NO338316B1 - Gassfylt mikrovesikkel-sammenstilling anvendelse og fremstilling derav og kit samt fremgangsmåte for fremstilling - Google Patents

Gassfylt mikrovesikkel-sammenstilling anvendelse og fremstilling derav og kit samt fremgangsmåte for fremstilling Download PDF

Info

Publication number
NO338316B1
NO338316B1 NO20063419A NO20063419A NO338316B1 NO 338316 B1 NO338316 B1 NO 338316B1 NO 20063419 A NO20063419 A NO 20063419A NO 20063419 A NO20063419 A NO 20063419A NO 338316 B1 NO338316 B1 NO 338316B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
microvesicle
gas
assembly
preparation
component
Prior art date
Application number
NO20063419A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20063419L (no
Inventor
Feng Yan
Michel Schneider
Philippe Bussat
Anne Senente
Original Assignee
Bracco Suisse Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bracco Suisse Sa filed Critical Bracco Suisse Sa
Publication of NO20063419L publication Critical patent/NO20063419L/no
Publication of NO338316B1 publication Critical patent/NO338316B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
    • A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
    • A61K49/225—Microparticles, microcapsules

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Acoustics & Sound (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Adornments (AREA)

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en sammenstilling som omfatter som en første komponent en gassfylt mikrovesikkel og som en andre komponent en strukturert enhet som er i stand til å assosiere til mikrovesikkelens ytre overflate, for derved å modifisere de fysikalsk/kjemiske egenskaper derav. Eventuelt, kan den andre komponent omfatte en målsøkende ligand, et bioaktivt middel, et diagnostisk middel eller en kombinasjon derav. Videre berører forbindelsen formuleringer som omfatter sammenstillingen, anvendelsen av formuleringene, en fremgangsmåte for å preparere sammenstillingen og formuleringene og en diagnostisk sett som omfatter sammenstillingen. Sammenstillingen ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet som en aktiv komponent i diagnostisk og/eller terapeutisk aktive formuleringer, særlig vedrørende imaging innen feltet ultralydkontrast-imaging, inklusive målrettet ultralyd imaging og/eller ultralyd-mediert medisintilførsel og andre imaging-teknikker slik som molekylær ressonans-imaging (MRI) eller nukleær imaging.
Bakgrunnen for oppfinnelsen
Hurtig utvikling av ultralydkontrastmidler i de senere år har generert et antall ulike formuleringer, som er egnet i ultralyd-imaging av organer og vev i human eller animalsk kropp. Disse midler er utformet for å bli benyttet primært for intravenøs eller intraarteriell injeksjon i samband med anvendelsen av medisinsk ekkografisk utstyr som benytter for eksempel, B-modus bildedannelse (på basis av den romlige fordeling av vevs tilbakespredningsegenskaper) eller Doppler-signalbearbeiding (basert på kontinuerlig bølge eller pulsert Doppler-bearbeiding av ultralydekkoer til bestemmelse av blod- eller væskestrømsparametere).
En klasse injiserbare formuleringer som er egnet som ultralydkontrastmidler inkluderer suspensjoner av gassbobler med en diameter av få mikroner som dispergert i et vandig medium.
Anvendelse av suspensjoner av gassbobler i bærevæske, som effektive ultralydre-flektorer er velkjente innen faget. Utviklingen av mikroboblesuspensjoner som ekkofarmasøytisk til forbedring av ultralyd-imaging fulgte tidligere observasjoner om at hurtige intravenøse injeksjoner av vandige løsninger kan forårsake at oppløste gasser kommer ut av løsningen ved dannelsen av bobler. På grunn av deres vesentlige forskjell i akustisk impedans i forhold til blod, ble disse intravaskulære gassbobler funnet å være utmerkede reflektorer for ultralyd. Injeksjon av suspensjoner av gassbobler i en bærevæske inn i den levende organismes blodstrøm forsterker i høy grad ultrasonisk ekkografi-imaging, noe som forbedrer visualiseringen av indre organer. Siden avbilding av organer og dyptsittende vev kan være avgjørende i etableringen av medisinske diagnoser, har mye anstrengelser vært viet til utviklingen av stabile suspensjoner av i høy grad konsentrerte gassbobler som på samme tid ville være enkle og fremstille og administrere, ville inneholde et minimum av inaktive emner og ville være kapable til langtidslagring og enkel administrering.
Den enkle dispersjon av frie gassbobler i det vandige medium er imidlertid av begrenset praktisk interesse, siden disse bobler generelt ikke er stabile nok til å være nyttige som ultralydkontrastmidler.
Dermed har interesse vært vist for metoder for stabilisering av gassbobler til ekkografi og andre ultrasoniske studier, for eksempel anvendelse av emulgatorer, oljer, tyknings-midler eller sukkere, eller ved innfanging eller innkapsling av gassen eller en forløper derav i et utvalg systemer. Disse stabiliserte gassbobler er innen faget generelt henvist til som "mikrovesikler" og kan bli oppdelt i to hovedkategorier.
En første kategori av stabiliserte bobler eller mikrovesikler er innen faget generelt henvist til som mikrobobler og inkluderer vandige suspensjoner i hvilke boblene av gass er avgrenset i grenseflaten gasser/væske med et tynt omslag (film)som involverer et stabiliserende amfifilt materiale som er plassert ved grenseflaten gass/væske. Mikroboblesuspensjoner blir typisk preparert ved å kontakte pulverformede amfifile materialer, eksempelvis frysetørkede eller fordannede liposomer eller frysetørkede eller spraytørkede fosfolipidløsninger, med luft eller annen gass og deretter med en vandig bærer, under agitering for generering av en mikroboblesuspensjon som deretter kan bli administrert, fortrinnsvis kort tid etter sin preparering.
Eksempler på vandig suspensjon av gassmikrobobler og preparering derav er, for eksempel, beskrevet i US 5 271 928, US 5 445 813, US5 413 774, US 5 556 610, 5 597 549, US 5 827 504 og WO 04/069284.
En andre kategori mikrovesikler er, innen faget, generelt henvist til som "mikroballonger" eller "mikrokapsler" og inkluderer suspensjoner der boblene av gass er omgitt av et fast materialomslag av et lipid eller av naturlige eller syntetiske polymerer. Eksempler på mikroballonger og på fremstillingen derav er, for eksempel, beskrevet i US 5 711 933 og US 6 333 021.
Mikrovesikler som bærer en samlet nettoladning er også kjent (se for eksempel internasjonal patentsøknad WO 97/29783; disse mikrovesiklers ytre omslag inneholder ioniske forbindelser som er i stand til å tildele den ønskede samlede ladning til den endelige mikrovesikkel.
I tillegg til disse formuleringer av gassfylte mikrovesikler, har det nylig vært vist interesse også henimot modifiserte formuleringer av gassfylte mikrovesikler, enten til forbedringer av den diagnostiske effekt og/eller til terapeutiske formål.
For eksempel kan mikrovesiklene være assosiert (eksempelvis ved inklusjon i dens grenseomslag) med spesifikke komponenter (kjent som målrettende ligander) som er i stand til å knyttes til et forutbestemt mål i en pasients kropp, eksempelvis til et spesifikt patogent sted. Disse formuleringer er innen faget generelt kjent som målrettede mikrovesikler. Eksempler på målrettede mikrovesikler, og målrettede ligander og på fremstillingen derav er eksempelvis beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 98/18051.
Et annet eksempel på modifiserte formuleringer er de hvor et terapeutisk middel er assosiert med mikrovesikkelen. Når formuleringen som omfatter mikrovesikkelen når det patogene stedet, kan medisinen med fordel frigjøres, eksempelvis ved tilførsel av en kontrollert akustisk energi som er i stand til å rive opp vesikkelen, for således å lokalt frigjøre det terapeutiske middel. Innen området er denne teknikk generelt kjent som ultralydformidlet medisinfrigj øring. Eksempler på mikrovesikler som omfatter et terapeutisk middel er, for eksempel, beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 94/28873.
Videre utviklinger innen området har ført til preparering av sammenstillinger hvori mikrovesikkelen er assosiert med en annen komponent, som bærer et ønsket terapeutisk middel eller en ønsket målrettende forbindelse.
For eksempel, beskriver WO 99/39738 en sammenstilling som omfatter en gassfylt mikrovesikkel og et væskefylt liposom i assosiasjon dermed, hvor liposomet omfatter en terapeutisk aktiv substans deri. Liposomet er assosiert til mikrovesikkelen ved enkel sammenblanding med mikrovesiklene eller gjennom en link mellom et konjugert par, idet hver av mikrovesiklene og liposomene er forsynt med en komponent som bærer en av to respektive komplementære enheter for nevnte par (eksempelvis biotin og avidin eller treptavidin).
WO 03/015831 beskriver en formulering som omfatter gassfylte mikrovesikler (mikrosfærer i søknaden) som er assosiert til liposomer, eller til mikrosfære-liposom-kompositter. Liposomene i kompositten kan inkludere en medisin og/eller en målrettende enhet. Mikrovesikkelen og liposomene som danner kompositten er fremstilt fra et tilsvarende utgangsmateriale; kompositten blir oppnådd ved preparering av en vandig løsning som omfatter en blanding av lipider, idet løsningen introduseres i et forseglet glass som omfatter den ønskede gass og til slutt agitering av løsningen. Den således oppnådde kompositt er dermed en enkel blanding av mikrovesikler og liposomer av den samme kjemiske natur. Nærmere bestemt, blir ingen spesifikk kjemisk eller fysisk interaksjon mellom mikrovesikler og liposomer beskrevet i dokumentet.
Videre, beskriver internasjonal patentsøknad WO 99/53963 en kombinert preparering som omfatter et første preparat som omfatter gassfylte mikrovesikler som er dispergert i et vandig medium og stabilisert ved et materiale og et andre preparat som er en olje i vannemulsjon som omfatter et materiale som stabiliserer emulsjonen. Overflate-materialene som stabiliserer mikrovesiklene og den dispergerte oljefase har affinitet for hverandre. Alternativt, kan de respektive overflatematerialer assosiasjon omfatte forbindelser som er i stand til interaksjon via kjemisk eller biologisk binding. Emulsjonens olje er en substans som er i stand til å generere et gass- eller damptrykk in vivo og er henvist til som den "diffunderbare komponent". Assosiasjonen mellom dråper av den emulgerte substans med mikrovesikkelen er i stand til å bestemme en kontrollerbar fremvekst av den dispergerte gassfase i mikrovesikkelen, gjennom involvent diffusjon dertil av molekyler av gass eller damp fra substansen.
US 5562099 A beskriver mikropartikler, inklusive gass-mikropartikler fra kontrastmidler dispergert eller løst i vandig polymerløsning eller dispersjon som reagerer med multivalent ion av motsatt ladning for å danne mikropartikler
US 6331289 B beskriver diagnostisk og/eller terapeutisk aktivt middel som omfatter gassinneholdende mikrobobler koblet til en vektor som har evnen til å målsøke celler. Nevnte vektor er koplet til mikroboblene ved hjelp av elektrostatisk ladningsinteraksjon. WO 95/23615 A beskriver midler som omfatter gassfylte mikrobobler dekket med partikler av motsatt ladning (gelatin og natriumsulfat).
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse omfatter sammenstilling kjennetegnet ved at den omfatter en gassfylt mikrovesikkel som bærer en første samlet nettoladning og en komponent som er assosiert til mikrovesikkelen hvori komponenten er en supermolekylær struktur som er dannet ved assosiasjonen av et antall molekyler, som bærer en andre samlet nettoladning som er motstående i fortegn til den første nettoladning, omfattende et amfifilt biokompatibelt overflateaktivt middel og har en diameter på 100 nm eller mindre.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av en sammenstilling ifølge et hvilket som helst av kravene 1-21 for fremstilling av en farmasøytisk aktiv formulering.
Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også farmasøytisk sett, kjennetegnet ved at det separat omfatter: a) en gassfylt mikrovesikkel eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering, som bærer en første samlet nettoladning som en første
komponent;
b) en andre komponent eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering, assosierbar med nevnte mikrovesikkel som bærer en andre
samlet nettoladning som er motstående i fortegn til første nettoladning, der nevnte assosierte komponent er en supermolekylær struktur dannet ved assosiasjonen av et antall molekyler, omfattende et amfifilt biokompatibelt overflateaktivt middel og har en diameter på 100 nm eller mindre.
Videre omfatter foreleggende oppfinnelse fremgangsmåte for å preparere en sammenstilling ifølge et hvilket som helst av kravene 1-22, kjennetegnet ved at den omfatter å blande en preparering som omfatter gassfylte mikrovesikler eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering med en preparering som omfatter en komponent eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering som blir assosiert med mikrovesiklene.
Det er ifølge oppfinnelsen nå funnet en nyskapende sammenstilling, for anvendelse i farmasøytisk aktive formuleringer, som omfatter en gassfylt mikrovesikkel som er assosiert gjennom en i det vesentlige elektrostatisk interaksjon, idet den andre komponent eventuelt omfatter en målrettende ligand, et bioaktivt middel, et diagnostisk middel eller en kombinasjon derav.
Et aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen vedrører en sammenstilling som omfatter en gassfylt mikrovesikkel som bærer en første samlet nettoladning og en komponent som er assosiert med mikrovesikkelen hvori komponenten bærer en andre samlet nettoladning som i fortegn er motsatt til den første nettoladning, idet den assosierte komponent omfatter et biokompatibelt overflateaktivt middel og har en diameter på 100 nm eller lavere.
Ifølge en foretrukket utførelsesform, omfatter assosiasjonskomponenten en målrettende ligand, et bioaktivt middel, et diagnostisk middel eller en kombinasjon derav.
Fortrinnsvis, er det overflateaktive middel et emulgerende middel, et dispergerende middel eller en kombinasjon derav, idet et amfifilt materiale er særskilt foretrukket.
Videre utover i denne beskrivelse, vil den andre komponent i sammenstillingen bli henvist til som mikrovesikkelens assosierte komponent ("MAC").
Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen, foreligger et ultralydkontrastmiddel i form av en suspensjon eller et antall nevnte sammenstillinger dispergert i en farmasøytisk akseptabel vandig bærer.
Ifølge en alternativ utførelsesform av oppfinnelsen foreligger ultralydkontrastmidlet i form av et frysetørket preparat.
Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører en metode til preparering av en sammenstilling som beskrevet i det foregående, som omfatter sammenblanding av en preparering som omfatter gassfylte mikrovesikler eller en forløper dertil med en preparering som omfatter den andre komponent eller en forløper dertil.
Til formålene ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer termen forløper gassfylte mikrovesikler innen sin betydning en/ett mellomliggende substans, preparat, formulering eller struktur som er i stand til å danne en suspensjon av gassfylte mikrovesikler inklusive, for eksempel, frysetørkede formuleringer som er i stand til å bli rekonstituert med en vandig bærer til dannelse av mikrovesikkelsuspensjonen eller mikroemulsjoner som er i stand til å gjennomgå en frysetørkende prosess til oppnåelse av et frysetørket produkt som deretter kan bli rekonstituert med en vandig bærer til dannelse av suspensjonen.
På lignende måte, inkluderer termen forløper for den andre komponenten en/et mellomliggende substans, preparert, formulering eller struktur som er i stand til å danne en andre komponent, inklusive, for eksempel, frysetørkede preparater som er rekonstituerbare i en vandig suspensjon som omfatter nevnte MAC.
Ifølge en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, kan sammenstillingen ifølge oppfinnelsen bli oppnådd ved: 1) preparering av en første vandig suspensjon som omfatter en gassfylt mikrovesikkel; 2) preparering av en andre vandig suspensjon som omfatter en komponent som skal bli assosiert med den gassfylte mikrovesikkel; 3) sammenblanding av de to suspensjoner, til oppnåelse av en vandig suspensjon som omfatter sammenstillingen.
Eventuelt kan et vasketrinn bli inkludert, etter prepareringen av enten den første og/eller den andre suspensjonen. Et valgfritt vasketrinn av den endelige suspensjon kan også bli utført. Termen "vasketrinn" inkluderer innen sin betydning en metode eller prosess som er rettet mot å separere og/eller i det minste delvis fjerne overskuddet av ikke-assosierte materiale, komponenter, partikler og lignende fra en suspensjon av en ønsket forbindelse (eksempelvis mikrovesikkel, MAC eller sammenstilling). Egnede separeringsmetoder inkludert, for eksempel dekantering, sentrifugering, ultrafiltrering eller mikrofiltrering.
Alternativt kan sammenstillingen i følge oppfinnelsen bli oppnådd ved:
1) preparering av en første vandig suspensjon som omfatter en gassfylt mikrovesikkel; 2) frysetørking av suspensjonen, til oppnåelse av et første lyofilisert produkt; 3) preparering av en andre suspensjon som omfatter en komponent som skal bli assosiert med en gassfylt mikrovesikkel; 4) frysetørking av suspensjonen, til oppnåelse av et andre lyofilisert produkt; 5) rekonstituering av det første og det andre lyofiliserte produkt med en fysiologisk akseptabel vandig bærer i nærvær av en gass, til oppnåelse av en vandig suspensjon som omfatter sammenstillingen.
Eventuelt kan et vasketrinn bli inkludert, etter prepareringen av enten den første og/eller den andre suspensjon. Et eventuelt vasketrinn av den endelige suspensjon kan også bli utført.
Det siste trinn 5 i prepareringsprosessen omfatter trinnene med a) å rekonstituere det andre lyofiliserte produkt med en fysiologisk akseptabel vandig bærer til oppnåelse av en suspensjon som omfatter den komponent som skal bli assosiert med den gassfylte mikrovesikkel og b) rekonstituering av det første lyofiliserte produkt med suspensjonen i nærvær av en gass.
Sammenstillingen kan også oppnås som et frysetørket preparat ved:
1) preparering av en vandig emulsjon som omfatter et ikke vannblandbart organisk løsningsmiddel, et fosfolipid og et lyoproteksjonsmiddel; 2) preparering av en vandig suspensjon som omfatter en komponent som skal bli assosiert med gassfylt mikrovesikkel;
3) sammenblanding av den vandige suspensjonen med den vandige emulsjonen; og
4) frysetørking av blandingen til fjerning av vannet og det organiske løsningsmidlet, til oppnåelse av et lyofilisert produkt som omfatter sammenstillingen.
Det oppnådde lyofiliserte produkt kan bli rekonstituert til en vandig suspensjon som omfatter en sammenstilling ifølge oppfinnelsen ved agitering av det lyofiliserte produkt under nærvær av gass og en vandig bærer.
Det er beskrevet en metode for ultralyddiagnostisk imaging som omfatter administrering av et kontrastforbedrende mengde av en vandig suspensjon av en sammenstilling som definert i det foregående, som eventuelt omfatter en målrettende ligand.
Det er også beskrevet en terapeutisk metode som omfatter administrering av en terapeutisk virksom mengde av en vandig suspensjon av en sammenstilling som definert i det foregående som omfatter et bioaktivt middel.
Nok et aspekt ved oppfinnelsen vedrører en farmasøytisk kit som inneholder sammenstillingens komponenter i en av de følgende former: a) som to separate suspensjon av mikrovesikler og MAC-er; b) som separate, frysetørkede prepareringer av de to komponenter, eventuelt sammen med en vandig bærer for rekonstituering; eller c) som en frysetørket preparering av sammenstillingen, sammen med en vandig bærer for rekonstituering.
En fordel med en sammenstilling ifølge oppfinnelsen er at den elektrostatiske interaksjon mellom mikrovesikkelen og MAC kan bli oppnådd ved dannelse av konvensjonelle komponenter som typisk blir benyttet for å danne mikrovesiklenes omslag, uten behov for å introdusere ytterligere komponenter eller elementer i omslaget, noe som ellers kan svekke mikrovesiklenes stabilitet.
Den oppnådde sammenstilling kan med fordel modifisere eller modulere gassfylte mikrovesiklers atferd når de er administrert inn i en pasients kropp (slik som, for eksempel, hastigheten av klaring fra blodstrømssirkulasjonen). For eksempel, kan sammenstillinger som omfatter positivt ladede mikrovesikler og negativt ladede MAC-er bli benyttet for å administrere en preparering. Av positivt ladet mikrovesikkel som imidlertid vil fremvise en atferd i likhet med negativt ladede mikrovesikler når de har kommet inn i kroppen. Alternativt, kan sammenstillingen som omfatter negativt ladede mikrovesikler og positivt ladede MAC-er bli benyttet for å administrere en preparering av negativt ladede mikrovesikler som imidlertid vil fremvise en atferd i likhet med positivt ladede mikrovesikler når de en gang har kommet inn i kroppen. I tillegg er det mulig å assosiere en ønsket målrettende forbindelse eller et farmasøytisk aktivt middel til mikrovesikkelen uten å svekke dens stabilitet (særskilt kvaliteten av det grenselag som omgir gassen), idet den målrettende forbindelsen eller det farmasøytisk aktive middel faktisk er assosiert til sammenstillingens andre komponent, idet kvaliteten i det vesentlige er upåvirket av forbindelsen eller middelets nærvær.
En ytterligere fordel med den foreliggende oppfinnelse er den ekstreme fleksibilitet i fremstillingen av ulike sammenstillinger til ulike formål. Faktum er, at en enkeltstående basisk preparering av ladede mikrovesikler kan bli assosiert til ulike prepareringer av MAC-er av motstående ladning, om nødvendig mer enn en på samme tid, avhengig av de spesifikke diagnostiske/terapeutiske behov. For eksempel er det mulig til mikrovesiklenes preparering å assosiere en første preparering av MAC som bærer en mål-rettende ligand (eksempelvis for bindingen av sammenstillingen til et spesifikt patogen punkt) og en andre preparering av MAC som inkluderer et bioaktivt middel (som kan bli frigjort ved det spesifikke patogene punkt når en gang sammenstillingen har blitt koblet dertil).
Dessuten, er ifølge oppfinnelsen observert at en sammenstilling ifølge oppfinnelsen kan fremvise en økt trykkresistens med hensyn til mikrovesikkelen alene.
Figurer
Figur 1 er et diagram som viser sammensetningen av ulike sammenstillinger som er dannet av mikrovesikler og MAC-er som omfatter de samme materialer, men i ulike mengder. Figur 2 og 3 viser in vivo atferd av ladede mikrovesikler og av tilsvarende sammenstillinger av MAC-er av motstående ladning i forhold til mikrovesikkelen.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.
En sammenstilling ifølge oppfinnelsen omfatter typisk en første komponent (også identifisert som bærerkomponenten) i form av en gassfylt mikrovesikkel som bærer en samlet nettoladning og andre komponent som er assosiert med bærerkomponenten (MAC) med en diameter på mindre enn 100 nm, som bærer en samlet nettoladning av motstående fortegn med hensyn til den første komponent og som omfatter i det minste ett overflateaktivt middel, nærmere bestemt et emulgerende middel og/eller dispergerende middel, mer foretrukket en antifil forbindelse.
Fortrinnsvis, inneholder MAC en ønsket målrettende ligand, et bioaktivt middel, et diagnostisk middel eller en kombinasjon derav.
Mikrovesikkelens assosierte komponent (MAC) foreligger fortrinnsvis i form av en supermolekylær struktur som dannes ved assosiasjonen av et antall molekyler av et eller flere overflateaktive midler. Gjerne, omfatter den supermolekylære struktur minst et overflateaktivt middel som bærer en nettoladning, mer foretrukket et ionisk overflateaktivt middel. Den stabile supermolekylære struktur kan for eksempel bli bestemt ved en hydrofob interaksjon mellom molekylenes hydrofobe partier. Ifølge en særskilt foretrukket utførelsesform, foreligger MAC i form av en micelle. Alternativt, kan nevnte MAC bli dannet av et enkeltstående molekyl av en polymer ionisk surfaktant, eventuelt funksjonalisert til å inkludere en egnet målrettende, bioaktiv og/eller diagnostisk enhet.
Sammenstillingen ifølge oppfinnelsen er egnet for preparering av en farmasøytisk aktiv formulering til anvendelse i diagnostiske eller terapeutiske metoder. Termen "farmasøytisk aktiv formulering" inkluderer innen sin betydning en formulering, eller forløper dertil, inklusive diagnostiske, bioaktive og/eller terapeutisk aktive formuleringer, som er i stand til å utøve en farmasøytisk virkning (eksempelvis en diagnostisk, bioaktiv og/eller terapeutisk virkning) ved administrering i en virksom mengde til en pasient i behov derav. På lignende måte, inkluderer termen "farmasøytisk aktiv" under henvisning til en forbindelse, et middel eller et kit innen sin betydning diagnostiske, bioaktive og terapeutiske forbindelser, midler eller kit.
Termen "målrettende ligand" inkluderer innen sin betydning enhver forbindelse, enhet eller rest som har eller er i stand til å promotere, en målrettende aktivitet for sammenstillingen ifølge oppfinnelsen overfor et biologisk eller patologisk punkt innen en levende kropp. Mål overfor hvilke målrettende ligand kan bli assosiert inkluderer vev, slik som, for eksempel, myokardialt vev inklusive myokardiale celler og kardiomyo-citter), membranformig vev (inklusive endotelium og epitelium), lamin, bindevev (inklusive intersitielt vev) eller tumorer; blodlevringer; og reseptor slik som for eksempel celleoverflatereseptorer for peptid hormoner neurotransmittere, antigene, komplementfragmenter, og immunoglobuliner og cytoplasmiske reseptorer for steroid hormoner.
Termen "bioaktivt middel" inkluderer innen sin betydning en substans, preparat eller partikkel som kan bli benyttet i en terapeutisk anvendelse, slik som i metoder for behandling av en sykdom i en pasient, så vel som en substans som er i stand til å utøve eller være ansvarlig for å utøve en biologisk effekt in vitro og/eller in vivo. Eksempler på bioaktive midler er medisiner, farmasøytika, proteiner, naturlige eller syntetiske peptider, inklusive oligopeptider og polypeptider, vitaminer, steroider og genetisk materiale, inklusive nukleosider, nukleotider og polynukleotid. En terapeutisk metode eller behandling av en pasient inkluderer typisk anvendelsen av et bioaktivt middel.
Termen "diagnostisk middel" inkluderer innen sin betydning en forbindelse, preparat eller partikkel som kan bli benyttet i samband med diagnostisk metode, inklusive billed-dannelse av en intern region av en pasient og/eller diagnostisering av tilstedeværelsen eller fraværet av en sykdom i en pasient. Eksempelvise diagnostiske midler inkluderer, for eksempel, kontrastmidler for anvendelse i samband med magnetisk ressonans-imaging, røntgen-imaging, nærmere bestemt datamaskintomografi, optisk imaging, nukleær imaging eller molekylær imaging av en pasient inklusive magnetitt-nanopartikler.
"Biokompatibel" eller "fysiologisk akseptabel" viser til en/et forbindelse, materiale eller formulering som, i en valgt mengde, kan bli administrert til en pasient uten negativt å påvirke eller i det vesentlige modifisere dens organismes sunne eller normale funksjon (eksempelvis uten bestemmelse av noen status for uakseptabel toksisitet, som forårsaker en ekstrem eller ukontrollerbar allergen respons eller å bestemme noen unormal patologisk tilstand eller sykdomsstatus).
