JP2023504232A - 膵臓がんの治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、超音波媒介の治療薬のすい臓へのデリバリーに関し、特には、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）などのすい臓がんの治療に関する。より特には、本発明は、治療薬のデリバリーにおける使用のための、およびＰＤＡＣを含むすい臓がんの治療のためのクラスタ組成物および医薬組成物を提供する。

Description

本発明は、膵臓への、および特には例えば膵管腺癌（ＰＤＡＣ）などの膵臓がんの治療のための治療薬の超音波媒介デリバリーに関する。したがって、本発明は、治療薬のデリバリーにおける使用のための、および、膵臓がん、例えばＰＤＡＣなどの治療における使用のためのクラスタ組成物および医薬組成物を提供する。

膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、５年生存率が９％未満である、最も致命的なタイプの悪性腫瘍のうちの一つである。現在の臨床治療レジメンは、放射線治療ありまたはなしの、化学療法および／または手術を含む。手術は治癒への唯一の可能性を残しているが、しばしば後期での診断およびＰＤＡＣの侵襲的な性質に起因してオプションとはなりにくい。がんが手術の可能性を許すような治療の後にダウングレードしたならば、全体的な生存率は顕著に上昇し、これは、腫瘍体積の重要性を示している。ＰＤＡＣは、従来の薬剤および標的薬剤に対して非常に抵抗性であることが知られている。このような化学療法抵抗性の理由は多因子的であると考えられるが、主要な機構の一つは、腫瘍床への薬剤浸透性の低い割合であると考えられている。このような極度の薬剤耐性の主な理由の一つは、ＰＤＡＣ細胞の周囲に保護的なバリアを形成する線維形成性および血管に乏しい間質である。したがって、治療薬、例えば化学療法薬を用いてこのような固形腫瘍を効果的に治療することへの主要な制限は、腫瘍間質液圧、血管化または灌流の欠失、または密な間質マトリックスの存在に起因した標的の場所への不適切なデリバリーである。間質微小環境は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、活性化された線維芽細胞および筋線維芽細胞、炎症細胞、および膵臓組織の正常な構造を歪める血管およびリンパ管で構成されている複雑な構造である。腫瘍細胞と間質のあいだの複雑な相互関係は、がん細胞の運動性、低酸素への抵抗性および間質新血管生成を促進する。これらの物理的バリアは、大部分の化学療法薬剤にとって腫瘍へのアクセスを不可能なものとしている。結果として、化学療法治療は、インビボにおいても同様の運命をたどり、補償のための用量の増加は全身性の副作用を悪化させる。したがって、腫瘍の機械的な破壊または薬剤の向上されたデリバリーを可能にするような腫瘍血管化の正常化は、より良好な臨床的見込みを提供し得る。したがって、改良されたドラッグデリバリーは、ＰＤＡＣを患う患者における化学療法の治療効果において重要なインパクトを与え得る。

固形腫瘍における標的ドラッグデリバリーに特に焦点を当てた治療オプションは、現在試験中であり、ナノ粒子、分子標的、および超音波またはマイクロバブル媒介の治療すなわちソノポレーションなどを含む。ソノポレーションは、特定の位置において薬剤の血管バリアへの浸透性および血管外漏出を増大させる生体力学的効果を引き起こすために、気体のマイクロバブルが血管系中に注入され、超音波によって刺激される（ＵＳ）方法である。マイクロバブルは、安定化されたガスバブル（直径２～３μｍ）であり、血管内に注入され、典型的には、周知の副作用なしにインビボで１～２分まで安定である。超音波の適用によって、これらのマイクロバブルは、振動し、そして、近くの内皮／血管壁と相互作用して様々な生体力学的効果によって穿孔を形成すると考えられている。相互作用は、血管区画からの薬剤の血管外漏出、細胞内薬剤取り込みの増大を可能にせしめ、および、治療薬が血管バリアだけでなく組織中により深く浸透することを可能にせしめ得る。この技術が有望であることが示されている一方で、ソノポレーションの本来の可能性は、治療増強のためではなく超音波イメージングのためにデザインされ、および最適化されている市販のマイクロバブルの使用に起因して限られている。この結果、実質的なリサーチは、超音波媒介の、標的化されたおよび工場された治療のために最適化された「次世代の」マイクロバブルを開発することに注力されている。主な制限は、マイクロバブルのサイズである。小さいと、それらが血管区画内で引き起こすことのできる生体力学的効果のレベルは限定的である。さらに、内皮壁との物理的な接触が制限され、そして、脈管壁からの距離に伴って生体力学的効果は典型的には指数関数的に減少するため、穿孔を引き起こす効率が限定的である。

近年、特許文献１において、超音波媒介の、標的化されたデリバリーの概念が提案され、ここで、マイクロバブル／マイクロ液滴クラスタ組成物が治療薬と共に投与され、そして、標的とされた病理の超音波照射が、治療薬単独の場合と比較して治療効果の増大を導き得る。音響クラスタ療法（ＡＣＴソノポレーションまたはＡＣＴ）と称される本概念は、その後、一連の前臨床的原理証明および概念実証の研究において調べられてきた。例えば、S. Kotopoulisら、Acoustic Cluster Therapy (ACT（登録商標）) induces transient tumour volume reduction in a subcutaneous xenograft model of pancreatic ductal adenocarcinoma. J Control Release, 245 (2016) 70-80（非特許文献１）は、マウスにおけるＰＤＡＣの治療のためにＡＣＴがパクリタキセルと組み合わされる前臨床試験を記載している。残念なことに、この研究におけるいくつかの制限のため、薬剤単独の場合と比較した薬学的効果の増大は、腫瘍成長速度の少しの減少というわずかなものであり、生存期間における改善および完全奏効は得られなかった。

上記を鑑みて、新規かつ代替的な組成物および例えばＰＤＡＣなどの膵臓がんを患う対象の治療のための方法のためにまだ達成に至っていない重要な必要性が存在する。

国際公開第２０１５／０４７１０３号

J Control Release, 245 (2016) 70-80

本発明の目的は、すい臓がんを患う対象の治療、および特には膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療における使用のための組成物および方法を提供することである。実施された研究、および、新規に計画された研究に基づき、発明者は、音響クラスタ療法がＰＤＡＣの治療において有効であること、ならびに、治療薬単独で対象を処置した場合と比較して、同時投与された治療薬の向上した治療効果を提供する。

すい臓への治療薬のデリバリーおよびすい臓がんの治療を向上させるクラスタ組成物を含む医薬組成物が、本発明において同定された。これは、マイクロバブル／マイクロ液滴クラスタを含む投与された医薬組成物からインビボにおいて大きなフェーズシフトバブルを生成するＡＣＴ技術を使用しており、これは、別個で、事前に、および／または、共に、および／または、事後に、投与された治療薬のデリバリーを可能にする。本方法は、治療薬単独の使用に対して、治療効果において顕著な向上を提供する。

一態様において、本発明は、すい臓がんの治療方法における使用のための医薬組成物を提供し、ここで、該医薬組成物は、
（ａ）水性の生体適合性溶媒中のクラスタの懸濁液を含むクラスタ組成物であって、該クラスタが１～１０μｍの範囲の平均直径、および０．９より小さい円形度を有し、ならびに、
（ｉ）ガスマイクロバブルと該マイクロバブルを安定化するための第１の安定化剤とを含む第１の成分、および
（ii）油相を含むマイクロ液滴と該マイクロ液滴とを安定化するための第２の安定化剤とを含む第２の成分であって、該油が、該ガスマイクロバブル中に拡散することのできるために少なくとも一時的にそれらのサイズを増大させる拡散性の成分を含む第２の成分
を含み、該第１および第２の成分の該マイクロバブルおよびマイクロ液滴が、反対の表面電荷を有し、および、静電的相互作用を介して該クラスタを形成しているクラスタ組成物、ならびに
（ｂ）（ａ）とは別個の組成物として提供される、化学療法薬および免疫療法薬またはそれらの組み合わせから選択される治療薬
を含む。

本発明はさらに、
（ａ）水性の生体適合性溶媒中のクラスタの懸濁液を含むクラスタ組成物であって、該クラスタが１～１０μｍの範囲の平均直径、および０．９より小さい円形度を有し、ならびに、
（ｉ）ガスマイクロバブルと該マイクロバブルを安定化するための第１の安定化剤とを含む第１の成分、および
（ii）油相を含むマイクロ液滴と該マイクロ液滴とを安定化するための第２の安定化剤とを含む第２の成分であって、該油が、該ガスマイクロバブル中に拡散することのできるために少なくとも一時的にそれらのサイズを増大させる拡散性の成分を含む第２の成分
を含み、該第１および第２の成分の該マイクロバブルおよびマイクロ液滴が、反対の表面電荷を有し、および、静電的相互作用を介して該クラスタを形成しているクラスタ組成物、ならびに
（ｂ）（ａ）とは別個の組成物として提供される、化学療法薬および免疫療法薬またはそれらの組み合わせから選択される治療薬
を含む医薬組成物を該対象に投与する工程を含む、すい臓がんを患う対象の治療のための方法を提供する。

図１は、クラスタサイズ対インビボでの製品有効性の視覚化を提供する図である。Ｙ軸は、ＵＳイメージングからのＧｒｅｙ Ｓｃａｌｅ増強の算定された相関係数（すなわち、活性化後に堆積されたバブルの量）を示し、およびＸ軸は、μｍでのクラスタ直径を示す。 図２Ａは、超音波活性化および増強を含むＡＣＴソノポレーション手順の適用のために、実施例２および実施例３の研究において使用される装置のセットアップ写真を提供する図である。 図２Ｂは、超音波活性化および増強を含むＡＣＴソノポレーション手順の適用のために、実施例２および実施例３の研究において使用される装置のセットアップスケッチを提供する図である。 図２Ｃは、ＰＤＡＣの患者由来異種移植マウスモデルの治療における治療効果が評価される、実施例２の研究のための治療スケジュールの概要を提供する図である。 図３は、実施例２の研究からの結果を提供する図である。Ｙ軸は、リポソームイリノテカン（黒四角）、生理食塩水対照（白四角）、およびＡＣＴと組み合わされたリポソームイリノテカン（黒丸）を用いたマウスでの膵管腺癌の治療に関する時間の関数としての腫瘍体積を示す。Ｘ軸は治療開始からの日数での時間を示す。治療は０日目、７日目、１４日目に行った。 図４は、実施例２の研究からの結果を提供する図である。Ｙ軸は、ナブ－パクリタキセル／ゲムシタビン（黒四角）、生理食塩水対照（白四角）、ナブ－パクリタキセル／ゲムシタビン投与前のＡＣＴ（白丸）、およびナブ－パクリタキセルの後のＡＣＴ（黒丸）を用いたマウスでの膵管腺癌の治療に関する時間の関数としての腫瘍体積を示す。Ｘ軸は治療開始からの日数での時間を示す。治療は０日目、７日目、１４日目に行った。 図５は、化学療法レジメンＦＯＬＦＯＸ（レコボリンおよびオキサリプラチンの２時間輸液の後、２時間でのフルオロウラシル（５－ＦＵ）のボーラス注入）、次いでフルオロウラシルの４８時間輸液の投与のあいだに行われたＡＣＴ治療の一例からのグラフを提供する図である。パネルＡ：各ＡＣＴ治療は、a.；クラスタ組成物の注入、次いでｂ.：通常の医療用イメージングＵＳ超音波照射によるクラスタの活性化、およびｃ.：低周波ＵＳ超音波照射による増強を含む。パネルＢ：Ｙ軸は、ピークに対する血漿濃度を示す。Ｘ軸は、分での時間を示す。全ての３つの薬剤をカバーするために、約５０分、８０分、１１０分で３回のＡＣＴ手順が実行される。 図６は、ゲムシタビンおよびナブ－パクリタキセルの化学療法併用レジメン：３０分でのナブ－パクリタキセルの輸液の後、３０分でのゲムシタビンの輸液、を用いた治療スケジュールの一例からのグラフである。ＡＣＴ手順は、グレーのＡＣＴ（登録商標）ソノポレーションバーで示されるように、化学療法薬の投与のあいだに、３回適用される。パネルＡ：各ＡＣＴ手順は、a.：クラスタ組成物の注入、ｂ.：通常の医療用イメージング超音波の６０秒間の照射を用いたクラスタの活性化、ｃ.：４００～６００ｋＨｚの超音波の５分間の照射を用いた増強工程から構成される。パネルＢ：Ｙ軸は、投与された化学療法薬の血漿濃度をピークのパーセントで示し、およびＸ軸は、分での時間を示す。 図７は、実施例３の研究からの結果を提供する図である。ここで、Ｙ軸は、腫瘍溶解性レオウイルス（黒三角）、生理食塩水対照（黒四角）、およびＡＣＴと組み合わされた腫瘍溶解性レオウイルス（黒丸）を用いたマウスでの肝細胞癌（ＨＣＣ）の治療に関する時間の関数としての腫瘍体積を示す。Ｘ軸は治療開始からの時間を示す。X軸の下の灰色の三角形は治療日を示す。

定義
本明細書で使用される、音響クラスタ療法（ＡＣＴ）は、以下でさらに詳細に定義されるが、少なくとも一つの治療薬（化学療法薬または免疫療法薬）と組み合わせてクラスタ組成物（以下の定義を参照）の投与、および、その後の標的とされる病理的領域（例えば腫瘍など）への超音波の適用を含む。

本明細書で使用される、「対象（subject）」とは、任意のヒト、または、処置または治療のために選択される非ヒトの動物個体を意味し、および、患者、特には例えばＰＤＡＣなどのすい臓がんと診断されたヒトの患者を含み、またそれに限定され得る。

本明細書で使用される、用語「治療的に有効な量（therapeutically effective amount）」とは、任意の治療に適用され得る、合理的な利益／リスク比での、対象における所望の治療効果を呈するために効果的である治療薬の量を意味する。

用語「マイクロバブル（microbubble）」または「通常の、造影剤のマイクロバブル（regular, contrast microbubble）」は、本明細書において、０．２～１０ミクロンの範囲の直径、典型的には２～３μｍのあいだの平均直径を有するマイクロバブルを記載するために使用される。「通常の、造影剤のマイクロバブル」は、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（登録商標）（GE Healthcare）、Ｏｐｔｉｓｏｎ（GE Healthcare）、Ｓｏｎｏｖｕｅ（Bracco Spa）、Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）（Lantheus Medical Imagin）、Ｍｉｃｒｏｍａｒｋｅｒ（VisualSonics Inc.）およびＰｏｌｙｓｏｎ Ｌ（Miltenyi Biotec GmbH）などの市販の薬剤を含む。

用語ＨＥＰＳ／ＲＦＢは、本明細書において、２ｍＬの水を用いて第１の成分（実施例１において提供される）を再構成することによって形成されるマイクロバブルを記載するために使用される。

本明細書における用語「フェーズシフトバブル（phase shift bubbles）」、「大きなフェーズシフトバブル（large, phase shift bubbles）」、「大きな活性化バブル（large, activated bubbles）」および「活性化されたバブル（activated bubbles）」は、クラスタ組成物の超音波（ＵＳ）により誘導される活性化の後で形成される大きな（１０μｍより大きい）バブルを記載するために使用される。

用語「マイクロ液滴（microdroplet）」は、本明細書において、０．２～１０ミクロンの範囲の直径を有するエマルションのマイクロ液滴を記載するために使用される。

「超音波照射（insonation）」または「ＵＳ超音波照射（US insonation）」は、超音波への曝露、または超音波を用いた治療を記載するために使用される。

用語「通常の医学的イメージング超音波（regular medical imaging ultrasound）」は、医学的イメージングのためのシェルフＵＳスキャナーおよびプローブからの超音波を記載するために使用される。すなわち、１～１０ＭＨｚのあいだの周波数および１．９より小さい、好ましくは０．７より小さい、およびさらに好ましくは０．４より小さいＭＩ。

用語「沈殿物トレーサー（deposit tracer）」は、本明細書において、微小循環中の大きなバブルの一時的な機械的な捕捉は、組織中でのフェーズシフトバブルの局部的な堆積は、活性化されたバブルの堆積の際に組織の微小循環を通して流れた血液の量を反映しているであろうことを暗示しているという意味において、活性化されたフェーズシフトバブルに関連して使用される。したがって、トラップされた「堆積された（deposited）」フェーズシフトバブルの数は、堆積時の組織灌流に直線的に比例するであろう。

用語「フェーズシフト（プロセス）（phase shift (process)）」は、本明細書において、物質の液体から気体状態へのフェーズ遷移を記載するために使用される。特には、ＵＳ超音波照射におけるクラスタ組成物のマイクロ液滴の油成分の液体から気体への状態の変化である遷移（プロセス）。

用語「二相性（bi-phasic）」は、例えばクラスタ組成物のマイクロバブル（気体）およびマイクロ液滴（液体）成分などの２相の状態、特には液体および気体状態を含むシステムを意味している。

