel (2), eines Gases (3) und von Zielliganden, die kovalent an Lipide (1) konjugiert sind, umfasst, welche der Zusammensetzung zell- und gewebespezifisches Targeting verleihen. Der Bereich zum Einschließen photoaktiver Mittel (2) kann beispielsweise ein öliger hydrophober Bereich sein.
Die Größe optoakustischer Kontrastmittel richtet sich im Allgemeinen nach zwei Faktoren. Erstens verlangt die Berücksichtigung der Echogenität und der Fähigkeit, durch Arteriolen und Venolen zu fließen, dass die Partikelgröße für intravenöse Anwendungen weniger als etwa 3 μm, vorzugsweise weniger als etwa 2 μm im Durchmesser beträgt. Ein zweiter Aspekt des Größenkriteriums ist eine Folge der Absorptionseigenschaften der photoaktiven Mittel. Für effektive Lichtstreuung ist ein Bereich von etwa 0,06λ bis etwa 2,0λ (wobei λ die Wellenlänge des einfallenden Lichts in nm ist), vorzugsweise etwa λ/2π, optimal. Vesikel in Größen, die für Wellenlängen über dem Absorptionsmaximum von Bluthämoglobin (z. B. etwa 600 nm bis etwa 1000 nm) ausgewählt sind, würden maximal effektive Streuung hervorrufen.
Ohne sich durch eine Theorie der Erfindung binden zu lassen, beginnen die Zusammensetzungen mit der Ultraschallfrequenz zu oszillieren, da Ultraschall mit der optoakustischen Membran der Zusammensetzungen der Erfindung interagiert. Wenn doppelte optische Impulse auf den Bereich angewandt werden, der die optoakustischen Kontrastmittel enthält, werden die von den akustisch aktiven Kontrastmitteln abgegebenen optischen Signale durch den Ultraschall moduliert. Auch die auf die Zusammensetzungen angewandten optischen Signale können in geringerem Maß die akustischen Signale modulieren, die von den Zusammensetzungen reflektiert werden.
Da die optischen Signale, die von den Zusammensetzungen schwingen, durch den Ultraschall moduliert werden, kann die von optischen Überträgerelementen empfangene Information verwendet werden, um den genauen räumlichen Ort der optischen Signale zu bestimmen. Die Ultraschallenergie kann präzise auf eine Position innerhalb eines Millimeters oder weniger des gewünschten Ortes fokussiert werden. Die Ultraschallenergie kann gepulst sein und, falls gewünscht, hinsichtlich der Amplitude und Frequenz variiert werden. Da die Ultraschallenergie moduliert wird, trifft dies auch für die von den optoakustischen Kontrastmitteln empfangenen optischen Signale zu. Damit kann eine Karte mit akustischer und optischer Information erstellt werden, die es erlaubt, ein hochwertiges Bild der Daten zu erhalten.
8 und 9 sind Beispiele zweier Anwendungen der Verfahren der vorliegenden Erfindung. 8 veranschaulicht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der optoakustische Kontrastmittel für oberflächliche oder externe Therapie verwendet werden, d. h., bei der die kombinierten Ultraschallüberträger und optischen Überträger und Scanner (2) außerhalb des Körpers verwendet werden und bei der sich der zu behandelnde Bereich des Patienten (1) im Körper befindet. Die kombinierten Ultraschallüberträger und optischen Überträger und Scanner (2) sind mit der Ultraschallausrüstung und optischen Ausrüstung (3) verbunden.
9 veranschaulicht eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der optoakustische Kontrastmittel bei der interstitiellen oder chirurgischen Therapie verwendet werden, d. h., bei der die kombinierten Ultraschallüberträger und optischen Überträger und Scanner (1) chirurgisch in den Körper eingebracht werden und bei der sich der zu behandelnde Bereich des Patienten (2) im Körper befindet. Das Glasfaserbündel für das endoskopische oder chirurgische Einsetzen (3) verläuft aus dem Körper heraus zu der Ultraschallausrüstung und optischen Ausrüstung (3).
Die optoakustischen Kontrastmittel können auch für orale oder rektale Anwendungen verwendet werden. Diese Kontrastmittel werden im Allgemeinen mit Sonden verwendet, welche sowohl mit optischen als auch mit akustischen Elementen ausgerüstet sind. Solche Sonden können transkutan oder endoskopisch für verschiedene diagnostische und therapeutische Anwendungen verwendet werden, wie einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig ist.
In anderen Ausführungsformen können die optoakustischen Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Kathetern oder Angioplastikballons verwendet werden, die mit optischen und/oder Ultraschallüberträgerelementen ausgerüstet sind.
Als stabilisierende Materialien und Vesikel in der vorliegenden Erfindung können viele verschiedene Lipide verwendet werden. Die Lipide können entweder natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Herkunft sein, einschließlich beispielsweise Fettsäuren, fluorierte Lipide, Neutralfette, Phosphatide, Öle, fluorierte Öle, Glykolipide, oberflächenaktive Mittel (Tenside und Fluorierte Tenside), aliphatische Alkohole, Wachse, Terpene und Steroide. Geeignete Lipide, die verwendet werden können, um die stabilisierenden Materialien der vorliegenden Erfindung herzustellen, umfassen beispielsweise Fettsäuren, Lysolipide, fluorierte Lipide, Phosphocholine, wie beispielsweise solche, die mit Plättchenaktivierungsfaktoren (PAF) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) assoziiert sind, einschließlich 1-Alkyl-2-acetoyl-sn-glycero-3-phosphocholine und 1-Alkyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine, die Blutgerinnsel angreifen, Phosphatidylcholin mit sowohl gesättigten als auch ungesättigten Lipiden, einschließlich Dioleoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipentadecanoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin; Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPCC), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Diarachidonylphosphatidylcholin (DAPC), Phosphatidylethanolamine wie beispielsweise Dioleoylphosphatidylethanolamin (DPPE) und Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerole, einschließlich Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), Phosphatidylinositol, Sphingolipide wie beispielsweise Sphingomyelin, Glycolipide wie beispielsweise Gangliosid GM1 und GM2, Glucolipide, Sulfatide, Glycosphingolipide, Phosphatidsäuren, wie beispielsweise Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA) und Distearoylphosphatidsäure (DSPA), Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachidonsäure, Ölsäure, polymertragende Lipide wie beispielsweise Chitin, Hyaluronsäure, Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG), auch bezeichnet als „pegylierte Lipide", wobei bevorzugte polymertragende Lipide DPPE-PEG (DPPE-PEG) umfassen, was sich auf das Lipid DPPE mit einem daran angebrachten PEG-Polymer bezieht, einschließlich beispielsweise DPPE-PEG5000, was sich auf DPPE mit einem daran angebrachten PEG-Polymer bezieht, das ein mittleres Molekulargewicht von etwa 5000 hat, Lipide, die sulfonierte Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharide tragen, Cholesterin, Cholesterinsulfat und Cholesterinhemisuccinat, Tocopherolhemisuccinat, Lipide mit ether- und esterverknüpften Fettsäuren, polymerisierte Lipide (von denen eine breite Vielfalt aus dem Stand der Technik bekannt ist), Diacetylphosphat, Dicetylphosphat, Stearylamin, Cardiolipin, Phospholipide mit kurzkettigen Fettsäuren mit einer Länge von etwa 6 bis etwa 8 Kohlenstoffen, synthetische Phospholipide mit asymmetrischen Acylketten wie beispielsweise eine Acylkette mit etwa 6 Kohlenstoffen und einer andere Acylkette mit etwa 12 Kohlenstoffen, Ceramide, nicht-ionische Liposomen, einschließlich Niosomen wie beispielsweise Polyoxyalkylen (z. B. Polyoxyethylen)fettsäureester, Polyoxyalkylen (z. B. Polyoxyethylen)fettalkohole, Polyoxyalkylen (z. B. Polyoxyethylen)fettalkoholester, Polyoxyalkylen (z. B. Polyoxyethylen)sorbitanfettsäurester (wie beispielsweise die Klasse von Verbindungen, die als TWEEN^® bezeichnet werden, einschließlich beispielsweise TWEEN^® 20, TWEEN^® 40 und TWEEN^® 80, kommerziell von ICI Americans Inc., Wilmington, DE, USA, erhältlich), Glycerolpolyethylglycol, Oxystearat, Glycerolpolyethylenglycolricinolat, alkyloxylierte (z. B. ethoxylierte) Sojybohnensterole, alkyloxyliertes (z. B. ethoxylierte) Rizinusöl, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymere und Polyoxyalkylen (z. B. Polyoxyethylen)fettsäurestearate, aliphatische Sterolsäurester, einschließlich Cholesterinsulfat, Cholesterinbutyrat, Cholesterinisobutyrat, Cholesterinpalmitat, Cholesterinstearat, Lanosterolacetat, Ergosterolpalmitat und Phytosterol-n-butyrat, Sterilester von Zuckersäuren, einschließlich Cholesteringlucuronid, Lanosterolglucuronid, 7-Dehydrocholesteringlucuronid, Ergosterolglucuronid, Cholesteringluconat, Lanosterolgluconat und Egosterolgluconat, Ester von Zuckersäuren und Alkoholen, einschließlich Laurylglucuronid, Stearoylglucuronid, Myristoylglucuronid, Laurylgluconat, Myristoylgluconat und Stearoylgluconat, Ester von Zuckern und aliphatischen Säuren, einschließlich Saccharoselaurat, Fructoselaurat, Saccharosepalmitat, Saccharosestearat, Glucuronsäure, Gluconsäure und Polyuronsäure, Saponine, einschließlich Sarsasapogenin, Smilagenin, Hederagenin, Oleanolsäure und Digitoxigenin, Glyceroldilaureat, Glyceroltrilaureat, Glyceroldipalmitat, Glycerol und Glycerolester, einschließlich Glyceroltripalmitat, Glyceroldistearat, Glyceroltristearat, Glyceroldimyristat, Glyceroltrimyristat, langkettige Alkohole, einschließlich n-Decylalkohol, Laurylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol und n-Octadecylalkohol, 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)-1-thio-β-D-galactopyranosid, Digalactosyldiglycerid, 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-deoxy-1-thio-β-D-galactopyranosid, 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-deoxyl-1-thio-α-D-mannopyranosid, 12-(((7'-Diethylaminocoumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)octadecansäure, N-[12-(((7'-Diethylaminocoumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)-octadecanoyl]2-aminopalmitinsäure, Cholesteryl(4'-trimethylammonio)butanoat, N-Succinyldioleoylphosphatidylethanolamin, 1,2-Dioleoyl-sn-glycerol, 1,2-Dipalmitoyl-sn-3-succinylglycerol, 1,3-Dipalmitoyl-2-succinylglycerol, 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerophosphoethanolamin und Palmitoylhomocystein und/oder beliebige Kombinationen davon. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die stabilisierenden Materialien Phospholipide, einschließlich eines oder mehrere von DPPC, DPPE, DPPA, DSPC, DSPE, DSPG, DSPA und DAPC.
Beispiele polymerisierter Lipide umfassen ungesättigte lipophile Ketten wie Alkenyl oder Alkynyl, die bis zu etwa 50 Kohlenstoffatome enthalten, Phospolipide, wie beispielsweise Phosphoglyceride und Sphingolipide, die polymerisierbare Gruppen tragen, und gesättigte und ungesättigte Fettsäurederivate mit Hydroxylgruppen, wie beispielsweise Triglyceride von d-12-Hydroxyölsäure, einschließlich Castoröl und Ergotöl. Polymerisierung kann so entworfen werden, dass sie hydrophile Substituenten wie beispielsweise Carboxyl- oder Hydroxylgruppen enthält, um die Dispergierbarkeit zu erhöhen, so dass der Gerüstrest, der aus dem biologischen Abbau in Wasser resultiert, löslich ist. Geeignete polymerisierbare Lipide sind auch beispielsweise von Klaveness et al., US-Patent Nr. 5,536,490 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist.
Geeignete fluorierte Lipide umfassen beispielsweise Verbindungen der Formel C_nF_2n+1(CH₂)_mC(O)OOP(OO^–)O(CH₂)_wN⁺(CH₃)₃C_nF_2n+1(CH₂)_mC(O)O, wobei m 0 bis etwa 18 ist, n 1 bis etwa 12 ist und w 1 bis etwa 8 ist. Beispiele und Verfahren ihrer Synthese sowie anderer fluorierten Lipide, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind beschrieben in US-Anmeldung Serien-Nr. 08/465,868, die am 6. Juni 1995 eingereicht wurde; Reiss et al., US-Patent Nr. 5,344,930, Frezard et al., Biochem Biophys Acta, 1192: 61–70 (1994), und Frezard et al., Art. Cells Blood Subs and Immob Biotech., 22: 1403–1408 (1994). Ein spezifisches Beispiel eines Difluoracylglycerylphosphatidylcholins, nicht fluoriertes Diacylglycerylphosphatidylcholin, ist durch Verbindung A unten dargestellt. Ein Fachmann weiß, dass analoge fluorierte Derivate anderer gängiger Phospholipide (z. B. Diacylphosphatidylserin, Diacylphosphatidylethanolamin, Diacylphosphatidylglycerol, Diacylphosphatidyglycerol und dergleichen) sowie fluorierte Derivate von Fettacylestern und freien Fettsäuren auch in Übereinstimmung mit dem Schutzumfang der Erfindung funktionieren können. Zusätzlich können lipidbasierte und fluorierte (einschließlich perfluorierte) Tenside in der vorliegenden Erfindung als stabilisierende Materialien verwendet werden.
Beispielhafte polymerisierbare und/oder fluorierte Lipidverbindungen, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind unten veranschaulicht.
In Formel a oben ist x eine ganze Zahl von etwa 8 bis etwa 18 und n ist 2x. Am meisten bevorzugt ist x 12 und n 24. In Formel B, C, K und L oben, sind m, n, M' und n' unabhängig eine ganze Zahl von etwa 8 bis etwa 18, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 14.
Falls gewünscht, kann das stabilisierende Material ein kationisches Lipid wie beispielsweise N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propan (DOTAP) und 1,2-Dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol (DOTB) umfassen. Wenn in den stabilisierenden Materialien ein kationisches Lipid verwendet wird, kann das molare Verhältnis von kationischem Lipid zu nicht-kationischem Lipid beispielsweise von etwa 1:1000 bis etwa 1:100 sein. Vorzugsweise kann das molare Verhältnis von kationischem Lipid zu nicht-kationischem Lipid beispielsweise von etwa 1:2 bis etwa 1:10 sein, wobei ein Verhältnis von etwa 1:1 bis etwa 1:2,5 bevorzugt ist. Noch mehr bevorzugt kann das molare Verhältnis von kationischem Lipid zu nicht-kationischem Lipid etwa 1:1 sein.
Falls gewünscht, können sich Aggregate oder Cochleate aus einem oder mehreren geladenen Lipiden in Assoziation mit einem oder mehr polymertragenden Lipiden befinden, wahlweise in Assoziation mit einem oder mehr neutralen Lipiden. Die geladenen Lipide können entweder anionisch (d. h. negativ geladen sein, d. h. sie tragen eine negative Nettoladung) oder kationisch sein (d. h. positiv geladen sein, das heißt, sie tragen eine positive Nettoladung). Typischerweise sind die Lipide in Gegenwart einer multivalenten Art aggregiert, wie beispielsweise einem Gegenion, dessen Ladung entgegengesetzt zum geladenen Lipid ist.
Beispielhafte anionische Lipide umfassen Phosphatidsäure und Phosphatidylglycerol und deren Fettsäureester, Amide von Phosphatidylethanolamin wie beispielsweise Anandamide und Methanandamide, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und deren Fettsäureester, Cardiolipin, Phosphatidylethylenglycol, saure Lysolipide, Sulfolipide und Sulfatide, freie Fettsäuren, sowohl gesättigte als auch ungesättigte, und negativ geladene Derivate davon. Phosphatidsäure und Phosphatidylglycerol und Festtsäureester davon sind bevorzugte anionische Lipide.
Wenn das geladene Lipid anionisch ist, kann ein multivalentes (divalentes, trivalentes, etc.) kationisches Material verwendet werden, um Aggregate zu bilden. Geeignete Kationen umfassen beispielsweise Kationen, die aus Erdalkalimetallen abgeleitet sind, wie beispielsweise Beryllium (Be²⁺), Magnesium (Mg²⁺), Calcium (Ca²⁺), Strontium (Sr²⁺) und Barium (Ba²⁺), amphotere Ionen wie beispielsweise Aluminium (Al³⁺), Gallium (Ga³⁺), Germanium (Ge³⁺), Zinn (Sn⁴⁺) und Blei (Pb²⁺ und Pb⁴⁺), Übergangsmetalle wie beispielsweise (Ti³⁺ und Ti⁴⁺), Vanadium (V²⁺ und V³⁺), Chrom (Cr²⁺ und Cr³⁺), Mangan (Mn²⁺ und Mn³⁺), Eisen (Fe²⁺ und Fe³⁺), Kobalt (Co²⁺ und Co³⁺), Nickel (Ni²⁺ und Ni³⁺), Kupfer (Cu²⁺), Zink (Zn²⁺), Zirkon (Zr⁴⁺), Niob (Nb³⁺), Molybdän (Mo²⁺ und Mo³⁺), Kadmium (Cd²⁺), Indium (In³⁺), Tungsten (W²⁺ und W⁴⁺), Osmium (Os²⁺, Os³⁺ und Os⁴⁺), Iridium (Ir²⁺, Ir³⁺ und Ir⁴⁺), Quecksilber (Hg²⁺) und Wismut (Bi³⁺) und Selten-Erd-Lanthanide wie beispielsweise Lanthan (La³⁺) und Gadolinium (Gd³⁺). Zur Bildung von Aggregaten und vernetzten Lipiden geeignet sind Kationen in all ihren gewöhnlichen Valenzzuständen. Bevorzugte Kationen umfassen Calcium (Ca²⁺), Magnesium (Mg²⁺) und Zink (Zn²⁺) und paramagnetische Kationen wie beispielsweise Mangan (vorzugsweise Mn²⁺) und Gadolinium (Gd³⁺). Besonders bevorzugt ist Calcium (Ca²⁺). Manche der obigen Ionen (z. B. Blei und Nickel) sind mit Toxizität verbunden und daher unter Umständen für den Gebrauch in vivo ungeeignet.
Wenn das geladene Lipid kationisch ist, kann ein anionisches Material verwendet werden, um Aggregate zu bilden. Vorzugsweise ist das anionische Material multivalent, wie beispielsweise divalent. Beispiele geeigneter anionischer Materialien umfassen monoatomare und polyatomare Anionen wie beispielsweise Carboxylationen, Sulfidionen, Sulfitionen, Sulfationen, Oxidionen, Nitridionen, Carbonationen und Phosphationen. Auch Anionen von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und 1,4,7,7,10- Tetraazocyclododecan-N',N',N'',N''-tetraessigsäure (DOTA), können verwendet werden. Andere Beispiele geeigneter anionischer Materialien umfassen Anionen von Polymeren und Copolymeren von Acrylsäure, Methacrylsäure, andere Polyacrylate und Methacrylate, Polymere mit anhängigen SO₃H-Gruppen, wie beispielsweise sulfoniertes Polystyrol, und Polystyrole, die Carboxysäuregruppen enthalten.
Beispiele kationischer Lipide umfassen die oben genannten. Ein bevorzugtes kationisches Lipid zur Bildung von Aggregaten ist N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA). Synthetische kationische Lipide können ebenfalls verwendet werden. Synthetische kationische Lipide umfassen gängige natürliche Lipide, die derivatisiert sind, um eine oder mehrere basische funktionelle Gruppen zu enthalten. Beispiele von Lipiden, die so modifiziert werden können, umfassen Dimethyldioctadecylammoniumbromid, Sphingolipide, Sphingomyelin, Lysolipide, Glycolipide wie beispielsweise Gangliosid GM1, Sulfatide, Glycosphingolipide, Cholesterin und Cholesterinester und -salze, N-Succinyldioleoylphosphatidylethanolamin, 1,2-Dioleoyl-sn-glycerol, 1,3-Dipalmitoyl-2-succinylglycerol, 1,2-Dipalmitoyl-sn-3-succinylglycerol, 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerophosphatidylethanolamin und Pamitoylhomocystein.
Für die Ausführungsformen der Erfindung geeignet sind auch spezifisch synthetisierte kationische Lipide, wie die, die beschrieben sind in US-Patentanmeldung Nr. 08/391,938, beantragt am 21. Februar 1995, deren Offenbarung hiermit in Gänze durch Bezugnahme hierin enthalten ist, und umfassen beispielsweise N,N'-Bis(dodecylaminocarbonylmethylen)-N-N'-bis(β-N,N,N-trimethylammoniumethylaminocarbonylmethylenethylendiamintetraiodid); N,N''-Bis(hexadecylaminocarbonylmethylen)-N,N',N''-tris(β-N,N,N- trimethylammoniumethylaminocarbonylmethylendiethylentriaminhexaiodid); N,N''-Bis(dodecylaminocarbonylmethylen)-N,N''-bis(β-N,N,N-trimethylammoniumethylaminocarbonylmethylen)-cyclohexylen-1,4-diamintetraiodid); 1,1,7,7-Tetra((β-N,N,N,N-tetramethylammoniumethylaminocarbonylmethylen)-3-hexadecylaminocarbonylmethylen-1,3,7-triazaheptanheptaiodid und N,N,NN'-(Tetraphosphoethanolaminocarbonylmethylen)diethylentriamintetraiodid.
Im Falle von stabilisierenden Materialien, die sowohl kationische als auch nicht-kationische Lipide enthalten, können viele verschiedene Lipide, wie oben beschrieben, als nicht-kationisches Lipid verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das nicht-kationische Lipid eines oder mehrere Phospholipide, wie beispielsweise DPPC, DPPE und Dioleoylphosphatidylethanolamin. Anstelle der oben aufgeführten kationischen Lipide, können in den stabilisierenden Materialien Lipide verwendet werden, die kationische Polymere tragen, wie beispielsweise Polylysin oder Polyarginin, sowie Alkylphosphonate, Alkylphosphinate und Alkylphosphite.
Gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, die in den vorliegenden stabilisierenden Materialien verwendet werden können, umfassen Moleküle, die etwa 12 Kohlenstoffatome bis etwa 22 Kohlenstoffatome in linearer oder verzweigter Form enthalten. Es können Kohlenwasserstoffgruppen, die aus Isoprenoideinheiten und/oder Prenylgruppen bestehen, verwendet werden. Geeignete gesättigte Fettsäuren umfassen beispielsweise Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Stearinsäure. Geeignete ungesättigte Fettsäuren umfassen beispielsweise Laurolein-, Pottwal-, Myristolein-, Palmitolein-, Petroselin- und Ölsäuren. Geeignete verzweigte Fettsäuren umfassen beispielsweise Isolaurin-, Isomyristin-, Isopalmitin- und Isostearinsäure.
Die vorliegende Erfindung umfasst weitere, einem Fachmann geläufige geeignete Lipide oder Kombinationen davon. Beispielsweise können kohlenhydrattragende Lipide verwendet werden, wie in US-Patent Nr. 4,310,505 beschrieben ist.
Außer stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln, die aus Lipiden gebildet sind, können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Vesikel beinhalten, die ganz oder teilweise aus Proteinen oder Derivaten davon formuliert sind. Geeignete Proteine umfassen beispielsweise Albumin, Hämoglobin, α-1-Antitrypsin, α-Fetoprotein, Aminotransferasen, Amylase, C-reaktives Protein, karzinoembryonales Antigen, Ceruloplasmin, Komplement, Creatinphosphokinase, Ferritin, Fibrinogen, Fibrin, Transpeptidase, Gastrin, Serumglobuline, Myoglobin, Immunglobuline, Lactatdehydrogenase, Lipase, Lipoproteine, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, α-1-Serumproteinfraktion, α-2-Serumproteinfraktion, β-Proteinfraktion, γ-Proteinfraktion und γ-Glutamyltransferase. Weitere stabilisierende Materialien und Vesikel, die aus Proteinen formuliert sind, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in US-Patent Nr. 4,572,203, 4,718,433, 4,774,958 und 4,957,656 beschrieben. Einem durchschnittlichen Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung weitere geeignete, proteinbasierte stabilisierende Materialien und Vesikel geläufig.
Außer stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln, die aus Lipiden und/oder Proteinen formuliert sind, können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch stabilisierende Materialien oder Vesikel umfassen, die aus Polymeren formuliert sind, welche natürlicher, halbsynthetischer (modifiziert natürlicher) oder synthetischer Herkunft sein können. Polymer bezeichnet eine Verbindung, die aus zwei oder mehr sich wiederholenden monomeren Einheiten und vorzugsweise aus 10 oder mehr sich wiederholenden monomeren Einheiten zusammengesetzt ist. Halbsynthetisches Polymer (oder modifiziertes natürliches Polymer) bezeichnet ein natürliches Polymer, das chemisch modifiziert ist. Geeignete natürliche Polymere umfassen natürlich vorkommende Polysaccharide wie beispielsweise Arabinane, Fructane, Fucane, Galactane, Galacturonane, Glucane, Mannane, Xylane (wie beispielsweise Insulin), Levan, Fucoidan, Carrageenan, Galatocarolose, Pectinsäure, Pectine, einschließlich Amylose, Pullulan, Glycogen, Amylopectin, Cellulose, Dextran, Dextrin, Dextrose, Glucose, Polyglucose, Polydextrose, Pustulan, Chitin, Agarose, Keratin, Chondroitin, Dermatan, Hyaluronsäure, Alginsäure, Xanthin-Gummi, Stärke und verschiedene andere natürliche Homopolymere oder Heteropolymere, wie beispielsweise solche, die eine oder mehr der folgenden Aldosen, Ketosen, Säuren oder Amine enthalten: Erythrose, Threose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Glucose, Dextrose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose, Talose, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Psicose, Fructose, Sorbose, Tagatose, Mannitol, Sorbitol, Lactose, Sucrose, Trehalose, Maltose, Cellobiose, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Aspartinsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin, Glucuronsäure, Gluconsäure, Glucarsäure, Galacturonsäure, Mannuronsäure, Glucosamin, Galactosamin und Neuraminsäure und natürlich vorkommende Derivate davon. Entsprechend umfassen geeignete Polymere beispielsweise Proteine wie beispielsweise Albumin. Beispielhafte halbsynthetische Polymere umfassen Carboxymethylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylcellulose und Methoxycellulose. Beispielhafte synthetische Polymere umfassen Polyphosphazene, Polyalkylene (z. B. Polyethylen) wie beispielsweise Polyethylenglycol (einschließlich beispielsweise die als PLURONICS^® bezeichnete Verbindungsklasse, kommerziell erhältlich von BASF, Parsippany, NJ, USA), Polyoxyalkylene, (z. B. Polyoxyethylen) und Polyethylenterephthalat, Polypropylene (wie beispielsweise Polypropylenglycol), Polyurethane (wie beispielsweise Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylchlorid und Polyvinylpyrrolidon), Polyamide, einschließlich Nylon, Polystyrol, Polymilchsäuren, fluorierte Kohlenwasserstoffpolymere, fluorierte Kohlenstoffpolymere (wie beispielsweise Polytetrafluorethylen), Acrylat, Methacrylat und Polymethylmethacrylat und Derivate davon. Bevorzugt sind synthetische Polymere oder Copolymere, die aus Monomeren hergestellt sind, wie beispielsweise Acrylsäure, Methacrylsäure, Ethylenimin, Crotonsäure, Acrylamid, Ethylacrylat, Methylmethacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), Milchsäure, Glycolsäure, ε-Caprolacton, Acrolein, Cyanoacrylat, Bisphenol A, Epichlorhydrin, Hydroxyalkylacrylate, Siloxan, Dimethylsiloxan, Ethylenoxid, Ethylenclycol, Hydroxyalkylmethacrylate, N-substituierte Acrylamide, N-substituierte Methacrylamide, N-Vinyl-2-pyrrolidon, 2,4-Pentadien-1-ol, Vinylacetat, Acrylonitril, Styrol, p-Aminostyrol, p-Aminobenzylstyrol, Natriumstyrolsulfonat, Natrium-2-sulfoxyethylmethacrylat, Vinylpyridin, Aminoethylmethacrylate, 2-Methacryloyloxytrimethylammoniumchlorid und Polyvinyliden, sowie polyfunktionelle Vernetzungsmonomere wie beispielsweise N,N'-Methylenbisacrylamid, Ethylenglycoldimethacrylate, 2,2'-(p-Phenylendioxy)diethyldimethacrylat, Divinylbenzol, Triallylamin und Methylenbis(4-phenylisocyanat), einschließlich Kombinationen davon. Bevorzugte Polymere umfassen Polyacrylsäure, Polyethylenimin, Polymethacrylsäure, Polymethylmethacrylat, Polysiloxan, Polydimethylsiloxan, Polymilchsäure, Poly(ε-caprolacton), Epoxidharz, Poly(ethylenoxid), Poly(ethylenglycol) und Polyamid(Nylon)-Polymere. Bevorzugte Copolymere umfassen Polyvinyliden-Polycarylonitril, Polyvinyliden-Polycarylonitril-Polymethylmethacrylat, Polystyrol-Polyacrylonitril und Poly-d-1,Lactid-Co-Glycolid-Polymere; am meisten bevorzugt Polyvinyliden-Polyacrylonitril. Einem Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung weitere geeignete Monomere und Polymere geläufig.
Stabilisierende Materialien und Vesikel können aus weiteren Materialien hergestellt sein. Die Materialien können grundlegend und fundamental sein und können die primäre Basis für die Erzeugung oder Etablierung der stabilisierenden Materialien sein. Beispielsweise können Tenside und Fluorierte Tenside grundlegende und fundamentale Materialien zum Herstellen von stabilisierenden Materialien und Vesikeln sein. Andererseits können die Materialien unterstützend sein und als zusätzliche oder ergänzende Mittel wirken, welche die Funktion des grundlegenden stabilisierenden Materials (der grundlegenden stabilisierenden Materialien) verstärken oder zu einer gewünschten Eigenschaft, zusätzlich zu der von dem grundlegenden stabilisierenden Material (den grundlegenden stabilisierenden Materialien) gebotenen, beitragen können, wie beispielsweise Tenside und/oder Polymere.
Es ist nicht immer möglich festzulegen, ob ein bestimmtes Material ein grundlegendes oder ein zusätzliches Mittel ist, da die Funktionsweise des Materials empirisch bestimmt wird, beispielsweise durch die Ergebnisse, die hinsichtlich der Herstellung stabilisierender Materialien oder Vesikel produziert worden sind. Beispielweise ist im Hinblick darauf, wie grundlegende und zusätzliche Materialien funktionieren können, beobachtet worden, dass die einfache Kombination eines Lipids und Wasser und Salzlösung, wenn sie geschüttelt wird, nach dem Autoklavieren zum Sterilisieren häufig eine trübe Lösung ergibt. Eine solche trübe Lösung kann als ein Kontrastmittel funktionieren, ist aber ästhetisch fragwürdig und kann Instabilität in Form ungelöster oder nicht verteilter Lipidpartikel beinhalten. Trübe Lösungen können auch unerwünscht sein, wenn die ungelöste Partikelmaterie einen Durchmesser von über etwa 7 μm und speziell über etwa 10 μm aufweist. Auch Herstellungsschritte wie beispielsweise Sterilfiltration können bei Lösungen, die ungelöste Partikelmaterie enthalten, problematisch sein. Deshalb könnte Propylenglycol zugegeben werden, um diese Trübheit zu beseitigen, indem es die Dispersion oder Lösung der Lipidpartikel erleichtert. Propylenglycol kann auch als Benetzungsmittel wirken, das die Vesikelbildung und Stabilisierung durch Erhöhung der Oberflächenspannung auf der Vesikelmembran oder Haut erhöhen kann. Es ist möglich, dass Polypropylenglycol auch als eine zusätzliche Schicht funktionieren kann, welche die Membran oder Haut des Vesikels beschichten kann, was zusätzliche Stabilisierung vermittelt. Als grundlegende oder zusätzliche stabilisierende Materialien in der vorliegenden Erfindung können die in US-Patent Nr. 4,684,479, 5,215,680 und 5,562,893 beschriebenen Tenside verwendet werden.
Öle und fluorierte Öle sind zusätzliche und grundlegende stabilisierende Materialien, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Geeignete Öle umfassen beispielsweise Sojaöl, Erdnussöl, Canolaöl, Olivenöl, Distelöl, Maisöl, Mazolaöl, Lebertran, Mandelöl, Baumwollsaatöl, Ethyloleat, Osopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Mineralöl, Myristylalkohol, Octyldodecanol, Pfirsichkernöl, Sesamöl, Myristyloleat, Octyloleat und Myristylpalmitat. Andere geeignete Öle umfassen biokompatible Öle, die aus gesättigten, ungesättigten und/oder teilweise hydrogenierten Fettsäuren, siliciumbasierten Ölen, einschließlich vinyl-terminierte, hydrid-terminierte, silanol-terminierte, amino-terminierte, epoxid-terminierte, carbinol-terminierte Flüssigkeiten, und anderen siliciumbasierten Ölen wie beispielsweise mercapto-modifizierten Siliciumflüssigkeiten und gesättigte, ungesättigte oder Aryl-Alkyl- oder Alkyl-Aryl-substituierte Siliciumöle, synthetischen Ölen wie beispielsweise Triglyceriden, die aus gesättigten und ungesättigten Ketten von C₁₂-C₂₄-Fettsäuren bestehen, wie beispielsweise die Glyceroltriglyceridester von Ölsäure, Terpenen, Linolen, Squalen, Squalamin oder einem anderen Öl bestehen, das im Allgemeinen bekannt dafür ist, unverdaulich zu sein und sich als eine stabilisierende Verbindung in Übereinstimmung mit den Lehren hierin eignet. Die hierin beschriebenen Öle können fluoriert sein, wie beispielsweise Triolein mit einem Fluor(F₂)-Gas. Ein „fluoriertes Öl" bezieht sich auf ein Öl, in dem mindestens ein Wasserstoffatom des Öls durch ein Fluoratom ersetzt ist. Vorzugsweise sind mindestens zwei oder mehr der Wasserstoffatome in dem Öl durch Fluoratome ersetzt. Fluorierte Triglyceridöle können hergestellt werden, indem eine reaktive fluorierte Art wie beispielsweise ein Fluorgas mit ungesättigtem Triglycerid umgesetzt wird, um das gewünschte fluorierte Triglycerid hervorzubringen. Beispielsweise sind in US-Patent Nr. 5,344,930 weitere Öle beschrieben.
Weitere zusätzliche und grundlegende stabilisierende Materialien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in US-Anmeldung Serien-Nr. 08/444,754, beantragt am 19. Mai 1995, beschrieben.
Als grundlegende oder zusätzliche stabilisierende Materialien können Verbindungen zur Herstellung gemischter Mizellensysteme verwendet werden, wie beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Cetylammoniumhalide, Cetylalkylammoniumhalide, Lauryltrimethylammoniumbromid (Dodecyl-), Cetyltrimethylammoniumbromid (Hexadecyl-), Myristyltrimethylammoniumbromid (Tetradecyl-), Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (wobei Alkyl C₁₂, C₁₄ oder C₁₆ ist), Benzyldimethyldodecylammoniumbromid/-chlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumbromid/-chlorid, Benzyldimethyltetradecylammoniumhalid (z. B. -Bromid/-Chlorid), Cetyldimethylethalammoniumhalidbromid/-chlorid oder Cetylpyridiniumbromid/-chlorid.
Es könnte möglich sein, die Stabilität stabilisierender Materialien oder Vesikel durch Einschließen von mindestens einer kleinen Menge, beispielsweise etwa 1 bis etwa 10 Mol-%, ausgehend von der verwendeten Gesamtmenge an Lipid, eines negativ geladenen Lipids zu verstärken. Geeignete negativ geladene Lipide umfassen beispielsweise Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Fettsäuren. Ohne durch eine Theorie der Anwendung gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass solche negativ geladenen Lipide zusätzliche Stabilität verleihen, indem sie der Neigung der Vesikel entgegenwirken, aufzubrechen, indem sie miteinander verschmelzen. Die negativ geladenen Lipide können daher wirken, um eine einheitliche, negativ geladenen Schicht auf der Außenfläche des Vesikels einzurichten, welche von einer ähnlich geladenen Außenschicht auf anderen Vesikeln abgestoßen wird, die sich daran annähern. Auf diese Weise könnten die Vesikel weniger dazu neigen, sich so nahe zu kommen, dass sie sich berühren, was zu einem Aufbrechen der Membran oder Haut der entsprechenden Vesikel und der Konsolidierung der sich berührenden Vesikel zu einem einzelnen, größeren Vesikel führen könnte. Eine Fortsetzung dieses Vorgangs der Konsolidierung würde natürlich zu einem signifikanten Abbau der Vesikel führen.
Die verwendeten Lipide, vor allem in Verbindung mit Vesikeln, sind vorzugsweise flexibel. Das bedeutet in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass die Vesikel ihre Form verändern können, beispielsweise, um eine Öffnung zu passieren, die einen Durchmesser aufweist, welcher kleiner ist das der Durchmesser des Vesikels.
In bevorzugten Ausführungsformen kann das stabilisierende Material und/oder die Vesikelzusammensetzung ganz oder teilweise eine fluorierte (einschließlich perfluorierte) Verbindung enthalten. Geeignete fluorierte Verbindungen umfassen beispielsweise fluorierte Tenside, einschließlich Alkyltenside, und fluorierte amphiphile Verbindungen. Es kann eine große Vielfalt solcher Verbindungen verwendet werden, einschließlich beispielsweise die Klasse von Verbindungen, die kommerziell als ZONYL^® Fluortenside (die Firma DuPont, Wilmington, DE, USA) erhältlich sind, einschließlich ZONYL^® Phosphatsalze (z. B. [F(CF₂CF₂)_3-8CH₂CH₂O]_1,2P(O)(O^–NH₄ ⁺)_2,1), die terminale Phosphatgruppen ausweisen, und ZONYL^® Sulfatsalze, die terminale Sulfatgruppen aufweisen (z. B. F(CF₂CF₂)_3-8CH₂CH₂SCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃OSO₂OCH₃). Geeignete ZONYL^® Tenside umfassen auch beispielsweise ZONYL^® Fluortenside, die als Telomer B identifiziert sind, einschließlich Telomer B Fluortenside, die pegyliert sind (d. h., an denen mindestens eine Polyethylenglycolgruppe angebracht ist), auch bekannt als PEG-Telomer B, erhältlich von der Firma DuPont. Weitere geeignete Fluorierte Tenside sind in US-Patent Nr. 5,276,146, 5,344,930 und 5,562,893 und in US-Anmeldung Serien-Nr. 08/465,868, beantragt am 6. Juni 1995, beschrieben.
Weitere geeignete fluorierte Tenside und fluorierte Lipidverbindungen zur Verwendung als die stabilisierenden Materialien in der vorliegenden Erfindung sind in US-Anmeldung Serien-Nr. 08/887,215, beantragt am 2. Juli 1997, beschrieben. Solche fluorierten Tenside und fluorierte Lipide umfassen die Verbindungen von Formel (I), (II), (III), (IV), (IVa), (V), (Va), (VI) und (VII).
Beispielsweise kann das stabilisierende Material ein fluoriertes Fettacylderivat sein, wie beispielsweise das von Formel (I): CF₃-(CF₂)_n-(CH₂)_m-C(=O)-OH (I)wobei n eine ganze Zahl von etwa 7 bis etwa 13 ist, vorzugsweise von etwa 9 bis etwa 11, und m eine ganze Zahl von etwa 1 bis etwa 4 ist, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 2.
Das stabilisierende Material kann eine PEG-Telomer-Verbindung der Formel (II) sein: C_xF_2x+1-(CH₂)_z-(OCH₂CH₂)₂-OH (II)wobei x eine ganze Zahl von etwa 6 bis etwa 12 ist, vorzugsweise von etwa 8 bis etwa 10, mehr bevorzugt etwa 9, und z eine ganze Zahl von etwa 8 bis etwa 20 ist, vorzugsweise von etwa 8 bis etwa 16, noch mehr bevorzugt von etwa 8 bis etwa 12, noch mehr bevorzugt etwa 8 bis etwa 10, am meisten bevorzugt etwa 9.
Das stabilisierende Material kann ein fluoriertes Kohlenhydratderivat sein, wie beispielsweise das von Formel (III): C_xF_2x+1-(CH₂)₂-(OCH₂CH₂)_Z-O-A (III)wobei x eine ganze Zahl von etwa 6 bis etwa 12 ist, vorzugsweise von etwa 8 bis etwa 10, mehr bevorzugt 9, z eine ganze Zahl von etwa 8 bis etwa 20 ist, vorzugsweise von etwa 8 bis etwa 16, mehr bevorzugt von etwa 8 bis etwa 12, noch mehr bevorzugt etwa 8 bis etwa 10, am meisten bevorzugt etwa 9, und A ein Monosaccharid oder ein Disaccharid ist. Geeignete Monosaccharide und Disaccharide umfassen beispielsweise Allose, Altrose, Glucose, Dextrose, Mamose, Glycerose, Gulose, Idose, Galactose, Talose, Fructose, Psicose, Sorbose, Rhamnose, Tagatose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Ribulose, Xylulose, Erythrose, Threose, Erythrulose, Fucose, Sucrose, Lactose, Maltose, Isomaltose, Trehalose, Cellobiose und dergleichen. Vorzugsweise ist das Monosaccharid oder Disaccharid Glucose, Dextrose, Fructose, Mannose, Galactose, Glucosamin, Galactosamin, Maltose, Saccharose oder Lactose.
Das stabilisierende Material kann auch ein fluoriertes lipophiles Derivat sein, wie beispielsweise das von Formel (IV), das die in US-Anmeldung Serien-Nr. 08/465,868, beantragt am 6. Juni 1995, beschriebenen Verbindungen enthält:
wobei jedes von x, y und z unabhängig 0 oder 1 ist; jedes X₁ unabhängig -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -NR₄-, -C(=X₂)-, -C(=X₂)-O-, -O-C(=X₂)-, -C(=X₂)-NR₄- oder -NR₄-C(=X₂)- ist, X₂ O oder S ist, Y eine direkte Bindung oder -X₃-M(=O)(OR₅)_q-O- ist, wobei q 1 oder 2 ist, X₃ eine direkte Bindung oder -O- ist, M P oder S ist, Z Wasserstoff, der Rest eines hydrophilen Polymers, ein Saccharidrest oder -N(R₆)_r ist, wobei r 2 oder 3 ist, jedes R₁ unabhängig eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen oder eine fluorierte Alkylgruppe aus 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen ist, R₂ eine direkte Bindung oder eine Alkylenverknüpfungsgruppe aus 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen ist, R₃ eine direkte Bindung oder ein Alkylendiradikal aus 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen ist, jedes von R₄ und R₅ unabhängig Wasserstoff oder eine Alkylgruppe aus 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen sind, und jedes R₆ unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe aus 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen oder ein Rest eines hydrophilen Polymer sind, vorausgesetzt, dass mindestens eines von x, y und z 1 ist, mindestens eines von R₁ eine fluorierte Alkylgruppe aus 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen ist, vorausgesetzt, dass, wenn R₂ eine direkte Bindung ist, zwei von x, y und z jeweils 0 sind.
In Formel (IV) ist jedes von X, y und Z unabhängig 0 oder 1, vorausgesetzt, dass mindestens eines von x, y und z 1 ist. In manchen Ausführungsformen, sind zwei von x, y und z jeweils 0. In anderen Ausführungsformen ist eines von x, y und z 0 oder 1 und die anderen beiden von x, y und z sind jeweils 1, wobei mehr bevorzugt ist, dass eines von x, y und z 0 ist und die anderen beiden von x, y und z 1 sind. In anderen Ausführungsformen ist jedes von x, y und z 1.
Jedes X₁ ist unabhängig -O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -NR₄-, -C(=X₂)-, -C(=X₂)-O-, -O-C(=X₂)-, -C(=X₂)-NR₄- oder -NR₄-C(=X₂). Bevorzugt ist jedes X₁ unabhängig -O-, -S-, -C(=X₂)-, -C(=X₂)-O-, -O-C(=X₂)-, -C(=X₂) -NR₄- oder -NR₄-C(=X₂). Mehr bevorzugt ist jedes X₁ unabhängig -C(=X₂)-O- oder -O-C(=X₂), am meisten bevorzugt -C(=X₂)-O-.
Jedes X₂ ist O oder S, vorzugsweise O.
Y ist eine direkte Bindung oder -X₃-M(=O)(OR₅)_q-O-, wobei q 1 oder 2 ist. Vorzugsweise ist Y -X₃-M(=O)(OR₅)_q-O-. M ist P oder S, vorzugsweise P. X₃ ist eine direkte Bindung oder -O-, vorzugsweise eine direkte Bindung.
Z ist ein Wasserstoffatom, der Rest eines hydrophilen Polymers, ein Saccharidrest oder -N(R₆)_r, wobei r 2 oder 3 ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist Z -N(R₆)_r.
Jedes R₁ ist unabhängig eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen oder eine fluorierte Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen, vorausgesetzt, dass mindestens eines von R₁ eine fluorierte Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen ist. Wenn daher nur eines von x, y und z 1 ist, ist R₁ notwendigerweise eine fluorierte Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen. In bevorzugten Ausführungsformen, bei denen eines oder keines von x, y und z 0 ist und bei denen vorzugsweise eines von x, y und z 0 ist und die anderen beiden von x, y und z jeweils 1 sind, ist mindestens eines von R₁ eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen und mindestens eines von R₁ ist eine fluorierte Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen. Bei einer fluorierten Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen ist R₁ vorzugsweise eine polyfluorierte Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen, wobei eine perfluorierte Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen mehr bevorzugt ist. Bei einer fluorierten Alkylgruppe mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatomen ist R₁ vorzugsweise C_nF_2n+1-(CH₂)_m-, wobei n 1 bis etwa 16 ist, vorzugsweise etwa 9 bis etwa 14, und m 0 bis etwa 18 ist, vorzugsweise 1 bis etwa 10, mehr bevorzugt 1 bis etwa 4.
R₂ ist eine direkte Bindung oder eine Alkylenverknüpfungsgruppe mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, vorausgesetzt, dass zwei von x, y und z jeweils 0 sind, wenn R₂ eine direkte Bindung ist. Vorzugsweise ist R₂ eine direkte Bindung oder eine Alkylenverknüpfungsgruppe mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen. Mehr bevorzugt ist R₂ eine Alkylenverknüpfungsgruppe mit etwa 3 Kohlenstoffen. Noch mehr bevorzugt ist R₂ -CH₂-CH₂-CH₂-.
R₃ ist eine direkte Bindung oder ein Alkylendiradikal mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen. Vorzugsweise ist R₃ eine direkte Bindung oder ein Alkylendiradikal mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen. Mehr bevorzugt ist R₃ ein Alkylendiradikal mit etwa 2 Kohlenstoffatomen. Noch mehr bevorzugt ist R₃ -CH₂CH₂-.
