CN115734786A

CN115734786A - 超声介导治疗的改进

Info

Publication number: CN115734786A
Application number: CN202180042550.8A
Authority: CN
Inventors: V·珍诺特; E·卡克奎维尔-比赫尔
Original assignee: Bracco Suisse SA
Current assignee: Bracco Suisse SA
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2023-03-03
Also published as: WO2021255025A1; JP2023528745A; BR112022023257A2; AU2021291211A1; US20230226184A1; KR20230024922A; CA3177232A1; IL299049A; EP4164751A1

Abstract

本发明涉及与充气微囊泡组合的超声介导的治疗性治疗的领域。本发明具体地涉及通过减少由充气微囊泡和超声的组合治疗性治疗引起的血管痉挛效应来增强所述治疗性治疗的功效。

Description

超声介导治疗的改进

技术领域

本发明总体上涉及与充气微囊泡组合的超声介导的治疗性治疗的领域。

具体地，本发明涉及血管痉挛抑制剂，用于在增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效中的用途。此外，本发明涉及用于增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效的方法。

发明背景

充气微囊泡(MV)是声共鸣器，当经受声场时，其通过不同的过程散射所接收的声能，所述过程诸如(i)振动，也称为空化，其赋予充气微囊泡声学和机械特性，以及(ii)加热。

在过去的几十年中，充气微囊泡的声学特性主要被用于超声造影成像(CEUS)。然而，目前正在评价充气微囊泡的机械和加热特性在超声介导治疗中的应用，诸如促进/增加药物(参考文献1)或基因的递送，帮助破坏血块(参考文献2)、打开血-脑屏障(参考文献3)、免疫调节(参考文献4)、神经调节(参考文献5)、放射敏化(参考文献6)、MV增强热消融(参考文献7)、高热疗法(hyperthermia)(参考文献8)，或帮助非热组织消融(参考文献9)。

治疗性超声(US)通常由高强度超声波组成，其特征在于高机械指数和长脉冲持续时间，通常不适用于诊断成像。

尽管充气微囊泡在超声介导治疗中的应用越来越多，但是本申请人现在已经观察到，这些组合治疗性治疗在某些受声波作用条件(insonation condition)下仍然可能遭受功效降低。

本申请人现在已经出乎意料地发现，使用血管痉挛抑制剂(VI)与使用充气微囊泡和超声介导治疗的组合可以改进治疗的总体功效。

事实上，本申请人已经观察到，在此类治疗性治疗中(大幅)降低的功效可能与在超声/充气微囊泡暴露后在受试者中发生的瞬时血管舒缩应答相关。虽然在文献中已经描述了此种现象，也称为“血管痉挛”(参见例如参考文献10)，但是据本申请人所知，其从未与基于充气微囊泡和超声的组合使用的治疗性治疗的功效降低相关联。

有利地，由本申请人所提出的解决方案允许基本上限制或避免以上所提及的治疗性功效的降低，而所述功效特别相对于在不存在血管痉挛抑制剂的情况下进行的组合微囊泡/超声介导治疗得到增强。从另一方面来看，此种血管痉挛抑制剂的使用允许维持组合微囊泡/超声介导治疗的治疗性功效的可接受水平。

与超声组合使用血管痉挛抑制剂和充气微囊泡在诊断成像领域是已知的。

例如，参考文献11涉及用于诊断成像的改进的方法，其包括向患者施用造影剂和冠状血管扩张剂。

参考文献12涉及待用于产生增强图像的组合制品，其包含可注射的水性气体分散体和血管扩张剂药物，即腺苷。

参考文献13涉及气体包封的声学应答性稳定化微气泡，其包含包封的生物活性气体，用于通过释放所述包封的生物活性剂促进有需要的患者中的局部血管舒张。

因此，根据申请人的知识，未曾描述过使用血管痉挛抑制剂用于限制或避免在治疗性治疗中组合使用超声和充气微囊泡的治疗性功效的降低。

发明概述

本发明的方面涉及血管痉挛抑制剂(VI)，用于在增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效中的用途。

在实施方案中，所述血管痉挛抑制剂选自由二氢吡啶钙阻滞剂、α-阻滞剂和硝基血管扩张剂组成的组。

在另外的实施方案中，所述血管痉挛抑制剂优选地选自由尼莫地平、硝苯地平、镁、哌唑嗪和硝酸甘油组成的组；还更优选地，所述血管痉挛抑制剂是尼莫地平。

可以将所述血管痉挛抑制剂与充气微囊泡的混悬液同时或依序施用。

当将VI与充气微囊泡的混悬液同时施用时，可以将其作为包含VI的微囊泡的混悬液或作为被共同施用的两种分开的溶液来共同施用。

当将VI与充气微囊泡混悬液依序施用时，优选地将其预先施用，例如在充气微囊泡的混悬液之前1秒至15分钟、优选地之前5秒至12分钟、更优选地之前至少10分钟。

本发明的另一方面涉及充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到受试者的血管系统中；

c)向受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

特别地，在所述方法中使用血管痉挛抑制剂允许增强所述组合治疗性治疗的功效。

在实施方案中，本发明的药物递送方案涉及充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

a’)将生物活性剂施用到受试者的血管系统中；

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到受试者的血管系统中；

c)向受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

在本发明的实施方案中，将所公开的方法的步骤a’)和步骤a)同时或依序进行。

附图

图1：用US+VI治疗期间肿瘤灌注的定量。在上图中：无VI预治疗；在下图中：VI预治疗。

发明详述

本申请人已经发现，在超声治疗中与充气微囊泡一起施用血管痉挛抑制剂(VI)可以改进治疗性治疗的功效。

如本文所使用的，术语“功效”是指治疗性超声和充气微囊泡的组合(US-MV)提供有益治疗效果的能力。

例如，US-MV的组合使用对于药物递送的功效可以通过其增强靶区域的血管腔室中生物活性分子(例如治疗剂或造影剂)的浓度的能力；其通过血管外渗的程度和/或其细胞内递送的程度来估计。

在用于超声溶栓(即血块的破坏)的US-MV的组合使用中，可以例如通过其增强血管的灌注或诱导血管的再通的能力，以直接方式，例如通过成像随访(imaging follow-up)(例如通过血管造影术、计算机断层摄影术、激光多普勒、超声造影成像或磁共振成像)，或以间接方式，例如通过血液样品的生物学分析；心电图改变；和/或通过评估临床改善(例如神经功能或心脏功能)来评价治疗的功效。

US-MV的组合使用对于MV增强热消融的功效可以例如通过测量特定体积组织的温度增加和通过降低达到该温度所需的声处理(sonication)时间；通过减少达到热增加所需的声能或功率或通过由成像随访组织损伤来评估。

US-MV的组合使用对于MV增强高热疗法的功效可以例如通过测量特定体积组织中的温度增加(例如通过磁共振测温法、或热电偶)；通过降低达到高热疗法所需的声能或功率；通过治疗区域中血流的增加(例如，通过血管造影术、磁共振成像、计算机断层摄影术、激光多普勒、超声造影成像)；通过药物递送的随访和/或通过以下所描述的“药物递送”的类似评价来评估。

US-MV的组合使用对于BBB打开的功效可以例如通过其增强生物活性分子(例如治疗剂或造影剂)通过血管从血管外渗到脑中的能力来评价。

神经调节，即由US+MV诱导的神经元功能的调节，是其中应用US-MV的组合使用的另一治疗性应用领域。在该情况下，组合的US-MV治疗的功效可以例如通过神经元的电活性的变化来评价。

US-MV的组合使用对于在放射敏化中的应用(即通过增强使用US和MV的放射治疗(RT)的效果治疗肿瘤)的功效可以例如通过检测如通过以下中任一项突显的治疗诱导的病变的存在来评价：在数周内组织血液动力学变化；暴露于US+RT的组织中细胞死亡和凋亡的水平增加；肿瘤生长的减少和/或存活增加。

US-MV的组合使用对于在非热消融的应用中的功效可以例如通过检测如例如通过血流的减少和/或通过超声处理的组织中的后续坏死和凋亡突显的治疗诱导的病变的存在来评估。

US-MV的组合使用也可以应用于抗肿瘤治疗中，通过免疫调节(即刺激抗肿瘤免疫应答)发挥抗肿瘤作用。由于US-MV诱导的免疫调节可以通过不同机制实现，诸如热消融、轻度高热疗法、机械破坏、或用于递送免疫治疗药物(例如DNA、mRNA、药物或抗体)的血管透化，因此预期改进这些机制可以改进免疫调节作用。US-MV的组合使用对于在免疫调节中的应用的功效可以例如通过免疫应答的诱导或改变(modification)；对免疫治疗的应答的改变和/或生物应答(例如肿瘤生长)的改变来评估。

在本说明书和权利要求书中，表述“用于治疗的超声和充气微囊泡的混悬液的组合使用”(简称为“US-MV的组合使用”)指示基于治疗性超声波与充气微囊泡的混悬液的组合使用的任何治疗性治疗。

如以上所提及的，可以使用这些治疗性治疗例如用于增加血管透化，例如用于促进/增加药物或基因的递送、用于帮助破坏血块、打开血脑屏障、免疫调节、神经调节、放射敏化，或者还用于帮助高热疗法、MV增强热消融和非热组织消融。

如本文所使用的表述“用于治疗的超声”指示使用超声实现生物效应以便治疗受试者中的疾病或障碍。在本说明书和权利要求书中，表述“用于治疗的US”或“治疗性US”可互换使用。

用于治疗的超声可以由不同类型的换能器产生。用于治疗的超声的换能器的合适实例是由单个或多个压电元件装备的聚焦换能器或未聚焦换能器。

通常，用于治疗的超声由专用平台(例如与MRI扫描仪耦合)和临床回波描记器平台提供。

为了实现生物效应，必须考虑用于治疗的超声的若干参数。

用于治疗的超声的特征通常在于优选地几秒(即1秒)至170min的治疗持续时间。如本文所使用的表述“治疗持续时间”指示在感兴趣的区域中超声应用的开始至其结束的总时间跨度。治疗持续时间的单位是时间。

表征用于治疗的超声的脉冲长度通常为5μs至60s、优选地5μs至10s，还更优选地，脉冲长度为100μs至5ms。表述“脉冲长度”是指从脉冲开始(“开”)至脉冲结束(“关”)的时间，指示脉冲“开”的实际时间。脉冲长度的单位是时间(例如微秒至秒)。

用于治疗的超声的频率通常为20kHz直至70MHz，优选地0.10MHz至50MHz、还更优选地约0.15MHz至约2MHz。术语“频率”指示在特定持续时间内发生的某些事件的数量。频率的单位是赫兹(即1/s)。

