CN1148812A

CN1148812A - “脂质体”

Info

Publication number: CN1148812A
Application number: CN95193097A
Authority: CN
Inventors: J·克拉夫内斯; A·堡格; T·V·雅各森; P·朗维; T·艾格; H·菊地; K·屋地
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; Nycomed Imaging AS
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; GE Healthcare AS
Priority date: 1994-03-28
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 1997-04-30
Also published as: AU2076895A; US5676928A; DE69527194T2; WO1995026205A1; EP0752889B1; ATE219688T1; CA2185810A1; IL113139A0; EP0752889A1; ZA952485B; DE69527194D1

Abstract

本发明提供了一种可用于人体或动物体的诊断的组合物，该组合物含有多层脂质体，也可含有或不含有单层脂质体，脂质体中包被至少一种显影剂并且脂质体被悬浮于含有该种显影剂的水介质中，其中，脂质体包括中性磷脂和荷电磷脂，脂质体的平均颗粒直径为50-3000nm并且脂质体内部水相中显影剂的浓度基本与悬浮脂质体的水介质中显影剂的浓度相同。这里所提及的造影剂就是典型的X-射线，磁共振显像或超声的造影剂。

Description

“脂质体”

本发明涉及一种诊断用注射组合物，该组合物含有包被着一种或多种显影剂的脂质体。

在广泛的诊断影像领域，造影剂被用来增强影像的强度，最重要的是用于X-射线成像，磁共振成像、超声波成像和核医学成像。

X-射线成像(包括计算机辅助X-射线断面照相术(CT)和数字递减血管照相术(DSA))中，反差的产生是由于电子密度的差异。当前，X-射线造影剂通常用的是重的元素，包括钡盐如硫酸钡(可用于增强肠胃系统影像的显现)和碘化造影剂(可用于肠胃系统及非肠胃系统的研究)。

碘化X-射线造影剂一般都包含碘化苯基基团，最典型的是含有至少一个2，4，6-三碘苯基团且在其3位和/或5位上具有选自下列基团的取代基：羧基，氨甲酰基，N-烷基氨甲酰基，N-羟基烷基氨甲酰基，酰氨基，N-烷基酰胺基和酰氨基甲基，这一类的离子X-射线造影剂包括甲基泛影酸，泛影酸，脑影酸，碘克沙酸及这些酸的盐。

非离子型碘化X-射线造影剂，由于其低渗透性及该性质所导致的较小的血液动力学影响，通常其毒性基本上要比离子型造影剂低，这些造影剂包括碘海醇(iohexol)，碘喷托(iopentol)，碘帕醇(iopamidol)，碘克沙醇(iodixanol)，碘普罗胺(iopromide)，碘曲仑(iotrolan)和甲泛葡胺(metrizamide)。其中那些被称为二聚体的(如，碘克沙醇和碘曲仑)，当其浓度在300mg/ml或更高时，就其渗透压而言，可以配成同血液等渗。

最近，基于重金属络离子/螯合物的肠胃外X-射线造影剂引起人们的兴趣，可参见WO-A-9114460和WO-A-9217215中所述。

由于其亲水性到目前为止所提及的所有X-射线造影剂，几乎具有相同的胞外生物分布且因此而有相类似的临床指征并且均由肾脏排出。因而，试图发现对器官更特异的造影剂。比如，将碘苯基团同大分子底物如淀粉相连，以图提高碘化造影剂在血管中的半衰期。

以可被生物降解粒子为基础的一些可能的肝脏造影剂已经被提出，(比如参见WO-A-8900988和WO-A-9007491)并且包含离子或非离子X-射线造影剂的脂质体也已被提及。但由于稳定性和毒性等问题，迄今为止还没有上市或是已进入晚期临床阶段，故而，需要一种更稳定，无毒性且器官特异性的X-射线造影剂，而这一需求尚未得到满足。

在磁共振成像中，能被造影剂所影响的主要的对比参数是自旋弛豫时间(T₁)和自旋-自旋弛豫时间(T₂)。顺磁性螯合物(比如锰离子(2+)，钇离子(3+)和铁离子(3+))可减少自旋-晶格弛豫时间(T₁)从而增加信号强度。磁共振造影剂若用磁性/超顺磁性物质，则会减少自旋-自旋弛豫时间(T₂)，从而导致信号强度的减弱。

镝元素顺磁螯合物及其它高剂量的顺磁化合物也能减弱磁共振信号强度。纵观磁共振造影剂，一些正在研制发展中，一些已经上市，详情可查：D.D.stark和W.G.Bradley：磁共振成像，Mosby 1992，Chapter 14。

一些亲水螯合物，如GdDTPA GdDOTA，GdHPDO3A和GdDTPA-BMA分布于胞外，且被肾消除。这样的复合物可用于观察诸如中枢神经系统的损害等。其它的对器官或组织特异性更强的造影剂包括MnDPDP，GdBOPA，GdEOB-DTPA，顺磁性卟啉，大分子化合物，粒子及脂质体等。

各种顺磁性金属离子及其螯合物曾被包被于脂质体中。比如：有不同类脂组分，不同表面电荷及不同直径的小单层脂质体颗粒(SUVs)，大单层脂质体颗粒(LUVs)和多层脂质体颗粒(MLVs)曾被提出用作磁共振的造影剂(例如见：S.E.Seltzer.放射学171(1989)第19页；S.E.Seltzer等实验放射学23(1988)第131页；C.Tilcock等放射学171(1989)第77页；C.Tilcock等生物化学与生物物理学报1022(1990)第181页；E.C.Unger等实验放射学25(1990)第638页；E.C.Unger等实验放射学23(1988)第928页；E.C.Unger等放射学171(1989)第81页；E.C.Unger等磁共振成像7(1989)第417页及J.Vion-Dury等药理学与实验治疗学杂志250(1989)第111页)。但是，尽管有许多关于用脂质体做磁共振造影剂的报导，目前尚无此类产品商业化或进入晚期临床发展阶段。