Jedes von R₄ und R₅ ist unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen. Mehr bevorzugt ist jedes von R₄ und R₅ ein Wasserstoffatom.
R₆ ist ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen oder ein Rest eines hydrophilen Polymers. Vorzugsweise ist R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen. Mehr bevorzugt ist R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, wobei eine Methylgruppe noch mehr bevorzugt ist.
Wenn ein Symbol in einer Formel oder ein Substituent mehr als einmal vorkommt, wie beispielsweise in Formel (IV), ist seine Bedeutung in jedem Fall unabhängig von dem anderen, sofern nicht anders angegeben. Diese Unabhängigkeit der Bedeutung unterliegt allen angegebenen Vorbehalten. Wenn jedes von zwei oder mehr benachbarten Symbolen als „eine direkte Bindung" definiert ist, um mehrfache, benachbarte direkte Bindungen zu liefern, wird außerdem aus den mehrfachen und benachbarten direkten Bindungen eine einzelne direkte Bindung.
Z und R₆ in der Definition von Z in Formel (IV) können der Rest eines hydrophilen Polymers sein. Beispielhafte Polymere, aus denen Z und/oder R₆ abgeleitet werden können, umfassen Polymere, in denen die Wiederholungseinheiten eine oder mehr Hydroxygruppen enthalten (Polyhydroxypolymere), einschließlich beispielsweise Poly(vinylalkohol); Polymere, in denen die Wiederholungseinheiten eine oder mehr Aminogruppen enthalten (Polyaminpolymere), einschließlich beispielsweise Peptide, Polypeptide, Proteine und Lipoproteine, wie beispielsweise Albumin und natürliche Lipoproteine; Polymere, in denen die Wiederholungseinheiten eine oder mehr Carboxygruppen enthalten (Polycarboxypolymere), einschließlich beispielsweise Carboxymethylcellulose, Alginsäure und Salze davon, wie beispielsweise Natrium- und Calciumalginat, Glycosaminoglycane und Salze davon, einschließlich Salze von Hyaluronsäure, phosphorylierte und sulfonierte Derivate von Kohlenhydraten, genetisches Material, wie beispielsweise Interleukin-2 und Interferon, und Phosphorothioat-Oligomere, und Polymere, in denen die Wiederholungseinheiten eine oder mehr Saccharideinheiten enthalten (Polysaccharidpolymere), einschließlich beispielsweise Kohlenhydrate. Das Molekulargewicht der Polymere, aus denen Z und/oder R₆ abgeleitet sind, kann variieren und liegt im Allgemeinen bei etwa 50 bis etwa 5.000.000, wobei Polymere mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 50.000 bevorzugt sind. Mehr bevorzugte Polymere haben ein Molekulargewicht von etwa 150 bis etwa 10.000, wobei Molekulargewichte von 200 bis etwa 8.000 noch mehr bevorzugt sind.
Bevorzugte Polymere, aus denen Z und/oder R₆ abgeleitet sind, umfassen beispielsweise Poly(ethylenglycol) (PEG), Poly(vinylpyrrolidin), Polyoxomere, Polysorbate und Poly(vinylalkohol), wobei PEG-Polymere besonders bevorzugt sind. Unter den PEG-Polymeren sind PEG-Polymere mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 10.000 bevorzugt. Mehr bevorzugt haben die PEG-Polymere ein Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 8.000, wobei PEG 2.000, PEG 5.000 und PEG 8.000, die ein Molekulargewicht von respektive 2.000, 5.000 und 8.000 haben, noch mehr bevorzugt sind. Einem Fachmann sind ausgehend von der vorliegenden Offenbarung sofort weitere geeignete hydrophile Polymere außer den oben beispielhaft genannten geläufig. Im Allgemeinen umfassen Polymere, aus denen Z und/oder R₆ abgeleitet sind, Polymere, die über Alkylierungs- oder Acylierungsreaktionen in die fluorierten amphiphilen Verbindungen eingebaut werden können.
Wie bei den verschiedenen, oben beispielhaft angegebenen Polymeren können die polymerischen Reste neben beispielsweise solchen, die typischerweise bei der Verknüpfung der polymerischen Reste an die fluorierten amphiphilen Verbindungen beteiligt sind, funktionelle Gruppen enthalten. Solche Funktionalitäten umfassen beispielsweise Carboxyl-, Amin-, Hydroxy- und Thiolgruppen. Diese funktionellen Gruppen an den polymerischen Resten können, falls gewünscht, weiter mit Materialien umgesetzt werden, die im Allgemeinen mit solchen funktionellen Gruppen reaktiv sind und die beim Targeting spezifischer Gewebe im Körper, beispielsweise von erkranktem Gewebe, helfen können. Beispielhafte Materialien, die mit den zusätzlichen funktionellen Gruppen umgesetzt werden können, umfassen beispielsweise Proteine, einschließlich Antikörper, Kohlenhydrate, Peptide, Glycopeptide, Glycolipide, Lektine und Nukleoside.
Außer Resten hydrophiler Polymere kann Z in Formel (IV) ein Saccharidrest sein. Beispielhafte Saccharide, aus denen Z abgeleitet werden kann, umfassen beispielsweise Monosaccharide oder Zuckeralkohole wie beispielsweise Erythrose, Threose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Fructose, Sorbitol, Mannitol und Sedoheptulose, wobei Fructose, Mannose, Xylose, Arabinose, Mannitol und Sorbitol bevorzugte Monosaccharide sind, sowie Disaccharide wie beispielsweise Lactose, Saccharose, Maltose und Cellobiose. Weitere Saccharide umfassen beispielsweise Inositol und Gangliosidkopfgruppen. Einem Fachmann sind ausgehend von der vorliegenden Offenbarung sofort weitere geeignete Saccharide, neben den oben beispielhaft angegebenen geläufig. Im Allgemeinen umfassen Saccharide, aus denen Z abgeleitet ist, Saccharide, die über Alkylierungs- oder Acylierungsreaktionen in die fluorierten amphiphilen Verbindungen eingebaut werden können.
Bevorzugte fluorierte Verbindungen, die im Schutzumfang von Formel (IV) liegen, sind die fluorierten Verbindungen der Formel (IVa):
wobei n eine ganze Zahl von etwa 7 bis etwa 13 ist, vorzugsweise von etwa 9 bis etwa 11, und m eine ganze Zahl von etwa 1 bis etwa 4 ist, vorzugsweise von 1 bis etwa 2.
Das stabilisierende Material kann auch eine fluorierte amphiphile Einheit von Formel (V) sein:
wobei R₁, R₂, R₃, X₁, Y, Z, x, y und z wie in Formel (IV) definiert sind, einschließlich die bevorzugten Ausführungsformen davon, und wobei e eine ganze Zahl von etwa 1 bis etwa 30 ist, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 20, mehr bevorzugt etwa 4 bis etwa 16, noch mehr bevorzugt etwa 4 bis etwa 12, am meisten bevorzugt etwa 7 bis etwa 9.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform kann die Verbindung von Formel (V) eine Verbindung der Formel (Va) sein:
wobei n und m wie oben in Formel (IVa) definiert sind und wobei e wie oben in Formel (V) definiert ist.
Das stabilisierende Material kann auch ein fluoriertes Fettsäurederivat sein, wie beispielsweise das von Formel (VI): CF₃-J-T-C(=O)-OH (VI)
Das stabilisierende Material kann auch ein fluoriertes lipophiles Derivat sein, wie beispielsweise das von Formel (VII):
In den obigen Formeln (VI) und (VII) ist J (-(C=C)_p1-(CF₂)_p2-(C=C)_p3-(CF₂)_p4-(C=C)_p5-(CF₂)_p6-(C=C)_p7-(CF₂)_p8-(C=C)_p9-(CF₂)_p10-(C=C)_p11-(CF₂)_p12-(C=C)_p13-), wobei p1, p2, p3, p4, p5, p6, p7, p8, p9, p10, p11, p12 und p13 unabhängig eine ganze Zahl von 0, 1 oder 2 sind; vorausgesetzt, dass die Summe von (p1 + p2 + p3 + p4 + p5 + p6 + p7 + p8 + p9 + p10 + p11 + p12 + p13) eine ganze Zahl von etwa 7 bis etwa 13 ist, und vorausgesetzt, dass mindestens eines von p2, p4, p6, p8, p10 oder p12 eine ganze Zahl von mindestens 1 ist, und wobei T (-(C=C)_t1-(CH₂)_t2-(C=C)_t3-(CH₂)_t4-) ist, wobei t1, t2, t3 und t4 unabhängig eine ganze Zahl von 0, 1 oder 3 ist; vorausgesetzt, dass die Summe von (t1 + t2 + t3 + t4) eine ganze Zahl von 1 bis etwa 4 ist.
Weitere geeignete fluorierte Verbindungen, die als stabilisierende Materialien und/oder Vesikel verwendet werden können, sind in US-Patent Nr. 5,562,893 beschrieben. Beispielsweise können synthetische organische monomere Wiederholungseinheiten verwendet werden, um Polymere zu bilden, die als stabilisierende Materialien geeignet sind, einschließlich Hydroxysäuren, Lactone, Lactide, Glycolide, acrylhaltige Verbindungen, Aminotriazol, Orthoester, Anhydride, Esterimide, Imide, Acetale, Urethane, Vinylalkohole, Enolketone und Organosiloxane.
Das Verfahren des Einführens von Fluor in eines dieser Materialien ist aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise ist die Einführung von Perfluor-t-butyl-Einheiten in US-Patent Nr. 5,234,680 beschrieben, dessen Offenbarung hierin in Gänze hiermit durch Bezugnahme enthalten ist. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen die folgende Reaktion von Perfluoralkylcarbanionen mit Wirtsmolekülen: (CF₃)₃C^– + R-X – (CF₃)₃C-R, wobei R eine Wirtsgruppe und X eine gute Austrittsgruppe ist, wie beispielsweise Brom, Chlor, Iod oder eine Sulfonato-Gruppe. Nach dem Hinzufügen einer Austrittsgruppe zu dem vorangehenden stabilisierenden Material anhand von aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren können anschließend Perfluor-t-butyl-Einheiten leicht in diese derivatisierten stabilisierenden Materialien wie oben beschrieben eingeführt werden. Aus dem Stand der Technik sind weitere Verfahren für das Einführen von Trifluormethylgruppen in verschiedene organische Verbindungen bekannt. Beispielsweise können Trifluormethylgruppen durch nukleophile Perfluoralkylierung anhand von Perfluoralkyltrialkylsilanen eingeführt werden.
Die Einführung von Fluor in stabilisierende Materialien und/oder Vesikel kann auch erreicht werden, indem Vesikel in Gegenwart eines Perfluorcarbongases gebildet werden. Wenn beispielsweise anhand von mechanischer Kavitation Vesikel aus Proteinen gebildet werden, beispielsweise aus humanem Serumalbumin in Gegenwart eines Perfluorcarbongases wie Perfluorpropan, wird das Fluor aus der Gasphase während der Bildung an die Proteinvesikel gebunden. Das Vorhandensein von Fluor in den Vesikeln und/oder stabilisierenden Materialien kann durch NMR von Vesikeltrümmern festgestellt werden, die von aufgebrochenen Vesikeln gereinigt wurden. Fluor kann auch anhand anderer Verfahren in stabilisierende Materialien und/oder Vesikel eingeführt werden, wie beispielsweise durch Ultraschallbehandlung, Sprühtrocknen oder Emulgierungstechniken.
Eine andere Art und Weise, auf die Fluor in das stabilisierende Material und/oder einen Vesikel eingeführt werden kann, ist durch Verwendung einer fluorhaltigen reaktiven Verbindung. Der Begriff „reaktive Verbindung" betrifft Verbindungen, die mit dem stabilisierenden Material und/oder Vesikel derart reagieren können, dass Fluoreinheiten kovalent an das stabilisierende Material und/oder den Vesikel angebracht werden. Wenn das stabilisierende Material ein Protein ist, sind bevorzugte reaktive Verbindungen entweder Alkylester oder Acylhalide, die mit den Aminogruppen des Proteins reagieren können, um über eine Acylierungsreaktion eine Amidverknüpfung bilden können. Die reaktive Verbindung kann während der Vesikelbildung in jedem Stadium eingeführt werden, wird aber vorzugsweise zu der Gasphase vor der Vesikelbildung gegeben. Wenn Vesikel beispielsweise anhand von mechanischen oder Ultraschallkavitationstechniken hergestellt werden sollen, kann die reaktive Verbindung zu der Gasphase gegeben werden, indem das bei der Bildung der Vesikel zu verwendende Gas (Startgas) durch eine Lösung der reaktiven Verbindung in die Gasphase geblasen wird. Die resultierende Gasmischung, die nun das Startgas und die reaktive Verbindung enthält, wird dann zur Bildung von Vesikeln verwendet. Die Vesikel werden vorzugsweise durch Ultraschallbehandlung von humanem Serumalbumin in Gegenwart einer Gasmischung gebildet, wie beschrieben in US-Patent Nr. 4,957,656.
Geeignete fluorhaltige Alkylester und Acylhalide zur Verwendung als stabilisierende Materialien und/oder vesikelbildende Materialien in der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise Diethylhexafluorglutarat, Diethyltetrafluorsuccinat, Methylheptafluorbutyrat, Ethylheptafluorbutyrat, Ethylpentafluorpropionat, Methylpentafluorpropionat, Ethylperfluoroctanoat, Methylperfluoroctanoat, Nonafluorpentanoylchlorid, Perfluorpropionylchlorid, Hexafluorglutarylchlorid und Heptafluorbutyrylchlorid.
Es können auch andere fluorhaltige reaktive Verbindungen synthetisiert und in der vorliegenden Erfindung als die stabilisierenden Materialien und/oder vesikelbildenden Materialien verwendet werden, einschließlich beispielsweise Aldehyde, Isocyanate, Isothiocyanate, Epoxide, Sulfonylhalide, Anhydride, Säurehalide und Alkylsulfonate, die Perfluorcarboneinheiten enthalten, einschließlich -CF₃, -C₂F₅, -C₃F₄ und -C(CF₃)₃. Diese reaktiven Verbindungen können verwendet werden, um Fluoreinheiten in eines der zuvor erwähnten stabilisierenden Materialien einzuführen, indem eine Kombination gewählt wird, die geeignet ist, um eine kovalente Anbringung der Fluoreinheit zu erreichen.
Es sollte ausreichend Fluor eingeführt werden, um die Durchlässigkeit des Vesikels für die wässrige Umgebung zu vermindern. Dies resultiert in einer langsameren Gasaustauschrate mit der wässrigen Umgebung, was sich an einem erhöhten Druckwiderstand zeigt. Obgleich sich die spezifische Menge von Fluor, die erforderlich ist, um den Vesikel zu stabilisieren, nach den Bestandteilen des Vesikels und dem darin enthaltenden Gas richtet, enthält das Vesikel nach dem Einführen von Fluor vorzugsweise 0,01 bis 20 Gew.-% und mehr bevorzugt etwa 1 bis 10 Gew.-% Fluor.
Es kann wünschenswert sein, eine fluorierte Flüssigkeit zu verwenden, insbesondere ein flüssiges Perfluorcarbon oder einen flüssigen Perfluorether, die bei den Anwendungstemperaturen einschließlich beispielsweise der in-vivo-Temperatur des menschlichen Körpers, flüssig sind, um die Stabilität der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu unterstützen oder zu verstärken. Geeignete flüssige Perfluorcarbone und flüssige Perfluorether umfassen beispielsweise Perfluorheptan, Perfluoroctan, Perfluornonan, Perfluordecan, Perfluordecalin, Perfluordodecalin, Perfluoroctyliodid, Perfluoroctylbromid, Perfluortripropylamin, Perfluortributylamin, Perfluorbutylethylether, Bis(perfluorisopropyl)ether und Bis(perfluorpropyl)ether). Von diesen ist Perfluoroctylbromid bevorzugt. Obgleich nicht beabsichtigt ist, an eine Betriebstheorie gebunden zu sein, kann sich die fluorierte flüssige Verbindungen an der Berührungsstelle zwischen dem Gas und der Membran oder Wandfläche des Vesikels befinden. Damit kann eine zusätzliche stabilisierende Schicht einer fluorierten flüssigen Verbindung auf der Innenfläche der stabilisierenden Zusammensetzung gebildet werden, die ebenfalls verhindern kann, dass Gas durch die Vesikelmembran diffundiert.
Andere Tenside, die auch in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind teilweise fluorierte Phosphocholintenside. In diesen fluorierten Tensiden können die dualen Alkylverbindungen an den terminalen Alkylketten fluoriert sein und die proximalen Kohlenstoffe können hydrogeniert sein.
Noch weitere geeignete Tenside, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen beispielsweise Verbindungen, die als TRITON-X^® (z. B. Octoxynole, erhältlich von Rohm & Haas, Philadelphia, PA), BRIJ^® (z. B. Polyoxyethylenether; erhältlich von ICI-Americas, Wilmington, De, USA) und FLUORADS^® (z. B. fluorchemische Tenside; erhältlich von 3M. St. Paul, MN, USA) identifiziert sind.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung können Vesikel enthalten, die drei Bestandteile umfassen: (1) ein neutrales Lipid, beispielsweise ein nicht-ionisches oder zwitterionisches Lipid, (2) ein negativ geladenes Lipid und (3) ein Lipid, das ein stabilisierendes Material trägt, beispielsweise ein hydrophiles Polymer. Die Menge des negativ geladenen Lipids ist vorzugsweise größer als etwa 1 Mol-% des gesamten vorhandenen Lipids und die Menge an Lipid, das ein hydrophiles Polymer trägt, ist größer als etwa 1 Mol-% des gesamten vorhandenen Lipids. Beispielhafte und bevorzugte negativ geladene Lipide umfassen Phosphatidsäuren. Das Lipid, das ein hydrophiles Polymer trägt, ist wünschenswerterweise ein Lipid, das kovalent mit dem Polymer verknüpft ist, und das Polymer hat vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 400 bis etwa 100.000. Geeignete hydrophile Polymere sind vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Polyethylenglycol (PEG), Polypropylenglycol, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon und Copolymeren davon besteht, wobei PEG-Polymere bevorzugt sind. Das PEG-Polymer hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 7.500, wobei Molekulargewichte von etwa 2.000 bis etwa 5.000 mehr bevorzugt sind. Das PEG oder ein anderes Polymer kann an das Lipid, beispielsweise DPPE, durch eine kovalente Bindung gebunden sein, beispielsweise eine Amid-, Carbamat- oder Aminbindung. Darüber hinaus kann das PEG oder ein anderes Polymer mit einer kovalenten Bindung an einen Zielliganden oder andere Phospholipide gebunden sein, einschließlich beispielsweise eine Amid-, Ester-, Ether-, Thioester-, Thioamid- oder Disulfidbindung. Wenn das hydrophile Polymer PEG ist, wird das Lipid, das solch ein Polymer trägt, als „pegyliert" bezeichnet. In bevorzugter Form kann das Lipid, das ein hydrophiles Polymer trägt, DPPE-PEG sein, einschließlich beispielsweise DPPE-PEG5000, was sich auf DPPE mit einem daran angebrachten Polyethylenglycolpolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 5.000 bezieht (DPPE-PEG5000). Ein weiteres geeignetes pegyliertes Lipid ist Distearoylphosphatidylethanolaminpolyethylenglycol 5000 (DSPE-PEG5000).
In bevorzugten Ausführungsformen können die Lipidzusammensetzungen etwa 77,5 Mol-% DPPC, 12,5 Mol-% DPPA und 10 Mol-% DPPE-PEG5000 umfassen. Bevorzugt sind auch Zusammensetzungen, die etwa 80 bis etwa 90 Mol-% DPPC, etwa 5 bis etwa 15 Mol-% DPPA und etwa 5 bis etwa 15 Mol-% DPPE-PEG5000 umfassen. Besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen, die DPPC, DPPA und DPPE-PEG5000 in einem Mol-%-Verhältnis von respektive 82:10:8 umfassen. DPPC ist im Wesentlichen neutral, da der Phosphatidylanteil negativ geladen ist und der Cholinanteil positiv geladen ist. Infolgedessen kann DPPA, das negativ geladen ist, zugegeben werden, um in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Mechanismus die Stabilisierung zu verstärken. DPPE-PEG liefert ein pegyliertes Material, das über die DPPE-Einheit an die Lipidmembran oder Haut des Vesikels gebunden ist, wobei die PEG-Einheit die Vesikelmembran oder -haut frei umgeben kann und damit eine physikalische Barriere für verschiedene enzymatische und andere endogene Stoffe im Körper bildet, deren Funktion es ist, solche Fremdmaterialien abzubauen. Das DPPE-PEG kann mehr Vesikel einer kleineren Größe liefern, die sicher und Druck gegenüber stabil sind, wenn sie mit anderen Lipiden wie DPPC und DPPA in den gegebenen Verhältnissen kombiniert werden. Das pegylierte Material könnte aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit Wasser außerdem theoretisch fähig sein, die Wirkung von Makrophagen auf das menschliche Immunsystem zu schlagen, die ansonsten dazu neigen, den fremden Gegenstand zu umgeben und zu entfernen. Das Ergebnis ist eine Verlängerung der Zeit, während der die stabilisierten Vesikel als Kontrastmedien wirken können.
Die Begriffe „stabil" oder „stabilisiert" bedeuten, dass die Vesikel eine geeignete Zeit lang gegenüber einem Abbau im Wesentlichen resistent sind, einschließlich beispielsweise gegenüber einem Verlust der Vesikelstruktur oder des verkapselten photoaktiven Mittels, Gases, des Gasvorläufers und/oder des Zielliganden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vesikel haben typischerweise eine wünschenswerte Haltbarkeit, wobei sie unter normalen Umgebungsbedingungen häufig mindestens etwa 90 Volumen-% ihrer ursprünglichen Struktur über mindestens zwei bis drei Wochen beibehalten. In bevorzugter Form sind die Vesikel wünschenswerterweise für einen Zeitraum von mindestens etwa 1 Monat stabil, mehr bevorzugt mindestens etwa 2 Monate, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 6 Monate, noch mehr bevorzugt etwa 18 Monate und noch mehr bevorzugt bis zu etwa 3 Jahre. Die hierin beschriebenen Vesikel, einschließlich mit Gas und/oder einem Gasvorläufer gefüllte Vesikel, sind auch selbst unter ungünstigen Bedingungen stabil, wie beispielsweise bei Temperaturen und Drücken, die über oder unter den unter normalen Umgebungsbedingungen auftretenden liegen.
Die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können nach Größe, Löslichkeit und Wärmestabilität kontrolliert werden, indem eine Auswahl aus den verschiedenen hierin beschriebenen zusätzlichen oder unterstützenden stabilisierenden Materialien getroffen wird. Diese Materialien können die Parameter der Vesikel beeinflussen, vor allem der aus Lipiden gebildeten Vesikel, nicht nur durch ihre physikalische Interaktion mit den Membranen, sondern auch durch ihre Fähigkeit, die Viskosität und Oberflächenspannung der Oberfläche des Vesikels zu modifizieren. Entsprechend können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vesikel beispielsweise durch Zugabe eines oder mehr einer breiten Vielzahl (i) von Viskositätsmodifikatoren günstig modifiziert und weiter stabilisiert werden, einschließlich beispielsweise durch Kohlenhydrate und ihre phosphorylierten und sulfonierten Derivate, Polyether, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 400 und 100.000, und Di- und Trihydroxyalkanen und deren Polymere, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 200 und 50.000, (ii) von Emulgatoren und/oder solubilisierenden Mitteln, einschließlich beispielsweise Akazie, Cholesterin, Diethanolamin, Glycerylmonostearat, Lanolinalkohole, Lecithine, Mono- und Diglyceride, Monoethanolamin, Ölsäure, Oleylalkohol, Poloxamer, beispielsweise Poloxamer 188, Poloxamer 184, Poloxamer 181, PLURONICS^® (BASF, Parsippany, NJ, USA), Polyoxyethylen-50-Stearat, Polyoxyl-35-Rizinusöl, Polyoxyl-10-Oleylether, Polyoxyl-20-Cetostearylether, Polyoxyl-40-stearat, Polysorbat 20, Polysorbat 40, Polysorbat 60, Polysorbat 80, Propylenglycoldiacetat, Propylenglycolmonostearat, Natriumlaurylsulfat, Natriumstearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonooleat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Stearinsäure, Trolamin und emulgierendes Wachs, (iii) von Suspensionsmitteln und/oder viskositätserhöhenden Mitteln, einschließlich beispielsweise Akazie, Agar, Alginsäure, Aluminiummonostearat, Bentonit, Magma, Carbomer 934P, Carboxymethylcellulose, Calcium und Natrium und Natrium 12, Carrageenan, Cellulose, Dextran, Gelatine, Guar-Gummi, Johannisbrotkernmehl, Veegum, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Magnesiumaluminiumsilicat, ZEOLITES^®, Methylcellulose, Pektin, Polyethylenoxid, Povidon, Propylenglycolalginat, Siliciumdioxid, Natriumalginat, Tragacanth, Xanthan-Gummi, α-d-Gluconolacton, Glycerol und Mannitol, (iv) von synthetischen Suspensionsmitteln, wie beispielsweise Polyethylenglycol (PEG), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA), Polypropylenglycol (PPG) und Polysorbat und (v) von tonizitätssteigernden Mitteln, die stabilisieren und Tonizität hinzufügen, wie beispielsweise Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Saccharose, Propylenglycol und Glycerol.
Die vorliegenden stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel sind wünschenswerterweise in einer wässrigen Umgebung formuliert, die das stabilisierende Material dazu induzieren kann (z. B. ein Lipid aufgrund seiner hydrophoben-hydrophilen Natur), Vesikel zu bilden, was die stabilste Konfiguration sein könnte, die in solch einer Umgebung erreicht werden kann. Die Verdünnungsmittel, die verwendet werden können, um eine solche wässrige Umgebung zu schaffen, umfassen beispielsweise Wasser, einschließlich entionisiertes Wasser, normale Salzlösung, physiologische Salzlösung oder Wasser, das ein oder mehrere gelöste Substanzen wie Salze und Agar enthält.
Die vorliegenden stabilisierenden Materialien oder Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise ein Gas und/oder einen Gasvorläufer. Das Gas liefert den stabilisierenden Materialien oder Zusammensetzungen verstärktes Reflexionsvermögen, besonders, wenn das Gas in den stabilisierenden Materialien oder Zusammensetzungen enthalten ist. Bevorzugte Gase und Gasvorläufer sind inert und biokompatibel und umfassen beispielsweise Luft, Edelgase wie Helium, Rubidium-hyperpolarisiertes Xenon, hyperpolarisiertes Argon, hyperpolarisiertes Helium, Neon, Argon und Xenon, Kohlendioxid, Stickstoff, Fluor, Sauerstoff, schwefelbasierte Gase wie beispielsweise Schwefelhexafluorid und Schwefeltetrafluorid, fluorierte Gase, einschließlich beispielsweise partiell fluorierte Gase oder vollständig fluorierte Gase und Mischung davon. In den stabilisierenden Materialien und Vesikeln können auch paramagnetische Gase wie beispielsweise ¹⁷O₂ verwendet werden. Gasvorläufer umfassen Materialien, die in vivo zu einem Gas umgewandelt werden können.
Viele verschiedene Materialien können in Kombination mit den stabilisierenden Materialien und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Gase und Gasvorläufer verwendet werden. Bei Gasvorläufern ist es nur erforderlich, dass das Material in der Lage ist, einen Phasenübergang in die Gasphase zu durchlaufen, wenn es durch die geeignete Temperatur geleitet wird. Geeignete Gase und/oder Gasvorläufer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise Hexafluoraceton, 1,2-Dichlortetrafluoraceton, Tetrafluorallen, Bortrifluorid, 1,2,3-Trichlor-2-fluor-1,2-butadien, Hexafluor-1,3-butadien, 1-Fluorbutan, Perfluorbutan, Decafluorbutan, Perfluor-1-buten, Perfluor-2-buten, 2-Chlor-1,1,1,4,4,4-hexafluorbutyn, 2-Chlor-1,1,1,4,4,4-hexafluor-2-buten, Perfluor-2-butyn, Octafluorcyclobutan, Perfluorcyclobuten, Perfluorcyclobutan, Perfluorcyclopentan, Octafluorcyclopenten, Perfluorcyclopropan, 1,1,1-Trifluordiazoethan, Hexafluordimethylamin, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorpentan, Hexafluorethan, Hexafluorpropylen, 1,1,2,2,3,3,4,4-Octafluorbutan, 1,1,1,3,3-Pentafluorbutan, Octafluorpropan, Octafluorcyclopenten, 1,1-Dichlorfluorethan, Hexafluor-2-butyn, Octafluor-2-buten, Hexafluorbutan-1,3-dien, Perfluordimethylamin, 4-Methyl-1,1,1,2-tetrafluorethan, 1,1,1-Trifluorethan, 1,1,2,2-Tetrafluorethan, 1,1,2-Trichlor-1,2,2-trifluorethan, 1,1,1-Trichlor-2,2,2-trifluorethan, 1,1-Dichlor-1,2-difluorethylen, 1,1-Dichlor-1,2,2,2-etrafluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2,2-pentafluorethan, 1,1-Difluor-2-chlorethan, 1,1-Dichlor-2-fluorethan, Dichlor-1,1,2,2-tetrafluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2-tetrafluorethan, 2-Chlor-1,1-difluorethan, 1,1,2-Trifluor-2-chlorethan, 1,2-Difluorchlorethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortrifluorethan, Fluorethan, Nitropentafluorethan, Nitrosopentafluorethan, Perfluorethylamin, 1,2-Dichlor-2,2-difluorethan, 1,1-Dichlor-1,2-Difluorethan, 1,2-Dichlor-1,1,3-trifluorpropan, 1,2-Difluorethan, 1,2-Difluorethylen, Trifluormethansulfonylchlorid, Trifluormethansulfenylchlorid, (Pentafluorthio)trifluormethan, Trifluormethansulfonylfluorid, Bromdifluornitrosomethan, Bromfluormethan, Bromchlordifluormethan, Bromchlorfluormethan, Bromtrifluormethan, Bromtrifluorethan, Chlordifluornitromethan, Chlorfluormethan, Chlortrifluormethan, Chlordifluormethan, Dibromfluormethan, Dibromdifluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlorfluormethan, 1-Bromperfluorbutan, Difluormethan, Difluoriodmethan, Fluormethan, Perfluormethan, Iodtrifluormethan, Iodtrifluorethylen, Nitrotrifluormethan, Nitrosotrifluormethan, Tetrafluormethan, Trichlorfluormethan, Trifluormethan, Perfluorpent-1-en, 1,1,1,2,2,3-Hexafluorpropan, 2,2-Difluorpropan, Heptafluor-1-nitropropan, Heptafluor-1-nitrosopropan, Heptafluor-2-iodpropan, Perfluorpropan, Hexafluorpropan, 1,1,1,2,3,3-Hexafluor-2,3-dichlorpropan, 1-Brom-1,1,2,3,3,3-hexafluorpropan, 1-Bromperfluorpropan, 2-Chlorpentafluor-1,3-butadien, 3-Fluorpropan, 3-Fluorpropylen, Perfluorpropylen, Perfluortetrahydropyran, Perfluormethyltetrahydrofuran, Perfluorbutylmethylether, Perfluormethyl-n-butylether, Perfluormethylisopropylether, Perfluormethyl-t-butylether, Perfluorbutylethylether, Perfluormethylpentylether, 3,3,3-Trifluorpropyn, 3-Fluorstyrol, Schwefel(di)decafluorid (S₂F₁₀), Schwefelhexafluorid, Selenhexafluorid, Trifluoracetonitril, Trifluormethylperoxid, Trifluormethylsulfid, Tungstenhexafluorid, 1-Bromononafluorbutan, 1-Chlor-1-fluor-1-brommethan, 1-Brom-2,4-Difluorbenzen, 2-Iod-1,1,1-trifluorethan, Brompentafluorid, Perfluor-2-methyl-2-penten, 1,1,1,3,3-Pentafluorpentan, 3-Fluorbenzaldehyd, 2-Fluor-5-nitrotoluol, 3-Fluorstyrol, 3,5-Difluoranilin, 2,2,2-Trifluorethylacrylat, 3-(Trifluormethoxy)acetophenon, Bis-(perfluorisopropyl)ether, Bis(perfluorpropyl)ether, Perfluorisobutylmethylether, Perfluor-n-propylethylether, Perfluorcyclobutylmethylether, Perfluorcyclopropylethylether, Perfluorisopropylmethylether, Perfluor-n-propylmethylether, Perfluordiethylether, Perfluorcyclopropylmethylether, Perfluormethylethylether, Perfluordimethylether, Luft, Edelgase wie beispielsweise Helium, Neon, Argon, Xenon, Kohlendioxid, Stickstoff, Isopropylacetylen, Allen, 1,2-Butadien, 2,3-Butadien, 1,3-Butadien, 2-Methyl-1,3-butadien, Butadien, 2-Methylbutan, 1-Buten, 2-Buten, 2-Methyl-1-buten, 3-Methyl-1-buten, 4-Phenyl-3-buten-2-on, 2-Methyl-1-buten-3-yn, Butylnitrat, 1-Butyn, 2-Butyn, 3-Methyl-1-butyn, 2-Brombutyraldehyd, Carbonylsulfid, Crotononitril, Cyclobutan, Methylcyclobutan, Cyclopropan, 3-Chlorcyclopenten, Dimethylamin, 1,2-Dimethylcyclopropan, 1,1-Dimethylcyclopropan, 1,2-Dimethylcyclopropan, Ethylcyclopropan, Methylcyclopropan, Diacetylen, 3-Ethyl-3-methyldiaziridin, Dimethylethylamin, Bis(dimethylphosphin)amin, Dimethyloxoniumchlorid, 2,3-Dimethyl-2-norbornan, 1,3-Dioxolan-2-on, 1,1-Dichlorethan, 1,1-Dichlorethylen, Chlorethan, 1,1-Dichlorethan, Methan, Chlordinitromethan, Iodmethan, Disilanmethan, 2-Methylbutan, Methylether, Methylisopropylether, Methyllactat, Methylnitril, Methylsulfid, Methylvinylether, Neon, Neopentan, Stickstoff, Stickoxid, 1,2,3-Nonadecantricarboxysäure-2-hydroxytrimethylester, 1-Nonen-3-yn, 1,4-Pentadien, n-Pentan, 4-Amino-4-methylpentan-2-on, 1-Penten, 2-Penten (cis und trans), 3-Brompent-1-en, 2-Chlorpropan, Tetrachlorphthalsäure, 2,3,6-Trimethylpiperidin, Propan, 1-Chlorpropan, 1-Chlorpropylen, Chlorpropylen(trans), Chlorpropan(trans), 2-Chlorpropylen, 2-Aminopropan, 1,2-Epoxypropan, Propen, Propyn, 2,4-Diaminotoluol, Vinylacetylen, Vinylether, Ethylvinylether, 5-Bromvalerylchlorid, 1-Bromethan, 6-Brom-1-hexen, 2-Brom-2-nitropropan, 2-Brom-5-nitrothiophen, 2-Brompropen, 3-Chlor-5,5-dimethyl-2-cyclohexen, 2-Chlor-2-methylpropan und Mischungen davon. Ein Fachmann könnte leicht feststellen, ob eine der obigen Verbindungen bei einer gegebenen Temperatur ein Gas oder ein Gasvorläufer ist.
Bevorzugte Gase und Gasvorläufer sind Verbindungen, die in Wasser kaum löslich sind, aber in manchen Fällen fettlöslich sein können, wie beispielsweise Alkane mit niedrigem Molekulargewicht und ihre fluorierten Analoge. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen das Gas und der Gasvorläufer eine fluorierte Verbindung, die Verbindungen umfasst, die ein oder mehr Fluoratome enthalten. Bevorzugte Verbindungen enthalten mehr als ein Fluoratom, wobei Perfluorkohlenstoffe mehr bevorzugt sind. Bevorzugte Gase und Gasvorläufer umfassen beispielsweise fluorierte Kohlenstoffe, Perfluorkohlenstoffe, Schwefelhexafluorid, Perfluorether und Kombinationen davon.
Bevorzugte Perfluorkohlenstoffe können gesättigt, ungesättigt oder zyklisch sein, einschließlich beispielsweise Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorcyclopropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluorpentan, Perfluorcyclopentan, Perfluorhexam Perfluorcyclohexan und Mischungen davon. Mehr bevorzugt ist der Perfluorkohlenstoff Perfluorhexan, Perfluorpentan, Perfluorpropan oder Perfluorbutan, wobei Perfluorpropan besonders bevorzugt ist.
Bevorzugte Ether umfassen teilweise oder vollständig fluorierte Ether, vorzugsweise mit einem Siedepunkt von etwa 36°C bis etwa 60°C. Fluorierte Ether sind Ether, in denen ein oder mehr Wasserstoffatome durch ein Fluoratom ersetzt sind. Fluorierte Ether können die allgemeine Formel CX₃(CX₂)_n-O-(CX₂)_nCX₃, wobei X ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom oder ein anderes Halogenatom ist, vorausgesetzt, dass mindestens eines von X ein Fluoratom ist. Bevorzugte fluorierte Ether umfassen beispielsweise Perfluortetrahydropropan, Perfluormethyltetrahydrofuran, Perfluorbutylmethylether (z. B. Perfluor-t-butylmethylether, Perfluorisobutylmethylether, Perfluor-n-butylmethylether), Perfluorpropylethylether (z. B. Perfluorisopropylethylether, Perfluor-n-propylethylether), Perfluorcyclobutylmethylether, Perfluorcyclopropylethylether, Perfluorpropylmethylether (z. B. Perfluorisopropylmethylether, Perfluor-n-propylmethylether), Perfluordiethylether, Perfluorcyclopropylmethylether, Perfluormethylethylether und Perfluordimethylether.
Andere bevorzugte Fluoretherverbindungen enthalten zwischen 4 und 6 Kohlenstoffatome und enthalten wahlweise ein Halidion, vorzugsweise Br^1–. Beispielsweise sind Verbindungen mit der Struktur C_nF_yH_xOBr, bei der n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6 ist, y eine ganze Zahl von 0 bis etwa 13 ist und x eine ganze Zahl von 0 bis etwa 13 ist, als Gasvorläufer geeignet. Beispiele von Gasvorläufern mit dieser Formel umfassen Perfluorpropyloxylbromid und 2-Bromoxyperfluorpropan.
Andere bevorzugte Gase sind Schwefelhexafluorid und Selenhexafluorid. Ein weiteres bevorzugtes Gas ist Heptafluorpropan, einschließlich 1,1,1,2,3,3,3- Heptafluorpropan und sein Isomer 1,1,2,2,3,3,3-Heptafluorpropan. Weitere Verbindungen, die als Gase und/oder Gasvorläufer verwendet werden können, umfassen Verbindungen, die ein Schwefelatom umfassen, einschließlich Verbindungen der Formel CF₃-(CF₂)_n-SF₅ oder SF₅-(CF₂)_n-SF₅, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 10 ist.
Mischungen unterschiedlicher Typen von Gasen und/oder Gasvorläufern, wie beispielsweise Mischungen eines Perfluorcarbons oder eines Perfluorethers und einem anderen Typ von Gas und/oder Gasvorläufer wie beispielsweise Luft oder Stickstoff können ebenfalls in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Einem Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung weitere geeignete Gase und Gasvorläufer geläufig.
Die Gasvorläufermaterialien umfassen vorzugsweise Verbindungen, die gegenüber Veränderungen der Temperatur empfindlich sind. Beispiele geeigneter Gasvorläufer, die gegenüber Veränderungen der Temperatur empfindlich sind, sind die Perfluorcarbone und Perfluorether. Wie ein Fachmann verstehen wird, können ein bestimmtes Perfluorcarbon und ein bestimmter Perfluorether in einem flüssigen Zustand vorliegen, wenn die stabilisierenden Materialien eingangs hergestellt werden, und werden somit als ein Gasvorläufer verwendet. Alternativ können das Perfluorcarbon oder der Perfluorether im gasförmigen Zustand vorliegen, wenn die stabilisierenden Materialien hergestellt werden, und werden somit direkt als Gas verwendet. Ob das Perfluorcarbon oder der Perfluorether als eine Flüssigkeit oder als ein Gas verwendet wird, richtet sich nach dessen Phasenübergangstemperatur von der Flüssig- in die Gasphase oder dem Siedepunkt. Ein bevorzugtes Perfluorcarbon, Perfluorpentan, hat eine Temperatur des Übergangs von der Flüssig- in die Gasphase (Siedepunkt) von 29,5°C. Das bedeutet, dass Perfluorpentan bei Raumtemperatur (etwa 25°C) im Allgemeinen eine Flüssigkeit ist, aber im menschlichen Körper, dessen Normaltemperatur etwa 37°C beträgt, was über der Übergangstemperatur von Perfluorpentan liegt, zu einem Gas umgewandelt wird. Unter normalen Umständen ist Perfluorpentan also ein Gasvorläufer. Wie einem durchschnittlichen Fachmann bekannt ist, steht der effektive Siedepunkt einer Substanz in Beziehung zum Druck, dem diese Substanz ausgesetzt ist. Diese Beziehung wird durch das ideale Gasgesetz veranschaulicht: PV = nRT, wobei P der Druck, V das Volumen, n die Substanzmenge in Mol, R die Gaskonstante und T die Temperatur ist. Das ideale Gasgesetz zeigt, dass sich bei zunehmendem Druck auch der effektive Siededruck erhöht. Wenn sich der Druck dagegen verringert, verringert sich auch der effektive Siedepunkt.
Einem Fachmann ist außerdem geläufig, dass die Phasenübergangstemperatur einer Verbindung von lokalen Bedingungen innerhalb des Gewebes beeinflusst werden kann, beispielsweise durch lokalen Druck (beispielsweise dem interstitiellen oder interfaszialen Druck oder anderen Drücken in dem Bereich). Wenn der Druck in den Geweben höher als. der Umgebungsdruck ist, sollte sich die Phasenübergangstemperatur erhöhen. Das Ausmaß solcher Auswirkungen kann durch Vorhersage anhand der Standardgasgesetze geschätzt werden, beispielsweise durch das Charles'sche Gesetz und das Boyle'sche Gesetz. Als Näherung gilt, dass sich bei Verbindungen mit einer Flüssig-zu-Gas-Phasenübergangstemperatur zwischen etwa 30°C und etwa 50°C ein Anstieg der Phasenübergangstemperatur von jeweils 1°C ergibt, wenn der Druck um jeweils 25 mmHg steigt. Die Flüssig-zu-Gas-Phasenübergangstemperatur (Siedepunkt) von Perfluorpentan liegt bei einem Standarddruck von etwa 760 mmHg bei 29,5°C, aber der Siedepunkt liegt bei einem interstitiellen Druck von 795 mmHg bei etwa 30,5°C.
Andere Gasvorläufer, die für den Gebrauch in den hierin beschriebenen stabilisierenden Materialien und Zusammensetzungen geeignet sind, sind Mittel, die pH-empfindlich sind. Diese Mittel umfassen Materialien, die Gas entwickeln können, wenn sie beispielsweise einem pH-Wert ausgesetzt sind, der neutral oder sauer ist. Beispiele solcher pH-empfindlichen Mittel umfassen Salze einer Säure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus anorganischen Säuren, organischen Säuren und Mischungen davon besteht. Kohlensäure (H₂CO₃) ist ein Beispiel einer geeigneter anorganischen Säure und Aminomalonsäure ist ein Beispiel einer geeigneten organischen Säure. Andere geeignete anorganische und organische Säuren sind einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt.
Gasvorläufer, die aus Salzen abgeleitet sind, sind vorzugsweise Alkalimetallsalze, Ammoniumsalze und Mischungen davon. Mehr bevorzugt ist das Salz ein Carbonat, ein Bicarbonat, ein Sesquecarbonat, ein Aminomalonat und Mischungen davon. Geeignete Gasvorläufermaterialien, die aus Salzen abgeleitet sind, umfassen beispielsweise Lithiumcarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Lithiumbicarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat, Magnesiumcarbonat, Calciumcarbonat, Magnesiumbicarbonat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumsesquecarbonat, Natriumsesquecarbonat, Natriumaminomalonat und Ammoniumaminomalonat. Aminomalonat ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und seine Herstellung ist beispielsweise in Thanassi, Biochemistry, 9(3): 525 (1979); Fitzpatrick, et al., Inorganic Chemistry, 13(3): 568 (1974); und Stelmashok et al., Koordinatsionnaya Khimiya 3(4): 524 (1977) beschrieben.
Die Gasvorläufermaterialien können auch photoaktivierte Materialien sein, wie beispielsweise Diazoniumion und Aminomalonat. Wie hiernach ausführlicher beschrieben, können bestimmte stabilisierende Materialien und/oder Vesikel, insbesondere Vesikel, derart formuliert sein, dass am Zielgewebe oder durch Einwirkung von Schall auf die stabilisierenden Materialien Gas gebildet wird. Beispiele von Gasvorläufern sind beispielsweise in US-Patent Nr. 5,088,499 und 5,149,319 beschrieben. Einem Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung weitere Gasvorläufer neben den oben beispielhaft dargestellten geläufig.
Die Gase und/oder Gasvorläufer sind vorzugsweise in die stabilisierenden Materialien und/oder Zusammensetzungen enthalten, unabhängig von der physikalischen Natur der Zusammensetzung. Die Gase und/oder Gasvorläufer können daher beispielsweise in stabilisierende Materialien enthalten sein, in denen die stabilisierenden Materialien zufällig aggregiert sind, beispielsweise als Emulsionen, Dispersionen oder Suspensionen, sowie in Vesikeln, einschließlich Vesikel wie beispielsweise Cochleate, Mizellen und Liposomen. Einschluss der Gase und/oder Gasvorläufer in die stabilisierenden Materialien und/oder Zusammensetzungen kann durch eine Reihe von Verfahren erreicht werden. Beispielsweise können gasgefüllte Zusammensetzungen hergestellt werden, indem eine wässrige Mischung, die ein Gas und/oder einen Gasvorläufer und ein Lipid oder mehr Lipide enthält, geschüttelt oder anderweitig bewegt wird. Dies fördert die Bildung stabilisierter Zusammensetzungen, in denen das Gas und/oder der Gasvorläufer verkapselt sind.
Darüber hinaus kann ein Gas direkt in eine wässrige Mischung von stabilisierenden Materialien und/oder vesikelbildenden Verbindungen geblasen werden. Alternativ kann ein Gasinstillationsverfahren verwendet werden, wie beispielsweise in US-Patent Nr. 5,352,435 und 5,228,446 beschrieben. Weitere geeignete Verfahren zum Einschluss von Gas und/oder einem Gasvorläufer in kationische Lipidzusammensetzungen sind in US-Patent Nr. 4,865,836 beschrieben. Einem Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung weitere Verfahren geläufig. Das Gas kann vorzugsweise nach oder während der Zugabe des stabilisierenden Materials und/oder während der Bildung von Vesikeln in die stabilisierenden Materialien und/oder andere Zusammensetzungen instilliert werden.
