CN101203249A - 多（肽）作为螯合剂：制造方法和用途 - Google Patents

多（肽）作为螯合剂：制造方法和用途 Download PDF

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Abstract

公开了新的用于成像的组合物，其包括(a)，包括用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽和(b)螯合在两个连续氨基酸的至少一个上的价金属离子。还公开了使用这些新组合物的成像方法，例如对个体中肿瘤的成像方法。还公开了合成成像试剂和用于制备成像试剂的试剂盒的方法。测定候选物质作为成像试剂的有效性的方法，该方法包括将候选物质与包含用于非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽缀合或螯合。

Description

多（肽）作为螯合剂：制造方法和用途
发明背景
本申请涉及于2005年4月1日提交的美国临时专利申请，60/667,815，其整体在这里作为参考引入。
技术领域
本发明主要涉及成像、放疗、标记、化疗，以及化学合成领域。此外，本发明涉及以下物质的组合物：(a)包含用来非共价结合价金属离子(valent metal ion)的两个或更多连续氨基酸的多肽和(b)非共价连接到两个连续氨基酸的至少一个上的一个或多个价金属离子。第二部分，例如成像部分、治疗部分或组织靶向部分，可以与该多肽键合。其它实施方案包括包含以下的组合物：(a)多肽，在其序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列，以及(b)一个或多个非共价连接到多肽的价金属离子。还公开了使用上述成像试剂的成像方法、合成上述成像试剂的方法、用于制备这些成像试剂的试剂盒，以及测定候选物质作为成像试剂的有效性的方法，该方法包括缀合或螯合候选物质到包含用来结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽。还公开了使用上述组合物治疗个体的过增生性疾病的方法。
背景技术
生物医学成像包括不同的模式，其被医师及研究者广泛应用以辅助个体疾病的诊断以及获得对机体的正常结构及功能的进一步认知。可作为例子的成像模式包括PET、SPECT、γ射线摄影成像、CT、MRI、超声法以及光学成像。
多数情况下，在个体的特殊部位进行最佳成像需要给个体服用特殊试剂。已证明无机金属如锝(99mTc)、铁、钆、铼、锰、钴、铟、铂、铜、镓或铑是许多成像试剂的有价值成分。
用无机金属标记分子可以通过将金属螯合至特殊化合物的氧、硫以及氮的组合上而实现。为此目的，已使用螯合剂如硫磺胶体、二乙烯三胺五醋酸(DTPA，O4)、乙二胺四乙酸(EDTA，O4)和DOTA(N4)。然而，通过这种方式螯合的无机金属对于成像的实用性有限，因为它们从机体很快地清除。
近年来，一些氨基酸已用γ射线发射放射性核素(I-123、I-131)或正电子发射放射性核素(C-11、N-13、F-18)(Laverman等，2002；Vaalburg等，1992)标记。尽管已表明可将一些氨基酸用于测量蛋白合成速率，而其它的仅用于测量试剂被吸收到细胞的速率(Laverman等，2002；Vaalburg等，1992)。
兴奋性氨基酸谷氨酸(GIu)是中枢神经系统中有效的神经递质，并通过不同的谷氨酸受体(GIuRs)发挥其作用(Chenu等，1998)。已将回旋加速器产生的L-(N-13)谷氨酸用于使患者恶性颅内肿瘤显影(Reiman等，1982)。服用L-(N-13)谷氨酸后，PET(N-13)谷氨酸被大多数脑部肿瘤快速吸收，而N-13的吸收与血脑屏障屏障的破坏相关，如已被对比CT或高锝酸盐(Tc-99m)研究证实(Reiman等，1982)。
L-(N-13)-谷氨酸也已被用于成骨肉瘤的成像(Gelbard等，1979)和胚胎横纹肌肉瘤的成像(Sordillo等，1982)。在这些研究中，经10周的化疗后，连续定量测量N-13由主要肿瘤吸收量的N-13的下降了40％。N-13标记显示富集在肉瘤的软组织部分，然而，99mTc二磷酸盐化合物吸收在发生钙化的区域最大(Gelbard等，1979；Sordillo等，1982)。
[13N]氨基酸的一个主要局限在于对于一般临床应用它们的半衰期太短。此外，关于[13N]氨基酸还没有研究过代谢房室模型(metabolic compartmental model)。对于常规应用，可靠的放射性药物的生产的是必须的，[13N]氨基酸可靠的生产方法还没有被认证。对于PET氨基酸配方，在生产方面的主要问题包括复杂的多级合成，低的放射化学产率以及复杂的纯化方法。因此，诸因素如高成本、可获得性以及在一些情况下增加的辐射限制了其临床应用及[13N]氨基酸的实用性。
由于其合适的半衰期(6小时)、易于生产、容易获得、能量(140keV)低以及成本低，优选的成像试剂的放射性标记物是锝(99mTc)。然而，为成像目的将99mTc连接到药物上却经常是种挑战。同位素如99mTc的较长的半衰期方便放射性标记的氨基酸运送到医院而不需使用原位回旋加速器或专用的放射化学实验室。
由于[13N]谷氨酸在肿瘤成像方面的成功，需要能够比[13N]谷氨酸更有效且更低廉地生产的成像试剂和放疗试剂。还需要比[13N]谷氨酸更稳定的试剂，其能够有效并容易地被生产，可被制造成更易于临床应用，如以试剂盒的形式。此外，需要不快速从机体清除的成像试剂，从而能够延长成像试剂或放疗试剂在所关注部位的靶向潜力以增进成像质量。
188Re在成像和潜在的治疗使用方面具有优异的特性，这是因为它有高的β射线能量(2.1MeV)、短的物理半衰期(16.9hr)以及用于计量测定和成像目的的γ射线发射能量是155keV。相对于寿命长的放射性核素，188Re的短物理半衰期使其可以给与高剂量。此外，短的半衰期减少了放射性废物的处理和贮藏的问题。特别是188Re可通过与99mTc发生器相似的室内发生系统得到。188Re可通过188W/188Re发生器得到，这就使其非常便于临床应用。99mTc和188Re都发射γ射线，故基于99mTc成像产生的放射量测定有望比使用现有的标准放射性同位素Y-90得到的更准确。
对于应用正电子发射断层显影(PET)的成像，PET放射合成必须快速进行，这是因为放射性同位素在长的化学合成过程中会衰变，以及在放射合成过程中可能会发生辐射暴露的高风险。基于回旋加速器的示踪物由于局部回旋加速器的可用性以及它的高成本而受到限制。美国食品和药物管理局(FDA)许可在良好的控制条件下用中央商业设备生产放射性药品，再将其分配给地方的诊所，在那里放射性药品被投用。相似地，可在良好控制的条件下生产的放射性核素发生器系统也被纳入目前的FDA流程，并且拥有长期成功的临床使用历史。发生器使用母子核素对(parent-daughter nuclide pair)，其中，相对长寿命的母同位素衰变成短寿命的用于成像的子同位素。母同位素是在回旋加速器设备中被生产，其可被输送到临床点，子同位素可由其现场分化用于临床。
68Ga具有高的正电子发射量(总衰变的89％)，因此，主要考虑的是它的空间分辨率，这取决于正电子射程(能量)、湮灭光子的非共线性、检测器的内在特性、大小、几何形状和再现算法的选择。在检测器设计方面，物理性质和它对系统的空间分辨率的影响已经被很多人广泛研究，带来了硬件的不断优化。虽然68Ga的最大正电子能量(最大＝1.90MeV，平均＝0.89MeV)比18F的(最大＝0.63MeV，平均＝0.25MeV)高，使用蒙特卡罗(MonteCarlo)分析空间分辨率的研究显示，在假定PET检测器的空间分辨率为3mm下，在软组织(3.01mm对3.09mm)中，18F和68Ga的常规半高宽(FWHM)无法区分。这意味着使用空间分辨率为5到7mm的目前的临床扫描器，使用基于68Ga的示踪剂的成像质量可与基于18F试剂的一样好，从而激励他人开发潜在的基于68Ga的成像试剂。此外，基于68Ga的PET试剂具有重要的商业潜力，这是因为该同位素可通过68Ge发生器(半衰期275天)来原位生产，并用作基于回旋加速器的PET同位素，例如18F或13N的方便的替代物。
发明内容
本发明人已发现某种新成像和放疗试剂，其包含多肽，该多肽用作价金属离子的载体或螯合剂。与DTPA-药物缀合物相比，这些试剂对个体的所关注部位具有延长的靶向潜力。在某些实施方案中，该多肽为包含5-60个酸部分的聚(谷氨酸)(GAP)或聚(天冬氨酸)(AAP)肽。在一些实施方案中，该多肽包含4个用来与99mTc螯合的酸部分。本发明人们还发现，可以在该多肽上结合第二部分，例如组织靶向部分、治疗部分或成像部分。这样该制剂适用于多模式成像或放化疗。这样的缀合反应可以在例如水性(湿)或溶剂(干)条件下下进行。金属离子络合到多肽提高了试剂的水溶性，并且可以使用该试剂对比增强靶向成像。
本发明的某些实施方案主要涉及在其序列中包含用于非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽，和一个或更多非共价键合到两个连续氨基酸的至少一个上的价金属离子的组合物，该氨基酸序列的作用为非共价结合价金属离子。如下面的说明书更具体地讨论的，“价金属离子”包括任何能够与另一个原子或分子成键如非共价键的金属离子。其它原子或分子通常是带负电荷的。
任何氨基酸，无论是自然存在的或是合成的，只要具有非共价键结合价金属离子的作用，就可被认为包括在本发明的多肽中。因此，能用于非共价键结合价金属离子的氨基酸必须是电子供体。这样的氨基酸在下面的说明书中作更详细的讨论。例如，该氨基酸可以包含能够用于非共价结合价金属离子的羧基部分。在某些实施方案中，用于非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸选自由天冬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸类似物、谷氨酸类似物、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、鸟氨酸和非天然存在的含有两个或更多羧基的氨基酸组成的组中。
在某些具体实施方案中，两个或更多连续氨基酸是谷氨酸残基。在又一些实施方案中，两个或更多连续氨基酸是天冬氨酸残基。在其它实施方案中，多肽包含任意比率的谷氨酸和天冬氨酸残基两者。在这些实施方案中，该多肽可包含任何数目的连续谷氨酸和/或天冬氨酸残基。例如，在某些实施方案中，该多肽包含至少2个连续谷氨酸和/或天冬氨酸残基。在又一些实施方案中，该多肽包含至少5个连续谷氨酸和/或天冬氨酸残基。在再一些具体的实施方案中，该多肽包含至少10个连续谷氨酸和/或天冬氨酸残基。在又一些具体的实施方案中，该多肽包含至少20个连续谷氨酸和/或天冬氨酸残基。在再一些实施方案中，该多肽包含至少50个连续谷氨酸和/或天冬氨酸残基。连续氨基酸残基可以相同(例如，全部是谷氨酸)或是不同类型氨基酸残基的组合(例如谷氨酸与天冬氨酸残基的混合物)。
该多肽可以是任何分子量。例如，在一些实施方案中，多肽分子量为300至30000道尔顿。通常，认为本发明的更具体的实施方案具有较低的分子量，例如分子量为750至9000道尔顿。估计分子量为750至9000道尔顿为含有约5至约60个连续氨基酸残基的多肽。认为这里指出的用于非共价结合价金属离子的连续氨基酸基本上不具有药理学活性，具有最低的生物学和/或药理学活性。
在本发明的某些实施方案中，通过配位到谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸类似物或天冬氨酸类似物的羧基部分，多肽能够螯合3至5个价金属离子。在这些实施方案中，多肽可以螯合任何数目的价金属离子。例如，多肽可以螯合1至200个或更多的价金属离子。
价金属离子可以是本领域普通技术人员熟知的任何能够非共价结合到氨基酸残基的价金属离子。例如，该价金属离子可以是一种放射性核素。放射性核素是显示放射性的人工或天然的同位素。在某些实施方案中，价金属离子可以选自由Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、In-111、T1-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212、Bi-213、Fe-56、Mn-55、Lu-177、成键铁离子、成键锰离子、成键钴离子、成键铂离子和成键铑离子组成的组中。在某些具体实施方案中，价金属离子是Tc-99m、Re-188或Ga-68。
本发明的某些实施方案中，多肽包含结合到该多肽第二部分。该第二部分可以以本领域普通技术人员熟知的任何方式结合到多肽上。例如，在某些实施方案中，该第二部分以酰胺键或酯键结合到多肽的羧基部分。
第二部分可以是任何类型的部分。例如，在某些实施方案中，该第二部分是组织靶向部分、诊断部分或治疗部分。这些部分在下面的说明中更加详细地讨论。在某些实施方案中，组织靶向部分是靶向配体。例如，靶向配体可以是疾病细胞周期靶向配体、抗代谢物、生物还原剂、信号传导治疗制剂、细胞周期特异性试剂、肿瘤血管生成靶向配体、肿瘤编程性细胞死亡靶向配体、疾病受体靶向配体、基于药物的配体、抗微生物剂、肿瘤缺氧靶向配体、拟葡萄糖配体(an agent that mimicsglucose)、氨磷汀(amifostine)、血管生成抑制素(angiostatin)、EGF受体配体、单克隆抗体C225、单克隆抗体CD31、单克隆抗体CD40、卡培他滨(capecitabine)、COX-2抑制剂、脱氧胞苷、富勒烯、赫赛汀(herceptin)、人血清白蛋白、乳糖、促黄体生成激素(leuteinizing hormone)、吡哆醛、喹唑啉、沙立度胺(thalidomide)、转铁蛋白或三甲基赖氨酸。
在本发明的某些具体实施方案中，该多肽包含5至60个连续谷氨酸残基和靶向配体，其中靶向配体是雌二醇、半乳糖、乳糖、环糊精、秋水仙碱、氨甲喋呤、紫杉醇、阿霉素、西乐葆(celebrex)、甲硝唑、腺苷、喷昔洛韦(penciclovir)、肉碱(carnetin)、雌二醇(3位)、雌二醇(17位)、亚麻酸、葡糖胺、甘露糖四乙酸盐或叶酸盐，其中，价金属离子是99mTc。
在其中多肽包含诊断部分的本发明的实施方案中，该诊断部分可以是成像部分。以下更详细讨论的成像部分在某些实施方案中可以是对照介质。例如，该对照介质可以是CT对照介质、MRI对照介质、光学对照介质和超声对照介质。CT对照介质的例子包括碘酞酸盐、碘海醇、泛影酸盐(diatrizoate)、碘帕醇、乙碘油(ethiodol)和碘番酸盐。MRI对照介质的例子包括钆螯合物(例如，Gd-DOTA)、锰螯合物(例如，Mn-DPDP)，铬螯合物(例如，Cr-DEHIDA)和铁粒子。光学对照介质的例子包括萤光素、萤光素衍生物、吲哚青绿(indocyanine green)、奥列刚绿(Oregongreen)、奥列刚绿衍生物、若丹明绿、若丹明绿的衍生物、曙红、赤藓红、德克萨斯红、德克萨斯红衍生物、孔雀石绿、纳米金硫代琥珀酰亚胺酯、瀑布蓝(cascadeblue)、香豆素衍生物、萘、吡啶噁唑衍生物、瀑布黄染料和dapoxyl染料。超声对照介质的例子包括超声全氟化对照介质，例如，全氟代物或全氟代类似物。
在某些实施方案中，第二部分是治疗部分。在下面的说明书中会对治疗部分进行详尽的讨论。在本发明的一些实施方案中，治疗部分是抗癌部分。认为任何本领域的普通技术人员熟知的抗癌剂都可用作本发明的抗癌部分，如本说明书其它部分所详述的一样，抗癌剂可以通过本领域的普通技术人员熟知的任何方式结合到本发明的多肽上。抗癌部分的例子包括能够螯合治疗性的放射性金属物质、氨甲喋呤、替尼泊甙(epipodophyllotoxin)、长春新碱、多烯紫杉醇、紫杉醇、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、拓扑替康(topotecan)、博来霉素、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨(fludarabine)和5-FUDR的螯合剂。在某些具体的实施方案中，抗癌部分是氨甲喋呤。
在其它实施方案中，抗癌部分是选自由Re-188、Re-186、Ho-166、Y-90、Sr-89、Sm-153组成的组中的治疗性的放射性金属物质。在又一些实施方案中，抗癌部分是能够螯合选自由砷、钴、铜、硒、铊和铂组成的组的治疗性金属的物质。
非共价连接到多肽的价金属离子可以通过本领域普通技术人员熟知的任何方式成像。成像方式的实例在下面的说明书中进行详尽的讨论，包括PET和SPECT。
本发明还主要涉及组合物，该组合物包括多肽，在该多肽的序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列；和连接到多肽的一个或多个氨基酸序列的一个或多个价金属离子。在这些实施方案的某些中，该多肽包含两个或更多连续谷氨酸残基。例如，在某些实施方案中，该多肽包含5至60个连续谷氨酸残基。在其它实施方案中，该多肽包含两个或更多连续天冬氨酸残基。例如，在某些实施方案中，该多肽包含5至60个连续天冬氨酸残基。
组织靶向氨基酸序列可以是靶向配体，例如疾病细胞周期靶向化合物、抗代谢物、生物还原剂，信号传导治疗剂，细胞周期特异性制剂、肿瘤血管发生靶向配体，肿瘤编程性细胞死亡靶向配体，疾病受体靶向配体，基于药物的配体，抗微生物剂，肿瘤缺氧靶向配体，模仿葡萄糖、氨磷汀、血管生成抑制素、EGF受体配体、单克隆抗体C225、单克隆抗体CD31、单克隆抗体CD40、卡培他滨、COX-2抑制剂、脱氧胞苷、富勒烯、赫赛汀、人血清白蛋白、乳糖、促黄体生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙立度胺、转铁蛋白或三甲基赖氨酸。诊断氨基酸序列可以是成像氨基酸序列，例如CT对照介质、MRI对照介质、光学对照介质或超声对照介质。如上所述，治疗氨基酸序列可以是一个抗癌氨基酸序列。在一些实施方案中，抗癌氨基酸序列能够螯合选自由砷、钴、铜、硒、铊和铂组成的组的治疗性金属。