超声成像的原理是基于超声波的穿透性，例如：一频率为1-10兆赫兹的超声波，通过一换能器，穿透人或动物的身体，超声波将与体内组织和体液的表面互相作用。超声图像的反差的形成就是由于在这些表面，超声波被不同程度地反射/吸收引起的；图像效果可用多谱勒技术来增强，包括运用彩色多谱勒来判定血液的流动。

运用造影剂来增强不同组织/体液间的声学特性的差异可能对超声成像有好处，这一点久已为人所识，自从1968年运用第一个超声波造影剂，靛蓝花青绿以来，已经有许多造影剂，包括超声波诱导剂，被测试。其中包括乳剂，固体颗粒，水溶性化合物，游离气泡及各种类型的含气体的有外被的造影剂系统。通常约为：易压缩的低密度造影剂在产生声波反向散射上是非常有效的；因而含气或产气的造影剂系统较其它类型系统有效得多。

现在，有三种超声波造影剂已能商业供货或已处于晚期临床发展阶段，它们是：Echovist^，一种含气体的半乳糖微晶； Levovist^，含有用脂肪酸包被的含气体的半乳糖微晶；Infoson^，含有被不完全变性的人血清白蛋白包被的气泡。然而，由于其较短的造影半衰期(就是说其在体内相对来说不稳定)和/或它们的有限的存贮期，这些造影剂的临床应用受到了限制。

因而，对于超声波造影剂的需求仍未改变，特别是需要可用来心脏和非心脏的灌注研究的造影剂，这就要求该造影剂不但要有好的存贮稳定性，还应在体内研究中也稳定，在心脏或非心脏的灌注分析中，造影剂最好能够至少维持几次循环。

尽管有众多的出版物建议用脂质体或其它技术来增加各种造影剂的组织或器官特异性，但却均有不足之处，因而当前尚无这种类型的产品在市场上出售或已进入晚期临床发展阶段。这一结果是由于以下问题造成的：低的包被率，毒性，短的存贮期和/或体内的不稳定性或短的造影半衰期；此外，现有的一些产品含有非常复杂的成分。因而，仍需要不存在这些问题的造影剂。在超声波成像领域，特别需要这样的造影剂：该造影剂应在体内有很高的稳定性，以便可以用来作心脏或非心脏的灌注并且其本身必须稳定，也便能有效地使肝成像，以进行诊断。

一般来说，脂溶性药物易于混合进脂质体中。另一方面，对于水溶性药物，通过药物所带电荷同带电脂类间的静电作用或是靠脂质体内外pH梯度，水溶性电解质也可被包被在脂质体内部水相中(见：日本专利申请No.2-187370和WPI 88-271022/38)。

然而，用上述方法包被的药物量很低。更有甚者，一旦药物是一种水溶性的非电解质物质，上述方法将行不通，因而有效地用脂质体包被一种水溶性的非电解质药物并非易事。为了有效地将水溶性的非电解质包装于脂质体内层水相中，人们提出了反相蒸发法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol75(9)，第4194页，1978)，乙醚注射法(ibid，Vol443，第629页，1975)及其它方法。

但是，这些方法中用到的乙醚是一种低熔点物质，因此这些方法不能用于工业化生产大量的脂质体。

国际专利申请WO 88/09165描述了一种可供注射用的脂质体的制剂。该脂质体含有一种X-射线造影剂溶液，脂质体又悬浮于生理盐缓冲液连续相中。尽管脂质体是在含X-射线造影剂的水介质中形成的，但用于注射时，脂质体要先离心分离并重悬于缓冲液中。由于通过在无菌条件下由各种组分来制备脂质体组合物中既不可靠又成本高昂，所以如果在脂质体制备后能够高压灭菌以提供注射所需的无菌组合物，这将有事半功倍的好处；从理论上说，脂质体悬液可用过滤除菌，但实际上，只有当脂质体所有颗粒的直径均小于0.22μm时，过滤除菌才是可行的。由于存在一远远低于高压时温度(大约121℃)的相转变温度(Tc)，所以以前脂质体悬液的高压几乎无一例外地不成功；然而kikuchi等在Chem.Pharm.Bull.39(4)1018-1022页，1991的报告中提出，当被包被的溶质和类脂双分子层带有相反电荷时，则会产生例外。我们发现若对WO 88/09165中提及的那种只在其内部含有X-射线造影剂的脂质体进行高压，则造影剂会从脂质体内逸出，进而，我们又发现这一问题可按下述方法解决：即在一连续相中高压脂质体，该连续相中造影剂浓度同脂质体内部液相中造影剂浓度基本相等。这样的高压灭菌一般在一密封容器中进行，该容器在冷却及存储中均保持密封，直至注射前即开即用。

本发明还基于这样一个发现：即通过用中性的类脂和带电荷类脂来构成脂质体的膜，并使脂质体颗粒的平均直径相对较小，比如在50-3000nm之间，由此可以使用于成像的脂质体造影剂在以下各方面均有改良：包装效率，毒性，生产流程和/或存贮期。脂质体所带的负电荷所产生的膜间静电排斥力可使之有高的包装能力，例如，至少达到5ml/g。

根据本发明的一个特性，我们提供一种可用于人或动物的诊断用组合物，该组合物含有多层脂质体，一般可含有也可不含有单层脂质体，脂质体中包被至少一种显影剂并且脂质体被悬浮于含有该种显影剂的水介质中，其中，脂质体包括中性的磷脂和带电荷磷脂，脂质体的平均颗粒直径为50至3000nm并且脂质体内部水相中显影剂的浓度基本同悬浮脂质体的水介质中显影剂的浓度相同。

本发明的组合物中填充在脂质体中的液体也包括与含造影剂的脂质体在一起的外部的由一般造影剂所构成的连续相(这些造影剂可满足血液等形成影像的要求)，这些包含在脂质体内部的造影剂将定位到肝和脾中，以增强这些器官的成像。