Es ist bevorzugt, dass die stabilisierenden Materialien und vor allem die Vesikel aus Lipiden und wahlweise stabilisierenden Verbindungen formuliert sind, um die Bildung stabiler Vesikel zu fördern. Des Weiteren ist bevorzugt, dass die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel auch ein hoch stabiles Gas umfassen. Der Begriff „hoch stabiles Gas" bezieht sich auf ein Gas, das in wässrigen Medien eingeschränkte Löslichkeit und Diffundierbarkeit aufweist. Beispielhafte hoch stabile Gase umfassen Perfluorcarbone, da sie im Allgemeinen in wässrigen Medien weniger diffundierbar und relativ unlöslich sind. Deren Verwendung könnte daher die Bildung hoch stabiler Vesikel fördern.
Was ihre Herstellung, Bildung und Verwendung angeht, können hierin verwendete Zusammensetzungen auch Gasvorläufer umfassen, die aktiviert werden können, um durch Temperatur, pH-Wert, Licht und Energie (wie beispielsweise Ultraschall) von einer Flüssigkeit oder einem Feststoff in ein Gas umgewandelt zu werden. Die Gasvorläufer können zu einem Gas werden, indem die Vorläufer bei geringerem Druck aufgewahrt werden. Beispielsweise kann ein Gefäß, das unter reduziertem Druck aufbewahrt wird, einen Gasraum von Perfluorpentan- oder Perfluorhexangas erzeugen, die zum Erzeugen eines vorgeformten Gases vor der Injektion geeignet sind. Vorzugsweise werden die Gasvorläufer durch Temperatur aktiviert. Unten ist eine Tabelle mit einer Liste einer Reihe von Gasvorläufern aufgeführt, die relativ nahe bei der normalen Körpertemperatur (37°C) oder darunter Phasenübergänge von flüssigen zu gasförmigen Zuständen durchlaufen, und der Größe der emulgierten Tröpfchen, die erforderlich wären, um ein Vesikel einer Maximalgröße von 10 μm zu bilden. TABELLE 1: Physikalische Eigenschaften von Gasvorläufern und Durchmesser emulgierter Tröpfchen zur Bildung eines 10-μm-Vesikels
Quelle: Chemical Rubber Company Handbook of Chemistry and Physics, Robert C. Weast und David R. Lide, Hrsg., CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida (1989–1990).
Wie oben erwähnt, ist es bevorzugt, den Gebrauch der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel zu optimieren, vor allem von Vesikeln, die aus Lipiden formuliert sind, in dem Gase eingeschränkter Löslichkeit verwendet werden. Der Begriff „eingeschränkte Löslichkeit" bezieht sich auf die Fähigkeit des Gases, aufgrund seiner Löslichkeit aus den Vesikeln in das umgebende wässrige Medium zu diffundieren. Eine bessere Löslichkeit in dem wässrigen Medium erlegt dem Gas in dem Vesikel einen Gradienten auf, so dass das Gas eine Tendenz zur Diffusion aus dem Vesikel hat. Eine geringere Löslichkeit in dem wässrigen Milieu kann andererseits den Gradienten zwischen dem Vesikel und der Berührungsstelle vermindern oder beseitigen, so dass eine Diffusion des Gases aus dem Vesikel behindert wird. Das in dem Vesikel eingeschlossene Gas hat vorzugsweise eine Löslichkeit unter der von Sauerstoff, das heißt, etwa 1 Teil Gas in etwa 32 Teilen Wasser. Siehe Matheson Gas Data Book, 1966, Matheson Company, Inc. Mehr bevorzugt besitzt das in dem Vesikel eingeschlossene Gas eine Löslichkeit in Wasser unter der von Luft; und noch mehr bevorzugt besitzt das in dem Vesikel eingeschlossene Gas eine Löslichkeit in Wasser unter der von Stickstoff.
Die Zusammensetzungen und stabilisierenden Materialien der vorliegenden Erfindung können auch eine Zieleinheit, wie beispielsweise einen Zielliganden umfassen. Zielliganden sind vorzugsweise kovalent oder nicht-kovalent mit den stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln assoziiert. Im Fall stabilisierender Materialien kann der Zielligand beispielsweise über eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung an mindestens eines der Lipide, Proteine, Polymere oder Tenside gebunden sein, die in den stabilisierenden Materialien eingeschlossen sind. Der Zielligand ist vorzugsweise kovalent an die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel gebunden. Im Fall von Lipidzusammensetzungen, die Cholesterin umfassen, ist der Zielligand vorzugsweise im Wesentlichen nur nicht-kovalent gebunden, und/oder der Zielligand ist kovalent an einen Bestandteil der Zusammensetzung gebunden, beispielsweise an ein anderes Lipid, wie beispielsweise ein Phospholipid, bei dem es sich nicht um Cholesterin handelt. Falls gewünscht, können die Zielliganden auch an andere stabilisierende Materialien gebunden sein, beispielsweise an Lipide, Polymere, Proteine oder Tenside, die in den Zusammensetzungen vorhanden sein können. Die Zielliganden, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, sind vorzugsweise Substanzen, die in vivo oder in vitro ein Targeting von Rezeptoren und/oder Gewebe durchführen können. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ein einzelnen Typen oder eine einzelne Klasse von Zielliganden umfassen sowie zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder mehr unterschiedliche Typen oder Klassen von Zielliganden.
Was das Targeting von Gewebe angeht, können die Zielliganden vorzugsweise ein Targeting von Herzgewebe und Membrangewebe durchführen, einschließlich Endothel- und Epithelzellen. Im Fall von Rezeptoren sind die Zielliganden wünschenswerterweise in der Lage, ein Targeting von GPIIbIIa-Rezeptoren oder Lymphozytenrezeptoren wie Rezeptoren von T-Zellen, B-Zellen oder Interleukin-2-Rezeptoren durchzuführen.
Geeignete Zielliganden zur Verwendung in Zielgeweben und/oder Rezeptoren umfassen beispielsweise Proteine, einschließlich Antikörper, Antikörperfragmente, Hormone, Hormonanaloga, Glykoproteine, Lipoproteine und Lektine, Peptide, Polypeptide, Aminosäuren, Zucker wie Saccharide, einschließlich Monosaccharide und Polysaccharide und Kohlenhydrate, Glykolipide, Vitamine, Steroide, Steroidanaloga, Hormone, Cofaktoren und genetisches Material, einschließlich Nukleoside, Nukleotide, Nukleotidsäurekonstrukte und Polynukleotide, wobei Peptide besonders bevorzugt sind.
Genetisches Material, das als Zielliganden verwendet wird, umfasst beispielsweise Nukleinsäuren, RNA und DNA, natürlicher oder synthetischer Herkunft, rekombinante RNA, rekombinante DNA, Sense-RNA, Sense-DNA, Antisense-RNA, Antisense-DNA, Hammerhead-RNA, Ribozyme, Hammerhead-Ribozymen, Antigen-Nukleinsäuren, einzelsträngige RNA, doppelsträngige RNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, Ribooligonukleotide, Desoxyribooligonukleotide, Antisense-Ribooligonukleotide und Antisense-Desoxyribooligonukleotide und Analoga eines der obigen.
Protein A, das von den meisten Stämmen von Staphylococcus aureus produziert wird, ist ein Beispiel eines Proteins, das in der vorliegenden Erfindung als ein Zielligand verwendet werden kann. Protein A ist beispielsweise von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) kommerziell erhältlich. Protein A kann dann verwendet werden, um verschiedene IgG-Antikörper zu binden. Im Allgemeinen umfassen Peptide, die als Zielliganden besonders nützlich sind, natürliche, modifizierte natürliche oder synthetische Peptide, die zusätzliche Arten von Resistenz gegenüber einem Abbau durch vaskulär zirkulierende Esterasen, Amidasen oder Peptidasen beinhalten. Ein sehr nützliches Verfahren der Stabilisierung von Peptideinheiten beinhaltet die Anwendung von Zyklierungstechniken. Als Beispiel kann die Ende-zu-Ende-Zyklierung, bei der der Carboxy-Terminus über eine Amidbindung kovalent mit dem Amino-Terminus verknüpft wird, geeignet sein, um einen Peptidabbau zu hemmen und die Halbwertszeit in der Zirkulation zu erhöhen. Darüber hinaus ist eine Seitenkette-zu-Seitenkette-Zyklierung oder eine Ende-zu-Ende-Zyklierung bei der Induktion von Stabilität ebenfalls besonders nützlich. Die Substitution einer L-Aminosäure durch eine D-Aminosäure in einem strategischen Bereich des Peptids kann außerdem Resistenz gegenüber einem biologischen Abbau bieten.
Bevorzugte Zielliganden in der vorliegenden Erfindung umfassen Zelladhäsionsmoleküle (CAM), darunter beispielsweise Zytokine, Integrine, Cadherine, Immunglobuline und Selektine, die alle ausführlich unten erläutert sind.
In Verbindung mit dem Targeting von Endothelzellen umfassen geeignete Zielliganden beispielsweise einen oder mehr der Folgenden: Oligosaccharide, mit der Sialyl-Lewis-X (Slex)-Sequenz als Terminus, α-Sialinsäure(2-3)βGal(1→4)[αFuc(1→3)βGlc-NAc-OR, MAdCAM-1, CD34, GlyCAM-1, PSGL-1, LFA-1, PECAM-1, Wachstumsfaktoren, einschließlich beispielsweise basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), saurer Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), Transformierender Wachstumsfaktor alpha (TGF-α), Transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β), Von Plättchen stammender Endothelzell-Wachstumsfaktor (Platelet-derived Endothelial cell growth factor, PD-ECGF), vaskulärer Endothel-Wachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) und humaner Wachstumsfaktor (HGF), Angiogenin, Tumornekrosefaktoren, einschließlich Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) und Tumornekrosefaktor Beta (TNF-β) und Rezeptorantikörper und Fragmente davon gegen die Familie der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptoren 1 oder 2, einschließlich beispielsweise TNF.R1, TNF-R2, FAS, TNFR-RP, NGF-R, CD30, CD40, CD27, OX40 und 4-1BB, kupferhaltiges Polyribonukleotidangiotropin mit einem Molekulargewicht von etwa 4.500, sowie niedermolekulare angiogene Faktoren, die keine Peptide sind, wie beispielsweise 1-Butyrylglycerol, die Prostanglandine, einschließlich beispielsweise Prostanglandin E₁ (PGE₁) und Prostanglandin E₂ (PGE₂), Nikotinamid, Adenosin, Dipyridamol, Dobutamin, Hyaluronsäureabbauprodukte wie beispielsweise Abbauprodukte, die aus der Hydrolyse von β-Verknüpfungen entstehen, einschließlich Hyalobiuronsäure, Angiogenesehemmer, einschließlich beispielsweise Kollagenaseinhibitoren, Minocycline, Medroxyprogesteron, Chitin, das chemisch mit 6-O-Sulfat und 6-O-Carboxymethylgruppen modifiziert ist, angiostatische Steroide wie beispielsweise Tetrahydrocortison, saurer und basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF, der Heparin binden kann) und Heparin, einschließlich niedermolekulare Fragmente von Heparin oder Analoga von Heparin, wie beispielsweise Fragmente mit einem Molekulargewicht von etwa 6.000, gemischt mit Steroiden wie beispielsweise Cortison oder Hydrocortison, Angiogenesehemmer einschließlich Angioinhibin (AGM-1470 – ein angiostatisches Antibiotikum), Plättchenfaktor 4, Protamin, sulfatierte Polysaccharid-Peptidoglycan-Komplexe, die aus der Bakterienwand einer Arthobacter-Art abgeleitet sind, von Pilzen abgeleitete Angiogenesehemmer wie beispielsweise Fumagillin, abgeleitet von Aspergillus fumigatus, D-Penicillamin, Goldthiomalat, Thrombospondin, Vitamin-D₃-Analoga, einschließlich beispielsweise 1-α,25-Dihydroxy-Vitamin-D₃ und ein synthetisches Analog 22-Oxa-I-α,25-Dihydroxy-Vitamin-D₃, Interferone, einschließlich beispielsweise α-Interferon, β-Interferon und γ-Interferon; Zytokine und Zytokinfragmente, wie beispielsweise die Interleukine, einschließlich beispielsweise Interleukin-1 (IL-1, IL-1α, IL-1β, IL-1rα), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-3 (IL-3), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-7 (IL-7), Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-9 (IL-9), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-11 (IL-11), Interleukin-12 (IL-12), Interleukin-13 (IL-13), Interleukin-14 (IL-14), Erythropoietin, ein 20mer-Peptid oder kleiner zum Binden an Rezeptor oder Antagonisten nativer Zytokine, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GMCSF), LTB, Leukozytenrezeptorantagonisten, einfach sulfatierte Polysaccharide wie Cyclodextrine, einschließlich α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin und γ-Cyclodextrin, Tetradecasulfat, Transferrin, Ferritin, Plättchenfaktor 4, Protamin, an Kupfer komplexiertes Gly-His-Lys, Ceruloplasmin; (12R)-Hydroxycicosatriensäure, Okadainsäure, Lektine, Antikörper, CD11a/CD18, Very-Late-Activation-Integrine, VLA-11, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, β1α7, β1α8, β1αv, die LEUCAM-Familie, LFA-1, Mac-1, p150.95, die Cytoadhäsions-Familie, CD41a, Vitronectin-Rezeptor β₄α₆, β₅α_ν, β₆α_?, β₇α₄, LPRM-1, β₇α_IEL, β₈α_δ. Andere geeignete Peptide, die als CAM-Liganden in der vorliegenden Erfindung dienen können, umfassen die in EP 0727 225 A2 , WO 94/07918, WO 94/19024, WO 93/25244, WO 93/23085 und WO 94/28942 beschriebenen.
In einer anderen Ausführungsform können kleine Peptide verwendet werden, die den Interleukin-1(IL-1)-Rezeptor binden. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Peptide, die durch Phagendisplay-Kernsequenzen mit QPY erzeugt wurden, für Peptidbindung entscheidend sind, einschließlich beispielsweise AF12198, ein 15-Mer mit einer Kernsequenz von WYQJY (SEQ ID Nr.: 1), wobei J ein Azetidin ist, und IL-1-Antagonisten mit K_d 10^–10 bis 10^–12 M, wie beispielsweise AcPhe-Glu, Trp-Pro-Gly-Ttp-Tyr-Gln-Aze-Tyr-Ala-Leu-Pro-Leu-CONH₂ (SEQ ID Nr.: 2) oder Ac-Phe-Glu-Trp-Pro-Gly-Trp-Tyr-Gln-Aze-Tyr-Ala-Leu-Pro-Leu (SEQ ID Nr.: 3).
Endotheliale Leukozytenadhäsionsmoleküle (ELAMs) sind Antigene, die unter Belastungsbedingungen von Endothelzellen exprimiert werden und anschließend die Wanderung der Leukozyten durch das Endothel, welches das Gefäßsystem auskleidet, in das umliegende Gewebe erleichtern. Dieselben endothelialen Leukozytenadhäsionsmoleküle könnten sich vorteilhaft als Rezeptoren zum Targeting von Vesikeln nutzen lassen. Diese endothelialen Leukozytenadhäsionsmoleküle gehören zu einer Familie, die als Selektine bekannt ist, deren bekannte Mitglieder, wie beispielsweise GMP-140, alle an der endothelialen Leukozytenadhäsion teilnehmen und ELAM-1, LAM-1 und das Granula-Membranprotein 140 (GMP-140), auch bekannt als Platelet Activation-Dependent-Granule-External Membrane Protein (PADGEM), VCAM-1/INCAM-110 (Vascular Adhesion Molecule/Inducible Adhesion Molecule) und ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule) umfasst.
Auch die Cadherin-Familie von Zelladhäsionsmolekülen kann als Zielliganden verwendet werden, einschließlich beispielsweise die E-, N- und P-Cadherine, Cadherin-4, Cadherin-5, Cadherin-6, Cadherin-7, Cadherin-8, Cadherin-9, Cadherin-10 und Cadherin-11, am meisten bevorzugt Cadherin C-5. Gegen Cadherine gerichtete Antikörper, beispielsweise der monoklonale Antikörper Ec6C10, können verwendet werden, um Cadherine zu erkennen, die lokal von spezifischen Endothelzellen exprimiert werden.
Es kann eine große Vielzahl unterschiedlicher Zielliganden ausgewählt werden, um an die zytoplasmatischen Domänen der ELAM-Moleküle zu binden. Zielliganden können in dieser Hinsicht Lektin umfassen, viele verschiedene Kohlenhydrate oder Zuckereinheiten, Antikörper, Antikörperfragmente, Fab-Fragmente, wie beispielsweise Fab'2, und synthetische Peptide, einschließlich beispielsweise Arginin-Glycin-Asparaginsäure (R-G-D), die auf die Wundheilung abzielen. Während viele dieser Materialien natürlicher Herkunft sein können, können manche durch molekularbiologische Rekombinationstechniken synthetisiert werden und Andere synthetischen Ursprungs sein. Peptide können durch verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannte Techniken hergestellt werden. Es können auch Zielliganden verwendet werden, die von menschlichen Leukozyten abgeleitet oder davon ausgehend modifiziert sind, wie beispielsweise CD11a/CD18 und Leukozytenzelloberflächenglykoprotein (LFA-1), da diese bekannterweise an den Endothelzellrezeptor ICAM-1 binden. Auch das durch Zytokine induzierbare Mitglied der Superfamilie der Immunglobuline, VCAM-1, das selektiv für mononukleäre Leukozyten ist, kann als Zielligand verwendet werden. VLA-4, das aus menschlichen Monozyten abgeleitet ist, kann für ein Targeting zu VCAM-1 verwendet werden. Antikörper und andere Targeting-Liganden können für ein Targeting zu Endoglin verwendet werden, bei dem es sich um einen Proliferationsmarker von Endothelzellen handelt. Endoglin ist in verschiedenen soliden Tumoren auf Endothelzellen hochreguliert. Ein Zielligand, der für ein Targeting von Endoglin verwendet werden kann, ist der Antikörper TEC-11. Thorpe et al., Breast Cancer Research and Treatment, 36: 237–51 (1995).
Endothelzellaktivierung bei Atherosklerose wird bei dieser Erfindung verwendet, um die Zusammensetzungen zielgerecht zu Bereichen mit Arteriosklerose zu leiten, beispielsweise zu einem Atherosklerose-Plaque. Ein solches verwendbares Ziel ist das induzierbare mononukleäre endotheliale Leukozytenadhäsionsmolekül, das von Rb1/9 als ein ATHERO-ELAM erkannt wird. Die monoklonalen Antikörper H4/18 und H18/7 können für ein Targeting von Endothelzelloberflächenantigenen verwendet werden, die von Vermittlerzytokinen induziert werden. Als eine bevorzugte Ausführungsform werden mit Gasvorläufern gefüllte Vesikel zielgerecht zu einem Atherosklerose-Plaque geleitet, um erkrankte Blutgefäße nicht invasiv festzustellen, bevor eine schwere Beschädigung auftritt, beispielsweise vor einem Schlaganfall oder einem Herzinfarkt, so dass ein geeignetes medizinisches oder chirurgisches Eingreifen erfolgen kann. ATHERO-ELAM ist ein bevorzugtes Ziel, und Liganden wie Antikörper, Peptide oder Lektine oder Kombinationen davon können verwendet werden, um ein Targeting dieses Zelloberflächenepitops, das in Zusammenhang mit Atherosklerose auf Endothelzellen exprimiert ist, zu erreichen. Alternativ können Lipoproteine oder Lipoproteinfragmente als Zielliganden verwendet werden, die von Lipoproteinen mit niedriger oder hoher Dichte abgeleitet sind. Darüber hinaus kann Cholesterin verwendet werden, um ein Targeting der Endothelzellen zu erreichen und die stabilisierenden Materialien, Emulsionen, Vesikel und dergleichen zu Bereichen eines Atherosklerose-Plaques zu lokalisieren. In Ausführungsformen, welche die Verwendung von Cholesterin als Zielligand beinhalten, ist das Cholesterin vorzugsweise nicht mit anderen chemischen Gruppen, Einheiten, Liganden und dergleichen modifiziert (nicht derivatisiert).
Es kann ein gegen thrombotisches Material in dem Plaque gerichteter Zielligand verwendet werden, um zwischen aktiven und inaktiven Bereichen eines Atherosklerose-Plaques zu unterscheiden. Aktive Plaques im Prozess der Erzeugung von Thromben sind gefährlicher, da diese Plaques ein Gefäß letztendlich verschließen oder zu einem Embolus führen können. Diesbezüglich können, neben niedermolekularen Heparinfragmenten, andere Zielliganden, wie beispielsweise Anti-Fibrin-Antikörper, Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Anti-Thrombin-Antikörper und Fibrinantikörper, die gegen Thrombozytenaktivierungsfaktoren gerichtet sind, verwendet werden, um ein Targeting eines aktiven Plaques mit entstehenden Gerinnseln zu erreichen. Bevorzugte Zielliganden sind solche, die gegen ein mit der Plasmamembran assoziiertes GPIIbIIIa in aktivierten Thrombozyten und gegen P-Selektin gerichtet sind, und ein Antikörper oder assoziiertes Antikörperfragment, das gegen GPIIbIIIa gerichtet ist. Die vorliegende Erfindung ist auch geeignet, um Bereiche eines akuten Herzinfarktes festzustellen. Anhand der Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durch Anbringen von Antikörpern gegen Myosin (insbesondere gegen Cardiomyosin) oder von Anti-Aktin-Antikörpern an die Lipide, Polymere oder stabilisierenden Materialien ein infarziertes Myokardgewebe festgestellt werden. Für ein Targeting von Granulationsgeweben (heilende Wunden) sind viele der obigen Zielliganden geeignet. Diesbezüglich kann auch das Wundheilungstripeptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) als Zielligand verwendet werden.
Wie bei den oben erläuterten Endothelzellen können viele verschiedene Peptide, Proteine und Antikörper als Zielliganden für ein Targeting von Epithelzellen verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Peptid, einschließlich synthetische, halbsynthetische oder natürlich vorkommende Peptide, mit hoher Affinität für den Zielrezeptor auf der Epithelzelle ausgewählt werden, wobei synthetische Peptide mehr bevorzugt sind. In Verbindung mit diesen bevorzugten Ausführungsformen sind Peptide mit etwa 5 bis etwa 15 Aminosäureresten bevorzugt. Antikörper können als ganzer Antikörper oder als Antikörperfragmente, beispielsweise Fab oder Fab'2, entweder natürlicher oder rekombinanter Herkunft, verwendet werden. Die Antikörper natürlicher Herkunft können tierischer oder menschlicher Herkunft oder chimär (Maus/Human) sein. Humane rekombinante oder chimäre Antikörper sind bevorzugt, und Fragmente sind ganzen Antikörpern gegenüber bevorzugt.
Beispiele monoklonaler Antikörper, die in den vorliegenden Zusammensetzungen als Zielliganden verwendet werden, umfassen CALAM 27, welches gebildet wird, indem BRLB/c-Mäuse mit ganzem humanem Plattenpithelkarzinom der Zunge immunisiert werden und Hybridome gebildet werden, indem extrahierte Milzzellen mit solchen einer NS1-syngenen Myelomzelllinie gekreuzt werden. Gioanni et al., Cancer Research, 47: 4417–4424 (1987). CALAM 27 ist gegen Oberflächenepitope normaler und bösartiger Epithelzellen gerichtet. Siehe Cancer Research, 47: 4417–4424 (1987). Entsprechend können Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen, welche diesen Antikörper umfassen, verwendet werden, um ein Targeting von Metastasen in den Lymphknoten zu erreichen. Der monoklonale Antikörper 3C2 kann als ein Zielligand verwendet werden, um ein Targeting von bösartigen Epithelzellen schwerer Ovarialkarzinome und endometrioider Karzinome zu erreichen. Ein weiterer beispielhafter Zielligand ist Mab 4C7 (siehe Cancer Research, 45: 2358–2362 (1985)), der verwendet werden kann, um ein Targeting von muzinösen Karzinomen, endometrioiden Karzinomen und mesonephroiden Karzinomen zu erreichen. Für ein Targeting von Plattenepithelkarzinomen bei Krebserkrankungen im Kopf- und Halsbereich kann Mab E48 (Biological Abstract, Vol. 099, Ausgabe 066, Ref. 082748) als Zielligand verwendet werden. Für ein Targeting bösartiger Melanome kann der monoklonale Antikörper 225.28s (Pathol. Biol., 38(8): 866–869 (1990)) verwendet werden. Der monoklonale Antikörper mAb2E, der gegen EPR-1 (Effektorzellprotease 1) gerichtet ist, kann ebenfalls verwendet werden.
Es können Zielliganden für ein Targeting von Antigenen ausgewählt werden, einschließlich Antigene in Verbindung mit Brustkrebs, wie der Rezeptor für epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR), der Rezeptor für Fibroblastenwachstumsfaktor, erbB2/HER-2 und tumorassoziierte Kohlenhydratantigene (Cancer, 74 (3): 1006–12 (1994)). CTA 16.88, homolog zu Zytokeratin 8, 18 und 19, wird in den meisten von Epithel abstammenden Tumoren exprimiert, einschließlich in Karzinomen des Kolons, der Bauchspeicheldrüse, der Brust, der Eierstöcke und der Lunge. Also können Antikörper, die gegen diese Zytokeratine gerichtet sind, beispielsweise 16.88 (IgM) und 88BV59 (IgG3k), die verschiedene Epitope auf CTA 16.88 erkennen (Semin. Nucl. Med., 23(2): 165–79 (1993)), als Zielliganden verwendet werden. Für ein Targeting von Kolonkrebs können Anti-CEA-IgG-Fab'-Fragmente als Zielliganden eingesetzt werden. Als Zielliganden können auch chemisch konjugierte bispezifische Anti-Zelloberflächenantigene, Anti-Hapten-Fab'-Fab-Antikörper, verwendet werden. Für ein Targeting von beispielsweise Magenkrebs können monoklonale Antikörper der MG-Reihe ausgewählt werden (Chin. Med. Sci. J., 6(1): 56 (1991)).
Auf Epithelzellen gibt es verschiedene Zelloberflächenepitope, für die Zielliganden ausgewählt werden können. Beispielsweise wurde das Protein des humanen Papillomvirus (HPV) mit gutartiger und bösartiger Epithelproliferation in Haut und Schleimhaut in Verbindung gebracht. Zwei onkogene HPV-Proteine, E6 und E7, können als Ziel verwendet werden, da diese in bestimmten epithelialen Krebsarten wie beim Zervixkarzinom exprimiert sind. Siehe Curr. Opin. Immunol., 6(5): 746 (1994). Als Tumorantigene können auch Membranrezeptoren für Peptidwachstumsfaktoren (PGF-R), die an der Krebszellproliferation beteiligt sind, ausgewählt werden. Anticancer Drugs, 5(4): 379 (1994). Auch epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Interleukin-2 können für ein Targeting durch geeignete Zielliganden, einschließlich Peptide, die an diese Rezeptoren binden, verwendet werden. Bestimmte Melanom-assoziierte Antigene (MAA), wie beispielsweise der Rezeptor für epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR) und Adhäsionsmoleküle (Tumor Biol., 15(4): 188 (1994)), die von malignen Melanomzellen exprimiert werden, können als Ziel für die hierin bereit gestellten Zusammensetzungen verwendet werden. Als Ziel kann auch das tumorassoziierte Antigen FAB-72 auf der Oberfläche von Karzinomzellen ausgewählt werden.
Für ein Targeting von Myokardzellen können viele verschiedene Zielliganden ausgewählt werden. Geeignete Zielliganden umfassen beispielsweise Antikardiomyosin-Antikörper, die polyklonale Antikörper, Fab'2-Fragmente umfassen oder menschlichen Ursprungs, tierischen Ursprungs, beispielsweise von der Maus, oder chimären Ursprungs sein können. Weitere Zielliganden umfassen Dipyridamol, Digitalis, Nifedipin, Apolipoprotein, Low-Density-Lipoproteine (LDL), einschließlich α-LDL-, vLDL und Methyl-LDL, Ryanodin, Endothelin, Komplementrezeptor Typ 1, IgG Fc, Beta-1-adrenergisch, Dihydropyridin, Adenosin, Mineralcorticoid, nikotinisches Acetylcholin und muskarines Acetylcholin, Antikörper gegen den humanen alpha-1A-adrenergen Rezeptor, Pharmazeutika, wie beispielsweise Wirkstoffe, einschließlich den Alpha-1-Antagonisten Prazosin, Antikörper gegen den Anti-Beta-Rezeptor; Wirkstoffe, die an den Anti-beta-Rezeptor binden, antikardiale RyR-Antikörper, Endothelin-1, das ein von Endothelzellen stammendes vasokonstriktorisches Peptid ist, das einen wirksamen positiven inotropen Effekt auf Herzgewebe ausübt (Endothelin-1 bindet an kardiale Sarkolemm-Vesikel), monoklonale Antikörper, die gegen den α-β-Rezeptor des T-Zellrezeptors erzeugt und daher eingesetzt werden, um Zielliganden zu erzeugen, der Komplementhemmer sCR1, Wirkstoffe, Peptide oder Antikörper, die gegen den Dihydropyridin-Rezeptor erzeugt werden, monoklonale Antikörper, die gegen den Interleukin-2-Rezeptor erzeugt werden, können als Zielliganden verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu Bereichen von Myokardgewebe zu leiten, die diesen Rezeptor exprimieren und die unter Entzündungsbedingungen hochreguliert werden können, Zyklosporin, um die Zusammensetzungen in ähnlicher Weise zu Bereichen entzündeten Myokardgewebes zu leiten, Methylisobutylisonitril, Lektine, die an spezifische Zucker auf Membranen von kardialen Myozyten und kardialen Endothelzellen binden, Adrenomedullin (ADM), bei dem es sich um ein endogenes hypotensives und vasorelaxierendes Peptid handelt, atriales natriuretisches Peptid (ANP), natriuretisches Peptid vom C-Typ (CNP), bei dem es sich um ein Peptid mit 22 Aminosäuren handelt, das von Endothelzellen abstammt. und strukturell mit dem atrialen natriuretischen Peptid verwandt, genetisch aber unterschiedlich ist und vasoaktive und antimitogene Aktivität besitzt, Vasonatrin-Peptid (VNP), bei dem es sich um eine Chimäre des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) und dem natriuretischen Peptid vom C-Typ (CNP) handelt, das 27 Aminosäuren umfasst, Thrombin, Endothel-Derived Relaxing Factor (EDRF), neutrale Endopeptidase 1 (NEP-1), kompetitive Inhibitoren von EDRF, einschließlich beispielsweise NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA), Kaliumkanalantagonisten wie beispielsweise Charybdotoxin und Glibenclamid, Antiherz-Antikörper, die bei Patienten mit idiopathischer erweiterter Kardiomyopathie identifiziert werden können, aber vorzugsweise im Myokard keine Zytolyse hervorrufen, Antikörper, die gegen den Adeninnukleotidtranslokator, die verzweigtkettige Ketosäure-Dehydrogenase oder gegen Herzmyosin gerichtet sind, spezifische Antagonisten des Endothelin-A-Rezeptors, die als BQ-123 bezeichnet werden können und Antikörper gegen den Angiotensin-II-Rezeptor.
Zwei der wichtigsten Antigene von Herz-Sarkolemm sind kalziumbindende Glykoproteine, die gemeinsam mit dem Dihydropyridinrezeptor gereinigt werden. Gegen gereinigtes Sarkolemm können Antikörper, einschließlich polyklonale oder monoklonale Antikörper, erzeugt werden. Diese Antikörper können auch als Zielliganden verwendet werden. Aus der Plasmamembran des Sarkolemms können gereinigte Fraktionen der kalziumbindenden Glykoproteine isoliert und anschließend zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. ANP, das als Zielligand verwendet werden kann, lässt sich aus Kulturen von Zellen aus menschlichem Aortaepithel erhalten. ANP befindet sich im Allgemeinen im Epithel, kann aber auch im Endothel- oder Myokardgewebe lokalisiert sein. ANP kann beispielsweise anhand von Rekombinationstechniken sowie durch Synthese des Peptids anhand von Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, die einem Fachmann gut bekannt sind. Es ist auch möglich, einen Antikörper, entweder polyklonal oder monoklonal, zu verwenden, der gegen ANP gerichtet ist. In ähnlicher Weise kann für ein Targeting von Endothel- und/oder Myokardzellen ein gegen ANP gerichtetes Peptid verwendet werden. Als potenzielle Zielliganden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu Myokardgewebe zu leiten, können sowohl die β- als auch die α-Form des atrialen natriuretischen Faktors verwendet werden.
Es können viele verschiedene Zielliganden verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen und insbesondere Vesikelzusammensetzungen zu dem GPIIbIIIa-Rezeptor zu leiten. Zusammensetzungen, die zu dem GPIIbIIIa-Rezeptor geleitet werden, sind sehr geeignet, um ein Targeting von Gefäßthrombosen oder Gerinnseln zu erreichen, und eignen sich für die Diagnose sowie die Behandlung solcher Gerinnsel. Zu solchen Zielliganden gehören beispielsweise Peptide wie Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) (SEQ ID Nr.: 4), Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP) (SEQ ID Nr. 5) und Gly-Pro-Arg-Pro (SEQ ID Nr.: 6). Pentapeptide, welche die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD) enthalten, sind ebenfalls geeignet, einschließlich beispielsweise G4120, bei dem es sich um ein zyklisches Peptid handelt, das die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp (RGD) enthält. Geeignet sind auch Peptide, die von humanem Gerinnungsfaktor XIIIa abstammen, einschließlich beispielsweise Fragmente wie NKLIVRRGQSFYVQIDFSRPYDPRRDLFRVEYVIGRYPQENKGTYIPVPIVSELQSGKWGAKIVMREDRSVRLSIQSSPKCIVGKFRMYVAVWTPYGVLRTSRNPETDTYILFNPWCEDDAVYLDNEKEREEYVLNDIGVIFYGEVNDIKTRSWSYGQF-R' (SEQ ID Nr.: 7), wobei R' -CONH₂- oder -NH₂ ist. Darüber hinaus Peptide, die Fragmente des Faktor-XIIIA-Fragments sind und in ihrer Sequenz die Sequenz NKLIVRRGOSFYVQIDFSRPYDPRRD (SEQ ID Nr.: 8) oder DDAVYLDNEKEREEYVLNDIGVIFYGEVNDIKTRSWSYGQF (SEQ ID. Nr.: 9) enthalten.
Weitere Peptide, die als Zielliganden für ein Targeting des GPIIbIIIa-Rezeptors geeignet sind, umfassen beispielsweise Peptide, welche die Tripeptidsequenz von Arginin-Tyrosin-Asparaginsäure (Arg-Tyr-Asp; auch abgekürzt RGD) umfassen, die vom Amino- bis Carboxy-Terminus verknüpft ist und an die GPIIbIIIa-Bindungsregion auf aktivierten Thrombozyten binden kann. Beispiele solcher Peptide umfassen beispielsweise Peptide der allgemeinen Formel R¹-(X¹)_a-Arg-Tyr-Asp-(Y)_o-(X²)_m-R², wobei jedes von X¹, X² und Y unabhängig ein oder mehrere Aminoreste sein kann, während in bestimmten Fällen bevorzugt ist, dass Y ein anderer als ein Serin- oder Alaninrest ist, und jedes von m, n und o unabhängig 0 oder 1 ist, vorausgesetzt, dass in bestimmten Fällen o 1 ist, wenn m 1 ist, und R¹ eine geschützte oder ungeschützte terminale Aminogruppe ist und R² eine geschützte oder ungeschützte terminale Carboxygruppe ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist X¹ das Peptid Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr (SEQ ID Nr.: 10) und X² ist das Peptid Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr (SEQ ID Nr.: 11). Geeignete Peptide umfassen Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr (SEQ ID Nr. 12) und Ala-Arg-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Asp-Gly-Ala-Gly-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr (SEQ ID Nr.: 13).
Auch synthetische Verbindungen, die eine natürliche Aminosäuresequenz mit synthetischen Aminosäuren kombinieren, können als der Zielligand verwendet werden, wie beispielsweise eine Fibrinogenrezeptorantagonistverbindung, welche die Sequenz XX-Gly-Asp umfasst, wobei XX eine synthetische α-Aminosäure ist, die eine lineare Seitenkette enthält, wie beispielsweise
wobei n + n' 3 ist, AA eine einfache Bindung ist und R ein Phenyl oder ein Benzyl ist; oder wobei n + n' 3 ist, AA eine einfache Bindung und R ein Phenyl oder Benzyl oder -(CH₂)_n-AA-(CH₂)_n'- ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, n' eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist, AA ein Sauerstoff, Schwefel oder eine einfache Bindung ist und R H, C_1-6-Alkyl, ein wahlweise substituiertes Aryl, ein wahlweise substituiertes Arylmethyl oder wahlweise substituiertes Cycloalkyl ist, vorausgesetzt, dass in bestimmten Fällen n + n' etwas anderes als 3 oder 4 ist, wenn AA eine einfache Bindung und R H ist.
Eine andere solche Verbindung umfasst einen Fibrinogenrezeptorantagonisten der Formel
wobei XX eine synthetische α-Aminosäure ist, die eine lineare Seitenkette mit der Formel
ist, wobei n + n' 3 ist, AA eine einfache Bindung ist und R ein Phenyl oder Benzyl oder -(CH₂)_n-AA-(CH₂)_n'- ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, n' eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist, AA ein Sauerstoff, Schwefel oder eine einfache Bindung ist und R H, C_1-6-Alkyl, ein wahlweise substituiertes Cycloalkyl ist, vorausgesetzt, dass in bestimmten Fällen n + n' etwas anderes als 3 oder 4 ist, wenn AA eine einfache Bindung und R H ist, und ZZ eine Folge von 1 bis 4 wahlweise substituierten Aminosäuren ist.
Andere geeignete Peptide zur Verwendung als Zielliganden umfassen beispielsweise „Elegantin", das folgende Sequenz hat: Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Cys-Ala-Asp-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Arg-Phe-Lys-R-R'-Arg-Thr-Ile-Cys-Arg-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-Asp-Asp-Arg-Cys-Thr-Gly-Gln-Ser-Ala-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Gly-Tyr (SEQ ID Nr.: 14), wobei jedes von R und R' unabhängig jede beliebige Aminosäure ist; „Albolabrin", das folgende Sequenz hat: Glu-Ala-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Leu-Pro-Gly-Ala-Gln-Cys-Gly-Glu-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Ser-Phe-Met-Lys-Lys-Gly-Thr-Ile-Cys-Arg-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Ile-Ser-Ala-Gly-Cys-Pro- Arg-Asn-Pro-Leu-His-Ala (SEQ ID Nr.: 15); „Batroxostatin", das folgenden Sequenz hat: Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Thr-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Cys-Ala-Glu-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Arg-Phe-Lys-Gly-Ala-Gly-Lys-Ile-Cys-Arg-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-Asp-Asp-Cys-Thr-Gly-Gln-Ser-Ala-Asp-Cys-Pro-Arg-Phe (SEQ ID Nr.: 16) und „Flavoridin", das folgende Sequenz hat: Gly-Gly-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Glu-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Ala-Gln-Cys-Ala-Asp-Gly-Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Arg-Phe-Lys-R-R'-Arg-Thr-Ile-Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Phe-Pro-Asp-Asp-Arg-Cys-Thr-Gly-Leu-Ser-Ala-Asp-Cys-Pro-Arg-R-Asn-Asp-Leu (SEQ ID Nr.: 17), wobei jedes von R und R unabhängig jede beliebige Aminosäure ist.
Weitere Liganden, die für ein Targeting des GPIIbIIIa-Rezeptors geeignet sind, umfassen synthetische Verbindungen wie beispielsweise Ac-(D)Phe-Pro-boroArg und das zyklische Pseudomimetikum Zyklo(D-2-aminobutyrat-N-methyl-L-arginylglycyl-L-aspartyl-3-aminomethylbenzolsäure)methansulfonatsalz. Peptide, die auch verwendet werden können, umfassen eine Bibliothek von Hexapaptiden, die von Cysteinresten flankiert sind (können zyklische Disulfide bilden), und zyklische Formen von Peptiden mit Disulfidbrücken mit der Sequenz Arg-Gly-Asp oder Lys-Gly-Asp sowie das vom Carboxyterminus abgeleitete Peptid REYVVMWK (SEQ ID Nr.: 18). Bestimmte Matrixglykoproteine wie beispielsweise Thrombospondin sind diesbezüglich ebenfalls geeignet. Weitere geeignete Liganden sind Mitglieder der Serpinfamilie von Serinproteaseinhibitoren wie beispielsweise Plasminogenaktivatorinhibitor Typ 1 (PAI-1).
Im Allgemeinen ist es bevorzugt, als Zielliganden für den GPIIbIIIa-Rezeptor ein Peptid zu verwenden, das von etwa 3 bis etwa 20 Aminosäuren aufweist, wobei Peptide, die von etwa 4 bis etwa 15 Aminosäuren aufweisen, mehr bevorzugt sind. Noch mehr bevorzugt können Zielliganden für den GPIIbIIIa-Rezeptor Peptide umfassen, die von etwa 4 bis etwa 8 Aminosäuren aufweisen, wobei Peptide, die etwa 4 bis etwa 6 Aminosäuren oder etwa 5 Aminosäuren aufweisen, noch mehr bevorzugt sind. Falls gewünscht, können die Peptide zykliert werden, beispielsweise durch (1) kovalente Verknüpfung von Seitenkette zu Seitenkette, einschließlich beispielsweise durch die Bildung einer Disulfid-Verknüpfung über die Oxidation von zwei thiolhaltigen Aminosäuren oder Analoga davon, einschließlich beispielsweise Cystein oder Penicillamin, (2) kovalente Verknüpfung von Ende zu Seitenkette, einschließlich beispielsweise durch Verwendung des Aminoterminus der Aminosäuresequenz und einer Seitenketten-Carboxylatgruppe, wie beispielsweise eine nicht wesentliche Glutaminsäure- oder Asparaginsäuregruppe. Alternativ kann die kovalente Verknüpfung von Ende zu Seitenkette den Carboxylat-Terminus der Aminosäuresequenz und eine Seitenketteamino-, -amidin-, -guanidingruppe oder eine andere Gruppe in der Seitenkette umfassen, die ein nukleophiles Stickstoffatom enthält, wobei solche Seitenkettengruppen beispielsweise Lysin, Arginin, Homoarginin, Homolysin oder dergleichen umfassen, (3) kovalente Verknüpfung von Ende zu Ende, bei denen es sich um kovalente Amidverknüpfungen handelt, oder dergleichen. Solche Prozesse sind einem Fachmann gut bekannt. Darüber hinaus kann „Pseudozyklierung" angewandt werden, bei der eine Zyklierung über nicht-kovalente Interaktionen stattfindet, beispielsweise durch elektrostatische Interaktionen, die eine Faltung der Sekundärstruktur umfassen, um einen Typ von zyklischer Einheit zu bilden. Es wird in Betracht gezogen, dass Metallionen die Induktion einer „pseudozyklischen" Formation unterstützen können. Diese Art von pseudozylischer Formation kann analog zu „Zinkfingern" sein. Wie einem durchschnittlichen Fachmann bekannt ist, umfassen Zinkfinger aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen die Bildung einer Region zwischen einem Zinkion (Zn²⁺) und Cystein, Penicillamin und/oder Homocystein in Form einer Schleife (dem Finger). Im Fall von Homocystein würde sich die RGD-Sequenz an der Spitze des Fingers befinden. Natürlich wird berücksichtigt, dass in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jeder Typ einer stabilisierenden Zyklierung geeignet wäre, solange der Erkennungs- und Bindungspeptidligand wie beispielsweise RGD die richtige Konformation und/oder Topographie beibehält, um an den entsprechenden Rezeptor in Gerinnseln mit einer geeigneten Michaelis-Menten-Konstante (k_M) oder Bindungskonstante zu binden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Konformation" auf die dreidimensionale Organisation des Gerüstes des Peptids, Peptoids oder Pseudopeptids und der Begriff „Topographie" bezieht sich auf die dreidimensionale Organisation der Seitenkette des Peptids, Peptoids oder Pseudopeptids.
Andere geeignete Zielliganden umfassen: Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Phe-Gly-Cys-CONH₂ (SE ID Nr.: 19), Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-CONH₂ (SE ID Nr.: 20), Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Phe-Leu-Asn-Cys-CONH₂ (SE ID Nr.: 21), Ac-Cys-Asn-Thr-Leu-Lys-Gly-Asp-Cys-CONH₂ (SE ID Nr.: 22), Ac-Cys-Asn-Trp-Lys-Arg-Gly-Asp-Cys-CONH₂ (SE ID Nr.: 23) und Ac-Cys-N-methyl-Arg-Gly-Asp-Pen-CONH₂ (SE ID Nr.: 24), wobei sich „Pen" auf Penicillamin (β,β-Dimethylcystein) bezieht.
Weitere Verbindungen, die als Zielliganden verwendet werden können, umfassen Peptide oder Derivate davon, die durch folgende Formel dargestellt sind: A-B-Arg-Gly-Asp-C-D wobei A Prolin, Thioprolin, Hydroxyprolin, Dehydroprolin, 2-Oxo-4-thiazolidincarboxysäure, N-Alkylglycin oder ein Aminosäurederivat der Formel
Tryptophan oder ein Tryptophanderivat der Formel
Pyroglutaminsäure oder 2-Azetidinon-4-carboxysäure ist, B Serin, Glycin, Valin, Alanin, Threonin oder β-Alanin ist, C eine Aminogruppe mit einer hydrophoben funktionellen Gruppe ist und D Hydroxy oder Amino ist, wobei R₁ Wasserstoff, -(CH₂)_pCH₃ oder -CO-(CH₂)_pCH₃ ist, R₂ Wasserstoff oder Alkyl ist, R₃ Wasserstoff oder Alkoxy ist, R₄ Wasserstoff oder Alkyl ist, R₅ Wasserstoff, Amino oder Acylamino ist, m eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, p eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist und q eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist.
Andere geeignete Zielliganden umfassen Peptide, Peptidderivate oder Salze davon mit der Formel: A-B-Arg-Gly-Asp-C-D wobei A Orotinsäure oder Hydroorotinsäure ist, B eine Aminosäure ist, C eine Aminosäure mit einer hydrophoben funktionellen Gruppe ist und D Hydroxy oder Amino ist. In den obigen Verbindungen umfassen Aminosäuren mit hydrophoben funktionellen Gruppen in der Definition von „C" beispielsweise Tryptophan und Phenylalanin.