本明細書において、用語「治療的送達／治療薬（therapy delivery/therapeutic agent(s)）」および「薬剤デリバリー／薬剤（drug delivery/drug(s)）」は、共に、薬剤分子、ナノ粒子、ナノ粒子デリバリーシステム、および、少なくとも一つの治療的に活性化された薬剤を含むリポソームデリバリーシステムを含むものとして理解される。

用語「第１の成分（1st component）」（または第１の成分、またはＣ１）は、本明細書において、分散された気体（マイクロバブル）成分を記載するために使用される。用語「第２の成分（2nd component）」（または第２の成分、またはＣ２）は、本明細書において、拡散性成分を含む分散された油相（マイクロ液滴）成分を記載するために使用される。

用語「クラスタ組成物（cluster composition）」は、本明細書において、第１の成分（マイクロバブル）および第２の成分（マイクロ液滴）の、例えば混合などの組み合わせの結果、生じる組成物を記載するために使用される。したがって、本明細書においてさらに説明される特徴を有するクラスタ組成物は、対象への投与ができる状態であり、および、音響クラスタ療法における使用のための配合組成物を意味している。

用語「拡散性成分（diffusible component）」は、本明細書において、一時的にそのサイズを増大させている、第１の成分中のマイクロバブル内へとインビボで拡散することのできる第２の成分の油相の化学成分を記載するために使用される。

本明細書において使用される用語「医薬組成物（pharmaceutical composition）」は、従来の意味をもち、そして特には、哺乳類への投与に適した形状にある。組成物は好ましくは、２つの別個の組成、クラスタ組成物（ａ）および治療薬（ｂ）を含み、これらは共に非経口注入、腹腔内注入、または筋肉内注入などを介してなど、同一または異なる投与経路のどちらかによる、哺乳類への投与に適切である。「哺乳類への投与に適した形状（in a form suitable for mammalian administration）」との記載は、滅菌された、パイロジェンフリーの、過度に有害な効果または悪影響を作り出す化合物がない、生体適合性のｐＨ（約ｐＨ４．０～１０．５）で製剤化されている組成物を意味する。このような組成物は、体液（例えば血液など）との接触において沈殿が起きないように製剤化されており、生物学的に適合性の賦形剤のみを含み、および好ましくは等張性である。

本明細書における用語「ソノメトリー（システム）（sonometry (system)）」は、音響技術を使用して活性化されたフェーズシフトバブルを動的に分類しおよび計測するためのインビトロ測定システムを意味している。

用語「反応性（reactivity）」は、本明細書において、第１の成分中のマイクロバブルおよび第２の成分中のマイクロ液滴の混合によってマイクロバブル／マイクロ液滴を形成する能力を記載するために使用される。コールターカウンティングは、Ｃ１およびＣ２中のマイクロバブルおよびマイクロ液滴の濃度およびサイズ分布の定量、ならびに、クラスタ組成物（医療品、ＤＰ）中の粒子の特性の評価に適切である。クラスタ組成物の反応性（Ｒ）は、
Ｒ＝（Ｃ_c1＋Ｃ_c2－Ｃ_DP）・１００／（Ｃ_c1＋Ｃ_c2）
（式中、Ｃ_c1、Ｃ_c2およびＣ_DPは、Ｃ１、Ｃ２およびＤＰにおいてそれぞれ観測される濃度の数字である）
によって定義される。反応性はしたがって、ＤＰ中のクラスタ形状に含まれるＣ１およびＣ２中のマイクロバブルおよびマイクロ液滴それぞれがどのくらいであるかという測定である。反応性はまた。これらのクラスタがどのくらい大きいか（すなわり、どのくらいの数の個々のマイクロバブルおよびマイクロ液滴が単一のクラスタを含んでいるか）にも関連している。Ｃ１、Ｃ２およびＤＰのコールター分析から、反応性は簡易に算出され得る。

本明細書における用語「マイクロバブル／マイクロ液滴クラスタ（microbubble/microdroplet cluster）」または「クラスタ（cluster）」は、静電引力によって、実体物として凝集されている、単一の粒子中で恒久的に一緒にまとまっているマイクロバブルおよびマイクロ液滴のグループを意味している。本明細書における用語「クラスタリング（clustering）」は、第１の成分中のマイクロバブルおよび第２の成分中のマイクロ液滴がクラスタを形成するプロセスを意味している。

医学的な超音波において、音響出力は、通常「メカニカルインデックス（Mechanical index）」（ＭＩ）によって記載される。本パラメータは、ＭＨｚで表される超音波音場の中心周波数（Ｆ_c）の平方根である０．３ｄＢ／ｃｍ／ＭＨｚで除した超音波音場（ＰＮＰ）内での最大負音圧として定義される［American Institute of Ultrasound in Medicine. Acoustic Output Measurement Standard for Diagnostic Ultrasound Equipment. 1st ed. 2nd ed. Laurel, MD: American Institute of Ultrasound in Medicine; 1998, 2003］。

医学的なＵＳイメージングのあいだの規則的な要件は、１．９未満のＭＩを使用することである。マイクロバブル造影剤を用いたＵＳイメージングのあいだ、０．７より小さいＭＩが微小出血および不可逆的な血管損傷などの生物的な悪影響を避けるために推奨されており、そして、０．４より小さいＭＩを使用することが、「最も良い手法（best practice）」と考えられている。

本明細書のＡＣＴ手順の意味において、用語「活性化（activation）」または「活性化工程（activation step）」は、超音波照射によるマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタのフェーズシフトの誘導、すなわち大きな、活性化されたバブルの生成を意味する。

用語「周波数（frequency）」は、毎秒当たりの（超音波）サイクル数（Ｈｚ）として定義される。本明細書中で使用される場合、本用語は、適用された超音波音場の中心周波数を意味する。

本明細書のＡＣＴ手順の意味において、用語「増強（enhancement）」または「増強ステップ（enhancement step）」は、大きな活性化されたバブルの体積振動の誘導を意味し、ＵＳ照射によって生体力学的効果が確認される。

発明の詳細
本発明は、すい臓がん、および特には膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を患う対象の治療方法における使用のためのクラスタ組成物を提供する。本発明は、マイクロバブル／マイクロ液滴クラスタを含む投与された医薬組成物からインビボにおいて大きなフェーズシフトバブルを生成するＡＣＴ技術を使用しており、これは、別個で、事前に、および／または、共に、および／または、事後に、投与された治療薬のデリバリーを可能にする。治療薬の治療効果は、以下でさらに説明されるように、微小血管中での生体力学的機構に起因して、薬剤単独の投与と比較して顕著に増加される。活性されたフェーズシフトバブルは、典型的な、通常の造影剤のマイクロバブルよりも直径で約１０倍大きい。

すい臓がんは、ＰＤＡＣ、非腺癌、および神経内分泌腫瘍を含む任意のタイプのすい臓のがんを含み、好ましくは、すい臓がんはＰＤＡＣである。ＰＤＡＣは、その名の由来である膵管（pangreatic duct）または膵管（pancreatic ductules）の細胞から上皮性腫瘍が発生する癌の形状である。膵管は、腺房細胞内で産生された消化酵素および重炭酸イオンがそれを通じて小腸に到達する導管として作用する。膵管細胞および腺房細胞は共に「外分泌（exocrine）」膵臓を構成し、ここから膵臓新生物のほとんど大部分が発生する。腺癌は、新生組織形成、すなわち上皮組織の異常かつ過剰な増殖と定義される。いったん、ＰＤＡＣの診断が確定または強く疑われると、腫瘍の病期分類が一般的に試みられる。これは主に、腹部の三相性ＣＴスキャンを通じて達成される。American Joint Committee on Cancer（AJCC）の第７版膵臓がん病期分類は、標準的な「ＴＮＭ」（腫瘍の大きさ、リンパ節の状態、転移）フォーマットに従っており、そして、腫瘍を病期分類し、および予後を判定するために通常使用される。ステージ０では、異常細胞は膵臓の内壁で発見される。これらの異常細胞はがん化し得、そして、近くの正常組織内に広がり得る。ステージ０はまた、ｉｎ ｓｉｔｕがん腫とも呼ばれる。ステージＩでは、がんが形成されているが、膵臓内でのみ発見される。ステージＩは、腫瘍の大きさに依存して、ステージＩＡおよびＩＢへと分けられます。ステージＩＡ：腫瘍は、２ｃｍまたはそれより小さい。ステージＩＢ：腫瘍は、２ｃｍよりも大きいが、４ｃｍよりは大きくない。ステージIIは、腫瘍の大きさとがんが広がっている場所に依存して、ステージIIＡおよびIIＢに分けられる。ステージIIＡ：腫瘍は、４ｃｍより大きい。ステージIIＢ：腫瘍は任意のサイズであり、および、がんが１～３個の近くのリンパ節に広がっている。ステージIIIでは、腫瘍は任意のサイズであり、および、がんが４個以上の近くのリンパ節、または膵臓の近くの主要な血管に広がっている。ステージIVでは、腫瘍は任意のサイズであり、および、がんが、例えば肝臓、肺、または腹膜腔（腹部の臓器の大部分を含む体腔）などの身体の他の部位広がっている。再発性膵臓がんは、治療された後に再発したがんである。がんは、膵臓に、または身体の他の部位に再発し得る。

本発明の使用のための組成物および治療の方法は、全てのステージのＰＤＡＣにおいて有用であり得、そして、一またはそれ以上のステージ０、Ｉ、II、III、またはIVの治療において使用され得る。ある実施形態において、本発明の医薬組成物は、ステージ０、Ｉ、II、III、またはIVのどれかのＰＤＡＣの治療のためのものである。ある実施形態において、医薬組成物は、より早期のステージにおけるＰＤＡＣの治療、例えばステージ０、Ｉ、またはIIにおけるＰＤＡＣの治療のためのものである。

本発明は、すい臓への治療薬のデリバリーの方法における使用のための、および、膵臓がんの治療における使用のためのクラスタ組成物を含む医薬組成物を提供し、ここで該方法は、投与されたクラスタ組成物からのインビボでの大きなフェーズシフトバブルを生成するためのフェーズシフト技術を含み、別に投与された治療薬のデリバリーおよび取り込みを可能にする。本発明の使用のための組成物および方法は、別個に共投与された治療薬の治療効果を高め、本発明の組成物の使用なしの治療と比較して改良された治療結果を提供する。

音響クラスタ療法（ＡＣＴ）は、腫瘍血管系における局所的な開口または穿孔を形成し、血管透過性の一時的な増大を導き、これによってドラッグの腫瘍床へのより良好な浸透を可能にするために、超音波の適用によって活性化されたマイクロバブル、およびより特にはマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタを利用する新規の技術である。本発明は、前臨床研究からの発見に部分的に基づいており、ここで、出願人は、ＰＤＡＣのための患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウスモデルにおいて臨床的に使用される化学療法レジメンの治療効果を増強するためのＡＣＴの活性について調べていた。出願人は、ＡＣＴ概念が、改善された治療薬の取り込みのための生物学的障壁を克服するための有効な方法であることを見出した。このことは、ＰＤＡＣ細胞の周囲に保護バリアを形成する癒着性かつ血管新生に乏しい少ない間質に起因する、腫瘍床への一般的に低い薬剤浸透率のため、膵臓癌、および特にはＰＤＡＣの治療に特に有益であることが見出された。Kotopoulisらは、ステージIIIのＰＤＡＣの治療のためのＡＣＴの使用の可能性について簡潔に言及しているが、本疾患に必然的に伴い得るであろう非常に特異的な治療利益、間質の遷移形成を克服するためのＡＣＴの使用に対して指摘しておらず、ましてや、本疾患の早期または後期のステージの治療について提案もしていない。さらに、Kotopoulisらは、１つの特定の低分子薬剤を挙げているだけであり、薬剤のリポソーム製剤などの代替的な、より大きな分子／構成物の治療薬を用いるＡＣＴ概念の使用、または、例えば腫瘍溶解ウイルスまたはチェックポイント阻害剤などの免疫療法薬の使用は教示していない。

本発明のＡＣＴ技術を参照する場合、治療薬の別個での投与に加えて、以下でより詳細に説明される事前に混合されたクラスタ組成物の投与を含む。治療薬は、治療薬は、標準治療に従って、すなわち、それぞれの製品特性概要（ＳｍＰＣ）に従って投与される。本発明の一実施形態において、これは、対象への投与の前に、負に帯電したマイクロバブルを正に帯電したマイクロ液滴と混合したクラスタ製剤の使用を含む。投与されたクラスタは、超音波によって活性化され得る。これらのマイクロバブルとマイクロ液滴との混合物は、静電気力によって一緒にまとまり小さなマイクロバブル－マイクロ液滴クラスタを結果として与える。マイクロ液滴は、典型的には、５０℃より低い沸点を有し、および、血中溶解度が低い油成分を含む。クラスタ組成物、すなわち分散は、薬物と一緒の、すなわち治療薬と一緒の投与が意図されている。クラスタ組成物のクラスタが超音波照射されると、振動しているマイクロバブルは、付着されたマイクロ液滴の瞬間的な気化（フェーズシフト）を開始する。結果として得られる拡大されたバブルが、インビボで毛細管サイズの血管内で形成されることが示されており、血管外漏出を可能にし、および超音波照射された組織内での薬剤浸透性を増加させる生体力学的効果を誘導するために低い周波数のＵＳによって励起され得る。

したがって、本発明による膵臓へのドラッグデリバリーおよび膵臓癌の治療は、２つの成分、二相性マイクロバブル／マイクロ液滴製剤システム（すなわち、クラスタ組成物）の使用によって達成され、ここで、第１の成分中のマイクロバブルは、静電引力により、投与前に第２の成分中のミクロンサイズのエマルションマイクロ液滴に物理的に付着される。本発明による、ＰＤＡＣの治療方法における使用のための組成物は、治療薬の改善された取り込みを提供し、その結果、例えば腫瘍体積の減少などを含む有益な治療がもたらされる。

投与前に第１の成分を第２の成分と混合することはマイクロバブル／マイクロ液滴のクラスタの効率的な形成のための前提条件であり、クラスタ組成物は、周囲条件で安定であり得る。クラスタは、拡散性成分の液体から気体への転移（フェーズシフト）を誘導する、低出力の通常の医学的イメージング超音波、すなわち１．９未満、好ましくは０．７未満、最も好ましくは０．４未満のＭＩを用いて、インビボで容易に活性化される。治療薬、すなわち化学療法薬または免疫療法薬、またはそれらの組み合わせは、その承認されたＳｍＰＣに従って別々に投与される。大きな活性化されたバブルは、超音波を照射された組織の微小血管系内に一時的に組み込まれ、そして、低出力、低周波の超音波のさらなる適用により、膵臓の標的組織への薬剤の取り込みを促進する。活性化されたフェーズシフトバブルは、典型的なマイクロバブルよりも直径で約１０倍大きく、この結果、
標的とされる（すなわち超音波照射される）病変部の微小血管系内での活性化されたバブルの一時的な堆積／捕捉、
活性化されたバブルと内皮の近接した接触、
通常の造影剤のマイクロバブルと比較して、慣性キャビテーション機構を回避した、活性化後のＵＳ治療のあいだの桁違いに大きい生体力学的効果、
をもたらす。

クラスタ組成物、すなわち第１の成分および第２の成分の組み合わせは、ガスマイクロバブルおよびオイルマイクロ液滴のクラスタ、すなわち安定したマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタの形状の個々のマイクロバブルおよびマイクロ液滴の懸濁液または分散液である。該クラスタの定量的検出および特性評価のための分析手順は、実施例１に記載されている。本明細書において、用語「クラスタ（clusters）」は、静電引力によって、実体物として凝集されている、単一の粒子中で恒久的に一緒にまとまっているマイクロバブルおよびマイクロ液滴のグループを意味している。クラスタ組成物中のクラスタの内容物およびサイズは、インビトロでの第１および第２の成分の混合の後、ある程度の時間（例えば１時間より長い）にわたって実質的に安定であり、すなわち、それらは自発的に崩壊せず、より大きな凝集体を形成せず、また、自発的に活性化（フェーズシフト）せず、および、希釈後、継続される撹拌のあいだでさえも、ある程度の時間にわたって実質的に安定である。したがって、希釈および／または攪拌を必要とする様々な分析技術を用いて、クラスタ組成物中のクラスタを検出し、および特徴付けることが可能である。さらに、クラスタ組成物の安定性は、必要な臨床処置（例えば、再構成、一回用量の中止および投与など）を行うことを可能にする。第１および第２の成分、ならびにクラスタ組成物は、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って調製される。

例えば、凍結乾燥したマイクロバブル成分をエマルションの形態のマイクロ液滴成分を用いて再構成することなどによる２つの成分の混合（インビトロでの）の後、本発明にしたがって調製されたクラスタ組成物は、その意図される使用に適している使用中安定性を示し、および、成分を混合してから１時間より長い、好ましくは３時間より長いなどの、投与に適した時間ウィンドウのあいだ、安定な特性を示す。クラスタ組成物は、このタイムウィンドウ内に対象に投与され得る。