用于治疗的超声的声压通常为10kPa至100MPa、优选地20kPa至50MPa、还更优选地50kPa至25MPa。

用于治疗的超声的声强(瓦特/cm²或W/cm²)通常为0.1W/cm²至990W/cm²、优选地1.3W/cm²至21.5W/cm²、还更优选地1.3W/cm²至5W/cm²。表述“声强”是指在声束中每单位面积由声波承载的功率。声强的单位是瓦特/cm²。

治疗性超声在大多数情况下以与诊断超声不同的频率进行。具体地，期望以更低频率进行治疗性超声以便实现低衰减，而在诊断超声中采用更高频率以获得更好的分辨率(参考文献14)。

由于其诱导生物效应的能力(与或不与MV组合)，用于治疗的超声也可以区别于诊断超声。

对于治疗，超声不仅可以通过加热来诱导效应，而且可以通过非热机制来诱导效应，这些非热机制包括声空化、辐射力、剪切应力和声流/微流、冲击波或其他未确定的非热过程。热效应和声空化是最显著的效应，它们的作用机制和生物效应在本领域中是已知的。如本文所使用的，用于治疗的US指示能够对经历治疗性超声治疗的受试者诱导生物效应的超声，所述生物效应包括例如局部温度升高、血管透化、血管破裂和/或剪切应力。

热效应取决于治疗的温度和持续时间。例如，低温升高(例如>43℃，1小时)将使组织对化学治疗或放射治疗敏感，而更高的温度升高(例如56℃，1秒)将引起不可逆的损伤，如热凝固和细胞死亡。

用于治疗的US的声空化和机械效应引起显著程度的机械和热效应以及化学和光学效应，导致各种生物效应，诸如局部温度升高、血管透化、血管破裂、细胞死亡和剪切应力。

在实施方案中，用于治疗的US指示能够诱导血管透化的US。

用于治疗的超声广泛用于各种类型病理学中的组织热消融，如症状性子宫肌瘤、癌症(例如乳腺和肝前列腺癌)、疼痛和神经障碍，但也用于超声溶栓(sonothrombolysis)和组织摧毁术(Histotripsy)。

将MV与超声组合用于治疗增强了已知要涉及声空化的许多不同治疗性应答的效果。实际上，当注射时，MV充当空化核，降低声空化的阈值。调整US条件，可以控制MV的空化方案，从振荡的稳定方案(稳定空化)移动至用于更高能量的剧烈崩溃。该空化方案可以选择性地用于改进热消融(MV增强热消融)、溶解血块(超声溶栓)、使血管透化(打开血脑屏障)以实现特定的药物或基因递送，用于免疫调节、神经调节、放射敏化、帮助高热疗法和组织的非热消融。

如本文所使用的术语“充气微囊泡”包括包含由稳定化材料的包膜或层(包括膜形成层)包围的微米或纳米尺寸的气泡的任何结构。该术语包括本领域中已知的充气脂质体、微气泡、微球、微气球或微胶囊。稳定化材料可以是本领域中典型地已知的任何材料，包括例如表面活性剂、脂质、鞘脂、寡脂(oligolipid)、糖脂、磷脂、蛋白质、多肽、碳水化合物、以及合成或天然聚合物材料。

术语充气微囊泡的“前体”包括其在气体的存在下与水性载体重构后将产生充气微囊泡的混悬液的任何组合物。所述组合物典型地包括任何上述呈干燥粉末形式(例如冷冻干燥或喷雾干燥)的稳定化材料，其能够在气体的存在下摇动其水性混悬液时形成充气微囊泡。

术语“微囊泡”包括水性混悬液，在其中气体的气泡在气体/液体界面处被包含设置在气体与液体界面处的稳定化两亲性材料的非常薄的包膜(膜)界定。微气泡混悬液可以通过使其合适的前体诸如粉末两亲性材料(例如冷冻干燥的预形成的脂质体或者冷冻干燥的或喷雾干燥的磷脂溶液)与空气或其他气体接触，并且然后与水性载体接触，同时搅拌以产生微气泡混悬液来制备，该微气泡混悬液然后可以被施用、优选地在其制备之后不久被施用。

充气微气泡通常由一种或多种两亲性组分稳定化。适用于形成微气泡的稳定化包膜的两亲性组分包含例如磷脂；溶血磷脂；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；带有聚合物(诸如壳多糖、透明质酸、聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)，也称为“聚乙二醇化脂质”)的脂质；带有磺化的单糖、二糖、寡糖或多糖的脂质；胆固醇、硫酸胆固醇或半琥珀酸胆固醇；半琥珀酸生育酚；具有醚或酯连接的脂肪酸的脂质；聚合的脂质；二乙酰磷酸酯；磷酸二鲸蜡酯；神经酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯(诸如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油聚乙二醇蓖麻醇酸酯、乙氧基化大豆甾醇、乙氧基化蓖麻油或环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)嵌段共聚物；甾醇脂肪酸酯，包括胆固醇丁酸酯、胆固醇异丁酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇硬脂酸酯、羊毛甾醇乙酸酯、麦角甾醇棕榈酸酯、或植物甾醇正丁酸酯；糖酸的甾醇酯，包括胆固醇葡糖苷酸、羊毛甾醇葡糖苷酸、7-脱氢胆固醇葡糖苷酸、麦角甾醇葡糖苷酸、胆固醇葡萄糖酸酯、羊毛甾醇葡萄糖酸酯、或麦角甾醇葡萄糖酸酯；糖酸和醇的酯，包括月桂基葡糖苷酸、硬脂酰葡糖苷酸、肉豆蔻酰葡糖苷酸、月桂基葡糖酸酯、肉豆蔻酰葡糖酸酯、或硬脂酰葡糖酸酯；糖与脂肪酸的酯，包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡糖醛酸、葡萄糖酸或聚糖醛酸；皂苷，包括菝葜皂苷元、异菝葜苷元、常春藤苷元、齐墩果酸、或毛地黄毒苷元；甘油或甘油酯，包括甘油三棕榈酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕榈酸酯；N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺；1,2-二油酰基-sn-甘油；1,2-二棕榈酰基-sn-3-琥珀酰甘油；1,3-二棕榈酰基-2-琥珀酰甘油；1-十六烷基-2-棕榈酰甘油磷酸乙醇胺或棕榈酰高半胱氨酸；包含至少一个(C₁₀-C₂₀)、优选地(C₁₄-C₁₈)烷基链的烷基胺或烷基铵盐，诸如例如，N-硬脂胺、N,N’-二硬脂胺、N-十六烷基胺、N,N’-二-十六烷基胺、N-硬脂酰氯化铵、N,N’-二硬脂酰氯化铵、N-十六烷基氯化铵、N,N’-二-十六烷基氯化铵、二甲基二-十八烷基溴化铵(DDAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；包含通过(C₃-C₆)亚烷基桥与N-原子连接的一个或优选地两个(C₁₀-C₂₀)、优选地(C₁₄-C₁₈)酰基链的叔铵盐或季铵盐，诸如例如，1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、1,2-油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰基-3-二甲基铵-丙烷(DSDAP)；及其混合物或组合。

如本文所使用的，术语“磷脂”旨在涵盖任何两亲性磷脂化合物，其分子能够在最终微气泡的混悬液中的气体-水界面处形成材料的稳定化膜(典型地呈单分子层的形式)。因此，这些材料在本领域中也被称为“成膜磷脂”。

磷脂典型地含有至少一个磷酸酯基团(phosphate group)和至少一个、优选地两个亲脂性长链烃基团。

合适的磷脂的实例包括甘油与脂肪酸的一个或优选地两个(相同或不同)残基和与磷酸的酯，其中磷酸残基转而又与亲水性基团结合，诸如例如，胆碱(磷脂酰胆碱-PC)、丝氨酸(磷脂酰丝氨酸-PS)、甘油(磷脂酰甘油-PG)、乙醇胺(磷脂酰乙醇胺-PE)、肌醇(磷脂酰肌醇-PI)。仅具有一个脂肪酸残基的磷脂的酯在本领域中通常被称为磷脂的“溶血(lyso)”形式或“溶血磷脂”。存在于磷脂中的脂肪酸残基通常是典型地含有12至24个碳原子、优选地14至22个碳原子的长链脂族酸；脂肪族链可以含有一个或多个不饱和度或优选地是完全饱和的。包括在磷脂中的合适的脂肪酸的实例是例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选地，采用饱和脂肪酸，诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。

磷脂的另外的实例是磷脂酸，即甘油-磷酸与脂肪酸的二酯；鞘脂，诸如鞘磷脂，即其中具有脂肪酸的甘油二酯的残基被神经酰胺链替代的那些磷脂酰胆碱类似物；心磷脂，即1,3-二磷脂酰甘油与脂肪酸的酯；糖脂(glycolipid)，诸如神经节苷脂GM1(或GM2)或脑苷脂；糖脂(glucolipid)；硫苷脂和鞘糖脂。

如本文所使用的，术语磷脂包括天然存在的、半合成的或合成制备的产物，其可以单独或作为混合物采用。

天然存在的磷脂的实例是天然卵磷脂(磷脂酰胆碱(PC)衍生物)，诸如，典型地，大豆或蛋黄卵磷脂。

半合成的磷脂的实例是天然存在的卵磷脂的部分地或完全地氢化的衍生物。优选的磷脂是磷脂酰胆碱、乙基磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或鞘磷脂的脂肪酸二酯。

磷脂的具体实例是，例如，二月桂酰-磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰-磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰-磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰-磷脂酰胆碱(DAPC)、二硬脂酰-磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2二硬脂酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(乙基-DSPC)、二-十五酰-磷脂酰胆碱(DPDPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-磷脂酰胆碱(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱(SPPC)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-油酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱(OPPC)、二月桂酰-磷脂酰甘油(DLPG)及其碱金属盐、二花生酰磷脂酰-甘油(DAPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其碱金属盐、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二花生酰磷脂酸(DAPA)及其碱金属盐、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)、二花生酰磷脂酰乙醇胺(DAPE)、二亚油酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二花生酰磷脂酰丝氨酸(DAPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)、以及二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)、二月桂酰-磷脂酰肌醇(DLPI)、二花生酰磷脂酰肌醇(DAPI)、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二油酰-磷脂酰肌醇(DOPI)。特别地，可以使用选自DAPC、DSPC、DPPC、DMPA、DPPA、DSPA、DMPG、DPPG、DSPG、DMPS、DPPS、DSPS、乙基-DSPC、乙基-DPPC或其混合物，更特别地DPPG、DPPS和DSPC的磷脂。磷脂可以进一步包括通过连接亲水性聚合物(诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))而修饰的磷脂。优选的聚合物修饰的磷脂包括“聚乙二醇化磷脂”，即结合至PEG聚合物的磷脂。聚乙二醇化磷脂的实例是聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(简称“PE-PEG”)，即其中亲水性乙醇胺部分被连接至可变分子量(例如300至20000道尔顿，优选地500至5000道尔顿)的PEG分子的磷脂酰乙醇胺，诸如DPPE-PEG(或DSPE-PEG、DMPE-PEG、DAPE-PEG或DOPE-PEG)。例如，DPPE-PEG2000是指具有附接至其的具有约2000的平均分子量的PEG聚合物的DPPE。典型的聚乙二醇化磷脂的实例包括DPPE-PEG2000、DSPE-PEG2000、DPPE-PEG5000、DSPE-PEG5000。

磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物，特别是DPPE-PEG和/或DSPE-PEG，典型地以与任何先前所提及的磷脂混合使用。

典型地，磷脂是使微气泡的包膜稳定化的主要组分，总计为形成充气微气泡的包膜的组分的总量的至少50％(w/w)、优选地至少75％。在一些优选实施方案中，基本上整个包膜(即至少90％w/w)可以由磷脂形成。

磷脂可以方便地以与任何以上所列的两亲性化合物混合使用。因此，例如，可以任选地例如以优选地范围从零至50重量％、更优选地至多达25％的比例将脂质(诸如胆固醇、麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、没食子酸丙酯或棕榈酸抗坏血酸酯)、脂肪酸(诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸及其衍生物)或丁基化羟基甲苯和/或其他非磷脂化合物添加至前述磷脂中的一种或多种中。特别优选的是棕榈酸。

其他赋形剂或添加剂可以存在于微气泡的干燥制剂中，或者可以与用于其重构的水性载体一起添加，而不必涉及(或仅部分地涉及)微气泡的稳定化包膜的形成。这些包括pH调节剂、同渗质量摩尔浓度调节剂、粘度增强剂、乳化剂、填充剂等，并且可以以常规量使用。例如，可以使用像聚氧丙二醇和聚氧乙二醇以及其共聚物的化合物。粘度增强剂或稳定剂的实例是选自直链和交联的多糖和寡糖、糖和亲水性聚合物诸如聚乙二醇的化合物。

由于充气微气泡的制备可以涉及冷冻干燥或喷雾干燥步骤，因此在制剂中包括冻干添加剂可以是有利的，诸如具有冷冻保护和/或冻干保护作用的试剂和/或填充剂，例如氨基酸，诸如甘氨酸或组氨酸；碳水化合物，例如糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖或环糊精，或多糖，诸如葡聚糖、壳聚糖及其衍生物(例如：羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖)；或聚氧亚烷基二醇，诸如聚乙二醇。

微气泡可以根据本领域中任何已知的方法制备。典型地，制造方法包括制备包含如以上所指示的两亲性材料的干燥粉末材料，优选地通过冻干(冷冻干燥)包含所述材料的水性或有机混悬液。微气泡及其前体的制备的实例公开于例如参考文献15或参考文献16中。根据该后一种制造程序，可以将磷脂(和其他任选的成膜材料)、冻干保护剂和其他任选的添加剂在搅拌下分散在水和与水不混溶的有机溶剂的混合物中，以形成微乳液。然后根据常规技术将所获得的含有被磷脂(和任选地被其他两亲性成膜化合物和/或添加剂)包围和稳定化的溶剂微滴的微乳液冻干以获得冻干材料，该冻干材料被储存(例如在合适的气体的存在下储存在小瓶中)并且可以用水性载体重构以最终得到充气微气泡混悬液。

可替代地，可以通过使用流动聚焦设备(flow-focusing device)制备校准的充气微气泡，如例如参考文献17中所公开的。

冷冻干燥产物通常将呈粉末或饼的形式，并且可以与期望的气体接触储存(例如在小瓶中)。产物易于在合适的生理学上可接受的水性液体载体(其典型地是可注射的)中重构，以在温和搅拌混悬液时形成充气微气泡。合适的生理学上可接受的液体载体是无菌水、水溶液诸如盐水(其可以有利地被平衡，使得用于注射的最终产物不是低渗的)、或一种或多种张力调节物质(诸如盐或糖、糖醇、二醇或其他非离子多元醇材料(例如，葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等))的溶液、壳聚糖衍生物(诸如羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖)或凝胶化(gelifying)化合物(诸如羧甲基纤维素、羟乙基淀粉或葡聚糖)。

其他合适的充气微囊泡在本领域中被称为“微气球”、“微胶囊”或“微球”。这些充气微囊泡包括其中气泡被固体材料包膜包围的混悬液，该固体材料包膜可以是例如聚合物的(天然的或合成的)、蛋白质的、水不溶性脂质的或其任何组合的。由聚合物材料制成的微气球的实例公开于例如参考文献18中。由不溶性脂质(例如三棕榈精或三硬脂精)制成的微胶囊的实例公开于例如参考文献19中。具有蛋白质包膜(例如天然蛋白质，诸如白蛋白)的微球公开于例如参考文献20中。

可以采用任何生物相容的气体、气体前体或其混合物填充以上微囊泡(后文也被称为“形成微囊泡的气体”)。

气体可以包含例如空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；一氧化二氮；稀有气体或惰性气体，诸如氦气、氩气、氙气或氪气；低分子量烃(例如含有至多达7个碳原子)，例如烷烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷或异戊烷，环烷烃诸如环丁烷或环戊烷，烯烃诸如丙烯、丁烯或异丁烯，或炔烃诸如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体、优选地氟化气体，诸如或卤化、氟化或全氟化低分子量烃(例如含有至多达7个碳原子)；或任何前述的混合物。在使用卤代烃的情况下，优选地所述化合物中的至少一些、更优选地所有卤素原子是氟原子。

氟化气体是优选的，特别是全氟化气体。氟化气体包括含有至少一个氟原子的材料，诸如，例如氟化烃(含有一个或多个碳原子和氟的有机化合物)；六氟化硫；氟化、优选地全氟化酮，诸如全氟丙酮；以及氟化、优选地全氟化醚，诸如全氟乙醚。优选的化合物是全氟化气体，诸如SF₆或全氟化碳(全氟化烃)，即其中所有氢原子都被氟原子取代的烃，已知它们形成特别稳定的微气泡混悬液。术语全氟化碳包括饱和、不饱和、以及环状全氟化碳。生物相容的、生理学上可接受的全氟化碳的实例是：全氟烷烃，诸如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟正丁烷，任选地与其他异构体诸如全氟异丁烷混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟烯烃，诸如全氟丙烯、全氟丁烯(例如全氟丁-2烯)或全氟丁二烯；全氟炔烃(例如全氟丁-2-炔)；以及全氟环烷烃(例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷)。优选的饱和全氟化碳包括，例如，CF₄、C₂F₆、C₃F₈、C₄F₈、C₄F₁₀、C₅F₁₂和C₆F₁₂。

使用以任何比率的任何以上气体的混合物也可以是有利的。例如，混合物可以包含常规气体，诸如氮气、空气或二氧化碳，以及形成稳定微气泡混悬液的气体，诸如如以上所指示的六氟化硫或全氟化碳。合适的气体混合物的实例可以在例如参考文献21中找到，其通过引用并入本文。以下组合是特别优选的：气体(A)和(B)的混合物，其中气体(B)是氟化气体，选自先前所示出的那些之中，包括其混合物，并且(A)选自空气、氧气、氮气、二氧化碳或其混合物。气体(B)的量可以占总混合物的约0.5％至约95％v/v，优选地约5％至80％。

特别优选的气体是SF₆、C₃F₈、C₄F₁₀或其混合物，任选地与空气、氧气、氮气、二氧化碳或其混合物混合。

在某些情况下，可以期望包括气态物质的前体(即能够在体内转化为气体的材料)。优选地，气态前体和由其衍生的气体是生理学上可接受的。气态前体可以是pH活化的、光活化的、温度活化的等。例如，某些全氟化碳可以用作温度活化的气态前体。这些全氟化碳，诸如全氟戊烷或全氟己烷，具有高于室温(或试剂产生和/或储存的温度)但低于体温的液/气相转变温度；因此，它们经历液/气相转变并且在人体内转化为气体。

尽管可商购的充气微囊泡仅被批准用于诊断用途，诸如

/Lumason(Bracco)Definity/Luminity(Lantheus)或Optison(GE Healthcare)，但是它们在治疗性应用中的标签外(off-label)用途在本领域中有所描述(参见例如参考文献22和参考文献23)。

本申请人现在已经观察到，基于用于治疗的超声和充气微囊泡的组合使用(US-MV)的治疗性方法可能具有降低的功效。

尽管不希望受任何特定理论的束缚，但本申请人已经观察到，此种降低的功效可能在一定程度上与在US/充气微囊泡暴露之后在受试者中、并且特别是在治疗区域中发生的瞬时血管舒缩应答(称为“血管痉挛”)相关。

血管痉挛

在本说明书和权利要求书中，表述“血管痉挛”指示由用于治疗的超声和充气微囊泡的混悬液的组合使用所诱导的强血管舒缩应答。

该(瞬时)血管舒缩应答的产生和效应描述于例如参考文献10中。

尽管不希望受任何特定理论的束缚，但充气微囊泡和超声介导治疗的组合治疗的降低的功效可能在一定程度上与在US/充气微囊泡暴露之后在受试者中、并且特别是在治疗区域中发生的该瞬时血管舒缩应答相关。

本申请人现在已经出乎意料地发现，通过使用血管痉挛抑制剂(VI)可以改进充气微囊泡和超声介导治疗的组合治疗的总体功效。

由充气微囊泡和用于治疗的超声的组合诱导的血管痉挛主要导致瞬时灌注不足，即由血管收缩引起的血流的减少。事实上，由血管收缩引起的血流减少也可能影响充气微囊泡通过声场的连续传输，导致在聚焦区域中充气微囊泡的短缺，并且显著减少超声脉冲的效应或使它们基本上无效。

血管痉挛抑制剂

如本文所使用的，表述“血管痉挛抑制剂”(VI)是指能够增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗的总体功效、特别是通过大幅减少或避免由US-MV治疗引起的血管的血管痉挛的发生的物质。

血管痉挛抑制剂可以例如通过主要基于降低细胞内钙浓度和诱导肌球蛋白的去磷酸化(实际上是ADP取代ATP)的不同机制诱导血管平滑肌细胞的松弛。

在已知用作血管痉挛抑制剂的所有化合物之中，本申请人已经出人意料地发现，归为二氢吡啶钙通道阻滞剂、α-肾上腺素受体拮抗剂和硝基血管扩张剂类别的血管痉挛抑制剂特别能够增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗的总体功效。