Verschiedene Peptide, die für den Gebrauch als ein Zielligand in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung geeignet wären, vor allem für ein Targeting von GPIIbIIIa, sind beispielsweise beschrieben in US-Patent Nr. 5,4983601 und der europäischen Patentanmeldung: 0 368 486 A2, 0 382 451 A2 und 0 422 938 B1, deren Offenbarungen hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten sind. Weitere geeignete Zielliganden umfassen beispielsweise konjugierte Peptide, wie beispielsweise Glykokonjugate und Lektine, bei denen es sich um Peptide handelt, die an Zuckereinheiten angebracht sind. Einem Fachmann sind angesichts der vorliegenden Offenbarung weitere Zielliganden bekannt, die, außer den oben beispielhaft genannten, in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Der Zielligand ist durch einen Abstandshalter, beispielsweise hydrophile Polymere, wie beispielsweise die hierin beschriebenen hydrophilen Polymere, vorzugsweise Polyethylenglycol, vorzugsweise kovalent an die Oberfläche des stabilisierenden Materials oder Vesikels gebunden. Bevorzugte Molekulargewichte der Polymere liegen im Bereich von 1.000 Da bis 10.000 Da, wobei 500 Da am meisten bevorzugt ist. Vorzugsweise ist das Polymer bifunktionell, wobei der Zielligand an einen Terminus des Polymers gebunden ist. Der Zielligand liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 20 Mol-% der äußeren Bestandteile des Vesikels. Im Fall von gasgefüllten Lipidvesikeln liegt diese Menge vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und etwa 10 Mol-%, wobei etwa 1 bis etwa 10 Mol-% am meisten bevorzugt sind. Das genaue Verhältnis richtet sich dem jeweiligen Zielliganden.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Zielliganden gegen Lymphozyten gerichtet, bei denen es sich um T-Zellen oder B-Zellen handeln kann, wobei T-Zellen das bevorzugte Ziel sind. Je nach dem Zielligand kann die Zusammensetzung zu einer oder mehr Klassen oder Klonen von T-Zellen geleitet werden. Zur Auswahl einer Klasse von Ziellymphozyten wird ein Zielligand mit eine spezifischen Affinität für diese Klasse eingesetzt. Beispielsweise kann ein Anti-CD4-Antikörper verwendet werden, um die Klasse von T-Zellen auszuwählen, die CD4-Rezeptoren aufweisen, ein Anti-CD8-Antikörper kann verwendet werden, um die Klasse von T-Zellen auszuwählen, die CD8-Rezeptoren aufweisen, ein Anti-CD34-Antikörper verwendet werden, um die Klasse von T-Zellen auszuwählen, die CD34-Rezeptoren aufweisen, etc. Vorzugsweise wird ein niedermolekularer Ligand eingesetzt, z. B. ein Fab- oder ein Peptidfragment. Beispielsweise kann ein OKT3-Antikörper oder ein OKT3-Antikörperfragment verwendet werden. Wenn ein Rezeptor für eine Klasse von T-Zellen oder Klone von T-Zellen ausgewählt wird, wird die Zusammensetzung zu dieser Klasse von Zellen transportiert. Die Verwendung von Peptiden, die von HLA abstammen, erlaubt beispielsweise die Auswahl von Zielklonen von Zellen, die Reaktivität gegenüber HLA-Proteinen entwickeln. Weitere geeignete Zusammensetzungen und Zielliganden für ein Targeting von B-Zellen und T-Zellen sind in US-Patent Nr. 5,620,689 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist.
Die folgende Tabelle veranschaulicht Liganden des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und deren Rezeptoren in der Klasse der T-Zellen, für die sie Affinität aufweisen. Alle Liganden, T-Zell-Rezeptoren und Peptidsequenzen in der Tabelle unten können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. TABELLE 2: MHC-Liganden und T-Zell-Rezeptoren

* Ein-Buchstaben-Code für Aminosäuren. Zusammengefasst aus Fremont et al., Current Opinion in Immunology. (1996) 8: 93–100, Seite 96; Tabelle 2.

Ein weiterer wichtiger Bereich für eine Zielabgabe umfasst das Interleukin-2 (IL-2)-System. IL-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor, der nach antigen- oder mitogeninduzierter Stimulation lymphoider Zellen produziert wird. Unter den Zelltypen, die IL-2 produzieren, sind CD4^–- und CD8⁺-T-Zellen und große granuläre Lymphozyten sowie bestimmte T-Zell-Tumoren. IL-2-Rezeptoren sind Glykoproteine, die auf ansprechenden Zellen exprimiert sind. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung sind sie erwähnenswert, da sie durch Endozytose leicht in Lysosomen eingeschlossen werden, wenn sie an IL-2 binden. Der letztendliche Effekt dieser Endozytose richtet sich nach der Zielzelle, aber zu den erwähnenswerten in-vivo-Effekten gehört die Regression transplantierbarer Maustumore, humaner Melanome oder von Nierenzellkrebs. IL-2 wurde auch für antibakterielle und antivirale Therapien vorgeschlagen und spielt eine Rolle bei der Allograft-Abstoßung. Neben IL-2-Rezeptoren umfassen bevorzugte Ziele den Anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper, natürliches IL-2 und ein IL-2-Fragment eines 20mer-Peptids oder kleiner, die durch Phagendisplay hergestellt wurden und an den IL-2-Rezeptor binden.
Des Weiteren kann ein IL-2-Peptidfragment, das Bindungsaffinität für IL-2-Rezeptoren aufweist, entweder durch direkte Anbringung an eine reaktive Einheit auf dem stabilisierenden Material oder über ein Abstandshalter- oder Linkermolekül mit einem reaktiven Ende wie beispielsweise einer funktionellen Amin-, Hydroxyl- oder Carboxylsäuregruppe eingebaut werden. Solche Linker sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und können zwischen 3 und 20 Aminosäureresten umfassen. Alternativ können D- Aminosäuren oder derivatisierte Aminosäuren verwendet werden, die Proteolyse in dem Zielgewebe vermeiden.
Weitere Systeme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen IgM-vermittelte Endozytose in B-Zellen oder eine Variante der oben beschriebenen Ligand-Rezeptor-Interaktionen, wobei der T-Zell-Rezeptor CD2 ist und der Ligand lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen 3 (LFA-3) ist, wie beispielsweise von Wallner et al., J. Experimental Med. 166: 923 (1987) beschrieben.
Der Zielligand kann auf unterschiedliche Weise in die vorliegenden stabilisierenden Materialien eingebaut werden. Im Allgemeinen kann der Zielligand in die vorliegenden stabilisierenden Materialien eingebaut werden, indem er kovalent oder nicht-kovalent mit einem oder mehr der stabilisierenden Materialien, die in den Zusammensetzungen enthalten sind, assoziiert wird, einschließlich beispielsweise die Lipide, Proteine, Polymere, Tenside und/oder zusätzlichen stabilisierenden Materialien. In bevorzugter Form ist der Zielligand kovalent mit einem oder mehr der zuvor erwähnten, in den vorliegenden stabilisierenden Materialien enthaltenen Materialien assoziiert. Bevorzugte stabilisierende Materialien der vorliegenden Erfindung umfassen Lipid-, Protein-, Polymer- oder Tensidverbindungen. In diesen Zusammensetzungen sind die Zielliganden bevorzugt kovalent mit den stabilisierenden Materialien assoziiert.
Beispielhafte kovalente Bindungen, durch welche die Zielliganden mit den stabilisierenden Materialien assoziiert sind, umfassen beispielsweise Maleimid, Amid (-CONH-), Thioamid (-CSNH-), Ether (ROR'), wobei R und R' gleich oder unterschiedlich sein können und nicht Wasserstoff sind), Ester (-COO-); Thioester (-COS-), -O-, -S-, -S_n-, wobei n größer als 1 ist, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 8 und mehr bevorzugt etwa 2, Carbamate, -NH-, -NR-, wobei R Alkyl ist, beispielsweise Alkyl mit 1 bis etwa 4 Kohlenstoffen, Urethan und substituiertes Imidat und Kombinationen von zwei oder mehr davon. Kovalente Bindungen zwischen Zielliganden und beispielsweise Lipiden können erreicht werden, indem Moleküle verwendet werden, die als Abstandshalter wirken können, um die konformationelle und topographische Flexibilität des Liganden zu erhöhen. Solche Abstandshalter umfassen beispielsweise Bernsteinsäure, 1,6-Hexandionsäure, 1,8-Octandionsäure und dergleichen sowie modifizierte Aminosäuren wie beispielsweise 6-Aminohexansäure, 4-Aminobuttersäure und dergleichen. Darüber hinaus kann im Fall von Zielliganden, die Peptideinheiten umfassen, Seitenkette-zu-Seitenkette-Vernetzung durch Seitenkette-zu-Ende-Vernetzung und/oder Ende-zu-Ende-Vernetzung ergänzt werden. Um ähnliche Ziele zu erreichen, können auch kleine Abstandshaltermoleküle wie beispielsweise Dimethylsuberimidat verwendet werden. Es können auch Mittel, einschließlich solcher, die in Reaktionen vom Typ Schiffsche Base verwendet werden, wie beispielsweise Glutaraldehyd, verwendet werden. Die Schiffschen Basenverknüpfungen, bei denen es sich um reversible Verknüpfungen handeln kann, können durch Verwendung reduktiver Aminierungsverfahren zu permanenteren kovalenten Verknüpfungen gemacht werden. Dies kann beispielsweise chemische Reduktionsmittel wie beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid-Reduktionsmittel oder deren schwächere Analoga, einschließlich Lithiumaluminiumdiisobutylhydrid (DIBAL), Natriumborhydrid (NaBH₄) oder Natriumcyanoborhydrid (NaBH₃CN), umfassen.
Die kovalente Verknüpfung der Zielliganden mit den stabilisierenden Materialien in den vorliegenden Zusammensetzungen kann mittels organischer Synthesetechniken erreicht werden, die einem durchschnittlichen Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig sind. Beispielsweise können die Zielliganden mittels gut bekannter Kopplungs- oder Aktivierungsmittel mit den stabilisierenden Materialien verknüpft werden. Wie einem Fachmann bekannt ist, sind Aktivierungsmittel im Allgemeinen elektrophil, was verwendet werden kann, um die Bildung einer kovalenten Bindung herbeizuführen. Geeignete Aktivierungsmittel, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise Carbonyldiimidazol (CDI), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid (DIC), Methylsulfonylchlorid, Castro-Reagenz und Diphenylphosphorylchlorid.
Die kovalenten Bindungen können Vernetzung und/oder Polymerisation umfassen. Vernetzung bezieht sich vorzugsweise auf die Anbringung von zwei Ketten von Polymermolekülen durch Brücken, die entweder aus einem Element, einer Gruppe oder einer Verbindung zusammengesetzt sind, die bestimmte Kohlenstoffatome der Ketten durch kovalente chemische Bindungen verbinden. Eine Vernetzung kann beispielsweise in Polypeptiden stattfinden, die durch die Disulfidbrücken des Cystinrestes verbunden sind. Vernetzung kann beispielsweise erreicht werden, indem (1) eine chemische Substanz (Vernetzungsmittel) hinzugefügt und die Mischung Wärme ausgesetzt wird, oder indem (2) ein Polymer einer energiereichen Strahlung unterzogen wird. Verschiedene Vernetzungsmittel oder „Leinen" unterschiedlicher Länge und/oder Funktionalität sind beispielsweise von Lumbland, Techniques in Protein Modification, CRC Press, Inc., Ann Arbor, MI, S. 249–68 (1995), beschrieben. Beispielhafte Vernetzungsmittel umfassen beispielsweise 3,3'-Dithio-bis(succinimidylpropionat), Dimethylsuberimidat und Varianten davon, basierend auf der Länge der Kohlenwasserstoffe und Bis-N-maleimido-1,8-octan.
Des Weiteren können die Zielliganden mit den Lipiden, Proteinen, Polymeren oder Tensiden oder anderen stabilisierenden Materialien über eine Verknüpfungsgruppe verknüpft oder an diese angebracht sein. Es sind verschiedene Verknüpfungsgruppen verfügbar und sind einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig. Die Verknüpfungsgruppe umfasst vorzugsweise ein hydrophiles Polymer. Geeignete hydrophile Polymere umfassen beispielsweise Polyalkylenoxide wie beispielsweise Polyethylenglycol (PEG) und Polypropylenglycol (PPG), Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylmethylether, Polyacrylamide wie beispielsweise Polymethacrylamide, Polydimethylacrylamide und Polyhydroxypropylmethacrylamide, Polyhydroxyethylacrylate, Polyhydroxypropylmethacrylate, Polymethyloxazoline, Polyethyloxazoline, Polyhydroxyethyloxazoline, Polyhydroxypropyloxazoline, Polyvinylalkohole, Polyphosphazene, Poly(hydroxyalkylcarbonsäuren), Polyoxazolidine, Polyaspartamid und Polymere von Sialinsäure (Polysialine). Die hydrophilen Polymere sind vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus PEG, PPG, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon und Copolymeren davon ausgewählt, wobei PEG- und PPG-Polymere mehr bevorzugt sind und PEG-Polymere noch mehr bevorzugt sind.
In Ausführungsformen, die Lipidzusammensetzungen umfassen, die polymertragende Lipide umfassen, einschließlich beispielsweise DPPE-PEG, kann der Zielligand direkt mit dem an dem Lipid angebrachten Polymer verknüpft sein, beispielsweise um ein Konjugat von DPPE-PEG-TL bereit zu stellen, wobei TL ein Zielligand ist. Unter Verwendung des Beispiels DPPE-PEG wie beispielsweise DPPE-PEG5000 kann das zuvor erwähnte Konjugat daher als DPPE-PEG5000-TL dargestellt werden. Das als eine Verknüpfungsgruppe verwendete hydrophile Polymer ist vorzugsweise ein bifunktionelles Polymer, beispielsweise bifunktionelles PEG wie beispielsweise Diamino-PEG. In diesem Fall ist ein Ende der PEG-Gruppe beispielsweise mit einer Lipidverbindung verknüpft und an dem freien Ende über eine Amidverknüpfung an den Zielliganden gebunden. Es kann auch ein hydrophiles Polymer, beispielsweise PEG, verwendet werden, das an einem Ende mit einer terminalen Carboxylatgruppe und an dem anderen Ende mit einer terminalen Aminogruppe substituiert ist. Diese letzteren bifunktionellen hydrophilen Polymere sind bevorzugt, da sie verschiedene Ähnlichkeiten zu Aminosäuren besitzen.
Es können Standardpeptidverfahren verwendet werden, um den Zielliganden mit dem Lipid zu verknüpfen, wenn Linkergruppen mit zwei einmaligen terminalen funktionellen Gruppen verwendet werden. Bifunktionelle hydrophile Polymere und vor allem bifunktionelle PEGs können mit organischen Standardsyntheseverfahren synthetisiert werden. Darüber hinaus sind viele dieser Materialien kommerziell erhältlich, wie beispielsweise α-Amino-ω-carboxy-PEG, das von Shearwater Polymers (Huntsville, AL, USA) kommerziell erhältlich ist. Ein Vorteil der Verwendung eines PEG-Materials als Verknüpfungsgruppe ist, dass die Größe des PEG derart variiert werden kann, dass die Anzahl an monomeren Untereinheiten von Ethylenglycol nur beispielsweise etwa 5 oder beispielsweise etwa 500 oder noch mehr betragen kann. Entsprechend kann die „Leine" oder Länge der Verknüpfung wie gewünscht variiert werden. Dies kann wichtig sein, beispielsweise je nachdem welcher Zielligand verwendet wird. Beispielsweise kann ein Zielligand, der ein großes Proteinmolekül umfasst, eine kurze Leine erfordern, um so ein membrangebundenes Protein zu simulieren. Eine kurze Leine würde es einem Vesikel außerdem erlauben, dicht an der Zelle zu bleiben.
Eine andere geeignete Verknüpfungsgruppe, die eine kurze Leine bereit stellen kann, ist Glycerinaldehyd. Glycerinaldehyd kann über eine Schiffsche-Base-Reaktion beispielsweise an DPPE gebunden werden. Anschließende Amadori-Neuanordnungen können eine im Wesentlichen kurze Verknüpfungsgruppe bereitstellen. Das β-Carbonyl der Schiffschen Base kann dann mit einem Lysin oder Arginin des Zielproteins oder -peptids reagieren, um das Ziellipid zu bilden.
Die in den vorliegenden stabilisierenden Materialien verwendeten Verbindungen können darüber hinaus verschiedene funktionelle Gruppen enthalten, wie beispielsweise Hydroxy-, Thio- und Amingruppen, die mit einer Carboxysäure oder einem Carboxysäurederivat des hydrophilen polymeren Linkers reagieren kann, wobei geeignete Kopplungsbedingungen verwendet werden, die einem durchschnittlichen Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig sind. Nachdem die Carboxysäuregruppe (oder deren Derivat) mit der funktionellen Gruppe, beispielsweise einer Hydroxy-, Thio- und Amingruppe, reagiert, um eine Ester-, Thioester- oder Amidgruppe zu bilden, kann der Schutz jeder geschützten funktionellen Gruppe entfernt werden, indem Verfahren verwendet werden, die einem Fachmann gut bekannt sind. Der Begriff „Schutzgruppe" bezieht sich auf jedes Element, das verwendet werden kann, um die Reaktion einer funktionellen Gruppe zu blockieren, und das wie gewünscht entfernt werden kann, um die ungeschützte funktionelle Gruppe zu erhalten. Es kann Jede aus einer Reihe unterschiedlicher Schutzgruppen verwendet werden und diese variieren, je nachdem, beispielsweise, ob die zu schützende Gruppe eine Amin-, Hydroxyl- oder Carboxyleinheit ist. Wenn die funktionelle Gruppe eine Hydroxylgruppe ist, umfassen geeignete Schutzgruppen beispielsweise bestimmte Ether, Ester und Carbonate. Solche Schutzgruppen sind beispielsweise in Greene, TW und Wuts, PGM „Protective Groups in Organic Synthesis" John Wiley, New York, 2. Auflage (1991) beschrieben, dessen Offenbarung hierin hiermit in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist. Schutzgruppen für Amingruppen umfassen beispielsweise t-Butyloxycarbonyl (Boc), Allyloxycarbonyl (Alloc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), o-Nitrobenzyloxycarbonyl und Trifluoracetat (TFA).
Amingruppen, die beispielsweise an einem Gerüst eines Polymers vorhanden sind, das in den Vesikeln enthalten ist, können durch Bildung einer Schiffschen Base an Amingruppen auf einem hydrophilen Verknüpfungspolymer gekoppelt werden, beispielsweise indem Kopplungsmittel wie Glutaraldehyd verwendet werden. Ein Beispiel dieser Kopplung ist beschrieben von Allcock et al., Macromolecules, 19(6): 1502 (1986). Wenn beispielsweise Vesikel aus Polylysin formuliert werden, können freie Aminogruppen auf der Oberfläche der Vesikel frei liegen und diese freien Aminogruppen können wie oben beschrieben aktiviert werden. Die aktivierten Aminogruppen können wiederum für die Kopplung an ein funktionalisiertes hydrophiles Polymer verwendet werden, wie beispielsweise α-Amino-ω-hydroxy-PEG, in dem die ω-Hydroxygruppe von einer Carbonatgruppe geschützt ist. Nach Abschluss der Reaktion kann die Carbonatgruppe gespalten werden, wodurch die terminale Hydroxylgruppe für die Reaktion mit einem geeigneten Zielliganden aktiviert werden kann. In bestimmten Ausführungsformen kann die Oberfläche eines Vesikels beispielsweise durch Verdrängung von Chloratomen in chlorhaltigen Phosphazenresten wie Polydichlorphosphazen aktiviert werden. Anschließende Zugabe eines Zielliganden und das Abschwächen (Quenchen) der verbleibenden Chloridgruppen mit Wasser oder wässrigem Methanol ergibt das gekoppelte Produkt.
Darüber hinaus kann Poly(diphenoxyphosphazen) synthetisiert (Allcock et al., Macromolecules, 19(6): 1502–1508 (1986)) und beispielsweise auf DPPE immobilisiert werden, gefolgt von Nitrierung der Phenoxyeinheiten durch Zugabe einer Mischung aus Salpetersäure und Säureanhydrid. Die nachfolgenden Nitrogruppen können dann beispielsweise durch (1) Behandlung mit Cyanogenbromid in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 11), gefolgt von Zugabe eines Zielliganden, der eine freie Aminoeinheit enthält, um ein gekoppeltes Harnstoffanalog zu erzeugen, (2) Bildung eines Diazoniumsalzes unter Verwendung von Natriumnitrit/HCl, gefolgt von der Zugabe des Zielliganden, um einen gekoppelten Liganden zu bilden, und (3) die Verwendung eines Dialdehyds, beispielsweise von Glutaraldehyd wie oben beschrieben, um eine Schiffsche Base zu bilden, aktiviert werden. Nach der Verknüpfung des DPPE mit dem hydrophilen Polymer und dem Zielliganden können die Vesikel anhand der hierin beschriebenen Verfahren formuliert werden.
Aldehydgruppen auf Polymeren können wie oben beschrieben mit Aminen gekoppelt werden, um eine Schiffsche Base zu bilden. Ein Beispiel dieser Kopplungsreaktion ist von Allcock et al., Macromolecules, 14: 1616 (1981) beschrieben.
In den obigen Verfahren wird das Polymer oder der Terminus des Lipids, beispielsweise Phosphatidylglycerol oder Phosphatidylethanolamin vorzugsweise aktiviert und mit dem hydrophilen polymeren Linker gekoppelt, dessen Terminus in geeigneter Weise blockiert worden ist. Als ein Beispiel dieser Strategie kann α-Amino-ω-hydroxy-PEG4000, das eine t-Boc-geschützte terminale Aminogruppe und ein freies Carboxylatende aufweist, mit 1,1'-Carbonyldiimidazol in Gegenwart von Hydroxybenzotriazol in N-Methylpyrrolidon aktiviert werden. Nach der Zugabe von Phosphatidylethanolamin kann die t-Boc-Gruppe mittels Trifluoressigsäure (TFA) entfernt werden, wobei das freie Amin zurück bleibt. Das Amin kann dann mit einem Zielliganden umgesetzt werden, der beispielsweise ein Peptid, Protein, Alkaloid oder eine andere Einheit umfasst, indem der Ligand auf ähnliche Weise aktiviert wird, um das Lipid-Linker-Zielligand-Konjugat bereit zu stellen. Außer den oben beispielhaft genannten können weitere Strategien verwendet werden, um die Lipid-Linker-Zielligand-Konjugate herzustellen. Im Allgemeinen verwenden diese Verfahren Synthesestrategien, die einem Fachmann der organischen Synthesechemie gut bekannt sind.
Wie einem durchschnittlichen Fachmann bekannt ist, umfassen Immunglobuline typischerweise eine flexible Region, der als „Scharnier"-Region identifiziert ist. Siehe z. B. „Concise Encyclopedia of Biochemistry", Zweite Auflage, Walter de Gruyter & Co. S. 282–283 (1988). Fab'-Fragmente können unter Verwendung der gut definierten Stellen der Thiole in der Scharnierregion mit den Lipiden, Polymeren, Proteinen und/oder Vesikeln verknüpft werden. Dies ist eine bevorzugte Region zum Koppeln von Fab'-Fragmenten, die sich die mögliche Bindungsstelle von der Antigenerkennungsstelle entfernt befindet. Im Allgemeinen kann es schwierig sein, die Thiole der Scharniergruppe zu verwenden, es sei denn, sie sind angemessen präpariert. Insbesondere, wie von Shahinian et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1239: 157–167 (1995) ausgeführt, kann es wichtig sein, die Thiolgruppen zu reduzieren, so dass sie für eine Kopplung, beispielsweise an von Maleimid derivatisierte Verknüpfungsgruppen, zur Verfügung stehen. Beispiele häufig verwendeter Reduktionsmittel sind Ethandithiol, Mercaptoethanol, Mercaptoethylamin oder das häufiger verwendete Dithiothreitol, das im Allgemeinen als Cleland-Reagenz bezeichnet wird. Es wird darauf hingewiesen, dass bei Verwendung bestimmter Reduktionsmittel wie beispielsweise Dithiothreitol Vorsicht angezeigt ist, da es zu einer Überreduktion kommen kann. In Verbindung mit Proteinen, deren Aktivität oder Bindungskapazität aufgrund einer Überreduktion und anschließende Denaturierung oder Konformationsänderung beeinträchtigt werden kann, ist eine diskriminierende Verwendung von Reduktionsmitteln erforderlich.
F(ab')₂-Antikörperfragmente können hergestellt werden, indem die Antikörper für 4 Std. bei 37°C mit Pepsin (60 μg/ml) in 0,1 M Natriumacetat (pH 4,2) inkubiert werden. Der Verdau wird beendet, indem 2 M Tris (pH 8,8) bis zu einer Endkonzentration von 80 mM zugegeben wird. Die F(ab')₂-Fragmente werden anschließend durch Zentrifugation (10.000 × g, 30 Min., 4°C) erhalten. Der Überstand kann dann bei 4°C gegen 150 mM NaCl, 20 mM Phosphat, bei pH 7,0 dialysiert werden. Dieser kann anschließend auf einer Säule mit Protein-A-Sepharose-CL-4B chromatographiert werden, um etwaiges unverdautes IgG zu entfernen. Die Fab'-Fragmente können dann hergestellt werden, indem die Lösungen vor Gebrauch ausführlich entgast und mit Stickstoff gespült werden. Die Fab'-Fragmente können in einer Konzentration von 5 mg/ml bereitgestellt und unter Argon in 30 mM Cystein reduziert werden. Alternativ kann Cysteamin verwendet werden. 100 mM Tris, pH 7,6, kann als ein Puffer für 15 Min. bei 37°C verwendet werden. Die Lösungen können dann mit einem gleichen Volumen des geeigneten experimentellen Puffers zweifach verdünnt werden und durch eine 0,4-ml-Spin-Säule mit Bio-Gel P-6DG zentrifuziert werden. Die resultierenden Fab'-Fragmente sind hinsichtlich ihrer Kopplung an Maleimid-Linker effektiver. Dasselbe Verfahren kann für andere Makromoleküle angewandt werden, die Cysteinreste zur Kopplung mit beispielsweise den Maleimid-Abstandshaltern enthalten. Es können auch Peptide verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten einen Cysteinrest. Wenn die Peptide nicht frisch hergestellt worden sind und eine Möglichkeit der Oxidation von Cysteinresten innerhalb der Peptidstruktur besteht, kann es erforderlich sein, die Thiolgruppe durch Anwendung des oben beschriebenen Ansatzes zu regenerieren.
Weitere Linker umfassen andere Derivate von Lipiden, die für die Kopplung an einen bifunktionellen Abstandshalter geeignet sind. Beispielsweise kann Phosphatidylethanolamin (PE) an ein bifunktionelles Mittel gekoppelt werden. Unter Anderem können N-Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrat (SMPB) und N-Succinimidyl-3-(p-pyridyldithiol)propionat (SPDP), N-Succinimidyl-trans-4-(N-maleimidylmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) und N-Succinimidyl-3-maleimidylbenzoat (SMB) verwendet werden, um beispielsweise die funktionalisierten Lipide MPB-PE und PDP-PE herzustellen.
Das freie Ende des hydrophilen Abstandshalters wie beispielsweise Polyethylenglycolethylamin, das eine reaktive Gruppe wie beispielsweise eine Amin- oder Hydroxylgruppe enthält, kann verwendet werden, um einen Cofaktor oder einen anderen Zielliganden zu binden. Beispielsweise kann Polyethylenglycolethylamin mit N-Succinimidylbiotin oder p-Nitrophenylbiotin umgesetzt werden, um eine Kopplungsgruppe in den Abstandshalter einzuführen. Beispielsweise kann Biotin mit dem Abstandshalter gekoppelt werden, der Proteine nicht-kovalent bindet. Als Beispiel kann MPB-PEG-DPPE wie folgt synthetisiert werden. DPPE-PEG mit einer freien Aminogruppe am Terminus des PEG wird wie zuvor beschrieben bereitgestellt. Anschließend kann die Synthese des SMPB:PEG-DPPE mit 1 Äquivalent Triethylamin in Chloroform bei einem Molverhältnis von 1:5 SMPB:DPPE-PEG durchgeführt werden. Nach 3 Stunden wird die Reaktionsmischung unter Argon bis zur Trockenheit verdampft. Überschüssiges, nicht umgesetztes SMPB und größere Nebenprodukte werden durch präparative Dünnschichtchromatographie (TLC, Silica-Gel, entwickelt mit 50% Aceton in Chloroform) entfernt. Der obere Anteil der Lipidbande kann mit etwa 20–30% Methanol in Chloroform (V:V) aus dem Silica extrahiert werden, was zu der Isolierung von reinem intaktem MPB-PEG-DPPE führt. Anschließend kann Streptavidin an Proteine gekoppelt werden, so dass die Proteine ihrerseits an das MPB-PEG-DPPE gekoppelt werden können. In Kürze beschrieben, wird SPDP bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit Streptavidin inkubiert und nicht umgesetztes SPDP chromatographisch entfernt. Der Reaktion wird Dithiothreitol (DTT) zugegeben und 10 Minuten später 2-Thiopyridon bei einer Konzentration von 343 nM. Der Rest der Reaktionsmischung wird mit DTT reduziert (25 mM für 10 Min.). Das thiolierte Produkt wird durch Gelausschluss isoliert. Die resultierenden Streptavidin-markierten Proteine können verwendet werden, um die an die Lipideinheiten befestigten, biotinylierten Abstandshalter zu binden.
Weitere geeignete Verfahren zum Verknüpfen des Zielliganden an die stabilisierenden Materialien der vorliegenden Erfindung und zum Aktivieren des freien Endes der stabilisierenden Materialien sind von Allen et al., US-Patent Nr. 5,620,689 beschrieben.
Die Zielverbindungen der vorliegenden Erfindung sind in Zusammensetzungen enthalten, die sich zur Bildung von Zielemulsionen und/oder Zielvesikeln verwenden lassen, einschließlich beispielsweise Zielemulsionen, Zielmizellen, Zielliposomen, Zielalbumin-beschichtete Mikrokügelchen, Zielpolymer-beschichtete Mikrokügelchen, Zielchochleate und dergleichen. Der Zielligand, der an den Verbindungen befestigt ist, aus denen die Vesikel hergestellt sind, kann beispielsweise von der Oberfläche der Vesikel nach außen gerichtet sein. Damit wird ein Zielvesikel bereitgestellt, das für ein Targeting von Rezeptoren und Geweben verwendet werden kann.
In bestimmten Ausführungsformen können die Zielliganden über nicht-kovalente Assoziationen in die vorliegenden stabilisierenden Materialien eingeschlossen sein. Wie einem Fachmann bekannt ist, ist eine nicht-kovalente Assoziation im Allgemeinen eine Funktion verschiedener Faktoren, einschließlich beispielsweise der Polarität der beteiligten Moleküle, der Ladung (positiv oder negativ), falls vorhanden, der beteiligten Moleküle, dem Ausmaß der Wasserstoffbindung durch das molekulare Netzwerk und dergleichen. Nicht-kovalente Bindungen sind vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Ionenwechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken, hydrophilen Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Kräften und beliebigen Kombinationen davon besteht. Nicht-kovalente Wechselwirkungen können eingesetzt werden, um den Zielliganden an das Lipid oder direkt an die Oberfläche eines Vesikels zu binden. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz Gly-Gly-His an die Oberfläche eines Vesikels gebunden werden, vorzugsweise mit einem Linker wie beispielsweise PEG, und es kann ein Kupfer-, Eisen- oder Vanadylion hinzuzugefügt werden. Proteine wie beispielsweise Antikörper, die Histidinreste enthalten, können dann über eine Ionenbrücke zu dem Kupferion an das Vesikel binden, wie in US-Patent Nr. 5,466,467 beschrieben ist. Ein Beispiel einer Wasserstoffbrücke umfasst Cardiolipin-Lipide, die in die Lipidzusammensetzungen eingeschlossen werden können.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die Vesikel umfassen können, können Veränderungen, beispielsweise des pH-Werts und/oder der Temperatur in vivo eingesetzt werden, um eine Veränderung der Stelle in den Zielliganden zu fördern, beispielsweise von einer Stelle im Innern des Vesikels zu einer Stelle am Äußeren der Außenwand des Vesikels. Dies kann eine Bindung des Zielliganden an Zielorte fördern, beispielsweise an Rezeptoren, wie beispielsweise Lymphozyten, und Geweben, einschließlich myokardiale, endotheliale und epitheliale Zellen, da die Wahrscheinlichkeit größer ist, dass der Zielligand solchen Zielorten ausgesetzt ist. Darüber hinaus kann energiereicher Ultraschall verwendet werden, um ein Aufbrechen der Vesikel zu fördern. Auch dies kann den Zielliganden der gewünschten Bindungsstelle aussetzen.
Als ein Beispiel kann ein Zielligand, der in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist, folgende Formel aufweisen: L-P-T wobei L ein Lipid, Protein, Polymer, Kohlenhydrat, Tensid, photoaktives Mittel oder dergleichen ist; P ein hydrophiles Polymer ist und T ein Zielligand ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist L ein Lipid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lecithinen, Phosphatidylcholinen, Phosphatidylserinen, Phosphatidylinositolen, Cardiolipinen, Cholesterinen, Cholesterolaminen, Lysophosphatiden, Erythrosphingosinen, Sphingomyelinen, Ceramiden, Cerebrosiden, gesättigten Phospholipiden, ungesättigten Phospholipiden und Krill-Phospholipiden besteht. Mehr bevorzugt ist L ein Lipid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lecithinen, Phosphatidylcholinen, Phosphatidylserinen und Phosphatidylinositolen besteht. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist L ein Lipid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholinen, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminen, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerolen)], 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphaten, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-[phosphoserinen), Lysophosphatidylcholinen, Lysophosphatidylglycerolen, 1,2-Diacyl-sn-glycerolen, 1,2-Diacylethylenglycerolen, N-(n-Caproylamin)-1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminen, N-Succinyl-1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminen, N-Glutaryl-1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminen und N-Dodecanyl-1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminen besteht. Mehr bevorzugt ist L ein Lipid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholinen, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminen, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerolen)], Diacyl-sn-glycero-3-phosphaten, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-[phosphoserinen), Lysophosphatidylcholinen, Lysophosphatidylglycerolen und 1,2-Diacyl-sn-glycerolen besteht.
In anderen Ausführungsformen ist L ein Protein, das Albumin umfasst.
In noch weiteren Ausführungsformen ist L ein Polymer, das synthetische Polymere oder Copolymere umfasst, die aus Monomeren hergestellt sind, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Acrylsäure, Methacrylsäure, Ethylenimin, Crotonsäure, Acrylamid, Ethylacrylat, Methylmethacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat, Milchsäure, Glycolsäure, ε-Caprolacton, Acrolein, Cyanoacrylat, Bisphenol A, Epichlorhydrin, Hydroxyalkylacrylaten, Siloxan, Dimethylsiloxan, Ethylenoxid, Propylenoxid, Ethylenglycol, Hydroxyalkylmethacrylaten, N-substituierten Acrylamiden, N-substituierten Methacrylamiden, N-Vinyl-2-pyrrolidon, 2,4-Pentadien-1-ol, Vinylacetat, Acrylonitril, Styrol, p-Aminostyrol, p-Aminobenzylstyrol, Natriumstyrolsulfonat, Natrium-2-sulfoxyethylmethacrylat, Vinylpyridin, Aminoethylmethacrylaten, 2-Methacryloyloxytrimethylammoniumchlorid und Polyphosphazen besteht. Bevorzugt sind auch Verbindungen, bei denen L ein Polymer ist, das synthetische Polymere oder Copolymere umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Polyacrylsäure, Polyethylenimin, Polymethacrylsäure, Polymethylmethacrylat, Polysiloxan, Polydimethylsiloxan, Polymilchsäure, Poly(ε-caprolacton), Epoxidharz, Poly(ethylenoxid), Poly(propylenoxid), Poly(ethylenglycol), Polyamid, Polyvinyliden-Polyacrylonitril, Polyvinyliden-Polyacrylonitril-Polymethylmethacrylat und Polystyrol-Polyacrylonitril besteht. Polyvinyliden-Polyacrylonitril-Copolymer ist von diesen Polymeren bevorzugt.
In anderen Ausführungsformen ist L ein Tensid, vorzugsweise ein fluoriertes Tensid.
In den obigen Verbindungen ist P ein hydrophiles Polymer. Vorzugsweise ist P ein hydrophiles Polymer, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyalkylenoxiden, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidonen, Polyacrylamiden, Polymethacrylamiden, Polyphosphazenen, Phosphazen, Poly(hydroxyalkylcarbonsäuren) und Polyoxazolidinen besteht. Mehr bevorzugt ist P ein Polyalkylenoxid-Polymer, wobei Polyethylenglycol und Polypropylenglycol noch mehr bevorzugt sind und Polyethylenglycol besonders bevorzugt ist.
In der obigen Formel ist T ein Zielligand. Vorzugsweise ist T ein hierin beschriebener Zielligand, einschließlich Proteine, Lipoproteine, Glycolipide, Antikörper, Peptide, Saccharide, Steroide, Steroidanaloga und genetisches Material, wobei Proteine, Peptide und Saccharide mehr bevorzugt sind.
In dem Fall von Zielliganden, die Saccharidgruppen aufweisen, umfassen geeignete Saccharideinheiten beispielsweise Monosaccharide, Disaccharide und Polysaccharide. Beispielhafte Monosaccharide können sechs Kohlenstoffatome aufweisen und diese Saccharide umfassen Allose, Altrose, Glucose, Dextrose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose, Talose, Fructose, Psicose, Verbose und Tagatose. Saccharide mit fünf Kohlenstoffatomen umfassen Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Ribulose und Xylulose. Saccharide mit vier Kohlenstoffatomen umfassen Erythrose, Threose und Erythrulose. Disaccharide umfassen Saccharose, Lactose, Maltose, Isomaltose und Cellobiose. Saccharid-tragende Ziellipide können anhand eines aus vielen Schritten bestehenden organischen Syntheseansatzes synthetisiert werden, wie hiernach ausführlicher beschrieben ist. Beispielsweise können Lipide, die Zielglucoseeinheiten tragen, hergestellt werden, indem beispielsweise α-Glucopyranosylbromidtetrabenzyl mit ω-Trifluoracetylaminopolyethylenglycol umgesetzt wird, um ω-Glucopyranosyltetrabenzyl-ω'-trifluoracetylaminopolyethylenglycol zu erhalten. Dieses kann dann in einer Natriumcarbonat- oder Kaliumcarbonatlösung hydrolysiert und anschließend hydrogeniert werden, um ω-Glucopyranosyl-ω'-aminopolyethylenglycol zu erhalten. Aminoglycopyranosyl- terminiertes Polyethylenglycol kann anschließend mit N-DPGS-Succinimid reagieren, um das lipidtragende Saccharid DPGS-NH-PEG-Glucose zu bilden. In bestimmten Ausführungsformen sind die Zielliganden gegen Krebszellen oder Tumorzellen gerichtet.
In einer anderen Ausführungsform kann der in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossene Zielligand folgende Formel aufweisen:
wobei jedes X1 unabhängig -O-, -S-, -SO₂-, -NR₄-, -X₄-C(=X₅)-, -C(=X₅)-X₄ oder -C(=X₅)- ist; jedes von X₂ und X₃ unabhängig eine direkte Bindung, -R₅-X₄-C(=X₅)-, -R₅-C(=X₅)-X₄, -X₄-C(=X₅)-R₅-, -C(=X₅)-X₄-R₅-, -X₄-R₅-C(=X₅)-X₄-, -R₅-X₄-C(=X₅)-R₅-C(=X₅)-X₄- oder -R₅-C(=X₅)-X₄-R₅-X₄-C(=X₅)- ist, jedes X₄ unabhängig -O-, -NR₄- oder -S- ist, jedes X₅ unabhängig O oder S ist, M -R₅-X₄-C(=X₅)-, -R₅-C(=X₅)-X₄, -R₅-X₄-(YX₅)P(=X₅)-X₄- oder -X₄-(YX₅)P(=X₅)-X₄-R₅- ist, jedes n unabhängig 0 oder 1 ist, Y Wasserstoff oder ein pharmazeutisch annehmbares Gegenion ist, Z ein hydrophiles Polymer ist, Q ein Zielligand oder ein Vorläufer eines Zielliganden ist, jedes R₁ unabhängig eine Alkylgruppe von 1 bis etwa 50 Kohlenstoffen ist, die wahlweise mit einem oder mehr Halogenatomen substituiert sein können, jedes R₂ unabhängig eine Alkylengruppe von 1 bis etwa 30 Kohlenstoffen ist, die wahlweise mit einem oder mehr Halogenatomen substituiert sein können, jedes von R₃ und R₄ unabhängig Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen ist und jedes R₅ unabhängig eine direkte Bindung oder ein Alkylen von 1 bis etwa 30 Kohlenstoffen ist.
Wenn in der obigen Formel ein Symbol öfter als einmal in einer bestimmten Formel oder einem Substituenten erscheint, ist seine Bedeutung in jedem Fall unabhängig von den anderen. In der obigen Formel ist darüber hinaus beabsichtigt, dass, wenn jedes von zwei oder mehr benachbarten Symbolen als eine „direkte Bindung" definiert ist, um mehrere benachbarte direkte Bindungen bereit zu stellen, die mehrfachen und benachbarten direkten Bindungen eine einzelne direkte Bindung ergeben.
In bevorzugten Ausführungsformen ist jedes X₁ unabhängig -X₄-C(=X₅)-, -C(=X₅)-X₄- oder -C(=X₅)-. Mehr bevorzugt ist jedes X₁ unabhängig X₄-C(=X₅)- oder -C(=X₅)-X₄-. Noch mehr bevorzugt ist X₁ -C(=X₅)-X₄-, beispielsweise -C(=O)-O-.
In bevorzugten Ausführungsformen ist jedes von X₂ und X₃ unabhängig eine direkte Bindung, -R₅-X₄-C(=X₅)-, -R₅-C(=X₅)-X₄, -X₄-C(=X₅)-R₅-, -C(=X₅)-X₄-R₅-, -X₄-R₅-C(=X₅)-X₄- oder -R₅-X₄-C(=X₅)-R₅-C(=X₅)-X₄-. Mehr bevorzugt ist X₂ -CH₂CH₂-C(=O)-NH- oder -CH₂CH₂-NH-C(=O)-CH₂CH₂-C(=O)-NH- und X₃ ist eine direkte Bindung, -C(=O)-NH, -NH-C(=O)-, -NH-C(=O)-CH₂, -NHCH₂-C(=O)-NH- oder NH-C(=O)-CH₂CH₂.
Vorzugsweise ist jedes X₄ unabhängig -O- oder NR₄-.
Vorzugsweise ist X₅ O.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist M -R₅-X₄-C(=X₅)- oder -R₅-X₄-(YX₅)P(=X₅)-X₄-, wobei M mehr bevorzugt -CH₂O-C(=O) oder -CH₂O-(HO)P(=O)-O- ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist M -R₅-X₄-C(=X₅)- oder -R₅-C(=X₅)-X₄-. In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist M -R₅-X₄-(YX₅)P(=X₅)-X₄- oder -X₄-(YX₅)P(=X₅)-X₄-R₅-, wobei mindestens eines von X₄ oder X₅ S ist.
In der obigen Formel ist Z ein hydrophiles Polymer. Vorzugsweise ist Z aus der Gruppe ausgewählt, die aus Polyalkylenoxiden, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidonen, Polyacrylamiden, Polymethacrylamiden, Polyphosphazenen, Poly(hydroxyalkylcarboxylsäuren) und Polyoxazolidinen besteht. Mehr bevorzugt umfasst Z ein Polyalkylenoxid. Noch mehr bevorzugt ist Z ein Polyalkylenoxid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyethylenglycol und Polypropylenglycol besteht, wobei Polyethylenglycol noch mehr bevorzugt ist. In bestimmten anderen bevorzugten Ausführungsformen ist Z ein hydrophiles Polymer, bei dem es sich nicht um Polyalkylenoxide handelt, einschließlich Polyethylenglycol und Polypropylenglycol. Das Molekulargewicht von Z kann beispielsweise je nach der jeweiligen Abschlussverwendung der Verbindungen variieren. Vorzugsweise ist Z ein Polymer mit einem Molekulargewicht, das im Bereich von etwa 100 bis etwa 10.000 und allen Kombinationen und Unterkombinationen von Bereichen darin liegt. Mehr bevorzugt ist Z ein Polymer mit einem Molekulargewicht, das im Bereich von etwa 1.000 bis etwa 5.000 liegt. Bevorzugt sind auch Polymere, die Polydispersitäten von mehr als etwa 1 bis etwa 3 und alle Kombinationen und Unterkombinationen von Bereichen darin aufweisen. Mehr bevorzugt ist Z ein Polymer mit Polydispersitäten von mehr als etwa 1 bis etwa 2, wobei Polydispersitäten von mehr als etwa 1 bis etwa 1,5 noch mehr bevorzugt sind und Polydispersitäten von mehr als etwa 1 bis etwa 1,2 noch mehr bevorzugt sind.
In der obigen Formel ist Q ein Zielligand oder ein Vorläufer davon. Q ist vorzugsweise ein hierin beschriebener Zielligand, einschließlich Proteine, Lipoproteine, Glycolipide, Antikörper, Peptide, Saccharide, Steroide, Steroidanaloga und genetisches Material, mehr bevorzugt Proteine, Peptide und Saccharide.
In der obigen Formel ist jedes R₁ unabhängig Alkyl, das im Bereich von 1 bis etwa 50 Kohlenstoffen und allen Kombinationen und Unterkombinationen von Bereichen darin liegt, oder Alkenyl aus etwa 2 bis etwa 50 Kohlenstoffen und allen Kombinationen und Unterkombinationen von Bereichen darin. Vorzugsweise ist jedes R₁ unabhängig Alkyl aus etwa 5 bis etwa 30 Kohlenstoffen. Noch mehr bevorzugt ist jedes R₁ unabhängig Alkyl aus mehr als etwa 1 bis etwa 40 Kohlenstoffen. Mehr bevorzugt ist jedes R₁ unabhängig Alkyl aus etwa 5 bis etwa 30 Kohlenstoffen. Noch mehr bevorzugt ist jedes R₁ unabhängig Alkyl aus etwa 10 bis etwa 2 Kohlenstoffen, wobei Alkyl aus etwa 15 Kohlenstoffen noch mehr bevorzugt ist. In bestimmten anderen bevorzugten Ausführungsformen ist R₁ ein längerkettiges Alkyl aus etwa 20 bis etwa 50 Kohlenstoffen oder aus etwa 30 bis etwa 50 Kohlenstoffen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann die Alkylgruppe in R₁ mit einem oder mehr Fluoratomen substituiert sein und kann perfluoriert sein.
In der obigen Formel ist jedes R₂ unabhängig Alkylen aus dem Bereich mit 1 bis etwa 30 Kohlenstoffen und allen Kombinationen und Unterkombinationen von Bereichen darin. Vorzugsweise ist jedes R₂ unabhängig Alkylen mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffen. Mehr bevorzugt ist jedes R₂ unabhängig Alkylen mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen. Noch mehr bevorzugt ist jedes R₂ unabhängig Alkylen mit 1 bis etwa 5 Kohlenstoffen, wobei Methylen besonders bevorzugt ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann die Alkylengruppe in R₂ mit einem oder mehr Fluoratomen substituiert sein und kann perfluoriert sein.