クラスタ組成物中の各クラスタは、少なくとも１つのマイクロバブルおよび少なくとも１つのマイクロ液滴、典型的には２～２０個の個々のマイクロバブル／マイクロ液滴を含み、および、クラスタは典型的には、１～１０μｍの範囲の平均直径を有し、およびしたがって、血管系内で自由に流れることができる。それらはさらに、特徴付けられ、および、円形度パラメータによって個々のマイクロバブルおよびマイクロ液滴から分離される。二次元形状（例えば、マイクロバブル、マイクロ液滴、またはマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタの射影）の円形度は、形状と同じ面積を有する円の周長を、形状の実際の周長で除した比率である。したがって、真円（すなわち、球状のマイクロバブルまたはマイクロ液滴の二次元射影）は、１の値の理論的円形度を有し、他の任意の幾何学的形状（例えば、クラスタの射影）は、１未満の円形度を有する。本発明の該クラスタは、０．９より小さい円形度を有する。円形度パラメータの定義は、国際公開第２０１５／０４７１０３号にさらに記載されている。

本発明にしたがい、１～１０μｍ、および特には３～１０μｍの範囲の平均サイズを有し、０．９より小さな円形度によって定義されるクラスタを含む組成物は、実施例に示されるように、特に有用であると考えられる。一実施形態において、平均クラスタ直径は、３～１０μｍ、および好ましくは４～９μｍ、より好ましくは５～７μｍの範囲である。このサイズ範囲のクラスタは、活性化前は血管系で自由流動性であり、それらはＵＳ照射によって容易に活性化され、および、それらは、例えば膵臓組織または膵臓癌組織中などにおける微細血管系内で一時的に堆積し、および留まるのに十分に大きい活性化されたバブルを生成する。クラスタ内のマイクロバブルは、診断のための周波数範囲（１～１０ＭＨｚ）において、すなわち活性化に際して、超音波エネルギーの効率的なエネルギー伝達を可能にし、低いＭＩ（１．９より小さい、および好ましくは０．７より小さい、およびより好ましくは０．４より小さい、しかしながら０．１よりは大きい）でエマルションマイクロ液滴の蒸発（フェーズシフト）、ならびに、気化された液体のマイクロバブル内への拡散、および／または、蒸気バブルとマイクロバブルとの間の融合を可能にする。活性化されたバブルは、次いで、マトリックスガス（例えば、血液ガス）の内方拡散により、１０μｍより大きいが４０μｍよりは小さい、直径の体積加重中央値に達するように、さらに拡大する。

すなわち投与前に第１の成分および第２の成分からのクラスタ組成物を調製によるこれらのクラスタの形成は、効率的なフェーズシフト事象のための前提条件であり、および、それらの数およびサイズ特性は、組成物の有効性、すなわちインビボにおける大きな、活性化された（すなわちフェーズシフトされた）バブルを形成する能力に強く関連しており、インビボにおける意図される機能性のための前提条件であることが発見された。数およびサイズ特性は、例えば、これらに限定される訳ではないが、第１の成分中のマイクロバブルと第２の成分中のマイクロ液滴とのあいだの引力の強さ（例えば、マイクロバブルおよびマイクロ液滴のあいだの表面電荷の差など）：マイクロバブルおよびマイクロ液滴のサイズ分布：マイクロバブルおよびマイクロ液滴の比率：および、水性マトリックスの組成（例えば、ｐＨ、緩衝液濃度、イオン強度など）などの種々の処方パラメータによって制御され得る。クラスタ組成物が調製され、および、投与される場合、形成されるクラスタの平均円相当径は、好ましくは３μｍより大きく、より好ましくは５～７μｍのあいだであって、しかしながら１０μｍよりは小さいことが望ましい。また、混合された調製物（クラスタ組成物）中における、３～１０μｍのあいだのクラスタの濃度は、好ましくは、１０００万／ｍＬより大きく、より好ましくは２０００万／ｍＬより大きいべきである。実施例１に示されるように、本発明による使用のためのクラスタ組成物は、第１および第２の成分の混合の後、０～３時間で測定されて、５．８～６．２μｍの平均直径を有する、４０００万～４４００万／ｍＬであるクラスタ濃度を有していた。一実施形態において、出願人の国際公開公報第２０１５／０４７１０３号の表５および表６に示される結果に基づき、投与のための組成物は、５～１０μｍのあいだの直径を有する、少なくとも６０万／ｍＬのクラスタを含むべきである。別の実施形態において、１～１０μｍの範囲のサイズであるクラスタのクラスタ濃度は、少なくとも約２５００万／ｍＬであるべきである。

活性化されたバブルの（インビボにおける）サイズは、第１および第２の成分の種々の処方パラメータおよび調製されるクラスタのサイズ特性を変えることによって設計され得る（実施例１参照）。クラスタは、投与後、臨床用超音波イメージングシステムからなどの、外用超音波エネルギーの適用によって、イメージング制御下で、大きなバブルを生成するために活性化される。生成された大きなフェーズシフトバブルは、典型的には、１０μｍ以上の直径である。診断用イメージングの曝露限界（ＭＩ＜１．９）内に全く問題なく収まる低いＭＩエネルギーレベルが、クラスタを活性化するために十分であり、これは、この技術を、入手可能な他のフェーズ転移技術（例えば音響マイクロ液滴気化法（ＡＤＶ）など）とは顕著に異なる技術にしている。活性化されたバブルのサイズが大きいため、それらは一時的に微小血管系内に留まり、および、クラスタを活性化するための超音波エネルギーの空間的に局所的な適用によって、例えば膵臓などの、興味の対象である組織または器官、より好ましくは膵臓内の癌組織（例えば、腫瘍など）に空間的に局在させられ得る。したがって、クラスタ組成物の投与後、クラスタは、超音波エネルギーの腹部および膵臓の部位に向けた適用によって、膵臓の内部、部位、または近傍で活性化され得る。生成された大きな活性化されたバブル（直径１０μｍ以上）は、低い超音波周波数（１ＭＨｚ以下）で音響共振する。

本発明の使用のための組成物および方法について、低周波超音波の適用による大きな活性化されたバブルのさらなる超音波照射は、治療薬の取り込みをさらに高めることが理解されるであろう、したがって、大きな活性化されたバブルの共振周波数に近い低周波超音波の適用が、膵臓の癌組織の血管系の透過性および／またはソノポレーションおよび／またはエンドサイトーシスを増加させるための機械的および／または熱的な生物学的効果の機構を製造するために使用され得、これゆえ、標的とされる組織への標的組織への治療薬のデリバリーおよび保持を増加させることが見出された。したがって、０．０５～２ＭＨｚの範囲、好ましくは０．１～１．５ＭＨｚの範囲、より好ましくは０．１～１．０ＭＨｚの範囲、さらに好ましくは０．２～１ＭＨｚの範囲、最も好ましくは０．４～０．６ＭＨｚ、例えば特には０．３３～０．６５ＭＨｚなどの範囲の周波数成分が、取り込みを増大させるためのさらなる超音波照射において使用される。驚くべきことに、活性化されたバブルが、例えば０．４～０．６ＭＨｚの範囲など、例えば実施例で使用される５００Ｈｚなどの超音波を適用することによる増大される取り込みを誘導するために超音波照射される場合、より大きな治療効果が見出された。およびこれゆえ、間質の線維形成に起因する問題が克服される。超音波誘導は、治療薬が膵臓の腫瘍床により良好に浸透することを可能にすることが見出された。この増大ステップのＭＩは、好ましくは０．５未満、より好ましくは０．４未満、および最も好ましくは０．３未満であるが、０．１５よりは大きく、好ましくは０．２より大きい。増大ステップのあいだに適用されるＭＩが０．２より小さいと、生成される生体力学的効果が不十分になり、したがって、治療的有効性を顕著に低下させることが予期される。

作用の直接的な機構すなわち生成される機械的および／または熱的な生物学的効果が、治療薬のデリバリーを増加させ、治療薬の分布を向上させる一方、これらの生体力学的効果の本質は、クラスタ組成物の化学的属性の直接的な結果、すなわちクラスタの化学組成および特性の結果であることが理解されるべきである。例えば、水性マトリックス中の気体バブルの寿命は、マトリックス中の気体の溶解度および拡散係数に反比例し、および、気体の密度に比例する。したがって、低い溶解性および拡散性を有する重い気体から作られたバブルは、高い溶解性および拡散性を有する軽い気体から作られたバブルよりも、より大きく成長し、長いあいだ持続する。例えば、５μｍのパーフルオロブタンのマイクロバブルは、５μｍの空気のマイクロバブルより水中で５００倍も長く持続され得る。したがって、マイクロ液滴成分の化学組成は、インビボにおける活性化されたバブルの寿命、およびしたがって、誘導され得る生体力学的力のレベル、および、ＡＣＴ法を用いて達成され得る治療効果のレベルを支配するであろう。このことから、パーフルオロオイルは、それらからのガスが非常に低い水への溶解性および拡散性、ならびに高い密度を有するため、第２の成分のマイクロ液滴における使用のために特に有用であろう。

本発明の組成物および方法を、自由流動性の通常の造影剤マイクロバブルが使用される方法と比較すると、投与される本発明のクラスタからインビボで生成される大きなフェーズシフトマイクロバブルは、血管のセグメント内に取り込まれ、および、活性化されたバブル表面は、内皮との密接な接触にある。加えて、活性化されたバブルの体積は、典型的には、通常のマイクロバブルのものの１０００倍である。同一の機械的指数（ＭＩ）において、両方のバブルのタイプにおける共鳴周波数（フェーズシフトマイクロバブルとしては０．５ＭＨｚ、および、通常の造影剤マイクロバブルとしては３ＭＨｚ）に近い周波数で超音波照射される場合、振動中の絶対体積変位（すなわち発揮される生体力学的力）は、フェーズシフトバブルにおける変位が通常の造影剤マイクロバブルにおける変位よりも３桁大きいことが示された。したがって、フェーズシフトバブルの超音波照射は、通常の造影剤マイクロバブルの超音波照射のあいだとは全く異なるレベルの、顕著により大きなサイズおよび深い浸透性を伴う、生体力学的効果を作り出すであろう。自由流動性の通常の造影剤マイクロバブルで観察される生物学的効果は、おそらくキャビテーション機構に依存しており、例えば微小出血および不可逆的な血管損傷などの安全性の懸念がある。しかしながら、クラスタからのより大きなフェーズシフトバブルは、より穏やかな様式で（より低いＭＩ、例えば０．４より小さい）振動され得、キャビテーション機構を回避しながらも、血管系からの、および膵臓の標的組織内への薬剤の取り込みを増大させるために十分な機械力を依然として誘導し得る。大きなフェーズシフトバブルの捕捉はまた、堆積トレーサーとして作用するであろう。これはさらに、活性化されたクラスタの数および組織の灌流を定量化を可能とし、ならびに、治療される病変部の空間的範囲を同定するための組織血管系の造影剤イメージングを可能にする。

投与されたクラスタの化学組成、およびクラスタの活性化のあいだに起こるプロセスは、クラスタの効果にとって極めて重要である。例えば、カプセル化された油滴の化学的性質は、ＵＳ照射に際して堆積する活性化されたバブルの量、および、インビボでのそれらの寿命に影響を与える。油の蒸気圧、沸点、および水溶性などの物理化学的特性はすべて、堆積する活性化されたバブルの量および堆積していた時間と相関している。Ｃ４～Ｃ６のホモログであってパーフルオロ炭化水素鎖では、水溶性および蒸気圧が低下し、かつ沸点が上昇するにつれて、活性化されたバブルの量よびそれらの寿命が、鎖長に依存して増大する。さらに、クラスタの活性化された大きなバブルは、血管系の細胞に対して機械的に作用し、生化学的シグナルを発生させる可能性があり、これにより治療薬の増大された取り込みが導かれることが留意されるべきである。

クラスタ組成物は、制御された方法でクラスタ化およびフェーズシフトするように設計される。標的とされる膵臓病変部で、例えば標準的な医療用イメージング周波数および強度などの超音波に暴露されると、投与されたクラスタ組成物のマイクロバブルは、付着したオイルマイクロ液滴に音響エネルギーを伝達し、および、蒸発シード種として作用するか、または、油が液体から気体へのフェーズシフト（気化）を受けるようにマイクロバブルと結合することができる。得られたバブルは、油の気化による初期の急激な膨張を受け、それに続く血液ガスの内方拡散に起因するよりゆっくりとした膨張を経て、および約１分間以上、好ましくは２～３分間以上、最も好ましくは３～６分間以上、一時的に微細循環（大動脈および毛細血管網）を遮断する。本発明の方法において、または使用のための医薬組成物において、治療薬は、例えば、クラスタ組成物と共投与または前投与または後投与されるなどしてさらに対象に投与される。クラスタは、外用超音波エネルギーの適用によって、大きなバブルを生成するために活性化され、そして、これらは腫瘍（例えば、膵臓内）の微小血管系内に捕捉される。さらに、捕捉後の低周波超音波の適用は、膵臓の標的組織への治療薬の浸潤を促進する。したがって、腫瘍間質液圧、血管化または灌流の欠如、または高密度間質マトリックスの存在のためであろうと、標的位置への不十分な送達による、膵臓の固形腫瘍を効果的に治療することにおける既存技術の主な制限は、治療薬の腫瘍へのアクセスのしやすさが顕著に増大されることが判明したため、本発明の技術によって克服され得る。

クラスタ組成物の第１の成分
第１の成分は、気体のマイクロバブルおよびマイクロバブルを安定化するための第１の安定化剤を含む。したがって、第１の成分は、分散された気体および気体を安定化するための材料を含む注入可能な水性媒体である。マイクロバブルは、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（登録商標）、Ｏｐｔｉｓｏｎ、Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）またはＳｏｎｏｖｕｅなどのいくつかの臨床用途に使用するために、市販され、および承認されている従来の超音波造影剤、または、ＭｉｃｒｏｍａｒｋｅｒおよびＰｏｌｙｓｏｎ Ｌなどの前臨床用途に用いられる類似の薬剤に類似していてもよい。任意の生体適合性のガスが、気体分散液中に存在していてもよく、ここで、本明細書中で使用される用語「気体（gas）」は、３７℃の通常のヒトの体温で、少なくとも部分的に、例えば実質的にまたは完全に、気体状（蒸気を含む）の形状にある任意の物質（混合物を含む）を含む。したがって、気体は、例えば、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；例えばヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトンなどの不活性ガス；例えば六フッ化硫黄、十フッ化二硫黄または五フッ化トリフルオロメチル硫黄などのフッ化物；六フッ化セレン；例えばメチルシランまたはジメチルシランなどの任意にはハロゲン化されていてもよいシラン；低分子量炭化水素（例えば、７個までの炭素原子を含む）、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタンまたはペンタンなどのアルカン、例えばシクロプロパン、シクロブタンまたはシクロペンタンなどのシクロアルカン、例えばエチレン、プロペン、プロパジエンまたはブテンなどのアルケン、または、例えばアセチレンまたはプロピレンなどのアルキン、例えばジメチルエーテルなどのエーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化された低分子量炭化水素（例えば、７つまでの炭素原子を含む）；または、任意の上述のものの混合物である。好ましくは、気体はハロゲン化された気体であり、およびより好ましくはペルフルオロ化ガスである。優位には、ハロゲン化された気体中のハロゲン原子の少なくともいくつかがフッ素原子であり：したがって、生体適合性ハロゲン化炭化水素ガスは、例えば、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロルテトラフルオロエタン、クロロトリフルオロエチレン、フルオロエチレン、エチルフルオライド、１，１－ジフルオロエタンおよびパーフルオロカーボンから選択され得る。代表的なパーフルオロカーボンとしては、例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン（例えば、パーフルオロ－ｎ－ブタン、任意にはパーフルオロ－イソ－ブタンなどの他の異性体との混合物）、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサンまたはパーフルオロヘプタンなどのパーフルオロアルカン；例えばパーフルオロプロペン、パーフルオロブテン（例えば、パーフルオロブト－２－エンなど）、パーフルオロブタジエン、パーフルオロペテン（例えば、パーフルオロペント－１－エンなど）またはパーフルオロ－４－メチルペント－２－エンなどのパーフルオロアルケン；パーフルオロブト－２－インなどのパーフルオロアルキン；および、例えばパーフルオロシクロブタンなどのパーフルオロアルキン；および、例えばパーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサンまたはパーフルオロシクロヘプタンなどのパーフルオロシクロアルカアなどが挙げられる。その他のハロゲン化されたガスとしては、塩化メチル、例えばパーフルオロアセトンなどのフッ素化（例えばパーフルオロ化）ケトン、および、例えば場パーフルオロジエチルエーテルなどのフッ素化（例えばパーフルオロ化）エーテルなどを挙げることができる。