Termen "overflateaktivt" viser til en forbindelse som er i stand til å stabilisere blandinger av for øvrig generelt ikke blandbare materialer, slik som blandinger av to ikke blandbare væsker (eksempelvis vann og olje), blandinger av væsker med gasser (eksempelvis gassbobler i vann) eller blandinger av væsker med uløselige partikler (eksempelvis metallnanopartikler i vann). Disse forbindelser er også, innen faget, generelt henvist til emulgerende midler, eller dispergerende midler. Fortrinnsvis er forbindelsen en amfifil forbindelse, dvs. en forbindelse med et molekyl med et hydrofilt polarhode (eksempelvis en polar eller ionisk gruppe) og en hydrofob organisk hale (eksempelvis hydrokarbondkjede). Eksempler på overflateaktivt middel, nærmere bestemt på emulgerende og/eller dispergerende midler, er: (C2-C10) organiske syrer, organiske fettsyrer som omfatter et (C12-C24), fortrinnsvis en (C14-C22), alifatisk kjede, de farmasøytisk akseptable (alkaliske) salter derav og respektive estere med polyoksyetylen, slik som palmitinsyre, stearinsyre, arakidonsyre, oljesyre, natriumdodekanoat, natriumoksalat eller natriumtartrat eller polyoksyetylen fettsyrestearat; polyioniske (alkali-) salter, slik som natriumsitrat, natriumpolyakrylat, natriumfosfat, organiske aminer, amider, kvarternære aminer (halid) salter, helst inneholdende en ( Cg-C22) hydrokarbonkjede, inklusive polyoksyetylert derivat derav, slik som etanolamin, trietanolamin, alkylamin, alkanolamider, trimetylalkylaminklorid, polyoksyetylerte alkylaminer, polyoksyetylerte alkylamider; aminosyrer; fosfolipider, slik som fettsyrer diestere av fosfatidylkolin, etylfosfatidylkolin, fosfatidylglyserol, fosfatidinsyre, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin eller sfingomyelin; estere av mono- eller oligosakkarider med (C12-C24), foretrukket en (C14-C22), organisk fettsyre, slik som sorbitan laurat; polymersurfaktanter, dvs. blokk-kopolymerer inklusive hydrofobe og hydrofile partier, slik som etylenoksid/propylenoksid blokk-kopolymerer; organiske sulfonater slik som alkali- (eksempelvis natrium) (C12-C24) alkyl, foretrukket (C14-C-22) alkyl, sulfonater; perfluororganiske syrer, slik som perfluoroktansyre; og blandinger derav. På grunn av dens nanometriske dimensjoner, vil MAC også bli henvist til som sammenstillingens nanokomponent, i motsetning til mikrovesikler med mikrometriske dimensjoner. Mikrovesikler har typisk dimensjoner på minst 0,5 \ im, foretrukket 0,8 \ im og opp til eksempelvis 20 [ im, mer foretrukket fra ca. 1 til 8 nm; den respektive gjennomsnittlige diameter i antall mikrovesikler (Dn), målt eksempelvis ved hjelp av en Coulter Counter, er gjerne minst 0,8 \ im, mer foretrukket minst 1 \ im (opptil eksempelvis ca. 8 nm) og mest foretrukket fra ca. 1 \ im til ca. 5 \ im.
Generelt, avhengig av den respektive metode for preparering, blir mikrovesikler og MAC-er oppnådd som en populasjon av partikler med en mer eller mindre smal fordeling av dimensjoner. Således, for å sammenligne ulike populasjoner av mikrovesikler eller MAC-er, blir gjennomsnittsverdier av fordelingen generelt benyttet. Slik det er kjent for fagfolk, kan dimensjonene av mikro/nanopartikler og deres respektive størrelsesfordeling bli kjennetegnet ved et antall parametere, idet den mest hyppig benyttede er gjennomsnittsdiameteren i antall DN, mediandiameteren i antall DN50, gjennomsnittsdiameteren i volum Dvog mediandiameteren i volum, Dyso- Selv om diametre i antall frembringer en indikasjon på partiklenes gjennomsnittlige antalls-dimensjon, frembringer diameteren i volum informasjon om hvordan partiklenes totalvolum er fordelt over hele populasjonen. Idet nærværet av noen få storvolumpartikler i en populasjon på for øvrig småvolumpartikler kan forårsake at den tilsvarende Dv-verdi blir forskjøvet henimot høye verdier, er det noen ganger mer hensiktsmessig å benytte Dvso-verdien for evaluering av fordelingen av en partikkels populasjon. Dysoer en beregnet verdi som indikerer at halvdelen av totalen av partiklenes interne volum foreligger i partikler med en diameter som er mindre enn DVso; Dette muliggjør reduksjon av virkningene av tilfeldig formet storvolumpartikler i evalueringen av størrelsesfordelingen. Det er klart, at monostørrelsespartikler fremviser identiske verdier for Dn, Dn5o, Dvog Dyso-verdier. På den annen side, vil en økende utbredelse av partiklers fordeling resultere i en større forskjell mellom disse ulike verdiene med en tilsvarende variasjon av det respektive forhold derav (eksempelvis økning av forholdet Dv/Dn). For eksempel, fremviser partikler populasjon som inneholder primært små partikler (eksempelvis partikler med en diameter rundt 2 nm) med ikke desto mindre en liten prosentandel av store partikler (for eksempel partikler med en diameter over 8 \ im) høyere verdier for Dy eller Dysosammenlignet med D>j-verdien, med tilsvarende høyere forhold DyÆ>Neller Dvso/Dn.
Den elektrostatiske interaksjonen mellom sammenstillingens to komponenter blir grunnleggende oppnådd ved anvendelse av en første molekylær forbindelse (som omfattes i mikrovesikkelens omslag) som bærer en første netto ladning og en andre molekylær forbindelse (som omfattes i strukturen for MAC) som bærer en andre netto ladning, som er motstående i fortegn til den første. Mikrovesiklene med den første samlet netto ladning og MAC med en andre samlet netto ladning, motstående i fortegn til den første, blir deretter assosiert med hverandre gjennom en elektrostatisk interaksjon til oppnåelse av en sammenstilling ifølge oppfinnelsen.
Den gassfylte mikrovesikkelen som danner den første komponent i en sammenstilling ifølge den foreliggende oppfinnelse kan være enhver mikrovesikkel som innen faget er kjent for å bære en samlet netto ladning. Foretrukne eksempler på mikrovesikler er mikrobobler og mikroballonger (eller mikrokapsler).
Mikrobobler
Et første eksempel på egnet gassfylt mikrovesikkel vil i det følgende bli henvis til som gassfylt mikroboble.
Gassfylte mikrobobler som er egnet til preparering til en sammenstilling ifølge den foreliggende oppfinnelse er generelt bobler av gass som dispergert i en vandig suspensjon som er stabilisert ved et (meget tynt) omslag som omfatter en amfifil (filmdannende) forbindelse, som er plasser ved grenseflaten til væske. Det stabiliserende omslag, innen faget noen ganger henvist til som et "evanescent omslag", har generelt en tykkelse på mindre enn 5 nm, typisk ca. 2-3 nm, noe som ofte utgjør et i det vesentlige monomolekylært sjikt. Minst et parti av det amfifile materialet som omfattes i omslaget består av ladede molekyler, for derved å bibringe den samlede netto ladning til mikroboblens omslag.
Den amfifile forbindelsen er inkludert i mikrovesikkelens omslag kan være en syntetisk eller naturlig forekommende eller kompatibel forbindelse og kan, for eksempel, inkludere et filmdannende lipid, nærmere bestemt et fosforlipid. Eksempler på amfifile forbindelser inkluderer, for eksempel fosfolipider; lysolipider; fettsyrer, slik som palmitsyre, stearinsyre, arakidonsyre eller oljesyre; lipider som bærer polymerer, slik som kitin, hyaluronsyre, polyvinylpyrrolidon eller polyetylen glykol (PEG), også henvist til som "pegylerte lipider"; lipider som bærer sulfonerte mono- di-, oligo- eller polysakkarider; kolesterol, kolesterol sulfat eller kolesterol hemisuccinat; tocoferol hemisuccinat; lipider med eter eller ester-forbundede fettsyrer; polymeriserte lipider; diacetylfosfat; dicetylfosfat; stearylamin; keramider; polyoksyetylen fettsyreestere (slik som polyoksyetylen fettsyrestearater), polyoksyetylen fettalkoholer, polyoksyetylen fettalkoholetere, polyoksyetylerte sorbitan fettsyreestere, glyserolpolyetylenglykol-ricinoleat, etoksylerte soyabønnesteroler, etoksylerte lakseroljer eller etylenoksid (EO) og propylenoksid (PO)-blokk kopolymerer; sterol-alifatiske syreestere inklusive, kolesterolbutyrat, kolesterol-iso-butyrat, kolesterolpalmitat, kolesterolstearat, lanosterol acetat, ergosterolpalmitat, eller fytosterol n-butyrat; sterolestere av sukkersyrer som inkluderer kolesterol glukuronider, lanosterol glukoronider, 7-dehydrokolesterol glukoronid, ergosterolglukoronid, kolesterolglukonat, lanosterolglukonat, eller ergosterol glukonat; estere av sukkersyre og alkoholer som inkluderer lauryl glukoronid, stearoylglukoronid, myristoylglukoronid, laurylglukonat, myristoylglukonat, eller stearoylglukonat; estere av sukkere med alifatiske syrer inklusive sukroselaurat, fruktoselaurat, sukrosepalmitat, sukrosestearat, glukuronsyre, glukonsyre eller polyuronsyre; saponiner inklusive sarsasapogenin, smilagenin, hederagenin, oleanolsyre, eller digitoksigenin; glyserol eller glyserolestere inklusive glyserol trippalmitat, glyseroldistearat, glyseroltristearat, glyseroldimyristat, glyseroltrimyristat, glyseroldilaurat, glyseroltrilaurat, glyseroldipalmitat; langkjedede alkoholer inklusive n-decylalkohol, laurylalkohol, myristylalkohol, cetylalkohol, eller n-oktadekylalkohol; 6-(5-kolesten-3P-yloksy)-l-tio- P -D-galactopyranosid; digalaktosyldiglyserid; 6-(5-kolesten-3 P -yloksy)heksyl-6-amino-6-deoksy-l-tio- P -D-galaktopyranosid; 6-(5-kolesten-3 P-yloksy)heksyl-6-amino-6-deoksyl-l-tio- P-D-mannopyranosid; 12-(((7'-dietylaminocoumarin-3 -yl)karbonyl)metylamino)octadecanosyre; N- [ 12-(((7' - dietylaminocoumarin-3 -yl)karbonyl)metylamino)octadecanoyl] -2-aminopalmitsyre; N-succinyldioleylfosfatidyletanolamin; 1,2-dioleyl-sn-glyserol; 1,2-dipalmitoyl-sn-3 - succinylglyserol; l,3-dipalmitoyl-2-succinylglyserol; l-heksadecyl-2-palmitoyl-glyserofosfoetanolamin eller palmitoylhomocystein; alkylammonium salter som omfatter minst en (C10-C20), foretrukket (Cn-Cig), alkylkjede, slik som, for eksempel, stearylammoniumklorid, heksadecylammoniumklorid, dimetyldioctadecylammonium bromid (DDAB), heksadecyltrimetylammonium bromid (CTAB); tertiære eller kvarternære ammoniumsalter som omfatter en eller helst to (C10-C20), fortrinnsvis (C14-Cig), alkylkjede bundet til N-atomet gjennom en (C3-C6) alkylenbro, slik som, for eksempel, l,2-distearoyl-3-trimetylammonium-propan (DSTAP), l,2-dipalmitoyl-3-trimetylammonium-propane (DPTAP), 1,2-oleoyl-3-trimetylammonium-propan (DOTAP), l,2-distearoyl-3-dimetylammonium-propan (DSDAP): og blandinger og kombinasjoner derav.
Avhengig av kombinasjonen av komponenter og av produksjonsprosessen for mikroboblene, kan de i det foregående opplistede eksempelvise forbindelser bli benyttet som hovedforbindelse til dannelse av mikrovesiklenes omfang eller som enkle additiver, idet de foreligger utelukkende i små mengder.
Ifølge en foretrukket utførelsesform, er minst en av de forbindelser som danner mikrovesikkelens omslag et fosfolipid, eventuelt i sammenblanding med en av de øvrige i det foregående nevnte filmdannende materialet. Ifølge den foreliggende beskrivelse, er termen fosfolipid ment å skulle omfatte enhver amfifil fosfolipid forbindelse, hvis molekyler er i stand til å danne en stabiliserende film av materialet (typisk i form av et mono-molekylært sjikt) ved grenseflaten gass-vann i den endelige mikroboblesuspensjonen. Dermed, er disse materialer innen faget også henvist til som filmdannende fosfolipider.
Amfifile fosfolipidforbindelser inneholder typisk minst en fosfatgruppe og minst en, helst to, lipofile langkjedede hydrokarbongrupper.
Eksempler på egnede fosfolipider inkludert estere av glyserol med en eller helst to (like eller ulike) rester av fettsyrer og med fosforsyre, hvori fosforsyreresten i sin tur er bundet til en profilgruppe, slik som kolin (fosfatidylkoliner - PC), serin (fosfatidyl-seriner - PS), glyserol (fosfatidylglyseroler - PG), etanolamin (fosfatidyletanolaminer - PE), inositol (fosfatidylinositol), og lignende grupper. Estere av fosfolipider med bare en rest av fettsyre er innen faget generelt henvist til som "lyso"-former av fosfolipidet. Fettsyrerester som foreligger i fosfolipidene er generelt langkjedede alifatiske syrer, typisk inneholdende 12 til 24 karbonatomer, gjerne fra 14 til 22; den alifatiske kjede kan inneholde en eller flere umetninger eller er fortrinnsvis fullstendig mettet. Eksempel på egnede fettsyrer som er inkludert i fosfolipidene er, for eksempel, laurinsyre, myristinsyre, palmetinsyre, stearinsyre, arakadinsyre, behensyre, oljesyre, linolinsyre og linolensyre. Helst blir det benyttet mettede fettsyrer slik som myristinsyre, palminsyre, stearinsyre og arakidinsyre.
Ytterligere eksempler på fosfolipid er fosfatidinsyre, dvs. diestere av glyserol-fosforsyre med fettsyrer, sfingolipider slik som sfingomyeliner, dvs. disse fosfatidylkolinanaler hvor resten av glyseroldiester med fettsyrer er erstattet med en keramidkjede; kardiolipiner; dvs. estere av en 1,3-difosfatidylglycerol med fettsyrer; glykolipider slik som gangliosider GM1 (eller GM2) eller cerebrosider; glykolipider; sulfatider og glykosfingolipider.
Slik det anvendes heri, inkluderer termen fosfolipider enten naturlig forekommende, halvsyntetiske eller syntetisk fremstilte produkter som kan bli benyttet enten enkeltvis eller som blandinger.
Eksempler på naturlig forekommende fosfolipider er naturlig lecitiner (fosfatidylkolin (PC) derivater) slik som, typisk, soyabønner- eller eggeplomme-lecitiner.
Eksempler på halvsyntetiske fosfolipider er de deler eller fullstendige hydrogenerte derivater av de naturlig forekommende lecitiner. Foretrukne fosfolipider er fettsyrediestere av fosfatdylkolin, etylfosfatidylkolin, fosfatidylglyserol, fosfatidinsyre, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin eller sfingomyelin.
Eksempler på foretrukne fosfolipider er, for eksempel dilauroyl-fosfatidylkolin (DLPC), dimyristoyl-fosfatidylkolin (DMPC), dipalmitoyl-fosfatidylkolin (DPPC), diarakidoyl-fosfatidylkolin (DAPC), distearoyl-fosfatidylkolin (DSPC), dioleoyl-fosfatidylkolin (DOPC), 1,2 Distearoyl-sn-glysero-3-Etylfosfokolin (Etyl-DSPC), dipentadecanoyl-fosfatidylkolin (DPDPC), l-myristoyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (MPPC), 1-palmitoyl-2-myristoyl-fosfatidylkolin (PMPC), 1 -palmitoyl-2-stearoyl-fosfatidylkolin (PSPC), l-stearoyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (SPPC), ), l-palmitoyl-2-oleylfosfatidylkolin (POPC), l-oleyl-2-palmitoyl-fosfatidylkolin (OPPC), dilauroyl-fosfatidylglyserol (DLPG) og dens alkalimetallsalter, diarakidylfosfatidylglyserol (DAPG) og dens alkalimetallsalter, dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG) og dens alkalimetallsalter, dipalmitoylfosfatidylglyserol (DPPG) og dens alkalimetallsalter, distearylfosfatidylglyserol (DSPG) og dens alkalimetallsalter, dioleyl-fosfatidylglyserol (DOPG) og dens alkalimetallsalter, dimyristylfosfatidinsyre (DMPA) og dens alkalimetallsalter, dipalmitoyl fosfatidinsyre (DPPA) og dens alkalimetallsalter, distearoyl fosfatidinsyre (DSPA), diarakidylfosfatidinsyre (DAPA) og dens alkalimetallsalter, dimyristoyl-fosfatidyletanolamin (DMPE), dipalmitylfosfat-idyletanolamin (DPPE), distearoyl fosfatidyl-etanolamin (DSPE), dioleylfosfatidyl-etanolamin (DOPE), diarakidylfosfatidyletanolamin (DAPE), dilinoleylfosfat-idyletanolamin (DLPE), dimyristyl fosfatidylserin (DMPS), diarakidyl fosfatidylserin (DÅPS), dipalmityl fosfatidylserin (DPPS), distearoylfosfatidylserin (DSPS), dioleoylfosfatidylserin (DOPS), dipalmitoyl sfingomyelin (DPSP), og distearoylsfingomyelin (DS SP).
Termen fosfolipid inkluderer videre modifisert fosfolipid, eksempelvis fosfolipider hvor den hydrofile gruppen i sin tur er bundet til en annen hydrofil gruppe. Eksempler på modifiserte fosfolipider er fosfatidyletanolaminer modifisert med polyetylenglykol (PEG), dvs. fosfatidyletanolaminer hvor den hydrofile etanolaminenheten er forbundet til et molekyl av variabel molekylvekt, eksempelvis fra 300 til 5000 dalton, slik som DPPE-PEG eller DSPE-PEG, dvs. DPPE (eller DSPE) som har en PEG-polymer festet dertil. For eksempel, viser DPPE-PEG2000 til DPPE med tilfestet dertil en PEG polymer med en aritmetisk gjennomsnittlig molekylvekt på ca. 2000. Særlig foretrukne fosfolipider er DAPC, DSPC, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS og Etyl-DSPC. Mest foretrukket er DAPC eller DSPC.
Blandinger av fosfolipider kan også bli anvendt, slik som, for eksempel blandinger av DPPC, DSPC og/eller DAPC med DSPS, DPPS, DSPA, DPPA, DSPG, DPPG, Etyl-DSPC og/eller Etyl-DPPC.
I noen utførelsesformer er fosfolipidet hovedkomponenten i mikroboblenes stabiliserende omslag, og utgjør minst 50 vekt-% av totalmengden komponenter som danner de gassfylte mikroboblenes omslag. I noen foretrukne utførelsesformer, kan i det vesentlige omslaget i sin helhet (dvs. minst 90 % og opp til 100 vekt-%), bli dannet av fosfolipider.
Fosfolipidene kan hensiktsmessig bli benyttet i blanding med en eller annen av de i det foregående opplyste amififile forbindelser. Således, for eksempel, kan lipider slik som kolesterol, ergosterol, fytosterol, sitosterol, lanosterol, tocoferol, propylgallat eller askorbylpalmitat, fettsyrer slik som myristinsyre, palmitinsyre, stearinsyre, arakidinsyre og derivater derav eller butylert hydrotoluen og/eller andre ikke-fosfolipide forbindelser kan eventuelt bli tilsatt til en eller flere av de foregående fosfolipider i proporsjoner som stammer fra 0 til 50 vekt-%, helst opp til 25 %. Særlig foretrukket er palmitinsyre.
Med sikte på å overbringe den ønskede samlede nettoladning til mikroboblen, må omslaget omfatte minst en komponent som bærer en samlet nettoladning, nærmere bestemt et ladet amfifilt materiale, helst et lipid eller et fosfolipid.
Eksempler på fosfolipider som bærer en samlet negativ ladning er derivater, nærmere bestemt fettsyrediestere, av fosfatidylserin, slik som DMPS, DPPS, DSPS; av fosfatidinsyre, slik som DMPA, DPPA, DSPA; av fosfatidylglyserol slik som DMPG, DPPG og DSPG Dessuten kan modifiserte fosfolipider, nærmere bestemt PEG-modifiserte fosfatidyletanolaminer, slik som DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3 000, DMPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3 000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PEG4000 eller DAPE-PEG5000 bli benyttet som negativt ladede molekyler. Også lyso-formen av de i det foregående nevnte fosfolipider, slik som lysofosfatidylserinderivater (dvs. lyso-DMPS, - DPPS eller -DSPS), lysofosfatidinsyrederivativer (for eksempel lyso-DMPA, -DPPA eller -DSPA) og lysofosfatidylglyserolderivativer (eksempelvis lyso-DMPG, -DPPG eller -DSPG), med fordel bli benyttet som negativt ladet forbindelse. Eksempler på negativt ladete lipider er gallesyresalter slik som kolinsyresalter, deoksykolinsyresalter eller glykokolinsyresalter; og C12-C24, helst C14-C22- fettysresalter slik som for eksempel, falmitinsyresalt, stearinsyresalt, l,2-dipalmitoyl-sn-3-succinylglyserolsalt eller 1,3-dipalitoyl-2-succinylglyserolsalt.
Helst, blir den negativt ladede forbindelse valgt blant DPPA, DPPS, DSPG, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG5000 eller blandinger derav.
Den negativt ladede komponent er typisk assosiert med et tilsvarende positivt motion, som kan være mono- (eksempelvis et alkalimetall eller ammonium), di- (eksempelvis et jordalkalimetall) eller tri-valent (eksempelvis aluminium). Helst blir motionet valgt blant alkalimetallkationer, slik som Li<+>, Na<+>eller iC , mer foretrukket Na .
Eksempler på fosfolipider som bærer en samlet positiv ladning er derivater av etylfosfatidylkolin, særlig estere av etylfosfatidylkolin med fettsyrer, slik som 1,2-disteraryl-sn-glysero-3-etylfosfokolin (Etyl-DSPC eller DSEPC), l,2-Dipalmitoyl-sn-glysero-3-Etylfosfokolin (Etyl-DPPC eller DPEPC). Det negative motion er helst et halogenion, særlig klor eller brom. Eksempler på positivt ladede lipider er alkylammoniumsalter med et halogent motion (eksempelvis klor eller brom) som omfatter minst en C10-C20, helst C14-C18, alkylkjede, slik som, for eksempel stearinammoniumklorid, heksadecylammoniumklorid, dimetyldioctadecylammoniumbromid (DDAB), heksadecyltrimetyl-ammoniumbromid (CTAB). Ytterligere eksempler på positivt ladede lipider er tertiære eller kvarternære ammoniumsalter med et halogent motion (eksempelvis klor eller brom) som omfatter en eller helst to C10-C20, helst C14-C18, acylkjeder, som er forbundet til N-atomet gjennom en C3-C6 alkylenbro, slik som, for eksempel, 1,2-distearoyl-3-trimetylammonium-propan (DSTAP), 1,2-dipalmityl-3-trimetyl-ammoniumpropan (DPTAP), l,2-oleyl-3-trimetylammoniumpropan (DOTAP), 1,2-distearoyl-3-dimetylammoniumpropan (DSDAP).
DSEPC, DPEPC og/eller DSTAP blir fortrinnsvis benyttet som positivt ladede forbindelser i mikrovesikkelens omslag.
Den positivt ladede komponent er typisk assosiert med et tilsvarende negativt motion, som kan være mono- (eksempelvis halogen), di- (eksempelvis sulfat) eller tri-valent (eksempelvis fosfat). Helst blir motionet utvalgt fra halogenatomet, slik som F" (fluor), Cl" (klor) eller Br" (brom).
Med sikte på å tillate en effektiv elektrostatisk interaksjon med MAC, bør den samlede mengde ladede forbindelser i mikrovesikkelens omslag være på minst en mol-% i forhold til den samlede mengde materialer som danner omslaget, eller minst 5 % og enda heller minst 10 %.. I noen foretrukne kombinasjoner av mikrovesikler og MAC-er har det vært observert at en mengde på minst 20 %, gjerne minst 40 % av ladede forbindelser i mikrovesikkelens omslag tillater binding av relativt høye mengder MAC-er til mikrovesiklene. Selv om den samlede mengde av mikrovesikkelens omslag i noen utførelsesformer kan bli dannet av ladede forbindelser, har det vært observert at det kan være fordelaktig å tilsette minst minimale mengder av nøytrale forbindelser til den formulering som utgjør omslaget. Gjerne, kan den samlede mengde ladet komponent således være lik med eller lavere enn ca. 95 mol-% i forhold til den samlede mengde komponenter som utgjør mikrovesikkelens omslag, helst lik med eller lavere enn 90 %, ned til særskilt foretrukne mengder som er lik med eller lavere enn 80 %.
Blandinger av nøytrale og blandede fosfolipider og/eller ladede lipider kan tilfreds-stillende bli benyttet for å danne mikrovesiklene i en sammenstilling ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Gjerne, blir blandingen av to eller flere lipider eller fosfolipider, minst et med en nøytral ladning og minst ett med en samlet nettoladning, benyttet. Enda heller, blir blandingen av to eller flere lipider eller fosfolipider, minst ett med nøytralt og minst en med positiv ladning benyttet, til oppnåelse av mikrovesikler med en samlet positiv ladning. Mengden ladet lipid eller fosfolipid kan variere fra ca. 95 % til en mol-%, i forhold til den samlede mengde lipid og fosfolipid, helst fra 80 % til 20 mol-%.
Foretrukne blandinger av nøytrale fosfolipider og ladede lipider eller fosfolipider er, for eksempel, DPPG/DSPC , DSTAP/DAPC, DPPS/DSPC, DPPS/DAPC, DSPA/DAPC,
DSPA/DSPC og DSPG/DSPC.
Andre eksipienter eller additiver kan foreligge enten i den tørre formulering eller kan bli tilsatt sammen med den vandige bærer som benyttes til rekonstitueringen, uten nød-vendigvis å være involvert (eller bare delvis involvert) i dannelsen av mikrovesikkelens stabiliserende omslag. Disse inkluderer pH regulatorer, osmolalitet-tilpassere, viskositetsforbedrere, emulgatorer, fyllmidler, etc. og kan bli benyttet i konvensjonelle mengder. Eksempelvis kan forbindelser i likhet med polyoksypropylenlykol og polyoksyetylenglykol så vel som kopolymerer derav bli benyttet. Eksempler på viskositetsforbedrere eller stabilisatorer er forbindelser som blir utvalgt fra lineære og tverrbundede poly- og oligosakkarider, sukkere, hydrofile polymerer i likhet med polyetylenglykol.
I det prepareringen av gassfylte mikrovesikler kan involvere et frysetørket- eller sprøytetørkingstrinn, kan det være fordelaktig i formuleringen å inkludere ett eller flere midler med tiobeskyttende og/eller lyobeskyttende virkning og/eller ett eller flere fyllstoffer, for eksempel en aminosyre slik som glysin; en karbohydrat, eksempelvis et sukker slik som sukrose, mannitol, maltose, trehalose, glukose, laktose eller et cyklodekstrin, eller et polysakkarid slik som dekstran; eller en polglykol slik som polyetylenglykol.
De mikrobobler som er anvendelige i en sammenstilling ifølge oppfinnelsen kan bli produsert i samsvar med enhver kjent fremgangsmåte innen faget. Typisk involverer produksjonsmetoden preparering av et gitt pulverformet materiale som omfatter et amfifilt materiale som indikert i det foregående, fortrinnsvis lyofilisering (frysetørking) av en vandig eller organisk suspensjon som omfatter materialet.
For eksempel, som beskrevet i WO 91/15244 kan de filmdannende amfifile forbindelser først bli omdannet til en lamelær form ved en liposomdannende metode. For eksempel, kan en vandig løsning som omfatter de filmdannende lipider og valgfritt øvrige additiver (eksempelvis viskositetsforbedrede, ikke filmdannende surfaktanter, eller elektrolytter etc.) bli levert til høyhastighets mekanisk homogenisering eller til sonikering under akustiske eller ultrasoniske betegnelser, og deretter frysetørket til dannelse av et frittstrømmende pulver som deretter lagres i nærvær av en gass. Valgfrie vasketrinn, som beskrevet for eksempel i US5,5970549 kan bli utført før frysetørking.
Ifølge en alternativ utførelsesform (beskrevet for eksempel i den i det foregående nevnte US 5,597,549) kan en filmdannende forbindelse og en hydrofil stabilisator (eksempelvis polyetylenglykol, polyvinyl pyrrolidon, polyvinylalkohol, glykolsyre, eplesyre eller maltol) bli oppløst i et organisk løsningsmiddel (for eksempel tertiært butanol, 2-metyl-2-butanol eller C2CI4F2) og løsningen kan deretter bli frysetørket til dannelse av tørt pulver.
Alternativt, som beskrevet i den i det foregående nevnte WO 04/069284, kan en fosfolipid (valgt fra de i det foregående nevnte og inklusive minst en av de foregående identifiserte ladede fosfolipider) og et lyobeskyttende middel (slik som de foregående opplistede, særlig karbohydrater, sukkere og alkoholer, polyglykoler og blandinger derav) blir dispergert i en emulsjon av vann med et vannløselig organisk løsningsmiddel (eksempelvis forgrenede eller lineære alkaner, alkener, sykloalkaner, aromatiske hydrokarboner, alkyleter, ketonet, halogenerte hydrokarboner, perfluorinerte hydrokarboner og blandinger derav). Den således oppnådde emulsjon, som inneholder mikrodråper av løsningsmiddel omgitt og stabilisert av fosfolipid materiale (og valgt ut av andre amfifile filmdannende forbindelser), blir deretter lyofilisert ifølge konvensjonelle teknikker til oppnåelse av et lyofilisert materiale, som blir lagret (eksempelvis i et glass i nærvær av en egnet gass) og som kan bli rekonstituert med en vandig bærer for til slutt å gi en gassfylt mikroboblesuspensjon.
En ytterligere prosess for preparering av gassfylte mikrobobler omfatter generering av en gass mikrobobledispersjon ved å utsette et vandig medium som omfatter et fosfolipid (og eventuelt andre amfifile filmdannende forbindelser og/eller additiver) for en styrt sterk agitasjonsenergi (eksempelvis ved hjelp av en rotor stator mikser) under nærvær av en ønsket gass og underlegge den oppnådde dispersjon lyofilisering for å gi et tørket rekonstituerbart produkt. Et eksempel på den prosess er, for eksempel gitt i WO 97/29782.
Sprøytetørkingsteknikker (som beskrevet for eksempel i US 5,605,673) kan også bli benyttet for å oppnå det tørkede produkt som inneholder mikrovesiklene for sammenstillingen ifølge oppfinnelsen.
Det tørkede eller lyofiliserte produkt som oppnås med en av de ovenstående teknikker vil generelt foreligge i form av et pulver eller kake, og kan bli lagret (eksempelvis i et glass) i kontakt med den ønskede gass. Produktet er med lettet rekonstituerbart i en egnet vandig flytende bærer, som er fysiologisk akseptabel, steril og injiserbar, for å danne de gassfylte mikrovesiklene. Egnede flytende bærere er vann, vandige løsninger slik som salin (som med fordel kan bli balansert slik at det endelige produkt for injeksjon ikke er hypotonik), eller løsningen av en eller flere tonisitetsjusterbare substanser slik som salter eller sukkere, sukkeralkoholer, glykoler eller andre ikke-ioniske polyolmaterialer (eksempelvis glukose, sukrose, sorbitol, mannitol, glyserol polyetylenglykoler, propylenglykoler og lignende).
Mikroballonger
Andre gassfylte mikrovesikler som er egnet for en sammenstilling ifølge oppfinnelsen blir innen faget henvist til som mikroballonger. Generelt, har disse gassfylte mikrovesikler ett materialomslag hvis tykkelse er større enn tykkelsen av mikroboblenes stabiliserende filmomslag. Avhengig av det materialet som danner omslaget (som kan være eksempelvis polymer, proteinholdig, av et vannløselig lipid eller enhver kombinasjon derav), er tykkelsen generelt minst 50 nm, typisk minst 100 nm, opp til noen få hundre nm, eksempelvis 300 nm).