本发明的脂质体悬液在其内部的水相中有高的包被容量(例如：至少5ml/g类脂，更有可能是至少6ml/g)，因此，能够容纳大量的水溶性药物，并且该悬液不但能耐受高压灭菌而且在血液中或在贮藏中均是稳定的。

本发明的组合物用于X-射线成像时，比如：可将本发明组合物按上文所述方法与现有技术中已知的任何碘化X-射线造影剂或重金属簇形化合物/螯合物X-射线造影剂相混合。

本发明组合物中的碘化X-射线造影剂每分子最好包含有3个或更多的碘原子并且通常包含一个或多个碘化苯基基团。非离子型的显影剂更佳，特别是那些被称作非离子二聚体，例如碘克沙醇(iodixanol)和碘曲仑(iotrolan)，这些非离子二聚体显影剂有很高的亲水性并且即使在高浓度，也仅产生较低的渗透压。该组合物中造影剂的浓度可有很大的不同且造影剂浓度将受到以下因素的影响：例如造影剂的性质，该组合物用何种途径使用以及临床指征等等。

例如，典型的浓度范围将是每毫升组合物包被有10-300mg(优选是60-300mg，更优选是70-110mg)的碘。而每毫升组合物中的总的碘量优选是40-450mg，更优选是160-320mg。本发明组合物的给药途径通常为静脉注射且注射剂量同样变化较大，比如用量常常取定于临床指征；通常，用于血管或肝成像的典型剂量是每千克体重用5-300mg的碘。

本发明脂质体制剂中重金属簇形化合物/螯合物优选含有至少二个金属原子，其元素序数应均高于碘；这类有代表性的造影剂有：钨簇形化合物/螯合物，详述见WO-A-9114460和WO-A-9217215。簇形化合物/螯合物可以是优选的。

用于磁共振成像的本发明组合物，比如可按上文所述方法与现有技术中已知的任何顺磁性物质相混合。这些顺磁性造影剂可以是包被在颗粒中，也可以是共价地同多空腔的颗粒结合，也可以是非共价地嵌合在脂质体的膜中。

顺磁性造影剂可以是生理上可接受的顺磁性金属盐或金属螯合物，也可以包括自由基，优先考虑的是一氧化氮型自由基。一旦顺磁性物质是自由金属离子，则锰盐(2+)应优先考虑。螯合物造影剂最有可能是锰离子(2+)，钆离子(3+)，镝离子(3+)或铁离子(3+)的螯合物并且可含有在一些文章中所描述的螯合剂(比如，可参看WO-A-9110645)，其中有NTA，EDTA，HEDTA，DTPA，DTPA-BMA，BOPTA，TTHA，NOTA，DOTA，DO3A，HP-DO3A，EOB-DTPA，TETA，HAM，DPDP，卟啉及其衍生物。

这些顺磁物质在本组合物中的浓度如可以是1mM-0.5M。本磁共振诊断用造影剂一般是静脉给药，肝磁共振成像的典型用量是每千克体重用0.02mmol的包被着的金属螯合物。同样，浓度和剂量均受下列因素影响：如顺磁性物质的性质，给药的途径及临床的指征。

用于磁共振成像的脂质体的造影剂的制剂是如通过包被来与超顺磁物质或铁磁性物质(比如现有技术中已知)。这类物质中优先选择的包括磁铁矿，γ-Fe₂O₃，混合铁氧体及其它有磁性的铁化合物，包括有机铁磁性化合物。被脂质体包被的物质可以是无衣壳的，也可以是有衣壳的，比如，用一些可以稳定磁性的材料，如葡聚糖，脂肪酸或其它生物可容许的化合物包被；该物质作肠胃外使用时，则其衣壳也应是可被生物降解的。这种造影剂一般以水悬浮的颗粒状态存在，其颗粒的直径在4nm到1μm，优选4-40nm。

这类诊断剂的浓度如可是0.01mM-0.1M。剂量将受造影剂性质的影响，也会受到其生物分布及临床指征的影响；在静脉注射时用于血管成像(包括灌注)或用于肝成像的典型的剂量是每千克体重用0.1-100μmol的包被的铁元素。

在超声成像及其它所有的超声技术中(包括多谱勒技术)，均可使用脂质体组合物。该组合物中优选包含下列脂质体：包被有生理可接受气体的脂质体或包被有该种气体前体的脂质体或是含有能同脂质体共价结合的气体的脂质体。

任何可被生物相容的气体一般均可用于本发明的组合物中，比如空气，氮气，氧气，氢气，一氧化氮，二氧化碳，更好的是一些水溶性气体，比如氦气，氩气，六氟化硫，可选择性氟化的低分子量的烃诸如甲烷，乙烯，四氟化碳或C₂-7全氟化烷如全氯化丙烷，全氟化丁烷，全氟化戊烷，也可以是以上气体的混合物。本文所使用的“气体”包括在37℃正常体温下处于气态的任意物质，因此，包括一些低沸点液体，比如乙醚或一些全氟化烷。

气体前体包括，丙二酸氨；碳酸盐及碳酸氢盐类如碳酸锂，碳酸氢锂，碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸氨，碳酸钙和碳酸氢镁；另有生理可接受的重氮基化合物；含有诸如-CO.O.CR¹R².O.CO.OR³等基团的碳酸酯；β-酮酸等。

这些气体前体可能通过各种反应方式产生含气体的脂质体。比如，由于体内到处是酸性pH条件，故碳酸盐或碳酸氢盐在给药后将立即在体内产生二氧化碳；重氮化合物则有可能被诸如紫外光等照射从而产生氮气；碳酸酯则是与体内非特异性的酯酶相互作用而降解产生二氧化碳；β-酮酸将通过自发的脱羧产气。