分类为钙阻滞剂(或钙拮抗剂或钙通道阻滞剂)的血管痉挛抑制剂通过阻滞钙离子流入血管平滑肌细胞来抑制钙诱导的血管平滑肌的收缩。

优选的钙阻滞剂VI可以是二氢吡啶钙阻滞剂。

二氢吡啶钙阻滞剂的实例包括氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、非洛地平、伊拉地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平和普拉地平，特别优选的是硝苯地平和尼莫地平。

优选地，VI是硝苯地平或尼莫地平、更优选地尼莫地平。

具有与钙拮抗剂相似特性并且被认为是生理学钙阻滞剂的镁也可以用作VI。

分类为α-肾上腺素受体拮抗剂(或α-阻滞剂)的血管痉挛抑制剂锁住α-1-肾上腺素受体在血管平滑肌中引起血管舒张的效应。α-肾上腺素受体拮抗剂的实例包括阿夫唑嗪、多沙唑嗪、哌唑嗪、西洛多辛、坦索罗辛和特拉唑嗪，特别优选的是哌唑嗪。

血管痉挛抑制剂也可以被分类为硝基血管扩张剂。术语“硝基血管扩张剂”指示一氧化氮的药理学来源，通常作为可以代谢转化为生物学活化的一氧化氮的有机硝酸盐/酯(nitrate)血管扩张剂。通常外源地施用的硝基血管扩张剂的合适实例是二甘醇二硝酸酯、三硝酸甘油酯(硝酸甘油)、单硝酸异山梨醇酯和二硝酸异山梨醇酯、托西硝乙胺、四硝酸季戊四醇酯、丙帕硝酯、西硝地尔、四硝胺和三硝乙醇胺，特别优选的是硝酸甘油。

一氧化氮通过刺激可溶性鸟苷酸环化酶导致血管平滑肌的松弛，导致环鸟苷一磷酸(cGMP)的细胞内水平增加。

在本发明的另外的实施方案中，所述血管痉挛抑制剂优选地选自由尼莫地平、硝苯地平、镁、哌唑嗪和硝酸甘油组成的组；还更优选地，所述血管痉挛抑制剂是尼莫地平。

一般而言，血管痉挛抑制剂基本上是与充气微囊泡非结合的。

术语“非结合”指示血管痉挛抑制剂与充气微囊泡基本上无物理或化学相互作用；更特别地，VI不是通过共价键或经由非共价结合(例如物理和/或静电相互作用)结合至充气微囊泡。

在实施方案中，VI被包含在单独的药物组合物中，不与充气微囊泡混悬液物理连接。

包含血管痉挛抑制剂的单独的药物组合物的实例包括市场上可获得的商业制剂，诸如用于传统和/或控释两者的口服剂型和肠胃外剂型。

可以将血管痉挛抑制剂与充气微囊泡的混悬液同时或依序施用。

如本文所使用的表述“同时施用”指示同时或基本上同时施用VI和充气微囊泡，施用途径相同或不同。

根据本发明，表述“依序施用”指示在不同时间施用VI和充气微囊泡，施用途径相同或不同。

在本发明的实施方案中，将VI与充气微囊泡的混悬液同时施用。

例如，可以将所述VI在它们施用之前立即直接添加至冷冻干燥的充气微囊泡的混悬液中。可替代地，可以将VI添加至用于重构冷冻干燥的充气微囊泡的生理学上可接受的水性载体(例如盐水)中。

在本发明的实施方案中，所述血管痉挛抑制剂是镁。

在另外的实施方案中，相对于充气微囊泡的混悬液的施用，通过将此类微囊泡稀释在镁溶液中来同时施用镁。

在本发明的替代性实施方案中，将VI与充气微囊泡的混悬液依序施用。

在优选实施方案中，将VI在充气微囊泡的混悬液之前1秒至15分钟、优选地之前5秒至12分钟、还更优选地之前至少10分钟施用。

可以将充气微囊泡的混悬液和VI通过静脉内注射同时或依序施用。可替代地，可以将充气微囊泡的混悬液通过静脉内注射施用，而将VI同时或依序口服施用。

优选地将VI通过静脉内注射以典型的批准的治疗剂量施用。

表述“批准的治疗剂量”指示已经被监管机构(例如FDA和EMA)批准用于其用途的血管痉挛抑制剂的剂量。例如，批准的治疗用途可以表示为VI剂量/待治疗的受试者的重量(mg/kg)、或VI剂量/天(mg/天)、或VI重量/时间单位(mg/小时)。

根据本发明，可以将充气微囊泡的混悬液用混悬液的连续输注或通过注射一定体积的混悬液的至少一次推注向受试者施用。

例如，混悬液的每个注射体积的微囊泡的总量可以从6×10⁵至15×10⁹个微囊泡/kg患者、优选地从1×10⁷至12×10⁹个微囊泡/kg、甚至更优选地从2×10⁷至10×10⁹个微囊泡/kg变化。考虑到注射的混悬液中微囊泡的浓度和患者的重量，每个注射的推注的体积被适配成所需的待注射的微囊泡的总量(其通常取决于待进行的具体治疗)。作为一般规则，对于混悬液中约1×10⁸至约3×10⁹个微囊泡/mL的微囊泡的浓度，推注体积可以从0.01mL至120mL、优选地从0.2mL至60mL并且甚至更优选地从0.4mL至20mL变化。

在本说明书和权利要求书中，表述“输注施用”指示可以通过任何合适的连续施用方式进行的施用程序，这些施用给药方式包括例如通过重力(例如盐水输注袋)或用专用设备，例如受控体积释放(旋转)注射器。

表述“推注施用”是指例如凭借注射器和置于外周静脉中的导管单次血管内注射一定体积的充气微囊泡的混悬液。推注的施用通常在几秒(例如5至120秒、优选地不超过60秒)内进行。

在本发明的实施方案中，将所述充气微囊泡的混悬液的施用作为至少一次推注向患者施用，优选地作为至少一次推注、并且至多达4次推注，例如每5分钟。

在本发明的另外的实施方案中，所述充气微囊泡的混悬液的施用包括施用有效量的充气微囊泡。

在该程度上，并且除非另有规定，否则如本文所使用的术语“有效剂量”或“有效量”是指根据本发明的充气微囊泡的混悬液的任何量，其足以满足其预期治疗目的：例如，以改进治疗剂在感兴趣的区域中的药物递送。

在感兴趣的区域上施用治疗性超声可以在施用充气微囊泡之前、期间或之后的任何时间发生。一般而言，优选的是在施用VI之后开始受声波作用。在某些实施方案中，当依序施用VI和微囊泡时(例如首先施用VI并且然后施用MV)，可以在施用微囊泡时或之后立即开始使感兴趣的区域受声波作用。可替代地，当同时施用VI和MV时，可以在同时施用时或之后立即开始使感兴趣的区域受声波作用。在某些实施方案中，可以确定微囊泡到达感兴趣的区域(例如通过感兴趣的区域的生理参数或通过感兴趣的区域的对比度回波描记成像)，并且当期望量的微囊泡已经到达感兴趣的区域时可以开始受声波作用。

如本文所使用的表述“感兴趣的区域”指示经历根据本发明的治疗性治疗的受试者的身体部分、器官或组织。

根据本说明书和权利要求书，术语“受试者”或“患者”是指活的人或动物患者，并且优选地正在经历本发明的超声介导治疗的人。

本发明的方面涉及用于增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到受试者的血管系统中；

c)向受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

所述血管痉挛抑制剂优选地选自由二氢吡啶钙阻滞剂、α-阻滞剂和硝基血管扩张剂组成的组；更优选地，其选自由尼莫地平、硝苯地平、镁、哌唑嗪和硝酸甘油组成的组；还更优选地，所述血管痉挛抑制剂是尼莫地平。

优选地将血管痉挛抑制剂以批准的治疗剂量例如通过静脉内注射施用到受试者的血管系统中。

可以将充气微囊泡的混悬液用连续输注或通过注射一定体积的混悬液的至少一次推注向受试者施用；更优选地，将所述充气微囊泡的混悬液作为至少一次推注向受试者施用。

将充气微囊泡的混悬液以有效剂量向受试者施用。

在本发明的实施方案中，将所公开的方法的步骤a)和步骤b)同时或依序进行。

在优选实施方案中，步骤a)与步骤b)同时进行。

在替代性实施方案中，步骤a)与步骤b)依序进行。优选地，步骤a)在步骤b)之前1秒至15分钟、更优选地之前5秒至12分钟、仍更优选地之前至少10分钟进行。

在另外的实施方案中，步骤b)与步骤a)依序进行。

声学参数诸如声压、声强和脉冲长度是以上所描述的那些。

特别地，在本发明的方法的步骤c)中，用于治疗的超声具有100kPa至900kPa、优选地200kPa至800kPa的声压。

在另外的实施方案中，在本发明的方法的步骤c)中，用于治疗的超声具有0.1W/cm²至990W/cm²、优选地1.3W/cm²至21.5W/cm²的声强。

在本发明的还另外的实施方案中，在步骤c)中，所述用于治疗的超声具有5μs至60s、优选地5μs至10s的脉冲长度，还更优选地脉冲长度是1ms。

在还另外的实施方案中，在步骤c)中，将所述用于治疗的超声施用持续1s至170分钟、优选地2至10分钟的时间。

在还另外的实施方案中，在步骤c)中，所述用于治疗的超声具有20kHz至70MHz的频率。

根据实施方案，步骤c)在步骤b)之后进行(例如在施用微囊泡之后数秒内)。

可替代地，步骤c)可以在步骤a)与步骤b)之间进行。例如，可以在施用VI之后(例如1至15分钟)、在注射充气微囊泡之前或同时开始声处理。

在一般实施方案中，将血管痉挛抑制剂用于充气微囊泡和超声的组合治疗性治疗中(用于增强其功效)，其中所述组合治疗性治疗诱导血管透化，例如用于允许或增强生物活性剂的外渗。在具体实施方案中，所述组合治疗性治疗诱导血脑屏障打开或破坏(BBB打开/破坏)，例如与生物活性剂的递送组合。在另一具体实施方案中，所述组合治疗性治疗诱导肿瘤灌注，例如用于生物活性剂的递送。