Mikroballonger atskiller seg også generelt fra mikrobobler når det dreier seg om akustisk respons overfor ultrasonikering. Selv om mikrobobler ultrasoniske atferd faktisk er nærmere atferden til frie gassbobler, gir mikroballonger (trolig pga. omslagets høye stivhet) generelt mindre respons (når det dreier seg om intensitet av det reflekterte ekkosignalet) når bestrålt ved lave nivåer av akustisk trykkenergi (eksempelvis ved en mekanisk indeks ca. 0,1).
Eksempler på mikroballonger som er egnet til preparering av en sammenstilling ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis mikroballonger med et polymert omslag, som helst omfatter en biodegraderbar polymer, eller et omslag på basis av biodegraderbare vannløslige lipider, slik som, for eksempel, de som er beskrevet i US5,711,933 og US 6,333,021. Mikroballonger med et proteinholdig omslag, blir frembrakt av naturlige proteiner
(albumin, hemoglobin) i likhet med de som er beskrevet i US-A-4,276,885 eller EP-A-0 324 938, kan også bli benyttet.
Polymerer som danner omslaget i injiserbare mikroballonger er fortrinnsvis hydrofile, biodegraderbare fysiologisk kompatible polymerer. Eksempler på slike polymerer, som kan være naturlige eller syntetiske, er i det vesentlige uløselige polysakkarider (eksempelvis kitosan eller kitin), polycyanoakrylater, polyaktider og polyglykolider og deres kopolymerer, kopolymerer av laktider og laktoner slik som y-kaprolakton eller 8-valerolakton, kopolymerer av etylenoksid og laktider, polyetyleniminer, polypeptider, og proteiner kopolymerer av etylenoksid og laktider, polyetyleniminer, polypeptider og proteiner slik som gelatin, kollagen, globuliner eller albuminer. Andre egnede polymerer som er nevnt i den i det foregående nevnte US 5,711,933 inkluderer poly-(orto)estere, polylmelkesyre og polyglykolsyre og deres kopolymerer (eksempelvis DEXON®, Davis & Geck, Montreal, Canada); poly(DL-laktid-co-y-kaprolakton), poly(DL laktid-co-5-valerolakton), poly(DL-laktid-co-y-butyrolakton), polyalkylcyano-akrylater; polyamider, polyhydroksybutyrat; polydioksanon; poly-6-aminoketoner; polyfosfazener; og polyanhydrider. Polyaminosyrer slik som polyglutamin- og poly-aspartinsyre kan også bli benyttet, så vel som deres derivater, slik som delvise estere med lavere alkoholer eller glykoler. Kopolymerer med andre aminosyrer slik som metionin, leucin, valin, prolin, glysin, alanin, etc. kan også bli benyttet. Derivater av polyglutamin- og polyaspartansyre med styrt biodegraderbart (slik som de beskrevne i VO87/03891, US 4,888,398 eller EP 130935..) kan også bli benyttet. Disse polymerer (og kopolymerer med andre amionosyrer) har formler av den følgende type: -(NH-CHA-CO)w-(NH-CHX-CO)y- hvor x betegner sidekjeden av en aminosyrerest (eksempelvis metyl, isopropyl, isobutyl eller benzyl); en er en gruppe av formel -(CH2)nCOOR^R<2>-OCOR, -(CH2)„ COO-Cffi^COOR, -(CH2)„ CO(NH-CHX-CO)mNH-CH(COOH)-(CH2)p COOH, eller de respektive anhydrider derav hvori R<1>og R<2>representerer H eller lavere alkyler, og R representerer alkyl eller aryl; eller R og RI er knyttet sammen ved et substituert eller usubstituert lengdeorgan til frembringelse av 5 eller 6-leddede ringer, n, m og t er lavere heltall, som ikke overskrider 5; og w og y er heltall som er utvalgt til å ha molekylvekter ikke under 5000.
Ikke-biodegraderbare polymerer (eksempelvis til frembringelse av mikroballonger som skal benyttes i fordøyelseskanalen) kan bli utvalgt fra de fleste vannuløselige, fysiologisk akseptable, bioresistente polymerer inklusive polyolfiner (polystyren), akryl-resiner (polyakrylater, polyakrylonitril), polyestere (polykarbonat), polyuretaner, polyurea og deres kopolymerer. ABS (akryl-butadien-styren) er en foretrukket kopolymer.
Biodegraderbare vannuløselige lipider som er egnet til dannelse av en mikroballong for en sammenstilling ifølge oppfinnelsen omfatter, for eksempel, faste vannuløselige mono-, di- eller triglyserider, fettsyrer, fettsyreestere, steroler slik som kolesterol, vokser og blandinger derav. Mono- di- og triglyserider inkluderer hovedsaklig mono-, di- og trilaurinforbindelser så vel som de tilsvarende -myristin, -palmitin, -stearin, - arakidin og -behenin derivativer. Mono-, di- and tri- myristin, -palmitin -stearin og blandede triglyserider slik som dipalmitoylmonooleylglyserid er særlig egnede; trippalmitin og tristerain er foretrukket. Fettsyrer inkluderer faste (ved romtemperatur, ca 18-25 °C ) fettsyrer (helst mettede) med 12 karbonatomer eller mer, inklusive, f.eks., laurin-, arakidin-, behen-, palmitin-, stearin-, sebacin-, myristin-, cerotin-, melissin- og erucinsyrer og fettsyreesterne derav. Helst, blir fettsyrene og deres estere benyttet I blanding sammen med andre glyserider.
Sterolene blir fortrinnsvis benyttet i sammenblanding med de øvrige glyserider og/eller fettsyrer og blir valgt fra kolesterol, fytosterol, lanosterol, ergosterol etc. og estere av sterolene med de ovenfor nevnte fettsyrer; Imidlertid foretrekkes kolesterol.
Foretrukne biodegraderbare lipider er triglyserider slik som trippalmitin, tristearin eller blandinger av de ovenfor nevnte triglyserider.
Eventuelt, kan opp til 75 vekt-% av biodegraderbar polymer, slik som de tidligere opplistede, bli blandet sammen med den biodegraderbare vannuløselige lipid som danner mikroballongenes omslag.
Med fordel, kan ioniske polymerer (dvs. polymerer som bærer ioniske enheter i sin struktur), fortrinnsvis biodegraderbare ioniske polymerer, også bli benyttet til dannelse av mikroballongenes stabiliserende omslag, for således å tildele den ønskede samlede nettoladning dertil. Ioniske polymerer kan bli benyttet som hovedkomponenter i det stabiliserende omslag eller de kan bli blandet inn i ulike mengder (eksempelvis fra 2 til 80 vekt-%) sammen med ikke-ioniske polymerer. Egnede ioniske polymerer er, for eksempel, polymerer som omfatter et kvarterniserende hydrogenatom, slik som kvarterniserte aminer eller polymerer som omfatter en karbosyklisk, sulfat-, sulfonat-, fosfonatenhet. Eksempler på egnede ioniske polymerer inkluderer, uten begrensning, Polyetylenimin, poly(dialyldimetylammonium klorid), poly{bis(2-kloroetyl)eter-alt-l,3-bis[3-(dimetylamino)propyl]urea} kvarternisert (Polyquaternium -2), poly(4-vinylpyridinium tribromid), hydroksyetylcellulose etoksylat kvarternisert (Polyquaternium -4, poly(p-xylen tetrahydrotiofeniumklorid), poly(L-lysin), kitin, dietyleneaminoetyldekstran, poly(akrylsyre), poly(metakrylsyre), poly(styren-a/£-maleinsyre), poly(aminosyre), alginsyre, poly(uridylsyre) , hyaluronsyre, dvs. poly(J3-glukuronsyre-a/?-J3-N-acetylclucosamid), poly(galacturonsyre), poly(vinyl acetat-co-crotonsyre), DNA, poly(3,3',4,4'-benzofenonetetracarboksylisk dianhydrid-cø-4,4'-oksydianilin), poly(isopren-gr<q>/?- maleinsyre monometyleter), kopolymer av glutaminsyre med alkylglutammat, heparin, poly(styrensulfonat), sulfonert poly(isoftalsyre), poly(vinylsulfonat, kaliumsalt), poly(vinylsulfat, kaliumsalt), kondroitinsulfat A, dekstransulfat, fucoidan, polyfosforsyre, natriumpolyfosfat, natrium-polyvinylfosfonat, poly-L-lisin hydrobromid, kitosan, kitosan sulfat, natriumalginat, alginsyre og ligninsulfonat.
Konvensjonelle additiver kan også bli inkorporert inn i ballongenes omslag, for å modifisere fysikalske egenskaper, slik som dispergerbarhet, elastisitet og vanngjennom-trengelighet. Nærmere bestemt, kan virksomme mengder av amfifile materialer bli tilsatt til den emulsjon som er preparert for fremstilling av mikroballongene, med sikte på å øke stabiliteten derav. Materialene kan med fordel bli valgt blant disse amfifile forbindelser, slik som lipider, fosfolipider og modifiserte fosfolipider, som er opplistet i det foregående av denne beskrivelsen.
Det tilsatte amfifile materialet kan med fordel være en forbindelse som bærer en samlet netto ladning. Foretrukne ladede lipider, fosfolipider og modifiserte fosfolipider er de som er opplistet i det foregående.
Med sikte på å muliggjøre en effektiv elektrostatisk interaksjon med MAC, bør den samlede mengde ladet additiv i mikroballongens omslag være på minst en mol-% med hensyn til den samlede mengde materiale som danner omslaget. Den samlede mengde av ladet komponent er imidlertid helst lavere enn ca. 70 mol-% med hensyn til den samlede mengde av det materialet som danner mikroballongens omslag. Helst er mengden ladet forbindelse fra ca 2 % til ca 40 %.
Andre eksipienter eller additiver, som nærmere bestemt blir benyttet til preparering av mikroballonger, kan bli inkorporert i omslaget, slik som redispergerende midler eller viskositetsforbedrere.
Biodegraderbare polymerholdige mikroballonger kan, for eksempel, bli preparert ifølge den prosessen som er beskrevet i US 5,711,933. som omfatter (a) emulgering av en hydrofob organisk fase inn i en vannfase for å oppnå dråper av den hydrofobe fase som en olje-i-vannemulsjon i vannfasen; (b) tilsetting til emulsjonen en løsning av minst en polymer i et flyktig løsningsmiddel som er uløselig i vannfasen, slik at polymeren danner et lag rundt dråpene; (c) fordamping av det flyktige løsningsmidlet slik at polymeren deponeres ved grensesnittutfelling rundt dråpene som deretter danner perler med en kjerne av den hydrofobe fase innkapslet av et membran av polymeren, idet perlene foreligger i suspensjonen i vannfasen; (d) fjerning av den innkapslede hydrofobe fase ved fordampning ved å utsette suspensjonen for redusert trykk; og (e) erstatte den inndampede hydrofobe fase med en egnet gass.
Biodegraderbare lipidholdige mikroballonger kan, for eksempel bli preparert ifølge den prosessen som er beskrevet i US 6,333,021, ved å dispergere en blanding av flere faste bestanddeler av mikrokapselomslaget som oppløst i et organisk løsningsmiddel i en vannbærerfase, for derved å produsere en olje-i-vannemulsjon. Emulsjonsvannfasen kan inneholde en virksom mengde av amfifile materialer som er benyttet til å stabilisere emulsjonen.
En viss mengde av det dispergerende middel og/eller av et kryobeskyttende eller lyobeskyttende middel, slik som tidligere indikert, blir dette tilsatt til emulsjonen av små dråper av den organiske fase i vannfasen, forut for nedfrysing til en temperatur under -30 °C. Ethvert hensiktsmessig redispergerende middel kan bli benyttet; redispergerende midler som er valgt fra sukkere, albumin, gelatin, polyvinyl, pyrolidon (PVP), polyvinylalkohol (PVA), polyetylenglykol (PEG) og etylenoksid-propylenoksidblokk-kopolymer (eksempelvis Pluronic<®>, eller Synperonic<®>) eller blandinger derav er foretrukket. I redispergerende midler som blir tilsatt for å forhindre partikkelaggiomerering er særlig nyttige når mikrokapslene foreligger i form av ikke-koaliserende, tørre og øyeblikkelig dispergerbare pulvere. Den frosne emulsjon blir dertil underlagt redusert trykk for å bevirke lyofilisering, dvs. fjerning ved sublimering av den organiske løsningen fra dråpene og fra bærerfasens vann, og det frysetørkede produkt blir deretter kontaktet med den ønskede gass.
Biokompatibel gass
Enhver biokompatibel gass, gassforløper eller blanding derav kan bli benyttet for å fylle ovennevnte mikrovesikler, idet gassen blir valgt avhengig av den valgte modalitet.
Gassen kan, for eksempel, omfatte luft; nitrogen; oksygen; karbondioksid; hydrogen; dinitrogenoksid; en edel eller inert gass slik som helium, argon, xenon eller krypton; en radioaktiv gass slik som Xe 133 eller Kr 81; en hyperpolarisert edelgass slik som hyperpolarisert helium, hyperpolarisert xenon eller hyperpolarisert neon; hydrokarbon av lav molekylvekt (eksempelvis inneholdende opptil 7 karbonatomer), for eksempel et alkan slik som metan, etan, propan, butan, isobutan, pentan eller isopentan, en sykloalkan slik som syklobutan eller syklopentan, en alken slik som propen, buten eller isobuten, eller en alkyn slik som acetylen; en eter; et keton; en ester; halogenere gasser, foretrukket fluorinerte gasser, slik som halogenerte-, fluorinerte- eller prefluorinerte hydrokarboner av lav molekylvekt (eksempelvis inneholdende opptil 7 karbonatomer); eller en blanding av noen av de foregående. Hvor et halogenert hydrokarbon blir benyttet, er gjerne noen, enda heller alle, av halogenatomene i forbindelsen fluoratomer.
Fluorinerte gasser blir foretrukket, nærmere bestemt perfluorinerte gasser, særlig innen området ultralyd-imaging. Fluorinerte gasser inkluderer materialer som inneholder minst et fluoratom slik som for eksempel fluorinerte hydrokarboner (organiske forbindelser som inneholder ett eller flere karbonatomer og fluor); som heksafluorid; fluorinerte, helst perfluorinerte, ketoner slik som perfluoraceton; og fluorinerte, helst perfluorinerte, etere slik som perfluordietyleter. Foretrukne forbindelser er perfluorinerte gasser, slik som SF6eller perfluorkarboner (perfluorinerte hydrokarboner), dvs. hydrokarboner hvor alle hydrogenatomene er erstattet med fluoratomer, hvilke er kjent for å danne særlig stabile mikroboblesuspensjoner, som beskrevet, for eksempel, i EP 0554 213.
Termen perfluorkarbon inkluderer mettede, umettede og sykliske perfuorkarboner. Eksempler på biokompatible, fysiologisk akseptable perfluorkarboner er: perfluor-alkaner, slik som perfluormetan, perfluoretan, perfluorpropaner, perfluorbutaner (eksempelvis perfluor-n-butan, eventuelt i blanding med andre isomerer slik som perfluor-isobutan), perfluorpentaner, perfluorheksaner eller perfluorheptaner; perfluoralkener, slik som perfluorpropen, perfluorbutener (eksempelvis perfluorbut-2en) eller perfluorbutadien; perfluoralkyner (eksempelvis perfluorbut-2-yn); og perfluorsykloalkaner (eksempelvis perfluorosyklobutan, perfluormetylsyklobutan, perfluordimetylsyklobutaner, perfluortrimetylsyklobutaner, perfluorsyklopentan, perfluormetylsyklopentan, perfluordimetylsyklopentaner, perfluorsykloheksan, perfluormetylsykloheksan og perfluorsykloheptan). Foretrukne mettede perfluorkarboner har formelen CnFn+2, hvor n er fra 1 til 12, gjerne fra 2 til 10, enda heller fra 3 til 8 og enda heller fra 3 til 6. egnede perfluorkarboner inkluderer for eksempel CF4,
C2F6, C3F8, C4F8, C4<F>10, C5<F>12, C6<F>12, C6<F>14,<C>7<F>14,<C>7<F>16, C8<F>18, og<C>9<F>20-
Særlig foretrukne gasser er SF6eller perfluorkarboner som er valgt fra CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10eller blandinger derav SF6, C3F8eller C4F10er særlig foretrukket.
Det kan også være fordelaktig å benytte en blanding av de ovennevnte gasser i ethvert forhold. For eksempel, kan blandingen omfatte en konvensjonell gass, slik som nitrogen, luft eller karbondioksid og en gass som danner en stabil mikroboblesuspensjon, slik som svovelheksafluor eller en perfluorkarbon som indikert i det foregående. Eksempler på egnede gassblandinger kan, for eksempel bli funnet i WO 94/09829. De følgende kombinasjoner er særlig foretrukne: en blanding av gasser (A) og (B) i hvilke gassen (B) er en fluorinert gass, helst valgt fra SF6, CF4, C2F6, C3F6, C3F8, C4F6, C4F8, C4<F>10,<C>5<F>10, C5F12eller blandinger derav, og (A) er valgt fra luft, oksygen, nitrogen, karbondioksid eller blandinger derav. Mengden gass (B) kan representere fra ca. 0,5 % til ca. 95 volum-% av den samlede blanding, helst fra ca. 5 % til ca 80 %.
Under visse omstendigheter kan det være ønskelig å inkludere en forløper til en gassformig substans (eksempelvis materiale som er i stand til å bli omdannet til en gass in vivo). Fortrinnsvis er den gassformige forløper og den gass som avledes derav fysiologisk akseptabel. Den gassformige forløper kan bli pH-aktivert, fotoaktivert, temperaturaktivert etc. For eksempel, kan visse perfluorkarboner bli benyttet som temperaturaktiverte gassformige forløpere. Disse perfluorkarboner slik som perfluor-pentan eller perfluorheksan, kan ha en væske-/gassfase over romtemperatur (eller den temperatur ved hvilke midlene blir produsert og/eller lagret), men under kropps-temperatur; således gjennomgår de en væske/gassfasetransisjon og blir omdannet til en gass innen menneskekroppen.
For ultrasonisk ekkografi, blir den biokompatible gass eller gassblanding helst utvalgt fra luft, nitrogen, karbondioksid, helium, krypton, xenon, argon, metan, halogenerte hydrokarboner (inklusive fluorinerte gasser slik som perfluorkarboner og svovelheksa-fluorid) eller blandinger derav. Fortrinnsvis, kan perfluorkarboner (særlig C4F10eller C^ Fg) eller SF6anvendes, eventuelt i blanding sammen med luft eller nitrogen.
For anvendelse av sammenstillingen i MRI inneholder mikrovesiklene helst en hyperpolarisert edelgass slik som hyperpolarisert neon, hyperpolarisert helium, hyperpolarisert xenon, eller blandinger derav, eventuelt i blanding sammen med luft, C02, oksygen, nitrogen, helium, xenon, eller et hvilket som helst av de halogenerte hydrokarboner som definert over.
For anvendelse i scintigrafi, vil mikrovesikkelen for en sammenstilling ifølge oppfinnelsen helst inneholde radioaktive gasser slik som Xe<133>eller Kr<81>eller blandinger derav, eventuelt i sammenblanding med luft, CO2, oksygen, nitrogen, helium, krypton eller en av de halogenerte hydrokarboner som definert i det foregående.
Mikrovesikkelens assosierte komponent (MAC)
Den andre komponent i den sammenstilling som er assosierte til mikrovesikkelen MAC kan være enhver strukturell enhet som omfatter et biokompatibelt overflateaktivt middel som bærer en samlet netto ladning. Nærmere bestemt, er den strukturelle enhet helst en supermolekylær struktur som dannes ved assosiasjoner av et flertall av helst amfifile, molekyler. I noen utførelsesformer, blir den ladede forbindelse blandet sammen med andre overflateaktive midler og/eller additiver som er nøytrale. MAC kan videre omfatte en ønsket målrettende ligand, bioaktivt middel og/eller diagnostiserende middel, avhengig av sammenstillingens spesifikke anvendelsesområde. Biokompatible overflateaktive materialer er egnet til preparering til en MAC for en sammenstilling ifølge oppfinnelsen kan bli utvalgt blant de i de foregående oppviste forbindelser, slik som organiske (C2-C10) syrer, organiske fettsyrer omfattende en (C12-C24), gjerne en (C14-C22), alifatisk kjede, i farmasøytisk akseptable (alkali)salter derav, og de respektive estere med polyoksyetylen, slik som palmitinsyre, stearinsyre, arakiodonsyre, oljesyre, natriumdodekanoat, natriumoksalat eller natrium tartrat eller polyoksyetylenfettsyre-stearat; polyioniske (alkali)salter slik som natriumcitrat, natruimpolyakrylat, natriumfosfat; organiske aminer, amider, kvarternære amin(halid)salter, foretrukket inneholdende en C8-C22hydrokarbonkjede, inklusive polyoksylerte derivater derav, slik som etanolamin, trietanolamin, alkylaminer, alkanolamider, trimetylalkyliminklorid, polyoksyletylerte alkylaminer, polyoksylerte alkanolamider; aminosyrer, fosfolipider, slik som fettsyrediestere av fosfatidylkolin, etylfosfatidylkolin, fosfatidylglyserol, fosfatidinsyre, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin eller av sfingomyelin, estere av mono- eller oligosakkardier med (C12-C24), foretrukket en(Ci4-C22), organisk fettsyre slik som sorbitanlaurat, polymere surfaktanter, dvs. blokk-kopolymerer som inkluderer hydrofobe og hydrofile partier, slik som etylenoksid/propylenoksid blokk-kopolymerer; organiske sulfonater; perfluororaniske syrer, slik som perflurooktansyre; og blandinger derav. Foretrukne forbindelser er de nøytrale eller ladede amfifile materialer som tidligere er listet blant de egnede komponenter i mikrobobler, inklusive lipider, fosfolipider og modifiserte fosfolipider. En foretrukket MAC er i form av en micelle.
Prepareringen av MAC kan bli oppnådd ifølge konvensjonelle teknikker, eksempelvis ved å dispergere de relevante komponenter som danner MAC i en vandig bærer og eventuelt vaske den oppnådde suspensjonen med sikte på å fjerne overskuddsmateriale.
Den andre komponenten er en nanokomponent, dvs. dens relative dimensjon er ca. 100 nm eller lavere, foretrukket på ca 80 nm eller lavere og mer foretrukket på ca 50 nm eller lavere. Dimensjonene på en MAC, særlig dens tallmessige gjennomsnittsdiameter, kan bli bestemt ifølge konvensjonelle teknikker, slik som for eksempel fotokorrelasjons-spektroskopi. For eksempel, kan et ZetaSizer 300 ha (Malvern Instruments GmbH) bli benyttet. Særlig når MAC inkorporeres en ønsket målrettende ligand, et bioaktivt middel og/eller diagnostisk middel innen sin struktur, er dens dimensjoner gjerne på minst 0,1 nm, enda heller på minst 1 nm.
Foretrukket har MAC en gjennomsnittsdimensjon som er minst 10 ganger mindre enn den gjennomsnittlige dimensjon til de mikrovesikler til hvilke MAC er assosiert, enda heller på minst 50 ganger mindre. Denne gjennomsnittlige dimensjonen er generelt lavere enn 1000 ganger, helst ikke lavere enn 500 ganger.
Slik det kan forstås er det, på grunn av de relativt mindre dimensjoner for MAC i forhold til den gassfylte mikrovesikkelen, mulig å assosiere et relativt stort antall MAC-er til mikrovesiklene, for således å øke sammenstillingens effektivitet i form av et høyere antall bindende målrettende enheter og/eller av mengden frigjørbart terapeutisk eller diagnostisk middel som er inkorporert deri. Dessuten, muliggjør de relativt små dimensjoner for MAC å oppnå sammenstillinger med dimensjoner som er sammenlign-bare med mikrovesiklenes dimensjoner. Det foretrekkes faktisk at den tallmessige gjennomsnittsdiameter av en sammenstilling ifølge oppfinnelsen ikke er mer enn 30 % høyere enn mikrovesikkelens gjennomsnittsdiameter målt før sammenstillingen, mer foretrukket ikke mer enn 20 % og enda mer foretrukket ikke mer enn 10 %. 1 noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, kan det ladede materialet utgjøre i det vesentlige totaliteten av MAC, dvs. 90 % eller mer. I noen andre utførelsesformer, er det best om de ladede molekyler som danner strukturen for MAC ikke representerer totaliteten av de forbindelser som danner strukturen, idet de er blandet sammen med en viss mengde nøytrale forbindelser. Slike ladede molekyler kan således representere mindre enn ca. 90 mol-% av den totale mengde av det materialet som danner MAC. På den annen side, er det ifølge oppfinnelsen observert at mengden ladede molekyler i MAC helst bør være på minst 0,5 mol-% i forhold til den samlede mengde materiale som danner omslaget, med sikte på å muliggjøre en effektiv interaksjon med den ladede mikrovesikkelen. Foretrukket er mengden på minst 1 %, mer foretrukket på minst 2 mol-%. I noen foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, er den mengden ladede molekyler som danner strukturen for MAC helst på ca. 50 % eller lavere, mer foretrukket på ca. 20 % eller lavere.
Miceller
Som tidligere nevnt, er en foretrukket komponent som kan bli assosiert med en mikrovesikkel i sammenstillingen ifølge oppfinnelsen en micelle. Termen "micelle" inkluderer, slik det anvendes heri, både miceller og blandede miceller, hvor termen blandede miceller viser til en micellær struktur som dannes av en blanding av to eller flere ulike forbindelser, hvorav minst en er en amfifil forbindelse som er i stand til å danne en micellær struktur. Termen blandede miceller inkluderer således innen sin betydning også miceller som dannes av minst en forbindelse, fortrinnsvis en amfifil forbindelse, som generelt er ute av stand til å danne en micellær struktur ved disper-gering som sådan i en vandig bærer, men som er i stand til å danne strukturen ved anvendelse i kombinasjon med egnede mengder av en micelledannende amfifil forbindelse. Eksempler på blandede miceller er miceller som dannes av umodifiserte fosfolipider (som generelt ikke er i stand til å danne miceller når dispergert som det ene materialet i en vandig bærer) og av en micelledannende forbindelse (eksempelvis PEG-modifisert fosfolipid eller fettsyresalt). Slik det er kjent innen faget, blir miceller dannet av amififile molekyler som er dispergert i vann når disse molekylers konsentrasjon overstiger en forutbestemt verdi kjent som CMC (kritisk micellær konsentrasjon). Ved konsentrasjoner under CMC, er molekylet generelt dispergert i den vandige løsningen som enkeltmolekyl. Over CMC, tenderer de amfifile molekyler til å organiseres i supermolekylære strukturer, i likevekt med de frie molekyler i løsningen, idet strukturene er kjennetegnet av det faktum at molekylenes hydrofobe (lipide) hale blir dispergert henimot strukturens indre parti mens den hydrofile (polare eller ioniske) hodegruppe for molekylet blir dispergert for strukturens ytre parti. Et amfifilt molekyls CNC kan bli bestemt eksperimentelt ved anvendelse av teknikker som er vanlige innen faget. For eksempel, kan en surfaktant CMC bli bestemt ved å plotte en egenskap som en funksjon av surfaktantens konsentrasjon. Egenskapen varierer vanligvis lineært med surfaktantkonsentrasjonen og etter denne konsentrasjon, blir kurven (eller egenskapen) ikke-lineær. Egnede egenskaper som kan bli benyttet til bestemmelse av CMC inkluderer bøyningsindeks, lysspredning, overflatespredning, elektrisk ledningsevne, osmotisk trykk og lignende. Til formål ifølge oppfinnelsen, er foretrukne micelle-dannende materialer de som har relativt lav CMC, eksempelvis på ca 10 mM eller lavere.
Miceller har typisk en dimensjon som omfattes av ca 0,1 nm til ca. 100 nm, fortrinnsvis fra ca 1 nm til ca 50 nm. Den antallsmessige gjennomsnittsdiameter (DN) er på ca 50 nm eller mindre, gjerne på ca 20 nm eller mindre og enda heller på 10 nm eller lavere, ned til eksempelvis 1 nm, fortrinnsvis ca. 2 nm.
En oversikt over miceller, micellære systemer og metoder for preparering derav kan, for eksempel bli funnet i referanseboken: "Surfactants and Polymers in Drug Delivery", by M. Malmsten, Ch. 2, s. 19-50, Marcel Dekker Inc. Ed., 2002).
Egnede materialer for danning av miceller som skal bli assosiert med mikrovesikler i en sammenstilling ifølge oppfinnelsen, kan bli utvalgt blant de lipide- og fofolipide materialer som tidligere er opplistet.
Eksempler på micelle dannende forbindelser er PEG-modifiserte fosfolipider, inklusive særlig PEG-modifiserte fosfatidyletanolaminer slik som DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PEG4000 eller DAPE-PEG5000; alkylammoniumsalter som omfatter minst en (C10-C20), helst (C14-Ci8), alkylkjede, slik som, for eksempel stearylammoniumklorid, heksadecylammoniumklorid, dimetyldioctadecylammoniumbromid (DDAB), heksadecyltrimetyl-ammoniumbromid (CTAB), tertiære eller kvarternære ammoniumsalter som omfatter en eller helst 2 (C10-C20), helst (Ch-Cis), acylkjeder som er forbundet med N-atomet gjennom en (C3-C6) alkylenbro, slik som l,2-distearoyl-3-trim etylammonium-propan (DSTAP), l,2-dipalmitoyl-3-trimetylammonium-propan (DPTAP), l,2-dioleoyl-3-trimetylammonium-propan (DOTAP), 1,2-distearoyl-3-dimetylammonium-propan (DSDAP); fettsyresalter, helst alkali, særlig natriumsalter, slik som natriumpalmitat, natriumstearat, natriumoleat, natriumlinoleat, natriumdodecanoat, l,2-dipalmitoyl-sn-3-succinylglyseratnatriumsalt eller 1,3-dipalmitoyl-2-succinylglyserolnatriumsalt.
Polymerer som inkluderer hydrofobe og hydrofile partier deri (også kjent som "polymere surfaktanter") kan også bli benyttet til å preparere micellære suspensjoner. Eksempler på egnede polymeriske surfaktanter inkluderer, uten begrensning, polyetylenoksider (PEO), slik som (Cg-C^n-alkyl PEO monoeter, (Cg-Cio)n-alkyl fenyl PEO, tetrametylbutylfenyl PEO, PEO polysorbater, disse PEO blir solgt under kommer-sielle navn som Brij , Lubrol , Triton , Nonidet eller Tween ; blokk kopolymerer slik som etylenoksid/propylenoksid blokk-kopolymerer (eksempelvis Pluronic eller Synperonic<®>) helst en molekylvekt på ca 3000 til 20000 dalton, foretrukket på fra 5000 til 15000 dalton; sukkerderivater slik som (C6-Cio)alkyl-P-D-glukopyranosid, ( Cg-Ci2)alkyl-P-D-maltosid; (C8-Ci6)alkyldimetylammoniumpropan-sulfonat; og gallesyrer og derivater derav, slik som natriumkolat eller natriumdoksykolat.