本发明的超声用组合物如可以是肠道使用，也可非肠道使用，尽管在特定的场合下，直接给药于体腔比如输卵管可能会更好。然而，一般情况下，常见的是血管内给药-最普遍的是通过静脉注射，这样可增强包括心脏和心外灌注研究中血管影像的效果。静脉注射后，由于该组合物的稳定性高，因而网状内皮系统将摄取许多该组合物，这一过程主要发生在肝中，所以可以使肝的超声反差增强。

低密度超声造影剂的一个理想特征就是它的易压缩性。由于本发明的组合物中的脂质体基本上包含非固体的基质，所以此组合物有着很大的延展性。这将增强该组合物的可压缩性并且因此增强了本发明的这种含气超声组合物的反射波信号的能力。

组成脂质体膜的基本成分之一是中性磷脂，该磷脂包含至少一个基本饱和脂肪酸残基。脂肪酸残基中的碳原子数优选至少是15个或更多，更优选的是至少有16个碳原子的脂肪酸残基。一旦脂肪酸残基中碳原子数少于14，则脂质体保持其内部水相的能力是低的而且用药后脂质体在血液中的稳定性也是差的。另一方面一旦脂肪酸残基中碳原子数是28个或更多，脂质体的生物相容性将降低，并且在生产脂质体时需非常高的温度。

形成本脂质体膜的另一基本组分是带电磷脂，带电磷脂至少含有一基本饱和脂肪酸残基。该残基中碳原子数通常至少为14，优选至少有15个碳原子，更优选至少有16个碳原子。一旦脂肪酸残基中的碳原子数少于14，同样，脂质体无论是保持其内部水相的能力还是在血液中的稳定性均要降低。另一方面，若脂肪酸残基中碳原子数是28或更多，则脂质体的生物相容性就会降低而且在生产脂质体时将需要非常高的温度。

上文中的“基本饱和”是指中性磷脂或带电磷脂的脂肪酸残基是完全饱和的(就是说不含碳碳双键)，也可以指二者的不饱和度是极低的，比如碘值不超过20，更好的是碘值不超过10。一旦不饱和度过高，脂质体将易被氧化且难于加热灭菌。

在本发明中有用的中性磷脂包括：中性甘油磷脂，比如部分或完全还原型的天然产生的(如由大豆或蛋黄来源的)或合成的磷脂酰胆碱，特别是半合成或合成的二软脂酰磷脂酰胆碱(DPPC)或二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。

在本发明中有用的带电磷脂包括：带正电或带负电的甘油磷脂。带负电的磷脂包括：磷脂酰丝氨酸，比如部分或完全还原型的天然产生的(如大豆或蛋黄来源的)或半合成的磷脂酰丝氨酸，特别是半合成或合成的二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)或二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)；磷脂酰甘油，比如部分或完全还原型的天然产生的(如由大豆或蛋黄衍生的)或半合成的磷脂酰甘油，特别是半合成或合成的二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)或二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)；磷脂酰肌醇，比如部分或完全还原型的天然产生的(如由大豆或蛋黄衍生的)或半合成的磷脂酰肌醇，特别是半合成或合成的二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)或是二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)；磷脂酸，比如部分或完全氢化的天然产生的(如由大豆和蛋黄来源的)或半合成的磷脂酸，特别是半合成或合成的二棕榈酰磷脂酸(DPPA)或是二硬脂酰磷脂酸(OSPA)。一般只用一种上述的带电磷脂，但也有可能用一种以上的带电磷脂。当用不只一种带电磷脂时，优选所用的二种带电磷脂带同种电荷，即全带正电或全带负电，这样可以防止凝集。

带正电荷的脂包括：磷脂酸同氨基醇形成的酯，比如二棕榈酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸同羟基乙二胺形成的酯。

依据本发明，中性磷脂和带电磷脂的重量比一般是200∶1到3∶1，优选是60∶1到4∶1，更优选40∶1到5∶1，比如大约是10∶1。

本脂质体除了含有上述提及的二种基本成分外，还可能含有各种可有可无的组分。比如，作为抗氧化剂，可加入维生素E(α-生育酚)和/或维生素E乙酸酯，加入量一般是脂类总量的0.01-2molar％，优选总量的0.1-1molar％。

为了增加脂质体中造影剂的包裹量，对于含上述磷脂的脂质体的诊断组合物来说，组合物中脂类总量的浓度一般是20mg/ml到100mg/ml，优选是40mg/ml到90mg/ml，更优选50mg/ml到80mg/ml。

造影剂优选被包被在脂质体中，脂质体是由适当的介质所溶或悬浮而形成等渗溶液或悬液形式(同体内的生理渗透压相比)，以便在用药后脂质体能稳定地维持于体内。水，缓冲液诸如Tris-HCl缓冲液，磷酸缓冲液，柠檬酸缓冲液等可用作溶解或悬浮脂质体的介质。

在室温下，较佳的pH范围是6.5-8.5，优选的pH范围是6.8-7.8。一旦造影剂是非离子型的X-射线造影剂(该造影剂含有多个羟基)比如碘海醇(iohexol)、碘克沙醇(iodixanol)或者碘帕醇(iopamidol)时，那么正如美国专利4278654中所述，温度-pH值负相关的缓冲液更合适一些。胺缓冲液有此特性，特别是TRIS。这类缓冲液在高压灭菌的温度下pH值较低，这样可增加X-射线造影剂在高压灭菌时的稳定性，当降回到室温时，这类缓冲液的pH值又返回到生理更易接受的pH值。Tris缓冲液还可大大延长造影剂的存贮期。

为了获得等渗溶液或悬浮液，造影剂以产生等渗溶液的浓度溶解或悬浮于介质中。当由于造影剂本身溶解性差等原因，等渗溶液不能由造影剂单独形成时，则要在介质中加入一些无毒的可溶物，以便形成等渗溶液，这些物质可以是氯化钠等盐类，也可以是诸如mantitol，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇等的糖类。