在另一实施方案中，将血管痉挛抑制剂用于充气微囊泡和超声的组合治疗性治疗中(用于增强其功效)，用于溶解血块(超声溶栓)。

在另外的实施方案中，将血管痉挛抑制剂用于充气微囊泡和超声的组合治疗性治疗中，用于改进热消融(MV增强热消融)。

在还另外的实施方案中，可以使用血管痉挛抑制剂用于增强充气微囊泡和超声的组合治疗性治疗的用于免疫调节、神经调节、放射敏化、帮助高热疗法或用于组织的非热消融的功效。

如由本申请人所证明的，施用VI能够增强组合治疗性治疗US-MV的药物递送功效。在某些实施方案中，与仅用无VI的组合US-MV治疗获得的外渗相比，VI的使用允许生物活性剂在周围肿瘤组织中的外渗增加几乎两倍。

在本发明中，表述“药物递送”指示包括至少一种生物活性剂的施用的治疗方案，所述生物活性剂不同于血管痉挛抑制剂。

生物活性剂包括能够与充气微囊泡组合用于超声介导的治疗性治疗的任何分子、化合物、制剂或材料，其能够对待治疗的区域或器官产生生物学或治疗活性效应。

生物活性剂的实例包括抗肿瘤剂，诸如长春新碱、长春花碱、长春地辛、白消安、苯丁酸氮芥、螺铂、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、阿霉素、丝裂霉素、博来霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、巯嘌呤、米托坦、丙卡巴肼、放线菌素(抗霉素D)、柔红霉素、盐酸多柔比星、紫杉醇、普卡霉素、氨鲁米特、雌莫司汀、氟他胺、亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬、睾内酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(门冬酰胺酶)、依托泊苷、干扰素a-2a和2b、血液制品诸如血卟啉类或前述物质的衍生物；生物应答调节剂，诸如胞壁酰肽；抗真菌剂，诸如酮康唑、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞嘧啶、咪康唑或两性霉素B；激素或激素类似物，诸如生长激素、促黑素细胞激素、雌二醇、二丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、地塞米松、氟尼缩松、氢化可的松、甲泼尼龙、醋酸帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙或醋酸氟氢可的松；维生素，诸如氰钴胺素或类维生素A；酶，诸如碱性磷酸酶或锰超氧化物歧化酶；抗过敏药，诸如氨来呫诺(amelexanox)；抗凝剂，诸如华法林、苯丙香豆素或肝素；抗血栓形成剂；循环系统药物，诸如普萘洛尔；代谢增效剂，诸如谷胱甘肽；抗结核药，诸如对氨基水杨酸、异烟肼、硫酸卷曲霉素、cyclosexine、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、吡嗪酰胺、利福平或硫酸链霉素；抗病毒剂，诸如阿昔洛韦、金刚烷胺、叠氮胸苷、利巴韦林或阿糖腺苷；血管扩张剂，诸如地尔硫卓、硝苯地平、维拉帕米、赤藓糖醇四硝酸酯、异山梨醇二硝酸酯、硝酸甘油或季戊四醇四硝酸酯；抗生素，诸如氨苯砜、氯霉素、新霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢拉定、红霉素、克林霉素、林可霉素、阿莫西林、氨苄西林、巴氨西林、羧苄西林、双氯西林、环己西林、picloxacillin、海他西林、甲氧西林、萘夫西林、盘尼西林或四环素；抗炎剂，诸如二氟尼柳、布洛芬、吲哚美辛、meclefenamate、甲芬那酸、萘普生、保泰松、吡罗昔康、托美丁、阿司匹林或水杨酸盐；抗原生动物剂，诸如氯喹、甲硝唑、奎宁或锑酸甲葡胺；抗风湿药，诸如青霉胺；麻醉剂，诸如复方樟脑酊；阿片剂，诸如可待因、吗啡或阿片；强心苷，诸如乙酰毛花苷(deslaneside)、洋地黄毒苷、地高辛、洋地黄苷或洋地黄；神经肌肉阻滞剂，诸如甲磺酸阿曲库铵、加拉碘铵、己芴溴铵、碘二甲箭毒、溴化泮库溴铵、氯化琥珀酰胆碱、氯化筒箭毒碱或维库溴铵；镇静剂，诸如异戊巴比妥、异戊巴比妥钠、阿普比妥(apropbarbital)、仲丁巴比妥钠、水合氯醛、乙氯维诺、炔己蚁胺、盐酸氟西泮、格鲁米特、美吗嗪盐酸盐、甲普隆、咪达唑仑盐酸盐、三聚乙醛、戊巴比妥、司可巴比妥钠、他布比妥、替马西泮或三唑仑；局部麻醉剂，诸如布比卡因、氯普鲁卡因、依替卡因、利多卡因、甲哌卡因、普鲁卡因或丁卡因；全身麻醉剂，诸如氟哌利多、依托咪酯、枸橼酸芬太尼与氟哌利多、盐酸氯胺酮、美索比妥钠或硫喷妥及其药学上可接受的盐(例如酸加成盐，诸如盐酸盐或氢溴酸盐，或碱盐，诸如钠、钙或镁盐)或衍生物(例如乙酸盐)；以及放射性化学品，例如包含α-、β-或γ-发射体，诸如例如177Lu、90Y或131I。特别重要的是抗血栓形成剂诸如肝素和具有肝素样活性的药剂诸如抗凝血酶III、达肝素和依诺肝素；血小板聚集抑制剂，诸如噻氯匹定、阿司匹林、双嘧达莫、伊洛前列素和阿昔单抗；以及溶栓酶，诸如链激酶和纤溶酶原激活物；镇痛剂，诸如可待因、芬太尼、Hydrocone、对乙酰氨基酚、羟考酮；对中枢或外周神经系统具有作用的药物，诸如抗癫痫药、抗帕金森病药、精神安定药或精神兴奋药；激素。生物活性剂的其他实例包括抗体，诸如阿达木单抗(Adalimumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)，或抗体的片段。生物活性剂的其他实例包括纳米制剂药物，诸如猪肺磷脂(Poractant alfa)、盐酸多柔比星脂质体注射剂、脂质体两性霉素B脂质复合物、脂质体两性霉素B、脂质体硫酸吗啡、脂质体阿糖胞苷、脂质体长春新碱、脂质体伊立替康、脂质体维替泊芬、脂质体柔红霉素和阿糖胞苷、白蛋白结合的紫杉醇。生物活性剂的其他实例还包括遗传物质，诸如天然或合成来源的核酸、RNA、以及DNA，包括重组RNA和DNA。可以将编码某些蛋白质的DNA用于许多不同类型的疾病的治疗中。例如，可以提供肿瘤坏死因子或白介素-2以治疗晚期癌症；可以提供胸苷激酶以治疗卵巢癌或脑肿瘤；可以提供白介素-2以治疗成神经细胞瘤、恶性黑色素瘤或肾癌；并且可以提供白介素-4以治疗癌症。诊断剂是可以允许与诊断技术相关的成像增强的任何化合物、组合物或颗粒，这些诊断技术包括磁共振成像、X射线，特别是计算机断层摄影术、光学成像、核成像或分子成像。合适的诊断剂的实例是例如磁铁矿纳米颗粒、碘化化合物(诸如

)、或顺磁性离子络合物(诸如疏水性钆络合物)。

根据本发明，施用血管痉挛抑制剂(VI)可以增强与治疗性治疗US-MV组合施用的所述生物活性剂的治疗/诊断效果。

如以上所提及的，血管痉挛抑制剂通过不同机制赋予生物活性剂的治疗/诊断效果的增强。例如，血管痉挛抑制剂可以增强(1)生物活性剂(例如治疗剂或造影剂)在靶区域的血管腔室中的浓度，(2)其通过血管的外渗，(3)其细胞内递送和/或(4)血液灌注。

所述生物活性剂可以作为与充气微囊泡分开的制剂施用和/或被包括在充气微囊泡的结构内。

在前一种情况下，例如通过注射将生物活性剂与组合的US-MV治疗性治疗同时或依序施用。

生物活性剂可以是生物活性分子(或生物活性分子的混合物)或可以呈包含生物活性分子的合适的药物组合物的形式，诸如市场上可商购的制剂或通过将生物活性分子与合适的水性载体混合所获得的临时制品，这些水性载体优选地是生理上可接受的，包含水(优选地无菌水)、水溶液诸如盐水(其可以有利地被平衡，使得用于注射的最终产物不是低渗的)、或一种或多种张力调节物质的溶液。张力调节物质包含盐或糖、糖醇、二醇或其他非离子多元醇材料(例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)、壳聚糖衍生物(诸如羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖)或凝胶化化合物(诸如羧甲基纤维素、羟乙基淀粉或葡聚糖)。

将生物活性剂以有效剂量向受试者施用，其中所述有效剂量是适用于发挥生物活性剂的治疗效果的剂量。

可以将生物活性剂用连续输注或通过注射一定体积的混悬液的至少一次推注向受试者施用；更优选地，将所述充气微囊泡的混悬液作为至少一次推注向受试者施用。

在实施方案中，本发明的药物递送方案涉及用于增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a’)将生物活性剂施用到受试者的血管系统中；

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到受试者的血管系统中；

c)向受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

在实施方案中，步骤a’)和步骤a)同时进行。

在另一实施方案中，步骤a’)和步骤a)依序进行。

原则上，步骤a)、a’)和/或b)可以同时或以任何顺序依序进行，取决于具体的治疗和方案，包括同时(仅以上步骤中的两个)和依序施用方案的组合。

例如，步骤a)和/或a’)可以与步骤b)同时或依序进行。

在实施方案中，步骤a)和/或步骤a’)与步骤b)同时进行。

在替代性实施方案中，步骤a)和/或步骤a’)与步骤b)依序进行。例如，步骤a)/a’)在步骤b)之前1秒至15分钟、更优选地之前5秒至12分钟、仍更优选地之前至少10分钟进行(彼此同时地或依序地)。

在另外的实施方案中，步骤a’)和步骤b)可以同时进行。例如，微囊泡的混悬液可以含有生物活性剂；可以将所述混悬液与VI同时施用或依序(例如在施用VI之后)施用。

在另外的实施方案中，可以通过不同的机制将生物活性剂包括在充气微囊泡的结构内：i)其可以通过共价键结合至充气微囊泡的两亲性分子；ii)其还可以经由物理和/或静电相互作用适当地缔合至充气微囊泡，以及iii)其可以是与形成充气微囊泡的组分混合以最终掺入充气微囊泡结构中的化合物。

在另外的实施方案中，本发明的药物递送方案涉及用于增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将包含生物活性剂的充气微囊泡的混悬液施用到受试者的血管系统中，所述生物活性剂被包括在所述充气微囊泡的结构内；

c)向受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

在实施方案中，步骤a)与步骤b)同时进行。

可以将包含生物活性剂的充气微囊泡的混悬液用连续输注或通过注射一定体积的混悬液的至少一次推注向受试者施用；更优选地，将所述充气微囊泡的混悬液作为至少一次推注向受试者施用。