Ytterligere lipider som kan bli benyttet til å preparere en micelle som skal bli inkludert i en sammenstilling ifølge oppfinnelsen inkluderer, for eksempel, umodifiserte fosfolipider, slik som tidligere nevnte fettsyrediestere av fosfatidylkolin, etylfosfatidylkolin, fosfatidylglyserol, fosfatidinsyre, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin eller sphingo-myelin. Idet disse umodifiserte fosfolipider generelt er ute av stand til å danne micellære strukturer når dispergert i en vandig bærer (idet disse forbindelsene tenderer til heller å assosieres som liposomer når dispergert i en vandig løsning), blir de umodifiserte fosfolipider helst benyttet i blanding sammen med noen av de tidligere nevnte micelle-dannende forbindelser. Nærmere bestemt, bør deres mengde helst være mindre enn ca 80 %, mer foretrukket ca 70 % eller mindre av totalvekten av den blandede forbindelse som danner den micellære struktur. Ifølge en foretrukket utførelsesform blir den micellære komponent dannet fra en blanding som omfatter fra ca. 30 % til ca. 70 %, helst fra ca 40 % til 60 vekt-% umodifisert fosfolipider. Det gjenværende av blandingen kan være enhver av de foregående opplistede micelledannende surfaktanter.
Den ønskede samlede netto ladning blir tildelt til micellen ved en av de tidligere opplistede negativt eller positivt ladede forbindelser, særlig lipider eller fosfolipider, inklusive modifiserte fosfolipider.
Således, er eksempler på fosfolipider som er egnet til å bibringe en samlet negativ ladning til micellen, fosfatidyliserinderivater, slik som DMPS, DPPS, DSPS; fosfatidinsyre derivatives, slik som DMPA, DPPA, DSPA; fosfatidylglyserolderivater slik som DMPG, DPPG og DSPG. Også modifiserte fosfolipider, nærmere bestemt PEG-modifisert fosfatidyletanolaminer, kan med fordel bli benyttet, slik som, for eksempel DMPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, -PEG3000 eller -PEG5000; DPPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, PEG3000 eller PEG5000; DSPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, PEG3000 eller PEG5000; DAPE-PEG750, -PEG1000, -PEG2000, PEG3000 eller PEG5000; og den respektive lysoform av de ovennevnte fosfolipider, slik som lysofosfatidylserinderivater, lysofosfatidylsyrederivater ((eksempelvis lyso-DMPA, -DPPA eller -DSPA) og lysofosfatidylglyserolderivater (eksempelvis lyso-DMPG, -DPPG eller -DSPG). Eksempler på negativt ladede lipider er gallesyresalter slik som kolinsyresalter, deoksykolinsyresalter, eller glykokolinsyresalter; og fettsyresalter slik som palmitinsyresalt, stearinsyresalt, l,2-dipalmitoyl-sn-3-succinylglyserolsalt eller 1,3-dipalmitoyl-2-succinylglyserolsalt.
Foretrukket, blir den negativt ladede forbindelse valgt blant DPPA, DPPS, DSPG, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG5000 eller blandinger derav.
Den negativt ladede komponent er typisk assosiert med et tilsvarende positivt motion, som kan være mono- (eksempelvis et alkalimetall), di- (eksempelvis jordalkalimetall) eller trivalent (eksempelvis aluminium). Foretrukket blir motionet valgt blant alkalimetallkationer, slik som Li ,Na , eller KT , mer foretrukket Na
Eksempler på fosfolipider egnede for å bibringe en samlet positiv ladning til micellen er estere av fosfatidylkoliner, slik som l,2-Distearoyl-sn-glysero-3-Etylfosfokolin (Etyl-DSPC), l,2-Dipalmitoyl-sn-glysero-3-Etylfosfokolin (Etyl-DPPC). Det negative motion er fortrinnsvis et halogenion, nærmere bestemt klor eller brom. Eksempler på positivt ladede lipider er alkylammoniumsalter, som omfatter minst en (C10-C20), helst (C14-Ci8), alkylkjede, eller tertiær eller kvarternært ammonium som omfatter en eller helst to (C10-C20), helst (Ci4-Cig), acylkjede som er forbundet med N-atomet gjennom en (C3-Ce) alkylenbro, i likhet med de i det foregående opplistede.
Etyl-DPPC, Etyl-DSPC, DSTAP blir helst benyttet som positivt ladede forbindelser.
Den positivt ladede forbindelsen er typisk assosiert med et tilsvarende positivt motion, som kan være mono- (eksempelvis halogen), di- (eksempelvis sulfat) eller trivalent (eksempelvis fosfat. Foretrukket motion er valgt blant halogenioner, slik som F" (fluor), Cl" (klor) eller Br" (brom)
Videre, kan de ioniske polymerer i likhet med de som er opplistet tidligere blant de mikroballong-dannende materialer med fordel bli benyttet til å danne en micelle med en samlet negativ eller positiv netto ladning.
Som i det foregående, kan de ladede molekyler, in noen utførelsesformer, med fordel være blandet sammen med de nøytrale amififile forbindelsene, i likhet med de som tidigere er opplistet (inklusive nøytrale fosfolipider), for å danne den ønskede micellære struktur. Foretrukne nøytrale forbindelser som skal bli blandet ammen med de i det foregående opplistede ladede forbindelser er polymere surfaktanter, slik som etylenoksidpropylenoksid, blokk-kopolymerer, eksempelvis Pluronic F68, Pluronic Fl 08, Pluronic F-127 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); Polyoksyetylert alkyl eter slik som Brij<®>78 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); Polyoksyetylenfettsyreester slik som Myrj<®>53 or Myrj<®>59 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); Polyoksyetylensorbitanfettsyre-ester slik som Tween 60 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); Polyetylen glykol tert-octylfenyleter slik som Triton<®>KS-100 (Sigma Aldrich, Missouri, USA); natrium-dodecylsulfat (SDS). Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen, blir miceller dannet av blandinger av en ladet amfifilforbindelse med et nøytralt fosfolipid og en eller flere av de i det foregående opplistede nøytrale forbindelser.
I noen foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, kan mengden ladet surfaktant i det vesentlige danne hele micellen (dvs. minst 80 %, helst minst 90 % og enda heller ca. 100 % av det micelledannede materialets totalvekt). I noen andre foretrukne utførelses-former, nærmere bestemt når minst en forbindelse som danner micellen er et umodifisert fosfolipid, er den samlede mengde av et surfaktant som danner micellen helst fra ca.
1 % til 80 %, mer foretrukket fra ca. 2 % til ca. 50 %.
Miceller kan bli preparert som kjent innen faget ved å dispergere de ovenstående forbindelser i en vandig flytende bærer og eventuelt agitere blandingen. Eksempler på egnede flytende bærere er vann, salinløsning (0,9 % natriumklorid), fosfatbufret salin (10 nM, pH 7,4), HEPES buffer (20 mM, pH 7,4), 5 vekt-% glukose i vann. For eksempel, kan ovenstående forbindelser bli dispergert i en konsentrasjon på fra ca. 1 til 100 mg/ml i en vandig væske og bli oppløst ved hjelp av agitering eller sonikering.
Micellene kan deretter bli lagret i en vandig dispersjon (eksempelvis i den vandige bærer som benyttes til preparering) før de blir blandet sammen med en suspensjon som inneholder mikrovesikler eller (som forklart i detalj videre utover i beskrivelsen) til en vandig organisk emulsjon fra hvilke mikrovesikler blir preparert. Alternativt, kan micellesuspensjonen bli frysetørket ifølge konvensjonelle teknikker, for å eliminere væsken og lagre det endelige tørre produkt for påfølgende anvendelser.
Liposomer
En annen supermolekylær struktur som kan bli assosiert som en MAC til en mikrovesikkel i en sammenstilling ifølge oppfinnelsen er en liposom, nærmere bestemt små unilaminære vesikler (SUV) liposomer.
Termen liposomer inkluderer i det vesentlige sfæriske aggregeringer av amfifile forbindelser, inklusive lipidforbindelser, typisk i form av ett eller flere kosentriske lag. Typisk blir de dannet i vandige suspensjoner og inneholder minst ett bisjikt av en amfifil forbindelse. De hydrofile hoder i de amfifile forbindelser som danner bilagets utvendige lag er rettet henimot dens sfæriske strukturs ytre side mens de hydrofile hoder i de amfifile forbindelser som danner bisjiktets tertiære lag er rettet henimot den sfæriske strukturs indre. Det indre av liposomenes sfæriske struktur er generelt fylt med den samme væske av den vandige suspensjon, eventuelt inneholdende ytterligere forbindelser som ikke er til stede (eller er til stede i mindre grad) i den ytre vandige suspensjon.
Foretrukne materialer for å preparere liposomer er fosfolipider, slik som de i det foregående opplistede, eventuelt i blanding sammen med noen av de i det foregående opplistede amfifile forbindelser.
SUV-liposomer kan bli dannet ifølge konvensjonelle teknikker, eksempelvis ved på egnet måte å bearbeide MLV-(multilamelære store vesikler)-suspensjoner, for eksempel ved ultrasonikering, ekstrudering eller mikrofluidisering. MLV kan oppnås, for eksempel, ved å oppløse fosfolipider i et organisk løsningsmiddel, ved å fordampe det organiske løsningsmidlet under vakuum til oppnåelse av en fosfolipid og til slutt hydratere filmen ved en temperatur over fosfolipidens transisjonstemperatur. Den oppnådde MLV kan således bli eksponert overfor ultrasoniske bestrålinger til oppnåelse av de ønskede SUV-liposomer. Alternativt, kan MLV bli ekstrudert gjennom et antall membraner (eksempelvis av polykarbonat) med minskende porestørrelse (eksempelvis 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 og 0,2 \ im) og deretter gjennom en ekstruder med mindre poredimen-sjoner (eksempelvis LIPEX Biomembranes<®>, Canada,) til oppnåelse av den endelige SUV. Som en ytterligere alternativ prepareringsprosess for SUV, kan MLV bli homogenisert under høyt trykk i en mikrofluidiserer (eksempelvis fra Mikrofluidics Corporation), for å redusere liposomstørrelsen til ca. 100 nm eller mindre, avhengig av mengden resirkulering av liposomer i mikrofluidisereren. Disse og andre prepareringsmetoder for SUV er, for eksempel, beskrevet i referanseboken "Liposomes, a practical approach", redigert av Roger R.C. New, Oxford University Press, 1989.
SUV-liposomers dimensjoner er typisk fra ca. 25 nm til ca. 100 nm, foretrukket fra ca. 30 nm til ca. 100 nm. Den antallsmessige gjennomsnittsdiameter kan variere fra ca 30 nm til ca 60 nm, foretrukket fra ca. 30 til ca 50 nm.
En gjennomgang av liposomer og deres prepareringsmetoder er også gitt i den i det foregående oppgitte referansebok "Surfactants and Polymers in Drug Delivery", av M. Malmsten, Ch. 4, s. 87-131, Marcel Dekker Inc. Ed., 2002).
Andre strukturer som kan bli assosiert som en MAC til en mikrovesikkel i en sammenstilling ifølge oppfinnelsen inkluderer kolloidale nanopartikler, eksempelvis kolloidale gullnanopartikler. Disse nanopartikler blir typisk oppnådd ved tilsetting av et egnet dispergeringsmiddel til en vandig løsning som omfatter i det vesentlige uløselige faste nanopartikler, for således å danne en vandig suspensjon av kolloidale nanopartikler (dvs. faste nanopartikler belagt med dispergeringsmidler). For eksempel, kan kolloidale nanopartikler bli oppnådd ved å dispergere gullnanopartikler (med en diameter på ca 2 til ca 5 nm) med natriumsitrat i en vandig løsning (se eksempelvis Grabar, "Preparation and Characterization of Au colloid monolayers", Analytical Chemistry, vol. 67, s. 735,1995). Kolloidale gullnanopartikler som er assosiert med gassfylte mikrovesikler kan bli benyttet til å øke penetreringsdybden i et utvalgt vev når mikrovesiklene er forårsaket til å disintegrere (dvs. indusert ved styrt høyenergi-ultralydbestråling). Således, kan en sammenstilling som omfatter kolloidale gullnanopartikler for eksempel bli assosiert med en ytterligere MAC som omfatter et bioaktivt middel, med sikte på å øke det bioaktive middels penetreringsdybde inn i det utvalgte vev, for således å forbedre den terapeutiske behandlings effektivitet.
Ytterligere MAC-er kan bli dannet av faste polymere nanopartikler. Disse faste polymere materialer kan bli dannet av ett eller flere av de polymere materialer som tidligere er opplistet i samband med prepareringen av gassfylte mikroballonger, således inklusive biodegraderbare fysiologiske akseptable polymerer, slik som i det vesentlige vannuløselige polysakkarider (eksempelvis kitosan eller kitin), polycyanoakrylater, polyacetider og polyglykolider og deres kopolymerer, kopolymerer av laktider og laktoner slik som y-caprolakton eller 8-valerolakton, kopolymerer av etylenoksid og laktider, polyetyleniminer, polypeptider og proteiner slik som gelatin, kollagen, globuliner eller albumine. Andre egnede polymerer er disse nevnt i det foregående US 5,711,933 og tidligere opplistet. Ikke-biodegraderbare polymerer, nærmere bestemt vannuløselige, fysiologisk akseptable og bioresistente polymerer, kan også bli benyttet, helst blandet sammen med en av de i det foregående biodegraderbare polymerer. Polymeren kan, for eksempel, være en polyolefin, slik som polystyren, en akrylplast slik som polyakrylater av polyakrylonitil, en polyester, slik som polykarbonat, polyuretan, polyurea og deres kopolymerer, ABS (akryl-butadin-styren) er en foretrukket kopolymer.
Målrettende ligander og bioaktive/diagnostiske midler
MAC, særlig i form av miceller, for en sammenstilling ifølge oppfinnelsen, kan med fordel innen sin struktur inkludere forbindelser med en målrettende, diagnostisk og/eller biologisk aktivitet.
Den målrettende ligand som er inkludert i MAC kan være syntetisk, halvsyntetisk eller naturlig forekommende. Materialer eller substanser som kan tjene som målrettende ligander inkluderer, for eksempel, men er ikke begrenset til proteiner, inklusive anti-stoffer, antistoffragmenter, reseptormolekyler, reseptorbindende molekyler, glyko-proteiner og lektiner, peptider, inklusive oligopeptider og polypeptider; peptidomi-metica; sakkarider inklusive mono og polysakkarider; vitaminer, steroider, steroid-analoger, hormoner, kofaktorer, bioaktive midler, genetisk materiale, inklusive nukleoside, nuklotider og polynukleotider.
Eksempler på egnede mål - targets - og målrettende ligander er, for eksempel, beskrevet i US-patent nr. 6,139,819.
Den målrettende ligand kan være en forbindelse i seg selv som er blandet sammen med de øvrige komponenter i det MAC-preparat som skal bli inkludert i den endelige struktur av MAC eller kan være en komponent som kan være bundet til et amfifilt molekyl som benyttes til dannelsen av MAC.
I en foretrukket utførelsesform, kan den målrettende ligand bli bundet til et amfifilt molekyl i MAC gjennom en kovalent binding. I et slikt tilfelle vil den spesifikke reaktive enhet som behøves å foreligge i det amfifile molekyl avhengig av den bestemte målrettende ligand som skal bli koblet dertil. Som et eksempel, dersom den målrettende ligand kan bli forbundet med det amfifile molekyl gjennom en amionogruppe, kan egnede reaktive enheter for det amfifile molekyl være isotiocyanatgrupper (som vil danne en tioureabinding), reaktive estere (for å danne en amid binding), aldehydgrupper (til dannelse av en liminbinding som skal bli redusert til en alkylaminbinding), etc; dersom den målrettende ligand kan bli forbundet med det amfifile molekyl gjennom en tiolgruppe, inkluderer egnede komplementærreaktive enheter for det amfifile molekyl haloacetylderivater eller maleimider (for å danne en tioeterbinding); og dersom den målrettende ligand kan bli forbundet med det amfifile molekyl gjennom en karboksyl-gruppe, kan egnede reaktive enheter for det amfifile molekylet være aminer og hydra-zider (til dannelse av amid- eller alkylamidbindinger). Med sikte på kovalent å binde en ønsket målrettende ligand, skal i det minste en del av den amfifile forbindelse som danner MAC således inneholde en egnet reaktiv enhet og den målrettende ligand som inneholder den komplementære funksjonalitet vil bli forbundet dertil ifølge kjente teknikker, eksempelvis ved å tilsette den til en vandig dispersjon som omfatter de amfifile komponenter i MAC. Den amfifile forbindelse kan bli kombinert med den ønskede målrettende ligand før preparering av MAC, og den således oppnådde kombinasjon kan bli benyttet i prepareringsprosessen for MAC. Alternativt, kan den målrettende ligand bli forbundet med den respektive amfifile forbindelse via prepareringsprosessen for MAC eller kan bli direkte forbundet til den amfifile forbindelse som allerede er i en micellær struktur.
Ifølge en alternativ utførelsesform, kan en målrettende ligand også på passende måte bli assosiert til MAC via fysikalsk og/eller elektrostatisk interaksjon. Som et eksempel, kan en funksjonell enhet med høy affinitet og selektivitet for en komplementær enhet bli
introdusert i det amfifile molekyl, mens den komplementære enhet vil bli forbundet med den målrettende ligand. For eksempel, kan en avidin (eller streptavidin) enhet (med høy
affinitet for biotin) bli kovalent forbundet med et fosfolipid mens den komplementære biotinenhet kan bli inkorporert inn i en egnet målrettende ligand, eksempelvis et peptid eller et antistoff. Den biotinetiketterte målrettende ligand vil således bli assosiert til det avidin-etikketerte fosfolipid på MAC ved hjelp av avidin-biotin koblingssystem. Alternativt, kan både fosfolipid- og målrettende liganden bli forsynt med en biotin enhet og påfølgende koblet til hverandre ved hjelp av avidin (som er en bifunksjonell komponent som er i stand til å bygge bro mellom to biotinenheter). Eksempler på biotin/ avidinkobling av fosfolipider og peptider er også beskrevet i den i det foregående nevnte US 6,139,819. Alternativt, kan van der Waals interaksjoner, elektrostatiske interaksjoner og andre assosiasjonsprosesser assosiere eller binde den målrettende ligand til de amfifile molekyler.
Ifølge en alternativ utførelsesform, kan den målrettende ligand være en forbindelse som er blandet sammen med de komponenter som danner MAC, for eventuelt å bli inkorporert i MAC-strukturen og slik som, for eksempel, et lipopeptid som beskrevet eksempelvis i internasjonal patent søknader WO 98/18501 eller 99/55383.
Alternativt, kan det først bli fremstilt en MAC, som omfatter en forbindelse med en egnet enhet som er i stand til å interagere med en tilsvarende komplementær enhet i en målrettende ligand; deretter, blir den ønskede målrettende ligand tilsatt MAC-suspensjonen for å bindes til den tilsvarende komplementære enheten på MAC. Som et ytterligere alternativ, kan det bli preparert en sammenstilling, som omfatter MAC som inkluderer en forbindelse med en egnet enhet som er i stand til å interagere med en tilsvarende komplementær enhet i en målrettende ligand; deretter, blir den ønskede mål-rettende ligand tilsatt til sammenstillingssuspensjonen, for å bindes til den tilsvarende enhet på MAC.
Eksempler på egnede spesifikke mål (targets) til hvilke sammenstillingen kan bli rettet er, for eksempel, fibrin og GPHbllla-bindingsreseptor på aktiverte blodplater. Fibrin og blodplater er faktisk generelt til stede i "trombi", dvs. coagula som kan bli dannet i blod-strømmen og forårsake en vaskulær obstruksjon. Egnede bindende peptider er, for eksempel, beskrevet i den i det foregående nevnte US 6,139,819. Ytterligere bindende peptider som er spesifikke for fibrin målretting er beskrevet, for eksempel, i internasjonal patentsøknad WO 02/055544.
Andre eksempler på viktige mål inkluderer reseptorer i sårbare plakker (plaques) og tumorspesifikke reseptorer, slik som kinase domeneregion (KDR) og VEGF (vaskulær endotel vekstfaktor)/KDR-kompleks. Bindende peptider som er egnet for KDR eller VEGF/KDR kompleks er, for eksempel, beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 03/74005 og WO 03/084574.
Bioaktive midler inkluderer enhver forbindelse eller materiale som er i stand til å bli benyttet i behandling (inkludert diagnose, forebyggelse, lindring, smerte lindring eller kurering) av enhver patologisk status i en pasient (inklusive sykdom, plager, sykdoms-skade eller ulykkesskade). Eksempler på bioaktive midler er de i de foregående opplistede. Av disse, er medisiner eller farmasøytika foretrukket, nærmere bestemt de medisiner som består av organiske molekyl (typisk et syntetisk molekyl) som i det vesentlige er i hydrofobt eller som inneholder en relevant porsjon derav som i det vesentlige er hydrofobt. Disse molekyler kan faktisk bli inkorporert relativt enkelt i strukturen for en MAC, nærmere bestemt i en micelle, på grunn av deres affinitet med den lipofile (eller hydrofobe) parti av de amfifile materialer som utgjør MAC. For eksempel, kan de organiske molekyler bli dispergert i den vandige bærer som rommer det amfifile materialet som utgjør MAC, nærmere bestemt i micellen, hvor det vil bli inkorporert ved affinitet inn i det hydrofobe parti av MAC. Alternativt, kan også hydrofile medisiner eller organiske molekyler bli inkorporert i MAC, nærmere bestemt når sistnevnte foreligger i form av et liposom. I dette tilfelle, vil den hydrofile forbindelsen fortrinnsvis være rommet i liposomets interne vandige parti.
Eksempler på medisiner som kan bli inkorporert i eller assosiert til MAC-ens struktur er, for eksempel de som er nevnt i den i det foregående nevnte WO 99/53963, således inklusive antineoplastiske midler som vinkristin, vinblastin, vindesin, busulfan, klorambucil, spiroplatin, cisplatin, karboplatin, metotreksat, adriamycin, mitomycin, bleomycin, cytosin arabinosid, arabinosyladenin, mercaptopurin, mitotan, procarbazin, dactinomycin (antinomycin D), daunorubicin, doksorubicin hydroklorid, taksol, plicamycin, aminoglutetimid, estramustin, flutamid, leuprolid, megestrol acetat, tamoksifen, testolakton, trilostan, amsacrin (m-AMSA), asparaginase (Lasparaginase), etoposid, interferon a-2a og 2b, blodprodukter slik som hematoporfrin eller derivater av det foregående; biologisk responsmodifikatorer slik som muramylpeptider; antifungale midler slik som ketoconazol, nystatin, griseofulvin, flucytosin, miconazol eller amfotericin B; Hormoner eller hormonanaloger slik som veksthormon, melanocyt-stimulerende hormon, estradiol, beclametason dipropionat, betametason, koritsonacetat, deksametason, flunisolid, hydrokortison, mentylprednisolon, parametasonacetat, prednisolon, prednison, triamcinolon eller fludrokortisonacetat; vitaminer slik som cyanobalamin eller retinoider; enzymer slik som alkalinfosfatase eller manganeses superoksiddismutase; antiallergiske midler slik som amelexanox; antikoagulerende midler slik som warfarin, fenprocoumon eller heparin; anittrombotiske midler; sirkulatoriske medisiner slik som propranolol; metaboliske potensiatorer slik som glutation; antituberkularer slik som p-aminosalicylsyre, isoniazid, capreomycinsulfat; cyklosexin, etambutol, etionamid, pyrazinamid, rifampin eller streptomycin sulfat; antiviraler slik som asyklovir, amantadin, azidothymidin, ribavirin eller vidarabin; blodkar-utvidende midler slik som diltiazem, nifedipin, verapamil, erytritoltetranitrat, isosorbiddinitrat, nitroglycerin eller pentaerytritoltetranitrat; antibiotika slik som dapson, kloramfenicol, neomycin, cefaclor, cefadroksil, cephaleksin, cefradin, erytro-mycin, clindamycin, lincomycin, amoksicillin, ampicillin, bacampicillin, carbenicillin, dicloksacillin, cyclacillin, picloksacillin, hetacillin, meticillin, nafcillin, penicillin eller tetracyclin; antiinflammatorier slik som diflunisal, ibuprofen, indometacin, meclefena-mat, mefenaminsyre, naproksen, fenylbutazon, piroksicam, tolmetin, aspirin eller salicylater; antiprotozoaner slik som kloroquin, metronidazol, kinin eller meglumin antimonat; antireumatika slik som penicillamin; narkotika slik som paregoric; opiater som kodein, morfin eller opium; hjerteglykosider slik som deslanesid, digitoksin, digoksin, digitalin eller digitalis; neuromuskulær blokkere slik som atracurium-mesylat, gallamintrietiodid, heksafluoreniumbromid, metocuriniodid, pancuroniumbromid, succinylkolinklorid, tubocurarinklorid eller vecuroniumbromid; sedativer slik som amobarbital, amobarbital natrium, apropbarbital, butabarbital natrium, kloralhydrat, etklorvynol, etinamat, flurazepam hydroklorid, glutetimid, metotrimeprazin hydroklorid, metyprylon, midazolam hydroklorid, paraldehyd, pentobarbital, secobar-bitalnatrium, talbutal, temazepam eller triazolam; lokalanestesi slik som bupivacain, klorprocain, etidocain, lidokain, mepivacain, procain eller tetracain; generell anestesi slik som droperidol, etomidat, fentanyl sitrat med droperidol, ketaminhydroklorid, metoheksitalnatrium eller tiopental og farmasøytisk akseptable salter (eksempelvis syreaddisjonssalter slik som hydrokloridet eller hydrobromidet eller basesalter slik som natrium- kalsium-, eller magnesiumsalter) eller derivater (eksempelvis acetater) derav; og radioaktive kjemikalier, eksempelvis som omfatter alfa-, beta- eller gamma-bestråo lere slik som for eksempel 177 Lu, 90 Y eller<131>I. Av særlig betydning er anti-trombotiske midler slik som heparin og midler med heparinlignende aktivitet slik som antitrombin EI, dalteparin og enoksaparin; blodplateaggregerende inhibitorer slik som ticlopidin, aspirin, dipyridamol, iloprost og abciksimab; og trombolytiske enzymer slik som streptokinase og plasminogen aktivator. Andre eksempler på bioaktive midler inkluderer genetisk materiale slik som nukleinsyre, RNA og DNA av naturlig eller syntetisk opprinnelse, Inklusive rekombinant RNA og DNA. Som nevnt i ovenstående patent, kan DN som kode for visse proteiner bli benyttet i behandlingen av mange ulike typer sykdommer, for eksempel, kan tumor nekrosefaktor eller interleukin-2 bli frembrakt til behandling av fremskreden kreft; tylmidinkinase kan bli frembrakt til behandling av eggstokk-kreft eller hjernesvulster; interlaukin-2 kan bli frembrakt til behandling av neuroblastoma, ondartet melanom eller nyrekreft; og interleukin-4 kan bli frembrakt til behandling av kreft.
Diagnostiske midler som kan bli inkorporert inn i eller assosiert til MAC i en sammenstilling ifølge oppfinnelsen er enhver forbindelse, sammensetning eller partikkel som kan muliggjøre imaging- forbedring i samband med diagnostiske teknikker, inklusive, magnetisk ressonans-imaging, røntgen, særlig datamaskin-tomografi, optisk imaging, nukleær imaging, molekylær imaging. Eksempler på egnede diagnostiske midler er, for eksempel magnetinanopartikler, iodinerte forbindelser, slik som Iomeprol<®>, eller paramagnetiske ionekomplekser, slik som hydrofobe gadoliniumkomplekser. For eksempel, kan magnetitnanopartikler bli sammenblandet med et negativt ladet amfifilt materiale (og eventuelt et nøytralt sådan), i likhet med de tidligere nevnte, med sikte på å stabilisere partiklene og holde dem dispergert i en vandig løsning. US 5,545,395, gir noen eksempler på preparering av de stabiliserte magnetiske partikler, eksempelvis ved dannelse av en blanding av DPPA og Pluronic for stabilisering av partiklene. Alternativt, kan gadolinkomplekser bli blandet sammen med egnede micelle-dannende forbindelser, for eksempel som beskrevet i europeisk patent EP 804 251, til dannelse av en gadolinholdig MAC.
Sammenstillingen
For å kunne evaluere de relative preparater for sammenstillingene ifølge oppfinnelsen, er det funnet nyttig å vise til mengdene av ladede forbindelser i mikrovesiklene og i MAC (uttrykt som "ekvivalenter av ladning") og til (^-potensialet for suspensjonene av mikrovesikler og sammenstillinger.
Termen "ekvivalent av ladning" (EC) indikerer antallet ladninger pr. mol av forbindelsen. Således, inneholder en mol av en monoionisk forbindelse en EC, en mol av en diionisk forbindelse inneholder to EC osv.