正如前文所述，本发明组合物的优点之一就是可以耐受高压灭菌。本组合物还有高的包被能力且其包被率相对于其脂组分来说也是高的。

另外，本发明诊断用组合物有良好的成像特性和副作用低的优点，这将在下文述及。

本发明中的脂质体可以用制造多层脂质体的传统工艺制造。这些工艺包括：Bangham法(分子诊断学杂志，13.238-252，1965)，多价醇法(日本实审专利公开(KoKoKu)4-36734)，脂溶液法(日本实审专利公开(KoKoKu)4-36735)以及机械化学法(日本实审专利公开(KoKoKu)No.4-28412)。

一般来说，多层脂质体可以按如下方法制备：将前文提及的磷脂溶于一种挥发性的有机溶剂中，比如氯仿，甲醇，二氯甲烷，乙醇等，或是溶于有机溶剂和水的混合溶剂中，然后除去溶剂，再将所得到的剩余物同一含有造影剂的水相相混合，振摇或搅拌这一混合物即可。

在上文所述的除去溶剂这一步中，Bangham法用的是蒸发的方法，但也可用喷雾干燥法或冷冻干燥法。

在前文所述的脂质体制备过程中，所使用的相对于脂的溶剂量不太重要，任何能够使类脂溶解的溶剂用量均可接受。从脂和溶剂的混合物中去除溶剂这一步可按传统方法进行，比如可以是减压蒸发，如果必要，蒸发可在惰性气体存在下进行。实际上，上文所提到的挥发性有机溶剂可以用来配制包含10份该有机溶剂和高达1份水的混合溶剂。

若用冷冻干燥来去除溶剂，则选择这样一种溶剂：在减压条件下，约0.005-0.1Torr以及低于其凝固点的温度下(一般为-30℃到-50℃)，该溶剂可被去除。若用喷雾干燥法去除溶剂，所需条件是：气压一般控制在1.0kg/cm²，空气流速为0.35cm²/分钟，进气温度调至高于所用溶剂的沸点。比如，溶剂是氯仿，进气温度调至60℃到90℃，喷雾干燥可按一般流程进行。

将这样得到的脂残余物，在温度同所用脂的相转变温度(Tc)相同或高于相转变温度下，与含有造影剂的水溶液相混合，然后，在等于或高于Tc温度下，剧烈地振摇或轻轻地搅拌该混合物，就可得到悬浮于含造影剂的水相中的所需脂质体。在含造影剂的水溶液中的电解质离子浓度应该尽量低，以免对脂质体包裹效率等产生不好影响；一般说来，除造影剂外，正离子和负离子的总浓度应不超过40mM，更好的是不要超过20mM。

尽管脂质体颗粒大小可用平均颗粒大小来表示，然而在确定包裹能力方面，用重量平均颗粒大小更优。

本发明脂质体的平均颗粒大小一般为50nm到3,000nm，优选150nm到1000nm，更优选是200nm到500nm。为了得到上述大小的脂质体颗粒，将含有大颗粒的脂质体经一次或多次过滤，过滤方法为顶出法(见生物化学与生物物理学报Vol，557，p9(1979))，滤膜孔径预定(比如约1微米)。

本发明中的脂质体至少有一部分是有多层膜的。一般说来，当按上述工艺制成的脂质体刚刚形成时，其为多层膜，但正如上文所述的过滤法，当脂质体悬液一次或多次通过滤膜时，比如通过孔径为1微米的滤膜时，有些脂质体外膜将被剥下，从而使滤后脂质体成为含多层膜和含单层膜的脂质体混合物，通常含多层膜的脂质体所占重量百分比不少于30％，更可能是不少于40％。就脂质体稳定性来说，含多层膜的脂质体有其优势，但混合物中单层膜脂质体的百分比较大也是可以的，特别是因为这样可以有比多层膜脂质体更高的包裹力。

这样制得的脂质体悬浮于水介质中(外液)，并可用来做诊断组合物。在脂质体形成时，未被包入其中的含造影剂的溶液就作为外液。或者，外液也可用其它液体代替，但外液中的显影剂浓度应同内液中的相同。在任何情况下，外液(分散介质)应同脂质体内部水相中等渗的。这样制备得到的脂质体悬液中电解质离子浓度应尽可能低；一般来说，除造影剂外，正负离子总浓度应该不超过40mM，最好是不超过20mM，这样是为了增加脂质体在加热灭菌和长期存贮时的稳定性。

如上所述，本发明脂质体包被水相的能力一般是至少5ml/g脂，优选至少6ml/g脂。

当用本发明的方法来包被碘化X-射线造影剂时，在最初水溶液中造影剂的浓度应该高，这样可使产物有较高的碘/脂比，从而可以减少成本及潜在的毒性。然而，根据本发明，较优选的碘/脂重量比范围应在1.3-1.45间。这要低于一些现有技术中的比值：在WO 88/09165中，给出的下限是1.5。

本发明中最优选的X-射线造影剂组合物含有作为中性磷脂的氢化磷脂酰胆碱和作为带电磷脂的氢化磷脂酰丝氨酸，优选的比例为10∶1。这种组合物可以有大于7ml/g的包裹能力。用于该组合物的最好的X-射线造影剂是碘克沙醇(iodixanol)。脂质体内和脂质体外的水介质优选每毫升含有400mg碘克沙醇(iodixanol)，而且还含有调节等渗的物质比如山梨醇，稳定剂比如EDTA Na₂Ca和Tris缓冲液(pH值约为7.4)。

可通过本发明的方法来制备供磁共振成像用的脂质体组合物，比如用脂质体包被诸如GdHPDO3A之类的顺磁性磁共振造影剂的水溶液或包被诸如四氧化三铁之类超顺磁性磁共振造影剂的悬浮液，其颗粒大小约为10nm；这种悬液可以通过控制四氧化三铁的沉降使之同亚铁(2+)盐和铁盐(3+)分开而制得。