将包含生物活性剂的充气微囊泡的混悬液以有效剂量向受试者施用，其中所述有效剂量使得充气微囊泡和包括在其结构中的生物活性剂以适用于发挥其治疗效果的剂量施用。

以下实施例将有助于进一步说明本发明。

实施例

材料和方法

制剂P01的制备

根据参考文献17中所描述的程序制备制剂P01(参见实施例2)。制剂中的两亲性材料是以9:1的各自摩尔比的DSPC:DPPE-PEG5000。通过库尔特计数器法(例如配备有Multisizer 3软件的库尔特计数器Multisizer 3)评价溶液中MV的浓度。

制剂P02的制备

使用参考文献16的工作实施例中所示出的程序用于制备制剂(P02)。

简言之，制备了含有约90mg/L的DSPC、7mg/L的棕榈酸、60mg/L的DPPE-PEG5000和100g/L的PEG4000的环辛烷和水(约1.5/100v/v)的乳液(Megatron MT3000，Kinematica；10’000rpm)，并且取样到DIN8R小瓶中(约1mL/小瓶)。

将小瓶在-50℃下在真空下冷却并且然后经受冻干，随后在高于室温下二次干燥直到完全去除水和溶剂(按重量计小于0.5％)。在冷冻干燥过程结束时，将小瓶的顶部空间用C4F10/N2的35/65混合物饱和，并且将小瓶塞住并密封。微囊泡溶液通过在气体的存在下在温和搅拌下将冻干制品(以15mg/mL的浓度)在NaCl溶液(0.9％)中重构而获得。重构体积被适配成获得用于动物体重的适当注射体积。

的制备

根据制造商的建议活化微囊泡。通过库尔特计数器法(例如配备有Multisizer 3软件的库尔特计数器Multisizer 3)定义微囊泡的浓度。

施用

如果需要，将微囊泡混悬液的体积稀释，以获得对于大鼠200-500μL，对于小鼠50-200μL的推注。每次注射后进行盐水冲洗。

当治疗持续时间是20min时，推注间隔5min。

根据方案、模型和物种，微囊泡的剂量以微囊泡的总数目/kg表示。根据方案，可以将整体剂量分成若干次推注。

实施例1

充气微囊泡和超声的组合治疗性治疗的功效的增强

模型和动物准备

所使用的模型是NMU大鼠肿瘤模型。青春期前大鼠(雌性，Sprague Dawley)接受50mg/kg的NMU(N-亚硝基-N-甲基脲，Sigma，Switzerland)的单次腹膜内注射。将患有肿瘤的大鼠纳入方案中。在NMU模型中，动物可以发展若干种肿瘤：在相同动物中允许具有接受微囊泡和用于治疗的超声的肿瘤；以及没有受超声声波作用(称为未治疗的)的肿瘤。使大鼠麻醉并且仰卧放置。将导管置于尾静脉中以注射药物和微囊泡。将US治疗换能器置于肿瘤的5cm处(由水槽隔开)。灌注后进行对比度回波描记术(C10-3v探针，EpiQ 7G，Philips)，以40-45度角置于肿瘤附近。

为了评价分子外渗的效率，在即将用超声和微囊泡进行治疗性治疗之前注射用

5.5荧光团标记的150kDa-葡聚糖。

测试了五种实验条件：

i)第一组大鼠(未治疗的)未被暴露于US-MV(CY5.5h的基础外渗)；

ii)第二组肿瘤仅施用MV；

iii)将第三组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV；

iv)将第四组大鼠暴露于US-MV治疗，和

v)将第五组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后暴露于US-MV治疗。

对于US+MV治疗，用于治疗的US采用600kPa的声压，1ms开/10s关的脉冲方案，持续20分钟的持续时间。

对于本研究，将这两种MV制剂，即P02(根据材料和方法制备)或Definity，以8μl气体/kg的剂量施用，分成4次推注，每次间隔5分钟。就MV数目而言，该气体体积当量对应于P02制剂的1.2×10⁸个/kg和Definity的5.2×10⁹个/kg。

对于用血管痉挛抑制剂预治疗，首先将尼莫地平(Sigma Aldrich，Switzerland)粉末在DMSO中稀释(40mg/ml)；在NaCl 0.9％中临时制备注射剂量(1.4mg/kg)并且在治疗之前10min注射。

然后从处死的动物中收获肿瘤；在体外采集的图像上定量荧光(

700)。通过ImageJ软件定量荧光。

结果

结果表明，施用尼莫地平能够增强组合治疗性治疗US-MV的药物递送功效。与在其他条件下所获得的外渗相比，在组合使用MV-US之前用VI预治疗允许将

5.5染料在肿瘤组织中的外渗增加几乎两倍。特别地，发现第一组(仅CY5.5h)中的平均荧光信号是1020RFU/px/ms，第二组(仅MV)中是930RFU/px/ms，第三组(VI+MV)中是1030RFU/px/ms，并且第四组(US-MV)中是990RFU/px/ms。出人意料地，在第五组中，发现在预先施用VI随后施用US-MV之后评估的平均荧光值是2060RFU/px/ms，即相对于其他组的荧光值的两倍。

实施例2

血管痉挛诱导中不同US参数的评价

模型和动物准备

用于这些实验的模型是肠系膜大鼠微循环。简言之，准备麻醉的动物以允许肠袢的可视化。在尾静脉中进行注射。

将大鼠置于配备有X20物镜(放大倍数最终：200)的倒置显微镜(

X2)下。由开源软件驱动的数字相机，根据方案在每个所需时间点采集和记录30秒的视频。

施用制剂01用于本研究。

US治疗通过实验单元素换能器(未聚焦，平面，1.5MHz)递送。表1报告了每种方案的测试US参数，包括脉冲方案、声压和US施用的持续时间。将换能器聚焦在光学物镜上，并且置于5cm的工作距离处。

在治疗之前、期间和之后采集图像序列。可以每5min进行另外的采集，直到US暴露开始之后40min，以监测血管痉挛消退。如果观察到微血管(即小静脉、小动脉或毛细血管)管腔减少，和/或血流减少和/或血流停止(与对照条件相比)，则确认血管痉挛。

结果：

如表1中所报告的，结果证实，在任何测试的声压下，对于所有研究的治疗持续时间(2min、5min和20min)、微囊泡剂量和施用模式(一次或多次推注)，在第一次超声脉冲之后立即发生血管痉挛。表述“超声脉冲”指示由超声换能器发射并且在介质内传播的多周期超声波。其特征在于称为“时间开”(例如1ms开)的持续时间、频率、振幅。

表1：实验条件和结果。

实施例3

不同类型的充气微囊泡在血管痉挛诱导中的评价

模型和动物准备

用于这些实验的模型是肠系膜大鼠微循环。模型和动物准备描述于实施例2中。

本研究旨在评价不同类型的充气微囊泡在血管痉挛诱导中的作用。出于该目的，研究了不同的微囊泡制剂，即在不同声压(从400kPa直至800kPa)下的制剂P02和

(Lantheus)。表2报告了所研究的实验条件。

结果

如从表2中看出的，结果证实了在任何测试的声压下的第一次超声脉冲和用任何研究的充气制剂之后立即发生血管痉挛。

表2：实验条件和结果。

实施例4

在非肿瘤模型中由钙通道阻滞剂介导的血管痉挛抑制的研究

模型和动物准备

本研究旨在评价由血管痉挛抑制剂化合物、特别是二氢吡啶钙通道阻滞剂尼莫地平诱导的血管痉挛的抑制。

出于该目的，在充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗之前10分钟，大鼠接受尼莫地平的预治疗。

首先将尼莫地平(Sigma Aldrich，Switzerland)粉末在DMSO中稀释(40mg/ml)；在NaCl 0.9％中临时制备注射剂量(1.4mg/kg)并且在治疗之前10min注射。

根据先前的研究选择治疗参数以获得血管痉挛的发生。施用P01制剂用于本研究。

结果：

表3表明用VI预治疗能够抑制100％的经受用于治疗的超声和充气微囊泡的混悬液的组合使用的动物中血管痉挛的发生。

表3实验条件和结果。

实施例5

与充气微囊泡组合的US介导的治疗对肿瘤灌注的作用(DA3肿瘤模型)。

动物模型和准备

在这些研究中使用小鼠DA3肿瘤模型。US治疗通过

系统(探针P4-2)递送。将探针置于距离肿瘤5cm处(由填充有脱气水的水槽隔开)。

然后，进行充气微囊泡(P01)的连续推注注射，并且使肿瘤经历治疗性声波作用(频率、声压和脉冲特性如表4中所指定)。通过微囊泡的回波描记信号(

系统)追踪每个肿瘤的灌注。记录信号并用

软件进行后分析。通过灌注的减少(即与对照条件相比，US脉冲之后微囊泡信号强度的降低和/或补充时间的增加)证明了血管痉挛的发生。

表述“补充时间”指示在由每个US脉冲引起的MV的实质性破坏之后，向具有新鲜充气微囊泡的容器供应超声束下的区域(the area under the ultrasound beam)所需的时间。

表述“MV破坏”对应于由US对MV的声学活化引起的MV的完整性或结构的损失。这可以由例如MV塌陷或气体溶解引起，并且由声学信号跟踪监测。

有关微囊泡和超声治疗的所有参数都是固定的(参见表4)。根据先前的研究选择治疗性声波作用参数，以获得DA3肿瘤中的血管透化。选择P01剂量以允许肿瘤的稳定灌注(1.3E+09个微囊泡/kg；分成4次推注，每6min注射一次)。测试了两组动物：一组用VI(尼莫地平，1.4mg/kg，iv，来自储备溶液，在治疗之前10min)预治疗，并且与仅施用NaCl 0.9％的组比较。

结果

在用盐水治疗的100％的动物中观察到每次US脉冲之间的灌注减少。在用VI预治疗之后，肿瘤灌注在100％的测试动物中是稳定的，表明血管痉挛的抑制。结果总结在表4中。

此外，图1报告了在用US+MV治疗期间肿瘤灌注的定量，比较了没有VI预治疗的情况下所获得的结果(上图)和用VI预治疗(尼莫地平1.4mg/kg IV)所获得的结果(下图)。结果证实VI施用之后获得改进的肿瘤灌注。事实上，与没有任何预治疗的情况下所获得的补充相比，用VI预治疗能够确保在由US脉冲破坏之后微囊泡的更恒定的补充。

表4：实验条件和结果

实施例6

与充气微囊泡组合的US介导的治疗对肿瘤灌注的作用(NMU肿瘤模型)。

模型和动物准备

青春期前大鼠(雌性，Sprague Dawley)接受50mg/kg的NMU(N-亚硝基-N-甲基脲，Sigma，Switzerland)的单次腹膜内注射。模型描述于实施例1中。