本发明还主要涉及到合成成像试剂的方法，其包括(1)获得多肽，在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸；和(2)将所述多肽与一个或多个价金属离子以及还原剂混合，来获得价金属离子标记的多肽，其中，一个或多个价金属离子非共价连接至两个连续氨基酸至少之一。还原剂可以是本领域普通技术人员熟知的任何还原剂。例如，在某些实施方案中，还原剂是连二亚硫酸盐离子、亚锡离子或亚铁离子。在此处所说的合成方法中，多肽可以是上面所提到的任何多肽，在此处将其所讨论的并入本部分。
在本发明的一些实施方案中，合成成像试剂的方法进一步定义为合成用于成像和化疗的试剂的方法。在本发明又一些实施方案中，合成成像试剂的方法进一步定义为合成用于二元成像的试剂的方法。这些方法中使用的成像模式可以是本领域普通技术人员熟知的任何成像模式。方法的例子在本说明书的其他部分详细讨论，包括PET、SPECT、MRI、CT和光学成像。
本发明的又一些实施方案主要涉及合成成像试剂的方法，其包括(1)获得多肽，在其序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列；和(2)将所述多肽与一个或多个价金属离子以及还原剂混合，来获得价金属离子标记的多肽。如上所述，还原剂可以是本领域普通技术人员熟知的任何还原剂，例如，连二亚硫酸盐离子、亚锡离子或亚铁离子。在某些实施方案中，该多肽包含至少2个连续谷氨酸残基或天冬氨酸残基。在更具体的实施方案中，多肽包含至少两个连续谷氨酸或天冬氨酸残基。价金属离子的例子包括上述讨论的任何一种。在具体实施方案中，价金属离子是Tc-99m。组织靶向氨基酸序列可以是组织靶向氨基酸配体，例如上述讨论的任何组织靶向配体。同样，诊断氨基酸序列、成像氨基酸序列和治疗氨基酸序列的例子包括上述讨论的任何序列。
本发明的又一些实施方案主要涉及在个体内某部位成像的方法，其包括以下步骤：(1)给个体投药诊断上有效量的任何上述新多肽和价金属离子的组合物；(2)检测来自定位在该部位的价金属离子-多肽螯合物的信号。可使用本领域的普通技术人员熟知的任何技术来检测来自定位在该部位的价金属离子-多肽螯合物的信号。例如，可使用PET、CT、SPECT、MRI、光学成像法或超声法来检测信号。在一些实施方案中，该方法进一步定义为进行二元成像以及放化疗的方法。放化疗是指应用放射性治疗金属物质的治疗，例如上面提及的任何物质。在又一些实施方案中，该成像方法进一步定义为在个体某部位进行二元成像的方法。本领域技术人员熟知的任何成像模式，包括任何上述讨论的那些的任何方法，都可以应用到本发明。
在本发明的再一些实施方案主要涉及到用来制备成像试剂的试剂盒，其中该试剂盒包括密封容器，其含有预定量的在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸序列的多肽；和足够量的还原剂，以非共价结合价金属离子至两个连续氨基酸的至少一个上。认为任何上述包含两个或更多连续氨基酸的多肽可包含在这些实施方案中。
本发明的另外的实施方案涉及制备成像试剂的试剂盒，其中，试剂盒包括密封的容器，其中含有预定量的在其序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列的多肽；和足够量的还原剂，来将一个或多个的价金属离子连接到多肽上。认为上述包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列的任何多肽都可包含在本发明中。该多肽可以包含一个或多个这样的序列，并可以包括这样序列的任何组合。如上所述，该多肽可以包含任何数目的连续氨基酸残基。在某些实施方案中，该多肽包含至少两个连续谷氨酸或天冬氨酸残基。在又一些实施方案中，该多肽包含至少5个、至少10个、至少20个或至少50个连续谷氨酸或天冬氨酸残基。在一些具体实施方案中，该多肽包含5至60个连续天冬氨酸或谷氨酸残基。
本发明还主要涉及测定候选物质作为成像试剂有效性的方法，其中，该方法包括：(1)获得候选物质；(2)缀合或螯合该候选物质到在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽上；(3)将该候选物质-多肽缀合物引入个体；(4)检测来自候选物质-多肽缀合物的信号，来测定候选物质作为成像试剂的有效性。本领域的普通技术人员熟知的任何方法都可以用来确定候选物质。方法的例子在下面的说明书中提及。任何缀合或螯合候选物质到多肽上的方法都被本发明关注，方法的例子在的下面说明书中提及。如以上所讨论的，任何检测来自候选物质-多肽缀合物的信号的方法都被本发明关注，包括任何用来检测上述以及本发明其它地方讨论的信号的方法。
对于在此处本说明书中所使用的“一(a)”或“一(an)”可以表示一或多。对于在此处权利要求书中所使用的，当与“包含”连接时，该词“一(a)”或“一(an)”可以表示一或多于一。对于此处使用的“另一”可以表示至少第二或更多。
本发明的其它目的、特征、优点将通过下面的详细描述变得清楚。然而，应当理解，详细描述和具体实施例，尽管其表示本发明优选的实施方案，也仅用于说明，因为从此详细描述，对于在本发明的精神和范围内的各种改变以及修正对于本领域的技术人员来说都会变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并包括在内以进一步证明本发明的某些方面。结合此处呈现的具体实施方案的详细描述，通过参考这些附图中的一个或多个会更好地理解本发明。
图1.GAP-3-EDL的合成方案。
图2.GAP-EDL的IH-NMR。
图3.乳腺癌细胞(RBA CRL-1747，4μCi/500000细胞/孔)中的细胞吸收。
图4.在3小时时在人乳腺癌细胞(4μCi/200,000/孔)中的细胞吸收。
图5.在3小时时在人卵巢癌细胞(4μCi/50,000/孔)中的细胞吸收。
图6.100000个大鼠乳腺肿瘤细胞用68Ga-GAP-EDL在30-240分钟孵育器中孵育。与68Ga-GAP组比较68Ga-GAP-EDL组有明显高的吸收(*p＜0.005，**p＜0.0005)。
图7.在未标记的雌酮的存在下，100000个大鼠乳腺肿瘤细胞用68Ga-GAP-EDL(0.1mg/孔)孵育。90分钟孵育后收集细胞。以相对于对照组的吸收％表示结果。与对照组相比*p＜0.005。经雌酮处理的细胞中吸收降低表明细胞吸收是ER-介导的过程。
图8.荷乳腺肿瘤大鼠(breast tumor-bearing rats)中的99mTc-GAP-EDL计数密度比。99mTc-GAP-EDL的体内肿瘤(子宫的)-组织计数密度比。
图9A-9B.A.荷乳腺肿瘤大鼠给药99mTC-GAP-EDL和99mTc-DTPA后的平面图像显示注射后0.5-4小时可以可看到肿瘤。B.在注射后55分钟后选择的图像。
图10.合成GAP-EDL(17位)。
图11A-11B.A.在乳腺癌细胞中的细胞吸收(RBACRL-1747，4μCi/孔)。B.在静脉注射300μCi/大鼠后，在荷乳腺肿瘤细胞系大鼠中Tc-99m-GAP和Tc-99m-GAP-雌二醇17的30、60、120和180分钟平面闪烁照像，获得的500000计数肿瘤与肌肉显像比较。
图12.GAP-COXi的合成方案。
图13.GAP-COXi的质子NMR。
图14.99mTc-GAP-COX-2(COX2抑制剂)的核成像。使用99mTc-GAP-COX-2(300μCi，静脉注射)，对荷乳腺肿瘤大鼠在顺铂治疗(4mg/kg，静脉注射)前后成像。显示了在注射后0.5-2小时选择的99mTc-GAP-COX-2的平面影像。
图15.合成GAP-DOX
图16.99mTc GAP试剂的细胞吸收。在乳腺癌细胞(RBACRL-1747，4μCi/50000细胞/孔)中的细胞吸收。
图17.合成GAP-DG。
图18.合成GAP-GAL。
图19.乳腺癌细胞(RBA CRL-1747，4μCi/孔)中的细胞吸收。
图20.荷乳腺肿瘤大鼠(n＝3，27.5μCi/大鼠，静脉注射)中99mTc-GAP-DGAC的吸收。
图21.荷乳腺肿瘤大鼠中99mTc-GAP-DGAC的肿瘤-组织计数密度比。
图22.荷乳腺肿瘤细胞大鼠中99mTc-GAP-DGAC的T/血液和b/肌肉计数密度比。
图23.兔99mTc-GAP-DGAC成像。在荷VX2肿瘤细胞兔(1mCi/兔，静脉注射)中的99mTc-GAP-DGAC的平面闪烁照相表明肿瘤可以被很好地显影。显示了肿瘤与非肿瘤的比率。T＝肿瘤。
图24.兔99mTc-GAP-D GAC成像。在荷VX2肿瘤兔(1mCi/兔，静脉注射)中的99mTc-GAP-DGAC的平面闪烁照相表明肿瘤可以被很好地显影。显示了肿瘤与非肿瘤的比率。T＝肿瘤。
图25.GAP-LAS合成路线。
图26.在2小时时时在人卵巢癌细胞(6[μ]Ci/60,000/孔)中的细胞吸收.
图27.在乳腺癌细胞(RBA CRL-1747，3μCi/50,000细胞/孔)中的细胞吸收。
图28.在2h时在人卵巢癌细胞(3μCi/60,000/孔)中的细胞吸收。
图29.在人顺铂抗性卵巢癌细胞(2.4μCi/孔)中的细胞吸收。
图30.在荷乳腺肿瘤大鼠(n＝3/时间间隔，20μCi/大鼠，静脉注射)中化合物的肿瘤/血液比率。
图31.荷乳腺肿瘤大鼠(n＝3/时间间隔，20μCi/rat，静脉注射)中的肿瘤-肌肉比率。
图32.合成GAP-FOL。
图33.合成GAP-MN。
图34.合成GAP-MTX。
图35.在荷肿瘤的大鼠中99mTc-GAP-TLM的30、60、120和180分钟成像。静脉注射300μCi/大鼠后，在荷乳腺肿瘤细胞系的大鼠99mTc-GAP-TLM的30、60、120分钟平面闪烁照相，获得500,000计数来表现肿瘤-肌肉以及心脏-肌肉显像。
图36.在荷乳腺肿瘤细胞大鼠中99mTc-GAP、99mTc-GAP-腺苷、99mTc-GAP-EDL17和99mTc-GAP-TML化合物的肿瘤-肌肉计数密度比。
图37.合成GAP-AND。
具体实施方式
本发明人已发现某种新的成像和放疗试剂，其包含作为载体的多肽以及用于金属络合物的螯合剂。多肽载体的例子包括含有5-60个氨基酸残基的聚(谷氨酸)(GAP)或聚(天冬氨酸)(AAP)。谷氨酸(GAP)和天冬氨酸(AAP)结合到谷氨酸/天冬氨酸或叶酸盐受体上。本发明人还发现第二部分如组织靶向试剂可连接到多肽上。这些成像试剂相对于试剂如[13N]谷氨酸可以被更有效且低成本地生产，并且不像[13N]那样快速地从机体清除，以致可延长该制剂在个体的机体中感兴趣部位的靶向潜力从而提高成像质量。
A.多肽和氨基酸
在某些实施方案中，本发明涉及新的组合物，其包含(a)多肽，在其序列中包含用来非共价连接价金属离子的两个或更多连续氨基酸；和(b)一个或多个非共价结合到两个连续氨基酸的至少一个上价金属离子。在又一些实施方案中，本发明涉及(a)多肽，在其序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列；以及(b)一个或多个连接到多肽上的价金属离子。
此处应用的“多肽”是指两个或更多氨基酸的连续序列。氨基酸可以是L型、D型或L和D型的外消旋的混合物。例如，在一些实施方案中，本发明的多肽包含至少两个氨基酸的连续序列。在又一些实施方案中，该多肽包含至少5个氨基酸的连续序列。在再一些实施方案中，该多肽包含至少10个氨基酸的连续序列。在又一些实施方案中，该多肽包含至少20个氨基酸的连续序列。在一些具体实施方案中，该多肽包含2-200个氨基酸的连续序列。在更加具体的实施方案中，该多肽包含5-60个氨基酸的连续序列。
如上所讨论，本发明的某些实施方案包括多肽，在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸。价金属离子的例子包括Ga(+3)、Re(+5)、Tc-99m(+5)和Gd(+3)。任何氨基酸，无论是自然存在的或是非天然存在的，只要能结合价金属离子，就认为可包括在本发明的多肽中。能够结合价金属离子的氨基酸的例子包括天冬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸类似物、谷氨酸类似物、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、鸟氨酸和任何合成的或非天然存在的含有2个或更多羧基的氨基酸。例如，在本发明的一些具体实施方案中，多肽可以包含2至大约1000个或更多能够结合价金属离子的连续氨基酸。
此处使用的“谷氨酸”，不仅指谷氨酸盐还指谷氨酸。包含在此定义中的为谷氨酸的盐，例如镁盐、钙盐、钾盐、锌盐及其组合物。谷氨酸残基可以是D型或L型。
此处使用的“谷氨酸类似物”包括在任何位置放射性标记了的谷氨酸残基。例如，天冬氨酸可以用正电子发射放射性核素(例如，C-11、N-13、F-18)或γ射线发射放射性核素(例如，I-123，I-131)标记。放射性标记的谷氨酸残基可通过本领域普通技术人员熟知的任何方法生产，例如使用回旋加速器(参见，例如，Reiman等，1982，pertaining to N-13-labeled L-glutamate，其在此详细引入以作参考)。包括在“谷氨酸类似物”定义中的还有其中氢原子用卤素原子取代的谷氨酸分子，例如氟代谷氨酸分子(参见，例如，Laverman等，2002，其研究了使用PET的用于肿瘤成像的氟代谷氨酸，在此详细引入以作参考)。
此处用到的术语“天冬氨酸”不仅单指天冬氨酸盐，还指天冬氨酸。天冬氨酸残基可以是D型或L型。该定义中包括天冬氨酸的盐，包括镁盐、钙盐、钾盐、锌盐及其组合物。
此处使用的“天冬氨酸类似物”包括在任何位置放射性标记了的天冬氨酸残基。例如，天冬氨酸可用正电子发射放射性核素(例如，C-11、N-13、F-18)或γ射线发射放射性核素(例如，I-123、I-131)标记。放射性标记的天冬氨酸残基可通过本领域普通技术人员熟知的任何方法生产，例如使用回旋加速器。包括在“天冬氨酸类似物”定义中的还有其中氢原子用卤素原子取代的天冬氨酸分子，例如氟代天冬氨酸分子(参见，例如，Laverman等，2002，在此详细引入以作参考)。
此处定义的包含两个或更多羧基的非天然存在的氨基酸是指如下化学结构的氨基酸：
Figure A20068001076000311
其中，R为包含一个或多个羧基任何部分。例如，R可以是烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、碳环芳基、杂环芳基、酰胺基、硫代酰胺基、酯基、胺基、硫醚基、磺酰基或任何本领域技术人员熟知的其它基团，只要该基团包含一个或多个的羧基取代基就可。除一个或多个的羧基外，R基团还可以包含其它附加取代基，例如，一个或多个的羟基、氰基、烷氧基、卤素、＝O、＝S、NO2、N(CH3)2、氨基或SH基。
“烷基”是指饱和脂肪族烃，其包括直链的、支链的和环烷基。优选该烷基具有1至12个碳。
“链烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的不饱和烃基，其包括直链的、支链的和环链基。优选该链烯基具有1至12个碳。
“炔基”是指是指包含至少一个碳-碳三键的不饱和烃基，其包括直链的、支链和环链基。优选该炔基含有1至12个碳。更优选其为具有1至7个碳，更优选1至4个碳的低级炔。
“烷氧基”是指“-O-烷基”基团，其中烷基按上述定义。
“芳基”是其中具有至少一个具有共轭的π电子系统的环的芳香族基团，并且包括碳环芳基、杂环芳基和二芳基基团，其所有都可被任选取代。优选芳基是取代的或非取代的苯基或吡啶基。优选的芳基取代基是卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、NO2、氨基、酯基(例如COOH)、硫醚、氰基、烷氧基、烷基和氨基。
“烷芳基”是指共价结合到芳基基团(如上所述)上的烷基(如上所述)。优选烷基是低级烷基。
“碳环芳基”是指在芳香环上的环原子都是碳原子的基团。碳原子任选以上述芳基优选的基团取代。
“杂环芳基”是指芳香环上具有1至3个杂原子作为环原子的基团，而环原子的剩余部分是碳原子。合适的杂原子包括氧、硫和氮，包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低基烷基吡咯并(pyrrolo)、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，所有的被任选取代。
“酰胺基”是指-C(O)-NH-R1，其中R1是烷基、芳基、烷芳基或氢。
“硫代酰胺基”是指-C(S)-NH-R1，其中R1可以是烷基、芳基、烷芳基或氢。
“酯基”是指-C(O)-OR′，其中R′可是烷基、芳基、烷芳基或氢。
“胺基”是指-N(R″)R″′，其中R″和R″′各自独立地是氢、烷基、芳基或烷芳基，条件是R″和R″′不全为氢。
“硫醚基”是指-S-R2，其中R2是烷基、芳基或烷芳基。
“磺酰基”是指-S(O)2-R3，其中R3是芳基、C(CN)＝C-芳基、CH2-CN、烷芳基、NH-烷基、NH-烷芳基或NH-芳基。
另外，本发明组合物的多肽除用来非共价结合价金属离子的氨基酸外可以包括任何数目的氨基酸。这些其它的氨基酸可以在用来结合价金属离子的两个或更多氨基酸序列的C末端或是在N末端。或者，这些其它的氨基酸可以插入到用来结合价金属离子的连续氨基酸中。此外，在一些实施方案中，多肽可以是支链的。因此，本发明组合物的多肽可以包含总数为2至约1000或更多总数的氨基酸残基，只要它包含至少两个的用来结合价金属离子的连续氨基酸即可。
在某些实施方案中，多肽的氨基酸残基是连续的，没有任何非氨基分子插入在氨基分子残基的序列中。在其它的实施方案中，多肽可以包含一个或多个的非氨基分子部分。
此处应用的“氨基酸”是指本领域普通技术人员熟知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或拟氨基酸(amino acid mimic)。氨基酸可以是L型或D型。因此，术语“氨基酸”包括含天然合成的蛋白质中的20个的常见氨基酸中的至少一个的氨基分子序列、上述天冬氨酸或谷氨酸的任何类似物、任何上述包含两个或更多羧基的非天然存在的氨基酸或任何其它改性的或不常见氨基酸，包括但不仅限于下面表1所显示那些。