f-potensialet (zeta-potensial), også kalt elektrokinetisk potensial, er det elektriske potensialet ved overflaten av kollodialpartikler i forhold til potensialet i bulkmedium på en lang avstand. Det kan bli målt ifølge konvensjonelle mikro-elektroforetiske analytiske metoder, eksempelvis via bestemmelsen av partiklenes hastighet i et drivende elektrisk felt ved Laser-Doppler-Anemometri. For eksempel kan ZetaSizer 3000 Has (Malvern Instrument GmbH) fordelaktig benyttes. I praksis, vil f-potensialet for den innledningsvise suspensjonen av mikrovesikler først bestemt, idet denne kan ha en positiv eller negativ verdi, avhengig av om mikrovesiklene inneholder henholdsvis positivt eller negativt ladede forbindelser. Deretter, blir ^-potensialet målt i den endelige suspensjonen som inneholder sammenstillingen (dvs. etter de nødvendige vasketrinn for fjerning av eventuelt ubundet MAC-er). Generelt, bestemmer tilsatsen av MAC-er av motstående tegn i forhold til mikrovesiklene en mer eller mindre uttalt minsking i absoluttverdien av suspensjonens f-potensial. Nærmere bestemt, i suspensjonen som omfatter positivt ladede mikrovesikler fremvises en minsking av ^-potensialet under tilsetting av en suspensjon av negativt ladede MAC-er, mens suspensjonen som omfatter negativt ladede mikrovesikler vil fremvise en forholdsvis økning i ^-potensialet (dvs. minsking i absoluttverdi) under tilsetting av en suspensjon av positivt ladede MAC-er. Som observert ifølge oppfinnelsen, er foretrukne sammenstillinger i suspensjonen som fremviser en vesentlig minsking i absoluttverdien med hensyn til f-potensialet for den innledningsvise mikrovesikkelsuspensjonen, dvs. en minsking på minst 50 %, foretrukket på minst 75 %, og mer foretrukket på minst 90 % av den innledningsvise verdi. Særlig foretrukne sammenstillingers suspensjoner er de som fremviser et i det vesentlige nøytralt f-potensial (dvs. 0 ± 10 mV, som svarer til en absolutt minsking på ca 100 % i forhold til mikrovesikkelsuspensjonens innledningsvise potensial) eller et f-potensial motstående i fortegn i forhold til ^-potensialet for den innledningsvise mikrovesikkelsuspensjon. I henhold til oppfinnelsen, er det observert at når sammen-stillingsuspensjonen ^-potensialet forblir lik i tegn med en absolutt minsking på minst 50 % i forhold til ^-potensialet for den innledningsvise mikrovesikkelsuspensjonen, kan dette være en indikasjon på et utilstrekkelig antall MAC-er er assosiert med mikrovesiklene.
Ifølge en foretrukket utførelsesform, er mengden ladede MAC-er i sammenstillingen slik at den bibringer et i det vesentlige nøytralt f-potensial til sammenstillingen eller et f-potensial som er motstående i tegn til mikrovesikkelens f-potensial. I henhold til oppfinnelsen, er det observert at for å oppnå det nøytrale f-potensialet for sammenstillingen er det imidlertid ikke nødvendig at sammenstillingen inneholder et overskudd av ekvivalenter på ladning ra MAC. Faktisk, har det vært observert at sammenstillingen som består av positive mikrovesikler og negative MAC-er og har et forhold mellom EC i MAC og ekvivalenter i motstående ladning i mikrovesiklene på ca 1:5 (dvs. et overskudd på ca. 5 ganger av overskuddsladninger på mikrovesiklene) ikke desto mindre fremviser et i det vesentlige nøytralt eller negativt f-potensial. Selv om det ikke foreligger noe ønske om å være bundet av noen bestemt teori kan det bli antatt at de (negative) ladninger som omfattes i MAC-ene er plassert på sammenstillingens ytre overflate; dersom antallet MAC-er som er assosiert til mikrovesikkelen er tilstrekkelig høyt, kan overskuddet av (positive) motstående ladninger på mikrovesikkelen resultere, i det minste delvis, skjermet av MAC-ene. Således, er ^-potensialet som målt på en partikkel sterkt influert av de ladninger som foreligger på partikkelens ytre grense, endog en sammenstilling med et overskudd av (positive) ekvivalenter for ladning som stammer fra en mikrovesikkel kan fremvise et negativt f-potensial, dersom mengden av (negativt) ladede MAC-er er tilstrekkelig til delvis å skjerme mikrovesikkelens (positive) ladning. Alt det ovenstående gjelder også for sammenstillinger som blir formet av negativt ladede mikrovesikler og positivt ladede MAC-er.
Generelt, kan forholdet mellom EC på mikrovesiklene og EC av ladningen på MAC i sammenstillingens endelige suspensjon kan variere fra ca. 10:1 til ca 1:10. Ifølge en foretrukket utførelsesform, er EC-forholdet i mikrovesikkel/MAC i den dannede sammenstilling foretrukket ca 3:1 eller mindre, eller mer foretrukket ca 2:1 eller mindre og enda mer foretrukket 3:2 eller mindre. Avhengig av den mengde ladede forbindelser som danner mikrovesiklene og MAC-ene, kan forholdet selvfølgelig være lavere, for eksempel ca 1:1 og ned til ca 1:4 eller mindre.
Tatt i betraktning de relativt små dimensjoner på MAC-en, er dimensjonene (antallsmessig gjennomsnittsdiameter) av sammenstillingen typisk på ca. 10 [ im eller mindre og generelt på ca 1 \ im eller mer. Foretrukket dimensjon for en sammenstilling ifølge oppfinnelsen er fra ca 1 \ im til ca 8 \ im, mer foretrukket fra ca 2 \ im til ca 5 \ im.
Ifølge en ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen, kan multilags sammenstillinger bli dannet ved å assosiere en gassfylt mikrovesikkel til et antall lag av komponenter, med en alternerende ladning. Således er det, for eksempel, mulig til en negativt ladet mikrovesikkel å assosiere et første lag av komponenter (eksempelvis miceller) som har positiv ladning; deretter kan et andre lag av komponenter (eksempelvis igjen miceller eller liposomer) med en negativ ladning bli assosiert til en sammenstilling, osv. Selv om assosiasjonen av det første lag av komponenter til mikrovesiklene vil forårsake en reduksjon i ^-potensialets absoluttverdi (i forhold til det som måles på en suspensjon av mikrovesiklene alene), vil den videre assosiasjon av et andre lag av komponenter (med en motstående ladning i forhold til en første komponent) på C-potensialet til på nytt å ende henimot verdier nærmere de for suspensjonen av mikrovesikler alene.
Ifølge en første metode for preparering, kan sammenstillingen bli oppnådd ved å blande en vandig suspensjon som omfatter mikrovesiklene (som oppnådd ifølge en av de i det foregående nevnte fremstillingsmetoder) med en vandig suspensjon som omfatter dens andre komponent (som oppnådd ifølge en av de i det foregående nevnte fremstillingsmetoder).
Eventuelt, kan således oppnådde blandinger bli underlagt ett eller flere vasetrinn, med sikte på å fjerne overskuddet av ikke-assosierte komponenter. Vaskingen kan bli utført ved en konvensjonell vasketeknikk, ved anvendelse av egnede vaskeløsninger, slik som destillert vann, fosfatbufret salin, tris/glyserolbuffer, salin eller 5 % glukoseløsning. Fasen av den vaskede blandingen som omfatter sammenstillingen ifølge oppfinnelsen (generelt supernatantfasen) blir således separert og innsamlet; valgfritt, blir den gjenvunnede sammenstillingsholdige suspensjon til slutt fortynnet før anvendelse, eksempelvis med en av de i det foregående nevnte fysiologisk akseptable bærere.
Ved dannelse, kan den suspensjon som omfatter sammenstillingen ifølge oppfinnelsen bli lagret for en påfølgende administrering eller kan bli administrert direkte. Om ønsket, kan suspensjonens flytende bærer bli eliminert (eksempelvis ved frysetørking) for oppnåelse av et tørt pulver av sammenstillingen som kan bli lagret (fortrinnsvis under nærvær av en gass som er egnet til å danne gassfylte mikrovesikler ved rekonstituering) over relativt langt tidsrom før rekonstituering.
Alternativt, kan sammenstillingens to komponenter bli lagret som separate preparater i tørket form (eksempelvis frysetørket) og blir rekonstituert som en suspensjon før administrering. For lagringen, blir de tørkede komponenter fortrinnsvis holdt i en atmosfære av den gass som daner mikrovesiklene ved rekonstituering med vann. Rekonstitueringen med en vandig flytende bærer kan finne sted separat på de to tørkede preparater som omfatter sammenstillingens respektive komponenter, for således å oppnå to separate suspensjoner som påfølgende blir blandet sammen til oppnåelse av den ønskede sammenstillingssuspensjon. Alternativt, kan de to tørkede preparater bli blandet sammen og deretter rekonstituert som en enkeltstående suspensjon med en vandig flytende bærer. I det sistnevnte tilfellet blir sammenstillingens blandede komponenter lagret i nærvær av den gass som vil danne mikrovesikler under rekonstituering med den vandige flytende bærer. Ifølge en foretrukket utførelsesform, blir det tørkede MAC-preparat først rekonstituert med en fysiologisk akseptabel vandig bærer og den oppnådde suspensjon blir da benyttet for å rekonstituere det tørkede mikrovesikkelpreparat, for endelig å oppnå en suspensjon av sammenstillingen.
En av de ovenstående fremstillingsmetoder kan også bli benyttet for å preparere en multilagssammenstilling som beskrevet i det foregående, ved først å blande de ladede gassfylte mikrovesikler med en første komponent som har en motstående ladning og deretter ved å blande den dannede sammenstilling med en andre komponent som har den samme ladning som mikrovesiklene.
For fremstillingen av sammenstillingen fra to separate preparater av mikrovesikler og MAC-er, kan det være fordelaktig å tilsette en overskuddsmengde MAC-er i forhold til den relative mengde av MAC-er som er ønsket i den endelige sammenstilling, nærmere bestemt fordi en viss mengde av MAC-ene kan bli fjernet i løpet av de eventuelle vasketrinn for sammenstillingens suspensjon. Generelt, er det foretrukket at mengden EC i et preparat som benyttes i prepareringen av MAC-en er i det minste lik med EC i det preparatet som benyttes for prepareringen av mikrovesiklene (det vil si et EC-forhold på ca 1:1). Foretrukket er EC-forholdet på ca. 2:1 eller høyere, enda mer foretrukket på minst 3:1 eller høyere, opp til eksempelvis 30:1.
Ifølge en foretrukket utførelsesform, blir en vandig suspensjon av en MAC (nærmere bestemt av miceller som definert i det foregående) tilsatt til en vandig/organisk emulsjon som omfatter et fosfolipid og et lyobeskyttende middel, som er preparert ifølge den metode som er beskrevet i ovennevnte WO 04/069284.1 dette tilfelle, vil de ladede MAC-er assosiere med det motsatt ladede lag av amfifilt materiale som omgir emulsjonens mikrodråper. MAC blir generelt tilsatt en mengde slik at forholdet mellom ekvivalenten av ladning i MAC-en og EC i suspensjonens mikrovesikler er på minst 1:2 eller høyere, heller 2:3 eller høyere og enda heller minst 1:1 eller høyere, opp til eksempelvis 10:1. På lignende måte, kan en vandig suspensjon av MAC bli tilsatt til en flaske mikroboblesuspensjon som har blitt oppnådd ved å underlegge et vandig medium som omfatter et fosfolipid (og eventuelt andre amfifile filmdannende forbindelser og/eller additiver) til en styrt høy agiteringsenergi i nærvær av en ønsket gass, som tidligere nevnt.
Frysetørking av blandingen frembringer den ønskede sammenstilling i form av et lyofilisert pulver, som kan bli lagret i kontakt med den ønskede gass og påfølgende rekonstituert som en fysiologisk suspensjon ved tilsats av en vandig bærer.
Gassen i kontakt med de lagrede frysetørkede produkter (sammenstilling, mikrovesikler og/eller MAC-er) kan foreligge i lagringsbeholderen med et i det vesentlige atmosfærisk trykk (dvs. ca. 1020 mbar +/- 5 %) eller ved et trykk som er lavere enn det atmosfæriske (eksempelvis 900 mbar eller lavere) som beskrevet i europeisk patentsøknad EP 1228770.
Injiserbare preparater etter rekonstituering av det lyofiliserte kontrastmiddel bør, så langt det er mulig, være isotonisk i forhold til blod. Dermed kan, før injeksjon, små mengder isotoniske midler også bli tilsatt til suspensjonene som omfatter sammenstillingen ifølge oppfinnelsen. De isotoniske midler er fysiologiske løsninger som er vanlig benyttet i medisin slik som, for eksempel, vandig salinløsning (0,9 % NaCl),
2,6 % glyserolløsning eller 5 % dekstroseløsning. Rekonstitueringen av de vandige suspensjoner blir generelt oppnådd ved enkel oppløsning av den gasslagringen tørkede filmdannende surfaktant og lett agitering.
Volumet og konsentrasjonen, av den rekonstituerende væske kan gjerne bli balansert for å gjøre de resulterende bruksklare formuleringer i det vesentlige isotoniske. Dermed vil volumet og konsentrasjonen av den valgte rekonstituerende væske være avhengig av typen og mengden stabilisator (og andre fyllmidler) som foreligger i det frysetørkede produkt.
Slik det vil bli forstått av fagfolk, muliggjør sammenstillingen ifølge oppfinnelsen en ekstrem fleksibilitet i prepareringen av ulike sammenstillinger til ulike formål. Faktisk, behøver strukturen av den grunnleggende bærerkomponent som benyttes for de ultralyd-diagnostiske/terapeutiske metoder (dvs. mikrovesikkelen) ikke å bli underlagt noen bestemte modifikasjoner, noe som unngår mulige ulemper i form av komponentens stabilitet. Slik komponent behøver utelukkende å ha en samlet nettoladning på sitt omslag, idet et slikt resultat med letthet kan oppnås ved anvendelse av konvensjonelle materialer som normalt benyttes til å danne omslaget. Faktisk, muliggjør den elektro statiske interaksjon mellom mikrovesikkelen og MAC-en en effektiv assosiering mellom de to komponentene, uten behov for å modifisere mikrovesikkelens struktur. På en annen side, kan sammenstillingens andre komponent, hvis stabilitet er mye mindre følsom overfor mulige modifikasjoner av dens sammensetning, med letthet bli tilpasset det spesifikke formål som kreves av sammenstillingen, ved å assosiere den ønskede målrettende ligand og/eller bioaktive forbindelse til den. Videre, på grunn av de relativt små dimensjoner av MAC i forhold til mikrovesikkelen, er det mulig å assosiere et relativt stort antall MAC-er til hver mikrovesikkel, noe som øker systemets effektivitet.
Dessuten, kan sammenstillingens mikrovesikler med letthet bli assosiert med mer enn en type ulike nanokomponenter, noe som resulterer i en flerbruks-sammenstilling. Nærmere bestemt, kan en enkeltstående preparering av ladede mikrovesikler (eksempelvis positivt ladede) bli benyttet som en bærer som skal bli assosiert med en ønsket type MAC som bærer en motstående ladning (eksempelvis negativ). Alternativt, kan en flerbruks-sammenstilling også bli oppnådd ved å preparere en trelags sammenstilling som beskrevet tidligere, hvor de ulike komponenter av motstående ladning er plassert som alternerende lag rundt mikrovesikkelen. De ulike MAC-er som er assosiert med mikrovesikkelen er forskjellige i sin kjemiske sammensetning eller supermolekylære struktur (eksempelvis micelle vs. liposomer) så vel som i den målrettende ligand, det diagnostiske middel og/eller de aktive midler som rommes deri, med fordel, blir en flerbrukssammenstilling inneholdende en kombinasjon av noen av disse. For eksempel, kan mikrovesikkelkomponenten bli kombinert med en første nanokomponent (eksempelvis i micelær form) som i sin struktur omfatter minst en målrettende ligand (som er i stand til å knyttes til en spesifikk reseptor som er assosiert med en patologisk status eller sykdom), og med en andre nanokomponent (eksempelvis enten i micelær form eller som et liposom) som omfatter enten en andre målrettende ligand eller en bioaktiv forbindelse (eksempelvis terapeutisk forbindelse til behandling av den patologiske status eller sykdom). Når en sammenstillings om omfatter en kombinasjon av målrettede ligand-bærende komponenter og en bioaktiv forbindelsesbærende komponent blir benyttet, særlig for en flerlags sammenstilling blir preparert, blir den komponent som bærer den målrettende ligand helst separat assosiert som siste komponent til den gassfylte mikrovesikkel, med sikte på å muliggjøre en effektiv målrettende aktivitet for sammenstillingen. Et eksempel på en flerbrukssammenstilling er, for eksempel, en sammenstilling som omfatter en gassfylt mikrovesikkel, en første komponent i micelær form, som omfatter en målrettende ligand som binder til en tumorspesifikk reseptor, og en andre komponent som omfatter et radiokjemikalium (bundet til en micelledannende forbindelse eller inkorporert i et liposom) Til terapeutisk behandling av tumoren.
En sammenstilling ifølge oppfinnelsen kan således bli benyttet til et utvalg av diagnostiske og/eller terapeutiske metoder.
For eksempel, kan en sammenstilling som omfatter en MAC med en egnet målrettende ligand bli benyttet til å sikte mot et spesifikt organ eller vev, som deretter kan bli selektivt avbildet ifølge konvensjonelle ultralyd-imagingsteknikker, på grunn av den forbedrede imaging som bestemmes av de gassfylte mikrovesikler som er bundet til organet eller vevet. Dersom et diagnostisk middel (eksempelvis for MRI) videre blir inkludert i sammenstillingen, er anvendelse av kombinerte diagnostiske teknikker mulig. Videre, dersom et bioaktivt middel blir inkludert i sammenstillingen (eksempelvis inkludert i et liposom), er det mulig å provosere en ultralydformidlet frigjøring av det bioaktive middel ved et utvalgt mål (eksempelvis hvor en målrettende ligand bindes) ved å påføre en styrt akustisk effekt som er i stand til å ødelegge de gassfylte mikrovesikler, som beskrevet for eksempel i WO 99/39738.
Selvfølgelig, kan en sammenstilling ifølge oppfinnelsen også, sammen med komponenter som bærer en målrettende ligand eller et farmasøytisk aktivt middel, også inneholde komponenter som er frie for nevnte forbindelser, hvilke blir benyttet, for eksempel til å balansere sammenstillingens samlede ladning.
Som tidligere nevnt, har det vært observert at assosiasjonen av en komponent, nærmere bestemt av et antall miceller, til en gassfylt mikrovesikkel til dannelse av en sammenstilling ifølge oppfinnelsen, resultere i en økt resistens for mikrovesiklenes hovedtrykk. For eksempel, har det vært observert at mikrovesikler som fremviser en PC50 (dvs. et typisk trykk ved hvilket mer enn 50 % mikrovesikkelpopulasjonen blir ødelagt) på ca. 500 mm Hg, kan man øke verdien av PC50 til minst 600 mm Hg og opp til 800 mm Hg, Når assosiert til ulike typer miceller til dannelse av en sammenstilling ifølge oppfinnelsen.
Sett
Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører diagnostiske sett som omfatter sammenstillingen ifølge oppfinnelsen eller dens respektive separate komponenter, som eventuelt ytterligere omfatter den vandige flytende bærer.
Ifølge en første utførelsesform, er settet en tokomponentsett som omfatter sammenstillingen ifølge oppfinnelsen sammen med en vandig flytende bærer. Tokomponent-settet kan inkludere to separate beholdere eller en tokammer-beholder.
I det førstnevnte tilfellet er den første beholder fortrinnsvis et konvensjonelt septum-forseglet glass, hvori det glass som inneholder sammenstillingen i form av en lyofilisert rest (oppnådd ifølge en av de i de foregående illustrerte metoder) i kontakt med den ønskede gass er forseglet med et septum gjennom hvilket bærervæsken kan bli injisert for rekonstituering av suspensjonen av de gassfylte mikrovesiklers/MAC-ers sammenstillinger. Bærevæsken er rommet i en andre beholder som fortrinnsvis tar form av en injeksjonssprøyte. Injeksjonssprøyten blir fortrinnsvis gjenfylt med den rekonstituerte suspensjon og benyttet til deretter å administrere kontrastmidlet ved injeksjon. I stedet for den før nevnte sammenstilling, kan en første beholder alternativt inneholde blanding av separat frysetørkede MAC- og mikrovesikkel-preparater, som vil danne den ønskede sammenstilling under rekonstituering med den vandige bærer. Selv om håndristing av beholderen generelt frembringer den ønskede energi for rekonstituering av suspensjonen, kan innretning for å rette eller tillate tilførsel av tilstrekkelig energi til beholderen bli frembrakt (eksempelvis en Vortex mikser), med sikte på å sikre egnet rekonstituering av sammenstillingens suspensjon. Den tokammer-beholderen er fortrinnsvis en tokammer-injeksjonssprøyte, hvor komponentene blir holdt atskilt eksempelvis ved hjelp av et septum som kan tas bort, og straks lyofilisatet har blitt rekonstituert ved forsiktig rysting, kan beholderen bli benyttet direkte til å injisere kontrastmidlet. Som før, kan innretning for å rette eller tillate tilførsel av tilstrekkelig energi til beholderen blir frembrakt.
Det vil bli forstått av fagfolk at andre tokammer-rekonstitueringssystemer som er i stand til å kombinere det tørkede pulver med den vandige løsning på en steril måte også befinner seg innen rekkevidden av den følgende oppfinnelse. I slike systemer, er det særlig fordelaktig om den vandige fase kan bli plassert inn mellom den vannuløselige gass og omgivelsene, for å øke produktets holdbarhet ved lagring.
Ifølge en annen utførelsesform, er et sett ifølge oppfinnelsen, et minst tokomponentsett som omfatter et MAC-preparat, et mikrovesikkelpreparat og, valgfritt, en vandig bærer.
Disse blir fortrinnsvis presentert som minst to separate beholdere, idet den første beholder inneholder det lyofiliserte mikrovesikkelpreparatet (eksempelvis i kontakt med en ønsket gass) og den andre inneholder det ønskede lyofiliserte MAC-preparat (eventuelt i kontakt med en ønsket gass under vakuum). En tredje valgfri beholder, som inneholder den vandige bærer for rekonstituering kan med fordel være inkludert i settet. Om ønsket, kan ytterligere beholdere som inneholder ytterligere lyofiliserte MAC-preparater være inkludert i settet. For administrering, blir MAC-suspensjonen først rekonstituert i den vandige bærer og den oppnådde suspensjonen blir deretter benyttet for å rekonstituere mikrovesikkelpreparatet, for deretter å danne den ønskede sammenstillingssuspensj onen.
Ingen spesifikke beholdere, glass eller tilknyttede systemer er påkrevd; den foreliggende oppfinnelse kan benytte konvensjonelle beholdere, glass og adaptere. Det eneste kravet er en god forsegling mellom korken og beholderen. Forseglingens kvalitet blir, derfor, en sak av primær betydning; enhver degradering av forseglingens integritet ville tillate uønskede substanser å komme inn i glasset. I tillegg til å sikre sterilitet, er opprettholdelse av vakuum essensielt for produkter som er korket ved omgivende- eller reduserte trykk for å sikre trykket og egnet rekonstituering. Materialet i den korken som danner beholderens gassforsegling er helst en ekstorner forbindelse eller multikom-ponent formulering på basis av en ekstorner, slik som polyisobutylen eller butylgummi. Hensiktsmessig kan en betylgummikork fra Daiko Seiko ltd bli benyttet.
Eksempler
Det følgende materiale blir benyttet i eksemplene:
PBS Fosfatbufret salin: 10 mM natriumfosfat, NaCl 0,9 % vekt/vekt,
pH = 7,4
Trisbuffer Trisbufret salin: 10 mM Tris (hydroksymetyl)aminometan, NaCl
0,9 %, pH = 7,4
HEPES buffer 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazinetanesulfonsyre (20 mM) and
NaCl (150mM),pH = 7,4
Tris glyserol buffer Tris (hydroksymetyl) aminometøn lg/l and 0,3 M glyserol, pH =
7,2
DIO18 marker 3,3' -diockdecyloksacarbocyanin (Molecular Probes Inc., USA) Gd-DTPA-(SE)2Distearoyl ester av gadolinium-dietylenetriaminpentaeddiksyre-kompleks (preparert ifølge G, W, Kabalka et al., Magnetic
Resonance in Medicin 8 (1988), 89-95)
DSPG Distearoylfosfatidylglyserol-natriumsalt (Genzyme)
IUPAC: 1,2 -Distearyl-sn-glysero-3-[fosfo-rac-(l-glyserol)] DAPC Diarachidoylfosfatidylkolin (Avanti Polar Lipids)
IUPAC: l,2-Diarachidyl-sn-glycero-3- fosfokolin
DSTAP 1,2 -Distearoyl-3-trimetylammonium-propan klorid (Avanti
Polar Lipids)
DSPC Distearoylfosfatidylkolin (Genzyme) IUPAC: 1, 2- Distearoyl-sn- glycero- 3- fosfokolin
DPPG Dipalmitylfosfatidylglyserol-natriumsalt (Genzyme) IUPAC:
1, 2 - Dipalmityl- sn- glycero- 3- [ fosfo- rac-( 1 - glyserol)]
DPPA Dipalmitoyl fosfatidsyre-natriumsalt (Genzyme)
IUPAC: 1, 2 - Dipalmityl- sn- glysero- 3- fosfate
DPPC Dipalmitoylfosfatidylkolin (Genzyme)
IUPAC: 1, 2 - Dipalmityl- sn- glysero- 3- fosfokolin
DSEPC Distearoyletylfosfatidylkolin (Avanti Polar Lipids)
IUPAC: l, 2- Distearyl- sn- glycero- 3- Etylfosfokolin
NaDOC natriumdeoksykolat (Fluka)
DSPE-PEG2000 Distearoylfosfatidyletanolamin modifisert med PEG2000,
natriumsalt (Nektar Therapeutics)
Etyl-SPC3 Soya-etylfosfokolin; 4:1 (vekt/vekt) blanding av Etyl-DSPC og
Etyl-DPPC
DPPE-cap-biotin 1,2 dipalmityl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin-N-(cap biotinyl)
natriumsalt (Avanti Polar Lipids)
PEG4000 Polyetyleneglykol, MW = 4000 (Fluka)
Pluronic 68 Etylenoksid/propyleneoksid blokk-kopolymer (Fluka)
C4F10Perfluorobutan
Dimensjoner og konsentrasjoner av mikrovesikler er bestemt ved anvendelse av Coulter Counter Multisizer (apartur: 30 \ im).
^-potensialer for mikrovesikkelsuspensjoner blir bestemt ved anvendelse av en Malvern Zetasizer 3000Hsa i 1 mM NaCl.
Dimensjoner av micelleprepareringer er bestemt ved anvendelse av en Malvern Zetasizer 3000Hsa.
Eksempel 1
Preparering av positivt ladede mikroballonger
Tripalmitin (60 mg) blir oppløst i cykloheksan (0,6 ml) ved 40 °C. Denne organiske fasen blir holdt ved 40 °C frem til emulgering. 40 mg Etyl-SPC3 (kationisk fosfolipid) blir dispergert i 30 ml destillert vann ved 60 °C i 15 minutter og deretter blir dispersjonen tillatt å avkjøles til 40 °C.
Den organiske fasen blir emulgert i den vandige fasen ved anvendelse av en Polytron® homogenisator PT3000 (1000 omdreininger pr min i 1 min), emulsjonen blir deretter fortynnet med 5 ml PVA (200 mg, Mw: 9000 fra Aldrich) i destillert vann, deretter avkjølt til 5 °C, frosset ved -45 °C i 10 min og deretter lyofilisert (0,2 mbar, 241).
Lyofilisatet blir redispergert i destillert vann i (20 ml) i nærvær av luft, mikroballonger blir vasket 2 ganger ved sentrifugering (600 g i 10 min) med fosfatbufret salin og den endelige suspensjonen av mikroballonger (20 ml). Størrelsesundersøkelsen av denne preparering ga de følgende resultater: DV5o= 2,54 pm; DN = 1,57 pm.
Eksempel la
Preparering av fluorescentmarkerte positivt ladede mikroballonger.
Eksempel 1 blir gjentatt ved tilsetting av 5 vekt- % (i forhold til totalvekten av tripalmitin) av lipofilt fluoriserende probe DI018 i den organiske fase for fluoriserende markering av mikroballongen. Størrelsesundersøkelsen for denne preparering ga det følgende resultat: Dvso= 2,38 pm; Dn = 1,45 pm.
Eksempel 2a-2e
Preparering av DSTAP-inneholdende positivt ladede mikrobobler.
15 mg av DAPC og kationisk lipid DSTAP (se relativt forhold i tabell 1) og 985 mg PEG4000 ble oppløst i tert-butanol (10 ml) ved 50 °C. Løsningen blir plassert i 10 ml glass (50 mg tørrstoff pr glass) deretter frysetørket på en Christ Epsilon 2-12DS frysetørker (-30 °C, 0,56 mbar i 241). Etter ytterligere tørking (25 °C, 0,1 mbar i 5 t), blir glassene korket med en ekstorner kort og forseglet med avrivbar aluminium.
De oppnådde lyofilisater blir eksponert overfor den ønskede gass (50:50 volum/volum av C4F10/N2og deretter redispergert i 5 ml av den PBS-bufrede løsning for således å oppnå en suspensjon av positivt ladede mikrobobler. Størrelsesundersøkelsen av suspenderte mikrobobler er rapportert i tabell 1.
Eksempler 3a - 3c
Preparering av negativt ladede mikrobobler
Prepareringen av eksempler 2a - 2e blir gjentatt ved å erstatte DAPC/DSTAP-blandingen med den samme totalmengde (15 mg) av DPPG/DSPC-blanding i ulike relative mengder, som indikert i tabell 2. Størrelsesundersøkelse av suspenderte mikrobobler er rapportert i tabell 2.
Eksempel 4
Preparering av positivt ladede mikrobobler
DSTAP (200 mg) blir dispergert i 100 ml vann som inneholder 5,4 volum- % av en blanding av propylenglykol og glyserol (3:10 vekt/vekt) ved 80 °C i 5 minutter og deretter avkjølt til romtemperatur.
Dispersjonen blir deretter overført til en reaktor under C4F4atmosfære og homogenisert ved 20000 omdr./min (Polytron PT3000) i 10 minutter, idet rotorstators blandeaksel holdes slik at åpningene er rett under væskens overflate. De oppnådde mikrobobler blir vasket to ganger ved sentrifugering med vann, deretter redispergert i en 7,5 % dekstran-løsning.
Suspensjonen blir fordelt i 10 ml glass (2 ml pr glass). Glassene blir avkjølt til -45 °C og lyofilisert i 24 timer, deretter korket, forseglet og holdt ved romtemperatur. Størrelsesundersøkelse av mikrobobler resuspendert i destillert vann var som følger: Dv=4,04 ;DN=1,75.
Eksempel 5a-5d
Preparering av negativt ladede miceller
50 mg av Gd-DTPA-(SE)2 (som inneholder spor av radioaktivt<153>Gd) og 10 mg NaDOC blir dispergert i 5% vandig glukose (10 ml) ved anvendelse av 3 mm sonikeringsprobe som er festet til en Branson 250 lydgiver (ytelse: 30% i 10 min), til oppnåelse av en vandig suspensjon av anioniske miceller. Den samme preparering blir gjentatt ved å dispergere ulike mengder av ulike forbindelser med samme volum av vandig glukoseløsning, som indikert i den følgende tabell 3.
Eksempel 6a-6f
Preparering av DPPA-holdige negativt ladede miceller
Ulike mengder av anionisk fosfolipid-DPPA og nøytralt fosfolipid-DPPC (som indikert i tabell 4) sammen med 16 mg Pluronic F68 blir dispergert i 10 ml PBS, ved anvendelse av en 3 mm utgiverprobe (Branson 250 lydgiver, ytelse 30 % i 10 min). En liten mengde DPPC-H (ca 2,5 [ id i 10 ml endelig suspensjon) blir tilsatt til micelleprepareringen som radioaktiv markør.