进行充气微囊泡的连续推注注射(如表5中所指定的)，并且使肿瘤经历治疗性声波作用(频率、声压和脉冲特性如后续实施例中所指定)。

如实施例5中所描述的评估治疗期间肿瘤的灌注。

有关微囊泡和超声治疗的所有参数都是固定的(参见表5)。根据先前的研究选择治疗性声波作用参数，以获得NMU肿瘤中的血管透化。选择P02剂量以允许肿瘤的稳定灌注(即1.2E+09个微囊泡/kg，分成4次推注；每5min一次推注)。

用尼莫地平(1.4mg/kg，iv，来自储备溶液，治疗之前10min，如实施例3中详述的)预治疗动物并且与NaCl 0.9％的注射比较。

结果

观察到第一次US脉冲之后对比度信号的降低。所有肿瘤在第一次脉冲之后呈现灌注的缺陷。

然而，用二氢吡啶钙通道阻滞剂尼莫地平(1.4mg/kg，之前10min)预治疗的大鼠在整个治疗中示出稳定的肿瘤灌注，表明血管痉挛的抑制。

表5：实验条件和结果。

实施例7

在血管痉挛的诱导中不同药理学类别的血管痉挛抑制剂的评价。

模型和动物准备

本研究旨在评估目前临床使用的不同药理学类别的血管痉挛抑制剂药物对血管痉挛抑制的功效。

有关微囊泡和超声治疗的所有参数都是固定的，如表6中所指示的。所选择的血管痉挛抑制剂药物及其相关剂量报告于表6中。预治疗与微囊泡注射和超声治疗之间的持续时间与每种药物的药物代谢动力学和药效学一致。

结果

如表6中所报告的，结果表明二氢吡啶钙阻滞剂(诸如尼莫地平和硝苯地平)、镁和硝基血管扩张剂(诸如三硝酸甘油(trinitrine))，显示出良好的抑制血管痉挛的能力。α-肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪展现出更低的能力，而非二氢吡啶钙阻滞剂地尔硫卓和ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂卡托普利对血管痉挛的发生未示出任何相关的抑制活性。

表6：实验条件和结果。

实施例8

示出充气微囊泡和超声的组合治疗性治疗的功效增强的另外的实验

8.1血块的破坏

所使用的模型是其中脑半球之一的大脑中动脉被阻塞的健康大鼠。该阻塞导致相应半球中的血液灌注减少，其特征在于通过计算机断层摄影术所测量的总血管体积中的斜率。为了评价US-MV对血块破坏的功效，将US-MV治疗之后的总血管体积与参照值(即MCA阻塞之前和之后的总血管体积)进行比较。

测试了六种实验条件：

vi)将第一组大鼠(未治疗的)暴露于US(US对凝块溶解的基础效应)；

vii)将第二组大鼠用血管痉挛抑制剂预治疗并且暴露于US；

viii)第三组大鼠仅施用MV；

ix)将第四组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV；

x)将第五组大鼠暴露于US-MV治疗，和

xi)将第六组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后暴露于US-MV治疗。

用约0,25MHz至2MHz(例如1MHz)的频率和约0.4MPa至1.5MPa(例如0.6MPa)的声压，用约几ms至几秒开(例如10ms)的脉冲长度，将US治疗施加于阻塞的MCA上。

对于用血管痉挛抑制剂的预治疗，将血管痉挛抑制剂(例如尼莫地平，约40mg/kg)在该程序之前(例如在施用MV之前5分钟)施用。

将MV制剂以约0,1μl至50μl的气体/kg(例如1μl的气体/kg，2.10⁸MV/kg)的剂量施用。就MV数目而言，该气体体积当量对应于约2×10⁷个/kg至多达10×10⁹个MV/kg。

如以上所示出的血管痉挛抑制剂的施用能够增强由组合治疗性治疗US-MV诱导的再灌注的功效。实际上，与其他条件相比，在MV-US的组合使用之前用VI预治疗允许总血管体积的显著增加。在仅用US+MV治疗的动物中可以观察到更低程度的再灌注，并且用US或US+VI治疗的动物中可以观察到更低得多的程度的再灌注。对于US和US+VI组，获得了类似的再灌注。在以下其他组中未观察到对再灌注的实质性影响：仅MV或MV+VI。

8.2BBB打开

所使用的模型是健康大鼠或带有脑肿瘤的大鼠。为了评价US+MV对BBB打开的功效，所有动物在接受超声治疗之前接受蓝色伊文思染料(Blue Evan’s Dye)溶液的注射。脑中外渗染料的量与血脑屏障的通透性增加(BBB打开)相关。

测试了六种实验条件：

i)将第一组大鼠(未治疗的)暴露于US(US对BBBO的基础效应)；

ii)将第二组大鼠用血管痉挛抑制剂预治疗并且暴露于US；

iii)第三组大鼠仅施用MV；

iv)将第四组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV；

v)将第五组大鼠暴露于US-MV治疗，和

vi)将第六组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后暴露于US-MV治疗。

将MV制剂(约0.1至50μl气体/kg；例如1μl气体/kg)在即将US施加之前施用。就MV数目而言，该气体体积当量对应于约2×10⁷个/kg至多达10×10⁹个MV/kg(例如2.10⁸个MV/kg)。

通过颅骨施加US治疗(约0.2MHz至2MHz，例如0.25MHz)，声压范围为约150kPa至1.8MPa(例如400kPa)并且脉冲长度为约几μs至几十ms开(例如10ms开)。

与其他条件相比，与US+MV治疗组合施用血管痉挛抑制剂增加了脑实质中外渗的伊文思蓝的量，反映了血脑屏障的更大打开。在用US+MV治疗的动物中可以观察到更低程度的BBBO，而在以下其他组中未观察到BBBO：仅US或仅MV；与血管痉挛抑制剂组合的US或MV。

8.3MV增强热消融

模型是健康的兔子。热消融的功效通过暴露于超声时后肢肌肉的温度升高和解剖之后观察该组织内的热病变而突显。使用插入在肌束的声处理区域中的热电偶探针跟踪该程序期间的温度升高。

测试了六种实验条件：

i)将第一组兔子(未治疗的)暴露于US(US对热消融的基础效应)；

ii)将第二组兔子用血管痉挛抑制剂预治疗并且暴露于US；

iii)第三组兔子仅施用MV；

iv)将第四组兔子用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV；

v)将第五组兔子暴露于US-MV治疗，和

对于用血管痉挛抑制剂的预治疗，将血管痉挛抑制剂(例如尼莫地平，约40mg/kg)在该程序之前(例如5分钟)施用。

将MV制剂(约0.1至50μl气体/kg，例如5μl气体/kg)在即将US施加之前施用。就MV数目而言，该气体体积当量对应于约2×10⁷个/kg至多达10×10⁹个MV/kg(例如10×10⁸个MV/kg)。

将US治疗应用在肌肉组织上(约0.25MHz至2MHz，例如0.5MHz)，声压范围为约数百kPa至几MPa(例如2.,7MPa)，脉冲长度为约几ms至多达几秒开(例如15s)。

使用US或US+VI或US+MV或US+MV+VI获得引起热病变的温度升高。两个组US与US+VI之间未观察到差异。然而，与US或US+VI相比，使用US+MV允许更高且更快的温度升高并且降低实现此种温度升高和诱导此类热病变所需的能量水平。当将血管痉挛抑制剂与US+MV组合施用时，与所有其他组相比，该观察到的效果被增强。在以下其他组中未观察到热病变：仅MV或与血管痉挛抑制剂组合的MV。

8.4神经调节

所使用的动物模型是大鼠。由US+MV诱导的神经元功能的调节通过测量位于躯体感觉大脑皮质中的神经元的电活性的改变来评价。所使用的方法被称为刺激驱动的躯体感觉诱发电位(SSEP)。该方法评价测量由前爪的电刺激引起的SSEP波形(振幅和潜伏期)的脑神经元应答。在此我们比较了由US+MV诱导的波形变化。

测试了六种实验条件：

i)将第一组大鼠(未治疗的)暴露于US以评价US对神经元应答的影响；

ii)将第二组大鼠用血管痉挛抑制剂预治疗并且暴露于US；

iii)第三组大鼠仅施用MV；

iv)将第四组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV；

v)将第五组大鼠暴露于US-MV治疗，和

vi)将第六组大鼠用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后暴露于US-MV治疗。

对于所有实验，在该程序之前记录基线信号以便评价由刺激诱导的波形变化。

将MV制剂(约μl气体/kg，例如1μl气体/kg)在即将US施加之前施用。就MV数目而言，该气体体积当量对应于约2×10⁷个/kg至多达10×10⁹个MV/kg，例如2.10⁸个MV/kg。

将US治疗应用在脑上(约0.25MHz至2MHZ，例如0.5MHz)，声压范围为约数百kPa至几MPa(例如0.4MPa)，并且脉冲长度为约几ms至多达几秒开(例如10ms)。

与基线信号相比，US+MV对躯体感觉皮质的刺激诱导SEPP信号振幅的降低和潜伏期的增加。与US+MV相比，VI与US+MV刺激的组合施用诱导SEPP振幅的更高降低和信号潜伏期的更高增加。与其他组相比，用US+MV+VI治疗的组中诱导此种信号改变所需的能量水平也更低。未观察到US或US+VI或MV或US+VI的波形变化。

8.5非热消融

模型是健康大鼠或带有脑肿瘤的大鼠。将脑暴露于US以便使组织消融。评价该程序的功效，检测治疗诱导的病变的存在，如通过以下突显的：i)组织血液动力学的变化，ii)靶组织中坏死和凋亡的水平增加和iii)数周内肿瘤生长的减少。

测试了六种实验条件：

i)将第一组大鼠(未治疗的)暴露于US(US对非热消融的基础效应)；

ii)将第二组大鼠用血管痉挛抑制剂预治疗并且暴露于US；

iii)第三组大鼠仅施用MV；

iv)将第四组大鼠用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV；

v)将第五组大鼠暴露于US-MV治疗，和

将MV制剂(约0.1至50μl气体/kg，例如1μl气体/kg)在即将US施加之前施用。就MV数目而言，该气体体积当量对应于约2×10⁷个MV/kg至多达10×10⁹个MV/kg。(例如2.10⁸个MV/kg)。

将US治疗应用在组织上(约0.25MHz至2MHz，例如1MHz)，声压范围为约数百kPa至几MPa(例如1Mpa)并且脉冲长度为约几ms至多达几秒开(例如20ms)。