パーフルオロ化されたガス、例えば六フッ化硫黄、ならびに、例えばパーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタンおよびパーフルオロヘキサン等などのパーフルオロカーボンの使用は、そのようなガスを含むマイクロバブルの血流中での高い安定性が認められるという観点で特に有利である。一実施形態において、第１の成分のガスは、フッ化硫黄およびハロゲン化された低分子量炭化水素（例えば、７個までの炭素原子を含む）の群から選択される。血流中に高度に安定なマイクロバブルを形成することを引き起こす物理化学的特性を有する他の気体も同様に有用であり得る。最も好ましくは、分散されるガスは、六フッ化硫黄、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン（すなわちＣ３～Ｃ６のパーフルオロカーボン）、窒素、空気またはそれらの混合物を含む。さらにより好ましくは、分散されるガスは、六フッ化硫黄、パーフルオロプロパン、またはパーフルオロブタン、またはそれらの混合物を含む。およびさらに好ましくは、分散されるガスは、パーフルオロブタンである。

分散されるガスは、任意の便利な形態であってよく、例えば、例えばＳｏｎａｚｏｉｄ（登録商標）、Ｏｐｔｉｓｏｎ、ＳｏｎｏｖｕｅまたはＤｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）などの、ガス含有成分として任意の適切なガス含有超音波造影剤製剤、または、例えばＭｉｃｒｏｍａｒｋｅｒまたはＰｏｌｙＳｏｎ Ｌなどの前臨床薬剤を使用することができる。第１の成分はまた、本明細書において「第１の安定化剤（first stabilizer）」と称される、マイクロバブル分散液を安定化するための材料を含有するであろう。このような配合物の代表的な例としては、例えば第１の安定化剤によって安定化された（例えば少なくとも部分的にカプセル化された）気体のマイクバブル、例えば耐凝集性表面膜（例えばゼラチンなど）、造膜性タンパク質（例えばヒト血清アルブミンなどのアルブミンなど）、ポリマー材料（例えば合成生分解性ポリマー、弾性界面合成ポリマー膜、微粒子生分解性ポリアルデヒト、ポリアミノ酸－多環イミドの微粒子化Ｎ－ジカルボン酸誘導体など）、非重合体および非重合性の壁形成材料、または界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃなどのポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体界面活性剤、ポリマー界面活性剤、または例えばリン脂質などの膜形成性界面活性剤）などが挙げられる。好ましくは、分散されたガスは、リン脂質、タンパク質、またはポリマーで安定化されたガスマイクロバブルの形状である。したがって、一実施形態において、第１の安定化剤は、リン脂質、タンパク質、およびポリマーの群から選択される。特に有用な第１の安定化剤は、例えば天然由来（例えば、大豆または卵黄由来など）、半合成（例えば、部分的または完全に水素化された）および合成のホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸および／またはカルジオリジンなどの正味の全体的な負電荷を有する分子を含むリン脂質を含む界面活性剤の群から選択される。代替的には、安定化のために適用されるリン脂質は、全体的な中性電荷を有していてもよく、および、例えばホスファチジルコリン添加パルミチン酸などの例えば脂肪酸などの負の界面活性剤を添加されてもよく、または、異なるように帯電されたリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンおよび／またはホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジン酸などの混合物であってもよい。第１の安定化剤、すなわち第１の成分のマイクロバブルを安定化させるために、種々の例が、国際公開第２０１５／０４７１０３号、実施例５ならびに表９および１０に示されており、ここでは種々の賦形剤を有する種々のマイクロバブル製剤が試験されている。この結果は、本発明で使用されているＡＣＴ概念が、多種多様なマイクロバブル製剤に、および安定化膜の組成物に関してもまた、適用可能であることを実証している。

分散された気体成分のマイクロバブルのサイズは、マイクロバブル／マイクロ液体クラスタにある場合であってさえも肺システムを介して妨げられることのない移動を可能とするために、好ましくは７μｍ未満、より好ましくは５μｍ未満、および最も好ましくは３μｍ未満であるべきである。

クラスタ組成物の第２の成分
第２の成分は、油相を含むマイクロ液滴と、該マイクロ液滴を安定化させるための第２の安定化剤を含み、ここで油は、拡散性成分を含む。この拡散性成分は、第１の成分のガスマイクロバブル内に拡散して、そのサイズを少なくとも一時的に増大させることができるものである。第２の成分について、「拡散性成分（diffusible component）」は、好適には、例えば投与などに際して、ガスを発生させることができるガス／蒸気、揮発性液体、揮発性固体またはそれらの前駆体であり、そのための主な要件は、その成分が、
分散されたガス中へのガスまたは蒸気分子の内方拡散を促進することができるように、インビボで十分なガス圧または蒸気圧（例えば少なくとも５０ｔｏｒｒ、および好ましくは１００ｔｏｒｒより高い）を有するかまたは作り出すことができるべきであることである。「拡散性成分」は、そのような系においては、拡散性成分の水相における蒸気圧は、非常に希薄なエマルション中であっても、純粋な成分材料の蒸気圧と実質的に等しくなるであろうゆえ、好ましくは、適切な水性媒体中のマイクロ液滴のエマルション（すなわち安定化された懸濁液）として配合される。

このようなマイクロ液滴中の拡散性成分は、優位には、処理温度および保管温度において液体であり、それは例えば、水相が適切な不凍材料を含む場合－１０℃まで低くてもよく、一方、気体であるかまたは体温で実質的な蒸気圧を示す気体である。適切な化合物は、例えば、国際公開第９４／１６３７９号または国際公開第２０１５／０４７１０３号の特許出願に示されている乳化可能な低沸点液体の様々なリストから選択されてもよく、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。乳化可能な拡散性成分の具体例としては、ジエチルエーテルなどの脂肪族エーテル；メントール、カンファーまたはユーカリプトールなどの多環式オイルまたはアルコール；フランまたはジオキサンなどの複素環化合物；飽和または不飽和、直鎖または分枝していてもよい脂肪族炭化水素、例えばｎ－ブタン、ｎ－ペンタン、２－メチルプロパン、２－メチルブタン、２，２－ジメチルプロパン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、１－ブテン、２－ブテン、２－メチルプロペン、１，２－ブタジエン、１，３－ブタジエン、２－メチル－１－ブテン、２－メチル－２－ブテン、イソプレン、１－ペンテン、１，３－ペンタジエン、１，４－ペンタジエン、ブテンイン、１－ブチン、２－ブチンまたは１，３－ブタンジンなど；例えばシクロブタン、シクロブテン、メチルシクロプロパンまたはシクロペンタンなどのシクロ脂肪族炭化水素；および、例えば７個までの炭素原子を含むハロゲン化低分子量炭化水素などが挙げられる。代表的なハロゲン化炭化水素としては、ジクロロメタン、臭化メチル、１，２－ジクロロエチレン、１，１－ジクロロエタン、１－ブロモエチレン、１－クロロエチレン、臭化エチル、塩化エチル、１－クロロプロペン、３－クロロプロペン、１－クロロプロパン、２－クロロプロパンおよび塩化ｔ－ブチルなどが挙げられる。優位には、ハロゲン原子の少なくともいくつかはフッ素原子であり、例えばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、１，２－ジクロロ－１，２－ジフルオロエタン、１，２－ジクロロ－１，１，２，２－テトラフルオロエタン、１，１，２－トリクロロ－１，２，２－トリフルオロエタン、２－ブロモ－２－クロロ－１，１，１－トリフルオロエタン、２－クロロ－１，１，２－トリフルオロエチルジフルオロメチルエーテル、１－クロロ－２，２，２－トリフルオロエチルジフルオロメチルエーテル、部分的にフッ化されたアルカン（例えば１Ｈ，１Ｈ，３Ｈ－ペンタフルオロプロパンなどのペンタフルオロプロパン、ヘキサフルオロブタン、２Ｈ－ノナフルオロt-ブタンなどのノナフルオロブタン、２Ｈ，３Ｈ－デカフルオロペンタンなどのデカフルオロペンタンなど）、部分的にフッ化されたアルケン（例えば１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ－ヘプタフルオロペント－１－エンなどのヘプタフルオロペンテン、および１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ－ノナフルオロヘクス－１－などのノナフルオロヘキセンなど）、フッ化エーテル（例えば、２，２，３，３－ペンタフルオロプロピルメチルエーテル、または、２，２，３，３－ペンタフルオロプロピルジフルオロメチルエーテルなど）、および、さらに好ましくはパーフルオロカーボンが挙げられる。パーフルオロカーボンの例としては、例えばパーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン（例えばパーフルオロ－２－メチルペンタン）、パーフルオロヘプタン、パーフルオロオクタン、パーフルオロノナンおよびパーフルオロデカンなどのパーフルオロアルカン；例えばパーフルオロシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロシクロペンタンおよびパーフルオロメチルシクロペンタンなどのパーフルオロシクロアルカン；パーフルオロブテン（例えばパーフルオロブト－２－エンまたはパーフルオロブタ－１，３－ジエンなど）、パーフルオロペンテン（例えばパーフルオロペント－１－エン）およびパーフルオロヘキセン（例えばパーフルオロ－２－メチルペント－２－エンまたはパーフルオロ－４－メチルペント－２－エン）などのパーフルオロアルケン；例えばパーフルオロシクロペンテンまたはパーフルオロシクロペンタジエンなどのパーフルオロシクロアルケン；および、例えばパーフルオロ－ｔ－ブタノールなどのパーフルオロ化アルコールなどが挙げられる。それゆえ、第２の成分の油（拡散性成分）は、脂肪族エーテル、複素環化合物、脂肪族炭化水素、ハロゲン化された低分子量炭化水素およびパーフルオロカーボンの群から選択され得る。一実施形態において、第２の成分の油相は、パーフルオロカーボンを含む。

本発明において特に有用なものは、１×１０^-4Ｍ未満、より好ましくは１×１０^-5Ｍ未満の水溶性を有する拡散性成分である。しかしながら、拡散性成分および／または共溶媒の混合物が使用される場合、その混合物の実質的な画分がより高い水溶性を有する化合物を含むことができることが留意されるべきである。水溶性に基づいた適切な油（拡散性成分）の例は、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロメチルシロペンタン、２－（トリフルオロメチル）パーフルオロペンタン、およびパーフルオロヘキサンである。

所望により、２つまたはそれ以上の拡散性成分の混合物が本発明に従って採用されてもよいことが理解されるであろう。本明細書における「拡散性成分（the diffusible component）」の参照は、そのような混合物として解釈される得るものである。

第２の成分はまた、マイクロ液滴分散液を安定化させるための材料、本明細書においては「第２の安定化剤（second stabilizer）」と称される材料を含んでいてもよい。第２の安定化剤は、ガス分散液を安定化させるために使用される任意の材料、例えばリン脂質、ポリマーまたはタンパク質などの例えば界面活性剤と同じであってもよく異なっていてもよい。このような任意の材料の性質は、分散された気相の成長速度などの要因に大きく影響し得る。一般的に、広範囲の界面活性剤が安定化剤として有用であり、例えばＥＰ－Ａ－０７２７２２５（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に示される広範なリストから選択され得る。有用な界面活性剤の代表例としては、脂肪酸（例えば、例えば１０～２０個の炭素原子を含む直鎖の飽和または不飽和の脂肪酸など）および炭水化物およびトリグリセリドエステル、リン脂質（例えばレシチン）、フッ素含有リン脂質、タンパク質（例えばヒト血清アルブミンなどのアルブミン）、ポリエチレングリコール、およびブロックコポリマー界面活性剤などのポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓなどのポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、アシルオキシアシルポリエチレングリコールなどの拡張ポリマー、例えばポリエチレングリコールメチルエーテル１６－ヘキサデカノイルオキシ－ヘキサデカノエート、例えばここで、ポリエチレングリコール部位は２３００、５０００または１００００の分子量を有する）、およびフッ素含有界面活性剤（例えば、ＺｏｎｙｌおよびＦｌｕｏｒａｄの製品名で販売されているもの、または国際公開第９６／３９１９７号（その内容は参照によりここに組み込まれる）に記載のもの）が挙げられる。特に有用な界面活性剤としては、リン脂質、および特には全体的に中性電荷を有する分子を含むリン脂質、例えばジステアロイル－ｓｎ－グリセロール－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）などが挙げられる。第２の成分において、種々の範囲の安定化剤がマイクロ液滴を安定化するために使用され得る。さらに、適切な表面電荷を促進するために、広範囲のイオン性、好ましくはカチオン性の物質が使用されてもよい。

第１の成分中のマイクロバブルと第２の成分中のエマルションマイクロ液滴との間のクラスタリングを達成するために好ましい静電相互作用を促進するために、これらは反対の表面電荷を有しているべきであることが理解されよう。したがって、第１の成分のマイクロバブルが負に帯電している場合、第２の成分のマイクロ液滴は正に帯電しているべきであり、またはその逆でもあり得る。好ましい実施形態において、第１の成分のマイクロバブルの表面電荷は負であり、および、第２の成分のマイクロ液滴の表面電荷は正である。油マイクロ液滴構造の適切な表面電荷を促進するために、カチオン性界面活性剤が構造を安定化するために添加されてもよい。広範囲のカチオン性物質、例えば塩基性窒素原子を有する少なくともある程度疎水性のおよび／または実質的に水に不溶性の化合物、例えば第１級、第２級または第３級アミンおよびアルカロイドが使用され得る。特に有用なカチオン性界面活性剤は、ステアリルアミンである。一実施形態において、第２の安定化剤は、ステアリルアミンを有するＤＳＰＣ－膜などの中性リン脂質添加カチオン性界面活性剤である。

一実施形態において、第１の安定化剤および第２の安定化剤は、それぞれ独立して、リン脂質、タンパク質、ポリマー、ポリエチレングリコール、脂肪酸、正に帯電した界面活性剤、負に帯電した界面活性剤またはこれらの混合物を含む。

一実施形態において、第１の成分は、リン脂質、タンパク質およびポリマーの群から選択される第１の安定化剤によって安定化された、六フッ化硫黄、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、窒素および空気またはそれらの混合物の群から選択される分散されたガスを含み、第２の成分は、例えばリン脂質、ポリマーおよびタンパク質を含む界面活性剤の群から選択される第２の安定化剤で安定化されている、例えばパーフルオロシクロアルカンなどのパーフルオロカーボンの群から選択される拡散性成分を含む。より特には、どちらの安定化剤も、リン脂質から選択される。

第１および第２の成分は、クラスタ組成物を調製するために、意図された使用の直前に、適切な時間枠での使用のために、混合される。また、第１および第２の成分の混合は、成分の形状に依存して様々な方法で達成され得ることがまた理解されるであろう；例えば、２つの流体成分の混合、乾燥粉末形状の一つの成分の、流体形状の一つの成分を用いた再構成、流体（例えば、注射用の水または緩衝液）を用いた再構成の前に乾燥形状の２成分の混合など。また、他の成分、例えばこれらに限定される訳ではないが、マイクロバブル／マイクロ液滴の表面電荷のレベル、２つの成分中のマイクロバブル／マイクロ液滴の濃度、マイクロバブル／マイクロ液滴のサイズ、液体マトリックス中のイオンの組成および濃度、ｐＨ、賦形剤（例えば緩衝液または等張液）の組成および濃度など（国際公開第２０１５／０４７１０３号、実施例１参照）が、混合時にマイクロバブルおよびマイクロ液滴がクラスタを形成する能力に影響し得ることが理解されるであろう。成分および組成物のこのような特性は、生成されたクラスタのサイズおよび安定性（インビトロおよびインビボの両方）にも影響し、および、生物学的属性（例えば、有効性および安全性プロファイル）に影響を及ぼす重要な因子であり得る。また、クラスタ組成物中の全てのマイクロバブル／マイクロ液滴がクラスタ化された形状で存在していなくてもよく、マイクロバブルおよび／またはマイクロ液滴のかなりの部分がマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタの集団と共に自由な（非クラスタ化の）形状存在していてもよいこともまた理解されるであろう。加えて、２つの成分が混合される方法は、これらの様態、例えばこれらに限定される訳ではないが；均一化のあいだに適用されるせん断応力（例えば、穏やかな手動の均一化または強力な機械的均一化）、および、均一化のための時間範囲などに影響を及ぼし得る。クラスタ組成物は、２つの成分の混合から例えば５時間以内、例えば３時間以内など、クラスタの特性が実質的に変化していない時間枠のあいだに対象に投与されるべきである。本出願人の使用中での安定性研究は、クラスタが少なくとも３時間は安定的な特性を示していることを表している（実施例１を参照のこと）。

静脈内注入を意図したエマルション中の分散された拡散性成分のマイクロ液滴サイズは、肺システムを介して妨げられることのない移動を可能にするが、微小血管系中での活性化されたバブルの保持に十分である体積を依然として維持するために、７μｍ未満、より好ましくは５μｍ未満、さらに好ましくは３μｍ未満であって、０．５μｍよりは大きく、より好ましくは１μｍより大きくあるべきである。