Etter sonikering, blir løsningen filtrert gjennom 0,2 \ im filtre (Millipore). Etter avkjøling til romtemperatur, blir micellestørrelsen målt ved anvendelse av Malvern Zetasizer 3000HSA og spesifikt radioaktivitet blir bestemt ved anvendelse av 50 \ il løsning som fortynnet i 10 ml LSC-coctail Hionic Fluor (Packard Bioscience) og talt opp i Tricarb 2200A væskescintillasjonsanalysator (Packard Bioscience).
Eksempel 7a-7b
Preparering av negativt ladende miceller inneholdende DSPE-PEG
20 mg DSPE-PEG2000 blir oppløst i 1 ml kloroform/etanol (1/1, volum/volum) ved 60 °C i en rundkolbe og løsningsmiddelblandingen blir avdampet under vakuum, noe som etterlater en tynn film på kolbens innervegg. Denne filmen blir ytterligere tørket over nattet i et vakuumkammer. Lipidfilmen blir deretter hydratisert med 10 ml Hepes-buffer ved 60 °C i 30 min. Løsningen blir deretter filtrert på 0,2 \ im filtre og tillatt å avkjøles til romtemperatur forut for undersøkelse. Filtrert løsning blir fortynnet med vann (fortynningsforhold 1:3) og analysert med Malvern Zetasizer 3000HSA med hensyn til størrelsesfordeling. Resultatene av to ulike prepareringer ifølge den ovenstående prosedyre er oppsummert i tabell 5.
Eksempel 8
Preparering av positivt ladede miceller inneholdende Etyl-SPC3
16 mg Etyl-SPC3 og 16 mg Pluronic F68 blir dispergert i 5 % vandig glukose (10 ml) ved anvendelse av et 3 mm sonikeringsprobe som er festet til en Branson 250 lydgiver (ytelse: 30 % i 10 min), til oppnåelse av en vandig suspensjon av kationiske miceller.
Eksempel 9a - 9e
Preparering av DSTAP-holdige positivt ladede miceller
Prepareringen av eksemplene 6a-6f blir gjentatt ved å erstatte negativt ladet DPPA med positivt ladet DSTAP. Relative mengder av lipider og fosfolipider i de ulike prepareringer er rapportert i tabell 6.
Eksempel 10a- 10b
Preparering av sammenstillinger med kationiske mikroballonger og anioniske miceller Mikroballongsuspensjonen fra eksempel 1 (1 ml) blir blandet sammen med ulike volummengder (indikert i tabell 7) av micellepreparering fra henholdsvis eksempel 5a og 5b. Etter 1 time, blir suspensjonen vasket to ganger med PBS ved sentrifugering (600 g i 5 min) og redispergert i PBS (1,2 ml). Mengden bundede miceller (uttrykt som prosentandelen av den radioaktivitet som ble målt på sammenstillingssuspensjonen i forhold til den radioaktivitet som ble målt på den innledningsvis micellepreparering) blir bestemt ved måling av suspensjonens Gd<153>radioaktivitet (gammatelling) ved dannelse av et Cobra II Autogamma-instrument (Packard Bioscience). Resultatene er gitt i tabell 7.
Slik det kan sluttes fra ovenstående tabell er det så at, selv om den relative mengde av bundede miceller (dvs. prosentandelen av bundede miceller i forhold til den totale mengde tilsatte miceller) minsker ved økning av den totale mengde miceller (dvs. volumet av micellesuspensjonen) som tilsettes til mikrovesikkelsuspensjonen, er den absolutte mengde av bundede miceller (gis ved produktet av første og siste kolonne i tabell 7) ikke desto mindre økende.
I det vesentlige lignende resultater blir oppnådd ved preparering av en sammenstilling med mikroballongene fra eksempel 1 og micelleprepareringen fra henholdsvis eksemplene 5c og 5d.
Eksempel 11
Bestemmelse av bindingsaktivitet for sammenstillingene fra eksempel 10a - 10b.
For å teste bindingsaktiviteten for sammenstillingene fra eksempel 10a og 10b (10 pl og 100 ul av hver micellesuspensjon-preparering), blir en neutravitinbelagt overflate preparert som følger: karbonatbuffer (pH 9,5 - 300 ul) og NeutrAvidin™ (Pierce - 1 mg/ml - 50 ul) blir tilsatt til hver fordypning i en tolvfordypningers skål (Nunc™). Etter inkubering (over natten - 4 °C) blir fordypningen vasket to ganger med PBS som inneholder 0,1 % Tween og to ganger PBS. Bovine serum albumin (2 % i PBS - 350 ul) bygges opp og etter inkubering (25 °C -1 time) blir fordypningen vasket 2 ganger med PBS som inneholder 0,1% Tween 20 og to ganger med PBS.
En mengde på 2 - IO8 sammenstillinger som ble preparert under eksemplene 10a og 10b blir tilsatt til hver fordypning, deretter blir fordypningen fylt med PBS, forseglet og deretter vendes skålen. Etter invers inkubering (21 - 25 °C), blir fordypningen vasket 2 ganger med PBS og overflaten blir observert gjennom et optisk mikroskop med en 40 ganger forstørrende linse. Begge sammenstillingene fra eksempel 1 Ob, som inneholder biotinerte celler, fremviser affinitet for neutravidinbelagt overflate, idet 100 ul/ml prepareringen frembringer en høyere dekning av overflaten i forhold til 10 ul/ml prepareringen. Tilsvarende ikke-biotinerte prepareringer fra eksempel 10a fremviser i stedet ingen bindingsaktivitet på denne travidinbelagte overflate.
I det vesentlige blir lignende resultater oppnådd ved å sammenligne bindingsaktiviteten for sammenstillinger som omfatter mikroballonger fra eksempel 1 og ikke-biotinerte miceller fra eksempel 5 c med tilsvarende sammenstillinger som omfatter mikroballonger fra eksempel 1 og biotinerte miceller fra eksempel 5d.
Eksempel 12a-23b
Preparering av sammenstillinger med kationiske mikrobobler og anioniske miceller Mikroboblesuspensjonen fra eksempel 2d (1 ml) blir blandet sammen med ulike volummengder (indikert i tabell 8) av micelleprepareringene fra henholdsvis eksempel 5a eller 5b. Suspensjoner blir forsiktig omrørt i 1 time, deretter vasket 2 ganger ved sentrifugering (180 g i 5 min) med Tris glyserolbuffer. Infranatant blir kastet og resten blir dispergert i Tris glyserol buffer (1 ml). Størrelse, konsentrasjon og ^-potensialet for de oppnådde sammenstillinger er rapportert i tabell 8.
I begge tilfeller, bestemmer økende volumer av miceller suspensjon en reduksjon av potensialet for den oppnådde respektive sammenstillingsuspensjon.
I det vesentlige lignende blir resultater oppnådd ved dannelse av mikroboblesuspen-sjonene fra eksemplene 12c eller 12e, i stedet for mikrobloblesuspensjonen fra eksempel 2d, eller ved å erstatte micelleprepareringene fra eksempel 5a og 5b med de fra henholdsvis eksemplene 5 c og 5 d.
Eksempel 13
Bestemmelse av bindingsaktivitet for sammenstillingene i eksemplene 12a-12b For å teste bindingsaktiviteten for sammenstillingen fra eksempel 12a-12b, blir en neutravidinbelagt overflate preparert som beskrevet i eksempel 11 og testet med ulike mengder (300, 100, 30 og 10 pl) av prepareringene i eksempel 12a og 12b.
En markert bindingsaktivitet er observert ved det optiske mikroskop for de 100 pl/ml og 300 ul/ml prepareringen fra eksempel 12b. en lavere binding er observert for den 30 ul/ml preparering mens 10 pl/ml blandingen fremviser svak binding. Alle sammenstillingene fra eksempel 12a (ikke inneholdende biotinerte miceller) fremviser ingen bindingsaktivitet.
Eksempel 14a til 14b
Preparering av sammenstilling med kationiske mikrobobler og anioniske miceller.
Det lyofiliserte innhold av et glass som ble oppnådd ifølge eksempel 4 blir eksponert for C4F10og redispergert i 2 ml destillert vann. Suspensjonen vaskes to ganger ved sentrifugering (180 g i 10 min) med PBS og redispergeres i 2 ml PBS. 50 ul av en micellepreparering som ble preparert henholdsvis ifølge eksempel 5a eller 5b, tilsettes, blandingen omrøres over natten med en roterende rører under C4F10atmosfære, vaskes deretter 2 ganger med PBS ved sentrifugering (180 g i 10 min) og redispergeres endelig i 2 ml PBS.
Tabell 9 fremlegger undersøkelsen av sammenstillingene fra eksempel 14a og 14b.
Slik det kan sluttes fra den ovenstående tabell, er i det vesentlige alle miceller assosiert til mikrobobler i de dannede sammenstillinger idet sammenstillingene har i det vesentlige den samme gjennomsnittlige diameter som de innledningsvise mikrobobler.
Eksempel 15
Preparering av sammenstillinger med anioniske mikrobobler og kationiske miceller En mikroboblesuspensjon som ble preparert ifølge eksempel 3b henviser (1 ml) blir blandet med ulike volummengder (indikert i tabell 10) av micelle prepareringen fra eksempel 8. Suspensjonen omrøres forsiktig i en time, vaskes deretter 2 ganger ved sentrifugering (180 g i 5 min) med Tris glyserolbuffer. Infranatant blir kastet og de resulterende sammenstillinger dispergeres i Trisglyserolbuffer (1 ml). Tabell 10 viser noen egenskaper for sammenstillingene.
Det kan bli observert at med en mengde miceller som er i stand til å bestemme en reversering i tegn for mikroboblesuspensjonens innledningsvise ^-potensial, blir sammenstillingens gjennomsnittsdimensjoner nærmere til de innledningsvise mikroboblers dimensjoner.
Eksempel 16
Bestemmelse av mengden bundede miceller som en funksjon av mengden ladede forbindelser i sammenstillingspreparering som omfatter kationiske mikrobobler og anioniske miceller
Ulike sammenstillingssuspensjoner blir preparert ved å blande inn 300 ul av en micelle-løsning som preparert ifølge eksempel 6a —6f i 1 ml mikroboblesuspensjon PBS som preparert ifølge eksemplene 2a-2e i et 5 ml glassrør, for samlet sett 30 sammenstillingsprepareringer. De blandede suspensjoner omrøres forsiktig i 30 min og vaskes deretter 2 ganger ved sentrifugering (180 g i 10 min) for å fjerne ubundet materiale. Mengden lipidmolekyler i miceller som er bundet til mikroboblene blir evaluert ved å dosere radioaktivt etikettert molekyl DPPC-<3>H som er inkorporert innen micellene.
Figur 1 viser resultatene av målingene, hvor linjen A til E representerer mengden miceller som er bundet til mikrovesiklene som en funksjon av mengden ladede forbindelser i micellene, for sammenstillinger som omfatter de respektive mikrovesikler som preparert ifølge eksemplene 2a til 2e.
Fra figuren, kan det bemerkes at i det vesentlige ingen bundede miceller er observert for sammenstillingsprepareringen som inkluderer miceller fra eksempel 6a (ingen ladet surfaktant). Videre, øker mengden miceller bundet til mikrovesiklene med økningen i mengden ladede forbindelser som er inkludert i mikrovesikkelen. Endelig, for denne særlige kombinasjonen av sammenstillinger micellevesikler, kan det bli observert at høyere mengder miceller bindes til mikrovesiklene når den relative mengde ladet forbindelse i micellen er fra ca. 1 % til ca. 5 % (vekt/vekt) av totalvekten.
Eksempel 17
Bestemmelse av mengden bundede miceller som en funksjon av mengden ladede forbindelser i sammenstillingsprepareringer som omfatter anioniske mikrobobler og kationiske miceller.
Ulike sammenstillingssuspensjoner blir preparert ved å blande inn 300 ul av hver av de micelleløsninger som ble preparert ifølge eksempel 9a-9e i 1 ml av hver av de mikro boblesuspensjoner som ble preparert ifølge henholdsvis eksemplene 3a til 3c i et 5 ml glass, for samlet sett 15 sammenstillingsprepareringer. De blandede suspensjoner omrøres forsiktig i 30 min. og vaskes deretter 2 ganger ved sentrifugering (180 g i 10 min) for å fjerne ubundet materiale. Mengden lipidmolekyler i micellene som er bundet til mikroboblene blir evaluert med dosering av radioaktivt etikettert molekyl DPPC- H som er inkorporert innen micellen.
Lignende resultater blir observert når det gjelder sammenstillingsprepareringer fra eksempel 16, dvs. at ved å øke mengden ladede forbindelser som er inkludert i mikro-vesikkelen er det mulig å øke mengden miceller som er bundet til mikrovesiklene og at, nærmere bestemt for sammenstillingen hvor mikrovesiklene inneholder en lavere mengde ladede forbindelser, er en høyere mengde miceller bundet til mikrovesiklene når den relative mengden ladet komponent i micellen er fra ca 1 % til 5 % (vekt/vekt).
Eksempel 18
Bestemmelse av mengden bundede miceller som en funksjon av mengden miceller som er tilsatt til mikroboblesuspensjoner inklusive ulike mengder ladede forbindelser. Ulike mengder (50, 100, 250 og 500 ul) av micelleprepareringer som fremstilt ifølge eksempel 7a eller 7b blir kombinert med 1 ml av mikrobobleprepareringene som preparert ifølge eksempel 2g, 2d og 2e for samlet sett 12 sammenstillingsprepareringer (nærmere bestemt er 2b og 2d kombinert med 7a, mens 2d er kombinert med 7b). Blandingene blir forsiktig omrørt i 10 min, og vasket 2 ganger ved sentrifugering (180 g 10 min) i vann til fjerning av det ubundede materialet.
De resulterende suspensjoner ble undersøkt ved Coulter Counter for måling av størrelsesfordeling og ved Malvern Zetasizer for ^-potensial. Et parti av prøvene blir frysetørket ved 0,2 mbar i 24 timer og lyofilisatet analyseres ved HPLC til bestemmelse av mengden av DSPE-PEG i sammenstillingen (ug PE-PEG/ml bobler), resultatene er oppsummert i den følgende tabell 11, som illustrerer den innledningsvise mengde DSPE-PEG som er inkludert i blandingen for å danne sammenstillingen, den endelige mengde DSPE-PEG i sammenstillingen (som svarer til mengden bundede miceller) forholdet (uttrykt som ekvivalent av ladning)mellom positive og negative ladninger i den endelige sammenstilling og den endelige suspensjons respektive ^-potensial.
Fra ovenstående tabell, kan det bli observert at, generelt sett, desto høyere mengde ladede forbindelser i mikrovesikkelen er, desto høyere er mengden bundede miceller i den endelige sammenstilling. Dessuten, med hensyn til den samme mikrobobleprepa-rering, desto høyere mengde bundet DSPE-PEG, desto høyere EC-forhold og desto lavere verdi for ^-potensialet.
Eksempel 19
Sammenstilling av kationiske mikrovesikler med anioniske miceller og sammen-lignende blanding av anioniske mikrovesikler og aninoiske miceller 20 mg DSPE-PEG2000 veies og oppløses i kloroform/metanol (1/1, volum/volum) ved 60 °C i en rundkolbe og løsningsmiddelblandingen blir avdampet under vakuum, som avsetter en tynn film på kolbens indre vegg. Denne filmen tørkes videre over natten i et vakuumkammer.
Lipidfilmen blir hydratisert med 10 ml 5 % glukose ved 60 °C i løpet av 30 minutter, løsningen blir filtrert på 0,2 um filtre og deretter avkjølt til romtemperatur forut for undersøkelsen.
Prepareringen blir gjentatt to ganger.
Mikrobobler blir preparert som beskrevet i eksempel 2e (positivt ladede) og 3 b (negativt ladede), ved anvendelse av en 50/50 (vekt/vekt) blanding av DAPC og DSTAP eller en 50/50 (vekt/vekt) blanding av DSPC og DPPG. Glass blir eksponert overfor C4F10/N250/50 (volum/volum) forut for rekonstituering.
2,5 ml micelleløsning blir fortynnet med 2,5 ml av 5 % glukose. De lyofiliserte mikrobobler blir rekonstituert ved anvendelse av den fortynnede løsning av miceller, virvlet i 2 minutter, deretter forsiktig blandet i 30 minutter.
Den oppnådde suspensjon blir vasket to ganger med glukose 5 % (ved sentrifugering, 180 g/10 min) og supernatanten blir dispergert i 2,5 ml 5 % glukose, ^-potensialet for hver suspensjon blir målt ved anvendelse av Malvern Zetasizer 3000Hsa (50ul/10ml NaCl lmM) mengden DSPE-PEG2000 i hver suspensjon blir bestemt ved anvendelse av HPLC. Resultater er oppgitt i tabell 12.
Fra den ovenstående tabell, kan det bli observert at i det vesentlige ingen binding av anioniske miceller på anioniske mikrobobler bli oppnådd, dvs. bare neglisjerbare mengder DSPE-PEG er funnet i den endelige blandingen, mens ^-potensialet forblir i det vesentlige negativt.
Eksempel 20
Kationiske mikroballonger - kolloida! gullsammenstilling
En suspensjon av kationiske mikroballonger som preparert ifølge eksempel 1 blir blandet inn i en kolloidal suspensjon av gullpartikler som stabiliserer med natriumsitrat (Polysciences - 60 nm) i ulike forhold (uttrykt som antall gullpartikler/antall mikroballonger, se tabell 13). Etter 2 timer, blir de flytende partikler separert og redispergert i destillert vann. Tabell 13 viser at en nøytral verdi for ^-potensialet blir nådd ved et forhold på ca. 200 gullpartikler pr mikroballong.
Eksempel 21 - Kationiske mikrobobler - magnetitter
Magnetitter som belagt med DPPA/Pluronic Fl08 (FE/DPPA/Pluronic F108 forhold 3/15/15 i mg/ml) ble preparert ifølge US patent 5,545,395. Løsningen ble fortynnet 100 ganger med Tris (lg/l)/Glyserol (0,3M) buffer (pH: 7,05). Kationiske mikrobobler (som preparert ifølge eksempel 2d, bortsett fra at den benyttede gass er SF6i stedet for blandingen C4F10/N2) blir redispergert under SF6 atmosfære med 5 ml magnetittløsning. Etter 2 minutter virvling, blir suspensjonen forsiktig blandet i 1 time. Deretter blir de flytende partikler vasket 2 ganger med Tris glyserolbuffer ved sentrifugering (180 g/10 min). Størrelse og konsentrasjon blir målt med Coulter counter Multisizer. ^-potensialet blir bestemt ved Malvern Zetasizer 3000Hsa (fortynning: 50ul/10ml vann). Magnetitters binding blir målt ved anvendelse av relaksasjonstid (T2)-bestemmelse (Bruecker: Minispec MQ20) og sammenlignet med en kontroll som blir gjennomført på en tilsvarende preparering av mikrobobler uten magnetittpartikler. Resultatene er oppgitt i tabell 14.
Som vist i den ovenstående tabell er det, i tillegg til reduksjonen av ^-potensialet i forhold til kontrollsuspensjonen observert en vesentlig reduksjon av T2 , noe som bekrefter en vesentlig binding av magnetittholdige miceller til mikroboblene.
Eksempel 22 - Effekt av motsatt ladede miceller på overflaten av ladede mikrobobler i in vivo administrering
Positivt ladede mikrobobler blir preparert som beskrevet i eksempel 2d ved anvendelse av 80/20 (vekt/vekt) blanding av DAPC og DSTAP. Negativt ladede mikrobobler blir preparert som beskrevet i eksempel 3 b ved anvendelse av en 50/50 (vekt/vekt) blanding av DSPC og DPPG. Glass blir eksponert overfor C4F10/N250/50 (volum/volum) forut for rekonstituering med Tris/glyserolbuffer (5 ml).
Miceller blir preparert ifølge eksempel 6f (negativt ladede) og eksempel 8 (positivt ladede). Deretter blir de følgende suspensjoner av mikrobobler eller av sammenstillinger preparert: Suspensjon A: 600 ul av Tris/Glyserolbuffer blir blandet inn i 2 ml mikrobobler (eksempel 2d - positivt ladede) og blandet forsiktig i 30 minutter.
Suspensjon B: 600 ul miceller ifølge eksempel 6g (negativt ladede) er blandet inn i 2 ml mikrobobler (eksempel 2d - positivt ladede) og blandet forsiktig i 30 minutter.
Suspensjon C: 600 ul Tris/glyserolbuffer blir blandet inn i 2 ml mikrobobler (eksempel 3b - negativt ladet) og blandet forsiktig i 30 minutter.
Suspensjon D: 600 ul miceller ifølge eksempel 8 (positivt ladede) blir blandet inn i 2 ml mikrobobler (eksempel 3b - negativt ladede) og blandet forsiktig i 30 minutter.
Alle suspensjoner blir vasket 2 ganger med Tris/glyserolbuffer (ved sentrifugering 180 g/10 min) og supernatantene blir redispergert i 2 ml buffer. Størrelse og konsentrasjoner er bestemt ved dannelse av en Coulter counter. ^-potensialet for hver suspensjon er bestemt med en Malvern Zetasizer 3000Hsa (50ul/10ml NaCl ImM) og er illustrert i den følgende tabell 15:
Suspensjonene ble injisert i en kaninørevene ved en dose på 5E + 06 mikrobobler per kg kroppsvekt. Todimensjonal ekkografi ble utført i Coherent Contrast Imaging (CCI) ved anvendelse av en Acuson Sequoia 512 som utstyrt med en 4C1-S transduser i intermittent imaging (to rammer/s) og en høy mekanisk indeks (MT). Bilder av nyren ble registrert på en videoopptaker i løpet av 3 minutter og sekvensen ble analysert til bestemmelse av den gjennomsnittlige bildepunktintensitet som en funksjon av tid i en region av interesse (ROI) som var utvalgt i barken (Figur 2 og 3).
Som sett i figurene, endret tilsatsen av miceller av motstående ladning på mikrobobler dramatisk mikroboblers in vivo atferd. Således er positivt ladede mikrobobler knapt påviselige i nyrens bark (suspensjon A). Etter inkubering med negativt ladede miceller, fremviser imidlertid de samme mikrobobler et sterkt signal i ROI (suspensjon B). Lignende negativt ladede mikrobobler (suspensjon C) fremviser et sterkt signal i nyren. Etter sammenblanding av positivt ladede miceller, er imidlertid nesten intet signal påviselig i ROI.
Eksempel 23 - Sammenstilling av kationiske mikrobobler med anioniske miceller som omfatter et legemiddel
2 ml mikroboblesuspensjon (som preparert ifølge eksempel 2a dispergert i PBS) blir blandet med ulike mengder Fungizone®-løsninger (micelær suspensjon av Amfotericin B med natrium deoksykolat i PBS - Bristol Myers Squibb) som illustrert i den følgende
tabell 16. Suspensjoner blir forsiktig omrørt i 1 time, deretter vasket 2 ganger ved sentrifugering (180 g/ 5 min) med PBS buffer. Infranatant blir kastet og de oppnådde sammenstillinger blir dispergert i Buffer (1 ml). Størrelse og konsentrasjon blir målt ved Coulter Counter Multisizer (apertur : 30um - 50ul/100ml NaCl 0,9%). ^-potensial bestemt ved en Malvern Zetasizer 3000Hsa (50ul/10ml destillert vann). Mengden Amfotericin B på mikrobobler ble målt ved spektrofotometri (409 nm - 50 ul av sammenstillinger i 2 ml CHCls/MeOH 1/1) og sammenlignet med en kalibreringskurve for Fungizone®. Resultatene som er illustrert i den følgende tabell 16 viser at ved å øke mengden tilsatte miceller, var det mulig å inkludere økende mengder legemidler inn i sammenstillingene.
Eksempel 24: Sammenstilling med dobbeltlag av miceller
Eksempel 24a: Preparering av negativt ladede bobler
DPPC/DPPS-holdige mikrobobler blir preparert ved anvendelse av den fremgangsmåten som ligner den som er beskrevet i eksempel 3a i US-patent 5,830,435.1 korthet, blir multilamilære liposomer (MLVs) oppnådd ved å dispergere 59,2 mg av DPPC og 40,8 mg DPPS i 100 ml destillert vann som inneholder 1 g propylenglykol. Liposomene blir inkubert ved 70 °C i 30 minutter under agitering. Liposomenes gjennomsnittsdiameter er på 1,4 um for DN og 2,7 ul for Dv.
Liposomsuspensjonen blir ført inn i en gasstett glassreaktor som utstyrt med en høy-hastighets mekanisk emulgator (Megatron MT3000, Kinematica, Sveits). En gasspose som inneholder C4F10blir knyttet til emulgatorens blandekammer. Etter homogenisering (10 000 omdr/min -1 min), blir en melkeaktig suspensjon av mikrobobler oppnådd. Infranatanten (ca 90 ml som inneholder for det meste liposomer) blir fjernet ved dekantering. Supernatanten (som inneholder mikroboblene) blir utvunnet og resuspendert i destillert vann til et totalvolum på 100 ml. Dekanteringstrinnet blir gjentatt og den endelige boblesuspensjon blir resuspendert i 10 % maltose. Alikoter av suspensjonen blir oppsamlet i 10 ml glassbeholdere (1 ml suspensjon pr flaske) og prøvene blir frosset ved -45 °C og lyofilisert.
Etter lyofilisering, blir flaskene lukket med gummikorker, evakuert og fylt med en gassblanding som inneholder en 1:1 (volum/volum) blanding av C4F10og luft. Mikrobobler blir generert ved å injisere 2 ml destillert vann inn i flaskene gjennom korken og håndriste.
Eksempel 24 b: Preparering av kationiske og anioniske miceller.
Eksempel 24 bl
Kationiske miceller blir preparert med 3,73 mg/ml av DSPE-PTE020 (et flerarmet PEG-fosfolipid, NOF Corporation, Japan) og 1,27 mg kationisk fosfolipid DPEPC (Dipalmitoyl Glysero-3-Etylfosfokolin, Avanti® Polar Lipids, Inc. USA).
Eksempel 24 b2
Anioniske og funksjonaliserte miceller blir preparert med 4,1 mg/ml av DSPE-PEG2000 og 0,9 mg/ml av GPUbllla-bindende lipopeptid (DPPE-PEG2000-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, preparert ifølge eksempel 3 fra US 6,139,819).
Både positivt og negativt ladede miceller blir preparert i 5 % glukoseløsning.
Eksempel 24c: Preparering av sammenstilling med negativt ladede bobler og multi-makslag med motsatte elektriske ladninger. 50 ul og 500 ul kationiske miceller som var preparert ifølge eksempel 24 bl blir henholdsvis tilsatt til 2 prepareringer som inneholder ca. lxl0<9>negativt ladede mikrobobler som preparert ifølge eksempel 24a. Blandingen blir forsiktig omrørt i 30 minutter og deretter vasket ved sentrifugering (10V1000 omdr/min) med resuspensjoner i en 5 % løsning av glukose. Størrelse og zetapotensialet for den oppnådde sammenstilling er bestemt som rapportert i tabell 17 i det følgende (rader "sammenstilling 1"). Resultatene viser at etter dekking av de negativt ladede mikrobobler med et lag kationiske miceller, blir sammenstillingssuspensjonens målte zetapotensial positivt. 100 ul og 250 ul anionisk micellesuspensjon (preparert ifølge eksempel 24b2) blir deretter respektive tilsatt den sammenstilling som inneholder 50 pl kationiske miceller og til den sammenstilling som inneholder 500 ul kationiske miceller. De to blandinger blir forsiktig omrørt i 30 minutter og vasket to ganger ved sentrifugering (1071000 omdr/min) med resuspensjoner i en 5 % løsning av glukose. Diameterne og zeta-potensialverdien for den oppnådde dobbellagssammenstilling er gitt i tabell 17 i det følgende (rader "Sammenstilling 2"); tilstedeværelsen av det andre lag av negative miceller bestemmer tilsvarende negative verdier for zetapotensialet.
Lignende sammenstillinger som omfatter et antall alternerende ladede lag kan også bli fremstilt med andre typer MAC-er, slik som liposomer og nanopartikler. For eksempel, kan negativt ladede mikrobobler bli belagt med kationiske og medisinholdige liposomer og deretter med et andre lag av anioniske miceller som bærer målrettende enheter.
Eksempel 25: Preparering av sammenstillinger fra emulsjon
50 ml av destillert vann som inneholder DAPC og DSTAP (80:20, 2 mg/ml) blir opp-varmet ved 70 °C i 30 minutter og deretter avkjølt til romtemperatur. 4 ml perfluorheksan blir emulgert i denne vandige fasen ved anvendelse av en høyhastighetshomo-genisator (polytron, 10000 omdr/min, 1 min). Den resulterende emulsjon fremviser en polymetrisk mediandiameter (DV5o) på 5,0 um og en antallsmessig gjennomsnittsdiameter (DN) på 2,7 ul som bestemt med en Malvern Mastersizer. Emulsjonen ble vasket ved sentrifugering og resuspendert i vann. Ulike mengder anioniske miceller som preparert ifølge eksempel 24b2 blir respektive tilsatt til tre alikoter av den ovennevnte kationiske emulsjon, med respektive konsentrasjoner på 135 ul, 270 ul og 540ul pr ml emulsjon. Etter inkubering (30 min ved romtemperatur og forsiktig omrøring) og
fjerning av overskuddet av miceller ved sentrifugering, ble den micellebelagte emulsjonen redispergert i en 20 % vekt/vekt vandig PEG4000 løsning. Emulsjon-micelle-sammenstillingen ble distribuert i glass (2 ml/glass) deretter frosset og lyofilisert i glass. Luft i lyofilisatenes glass ble evakuert og erstattet med C4F10. Etter rekonstituering med 2 ml 5 % glukoseløsning, blir det oppnådd en melkeaktig mikroboble-micellesammen-stillingssuspensjon. ble oppnådd, ["sic"]. Resultater av Coulter counter og zetapoten-sialanalyser er samlet i tabell 18 nedenfor.
Preparering med økte mengder av anioniske miceller, resulterer i økende mengder av mikrobobler. Videre, kan overflateladningsegenskaper også bli modulert (zetapotensial-verder som varierer fra positive til negative) som ønsket.
Eksempel 26: Preparering av sammenstillinger fra gassemulsjon Negativt ladede mikrobobler blir oppnådd ifølge eksempel 24a ved anvendelse av C4F10som gassfase og DPPS som fosfolipid (2 mg/ml) til stabiliserte mikrobobler. Etter boblegenerering ved høyhastighetsmekanisk emulgering (Megatron® MT3000, Kinematica, Switzerland) av DPPS-liposomsuspensjonen, blir mikroboblene vasket ved diafiltrering i 30 min. ved anvendelse av 1 um polykarbonatmembran (Nuclepore®), til fjerning av overskuddet av fosfolipider i boblesuspensjonen. Kationiske miceller som inneholder DPEPC og DSPE-PEG2000 som konjugert til rotte anti-mus monoclonal IgGl overfor P-selctin (70:30 i molforhold, 5 mg/ml) blir tilsatt til boblesuspensjonen (50 ul miceller for 1 ml mikrobobler ca 5xl0<9>bobler/ml) blandingen blir forsiktig omrørt i 30 minutter ved romtemperatur og sentrifugert. Sammenstillingene (supernatantene) blir resuspendert i en 10 % maltoseløsning, frosset og lyofilisert (2 ml/glass). Etter frysetørking, blir lyofilisatene gasset med C4F10og rekonstituert med 2 ml destillert vann. Coulteranalysen viste at mer enn 90 % av boblemicellesammen-stillingene fremdeles var intakte etter lyofilisering. Disse mikrobobler viste en DN på 1,3 um og DV på 2,9 um. Strømningscytometriske målinger bekreftet tilstedeværelsen av de biokjemisk aktive IgGl antistoff på sammenstillingenes overflate.