与所有其他条件相比，血管痉挛抑制剂与US+MV的组合施用允许治疗组织中血流的更高减少和更高水平的坏死和凋亡。这意味着与所有其他组相比，肿瘤生长在一周内减少更多。在用US+MV治疗的动物中观察到更低程度的类似效应。在以下组中未观察到病变：US或US+VI或MV或MV+VI。

8.6放射敏化

模型是带有肿瘤的大鼠。目的是使用US+MV治疗肿瘤，增强放射治疗(RT)的效果。评价该程序的功效，检测治疗诱导的病变的存在，如通过以下突显的：i)组织血液动力学的变化，ii)暴露于US+RT的组织中细胞死亡和凋亡的水平增加和iii)肿瘤生长的减少和数周内的存活增加。

测试了十种实验条件：

i)将第一组大鼠暴露于RT以评价单独治疗的效果；

ii)将第二组大鼠暴露于RT和血管痉挛抑制剂；

iii)将第三组大鼠暴露于US；

iv)将第四组暴露于US和血管痉挛抑制剂；

v)第五组大鼠仅施用MV；

vi)将第六组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV；

vii)将第七组大鼠暴露于US-MV治疗；

viii)将第八组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后暴露于US-MV治疗；

ix)将第九组暴露于US-MV和RT治疗；

x)将第十组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后暴露于US-MV和RT治疗。

对于用血管痉挛抑制剂的预治疗(例如尼莫地平，约40mg/kg)在该程序之前(例如5分钟)施用。

将MV制剂(约0.1至50μl气体/kg，例如1μl气体/kg)在即将US施加之前施用。就MV数目而言，该气体体积当量对应于约2×10⁷个/kg至多达10×10⁹个MV/kg(例如2.10⁸个MV/kg)。

将US治疗应用在肿瘤上(约0.25MHz至2MHz，例如0.25MHz)。以约几百kPa至几MPa(例如600kPa)的声压，几ms至多达几秒(例如10ms)的脉冲长度对组织施加US治疗。

将放射治疗在US治疗之后施加在相同的组织上。

与其他条件相比，在RT+US+MV之前施用血管痉挛抑制剂允许在治疗的组织中更高的血流减少和更高水平的细胞死亡和细胞凋亡。这意味着与其他组相比降低的肿瘤生长和更高的存活率。在较低水平上，MV+US+RT或MV+US+/-VI或RT+/-VI也降低血流并且诱导肿瘤组织中的细胞死亡和凋亡并降低肿瘤生长。与MV+US相比，在用MV+US+VI治疗的组中，该效果更优异。在RT或RT+VI之间未观察到差异。在用MV或MV+VI或US或US+VI治疗的组中未观察到效果。

8.7高热疗法

模型是带有肿瘤的兔子。目的是通过荧光-细胞毒性药物治疗肿瘤并且通过US诱导高热疗法的方法增强药物递送。

通过由MR测温法监测肿瘤中的温度来评价高热疗法，得到治疗区域的温度图。通过由荧光测定法获得的肿瘤中荧光累积的定量来评价药物递送的功效。

测试了七组实验条件。所有组接受细胞毒性药物。

i)第一组仅接受细胞毒性药物(肿瘤中荧光信号的基础累积)；

ii)将第二组兔子用US+/-细胞毒性药物治疗；

iii)将第三组兔子用血管痉挛抑制剂预治疗并且暴露于US+/-细胞毒性药物；

iv)第四组兔子施用MV+/-细胞毒性药物；

v)将第五组兔子用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后施用MV+/-细胞毒性药物；

vi)将第六组兔子暴露于US-MV治疗+/-细胞毒性药物，和

xvii)将第七组用血管痉挛抑制剂预治疗并且然后暴露于US-MV治疗+/-细胞毒性药物。

将MV制剂(例如，约0.1至50μl气体/kg)在即将US施加之前施用。就MV数目而言，该气体体积当量对应于约2×10⁷个/kg至多达10×10⁹个MV/kg。(例如2.10⁸个MV/kg)

将US治疗施加在肿瘤上(约0.25MHz至2MHz，例如0.5MHz)，声压范围为约200kPa至1MPa(例如500kPa)并且脉冲长度为约1ms至多达10秒开(例如10ms)。

对于组VI或MV或单独的MV+VI，均未观察到温度的实质增加。使用US或US+VI或US+MV或US+MV+VI获得高热疗法。达到和维持高热疗法所需的能量水平在组MV+US中降低，并且在组US+MV+VI中降低至更高的程度。

对于所有高热疗法有效的组，测量荧光信号累积的增加。与MV+US相比，该效果在US+MV+VI中更显著，反映了组合使用US-MV和VI的情况下细胞毒性药物的更高递送。

参考文献

[1]Y.Wang et al.,“Clinical study of ultrasound and microbubbles forenhancing chemotherapeutic sensitivity of malignant tumors in digestivesystem,”Chinese J.Cancer Res.,vol.30,no.5,pp.553–563,2018.

[2]L.Auboire et al.,“Microbubbles combined with ultrasound therapy inischemic stroke:A systematic review of in-vivo preclinical studies,”PLoS One,vol.13,no.2,Feb.2018.

[3]J.H.Hwang,Y.Zhou,C.Warren,A.A.Brayman,and L.A.Crum,“Targetedvenous occlusion using pulsed high-intensity focused ultrasound,”IEEETrans.Biomed.Eng.,vol.57,no.1,pp.37–40,Jan.2010.

[4]J.Tu,H.Zhang,J.Yu,C.Liufu,and Z.Chen,“Ultrasound-mediatedmicrobubble destruction:A new method in cancer immunotherapy,”OncoTargets andTherapy,vol.11.Dove Medical Press Ltd.,pp.5763–5775,2018.

[5]J.Blackmore,S.Shrivastava,J.Sallet,C.R.Butler,and R.O.Cleveland,“Ultrasound Neuromodulation:A Review of Results,Mechanisms and Safety,”Ultrasound in Medicine and Biology,vol.45,no.7.Elsevier USA,pp.1509–1536,01-Jul-2019.

[6]H.Deng et al.,“Ultrasound-stimulated microbubbles enhanceradiosensitization of nasopharyngeal carcinoma,”Cell.Physiol.Biochem.,vol.48,no.4,pp.1530–1542,Aug.2018.

[7]D.J.Ching et al,"Effect of microbubble contrast agent during highintensity focused ultrasound ablation on rabbit liver in vivo"Eur J Radiol.；81(4):e519-23,2012 Apr.

[8]M.A.Santos,"Microbubble-assisted MRI-guided focused ultrasound forhyperthermia at reduced power levels",International Journal Of Hyperthermia,Vol.35,no.1,591–603,2018.

[9]C.D.Arvanitis,N.Vykhodtseva,F.Jolesz,M.Livingstone,andN.McDannold,“Cavitation-enhanced nonthermal ablation in deep brain targets:Feasibility in a large animal model,”J.Neurosurg.,vol.124,no.5,pp.1450–1459,May 2016.

[10]S.B.Raymond,J.Skoch,K.Hynynen,and B.J.Bacskai,“Multiphotonimaging of ultrasound/Optison mediated cerebrovascular effects in vivo,”J.Cereb.Blood Flow Metab.,vol.27,no.2,pp.393–403,Feb.2007.

[11]EP1017425(B1)

[12]WO9953964

[13]US 10,456,483 B2

[14]US5558092A

[15]WO9115244A2

[16]WO2004069284A2

[17]WO2019170606A1

[18]US5711933A

[19]US6333021B1

[20]US6723303B1

[21]WO9409829A1

[22]A.R.Rezai et al.,“Noninvasive hippocampal blood-brain barrieropening in Alzheimer’s disease with focused ultrasound.”

[23]G.Dimcevski et al.,“A human clinical trial using ultrasound andmicrobubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreaticcancer,”J.Control.Release,vol.243,pp.172–181,Dec.2016.

Claims

1.一种血管痉挛抑制剂，用于在增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效中的用途。

2.根据权利要求1的用于所述用途的血管痉挛抑制剂，其中所述血管痉挛抑制剂选自由二氢吡啶钙阻滞剂、α-阻滞剂和硝基血管扩张剂组成的组。

3.根据权利要求2的用于所述用途的血管痉挛抑制剂，其中所述血管痉挛抑制剂选自由尼莫地平、硝苯地平、镁、哌唑嗪和硝酸甘油组成的组。

4.根据前述权利要求中任一项的用于所述用途的血管痉挛抑制剂，其中将所述血管痉挛抑制剂与充气微囊泡的混悬液的施用同时或依序施用。

5.根据权利要求4的用于所述用途的血管痉挛抑制剂，其中将所述血管痉挛抑制剂在施用充气微囊泡的混悬液之前1秒至15分钟预先施用。

6.一种用于增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到所述受试者的血管系统中；

c)向所述受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述血管痉挛抑制剂选自由二氢吡啶钙阻滞剂、α-阻滞剂和硝基血管扩张剂组成的组。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述血管痉挛抑制剂选自由尼莫地平、硝苯地平、镁、哌唑嗪和硝酸甘油组成的组。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中将所述充气微囊泡的混悬液用连续输注或通过注射至少一次推注来施用。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中将所述方法的步骤a)和步骤b)同时或依序进行。

11.根据权利要求10所述的方法，其中将步骤a)在所述步骤b)之前1秒至15分钟进行。

12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其中所述用于治疗的超声具有100kPa至900kPa的声压。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，其中所述用于治疗的超声具有5μs至60s的脉冲长度。

14.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中将所述用于治疗的超声施加持续1秒至170分钟的时间。

15.根据权利要求6至14中任一项所述的方法，其中所述用于治疗的超声具有20kHz至70MHz的频率。

16.一种用于增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a’)将生物活性剂施用到受试者的血管系统中；

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到所述受试者的血管系统中；

c)向所述受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

17.一种用于增强充气微囊泡和用于治疗的超声的组合治疗性治疗的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将包含生物活性剂的充气微囊泡的混悬液施用到所述受试者的血管系统中，所述生物活性剂被包括在所述充气微囊泡的结构内；

c)向所述受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

18.根据权利要求1-5的用于所述用途的血管痉挛抑制剂，所述用途包括：

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到所述受试者的血管系统中；

c)向所述受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

19.根据权利要求1-5的用于所述用途的血管痉挛抑制剂，所述用途包括：

a’)将生物活性剂施用到受试者的血管系统中；

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

b)将充气微囊泡的混悬液施用到所述受试者的血管系统中；

c)向所述受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。

20.根据权利要求1-5的用于所述用途的血管痉挛抑制剂，所述用途包括：

a)将血管痉挛抑制剂施用到受试者的血管系统中；

c)向所述受试者的感兴趣的区域施加用于治疗的超声。