インビボでの分散された気相の成長は、例えば、任意のカプセル化材料の膨張（これが十分な柔軟性を有する場合）、および／または、投与された材料から成長している気液界面への過剰な界面活性剤の抽出を伴い得る。しかしながら、カプセル化材料の伸張および／または材料の超音波との相互作用が、その多孔性を実質的に増加させるかもしれないということも可能である。カプセル化材料のこのような破壊は、これまで多くの場合、外向きの拡散およびそれによって露出されたガスの溶解を介してエコー源性の急速な損失を導くことが見いだされてきた一方、出願人は、本発明による組成物を使用する際に、曝露された気体が実質的な安定性を示すことを見出した。理論的な計算に束縛されることを望む訳ではないが、出願人は、例えば解放されたマイクロバブルの形状で曝露された気体は、例えばマイクロバブルの崩壊などに対して、拡散性成分によって作り出された過飽和環境によって安定化し、これがマイクロバブル気体の外方拡散傾向に対抗する内方圧力勾配を提供すると考えている。カプセル化材料の実質的な非存在のおかげで、曝露されたガス表面は、活性化されたバブルが、典型的な診断的イメージング周波数における高い後方散乱および低いエネルギー吸収（例えば、高い後方散乱：減衰比によって表される）によって証明される、特に好ましい音響特性を示すように活性化され得、この反響効果は、顕著な期間、継続した超音波照射の間でさえも継続され得る。

インビボでの活性化および増強
本発明は、以下の工程；
（ｉ）膵臓癌を患う哺乳動物対象に医薬組成物を投与する工程であって、少なくとも１つの治療薬が、クラスタ組成物とは別に、事前に、および／または共に、および／または事後に投与される工程、
（ii）任意には、該対象内の治療のために標的領域を同定するために、超音波イメージングを用いて該医薬組成物のクラスタをイメージングする工程、
（iii）該対象内の標的領域の超音波照射により、工程（ｉ）からのクラスタ組成物の第２の成分の拡散性成分のフェーズシフトを活性化する工程、および
（iv）さらなる超音波照射により、工程（ｉ）で投与された治療薬の血管外漏出を促進させる工程
を含む音響クラスタ療法（ＡＣＴ）治療における使用のための、上述された医薬組成物を提供する。本発明の方法において、治療またはデリバリーのために、本方法は、上記の工程を含む。

クラスタのマイクロバブル成分の音響共振は、診断用周波数範囲（１～１０ＭＨｚ）内にある。クラスタ組成物が対象に投与された場合、クラスタの活性化は、例えば従来の医療用超音波腹部および心臓適用で使用される標準的な診断用超音波イメージングパルスを用いて、中域から低域の機械指数、すなわち１．９未満、および好ましくは０．７未満、およびより好ましくは０．４未満であるが、０．１より大きいＭＩで容易に得られる。より大きな（直径で１０μｍ以上）フェーズシフトバブルを作製するためのクラスタのフェーズシフトへの活性化は、イメージングパルスを採用することにより、ミリメートルの空間分解能の範囲内で臨床イメージングシステムを用いて達成され得る。活性化に際し、マイクロ液滴内の油が気化し、その結果生じた大きな活性化されたバブルは、一時的に微小血管系内に堆積する。活性化および堆積の後の、低周波超音波のさらなる適用が、生物学的障壁を効果的に克服することにより送達メカニズムの強化を可能にし、癌膵臓組織へのドラッグデリバリーの効率を向上させる。これらの機構は、ソノポレーションのプロセス、すなわち血管区画内のマイクロバブルの超音波照射およびそれに続く体積振動が、血管障壁の透過性を増加させるプロセスを含み得る。換言すると、ＡＣＴ手法は内皮壁の透過性を増大させ、およびそれゆえ、治療薬の血管外漏出、分布、および細胞への取り込みを促進する。治療効果を高めるための細胞シグナルの生成、薬物の浸透を増大させる間質構造の機械的破壊などの他のメカニズムもまた誘導され得る。

クラスタは、低いＭＩ（約０．１であるクラスタ活性化閾値未満）では活性化されず、このことは、例えばクラスタの活性化なしに腫瘍微小血管病変部を同定するためなどに、標準的な医療用超音波造影剤イメージングが行われることを可能にする。このため、一実施形態において、本方法は、治療のための病変位置を同定するために、クラスタを活性化することなく、マイクロバブル成分すなわち分散された気体を画像化するための低ＭＩ造影剤イメージングモード（ＭＩ＜０．１５）を使用する工程を含む。したがって、クラスタは低いＭＩ（活性化閾値未満）では活性化されないので、標準的な医療用超音波造影剤イメージングが、例えば腫瘍の微小血管病変を同定するなどのために、活性化工程に先立って実行され得る。イメージングパルスを用いた医療用超音波イメージング制御下での活性化は、超音波フィールドによって検査される組織領域でのクラスタの空間的標的活性化を可能にする。活性化後、生成された大きなフェーズシフトバブルは、その大きさゆえに一時的に膵臓の微小血管系内に捕捉される。結果として得られる大きなフェーズシフトバブルは、蒸発されたエマルションマイクロ液滴の体積の約１０００倍（直径２μｍの油マイクロ液滴から、直径２０μｍのバブル）である。これらの大きなフェーズシフトバブルの散乱断面積は、活性化前のクラスタに含まれるミクロンサイズのマイクロバブルの散乱断面積よりも桁外れに大きい。この結果、大きなフェーズシフトバブルは大量の後方散乱信号を生成し、診断用イメージングシステムを用いた基本的なイメージングモードで容易に画像化される。大きなフェーズシフトバブルの機械的共振周波数もまた、活性化前のクラスタに含まれるマイクロバブルの共振周波数よりも１桁低い（１ＭＨｚ以下）。より大きなフェーズシフトバブルの共振周波数に見合った音場の適用は、医療診断用の範囲内のＭＩにおける比較的大きな径方向振動を形成する。したがって、０．０５～２ＭＨｚ、好ましくは０．１～１．５ＭＨｚ、より好ましくは０．１～１．０ＭＨｚ、さらにより好ましくは０．２～１ＭＨｚ、最も好ましくは０．４～０．６ＭＨｚ、および特には０．３３～０．６５ＭＨｚの範囲の低周波超音波が、投与された薬剤の取り込みを促進し、およびしたがって血管外漏出tを促進するという生物学的効果の機構を作り出すために適用され得る。インビボでの活性化の後、活性化されたバブルの大部分が、直径で１０～２０μｍ以内に収まっていることが見いだされた。このサイズの自由なマイクロバブルのＭｉｎｎａｅｒｔ共鳴周波数は、０．６５～０．３３ＭＨｚである。したがって、低周波の増強工程のための最も好ましい周波数範囲は、０．３３～０．６５ＭＨｚである。活性化されたバブルの共振効果の利用は、他の技術で可能であるものよりも、より低い音響強度およびより低い周波数においてこれらの生物学的効果の開始のより良好な制御を可能にする。大きなフェーズシフトバブルがイメージング制御下で活性化され、および組織の微小血管系内に堆積されるという事実（組織中での大きな活性化されたバブルの空間的標的化を可能にする）と相まって、およびそれらの延長された滞留時間は、ドラッグデリバリー機構のより効率的かつ制御された実施を可能にする。

膵臓へのドラッグデリバリーおよびＰＤＡＣの治療のためのＡＣＴ概念、すなわち本発明の使用のための組成物は、成分と（第１および第２の）成分との幅広い組み合わせに、および、さらに幅広い治療薬にも適用される概念であることが想定される。

治療薬
対象に送達される、「薬剤（the drug）」とも称される、治療薬は、化学療法薬および免疫療法薬の群から選択される。これは、クラスタ組成物とは別の組成物として投与される。特許請求された本発明において有用な治療薬のクラス、および特定の薬剤の例としては、以下のものが含まれるが、これらに限定される訳ではない：

アルキル化剤
ナイトロジェンマスタード：塩酸メクロレタミン（Mustargen）
ニトロソウレア：カルムスチン（BiCNU）、ストレプトゾシン（Zanosar）、ロムスチン（CeeNU）
テトラジン：ダカルバジン（DITC-Dome）、テモゾロミド（Temodar）
アジリジン：チオテパ（Thioplex）、マイトマイシン（Mutamycin）、アジリジニルベンゾキノン（AZQ）
シスプラチン：シスプラチン（Platinal）、カルボプラチン（Paraplatin）、オキサリプラチン（Eloxatin）

代謝拮抗剤
抗フォレート剤：メトトレキサート（Otrexup、Rasuvo、Trexall）、ペメトレキセド（Altima）
フルオロピリミジン：フルオロウラシル（Adrucil）、カペシタビン（Xeloda）
デオキシヌクレオチド
アナログ：シタラビン（Cytosar-U）、デシタビン（Dacogen）、アザシチジン（Vidaza）、ゲムシタビン（Gemzar）、フルダラビン（Fludara）、ネララビン（Arranon）、ペントスタチン（Nipent）
チオプリン：チオグアニン（Tabloid）、メルカプトプリン（Purinethol、Purixan）

微小管阻害剤
ビンカアルカロイド：ビノレルビン（Navelbine）、ビニクリスチン（Oncovin、Vincasar Pfs）、ビンデシン（Eldisine）、ビンフルニン（Javlor）
タキサン：パクリタキセルまたはナブパクリタキセル（Onxol、Abraxane）、カバジタキセル（Jevtana）、ドセタキセル（Docetaxel、Docefrez）
ポドフィロトキシン：エトポシド（Eposin、Etoposide）、テニポシド（Vumon）

トポイソメラーゼ阻害剤
トポイソメラーゼＩ：イリノテカン（Onivyde）、トポテカン（Act Topotecan、Hycamtin）
トポイソメラーゼII：ドキソルビシン（Adriamycin、Caelyx）、ミトキサントロン（Novantrone）、テニポシド（Vumon）、ノボビオシン（Novobiocin Sodium）、メルバロン、アクラルビシン

細胞障害性抗生物質
アントラサイクリン：ドキソルビシン（Adriamycin、Caelyx）、ダウノルビシン（Cerubidine、DaunoXome）、エピルビシン（Ellence）、イダルビシン（Idamycin）、ブレオマイシン（Blenoxane）、マイトマイシン（Mitosol、Mutamycin）

免疫療法
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法：シプレウセル－Ｔ（Provenge）、チサンゲンレクロイセル（Kymriah）、アクシカブタジン シロロイセル（Yescarta）
抗体療法：アレムツズマブ（Campath CD52）、アテゾリズマブ（Tecentriq PD-L1）、イピリムマブ（Yervoy CTLA4）、ペムブロリズマブ（Keytruda PD-1）、デュルバルマブ（Imfinizi IgG1k）
腫瘍溶解性ウイルス：タリモジンラヘルパレプベク（OncoVEX GM-CSF/T-vecIMLYGIC）、Ａｄ２／５ ｄｌ１５２０（Onyx-015）、ＧＬＶ－１ｈ６８（GL-ONC1）、ＣＶ７０６
がんワクチン：オンコファージ、シプリューセル－Ｔ（Provenge）

サイトカイン療法
インターフェロン：ＩＦＮα（Infergen）、ＩＦＮβ（Actimmune）
インターロイキン：市販品なし、臨床試験中。

一実施形態において、治療薬は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞障害性抗生物質、免疫治療薬およびサイトカイン治療薬の群から選択される。

一実施形態において、治療薬は、治療薬のためのビヒクルとして使用される、例えばリポソーム、コンジュゲート、ナノ粒子またはミクロスフェアの形状で含まれるビヒクル中に製剤化される。したがって、治療薬は、例えばリポソームもしくは微粒子製剤中またはモノクローナル抗体としてなどの例えばナノドラッグなどのより大きな薬物構築物の一部であってよい。したがって、一実施形態において、治療薬は、リポソーム製剤中に治療薬を含むなどの、閉鎖脂質スフェアに製剤化される。

実施例に示されるように、本発明者らは、ＡＣＴを、大きな構築物、ナノドラッグ ナブ－パクリタキセル（ナノ粒子中のアルブミンタンパク質に結合したパクリタキセル）およびナノドラッグリポソームイリノテカンと組み合わせることによる相乗効果を評価した。上述されるように、ＡＣＴ概念は、実施例３にも示されているように、そのようなより大きな薬物分子または構築物との組み合わせに特に有用であり得る。

これらがビヒクルの形状中に製剤化される、適切な承認された治療薬の例は、以下：
リポソーム化学療法薬Ｄｏｘｉｌ、ここでドキソルビシンはリポソーム中にカプセル化されている；
リポソーム化学療法薬オニヴァイド（登録商標）（イリノテカンがリポソーム中にカプセル化されている）；および
パクリタキセルアルブミン結合粒子懸濁液アブラキサン（登録商標）
である。

さらに、１つまたは複数の化学療法薬と１つまたは複数の免疫治療薬とのあいだの併用療法が好ましい。さらに、単一のリポソームを用いて２つの抗癌剤を含む新世代のリポソーム、およびリポソームに結合した抗体を含む免疫リポソームが、本発明に包含される。

好ましい実施形態において、治療薬は、大きな分子（例えばタンパク質または抗体など）またはナノ構造薬物の群から選択され、これには、これらに限定される訳ではないが、ナブ－パクリタキセル／ゲムシタビン、リポソームイリノテカン、リポソームドキソルビシンおよびモノクローナル抗体の組み合わせが含まれる。

第２の好ましい実施形態において、治療薬は、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペス、ニューカッスル病ウイルス、およびワクシニアを含むがこれらに限定される訳ではない腫瘍溶解性ウイルスなどの免疫療法薬の群から選択される。ウイルスは、がん細胞の「破裂」を引き起こすことができ、がん細胞を死滅させ、および、がん抗原を放出する。これらの抗原は、近くに残っている、および身体の他の場所にあるかもしれない任意の腫瘍細胞を探し出し、かつ、排除することができる免疫応答を刺激することができる。

一実施形態において、治療薬は、ゲムシタビンと組み合わされているナブパクリタキセル（Abraxane）を含む。別の実施形態において、治療薬はリポソームイリノテカン（Onivyde（登録商標））である。

さらに別の実施形態において、複数の治療薬が併用レジメンとして投与される。適切な併用レジメンの例としては、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカンおよびオキサリプラチンを含む併用レジメン（FOLFIRINOX）を含む併用レジメン、ロイコボリン、フルオロウラシルおよびイリノテカン（FOLFIRI）を含む併用レジメン、並びにロイコボリン、フルオロウラシルおよびオキサリプラチン（FOLFOX）を含む併用レジメンが挙げられる。

さらに別の実施形態において、治療薬は、例えばチェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤＬ１チェックポイント阻害剤などの免疫治療薬である。

本発明の一実施形態において、方法は、対象を免疫療法で治療することと組み合わせられた、少なくとも１つの化学療法薬を用いた治療を含む。

免責事項：一実施形態において、治療薬は、パクリタキセルではなく、すなわち遊離非アルブミン結合型としてである。一実施形態において、治療薬は、ナブ-パクリタキセルとのゲムシタビンの組合せではない。

別途投与される治療薬に加えて、一実施形態において、クラスタ組成物の第２の成分は、マイクロ液滴に含まれるさらなる治療薬を含む。

投与経路
クラスタ組成物は、哺乳類対象に非経口的に、好ましくは静脈内で投与される。投与経路はまた、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与または皮下投与から選択されてもよい。対象への投与のために、治療薬は、別個の組成物としてクラスタ組成物とは別に、事前に、および／または共に、および／または事後に投与される。治療薬は、それぞれの承認された製品特性概要（Summary of Product Characteristics）に従い投与される。典型的には、経路は、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与および筋肉内投与からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。したがって、２つの組成物、すなわち、クラスタ組成物（ａ）および治療薬組成物（ｂ）は、同じ投与経路を介してまたは異なる投与経路を介して投与され得る。

治療スケジュール
本発明の、使用のための組成物、治療方法、および／または薬物のデリバリー方法は、例えば、多剤併用治療レジメンの一部として行われ得ることが理解されるであろう。一実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、１つより多い治療薬の使用を含む。このような化学療法薬併用レジメンは、例えば、ロイコボリン、フルオロウラシル、イリノテカン（FOLFIRI）を含んでいてもよい。

さらに、一実施形態において、例えば図５および図６に例示されるように、治療薬を投与する期間中に、いくつかのＡＣＴ治療が実施され得る。一実施形態において、治療方法は、１～５回、例えば２～４回の治療を含む。「ＡＣＴ治療（ACT treatment）」または「ACT手法（ACT procedure）」は、少なくとも、クラスタ組成物の投与、通常の医療用イメージングＵＳ超音波照射によるクラスタの活性化、およびそれに続く、強化された取り込みを誘導するための低周波ＵＳ超音波照射を含む。図５および図６は、治療スケジュールの一例を提供する。