In der obigen Formel ist jedes von R₃ und R₄ unabhängig Wasserstoff oder Alkyl aus dem Bereich mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen und allen Kombinationen und Unterkombinationen von Bereichen darin. Vorzugsweise ist jedes von R₃ und R₄ unabhängig Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis etwa 5 Kohlenstoffen. Mehr bevorzugt ist jedes von R₃ und R₄ Wasserstoff.
In der obigen Formel ist jedes R₅ unabhängig eine direkte Bindung oder Alkylen aus dem Bereich mit zwischen 1 bis etwa 30 Kohlenstoffen und allen Kombinationen und Unterkombinationen von Bereichen darin. Vorzugsweise ist jedes R₅ unabhängig eine direkte Bindung oder ein Alkylen mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffen. Mehr bevorzugt ist jedes R₅ unabhängig eine direkte Bindung oder ein Alkylen mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen. Noch mehr bevorzugt ist jedes R₅ unabhängig eine direkte Bindung oder ein Alkylen mit 1 bis etwa 5 Kohlenstoffen. Noch mehr bevorzugt ist jedes R₅ eine direkte Bindung oder -(CH₂)_x-, wobei x 1 oder 2 ist.
Die Zusammensetzungen und stabilisierenden Materialien der vorliegenden Erfindung können auch ein bioaktives Mittel umfassen oder in Kombination mit einem bioaktiven Mittel verwendet werden. Geeignete bioaktive Mittel umfassen beispielsweise antineoplastische Mittel, Blutprodukte, Modifikatoren biologischer Reaktionen, Fungizide, Hormone, Steroide, Vitamine, Peptide, Peptidanaloga, Enzyme, Allergie hemmende Mittel, gerinnungshemmende Mittel, Blutkreislaufmittel, Antituberkulosemittel, antivirale Mittel, Antianginamittel, Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Analgetika, Anti-Protozoen-Mittel, Anti-Rheuma-Mittel, Narkotika, Herzglycoside, Chelate, neuromuskuläre Blockierungsmittel, Sedativa (Hypnotika), lokale Betäubungsmittel, Mittel für Vollnarkose, radioaktive Partikel, radioaktive Ionen, Röntgenkontrastmittel, monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper und genetisches Material.
Beispielhafte bioaktive Mittel sind unten aufgeführt; die Liste ist jedoch nur beispielhaft und soll die bioaktiven Mittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, nicht einschränken.
Antineoplastische Mittel umfassen beispielsweise Platinverbindungen (z. B. Spiroplatin, Cisplatin und Carboplatin), Methotrexat, Adriamycin, Mitomycin C, Ansamitocin, Bleomycin, Bleomycinsulfat, Cytosinarabinosid, Arabinosyladenin, Mercaptopolylysin, Vincristin, Busulfan, Chlorambucil, Melphalan (z. B. PAM, L-PAM oder Phenylalaninsenf), Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazinhydrochlorid, Dactinomycin (Actinomycin D), Daunorubicinhydrochlorid, Doxorubicinhydrochlorid, Taxol, Plicamycin (Mithramycin), Aminoglutethimid, Estramustinphosphatnatrium, Flutamid, Leuprolidacetat, Megestrolacetat, Tamoxifencitrat, Testolacton, Trilostan, Amsacrin (m-AMSA), Asparaginase (L-Asparaginase), Erwina-Asparaginase, Etoposid (VP-16), Interferon-α-2a, Interferon-α-2b, Teniposid (VM-26), Vinblastinsulfat (VLB), Vincristinsulfat und Carzelesin.
Blutprodukte umfassen beispielsweise Erythropoietin, parenterales Eisen, Hämin und Hämatoporphyrine und deren Derivate.
Modifikatoren biologischer Reaktionen umfassen beispielsweise Muramyldipeptid, Muramyltripeptid, Bestandteile von Mikrobenzellwänden, Lymphokine (z. B. bakterielles Endotoxin wie beispielsweise Lipopolysaccharid, Makrophagenaktivationsfaktor), Untereinheiten von Bakterien (wie beispielsweise Mycobacterien, Corynebakterien), das synthetische Dipeptid, N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und Prostaglandine.
Fungizide umfassen beispielsweise Ketoconazol, Nystatin, Griseofulvin, Flucytosin (5-fc), Miconazol, Amphotericin B, Ricin und β-Lactam-Antikörper (z. B. Sulfazecin).
Hormone und Steroide umfassen beispielsweise Wachstumshormon, Melanozyten stimulierendes Hormon, adrenocorticotropes Hormon, Dexamethason, Dexamethasonacetat, Dexamethasonnatriumphosphat, Cortison, Cortisonacetat, Hydrocortison, Hydrocortisonacetat, Hydrocortisoncypionat, Hydrocortisonnatriumphosphat, Hydrocortisonnatriumsuccinat, Prednison, Prednisolon, Prednisolonacetat, Prednisolonnatriumphosphat, Prednisolontebutat, Prednisolonpivalat, Triamcinolon, Triamcinolonacetonid, Triamcinolonhexacetonid, Triamcinolondiacetat, Methylprednisolon, Methylprednisolonacetat, Methylprednisolonnatriumsuccinat, Flunsolid, Beclomethasondipropionat, Betamethasonnatriumphosphat, Betamethason, Vetamethasondinatriumphosphat, Vetamethasonnatriumphosphat, Betamethasonacetat, Betamethasondinatriumphosphat, Chlorprednisonacetat, Corticosteron, Desoxycorticosteron, Desoxycorticosteronacetat, Desoxycorticosteronpivalat, Desoximethason, Estradiol, Fludrocortison, Fludrocortisonacetat, Dichlorisonacetat, Fluorhydrocortison, Fluormetholon, Fluprednisolon, Paramethason, Paramethasonacetat, Androsteron, Fluoxymesteron, Aldosteron, Methandrostenolon, Methylandrostendiol, Methyltestosteron, Norethandrolon, Testosteron, Testosteronenanthat, Testosteronpropionat, Equilenin, Equilin, Estradiolbenzoat, Estradioldipropionat, Estriol, Estron, Estronbenzoat, Acetoxypregnenolon, Anagestonacetat, Chlormadinonacetat, Flurogestonacetat, Hydroxymethylprogesteron, Hydroxymethylprogesteronacetat, Hydroxyprogesteron, Hydroxyprogesteronacetat, Hydroxyprogesteroncaproat, Melengestrolacetat, Normethisteron, Pregnenolon, Progesteron, Ethynylestradiol, Mestranol, Dimethisteron, Ethisteron, Ethynodioldiacetat, Norethindron, Norethindronacetat, Norethisteron, Fluocinolonacetonid, Flurandrenolon, Flunisolid, Hydrocortisonnatriumsuccinat, Methylprednisolonnatriumsuccinat, Prednisolonphosphatnatrium, Triamcinolonacetonid, Hydroxydionnatrium, Spironolacton, Oxandrolon, Oxymetholon, Prometholon, Testosteroncypionat, Testosteronphenylacetat, Estradiolcypionat und Norethynodrel.
Vitamine umfassen beispielsweise Cyanocobalamin, Neinolsäure, Retinoide und Derivate davon wie beispielsweise Retinolpalmitat, α-Tocopherol, Napthochinon, Cholecalciferol, Folsäure und Tetrahydrofolat.
Peptide und Peptidanaloga umfassen beispielsweise Mangansuperoxid-Dismutase, Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Glutathion, Insulin, Dopamin, Peptidliganden, die RGD, AGD, RGE, KGD, KGE oder KQAGDV (Peptide mit Affinität für den GPIIBIIIa-Rezeptor) enthalten, Opiatpeptide, Enkephaline, Endorphine und deren Analoga, humanes chorionisches Ginadotropin (HCG), Corticotropinfreisetzungsfaktor (CRF), Cholecystokinine und deren Analoga, Bradykinine und deren Analoga und Promotoren und Inhibitoren, Elastine, Vasopressine, Pepsine, Glucagon, Substanz P, Integrine Captopril, Enalapril, Lisinopril und andere ACE-Hemmer, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Oxytocin, Calcitonine, IgG oder Fragmente davon, IgA oder Fragmente davon, IgM oder Fragmente davon, Liganden für Effektorzellproteaserezeptoren (alle Subtypen), Thrombin, Streptokinase, Urokinase, t-PA und alle aktiven Fragmente und Analoga, Protein Kinase C und ihre Bindungsliganden, Interferone (α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon), Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), Granulozytenkolonie-stimulierende Faktoren (GCSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren (GMCSF), Tumornekrosefaktoren (TNF), Nervenwachstumsfaktoren (NGF), von Plättchen stammende Wachstumsfaktoren (Platelet Derived Growth Factors), Lymphotoxin, epidermale Wachstumsfaktoren, Fibroblastenwachstumsfaktoren, vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren, Erythropoietin, transformierende Wachstumsfaktoren, Oncostatin M, Interleukine (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12), Metalloproteinkinaseliganden, Kollagenasen und Agonisten und Antagonisten.
Enzyme umfassen beispielsweise alkalische Phosphatase, Cyclooxygenase Typ 1 und Agonisten und Antagonisten.
Allergie hemmende Mittel umfassen beispielsweise Amelexanox.
Gerinnungshemmende Mittel umfassen beispielsweise Phenprocoumon und Heparin.
Blutkreislaufmittel umfassen beispielsweise Propranolol.
Antituberkulosemittel umfassen beispielsweise Para-Aminosalicylsäure, Isoniazid, Capreomycinsulfatcycloserin, Ethambutolhydrochloridethionamid, Pyrazinamid, Rifampin und Streptomycinsulfat.
Antivirale Mittel umfassen beispielsweise Acyclovir, Amantadinazidothymidin (AZT oder Zidovudine), Ribavirin und Vidarabinmonohydrat (Adeninarabinosid, ara-A).
Antianginamittel umfassen beispielsweise Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Erythritoltetranitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglycerin(glyceryltrinitrat) und Pentaerythritoltetranitrat.
Antibiotika umfassen beispielsweise Dapson, Chloramphenicol, Neomycin, Cefaclor, Cefadroxil, Cephalexin, Cephradinerythromycin, Clindamycin, Lincomycin, Amoxicillin, Ampicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Dicloxacillin, Cyclacillin, Picloxacillin, Hetacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin, Penicillin G, Penicillin V, Ticarcillin, Rifampin und Tetracyclin.
Enzündungshemmende Mittel und Analgetika umfassen beispielsweise Diflunisal, Ibuprofen, Indomethacin, Meclofenamat, Mefenaminsäure, Naproxen, Oxyphenbutazon, Phenylbutazon, Piroxicam, Sulindac, Tolmetin, Aspirin und Salicylate.
Anti-Protozoen-Mittel umfassen beispielsweise Chloroquin, Metronidazol, Hydroxychloroquin, Chinin und Megluminantimonat.
Anti-Rheuma-Mittel umfassen beispielsweise Penicillamin.
Narkotika umfassen beispielsweise mit einer anderen Substanz, meist Kampfer vermischtes Opium (Paregoric) und Opiate wie beispielsweise Codein, Heroin, Methadon, Morphin und Opium.
Herzglykoside umfassen beispielsweise Deslanosid, Digitoxin, Digoxin, Digitalin und Digitalis.
Chelate umfassen beispielsweise Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und 1,4,7,10-Tetraazocyclododecan-N',N',N'',N''-tetraessigsäure (DOTA). Es kann jedes Chelat verwendet werden, das im Allgemeinen in Verbindung mit paramagnetischen oder radioaktiven Metallionen verwendet wird.
Neuromuskuläre Blockierungsmittel umfassen beispielsweise Atracuriummesylat, Gallamintriethiodid, Hexafluoreniumbromid, Metocuriniodid, Pancuroniumbromid, Succinylcholinchlorid (Suxamethoniumchlorid), Tubocurarinchlorid und Vecoroniumbromid.
Sedativa (Hypnotika) umfassen beispielsweise Amobarbital, Amobarbitalnatrium, Aprobarbital, Butabarbitalnatrium, Chloralhydrat, Ethchlorvynol, Ethinamat, Flurazepamhydrochlorid, Glutethimid, Methotrimeprazinhydrochlorid, Methyprylon, Midazolamhydrochloridparaldehyd, Pentobarbital, Penobarbitalnatrium, Phenobarbitalnatrium, Secobarbitalnatrium, Talbutal, Temazepam und Triazolam.
Lokale Narkosemittel umfassen beispielsweise Bupivacainhydrochlorid, Chlorprocainhydrochlorid, Etidocainhydrochlorid, Lidocainhydrochlorid, Mepivacainhydrochlorid, Procainhydrochlorid und Tetracainhydrochlorid.
Mittel zur Vollnarkose umfassen beispielsweise Droperidol, Etomidat, Fentanylcitrat mit Droperidol, Ketaminhydrochlorid, Methohexitalnatrium und Thiopentalnatrium.
Radioaktive Partikel oder radioaktive Ionen umfassen beispielsweise Strontium, Rhenium, Yttrium, Technetium und Kobalt.
Röntgenkontrastmittel umfassen beispielsweise aus dem Stand der Technik bekannte Röntgenkontrastmittel, die Schwermetalle enthalten, wie beispielsweise Yttrium, Ytterbium, Lanthanide in Chelaten oder andere iodierte Materialien wie beispielweise Iothalamid.
Genetisches Material umfasst beispielsweise Nukleinsäuren, RNA und DNA, natürlicher oder synthetischer Herkunft, einschließlich rekombinante RNA und DNA und Antisense-RNA und -DNA, Hammerhead-RNA, Ribozyme, Hammerhead-Ribozyme, Antigen-Nukleinsäuren, einzel- und doppelsträngige RNA und DNA und Analoga davon, Ribooligonukleotide, Antisense-Ribooligonukleotide, Desoxyribooligonukleotide und Antisense-Desoxyribooligonukleotide. Andere Arten von genetischem Material, das verwendet werden kann, umfassen beispielsweise Gene auf Expressionsvektoren wie Plasmiden, Phagemiden, Cosmiden, artifiziellen Hefechromosomen (YACs) und defekten oder Helfer''-Viren, Antigen-Nukleinsäuren, einzel- und doppelsträngige RNA und DNA und Analoga davon wie beispielsweise Phosphorothioat und Phosphorodithioatoligodesoxynukleotide. Darüber hinaus kann das genetische Material beispielsweise mit Proteinen oder anderen Polymeren kombiniert sein. Weitere Beispiele von genetischem Material umfassen beispielsweise DNA, die mindestens einen Anteil von LFA-3 kodiert, DNA, die mindestens einen Anteil eines HLA-Gens kodiert, DNA, die mindestens einen Anteil von Dystrophin kodiert, DNA, die mindestens einen Anteil von CFTR kodiert, DNA, die mindestens einen Anteil von IL-2 kodiert, DNA, die mindestens einen Anteil von TNF kodiert und ein Antisense-Oligonukleotid, das an die DNA binden kann, die mindestens einen Anteil von Ras kodiert. DNA, die bestimmte Proteine kodiert, kann bei der Behandlung vieler verschiedener Arten von Krankheiten verwendet werden. Beispielsweise kann Adenosindeaminase bereit gestellt werden, um ADA-Defizienz zu behandeln, Tumornekrosefaktor und/oder Interleukin-2 können bereit gestellt werden, um Krebserkrankungen zu behandeln, HDL-Rezeptoren können bereit gestellt werden, um eine Lebererkrankung zu behandeln, Thymidinkinase kann bereit gestellt werden, um Ovarialkrebs, Gehirntumoren oder eine HIV-Infektion zu behandeln, HLA-B7 kann bereit gestellt werden, um ein bösartiges Melanom zu behandeln; Interleukin-2 kann bereit gestellt werden, um ein Neuroblastom, bösartiges Melanom oder Nierenkrebs zu behandeln, Interleukin-4 kann bereit gestellt werden, um Krebs zu behandeln, HIV-env kann bereit gestellt werden, um eine HIV-Infektion zu behandeln, Antisense-ras/p53 kann bereit gestellt werden, um Lungenkrebs zu behandeln und Faktor VIII kann bereit gestellt werden, um Hämophilie B zu behandeln. Siehe beispielsweise Science 258: 744–746.
Das bioaktive Mittel kann ein Pro-Pharmakon sein, einschließlich die Pro-Pharmaka, die beispielsweise von Sinkula et al., J. Pharm. Sci., 64: 181–210 (1975), in US- Anmeldung, Serien-Nr. 08/851,780, beantragt am 6. Mai 1997, und in US-Anmeldung, Serien-Nr. 08/887,215, beantragt am 2. Juli 1997, beschrieben sind.
Die bioaktiven Mittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise in geringer Konzentration hoch aktiv. Die Zielaspekte der Erfindung erlauben des Weiteren die Verwendung niedriger Dosen für eine Therapie, da die effektive Konzentration am Therapieort im Körper unverdünnt bleibt. Die einem Patienten zu verabreichende Menge an bioaktivem Mittel richtet sich beispielsweise nach dem jeweiligen bioaktiven Mittel, dem Verfahren, mit dem das bioaktive Mittel verabreicht wird, sowie dem Alter, Geschlecht, Gewicht und dem körperlichen Zustand des Patienten. Eine Behandlung wird im Allgemeinen mit geringen Dosen eingeleitet, die dann in kleinen Stufen erhöht werden können, bis der unter den Umständen gewünschte Effekt erreicht ist. Ein Fachmann kann sich darüber hinaus auf Bezugsmaterial berufen, wie beispielsweise auf Physician's Desk Reference, herausgegeben von der Medical Economics Company in Montvale, NJ 07645-1742, um die geeignete Menge eines bestimmten bioaktiven Mittels festzustellen, das einem Patienten verabreicht werden soll. In einer bevorzugten Ausführung wird das bioaktive Mittel durch Anwendung von Ultraschall an den Patienten abgegeben (z. B. in einem Bereich des Patienten und/oder an erkranktes Gewebe in dem Patienten) zum Zweck, beispielsweise, des Behandelns einer Kondition (d. h. eines Krankheitszustands, von Beschwerden, einer Störung, etc.) des Patienten.
Die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel der vorliegenden Erfindung können anhand vieler verschiedener Verfahren hergestellt werden. Diese sind unten gesondert für die Ausführungsformen beschrieben, die stabilisierende Materialien und ein Gas, einschließlich gasgefüllte Vesikel, umfassen, und für Ausführungsformen, die stabilisierende Materialien und einen Gasvorläufer, einschließlich mit einem Gasvorläufer gefüllte Vesikel, umfassen, obwohl stabilisierende Materialien, die sowohl ein Gas als auch einen Gasvorläufer umfassen, ein Teil der vorliegenden Erfindung sind.
Für die Herstellung der stabilisierenden Materialien, einschließlich Vesikel, wie beispielsweise Mizellen und/oder Liposomen ist eine breite Vielzahl von Verfahren verfügbar. Zu diesen gehören beispielsweise Schütteln, Trocknen, Gasinstallation und Sprühtrocknen. Geeignete Verfahren zum Herstellen von Vesikelzusammensetzungen sind beispielsweise in US-Patent Nr. 5,469,854 beschrieben. Die Vesikel sind vorzugsweise aus Lipiden hergestellt, die im Gelzustand bleiben.
Mizellen können mit einem beliebigen aus einer Vielzahl herkömmlicher Mizellenherstellungsverfahren hergestellt werden, die einem Fachmann geläufig sind. Diese Verfahren umfassen typischerweise eine Suspension der stabilisierenden Materialien wie beispielsweise einer Lipidverbindung in einem organischen Lösungsmittel, Verdampfung des Lösungsmittels, Resuspension in einem wässrigen Medium, Ultraschallbehandlung und Zentrifugation. Die vorangehenden Verfahren sowie andere sind beispielsweise in Canfield et al., Methods in Enzymology, 189: 418 (1990); El-Gorab et al., Biochem. Biophys. Acta, 306: 58 (1973); Colloidal Surfactant, Shinoda, K., Nakagama, Tamamushi und Isejura, Academic Press, NY (1963) (insbesondere „The Formation of Micelles", Shinoda, Kapitel 1, S. 1–88); Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems, Fendler und Fendler, Academic Press, NY (1975), beschrieben.
In Liposomen kann (können) die Lipidverbindung (Lipidverbindungen) in Form einer Einzelschicht oder einer Doppelschicht vorliegen und die Einzelschicht- oder Doppelschichtlipide können verwendet werden, um eine oder mehrere Einzelschichten oder Doppelschichten herzustellen. In dem Fall von mehr als einer Einzelschicht oder Doppelschicht, sind die Einzelschichten oder Doppelschichten im Allgemeinen konzentrisch. Lipide können daher verwendet werden, um einschichtige Liposomen (die aus einer Einzelschicht oder Doppelschicht bestehen), mehrschichtige Liposomen (die aus zwei oder drei Einzelschichten oder Doppelschichten bestehen) oder vielschichtige Liposomen (die aus mehr als drei Einzelschichten oder Doppelschichten bestehen) zu bilden.
In Verbindung mit der Herstellung von Vesikeln, einschließlich Liposomen, ist eine breite Vielzahl von Verfahren bekannt. Entsprechend können Liposomen mithilfe einer Vielzahl herkömmlicher Liposomenherstellungstechniken hergestellt werden, die einem Fachmann geläufig sind, einschließlich beispielsweise Lösungsmitteldialyse, French-Press-Verfahren, Extrusion (mit oder ohne Gefrieren-Auftauen), Umkehrphasenverdampfung, einfaches Gefrieren-Auftauen, Ultraschallbehandlung, Chelatdialyse, Homogenisierung, Lösungsmittelinfusion, Mikroemulgierung, spontane Bildung, Lösungsmittelverdampfung, Lösungsmitteldialyse, French-Press-Zelltechnik, kontrollierte Detergensdialyse und andere, die jeweils die Herstellung der Vesikel auf verschiedene Art und Weise beinhalten. Siehe z. B. Madden et al., Chemistry and Physics of Lipids, 53: 37 (1990). Geeignete Gefrier-Auftau-Techniken sind beispielsweise in der internationalen Anmeldung, Serien-Nr. PCT/US89/05040, beantragt am 8. November 1989 beschrieben, deren Offenbarung hiermit hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist. Verfahren, die Gefrier-Auftau-Techniken umfassen, sind in Verbindung mit der Herstellung von Liposomen bevorzugt. Die Herstellung von Liposomen kann in einer Lösung stattfinden, wie beispielsweise einer wässrigen Salzlösung, wässrigen Phosphatpufferlösung oder in sterilem Wasser. Die Liposomen können auch durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, die Schütteln oder Vortexen umfassen, was beispielsweise durch Verwendung einer mechanischen Schüttelvorrichtung wie beispielsweise eines Wig-L-Bug^TM (Crescent Dental, Lyons, IL, USA), eines Mixomats (Degussa AG, Frankfurt, Deutschland), einer Capmix-Vorrichtung (Espe Fabrik Pharmazeutischer Präparate GmbH & Co., Seefeld, Oberay, Deutschland), eines Silamat Plus (Cicadent, Liechtenstein) oder eines Vibros (Quayle Dental, Sussex, Großbritannien) erreicht werden kann. Es kann auch herkömmliche Mikroemulgierungsausrüstung, wie beispielsweise ein Microfluidizer^TM (Microfluidics, Waburn, MA, USA), verwendet werden.
Sprühtrocknen kann verwendet werden, um gasgefüllte Vesikel herzustellen. Unter Verwendung dieses Verfahrens können die stabilisierenden Materialien wie beispielsweise Lipide in einer wässrigen Umgebung vorgemischt und anschließend sprühgetrocknet werden, um gasgefüllte Vesikel herzustellen. Die Vesikel können unter einem Gasraum eines gewünschten Gases aufbewahrt werden.
Viele Liposomenherstellungstechniken, die zur Anwendung bei der Herstellung der Vesikelzusammensetzungen angepasst werden können, sind beispielsweise in US-Patent Nr. 4,728,578, 4,728,575, 4,737,323, 4,533,254, 4,162,282, 4,310,505 und 4,921,706, der britischen Patentanmeldung GB 219 095 A, der internationalen Anmeldung Nr. PCT/US86/01161 und PCT/US89/05040, Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, 858: 161 (1986), Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, 812: 55 (1985), Mayhew et al., Methods in Enzymology, 149: 64 (1987); Meyhew et al., Biochimica et Biophysica Acta, 755: 169 (1984), Cheng et al., Investigative Radiology, 22: 47 (1987) und Liposome Technology, Gregoriadis, Hrsg. Band I, S. 29–31, 51–67 und 79–108 (CRC Press Inc., 1984) beschrieben.
In Verbindung mit stabilisierenden Materialien und insbesondere Lipidzusammensetzungen in Form von Vesikeln kann es vorteilhaft sein, die Lipidzusammensetzungen bei einer Temperatur unter der Phasenübergangstemperatur vom Gel- zum Flüssigkristallin-Zustand der Lipide herzustellen. Diese Phasenübergangstemperatur ist die Temperatur, bei der sich eine Lipiddoppelschicht von einem Gel- in ein Flüssigkristallin-Stadium umwandelt. Siehe beispielsweise Chapman et al., J. Biol. Chem., 249: 2512 (1974). Es wird angenommen, dass Vesikel, die aus Lipiden hergestellt sind, die höhere Phasenübergangstemperaturen vom Gel- zum Flüssigkristallin-Zustand aufweisen, bei einer beliebigen Temperatur zu verstärkter Undurchlässigkeit neigen. Siehe Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers (CRC Press, Boca Raton, FL 1990, USA) auf S. 139 für Hauptkettenschmelzübergänge gesättigter Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Die Phasenübergangstemperaturen vom Gel- zum Flüssigkristallin-Zustand verschiedener Lipide sind einem Fachmann leicht geläufig und sind beispielsweise von Gregoriadis, Hrsg. Band I, S. 1–18 (CRC Press Inc., 1984) beschrieben.
Stabilisierende Materialien wie beispielsweise Lipide, die ein Gas umfassen, können hergestellt werden, indem eine wässrige Lösung, die, falls gewünscht, ein stabilisierendes Material enthält, in Gegenwart eines Gases bewegt wird. Der Begriff „Bewegen" bedeutet jede Schüttelbewegung einer wässrigen Lösung, so dass Gas aus der lokalen Umgebung in die wässrige Lösung eingeführt wird. Dieses Bewegen wird vorzugsweise bei einer Temperatur unter der Phasenübergangstemperatur vom Gel- zum Flüssigkristallin-Zustand des Lipids durchgeführt. Das Schütteln bei der Bewegung der Lösungen wird vorzugsweise mit genügend Kraft ausgeführt, um die Bildung einer Lipidzusammensetzung, einschließlich Vesikelzusammensetzungen und insbesondere Vesikelzusammensetzungen, die gasgefüllte Vesikel umfassen, zu bewirken. Das Schütteln kann durch Verwirbeln, beispielsweise durch Vortexen, von Seite zu Seite oder in einer Bewegung von oben nach unten erfolgen. Es können verschiedene Bewegungsarten kombiniert werden. Das Schütteln kann auch stattfinden, indem der Behälter mit der wässrigen Lipidlösung geschüttelt wird oder indem die wässrige Lösung in dem Behälter geschüttelt wird, ohne den Behälter selbst zu schütteln.
Das Schütteln kann manuell oder maschinell stattfinden. Mechanische Schüttler, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise einen Schütteltisch wie beispielsweise einen Schütteltisch von VWR Scientific (Cerritos, CA, USA), sowie jede der hierin bereits beschriebenen Schüttelvorrichtungen, wobei die Capmix-Vorrichtung (Espe Fabrik Pharmazeutischer Präparate GmbH & Co., Seefeld, Oberay, Deutschland) bevorzugt ist. Es wurde herausgefunden, dass bestimmte Arten von Schütteln oder Vortexen verwendet werden können, um Vesikel in einem bevorzugten Größenbereich herzustellen. Schütteln ist bevorzugt und es ist bevorzugt, dass das Schütteln unter Verwendung des mechanischen Capmix-Schüttlers von Espe stattfindet. In Übereinstimmung mit diesem bevorzugten Verfahren ist es bevorzugt, dass eine Umkehrbewegung verwendet wird, um die Lipidzusammensetzungen und insbesondere Vesikel zu erzeugen. Noch mehr bevorzugt ist, dass die Umkehrbewegung die Form eines Bogens hat. Es wird berücksichtigt, dass die Umkehrrate sowie ihr Bogen in Verbindung mit der Bildung von Vesikeln besonders wichtig sind. Die Anzahl der Umkehrungen oder Vollzyklusoszillationen liegt zwischen etwa 1.000 bis etwa 20.000 pro Minute, mehr bevorzugt bei etwa 2.500 bis etwa 8.000 pro Minute, am meisten bevorzugt bei etwa 3.300 bis etwa 5.000 pro Minute. Natürlich kann sich die Anzahl der Oszillationen nach der Masse der bewegten Inhalte richten. Eine größere Masse erfordert im Allgemeinen weniger Oszillationen. Ein anderes Mittel zum Herstellen einer Schüttelbewegung umfasst die Wirkung eines Gases, das bei hoher Geschwindigkeit oder mit hohem Druck abgegeben wird.
Natürlich wird bei einem größeren Volumen an wässriger Lösung vorzugsweise die Gesamtmenge an Kraft entsprechend erhöht. Kräftiges Schütteln ist definiert als mindestens etwa 60 Schüttelbewegungen pro Minute und ist bevorzugt. Vortexen findet bei etwa 60 bis etwa 300 Umdrehungen pro Minute statt, mehr bevorzugt bei etwa 300 bis etwa 1.800 Umdrehungen pro Minute.
Außer den oben beschriebenen, einfachen Schüttelverfahren können auch aufwändigere Verfahren angewandt werden. Solche aufwändigen Verfahren umfassen beispielsweise Flüssig-Kristallin-Schüttel-Gaseintropfverfahren und Vakuum-Trockengas-Instillationsverfahren, wie die in US-Patent Nr. 5,469,854, 5,580,575, 5,585,112 und 5,542,935, sowie in US-Anmeldung, Serien-Nr. 08/307,305, beantragt am 16. September 1994, Beschriebenen. Bei der Herstellung von Zusammensetzungen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können auch Emulgierungsverfahren angewandt werden, Solche Emulgierungsverfahren sind beispielsweise in Quay, US-Patent. Nr. 5,558,094, 5,558,853, 5,558,854 und 5,573,751 beschrieben. Zur Herstellung der mit Gasvorläufer gefüllten Vesikel kann auch Sprühtrocknen angewandt werden. Bei Anwendung dieses Verfahrens können die Lipide in einer wässrigen Umgebung vorgemischt und anschließend sprühgetrocknet werden, um mit Gasvorläufer gefüllte Vesikel herzustellen. Die Vesikel können unter einer Gasphase aus einem gewünschten Gas aufbewahrt werden. Obgleich jede aus einer Anzahl verschiedener Techniken verwendet werden kann, werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vesikelzusammensetzungen vorzugsweise mithilfe einer Schütteltechnik hergestellt. Die Schütteltechnik umfasst vorzugsweise das Bewegen mithilfe einer mechanischen Schüttel-Vorrichtung, beispielsweise einer Capmix-Vorrichtung von Espe (Seefeld, Oberay, Deutschland), wobei beispielsweise die in US-Patent Nr. 5,542,935 beschriebenen Techniken verwendet werden. Darüber hinaus kann Bewegen oder Schütteln nach Extrusions- und Sterilisationsverfahren, die unten ausführlich erläutert sind, Vesikelzusammensetzungen bereit stellen, die im Wesentlichen keine oder nur minimale Rückstände einer wasserfreien Lipidphase im Rest der Lösung enthalten (Bangham et al., J. Mol. Biol. 13: 238 (1965)). Andere Herstellungstechniken umfassen die in Unger, US-Patent Nr. 5,205,290 Beschriebenen.
Schäume umfassen eine weitere Ausführungsform der Erfindung. Schäume haben biomedizinische Anwendung beim Gewebeaufbau, der Wundheilung und der Prävention peritonealer Adhäsionen. Phospholipidschäume lassen sich herstellen, indem die Konzentration der Phospholipide erhöht wird und mit Materialien wie beispielsweise Cetylalkohol, Tensiden, Simethicon oder Polymeren wie Methylcellulose gemischt wird. Es können auch fluorierte Phospholipide verwendet werden, um stabile, lang haltbare Schäume zu erzeugen. Die stabilsten Schäume werden im Allgemeinen aus Materialien hergestellt, die polymerisiert oder vernetzt sind, wie beispielsweise polymerisierbare Phospholipide. Da Schaumbildung auch eine Funktion der Verringerung der Oberflächenspannung ist, sind Detergenzien im Allgemeinen geeignete Schaumbildner.
Schäume können auch hergestellt werden, indem gasgefüllte Vesikel geschüttelt werden, wobei der Schaum oben auf der wässrigen Lösung erscheint und mit einer Abnahme des Volumens der wässrigen Lösung bei Bildung des Schaums gekoppelt ist. Vorzugsweise ist das Endvolumen des Schaums mindestens etwa das Doppelte des Ursprungsvolumens der wässrigen stabilisierenden Materiallösung; mehr bevorzugt ist das Endvolumen des Schaums mindestens etwa das Dreifache des Ursprungsvolumens der wässrigen stabilisierenden Materiallösung; noch mehr bevorzugt ist das Endvolumen des Schaums mindestens etwa das Vierfache des Ursprungsvolumens der wässrigen stabilisierenden Materiallösung und am meisten bevorzugt wird die gesamte wässrige stabilisierende Materiallösung in Schaum verwandelt.
Die erforderliche Dauer des Schüttelzeitraums kann bestimmt. werden, indem die Bildung von Schaum festgestellt wird. Beispielsweise können 10 ml Lipidlösung in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen etwa 15–20 Minuten mit dem Vortex behandelt werden oder solange, bis die Viskosität der gasgefüllten Liposomen ausreichend dick wird, dass sie nicht länger an den Seitenwänden haften, wenn sie verwirbelt werden. Zu diesem Zeitpunkt kann der Schaum bewirken, dass die Lösung, welche die gasgefüllten Liposomen enthält, auf ein Niveau von etwa 30 bis etwa 35 ml ansteigt.
Die zur Bildung eines bevorzugten Schaumniveaus erforderliche Konzentration von Lipid richtet sich nach der Art des verwendeten Lipids und kann von einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung leicht bestimmt werden. Beispielsweise ist die Konzentration von 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), das zur Bildung gasgefüllter Liposomen nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, etwa 20 mg/ml bis etwa 30 mg/ml Salzlösung. Die verwendete Konzentration von Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) ist etwa 5 mg/ml bis etwa 10 mg/ml Salzlösung. Insbesondere ergibt DPPC in einer Konzentration von 20 mg/ml bis 30 ml/ml beim Schütteln ein Gesamtvolumen von Suspension und eingeschlossenem Gas, das viermal größer ist als das Suspensionsvolumen alleine. DSPC in einer Konzentration von 10 mg/ml ergibt beim Schütteln ein Gesamtvolumen, das von jeglichem flüssigen Suspensionsvolumen vollkommen frei ist und nur Schaum enthält.
Mikroemulgierung ist ein gängiges Verfahren zum Herstellen einer Emulsion eines Schaumvorläufers. Temperaturerhöhungen und/oder erniedrigte Drücke bewirken Schaumbildung, da sich in der Flüssigkeit Gasblasen bilden. Wie oben erläutert, kann der Schaum beispielsweise durch Tenside, Detergenzien oder Polymere stabilisiert werden.
Die Größe gasgefüllter Vesikel kann, falls gewünscht, durch eine Vielzahl von Verfahren angepasst werden, einschließlich beispielsweise Mikroemulgierung, Vortexen, Extrusion, Filtration, Ultraschallbehandlung, Homogenisierung, wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen, Extrusion unter Druck durch Poren definierter Größe und ähnliche Verfahren. In Übereinstimmung mit den hierin beschriebenen Verfahren hergestellte gasgefüllte Vesikel können eine Größe im Bereich von weniger als etwa 1 μm bis größer als etwa 100 μm aufweisen. Darüber hinaus werden nach Extrusions- und Sterilisationsverfahren, die unten ausführlich erläutert sind, durch Bewegen oder Schütteln Vesikelzusammensetzungen bereit gestellt, die im Rest der Lösung im Wesentlichen keine oder minimale verbleibende wasserfreie Lipidphase aufweisen (Bangham et al., J. Mol. Biol., 13: 238 (1965)). Falls gewünscht, können die Vesikel der vorliegenden Erfindung so wie sie gebildet werden verwendet werden, ohne ihre Größe weiter zu modifizieren. Für die intravaskuläre Anwendung haben die Vesikel vorzugsweise Durchmesser von unter etwa 30 μm und mehr bevorzugt unter etwa 12 μm. Für gezielten intravaskulären Gebrauch, einschließlich beispielsweise Bindung an bestimmte Gewebe wie Krebsgewebe, können die Vesikel wesentlich kleiner sein, beispielsweise unter etwa 100 nm im Durchmesser. Für enterische oder gastroenterale Anwendung können die Vesikel wesentlich größer sein, beispielsweise bis zu einem Millimeter groß. Vorzugsweise haben die Vesikel eine Größe mit einem Durchmesser von etwa 2 μm bis etwa 100 μm.
Die Größe gasgefüllter Vesikel kann durch einen einfachen Prozess der Extrusion durch Filter festgelegt werden, wobei die Porengröße des Filters die Größenverteilung der resultierenden gasgefüllten Vesikel kontrolliert. Durch Verwendung von zwei oder mehr in Kaskaden oder gestapelt angeordneten Filtersätzen, beispielsweise eines 10-μm-Filters gefolgt von einem 8-μm-Filter, können die gasgefüllten Vesikel so ausgewählt werden, dass sie eine sehr enge Größenverteilung um 7 bis 9 μm aufweisen. Nach der Filtration bleiben diese gasgefüllten Vesikel über 24 Stunden stabil.
Der Schritt der Größenfestlegung oder Filtration kann beispielsweise erreicht werden, indem eine Filteranordnung verwendet wird, wenn die Zusammensetzung vor dem Gebrauch aus einem sterilen Gefäß genommen wird, oder mehr bevorzugt kann die Filteranordnung während des Gebrauchs in eine Spritze integriert sein. Das Verfahren der Festlegung der Vesikelgröße umfasst dann eine Spritze, die einen Zylinder, mindestens einen Filter und eine Kanüle umfasst, und wird anhand eines Extraktionsschritts durchgeführt, der das Extrudieren der Vesikel aus dem Zylinder durch den an die Spritze zwischen dem Zylinder und der Kanüle angebrachten Filter umfasst, wodurch die Größe der Vesikel festgelegt wird, bevor sie einem Patienten verabreicht werden. Der Extraktionsschritt kann auch das Aufziehen der Vesikel in die Spritze umfassen, wobei der Filter auf die gleiche Weise wirkt, um die Größe der Vesikel festzulegen, wenn diese in die Spritze gelangen. Eine andere Alternative ist, solch eine Spritze mit Vesikeln zu füllen, deren Größe bereits durch andere Mittel festgelegt worden ist, wobei der Filter in diesem Fall dazu dient sicherzustellen, dass nur Vesikel im gewünschten Größenbereich oder der gewünschten Maximalgröße anschließend durch Extrusion aus der Spritze verabreicht werden.
In anderen Ausführungsformen können die Vesikelzusammensetzungen vor dem Schütteln hitzesterilisiert oder filtersterilisiert und durch einen Filter extrudiert werden. Vesikelzusammensetzungen, die ein Gas umfassen, können im Allgemeinen hitzesterilisiert werden und Vesikelzusammensetzungen, die Gasvorläufer umfassen, können im Allgemeinen filtersterilisiert werden. Sobald gasgefüllte Vesikel gebildet sind, können sie wie oben beschrieben zur Größenfestlegung filtriert werden. Durchführen dieser Schritte vor der Bildung von mit Gas und/oder einem Gasvorläufer gefüllten Vesikeln stellt sterile mit Gas und/oder einem Gasvorläufer gefüllte Vesikel bereit, die für die Verabreichung an einen Patienten bereit sind. Beispielsweise kann ein Mischgefäß wie beispielsweise ein Reaktionsgefäß oder eine Spritze mit einer filtrierten Lipidzusammensetzung gefüllt werden und die Zusammensetzung kann in dem Mischgefäß sterilisiert werden, beispielsweise durch Autoklavieren. In die Zusammensetzung kann Gas instilliert werden, um gasgefüllte Vesikel zu bilden, indem das sterile Reaktionsgefäß geschüttelt wird. Das sterile Reaktionsgefäß ist vorzugsweise mit einem Filter ausgestattet, der derart positioniert ist, dass die gasgefüllten Vesikel den Filter vor dem Berühren eines Patienten passieren.
Der Schritt des Extrudierens der Lösung einer Lipidverbindung durch einen Filter vermindert die Menge an unhydriertem Material, indem etwaiges getrocknetes Material aufgebrochen wird und eine größere Oberfläche für die Hydration frei gelegt wird. Der Filter hat vorzugsweise eine Porengröße von etwa 0,1 bis etwa 5 μm, mehr bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 4 μm, noch mehr bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 2 μm und noch mehr bevorzugt etwa 1 μm. Unhydrierte Verbindung, die im Allgemeinen unerwünscht ist, erscheint als amorphe Klumpen nicht-einheitlicher Größe.
Der Sterilisationsschritt stellt eine Zusammensetzung bereit, die einem Patienten zur diagnostischen Bilddarstellung einfach verabreicht werden kann. In bestimmten Ausführungsformen kann die Sterilisation durch Hitzesterilisation erreicht werden, vorzugsweise, indem die Lösung bei einer Temperatur von mindestens etwa 100°C autoklaviert wird, und mehr bevorzugt, indem bei etwa 100°C bis etwa 130°C autoklaviert wird, noch mehr bevorzugt bei etwa 110°C bis etwa 130°C, noch mehr bevorzugt bei etwa 120°C bis etwa 130°C und noch mehr bevorzugt bei etwa 130°C. Die Erhitzung findet vorzugsweise für mindestens etwa 1 Minute statt, mehr bevorzugt etwa 1 bis etwa 30 Minuten, noch mehr bevorzugt etwa 10 bis etwa 20 Minuten und noch mehr bevorzugt etwa 15 Minuten lang. Falls gewünscht, können die Extrusions- und Erhitzungsschritte wie oben ausgeführt umgekehrt werden, oder es kann nur einer der beiden Schritte verwendet werden. Es können weitere Arten der Sterilisation verwendet werden, einschließlich Aussetzen gegenüber Gammastrahlen.
Außer den obigen Ausführungsformen können Gasvorläufer, die in Vesikeln enthalten sind, formuliert werden, die bei Aktivierung, beispielsweise durch Aussetzen gegenüber erhöhter Temperatur, variierendem pH-Wert oder Licht, einen Phasenübergang beispielsweise von einer Flüssigkeit, einschließlich einer in einem Vesikel eingeschlossenen Flüssigkeit, zu einem Gas durchlaufen, das sich ausdehnt, um die hierin beschriebenen gasgefüllten Vesikel zu erzeugen. Diese Technik ist in US-Patent Nr. 5,542,935 und 5,585,112 beschrieben. Das bevorzugte Verfahren des Aktivierens des Gasvorläufers ist durch Aussetzen gegenüber erhöhter Temperatur. Aktivierungs- oder Übergangstemperatur und derartige Begriffe beziehen sich auf den Siedepunkt des Gasvorläufers und sind die Temperatur, bei welcher der Phasenübergang des Gasvorläufers von flüssig zu gasförmig stattfindet. Geeignete Gasvorläufer sind solche Materialien, die Siedepunkte im Bereich von etwa –100°C bis etwa 70°C aufweisen. Die Aktivierungstemperatur ist bei jedem Gasvorläufer anders und kann von einem Fachmann leicht bestimmt werden.
Die Verfahren des Herstellens mit Gasvorläufer gefüllter Vesikel können unterhalb des Siedepunkts des Gasvorläufers durchgeführt werden, so dass eine Flüssigkeit beispielsweise in einen Vesikel eingeschlossen wird. Darüber hinaus können die Verfahren am Siedepunkt des Gasvorläufers durchgeführt werden, so dass ein Gas beispielsweise in einen Vesikel eingeschlossen wird. Bei Gasvorläufern mit Siedepunkt bei einer niedrigen Temperatur können flüssige Vorläufer anhand einer Mikrofluidierungsvorrichtung, die auf eine niedrige Temperatur gekühlt ist, emulgiert werden. Die Siedepunkte können auch gesenkt werden, indem Lösungsmittel in Flüssigmedium verwendet werden, um einen Vorläufer in flüssiger Form einzusetzen. Des Weiteren können die Verfahren durchgeführt werden, bei denen die Temperatur während des gesamten Prozesses erhöht wird, wodurch der Prozess mit einem Gasvorläufer als Flüssigkeit beginnt und mit einem Gas endet.
Die Verfahren der mit temperaturaktiviertem Gasvorläufer gefüllten Vesikel können bei einer Temperatur unterhalb des Siedepunkts des Gasvorläufers durchgeführt werden. In dieser Ausführungsform ist der Gasvorläufer in einem Vesikel derart eingeschlossen, dass der Phasenübergang nicht während der Herstellung stattfindet. Stattdessen werden die mit Gasvorläufer gefüllten Vesikel in der Flüssigphase des Gasvorläufers hergestellt. Eine Aktivierung des Phasenübergangs kann zu jedem Zeitpunkt erfolgen, wenn die Temperatur den Siedepunkt des Vorläufers übersteigen kann. Wenn die Menge an Flüssigkeit in einem Tröpfchen des flüssigen Gasvorläufers bekannt ist, kann außerdem nach Erreichen des gasförmigen Zustands die Größe der Vesikel bestimmt werden.
Alternativ können die Gasvorläufer verwendet werden, um stabile gasgefüllte Vesikel herzustellen, die vor dem Gebrauch geformt werden. In dieser Ausführungsform wird der Gasvorläufer in einen Behälter gegeben, in dem sich eine Lipidzusammensetzung bei einer Temperatur unterhalb der Phasenübergangstemperatur von flüssig zu gasförmig des jeweiligen Gasvorläufers befindet. Wenn die Temperatur erhöht wird und sich zwischen dem Gasvorläufer und der flüssigen Lösung eine Emulsion bildet, durchläuft der Gasvorläufer einen Übergang vom flüssigen zum gasförmigen Zustand. Als ein Ergebnis dieser Erhitzung und Gasbildung verdrängt das Gas die Luft im Gasraum über der Flüssigmischung, um gasgefüllte Vesikel zu bilden, welche das Gas des Gasvorläufers, Umgebungsgas (z. B. Luft) einschließen oder Gasvorläufer im gasförmigen Zustand und Umgebungsluft zusammen einschließen. Dieser Phasenübergang kann für optimales Mischen und optimale Bildung des Kontrastmittels genutzt werden. Beispielsweise kann der Gasvorläufer Perfluorbutan in die Lipidvesikel eingeschlossen werden, und wenn die Temperatur über den Siedepunkt von Perfluorbutan (4°C) erhöht wird, wird Perfluorbutangas in den Vesikeln eingeschlossen. Entsprechend können die Gasvorläufer ausgewählt werden, um gasgefüllte Vesikel in vivo zu bilden, oder können so konzipiert sein, dass sie die gasgefüllten Vesikel in situ während des Herstellungsvorgangs, bei der Lagerung oder zu einem anderen Zeitpunkt vor dem Gebrauch herstellen. Es kann ein Wasserbad, eine Ultraschallvorrichtung oder hydrodynamische Aktivierung durch Zurückziehen des Kolbens einer Spritze gegen einen geschlossenen Stopphahn verwendet werden, um gasgefüllte Zielvesikel aus temperaturempfindlichen Gasvorläufern vor einer intravenösen Injektion oder Infusion zu aktivieren.
Als eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung, indem der Gasvorläufer im flüssigen Zustand in einer wässrigen Emulsion vorgeformt ist, kann die Maximalgröße der Vesikel anhand des idealen Gasgesetzes geschätzt werden, sobald der Übergang zum gasförmigen Zustand herbeigeführt wird. Zum Zweck der Herstellung gasgefüllter Vesikel aus Gasvorläufern wird davon ausgegangen, dass sich die Gasphase sofort bildet und im Wesentlichen in dem neu gebildeten Vesikel kein Gas aufgrund von Diffusion in die Flüssigkeit, die im Allgemeiner wässriger Art ist, abgereichert wurde. Ausgehend von einem bekannten Flüssigvolumen in der Emulsion könnte man daher einen oberen Grenzwert der Größe des gasgefüllten Vesikels vorhersagen.
In der vorliegenden Erfindung kann eine Mischung einer Lipidverbindung und eines Gasvorläufers, die flüssige Tröpfchen definierter Größe enthält, derart formuliert werden, dass die Tröpfchen sich nach Erreichen einer bestimmten Temperatur, beispielsweise des Siedepunkts des Gasvorläufers, zu gasgefüllten Vesikeln definierter Größe ausdehnen. Die definierte Größe stellt einen oberen Grenzwert der tatsächlichen Größe dar, weil das ideale Gasgesetz Faktoren wie Gasdiffusion in Lösungen, Verlust von Gas an die Atmosphäre und die Auswirkungen einer Druckerhöhung nicht berücksichtigt.
Das ideale Gasgesetz, das zum Berechnen der Erhöhung des Volumens der Gasbläschen nach Übergang vom flüssigen zum gasförmigen Zustand verwendet werden kann, lautet PV = nRT, wobei P der Druck in Atmosphären (atm) ist, V das Volumen in Litern (1) ist, n die Anzahl der Mole an Gas ist, T die Temperatur in Grad Kelvin (K) ist und R die ideale Gaskonstante (22,4 1 × atm/K × mol) ist. Wenn Volumen, Dichte und Temperatur der Flüssigkeit in der Mischung von Flüssigkeiten bekannt sind, können die Menge, beispielsweise in Mol, und das Volumen des flüssigen Vorläufers berechnet werden, der sich bei Umwandlung zu einem Gas zu einem Vesikel bekannten Volumens ausdehnt. Das berechnete Volumen spiegelt einen oberen Grenzwert der Größe des gasgefüllten Vesikels wider, wobei eine sofortige Ausdehnung zu einem gasgefüllten Vesikel und vernachlässigbare Diffusion des Gases während der Ausdehnungszeit angenommen wird.
Zur Stabilisierung des Vorläufers im flüssigen Zustand in einer Mischung, in der das Vorläufertröpfchen kugelförmig ist, kann das Volumen des Vorläufertröpfchens durch die Gleichung: Volumen (kugelförmiges Vesikel) = 4/3π³ bestimmt werden, wobei r der Radius der Kugel ist.
Wenn das Volumen vorhergesagt und die Dichte der Flüssigkeit bei der gewünschten Temperatur bekannt ist, kann die Menge an flüssigem Gasvorläufer in dem Tröpfchen bestimmt werden. Näher erläuternd ausgedrückt, gilt Folgendes: V_Gas = 4/3π(r_Gas)³, wobei Substitution nach dem idealen Gasgesetz, PV = nRT, V_Gas = nRT/P_Gas oder (A) n = 4/3[π_Gas ³]P/RT, Menge n = 4/3[π_Gas ³P/RT] × MW_n, ergibt. Konversion zurück zu einem flüssigen Volumen ist (B) _VFlüssig = [4/3[[π_Gas ³]P/RT] × MW_n/D], wobei D die Dichte des Vorläufers ist. Auflösen der Gleichung nach dem Durchmesser des Flüssigtröpfchens ergibt (C) Durchmesser/2 = [3/4π[4/3[π_Gas3]P/RT]MW_n/D]^1/3, reduziert auf Durchmesser = 2[[r_Gas ³]P/RT[MW_n/D]]^1/3.
Als ein weiteres Mittel zum Herstellen von Vesikeln der gewünschten Größe für die Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung und in Kenntnis des Volumens und vor allem des Radius der Flüssigtröpfchen kann man Filter geeigneter Größe verwenden, um die Größe der Gasvorläufertröpfchen dem geeigneten Kugeldurchmesser anzupassen.
Es kann ein repräsentativer Gasvorläufer verwendet werden, um ein Vesikel definierter Größe, beispielsweise 10 μm im Durchmesser, zu bilden. In diesem Beispiel wird das Vesikel im Blutstrom eines Menschen gebildet, also wäre die typische Temperatur 37°C oder 310 K. Bei einem Druck von 1 Atmosphäre und unter Anwendung der Gleichung in (A), wären 7,54 × 10^–17 Mol des Gasvorläufers erforderlich, um das Volumen eines Vesikels mit einem Durchmesser von 10 μm zu füllen.
Unter Anwendung der oben berechneten Menge eines Gasvorläufers und 1-Fluorbutan, das ein Molekulargewicht von 76,11, einen Siedepunkt von 32,5°C und eine Dichte von 0,7789 g/ml bei 20°C aufweist, sagen weitere Berechnungen voraus, dass für ein 10-μm-Vesikel 5,74 × 10^–15 Gramm dieses Vorläufers benötigt werden. Weitere Extrapolierung und in Kenntnis der Dichte sagt Gleichung (B) weiter voraus, dass 8,47 × 10^–16 ml des flüssigen Vorläufers erforderlich sind, um ein Vesikel mit einem oberen Grenzwert von 10 μm zu bilden. Schließlich wird unter Anwendung von Gleichung (C) eine Mischung, beispielsweise eine Emulsion gebildet, die Tröpfchen mit einem Radius von 0,0272 μm oder einem entsprechenden Durchmesser von 0,0544 μm enthält, um ein mit einem gasförmigen Gasvorläufer gefülltes Vesikel mit einem oberen Grenzwert eines 10-μm-Vesikels herzustellen.
Eine Emulsion dieser bestimmten Größe würde leicht erreicht, indem ein Filter geeigneter Größe verwendet wird. Wie an der Größe des Filters, der zur Bildung von Gasvorläufertröpfchen definierter Größe erforderlich ist, ersichtlich ist, wäre die Größe des Filters außerdem ausreichend, um etwaige mögliche bakterielle Verunreinigungen zu entfernen, und könnte daher auch als Sterilfilter verwendet werden.
Diese Ausführungsform zum Herstellen gasgefüllter Vesikel lässt sich auf alle durch Temperatur aktivierte Gasvorläufer anwenden. Tatsächlich ermöglicht die Senkung des Gefrierpunktes des Lösungsmittelsystems die Verwendung von Gasvorläufern, die bei Temperaturen unter 0°C Phasenübergänge von flüssig zu gasförmig durchlaufen. Das Lösungsmittelsystem kann ausgewählt werden, um ein Medium zur Suspension des Gasvorläufers bereit zu stellen. Beispielsweise weist 20%iges Propylenglycol, mischbar in gepufferter Salzlösung, eine Gefrierpunktsenkung deutlich unterhalb des Gefrierpunktes von Wasser alleine auf. Durch Erhöhen der Menge von Propylenglycol oder Hinzufügen von Materialien wie beispielsweise Natriumchlorid kann der Gefrierpunkt noch weiter gesenkt werden.
Die Auswahl geeigneter Lösungsmittelsysteme kann auch durch physikalische Verfahren bestimmt werden. Wenn Substanzen, fest oder flüssig, hierin als gelöste Stoffe bezeichnet, in einem Lösungsmittel wie beispielsweise in Puffern auf Wasserbasis gelöst werden, wird der Gefrierpunkt um ein Niveau gesenkt, das von der Zusammensetzung der Lösung abhängt. Wie von Wall definiert kann man daher die Senkung des Gefrierpunkts des Lösungsmittels durch folgende Gleichung ausdrücken: Inx_a = In(1 – x_b) = ΔH_Fus/R(1/T₀ – 1/T), wobei x_a die Molfraktion des Lösungsmittels ist; x_b ist die Molfraktion des gelösten Stoffes; ΔH_Fus ist die Wärme der Fusion des Lösungsmittels und T₀ ist der normale Gefrierpunkt des Lösungsmittels.
Der normale Gefrierpunkt des Lösungsmittels lässt sich durch Auflösen der Gleichung erhalten. Wenn x_b relativ zu x_a klein ist, kann die obige Gleichung folgenderweise umgeschrieben werden : x^b = ΔH_Fus/R(1/T₀ – 1/T₀T) = ΔH_FusΔT/RT₀ ². Die obige Gleichung geht davon aus, dass die Temperaturänderung ΔT im Vergleich zu T₂ gering ist. Diese Gleichung lässt sich vereinfachen, indem die Konzentration des gelösten Stoffes als Molarität m (Mol an gelöstem Stoff je Tausend Gramm Lösungsmittel) ausgedrückt wird. Die Gleichung kann damit umgeschrieben werden zu X_b = m/[m + 1000/m_a] ≈ mMa/1000, wobei Ma das Molekulargewicht des Lösungsmittels ist. Nach Substitution der Fraktion x_b erhält man ΔT = [M_aRT₀ ²/1000ΔH_Fus]m oder ΔT = K_fm, wobei K_f = M_aRT₀ ²/1000ΔH_Fus. K_f ist der molale Gefrierpunkt und entspricht 1,86 Grad pro Einheit der molalen Konzentration von Wasser bei einem Druck von einer Atmosphäre. Die obige Gleichung kann verwendet werden, um den molalen Gefrierpunkt von Lösungen mit Gasvorläufer gefüllter Vesikel zu bestimmen. Entsprechend kann die obige Gleichung angewandt werden, um Gefrierpunktsenkungen zu schätzen und die geeignete Konzentration von flüssigem oder festem gelösten Stoff zu bestimmen, die erforderlich ist, um die Gefriertemperatur des Lösungsmittels auf einen geeigneten Wert zu senken.
Verfahren zur Herstellung der temperaturaktivierten, mit Gasvorläufer gefüllten Vesikel umfassen: (a) Vortexen und/oder Schütteln einer wässrigen Mischung eines Gasvorläufers und weiterer Materialien wie gewünscht, einschließlich beispielsweise stabilisierende Materialien, Verdickungsmittel und/oder Dispersionsmittel. Optionale Varianten dieses Verfahrens umfassen Autoklavieren vor dem Vortexen oder Schütteln; Erhitzen einer wässrigen Mischung eines Gasvorläufers; Belüften des Gefäßes, das die Mischung/Suspension enthält, Schütteln oder das mit Gasvorläufer gefüllte Vesikel spontan bilden lassen und Abkühlen der Suspension mit Gasvorläufer gefüllter Vesikel und Extrudieren einer wässrigen Suspension von Gasvorläufern durch einen Filter von etwa 0,22 μm. Alternativ kann während der Verabreichung der Vesikel in vivo derart filtriert werden, dass ein Filter von etwa 0,22 μm angewandt wird, (b) Mikroemulgierung, wobei eine wässrige Gasvorläufermischung durch Bewegen emulgiert und erhitzt wird, um vor der Verabreichung an einen Patienten beispielsweise Vesikel zu bilden, (c) Erhitzen eines Gasvorläufers in einer Mischung mit oder ohne Bewegen, wobei die weniger dichten, mit Gasvorläufer gefüllten Vesikel oben in der Lösung schweben, indem sie sich ausdehnen und andere Vesikel in dem Gefäß verdrängen, und Belüften des Gefäßes, um Luft freizusetzen, und (d) Verwenden eines versiegelten Gefäßes in einem der obigen Verfahren, um die wässrige Gasvorläufersuspension zu beinhalten und die Suspension bei einer Temperatur unter der Phasenübergangstemperatur des Gasvorläufers zu halten, gefolgt von Autoklavieren, um die Temperatur über die Phasenübergangstemperatur zu erhöhen, wahlweise mit Schütteln, oder sich das mit Gasvorläufer gefüllte Vesikel spontan bilden lassen, wobei der ausgedehnte Gasvorläufer in dem versiegelten Gefäß den Druck in dem Gefäß erhöht, und Abkühlen der Suspension aus gasgefüllten Vesikeln, wonach auch Schütteln stattfinden kann.
Gefriertrocknen ist geeignet, um vor dem Schüttelinstallationsverfahren Wasser und organisches Material zu entfernen. Es können Trockeninstallationsverfahren verwendet werden, um Wasser aus Vesikeln zu entfernen. Indem der Gasvorläufer nach dem Erwärmen bereits in die getrockneten Vesikeln (d. h. vor dem Trocknen) eingeschlossen ist, kann der Gasvorläufer sich ausdehnen, um das Vesikel zu füllen. Gasvorläufer können auch verwendet werden, um getrocknete Vesikel zu füllen, nachdem sie einem Vakuum unterzogen wurden. Da die getrockneten Vesikel bei einer Temperatur unter ihrer Übergangstemperatur vom Gelzustand zum flüssigkristallinen Zustand gehalten werden, kann die Trockenkammer langsam mit dem Gasvorläufer im gasförmigen Zustand gefüllt werden.
Bevorzugte Verfahren zum Herstellen der temperaturaktivierten mit Gasvorläufer gefüllten Vesikel umfassen Schütteln einer wässrigen Lösung mit einer Lipidverbindung in Gegenwart eines Gasvorläufers bei einer Temperatur unter der Phasenübergangstemperatur vom flüssigen zum gasförmigen Zustand des Gasvorläufers. Dies wird vorzugsweise bei einer Temperatur unter der Phasenübergangstemperatur vom Gelzustand zum flüssigkristallinen Zustand des Lipids durchgeführt. Die Mischung wird anschließend auf eine Temperatur über der Phasenübergangstemperatur vom flüssigen zum gasförmigen Zustand des Gasvorläufers erhitzt, was bewirkt, dass der Vorläufer sich verflüchtigt und ausdehnt. Die Erhitzung wird anschließend fortgesetzt, und die Temperatur der Mischung kann dann unter die Phasenübergangstemperatur vom flüssigen zum gasförmigen Zustand des Gasvorläufers fallen. Das Schütteln der Mischung kann während des Erhitzungsschrittes oder im Anschluss an das Abkühlenlassen der Mischung erfolgen. Andere Verfahren des Herstellens mit Gasvorläufer gefüllter Vesikel kann das Schütteln einer wässrigen Lösung beispielsweise eines Lipids und eines Gasvorläufers und Trennen der resultierenden mit Gasvorläufer gefüllten Vesikel umfassen.
Herkömmliche, wässrig gefüllte Liposomen aus dem Stand der Technik werden routinemäßig bei einer Temperatur über der Phasenübergangstemperatur der zu ihrer Herstellung verwendeten Lipide gebildet, da sie im flüssigkristallinen Zustand flexibler und daher für biologische Systeme geeignet sind. Siehe beispielsweise Szoka und Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., 75: 4194–4198 (1978). Im Gegensatz dazu sind die nach hierin beschriebenen Ausführungsformen hergestellten Vesikel mit Gasvorläufer gefüllt, was größere Flexibilität verleiht, da Gasvorläufer nach der Gasbildung komprimierbarer und gefügiger sind als eine wässrige Lösung.
Die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Verfahren sehen das Schütteln einer wässrigen, ein Lipid umfassenden Lösung in Gegenwart eines temperaturaktivierbaren Gasvorläufers vor. Vorzugsweise wird das Schütteln mit soviel Kraft durchgeführt, dass sich innerhalb kurzer Zeit, beispielsweise in etwa 30 Minuten, vorzugsweise innerhalb von etwa 20 Minuten und mehr bevorzugt innerhalb von etwa 10 Minuten ein Schaum bildet. Das Schütteln kann Mikroemulgierung, Mikrofluidisierung, Wirbeln (beispielsweise durch Vortexen), eine Bewegung von Seite zu Seite oder nach oben und unten umfassen. Im Fall der Zugabe eines Gasvorläufers im Flüssigzustand kann außer den oben aufgeführten Schüttelverfahren eine Ultraschallbehandlung verwendet werden. Das Weiteren können verschiedene Bewegungsarten kombiniert werden. Das Schütteln kann außerdem erfolgen, indem der Behälter, der die wässrige Lipidlösung enthält, geschüttelt wird, oder indem die wässrige Lösung in dem Behälter geschüttelt wird, ohne den Behälter selbst zu schütteln. Des Weiteren kann das Schütteln manuell oder maschinell stattfinden. Mechanische Schüttler, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise die hierin zuvor beschriebenen, mechanischen Schüttler, wobei eine Capmix-Vorrichtung von Espe (Seefeld, Oberay, Deutschland) bevorzugt ist. Ein weiteres Mittel zum Hervorbringen einer Schüttelbewegung umfasst die Wirkung eines Gasvorläufers, der mit hoher Geschwindigkeit oder hohem Druck abgegeben wird.
Nach den hierin beschriebenen Verfahren kann außer einem Gasvorläufer ein Gas aus der lokalen Umgebungsatmosphäre bereitgestellt werden. Die lokale Umgebungsatmosphäre kann eine Atmosphäre innerhalb eines versiegelten Behälters sowie die äußere Umgebung umfassen. Alternativ kann beispielsweise ein Gas in den Behälter mit der wässrigen Lipidlösung oder in die wässrige Lösung selbst gespritzt oder anderweitig zugegeben werden, um ein anders Gas als Luft bereit zu stellen. Gase, die leichter als Luft sind, werden im Allgemeinen in einen versiegelten Behälter gegeben, während Gase, die schwerer als Luft sind, in einen versiegelten oder einen unversiegelten Behälter gegeben werden können. Die vorliegende Erfindung umfasst daher das gemeinsame Einschließen von Luft und/oder anderen Gasen zusammen mit den hierin beschriebenen Gasvorläufern.
Die mit Gasvorläufer gefüllten Vesikel können auf im Wesentlichen dieselbe Art wie die hierin beschriebenen gasgefüllten Vesikel verwendet werden, sobald sie durch Verabreichung an die Gewebe eines Wirts aktiviert sind, wobei Faktoren wie Temperatur oder pH-Wert verwendet werden können, um die Bildung des Gases zu bewirken. Die Gasvorläufer können Phasenübergänge vom flüssigen in den gasförmigen Zustand bei oder in der Nähe der normalen Körpertemperatur des Wirts durchlaufen und können beispielsweise durch die in-vivo-Temperatur des Wirts aktiviert werden, um darin einen Übergang in die gasförmige Phase zu durchlaufen. In den bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Aktivierung vor der Verabreichung an einen Patienten beispielsweise durch thermische, mechanische oder optische Mittel verwendet. Diese Aktivierung kann stattfinden, wenn beispielsweise das Wirtsgewebe menschliches Gewebe mit einer Normaltemperatur von 37°C ist und die Gasvorläufer bis etwa 60°C oder etwa 70°C Phasenübergänge von flüssigen zu gasförmigen Zuständen durchlaufen.
In jeder der oben zur Herstellung lipidbasierter Vesikel beschrieben Techniken können photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden vor, während oder nach Bildung der Vesikel mit den Lipiden eingeschlossen werden, wie einem durchschnittlichen Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig ist.
Konjugate von Zielliganden und fluorierten Tensiden, bioaktiven Mitteln und fluorierten Tensiden oder photoaktiven Mitteln und fluorierten Tensiden können durch Varianten eines Themas synthetisiert werden, das durch die in der vorliegenden Offenbarung ausgeführte Reaktionsfolge nahe gelegt wird, sowie in Übereinstimmung mit Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise offenbart von Quay et al., europäische Patentveröffentlichung EP 0 727 225 A2 . Beispielsweise können Konjugate aus Zielligand und fluoriertem Tensid, Konjugate aus bioaktivem Mittel und fluoriertem Tensid oder Konjugate aus photoaktivem Mittel und fluoriertem Tensid mit den Reaktionschemata unten hergestellt werden, wobei sich „LIG" auf einen Zielliganden, ein bioaktives Mittel oder ein photoaktives Mittel bezieht und „R_f" sich auf ein fluoriertes Tensid oder ein fluoriertes Lipid bezieht. „R_f" kann beispielsweise (C_nF_2n+1) sein. R_f(CH₂CH₂O)_xCOCl + LIG-NH₂ → R_f(CH₂CH₂O)_xCONH-LIG R_f(OCH₂CH₂)_xCOCl + LIG-OH → R_f(CH₂CH₂O)_xCO₂-LIG R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xSH + LIG-SH → R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xSS-LIG R_fSO₂Cl + LIG-NH₂ → R_fSO₂NH-LIG LIG-CHO+R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xNH₂ + NaCNBH₃ → R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xNH-LIG LIG-Br + R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xSH → R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xS-LIG Lig-Br + R_fCH₂ + Bu₃SnH → R_fCH₂CH₂-LIG R_fCOCl + LIG-NH₂ → R_fCONH-LIG R_fNCO + LIG-NH₂ → R_fNCONH-LIG LIG-CHO + R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xNH₂ → R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_xNH-LIG + R_fCO → (R_fCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_x)(R_fCO)N-LIG
In Bezug auf polyethylenglycolhaltige Fragmente können Folgende verwendet werden, beispielsweise PEG2-NHS-Ester, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL, Methoxy-PEG-Vinylsulfon, PEG-(VS)₂, Methoxy-PEG-Ald, PEG-(Ald)₂, Methoxy-PEG-Epx, PEG-(Epx)₂, Methoxy-Tres, PEG-(Tres)₂, Methoxy-PEG-NPC, PEG-(NPC)₂, Methoxy-PEG-CDI, PEG-(CDI)₂, mPEG-Gly-Osu, mPEG-Nle-Osu, Methoxy-SPA-PEG, (SPA)₂-PEG, Methoxy-SS-PEG, (SS)₂-PEG, von denen alle von Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama, USA) erhältlich sind. Wenn diese Arten von Fragment verwenden werden, d. h. wenn die Fragmente selbst keine Tensideigenschaften aufweisen, die für eine bestimmte Ultraschallkontrastformulierung adäquat sind, oder nur schwach als Tenside wirken, kann das gebildete Konjugat in der Endformulierung in Verbindung mit anderen Tensiden verwendet werden.
Vesikelzusammensetzungen, die Vesikel umfassen, welche aus Proteinen formuliert sind, wie beispielsweise Albuminvesikel, können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden, wie einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig ist. Geeignete Verfahren umfassen die beispielsweise in US-Patent Nr. 4,572,203, 4,718,433, 4,774,958 und 4,957,656 beschriebenen. Zu diesen Verfahren gehören auch solche, die eine Ultraschallbehandlung einer Proteinlösung umfassen. In bevorzugter Form kann das Startmaterial eine wässrige Lösung oder ein hitzedenaturierbares, wasserlösliches, biokompatibles Protein sein. Das verkapselnde Protein ist vorzugsweise hitzeempfindlich, so dass es durch Erhitzen während der Ultraschallbehandlung partiell unlöslich gemacht werden kann. Geeignete hitzeempfindliche Proteine umfassen beispielsweise Albumin, Hämoglobin und Kollagen, vorzugsweise ist das Protein ein menschliches Protein, wobei Humanserumalbumin (HSA) mehr bevorzugt ist. HAS ist kommerziell als eine sterile, 5%ige wässrige Lösung erhältlich, die für die Verwendung bei der Herstellung proteinbasierter Vesikel geeignet ist. Wie einem durchschnittlichen Fachmann geläufig ist, können andere Konzentrationen von Albumin sowie andere Protein, die hitzedenaturierbar sind, verwendet werden, um die Vesikel herzustellen. Allgemein ausgedrückt, kann die Konzentration von HSA variieren und im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 25 Gew.-% liegen, einschließlich aller Kombinationen und Unterkombinationen darin liegender Bereiche. In Verbindung mit bestimmten Verfahren für die Herstellung proteinbasierter Vesikel kann es vorzuziehen sein, das Protein in Form einer verdünnten wässrigen Lösung einzusetzen. Bei Albumin kann bevorzugt sein, eine wässrige Lösung zu verwenden, die von etwa 0,5 bis etwa 7,5 Gew.-% Albumin enthält, wobei Konzentrationen von weniger als etwa 5 Gew.-% bevorzugt sind, beispielsweise von etwa 0,5 bis etwa 3 Gew.-%.
Proteinbasierte Vesikel können unter Verwendung von kommerziell erhältlicher Ausrüstung hergestellt werden. Beispielsweise können in Verbindung mit einem Futtermittelherstellungsverfahren, wie beispielsweise offenbart in US-Patent Nr. 4,957,656, rostfreie Edelstahltanks, die kommerziell von Walker Stainless Equipment Co. (New Lisbon, WI, USA) erhältlich sind, und Verfahrensfilter, die von Millipore (Bedford, MA, USA) kommerziell erhältlich sind, verwendet werden.
Für das Ultraschallverfahren können sowohl ein Wärmeaustauscher als auch ein Durchsatz-Beschallungsgefäß in Reihe verwendet werden. Wärmeaustauscherausrüstung dieser Art ist von ITT Standard (Buffalo, NY) erhältlich. Der Warmeaustauscher hält die Betriebstemperatur für den Ultraschallvorgang aufrecht, wobei die Temperatursteuerung im Bereich von etwa 65°C bis etwa 80°C liegt, je nach Aufmachung des Mediums. Die Vibrationsfrequenz der Ultraschallausrüstung kann über einen weiten Bereich variieren, beispielsweise von etwa 5 bis etwa 40 Kilohertz (kHz), wobei die Mehrzahl der kommerziell erhältlichen Ultraschallgeräte bei etwa 10 oder 20 kHz arbeitet. Geeignete Ultraschallausrüstung umfasst beispielsweise eine Vibra-Cell von Sonics & Materials, ausgestattet mit einem Ultraschallkopf mit abgeflachter Spitze, erhältlich von Sonics & Materials, Inc. (Danbury, Ct, USA). Die auf das Ultraschallkopf angewandte Energie kann auf einer werkseitig eingestellten Energieskala von 1 bis 10 variiert werden, wie bei Vibra-Cell-Modell VL1500 von Sonics & Materials. Es kann eine mittlere Energieeinstellung, beispielsweise von 5 bis 9, verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass die Vibrationsfrequenz und die zugeführte Energie ausreichen sind, um eine Kavitation in der beschallten Lösung hervorzurufen. Die Zufuhr-Durchsatzraten können von etwa 50 ml/Min bis etwa 1000 ml/Min reichen, einschließlich aller Kombinationen und Unterkombinationen von darin liegenden Bereichen. Die Verweildauer in dem Beschallungsgefäß kann von etwa 1 Sekunde bis etwa 4 Minuten reichen und die Rate des Hinzufügens eines gasförmigen Fluids kann im Bereich von etwa 10 Kubikzentimetern (cc) pro Minute bis etwa 100 cc/Min. oder bei 5% bis 25% der Zufuhr-Durchsatzrate liegen, einschließlich aller Kombinationen und Unterkombinationen von darin liegenden Bereichen.
Es kann bevorzugt sein, die Ultraschallbehandlung derart durchzuführen, um ein Schäumen und insbesondere intensives Schäumen der Lösung hervorzubringen. Intensives Schäumen und Aerosolbildung sind im Allgemeinen wichtig, um eine Kontrastmittel mit verstärkter Konzentration und Stabilität zu erhalten. Zur Förderung des Schäumens kann der Energieeintrag in das Beschallungshorn erhöht werden und der Vorgang kann unter schwachem Druck erfolgen, beispielsweise bei etwa 1 bis etwa 5 psi. Schäumen kann leicht durch das trübe Aussehen der Lösung und durch den produzierten Schaum festgestellt werden.
Geeignete Verfahren für die Herstellung proteinbasierter Vesikel können auch ein physikalisches oder chemisches Verändern des Proteins oder von Proteinderivaten in wässriger Lösung umfassen, um das Material zu denaturieren oder zu fixieren. Beispielsweise können proteinbasierte Vesikel aus einer 5%igen wässrigen HSA-Lösung durch Erhitzen nach oder während der Bildung des Kontrastmittels durch Ultraschallbehandlung hergestellt werden. Chemische Veränderung kann das chemische Denaturieren oder Fixieren durch Binden des Proteins mit einem bifunktionellen Aldehyd wie beispielsweise Glutaraldehyd umfassen. Beispielsweise können die Vesikel mit 0,25 Gramm 50%igem wässrigem Glutaraldehyd pro Gramm Protein bei pH 4,5 für 6 Stunden umgesetzt werden. Das nicht umgesetzte Glutaraldehyd kann dann vom Protein gewaschen werden.
In jeder der oben zur Herstellung proteinbasierter stabilisierender Materialien und/oder Vesikel beschriebenen Techniken können photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden vor, während oder nach der Bildung der Vesikel mit den Proteinen eingeschlossen werden, wie einem durchschnittlichen Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig ist.
Vesikelzusammensetzungen, die Vesikel umfassen, die aus Polymeren formuliert sind, können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, wie einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung geläufig ist. Geeignete Verfahren umfassen beispielsweise Grenzflächenpolymerisation, Phasentrennung und Koazervierung, Herstellung durch Zentrifugation durch mehrere Öffnungen sowie Lösungsmittelverdunstung. Geeignete Verfahren, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung angewandt oder modifiziert werden können, umfassen solche Verfahren, die in US-Patent Nr. 4,179,546, 3,945,956, 4,108,806, 3,293,114, 3,401,475, 3,479,811, 3,488,714, 3,615,972, 4,549,892, 4,540,629, 4,421,562, 4,420,422, 4,898,734, 4,822,534, 3,732,172, 3,594,326 und 3,015,128; in Japan Kokai Tokkyo Koho 62 286534, in dem britischen Patent Nr. 1,044,680, in Deasy, Microencapsulation and Related Drug Processes, 20: 195–240 (Marcel Dekker, Inc., N. Y., 1984), Chang et al., Canadian J. of Physiology and Pharmacology, 44: 115–129 (1966) und in Chang, Science 146: 524–525 (1964) beschrieben sind.
In einem bevorzugten Verfahren können die Vesikel hergestellt werden, indem ein Wärmeausdehnungsverfahren verwendet wird, das beispielsweise in US-Patent Nr. 4,179,546, 3,945,956 und 4,108,806, in dem britischen Patent Nr. 1,044,680 und in Japan Kokai Tokkyo Koho 62 286534 beschrieben ist. Im Allgemeinen kann das Wärmeausdehnungsverfahren durchgeführt werden, indem Vesikel eines expandierbaren Polymers oder Copolymers hergestellt werden, die in ihrem Leerraum (Kavität) eine flüchtige Flüssigkeit (Gasvorläufer) enthalten. Das Vesikel wird anschließend erhitzt, wodurch das Vesikel vorgeweicht und die flüchtige Flüssigkeit zu einem Gas umgewandelt wird, was bewirkt, dass sich das Vesikel auf bis zum Mehrfachen seiner ursprünglichen Größe ausdehnt. Wenn die Wärme entfernt wird, behält das thermoplastische Polymer mindestens einen Teil seiner expandierten Form bei. Durch dieses Verfahren hergestellte Vesikel neigen dazu, eine besonders niedrige Dichte zu haben.
Polymere, die für das Wärmeausdehnungsverfahren geeignet sind, sind einem Fachmann leicht geläufig und umfassen thermoplastische Polymere oder Copolymere, einschließlich Polymere oder Copolymere vieler der oben beschriebenen Monomere. Bevorzugte der oben beschriebenen Polymere oder Copolymere umfassen Polyvinyliden-Polyacrylonitril, Polyvinyliden-Polyacrylonitril-Polymethylmethacrylat und Polystyrol-Polyacrylonitril. Ein am meisten bevorzugtes Copolymer ist Polyvinyliden-Polyacrylonitril.
Flüchtige Flüssigkeiten, die für das Wärmeausdehnungsverfahren geeignet sind, sind einem Fachmann leicht geläufig und umfassen aliphatische Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Ethan, Ethylen, Propan, Propen, Butan, Isobutan, Neopentan, Acetylen, Hexan Heptan, Chlorfluorkohlenstoffe wie beispielsweise CCl₃F, CCl₂F₃, CClF₃, CClF₂-CCl₂F₂, Chlorheptafluorcyclobutan und 1,2-Dichlorhexafluorcyclobutan, Tetraalkylsilane wie beispielsweise Tetramethylsilan, Trimethylethylsilan, Trimethylisopropylsilan und Trimethyl-n-propylsilan sowie Perfluorkohlenstoffe, einschließlich die oben beschriebenen Perfluorkohlenstoffe. Es ist wichtig, dass die flüchtige Flüssigkeit kein Lösungsmittel für das verwendete Polymer oder Copolymer darstellt. Es ist außerdem bevorzugt, dass die flüchtige Flüssigkeit einen Siedepunkt hat, der unter der Erweichungstemperatur des beteiligten Polymers oder Copolymers liegt. Siedepunkte verschiedener flüchtiger Flüssigkeiten und Erweichungstemperaturen verschiedener Polymere und Copolymere sind für einen Fachmann leicht feststellbar und geeignete Kombinationen von Polymeren und Copolymeren und flüchtigen Flüssigkeiten sind einem Fachmann geläufig. Als Richtlinie, und wie ein Fachmann erkennt, gilt, dass mit steigender Länge der Kohlenstoff kette der flüchtigen Flüssigkeit auch der Siedepunkt dieser Flüssigkeit steigt. Ein sanftes Vorerhitzen der Vesikel in Wasser in Gegenwart von Wasserstoffperoxid vor dem endgültigen Erhitzen und der endgültigen Ausdehnung kann außerdem die Vesikel vorweichen, damit die Ausdehnung leichter stattfinden kann.
Um beispielsweise Vesikel aus synthetischen Polymeren herzustellen, können Vinyliden und Acrylnitril in einem Medium von Isobutanflüssigkeit mithilfe eines oder mehr der vorangehenden modifizierten oder unmodifizierten Verfahren aus der Literatur copolymerisiert werden, so dass Isobutan in den Vesikeln eingeschlossen wird. Werden solche Vesikel anschließend auf eine Temperatur von etwa 80°C bis etwa 120°C erhitzt, dehnt sich das Isobutangas aus, was wiederum die Vesikel ausdehnt. Nachdem die Hitze entfernt wird, verbleiben die ausgedehnten Vesikel aus Polyvinyliden- und Acrylnitril-Copolymer im Wesentlichen in ihrer ausgedehnten Position fixiert. Die resultierenden Vesikel mit geringer Dichte sind sowohl trocken als auch in einem wässrigen Medium suspendiert extrem stabil. Isobutan wird hierin lediglich als eine veranschaulichende Flüssigkeit verwendet, unter der Voraussetzung, dass andere Flüssigkeiten, die bei Temperaturen, die für die Synthese dieser Vesikel und die Bildung der Vesikel sehr geringer Dichte bei Erhitzen geeignet sind, einen Übergang vom flüssigen zum gasförmigen Zustand durchlaufen, für Isobutan substituiert werden können. Gleichermaßen können Monomere außer Vinyliden und Acrylnitril bei der Herstellung der Vesikel verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Vesikel, die aus synthetischen Polymeren formuliert sind und die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, von Expancel, Nobel Industries (Sundsvall, Schweden) kommerziell erhältlich, einschließlich EXPANCEL 551 DE(TM) Mikrokügelchen. Die EXPANCEL 551 DE(TM) Mikrokügelchen sind aus einem Copolymer von Vinyliden und Acrylnitril zusammengesetzt, in dem flüssiges Isobutan verkapselt ist. Solche Mikrokügelchen werden als eine trockene Zusammensetzung verkauft und haben eine Größe von etwa 50 μm. Die EXPANCEL 551 DE(TM) Mikrokügelchen haben eine relative Dichte von nur 0,02 bis 0,05, was zwischen einem Fünftel und einem Zwanzigstel der Dichte von Wasser liegt.
In jeder der oben für die Herstellung polymerbasierter stabilisierender Materialien und/oder Vesikel beschriebenen Techniken können vor, während oder nach der Bildung der Vesikel photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden mit den Polymeren eingeschlossen werden, wie einem Fachmann angesichts der vorliegenden Erfindung geläufig ist.
Wie bei der Herstellung von stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln sind für die Herstellung von stabilisierenden Materialien, die photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden umfassen, viele Techniken verfügbar. Beispielsweise können die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikelzusammensetzungen aus einer Mischung von Lipidverbindungen, photoaktiven Mitteln, bioaktiven Mitteln und/oder Zielliganden und Gasen und/oder Gasvorläufern hergestellt sein. In diesem Fall werden Lipidzusammensetzungen wie oben beschrieben hergestellt, wobei die Zusammensetzungen auch photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden umfassen. Mizellen können also beispielsweise in der Gegenwart von eines photoaktiven Mittels, bioaktiven Mittels und/oder eines Zielliganden hergestellt werden. In Verbindung mit Lipidzusammensetzungen, die ein Gas umfassen, kann die Herstellung beispielsweise das Blasen eines Gases direkt in eine Mischung der Lipidverbindungen und einem zusätzlichen Material oder mehreren zusätzlichen Materialien umfassen. Alternativ können die Lipidzusammensetzungen aus Lipidverbindungen und Gas und/oder Gasvorläufern vorgeformt werden. Im letzteren Fall wird das photoaktive Mittel, das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand dann anschließend vor dem Gebrauch zu der Lipidzusammensetzung gegeben. Beispielsweise kann eine wässrige Mischung von Liposomen und Gas hergestellt werden, der das photoaktive Mittel, das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand zugegeben wird, und die bewegt wird, um die Liposomenzusammensetzung bereit zu stellen. Die Liposomenzusammensetzung kann leicht isoliert werden, da die mit Gas und/oder dem photoaktiven Mittel, dem bioaktiven Mittel und/oder dem Zielliganden gefüllten Liposomenvesikel im Allgemeinen oben auf der wässrigen Lösung schwimmen. Überschüssiges photoaktives Mittel, bioaktives Mittel und/oder Zielligand kann aus der verbleibenden wässrigen Lösung wiedergewonnen werden.
Wie ein Fachmann erkennt, kann jedes der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikelzusammensetzungen zur Aufbewahrung lyophilisiert und mithilfe starker Bewegung rekonstituiert oder rehydriert werden, beispielsweise mit einem wässrigen Medium (beispielsweise steriles Wasser, phosphatgepufferte Lösung oder wässrige Salzlösung). Lyophilisierte Zubereitungen haben im Allgemeinen den Vorteil längerer Haltbarkeit. Zum Verhindern einer Agglutination oder Fusion der Lipide und/oder Vesikel als Ergebnis der Lyophilisierung kann es nützlich sein, Additive zuzugeben, die verhindern, dass eine solche Agglutination oder Fusion stattfindet. Geeignete Additive umfassen Sorbitol, Mannitol, Natriumchlorid, Glucose, Dextrose, Trehalose, Polyvinylpyrrolidon und Poly(ethylenglycol) (PEG), beispielsweise PEG 400. Diese und andere Additive sind in der Literatur beschrieben, beispielsweise in der US-Pharmakopöe, USP XXII, NF XVII, The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, USA.
Die Konzentration an Lipiden, die erforderlich ist, um eine gewünschte Menge an stabilisierten Vesikeln zu bilden, richtet sich nach der Art des verwendeten Lipids und kann durch Routineexperimente einfach bestimmt werden. Beispielsweise ist die Konzentration von 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), das verwendet wird, um stabilisierte Vesikel nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung herzustellen, etwa 0,1 mg/ml bis etwa 30 mg/ml Salzlösung, mehr bevorzugt etwa 0,5 mg/ml bis etwa 20 mg/ml Salzlösung und am meisten bevorzugt etwa 1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml Salzlösung. Die Konzentration von Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), das in bevorzugten Ausführungsformen verwendet wird, ist etwa 0,1 mg/ml bis etwa 30 mg/ml Salzlösung, mehr bevorzugt etwa 0,5 mg/ml bis etwa 20 mg/ml Salzlösung und am meisten bevorzugt etwa 1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml Salzlösung. Die Menge der Zusammensetzung, die einem Patienten verabreicht wird, kann variieren. Typischerweise kann die intravenöse Dosis weniger als etwa 10 ml für einen Patienten mit 70 kg betragen, wobei geringere Dosen bevorzugt sind.
Eine andere Ausführungsform des Herstellens einer therapeutischen Zielzusammensetzung umfasst das Kombinieren mindestens eines Lipids und eines Gasvorläufers; Bewegen, bis sich gasgefüllte Vesikel bilden; Zugeben eines photoaktiven Mittels, bioaktiven Mittels und/oder eines Zielliganden zu den gasgefüllten Vesikeln, so dass das photoaktive Mittel, das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand an das gasgefüllte Vesikel durch eine kovalente Bindung oder eine nicht-kovalente Bindung bindet; und Bewegen, bis ein Transport-/Abgabevehikel resultiert, das gasgefüllte Vesikel und ein photoaktives Mittel, bioaktives Mittel und/oder einen Zielligand umfasst. Anstelle des Bewegens, bis sich gasgefüllte Vesikel bilden, bevor das photoaktive Mittel, das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand zugegeben werden, kann der Gasvorläufer bis zum Zeitpunkt der Verwendung ein Gasvorläufer bleiben.
Alternativ kann ein Verfahren des Herstellens einer therapeutischen Zielzusammensetzung das Kombinieren mindestens eines Lipids und eines photoaktiven Mittels, bioaktiven Mittels und/oder eines Zielliganden umfassen, so dass das photoaktive Mittel, das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand an das Lipid durch eine kovalente Bindung oder eine nicht-kovalente Bindung bindet; Zugeben eines Gasvorläufers und Bewegen, bis ein Transport-/Abgabevehikel resultiert, das gasgefüllte Vesikel und ein photoaktives Mittel, bioaktives Mittel und/oder einen Zielligand umfasst. Der Gasvorläufer kann zugegeben werden und bis zum Zeitpunkt der Verwendung ein Gasvorläufer bleiben.
Alternativ können die Gasvorläufer verwendet werden, um stabile gasgefüllte Vesikel mit photoaktiven Mitteln, bioaktiven Mitteln und/oder Zielliganden zu erzeugen, die vor dem Gebrauch gebildet werden. In dieser Ausführungsform werden der Gasvorläufer und das photoaktive Mittel, das bioaktive Mittel und/oder der Zielligand zu einem Behälter gegeben, in dem sich ein Suspensions- und/oder Stabilisierungsmedium bei einer Temperatur unter der Phasenübergangstemperatur von flüssig zu gasförmig des entsprechenden Gasvorläufers befindet. Wenn die Temperatur dann überschritten wird und sich eine Emulsion zwischen dem Gasvorläufer und der flüssigen Lösung bildet, durchläuft der Gasvorläufer einen Übergang vom flüssigen zum gasförmigen Zustand. Als Ergebnis dieser Erhitzung und Gasbildung verdrängt das Gas die Luft im Gasraum über der flüssigen Suspension, um gasgefüllte Lipidkügelchen zu bilden, welche das Gas des Gasvorläufers, das Umgebungsgas, beispielsweise Luft, einschließen oder Gasvorläufer im gasförmigen Zustand und Umgebungsluft zusammen einschließen. Dieser Phasenübergang kann für optimales Mischen und Stabilisieren des Transport-/Abgabevehikels verwendet werden. Beispielsweise kann der Gasvorläufer Perfluorbutan in dem Lipid oder einer anderen stabilisierenden Verbindung eingeschlossen sein, und wenn die Temperatur über den Siedepunkt von Perfluorbutan (4°C) hinaus erhöht wird, ergibt sich ein in der stabilisierenden Verbindung eingeschlossenes Fluorbutangas. Als ein weiteres Beispiel kann der Gasvorläufer Fluorbutan in einer wässrigen Lösung suspendiert werden, die emulgierende und stabilisierende Mittel wie beispielsweise Glycerol oder Propylenglycol enthält, und auf einem kommerziellen Vortexter gevortext werden. Das Vortexen wird bei einer Temperatur durchgeführt, die niedrig genug ist, damit der Gasvorläufer flüssig ist, und fortgesetzt wird, während die Temperatur der Probe über die Phasenübergangstemperatur vom flüssigen zum gasförmigen Zustand hinaus erhöht wird. Dabei wandelt sich der Vorläufer während des Mikroemulgierungsvorgangs in den gasförmigen Zustand um. In Gegenwart der geeigneten stabilisierenden Mittel entstehen überraschend stabile gasgefüllte Vesikel und photoaktive Mittel, bioaktive Mittel und/oder Zielliganden.
Alle obigen Ausführungsformen, welche die Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten stabilisierten gasgefüllten Vesikel umfassen, können durch Autoklavieren oder Sterilfiltration sterilisiert werden, wenn diese Verfahren entweder vor dem Gasinstillationsschritt oder vor der temperaturvermittelten Gasumwandlung der temperaturempfindlichen Gasvorläufer in der Suspension durchgeführt werden. Alternativ können ein oder mehrere antibakterielle Mittel und/oder Konservierungsmittel in der Formulierung der Zusammensetzungen enthalten sein, einschließlich beispielsweise Natriumbenzoat, alle Quaternären Ammoniumsalze, Natriumazid, Methylparaben, Propylparaben, Sorbinsäure, Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Chlorbutanol, Dehydroessigsäure, Ethylendiamin, Monothioglycerol, Kaliumbenzoat, Kaliummetabisulfit, Kaliumsorbat, Natriumbisulfit, Schwefeldioxid und organische Quecksilbersalze. Solche Sterilisation, die auch durch andere herkömmliche Mittel erreicht werden kann, wie beispielsweise durch Bestrahlung, ist erforderlich, wenn die stabilisierten Mikrokügelchen für Bilddarstellung unter invasiven Umständen verwendet werden, beispielsweise intravaskulär oder intraperitoneal. Die geeigneten Sterilisationsmittel sind dem Fachmann, der von der vorliegenden Beschreibung der stabilisierten gasgefüllten Vesikel und deren Verwendung angeleitet wird, geläufig. Die Zusammensetzungen werden im Allgemeinen als wässrige Suspension gespeichert, aber im Falle getrockneter oder lyophilisierter Vesikel oder getrockneter oder lyophilisierter Lipidkügelchen können die Zusammensetzungen als ein getrocknetes oder lyophilisiertes Pulver gespeichert werden, das vor dem Gebrauch sofort rekonstituiert oder rehydriert werden kann.
Darüber hinaus können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Form einer festen porösen Matrix vorliegen. Eine feste poröse Matrix kann mit einem Lösungsmittel, einem Tensid, einem Gas und/oder Gasvorläufer, einem photoaktiven Mittel, einem bioaktiven Mittel und/oder einem Zielliganden hergestellt werden. Der Zielligand kann an das Tensid der festen porösen Matrix angebracht werden, indem er an eines oder mehr der in den Zusammensetzungen verwendeten Materialien, aus denen sie hergestellt werden, gebunden wird, einschließlich die Lipide, Proteine, Polymere und/oder zusätzliche stabilisierende Materialien.
Eine feste poröse Matrix, die ein Lösungsmittel, ein Tensid und ein photoaktives Mittel, einen Zielliganden und/oder ein bioaktives Mittel umfasst, kann durch kontrollierte Bewegung oder kontrolliertes Trocknen anhand einer Reihe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren verarbeitet werden. Die Verfahren des Trocknens umfassen beispielsweise Sprühtrocknen, Lyophilisieren und Vakuumtrocknen. Bewegungsverfahren umfassen beispielsweise Schütteln, Vortexen und Bearbeitung in einer Kugelmühle.
Am meisten bevorzugt wird eine feste poröse Matrix, die ein Tensid und ein photoaktives Mittel, einen Zielliganden und/oder ein bioaktives Mittel umfasst, derart hergestellt, dass ein Lösungsmittel, ein Tensid und ein photoaktives Mittel, ein Zielligand und/oder ein bioaktives Mittel kombiniert werden, um eine Emulsion in Form eines zufälligen Aggregates zu bilden. Im Fall von Sprühtrocknen wird die Emulsion oder die kolloidale Suspension in Assoziation mit einem Treibmittel, wie beispielsweise Methylenoxid, platziert. Jeder Inhaltsstoff der festen porösen Matrix, das Lösungsmittel, Tensid und das photoaktive Mittel, der Zielligand und/oder das bioaktive Mittel, können kombiniert werden und das Treibmittel anschließend dazu gegeben werden. Alternativ können die Inhaltsstoffe getrennt und in einem Luftstrom zusammen mit dem Treibmittel kombiniert werden. Das Treibmittel wird von dem Tensid, wie beispielsweise einem Phospholipid oder einem Fluorierten Tensid, in wässrigem oder organischem Medium stabilisiert, wobei ersteres bevorzugt ist. Darüber hinaus können manche Emulsionen aus unpolarem photoaktivem Mittel ein Öl enthalten, um Löslichkeit zu bewirken. Wenn die Suspension oder Emulsion dann sprühgetrocknet wird, trocknen das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel und das Treibmittel und das Lösungsmittel werden entfernt, wobei sie dazu neigen, in den Kristallen des photoaktiven Mittels und/oder bioaktiven Mittels Mikrokavitäten zu bilden. Die Tenside neigen typischerweise dazu, an die Oberfläche des porösen Kristallgitters des photoaktiven Mittels und/oder bioaktiven Mittels zu adsorbieren. Das resultierende pulverförmige kristalline Material kann dann unter einem Gasraum des gewünschten Gases aufbewahrt werden. Vorzugsweise wird ein unlösliches Gas wie Perfluorbutan ausgewählt. Dieses führt zu kristallinen Matrizen, die unlösliches Gas aufnehmen. Wenn die Matrizen resuspendiert werden, ergeben sich als Resultat kristalline Matrizen aus photoaktivem Mittel und/oder bioaktivem Mittel, die von einem Film von Gas-/Gasvorläufermaterial und Tensid und wahlweise einem Zielliganden umgeben sind.
Als eine Alternative zum Sprühtrocknen können die kristallinen Matrizen photoaktiver Mittel und/oder bioaktiver Mittel durch Lyophilisieren hergestellt werden. Eine andere Alternative, Bewegen, beispielsweise mithilfe einer Kugelmühle, kann anstelle von oder in Kombination mit Sprühtrocknen und/oder Lyophilisierung durchgeführt werden. Mit einer Kugelmühle oder einer Kolloidmühlenvorrichtung kann eine Großmenge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die kristallinen Partikel geeigneter Größe, im Allgemeinen unter 10 μm, vorzugsweise unter 5 μm und noch mehr bevorzugt unter 1 μm, werden hergestellt, indem die Bulk-Kristalle ausreichender Energie und Dauer des Kugelmühlenverfahrens unterzogen werden. Die Tenside können vor oder während des Kugelmühlenverfahrens in die kristalline Bulk-Matrix eingeschlossen werden. Alternativ kann das Tensid nach der Herstellung der Mikropartikel in die kristalline Matrix eingebaut werden. In diesem letzteren Fall können die kristallinen Mikropartikel oder Nanopartikel in einem Lösungsmittel (im Allgemeinen organisch) suspendiert werden, in welchem das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel unlöslich sind. Das Tensid wird der Suspension zugegeben und durch Bewegen gemischt. Das organische Lösungsmittel kann durch Lyophilisieren oder Sprühtrocknen entfernt werden. Die resultierende mikro- oder nanokristalline feste tensidische Matrix eines Tensids und eines photoaktiven Mittels und/oder bioaktiven Mittels mit getrocknetem Tensid wird dann in einem Gasraum des geeigneten Gases aufbewahrt und vor der Verwendung hydriert.
Das Lösungsmittel der festen porösen Matrix kann ein wässriges Lösungsmittel oder ein organisches Lösungsmittel sein. Geeignete Lösungsmittel umfassen alkylierte Alkohole, Ether, Acetone, Alkane, Dimethylsulfoxid, Toluol, zyklische Kohlenwasserstoffe, Benzol und Gasvorläufer. Die Ether können methoxylierte Ether, alkylierte Ether, Diether, Triether, Oligoether, Polyether, zyklische Ether und Kronenether sein, der alkylierte Alkohol kann Methanol sein und das Alkan kann Hexan sein. Das Lösungsmittel kann partiell oder vollständig fluoriert sein. Das Lösungsmittel ist ein Suspensionsmedium für das Assoziieren des Tensids mit dem photoaktiven Mittel bei der Herstellung einer festen porösen Matrix. Das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel ist typischerweise nur geringfügig in dem Lösungsmittel löslich.
Beim Herstellen einer festen porösen Matrix können die Tenside, Gase, Gasvorläufer, photoaktiven Mittel, bioaktiven Mittel und/oder Zielliganden alle Beliebigen der hierin beschriebenen sein.
Das bei der Herstellung einer festen porösen Matrix geeignete Lösungsmittel kann während des Verarbeitens der Matrix entfernt werden. Während des Sprühtrocknens können beispielsweise das Lösungsmittel, das Tensid und das photoaktive Mittel zusammen mit einem Treibmittel in einen gasförmigen Strom derart kombiniert werden, dass ein wesentlicher Anteil des Lösungsmittels während des Sprühtrocknens verdunstet. Als ein Ergebnis wird eine feste poröse Matrix eines Tensids und eines photoaktiven Mittels, eines bioaktiven Mittels und/oder eines Zielliganden hergestellt.
Weitere Einzelheiten in Bezug auf feste poröse Matrixsysteme sind in der vorläufigen US-Anmeldung, Serien-Nr. 60/046,379, beantragt am 13. Mai 1997, beschrieben.
Wie oben erläutert, sind die optoakustischen Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Ultraschallbilddarstellung und optischer Bilddarstellung besonders geeignet. Diagnostischer Ultraschall kann verwendet werden, um die Vesikel oder stabilisierenden Materialien zu visualisieren, den Ort der Vesikel oder der stabilisierenden Materialien in bestimmten Geweben zu verifizieren und/oder die Vesikel oder stabilisierenden Materialien zu schwingen. Therapeutischer Ultraschall kann verwendet werden, um ein Aufbrechen der Vesikel oder stabilisierenden Materialien zu fördern, wenn die Vesikel oder stabilisierenden Materialien das beabsichtigte Ziel, einschließlich Gewebe- und/oder Rezeptorziele, erreichen.
Das Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung kann geeignet sein, um Bilder von Gewebe, wie beispielsweise Myokard-, Endothel- und/oder Epithelgewebe sowie der gastrointestinalen, pulmonalen und kardiovaskulären Regionen, bereit zu stellen, kann aber auch breiter eingesetzt werden, wie beispielsweise bei der Bilddarstellung des Gefäßsystems oder auf andere Weise, wie einem Fachmann leicht geläufig ist. Erkranktes Gewebe umfasst beispielsweise Endothelgewebe, das aus einem Gefäßsystem resultiert, welches ein erkranktes Gewebe unterstützt. Als Ergebnis weist die Lokalisierung und Visualisierung von Endothelgewebe in einer Region eines Patienten, die unter normalen Bedingungen nicht mit Endothelgewebe assoziiert ist, auf erkranktes Gewebe in der Region hin. Die vorliegenden Verfahren können auch in Verbindung mit dem Transport/der Abgabe von Zielliganden an interne Regionen eines Patienten verwendet werden.
Darüber hinaus lehrt die vorliegenden Erfindung Verfahren des Abgebens eines therapeutischen photoaktiven Mittels an einen Patienten und/oder Behandeln eines Zustands in einem Patienten durch Verabreichen der optoakustischen Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung an einen Patienten, wobei bei dem Patienten oder einer Region des Patienten Ultraschall angewandt wird, um das photoaktive Mittel und/oder bioaktive Mittel abzugeben, und wobei dem Patienten oder einer Region des Patienten anschließend Lichtenergie verabreicht wird. Vorzugsweise brechen im Wesentlichen alle optoakustischen Kontrastmittel, stabilisierenden Mittel und/oder Vesikel auf, wenn an den Patienten oder eine Region des Patienten das photoaktive Mittel und/oder bioaktive Mittel abgegeben wird. Wahlweise können die Zusammensetzungen durch Ultraschall-Bilddarstellung und/oder optische Bilddarstellung überwacht werden, um den Ort der Zusammensetzungen vor dem Anwenden von Ultraschall zur Abgabe des photoaktiven Mittels und/oder bioaktiven Mittels an den Patienten oder eine Region des Patienten festzustellen. Diese Verfahren können besonders beim Behandeln von Krebs mit therapeutischen photoaktiven Mitteln geeignet sein. Bestrahlung mit Licht bei diesem Verfahren kann interstitiell, oberflächlich, intravaskulär oder mithilfe von Lichtleitern wie beispielsweise Glasfasern verwendet werden.
Die vorliegenden Erfindung beschreibt Verfahren der Bilddarstellung eines Patienten und/oder des Diagnostizierens des Vorhandenseins von erkranktem Gewebe in einem Patienten durch Verabreichen der optoakustischen Kontrastmittel an einen Patienten und des Scannens des Patienten mithilfe von Ultraschall-Bilddarstellung und/oder optischer Bilddarstellung, um sichtbare Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Patient sowohl mithilfe von Ultraschall-Bilddarstellung als auch mit optischer Bilddarstellung gescannt, um sichtbare Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten zu erhalten. Wenn sichtbare Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten erhalten werden, bricht im Wesentlichen keines der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel auf.
Beispielsweise kann Ultraschall bei dem Patienten oder einer Region des Patienten angewandt werden, um die optoakustischen Kontrastmittel in Schwingung zu bringen, wobei im Wesentlichen keines der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel aufbricht, und anschließend können sowohl Ultraschall-Bilddarstellung als auch mit optischer Bilddarstellung verwendet werden, um sichtbare Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten zu erhalten. Der Begriff „im Wesentlichen" in diesem Zusammenhang bedeutet, dass mehr als etwa 50% der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel nicht aufbrechen, vorzugsweise brechen mindestens etwa 60%, etwa 70% oder etwa 80% der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel nicht auf, mehr bevorzugt brechen mindestens etwa 90%, etwa 95%, etwa 99% oder etwa 100 der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel nicht auf.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann Ultraschall verwendet werden, um die optoakustischen Kontrastmittel in Schwingungen zu bringen, und anschließend kann optische Bilddarstellung ohne Ultraschall-Bilddarstellung verwendet werden, um sichtbare Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten zu erhalten. Vorzugsweise bricht in dieser Ausführungsform im Wesentlichen keines der optoakustischen Kontrastmittel auf, wenn Ultraschall verwendet wird, um die optoakustischen Kontrastmittel in Schwingungen zu bringen, wobei „im Wesentlichen" oben in Zusammenhang mit stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln definiert ist, die nicht aufbrechen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann Ultraschall verwendet werden, um die optoakustischen Kontrastmittel in Schwingungen zu bringen, und anschließend kann Ultraschall-Bilddarstellung ohne optische Bilddarstellung verwendet werden, um sichtbare Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten zu erhalten. In dieser Ausführungsform liefert das photoaktive Mittel in dem optoakustischen Kontrastmittel ein anderes Ultraschallbild im Vergleich zu Ultraschallkontrastmitteln, die kein photoaktives Mittel enthalten. In dieser Ausführungsform bricht im Wesentlichen keines der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel auf, wobei „im Wesentlichen" oben in Zusammenhang mit stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln definiert ist, die nicht aufbrechen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wenn die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel auch ein bioaktives Mittel umfassen, kann Ultraschall angewandt werden, um das bioaktive Mittel und/oder photoaktive Mittel abzugeben, nachdem sichtbare Bilder der Region des Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in der Region eines Patienten erhalten worden sind. In dieser Ausführungsform brechen im Wesentlichen die gesamten stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel auf, um das bioaktive Mittel und/oder photoaktive Mittel abzugeben. Der Begriff „im Wesentlichen" in diesem Zusammenhang bedeutet, dass mehr als etwa 50% der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel aufbrechen, vorzugsweise brechen mindestens etwa 60%, etwa 70% oder etwa 80% der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel auf, mehr bevorzugt brechen mindestens etwa 90%, etwa 95%, etwa 99% oder etwa 100% der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel auf.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann Ultraschall verwendet werden, um im Wesentlichen die gesamten stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel aufzubrechen, um das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel abzugeben, und es können sowohl Ultraschall-Bilddarstellung als auch optische Bilddarstellung verwendet werden, um Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in dem Patienten zu erhalten. Wenn Ultraschall verwendet wird, um im Wesentlichen die gesamten stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel aufzubrechen, können die optoakustischen Kontrastmittel durch Ultraschall-Bilddarstellung und/oder optische Bilddarstellung überwacht werden, um den Ort der Zusammensetzungen festzustellen, bevor Ultraschall angewandt wird, um im Wesentlichen die gesamten stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel aufzubrechen. Nach der Abgabe wird Lichtenergie angewandt, um die photoaktiven Mittel zu aktivieren oder zu bestrahlen. In dieser Ausführungsform ist der Begriff „im Wesentlichen" wie oben in Bezug auf stabilisierende Materialien und/oder Vesikel definiert, die aufbrechen.
In noch einer anderen Ausführungsform kann Ultraschall verwendet werden, um im Wesentlichen die gesamten stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel aufzubrechen, um das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel abzugeben, und anschließend kann Ultraschall-Bilddarstellung ohne optische Bilddarstellung verwendet werden, um Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten zu erhalten. Nach der Abgabe wird Lichtenergie angewandt, um die photoaktiven Mittel zu aktivieren oder zu bestrahlen. In dieser Ausführungsform ist der Begriff „im Wesentlichen" wie oben in Bezug auf stabilisierende Materialien und/oder Vesikel definiert, die aufbrechen.
In einer weiteren Ausführungsform kann Ultraschall verwendet werden, um im Wesentlichen die gesamten stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel aufzubrechen, um das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel abzugeben, und anschließend kann optische Bilddarstellung ohne Ultraschall-Bilddarstellung verwendet werden, um Bilder einer Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in einer Region eines Patienten zu erhalten. Nach der Abgabe wird Lichtenergie angewandt, um die photoaktiven Mittel zu aktivieren oder zu bestrahlen. In dieser Ausführungsform ist der Begriff „im Wesentlichen" wie oben in Bezug auf stabilisierende Materialien und/oder Vesikel definiert, die aufbrechen.
Die einem Patienten zu verabreichende Menge der optoakustischen Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung richtet sich beispielsweise nach dem Verfahren, mit dem die Zusammensetzungen verabreicht werden, und nach dem Alter, Geschlecht, Gewicht und dem körperlichen Zustand des Patienten. Im Allgemeinen wird eine Behandlung mit kleinen Dosen eingeleitet, die dann in kleinen Stufen erhöht werden können, bis der gewünschte Effekt unter den Umständen erreicht ist. Die Zielaspekte der Erfindung erlauben des Weiteren die Verwendung niedriger Dosen des für eine Therapie zu verwendenden optoakustischen Kontrastmittels, da die effektive Konzentration der Kontrastmittel am Therapieort im Körper unverdünnt bleibt.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können einem Patienten auf vielerlei Weise verabreicht werden. Die Mittel der Verabreichung unterscheiden sich je nach der beabsichtigten Anwendung. Wie ein Fachmann erkennt, kann eine Verabreichung der Zusammensetzungen, stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Art durchgeführt werden, beispielsweise topisch, einschließlich ophthalmisch, dermal, okulär und rektal, intrarektal, transdermal, oral, intraperitoneal, parenteral, intravenös, intravaskulär, intralymphatisch, intratumoral, intramuskulär, interstitiell, intraarteriell, subkutan, intraokulär, intrasynovial, transepithelial, pulmonal über Inhalation, ophthalmisch, sublingual, bukkal oder über Naseninhalation über Insufflation oder Verneblung.
Die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel der vorliegenden Erfindung können als eine Infusion verabreicht werden. „Infusion" bezieht sich auf intravaskuläre oder intraarterielle Verabreichung bei einer Rate von beispielsweise unter etwa 1 cc/Sekunde, mehr bevorzugt unter etwa 0,5 cc/Sekunde oder unter etwa 30 cc/Minute, noch mehr bevorzugt bei etwa 0,1 cc/Minute bis etwa 30 cc/Minute, am meisten bevorzugt bei etwa 0,1 cc/Minute bis etwa 5,0 cc/Minute. Es ist auch wünschenswert, die Rate der Infusion zu variieren. Beispielsweise kann eine Infusion bei einer Rate von etwa 1,0 bis etwa 4,0 cc/Sekunde eingeleitet werden, gefolgt von einer eher anhaltenden Infusionsrate von etwa 0,1 cc/Sekunde. Die schnelle Infusionsrate zu Anfang erreicht den optimalen Spiegel des stabilisierenden Materials und/oder des Vesikels im Blut, während die langsamere Infusionsrate hämodynamisch besser toleriert wird.
Die Abgabe photoaktiver Mittel und/oder bioaktiver Mittel aus den stabilisierenden Materialien der vorliegenden Erfindung mittels Ultraschall wird am besten bei Geweben erreicht, die ein gutes akustisches Fenster für die Übertragung von Ultraschallenergie aufweisen. Dies ist bei den meisten Geweben im Körper der Fall, beispielsweise bei den Muskeln, dem Herzen, der Lunge, der Leber und den meisten anderen lebenswichtigen Strukturen. Im Gehirn könnte ein chirurgisches Fenster erforderlich sein, um die Ultraschallenergie durch den Schädel zu leiten.
Die Zusammensetzungen, stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel der vorliegenden Erfindung sind vor allem für Zielliganden geeignet, die in wässrigen Medien oder bei Aussetzen gegenüber Sauerstoff und/oder atmosphärischer Luft abgebaut werden könnten. Beispielsweise können Vesikel zur Verwendung mit labilen Zielliganden mit einem inerten Gas gefüllt sein. Darüber hinaus können die Zusammensetzungen mit einem inerten Gas gefüllt sein und verwendet werden, um einen labilen Zielliganden zur Verwendung in einer Region eines Patienten zu verkapseln, die normalerweise bewirken würde, wie beispielsweise bei kutanen oder ophthalmischen Anwendungen.
Für topische Anwendungen können die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel allein verwendet, mit einem oder mehr solubilisierenden Mitteln wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) gemischt oder mit einem Transport-/Abgabevehikel verwendet und auf die Haut oder Schleimhäute aufgetragen werden. Penetrierende und/oder solubilisierende Mittel, die für die topische Anwendung der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel geeignet sind, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Stabilisierende Materialien und/oder Vesikel, die mit penetrierungsverstärkenden Mitteln formuliert sind, können transdermal in einem Patch oder Reservoir mit einer durchlässigen Membran verabreicht werden, die auf die Haut aufgetragen werden. Die Verwendung von aufbrechendem Ultraschall kann die transdermale Abgabe von photoaktiven Mitteln erhöhen. Des Weiteren kann ein Mechanismus verwendet werden, um die Abgabe der photoaktiven Mittel zu überwachen und zu modulieren. Beispielsweise kann Ultraschall verwendet werden, um das Aufbrechen der gasgefüllten Vesikel visuell zu überwachen und die Abgabe der photoaktiven Mittel und/oder bioaktiven Mittel zu modulieren, und/oder es kann ein Hydrophon verwendet werden, um den Klang des Aufbrechens der gasgefüllten Vesikel festzustellen und die Abgabe der photoaktiven Mittel und/oder bioaktiven Mittel zu modulieren.
Die Erfindung ist geeignet, um Zusammensetzungen in die Lunge eines Patienten abzugeben. Für pulmonale Anwendungen können getrocknete oder lyophilisierte pulverisierte Zusammensetzungen über einen Inhalator verabreicht werden. Wässrige Suspensionen von Liposomen, Mizellen oder anderen Vesikeln, vorzugsweise mit Gas/Gasvorläufer gefüllt, können über Vernebelung verabreicht werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind leichter als beispielsweise herkömmliche flüssig gefüllte Liposomen, die sich im Allgemeinen eher im zentralen proximalen Atemweg ablagern als die Peripherie der Lunge erreichen. Sie könnten daher eine verbesserte Abgabe der Zusammensetzungen der Erfindung an die Peripherie der Lunge, einschließlich der terminalen Atemwege und der Alveoli, liefern. Zur Verabreichung an die Lunge können die Zusammensetzungen durch Vernebelung angewandt werden.
In Anwendungen, wie beispielsweise dem Targeting der Lunge, die mit Lipiden ausgekleidet ist, kann das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel nach Aggregation der mit Gas und/oder Gasvorläufer gefüllten Liposomen mit den Lipiden, die das Zielgewebe auskleiden, freigesetzt werden. Darüber hinaus können die mit Gas und/oder Gasvorläufer gefüllten Liposomen nach Verabreichung ohne die Verwendung von Ultraschall aufbrechen. Es braucht daher kein Ultraschall angewandt werden, um das photoaktive Mittel und/oder das bioaktive Mittel bei dieser Art der Verabreichung freizusetzen. Natürlich kann es dennoch erforderlich sein, Lichtenergie anzuwenden, um das photoaktive Mittel zu aktivieren und seine therapeutischen Fähigkeiten auszulösen.
Die Freisetzung der photoaktiven Mittel, bioaktiven Mittel und/oder das Aufbrechen von Vesikeln kann durch Ultraschall mithilfe mehrerer unterschiedlicher Mechanismen überwacht werden. Wenn Bläschen zerstört werden, bewirkt dies schließlich eine Auflösung des Ultraschallsignals. Vor der Signalauflösung liefern die Vesikel jedoch eine erste Signalfolge. In anderen Worten, wenn steigende Mengen an Ultraschallenergie auf die Behandlungszone angewandt werden, welche die Vesikel enthält, gibt es eine vorübergehende Signalsteigerung. Diese vorübergehende Signalsteigerung kann bei der Basisfrequenz, der harmonischen oder ungeradzahligen harmonischen oder der ultraharmonischen Frequenz aufgezeichnet werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung werden im Allgemeinen in Form einer wässrigen Suspension wie beispielsweise in Wasser oder einer Salzlösung (z. B. phosphatgepufferte Salzlösung) verabreicht. Das Wasser ist vorzugsweise steril. Außerdem ist die Salzlösung vorzugsweise eine isotone Salzlösung, obgleich die Salzlösung, falls gewünscht, hypoton sein kann (z. B. etwa 0,3 bis etwa 0,5% NaCl). Die Lösung kann, falls gewünscht, gepuffert werden, um einen pH-Bereich von etwa 5 bis etwa 7,4 bereit zu stellen. Vorzugsweise ist in dem Medium Dextrose oder Glucose enthalten. Andere Lösungen, die zur Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Öle, wie beispielsweise Mandelöl, Maisöl, Baumwollsaatöl, Ethyloleat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Mineralöl, Myristylalkohol, Octyldodecanol, Olivenöl, Erdnussöl, Pfirsichkernöl, Sesamöl, Sojaöl, Squalen und fluorierte Öle. Geeignete fluorierte Öle sind in US-Patent Nr. 5,344,930 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist.
Die Größe der stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel der vorliegenden Erfindung richtet sich nach dem Verwendungszweck. Bei kleineren Vesikeln ist die Ultraschallresonanzfrequenz im Allgemeinen höher als bei größeren Vesikeln. Die Größenfestlegung dient außerdem dem Modulieren der resultierenden vesikulären Bioverteilung und -beseitigung. Außer durch Filtrieren kann die Größe der Vesikel, falls gewünscht, durch Verfahren angepasst werden, die einem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise Schütteln, Mikroemulgierung, Vortexen, Filtrieren, wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen, Extrusion, Extrusion unter Druck durch Poren einer definierten Größe, Ultraschallbehandlung, Homogenisierung, die Verwendung eines Laminarstroms eines Kerns von Flüssigkeit, der in eine nicht mischbare Hülle von Flüssigkeit eingeführt wird. Extrusion unter Druck durch Poren definierter Größe ist ein bevorzugtes Verfahren des Anpassens der Größe der Vesikel. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,728,578, 4,728,575, 4,737,323, 4,533,254, 4,162,282, 4,310,505 und 4,921,706 und PCT/US89/05040; Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, 858: 161–168 (1986); Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, 812: 55–65 (1985) ; Mayhew et al., Methods in Enzymology, 149: 64–77 (1987); Mayhew et al., Biochimica et Biophysica Acta, 755: 169–74 (1984); Cheng et al., Investigative Radiology, 22: 47–55 (1987) und Liposomes Technology, Gregoriadis, Hrsg. Band I, S. 29–37, 51–67 und 79–108 (CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1984).
Da die Vesikelgröße die Bioverteilung beeinflusst, können für verschiedene Zwecke Vesikel verschiedener Größe ausgewählt werden. Bei einer intravaskulären Anwendung beispielsweise liegt der bevorzugte Größenbereich bei einem mittleren Außendurchmesser zwischen etwa 30 nm und etwa 10 μm, wobei der bevorzugte mittlere Außendurchmesser etwa 5 μm beträgt. Spezifischer ist die Größe der Vesikel für eine intravaskuläre Anwendung vorzugsweise etwa 10 μm oder weniger im mittleren Außendurchmesser und vorzugsweise weniger als etwa 7 μm und mehr bevorzugt weniger als etwa 5 μm im mittleren Außendurchmesser. Vorzugsweise sind die Vesikel nicht kleiner als etwa 30 nm im mittleren Außendurchmesser. Zur Bereitstellung einer therapeutischen Abgabe an Organe wie beispielsweise die Leber und um eine Differenzierung des Tumors von der Normalgröße zu ermöglichen, sind kleinere Vesikel zwischen etwa 30 nm und etwa 100 nm im mittleren Außendurchmesser bevorzugt. Für eine Embolisierung eines Gewebes wie der Niere oder der Lunge haben die Vesikel vorzugsweise einen mittleren Außendurchmesser von weniger als etwa 200 μm. Für eine intranasale, intrarektale oder topische Verabreichung haben die Vesikel vorzugsweise einen mittleren Außendurchmesser von weniger als etwa 100 μm. Große Vesikel mit einer Größe zwischen 1 und etwa 10 μm sind im Allgemeinen auf den intravaskulären Raum begrenzt, bis sie von phagozytären Elementen, welche die Gefäße auskleiden, wie beispielsweise den Kapillarsinusoide auskleidenden Makrophagen und Kupfferschen Zellen, beseitigt werden. Für die Passage zu den Zellen jenseits der Sinusoide sind kleinere Vesikel, beispielsweise mit einem mittleren Außendurchmesser von unter etwa 1 μm, z. B. mit einer Größe von unter etwa 300 nm, bevorzugt. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Vesikel einzeln verabreicht, anstatt beispielsweise in eine Matrix eingebettet zu sein.
Für die Anwendung in vitro, wie beispielsweise Zellkulturanwendungen, können die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel den Zellen in Kulturen zugegeben und anschließend inkubiert werden. Danach können auf das Kulturmedium, das die Zellen und stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel enthält, Ultraschall-Bilddarstellung und optische Bilddarstellung angewandt werden.
Bei der Durchführung der Bilddarstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung können die die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikelzusammensetzungen alleine oder in Kombination mit diagnostischen Mitteln, bioaktiven Mitteln oder anderen Mitteln verwendet werden, einschließlich Exzipienten wie beispielsweise Aroma- oder Färbematerialien, die einem Fachmann gut bekannt sind.
In dem Fall diagnostischer Anwendungen werden Ultraschallenergie und optische Bilddarstellung auf mindestens einen Teil des Patienten angewandt, um das Zielgewebe bildlich darzustellen. Ultraschall-Bilddarstellungstechniken, einschließlich Frequenzverdopplung und „Gated Imaging", sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und beispielsweise beschrieben in Uhlendorf, IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics and Frequency Control, 14(1): 70–79 (1994) und Sutherland et al., Journal of the American Society of Echocardiography, 7(5): 441–458 (1994).
Ultraschall kann sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Zwecke verwendet werden. Bei diagnostischem Ultraschall können Ultraschallwellen oder eine Abfolge von Ultraschallimpulsen mit einem Ultraschallkopf (Transducer) angewandt werden. Der Ultraschall wird im Allgemeinen gepulst und ist nicht kontinuierlich, obgleich er, falls gewünscht, auch kontinuierlich sein kann. Diagnostischer Ultraschall umfasst im Allgemeinen die Anwendung eines Impulses von Echos, nach denen der Ultraschallkopf nach einem Zeitraum des Zuhörens reflektierte Signale empfängt. Es können harmonische Schwingungen, ultraharmonische Schwingungen oder subharmonische Schwingungen verwendet werden. Der Frequenzverdopplungsmodus kann vorteilhaft verwendet werden, wobei die 2x-Frequenz empfangen wird, wobei x die anfallende Frequenz ist. Dies kann das Signal des Hintergrundmaterials verringern und das Signal des Ultraschallkopfes (Transducers) verstärken, wenn die Kontrastmedien der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welche an die gewünschte Stelle, beispielsweise zu Blutgerinnseln geleitet werden. Mit diesem Verfahren können gleichermaßen auch andere harmonische Signale, wie beispielsweise ungeradzahlige harmonische Signale, beispielsweise 3x oder 5x, empfangen werden. Es können auch subharmonische Signale, beispielsweise x/2 und x/3, empfangen und verarbeitet werden, um ein Bild zu formen.
Außer dem Impulsverfahren kann Ultraschall mit kontinuierlichen Wellen, beispielsweise Power Doppler, angewandt werden. Dies kann besonders nützlich sein, wenn steife Vesikel, beispielsweise Vesikel, die aus Polymethylmethacrylat formuliert sind, verwendet werden. In diesem Fall kann die relativ höhere Energie des Power Dopplers veranlasst werden, die Vesikel in Schwingung zu bringen und, falls gewünscht, ihr Aufbrechen auszulösen. Dies kann akustische Emissionen erzeugen, die im selben subharmonischen oder ultraharmonischen Bereich oder in manchen Fällen in derselben Frequenz wie der angewandte Ultraschall liegen. Bei diesem Prozess kann ein ganzes Spektrum akustischer Signaturen freigesetzt werden und der verwendete Ultraschallkopf (Transducer) kann die akustischen Emissionen empfangen, um beispielsweise das Vorhandensein eines Gerinnsels festzustellen. Darüber hinaus kann der Vorgang des Aufbrechens der Vesikel verwendet werden, um kinetische Energie an die Oberfläche zu übertragen, beispielsweise eines Gerinnsels, um die Lyse des Gerinnsels zu fördern. So lässt sich mit einer Kombination aus diagnostischem und therapeutischem Ultraschall eine therapeutische Thrombolyse erreichen. Es kann auch ein Spektral-Doppler verwendet werden.
Im Allgemeinen brechen Energieniveaus diagnostischen Ultraschalls stabilisierende Materialien und/oder Vesikel nicht auf. Wie oben erwähnt, kann diagnostischer Ultraschall die Anwendung eines oder mehrerer Schallimpulse umfassen. Pausen zwischen Impulsen erlauben den Empfang und die Analyse der reflektierten Schallsignale. Die beschränkte Anzahl von Impulsen, wie sie bei diagnostischem Ultraschall verwendet wird, beschränkt die effektive Energie, die auf das untersuchte Gewebe angewandt wird.
Energiereicherer Ultraschall, beispielsweise Ultraschall, der durch therapeutische Ultraschallausrüstung erzeugt wird, kann im Allgemeinen stabilisierende Materialien und/oder Vesikel aufbrechen. Je nach dem mit dem Ultraschall zu behandelnden Gewebebereich verwenden Vorrichtungen für therapeutischen Ultraschall Arbeitszyklen zwischen etwa 10 bis etwa 100. Körperbereiche, die im Allgemeinen von größeren Mengen an Muskelmasse gekennzeichnet sind, wie beispielsweise der Rücken und die Schenkel, sowie stark vaskularisiertes Gewebe, wie beispielsweise Herzgewebe, erfordern unter Umständen einen größeren Arbeitszyklus, beispielsweise bis zu etwa 100.
Bei therapeutischem Ultraschall werden kontinuierliche Ultraschallwellen verwendet, um höhere Energiestufen zu verabreichen. Für das Aufbrechen von Vesikeln sind kontinuierliche Ultraschallwellen bevorzugt, obgleich die Schallenergie auch gepulst sein kann. Wenn gepulste Schallenergie verwendet wird, wird der Schall im Allgemeinen in Echoabfolgelängen von etwa 8 bis etwa 20 oder mehr Impulsen pro Zeiteinheit gepulst. Vorzugsweise liegen die Echoabfolgelängen bei etwa 20 Impulsen pro Zeiteinheit. Darüber hinaus kann die verwendete Schallfrequenz von etwa 0,025 bis etwa 100 Megahertz (MHz) variieren. Die Frequenz für therapeutischen Ultraschall liegt zwischen etwa 0,75 und etwa 3 MHz, vorzugsweise zwischen etwa 1 und etwa 2 MHz. Darüber hinaus können die Energiestufen von etwa 0,5 Watt (W) pro Quadratzentimeter (cm²) bis etwa 5,0 W/cm², vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 2,5 W/cm², variieren. Energiestufen für therapeutischen Ultraschall, der Hyperthermie umfasst, liegen im Allgemeinen bei etwa 5 W/cm² bis etwa 50 W/cm². Für sehr kleine Vesikel, beispielsweise Vesikel mit einem Durchmesser von weniger als etwa 0,5 mm, sind höhere Schallfrequenzen im Allgemeinen bevorzugt, da kleinere Vesikel Schallenergie bei höheren Schallfrequenzen effektiver absorbieren können. Wenn sehr hohe Frequenzen verwendet werden, beispielsweise höher als etwa 10 MHz, durchdringt die Schallenergie im Allgemeinen Flüssigkeiten und Gewebe nur bis zu einer beschränkten Tiefe. Externe Anwendung der Schallenergie eignet sich daher für Haut und andere oberflächliche Gewebe. Für tiefe Strukturen ist es im Allgemeinen erforderlich, die Ultraschallenergie so zu fokussieren, dass sie vorzugsweise in eine fokale Zone geleitet wird. Alternativ kann Ultraschallenergie über interstitielle Sonden, intravaskuläre Ultraschallkatheter oder endoluminale Katheter angewandt werden. Außer in den oben diskutierten therapeutischen Verwendungen können die vorliegenden Zusammensetzungen in Verbindung mit Ösophaguskarzinomen oder in den Koronararterien zur Behandlung von Atherosklerose oder den beispielsweise in US-Patent Nr. 5,149,319 beschriebenen therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden.
Es kann eine therapeutische Ultraschallvorrichtung verwendet werden, die zwei Ultraschallfrequenzen einsetzt. Die erste Frequenz kann x sein und die zweite Frequenz kann 2x sein. Vorzugsweise ist die Vorrichtung derart gestaltet, dass die fokalen Zonen der ersten und zweiten Frequenzen zu einer einzigen fokalen Zone zusammenlaufen. Die fokale Zone der Vorrichtung kann dann zu den Zusammensetzungen, beispielsweise stabilisierenden Materialien und/oder Zielvesikelzusammensetzungen, in dem Zielgewebe geleitet werden. Die Ultraschallvorrichtung kann eine Frequenzverdopplungstherapie mit gleichzeitiger Anwendung der x- und 2x-Frequenzen von Ultraschallenergie liefern. Im Fall von Ultraschall, der in Verbindung mit Vesikeln verwendet wird, kann die Frequenzverdopplungstherapie ein verbessertes Aufbrechen von Vesikeln im Vergleich zu Ultraschallenergie, die eine einzelne Frequenz umfasst, liefern. Der bevorzugte Frequenzbereich kann innerhalb der harmonischen Basisfrequenzen der Vesikel liegen. Bei dieser Vorrichtung kann auch niedrigere Energie verwendet werden.
Eine Ultraschallvorrichtung, die in Verbindung mit der zuvor erwähnten Frequenzverdopplungstherapie verwendet werden kann, ist beispielsweise von Kawabata et al., Ultrasonics Sonochemistry, 3: 1–5 (1996) beschrieben.
Bei der Ultraschall-Bilddarstellung besitzen die Vesikel der Erfindung vorzugsweise ein Reflexionsvermögen von mehr als 2 dB, mehr bevorzugt zwischen etwa 4 dB und etwa 20 dB. Innerhalb dieser Bereiche zeigen die größeren Vesikel das höchste Reflexionsvermögen der Vesikel, durch höhere Konzentrationen von Vesikeln und/oder wenn höhere Ultraschallfrequenzen verwendet werden.
Für den therapeutischen Transport/die therapeutische Abgabe photoaktiver Mittel und/oder bioaktiver Mittel, wird das Aufbrechen der Vesikel und/oder der stabilisierenden Materialien durchgeführt, indem Ultraschall einer bestimmten Frequenz auf die Region des Patienten angewandt ist, an der eine Therapie gewünscht wird, nachdem die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel verabreicht worden sind oder anderweitig die gewünschte Region erreicht haben, z. B. durch Transport/Abgabe mit Zielliganden. Insbesondere wurde herausgefunden, dass die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel bei Anwendung von Ultraschall bei einer Frequenz, die der Spitzenresonanzfrequenz der Vesikel und/oder stabilisierenden Materialien entspricht, aufbrechen und ihren Inhalt freisetzen, z. B. die photoaktiven Mittel und/oder bioaktiven Mittel. Die Spitzenresonanzfrequenz kann entweder in vivo oder in vitro, vorzugsweise in vivo, bestimmt werden, indem die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel Ultraschall ausgesetzt werden, indem die reflektierten Resonanzfrequenzsignal empfangen werden und indem das empfangene Spektrum an Signalen analysiert wird, um die Spitze zu bestimmen, wobei herkömmliche Mittel verwendet werden. Die Spitze, wie bestimmt, entspricht der Spitzenresonanzfrequenz oder der Frequenzverdopplung.
Die Zusammensetzungen der Erfindung, die für den therapeutischen Transport/die therapeutische Abgabe photoaktiver Mittel verwendet werden, haben eine Spitzenresonanzfrequenz von zwischen etwa 0,5 MHz und etwa 10 MHz. Natürlich variiert die Spitzenresonanzfrequenz je nach dem Außendurchmesser und bis zu einem gewissen Grad der Elastizität oder Flexibilität der Vesikel, wobei die größeren und elastischeren oder flexibleren Vesikel eine niedrigere Resonanzfrequenz als die kleineren und weniger elastischen oder flexiblen Vesikel aufweisen.
Die Vesikel brechen außerdem auf, wenn sie Ultraschall bei Nicht-Spitzenresonanzfrequenz in Kombination mit einer höheren Intensität (Wattzahl) und Dauer (Zeit) ausgesetzt sind. Diese höhere Energie resultiert jedoch in stark erhöhter Erwärmung, was möglicherweise nicht erwünscht ist. Indem die Frequenz der Energie angepasst wird, bis sie der Spitzenresonanzfrequenz entspricht, werden die Effizienz des Aufbrechens und die Freisetzung des photoaktiven Mittels verbessert, es tritt im Allgemeinen keine nennenswerte Gewebeerwärmung auf (häufig kein Temperaturanstieg über etwa 2°C) und es ist weniger Gesamtenergie erforderlich. Die Anwendung von Ultraschall bei Spitzenresonanzfrequenz ist daher zwar nicht erforderlich, aber bevorzugt.
Für diagnostischen oder therapeutischen Ultraschall kann in den Verfahren der Erfindung jeder der verschiedenen Typen von Vorrichtungen für diagnostische Ultraschall-Bilddarstellung verwendet werden, wobei der jeweilige Typ oder das jeweilige Modell der Vorrichtung nicht wesentlich sind. Andere geeignete Vorrichtungen, die für das Verabreichung von Ultraschall-Hyperthermie konzipiert sind, sind in US-Patent Nr. 4,620,456, 4,658,828 und 4,586,512 beschrieben. Vorzugsweise verwendet die Vorrichtung ein Resonanzfrequenz (RF)-Spektralanalysegerät. Die Ultraschallsonden (Transducer) können extern angewandt oder implantiert werden. Ultraschall wird im Allgemeinen bei geringerer Intensität und Dauer gestartet und anschließend werden Intensität, Zeit und/oder Resonanzfrequenz erhöht, bis das Vesikel im Ultraschall visualisiert ist (z. B. bei diagnostischen Ultraschallanwendungen).
Obgleich die Anwendung der verschiedenen Prinzipien einem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung leicht geläufig ist, gilt die allgemeine Richtlinie, dass bei gasgefüllten Vesikeln mit einem mittleren Außendurchmesser von etwa 1,5 bis etwa 10 μm die Resonanzfrequenz im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 MHz liegt. Indem die fokale Zone auf die Mittel des Zielgewebes (z. B. eines Tumors) ausgerichtet wird, können die Vesikel in Echtzeit-Ultraschall visualisiert werden, während sie in dem Zielgewebe akkumulieren. Wird beispielsweise ein Konvexschallkopf mit 7,5 MHz verwendet, wobei die Energie, mit welcher der Ultraschallkopf (Transducer) versorgt wird, auf ein Maximum eingestellt und die fokale Zone auf das Innere des Zielgewebes eingestellt wird, liegt die zeitgemittelte, räumliche Spitzenintensität (spatial peak temporal average, SPTA) bei einem Maximum von etwa 5,31 mW/cm² in Wasser. Diese Energie bewirkt eine gewisse Freisetzung der photoaktiven Mittel aus den Vesikeln, aber mit höherer Energie kann eine viel stärkere Freisetzung erreicht werden. In gleicher Weise lässt sich die Freisetzung photoaktiver Mittel verhindern, indem niedrige Energie verwendet wird.
Durch Umschalten des Ultraschallkopfes (Transducers) auf den Doppler-Modus sind höhere Energieabgaben möglich, d. h. bis zu 2,5 W/cm² vom selben Ultraschallkopf (Transducer). Wenn das Gerät im Doppler-Modus arbeitet, kann die Energie auf eine ausgewählte fokale Zone innerhalb des Zielgewebes abgegeben werden und die Vesikel können veranlasst werden, das photoaktive Mittel freizusetzen. Durch Auswahl des Ultraschallkopfes (Transducers) passend zur Resonanzfrequenz der Vesikel wird dieser Prozess der Freisetzung eines photoaktiven Mittels noch effizienter.
Für Vesikel mit größerem Durchmesser, z. B. mit einem mittleren Außendurchmesser über 3 μm, könnte ein Niederfrequenz-Ultraschallkopf (Transducer) wirksamer sein, um eine therapeutische Freisetzung zu erreichen. Beispielsweise kann ein Niederfrequenz-Ultraschallkopf (Transducer) mit 3,5 MHz (20-mm-Konvexschallkopfmodell) gewählt werden, um der Resonanzfrequenz der gasgefüllten Vesikel zu entsprechen. Bei Verwendung dieses Ultraschallkopfes (Transducers) können 101,6 Milliwatt pro cm² an die fokale Stelle abgegeben werden und bei Umschalten auf den Doppler-Modus wird die Energieabgabe (SPTA) auf 1,02 Wcm² erhöht.
Um das Phänomen der Kavitation zu nutzen, um die photoaktiven Mittel in den stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln freizusetzen und/oder zu aktivieren, können niedrigere Frequenzenergien verwendet werden, da eine Kavitation bei niedrigeren Frequenzen effektiver stattfindet. Durch Verwendung eines 0,757-MHz-Ultraschallkopfes (Transducers), der mit hohen Spannungen (bis 300 Volt) betrieben wird, erfolgt eine Kavitation von Lösungen von Vesikeln bei Schwellenwerten von etwa 5,2 Atmosphären. Ultraschallinduzierte Kavitation verändert die optische Signatur photoaktiver Materialien, die in den stabilisierenden Materialien und/oder Vesikeln enthalten sind.
Die Tabelle unten zeigt die Bereiche von Energien, die durch diagnostischen Ultraschall aus häufig verwendeten Geräten wie dem Allzweck-Scanner Portascan von Piconics Inc. (Tyngsboro, MA, USA) mit Empfänger-Impulsgeber 1966 Modell 661, dem Echoview 8L Scanner, einschließlich 80C System, von Picker (Cleveland, OH, USA) oder dem Modell D-9 Versatone Bidirectional Doppler von Medisonics (Mountain View, CA, USA) auf Gewebe übertragen werden. Die Energiebereiche bei der Impulswiederholung sind im Allgemeinen für Diagnose und Überwachung stabilisierender Materialien und/oder Vesikel geeignet, aber nicht ausreichend, um die Vesikel aufzubrechen. Tabelle 3 Energie und Intensitäten, produziert von diagnostischer Ausrüstung*

* Werte erhalten aus Carson et al., Ultrasound in Med. & Biol., 3: 341–350 (1978), dessen Offenbarung hiermit hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist.

In diagnostischen und therapeutischen Anwendungen kann Ultraschall mit sowohl fester Frequenz als auch mit modulierter Frequenz verwendet werden. Feste Frequenz ist definiert, bei der die Frequenz der Schallwelle über die Zeit konstant ist. Eine modulierte Frequenz ist eine, bei der sich die Wellenfrequenz über die Zeit verändert, beispielsweise von hoch zu niedrig (PRICH) oder von niedrig zu hoch (CHIRP). Beispielsweise wird ein PRICH-Impuls mit Schallenergie einer Anfangsfrequenz von 10 MHz mit steigender Energie von etwa 1 bis etwa 5 Watt auf 1 MHz gebracht. Fokussierter, frequenzmodulierter Ultraschall kann die Rate lokaler gasförmiger Ausdehnung in den Zusammensetzungen und das Aufbrechen erhöhen, um eine lokale Abgabe therapeutischer photoaktiver Mittel zu liefern.
Die verwendete Schallfrequenz kann im Bereich von etwa 0,025 bis etwa 100 MHz liegen, vorzugsweise zwischen etwa 0,75 und etwa 3 MHz, mehr bevorzugt zwischen etwa 1 und etwa 2 MHz. Es können häufig verwendete therapeutische Frequenzen von etwa 0,75 bis etwa 1,5 MHz verwendet werden. Es können häufig verwendete therapeutische Frequenzen von etwa 3 bis etwa 7, 5 MHz verwendet werden. Für sehr kleine Vesikel, z. B. mit einem mittleren Außendurchmesser unter 0,5 μm, sind höhere Schallfrequenzen bevorzugt, da diese kleineren Vesikel Schallenergie bei höheren Schallfrequenzen effektiver absorbieren. Wenn sehr hohe Frequenzen verwendet werden, z. B. über 10 MHz, hat die Schallenergie im Allgemeinen eingeschränkte Tiefenpenetration in Flüssigkeiten und Gewebe. Für die Haut und andere oberflächliche Gewebe kann eine externe Anwendung bevorzugt sein, aber für tiefe Strukturen ist die Anwendung von Schallenergie über interstitielle Sonden oder intravaskuläre Ultraschallkatheter bevorzugt.
Für optische Bilddarstellung können auch optisch aktive Gase wie beispielsweise Argon oder Neon in den Zusammensetzungen der Erfindung enthalten sein. Die Wellenlänge und Intensität einer auf ein photoaktives Mittel anzuwendenden Bestrahlung richtet sich nach den jeweils verwendeten photoaktiven Mitteln, da verschiedene photoaktive Mittel verschiedene optimale Reaktions-Wellenlängen haben. Die erforderliche Wellenlänge und Intensität der Bestrahlung kann daher von einem Fachmann auf der Basis der jeweils verwendeten photoaktiven Mittel leicht bestimmt werden. Geeignete Wellenlängen sind im Allgemeinen etwa 500 nm bis etwa 1400 nm, und geeignete Intensitäten sind im Allgemeinen etwa 1 mW/cm² bis etwa 1.000 mW/cm². Photodynamische Therapie unter Verwendung optischer Bilddarstellung ist beispielsweise von Bergstrom et al., J. Photochem. Photobiol. B., 24(1): 17–23 (1994), Gatenby et al., Radiology, 163 (1): 172–5 (1987), Gatenby et al., Radiology, 163 (1): 167–71 (1987), beschrieben.
Wie oben diskutiert, können die stabilisierenden Materialien und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit diagnostischer Bilddarstellung und therapeutischer Bilddarstellung verwendet werden, einschließlich beispielsweise Ultraschall, optische Bilddarstellung, Magnetresonanzbilddarstellung (MRT), Kernmagnetresonanz (NMR), Computertomographie (CT), Elektronenspinresonanz (ESR), nuklearmedizinische Bildgebung, Elastographie, Wirkstofftransport/-abgabe mit Ultraschall, Hochfrequenz (HF) und Mikrowellenlaser. Vorzugsweise werden die stabilisierenden Materialien und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung mit Ultraschall-Bilddarstellung und optischer Bilddarstellung verwendet. Die stabilisierenden Materialien und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit verschiedenen Kontrastmitteln, einschließlich herkömmlichen Kontrastmitteln, verwendet werden, die dazu dienen, ihre Wirksamkeit als Kontrastmittel für diagnostische und therapeutische Bilddarstellung zu erhöhen.
Beispiele geeigneter Kontrastmittel zur Verwendung in Kombination mit den vorliegenden stabilisierenden Materialien umfassen beispielsweise stabile freie Radikale wie beispielsweise stabile Nitroxide sowie Verbindungen, die Übergangs-, Lanthanid- und Actinidelemente umfassen, die, falls gewünscht, in Form eines Salzes vorliegen oder kovalent oder nicht-kovalent an Komplexbildner, einschließlich lipophile Derivate davon, oder an proteinöse Makromoleküle gebunden sein können. Bevorzugte Übergangs-, Lanthanid- und Actinidelemente umfassen beispielsweise Gd(III), Mn(II), Cu (II), Cr(III), Fe(II), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) und Dy(III). Mehr bevorzugt sind die Elemente Gd(III), Mn(II), Cu (II), Fe(II), Fe(III), Eu(III) und Dy(III), am meisten bevorzugt Mn(II) und Gd(III). Die vorangehenden Elemente können in Form eines Salzes, einschließlich anorganischer Salze, wie beispielsweise als ein Mangansalz, beispielsweise Manganchlorid, Mangancarbonat, Manganacetat, und organischer Salze, wie beispielsweise Mangangluconat und Manganhydroxyapatit, vorliegen. Andere beispielhafte Salze umfassen Salze von Eisen wie beispielsweise Eisensulfide und Eisen(III)-salze, wie beispielsweise Eisen(III)-chlorid.
Die obigen Elemente können auch beispielsweise durch kovalente oder nicht-kovalente Assoziation an Komplexbildner, einschließlich an lipophile Derivate davon, oder an proteinöse Makromoleküle gebunden sein. Bevorzugte Komplexbildern umfassen beispielsweise Texaphyrine, Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N',N''-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N''-triessigsäure (DOTA), 3,6,9-Triaza-12-oxa-3,6,9-Tricarboxymethylen-10-carboxy-13-phenyltridecansäure (B-19036), Hydroxybenzylethylendiamindiessigsäure (HBED), N,N'-Bis(pyridoxyl-5-phosphat)ethylendiamin, N,N'-Diacetat (DPDP), 1,4,7-Triazacyclononan-N,N',N''-triessigsäure (NOTA), 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N',N''-tetraessigsäure (TETA), Kryptanden (makrozyklische Komplexe) und Desferrioxamin. Mehr bevorzugt sind die Komplexbildner EDTA, DTPA, DOTA, DO3A und Kryptanden, am meisten bevorzugt DTPA. Bevorzugte lipophile Komplexe umfassen alkylierte Derivate der Komplexbildner EDTA, DOTA, beispielsweise N,N'-Bis-(carboxydecylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropylethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-DDP), N,N'-Bis-(carboxyoctadecylamidomethyl-N-2,3- dihydroxypropyl)-ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-ODP) und N,N'-Bis(carboxylaurylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropyl)ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-LDP), einschließlich solche, die in US-Patent Nr. 5,312,617 beschrieben sind, dessen Offenbarung hiermit hierin in Gänze durch Bezugnahme enthalten ist. Bevorzugte proteinöse Makromoleküle umfassen beispielsweise Albumin, Kollagen, Polyarginin, Polylysin, Polyhistidin, γ-Globulin und β-Globulin, wobei Albumin, Polyarginin, Polylysin und Polyhistidin mehr bevorzugt sind. Geeignete Komplexe umfassen daher Mn(II)-DTPA, Mn(II)-EDTA, Mn(II)-DOTA, Mn(II)-DO3A, Mn(II)-Kryptanden, Gd(III)-DTPA, Gd(III)-DOTA, Gd(III)-DO3A, Gd(III)-Kryptanden, Cr(III)-EDTA, Cu(II)-EDTA oder Eisendesferrioxamin, mehr bevorzugt Mn(II)-DTPA oder Gd(III)-DTPA.
Nitroxide sind paramagnetische Kontrastmittel, die sowohl die T1- als auch die T2-Relaxationsraten in der MRT durch das Vorhandensein eines ungepaarten Elektrons in dem Nitroxidmolekül erhöhen. Wie einem durchschnittlichen Fachmann bekannt ist, kann die paramagnetische Wirksamkeit einer gegebenen Verbindung als ein MRT-Kontrastmittel zumindest teilweise mit der Anzahl ungepaarter Elektronen in dem paramagnetischen Kern oder Molekül und insbesondere mit dem Quadrat der Anzahl ungepaarter Elektronen zusammenhängen. Beispielsweise hat Gadolinium sieben ungepaarte Elektronen, wohingegen ein Nitroxidmolekül ein ungepaartes Elektron aufweist. Gadolinium ist daher im Allgemeinen ein viel stärkeres MRT-Kontrastmittel als ein Nitroxid. Die effektive Korrelationszeit, ein weiterer wichtiger Parameter zur Beurteilung der Effektivität von Kontrastmitteln, verleiht den Nitroxiden jedoch mögliche erhöhte Relaxivität. Wenn die Rotationsrate (Tumbling Rate) verlangsamt wird, beispielsweise durch Befestigung des paramagnetischen Kontrastmittels an einem großen Molekül, rotiert es langsamer und überträgt Energie daher effektiver, um die Relaxation der Wasserprotonen zu beschleunigen. In Gadolinium ist die Elektronenspinrelaxationszeit jedoch schnell und begrenzt daher das Ausmaß der Erhöhung der Relaxivität durch langsame Rotationskorrelationszeiten. Bei Nitroxiden sind die Elektronenspinrelaxationszeiten jedoch günstiger und durch Verlangsamung der Rotationskorrelationszeiten dieser Moleküle lassen sich enorme Steigerungen der Relaxivität erreichen. Die gasgefüllten Vesikel der vorliegenden Erfindung sind ideal, um die Ziele einer langsameren Rotationskorrelationszeit und einer resultierenden Verbesserung der Relaxivität zu erreichen. Ohne sich durch eine bestimmte Verfahrenstheorie binden zu wollen, wird in Betracht gezogen, dass die resultierenden Korrelationszeiten verbessert werden können, da die Nitroxide so konzipiert sein können, um den Umfang der Vesikel zu beschichten, beispielsweise indem Alkylderivate davon hergestellt werden. Darüber hinaus kann das resultierende Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung als eine Magnetkugel angesehen werden, das heißt als eine geometrische Konfiguration, welche die Relaxivität maximiert.
Beispielhafte superparamagnetische Kontrastmittel, die sich zur Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen Metalloxide und -sulfide, die eine Magnetdomäne aufweisen, ferro- oder ferrimagnetische Verbindungen wie beispielsweise reines Eisen, magnetisches Eisenoxid wie beispielsweise Magnetit, γ-Fe₂O₃, Fe₃O₄, Manganferrit, Kobaltferrit und Nickelferrit. In der vorliegenden Erfindung können auch paramagnetische Gase angewandt werden, beispielsweise Sauerstoff-17-Gas (¹⁷O₂). Darüber hinaus kann auch hyperpolarisiertes Xenon-, Neon- oder Heliumgas eingesetzt werden. MR-Ganzkörper-Bilddarstellung kann dann angewandt werden, um den Körper schnell zu untersuchen, beispielsweise hinsichtlich einer Thrombose, und, falls gewünscht, kann Ultraschall angewandt werden, um die Thrombolyse zu unterstützen.
Die Kontrastmittel, wie die oben beschriebenen paramagnetischen und superparamagnetischen Kontrastmittel, können als ein Bestandteil in den Transport-/Abgabevehikeln und/oder stabilisierenden Materialien eingesetzt werden. In Bezug auf Vesikel können die Kontrastmittel in deren innerem Leerraum als eine eingeschlossen sein, als eine Lösung mit den Vesikeln verabreicht werden, in etwaigen zusätzlichen stabilisierenden Materialien enthalten sein oder auf der Oberfläche oder Membran des Vesikels beschichtet sein. Es können Mischungen eines oder mehrerer beliebigen der paramagnetischen Mittel und/oder superparamagnetischen Mittel in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden. Falls gewünscht, können die paramagnetischen und superparamagnetischen Mittel können auch separat zusammen verabreicht werden.
Falls gewünscht, können die paramagnetischen Mittel oder superparamagnetischen Mittel als alkylierte oder als andere Derivate transportiert/abgegeben werden, die in den Zusammensetzungen enthalten sind, insbesondere in der Lipidwand der Vesikel. Insbesondere können die Nitroxide 2,2,5,5-Tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, freies Radikal, und 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy, freies Radikal, an den Positionen des Rings, an denen sie nicht von den Methylgruppen besetzt sind, über verschiedene Verknüpfungen, beispielsweise eine Acetyloxy-Verknüpfung, Addukte mit langkettigen Fettsäuren bilden. Solche Addukte sind sehr zugänglich für den Einschluss in die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
Die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel der vorliegenden Erfindung und insbesondere die Vesikel können nicht nur als effektive Trägerstoffe der oben beschriebenen superparamagnetischen Mittel dienen, sondern auch den Effekt der Suszeptibilität der Kontrastmittel verbessern.
Superparamagnetische Kontrastmittel umfassen Metalloxide, insbesondere Eisenoxide, aber einschließlich Manganoxide und als Eisenoxide, die verschiedene Mengen von Mangan, Kobalt und Nickel enthalten, die eine magnetische Domäne aufweisen. Diese Mittel sind Nano- oder Mikropartikel und haben sehr hohe Bulk-Suszeptibilitäten und transverse Relaxationsraten. Die größeren Partikel, beispielsweise Partikel mit Durchmessern von etwa 100 nm, haben im Vergleich zu R1-Relaxivitäten viel höhere R2-Relaxivitäten. Die kleineren Partikel, beispielsweise Partikel mit Durchmessern von etwa 10 bis etwa 15 nm, haben etwas geringere R2-Relaxivitäten, aber viel ausgewogenere R1- und R2-Werte. Viel kleinere Partikel, beispielsweise monokristalline Eisenoxidpartikel mit Durchmessern von etwa 3 bis etwa 5 nm, haben niedrige R2-Relaxivitäten, aber wahrscheinlich die am meisten ausgewogenen R1- und R2-Relaxationsraten. Ferritin kann ebenfalls formuliert werden, um einen Kern eines superparamagnetischen Eisens mit sehr hoher Relaxationsrate zu verkapseln. Es wurde entdeckt, dass die Lipid- und/oder Vesikelzusammensetzungen, insbesondere Vesikelzusammensetzungen, einschließlich gasgefüllte Vesikel, die Wirksamkeit und Sicherheit dieser konventionellen eisenoxidbasierten MRT-Kontrastmittel erhöhen.
Die Eisenoxide können einfach in die stabilisierenden Materialien und/oder Vesikel eingeschlossen werden. Vorzugsweise können die Eisenoxide im Fall von aus Lipiden formulierten Vesikeln in die Wände der Vesikel eingeschlossen werden, beispielsweise, indem sie auf die Oberfläche der Vesikel adsorbiert werden oder im Inneren der Vesikel eingeschlossen werden.
Ohne sich durch eine bestimmte Verfahrenstheorie binden zu wollen, wird angenommen, dass die Vesikel der vorliegenden Erfindung die Effizienz der superparamagnetischen Kontrastmittel durch mehrere Mechanismen erhöhen. Erstens wird angenommen, dass die Vesikel wirken, um die scheinbare magnetische Konzentration der Eisenoxidpartikel zu erhöhen. Es wird außerdem angenommen, dass die Vesikel die scheinbare Rotationskorrelationszeit der MRT-Kontrastmittel, einschließlich paramagnetische und superparamagnetische Kontrastmittel, derart erhöhen, dass die Relaxationsraten erhöht werden. Darüber hinaus scheinen die Vesikel die scheinbare Magnetdomäne des Kontrastmittels entsprechend der hiernach beschriebenen Art und Weise zu verstärken.
Bestimmte Vesikel der vorliegenden Erfindung und vor allem Vesikel, die aus Lipiden formuliert sind, können als flexible kugelförmige Domänen unterschiedlicher Suszeptibilität in dem Suspensionsmedium visualisiert werden, einschließlich der wässrigen Suspension des Kontrastmittels oder Blut oder sonstigen Körperflüssigkeiten, beispielsweise in dem Fall einer intravaskulären Injektion oder Injektion in andere Körperstellen. In dem Fall von Ferriten oder Eisenoxidpartikeln sollte beachtet werden, dass sich der von diesem Mittel gelieferte Kontrast nach der Partikelgröße richtet. Dieses Phänomen ist sehr gängig und wird häufig als die „säkulare" Relaxation der Wassermoleküle bezeichnet. Mit physikalischeren Begriffen beschrieben, richtet sich dieser Relaxationsmechanismus nach der effektiven Größe des molekularen Komplexes, in dem sich ein paramagnetisches Atom oder ein paramagnetisches Molekül oder paramagnetische Moleküle befinden. Eine physikalische Erklärung kann in den folgenden Solomon-Bloembergen-Gleichungen beschrieben werden, welche die paramagnetischen Beiträge als eine Funktion der T1- und T2-Relaxationszeiten eines Spin-1/2-Nukleus mit gyromagnetischem Faktor g, gestört durch ein paramagnetisches Ion, definieren: 1/T₁M = (2/15)S(S + 1)γ²g²β²/r⁶[3τ_c/(1 + ω₁ ²τ_c ²) + 7τ_c/(1 + ω_S ²τ_c ²)] + (2/3)S(S + 1)A²/h²[τ_e/(1 + ω_S ²τ_c ²)] und 1/T₂M = (1/15)S(S + 1)γ²g²β²/r⁶[4τ_c + 3τ_c/(1 + ω₁ ²τ_c ²) + 13τ_c/(1 + ω_s ²τ_c ²)] + (1/3)S(S + 1)A²/h²[τ_e/(1 + ω_S ²τ_c ²)], wobei S die Elektronenspinquantenzahl ist; g ist der elektronische Faktor, β ist das Bohrsche Magneton; ω₁ und ω_S (657 ω₁) sind die Larmorschen Winkelpräzessionsfrequenzen der Kernspins und Elektronenspins; r ist die Ionen-Kern-Distanz; A ist die hyperfeine Kopplungskonstante, τ_c und τ_e sind die Korrelationszeiten für die dipolaren und skalaren Interaktionen, und h ist die Planksche Konstante.
Einige große Partikel können einen viel größeren Effekt haben als eine große Anzahl viel kleinerer Partikel, hauptsächlich aufgrund einer größeren Korrelationszeit. Wenn man die Eisenoxidpartikel aber sehr groß macht, könnte sich erhöhte Toxizität ergeben und die Lunge kann embolisiert werden, oder es könnte das Komplementkaskadensystem aktiviert werden. Des Weiteren wird angenommen, dass die Gesamtgröße des Partikels nicht so wichtig ist, wie der Durchmesser des Partikels an seinem Rand oder an seiner Außenfläche. Die Magnetisierungsdomäne oder der Suszeptibilitätseffekt nimmt ausgehend von der Oberfläche des Partikels exponentiell ab. Allgemein ausgedrückt zeigt diese exponentielle Abnahme im Fall von dipolaren (durch den Raum wirkenden) Relaxationsmechanismen eine r⁶-Abhängigkeit einer paramagnetischen Dipol-Dipol-Interaktion. Wörtlich ausgelegt bedeutet dies, dass ein Wassermolekül, das sich in einem Abstand von 4 Ångström zu einer paramagnetischen Fläche befindet, 64-Mal weniger beeinflusst wird, als ein Wassermolekül, dass sich in einem Abstand von 2 Ångström zu derselben paramagnetischen Fläche befindet. Die ideale Situation in Bezug auf die Maximierung des Kontrasteffekts wäre es, die Eisenoxidpartikel hohl, flexibel und so groß wie möglich zu gestalten. Es war zuvor nicht möglich, dies zu erreichen, und es wird angenommen, dass auch die Vorteile vordem nicht erkannt worden sind. Durch Beschichten der Innen- oder Außenflächen der Vesikel mit den Kontrastmitteln kann die Wirksamkeit der Kontrastmittel deutlich erhöht werden, selbst wenn die einzelnen Kontrastmittel, beispielsweise Eisenoxidnanopartikel oder paramagnetische Ionen, relativ kleine Strukturen sind. Damit können die Kontrastmittel als eine effektiv viel größere Kugel wirken, wobei die effektive Magnetisierungsdomäne vom Durchmesser des Vesikels bestimmt wird und an der Oberfläche des Vesikels maximal ist. Diese Mittel bieten den Vorteil der Flexibilität, nämlich Compliance. Während steife Vesikel in der Lunge oder anderen Organen bleiben und toxische Reaktionen auslösen, gleiten diese flexiblen Vesikel viel leichter durch die Kapillaren.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen flexiblen Vesikeln, kann es unter bestimmten Umständen wünschenswert sein, Vesikel aus im Wesentlichen undurchlässigen polymerischen Materialien zu formulieren, einschließlich beispielsweise Polymethylmethacrylat. Dies würde im Allgemeinen zur Bildung von Vesikeln führen, die im Allgemeinen undurchlässig und relativ unelastisch und brüchig sind. In Ausführungsformen, die diagnostische Bilddarstellung umfassen, beispielsweise Ultraschall, würden Kontrastmedien, welche solche brüchigen Vesikel umfassen, im Allgemeinen nicht das wünschenswerte Reflexionsvermögen liefern, wie es die flexiblen Vesikel liefern können. Durch Erhöhung der Energieabgabe beim Ultraschall können die brüchigen Mikrokügelchen jedoch veranlasst werden aufzubrechen, wodurch akustische Emissionen verursacht werden, die von einem Ultraschallkopf festgestellt werden können.
Auch nuklearmedizinische Bilddarstellung (NMI) kann in Verbindung mit den diagnostischen und therapeutischen Verfahrensaspekten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. NMI kann beispielsweise eingesetzt werden, um radioaktive Gase wie Xe¹³³ festzustellen, welches in den vorliegenden Zusammensetzungen außer den oben diskutierten oder anstelle der oben diskutierten Gase enthalten sein kann. Solche radioaktiven Gase können in den Vesikeln zur Verwendung bei der Feststellung von beispielsweise einer Thrombose eingeschlossen sein. Vorzugsweise sind in den Wänden der Vesikel bifunktionelle Chelatderivate enthalten, und die resultierenden Vesikel können sowohl bei der NMI als auch bei Ultraschallverfahren eingesetzt werden. In diesem Fall können energiereiche hochwertige nuklearmedizinische Bilddarstellungs-Isotope wie beispielsweise Technetium^99m oder Indium¹¹¹ in die Wände der Vesikel eingeschlossen werden. Ganzkörper-Gamma-Untersuchungskameras können dann eingesetzt werden, um Bereiche der Vesikelaufnahme in vivo schnell zu lokalisieren. Falls gewünscht, kann auch Ultraschall verwendet werden, um das Vorhandensein beispielsweise eines Gerinnsels in den Blutgefäßen zu bestätigen, da Ultraschalltechniken im Vergleich zu nuklearmedizinischen Techniken im Allgemeinen eine bessere Auflösung liefern. NMI kann auch verwendet werden, um den gesamten Körper eines Patienten zu untersuchen, um Bereiche einer Gefäßthrombose festzustellen, und Ultraschall kann auf diese Bereiche angewandt werden, um das Aufbrechen der Vesikel zu fördern und das Gerinnsel zu behandeln.
Elastographie ist eine Bilddarstellungstechnik, die im Vergleich zu Ultraschall, bei dem Frequenzen über 1 MHz beteiligt sein können, im Allgemeinen viel geringere Schallfrequenzen einsetzt, beispielsweise etwa 60 kHz. Bei der Elastographie wird die Schallenergie oder Vibrationsenergie im Allgemeinen auf das Gewebe angewandt, und anschließend kann die Elastizität des Gewebes bestimmt werden. In Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die hoch elastische Vesikel umfassen, erhöht die Ablagerung solcher Vesikel beispielsweise auf einem Gerinnsel die lokale Elastizität des Gewebes und/oder des Raums in der Umgebung des Gerinnsels. Diese erhöhte Elastizität kann dann mittels Elastographie festgestellt werden. Falls gewünscht, kann Elastographie in Verbindung mit anderen Bilddarstellungstechniken, wie beispielsweise MRT und Ultraschall, verwendet werden.
Beispiele
Die Erfindung wird des Weiteren in den folgenden Beispielen gezeigt. Beispiel 1–4 dienen nur dem Zweck der Veranschaulichung und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken. Beispiel 1–3 sind eigentliche Beispiel, während Beispiel 4 ein prophetisches Beispiel ist.
Beispiel 1
Perfluorpropan-verkapselte Lipiddoppelschichten wurden mit einer Lipidformulierung gebildet, die 5 mg/ml einer Mischung umfasste, welche 82 Mol-% Dipalmitoylphosphatidylcholin, 10 Mol-% Dipalmitoylphosphatidinsäure und 8 Mol-% Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG 5.000 (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala., USA) in einem Vehikel umfassend 8:1:1 (Vol.:Vol.:Vol.) normale Salzlösung:Propylenglycol:Glycerol umfasste, was einen Schaum und eine untere Vehikelschicht ergab, die überwiegend partikelfrei war. Zu dieser Mischung wurde 1 mg/ml Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, derivatisiert mit Lissamine^TM-Rhodamin B (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala., USA) bei etwa 25 Mol-Prozent (z. B. im Allgemeinen etwa 1 bis etwa 50 Mol-Prozent), gegeben.
Dipalmitoylphosphatidylethanolamin wird mit Lissamine^TM-Rhodamin B nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren derivatisiert, einschließlich den von Leenhouts et al., Biochim. Biophys. Acta. 1237(2): 121–126 (1995) und MacDonalds, J. Biol. Chem., 265: 13533–13539 (1990) Beschriebenen. Das zu verwendende Maximum wird durch die Konzentration bestimmt, die noch die Bildung stabiler lipidbeschichteter Bläschen erlaubt. Vorzugsweise ist dies bei 10 bis 20 Mol-Prozent.
Die optoakustischen Liposomen wurden gebildet, indem die Mischung auf einem ESPE-Capmix für zwei Minuten bei 4.500 Umdrehungen pro Minute geschüttelt wurde. Varianten des Vehikels ergaben verschiedene Grade der Klarheit der unteren Vehikelschicht. Vor der Filtrierung wurde die Größe der gasgefüllten Mikrokügelchen mit einem Particle Sizing Systems Model 770 Optical Sizer (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, Kalif., USA) festgelegt. Die Größenfestlegung bewirkte, dass 99% aller Partikel eine Größe unter 34 μm aufwiesen. Das resultierende Produkt wurde durch einen 8-μm-Filter filtriert, um Mikrokügelchen einheitlicher Größe zu erhalten. Die Größenfestlegung der folgenden Mikrokügelchen bewirkte, dass 99,5 aller Partikel eine Größe unter 10 μm aufwiesen. Das photoaktive Lipid wurde optimal mit Licht bei 550 nm (gelb-grün) angeregt und die Fluoreszenzemissionsspitze lag bei 590 nm.
Beispiel 2
1,5 g eines fluoreszein-derivatisierten Diacylphosphatidylethanolamins und 3 g Sojaöl wurden in einem Vortexmischer bewegt. Diacylphosphatidylethanolamin wurde mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren mit Fluoreszein derivatisiert, einschließlich die von Ahlers et al., Biophys. J., 63: 823–838 (1992) Beschriebenen, deren Offenbarung hiermit in Gänze durch Bezugnahme hierin enthalten ist. Zu dieser Mischung wurde 1,0 g einer Lipidmischung gegeben, die 82 Mol-% Dipalmitoylphosphatidylcholin, 10 Mol-% Dipalmitoylphosphatidinsäure und 8 Mol-% Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG 5.000 (alle Phospholipide von Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) umfasste. Die Mischung wurde 10 Minuten bei 50°C gerührt, anschließend in einen Behälter mit 200 ml normaler Salzlösung plus 1% (Gew./Vol.) Pluronic P-65 überführt und mit einem Microfluidizer (10×) bei 16.000 psi emulgiert, während die Temperatur bei 50°C gehalten wurden. Das Material wurde anschließend in 1,0-ml-Aliquots in 1,5-ml-Gefäße aufgeteilt. Die Gefäße wurden vakuum-evakuiert und der Gasraum mit Perfluorbutan gefüllt. Die Gefäße wurden versiegelt und auf einem ESPE-Capmix für 60 Sekunden bei 4.500 Umdrehungen pro Minute geschüttelt (alternativ können die Gefäße auf einem Wig-L-Bug (Crescent Dental, Lyons, IL, USA) platziert und bei 2.800 Umdrehungen pro Minute 2 Minuten lang bewegt werden). Das resultierende Produkt war eine Suspension eines fluoreszierenden Lipids in ölgefüllten Liposomen oder Lipokügelchen (d. h. Vesikeln), die etwa 0,45 Gew.-% Fluorophor und 0,45 Gew.-% andere Lipide enthielten. Das Endprodukt umfasste akustisch und optisch aktive Lipokügelchen, die mit Perfluorbutangas instilliert waren und einen mittleren Durchmesser unter 10 μm aufwiesen.
Beispiel 3
Die Zielformulierung, die in Beispiel 11 der sich in gemeinschaftlichem Besitz befindenden US-Anmeldung, Serien-Nr. 08/851,780, eingereicht am 6. Mai 1997, (deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme enthalten ist), offenbart ist, wurde auf folgende Weise hergestellt: Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung von 66,8 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-succinat, 11,5 mg N-Hydroxysuccinimid, 2 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) und 40 ml Acetonitril in einer 100-ml-Rundbodenflasche wurde tropfenweise eine Lösung von 20,6 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml Acetonitril gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 Stunden lang gerührt. Das feste Material, das sich während der Reaktion bildete (Dicyclohexylharnstoff), wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wurde in vacuo konzentriert, um eine Ausbeute von 78 mg eines weißen Produktes von N-DPGS-Succinimid zu erhalten.
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung des obigen N-DPGS-Succinimid (78 mg) und CHCl₃ (10 ml) (Mallinckrodt, St. Louis, MO, USA) in einer 100-ml-Rundbodenflasche wurde tropfenweise eine Lösung von ω-Amino-ω'-carboxypolyethylenglycol (0,3 g) und Triethylamin (40 mg) in CHCl₃ (20 ml) gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 Stunden lang bei 10°C gerührt. Nach Rühren über Nacht wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser gegossen und mit 10% HCl auf einen pH-Wert von etwa 3 oder weniger neutralisiert. Die untere organische Schicht wurde mithilfe eines Separationstrichters entfernt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde aufgefangen und getrocknet (NaSO₄). Filtration und Konzentration in vacuo ergaben eine Ausbeute von 0,34 g eines weißen Feststoffes von 3-ω-Carboxypolyethylenglycoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω-carboxy-PEG).
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung von DPGS-ω-carboxy-PEG (200 mg) von Schritt B, N-Hydroxysuccinimid (6 mg), Dimethylaminopyridin (DMAP) (2 mg) und Acetonitril (40 ml) in einer 250-ml-Rundbodenflasche wurde tropfenweise eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (12 mg) in Acetonitril (10 ml) gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 Stunden lang gerührt und der weiße Feststoff, der sich bildete (Dicyclohexylharnstoff), wurde durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde in vacuo konzentriert, um eine Ausbeute von 200 mg eines weißen Feststoffes von 3-Succinamoyloxycarbonylpolyethylenglycoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid) zu erhalten.
Zu einer gekühlten (5 bis 10°C) gerührten Lösung von menschlichem IL-2 (20 mg) (Signal Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in einem wässrigen Puffer (20 ml) bei einem pH-Wert von 8,5 wurde tropfenweise eine Lösung von DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid aus Schritt C (4 mg) und Acetonitrol (10 ml) gegeben. Die Temperatur der resultierenden Mischung wurde auf Raumtemperatur äquilibriert, und die Reaktionsmischung wurde etwa 48 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde in vacuo konzentriert und die verbleibenden Salze wurden unter Verwendung eines Dialysebeutels mit einem Molekulargewicht-Cutoff von etwa 3500, äquilibriert gegen Wasser, durch Dialyse entfernt. Die resultierende dialysierte Lösung wurde eingefroren und lyophilisiert, um einen Ertrag von 12 mg eines weißen Feststoffes einer N-(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-succinyl)-PEG-Interleukin-2(DPGS-PEG-IL-2)-Konjugat-Zieleinheit zu erhalten.
Die oben beschriebene Vesikelformulierung wurde derart modifiziert, dass 15 Molprozent des fluoreszierenden Lipids NBD-Diacylphosphatidylethanolamin (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) für den DPPA-Bestandteil und einen Anteil des DPPC-Bestandteils substituiert wurde. Die Lipidendkonzentration des optoakustischen Mittels umfasste 72 Mol-% DPPC, 8-Mol-% DPPE-PEG5000, 5 Mol-% DPGS-PEG-IL-2 und 15% NBD-Diacylphosphatidylethanolamin. Die Lipidmischung wurde anschließend in 1,0-ml-Aliquots in 1,5-ml-Gefäße aufgeteilt. Die Gefäße wurden vakuum-evakuiert und der Gasraum mit Perfluorpentangas gefüllt, und die Gefäße wurden auf einem ESPE-Capmix 60 Sekunden bei 4500 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Die Formulierung kann zur Bilddarstellung (akustisch und/oder optisch) eines Thrombus und für eine Thrombolyse injiziert werden. Optische Bilddarstellung wird am Besten mit einfallender Strahlung von 460 nm und Fluoreszenzerfassung bei 534 nm durchgeführt.
Beispiel 4
Wie in 7 gezeigt, kann die Form des Transport-/Abgabevehikels ein fester Matrixwirkstoff oder ein akustisch aktives Lipokügelchen (wie in 7A veranschaulicht) oder ein Lipidvesikel (wie in 7B veranschaulicht) sein. Beide Transport-/Abgabevehikel enthalten ein echogenes Gas oder einen Gasvorläufer und präsentieren Zielliganden zum Transport/zur Abgabe an Rezeptoren an der Stelle, die eine Therapie erfordert. Beide Vehikel enthalten ein photoaktives Mittel, das ein Wirkstoff (z. B. ein bioaktives Mittel) sein kann oder einen Wirkstoff begleiten kann.
Photofrin (Quadra Logic Technologies, Vancouver, BC, Kanada), ein photoaktives Mittel, bei dem es sich um ein gereinigtes Hämatoporphyrinderivat handelt, wird zu einem flüssig-gelösten getrockneten Wirkstoff umgewandelt und zu menschlichen Melanomzellen geleitet, wobei Mikrobläschen ein wahlweise fluoriertes Lipidkonjugat von Anti-Interleukin-2-Fab-Fragment (AB5 (APC)) (erhältlich von Oncogene Research, Cambridge, MA, USA) enthalten. Die Synthese des Konjugates ist unten ausführlich beschrieben.
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung von 66,8 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-succinat, 11,5 mg N-Hydroxysuccinimid, 2 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) und 40 ml Acetonitril in einer 100-ml-Rundbodenflasche wurde tropfenweise eine Lösung von 20,6 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml Acetonitril gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 Stunden lang gerührt. Das feste Material, das sich während der Reaktion bildete (Dicyclohexylharnstoff), wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wurde in vacuo konzentriert, um eine Ausbeute von 78 mg eines weißen Produktes von N-DPGS-Succinimid zu erhalten.
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung von N-DPGS-Succinimid (78 mg) und CHCl₃ (10 ml) (Mallinckrodt, St. Louis, MO, USA) in einer 100-ml-Rundbodenflasche wurde tropfenweise eine Lösung von ω-Amino-ω'-carboxypolyethylenglycol (0,3 g) und Triethylamin (40 mg) in CHCl₃ (20 ml) gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 Stunden lang bei 10°C gerührt. Nach Rühren über Nacht wurde die Reaktionsmischung in Eiswasser gegossen und mit 10% HCl auf einen pH-Wert von etwa 3 oder weniger neutralisiert. Die untere organische Schicht wurde mithilfe eines Separationstrichters entfernt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde aufgefangen und getrocknet (NaSO₄). Filtration und Konzentration in vacuo ergaben eine Ausbeute von 0,34 g eines weißen Feststoffes von 3-ω-Carboxypolyethylenglycoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω-carboxy-PEG).
Zu einer gekühlten (0 bis 5°C) Lösung von DPGS-ω-carboxy-PEG (200 mg), N-Hydroxysuccinimid (6 mg), Dimethylaminopyridin (DMAP) (2 mg) und Acetonitril (40 ml) in einer 250-ml-Rundbodenflasche wurde tropfenweise eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (12 mg) in Acetonitril (10 ml) gegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 Stunden lang gerührt und der weiße Feststoff, der sich bildete (Dicyclohexylharnstoff), wurde durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde in vacuo konzentriert, um eine Ausbeute von 200 mg eines weißen Feststoffes von 3-Succinamoyloxycarbonylpolyethylenglycoliminosuccinat-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid) zu erhalten.
Zu einer gekühlten (5 bis 10°C) gerührten Lösung von menschlichem IL-2 (20 mg) (Signal Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in einem wässrigen Puffer (20 ml) bei einem pH-Wert von 8,5 wurde tropfenweise eine Lösung von DPGS-ω-carboxy-PEG-succinimid (4 mg) und Acetonitrol (10 ml) gegeben. Die Temperatur der resultierenden Mischung wurde auf Raumtemperatur äquilibriert, und die Reaktionsmischung wurde etwa 48 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde in vacuo konzentriert und die verbleibenden Salze wurden unter Verwendung eines Dialysebeutels mit einem Molekulargewicht-Cutoff von etwa 3500, äquilibriert gegen Wasser, durch Dialyse entfernt. Die resultierende dialysierte Lösung wurde eingefroren und lyophilisiert, um einen Ertrag von 12 mg eines weißen Feststoffes eines N-(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-succinyl)-PEG-Interleukin-2(DPGS-PEG-IL-2) zu erhalten. Weitere Einzelheiten zu dieser Reaktion sind in US-Anmeldung, Serien-Nr. 08/851,780, beantragt am 6. Mai 1997, ausgeführt.
Da Photofrin wasserlöslich ist, wird es am besten als ein methanollöslicher getrockneter Wirkstoff verwendet, wobei die Methanollösung zu einer Lipidmischung von DPPC/DPPA/DPPE-PEG5000 (8:1:1 Gew./Gew./Gew.) gegeben wird. Die Mischung wird in eine Kugelmühle gegeben, so dass sich Wirkstoffpartikel einheitlicher Größe bilden, und gefiltert, um die Partikel über 0,5 μm auszuschließen. Dieses Material wird anschließend in einen Lyophilisator gegeben und getrocknet, um ein lipidbeschichtetes Wirkstoffaggregat zu erhalten. Dieses kann dann in normaler Salzlösung in einem Schüttler rekonstituiert werden, wobei der Gasraum durch Perfluorbutan ersetzt ist.
Obwohl die Erfindung in beträchtlichen Einzelheiten ausgeführt worden ist, ist einem Fachmann klar, dass die bevorzugten Ausführungsformen zahlreichen Änderungen und Modifikationen unterzogen werden können, und dass solche Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verwendung eines stabilisierenden Materials; eines photoaktiven Mittels; und eines Gases, eines Gasvorläufers oder eines Gases und eines Gasvorläufers, wobei das Gas und der Gasvorläufer eine fluorierte Verbindung umfasst, in Kombination für die Herstellung einer Zusammensetzung zum Gebrauch in einem Verfahren zum Abgeben eines photoaktiven Mittels an eine Region eines Patienten, wobei das Verfahren umfasst: Verabreichen an den Patienten der Zusammensetzung, die das stabilisierende Material, das photoaktive Mittel und das Gas, Gasvorläufer oder Gas und Gasvorläufer umfasst; Anwenden von Ultraschall zum Durchbrechen des stabilisierenden Materials und Abgeben des photoaktiven Mittels an den Bereich; und Anwenden von Lichtenergie zum Aktivieren des photoaktiven Mittels, wobei die Lichtenergie intravaskular über einen Katheter angewandt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Verfahren weiterhin das Überwachen des Ortes der Zusammensetzung mit Ultraschallabbildung umfasst, um den Ort der Zusammensetzung zu bestimmen vor Anwenden von Ultraschall zum Aufbrechen des stabilisierenden Materials und Abgeben des photoaktiven Mittels an den Bereich.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin die Überwachung des Ortes der Zusammensetzung mit optischer Abbildung umfasst, um den Ort der Zusammensetzung vor Anwendung von Ultraschall zu bestimmen zum Aufbrechen des stabilisierenden Materials und Abgeben des photoaktiven Mittels an den Bereich.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Verfahren weiterhin das Überwachen des Ortes der Zusammensetzung mit Ultraschallabbilden und optischen Abbilden, wobei optische mitschwingende Signale aus der Zusammensetzung durch Ultraschall moduliert werden, um den Ort der Zusammensetzung vor Anwendung von Ultraschall zum Aufbrechen des stabilisierenden Materials zu bestimmen und Abgeben des photoaktiven Mittels an den Bereich umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Bereich des Patienten Krebsgewebe ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das stabilisierende Material in Vesikelform vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das stabilisierende Material in einer nicht vesikularen Form vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das stabilisierende Material eine Flüssigkeit, ein Protein oder ein Polymer umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das stabilisierende Material ein Lipid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das stabilisierende Material ein Tensid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das stabilisierende Material ein fluoriertes Tensid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das photoaktive Mittel aktiv in einem Wellenlängenbereich von etwa 500 nm bis etwa 1400 nm ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das photoaktive Mittel aktiv bei einer Infrarotwellenlänge ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das photoaktive Mittel ein Photosensitivierer ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das photoaktive Mittel ein fluoreszierendes Material ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das photoaktive Mittel wenigstens eines ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die besteht aus Fluoresceinen, Indocyaningrün, Rhodamin, Triphenylaminen, Polymethinen, Cyaninen, Phthalocyaninen, Naphthocyaninen, Merocyaninen, Fullerenen, Oxatellurazolen, Verdinen (Anilingrünfarbstoffe), Rhodinen, Perphycenen, Sapphyrinen, Rubyrinen, Metallporphyrinen, Cholesteryl-4,4-Difluor-5,7-Dimethyl-4-bora-3a,4a-Diaza-s-Indacen-3-Dodecanoat, Cholesteryl-12-(N-Methyl-N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-Dodecanat, Cholesteryl-cis-Parinarat, Cholesteryl-3-((6-Phenyl)-1,3,5-Hexatrienyl)-Phenylproprionat, Cholesteryl-1-Pyrenbutyrat, Cholesteryl-1-Pyrendecanoat, Cholesteryl-1-Pyrenhexanoat, 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)-Amino)-23,24-Bis-Nor-5-cholen-3-β-ol, 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)-Amino)-23,24-Bis-Nor-5-cholen-3-β-yl cis-9-Octadecenoat, 1-Pyrenmethyl-3-(Hydroxy-22,23-Bis-Nor-5-cholenat, 1-Pyrenmethyl-3β-(cis-9-Octadecenoyloxy)-22,23-Bis-Nor-5-cholenat, Acridin-Orange-10-Dodecylbromid, Acridin-Orange-10-Nonylbromid, 4-(N,N-Dimethyl-N-Tetradecylammonium)-Methyl-7-Hydroxycoumarin)Chlorid, 2-Dodecylresorufin, 4-Heptadecyl-7-Hydroxycoumarin, 5-Hexadecanoylaminoeosin, N-Octadecyl-N'-(5-(Fluoresceinyl))-Thioharnstoff, Octadecylrhodamin-B-Chlorid, 2-(3-(Diphenylhexatrienyl)Propanoyl)-1-Hexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin, 6-N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)Hexansäure, 1-Hexadecanoyl-2-(1-Pyrendecanoyl)-sn-Glycero-3-Phosphocholin, 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat, 12-(9-Anthroyloxy)Ölsäure, 5-Butyl-4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-Diaza-s-Indacen-3-Nonansäure, N-(lissamin-Rhodamin-B-Sulfonyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz, Phenylglyoxalmonohydrat, Naphthalin-2,3-Dicarbox-aldehyd, 8-Brommethyl-4,4-Difluor-1,3,5,7-Tetramethyl-4-bora-3a,4a-Diaza-s-Indacen, o-Phthaldialdehyd, Lissamin-Rhodamin-B-Sulfonylchloriden, 9-Anthronitril, 1-Pyrensulfonylchlorid, 4-(4-(Dihexadecylamino)-Styrol)-N-Methylpyridiniumiodid, Texaphyrinen, Texaphyrinmetallchelaten, Chlorinen, Chlorin e6, Bonellin, mono-L-Aspartylchlorin e6, Mesochlorin, Mesotetraphenylisobacteriochlorin, Mesotetraphenylbacteriochlorin, Hypocrellin-B, Purpurinen, Octaethylpurpurin, Zink(II)Etiopurpurin, Zinn(IV)Etiopurpurin, Zinnethyletiopurpurin, Lutetium-Texaphyrin, Photofrin, ProtoporphyrinIX, Zinnprotoporphyrin, Porphyrinen, Benzoporphyrinen, Hämatoporphyrin, Methylpheophorbid-α0.-Hexylether, Porphycenen, Ketochlorinen, sulfonierten Tetraphenylporphinen, δ-Aminolevulinsäure, Chlorophyll, Carotenoide, Flavonoide, Bilinen, Phytochromen, Phycobilinen, Phycoerythrin, Phycocyaninen, Retinolsäure, Retinoinen und Retinaten.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das photoaktive Mittel an das stabilisierende Material konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das photoaktive Mittel an einen Antikörper konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die fluorierte Verbindung Hexafluorid, ein Perfluorkohlenwasserstoff oder Perfluorether ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin die fluorierte Verbindung gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Schwefelhexafluorid, Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorcyclopropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluorpentan, Perfluorcyclopentan, Perfluorhexan, Perfluorcyclohexan, Perfluortetrahydropyran, Perfluormethyltetrahydrofuran, Perfluorbutylmethylether, Perfluorpropylethylether, Perfluorcyclobutylmethylether, Perfluorcyclopropylethylether, Perfluorpropylmethylether, Perfluordiethylether, Perfluorcyclopropylmethylether, Perfluormethylethylether und Perfluordimethylether.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung weiterhin eine fluorierte Flüssigkeit umfasst.
Verwendung nach Anspruch 21, worin die fluorierte Flüssigkeit gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Perfluorheptan, Perfluoroctan, Perfluornonan, Perfluordecan, Perfluordodecan, Perfluordecalin, Perfluordodecalin, perfluoroctyliodid, Perfluoroctylbromid, Perfluortripropylamin, Perfluortributylamin, Perfluorbutylethylether, bis(Perfluorisopropyl)-Ether und Bis(Perfluorpropyl)-Ether.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung weiterhin einen Zielliganden umfasst.
Verwendung nach Anspruch 23, worin der Zielligand gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus einem Protein, einem Peptid und einem Saccharid.
Verwendung nach Anspruch 23, worin der Zielligand gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus einem Glycolipid, einen Lipoprotein und einem Antikörper.
Verwendung nach Anspruch 23, worin der Zielligand ein genetisches Material ist.
Verwendung nach Anspruch 26, worin das genetische Material gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus RNA, DNA, Sense-RNA, Sense-DNA, Antisense-RNA, Antisense-DNA, Hammerhead-RNA, Ribozymen, Hamerhead-Ribozymen, Antigen-Nucleinsäuren, Ribooligonukleotiden, Desoxyribooligonukleotiden, Antisense-Ribonukleotiden und Antisense-Desoxyribooligonukleotiden.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung weiterhin ein bioaktives Mittel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung weiterhin ein Öl umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung eine poröse Matrix umfasst.