在某些实施方案中，本发明的含多肽的组合物包含生物相容蛋白、多肽或肽。对于此处所使用的术语“生物相容的”是指以此处所描述的方法和剂量应用或给药到被给个体时不会产生显著的不利效果的物质。个体包括但不仅限于哺乳动物例如实验室动物(例如，大鼠、小鼠、家兔)和人。不利的或不希望的效果是指例如明显的毒性或不利的免疫反应。在某些实施方案中，含多肽组合物可以是合成的多肽，其基本上不含毒性、病原体和有害的免疫原。
包括在本发明的组合物中的多肽可以通过本领域技术人员熟知的任何技术制备，其包括标准分子生物学技术、从天然来源的分离或化学合成。
在某些实施方案中，多肽可以是纯化的。通常，“纯化的”是指特定的多肽组合物，其已进行分离而去除各种其它的氨基酸序列，且该多肽组合物基本上保留了它的活性，例如可通过蛋白测定法测定，其为本领域普通技术人员熟知。
B.价金属离子
如上所述，发明的某些实施方案涉及包含多肽的组合物，在该多肽序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸。“价金属离子”在此被定义为能够与另一个原子或分子成键如非共价键的金属离子。另一个原子或分子可以是带负电荷的。本领域普通技术人员熟知的任何价金属离子都可以认为包含在本发明的组合物中。本领域的普通技术人员会熟知价金属离子及其应用。在本发明组合物的某些具体实施方案中，价金属离子是放射性核素。应用于本发明组合物的价金属离子的例子包括：Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、In-111、Tl-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212、Bi-213。
由于更好的成像特征以及低成本，已经进行了尝试在可能的情况下，用相应的99mTc标记的化合物来替换123I、131I、67Ga和111In标记的化合物。由于良好的物理特性以及极低的成本($0.21/mCi)，99mTc已经被优选用于标记放射性药物。
对于人类的最佳的放射性成像，必须要考虑一些因素。要使检测效果最大化，优选发射γ射线能量在100至200keV范围的价金属离子。此处的“γ射线辐射体”被定义为发射任何范围γ射线能的试剂。本领域普通技术人员会熟知作为γ射线辐射体的各种价金属离子。为了使患者辐射剂量吸收最小化，放射性核素的物理半衰期应当与允许的成像过程一样短。为了使在任何一天和一天中任何时间都能实施检查，使放射性核素源在临床点随时可得到是有利的。99mTc是优选的放射性核素，这是因为它发射140keV的γ射线，它的物理半衰期为6小时，它可以使用钼-99/锝-99m发生器而易于原位获得。本领域普通技术人员将会熟知在人体确定最佳的放射性成像的方法。
本发明的多肽可以包含一个或多个螯合在多肽上的价金属离子。在一些具体实施方案中，该螯合是在谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸类似物或天冬氨酸类似物的羧基部分。在一些实施方案中，价金属离子是螯合在第二部分，例如第二部分的羧基基团。在一个实施方案中，价金属离子是螯合在多肽的谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸类似物或天冬氨酸类似物的羧基基团，以及在一个或多个第二部分的羧基基团。在又一些实施方案中，价金属离子螯合在多肽的3个或更多个谷氨酸羧基部分。在其它实施方案中，价金属离子螯合在多肽的在3个或更多个天冬氨酸部分。这些实施方案可以包括螯合在聚(谷氨酸)或聚(天冬氨酸)多肽上的多个价金属离子。
在本发明的某些具体实施方案中，该价金属离子是治疗性价金属离子。例如，在一些实施方案中，价金属离子是作为β-辐射体的治疗性放射性核素。此处定义的β-辐射体是指发射任何范围β射线能量的任何试剂。β射线辐射体的例子包括Re-188、Re-186、Ho-166、Y-90、Bi-212、Bi-213和Sn-153。β射线辐射体可以是也可以不是γ射线辐射体。本领域普通技术人员将会熟知β射线辐射体在治疗过增生性疾病如癌中的使用。
在本发明组合物的又一些实施方案中，该价金属离子是既不是β射线辐射体也不是γ射线辐射体的治疗性价金属离子。例如，治疗性价金属离子可以是铂、钴、铜、砷、硒或铊。包含这些治疗性价金属离子的组合物可用于治疗过增生性疾病如治疗癌的方法中。实施包括本发明的组合物的二元化疗和放疗的方法将会在下面进行更详细地讨论。
C.治疗部分
在本发明组合物的某些实施方案中，第二部分结合在多肽上。“部分”在此处被定义为分子的一部分。在某些具体实施方案中，第二部分是治疗部分。“治疗部分”在此处被定义为任何治疗试剂。“治疗试剂”在此处被定义为包括任何能够给药于个体或接触细胞或组织，以治疗疾病或紊乱，或预防疾病或紊乱，或治疗或预防正常生理过程的改变或破坏(disruption)为目的的化合物或物质或药物。例如，该治疗部分可以是抗癌部分，例如化疗剂。在本发明的某些实施方案中，该治疗部分是治疗性氨基酸序列，其融合或化学缀合至治疗性氨基酸序列。这样的化学缀合体或融合蛋白将会在本说明书的其它部分做进一步讨论。
抗癌部分的例子包括本领域普通技术人员已知的任何化疗试剂。这样的化疗试剂的例子包括但并不仅限于顺铂(CDDP)、碳铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊甙(etoposide)(VP 16)、三苯氧胺、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇(taxol)、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲喋呤或上述物质任何类似物或衍生物变体。在某些具体实施方案中，该抗癌部分为氨甲喋呤。
抗癌剂的其它例子包括列于表2中用于癌症化疗的那些药物选择。
表2
用于癌症化疗药物选择
下表列举了在美国和加拿大用于治疗癌症的药物及它们的主要副作用。列举的药物选择基于Medical Letter顾问的意见。也作为指标列举了一些没有被美国食品和药物管理局批准的药物。下面是抗癌药物和它们的副作用。为了本发明的目的，这些所列举的意在举例并非穷举性的。
供选择的药物
Figure A20068001076000371
Figure A20068001076000381
Figure A20068001076000391
Figure A20068001076000401
Figure A20068001076000411
Figure A20068001076000421
*化疗仅有中等活性。
**化疗仅有较小活性。
1使用或不使用化疗的三苯氧胺被普遍推荐给经绝后的雌激素-受体-阳性，阳性模式患者，而使用或不使用三苯氧胺的化疗给予绝经前的阳性模式患者。使用化疗和/或三苯氧胺的辅助治疗被推荐给有大肿瘤或其它预后性症状指示的阴性模式患者。
2Megastrol和其它的激素试剂可能会对三苯氧胺无效的患者有效。
3高剂量化疗后(Medical Letter，34：79，1982)。
4对于直肠癌，使用氟尿嘧啶加上辐射的术后辅助治疗，在其之前和之后单独用氟尿嘧啶治疗。
5仅与外科切除术、放疗或两者结合时才有主要活性的药物
6维生素A类似物lactratinoln(Acgutana)能控制肿瘤发生前的损伤(粘膜白斑病)，并且可以降低第二原发肿瘤的速率(Banner等，1994)。
Figure A20068001076000422
在美国仅用于研究使用。
7高危患者(例如，高计数、细胞生成异常、成年人)可以要求附加的用来诱导、维持和强化(缓和完成后附加药物的使用)的药物。附加的药物包括环磷酰胺、米托蒽醌和硫鸟嘌呤。一个在英国的大型控制试验的结果表明强化可以提高所有急性成淋巴细胞性白血病(ALL)儿童的存活率(Chasselle等，1995)。
8有不良预后起始或缓和后复发的患者。
9患有急性早幼粒细胞白血病的患者对维A酸有完全反应。这样的治疗可能引起主要以发热和呼吸困难(respiratorydistress)为特征的毒性综合症(Warrell，Jr等，1993)。
10HLA相合同胞异基因骨髓移植(allogeneic HLA-identicalsibling bone marrow transplation)能够治疗40％至70％患有CML在慢性期的患者，18％至28％CML加速期的患者，以及＜15％的急变期的患者。以下不利地影响骨髓移植后无病存活：年龄＞50岁、从诊断起疾病持续期＞3年、使用单-抗原错配或匹配不相关的供体骨髓。干扰素对获得完全的细胞生成反应(大约10％)的CML慢性期患者有治疗作用；这是对＞80岁并有最新诊断CML慢性期的患者和所有不是同种异体骨髓移植候选人的患者的选择措施。单独的化疗只能缓解。
11如果使用任何这些合用可以完成第二慢性期，应该考虑异基因骨髓移植。在第二慢性期的骨髓移植可以治愈30％至35％的CML患者。
12限制阶段的Hodgkin′s病(1期和2期)，通过放疗可以治愈。扩散疾病(3b期和4期)需要化疗。一些过渡期和选择性的临床情况从二者均可受益来治疗。
+在美国仅用于研究使用
抗癌药物和激素
Figure A20068001076000431
Figure A20068001076000441
Figure A20068001076000451
在美国仅用于研究使用
Figure A20068001076000453
剂量限制性效果在粗体型(bold type)。表皮反应(有时严重)、色素沉着和眼睛毒性已经被事实上所有的非激素类抗癌药物报道。与其它药物的不良相互作用参见Medical LetterHandbook of Adverse Drug Interaction，1995。
1在美国仅用于研究使用
2甲地孕酮和其它激素类试剂对于三苯氧胺无效的患者可能会有效。
3高剂量化疗后(Medical Letter，34：78，1992)
4对于直肠癌，手术后应用氟尿嘧啶(fluoroutacil)加上辐射辅助治疗，其之前之后单独使用氟尿嘧啶治疗。
5仅与外科切除术、放疗或两者结合时才有主要活性的药物
6维生素A类似物异维生素A酸(isotretioin)(Accutana)能控制肿瘤发生前的损伤(粘膜白斑病)，并且可以降低第二原发肿瘤的速率(Senner等，1994)。
7高危患者(例如，高计数、细胞生成异常、成年人)可以要求用来诱导、维持和强化的附加药物(缓和完成后附加药物的使用)。附加的药物包括环磷酰胺、米托蒽醌、硫鸟嘌呤。一个在英联邦国家的大型控制试验的结果表明强调成分可以提高所有急性成淋巴细胞性白血病儿童的存活率(Chasselle等，1995)。
8有不良预后起始或缓和后复发的患者。
9患有急性早幼粒细胞白血病的患者对维A酸有完全反应。这样的治疗可能引起主要以发热和呼吸困难为特征的毒性综合症(Warrell、Jr等，1993)。
10HLA相合同胞异基因骨髓移植能够治疗40％至70％患有CML在慢性期的患者，15％至25％CML加速期的患者，以及＜15％的急变期的患者。以下不利地影响骨髓移植后无病存活：年龄＞50岁、从诊断起疾病持续期＞3年、使用单-抗原错配或匹配不相关的供体骨髓。干扰素α对获得完全的细胞生成反应(大约10％)的CML慢性期患者有治疗作用；这是对＞80岁并有最新诊断CML慢性期的患者和所有不是同种异体骨髓移植候选人的患者的选择措施。单独的化疗只能缓解。
D.诊断部分
在本发明的组合物某些实施方案中，诊断部分结合在多肽上。此处所定义的“诊断部分”是分子的一部分，该分子是以促进疾病或紊乱，或伴随非正常细胞生理条件的诊断为目的而能够给药于个体或接触组织的化学药品或化合物。任何本领域普通技术人员熟知的诊断试剂都可作为诊断部分。在某些实施方案中，该诊断部分是诊断氨基酸序列，其与能够结合价金属离子的多肽化学缀合或融合。
诊断部分的一个例子可以是成像部分。此处所定义的“成像部分”是分子的一部分，该分子为以促进个体、组织或细胞的特殊性质或方面的显像为目的，通过使用成像模式，能够给药于个体、接触组织或应用到细胞的试剂或化合物。成像模式将在下面作更详细的讨论。本领域普通技术人员熟知的任何成像试剂都可作为本发明的成像部分。因此，例如，在本发明的组合物某些实施方案中，该组合物可以应用到多模式成像技术。二元成像和多模式成像将在下面说明书进行更详细地讨论。
在某些实施方案中，成像部分是对照介质。例子包括CT对照介质、MRI对照介质、光学对照介质、超声对照介质或任何其它用于本领域普通技术人员熟知的任何其它形式的成像模式的对照介质。例子包括泛影酸盐(CT对照介质)、钆螯合物(MRI对照介质)和萤光素钠(光学对照介质)。附加对照介质的例子将在下面说明书中进行更详细地讨论。本领域普通技术人员将会熟知可应用于本发明的多肽的成像部分的广泛类型的成像试剂。
E.组织靶向部分
在本发明的组合物一些实施方案中，第二部分结合到多肽上，其中，第二部分是组织靶向部分。“组织靶向部分”在此处被定义为能够结合或附着在组织上的分子的一部分。结合可以通过任何本领域普通技术人员熟知的结合机制进行。例子包括抗代谢物、细胞凋亡试剂、生物还原剂、信号传导治疗剂、受体应答剂(responseveagents)或细胞周期特异性试剂。组织可以是任何类型的组织，例如细胞。例如，细胞可以是个体的细胞如癌细胞。在某些实施方案中，组织靶向部分是化学缀合或融合到能够结合价金属离子的多肽上的组织靶向氨基酸序列。
在一些实施方案中，该组织靶向部分是“靶向配体”。“靶向配体”在此处被定义为特异性结合到另一个分子上的分子或分子的一部分。本领域普通技术人员将会熟知可以用为本发明内容中的靶向配体的各种试剂。
靶向配体的例子包括细胞周期靶向化合物、肿瘤血管发生靶向配体、肿瘤编程性细胞死亡靶向配体、疾病受体靶向配体、基于药物的配体、抗微生物剂、肿瘤缺氧靶向配体、拟葡萄糖试剂、氨磷汀、血管生成抑制素、EGF受体配体、卡培他滨、COX-2抑制剂、脱氧胞苷、富勒烯、卡培他滨、人血清白蛋白、乳糖、促黄体生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙立度胺、转铁蛋白和三甲基赖氨酸。
在本发明的又一些实施方案中，组织靶向部分是一种抗体。任何抗体都可作为本发明内容中的组织靶向部分。例如，该抗体可以是单克隆抗体。本领域普通技术人员将会熟知单克隆抗体、制备单克隆抗体的方法和使用单克隆抗体作为配体的方法。在本发明的某些实施方案中，该单克隆抗体是指向抗肿瘤标记物的抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体是单克隆抗体C225，单克隆抗体CD31或单克隆抗体CD40。
一个单独的组织靶向部分或多于一个这样的组织靶向部分可以结合到本发明的多肽上。在这些实施方案中，任何数目的组织靶向部分可以结合到此处提及的多肽上。因此，可能有一个或多个连接到本发明的多肽上的组织靶向部分。该组织靶向部分可以以任何方式结合到多肽上。例如，该组织靶向部分可以以酰胺键或酯键结合在多肽上。本领域普通技术人员将会熟知这些试剂的化学作用，以及结合这些试剂作为本发明多肽部分的方式。合成本发明化合物的方法将在下面详细讨论。
有关组织靶向部分和与化合物缀合的信息提供在美国专利6,692,724；美国专利申请系列号09/599,152、美国专利申请系列号10/627,763、美国专利申请系列号10/672,142、美国专利申请系列号10/703,405、美国专利申请系列号10/732,919中，它们中的每一件在此通过参考全部引用在本说明书的这个部分以及说明书的其它部分。
组织靶向部分有代表性的例子在下面进行讨论。
1.疾病细胞周期靶向化合物
疾病细胞周期靶向是指在增殖细胞中是正调节性的靶向试剂。“疾病细胞周期靶向化合物”是用来测量在增殖细胞中是正调节性或负调节性的试剂的化合物。例如，细胞可以是癌细胞。用于此目的的化合物可用于测量细胞中的各种参数，例如，肿瘤细胞DNA含量。
许多这样的试剂是核苷类似物。例如，已经开发出下列物质作为野生型和突变体HSV1-tk表达的报告分子(reporter)底物(Gambhir等，2000)：嘧啶核苷(例如，2′-氟-2′-脱氧-5-碘-1-[β]-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶[FIAU]、2′-氟-2′-脱氧-5-碘-1-[β]-D-核糖呋喃糖-尿嘧啶[FIRU]、2′-氟-2′-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶[FMAU]、2′-氟-2′-脱氧-5-碘-1-[β]-D-核糖呋喃糖尿嘧啶[IVFRU])和无环鸟苷：9-[(2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基)甲基]鸟嘌呤(GCV)和9-[4-羟基-3-(羟基-甲基)丁基]鸟嘌呤(PCV)(Tjuvajev等，2002；Gambhir等，1998；Gambhir等，1999)和其它的18F标记的无环鸟苷类似物，例如，8-氟-9-[(2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基)甲基]鸟嘌呤(FGCV)(Gambhir等，1999；Namavari等，2000)、8-氟-9-[4-羟基-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤(FPCV)(Gambhir等，2000；Iyer等，2001)、9-[3-氟-1-羟基-2-丙氧基甲基]鸟嘌呤(FHPG)(Alauddin等，1996；Alauddin等，1999)和9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤(FHBG)(Alauddin and Conti，1998；Yaghoubi等，2001)。本发明化合物的具体离子包括腺苷和喷昔洛韦(鸟嘌呤)作为该疾病细胞周期靶向配体。本领域普通技术人员将会熟知这些以及其它用于疾病细胞周期靶向的试剂。
2.血管发生靶向配体
“血管发生靶向配体”是指可以结合新生血管的试剂，例如肿瘤细胞新生血管。用于此目的的试剂被本领域普通技术人员熟知，被用来实施不同的肿瘤测量，包括测量肿瘤血管床的大小和测量肿瘤的体积。这些试剂中的一些结合到血管壁上。本领域普通技术人员将会熟知可以用于此目的的试剂。
在整个申请中，“肿瘤血管发生靶向”是指使用试剂与肿瘤新生血管和肿瘤细胞结合。用于此目的的试剂为本领域普通技术人员熟知，被用来实施不同的肿瘤测量，包括测量肿瘤血管床的大小和测量肿瘤的体积。这些试剂中的一些结合到血管壁上。本领域普通技术人员将会熟知那些可以应用到此用途的试剂。肿瘤血管发生靶向配体是以上述定义的肿瘤血管发生靶向为目的而使用的配体。例子包括COX-2抑制剂、抗-EGF受体配体、赫赛汀、血管生成抑制素、C225和沙立度胺。COX-2抑制剂包括，例如西乐葆、罗非考昔(rofecoxib)、艾托考昔(etoricoxib)和这些试剂的类似物。
3.肿瘤编程性细胞死亡靶向配体
“肿瘤编程性细胞死亡靶向配体”是指使用试剂来结合正在经历编程性细胞死亡或处于经历编程性细胞死亡风险期的细胞。这些试剂通常被用于在细胞的繁聚(population)，如肿瘤中，提供编程性细胞死亡程度或风险，或程序性细胞死亡的指示。本领域普通技术人员将会熟知用于此目的的试剂。“肿瘤编程性细胞死亡靶向配体”是能够实施本段落定义的“肿瘤编程性细胞死亡靶向”的配体。本发明的该靶向配体可以包括TRAIL(TNF相关的包括编程性细胞死亡的配体)单克隆抗体。TRAIL是肿瘤坏死因子配体家族的一员，该家族迅速诱导在不同的转化细胞系中的编程性细胞死亡。本发明的该靶向配体还可以包括胱天蛋白酶-3的底物，例如，包含4个氨基酸序列天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸的肽或多肽、胱天蛋白酶-3底物(例如，包含氨基酸序列天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸的肽或多肽)和BcI家族的任何成员。BcI家族成员的例子包括，Bax、Bcl-xL、Bid、Bad、Bak和BcI-2)。本领域普通技术人员将会熟知该Bcl家族和它们各自的底物。
在取消它们在肿瘤细胞中的细胞保护作用和恢复编程性细胞死亡灵敏度这样的思想下，编程性细胞死亡抑制剂是药物发现的目标(Reed，2003)。
4.疾病受体靶向配体
在“疾病受体靶向配体”中，某些试剂被开发，因为其能够结合到某些在疾病，例如癌症，状态下过表达的细胞受体上。这样的靶向受体例子包括，雌激素受体、雄激素受体、脑垂体受体、转铁蛋白受体和黄体酮受体。可用于疾病受体靶向的试剂包括：雄激素、雌激素、生长抑素、黄体酮、转铁蛋白、促黄体生成激素和促黄体生成激素抗体。
放射标记的配体，例如喷曲肽(pentetreotide)、善得定(octreotide)、转铁蛋白和脑垂体肽结合到细胞受体上，这些受体中的一些在某些细胞上过表达。因为这些配体不是免疫原性的而可从血液中快速清除，因此与抗体成像相比似乎更有前途。
在此包括叶酸盐受体作为疾病受体的另一个例子。叶酸盐受体(FRs)在许多瘤细胞类(例如，肺、乳腺、卵巢、宫颈、结肠直肠、鼻咽、肾脏、腺癌、恶性黑素瘤和室管膜瘤)上过表达，但是仅主要表达在几个正常的分化组织上(例如，脉络膜丛、胎盘、甲状腺和肾)(Weitman等，1992a；Campbell等，1991；Weitman等，1992b；Holm等，1994；Ross等，1994；Franklin等，1994；Weitman等，1994)。FRs已经被用于将叶酸盐-缀合的蛋白毒素、药物/反义寡核苷酸和脂质体传递到过表达叶酸受体的肿瘤细胞中(Ginobbi等，1997；Leamon和Low，1991；Leamon和Low，1992；Leamon等，1993；Lee和Low，1994)。此外，包含结合到抗-T细胞受体抗体的抗-FR抗体的双特异性抗体已经被用于靶向T细胞到FR阳性肿瘤细胞并且目前在临床试验中用于卵巢癌(Canevari等，1993；Bolhuis等，1992；Patrick等，1997；Coney等，1994；Kranz等，1995)。
叶酸盐受体靶向配体的例子包括叶酸和叶酸类似物。优选的叶酸盐受体靶向配体包括叶酸盐、氨甲喋呤和拓优得(tomudex)。叶酸和叶酸拮抗剂例如氨甲喋呤除了经典的还原叶酸盐载体系统(Westerhof等，1991；Orr等，1995；Hsueh andDolnick，1993)外，通过与叶酸受体的高亲和力进入细胞(糖基磷酯酰肌醇-连接的膜叶酸-结合蛋白)。
5.药物评价
某些基于药物的配体可用于测量个体对药物的药理学响应。对个体对所给药物的响应的测定中可测量一系列的参数。本领域普通技术人员将会熟知可以被测量的反应类型。这些响应部分取决于不同的因素，包括要被评价的特殊药物、个体要被治疗的特殊疾病和状态和个体的特性。基于药物的配体的例子包括肉毒碱和嘌呤霉素。
6.抗微生物剂
任何抗微生物剂都作为靶向配体而包括。优选的抗微生物剂包括用于阳性和阴性细菌的氨苄西林、阿莫西林、盘尼西林、头孢菌素、克林霉素(clidamycin)、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、纳他霉素、萘夫西林、利福平、四环素、万古霉素、博来霉素和脱氧土霉素；用于真菌的两性霉素B、金刚烷胺、制霉菌素、酮康唑、多链丝霉素、阿昔洛韦和更昔洛韦。本领域普通技术人员将会熟知被认为是抗微生物剂的不同试剂。
7.拟葡萄糖试剂
还包括拟葡萄糖试剂也作为靶向配体。优选的拟葡萄糖或糖试剂包括新霉素、卡那霉素、庆大霉素、巴龙霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、核糖霉素、西索米星、小诺米星、青紫霉素、双脱氧卡那霉素、异帕米星、阿司米星、氨基糖苷类、葡萄糖或葡糖胺。
8.肿瘤缺氧靶向配体
本发明的一些实施方案中，该靶向配体是肿瘤缺氧靶向配体。肿瘤细胞在有氧状态下比在缺氧条件下对常规辐射的灵敏度大；即使是在肿瘤中小百分比的缺氧细胞也可以限制对辐射的响应(Hall，1988；Bush等，1978；Gray等，1958)。已经证明许多动物肿瘤和仅极少数人的肿瘤细胞具有缺氧抗辐射性(Dische，1991；Gatenby等，1988；Nordsmark等，1996)。在大多数情况下，通过组织学发现和动物肿瘤研究，推断人肿瘤细胞有缺氧现象发生。体内缺氧的证明需要使用氧电极的组织测量，而这些技术的侵入力限制了它们的临床应用。
醚醇硝唑是一个肿瘤缺氧靶向配体的例子，是缺氧细胞敏化剂，使用不同的放射性同位素(例如18F、123I、99mTc)标记MISO可用于通过PET或平面闪烁照像法来区别缺氧但有代谢活性的肿瘤和完好的富氧的活性肿瘤。[18F]氟代醚醇硝唑(FMISO)已经被用于通过PET来评价肿瘤缺氧。近来的研究表明，由于其能够通过[18F]FMISO来监测细胞氧含量，PET法具有高的预测肿瘤对辐射的响应的潜力(Koh等，1992；VaIk等，1992；Martin等，1989；Rasey等，1989；Rasey等，1990；Yang等，1995)。PET不通过校准就可以给出更高的分辩能力，然而，使用PET同位素的成本在临床环境下是行不通的。
F.合成方法
1.用于本发明组合物的试剂来源
用来制备本发明组合物的试剂可以从任何来源获得。本领域的普通技术人员知晓其广泛来源。例如，试剂可以从商业来燕、从化学合成或从天然来源获得。试剂可以通过使用本领域普通技术人员熟知的任何技术被分离和纯化。例如，特殊分子量的聚核苷酸可以通过使用特殊的透析膜被分离。应用到本发明组合物中的价金属离子的例子包括从发生器获得的价金属离子(例如，Tc-99m、Cu-62、Cu-67、Ga-68、Re-188、Bi-212)、从回旋加速器获得的价金属离子(例如，Cu-60、Cu-61、As-72、Re-186)和从商业来源获得的价金属离子(例如，In-111、Tl-201、Ga-67、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Ho-166)。未成键的自由金属离子可通过离子交换树脂或通过添加反式螯合剂(transchelator)(例如，葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖二酸盐和乙酰丙酮)纯化。本领域普通技术人员将会熟知包括使用离子交换树脂和反式螯合剂在内的纯化方法。
2.配位价金属离子到多肽上
价金属离子如钆、镓、铼、锝或铂可以在没有螯合剂时螯合在多肽上。该反应可在水性介质或非水介质中进行。最优选该结合在水性介质中进行。
在一些实施方案中，价金属离子螯合在两个或更多连续氨基酸中的一个酸基团上，该两个或更多连续氨基酸选自由谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸类似物、天冬氨酸类似物和包括两个或更多羧基的非天然存在的氨基酸组成的组中。在某些具体实施方案中，价金属离子是螯合在一系列连续谷氨酸或天冬氨酸残基的4或5个羧基上。
本领域普通技术人员熟知的将价金属离子配位到多肽上的任何方法都可以应用到本发明中。在本发明的一些实施方案中，例如，将多肽溶解在水中，然后加入氯化锡(II)溶液。然后可以添加价金属离子(例如，Na99mTcO4或Na186/188ReO4)。其它金属(氯化镓、氯化钆、氯化铜、氯化钴、铂)可以不需要氯化锡(II)溶液。本领域普通技术熟知的任何方法都可用于测量放射化学纯度。例如，可以使用用甲醇∶醋酸铵(1∶4)洗涤脱的薄层色谱法(TLC)来测量。
本领域普通技术人员熟知的任何方法可用于从溶液中分离价金属离子-多肽缀合物。例如，在一些实施方案中，反应混合物可以通过透析和蒸干来纯化，之后在水中再生(reconstituted)以使用。
3.缀合第二部分到多肽上
本领域普通技术熟知的任何方法可用于缀合诊断部分、治疗部分或组织靶向部分到多肽上。例如，第二部分可以缀合到多肽的谷氨酸或天冬氨酸残基上来形成羧酸盐-金属离子络合物。
任何比率的试剂均可用于反应混合物中。例如，在一些实施方案中，在水中多肽与部分的比率是1∶1。不同的比率可以改变在水溶液中的溶解度和粘度。在本方法的一些实施方案中，使用偶联剂来将第二部分偶联在多肽上。在某些实施方案中，在水性环境中使用的偶联剂是1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺-HCl(EDC)。使用在非水环境下的其它偶联剂的例子是1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)。本方法在一些实施方案中，第二部分可以首先溶解于水中。然后可将包含第二部分的水溶液加入到包含多肽的水溶液中。然后将反应混合物在室温下搅拌25小时。产物可以通过本领域普通技术人员熟知的任何方法从溶液中分离。例如，使用截留分子量为1000道尔顿的透析膜从水溶液中透析产物。该产物可以被立即使用或者冷冻干燥并保存。
第二部分可以缀合到多肽的任何残基上。在某些优选的实施方案中，缀合到多肽的酸性基团上。该多肽可以包含一个第二部分或多个第二部分。在本发明的某些具体实施方案中，多肽的每个羧基要么缀合到第二部分或要么配位到价金属离子。多于一种类型的第二部分可以缀合到特殊的多肽上。例如，在一些实施方案中，治疗和组织靶向部分缀合到一个多肽上。治疗试剂例如，氨甲喋呤或阿霉素可以缀合多肽的氨基或酸部分。诊断试剂例如泛影酸、碘酞酸(iothalmic acid)和碘番酸可以缀合到多肽的氨基或酸部分。组织靶向部分如缺氧标记物(甲硝唑、醚醇硝唑)、糖酵解标记物(糖)、氨基酸(例如，酪氨酸、赖氨酸)、细胞周期标记物(例如，腺苷、鸟苷)或受体标记物(例如，雌激素、叶酸盐、雄激素)可以缀合到多肽的氨基或酸部分。在具体实施方案中，缀合是在多肽的酸部分。在其它具体实施方案中，两个或更多不同的治疗或诊断部分缀合到同一多肽上。例如，在某些实施方案中，诊断试剂(例如，X-射线对照介质或光学对照介质)和放射性金属物质缀合到同一多肽上。它可以应用到PET/CT、SPECT/CT或光学/CT应用中。在又一些实施方案中，非放射性的金属物质(例如，钆、铁或锰)配位到多肽上。它可用于各种成像模式，包括PET/MRI、SPECT/MRI或光学/MRI应用中。在再一些实施方案中，治疗试剂和放疗金属物质缀合到同一多肽上。这样的试剂可用于放化疗。
4.生成嵌合多肽
本发明的某些实施方案主要涉及包含多肽的组合物，该多肽在其序列中包含(a)组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列；以及(b)一个或多个非共价地结合到多肽上的价金属离子。“组织靶向氨基酸序列”在此处被定义为能够结合或连接到组织上的氨基酸序列。“诊断氨基酸序列”是指能够给药于个体或接触组织，目的是促进疾病或紊乱或与异常细胞生理相关的情况的诊断的氨基酸序列。“治疗氨基酸序列”在此被定义为能够给药于个体或接触组织或细胞，目的是治疗疾病或紊乱，或预防疾病或紊乱，或治疗或预防正常生理过程的变化或中断的氨基酸序列。例如，该治疗氨基酸序列可以是抗癌氨基酸序列，例如化疗试剂。化疗试剂在本说明书的其它部分讨论。
一个或多个价金属离子可以非共价地结合到组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列上和/或治疗氨基酸序列上，或者一个或多个价金属离子可以在一个独立的氨基酸序列上非共价连接到多肽上。
例如，在一些实施方案中，该价金属离子连接到一个独立的在其序列中包含用来结合价金属离子的一个或多个氨基酸的氨基酸序列上。例如，该序列可以是聚(谷氨酸)氨基酸序列或聚(天冬氨酸)氨基酸序列。这样的氨基酸序列与组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列上或治疗氨基酸序列融合或化学缀合而产生嵌合多肽。
本发明的嵌合多肽通过化学合成法或通过两部分之间的化学连接来制备。在某些具体的实施方案中，它们是在恰当的宿主细胞中在指导融合的聚核苷酸表达的调节序列的控制下，通过融合结合价金属离子的氨基酸序列的编码序列和组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列或治疗氨基酸序列的的编码序列来制备的。
两个全长编码序列的融合可以通过分子生物学领域熟知的方法来实现。优选融合的聚核苷酸仅在第一个编码序列的5′末端有AUG翻译起始密码子，而没有第二个编码序列的起始密码子来避免生成两个独立的编码产物。另外，前导序列可置于聚核苷酸的5′末端以导向表达的产物到宿主细胞中特定位点或区室(compartment)以有助于基因表达后的分泌或后继的纯化。两个编码序列可在没有任何连接体(linker)的条件下直接融合或通过使用一种柔韧的聚合连接体，例如重复1至3次的五聚体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列ID NO：1)组成的连接体(参见Huston等，1988，在此详细引入以作参考)来融合。其它可以使用的连接序列包括Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(序列ID NO：2)(Chaudhary等，1990，在此详细引入以作参考)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(序列ID NO：3)(Bird等，1988，在此详细引入以作参考)。
G.成像模式和成像试剂
本发明的某些实施方案涉及个体中使位点成像的方法，该方法包括(a)对个体给药本发明的包含价金属离子-多肽螯合物的诊断有效剂量的组合物，然后(b)检测来自定位于位点的价金属离子-多肽螯合物的信号。此外，如上所述，在某些实施方案中，作为诊断/成像部分的第二部分可以缀合在多肽-价金属离子螯合物上。本领域普通技术人员熟知的任何成像模式可作为检测来自定位于位点的价金属离子-多肽螯合物或成像部分-多肽-价金属离子复合物的信号的方式。成像模式的例子如下所述。
1.成像模式的例子
a.γ射线射线摄影成像
不同的用于成像的核医学技术为该领域普通技术人员熟知。这些技术中的任何一个可用于本发明的成像方法部分来测量来自报告分子的信号。例如，认为γ射线摄影成像技术是可以用于测量来自报告分子信号的成像方法。本领域普通技术人员将会熟知应用γ射线摄影成像的技术(参见Kundra等，2002，在此详细引入以作参考)。在一个实施方案中，测定信号可以包括使用111-In-抑生长肽(octreotide)-SSRT2A报告分子系统的γ射线摄影成像技术。
b.PET和SPECT
放射性核素成像模式(正电子发射断层显像法(PET)；单光子发射计算机化断层显像法(SPECT)是诊断横断层面的成像技术，其可以反映放射性核素标记的放射性示踪剂的位置和浓度)。虽然CT和MRI提供了关于肿瘤位置和范围的重要的解剖学信息，但这些成像模式不能够充分地区别来自水肿的侵害性损伤、辐射坏死、分级或神经胶质瘤病。PET和SPECT可以用于通过测定代谢活性来定位和表征肿瘤。
PET和SPECT提供了涉及细胞水平的信息的信息，例如细胞活力。在PET中，患者摄取或被注射发射正电子的轻度放射性的物质，该物质可以作为在体内移动的底物被监测。在一个普通的应用中，例如，给予患者带有正电子辐射体的葡萄糖，然后，当他们执行不同的任务时其脑部被监测。因为脑部在工作时会消耗葡萄糖，PET图像就会显示在哪里脑部活动最活跃。
与PET相近的是单光子发射计算机断层化显像法或SPECT。两者的主要区别在于SPECT不使用正电子发射物质，而使用发射高能量的光子的放射性的示踪物。SPECT对诊断冠状动脉疾病是有价值的，并且每年在美国已经有250万的SPECT心脏研究。
用于成像的PET放射性药物通常被正电子发射物如11C、13N、15O、18F、82Rb、62Cu和68Ga标记。SPECT放射性药物通常被正电子发射物如99mTc、201Tl和67Ga标记。关于脑成像，PET和SPECT放射性药物通过血脑屏障渗透性、脑部灌流和代谢受体结合以及抗原-抗体结合来分类(Saha等，1994)。血脑屏障SPECT试剂，例如99mTcO4-DTPA、201Tl和[67Ga]柠檬酸盐被正常脑细胞外排斥，但是因为改变了BBB而可进入肿瘤细胞。SPECT灌流试剂如[123I]IMP、[99mTc]HMPAO、[99mTc]ECD是亲脂性试剂，因此扩散到正常的脑部。重要的受体结合SPECT放射性药物包括[123I]QNE、[123I]IBZM和[123I]iomazenil。这些示踪物结合到特定的受体上，在评价受体相关的疾病上有重要作用。
c.计算机化断层显像法(CT)
计算断层显像法(CT)可作为本发明内容的一种成像模式。通过从不同的角度获取一系列的X-射线，有时多于一千，之后使用计算机将它们组合，CT使得构建身体的任何部分的三维图像成为可能。计算机被编程来显示任何深度和任何角度的二维层片。
在CT中，当最初的CT扫描不能诊断时，静脉注射辐射透不过的对照试剂可以帮助识别和描绘软组织团块。类似地，对照试剂帮助评价软组织或骨损伤的血管供应(vascularity)。例如，使用对照试剂可以帮助描绘肿瘤和邻近血管分布的关系。
CT对照试剂包括，例如，碘化对照介质。这些试剂的例子包括碘酞酸盐、碘海醇、泛影酸盐、碘帕醇、乙碘油和碘番酸盐。也已报道使用钆试剂作为CT对照试剂(参见，例如，Henson等，2004))。例如，已将马根维显试剂(gadopentate agents)用作CT对照试剂(Strunk and Schild，2004中被讨论)。
d.磁共振成像(MRI)
磁共振成像(MRI)是比CT更新的成像模式，其使用高强度的磁体和放射频率信号来产生图像。在生物组织中最丰富的分子种类是水。水质子核的量子力学上的“自旋”最终产生了在成像试验中的信号。在MRI中，将要成像的样品放置在强静态磁场中(1至12德斯拉)，使用放射频率(RF)辐射脉冲激发自旋而在样品中产生净磁化强度。然后在自旋上施加不同的磁场梯度和其它的RF脉冲来编码立体信息到记录的信号中。通过收集并分析这些信号，可以计算出三维的图像，与CT图像相似，通常以二维片层显示。
在MR成像中使用的对照试剂与在其它成像技术中使用的那些试剂不同。它们的目的是帮助区分有相同信号特征的组织成分和缩短驰豫时间(其将会在T1-加权的自旋回波MR成像上产生更强信号而在T2-加权的成像产生较不强的信号)。MRI对照试剂的例子包括钆螯合剂、锰螯合剂、铬螯合剂和铁粒子。
CT和MRI都提供有助于区分组织范围和血管结构的解剖学信息。与CT相比，MRI的缺点包括低的患者耐受性，与起搏器和其它植入的金属装置以及与多种原因相关的人造制品(更不用说其为移动的(Alberico等，2004)相冲突。相反，CT快速、耐受性良好且容易获得，但是与MRI相比有较低分辨率，并且需要碘化的对照物和离子化辐射(Alberico等，2004)。CT和MRI共同的缺点在于两个成像模式都不能提供细胞水平的功能信息。例如，两种成像模式都不能提供关于细胞活力的信息。
e.光学成像
关学成像是另一种成像模式，其已经在医学的特殊领域得到广泛接受。例子包括细胞成分的光学标记和血管造影术例如萤光素血管造影术和吲哚青绿血管造影术。光学成像试剂的例子包括，例如，萤光素、萤光素衍生物、吲哚青绿、奥列刚绿、奥列刚绿衍生物、若丹明绿、若丹明绿衍生物、曙红、赤藓红、德克萨斯红、德克萨斯红衍生物、孔雀石绿，纳米金硫代琥珀酰亚胺酯、瀑布蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶噁唑衍生物、瀑布黄染料、dapoxyl染料。
f.超声法
另一种获得广泛接受的生物医学成像模式是超声法。超声成像用于非侵袭性地提供机体软组织结构和血流信息的实时断面甚至三维的图像。高频的声波和计算机可以产生血管、组织和器官的图像。
对血流超声成像可受一些因素例如血管的大小和深度限制。相对近来的发展，超声对照试剂包括全氟代物和全氟代类似物，它们被设计通过增强灰阶图像(grey-scale image)和多普勒信号来克服这些限制。
2.二元成像过程
本发明的某些实施方案涉及使用包括测定来自成像部分-多肽-价金属离子复合物的第一个信号和第二个信号的双成像模式使个体中的位点成像的方法。第一个信号来自价金属离子，第二个信号来自成像部分。如上所述，该领域普通技术人员熟知的任何成像模式都可以用在本成像的方法的这些实施方案中。
成像模式可在给药包含诊断有效量的本发明的组合物的组合物过程中或其后任何时间实施。例如，成像研究可以在给药本发明的二元成像组合物时实施或在此后任何时间实施。在一些实施方案中，第一成像模式在给药双成像试剂的同时实施或在给药双成像试剂后约1秒、1小时、1天或任意长时间实施或在任何所述时间之间实施。
第二成像模式可以在第一成像模式的同时实施或在第一成像模式后的任意时间实施。例如，第二成像模式可以在第一成像模式完成后约1秒、约1小时、约1天或任意长时间实施或在任何所述时间之间实施。在本发明的某些实施方案中，第一和第二成像模式同时实施，以便它们在给药后同时开始。本领域普通技术人员将会熟知本发明预期的不同成像模式的实施。
该双成像方法的一些实施方案中，使用相同的成像设备实施第一成像模式和第二成像模式。在其它实施方案中，使用不同的成像设备来实施第二成像模式。本领域普通技术人员将会熟知可用于实施第一成像模式和第二成像模式的成像设备，并且熟练的人员将会熟知这些成像设备的使用以产生图像。
H.放射标记试剂
如上所述，本发明组合物的某些实施方案包括螯合在上述多肽上的价金属离子，其中，该价金属离子是放射性核素。本发明提供的放射标记试剂、化合物和组合物以具有合适量的放射性来提供。例如，在形成99mTc放射性复合物中，通常优选在含有放射性浓度大约0.01毫居里(mCi)至大约300mCi每mL的溶液中形成放射性复合物。
本发明提供的放射标记的成像试剂可用于在使哺乳动物体内的位点显像。根据本发明，该成像试剂通过本领域普通技术人员熟知的任何方法给药。例如，可通过一个单位的注射剂量供给药。本领域技术人员熟知的任何普通载体，例如无菌生理盐水溶液或血浆可以在放射标记后制备用于注射的本发明的化合物中使用。通常，单位给药剂量具有放射性大约0.01mCi至大约300mCi，优选10mCi至大约200mCi。单位剂量的用于注射的该溶液为大约0.01mL至10mL。
诊断有效量的本发明组合物经静脉给药后，可以进行成像。使个体例如器官或肿瘤中的位点成像可以，如果需要，在放射性标记的试剂被给药到患者之后数小时或更长时间内发生。在大多数情况下，给药剂量的足够量会在0.1小时内聚集在要成像的区域。如上所述，可以通过本领域普通技术熟知的任何方法进行成像。例子包括PET、SPECT和γ射线闪烁照相法。在γ射线闪烁照相法中，放射性标记物是发射γ射线的放射性核素，放射性示踪剂通过γ射线检测照相定位(这一过程通常是指γ闪烁照相法)。成像的位点是可检测的，原因是放射性示踪剂被选择或是位于病理位点上(称为阳性对照)或选择地该示踪剂被特定选择并不位于这样的病理位点上(称为阴性对照)。
I.试剂盒
本发明的某些实施方案中主要与用于制备成像试剂的试剂盒有关，其中，该试剂盒包括密封的容器，该容器中含有预定量的多肽，在该多肽序列中包括用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸；和足够量的还原剂，以在两个上述连续氨基酸的至少一个上螯合价金属离子。在其它实施方案中，用来制备成像试剂的试剂盒包括密封的容器，该容器中含有预定量的多肽，在该多肽序列中包括组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列和足够量的还原剂以将一个或多个价金属离子连接到多肽上。
本发明的试剂盒包括密封的小瓶，该小瓶中含有预定量的本发明的多肽和足够量的还原剂以用价金属离子标记化合物。在本发明的一些实施方案中，该试剂盒包括其为放射性核素的价金属离子。在又一些实施方案中，该放射性核素是99mTc。在本发明的又一些实施方案中，该多肽标记有第二部分，该第二部分是诊断部分、成像部分或治疗部分。
该试剂盒还可以包括常见的药物辅料例如，来调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲盐、防腐剂等。
在某些实施方案中，包括在组合物中的抗氧化剂用来防止螯合剂部分被氧化。在某些实施方案中，该抗氧化剂是维生素C(抗坏血酸)。然而，认为本领域普通技术人员熟知的任何其它的抗氧化剂，例如生育酚、维生素B6、硫胺素或紫槲皮甙也可以使用。该试剂盒的组份可以是液体、冷冻的或干燥的形式。在一个优选的实施方案中，试剂盒组份以冻干的形式提供。
该瞬时冷冻的试剂盒可当作商业化的产品。该瞬时冷冻的试剂盒通过添加高锝酸盐能够用于放射诊断的目的。该技术已知为“振荡和注射(shake and shoot)”法。放射性药物的制备时间将少于15分钟。同样的试剂盒也可以用不同的金属螯合以用于不同的成像应用。例如，铜-61(3.3小时半衰期)用于PET；钆用于MRI。冷冻试剂盒本身可以用作前体药物来治疗疾病。例如，试剂盒可被应用在组织特异性靶向成像和治疗中。
J.测定候选物质作为成像试剂有效性的方法
本发明还包括测定候选物质作为成像试剂有效性的方法，包括(a)获得候选物质；(b)将该候选物质缀合或螯合到其序列中包括用来结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽上；(c)将该候选物-多肽缀合物引入个体中；(4)测定来自候选物-多肽缀合物的信号，来判定候选物质作为成像试剂的有效性。
这些方法可以包含大量的候选物质的随机筛选；或者，该试验可用于集中筛选通过其结构特征用肉眼选择的有可能作为成像试剂起作用的特殊类型的候选物质。
起作用是指将上述候选物-多肽缀合物给药到个体后而可以测定来自待测定的候选物质的信号的能力。
为了鉴别候选物质作为成像试剂的有效性，通常是测定在存在和不存在候选物质时测量来自多肽的信号的能力来判断。
本领域普通技术人员熟知的任何成像模式，例如上面提及的成像部分，可用于测量来自候选物质-多肽缀合物信号。
当然，应明白尽管有效的成像试剂可能没有找到，本发明的所有筛选方法本身是有用的。本发明提供了筛选这些化合物的方法，而不仅仅是找到它们方法。
1.调节物
此处使用的术语“候选物质”是指任何可能具有成像试剂潜力的分子。该候选物质可能是蛋白或其片段、小分子或甚至是核酸分子。可以证明为以下情况：最有用的药理学化合物将会是那些结构上与已知成像试剂相关的化合物。使用先导化合物来帮助开发改良的化合物被认为是“合理化药物设计(ratiohal drug design)”，且不仅包括与已知的抑制剂和激活剂的比较，还包括与靶向分子结构相关的预测。
合理化药物设计的目的是产生已知成像试剂的结构类似物。通过产生这样的类似物，可能会形成比天然分子活性更高或稳定性更强的化合物，这些天然分子对变化有不同的易感性或可能影响不同其它分子的功能。在一种途径中，我们会形成靶向分子或其片段的三维结构。这可以通过X-射线晶体学、计算机模拟或通过两种途径的结合来完成。
也可以使用抗体来确定靶向化合物激活剂或抑制剂的结构。原则上，这种途径产生了可以基于其完成随后的药物设计的药(pharmacore)。可以通过对有功能的、药理学活性的抗体产生抗独特型的抗体可完全绕开蛋白晶体学。作为镜像的镜像，抗独特型的结合位点希望是原始抗原的类似物。于是该抗独特型可用于从化学或生物学的方法生成的肽库中鉴别和分离肽。然后所选择的肽可用作药。抗独特型可通过使用此处所描述的使用抗体作为抗原来生产抗体的方法来生产。
另一方面，在对有用化合物的“强力攻击(brute force)”鉴别的努力中，我们可以通过各种商业来源来获得小分子库，这些小分子库被认为符合候选物质的基本标准。通过产生第二、第三、第四代具有活性，而在其它情况下是不需要的化合物的化合物模型，组合途径也使其自身快速演变出有潜力的成像试剂。
候选物质可以包括天然存在化合物的片段或部分，或可以是作为已知非活性化合物的活性组合物发现的那些。由于存在有潜力的有用药物试剂，建议可测试从天然来源，例如动物、细菌、真菌、包括树叶和树皮的植物来源和海产样品中分离的化合物作为候选物。应该知道被筛选的药物试剂也可以从化学组合物或人造化合物中衍生或合成。因此，应该知道本发明鉴定的候选化合物可以是肽、多肽、聚核苷酸、小分子抑制剂或任何其它可以从已知抑制剂或激动剂起始的合理化药物设计而设计的化合物。
使用测试化合物对个体例如动物治疗包括将化合物以恰当的形式给药于动物。可以通过任何用于临床或非临床目的途径给药，例如通过气管滴注、支气管滴注、皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉注射。认为特殊的途径有系统性静脉注射、经血液或淋巴供给的局部给药或直接到受侵部位。
K.过增生性疾病
本发明的某方面涉及组合物，其中治疗的部分缀合到本发明的多肽-价金属离子螯合物上。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物可用于二元成像和治疗。在某些具体实施方案中，该治疗部分是已知或期望在治疗或预防个体的过增生性疾病中有益的试剂部分。该个体可以是动物，例如哺乳动物。在某些具体实施方案中，该个体是人。
在本发明的其它实施方案中，价金属离子是治疗性的价金属离子(例如Re-188、Re-186、Ho-166、Y-90、Sr-89和Sm-153)，而多肽-价金属离子螯合物是可应用于治疗和预防过增生性疾病的治疗试剂(而不是成像试剂)。
过增生性疾病在此处被定义为任何与异常细胞生长或异常细胞更新(turnover)有关的疾病。例如，过增生性疾病可以是癌症。此处所用的术语“癌”被定义为在组织中不能控制的进行性的细胞生长。技术人员知道其它存在的同义术语，例如瘤或恶性肿瘤或肿瘤。认为任何类型的癌可通过本发明的方法来治疗。例如，该癌症可以是乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴癌或白血病。在本发明的其它实施方案中，该癌症是转移性癌。
L.二元化疗和放疗(“放化疗”)
在本发明的某些实施方案中，本发明的组合物适于二元化疗和放疗(“放化疗”)。例如，此处所说的多肽可以螯合到为治疗性价金属离子的价金属离子上，以及为治疗部分第二部分(例如抗癌部分)上。
例如，该价金属离子可以是β射线辐射体。此处定义的β射线辐射体是发射任何范围β射线能量的任何试剂。β射线辐射体的例子包括Re-188、Re-186、Ho-166、Y-90和Sn-153。本领域普通技术人员会熟知用于治疗过增生性疾病，例如癌的这些试剂。
本领域普通技术人员会熟知可应用于本发明的化合物给药中的化疗方案和放疗方案的设计。如下所述，这些试剂可用于与其它旨在治疗过增生性疾病，例如癌症的治疗模式组合。另外，本领域普通技术人员会熟知筛选恰当剂量给药于个体。该方案可以包括单剂量或多剂量。使用本领域普通技术人员熟知的方案对患者进行毒性和对治疗的反应的监测。
M.药物制备
本发明的药物组合物包括治疗或诊断有效量的本发明的组合物。短语“药学或药理学可接受的”或“治疗有效的”或“诊断有效的”是指当适当地给药到个体例如人时不产生有害的、过敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。根据本发明的公开，如在这里引入以作参考的Remington’s PharmaceuticalSciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990所列举的，制备治疗有效的或诊断有效的组合物会本领域技术人员所熟知。另外，对动物(例如人)给药，需明确制备应当符合如FDA Officeof Biological Standards所要求的无菌、热原性、一般安全、纯度标准。
此处使用的“包括治疗有效量的组合物”或“包括诊断有效量的组合物”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗微生物剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染剂，类似这样的材料和它们的组合，本领域普通技术人员将会熟知它们。除了任何与活性成分不相容的常规载体，认为它们可用于本组合物中。
本发明组合物可以包括不同类型的载体，这取决于它们是以固体、液体还是气溶胶形式给药，以及是否如同注射给药途径那样需要灭菌。本发明的组合物可以通过下面的形式给药：静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、内部损伤地、颅内、关节内、前列腺内、向胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部地(topically)、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、局部地(topically)、局部地(locally)、注射、输注、连续输注、靶细胞定向集中灌注浴、经导尿管、经灌胃、以脂质组合物(例如，脂质体)或通过其它方法或任何前述方法的组合，这是被本领域普通技术熟知的。
本发明的组合物给药到患者实际所需要的剂量可以通过物理和生理因素，例如体重、严重程度、要成像的组织、被治疗的疾病类型、之前或后续的成像或治疗性介入、患者的特发症、以及给药途径等来决定。负责给药的从业者在任何情况下将确定在组合物中活性成分的浓度和给个体的合适剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可以包括例如，至少约0.1％的多肽-价金属离子螯合物。在其它实施方案中，活性复合物可以包括单位重量的大约2％至大约75％或大约25％至大约60％，例如，任何可从此导出的范围。在其它非限制性的例子中，剂量也可以包括每次给药大约0.1mg/kg/体重至大约1000mg/kg/体重或任何在此范围中的量或任何大于1000mg/kg/体重的量。
不管怎样，组合物可以包括不同的抗氧化剂来延缓一个或多个组分的氧化。另外，防止微生物的活动可以通过防腐剂例如不同的包括但并不仅限于对羟苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒或其组合的抗微生物剂和抗真菌剂来实现。
本发明的组合物可以以游离碱、中性或盐的形式配方。药物学可接受的盐包括从无机碱如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁；或有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因衍生的以游离羧基形成的盐。
在组合物是液体形式的实施方案中，载体可能是包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)和它们的组合的溶剂或分散介质。例如可以通过使用包衣如卵磷脂来保持适当的流动性；通过分散在载体里如液态多元醇或脂质中来保持所需的粒子大小；通过使用表面活化剂如羟丙基纤维素；或它们这样方法的组合来维持适当的流动性。在许多情况下，优选包括等渗试剂例如糖、氯化钠或它们的组合。
无菌可注射溶液可以使用技术如过滤除菌制备。通常，分散体通过将不同的灭菌活性成分混入到包括基本的分散介质和其它成分的灭菌容器内来制备。在用无菌粉末制备无菌注射溶液、混悬液或乳剂的情况下，制备的优选方法是真空干燥或冷冻干燥技术，该技术产生加入了任何来自其之前经无菌过滤的液体介质的另外需要的成分的活性成分的粉末。必要时，该液体介质应该被适当缓冲，并且该液体稀释剂在注射前首先用足够的盐或葡萄糖调等渗。认为还包括用于直接注射的高浓度组合物的制备，其中使用DMSO作为溶剂被认为可产生及其快速的渗透，导致高浓度的活性成分到达一个小的区域。
在生产和贮藏条件下该组合物必须是稳定的，并且防腐以预防微生物例如细菌和真菌的污染作用。内毒素的污染应该被保持在最低的安全水平，例如，低于0.5ng/mg蛋白。
在具体实施方案中，可通过在组合物中使用延迟吸收剂，譬如，例如，单硬脂酸铝、明胶或它们的组合带来可注射组合物的延迟吸收。
N.组合治疗
本发明的某些方面是关于包括多肽的组合物，该多肽包括为治疗部分的第二部分。在其它实施方案中，该多肽包作为治疗氨基酸序列的氨基酸序列。
这些组合物可与另一治疗试剂或治疗方法，优选另一癌症治疗，合用于治疗疾病例如癌症。可以分钟至周的间隔在另一种治疗方法之前或之后进行使用本发明的这些组合物的治疗。在给药另一种制剂的实施方案中，应该确保在每次投药的时间间隔内有效的时间期间并不过期，这样制剂仍然可以对细胞发挥有利的组合效果。例如，认为可基本上同时(例如，小于1分钟内)与本发明的组合物对一个体给药一种制剂的两、三、四或更多的剂量。另一方面，在给药治疗量的本发明组合物之前和/或之后的约1分钟至约48小时以上内，或在此处没有提及的任何时间之前和/或之后，给予治疗试剂或方法。在某些其它实施方案中，可在给予另一治疗模式例如外科手术或基因治疗之前和/或之后约1天至约21天内，给药本发明的组合物。然而，在某些情况下，为了有效治疗希望延长该时间，各给药之间数周(例如1至8周以上)过去了。
可以使用不同的组合，所要求的用于二元化疗和放疗试剂指定为“A”，第二试剂，其可以是任何其它治疗试剂或方法，为“B”：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
考虑到这些制剂的毒性(如果有的话)，将本发明的组合物给药到患者要遵循一般的化疗给药的方案。必要时希望重复治疗周期。不同的标准治疗以及外科介入可用于与描述的试剂组合应用。这些治疗包括但不仅限于追加化疗(additionalchemotheraphy)、追加放疗、免疫治疗、基因治疗和外科手术。
a.化疗
癌症治疗还包括各种与基于化学和放射的治疗两者的各种组合治疗。组合化疗包括例如顺铂(CDDP)、碳铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊甙(VP16)、三苯氧胺、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉酚、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲喋呤或上述物质的任何类似物或衍生物变体。
b.放疗
其它导致DNA损伤并且被广泛使用的因素包括通常熟知的γ-射线、X-射线和/或定向传递放射性同位素到肿瘤细胞。也包括其它形式的DNA损伤因素如微波和UV-照射。很可能所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复、染色体的组装和保持产生各种损伤。X-射线的剂量范围从长期(3至4周)日剂量50至200伦琴至单剂量2000至6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很大，这取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型以及瘤细胞的吸收。当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”用在此处来描述某过程，通过该过程，治疗构造和化疗或放疗试剂被传送到靶细胞或位于和靶细胞直接毗连的位置。为了实现细胞杀死或停滞，两种试剂以组合的有效剂量传递到细胞来杀死细胞或阻止它分裂。
c.免疫治疗
通常，免疫治疗依赖于免疫效应细胞和分子的使用来靶向和破坏癌细胞。该免疫效应物可以是例如肿瘤细胞表面某标记物的特异性抗体。抗体单独可以用作治疗效应物或者它可以募集(recruit)其它细胞来事实上完成细胞杀死。该抗体也可以缀合到药物或毒素(化疗的、放射性核苷、篦麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)上，且只用作靶向剂。或者，该效应物可以是载有与肿瘤细胞靶直接或间接作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
因此，免疫治疗可用作与基因治疗结合的组合治疗的一部分。通常的组合治疗的途径在下面讨论。通常，肿瘤细胞必须负荷某种易于被寻靶的标记物，即，不在大多数其它细胞上存在。在本发明的内容中，许多肿瘤标记物存在，并且它们中的任何都适合寻靶。普通的肿瘤标记物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿系肿瘤相关抗(urinary tumor associatedantigen)、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白、erb B和p155。
d.基因
在又一些实施方案中，第二治疗是基因治疗，其中在本发明的治疗试剂之前、之后或与之同时给药治疗组合物。传递治疗剂量的与编码基因产物的载体结合的本发明的组合物将对靶组织具有组合的抗过增生效果。
e.外科手术
接近60％患有癌症的患者将遭受某种类型的外科手术，其包括预防、诊断或肿瘤分类(staging)、治疗和缓解的手术。治疗的手术是与其它治疗例如本发明的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或其它治疗结合使用的癌症治疗。治愈的外科手术包括其中所有或一部分的癌组织被物理移除、切断和/或破坏的切除术。肿瘤切除术是指物理移除至少部分肿瘤。除肿瘤切除术外，外科手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(Mohs’手术)。此外，本发明可以与浅表癌(superficial cancer)、初癌或偶然量的正常组织的移除结合使用。
O.实施例
实施例1
用于雌激素受体-阳性表征的 99m Tc-GAP-雌二醇(EDL) 合成3-氨乙基雌二醇
将雌酮(1.47g，5.45mmol)溶解于乙醇中(50ml)。加入NaOEt(742mg，10.9mmol)和溴代乙腈(0.5ml，1.722g/ml，6.65mmol)。反应混合物加热回流24小时。将乙醇蒸干，加入乙酸乙酯(100ml)。混合物在分液漏斗中用水(100ml)洗涤。将有机层用硫酸镁干燥并过滤。在减压下蒸发乙酸乙酯，将固态产物在滤纸上用醚洗涤。3-乙腈雌二醇的产率为75％。将3-乙腈雌二醇(620mg，2mmol)溶解于THF(50ml)中。加入氢化铝锂(1M在THF中)，将反应混合物搅拌过夜。将溶剂蒸发，固体溶解于乙酸乙酯中并在分液漏斗中用水(100ml)洗涤。乙酸乙酯层用硫酸镁干燥并过滤。将溶剂蒸发。收集3-氨乙基雌二醇，产率为92％。99mTc-GAP-EDL的合成路线显示在图1中。其结构通过NMR光谱确定。
合成 99m Tc-谷氨酸肽-雌二醇(GAP-EDL)
通过添加2ml 2N的HCl，将谷氨酸肽的钠盐(GAP，500mg，MW 1500-3000)转化为酸的形式，之后使用截流分子量为1000的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)透析48小时。冷冻干燥后，将GAP酸(357.7mg，0.1589mmole)溶解于DMF(10ml)中。加入3-氨乙基雌二醇(502.5mg，1.59mmole)、二环己基碳二亚胺(327.54mg，1.59mmole)和4-N，N--二甲胺基吡啶(194mg，1.59mmol)。将该混合物在室温下搅拌2天。在高真空下将DMF蒸发后，在该混合物中加入2ml1N的碳酸氢钠。该混合物用截流分子量为1000膜透析48小时。将产物冷冻干燥，称重为508mg。GAP-EDL的结构由NMR光谱(图2)确定。UV光谱测定有30％的雌二醇缀合到了GAP上。
将99mTc-高锝酸盐(3.5mCi)(Syncor Pharmaceutical Inc.，Houston，TX)加入到含有冻干的GAP-EDL残余(5mg)和0.6ml水中的氯化锡(II)(SnCl2，100μg，0.53μmol)的小瓶中。产物使用PD-10柱(sephadex G-25，10ml)(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)纯化并使用PBS(5ml)洗涤脱。每1ml洗涤脱液收集在一个试管中。产物在管3-5中被分离，产率为3.0mCi(86％)。放射化学纯度通过Radio-TLC扫描仪(Bioscan，Washington，DC)，使用1M的醋酸铵∶甲醇(4∶1)作为洗涤脱液来评价。产物的纯度为97％。
体外细胞结合亲和性研究
本试验使用5种不同的细胞系。3种为乳腺癌细胞系(13762NF、MCF7和T47D)，2种为卵巢癌细胞系(对顺铂敏感和有抗性的)。简单描述为，将细胞(50000/孔)用20μl的雌酮(54μg/孔)或DMSO(对照)和99mTc-GAP-EDL(6μg/孔，1μCi/孔)处理。孵育0.5-4小时后，使用冰冷的PB S(1ml)洗涤细胞两次，再加入胰蛋白酶EDTA(0.1ml)。2分钟后，加入PBS(0.4ml)，将包含细胞的全部体积转移到试管中来计算活性。每个数据代表3次测量的平均值，并且该数据是作为添加的99mTc-GAP-EDL的吸收百分率来计算的。
与99mTc-GAP-EDL(对照)相比，使用雌酮处理的细胞中吸收降低了10-40％(图3)。99mTc-标记的GAP-雌二醇缀合物可以用雌酮或乙烯雌酚封阻(图3和图4)。使用ER(-)卵巢细胞系时，顺铂敏感性与顺铂抗性卵巢肿瘤细胞对99mTc-标记的雌二醇的吸收之间没有显著的区别(图5)。结果表明99mTc-GAP-EDL的细胞吸收为通过雌激素受体介导的过程。使用68Ga-GAP-EDL时观察到类似的发现(图6和图7)。
组织分布研究
12只雌性Fischer344大鼠(150±25g)(HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)(n＝3只大鼠/时间点)用衍生自RBA CRL-1747细胞系的乳腺肿瘤细胞接种(肌内注射)。该细胞在添加了Earle’s BSS(90％)和胎牛血清(10％)的Eagle’s MEM中培养。将肿瘤细胞(106细胞/大鼠)注射(肌内注射)到后腿上。移植14-17天后当肿瘤直径接近1cm时进行研究。
在组织分布研究中，将每只动物注射99mTc-GAP-EDL或99mTc-GAP(静脉注射，10μCi/大鼠，10μg/大鼠)。大鼠在0.5-4小时时处死。切出所选择的组织，称重并且使用γ射线计数器(Packard Instruments，Downers Grove，IL)计算放射性。计算示踪物在每一样品中的生物分布，以每克组织湿重的注射剂量的百分率(％ID/g)表示。
体内生物分布研究表明，在99mTc-GAP-EDL组中，随着作用时间，肿瘤-组织和子宫-组织的计数密度比增加(图8)。在4小时时，99mTc-GAP-EDL组中肿瘤-组织和子宫-组织的计数密度比明显高于在99mTc-GAP组中的(表3和4)。辐射剂量测定显示在表5中。
表3  99mTc-GAP在荷乳腺肿瘤大鼠中的生物分布(分子量750-3000)
每克组织重量的注射剂量％(n＝3/次，间隔，静脉注射)
Figure A20068001076000771
Figure A20068001076000781
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差
表4.99mTc-GAP-EDL在荷乳腺肿瘤大鼠中的生物分布
每克组织重量的注射剂量％(n＝3/次，间隔，静脉注射)
Figure A20068001076000782
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差
MIRDOSE(IBM PC VERSION 3.1-AUGUST 1995)
----------------------------------------------
表5.参考成年人的99mTc-GAP-EDL放射剂量估计
               总          剂量          初步             二次
靶器官                                          ％               ％
               mGy/MBq     rad/mCi       分布             分布
1)肾上腺素     8.24E-03    3.05E-02      肝脏   72.8％    肾     23.2％
2)脑           1.51E-05    5.60E-05      肝脏   74.2％    肺     10.0％
3)乳腺         1.08E-03    4.00E-03      肝脏   86.9％    肾     4.9％
4)胆囊壁       1.32E-02    4.87E-02      肝脏   91.0％    肾     8.2％
5)LLI壁        3.72E-04    1.38E-03      肝脏   53.3％    肾     39.0％
6)小肠         2.23E-03    8.24E-03      肝脏   72.0％    肾     25.2％
7)胃           3.20E-03    1.18E-02      肝脏   63.7％    肾     20.8％
8)ULI壁        3.22E-03    1.19E-02      肝脏   80.5％    肾     17.4％
9)心脏壁       4.00E-03    1.48E-02      肝脏   80.2％    心脏   9.7％
10)肾          4.08E-02    1.51E-01      肾脏   89.1％    肝     9.9％
11)肝脏        4.55E-02    1.68E-01      肝脏   98.1％    肾     1.7％
12)肺          3.91E-03    1.45E-02      肝脏   73.3％    肺     18.8％
13)肌肉        1.38E-03    5.10E-03      肝脏   75.0％    肾     18.7％
14)卵巢        7.34E-04    2.72E-03      肝脏   71.5％    肾     25.2％
15)胰腺        7.43E-03    2.75E-02      肝脏   71.4％    肾     17.7％
16)红骨髓      1.68E-03    6.20E-03      肝脏   68.3％    肾     26.9％
17)骨表面      2.25E-03    8.32E-03      肝脏   75.7％    肾     19.0％
18)皮肤        6.29E-04    2.33E-03      肝脏   79.1％    肾     15.9％
19)脾脏        1.66E-02    6.15E-02      脾脏   83.3％    肾     10.5％
20)睾丸        3.12E-05    1.16E-02      肝脏   69.3％    肾     26.2％
21)胸腺        1.00E-03    3.72E-03      肝脏   81.4％    心脏   6.0％
22)甲状腺      1.85E-03    6.86E-03      甲状腺 91.8％    肝     6.4％
23)膀胱壁      2.15E-04    7.95E-04      肝脏   74.6％    肾     23.0％
24)子宫        6.39E-04    2.36E-03      肝脏   70.9％    肾     26.5％
27)全身        2.78E-03    1.03E-02      肝脏   80.0％    肾     15.2％
   有效剂量当量
28)EFF DOSE    8.60E-03    3.18E-02      其余   86.7％    肺     5.5％
   EQUIV
   有效剂量
29)            4.37E-03    1.62E-02      肝脏   52.1％    肺     10.7％
   EFF DOSE
EDE和ED的单位是mSv/MBq或rem/mCi.
保留时间：
心脏Contents    1.90E-02hr
肾              7.35E-01hr
肝              3.83E+00hr
肺         5.50E-02hr
脾         1.65E-01hr
甲状腺     3.00E-03hrMIRDOSE 3.1
MIRDOSE    3.1 Source Files：
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MIRDO SE3.EXE
应用不同的分子量在0.5、2、5和24小时比较GAP(G)对GAP-DGAC(G-DG)的生物分布。
闪烁照相成像研究
使用来自Digirad(San Diego，CA)的安装有低能量平行孔瞄准仪的2020tc图像仪的γ照相机获得闪烁照相图像。该照相机视野范围是20cm×20cm，边缘为1.3cm。内在空间分辨率是3mm，矩阵(matrix)为64×64。安装有低能量、高分辨率的瞄准仪设备，该系统被设计为平面敏感度为至少125计数/分钟(cpm)/μCi及空间分辨率为7.6mm。
静脉注射99mTc-GAP-EDL和99mTc-EDTA后0.5-4小时分别进行闪烁照相成像。为了确定肿瘤吸收99mTc-GAP-EDL是否与雌激素受体相关，我们进行了阻断研究。每只大鼠在接受99mTc-GAP-EDL(300μCi/大鼠，静脉注射)前1小时用乙烯雌酚预处理(n＝3，10mg/kg，静脉注射)并在0.5-4小时成像。计算机描绘的所关注的区域(ROI)(每象素计数)用于测定肿瘤-背景的计数密度比。
肿瘤在0.5-4小时时可以被很好地看到(图9)。对0.5-4小时的图像ROI分析表明对99mTc-GAP-EDL和99mTc-EDTA的肿瘤-肌肉比分别为1.67-2.95和1.26-1.75。在阻断研究中，对99mTc-GAP-EDL和阻断组的肿瘤-肌肉比分别为1.98-2.39和1.21-1.63。在使用乙烯雌酚预处理的大鼠中有显著降低。结果表明肿瘤吸收99mTc-GAP-EDL是通过雌激素受体介导的过程。
合成GAP-17-EDL
除了3位GAP-EDL外，17位的雌二醇也缀合在GAP上。通过使雌酮与NaCN反应制备17-EDL-NH2。然后在四氢呋喃中用LiAlH4还原该腈类似物。将150mg的GAP(分子量1500-3000)溶解在5ml的无水DMF中。加入35.4mg的DCC和45mg的17-EDL-NH2。将该混合物在室温下搅拌过夜。减压下移去溶剂后加入10ml的水。使用0.8微米滤膜过滤水层。滤液使用MWCO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到165mg的白色粉末(GAP-17-EDL，产率85.8％)。合成路径显示在图10中。17EDL-NH2和GAP-EDL(17位)的质子NMR光谱证实了各自的结构。细胞对该17位GAP-EDL的吸收与3位GAP-EDL的吸收相似(图11A)。动物成像显示在图11B中。
实施例2
用于环氧化酶-2表征的 99m Tc-GAP-西乐葆(COXi)
合成COXi-OEt
将381.4mg(1.0mmol)西乐葆(BZF，4-[5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1-吡唑-1-基]-苯磺酰胺)和152.4mg(1.0mmol)DBU(1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯)溶解在10ml的氯仿中。滴加在5ml的氯仿中的129.1mg(1.0mmol)的异氰酸乙酸乙酯。该混合物在室温下搅拌3小时。溶剂在真空条件下蒸发，粗产物上硅胶填充柱(流动相：氯仿和甲醇梯度洗涤脱)。然后分离出产物(418.6mg，白色固体)(产率82％)。GAP-Coxi的合成路径显示在图12中。BZF和COXi-OEt的质子NMR证实了各自的结构。(图13)。
合成COXi-NH 2
将420.7mg的乙二胺(7.0mmol)加入到含有357.4mg(0.7mmol)COXi-OEt的6ml的乙醇中。将该混合物在室温下搅拌16小时。将溶剂蒸发。将该混合物溶解在10ml的氯仿中并用7ml的盐水洗涤两次。将氯仿层用无水硫酸镁干燥、过滤并蒸发。粗反应混合物381mg(粗产率103.8％)上硅胶填充柱并用氯仿和甲醇洗涤脱。得到COXi-NH2304.7mg(白色固体，产率83％)。质子NMR和质谱证实了其结构。
合成GAP-COXi
将353mg的GAP溶解在15ml的无水DMF中。加入25.0mg的DCC(二环己基碳二亚胺)和108mg的COXi-NH2，再在室温下搅拌过夜。在真空条件蒸发溶剂后，向粗产物中加入15ml的水。然后加入0.5N的碳酸氢钠调节pH到8。使用0.8微米的膜滤器过滤混合物，再透析(MW CO＜1000的膜)。经冷冻干燥机干燥后得到GAP-COXi(378mg，白色粉末，产率82.4％)。GAP-COXi的质子NMR光谱数据证实了其结构。
组织分布研究
12只雌性Fischer 344大鼠(150±25g)(HarlanSprague-Dawley，Indianapolis，IN)(n＝3只大鼠/时间点)用衍生自RBA CRL-1747细胞系的乳腺肿瘤细胞接种(肌内注射)。该细胞在添加了Earle’s BSS(90％)和胎牛血清(10％)的Eagle’s MEM中培养。肿瘤细胞(106细胞/大鼠)注射(肌内注射)到后腿上。移植14-17天后当肿瘤直径接近1cm时进行研究。
在生物分布研究中，每只动物用99mTc-GAP-COXi或99mTc-GAP注射(静脉注射，10μCi/大鼠，10μg/大鼠)。大鼠在0.5-4小时被处死。切出所选择的组织，称重并且使用γ射线计数器(Packard Instruments，Downers Grove，IL)计算放射性。计算示踪物在每种样品中的生物分布，以每克组织湿重的注射剂量的百分率(％ID/g)计算。
体内生物分布研究表明，在99mTc-GAP-COXi组中，随着作用时间，肿瘤-肌肉(血液)的计数密度比增加(图8)，并且比99mTc-GAP组数值高(表3和6)。
表6.99mTc-GAP-COX2i在荷乳腺肿瘤大鼠中的生物分布
每克组织重量的注射剂量％(n＝3/次，间隔，静脉注射)
Figure A20068001076000831
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差。
闪烁照相成像和放射自显影研究
静脉注射99mTc-GAP-COX2i(300μCi/大鼠，静脉注射)后0.5-4小时获得闪烁照相图像，0.5-4小时对荷乳腺肿瘤(衍生自RBA CRL-1747细胞系)的大鼠成像。通过定量图像分析仪(CycloneStorage Phosphor System，Packard，Meridian，CT)获得全身放射自显影照片。接着静脉注射99mTc-GAP-COX2i(100μCi/大鼠，静脉注射)，1小时时将在右腿上荷有人子宫肉瘤的无胸腺裸鼠杀死，其尸体被固定在羧甲基纤维素(3％)中。冷冻的尸体装在低温恒温器(LKB2250低温切片机)上，并被切成100μm的冠状切片。将每个切片解冻并装在载玻片上。该载玻片与多功能磷感屏成像系统(MP，7001480)接触并保露16小时。肿瘤在0.5-4小时时可以被很好地看到(图14)。在放射自显影图中也有同样的发现。
实施例3
用于拓扑异构酶表性的 99m Tc-GAP-阿霉素(DOX)
合成GAP-DOX
将112.5mg的GAP(分子量1500-3000)溶解在10ml的无水DMF中。加入51.6mg的DCC(二环己基碳二亚胺)和33.8mg的DOX(盐酸阿霉素)，再在室温下搅拌过夜。真空下蒸发溶剂。然后加入5ml的水和0.7ml的1N的碳酸氢钠。水层的pH为7.0。使用0.8微米的膜滤器过滤混合物并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到139mg的红色粉末(GAP-DOX，产率79.1％)。
用不同阿霉素浓度由485-490nm的UV观察值得到标准曲线。GAP-DOX组合物中含有72％的GAP和28％的DOX。其合成路径和质子NMR显示在图15中。
体外细胞结合亲和性研究
2种不同的细胞系用于分析：乳腺癌(13762NF)和肺癌细胞系。简单而言，将细胞(50000/孔)用20μl的99mTc-GAP-DOX或GAP(对照)(6μg/孔，1μCi/孔)处理。孵育0.5-4小时后，使用冰冷的PBS(1ml)洗涤细胞两次，加入胰蛋白酶EDTA(0.1ml)。2分钟后，加入PBS(0.4ml)，将包含细胞的全部体积转移到试管中来计算活性，每个数据代表3次测量的平均值，并且该数据作为添加的99mTc-GAP-DOX的吸收百分率来计算。99mTc-标记的GAP和GAP-DOX的细胞吸收之间没有显著的区别(图16)。
实施例4
用于糖酵解表征的 99m Tc-GAP-糖
合成GAP-DG(单糖)
湿法：将225mg的GAP(盐型，分子量1500-3000)溶解在2ml水中。边搅拌边加入65.1mg的S-NHS(1-羟基-2，5-双氧-3-吡咯烷磺酸，单钠盐水合物)和0.4ml的1N的氢氧化钠溶液。加入21.6mg的DG(盐酸葡糖胺)和57.5mg的EDAC(1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)并在室温下搅拌过夜。使用0.8微米的膜滤器过滤反应混合物并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到215mg白色粉末(GAP-DG，产率89.2％)。
干法：将225mg的GAP(分子量1500-3000)溶解在15ml的无水DMF中。加入62mg的DCC和21.6mg的DG，在室温下搅拌过夜。减压下去除溶剂后，加入5ml的水。使用0.8微米的膜滤器过滤水层并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到195mg的白色粉末(GAP-DG，产率80.9％)。GAP-DG的合成方案和质子NMR数据显示在图17中。
合成GAP-GAL(单糖)
湿法：将225mg的GAP(盐型，分子量1500-3000)溶解在2ml水中。边搅拌边加入65.1mg的S-NHS(1-羟基-2，5-双氧-3-吡咯烷磺酸，单钠盐水合物)和0.4ml的1N的氢氧化钠溶液。加入21.6mg的GAL(盐酸半乳糖胺)和57.5mg的EDAC(1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)并在室温下搅拌过夜。使用0.8微米的膜滤器过滤混合物并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到165.7mg的白色粉末(GAP-GAL，产率68.7％)。
干法：将225mg的GAP(分子量1500-3000)溶解在15ml的无水DMF中。加入68.9mg的DCC和60mg的GAL，在室温下搅拌过夜。减压下除去溶剂后，加入10ml的水。使用0.8微米的膜滤器过滤水层并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到174.6mg的白色粉末(GAP-GAL，产率71.3％)。GAP-GAL的合成方案和质子NMR数据显示在图18中。
合成GAP-DGAc(单糖)
干法：将100mg的GAP(酸型，分子量750-3000)加入到1.2ml的无水DMF和1ml的DMSO中。加入65.6mg的DCC、43.9mg的DMAP和101.2mg的四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖(0.29mmol)，再在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发除去溶剂后，加入5ml的NaHCO3(1N)。使用0.8微米的膜滤器过滤混合物并使用MW CO＜500的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到297.6mg的白色粉末(GAP-DGAc，盐型)。不同分子量的GAP-DGAc(表7-12)的结构、体外细胞吸收和体内生物分布和成像研究显示在图19-24中。
表7.在0.5、2、5和24小时的％ID/g比较
          肝脏                肾脏             肿瘤                  血液
G(5-20)   3.4、3.5、2.9、-    10、13、12、-    0.5、0.4、0.3、-      1.7、0.9、0.6、-
G-DG-6    7、6、6、4          8、10、10、6     0.4、0.3、0.1、0.1    0.9、0.4、0.2、0.1
G-DG-1    4、3.5、3.5、2      8、12、14、8     0.4、0.2、0.2、0.1    0.8、0.3、0.3、0.1
G-DG-20   3、3、3、1.7        14、19、17、11   0.4、0.2、0.2、0.1    0.9、0.3、0.2、0.1
G-DG
          6、6、5、3          7、10、9、6      0.4、0.3、0.2、0.2    1.2、0.5、0.3、0.1
(5-20)
表8.计数密度比较
                肿瘤/肌肉         肿瘤/血液
G(5-20)         4、6、6、-        0.3、0.4、0.5、-
G-DG-6          4、6、8、7        0.4、0.6、0.7、0.9
G-DG-10         4、7、9、8        0.5、0.6、0.7、1.2
G-DG-20         3、6、7、6        0.5、0.7、0.6、0.9
G-DG            5、8、9、13       0.3、0.5、0.8、1.6
(5-20)
说明：
1.GAP(5-20，分子量750-3000)组只有3个时间点0.5、2和4小时。
2.与单独GAP相比，当与糖缀合时血液背景降低。
3.较高分子量具有较低的肝吸收。这可能由于更多的糖部分缀合在分子上。缀合率通过元素分析测定为52％(w/w)。
4.与6、10和20相比，带有10个氨基酸的GAP-DGAC具有最好的价值。
表9.99mTc-GAP在荷乳腺肿瘤大鼠中的生物分布(分子量750-3000)
每克组织重量的注射剂量％(n＝3/次，间隔，静脉注射)
Figure A20068001076000871
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差。
表10.99mTc-GAP-DGAC在荷乳腺肿瘤大鼠中的生物分布(分子量750-3000)
Figure A20068001076000881
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差。
表11.99mTc-GAP6-DGAC在荷乳腺肿瘤大鼠的生物分布(分子量900)
每克组织重量的注射剂量％(n＝3/次，间隔，静脉注射)
Figure A20068001076000891
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差。
表12.99mTc-GAP10-DGAC在荷乳腺肿瘤大鼠中的生物分布(分子量900)
每克组织重量的注射剂量％(n＝3/次，间隔，静脉注射)
Figure A20068001076000892
Figure A20068001076000901
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差。
Figure A20068001076000902
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差。
合成GAP-LAS(二糖)
制备LAS-NH2：将购自Pierce Chemical Company的100mgLAS-NHS(单(乳酰氨基)单(琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)溶解在0.6ml的盐水中。加入101.1mg乙二胺并在室温下搅拌过夜。使用0.8微米的膜滤器过滤反应混合物并使用MW CO＜500的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到71.9mg的白色粉末(LAS-NH2，产率79.3％)。
合成GAP-LAS：在室温下搅拌过夜下向15ml无水DMF的GAP(分子量1500-3000)溶液中加入23.1mg的DCC和50.3mg的LAS-NH2。使用0.8微米的膜滤器过滤水层并用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到197.6mg的白色粉末(GAP-LAS，产率91.4％)。LAS-NH2和GAP-LAS的合成路径显示在图25中，质子NMR数据证实了其结构。
合成GAP-HCD(多糖)
干法：将203mg的GAP(酸型，分子量750-3000)加入到7ml的DMSO中。加入73.5mg的DCC、39.2mg的DMAP和419.8mg的羟丙基-β-环糊精(0.29mmol)，再在室温下搅拌过夜。减压下去除溶剂后，加入5ml的NaHCO3(1N)。使用0.8微米的膜滤器过滤混合物并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到197.1mg的白色粉末(GAP-HCD，盐型)。
体外细胞吸收研究
将2种不同的细胞系用于分析。它们是乳腺癌(13762NF)和卵巢癌(对顺铂敏感或抗性)细胞系。简而言之，将细胞(50000/孔)用20μl的99mTc-GAP-糖(GAL、LAS或HCD)或GAP(对照)(100μg/孔，1-2μCi/孔)处理。孵育0.5-4小时后，使用冰冷的PBS(1ml)洗涤细胞两次，加入胰蛋白酶EDTA(0.1ml)。2分钟后，加入PBS(0.4ml)，将包含细胞的全部体积转移到试管中来计算活性，每个数据代表3次测量的平均值，并且作为添加的99mTc-GAP的吸收百分率来计算。99mTc-GAP-GAL组的吸收更高(图26)，但是99mTc-标记的GAP和GAP-LAS的细胞吸收之间没有显著性区别(图27和图28)。GAP-HCD的吸收高于FDG(图29)。
组织分布研究
12只雌性Fischer 344大鼠(150±25g)(n＝3只大鼠/时间点)用衍生自RBA CRL-1747细胞系的乳腺肿瘤细胞接种(肌内注射)。该细胞在添加了Earle’s BSS(90％)和胎牛血清(10％)的Eagle’sMEM中培养。将肿瘤细胞(106细胞/大鼠)注射(肌内注射)到后腿上。移植14-17天后当肿瘤直径接近1cm时进行研究。
在组织分布研究中，每只动物被注射99mTc-GAP-LAS或99mTc-GAP(静脉注射，10μCi/大鼠，10μg/大鼠)。大鼠在0.5-4小时处死。切出所选择的组织，称重并且使用γ射线计数器计算放射性。示踪物在每种样品中的生物分布，以每克组织湿重的注射剂量的百分率(％ID/g)计算。
体内生物分布研究表明，99mTc-GAP-LAS组中的肿瘤-肌肉(血液)计数密度比与99mTc-GAP中的相似(表3和13、图30和图31)。结果建议进一步评价不同类型的糖。
表13.99mTc-GAP-LAS在荷乳腺肿瘤大鼠中的生物分布
每克组织重量的注射剂量％(n＝3/次，间隔，静脉注射)
Figure A20068001076000931
显示的值表示3只动物数据的平均值±标准偏差。
闪烁照相成像和放射自显影研究
静脉注射99mTc-GAP-LAS或GAP-HCD(300μCi/大鼠，静脉注射)后0.5-4小时获得闪烁照相的图像，0.5-4小时对荷乳腺肿瘤(由RBA CRL-1747细胞系衍生)的大鼠成像。通过定量图像分析仪(Cyclone Storage Phosphor System，Packard，Meridian，CT)获得全身放射自显影照片。静脉注射99mTc-GAP-GAL或GAP-LAS(100μCi/大鼠，静脉注射)后，在1小时将在右腿上荷有人子宫肉瘤的无胸腺裸鼠杀死，将其尸体固定在羧甲基纤维素(3％)中。将冷冻的尸体装在低温恒温器(LKB 2250低温切片机)上，并被切成100μm的冠状切片。将每个切片解冻并装在载玻片上。该载玻片与多功能磷感屏成像系统(MP，7001480)接触并暴露16小时。99mTc-GAP-LA S或GAP-HCD组的肿瘤在0.5-4小时时均可以被很好地看到。在放射自显影图中，单糖和二糖也显示同样的结果。
实施例5
用于叶酸受体表征的 99m Tc-GAP-叶酸盐(FOL)
合成GAP-FOL
将200mg的GAP(分子量1500-3000)溶解于10ml的无水DMF中。加入128mg的DCC和60mg的FOL-NH2(Ilgan et al.，1998a)，在室温下搅拌过夜。减压下去除溶剂后，加入15ml的水。使用0.8微米的膜滤器过滤水层并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到207mg的黄色粉末(GAP-FOL，产率80.3％)。合成路径显示在图32中。质子NMR证实了其结构。
实施例6
用于缺氧表征的 99m Tc-GAP-甲硝唑(MN)
合成GAP-MN
向150mg GAP(分子量1500-3000)在10ml无水DMF和70.4mg DCC中的溶液中，加入70.4mg的MN(1-(2-氨乙基)-2-甲基-5-硝基咪唑二盐酸盐一水合物)，在室温下搅拌过夜下加入1N的氢氧化钠溶液。减压下去除溶剂后，使用0.8微米的膜滤器过滤水层并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到130.6mg的棕色粉末(GAP-MN，产率64.5％)。合成路径显示在图33中。质子NMR证实了其结构。
放射自显影研究
通过定量图像分析仪(Cyclone Storage Phosphor System，Packard，Meridian，CT)获得全身放射自显影照片。静脉注射99mTc-GAP-MN或GAP(100μCi/大鼠，静脉注射)后，在1小时将右腿上荷有人子宫肉瘤的无胸腺裸鼠杀死，将其身体固定在羧甲基纤维素(3％)中。将冷冻的尸体装在低温恒温器(LKB 2250低温切片机)上，并被切成100μm的冠状切片。将每个切片解冻并装在载玻片上。该载玻片与多功能磷感屏成像系统(MP，7001480)接触并暴露16小时。99mTc-GAP-MN组肿瘤在0.5-4小时时可以被很好地看到(图14)。
实施例7
用于抗叶酸盐表征的 99m Tc-GAP-氨甲喋呤(MTX)
合成GAP-MTX
向150mg GAP(分子量1500-3000)在10ml无水DMF和93mgDCC中的溶液中，加入45mgMTXNH2(Ilgan et al.，1998b)，在室温下搅拌过夜。减压下蒸发溶剂后，加入10ml水和1N的氢氧化钠溶液1ml。使用0.8微米的膜滤器过滤水层并使用MWCO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到139mg的黄色粉末(GAP-MTX，产率72.3％)。合成路径显示在图34中。质子NMR证实了其结构。
体外细胞吸收研究
本试验使用乳腺(13762NF)细胞系。简而言之，将细胞(50000/孔)用20μl的99mTc-GAP-MTX或GAP(对照)(100μg/孔，1-2μCi/孔)处理。孵育0.5-4小时后，使用冰冷的PBS(1ml)洗涤细胞两次，加入胰蛋白酶EDTA(0.1ml)。2分钟后，加入PBS(0.4ml)，将包含细胞的全部体积转移到试管中来计算活性，每个数据代表3次测量的平均值，并且该数据作为添加的99mTc-GAP的吸收百分率来计算。在99mTc-GAP-MTX组的吸收高于99mTc-GAP组(图16)。
实施例8
用于脂质代谢成像的 99m Tc-GAP-亚麻酸盐和三甲基赖氨酸
制备亚麻酸-NH2
将793.3mg的乙二胺(13.2mmol)加入到含有亚麻酸1.2ml(4mmol)、DCC(1.65g，8mmol)，NHS(1.224g，8mmol)和DMAP(0.325g，4mmol)的10ml的氯仿中。将该混合物在室温下搅拌16小时。将溶剂蒸发。将该混合物溶解在10ml的氯仿中并用7ml的盐水洗涤两次。将氯仿层用无水硫酸镁干燥，过滤并蒸发。粗反应混合物重2.57g(粗产率100％)。该产物没有进一步纯化用于缀合试验。
合成GAP-亚麻酸盐
在含有300mg的GAP(分子量1500-3000，0.133mmol)的15ml无水DMF中，加入275mg的DCC(1.33mmol)和85mg的亚麻酸-NH2(0.133mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂。在所得到的混合物中加入NaOH(0.5N)以调节pH到9-10。使用0.8微米的膜滤器过滤溶液并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到317.5mg的白色粉末(GAP-亚麻酸盐)。
合成GAP-三甲基赖氨酸(TML)
在含有83mg的GAP(分子量2250，0.036mmol)的5ml的无水DMF中，加入32.6mg的DCC(0.158mmol)、19.03mg的DMAP(0.156mmol)和25mg的TML(0.132mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜。在真空下蒸发溶剂。在所得到的混合物中加入NaHCO3(0.5ml，1N)以调节pH到8。使用0.8微米的膜滤器过滤溶液并使用MW CO＜1000的膜透析。经冷冻干燥机干燥后得到89.8mg的白色粉末(GAP-TML，产率84％)。在大鼠中，肿瘤可以被很好地看到(图35-36)。
实施例9
用于增殖表征的 9m Tc-GAP-腺苷(ADN)
合成GAP-ADN
将330.8mg的GAP(分子量1500-3000)溶解在15ml的无水DMF中。加入60.7mg的DCC(二环己基碳二亚胺)和43.3mg的3’-氨基-3’脱氧-N6，N6-二甲基腺苷(ADN)，将该混合物在室温下搅拌过夜。减压下去除溶剂后，加入10ml的水。使用0.8微米的膜滤器过滤该混合物并使用MW CO＜1000的膜透析。得到290mg的白色粉末(GAP-AND，产率78.1％)。该合成路径显示在图37中。质子NMR证实了其结构。肿瘤可以在大鼠中很好地看到。
根据本公开，不通过过度的实验方法，可以进行和完成此处所公开和要求的组合物和方法。尽管本发明的组合物和方法已经以优选的实施方案描述，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，将变化而应用于此处所描述的组合物和方法以及过程或过程的次序中，对本领域技术人员来说是显而易见的。更具体地，显然某些化学和生理学相关的试剂都可替代此处描述的试剂，而可获得相同或相似的结果。认为对本领域技术人员而言显而易见的所有这样相似的替代和改变都是在所附的权利要求限定的发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
通过参考特别引入以下参考文献，其在一定程度上对在此所列内容提供示例性的方法或其他详细补充。
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序列表
<110>杨敬文(YANG，DAVID J.)
于东防(YU，TONY DONG-FANG)
欧昌顺(OH，CHANG SOK)
萨迪·科汗尼(KOHANIM，SAADY)
金义信(KIM，E.EDMUND)
阿里·啊兹哈瑞尼亚(AZHDARINIA，ALI)
<120>多(肽)作为螯合剂：制造和使用方法
<130>UTF C：910WO
<140>未知
<141>2006-03-31
<140>60/667,815
<141>2005-04-01
<160>3
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>1
Gly Gly Gly Gly Ser
1                5
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>2
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
 1              5           10
<210>3
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
<400>3
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1               5                   10                   15
Leu Asp

Claims (100)

1.一种组合物，其包含：
a)多肽，在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸；和
b)一个或多个非共价结合到该两个连续氨基酸的至少一个上的价金属离子。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，该两个或更多连续氨基酸选自由天冬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸类似物、谷氨酸类似物、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸、鸟氨酸和含有2个或更多羧基的非天然存在的氨基酸组成的组中。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，该两个或更多连续氨基酸为谷氨酸残基。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，该两个或更多连续氨基酸为天冬氨酸残基。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，该多肽包含至少2个连续谷氨酸残基。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，该多肽包含至少5个连续谷氨酸残基。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，该多肽包含至少10个连续谷氨酸残基。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，该多肽包含至少20个连续谷氨酸残基。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中，该多肽包含至少50个连续谷氨酸残基。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，该多肽的分子量为300至30000。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，该多肽的分子量为750至9000。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中，该多肽包含至少2个连续天冬氨酸残基。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，该多肽包含至少5个连续天冬氨酸残基。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中，该多肽包含至少10个连续天冬氨酸残基。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中，该多肽包含至少20个连续天冬氨酸残基。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中，该多肽包含至少50个连续天冬氨酸残基。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中，该多肽的分子量为300至30000。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中，该多肽的分子量为750至9000。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中，该多肽能够通过配位到谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸类似物或天冬氨酸类似物的羧基部分而螯合3至5个价金属离子。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中，该价金属离子为放射性核素。
21.根据权利要求1所述的组合物，其中，该价金属离子为选自由Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、In-111、Tl-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212、Bi-213、Fe-56、Mn-55、Lu-177、成键铁离子、成键锰离子、成键钴离子、成键铂离子和成键铑离子组成的组中。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，该金属离子为Tc-99m。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中，该金属离子为Re-188。
24.根据权利要求21所述的组合物，其中，该金属离子为Ga-68。
25.根据权利要求1所述的组合物，进一步被定义为包含键合到该多肽上的第二部分。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中，该第二部分以酰胺键或酯键键合到该多肽的羧基部分上。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中，该第二部分为组织靶向部分、诊断部分或治疗部分。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中，该组织靶向部分为靶向配体。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中，该组织靶向配体为疾病细胞周期靶向化合物、抗代谢物、生物还原剂、信号传导治疗剂、细胞周期特异性试剂、肿瘤血管发生靶向配体、肿瘤编程性细胞死亡靶向配体、疾病受体靶向配体、基于药物的配体、抗微生物剂、肿瘤缺氧靶向配体、拟葡萄糖试剂、氨磷汀、血管生成抑制素、EGF受体配体、单克隆抗体C225、单克隆抗体CD31、单克隆抗体CD40、卡培他滨、COX-2抑制剂、脱氧胞苷、富勒烯、赫赛汀、人血清白蛋白、乳糖、促黄体生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙立度胺、转铁蛋白或三甲基赖氨酸。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中，该多肽包含5至60个连续谷氨酸残基，其中的靶向配体为雌二醇、半乳糖、乳糖、环糊精、秋水仙碱、氨甲喋呤、紫杉醇、阿霉素、西乐葆、甲硝唑、腺苷、喷昔洛韦、肉碱、雌二醇(3位)、雌二醇(17位)、亚麻酸、葡糖胺、甘露糖四乙酸盐或叶酸盐，其中，价金属离子是99mTc。
31.根据权利要求27所述的组合物，其中，该诊断部分为成像部分。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中，该成像部分为对照介质。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中，该对照介质选自由CT对照介质、MRI对照介质、光学对照介质和超声对照介质组成的组中。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中，该对照介质为CT对照介质。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中，该CT对照介质选自由碘酞酸盐、碘海醇、泛影酸盐、碘帕醇、乙碘油和碘番酸盐组成的组中。
36.根据权利要求33所述的组合物，其中，该对照介质为MRI对照介质。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中，该MRI对照介质为选自钆螯合物、锰螯合物、铬螯合物和铁粒子组成的组中。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中，该MRI对照介质为Gd-DOTA、Mn-DPDP或Cr-DEHIDA。
39.根据权利要求33所述的组合物，其中，该对照介质为光学对照介质。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中，该光学对照介质为选自由萤光素、萤光素衍生物、吲哚青绿、奥列刚绿、奥列刚绿衍生物、若丹明绿、若丹明绿的衍生物、曙红、赤藓红、德克萨斯红、德克萨斯红的衍生物、孔雀石绿、纳米金硫代琥珀酰亚胺酯、瀑布蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶噁唑衍生物、瀑布黄染料和dapoxyl染料组成的组中。
41.根据权利要求33所述的组合物，其中，该对照介质为超声对照介质，其为超声全氟化对照介质。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中，该超声全氟化对照介质为选自由全氟代物或全氟代物的类似物组成的组中。
43.根据权利要求27所述的组合物，其中，该第二部分为治疗部分。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中，该治疗部分为抗癌部分。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中，该抗癌部分选自由能够螯合治疗性的放射性金属物质的螯合剂、氨甲喋呤、表鬼臼毒、长春新碱、多西紫杉醇、紫杉醇、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、拓扑替康、博来霉素、吉西他滨、氟达拉滨和5-FUDR组成的组中。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中，该抗癌部分为氨甲喋呤。
47.根据权利要求44所述的组合物，其中，该抗癌部分为选自由Re-188、Re-186、Ho-166、Y-90、Sr-89、Sm-153组成的组中的治疗性的放射性金属物质。
48.根据权利要求44所述的组合物，其中，该抗癌部分为能够螯合选自由砷、钴、铜、硒、铊和铂组成的组中的治疗性金属的物质。
49.根据权利要求1所述的组合物，其中，该非共价连接到该多肽上的价金属离子可以使用PET或SPECT成像。
50.一种组合物，其包含：
a)多肽，在其序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列；和
b)连接到该多肽的氨基酸残基上的价金属离子。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中，该多肽包含两个或更多连续谷氨酸残基。
52.根据权利要求50所述的组合物，其中，该多肽包含两个或更多连续天冬氨酸残基。
53.根据权利要求50所述的组合物，其中，该多肽包含5至60个连续谷氨酸残基。
54.根据权利要求50所述的组合物，其中，该多肽包含5至60个连续天冬氨酸残基。
55.根据权利要求50所述的组合物，其中，该价金属离子为放射性核素。
56.根据权利要求50所述的组合物，其中，该价金属离子为选自由Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、In-111、Tl-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212、Bi-213、成键铁离子、成键锰离子、成键钴离子、成键铂离子或成键铑离子组成的组中。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中，该价金属离子为Tc-99m。
58.根据权利要求50所述的组合物，其中，该组织靶向氨基酸序列为靶向配体。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中，该靶向配体为疾病细胞周期靶向化合物、抗代谢物、生物还原剂、信号传导治疗制剂、细胞周期特异性制剂、肿瘤血管发生靶向配体、肿瘤编程性细胞死亡靶向配体、疾病受体靶向配体、基于药物的配体、抗微生物剂、肿瘤缺氧靶向配体、拟葡萄糖试剂、氨磷汀、血管生成抑制素、EGF受体配体、单克隆抗体C225、单克隆抗体CD31、单克隆抗体CD40、卡培他滨、COX-2抑制剂、脱氧胞苷、富勒烯、赫赛汀、人血清白蛋白、乳糖、促黄体生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙立度胺、转铁蛋白或三甲基赖氨酸。
60.根据权利要求50所述的组合物，其中，该诊断氨基酸序列为成像氨基酸序列。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中，该成像氨基酸序列为选自由CT对照介质、MRI对照介质、光学对照介质和超声对照介质组成的组中的对照介质。
62.根据权利要求50所述的组合物，其中，该治疗氨基酸序列为抗癌氨基酸序列。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中，该抗癌氨基酸序列能够螯合选自由砷、钴、铜、硒、铊和铂组成的组中的治疗性金属。
64.一种合成成像试剂的方法，其包括：
a)获得多肽，在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸；和
b)将所述多肽与一个或多个价金属离子以及还原剂混合，来获得价金属离子标记的多肽，其中，一个或多个价金属离子非共价连接到该两个连续氨基酸的至少一个上。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，该还原剂为连二亚硫酸盐离子、亚锡离子或亚铁离子。
66.根据权利要求64所述的方法，其中，该多肽包含5至60个连续谷氨酸残基。
67.根据权利要求64所述的方法，其中，该多肽包含5至60个连续天冬氨酸残基。
68.根据权利要求64所述的方法，其中，该多肽能够通过到配位到谷氨酸、天冬氨酸、或它们的类似物的羧基部分而螯合3至5个价金属离子。
69.根据权利要求64所述的方法，其中，该价金属离子为选自由Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、In-111、Tl-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212、Bi-213、成键铁离子、成键锰离子、成键钴离子、成键铂离子或成键铑离子组成的组中。
70.根据权利要求69所述的方法，其中，该金属离子为Tc-99m。
71.根据权利要求64所述的方法，其中，该多肽进一步定义为包含键合到多肽上的第二部分。
72.根据权利要求71所述的方法，其中，该第二部分以酰胺键或酯键键合到多肽的羧基部分上。
73.根据权利要求71所述的方法，其中，该第二部分为组织靶向部分、诊断部分或治疗部分。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，该组织靶向部分为靶向配体。
75.根据权利要求74所述的方法，其中，该靶向配体为疾病细胞周期靶向化合物、抗代谢物、生物还原剂、信号传导治疗制剂、细胞周期特异性试剂、肿瘤血管发生靶向配体、肿瘤编程性细胞死亡靶向配体、疾病受体靶向配体、基于药物的配体、抗微生物剂、肿瘤缺氧靶向配体、拟葡萄糖试剂、氨磷汀、血管生成抑制素、EGF受体配体、单克隆抗体C225、单克隆抗体CD31、单克隆抗体CD40、卡培他滨、COX-2抑制剂、脱氧胞苷、富勒烯、赫赛汀、人血清白蛋白、乳糖、促黄体生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙立度胺、转铁蛋白或三甲基赖氨酸。
76.根据权利要求64所述的方法，进一步定义为合成用于成像和化疗的试剂的方法。
77.根据权利要求64所述的方法，进一步定义为合成用于二元成像的试剂的方法。
78.根据权利要求77所述的方法，其中，该成像为PET、SPECT、MRI、CT或光学成像。
79.一种合成成像试剂的方法，其包括：
a)获得多肽，在其序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列；和
b)将所述多肽与一个或多个价金属离子以及还原剂混合，来获得价金属离子标记的多肽。
80.根据权利要求79所述的方法，其中，该还原剂为连二亚硫酸盐离子、亚锡离子或亚铁离子。
81.根据权利要求79所述的方法，其中，该多肽包含5至60个连续谷氨酸残基。
82.根据权利要求79所述的方法，其中，该多肽包含5至60个连续天冬氨酸残基。
83.根据权利要求79所述的方法，其中，该价金属离子为选自由Tc-99m、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Cu-67、In-111、Tl-201、Ga-67、Ga-68、As-72、Re-186、Re-188、Ho-166、Y-90、Sm-153、Sr-89、Gd-157、Bi-212、Bi-213、成键铁离子、成键锰离子、成键钴离子、成键铂离子或成键铑离子组成的组中。
84.根据权利要求83所述的方法，其中，该金属离子为Tc-99m。
85.根据权利要求79所述的方法，其中，该组织靶向氨基酸序列为靶向配体。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，该靶向配体为疾病细胞周期靶向化合物、抗代谢物、生物还原剂、信号传导治疗制剂、细胞周期特异性试剂、肿瘤血管发生靶向配体，肿瘤编程性细胞死亡靶向配体、疾病受体靶向配体、基于药物的配体、抗微生物剂、肿瘤缺氧靶向配体、拟葡萄糖试剂、氨磷汀、血管生成抑制素、EGF受体配体、单克隆抗体C225、单克隆抗体CD31、单克隆抗体CD40、卡培他滨、COX-2抑制剂、脱氧胞苷、富勒烯、赫赛汀、人血清白蛋白、乳糖、促黄体生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙立度胺、转铁蛋白或三甲基赖氨酸。
87.根据权利要求79所述的方法，其中，该诊断氨基酸序列为成像氨基酸序列。
88.根据权利要求87所述的方法，其中，该成像氨基酸序列为选自由CT对照介质、MRI对照介质、光学对照介质和超声对照介质组成的组中的对照介质。
89.根据权利要求79所述的方法，其中，该治疗氨基酸序列为抗癌氨基酸序列。
90.根据权利要求89所述的方法，其中，该抗癌氨基酸序列能够螯合至选自由砷、钴、铜、硒、铊和铂组成的组中的治疗金属。
91.一种对个体某部位成像的方法，其包括以下步骤：
a)给个体服用诊断上有效量的的组合物，该组合物包含在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽，在该多肽中，一个或多个价金属离子非共价键合到两个连续氨基酸的至少一个氨基酸上；和
b)检测位于该部位的价金属离子-多肽螯合物发出的信号。
92.根据权利要求91所述的方法，其中，该信号使用PET、CT、SPECT、MRI、光学成像法或超声法检测。
93.根据权利要求91所述的方法，进一步被定义为进行二元成像和放化疗的方法。
94.根据权利要求91所述的方法，进一步被定义为对个体某部位进行二元成像的方法。
95.根据权利要求91所述的方法，其中，检测信号包括使用PET、SPECT、MRI、CT、光学成像法或超声法。
96.一种用于制备成像试剂的试剂盒，所述的试剂盒包含密封的容器，其中含有预定量的在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽；和足够量的还原剂，以非共价结合价金属离子至两个连续氨基酸的至少一个上。
97.一种用于制备成像试剂的试剂盒，所述的试剂盒包含密封的容器，其中含有预定量的在其序列中包含组织靶向氨基酸序列、诊断氨基酸序列和/或治疗氨基酸序列的多肽；和足够量的还原剂，来将一个或多个的价金属离子连接到多肽上。
98.根据权利要求96或97所述的试剂盒，其中，该多肽包含至少2个连续谷氨酸或天冬氨酸残基。
99.根据权利要求98所述的试剂盒，其中，该多肽包含至少5个连续谷氨酸或天冬氨酸残基。
100.一种测定候选物质作为成像试剂有效性的方法，所述方法包括：
a)获得候选物质；
b)将该候选物质缀合或螯合到在其序列中包含用来非共价结合价金属离子的两个或更多连续氨基酸的多肽上；
c)将该候选物-多肽缀合物引到个体上；和
d)测定来自该候选物-多肽缀合物的信号，来判定该候选物质作为成像试剂的有效性。
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