図５は、以下の化学療法併用レジメンＦＯＬＦＯＸを用いた治療中に行われたＡＣＴ治療のグラフを示している。
オキサリプラチンおよびレコボリンの２時間輸液の後、フルオロウラシル（５－ＦＵ）のボーラス注入と５－ＦＵの４８時間輸液を行う。ＡＣＴ手順は、グレーのＡＣＴ（登録商標）ソノポレーションバーで示されるように、化学療法薬の投与のあいだに、３回適用される
図５のパネルＡ：各ＡＣＴ手順は以下
ａ．：クラスタ組成物の注入
ｂ．：６０秒間の通常の医療用イメージング超音波の照射を用いたクラスタの活性化、および
ｃ．：５分間の４００～６００ｋＨｚの超音波の照射を用いた増強工程
から構成される。
図５のパネルＢ：Ｙ軸は、投与された化学療法薬の血漿濃度をピークのパーセントで示しており、Ｘ軸は、時間を分単位で示している。この例では、全ての３つの薬剤をカバーするために、約５０分、８０分、１１０分で３回のＡＣＴ手順が実行される。図６には、ＰＤＡＣの治療のための標準治療組み合わせレジメン；ゲムシタビンおよびナブ-パクリタキセルのために、同様の概要が示されている。

本発明者らは、治療薬の投与ごとに単一のＡＣＴ手順を適用するよりもむしろ、ＡＣＴ手順を繰り返すことが有益であることを見出した。ＡＣＴの活性化のあいだのＵＳイメージングを使用して、本発明者らは、腫瘍におけるＡＣＴバブルの堆積における顕著な効果を観察した。同一動物に対する注入から注入までの堆積パターンにおける強い分散が観察された；堆積したＡＣＴバブルの密度は、腫瘍の様々なセグメント間で異なり、および、このパターンは注入の間で変化した。完全には解明されていないが、これらの効果は様々な腫瘍セグメントに対する灌流における一時定な変動に起因すると仮定される。これらの観察に基づき、腫瘍体積のできるだけ多くに到達するために、実施例において、本発明者らは、ＡＣＴ手順を３回連続して、立て続けに適用した。これはまた、ＦＯＬＦＯＸおよびＮＡＢ／ＧＥＭレジメンについて上述したように、臨床使用のあいだにいくつかのＡＣＴ処置を適用することの利点を指摘するものである。

したがって、一実施形態において、例えば１～５個の治療薬などの複数の治療薬が、例えば３時間までにわたるようなあるタイムスパンで、同時にまたは順次投与され、ここで、例えば１～５回などの少なくとも１回のＡＣＴ治療が同じ期間のあいだに行われる。

一実施形態において、以下のACT手順が提供される；
クラスタ組成物の例えば静脈内投与などの投与に続いて、通常の医療用イメージングＵＳを用いた腫瘍の局部的ＵＳ超音波照射（活性化）、その後、増大された取り込みを誘導するための低周波ＵＳ超音波照射（血管外漏出の促進）、そしてこれらの工程は、例えば３回連続してなど、２～５回連続して行われる。したがって、ＡＣＴ治療の工程（ｉ）～（iv）は、１～４回繰り返される。これは、治療薬の投与と同時に行われる。活性化、すなわち最初のＵＳ超音波照射は、クラスタ組成物の各投与の直後、例えば１分以内に開始されるべきであり、例えば３０～１２０秒間継続させる。低周波超音波を用いた超音波照射が活性化工程に続き、典型的には３～１０分間、例えば約５分間継続されるべきである。工程（iii）の後、工程（iv）の即時開始が好ましい。二周波トランスデューサが、活性化工程および増強工程の両方のために、治療において有益に使用され得る。このようなものを使用することによって、工程（iii）における活性化超音波照射から工程（iv）における増強超音波照射への切り替えを、遅延なく行われ得る。活性化の直後にエンハンスメントフィールドを適用することは、結果としてもたらされる治療効果のために重要であり得る。この点で、広帯域または二周波のＵＳトランスデューサを使用して活性化および増強超音波照射の両方を適用することは有益であろう。すなわち、記載された好ましい範囲に必要とされるすべての周波数にわたって十分なＵＳ圧力（すなわちＭＩ）を供給することができるトランスデューサである。例えば、１～１０ＭＨｚおよび４００～６００ｋＨｚの両方で０．４までのＭＩを送達することができるトランスデューサである。

別の実施形態において、多剤併用レジメンは、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１またはＣＴＬＡ４モノクローナル抗体と、化学療法薬、例えばペムブロリズマブ＋シスプラチン＋オキサリプラチン（５－ＦＵ）またはカペシタビンを含む。したがって、いくつかの治療薬を使用することができ、治療レジメンの間にいくつかのＡＣＴ手順が適用され得る。好ましい実施形態において、ＡＣＴ処置は、活性治療分子が投与後に血中で最大濃度または最大濃度に近い濃度を示すときに行われる。したがって、ＡＣＴ処置のタイミングは、治療薬の薬物動態に依存して変わり得る。

治療薬は、クラスタ組成物とは別に、事前に、および／または共に、および／または後に、投与される。好ましい実施形態において、治療薬は、少なくとも１つのクラスタ組成物の１つを投与した後に投与される。驚くべきことに、実施例２において、治療薬の投与前にＡＣＴ治療、すなわちクラスタの投与および超音波照射を行うことが、治療薬の投与後（すなわち治療薬が血流中にあるとき）にＡＣＴ治療を開始した場合と同様の効果サイズを示すことが見出された。この結果は、ＡＣＴによって誘導される生体力学的効果、すなわち増大された血管バリアの透過性が、ＵＳ手順終了後もしばらく持続することを示している。これは、治療的投与および治療を開始する前に、ＡＣＴ治療が行なわれ得るため、臨床上有益であり得る。したがって、一実施形態において、クラスタ組成物が投与され、インビボでＵＳ超音波照射が行われた後に、治療薬が投与される。別の実施形態において、クラスタ組成物は、例えば化学療法などの治療薬の投与の直前または直後のいずれかに投与される。

結果
本発明者らは、化学療法薬および／または免疫療法薬の少なくとも１つを用いた治療と組み合わせられた、ＰＤＡＣの治療においてＡＣＴ概念を適用することが、すなわち本発明によって提供されるように、治療薬を単独でおよび同じ用量で使用する、すなわち特許請求される方法または組成物を使用せずに、使用する場合と比較して、治療効果における著しい増大が得られることを見いだした。使用のための医薬組成物、および治療方法は、例えば、治療薬の促進された血管外漏出の結果として、治療薬の改善された取り込みをもたらし、治療効果は顕著に増強される。治療は、腫瘍の成長の著しい阻害、誘導された腫瘍の収縮、およびそれ故の腫瘍体積の減少を提供する。全体的な結果として、本方法は、生存時間の改善を提供し得る。本発明の方法を用いて、５０％より多い、例えば７５％より多い、例えば９０％より多い、ＰＤＡＣ腫瘍体積の減少が達成され得る。実施例２および３に示されるように、本発明の方法を用いて、最初の薬剤投与後５０日目に、薬剤単独による治療と比較して、８５％または９０％さえもの腫瘍体積の減少が達成された。さらに、実施例２に示されるように、完全寛解さえもが達成され得、したがって、ＡＣＴを用いない治療と比較して、完全奏功の割合が著しく増加した。本発明の方法を用いると、例えば最初の薬剤投与後１２０日目に完全寛解が見られる治療対象者の割合は、少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、または少なくとも６０％でさえある。これらの効果レベルは、マウスにおける前臨床試験で観察されたものであり、そして、ヒトにおける効果レベルはより低いかもしれないことが留意されるべきである。本方法のさらなる利点は、治療薬の投与量を、通常使用される用量と比較して減少させることができ、この結果、治療効果を維持または改善しながら、減少された全身的な副作用をもたらし得ることである。実施例３においては、ＡＣＴとの組み合わせを用いた類似の相乗効果が、免疫治療薬である腫瘍溶解性レオウイルスを用いて示された。

一実施形態において、本発明の医薬組成物は、膵臓への、特にはＰＤＡＣと診断された対象への治療薬のデリバリーにおける使用のためのものである。使用のための組成物、およびＡＣＴ技術を使用することは、治療薬の有効な局所濃度に達するために、治療薬の部位特異的デリバリーを提供し、さらに、関心領域での改良された取り込みを提供する。

したがって、一実施形態において、本発明は、治療薬をデリバリーする方法における使用のための医薬組成物を提供し、ここで、本方法は、以下の工程：
（ｉ）ＰＤＡＣを患う哺乳動物対象に、第１の態様で定義された医薬組成物を投与する工程であって；少なくとも１つの治療薬が、クラスタ組成物に事前に、および／または共に、および／または事後に、および、工程（ii）～（iii）の前に、または工程（ii）～（iii）のいずれかの後に、投与される工程、
（ii）任意には、該対象内の治療のために標的領域を同定するために、超音波イメージングを用いて該医薬組成物のクラスタをイメージングする工程、
（iii）該対象内の標的領域の超音波照射により、工程（ｉ）からのクラスタ組成物の第２の成分の拡散性成分のフェーズシフトを、
（ａ）該クラスタのマイクロバブルが、該拡大されたバブルによる該標的領域での微小循環中への一時的な堆積に起因して該標的領域に局在化される拡大されたバブルをもたらすために、工程（iii）の該拡散性成分によって、拡大され；および
（ｂ）工程（ｉ）で投与される治療薬の血管外漏出を促進する
ように、活性化する工程；ならびに
（iv）さらなる超音波照射により、工程（ｉ）で投与された治療薬の血管外漏出をさらに促進させる工程
を含む。

同様に、本発明は、少なくとも１つの治療薬を哺乳動物対象にデリバリーする方法であって、以下の工程：
（ｉ）哺乳動物対象に、第１の態様で定義された医薬組成物を投与する工程、
（ii）任意には、該対象内の治療のために標的領域を同定するために、超音波イメージングを用いて該医薬組成物のマイクロバブルをイメージングする工程、
（iii）該対象内の標的領域の超音波照射により、工程（ｉ）からのクラスタ組成物の第２の成分の拡散性成分のフェーズシフトを、
（ａ）該クラスタのマイクロバブルが、該拡大されたバブルによる該標的領域での微小循環の一時的な遮断に起因して該標的領域に局在化される拡大されたバブルをもたらすために、工程（iii）の該拡散性成分によって、拡大され；および
（ｂ）該活性化工程（iii）が、工程（ｉ）で投与される治療薬の血管外漏出を促進する
ように、活性化する工程；ならびに
（iv）さらなる超音波照射により、工程（ｉ）で投与された治療薬の血管外漏出をさらに促進させる工程
を含む方法を提供する。

本発明の使用のための方法および組成物は、例えば、上記に開示したように、例えば、造影剤としてクラスタのマイクロバブルを使用することを含む超音波イメージングを行うことによって、診断的イメージングを伴い得るが、典型的には治療の結果を診断するおよび／または評価するために、他のタイプのイメージング検査と組み合わせられてもよい。そのようなイメージングには、例えば膵臓腫瘤を同定するための初期試験としてなどの腹部コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、または胆管膵管造影（ＭＲＣＰ）を伴うまたは伴わない腹部磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、腹部超音波検査（ＵＳ）、内視鏡的胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）を伴うまたは伴わない超音波検査（ＥＵＳ）などが含まれ得る。ＥＵＳおよびＥＲＣＰは、上述の検査の中で最も侵襲的であるが、正確な診断を提供し得る生検を可能にする、挙げられたものの中で唯一の検査である。

一態様、例えば治療における使用のための組成物に関連する態様の文脈において記載される実施形態および特徴は、デリバリーにおける使用、または治療もしくはデリバリーのための方法に関連する本発明の他の態様にも適用される。

以下の実施例は、本発明の原理に従って本発明を説明するために提供されるが、いかなる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例
本出願人の特許出願である国際公開公報第２０１５／０４７１０３号、特に該出願の実施例であってクラスタ組成物の特徴付けのための分析方法論、クラスタの使用による結果等の説明を提供している内容が、参照により本明細書に組み込まれる。

以下の実施例では、第１の成分をＣ１と称し、第２の成分をＣ２と称し、およびクラスタ組成物、すなわち第１の成分と第２の成分の組み合わせから得られる組成物をＤＰ（医薬品（drug product））と称する。

実施例１は、ＤＰ中のマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタの特性評価および定量のための分析方法論の説明を提供し、および、濃度、サイズおよび円形度を含む関連する応答および属性について説明する。また、活性化されたバブルのサイズおよび濃度の特性評価と定量化のための分析手法の詳細もまた提供される。加えて、事前混合されたＤＰと共注入されたＤＰとの特性の比較として、調製後のクラスタの安定性に関するデータが提供される。また、ＤＰ中のクラスタ含有量およびサイズを制御された操作のための工学的工程も詳細に説明される。

実施例１はさらに、微小循環中に大きな活性化されたバブルを堆積させる能力として、製品の有効性に対するクラスタの特性の影響を解明するインビボ研究からの結果を示している。さらにこれらのデータを分析し、０．９未満の円形度によって定義される３～１０μｍのあいだの平均サイズを有するクラスタが、クラスタ組成物の有効性に寄与していると結論付けている。

実施例１ クラスタの調製、分析ツール、および基本的な特性
Ｃ１とＣ２の混合によって形成される、すなわちＤＰ中に存在するマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタは、組成物の重要な品質属性、すなわち薬物のデリバリーに関する機能性にとって極めて重要である。したがって、形成されたクラスタを濃度およびサイズに関して特徴付け、および制御するための分析手法は、本発明を評価するため、および医薬品の品質管理（ＱＣ）のために不可欠なツールである。発明者らは、この目的のために適用され得る３つの異なる分析ツール、コールターカウンティング、フロー粒子画像分析（ＦＰＩＡ）、顕微鏡／画像分析を特定した。

クラスタ組成物中のクラスタの特徴付けに適用されるこれらの技術に加えて、インビボでのクラスタの活性化、すなわち超音波照射による大きな活性化されたバブルの形成を研究するための分析的方法論が開発された。この方法論「ソノメトリー（sonomerty）」は、国際公開第２０１５／０４７１０３号のＥ１～６に詳述されている。ソノメトリー分析からの主な報告応答は、活性化されたバブルの数および体積、ならびにそれらのサイズ分布、活性化後の時間に対する両者である。活性化応答はまた、国際公開第２０１５／０４７１０３号のＥ１～５に詳述されているように、顕微鏡／画像分析によって調べされてもよい。

成分および組成物
開示される実施例で調査された組成物における第１の成分（Ｃ１）は、水素化卵ホスファチジルセリンナトリウム（ＨＥＰＳ－Ｎａ）膜によって安定化され、凍結乾燥スクロースに埋め込まれたパーフルオロブタン（ＰＦＢ）マイクロバブルで構成された。ＨＥＰＳ－Ｎａは負に帯電した頭部基を有し、その結果、マイクロバブルの表面は負に帯電している。Ｃ１の各バイアルは、約１６μＬまたは２×１０⁹個のマイクロバブルを含み、その平均直径は約２．０μｍである。この凍結乾燥製剤は、室温で保存した場合、長いシェルフ寿命、より特には３年間の寿命を示す。

本実施例で調査された組成物における第２の成分（Ｃ２）は、正の表面電荷を提供するために３％ ｍｏｌ／ｍｏｌのステアリルアミン（ＳＡ）が添加された１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスポコリン（ＤＳＰＣ）膜によって安定化されたパーフルオロメチル－シクロペンタン（ｐＦＭＣＰ）マイクロ液滴から構成された。Ｃ２中のマイクロ液滴が、５ｍＭ ＴＲＩＳバッファーに分散された。これらの研究で調査されたＣ２の標準製剤は、約４μＬまたは１ｍＬあたり０．８×１０⁹個のマイクロ液滴を含み、平均直径は約１．８μｍである。第２の成分は、冷蔵保存された場合、長いシェルフ寿命、より特には１８か月以上の寿命を示す。

場合によっては、クラスタ特性への影響を解明するために、例えばＳＡ含有量、マイクロ液滴サイズ、マイクロ液滴濃度、ＴＲＩＳ濃度およびｐＨなどの様々な製剤変数を制御された様式で変化させた。このような試料を使用した場合、これらの態様は本明細書中で詳述される。

クラスタ組成物（ＤＰ）は、Ｃ１のバイアルを２ｍＬのＣ２を用いて再構成し、次いで３０秒間の手動ホモジナイゼーションによって無菌的に調製された。滅菌済みの単回使用シリンジおよび注射針を用いて、Ｃ２のバイアルから２ｍＬを取り出した。シリンジの内容物がＣ１のバイアルのストッパーを通して添加され、投与のための組成物を調製するように得られたＤＰが均一化された。

国際公開第２０１５／０４７１０３号に示されるように、第１および第２の成分、すなわち、マイクロバブル製剤およびマイクロ液滴製剤は、変化され得る。例えば、国際公開第２０１５／０４７１０３号の表９および１０に示されるように、本発明による治療に有用であると期待される、適切な特性を有するクラスタを調製するために、第１の成分のガスおよび安定化膜の両方が変えられ得る。

分析中のクラスタ組成物中のクラスタの安定性
ＤＰ中のクラスタは、マイクロバブルとマイクロ液滴との間の静電引力によって形成され、保持されている。これらの力は有限であり、および、クラスタは形成後、例えば機械的ストレスまたは熱（ブラウン）運動などの様々な経路／影響を通じて崩壊し得る。正確かつ的確な特性評価のために、分析時間のあいだにクラスタが安定に維持されていることが重要である。この安定性は、上記の全ての方法論を用いて試験された。安定性を評価するために、１つのＤＰサンプルに対して５分より長いあいだ３～５回の分析が繰り返された。これらのリプリケートのあいだでは、濃度およびサイズのいずれにおいても顕著な変化は観察されず、マイクロバブル、マイクロ液滴およびクラスタは、記載された分析条件下、すなわちＰＢＳまたは水での希釈後、連続ホモジナイザー（撹拌）下で５分より長いあいだ安定していることを示している。

製剤態様
ＤＰ中のクラスタ含有量およびサイズを制御し、最適な特性を標的とするために、多くの異なる製剤態様が検討され得る。クラスタ含有量およびサイズ分布を設計するために使用され得るパラメータとしては、マイクロバブルとマイクロ液滴との間の表面電荷の差、例えばＳＡ％：Ｃ２のマイクロ液滴サイズ：ｐＨ：Ｃ２中のＴＲＩＳ濃度：およびマイクロバブルおよびマイクロ液滴の濃度などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。加えて、高温での延長された保管などによる成分の化学的劣化が、ＤＰの調製のあいだのＣ１およびＣ２のクラスタ形成能力に影響を与えるかもしれない。

国際公開第２０１５／０４７１０３号で報告されているように、３０種類の組成物のインビボでの特性評価から、システムの性質と特性を解明するいくつかの重要な相関関係が抽出され得る。形成されるクラスタのサイズもまた、系の反応性に強く関連していることが発見された。反応性の比較的低いレベル（例えば２０％未満）では、小さなクラスタ（１～５μｍ）および中程度のサイズのクラスタ（５～１０μｍ）のみが形成される。反応性が高くなると、より大きなクラスタが形成され始め、Ｒが約２０％より大きくなると１０～２０μｍのクラスタが形成され始め、Ｒが約５０％より大きくなると２０～４０μｍのクラスタが形成され始める。大きなクラスタが形成されると、より小さいおよび中間のサイズのクラスタが犠牲になる。クラスタ濃度１～５μｍおよび５～１０μｍで、含有量と反応性の間に明確な最適値があることが発見された。より大きなクラスタ（すなわち、１０μｍより大きい、または２０μｍより大きい）の形成は、組成物の有効性に有害であり、および、クラスタ形成能は適切にバランスを取らなければならないことが発見された。

出願人の実験、および国際公開第２０１５／０４７１０３号の表５および表６に示されている結果に基づいて、クラスタ組成物の有効性（Ｇｒｅｙ Ｓｃａｌｅ単位（ＧＳ）での線形増強）が、クラスタ平均サイズおよびクラスタの濃度（百万／ｍＬ）と相関している。Ｇｒｅｙ Ｓｃａｌｅ増強は、クラスタ組成物の投与およびインビボでの活性化の後のＵＳイメージングによって観察される輝度（コントラスト）の増加であり、および、イメージングされた組織内の活性化されたバブルの量の尺度である。そこで報告された結果は、クラスタ組成物のｉ．ｖ．投与および左心室での活性化に際した犬の心筋からの超音波信号における線形増強（Ｇｒｅｙ Ｓｃａｌｅ単位）に対する様々なサイズクラスのクラスタの寄与の多変量、主成分分析（ＰＣＡ）からのものであり、国際公開第２０１５／０４７１０３号の実施例２を参照のこと。ＰＣＡは、これの表５および表６に詳述されている３０サンプルのデータに対して実施された。その結果は、小および中サイズのクラスタ（１０μｍより小さい）がクラスタ組成物の有効性に顕著に寄与するのに対し、より大きなクラスタ（１０μｍより大きい）は寄与しないことを実証している。これらの結果および結論は、本発明にも適用される。クラスタのサイズ分布は重要であり、および、平均サイズは３～１０μｍ、および好ましくは４～９μｍ、より好ましくは５～７μｍの範囲であるべきである。

実施例１に従って調製されたクラスタ組成物のクラスタ濃度と平均径が分析され、および、約４０００～４４００万個／ｍＬのクラスタ濃度、および、約５．８～６．２μｍのクラスタ平均直径で、数時間のあいだ維持されていることが発見された。結果は以下の表１に示されており、国際公開第２０１５／０４７１０３号の表６の結果と一致している。表１のデータは、調製されたクラスタ組成物は許容可能な安定性を有し、および最適なクラスタのサイズおよび濃度が達成され得ることを示している。

クラスタの大きさは、有効性に影響を与える。図１は、クラスタの大きさと製品の有効性を視覚化したもので、３～１０μｍの範囲の平均直径を有するクラスタが最適な有効性をもっていることを示している。したがって、図１において、製品の有効性とクラスタ径の関係が提供されている。Ｙ軸は、クラスタの左心室への注入および活性化の後の犬の心筋のＵＳ画像からのＧｒｅｙ Ｓｃａｌｅ増強に対する相関係数を示し、および、堆積した活性化されたバブルの量を反映する。Ｘ軸はμｍでのクラスタの直径を示す。灰色のボックスは評価された種々のクラスタサイズビンを示す：１～５μｍ、５～１０μｍ、１０～２０μｍ、および２０～４０μｍ。実線は、有効性対クラスタ直径の連続関数を表す。エラーバーは標準誤差を表す。図１は、国際公開第２０１５／０４７１０３号の図１２（左側）の代替的な可視化であり、および、以下の表２で提供されるデータに基づいている。

国際公開第９９／５３９６３号で教示された２つの成分の共注入とは対照的に、本発明の概念を適用すること、すなわち投与前にＣ１およびＣ２からクラスタ組成物を調製することによって、したがってマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタを形成することによって、１０倍より大きい有効性の増加が可能になる。第１の成分および第２の成分の組み合わせによるマイクロバブル／マイクロ液滴クラスタの形成、およびこれらの予め作られたクラスタを投与することは、インビボでの意図される機能性のための前提条件である。クラスタ組成物は、２つの成分を混合してから３時間以内など、クラスタの特性が実質的に変わらない時間ウィンドウのあいだに対象に投与され得る。

実施例２ ＰＤＡＣの患者由来異種移植マウスモデルにおける治療効果－化学療法を伴う音響クラスタ療法
試験デザイン：音響クラスタ療法（ＡＣＴ）および本発明による使用のための組成物（ＡＣＴと称される）を、２つの異なる化学療法レジメンを用いて治療効果レベルについて調べた。

以下のＡＣＴ手順が用いられた；クラスタ組成物の静脈内投与＋腫瘍の局所的超音波（ＵＳ）照射が、化学療法薬の投与の直前または直後のいずれかで連続３回行われた。実験セットアップ（リグ）および治療スケジュールは、図２に示されており、ここで図２Ａ）は、超音波活性化および増強のための、研究で使用される装置のセットアップ写真を提供し、および図２Ｂ）は、セットアップスケッチを提供する。図２Ｂにおいて、符号は以下を示す。１は二周波超音波トランスデューサ（２．７ＭＨｚおよび５００ｋＨｚ出力）、２は超音波導波管、３は水浴、４は超音波ゲル、５は超音波吸収パッド、６はクラスタ組成物入り注入シリンジ、７はＶｅＶｏ撮影台、８はカテーテルおよび９は腫瘍である。

さらに、図２Ｃは、治療スケジュールの概要を示し、ここでクラスタ組成物は、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（GE Healthcare）（実施例１に概説される成分１）の１つのバイアルを、６．８ｍｇ ＰＦＭＣＰ／ｍＬを含むパーフルオロメチルシロペンタン（ＰＦＭＣＰ）エマルション２ｍＬで再構成することによって配合された。ＰＦＭＣＰ液滴は、３Ｍのステアリルアミンを含むジステアロイルホスファチジルコリンを用いて安定化された（実施例１に概略されている成分２）。

図２Ｃにおいて、以下の呼称を使用される：
ａ．：麻酔され、カテーテルが挿入されたマウス、
ｂ．：クラスタ組成物の注入、
ｃ．：２．７ＭＨｚでの６０秒間の超音波活性化、および
ｄ．：５００ｋＨｚでの５分間の超音波増強。
ゲムシタビンおよびナブ－パクリタキセルの、ＡＣＴ治療前または後の図示されているような注入。または、図示されているような、リポソームイリノテカンのＡＣＴ治療の前の注入。

各ＡＣＴ治療は、クラスタ組成物の２ｍＬ／ｋｇでの注入、および、それに続くＵＳ活性化および増強工程を含んでいた。

ＰＤＡＣ患者由来の腫瘍異種移植片を、腫瘍サイズが１６３±３（平均標準誤差）ｍｍ³に達した時点で治療研究に登録されたアトミティックヌードマウスに皮下移植した。マウス（７～１０匹／群、表３参照）は、化学療法薬単独またはＡＣＴとの組み合わせで治療された。加えて、生理食塩水＋ＡＣＴ対照群も実施した。２つの化学療法レジメンが試験された。
－ ナブ－パクリタキセル（ＮＡＢ、１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｖ.、ｗｅｅｋｌｙ×３）およびゲムシタビン（ＧＥＭ、６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.、ｗｅｅｋｌｙ×３）の組み合わせ（ＮＡＢ／ＧＥＭ）、ならびに
－ リポソームイリノテカン（ＯＮＩ、１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｖ.、ｗｅｅｋｌｙ×３）。

表３は、治療群の概要および各群の動物数を示している。

ゲムシタビンは腹腔内投与（Gemcitabine IP）、ナブ－パクリタキセルは静脈内投与（Nab-Paclitaxel IV）、リポソームイリノテカンは静脈内投与（Liposomal irinotecan IV）であった。

試験開始後４９日間は、体重および腫瘍の大きさをノギスで測定し、動物は毎日モニターされた。４９日目に、進行性疾患を示した動物は淘汰され、一方、有意な寛解（腫瘍サイズが６０ｍｍ³未満で定義）を示した動物は１２０日間までモニターされた。１２０日目に、測定可能な残存腫瘍量がない動物として定義される各群の完全寛解者の割合が決定された。腫瘍堆積は、最初の治療日（０日目）の１５０ｍｍ³に正規化された。

結果
平均腫瘍体積および平均の標準誤差（ＳＥＭ）の結果が、以下の表４および表５に記載されている。

表４および表５に示される結果を、それぞれ図３および図４に図示した。

図３は、患者由来の膵管腺癌の治療に対する、リポソームイリノテカンと組み合わされたＡＣＴの治療効果を提供する。Ｙ軸は、ｍｍ³での腫瘍体積を示す。Ｘ軸は試験開始からの経過時間を日数で示している。治療は０日目、７日目、１４日目に適用された。治療群は以下の通り：生理食塩水対照（白四角）、リポソームイリノテカン単独（黒四角）、およびＡＣＴを伴うリポソームイリノテカン（黒丸）。

図４は、膵管腺癌に対するゲムシタビンおよびナブ－パクリタキセルと組み合わされたＡＣＴの治療効果を提供する。Ｙ軸は、ｍｍ³での腫瘍体積を示す。Ｘ軸は試験開始からの経過時間を日数で示している。治療は０日目、７日目、１４日目に適用された。治療群は以下の通り：生理食塩水対照（白四角）、ゲムシタビンおよびナブ－パクリタキセル単独（黒四角）、薬剤投与の前に適用されたＡＣＴを伴うゲムシタビンおよびナブ－パクリタキセル（白丸）、および薬剤投与の後に適用されたＡＣＴを伴うゲムシタビンおよびナブ－パクリタキセル（黒丸）。

まとめると、結果は、ナブ－パクリタキセル／ゲムシタビン（ＡＢＸ／ＧＥＭ）またはリポソームイリノテカン（ＯＮＩ）の単独投与は、使用した用量で腫瘍の成長の顕著な抑制を示した。しかしながらさらに、化学療法治療の前または後の、本発明によるＡＣＴの適用は、劇的に活性および治療効果を向上し、および治療の最終投与から１００日より長い日であっても、腫瘍の縮小を顕著に誘導した。ＡＢＸ／ＧＥＭの投与後のＡＣＴの適用は、最初の薬剤投与後５０日目に、ＡＢＸ／ＧＥＭ単独と比較して、腫瘍体積が９０％減少した（Ｐ＝０．００１）。一部のマウスは完全寛解した。１２０日目においても、ＡＢＸ／ＧＥＭ＋ＡＣＴ群の５０％のマウスは、ＡＢＸ／ＧＥＭ単独群の１０％に対し、腫瘍体積５０ｍｍ³未満と安定した完全寛解を維持していた。同様の活性は、ＯＮＩ治療でも観察された。試験開始後５０日目に、ＯＮＩ＋ＡＣＴ群はＯＮＩ単独群と比較して、腫瘍体積における８５％の減少を誘導した（Ｐ＝０．０２４）。１２０日目においても、ＯＮＩ＋ＡＣＴ（登録商標）投与群では、６０％のマウスが腫瘍体積５０ｍｍ³未満と安定した完全寛解状態にあったのに対し、ＯＮＩ単独投与群では１０％であった。したがって、完全寛解の割合における顕著な増加が存在する。化学療法薬投与の直前にＡＣＴを投与することもまた、効果の向上を示したが、化学療法薬投与後に投与した場合よりも少し少なかった。全体的に、これらの知見は、ＰＤＡＣにおけるＡＢＸ／ＧＥＭおよびＯＮＩなどの化学療法薬の治療効果を改善するＡＣＴの有用性の可能性を示しており、および、患者における評価を支持する確固たる前臨床エビデンスを提供する。それはまた、臨床試験のデザインに関する知見も提供する。

実施例３ 肝細胞癌（ＨＣＣ）皮下マウスモデルにおける治療効果－レオウイルスを用いた癌免疫療法±音響クラスタ治療
本実施例は、ＨＣＣの治療のための、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わされたＡＣＴの効果を報告する。本疾患モデルは、多くの重要な特徴においてＰＤＡＣに類似しており、J Gastrointest Oncol. 2018 Feb; 9(1): 180-195. doi: 10.21037/jgo.2017.06.09を参照）、したがって、本発明を支持する関連データを提供する。

腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスを用いてがん細胞に感染し、および破壊するがん免疫療法の一形態である。ウイルスは、我々の細胞に感染または侵入し、その後、細胞の遺伝子機構を使用して自身のコピーを作成し、その後、周囲の感染していない細胞に拡散する粒子である。最近では、すでに形成された腫瘍をターゲットにし、および攻撃するためにウイルスが使用されている。このようなウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスとして知られており、がん治療への有望なアプローチを提示している。がん細胞は、しばしば抗ウイルス防御機能が低下しているため、感染を受けやすくなっている。感染後、これらの腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に「破裂（burst）」を引き起こし、がん細胞を死滅させ、がん抗原を放出させることができる。これらの抗原は、その後、近くに残っているおよび体内の他の場所に残っている可能性のある腫瘍細胞を探し出し、および排除できる免疫応答を刺激し得る。

レオウイルス科（レオウイルス）のウイルスは、ＰＤＡＣの治療に関して広範囲に検討されており（ＮＣＴ０１２８００５８、ＮＣＴ０２６２０４２３、ＮＣＴ０３７２３９１５）、明確な証拠または治療効果が確認されている。しかしながら、レオウイルスの有効性を低下させ得る要因は、がん細胞による限定的な取り込みである。この点、ＡＣＴをウイルス療法と組み合わせることは、ウイルス取り込みを強力に増大させ得、これゆえ治療効果における増加が導かれると期待される。

研究デザイン：音響クラスタ療法（ＡＣＴ）および本発明による使用のための組成物（ＡＣＴと称される）が、腫瘍溶解性レオウイルスと組み合わせられた場合の、治療効果レベルが調べられた。

適用されたＡＣＴ手順は、実施例２に記載した通りであった。

ＨＣＣ腫瘍異種移植片を、ｂａｌｂ／Ｃマウスに皮下注射により移植した。１×１０⁷個の癌細胞が、脇腹に注入され、および試験への登録の前に約２１日間自由に成長させた。マウス（各群あたりＮ＝５）は、単独またはＡＣＴと組み合わされたレオウイルスで治療された。加えて、リン酸緩衝液生理食塩水の対照群も調べられた。ウイルスは、０、５、７、１０、１４、１６日目に、計６回投与された。１日あたり１×１０⁷プラーク形成単位（ＰＦＵ）の投与量が、ＡＣＴ投与の直前に静脈内投与された。試験期間中（２５日間）、週２回、体重および腫瘍の大きさ（体積）がノギスによる測定によりモニターされた。

結果：
平均腫瘍体積および平均の標準誤差（ＳＥＭ）の結果が、以下の表６に記載され、図７に図示された。

図７は、肝細胞癌の治療に関する腫瘍溶解性レオウイルスと組み合わされたＡＣＴの治療効果を提供している。Ｙ軸は、ｍｍ³での腫瘍体積を示す。Ｘ軸は試験開始からの経過時間を日数で示している。Ｘ軸の下部の灰色の三角形は治療日を示す。治療群は以下の通り：生理食塩水対照（逆三角形）、腫瘍溶解性ウイルス単独（黒四角）、およびＡＣＴを伴う腫瘍溶解性ウイルス（黒丸）。

表６に表示され、および図７に図示されている結果からわかるように、レオウイルス単独での処理は、ＰＢＳ対照群と比較した場合に、調査した用量では腫瘍成長の有意な阻害を示さなかった。しかしながら、同じ用量のウイルスをＡＣＴ治療を組み合わせた場合、著しくかつ顕著な腫瘍の阻害が観察され、ウイルス単独と比較して２５日目には腫瘍体積が９５％より大きな減少が観察された。２５日目には、p値は、９５％信頼区間の両側ＡＮＯＶＥ検定（Ｄｕｎｎｓ多重比較補正を用いたノンパラメトリック・クラスカル・ワリス検定）を用いて計算されて、ｐ＝０．０３７であった。

したがって、この研究は、レオウイルスによる免疫療法治療と本発明によるＡＣＴとを組み合わせた場合の強い相乗効果を確認している。実施例で使用した疾患モデルは、多くの重要な特性においてＰＤＡＣに類似しているので、同様の相乗効果がＰＤＡＣの治療に期待されるであろう。

実施例４（プロスペクティブ）。膵臓癌のための同系マウスモデルにおける、ＰＤ－１抗体を用いた音響クラスタ療法（ＡＣＴ）のパイロット試験
序論：多くのがん種で大きな成功を収めているにもかかわらず、免疫チェックポイント阻害剤などのがん免疫療法は、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）患者において有意義な効果を全く示さない。この無効性に寄与する３つの主な要因は、1）低い腫瘍の免疫原性、２）低い細胞の動員、３）サイトカインによるＴ細胞の不活性化、である。高い間質液圧を有する間質線維形成は、Ｔ細胞の浸潤を物理的に妨げ、化学的に引き起こされた腫瘍内低酸素は、間質細胞から免疫抑制サイトカインを放出し、Ｔ細胞活性化を抑制する［Hilmiら, World J Gastroenterol 24, 2137-2151］。超音波（ＵＳ）媒介薬物デリバリーのための新規アプローチである音響クラスタ療法（ＡＣＴ）［Sontumら, International Journal of Pharmaceutics 495 (2015) 1019-1027］は、負に帯電したマイクロバブルおよび正に帯電したマイクロ液滴のクラスタの分散液を使用して、局所的ＵＳ超音波照射に際して血管の局在的透過性が増大されて腫瘍組織中への薬剤の血管外滲出を可能にする。ＰＤＡＣの血管透過性を増大させるためにＡＣＴ法を用いることで、Ｔ細胞の浸潤を増加させ、Ｔ細胞の活性化を改善する免疫治療薬のデリバリーを増加させることができる。したがって、ＰＤＡＣを患う患者における免疫療法の治療成績に大きな影響を与えることにつながり得る。

目的：本研究の目的は、膵臓癌の同系マウスモデルにおいて、ＰＤ－１抗体と組み合わされたＡＣＴの抗腫瘍活性を評価することである。

実験デザイン
Ａ－膵臓癌ための同系マウスモデルを用いたＰＤ－１抗体と組み合わされたＡＣＴの抗腫瘍活性の評価。

適用されるＡＣＴ手順は、実施例２に記載されているとおりであろう。

本試験では、同系マウスＰＤＡＣモデルが使用される。このモデルは、ヒトＰＤＡＣを密接に再現することが示されているＫＰＣ遺伝子操作マウスモデル［Hingoraniら、Cancer Cell 7、469-483］［Leeら、Curr Protoc Pharmacol 73、14 39 11-14 39 20］から得られるマウスＰＤＡＣ細胞株を使用する。細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＢＬＡＣＫ ６）マウスの脇腹に皮下接種されるであろう。ＡＣＴに基づく治療の有効性を評価するため、マウスは、４つの治療群に登録され得る：（１）アイソタイプＩｇＧ対照、（２）アイソタイプＩｇＧ＋ＡＣＴのみ、（３）ＰＤ－１抗体、（４）ＰＤ－１抗体＋ＡＣＴ、１４匹／群。

ＰＤ－１抗体（０．２ｍｇ／マウス）が、０、３、７、１０日目にｉ.ｐ.投与されるであろう。腫瘍はノギスで計測し、腫瘍体積を以下の式を用いて算出する：腫瘍体積＝（ａ×ｂ２／２）、ここで、「ｂ」は最小径であり、および「a」は最大径である。確立された腫瘍が約５０～１５０ｍｍ³に達した後、マウスは、群ごとの腫瘍の大きさのばらつきを抑えるために様々な治療群にペアマッチされる。同日、スケジュールに従って抗体およびＡＣＴが投与する（計４回投与）。各マウスの個々の腫瘍がおおよそのエンドポイント（腫瘍体積が１，５００ｍｍ³より大きい）に達した時点で、マウスは調節されたＣＯ₂で犠牲死される。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）は、対照群で所定のエンドポイントに達した時点で、対照群の腫瘍の測定値を他の試験群と比較することにより算出される。

Ｂ－ＡＣＴの活性を用いた免疫細胞の増大された存在の評価。

治療による腫瘍免疫微小環境における変化を評価するため、各群から４匹のマウスが１０日目の最後の薬剤投与１時間後に犠牲死される。血液および腫瘍組織が採取される。各マウスからの腫瘍組織の半分が瞬間凍結され、および、残りの半分をホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ処理）される。ＦＦＰＥ組織が、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色ならびに免疫マーカー：Ｆ４／８０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｆｏｘｐ３を含む免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて分析される。

結果（プロスペクティブ）：結果は、抗ＰＤ１治療単独と比較して、ＡＣＴとの組み合わせは、次の治療効果エンドポイントの１つ以上を満たすことをもたらすということを示すであろう：ＴＧＩにおける顕著な増加、全生存期間の中央値の顕著な増加、免疫細胞の腫瘍浸潤の顕著な増加。

したがって、この試験は、抗ＰＤ１を用いる免疫療法治療を本発明によるＡＣＴと組み合わせた場合の強力な相乗効果を確認するであろう。

実施例５（プロスペクティブ） 種々のマイクロバブルおよびマイクロ液滴成分を有するクラスタ組成物の製造
本発明がＣ１およびＣ２の様々な化学組成物に適用可能であることを示すために、いくつかの製剤が製造または商業的に調達され、および、得られたクラスタ組成物のインビトロ属性を調べる。

Ｃ１実施例
市販のマイクロバブルＵＳイメージング剤Ｓｏｎｏｖｕｅ（Bracco Spa、イタリア）およびＭｉｃｒｏｍａｒｋｅｒ（VisualSonics Inc、米国）が調達され、Ｃ１成分として使用される。Ｓｏｎｏｖｕｅは、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールナトリウム、パルミチン酸およびＰＥＧ４０００の膜で安定化された六フッ化硫黄のマイクロバブルであり、５ｍＬの水性マトリックスと再構成され得るように凍結乾燥形状で提供される。Ｍｉｃｒｏｍａｒｋｅｒは、リン脂質、ポリエチレングリコール、および脂肪酸で安定化されたパーフルオロブタン／窒素マイクロバブルであり、０．７ｍＬの水性マトリックスを用いて再構成される凍結乾燥形状で提供される。

Ｃ２実施例
以下の拡散性成分を含むマイクロ液滴（Ｃ２）成分；
パーフルオロジメチルシクロブタン、２－（トリフルオロメチル）パーフルオロペンタン、およびパーフルオロヘキサン
は、以下のように製造されるであろう。

ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）７９０ｍｇおよびステアリルアミン（ＳＡ）８．１ｍｇが２５０ｍＬ丸底フラスコに秤量され、およびクロロホルム５０ｍＬが加えられる。サンプルは、透明な溶液が得られるまで温水で加熱される。クロロホルムは、３５０ｍｍＨｇおよび４０℃のロータリーエバポレーターで蒸発乾固され、続いてさらに５０ｍｍＨｇでデシケーター内で一晩乾燥されることにより除去される。その後、１６０ｍＬの水が加えられ、フラスコは再びロータリーエバポレーターにかけられ、脂質が、全回転速度および８０℃の水浴温度で、２５分間再水和される。得られた脂質分散液は、適切なバイアルに移され、使用まで冷蔵庫内で保存される。

エマルションは、１ｍＬの冷却された脂質分散液のアリコートを、２ｍＬのクロマトグラフィーバイアルに移すことによって調製される。６個のバイアルのそれぞれに、上記で詳述したように１００μｍのフルオロカーボンオイルが加えられる。クロマトグラフィーバイアルは、ＣａｐＭｉｘ（Espe, GmbH）上で７５秒間振盪される。得られたエマルションは、遠心分離および下澄液の除去によって３回洗浄され、その後、等量の５ｍＭ ＴＲＩＳバッファーが添加される。バイアルは直ちに氷上で冷却され、プールされ、および使用まで冷温保存される。

コールターカウンター分析が、マイクロ液滴の体積濃度および直径を決定するために行われ、そしてその後、エマルションは、分散相濃度４μＬのマクロ液滴／ｍＬとなるように５ｍＭ ＴＲＩＳバッファーを用いて希釈される。

クラスタ組成物の調製は、ＳｏｎｏｖｕｅまたはＭｉｃｒｏｍａｒｋｅｒを、それぞれ５ｍＬまたは０．７ｍＬの上記のＣ２成分のそれぞれで再構成することによって行われるであろう。

結果（プロスペクティブ）
成分Ｃ１およびＣ２の混合により、全ての６つの組み合わせが、３～１０μｍである平均直径を有する、１ｍＬあたり１０００万個より多いクラスタを含むと予想される。

Claims (24)

1. すい臓がんの治療方法における使用のための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
   （ａ）水性の生体適合性溶媒中のクラスタの懸濁液を含むクラスタ組成物であって、前記クラスタが１～１０μｍの範囲の平均直径、および０．９より小さい円形度を有し、ならびに、
   （ｉ）ガスマイクロバブルと前記マイクロバブルを安定化するための第１の安定化剤とを含む第１の成分、および
   （ii）油相を含むマイクロ液滴と前記マイクロ液滴とを安定化するための第２の安定化剤とを含む第２の成分であって、前記油が、前記ガスマイクロバブル中に拡散することのできるために少なくとも一時的にそれらのサイズを増大させる拡散性の成分を含む第２の成分
   を含み、前記第１の成分および前記第２の成分の前記マイクロバブルおよび前記マイクロ液滴が、反対の表面電荷を有し、および、静電的相互作用を介して前記クラスタを形成しているクラスタ組成物、
   （ｂ）前記（ａ）とは別個の組成物として提供される、化学療法薬および免疫療法薬またはそれらの組み合わせの群から選択される治療薬
   を含む医薬組成物。
2. 前記第１の成分の前記ガスマイクロバブルのガスが、六フッ化硫黄、Ｃ３～Ｃ６のパーフルオロカーボン、窒素、空気またはそれらの混合物を含む請求項１記載の使用のための請求項１記載の医薬組成物。
3. 前記第１の安定化剤および前記第２の安定化剤が、それぞれ、他方と反対である正味の静電荷を有している請求項１記載の使用のための請求項１または２記載の医薬組成物。
4. 前記第１の安定化剤および前記第２の安定化剤が、それぞれ独立して、リン脂質、タンパク質、ポリマー、ポリエチレングリコール、脂肪酸、正に帯電した界面活性剤、負に帯電した界面活性剤またはこれらの混合物を含む請求項１記載の使用のための請求項３記載の医薬組成物。
5. 前記第２の成分の前記マイクロ液滴の前記油相が、部分的にまたは完全にハロゲン化された炭化水素またはそれらの混合物を含む請求項１記載の使用のための請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記クラスタが、３～１０μｍの範囲の、好ましくは４～９μｍの範囲の平均の直径を有している請求項１記載の使用のための請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. １～１０μｍの範囲のサイズであるクラスタのクラスタ濃度が、少なくとも約２５００万／ｍＬである請求項１記載の使用のための請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記治療薬が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞障害性抗生物質、免疫治療薬およびサイトカイン治療薬の群から選択される請求項１記載の使用のための請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 前記治療薬が、リポソーム、コンジュゲート、ナノ粒子またはミクロスフェアの形状で含まれるビヒクル中に製剤化される請求項１記載の使用のための請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記治療薬が、ナブ－パクリタキセル、リポソームイリノテカン、およびチェックポイント阻害剤などの免疫治療薬の群から選択される請求項１記載の使用のための請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記使用が、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療のためのものである請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 前記使用が、ステージ０～IVのいずれかである膵管腺癌の治療のためのものである請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 前記使用が、以下の工程；
    （ｉ）膵臓癌を患う哺乳動物対象に前記医薬組成物を投与する工程であって、少なくとも１つの治療薬が、前記クラスタ組成物とは別に、事前に、および／または共に、および／または事後に投与される工程、
    （ii）任意には、前記対象内の治療のために標的領域を同定するために、超音波イメージングを用いて前記医薬組成物の前記クラスタをイメージングする工程、
    （iii）前記対象内の標的領域の超音波照射により、前記工程（ｉ）からの前記クラスタ組成物の前記第２の成分の前記拡散性成分のフェーズシフトを活性化する工程、
    （iv）さらなる超音波照射により、前記工程（ｉ）で投与された前記治療薬の血管外漏出を促進させる工程
    を含む音響クラスタ療法（ＡＣＴ）治療を含む請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 前記クラスタ組成物が、前記第１の成分および前記第２の成分が混合されてから３時間という時間ウィンドウのあいだに投与され得る請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. フェーズシフトを活性化する前記工程（iii）が、１～１０ＭＨｚの周波数および０．１～０．７の機械的指数での超音波照射を用いて行われる請求項１３または１４記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. 血管外漏出を促進させる前記工程（iv）が、３３０～６５０ｋＨｚの周波数および０．１５～０．４の機械的指数での超音波照射を用いて行われる請求項１３～１５のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
17. 前記ＡＣＴ治療の前記工程（ｉ）～（iv）が１～４回繰り返される請求項１３～１６のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
18. 多剤併用治療の一部として行われる請求項１３～１７のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
19. フェーズシフトを活性化する前記工程（iii）の前記超音波照射が、前記工程（ｉ）の直後に開始され、および、血管外漏出を促進させる前記工程（iv）の前記超音波照射がその直後に続く請求項１３～１８のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. 前記工程（iii）の前記超音波照射が、３０～１２０秒間継続し、続いて、前記工程（iv）の前記超音波照射が、３～１０分間継続する請求項１３～１９のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
21. １～５個の治療薬が、あるタイムスパンで、同時にまたは順次投与され、ここで、例えば１～５回などの少なくとも１回のＡＣＴ治療が同じ期間のあいだに行われる請求項１３～２０のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
22. 広帯域または二周波のＵＳトランスデューサが、前記工程（iii）の前記活性化の超音波照射および前記工程（iv）の増強の前記超音波照射の両方に使用される請求項１３～２１のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
23. 治療薬をデリバリーする方法であって、以下の工程：
    （ｉ）ＰＤＡＣを患う対象に、請求項１記載の医薬組成物を投与する工程であって；少なくとも１つの治療薬が、別々に前記クラスタ組成物に事前に、および／または共に、および／または事後に、および、前記工程（ii）～（iii）の前に、または前記工程（ii）～（iii）のいずれかの後に、投与される工程、
    （ii）任意には、前記対象内の治療のために前記標的領域を同定するために、超音波イメージングを用いて前記医薬組成物のクラスタをイメージングする工程、
    （iii）前記対象内の標的領域の超音波照射により、前記工程（ｉ）からの前記クラスタ組成物の前記第２の成分の前記拡散性成分のフェーズシフトを、
    （ａ）前記クラスタの前記マイクロバブルが、前記拡大されたバブルによる前記標的領域での微小循環の一時的な遮断に起因して前記標的領域に局在化される拡大されたバブルをもたらすために、前記工程（iii）の前記拡散性成分によって、拡大され；および
    （ｂ）前記工程（ｉ）で投与される前記治療薬の血管外漏出を促進する
    ように、活性化する工程；
    （iv）さらなる超音波照射により、前記工程（ｉ）で投与された前記治療薬の血管外漏出をさらに促進させる工程
    を含む方法における使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
24. 前記使用が、前記治療薬単独を用いる場合と比較して、以下の：
    治療薬の改善された取り込み、腫瘍の成長の阻害、誘導された腫瘍の収縮、腫瘍体積の減少、生存時間の改善、完全奏功が見られる治療された対象の増加された割合
    の一または複数の形状の治療効果における増強を提供する請求項１～２２のいずれか１項に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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