制备含有造影剂同脂质体膜共价相联的脂质体，可以用类似于US-A-5135737中所描述的方法进行制备。

用于超声成像的含气体组合物可以用各种方法制备，比如用以前所描述的制备含气体的单层和多层颗粒的方法制备。这些技术在诸如US-A-4544545，US-A-4900540，WO-A-9109629和WO-A-9115244中有所阐述。比如说用这些方法，脂质体可将一种对pH值敏感的气体前体溶液包被，此后使系统的pH值变化，使得该前体在脂质体中产生气体。

在上述情况下，将一种或多种的离子载体嵌合于脂质体膜上是有益的，因其可以帮助转运氢离子或氢氧离子跨膜，从而可促进系统pH值的变化-有关这样的例子，可参见前文提到的WO-A-9109629。

另一种方法是将一种非特异性的人的酯酶同碳酸酯溶液一起包被于脂质体中，然后将所得脂质体保温(比如：37℃)5天，。此后，分离并制备那些漂浮的，含二氧化碳气体的脂质体，这些脂质体可认为是所需要的。

另一种制备含气体脂质体的方法是对已包装了水介质的脂质体悬液施以气体外压。一般来说，气体应以极高的压力施用，比如至少应有5个大气压左右的压力。

另一种制备含气脂质体的方法如下：先将选定的磷脂分散于水介质或水和有机溶剂组成的混合溶剂中，该有机溶剂应是水溶性，能为生物体所接受，并且知道能稳定磷脂溶液，比如甘油或丙二醇(Propylenglycol)，然后在所选气体或气体混合物存在的情况下，剧烈搅动该溶液。另外，可以在所选气体及气体混合物存在的情况下，对所述磷脂溶液进行超声处理，这样可形成所需的脂质体。

任何前文所提及的生物体相容气体均可用于制备本发明的超声造影剂。

通常，用于各类成像的本发明的组合物，如果需要，均可用其它物质修饰，比如用聚乙二醇修饰来增加脂质体在血液循环中的半衰期。这在应用时，包括用于心血管成像中，是一个突出的优点。

以下例举非限定性的实施例来说明本发明。测试技术：

(1)测定颗粒大小

脂质体的重力平均颗粒大小用准弹性光散射的方法进行测定，该方法使用的仪器是动态光散射仪(DLS)(Otsuka Electronics Co.，Ltd生产)

(2)包被能力的测定

脂质体内部水相体积是通过计算包含于脂质体内部的碘克沙醇的比例得到的；也就是说若碘克沙醇的包被率是40％，则1ml的脂质体制剂中，有0.4ml是其内部的水相。

包裹能力被定义为每克脂中内部水相的体积。比如，脂质体制剂中脂浓度是0.056g/ml，并且在脂质体中的碘克沙醇的百分率是40％，因此在1ml脂质体中，0.056g的脂中有0.4ml的内部水相，因此，包裹力就是7.1ml/g脂。

脂质体制剂中蔗糖的包裹率是用凝胶过滤法测得的。此方法中，脂质体制剂通过一凝胶过滤柱(载体Sephadgx G 50，pharmacia；柱直径为16mm；柱高为30mm)，用生理盐水作为流动相，将洗脱出的液体分部收集(2.5ml/部分)。每部分中取出0.8ml，再加入2ml甲醇和1ml氯仿到这0.8ml中，振荡使整个液体清澈。再加入1ml氯仿，振荡后，加入1.2ml蒸馏水，再次振荡后，将之放入一冷冻离心机(Kuboka ShojiK.K.，KR-702型)中离心(3500转/分，10分钟，室温下)，分相后，上层相(水-甲醇相)中回收的碘克沙醇的浓度通过测其在246nm下的光吸收值测出。若碘克沙醇在萃取物中的浓度过高，可用蒸馏水适度稀释洗脱液，再取0.8ml出来，用甲醇，氯仿及蒸馏水萃取。

包裹率可按下法求得：用空体积洗脱液中碘克沙醇的量去除以收集的所有洗脱液中碘克沙醇的量(25个洗脱组分中碘克沙醇的总量)，其值即为包裹率。注意：终点处洗脱液中碘克沙醇的含量是最低的。实施例1包被X-射线造影剂，碘克沙醇：

将下列物质在烧瓶中混合：0.64g蛋黄衍生的氢化的磷脂酰肌醇(HEPC)，0.064g由HEPC合成的磷脂酰丝氨酸(HEPS)，60ml的氯仿，甲醇和水的混合物(体积比为100∶20∶0.1)。在65℃的水浴上加热并使磷脂溶解，所得的溶液用旋转蒸发仪在60℃下蒸去溶剂。

所得剩余物再经真空干燥2小时形成脂膜。将含有碘克沙醇(1，3-二(乙酰氨基)-N，N’-二〔3，5-二(2，3-二羟基丙胺羰基)-2，4，6-三碘苯基〕-2-羟丙烷)(0.4g/ml)和蔗糖(0.05g/ml)的水溶液加热到65℃，将10ml热溶液同所得脂膜混合，用搅拌器搅拌10分钟，同时在65℃下加热。该混合物加压过滤一次，滤膜为孔径是1.0μm的聚碳酸酯滤膜，所得到的就是大小合适的多层膜脂质体颗粒(MLV)。

将得到的MLV放在玻璃器皿中，在121℃下，高压灭菌20min，结果如表1所示。

包裹能力按照上文(2)中给出的方法测得。重力平均颗粒大小按(1)中所述的方法测得。

表1

高压灭菌前高压灭菌后颗粒大小(nm) 260±116 251±120(平均值±标准差)包裹能力 6.4 6.5(ml/g脂)碘/脂重量比 1.3 1.3包裹率(％) 45.1 45.8实施例2碘克沙醇的包裹

根据实施例1中所述的方法制备含有碘克沙醇的脂质体剂型。

结果见表2。

表2

制剂中

各物质浓度颗粒大小(nm) 包裹能力碘/ 脂重量比

(mg/ml) (平均值±标准差) (mg/g脂)HEPC HEPS Iodixanol 高压灭菌前高压灭菌后高压灭菌前高压灭菌后高压灭菌前高压灭菌后64.0 6.4 400 260＋11 251＋120 6.4 6.4 1.3 1.3

664.0 6.4 200 273±125 275+118 7.8 8.0 0.8 0.8实施例3

实施例1中得到的脂质体悬液，用等渗的葡萄糖稀释至浓度为50mg包被碘/ml。稀释中，悬液将变成乳白色。乳浊液经显微镜镜检，末发现有脂质体凝集成团。将此液体存贮一年后观察，也未发现包被的碘克沙醇的量及颗粒的大小分布受到影响。实施例4

实施例3中得到的组合物被静脉注射入大鼠体内。注射后，证实大部分的包被的碘克沙醇分布于肝中，但在脾中也发现了高浓度的碘克沙醇。随着注射后时间的推移，组织中的碘克沙醇含量不断减少直至在肝和脾中不能检测出碘克沙醇的存在。其他器官中碘克沙醇的水平也不断减少，并且同血液中碘克沙醇的减少相平行。大部分的注射进去的碘克沙醇可在尿中回收。实施例5

从实施例3中制得的组合物被静脉注射到患有肝癌的大鼠中，大鼠已带有多个肝癌的转移肿瘤。分别以50mg和100mg包被碘/kg体重用药，在肝的正常区域分别观察到42个和62个汉普森氏单位(HU)的X-射线衰减，但在转移肿瘤中却很少有衰减。显微镜镜检表明所探测到的肿瘤直径小于5mm。实施例6

将从实施例3中制得的组合物，以200-7500mg包被碘/kg体重的剂量，静脉注射入多组小鼠中。在其后14天中，观察体重变化及是否死亡。

分析结果表明，所有小鼠均可承受剂量高达3g包被碘克沙醇/千克体重的脂质体的注射。同未注射小鼠相比，这些小鼠在观察期中体重无变化。当注射剂量增至4g和5g包被碘克沙醇/千克体重时，可观察到轻微的，剂量依赖性的降低，并且出现死亡。所以估计半致死量为5g脂质体包被碘克沙醇/千克体重。实施例7

从实施例1中制得的组合物，以剂量100-1000mg包被碘/千克体重对大鼠进行单次和重复静脉注射(注射3次/周，3周)，然后对各种与组织固着的酶在血液中的水平进行测定，同时在不同的时间点对所有重要器官进行组织学分析。结果发现：同只注射盐水的对照鼠相比，试验鼠血清中各酶只受到很小的影响。在试验鼠的肝和脾中观察到由吞噬细胞产生的吞噬空泡的增多，且该种增多是剂量依赖性的，除此之外，末检测到任何由脂质体诱导引起的组织学变化。随着时间的延长，由吞噬细胞引起的空泡化程度也减弱，这一结果与肝和脾中碘克沙醇的量随时间延长而降低相平行。实施例8包含有碘克沙醇的脂质体一种诊断用组合物包括：

碘克沙醇(总量) 400mg/ml

(包被碘) 80mg/ml

山梨醇 20mg/ml

氨丁三醇(TRIS) 0.097mg/ml

EDTANa₂Ca 0.1mg/ml

氢化磷脂酰胆碱 51.2mg/ml

氢化磷脂酰丝氯酸 5.1mg/ml

注射用水加至 1ml(约0.9ml)该组合物经溶解磷脂于氯仿/甲醇/水(体积比为4∶1∶0.025)中，再蒸干溶剂(旋转蒸干)而制成。制备含有碘克沙醇和山梨醇的等渗液并加热至60-70℃，以后各步中也要维持这一温度。搅拌下加入磷脂混合物，这样就制成了脂质体。为了控制脂质体颗粒的大小，将制成的脂质体匀浆(用转子/定子匀浆器)。然后，脂质体被挤压通过孔径为1μm的7层一叠的聚碳酸酯滤膜。

用含有碘克沙醇和山梨醇的等渗溶液稀释产物，再加入氨丁三醇和EDTA。将产物灌入玻璃瓶中并高压灭菌(121℃，15分钟)。实施例9含有碘曲仑的脂质体

按实施例8所述方法制备该脂质体，但用碘曲仑代替碘克沙醇。实施例10含氢化磷脂酰甘油的包含有碘曲仑的脂质体

脂质体的制作过程与实施例8中所述方法相同，但用氢化磷脂酰甘油代替氢化磷脂酰丝氨酸。实施例11磁共振造影剂(钆元素)

含氢化磷脂酰胆碱和氢化磷脂酰丝氨酸的脂质膜按照例1中所示方法制作。

10ml 0.5M的Gd HPDO3A溶液加热至65℃。在该温度下，用搅拌器搅动该混合物15分钟。将该混合物加压滤过一层孔径是1.0μm的聚碳酸酯滤膜，就可制得多层膜脂质体颗粒(MLV)。

将MLV装入一玻璃瓶中，并在121℃下高压20分钟以灭菌。

这种MLV包含有GdHPDO3A。实施例12磁共振造影剂(锰元素)

按照实施例11中所述方法制备脂质体，但用一种锰的螯合物溶液(0.07M)代替GdHPDO3A，该螯合物溶液是按照WO 93/21960(Nycomed Imaging AS)中所述方法制备的，该螯合物学名为3，6-二〔N-(2，3-二羟丙基)-N-甲基氨甲酰甲基〕-3，6-重氮基辛二酸。

此MLV中含有锰的螯合物。实施例13磁共振造影剂(镝元素)

按实施例11中所述方法制备脂质体，但用0.5M的DyDTPA-BMA(0.5M)溶液代替GdHPDO3A。

此MLV中包含有Dy DTPA-BMA实施例14磁共振造影剂(氧化铁)

按实施例11中所述方法制备脂质体，但用10mM磁性氧化铁悬液(10mM，粒子大小为10-30nm)代替GdHPDO3A。

此MLV中含有磁性氧化铁。实施例15脂质体GDHPD03A(HEPC-HEPS)

将含有640mg由卵黄来源的氢化磷脂酰胆碱和64mg由HEPC合成的氢化磷脂酰丝氨酸有混合物(按照实施例1中所述的方法制得的)加到装有10ml含有250mM GdHPD03A(加多利道(gadoteridol))的5％葡萄糖溶液(等渗溶液)小瓶中。在65℃下将混合物搅拌30分钟然后将该混合物再在65℃放置1小时。所得脂质体溶液经过5次的冻-融循环处理后再在65℃下加压过滤5次，滤膜是2张叠在一起的孔径为400nm的多聚碳酸酯滤膜，最终获得的产物就是脂质体GDHPD03A。实施例16脂质体GdHPD03A(DPPC/DPPG)

按照实施例1中提供的方法，制备含有640mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和64mg二软脂酰磷脂酰甘油(DPPG)的类脂混合物，将之加入到装有10ml含250mM GdHPD03A的5％葡萄糖溶液(等渗溶液)的小瓶中。在50℃下搅拌30分钟后，，再将此混合物置于该温度1小时。所得脂质体溶液经过5次冻-融循环处理后再在50℃下加压过滤5次，滤膜是2张叠在一起的孔径为400nm的聚碳酸酯滤膜。实施例17脂质体GdDTPA-BMA

制备此物质的方法除了用含250mM GdDTPA-BMA(加多半特(gadodiamide))的水溶液代替GdHPD03A外，其余均与实施例15中的方法相同。实施例18脂质体DyTTHA

制备该物质的步骤与实施例15中所述方法相同，但以含250mMDyTTHA的水溶液代替GdHPD03A(DyTTHA就是三乙烯四胺六醋酸同镝形成的络合物)。实施例19超声造影剂

脂质体的制备按实施例11所示方法进行，其中以盐水代替GdHPP03A。以氮气对此混合物加压(70psi)一小时。除去多余的氮气，然后将所得的脂质体混合物过滤，滤膜为孔径为1.0μm的一层多聚碳酸酯滤膜。

得到的MLV中含有氮气。实施例20

将实施例8中制得的组合物静脉注射给大鼠。在剂量为75mg和100mg包被碘/千克体重时，可观察到鼠肝中X-射线衰减分别为47个和70个汉普森氏单位(HU)。实施例21

将从实施例8中得到的组合物静脉注射给大鼠。发现半致死量大约是2000mg包被碘/千克体重。

Claims

1.可用于人体或动物体的诊断用组合物，该组合物含有多层脂质体，也可含有或不含有单层脂质体，所述脂质体中含有至少一种显影剂且脂质体被悬浮在含有同种显影剂的水介质中，其中，脂质体包括中性磷脂及带电磷脂，其平均颗粒直径为50到3000nm并且充满脂质体内部水相中的显影剂的浓度基本上与悬浮脂质体的水介质中的显影剂浓度相同。

2.根据权利要求1的诊断用组合物，其中悬浮脂质体的水介质是等渗的。

3.权利要求1或2的诊断用组合物，其中中性磷脂和/或带电磷脂包含至少一种基本饱和的含至少14个碳原子的脂肪酸残基。

4.上述任一权利要求的诊断用组合物，其中中性磷脂和/或带电磷脂包含至少一种基本饱和的含最高达28个碳原子的脂肪酸残基。

5.上述任一权利要求的诊断用组合物，其中中性磷脂是磷脂酰胆碱。

6.上述任一权利要求的诊断用组合物，其中带电磷脂是磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸或是磷脂酸与氨基醇形成的酯。

7.权利要求5或6的诊断用组合物，其中磷脂酰基团是合成的或半合成的二棕榈酰磷脂酰基团或是二硬脂酰磷脂酰基团。

8.上述任一权利要求的诊断用组合物，其中脂质体颗粒的平均大小是150nm到1000nm。

9.上述任一项权利要求的诊断用组合物，其中脂质体的包裹能力至少是5ml/g。

10.权利要求9的诊断用组合物，其中脂质体的包裹能力至少是6ml/g。

11.上述任一权利要求的诊断用组合物，其中中性磷脂与带电磷脂的重量比是60∶1到4∶1。

12.上述任一权利要求的诊断用组合物，其中类脂的总浓度是20mg/ml到100mg/ml。

13.权利要求12的诊断用组合物，其中脂的总浓度是50mg/ml到80mg/ml。

14.上述任一权利要求的诊断用组合物，其中显影剂是X-射线、磁共振成像或者超声波造影剂。

15.权利要求14的诊断用组合物，其中X-射线造影剂含有一个或多个碘苯基基团或重金属簇形化合物或重金属螯合物。

16.权利要求15的诊断用组合物，其中造影剂是碘克沙醇。

17.权利要求14的诊断用组合物，其中显影剂是一种磁共振成像造影剂。

18.权利要求17的诊断用组合物，其中磁共振成像造影剂中含有锰。

19.权利要求17的诊断用组合物，其中磁共振成像造影剂是钆的螯合物。

20.权利要求17的诊断用组合物，其中磁共振成像的造影剂是共价联接于脂质体膜上的。

21.一种包括含有超声波造影剂的脂质体的诊断用组合物，且其中脂的总浓度至少是20mg/ml。

22.权利要求1或21的诊断用组合物，其中超声波造影剂在体温下是气体。

23.权利要求22的诊断用组合物，其中超声波造影剂是液体、固体或半固体化合物，这些化合物在体内可形成气体。

24.一种生产诊断用组合物的方法，其特征在于将中性磷脂和带电磷脂溶于溶剂中，再除去溶剂得到剩余物，将该剩余物同含有显影剂的水溶液混合，由此形成包裹有显影剂的脂质体。

25.权利要求24的制备脂质体的方法，其中脂质体形成后，可通过加压使之通过滤膜来减小脂质体的大小。

26.权利要求1的诊断用组合物在体内诊断中的应用。

27.对权利要求1到23的任一项的诊断用组合物高压灭菌以产生一种无菌的诊断用组合物。