Claims (27)

1. Sammenstilling,karakterisert vedat den omfatter en gassfylt mikrovesikkel som bærer en første samlet nettoladning og en komponent som er assosiert til mikrovesikkelen hvori komponenten er en supermolekylær struktur som er dannet ved assosiasjonen av et antall molekyler, som bærer en andre samlet nettoladning som er motstående i fortegn til den første nettoladningen, omfattende et amfifilt biokompatibelt overflateaktivt middel og har en diameter på 100 nm eller mindre.
2. Sammenstilling ifølge krav 1,karakterisert vedat den assosierte komponenten har en diameter på 80 nm eller mindre.
3. Sammenstilling ifølge krav 1,karakterisert vedat den assiosierte komponenten har en diameter på 50 nm eller mindre.
4. Sammenstilling ifølge krav 1,karakterisert vedat den assosierte komponenten omfatter en målsøkende ligand, et bioaktivt middel, et diagnostisk middel eller en hvilken som helst kombinasjon derav.
5. Sammenstilling ifølge krav 4,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en andre komponent som bærer en samlet nettoladning, som eventuelt omfatter en/et annerledes målsøkende ligand, bioaktivt middel, diagnostisk middel eller en hvilken som helst kombinasjon derav.
6. Sammenstilling ifølge krav 5,karakterisert vedat den andre komponenten bærer en samlet nettoladning som er lik i tegn i forhold til mikrovesikkelens ladning.
7. Sammenstilling ifølge krav 1,karakterisert vedat det biokompatible amfifile overflateaktive middelet er et lipid, et fosfolipid eller et modifisert fosfolipid.
8. Sammenstilling ifølge krav 1,karakterisert vedat det biokompatible overflateaktive middel er valgt blant (C2-C10) organiske syrer, organiske fettsyrer omfattende en (C12-C24) alifatisk kjede, farmasøytisk akseptable salter derav, estere derav med polyoksyetylen, polyioniske (alkali) salter, organiske aminer, amider, kvarternære aminsalter, aminosyrer, fosfolipider, estere av mono- eller oligosakkarider med (C12-C24), organiske fettsyrer, organiske sulfonater, perfluororganiske syrer, polymere surfaktanter og blandinger derav.
9. Sammenstilling ifølge krav 1,karakterisert vedat forholdet mellom antall ladninger per mol mikrovesikler og antall ladninger per mol av den andre komponenten er fra ca. 10:1 til ca. 1:10.
10. Sammenstilling ifølge krav 9,karakterisert vedat forholdet er på ca. 2:1 eller mindre.
11. Sammenstilling ifølge krav 1,karakterisert vedat mikrovesikkelen er en mikroboble som er stabilisert ved et omslag som omfatter en amfifil filmdannende forbindelse eller en mikroballong med et omslagsmateriale.
12. Sammenstilling ifølge krav 11,karakterisert vedat den amfifile filmdannende forbindelse som omfattes i det omslag som stabiliserer mikroboblen er et fosfolipid.
13. Sammenstilling ifølge krav 11,karakterisert vedat omslaget omfatter et fosfolipid eller et lipid som bærer en positiv eller negativ nettoladning.
14. Sammenstilling ifølge krav 11,karakterisert vedat mikroballongens omslagsmateriale omfatter et polymermateriale, et proteinholdig materiale, et vannløselig lipid eller enhver kombinasjon derav.
15. Sammenstilling ifølge krav 11,karakterisert vedat mikroballongens omslagsmateriale omfatter en ionisk biodegraderbare polymerer.
16. Sammenstilling ifølge krav 14,karakterisert vedat mikroballongens omslagsmateriale videre omfatter et fosfolipid eller et lipid som bærer en positiv eller negativ nettoladning.
17. Sammenstilling ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den komponenten som er assosiert til mikrovesikkelen er en micelle.
18. Sammenstilling ifølge krav 17,karakterisert vedat micellen omfatter et fosfolipid eller et lipid som bærer en positiv eller negativ nettoladning, eller en polymer ionisk surfaktant.
19. Sammenstilling ifølge krav 13, 16 eller 18,karakterisertv e d at fosfolipidet eller lipidet er valgt fra fosfatidylserinderivater, fosfatidinsyre-derivater, fosfatidylglyserolderivater, polyetylenglykolmodifiserte fosfatidyletanolaminer, etylfosfatidylkolinderivater og de respektive lysoformer; kolinsyresalter; deoksykolinsyresalter; glysokolinsyresalter; (C12-C24) fettsyresalter derav; alkylammoniumsalter som omfatter minst en (C10-C20) alkylkjede; tertiære eller kvarternære ammoniumsalter som omfatter minst en (C10-C20) acylkjede som er forbundet med nitrogenatomet gjennom en (C3-C6) alkylenbro og blandinger derav.
20. Sammenstilling ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 19,karakterisert vedat en vandig suspensjon av sammenstillingen av en farmasøytisk akseptabel bærer fremviser et ^-potensial som er minsket med minst 50 % i absoluttverdi i forhold til ^-potensialet av en vandig suspensjon i den samme bærer av de gassfylte mikrovesikler som danner sammenstillingen.
21. Sammenstilling ifølge krav 20,karakterisert vedat ^-potensialet er minsket med ca. 100 % eller mer i absoluttverdi.
22. Anvendelse av en sammenstilling ifølge et hvilket som helst av kravene 1-21 for fremstilling av en farmasøytisk aktiv formulering.
23. Vandig suspensjon av en fysiologisk akseptabel væske som omfatter en sammenstilling ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 21.
24. Farmasøytisk settkarakterisert vedat den separat omfatter: c) en gassfylt mikrovesikkel eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering, som bærer en første samlet nettoladning som en første komponent; d) en andre komponent eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering, assosierbar med nevnte mikrovesikkel som bærer en andre samlet nettoladning som er motstående i fortegn til første nettoladning, der nevnte assosierte komponent er en supermolekylær struktur dannet ved assosiasjonen av et antall molekyler, omfattende et amfifilt biokompatibelt overflateaktivt middel og har en diameter på 100 nm eller mindre.
25. Farmasøytisk sett ifølge krav 24,karakterisert vedat den omfatter en farmasøytisk akseptabel flytende bærer.
26 Fremgangsmåte for å preparere en sammenstilling ifølge et hvilket som helst av kravene 1-22,karakterisert vedat den omfatter å blande en preparering som omfatter gassfylte mikrovesikler eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering med en preparering som omfatter en komponent eller en forløper derav i form av en frysetørret preparering som blir assosiert med mikrovesiklene.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisert vedat den omfatter:
1) preparering av en første vandig suspensjon som omfatter en gassfylt mikrovesikkel;
2) preparering av en andre vandig suspensjon som omfatter en komponent som skal bli assosiert med den gassfylte mikrovesikkel;
3) blande sammen de to suspensjonene, til oppnåelse av en vandig suspensjon som omfatter sammenstillingen.
NO20063419A 2003-12-22 2006-07-24 Gassfylt mikrovesikkel-sammenstilling anvendelse og fremstilling derav og kit samt fremgangsmåte for fremstilling NO338316B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03029534 2003-12-22
PCT/IB2004/004230 WO2005063305A1 (en) 2003-12-22 2004-12-21 Gas-filled microvesicle assembly for contrast imaging

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20063419L NO20063419L (no) 2006-09-21
NO338316B1 true NO338316B1 (no) 2016-08-08

Family

ID=34717195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20063419A NO338316B1 (no) 2003-12-22 2006-07-24 Gassfylt mikrovesikkel-sammenstilling anvendelse og fremstilling derav og kit samt fremgangsmåte for fremstilling

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9750821B2 (no)
EP (1) EP1701745B1 (no)
JP (2) JP5513708B2 (no)
CN (1) CN100563718C (no)
AU (1) AU2004308756B2 (no)
CA (1) CA2547024C (no)
ES (1) ES2531732T3 (no)
NO (1) NO338316B1 (no)
WO (1) WO2005063305A1 (no)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2352087T3 (es) 2003-02-04 2011-02-15 Bracco Suisse Sa Agentes de contraste para ultrasonido y procedimiento para la preparación de los mismos.
EP1696965B1 (en) * 2003-12-22 2014-12-10 Bracco Suisse SA Assembly of gas-filled microvesicle with active component for contrast imaging
WO2005063305A1 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Bracco Research Sa Gas-filled microvesicle assembly for contrast imaging
US9248204B2 (en) 2004-08-18 2016-02-02 Bracco Suisse S.A. Gas-filled microvesicles composition for contrast imaging
US9446156B2 (en) 2006-09-05 2016-09-20 Bracco Suisse S.A. Gas-filled microvesicles with polymer-modified lipids
US20090180967A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-16 Eugene Tu Ultrsonically active microparticles and method of use
US20090234231A1 (en) * 2008-03-13 2009-09-17 Knight Jon M Imaging Catheter With Integrated Contrast Agent Injector
US9192685B2 (en) 2008-10-07 2015-11-24 Bracco Suisse S.A. Targeting construct comprising anti-polymer antibody and contrast/therapeutic agents binding to the same
CN101745126B (zh) * 2008-12-10 2012-04-25 温州医学院 一种包载水溶性药物超声造影剂的制备方法
WO2011025893A1 (en) 2009-08-28 2011-03-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems, methods, and devices for production of gas-filled microbubbles
WO2011034892A2 (en) * 2009-09-15 2011-03-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems, methods, and devices for microbubbles
CN101773675B (zh) * 2010-03-05 2012-05-30 中山大学 一种负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡及其制备方法
WO2011130658A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 University Of Pittsburgh -Of The Commonwealth System Of Higher Education Custom designed microbubble contrast agents and techniques of ultrasound delivery optimized for nucleic acid delivery to alter gene expression
TW201208706A (en) 2010-08-17 2012-03-01 Univ Nat Yang Ming Ultrasonically-triggered drug vehicle with magnetic resonance imaging function
WO2012030675A1 (en) * 2010-08-28 2012-03-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems, methods, and devices for plasmid gene transfection using polymer-modified microbubbles
KR102025743B1 (ko) 2011-12-16 2019-09-26 나노비오?스 금속성 및 산화하프늄 소재를 포함하는 나노입자, 이의 제조 및 용도
US10357450B2 (en) 2012-04-06 2019-07-23 Children's Medical Center Corporation Process for forming microbubbles with high oxygen content and uses thereof
EP2842545B1 (en) * 2012-04-24 2020-02-12 Osaka University Method for producing an aqueous dispersion of drug nanoparticles and use thereof
US20150343079A1 (en) * 2012-10-25 2015-12-03 Sogang University Research Foundation Ultrasound contrast agent with nanoparticles including drug and method for preparing the same
WO2014096165A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Bracco Suisse Sa Gas-filled microvesicles
EP2968825A4 (en) 2013-03-15 2016-09-07 Childrens Medical Center GAS STABILIZED PARTICLES AND METHODS OF USE
SG11201509436TA (en) 2013-05-30 2015-12-30 Nanobiotix Pharmaceutical composition, preparation and uses thereof
KR101595795B1 (ko) * 2014-03-19 2016-02-22 (주)아이엠지티 약물을 함유한 나노입자가 결합된 이중-목적 paｔ／초음파 조영제 및 이의 제조방법
CN104337766A (zh) * 2014-10-09 2015-02-11 唐春林 一种地高辛脂质微泡及其制备方法
ES2890662T3 (es) 2014-11-25 2022-01-21 Curadigm Sas Composiciones farmacéuticas, preparación y usos de las mismas
EP3229843B1 (en) 2014-11-25 2020-01-01 Curadigm Sas Pharmaceutical composition, preparation and uses thereof
DK3229776T3 (da) 2014-11-25 2023-07-31 Curadigm Sas Farmaceutisk sammensætning, der kombinerer mindst to særskilte nanopartikler og en farmaceutisk forbindelse, fremstilling og anvendelser deraf
MX2017006813A (es) 2014-11-25 2018-01-30 Nanobiotix Composicion farmaceutica, preparacion y usos de la misma.
MX2017006812A (es) * 2014-11-25 2018-02-12 Nanobiotix Composición farmacéutica, preparación y usos de la misma.
BR112017013787A2 (pt) * 2014-12-31 2018-03-13 Lantheus Medical Imaging, Inc. Composições de microesfera de gás lipídio- encapsulado e métodos relacionados
EP3302419A1 (en) 2015-05-28 2018-04-11 Nanobiotix Nanoparticles for use as a therapeutic vaccine
JP2019503403A (ja) * 2016-02-01 2019-02-07 トラスト バイオソニックス インクＴｒｕｓｔ Ｂｉｏｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ． 脂質組成のマイクロバブル及びその製造方法
TWI832081B (zh) 2016-05-04 2024-02-11 美商藍瑟斯醫學影像公司 用於形成充氣微球體及成像個體之方法、震盪裝置及電腦可讀軟體
US9789210B1 (en) * 2016-07-06 2017-10-17 Lantheus Medical Imaging, Inc. Methods for making ultrasound contrast agents
NO342271B1 (en) * 2016-09-29 2018-04-30 Sintef Tto As A new drug delivery system for treatment of cancer
US11147890B2 (en) 2017-02-28 2021-10-19 Children's Medical Center Corporation Stimuli-responsive particles encapsulating a gas and methods of use
JP7227694B2 (ja) * 2017-12-08 2023-02-22 大平 猛 正に帯電したナノバブル分散液
CN113573803B (zh) * 2018-12-21 2024-05-28 博莱科瑞士股份有限公司 含有配体的充气微泡
US20200360289A1 (en) * 2019-05-15 2020-11-19 Bracco Suisse Sa Freeze-dried product and gas-filled microvesicles suspension
CN115734786A (zh) * 2020-06-15 2023-03-03 博莱科瑞士股份有限公司 超声介导治疗的改进

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995023615A1 (en) * 1994-03-01 1995-09-08 Holmes, Michael, John Gas-containing microcapsules useful as contrast agents for diagnostic imaging
US5531980A (en) * 1990-04-02 1996-07-02 Bracco International Bv Stable microbubbles suspensions injectable into living organisms
US5562099A (en) * 1990-10-05 1996-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Polymeric microparticles containing agents for imaging
US6221337B1 (en) * 1996-02-19 2001-04-24 Nycomed Imaging As Microbubbles surrounded by a monolayer of negatively charged phospholipids as contrast agents
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
WO2003015831A1 (en) * 2001-08-16 2003-02-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Gas microsphere liposome composites

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2647121A (en) * 1951-02-02 1953-07-28 Ruth P Jacoby Diamine-bis-acetamides
US2819718A (en) * 1953-07-16 1958-01-14 Isidore H Goldman Drainage tube
US2844629A (en) * 1956-04-25 1958-07-22 American Home Prod Fatty acid amides and derivatives thereof
US3096560A (en) * 1958-11-21 1963-07-09 William J Liebig Process for synthetic vascular implants
JPS5141663B1 (no) * 1966-03-12 1976-11-11
NL143127B (nl) * 1969-02-04 1974-09-16 Rhone Poulenc Sa Versterkingsorgaan voor een defecte hartklep.
US3614954A (en) * 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Electronic standby defibrillator
US3614955A (en) * 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Standby defibrillator and method of operation
US3945052A (en) * 1972-05-01 1976-03-23 Meadox Medicals, Inc. Synthetic vascular graft and method for manufacturing the same
US3805301A (en) * 1972-07-28 1974-04-23 Meadox Medicals Inc Tubular grafts having indicia thereon
US4013507A (en) * 1973-09-18 1977-03-22 California Institute Of Technology Ionene polymers for selectively inhibiting the vitro growth of malignant cells
US3995623A (en) * 1974-12-23 1976-12-07 American Hospital Supply Corporation Multipurpose flow-directed catheter
US4281669A (en) * 1975-05-09 1981-08-04 Macgregor David C Pacemaker electrode with porous system
US4096860A (en) * 1975-10-08 1978-06-27 Mclaughlin William F Dual flow encatheter
CA1069652A (en) * 1976-01-09 1980-01-15 Alain F. Carpentier Supported bioprosthetic heart valve with compliant orifice ring
US4134402A (en) * 1976-02-11 1979-01-16 Mahurkar Sakharam D Double lumen hemodialysis catheter
US4072146A (en) * 1976-09-08 1978-02-07 Howes Randolph M Venous catheter device
US4335723A (en) * 1976-11-26 1982-06-22 The Kendall Company Catheter having inflatable retention means
US4099528A (en) * 1977-02-17 1978-07-11 Sorenson Research Co., Inc. Double lumen cannula
US4140126A (en) * 1977-02-18 1979-02-20 Choudhury M Hasan Method for performing aneurysm repair
US4182833A (en) * 1977-12-07 1980-01-08 Celanese Polymer Specialties Company Cationic epoxide-amine reaction products
US4180068A (en) * 1978-04-13 1979-12-25 Motion Control, Incorporated Bi-directional flow catheter with retractable trocar/valve structure
DE2960875D1 (en) * 1978-04-19 1981-12-10 Ici Plc A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning
US4284459A (en) * 1978-07-03 1981-08-18 The Kendall Company Method for making a molded catheter
US4227533A (en) * 1978-11-03 1980-10-14 Bristol-Myers Company Flushable urinary catheter
US4276885A (en) 1979-05-04 1981-07-07 Rasor Associates, Inc Ultrasonic image enhancement
US4339369A (en) * 1981-04-23 1982-07-13 Celanese Corporation Cationic epoxide-amine reaction products
JPS60501759A (ja) 1983-07-01 1985-10-17 バテル　メモリアル　インステイチユ−ト 生物分解性ポリペプチド及び薬剤の緩慢な放出のためのその使用
SE463651B (sv) 1983-12-21 1991-01-07 Nycomed As Diagnostikum och kontrastmedel
ATE60340T1 (de) 1984-10-19 1991-02-15 Battelle Memorial Institute Durch mikroorganismen abbaubares polypeptid und seine verwendung fuer die fortschreitende abgabe von medikamenten.
CH667874A5 (fr) 1985-12-19 1988-11-15 Battelle Memorial Institute Polypeptide synthetique biodegradable et son utilisation pour la preparation de medicaments.
IE61591B1 (en) 1987-12-29 1994-11-16 Molecular Biosystems Inc Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production
US6146657A (en) 1989-12-22 2000-11-14 Imarx Pharmaceutical Corp. Gas-filled lipid spheres for use in diagnostic and therapeutic applications
US6088613A (en) 1989-12-22 2000-07-11 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of magnetic resonance focused surgical and therapeutic ultrasound
US5776429A (en) 1989-12-22 1998-07-07 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas-filled microspheres using a lyophilized lipids
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5733572A (en) 1989-12-22 1998-03-31 Imarx Pharmaceutical Corp. Gas and gaseous precursor filled microspheres as topical and subcutaneous delivery vehicles
US20080063603A1 (en) 1990-04-02 2008-03-13 Bracco International B.V. Ultrasound contrast agents and methods of making and using them
US5445813A (en) 1992-11-02 1995-08-29 Bracco International B.V. Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography
US5556610A (en) 1992-01-24 1996-09-17 Bracco Research S.A. Gas mixtures useful as ultrasound contrast media, contrast agents containing the media and method
AU636481B2 (en) 1990-05-18 1993-04-29 Bracco International B.V. Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography
US5487390A (en) 1990-10-05 1996-01-30 Massachusetts Institute Of Technology Gas-filled polymeric microbubbles for ultrasound imaging
JP2974083B2 (ja) 1990-11-26 1999-11-08 株式会社 小松製作所 静油圧―機械式伝動機の制御装置
EP0593627A1 (en) 1991-07-05 1994-04-27 The University Of Rochester Ultrasmall non-aggregated porous particles entrapping gas-bubbles
IL104084A (en) 1992-01-24 1996-09-12 Bracco Int Bv Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them
DE4208527A1 (de) * 1992-03-17 1993-09-23 Max Planck Gesellschaft Liposomen mit negativer ueberschussladung
WO1994001140A1 (de) 1992-07-03 1994-01-20 Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh Echokontrastmittelzubereitung
US5464696A (en) 1992-08-13 1995-11-07 Bracco International B.V. Particles for NMR imaging
US5798091A (en) 1993-07-30 1998-08-25 Alliance Pharmaceutical Corp. Stabilized gas emulsion containing phospholipid for ultrasound contrast enhancement
PT711179E (pt) 1993-07-30 2005-03-31 Imcor Pharmaceutical Company Composicoes de microbolhas estabilizadas para ultra-som
US7083572B2 (en) * 1993-11-30 2006-08-01 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Therapeutic delivery systems
DE69432295T2 (de) 1993-12-15 2003-08-14 Bracco Research Sa Gas-mischungen verwendbar als ultraschallkontrastmittel
EP0699445A3 (en) 1994-08-04 1996-04-17 Gakko Houjin Toin Gakuen Process for the preparation of an ultrasonic microbubble contrast agent with a surfactant
GB9417941D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
EP0783295A1 (en) 1994-09-23 1997-07-16 The Liposome Company, Inc. Method of producing a lyophilized liposome product
US6333021B1 (en) 1994-11-22 2001-12-25 Bracco Research S.A. Microcapsules, method of making and their use
IL116328A (en) 1994-12-16 1999-09-22 Bracco Research Sa Frozen suspension of gas microbubbles in frozen aqueous carrier for use as contrast agent in ultrasonic imaging
US6139819A (en) 1995-06-07 2000-10-31 Imarx Pharmaceutical Corp. Targeted contrast agents for diagnostic and therapeutic use
US5833948A (en) 1995-06-15 1998-11-10 Bracco Research S.A. Blood-pool imaging composition comprising micelles containing a lipophilic chelating agent and a non-ionic surfactant
IL125800A0 (en) 1996-02-19 1999-04-11 Nycomed Imaging As Thermally stabilized contrast agent
US6165442A (en) 1996-02-19 2000-12-26 Nycomed Imaging As Thermally stabilized ultrasound contrast agent
GB2330505B (en) 1996-07-22 2001-02-07 Seagate Technology Phase detector estimator
MXPA99001053A (es) 1996-08-02 2002-03-11 Nycomed Imaging As Mejoramientos en o que se relacionan con agentes de contraste.
EE03749B1 (et) * 1996-10-21 2002-06-17 Nycomed Imaging As Kombineeritud preparaat samaaegseks, eraldi või järjestikuseks kasutamiseks kontrastainena ultrahelikujutamisel
EP0973552B1 (en) 1996-10-28 2006-03-01 Amersham Health AS Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
BR9713978A (pt) 1996-10-28 2000-05-02 Nycomed Imaging As Agente diagnóstico alvejável e/ou terapeuticamente ativo, processo para preparação e uso do mesmo, formulação combinada, e, processos para gerar imagens intensificadas de um corpo animal humano ou não-humano e para investigação in vitro de alvejamento por um agente
GB9701237D0 (en) 1997-01-22 1997-03-12 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
US6143276A (en) 1997-03-21 2000-11-07 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods for delivering bioactive agents to regions of elevated temperatures
US6416740B1 (en) 1997-05-13 2002-07-09 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Acoustically active drug delivery systems
US6245318B1 (en) 1997-05-27 2001-06-12 Mallinckrodt Inc. Selectively binding ultrasound contrast agents
GB9717589D0 (en) 1997-08-19 1997-10-22 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
JP2001520207A (ja) 1997-10-21 2001-10-30 ニユコメド・イメージング・アクシエセルカペト 微小血管に標的設定された造影剤および血管拡張剤による超音波造影
US20020169138A1 (en) * 1997-10-24 2002-11-14 Southern Research Institute Delivery vehicles for bioactive agents and uses thereof
US20010003580A1 (en) 1998-01-14 2001-06-14 Poh K. Hui Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend
WO1999039738A1 (en) 1998-02-09 1999-08-12 Bracco Research S.A. Targeted delivery of biologically active media
GB9808599D0 (en) 1998-04-22 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or realting to contrast agents
GB9809084D0 (en) 1998-04-28 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
FR2782006B1 (fr) 1998-08-07 2002-04-19 Gattefosse Ets Sa Composition a liberation prolongee apte a former une micro-emulsion
JP2000143550A (ja) * 1998-11-10 2000-05-23 Toin Gakuen 超音波造影剤
DE10013850A1 (de) 2000-03-15 2001-09-20 Schering Ag Gasgefüllte Mikrokapseln enthaltend funktionalisiertes Polyalkylcyanacrylat, sowie Verfahren zu deren Herstellung
CA2432474C (en) 2000-12-23 2012-06-26 Dyax Corp. Fibrin binding polypeptides useful inter alia in medical imaging processes
US6793626B2 (en) 2001-01-17 2004-09-21 Fuji Photo Film Co., Ltd. Ultrasonic scatterer, ultrasonic imaging method and ultrasonic imaging apparatus
JP2002212108A (ja) 2001-01-17 2002-07-31 Fuji Photo Film Co Ltd 超音波散乱体
US7179449B2 (en) 2001-01-30 2007-02-20 Barnes-Jewish Hospital Enhanced ultrasound detection with temperature-dependent contrast agents
ES2243350T3 (es) 2001-01-31 2005-12-01 Bracco International B.V. Agente de contraste liofizable que comprende microburbujas de gas.
WO2003005029A2 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Governors Of The University Of Alberta Magnetic nanoparticles for bioseparation application and methods for producing same
WO2003084574A1 (en) 2002-03-01 2003-10-16 Bracco International Bv Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
JP2006514915A (ja) 2002-03-01 2006-05-18 ダイアックス、コープ Ｋｄｒおよびｖｅｇｆ／ｋｄｒ結合ペプチドならびに診断および治療におけるその使用
CA2489287C (fr) 2002-06-19 2011-04-05 Dimitrios Patsalaridis Dispositif de support ancrable dans le sol
US7459145B2 (en) * 2002-10-25 2008-12-02 Georgia Tech Research Corporation Multifunctional magnetic nanoparticle probes for intracellular molecular imaging and monitoring
ES2352087T3 (es) 2003-02-04 2011-02-15 Bracco Suisse Sa Agentes de contraste para ultrasonido y procedimiento para la preparación de los mismos.
WO2005041897A2 (en) 2003-10-31 2005-05-12 Point Biomedical Corporation Reconstitutable microsphere compositions useful as ultrasonic contrast agents
EP1696965B1 (en) 2003-12-22 2014-12-10 Bracco Suisse SA Assembly of gas-filled microvesicle with active component for contrast imaging
WO2005063305A1 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Bracco Research Sa Gas-filled microvesicle assembly for contrast imaging
DE602005021057D1 (de) 2004-01-20 2010-06-17 Toronto E Hochfrequenz-ultraschall-darstellung mit kontrastmitteln
US9248204B2 (en) 2004-08-18 2016-02-02 Bracco Suisse S.A. Gas-filled microvesicles composition for contrast imaging

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5531980A (en) * 1990-04-02 1996-07-02 Bracco International Bv Stable microbubbles suspensions injectable into living organisms
US5562099A (en) * 1990-10-05 1996-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Polymeric microparticles containing agents for imaging
WO1995023615A1 (en) * 1994-03-01 1995-09-08 Holmes, Michael, John Gas-containing microcapsules useful as contrast agents for diagnostic imaging
US6221337B1 (en) * 1996-02-19 2001-04-24 Nycomed Imaging As Microbubbles surrounded by a monolayer of negatively charged phospholipids as contrast agents
US6331289B1 (en) * 1996-10-28 2001-12-18 Nycomed Imaging As Targeted diagnostic/therapeutic agents having more than one different vectors
WO2003015831A1 (en) * 2001-08-16 2003-02-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Gas microsphere liposome composites

Also Published As

Publication number Publication date
EP1701745B1 (en) 2014-12-10
NO20063419L (no) 2006-09-21
AU2004308756A1 (en) 2005-07-14
US20070071685A1 (en) 2007-03-29
US9750821B2 (en) 2017-09-05
CN100563718C (zh) 2009-12-02
CA2547024C (en) 2013-12-17
WO2005063305A1 (en) 2005-07-14
JP2012051932A (ja) 2012-03-15
AU2004308756B2 (en) 2010-06-24
ES2531732T3 (es) 2015-03-18
JP5513708B2 (ja) 2014-06-04
CN1897979A (zh) 2007-01-17
EP1701745A1 (en) 2006-09-20
CA2547024A1 (en) 2005-07-14
JP2007515470A (ja) 2007-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9750821B2 (en) Gas-filled microvesicle assembly for contrast imaging
NO338317B1 (no) Sammenstilling av gassfylt mikrovesikkel anvendelse og fremstilling derav og kit samt fremgangsmåte for fremstilling
US10076580B2 (en) Gas-filled microvesicles composition for contrast imaging
US9364569B2 (en) Ultrasound contrast agents and process for the preparation thereof
AU2003210631B2 (en) Novel targeted compositions for diagnostic and therapeutic use
AU2007293888B2 (en) Gas-filled microvesicles with polymer-modified lipids

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees