KR20230024922A - 초음파-매개된 요법의 개선 - Google Patents

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빅토르 자노
에블린 카퀴벨-비헬
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브라코 스위스 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 기체-충전된 미세소포와 조합된 초음파-매개된 치료적 처리의 분야에 관한 것이다. 그것은 특히 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시켜, 상기 치료적 처리에 의해 유발되는 혈관 경련 효과를 감소시키는 것과 관련이 있다.

Description

초음파-매개된 요법의 개선
본 발명은 일반적으로 기체-충전된 미세소포와 조합된 초음파-매개된 치료적 처리의 분야에 관한 것이다. 특히, 그것은 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키는데 사용하기 위한 혈관 경련 억제자에 관한 것이다. 또한, 그것은 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.
기체-충전된 미세소포 (MV)는, 음장에 제출될 때, (i) 기체-충전된 미세소포에 음향적 및 기계적 성질을 부여하는, 공동화(cavitation)라고도 불리는, 진동, 및 (ii) 가열과 같은 다양한 과정을 통해 수신된 음향 에너지를 산란시키는 음향 공명기이다.
지난 수십 년 동안, 기체-충전된 미세소포의 음향적 성질은 주로 조영 증강 초음파 이미지화 (Contrast-Enhanced Ultrasound imaging: CEUS)에 이용되었다. 하지만, 기체-충전된 미세소포의 기계적 및 가열 성질은 현재 의약 (Ref. 1) 또는 유전자 전달을 촉진하거나/증가시키거나, 혈전 붕괴 (Ref. 2), 혈액 뇌 장벽 개방 (Ref. 3), 면역조절 (Ref. 4), 신경조절 (Ref. 5), 방사선 감작 (Ref. 6), MV 증강 열 절제 (Ref. 7), 고체온(hyperthermia) (Ref. 8)을 돕거나, 또는 비-열 조직 절제 (Ref. 9)을 돕는 것과 같은 초음파-매개된 요법으로의 적용에 대해 평가 중이다.
치료용 초음파 (US)는 보통, 일반적으로 진단 이미지화에 적합하지 않은 높은 기계적 지수 및 긴 펄스 지속 기간을 특징으로 하는 고강도 초음파로 이루어진다.
초음파-매개된 요법에서 기체-충전된 미세소포의 적용 횟수가 증가하지만, 출원인은 그럼에도 이들 조합 치료적 처리가 특정 초음파 입사(insonation) 조건 하에서 효능의 감소를 겪을 수 있다는 것을 이제 관찰하였다.
출원인은 예상치 못하게 기체-충전된 미세소포 및 초음파-매개된 요법의 사용과 조합된 혈관 경련 억제자 (VI)의 사용이 전체적인 치료 효능을 개선할 수 있다는 것을 이제 발견하였다.
사실은, 출원인은 이러한 치료적 처리에서 효능의 (실질적인) 감소는 초음파/기체-충전된 미세소포 노출시 대상체에서 일어나는 일시적인 혈관 운동 반응과 관련이 있을 수 있다는 것을 관찰하였다. "혈관 경련"이라고도 알려진 이러한 현상이 문헌에 기재되어 있지만 (예를 들어, Ref. 10 참조), 출원인이 아는 한, 그것은 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 사용을 기반으로 하는 치료적 처리의 효능 감소와 관련이 없다.
유리하게는, 출원인에 의해 제안된 해결책은 상기 언급된 치료적 효능의 감소를 실질적으로 제한하거나 방지할 수 있게 하는 반면에, 상기 효능은 혈관 경련 억제자의 부재시 수행된 조합 미세소포/초음파-매개된 처리에 관하여 특히 향상된다. 또 다른 측면에서 보면, 이러한 혈관 경련 억제자의 사용이 조합 미세소포/초음파-매개된 처리의 허용 가능한 수준의 치료적 효능을 유지할 수 있게 한다.
예를 들어, Ref. 11은 환자에게로의 조영제 및 관상 혈관 확장제의 투여를 수반하는, 진단적 이미지화를 위한 개선된 방법을 다룬다.
Ref. 12는 증강된 이미지를 생성하는데 사용하기 위한 주사 가능한 수성 기체 분산제 및 혈관 확장제, 즉 아데노신을 포함하는 조합된 조제물을 다룬다.
Ref. 13은 상기 캡슐화된 생체활성제를 방출함으로써 필요로 하는 환자에서 국소화된 혈관 확장을 촉진하기 위한 캡슐화된 생체활성 기체를 포함하는 기체 캡슐화된 음향적으로 반응성인 안정화된 미세기포에 관한 것이다.
출원인의 지식에 따르면, 따라서 치료적 처리에서 초음파 및 기체-충전된 미세소포의 조합 사용의 치료적 효능 감소를 제한하거나 방지하기 위한 혈관 경련 억제자의 사용은 기재된 적이 없다.
본 발명의 양태는 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키는데 사용하기 위한 혈관 경련 억제자 (VI)에 관한 것이다.
구체예에서, 상기 혈관 경련 억제자는 디하이드로피리딘 칼슘 차단제, α-차단제 및 니트로 혈관 확장제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 구체예에서, 상기 혈관 경련 억제자는 바람직하게는 니모디핀, 니페디핀, 마그네슘, 파라조신 및 니트로글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더 바람직하게는 상기 혈관 경련 억제자는 니모디핀이다.
상기 혈관 경련 억제자는 기체 충전된 미세소포의 현탁액에 관하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
VI가 기체-충전된 미세소포의 현탁액과 동시에 투여될 때, 그것은 VI를 포함하는 미세소포의 현탁액으로서 동시 투여될 수 있거나 또는 2개의 별개의 용액으로서 동시 투여될 수 있다.
VI가 기체-충전된 미세소포의 현탁액에 관하여 순차적으로 투여될 때, 그것은 바람직하게는 사전에, 예를 들어, 기체-충전된 미세소포의 현탁액 전 1초 내지 15분에, 바람직하게는 5초 내지 12분 전에, 더 바람직하게는 적어도 10분 전에 미리 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료용 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리 방법에 관한 것으며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계.
특히, 상기 방법에서 혈관 경련 억제자의 사용은 상기 조합 치료적 처리의 효능을 향상시킨다.
구체예에서, 본 발명의 약물 전달 프로토콜은 치료용 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a') 대상체의 혈관계에 생체활성제를 투여하는 단계;
a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계.
특히, 상기 방법에서 혈관 경련 억제자의 사용은 상기 조합 치료적 처리의 효능을 향상시킨다.
본 발명의 구체예에서, 개시된 방법의 단계 a') 및 단계 a)는 동시에 또는 순찾거으로 수행된다.
도 1: US+VI로의 처리 동안의 종양 관류의 정량화. 상부 패널: VI 전처리 없음; 하부 패널: VI 전처리.
출원인은 초음파 요법에서 기체-충전된 미세소포와 함께 혈관 경련 억제자 (VI)의 투여가 치료적 처리의 효능을 개선할 수 있다는 것을 발견하였다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효능"은 치료적 초음파 및 기체-충전된 미세소포 (US-MV)의 조합이 유익한 치료 효과를 제공하는 능력을 나타낸다.
예를 들어, 약물 전달을 의한 US-MV의 조합 사용의 효능은 표적 지역의 혈관 구획에서 생체활성 분자 (예를 들어, 치료제 또는 조영제)의 농도를 향상시키는데 있어서의 그것의 능력; 혈관을 통한 유출의 정도 및/또는 세포내 전달의 정도에 의해 추정될 수 있다.
음파 혈전 용해(sonothrombolysis) (즉, 혈전의 붕괴)를 위한 US-MV의 조합 사용에 있어서, 치료의 효능은 직접적인 방식으로, 예를 들어, 이미지화 추적 검사에 의해 (예를 들어, 혈관조영술, 컴퓨터 단층촬영술, 레이저 도플러(laser doppler), 조영 증강 초음파 이미지화 또는 자기 공명 이미지화에 의해) 또는 간접적인 방식으로, 예를 들어, 혈액 샘플의 생물학적 분석에 의해; 심전도 변화; 및/또는 임상적 개선(들) (예를 들어, 신경학적 기능 또는 심장 기능)의 평가에 의해, 예를 들어, 관류를 향상시키거나 혈관의 재소통(recanalization)을 유발하는데 있어서의 그것의 능력으로 추정될 수 있다.
MV 증강 열 절제를 위한 US-MV의 조합 사용의 효능은, 예를 들어, 특정 부피의 조직의 온도 증가를 측정함으로써 및 이 온도에 도달하는데 필요한 초음파 처리 시간의 감소에 의해; 열 증가에 도달하는데 필요한 음향 에너지 또는 파워의 감소에 의해; 또는 이미지화에 의한 조직 손상의 추적 검사에 의해 평가될 수 있다.
MV 증강 고체온을 위한 US-MV의 조합 사용의 효능은, 예를 들어, 특정 부피의 조직에서 온도의 증가를 측정함으로써 (예를 들어, 자기 공명 온도 측정법, 또는 열전대에 의해); 고체온을 달성하는데 필요한 음향 에너지 또는 파워의 감소에 의해; 약물 전달의 추적 검사에 의한 처리된 지역에서 혈류의 증가에 의해 (예를 들어, 혈관조영술, 자기 공명 이미지화, 컴퓨터 단층촬영술, 레이저 도플러, 조영 증강 초음파 이미지화에 의해) 및/또는 "약물 전달"에 대해 하기 기재된 유사한 추정에 의해 평가될 수 있다.
BBB 개방을 위한 US-MV의 조합 사용의 효능은, 예를 들어, 혈관에서 뇌로의 혈관을 통한 생체활성 분자 (예를 들어, 치료제 또는 조영제)의 유출을 향상시키는데 있어서의 그것의 능력에 의해 평가될 수 있다.
신경조절, 즉, US+MV에 의해 유도된 신경 기능의 조절은 US-MV의 조합 사용이 적용되는 또 다른 치료 적용 분야이다. 이 경우에, 조합 US-MV 처리의 효능은, 예를 들어, 뉴런의 전기적 활성의 변화에 의해 평가될 수 있다.
US 및 MV를 사용하여 방사선 요법 (RT)의 효과를 향상시킴으로써 방사선 감작, 즉, 종양의 치료에 적용하기 위한 US-MV의 조합 사용의 효능은, 예를 들어, 다음 중 어느 것에 의해 강조되는 치료 유도된 병변의 존재를 검출함으로써 평가될 수 있다: 조직 혈액역학의 변화; US+RT에 노출된 조직에서 세포사 및 아폽토시스(apoptosis) 수준의 증가; 1주에 걸친 종양 성장의 감소 및/또는 생존의 증가.
비-열 절제에 적용하기 위한 US-MV의 조합 사용의 효능은, 예를 들어, 강조된 치료 유도된 병변(들)의 존재를 검출함으로써, 예를 들어, 혈류의 감소에 의해 및/또는 초음파 처리된 조직에서 괴사 및 아폽토시스의 추적 검사에 의해 평가될 수 있다.
US-MV의 조합 사용은 또한 항-종양 요법에 적용되어, 면역조절, 즉, 항-종양 면역 반응의 자극에 의한 항-종양 효과를 발휘할 수 있다. US-MV 유도된 면역조절이 면역요법제 (예를 들어, DNA, mRNA, 약물 또는 항체)의 전달을 위해 열 절제, 가벼운 고체온, 기계적인 파괴, 또는 혈관 투과화과 같은 다양한 메커니즘을 통해 달성될 수 있기 때문에, 이들 메커니즘을 개선하는 것이 면역조절 효과를 개선할 수 있을 것으로 예상된다. 면역조절에 적용하기 위한 US-MV의 조합 사용의 효능은, 예를 들어, 면역 반응의 유도 또는 변형; 면역요법에 대한 반응의 변형 및/또는 생물학적 반응 (예를 들어, 종양 성장)의 변형에 의해 평가될 수 있다.
상세한 설명 및 청구범위에서, 표현 "치료용 초음파 및 기체-충전된 미세소포의 현탁액의 조합 사용" (간략히 "US-MV의 조합 사용")은 기체-충전된 미세소포의 현탁액과 조합된 치료적 초음파의 사용을 기반으로 하는 임의의 치료적 처리를 나타낸다.
상기 언급된 바와 같이, 이들 치료적 처리는, 예를 들어, 혈관 투과화를 증가시키기 위해, 예를 들어, 의약 또는 유전자의 전달을 촉진하거나/증가시키거나, 혈전의 붕괴, 혈액 뇌 장벽의 개방, 면역조절, 신경조절, 방사선 감작을 돕거나, 또는 고체온, MV 증강 열 절제 및 비-열 조직 절제를 돕기 위해 사용될 수 있다.
표현 "치료용 초음파"는 본원에서 사용된 바와 같이 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 생물학적 효과를 달성하기 위한 초음파의 사용을 나타낸다. 상세한 설명 및 청구범위에서 표현 "치료용 US" 또는 "치료적 US"가 교체 가능하게 사용된다.
치료용 초음파는 다양한 유형의 변환기에 의해 생성될 수 있다. 치료용 초음파에 적합한 변환기의 예는 단일 또는 다수의 피에조(piezo)-전기 소자가 장착된 집속(focused) 변환기 또는 비집속 변환기이다.
일반적으로 치료용 초음파는 전용 플랫폼 (예를 들어, MRI 스캐너와 커플링됨) 및 임상적 초음파 검사 플랫폼에 의해 제공된다.
생물학적 효과를 달성하기 위해, 치료용 초음파의 여러 파라미터가 고려되어야 한다.
치료용 초음파는 일반적으로 바람직하게는 수초, 즉, 1초, 내지 170 min에 포함되는 치료 기간을 특징으로 한다. 표현 "치료 기간"은 본원에서 사용된 바와 같이 관심있는 영역에서 초음파 적용의 시작과 그 끝 사이의 전체 기간을 나타낸다. 치료 기간의 단위는 시간이다.
치료용 초음파를 특성화하는 펄스 길이는 일반적으로 5 μs 내지 60 s에 포함되며, 바람직하게는 5 μs 내지 10 s에 포함되고, 더 바람직하게는 펄스 길이는 100 μs 내지 5 ms에 포함된다. 표현 "펄스 길이"는 펄스의 시작 ("온(on)")에서 상기 펄스의 끝 ("오프(off)")까지의 시간을 나타내며, 펄스가 "온" 상태인 실제 시간을 나타낸다. 펄스 길이의 단위는 시간 (예를 들어, 마이크로초 내지 초)이다.
치료용 초음파의 주파수는 일반적으로 20 kHz에서 최대 70 MHz, 바람직하게는 0.10 MHz 내지 50 MHz, 더 바람직하게는 약 0.15 내지 약 2 MHz로 구성된다. 용어 "주파수"는 특정 기간에 일어나는 특정 이벤트의 수를 나타낸다. 주파수의 단위는 헤르츠(Hertz) (즉, 1/s)이다.
치료용 초음파의 음압은 일반적으로 10 kPa 내지 100 MPa로 구성되며, 바람직하게는 20 kPa 내지 50 MPa에 포함되고, 더 바람직하게는 50 kPa 및 25 MPa에 포함된다.
치료용 초음파의 음향의 강도 (watt/cm2 또는 W/cm2)는 일반적으로 0.1 내지 990 W/cm2에 포함되며, 바람직하게는 1.3 W/cm2 내지 21.5 W/cm2에 포함되고, 더 바람직하게는 1.3 내지 5 W/cm2에 포함된다. 표현 "음향의 강도"는 소리 빔(beam)의 단위 면적 당 음파에 의해 운반되는 힘을 나타낸다. 음향의 강도의 단위는 watts/cm2이다.
치료적 초음파는 대부분의 경우에 진단적 초음파와 상이한 주파수에서 수행된다. 구체적으로, 낮은 감쇠를 달성하기 위해서 낮은 주파수에서 치료적 초음파를 수행하는 것이 바람직한 반면에, 더 나은 해상도를 얻기 위해 높은 주파수가 진단적 초음파에 이용된다 (Ref. 14).
치료용 초음파는 또한 생물학적 효과를 유도하는 능력으로 인해 진단적 초음파와 구별될 수 있다 (MV와의 조합 여부에 관계없이).
요법을 위해서, 초음파는 가열, 뿐만 아니라 음향 공동화, 방사력, 전단 응력 및 음향 유동/미세유동, 충격파 또는 다른 미결정 비열 과정을 포함하는 비열 메커니즘을 통해서도 효과를 유도할 수 있다. 열 효과 및 음향 공동화가 가장 큰 효과이고, 그것들의 작용 메커니즘 및 생물학적 효과는 해당 분야에 공지되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 치료용 US는 치료적 초음파 처리를 거친 대상체에 대해, 예를 들어, 국소적 온도 증가, 용기 투과화, 혈관 파열 및/또는 전단 응력을 포함하는 생물학적 효과를 유도할 수 있는 초음파를 나타낸다.
열 효과는 온도 및 치료 기간에 의존적이다. 예를 들어, 낮은 온도 증가 (예를 들어, 43℃ 초과, 1시간)는 조직을 화학요법 또는 방사선요법에 민감하게 만드는 반면, 더 높은 온도 증가 (예를 들어, 56℃, 1 sec)는 열 응고 및 세포사와 같은 비가역적 손상을 유발할 것이다.
치료용 US의 음향 공동화 및 기계적 효과는 상당한 정도의 기계적 및 열 효과, 뿐만 아니라 화학적 및 광학적 효과를 유발하여 국소적 온도 증가, 혈관 투과화, 혈관 파열, 세포사 및 전단 응력 과 같은 다양한 생물학적 효과로 이어진다.
구체예에서, 치료용 US는 혈관 투과화를 유도할 수 있는 US를 나타낸다.
치료용 초음파는 증상성 자궁 섬유증, 암 (예를 들어, 유방암 및 간암, 전립선암), 통증 및 신경학적 장애와 같은 다양한 유형의 병리 상태의 조직 열 절제에 광범위하게 사용되지만, 또한 음파 혈전 용해 및 히스토트립시(Histotripsy)에도 사용된다.
치료용 초음파와 조합으로 MV의 사용은 음향 공동화가 수반되는 것으로 알려진 많은 상이한 치료 반응의 효과를 향상시킨다. 실제로, 주사될 때, MV는 공동핵의 역할을 하여, 음향 공동화의 임계치를 낮춘다. US 조건을 조정하면, MV의 공동화 양생법을 제어하여 더 높은 에너지를 위해 진동의 안정한 양생법 (안정한 공동화)에서 격렬한 붕괴로 이동시키는 것이 가능하다. 이 공동화 양생법은 열 절제 (MV 증강 열 절제)를 개선하고, 혈전을 용해시키고 (음파 혈전 용해), 혈관 투과시켜 (혈액 뇌 장벽 개방) 특이적인 약물 또는 유전자 전달을 달성하기 위해, 면역조절, 신경조절, 방사선 감작, 고체온 및 조직의 비-열 절제를 돕는데 선택적으로 사용될 수 있다.
용어 "기체-충전된 미세소포"는 본원에서 사용된 바와 같이 안정화 물질의 외피 또는 층 (필름 형성 층 포함)으로 둘러싸인 마이크로미터 또는 나노미터 크기의 기포를 포함하는 임의의 구조를 포함한다. 용어는 기체-충전된 리포솜, 미세기포, 미소구체, 미세풍선 또는 미소캡슐로서 해당 분야에 공지된 것들을 포함한다. 안정화 물질은, 예를 들어, 계면활성제, 지질, 스핑고지질(sphingolipid), 올리고지질, 당지질, 인지질, 단백질, 폴리펩타이드, 탄수화물, 및 합성 또는 천연 폴리머 물질을 포함하는 전형적으로 해당 분야에 공지된 임의의 물질일 수 있다.
용어 기체-충전된 미세소포의 "전구물질"은 기체의 존재 하에 수성 담체로 복원될 때 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 제공하는 임의의 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 전형적으로 기체의 존재 하에 수성 현탁액을 흔들 때 기체-충전된 미세소포를 형성할 수 있는 건식 분말 형태 (예를 들어, 동결건조되거나 또는 분무건조된 형태)의 상기 인용된 안정화 물질을 포함한다.
용어 "미세기포"는 기포가 기체와 액체의 계면에 배치된 양친매성 안정화 물질을 수반하는 매우 얇은 외피 (필름)에 의해 기체/액체 계면에 결합된 수성 현탁액을 포함한다. 미세기포 현탁액은 이후에, 바람직하게는 제조 직후에 투여될 수 있는 미세기포 현탁액을 생성하기 위해 교반하면서, 적합한 전구물질, 예컨대 분말 양친매성 물질 (예를 들어, 동결건조된 사전형성된 리포솜 또는 동결건조된 또는 분무건조된 인지질 용액)을 공기 또는 다른 기체와 접촉시킨 다음 수성 담체와 접촉시킴으로써 제조될 수 있다.
기체-충전된 미세기포는 일반적으로 하나 이상의 양친매성 구성요소에 의해 안정화된다. 미세기포의 안정화 외피를 형성하는데 적합한 양친매성 구성요소는, 예를 들어, 인지질; 리소인지질; 지방산, 예컨대 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산 또는 올레산; 지질 함유 폴리머, 예컨대 키틴, 히알루론산, 폴리비닐피롤리돈 또는 "페길화된 지질"이라고도 불리는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 지질 함유 설폰화된 단당류, 이당류, 올리고당 또는 다당류; 콜레스테롤, 콜레스테롤 설페이트 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트; 토코페롤 헤미숙시네이트; 에테르 또는 에스터-연결된 지방산을 가진 지질; 폴리머화된 지질; 디아세틸 포스페이트; 디세틸 포스페이트; 세라미드; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터 (예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 지방 알콜, 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 폴리옥시에틸화된 소르비탄 지방산 에스터, 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 리시놀레에이트, 에톡실화된 대두 스테롤, 에톡실화된 피마자유 또는 에틸렌 옥시드 (EO) 및 프로필렌 옥시드 (PO) 블록 코폴리머; 콜레스테롤 부티레이트, 콜레스테롤 아이소-부티레이트, 콜레스테롤 팔미테이트, 콜레스테롤 스테아레이트, 라노스테롤 아세테이트, 에르고스테롤 팔미테이트, 또는 파이토스테롤 n-부티레이트를 포함하는 스테롤 지방산 에스터; 콜레스테롤 글루쿠로니드, 라노스테롤 글루쿠로니드, 7-데하이드로콜레스테롤 글루쿠로니드, 에르고스테롤 글루쿠로니드, 콜레스테롤 글루코네이트, 라노스테롤 글루코네이트, 또는 에르고스테롤 글루코네이트를 포함하는 당산의 스테롤 에스터; 라우릴 글루쿠로니드, 스테아로일 글루쿠로니드, 미리스토일 글루쿠로니드, 라우릴 글루코네이트, 미리스토일 글루코네이트, 또는 스테아로일 글루코네이트를 포함하는 당산 및 알콜의 에스터; 수크로스 라우레이트, 프럭토스 라우레이트, 수크로스 팔미테이트, 수크로스 스테아레이트, 글루쿠론산, 글루콘산 또는 폴리우론산을 포함하는 지방산을 가진 당의 에스터; 사르사사포게닌, 스밀라게닌, 헤데라게닌, 올레아놀산, 또는 디기톡시게닌을 포함하는 사포닌; 글리세롤 tri팔미테이트, 글리세롤 디스테아레이트, 글리세롤 트리스테아레이트, 글리세롤 디미리스테이트, 글리세롤 트리미리스테이트, 글리세롤 디라우레이트, 글리세롤 트리라우레이트, 글리세롤 디팔미테이트를 포함하는 글리세롤 또는 글리세롤 에스터; N-숙시닐-디올레일포스파티딜-에탄올-아민; 1,2-디올레일-sn-글리세롤; 1,2-디팔미토일-sn-3-숙시닐글리세롤; 1,3-디팔미토일-2-숙시닐-글리세롤; 1-헥사데실-2-팔미토일글리세로-포스포에탄올아민 또는 팔미토일-호모시스테인; 적어도 하나의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18), 알킬 사슬, 예를 들어, N-스테아릴아민, N,N'-디스테아릴아민, N-헥사데실아민, N,N'-디헥사데실아민, N-스테아릴암모늄 클로라이드, N,N'-디스테아릴암모늄 클로라이드, N-헥사데실암모늄 클로라이드, N,N'-디헥사데실암모늄 클로라이드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로미드 (DDAB), 헥사데실트리메틸암모늄 브로미드 (CTAB)를 포함하는 알킬아민 또는 알킬암모늄 염; 하나 또는 바람직하게는 2개의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18), (C3-C6) 알킬렌 다리를 통해 N-원자에 연결된 아실 사슬, 예를 들어, 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DSTAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DPTAP), 1,2-올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판 (DSDAP)을 포함하는 3차 또는 4차 암모늄 염; 및 그것들의 혼합물 또는 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인지질"은 임의의 양친매성 인지질 화합물을 포함하려는 의도가 있으며, 그것의 분자는 최종 미세기포의 현탁액에서 기체-물 경계면에서 물질의 안정화 필름 (전형적으로 단분자층의 형태)을 형성할 수 있다. 따라서, 이들 물질은 또한 해당 분야에서 "필름 형성 인지질"이라고 불린다.
인지질은 전형적으로 적어도 하나의 포스페이트 기 및 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 친유성 장쇄 탄화수소 기를 함유한다.
적합한 인지질의 예는 지방산의 하나 또는 바람직하게는 2개의 (동일하거나 상이한) 잔기 및 인산을 가진 글리세롤의 에스터를 포함하며, 인산 잔기는 친수성 기, 예를 들어, 콜린 (포스파티딜콜린 - PC), 세린 (포스파티딜세린 - PS), 글리세롤 (포스파티딜-글리세롤 - PG), 에탄올아민 (포스파티딜에탄올아민 - PE), 이노시톨 (포스파티딜이노시톨 - PI)에 차례로 결합한다. 단 하나의 지방산 잔기를 가진 인지질의 에스터는 일반적으로 해당 분야에서 인지질의 "리소" 형태 또는 "리소인지질"이라고 불린다. 인지질에 존재하는 지방산 잔기는 일반적으로 장쇄 지방산이며, 전형적으로 12 내지 24개의 탄소 원자, 바람직하게는 14 내지 22개의 탄소 원자를 함유하고; 지방족 사슬은 하나 이상의 불포화를 함유할 수 있거나 바람직하게는 완전히 포화된다. 인지질에 포함되는 적합한 지방산의 예는, 예를 들어, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라킨산, 베헨산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산이다. 바람직하게는, 포화 지방산, 예컨대 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 아라킨산이 이용된다.
인지질의 추가의 예는 포스파티드산, 즉, 지방산을 가진 글리세롤-인산의 디에스터; 스핑고지질, 예컨대 스핑고미엘린, 즉, 지방산을 가진 글리세롤 디에스터의 잔기가 세라미드 사슬로 대체된 상기 포스파티딜콜린 유사체; 카르디올리핀, 즉, 지방산을 가진 1,3-디포스파티딜글리세롤의 에스터; 당지질, 예컨대 갱글리오시드 GM1 (또는 GM2) 또는 세레브로시드; 글루코지질; 설파티드 및 글리코스핑고지질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 인지질은 단독으로 또는 혼합물로서 이용될 수 있는 자연 발생, 반합성, 또는 합성으로 제조된 생성물을 포함한다.
자연 발생 인지질의 예는 천연 레시틴 (포스파티딜콜린 (PC) 유도체), 예컨대 전형적으로, 대두 또는 난황(egg yolk) 레시틴이다.
반합성 인지질의 예는 자연 발생 레시틴의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유도체이다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린, 에틸포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 또는 스핑고미엘린의 지방산 디에스터이다.
인지질의 특정 예는, 예를 들어,
디라우로일-포스파티딜콜린 (DLPC), 디미리스토일-포스파티딜콜린 (DMPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린 (DPPC), 디아라키도일-포스파티딜콜린 (DAPC), 디스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일-포스파티딜콜린 (DOPC), 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (에틸-DSPC), 디펜타데카노일-포스파티딜콜린 (DPDPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일-포스파티딜콜린 (PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일-포스파티딜콜린 (PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (SPPC), 1-팔미토일-2-올레일포스파티딜콜린 (POPC), 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 (OPPC), 디라우로일-포스파티딜글리세롤 (DLPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디아라키도일포스파티딜-글리세롤 (DAPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (DMPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디스테아로일포스파티딜글리세롤 (DSPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디올레오일-포스파티딜글리세롤 (DOPG) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일 포스파티드산 (DMPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디팔미토일 포스파티드산 (DPPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디스테아로일 포스파티드산 (DSPA), 디아라키도일포스파티드산 (DAPA) 및 그것의 알칼리 금속 염, 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디스테아로일 포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 디올레일포스파-티딜-에탄올아민 (DOPE), 디아라키도일-포스파티딜-에탄올아민 (DAPE), 디리놀레일포스파티딜-에탄올아민 (DLPE), 디미리스토일 포스파티딜세린 (DMPS), 디아라키도일 포스파티딜세린 (DAPS), 디팔미토일 포스파티딜세린 (DPPS), 디스테아로일포스파티딜세린 (DSPS), 디올레오일포스파티딜세린 (DOPS), 디팔미토일 스핑고미엘린 (DPSP), 및 디스테아로일스핑고미엘린 (DSSP), 디라우로일-포스파티딜이노시톨 (DLPI), 디아라키도일포스파티딜이노시톨 (DAPI), 디미리스토일포스파티딜이노시톨 (DMPI), 디팔미토일포스파티딜이노시톨 (DPPI), 디스테아로일포스파티딜이노시톨 (DSPI), 디올레오일-포스파티딜이노시톨 (DOPI)이다. 특히 DAPC, DSPC, DPPC, DMPA, DPPA, DSPA, DMPG, DPPG, DSPG, DMPS, DPPS, DSPS, 에틸-DSPC, 에틸-DPPC 또는 그것들의 혼합물로부터 선택된 특정 인지질이 사용될 수 있으며, 더 구체적으로는 DPPG, DPPS 및 DSPC가 사용될 수 있다. 인지질은 친수성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜 (PPG)을 그것에 연결함으로써 변형된 인지질을 더 포함할 수 있다. 바람직한 폴리머-변형된 인지질은 "페길화된 인지질", 즉, PEG 폴리머에 결합된 인지질을 포함한다. 페길화된 인지질의 예는 페길화된 포스파티딜에탄올아민 (간단히 말해서 "PE-PEG"), 즉, 친수성 에탄올아민 모이어티(moiety)가 가변적인 분자량 (예를 들어, 300 내지 20000 달톤, 바람직하게는 500 내지 5000 달톤)의 PEG 분자, 예컨대 DPPE-PEG (또는 DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG 또는 DOPE-PEG)에 연결된 포스파티딜에탄올아민이다. 예를 들어, DPPE-PEG2000은 약 2000의 평균 분자량을 가진 PEG 폴리머가 부착된 DPPE를 나타낸다. 전형적인 페길화된 인지질의 예는 DPPE-PEG2000, DSPE-PEG2000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG5000을 포함한다.
포스파티딜에탄올아민의 페길화된 유도체, 특히 DPPE-PEG 및/또는 DSPE-PEG는 전형적으로 이전에 언급된 인지질과 혼합되어 사용된다.
전형적으로, 인지질은 미세기포의 안정화 외피의 주요 구성요소이며, 기체 충전된 미세기포의 외피를 형성하는 구성요소의 총량의 기체 충전된 미세기포의 외피를 형성하는 구성요소의 총량의 적어도 50% (w/w), 바람직하게는 적어도 75%에 이른다. 바람직한 구체예의 일부에서, 실질적으로 전체의 외피 (즉, 적어도 90% w/w)는 인지질로 형성될 수 있다.
인지질은 상기 나열된 양친매성 화합물과 혼합하여 편리하게 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 지질, 예컨대 콜레스테롤, 에르고스테롤, 파이토스테롤, 시토스테롤, 라노스테롤, 토코페롤, 프로필 갈레이트 또는 아스코르빌 팔미테이트, 지방산, 예컨대 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라킨산 및 그것들의 유도체 또는 부틸화된 하이드록시톨루엔 및/또는 다른 비-인지질 화합물은, 예를 들어, 바람직하게는 0 내지 50 중량%의 범위, 더 바람직하게는 최대 25%의 비율로 상기 언급된 인지질 중 하나 이상에 선택적으로 추가될 수 있다. 팔미트산이 특히 바람직하다.
다른 부형제 또는 첨가제는 미세기포의 건식 제제로 존재할 수 있거나 복원에 사용되는 수성 담체와 함께 추가될 수 있으며, 미세기포의 안정화 외피의 형성에 반드시 수반되는 것은 아니다 (또는 단지 부분적으로 수반된다). 이것들은 pH 조절자, 삼투압 조정자, 점성 증진제, 에멀젼화제, 벌크화제, 등을 포함하고 통상적인 양으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥시프로필렌 글리콜 및 폴리옥시에틸렌 글리콜, 뿐만 아니라 그것들의 코폴리머와 같은 화합물이 사용될 수 있다. 점성 증진제 또는 안정화제의 예는 선형 및 가교된 다당류 및 올리고당, 당 및 친수성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 화합물이다.
기체-충전된 미세기포의 제조가 동결건조 또는 분무건조 단계를 수반할 수 있기 때문에, 제제에 동결건조 첨가제, 예컨대 동결방지 및/또는 동결보호 효과를 가진 작용제 및/또는 벌크화제, 예를 들어, 아미노산, 예컨대 글리신 또는 히스티딘; 탄수화물, 예를 들어, 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 말토스, 트레할로스, 글루코스, 락토스 또는 사이클로덱스트린, 또는 다당류, 예컨대 덱스트란, 키토산 및 그것의 유도체 (예를 들어: 카르복시메틸 키토산, 트리메틸 키토산); 또는 폴리옥시알킬렌글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것이 유리할 수 있다.
미세기포는 해당 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 생산될 수 있다. 전형적으로, 제조 방법은 상기 지시된 바와 같이, 바람직하게는 상기 물질을 포함하는 수성 또는 유기 현탁액의 동결건조 (동결건조)에 의한 양친매성 물질을 포함하는 건조 분말 물질의 제조를 수반한다. 미세기포 및 그것의 전구물질의 제조의 예는, 예를 들어, Ref. 15 또는 Ref. 16에 개시되어 있다. 이 후자의 제조 절차에 따르면, 인지질 (및 다른 선택적인 필름 형성 물질), 동결보호제 및 다른 선택적인 첨가제는 교반 하에서 물 및 물과 혼합할 수 없는 유기 용매의 혼합물에 분산되어 마이크로에멀젼을 형성할 수 있다. 인지질에 의해 (및 선택적으로 다른 양친매성 필름 형성 화합물 및/또는 첨가제에 의해) 둘러싸여 안정화된 용매의 미세액적을 함유하는 얻어진 마이크로에멀젼은 통상적인 기술에 따라 동결건조되어 동결건조된 물질을 얻었으며, 이것은 저장되고 (예를 들어, 적합한 기체의 존재 하에 바이알에) 수성 담체로 복원되어 최종적으로 기체-충전된 미세기포 현탁액을 제공할 수 있다.
대안으로, 교정된 기체-충전된 미세기포가, 예를 들어, Ref. 17에 개시된 바와 같이, 유체 집속 디바이스를 사용하여 제조될 수 있다.
동결 건조된 생성물은 일반적으로 분말 또는 케이크(cake)의 형태로 되어있을 것이고, 원하는 기체에 접촉되어 저장될 수 있다 (예를 들어, 바이알에). 생성물은 전형적으로 주사 가능한, 적합한 생리학적으로 허용 가능한 수성 액체 담체에서 쉽게 복원되어, 현탁액을 부드럽게 교반하면, 기체-충전된 미세기포가 형성된다. 적합한 생리학적으로 허용 가능한 액체 담체는 멸균수, 수용액, 예컨대 식염수 (이것은 주사용 최종 생성물이 저장성이 아니도록 유리하게 균형을 이룰 수 있다), 또는 하나 이상의 장성 조절 물질, 예컨대 염 또는 당, 당 알콜, 글리콜 또는 다른 비-이온성 폴리올 물질 (예를 들어, 글루코스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 키토산 유도체, 예컨대 카르복시메틸 키토산, 트리메틸 키토산 또는 겔화 화합물, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 전분 또는 덱스트란의 용액이다.
다른 적합한 기체-충전된 미세소포는 해당 분야에서 "미세풍선" "미소캡슐" 또는 "미소구체"라고 불린다. 이들 기체-충전된 미세소포는 기포가, 예를 들어, 폴리머성 (천연 또는 합성), 단백질성, 또는 불수용성 지질 또는 이것들의 임의의 조합일 수 있는 고체 물질 외피에 의해 둘러싸인 현탁액을 포함한다. 폴리머 물질로 제조된 미세풍선의 예는, 예를 들어, Ref. 18에서 개시되어 있다. 불용성 지질 (예를 들어, 트리팔미틴 또는 트리스테아린)로 제조된 미소캡슐의 예는, 예를 들어, Ref. 19에서 개시되어 있다. 단백질성 외피 (예를 들어, 천연 단백질, 예컨대 알부민)를 가진 미소구체는, 예를 들어, Ref. 20에서 개시되어 있다.
임의의 생체적합성 기체, 기체 전구물질 또는 그것들의 혼합물 (본원에서 "미세소포-형성 기체"로도 확인됨)이 상기 미세소포를 충전하는데 이용될 수 있다.
기체는, 예를 들어, 공기; 질소; 산소; 이산화탄소; 수소; 아산화질소; 비활성 또는 불활성 기체, 예컨대 헬륨, 아르곤, 제논 또는 크립톤; 저분자량 탄화수소 (예를 들어, 최대 7개의 탄소 원자를 함유함), 예를 들어, 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 아이소부탄, 펜탄 또는 아이소펜탄, 사이클로알칸, 예컨대 사이클로부탄 또는 사이클로펜탄, 알켄, 예컨대 프로펜, 부텐 또는 아이소부텐, 또는 알킨, 예컨대 아세틸렌; 에테르; 케톤; 에스터; 할로겐화된 기체, 바람직하게는 불소화된 기체, 예컨대 또는 할로겐화된, 불소화된 또는 과불소화된 저분자량 탄화수소 (예를 들어, 최대 7개의 탄소 원자를 함유함); 또는 상기 언급된 것들의 혼합물을 포함할 수 있다. 할로겐화된 탄화수소가 이용되는 경우, 상기 화합물의 바람직하게는 적어도 일부의, 더 바람직하게는 모든 할로겐 원자는 불소 원자이다.
불소화된 기체, 특히 과불소화된 기체가 바람직하다. 불소화된 기체는 적어도 하나의 불소 원자를 함유하는 물질, 예를 들어 불소화된 탄화수소 (하나 이상의 탄소 원자 및 불소를 함유하는 유기 화합물); 황 헥사플루오라이드; 불소화된, 바람직하게는 과불소화된, 케톤, 예컨대 퍼플루오로아세톤; 및 불소화된, 바람직하게는 과불소화된, 에테르, 예컨대 퍼플루오로디에틸 에테르를 포함한다. 바람직한 화합물은 과불소화된 기체, 예컨대 SF6 또는 과불화탄소 (과불소화된 탄화수소), 즉, 모든 수소 원자가 불소 원자로 대체된 탄화수소이며, 이것은 특히 안정한 미세기포 현탁액을 형성하는 것으로 알려져 있다. 용어 퍼플루오로탄소는 포화, 불포화, 및 환형 과불화탄소를 포함한다. 생체적합성, 생리학적으로 허용 가능한 과불화탄소의 예는 퍼플루오로알칸, 예컨대 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄 (예를 들어, 선택적으로 다른 이성질체와 혼합된 퍼플루오로-n-부탄, 예컨대 퍼플루오로-아이소부탄), 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로헵탄; 퍼플루오로알켄, 예컨대 퍼플루오로프로펜, 퍼플루오로부텐 (예를 들어, 퍼플루오로부트-2엔) 또는 퍼플루오로부타디엔; 퍼플루오로알킨 (예를 들어, 퍼플루오로부트-2-인); 및 퍼플루오로사이클로알칸 (예를 들어, 퍼플루오로사이클로부탄, 퍼플루오로메틸사이클로부탄, 퍼플루오로디메틸사이클로부탄, 퍼플루오로트리메틸사이클로부탄, 퍼플루오로사이클로펜탄, 퍼플루오로메틸사이클로펜탄, 퍼플루오로디메틸사이클로펜탄, 퍼플루오로사이클로헥산, 퍼플루오로메틸사이클로헥산 및 퍼플루오로사이클로헵탄)이다. 바람직한 포화 과불화탄소는, 예를 들어, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12 및 C6F12를 포함한다.
어떠한 비율로도 상기 기체의 혼합물을 사용하는 것이 또한 유리할 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 상기 지시된 바와 같이 통상적인 기체, 예컨대 질소, 공기 또는 이산화탄소 및 안정한 미세기포 현탁액을 형성하는 기체, 예컨대 황 헥사플루오라이드 또는 퍼플루오로탄소를 포함할 수 있다. 적합한 기체 혼합물의 예는, 예를 들어, Ref. 21 (본원에 참조로 포함됨)에서 발견될 수 있다. 다름 조합이 특히 바람직하다: 기체 (B)는 그것들의 혼합물을 포함하는, 이전에 예시된 것들 중 선택된 불소화된 기체이고, (A)는 공기, 산소, 질소, 이산화탄소 또는 그것들의 혼합물로부터 선택되는 기체 (A)와 (B)의 혼합물. 기체 (B)의 양은 전체 혼합물의 약 0.5% 내지 약 95% v/v, 바람직하게는 약 5% 내지 80%로 나타날 수 있다.
특히 바람직한 기체는 선택적으로 공기, 산소, 질소, 이산화탄소 또는 그것들의 혼합물과 혼합된 SF6, C3F8, C4F10 또는 그것들의 혼합물이다.
특정 상황에서 기체 물질 (즉, 생체 내에서(in vivo) 기체로 전환될 수 있는 물질)에 대한 전구물질을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는 기체 전구물질 및 그것으로부터 유래된 기체는 생리학적으로 허용 가능하다. 기체 전구물질은 pH-활성화되거나, 광 활성화되거나, 온도 활성화, 등이 될 수 있다. 예를 들어, 특정 과불화탄소는 온도 활성화된 기체 전구물질로서 사용될 수 있다. 이들 과불화탄소, 예컨대 퍼플루오로펜탄 또는 퍼플루오로헥산은 실온 (또는 작용제가 생산 및/또는 저장되는 온도)보다 높지만 체온보다 낮은 액체상/기체상 전이 온도를 가지며; 따라서, 그것들은 액체상/기체상 전이를 겪고 인간 체내에서 기체로 전환된다.
상업적으로 이용 가능한 기체-충전된 미세소포, 예컨대 SonoVue®/Lumason (Bracco) Definity/Luminity (Lantheus) 또는 Optison (GE Healthcare)는 단지 진단적 용도로만 승인되지만, 치료적 적용에서 그것들의 오프라벨(off-label) 용도는 해당 분야에 기재되어 있다 (예를 들어 Ref. 22 및 Ref. 23 참조).
출원인은 치료용 초음파 및 기체-충전된 미세소포의 조합 사용 (US-MV)을 기반으로 하는 치료 방법이 효능의 감소를 겪을 수 있다는 것을 이제 관찰하였다.
어떠한 특정 이론에 결부되는 것은 아니지만, 출원인은 이러한 효능의 감소가 대상체에서, 특히 US/기체-충전된 미세소포 노출 후 치료 중인 영역에서 일어나는, "혈관 경련"으로 알려져 있는, 일시적인 혈관 운동 반응과 어느 정도 관련이 있을 수 있다는 것을 관찰하였다.
혈관 경련
상세한 설명 및 청구범위에서, 표현 "혈관 경련"은 치료용 초음파 및 기체-충전된 미세소포의 현탁액의 조합 사용에 의해 유도되는 강력한 혈관 운동 반응을 나타낸다.
이 (일시적인) 혈관 운동 반응의 생성 및 효과는, 예를 들어, Ref. 10에 기재되어 있다.
어떠한 특정 이론에 결부되는 것은 아니지만, 기체-충전된 미세소포 및 초음파-매개된 요법의 조합 처리의 감소된 효능은 US/기체-충전된 미세소포 노출 후 대상체에서, 및 특히 치료 중인 영역에서 발생하는 이러한 일시적인 혈관 운동 반응과 어느 정도 연관성이 있을 수 있다.
출원인은 이제 예상치 못하게 기체-충전된 미세소포 및 초음파-매개된 요법의 조합 처리의 전체 효능이 혈관 경련 억제자 (VI)의 사용에 의해 개선될 수 있다는 것을 발견하였다.
기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합에 의해 유도된 혈관 경련은 주로 일시적인 저관류, 즉, 혈관 수축(vasoconstriction)으로부터 유래된 혈류의 감소를 제공한다. 실제로, 혈관 수축에 기인하는 혈류 감소는 또한 음장을 통해 기체-충전된 미세소포의 지속적인 수송에 영향을 미쳐서, 중심 영역에서 기체-충전된 미세소포의 부족으로 이어지고 초음파 펄스의 효과를 실질적으로 감소시키거나 그것들을 실질적으로 비효과적으로 만들 수 있다.
유리하게는, 출원인에 의해 제안된 용액은 치료 효능의 상기 언급된 감소를 실질적으로 제한하거나 방지하는 반면, 상기 효능은 혈관 경련 억제자의 부재시 수행된 조합 미세소포/초음파-매개된 치료에 관하여 특히 향상된다. 또 다른 측면에서 보면, 이러한 혈관 경련 억제자의 사용이 조합 미세소포/초음파-매개된 치료의 치료 효능의 허용 가능한 수준을 유지시킨다.
혈관 경련 억제자
본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "혈관 경련 억제자" (VI)는 특히 US-MV 치료에 의해 유발되는 혈관 경련의 발생을 실질적으로 감소시키거나 방지함으로써 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료의 전체적인 효능을 향상시킬 수 있는 물질을 나타낸다.
혈관 경련 억제자는, 예를 들어, 주로 세포내 칼슘 농도를 낮추고 미오신의 탈인산화 (ADP에 대한 ATP의 실제 대체)를 유도하는 것을 기반으로 하는 상이한 메커니즘을 통해 혈관 평활근 세포의 이완을 유도한다.
혈관 경련 억제자의 역할을 하는 것으로 알려져 있는 모든 화합물 중에서, 출원인은 놀랍게도 디하이드로피리딘 칼슘 채널 차단제, α-아드레날린 수용체 안타고니스트 및 니트로 혈관 확장제의 클래스로 분류된 혈관 경련 억제자가 특히 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료의 전체적인 효능을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
칼슘 차단제 (또는 칼슘 안타고니스트 또는 칼슘 채널 차단제)로 분류된 혈관 경련 억제자는 혈관 평활근 세포로의 칼슘 이온 유입을 차단함으로써 혈관 평활근의 칼슘-유도된 수축을 억제한다.
바람직한 칼슘 차단제 VI는 디하이드로피리딘 칼슘 차단제일 수 있다.
디하이드로피리딘 칼슘 차단제의 예는 암로디핀, 아라니디핀, 아젤니디핀, 바르니디핀, 베니디핀, 실니디핀, 클레비디핀, 에포니디핀, 펠로디핀, 이스라디핀, 라시디핀, 레르카니디핀, 마니디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 닐바디핀, 니모디핀, 니솔디핀 및 프라니디핀을 포함하며, 니페디피딘 및 니모디핀이 특히 바람직하다.
바람직하게는 VI는 니페디핀 또는 니모디핀이며, 더 바람직하게는 니모디핀이다.
칼슘 안타고니스트와 유사한 성질을 갖고 생리학적 칼슘 차단제로 고려되는 마그네슘이 또한 VI로서 사용될 수 있다.
α-아드레날린 수용체 안타고니스트 (또는 α-차단제)로 분류된 혈관 경련 억제자는 혈관 확장을 유발하는 혈관 평활근에서 알파-1-아드레날린성 수용체의 효과를 잠근다. α-아드레날린 수용체 안타고니스트의 예는 알푸조신, 독사조신, 파라조신 실로도신, 탐술로신 및 테라조신을 포함하며, 파라조신이 특히 바람직하다.
혈관 경련 억제자는 또한 니트로 혈관 확장제로 분류될 수 있다. 용어 "니트로 혈관 확장제"는 보통 생물학적으로 활성화된 산화질소로 대사적으로 전환될 수 있는 유기 니트레이트 혈관확장제로서 산화질소의 약리학적 공급원을 나타낸다. 보통 외인성으로 투여되는 니트로 혈관 확장제의 적합한 예는 디에틸렌 글리콜 디니트레이트, 글리세릴 트리니트레이트 (니트로글리세린), 아이소소르비드 모노니트레이트 및 디니트레이트, 이트라민 토실레이트, 펜타에리트리틸 테트라니트레이트, 프로파틸니트레이트, 시니트로딜, 테니트라민 및 트롤니트레이트이며, 니트로글리세린이 특히 바람직하다.
산화질소는 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 자극하여, 환형 구아노신 모노포스페이트 (cGMP)의 세포내 수준의 증가를 유발함으로써 혈관 평활근의 이완을 유도한다.
구체예에서, 상기 혈관 경련 억제자는 디하이드로피리딘 칼슘 차단제, α-차단제 및 니트로 혈관 확장제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 상기 혈관 경련 억제자는 바람직하게는 니모디핀, 니페디핀, 마그네슘, 파라조신 및 니트로글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 더 바람직하게는 상기 혈관 경련 억제자는 니모디핀이다.
일반적으로 혈관 경련 억제자는 기체-충전된 미세소포에 실질적으로 결합되지 않는다.
용어 "미결합된"은 혈관 경련 억제자가 기체-충전된 미세소포와 물리적 또는 화학적 상호작용이 실질적으로 없다는 것을 나타내며; 더 구체적으로, VI는 공유 결합을 통해 또는 비-공유 결합 (예를 들어, 물리적 및/또는 정전기 상호작용)을 통해 기체-충전된 미세소포에 결합되지 않는다.
구체예에서, VI는 기체 충전된 미세소포 현탁액에 물리적으로 연결되지 않은, 별개의 약학적 조성물에 포함된다.
혈관 경련 억제자를 포함하는 별개의 약학적 조성물의 예는 전통적인 및/또는 제어된 방출 둘 다를 위한 경구 투약 형태 및 비경구 투약 형태와 같은, 시장에서 시판되고 있는 상업적 제제를 포함한다.
혈관 경련 억제자는 기체 충전된 미세소포의 현탁액과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
표현 "동시 투여"는 본원에서 사용된 바와 같이 동시에 또는 같은 시기에 순차적으로VI와 기체-충전된 미세소포를 투여하는 것을 나타내며, 투여 경로는 동일하거나 상이하다.
본 발명에 따르면, 표현 "순차적 투여"는 상이한 시기에 VI와 기체-충전된 미세소포를 투여하는 것을 나타내며, 투여 경로는 동일하거나 상이하다.
본 발명의 구체예에서, VI는 기체-충전된 미세소포의 현탁액과 동시에 투여된다.
예를 들어, 상기 VI는 투여 직전에 동결 건조된 기체-충전된 미세소포의 현탁액에 직접 추가될 수 있다. 대안으로, VI는 동결 건조된 기체-충전된 미세소포 의 복원에 사용되는 생리학적으로 허용 가능한 수성 담체 (예를 들어, 식염수)에 추가될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 혈관 경련 억제자는 마그네슘이다.
추가의 구체예에서, 마그네슘은 마그네슘 용액에 이러한 미세소포를 희석함으로써 기체 충전된 미세소포의 현탁액의 투여에 관하여 동시에 투여된다.
본 발명의 대안의 구체예에서, VI는 기체-충전된 미세소포의 현탁액에 순차적으로 투여된다.
바람직한 구체예에서, VI는 기체-충전된 미세소포의 현탁액 전 1초 내지 15분에, 바람직하게는 5초 내지 12분 전에, 더 바람직하게는 적어도 10분 전에 투여된다.
기체-충전된 미세소포의 현탁액 및 VI는 정맥내 주사에 의해 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 대안으로, 기체-충전된 미세소포의 현탁액은 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 한편 VI는 경구로 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
VI는 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 전형적으로 승인된 치료 용량으로 투여된다.
표현 "승인된 치료 용량"은 사용에 대해 규제 기관 (예를 들어, FDA 및 EMA)에 의해 승인된 혈관 경련 억제자의 용량을 나타낸다. 예를 들어, 승인된 치료 용도는 치료되는 대상체의 체중 당 VI 용량 (mg/kg), 또는 일수 당 VI 용량 (mg/일), 또는 시간 단위 당 VI 중량 (mg/시간)으로 표현될 수 있다.
본 발명에 따르면, 기체-충전된 미세소포의 현탁액은 현탁액의 지속적인 주입으로 또는 특정 부피의 현탁액의 적어도 하나의 볼루스(bolus)를 대상체에게 주사함으로써 투여될 수 있다.
예를 들어, 각각 주사된 현탁액의 부피 당 미세소포의 총량은 환자 kg 당 6x105 to 15x109개의 미세소포, 바람직하게는 kg 당 1x107 내지 12x109개의 미세소포, 더 바람직하게는 kg 당 2x107 내지 10x109개의 미세소포로 달라질 수 있다. 각각 주사된 볼루스의 부피는 주사되는 미세소포의 필요한 총량 (일반적으로 일반적으로 수행되는 특정 처리에 따라 다르다)에 맞춰 조정되며, 주사되는 현탁액 중의 미세소포의 농도 및 환자의 체중을 고려한다. 일반적으로는, 약 1x108 내지 약 3x109개의 미세소포/mL의 현택액 중의 미세소포의 농도에 대해, 볼루스 부피는 0.01 내지 120 mL, 바람직하게는 0.2 내지 60 mL 및 더 바람직하게는 0.4 내지 20 mL로 달라질 수 있다.
상세한 설명 및 청구범위에서, 표현 "주입 투여"는 임의의 적합한 지속적인 투여 수단에 의해, 예를 들어, 중력에 의해 (예를 들어, 식염수 주입 백(bag)) 또는 전용 디바이스, 예를 들어, 제어된 부피 방출 (회전) 주사기를 이용하여 수행될 수 있는 투여 절차를 나타낸다.
표현 "볼루스 투여"는, 예를 들어, 말초 정맥에 배치된 주사기 및 카테터(catheter)의 수단에 의한 특정 부피의 기체-충전된 미세소포의 현탁액의 단일 혈관내 주사를 나타낸다. 볼루스의 투여는 일반적으로 수초 (예를 들어, 5 내지 120초, 바람직하게는 60초 이하) 내에 수행된다.
본 발명의 구체예에서, 기체-충전된 미세소포의 상기 현탁액의 투여는 적어도 하나의 볼루스로, 바람직하게는 적어도 하나의 볼루스로, 그리고 최대 4개의 볼루스로, 예를 들어, 5분 마다 환자에게 투여된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 기체-충전된 미세소포의 상기 현탁액의 투여는 기체 충전된 미세소포의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
이 정도로, 그리고 달리 제공되지 않는 한, 용어 "유효 용량" 또는 "유효량"은 본원에서 사용된 바와 같이 의도된 치료 목적(들)을 실행하기에 충분한 본 발명에 따르는 기체-충전된 미세소포의 현탁액의 임의의 양을 나타낸다: 예를 들어, 관심있는 영역에 치료제의 약물 전달을 개선하기 위해.
관심있는 영역에 대한 치료적 초음파의 적용은 기체-충전된 미세소포의 투여 전, 중 또는 후의 임의의 시간에 일어날 수 있다. 일반적으로, VI의 투여 후 초음파 입사를 시작하는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, VI 및 미세소포가 순차적으로 (예를 들어, 처음에 VI 그 다음으로 MV) 투여될 때, 관심있는 영역의 초음파 입사는 미세소포의 투여시 또는 그 직후에 시작될 수 있다. 대안으로, VI와 MV가 동시에 투여될 때, 관심있는 영역의 초음파 입사는 동시 투여시 또는 그 직후에 시작될 수 있다. 특정 구체예에서, 관심있는 영역에서 미세소포의 도착이 결정될 수 있고 (예를 들어, 생리학적 파라미터를 통해 또는 관심있는 영역의 조영 초음파 검사 이미지화를 통해) 초음파 입사는 원하는 양의 미세소포가 관심있는 영역에 도달했을 때 시작될 수 있다.
표현 "관심있는 영역"은 본원에서 사용된 바와 같이 본 발명에 따라는 치료적 처리를 겪은 대상체의 신체 일부, 장기 또는 조직을 나타낸다.
상세한 설명 및 청구범위에 따르면, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 살아있는 인간 또는 동물 환자, 바람직하게는 본 발명의 초음파-매개된 요법을 겪은 인간을 나타낸다.
본 발명의 양태는 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계.
상기 혈관 경련 억제자는 바람직하게는 디하이드로피리딘 칼슘 차단제, α-차단제 및 니트로 혈관 확장제로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더 바람직하게는 니모디핀, 니페디핀, 마그네슘, 파라조신 및 니트로글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더 바람직하게는 상기 혈관 경련 억제자는 니모디핀이다.
혈관 경련 억제자는 바람직하게는, 예를 들어, 승인된 치료적 투약량으로 대상체의 혈관계로의 정맥내 주사로 투여된다.
기체-충전된 미세소포의 현탁액은 지속적인 주입으로 또는 특정 부피의 현탁액의 적어도 하나의 볼루스를 대상체에게 주사함으로써 투여될 수 있고; 더 바람직하게는 기체-충전된 미세소포의 상기 현탁액은 대상체에게 적어도 하나의 볼루스로 투여된다.
기체 충전된 미세소포의 현탁액은 대상체에게 유효 용량으로 투여된다.
본 발명의 구체예에서, 개시된 방법의 단계 a) 및 단계 b)는 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
바람직한 구체예에서, 단계 a)는 단계 b)와 동시에 수행된다.
대안의 구체예에서, 단계 a)는 단계 b)까지 순차적으로 수행된다. 바람직하게는, 단계 a)는 단계 b) 전 1초 내지 15분, 더 바람직하게는 5초 내지 12분 전, 더 바람직하게는 적어도 10분 전에 수행된다.
추가의 구체예에서, 단계 b)는 단계 a)까지 순차적으로 수행된다.
음향 파라미터, 예컨대 음압, 음향의 강도 및 펄스 길이는 상기 기재된 것들이다.
특히, 본 발명의 방법의 단계 c)에서, 치료용 초음파는 100 kPa 내지 900 kPa, 바람직하게는 200 kPa 내지 800 kPa에 포함되는 음압을 갖는다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 c)에서, 치료용 초음파는 0.1 내지 990 W/cm2, 바람직하게는 1.3 W/cm2 내지 21.5 W/cm2에 포함되는 음향의 강도를 갖는다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 단계 c)에서 상기 치료용 초음파는 5 μs 내지 60 s, 바람직하게는 5 μs 내지 10s에 포함되는 펄스 길이를 가지며, 더 바람직하게는 펄스 길이는 1 ms이다.
추가의 구체예에서, 단계 c)에서 상기 치료용 초음파는 1s 내지 170분, 바람직하게는 2 내지 10분에 포함되는 시간 동안 적용된다.
추가의 구체예에서, 단계 c)에서 상기 치료용 초음파는 20 kHz 내지 70MHz에 포함되는 주파수를 갖는다.
구체예에 따르면, 단계 c)는 단계 b) 이후에 수행된다 (예를 들어, 미세소포의 투여로부터 수초 내에).
대안으로, 단계 c)는 단계 a)와 단계 b) 사이에 수행될 수 있다. 예를 들어, 초음파 처리는 VI 투여 후에 (예를 들어, 1 내지 15분), 기체 충전된 미세소포의 주사 전에 또는 동시에 시작될 수 있다.
일반적인 구체예에서, 혈관 경련 억제자는 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리에 사용되며 (그것의 효능을 향상시키기 위해), 상기 조합 치료적 처리는, 예를 들어, 생체활성제의 유출을 허용하거나 향상시키기 위해 혈관 투과화를 유도한다. 특정 구체예에서, 상기 조합 치료적 처리는, 예를 들어, 생체활성제의 전달과 조합하여 혈액 뇌 장벽 개방 또는 붕괴 (BBB 개방/붕괴)를 유도한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 조합 치료적 처리는, 예를 들어, 생체활성제의 전달을 위해 종양 관류를 유도한다.
또 다른 구체예에서 혈관 경련 억제자는 혈전을 용해시키기 위해 (음파 혈전 용해) 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리에 사용된다 (그것의 효능을 향상시키기 위해).
추가의 구체예에서, 혈관 경련 억제자는열 절제 (MV 증강 열 절제)를 개선하기 위해 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리에 사용된다.
추가의 구체예에서, 혈관 경련 억제자는 면역조절, 신경조절, 방사선 감작, 고체온의 돕기 또는 조직의 비-열 절제를 위해 기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
출원인에 의해 입증된 바와 같이, VI의 투여는 조합 치료적 처리 US-MV의 약물 전달 효능을 향상시키는 것이 가능하다. 특정 구체예에서, VI의 사용은 VI가 없는 조합 US-MV 처리로만 얻어진 유출과 비교하여 주위 종양 조직에서 생체활성제의 유출을 거의 2배 증가시켰다.
본 발명에서 표현 "약물 전달"은 적어도 생체활성제의 투여를 포함하는 치료 프로토콜을 나타내며, 상기 생체활성제는 혈관 경련 억제자와는 상이하다.
생체활성제는 기체-충전된 미세소포와 조합하여 초음파-매개된 치료적 처리에 사용될 수 있는 임의의 분자, 화합물, 제제 또는 물질을 포함하며, 이것은 치료되는 영역 또는 장기에 생물학적으로 또는 치료적으로 활성인 효과를 생산할 수 있다.
생체활성제의 예는 항신생물제, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 부설판, 클로람부실, 스피로플라틴, 씨스플라틴, 카르보플라틴, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 시토신 아라비노시드, 아라비노실 아데닌, 메르캅토퓨린, 미토탄, 프로카르바진, 닥티노마이신 (안티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신, 하이드로클로라이드, 탁솔, 플리카마이신, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 플루타미드, 루프롤리드, 메게스트롤 아세테이트, 타목시펜, 테스토락톤, 트릴로스탄, 암사크린 (m-AMSA), 아스파라기나제 (라스파라기나제), 에토포시드, 인터페론 a-2a 및 2b, 혈액 생성물, 예컨대 헤마토포르피린 또는 상기 언급된 것들의 유도체; 생물학적 반응 개질제, 예컨대 무라밀펩타이드; 항진균제, 예컨대 케토코나졸, 니스타틴, 그리세오풀빈, 플루시토신, 미코나졸 또는 암포테리신 B; 호르몬 또는 호르몬 유사체, 예컨대 성장 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손, 코르티손 아세테이트, 덱사메타손, 플루니솔리드, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 파라메타손 아세테이트, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론 또는 플루드로코르티손 아세테이트; 비타민, 예컨대 시아노코발라민 또는 레티노이드; 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제 또는 망간 초산화물 디스무타제; 항알레르기제, 예컨대 아멜렉사녹스; 응고방지제, 예컨대 와파린, 펜프로쿠몬 또는 헤파린; 항트롬빈제; 순환 약물, 예컨대 프로프라놀올; 대사 강화제, 예컨대 글루타티온; 결핵치료제, 예컨대 p-아미노살리실산, 아이소니아지드, 카프레오마이신 설페이트, 사이클로섹신, 에탐부톨, 에티온아미드, 피라진아미드, 리파핀 또는 스트렙토마이신 설페이트; 항바이러스제, 예컨대 아시클로비르, 아만타딘, 아지도티미딘, 리바비린 또는 비다라빈; 혈관 확장제, 예컨대 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 에리트리톨 테트라니트레이트, 아이소소르비드 디니트레이트, 니트로글리세린 또는 펜타에리트리톨 테트라니트레이트; 항생제, 예컨대 다프손, 클로람페니콜, 네오카이신, 세파클로르, 세파드록실, 세파렉신, 세프라딘, 에리트로마이신, 클린다마이신, 린코마이신, 아목시실린, 앰피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 디클록사실린, 시클라실린, 피클록사실린, 헤타실린, 메티실린, 나프실린, 페니실린 또는 테트라사이클린; 항염증제, 예컨대 디플루니살, 이부프로펜, 인도메타신, 메클레페나메이트, 메페남산, 나프록센, 페닐부타존, 피록시캄, 톨메틴, 아스피린 또는 살리실레이트; 항원충제, 예컨대 클로로퀸, 메트로니다졸, 퀴닌 또는 메글루민 안티모네이트; 항류머티즘제, 예컨대 페니실라민; 마취제, 예컨대 진통제; 아편제, 예컨대 코데인, 모르핀 또는 아편; 강심배당체, 예컨대 데슬라네시드, 디기톡신, 디곡신, 디기탈린 또는 디기탈리스; 신경근 차단제, 예컨대 아트라쿠리움 메실레이트, 갈라민 트리에티오디드, 헥사플루오레니움 브로미드, 메토쿠린 아이오다이드, 판쿠로니움 브로미드, 숙시닐콜린 클로라이드, 토보쿠라린 클로라이드 또는 베쿠로니움 브로미드; 진정제, 예컨대 아모바비탈, 아모바비탈 나트륨, 아프로프바비탈, 부타바비탈 나트륨, 클로랄 하이드레이트, 에트클로르비놀, 에티나메이트, 플루라제팜 하이드로클로라이드, 글루테티미드, 메토트리메프라진 하이드로클로라이드, 메티프릴론, 미다졸람하이드로클로라이드, 파르알데하이드, 펜토바비탈, 세코바비탈 나트륨, 탈부탈, 테마제팜 또는 트리아졸람; 국소 마취제, 예컨대 부피바카인, 클로로프로카인, 에티도카인, 리도카인, 메피바카인, 프로카인 또는 테트라카인; 전신 마취제, 예컨대 드로페리돌, 에토미데이트, 드로페리돌을 가진 펜타닐 시트레이트, 케타민 하이드로클로라이드, 메토헥시탈 나트륨 또는 티오펜탈 및 그것들의 약학적으로 허용 가능한 염 (예를 들어, 산 부가 염, 예컨대 하이드로클로라이드 또는 하이드로브로미드 또는 염기성 염, 예컨대 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘 염) 또는 유도체 (예를 들어, 아세테이트); 및 예를 들어, 알파-, 베타-, 또는 감마-방출기를 포함하는 방사화학물질, 예를 들어 177Lu, 90Y 또는 131I를 포함한다.
항트롬빈제, 예컨대 헤파린 및 헤파린-유사 활성을 가진 작용제, 예컨대 항트롬빈 III, 달테파린 및 에녹사파린; 혈소판 응집 억제자, 예컨대 티클로피딘, 아스피린, 디피리다몰, 일로프로스트 및 아브식시맙; 및 혈전 용해 효소, 예컨대 스트렙토키나제 및 플라스미노겐 활성제; 진통제, 예컨대 코데인, 펜타닐, 하이드로콘, 아세트아미노펜, 옥시코돈; 중추신경계 또는 말초신경계에 대한 활성을 가진 약물, 예컨대 항간질제, 항파킨슨병제, 정신억제제 또는 정신흥분제; 호르몬이 특히 중요하다. 생체활성제의 다른 예는 아달리무맙, 아벨루맙, 두라발루맙 인플릭시맙, 아테졸리주맙, 니볼루맙, 베바시주맙, 펨브롤리주맙, 라무시루맙, 트라스투주맙, 페르투주맙, 이필리무맙, 파니투무맙, 나탈리주맙, 세툭시맙과 같은 항체, 또는 항체의 단편을 포함한다.생체활성제의 다른 예는 나노제제화된 약물, 예컨대 포락탄트 알파, 독소루비신 HCl 리포솜 주사, 리포솜 암포테리신 B 지질 복합체, 리포솜 암포테리신 B, 리포솜 모르핀 설페이트, 리포솜 시타라빈, 리포솜 빈크리스틴, 리포솜 이리노테칸, 리포솜 베르테포르핀, 리포솜 다우노루비신 및 시타라빈, 알부민-결합된 파클리탁셀을 포함한다. 생체활성제의 다른 예는 또한 유전 물질, 예컨대 천연 또는 합성 기원의 핵산, RNA, 및 DNA, 예컨대 재조합 RNA 및 DNA를 포함한다. 특정 단백질을 암호화하는 DNA는 많은 상이한 유형의 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 괴사 인자 또는 인터류킨-2는 진행암을 치료하기 위해 제공될 수 있고; 티미딘 키나제는 난소암 또는 뇌종양을 치료하기 위해 제공될 수 있고; 인터류킨-2는 신경아세포종, 악성 흑색종 또는 신장암을 치료하기 위해 제공될 수 있고; 인터류킨-4는 암을 치료하기 위해 제공될 수 있다. 진단제는 자기 공명 이미지화, X-선, 특히 컴퓨터 단층촬영술, 광학 이미지화, 핵 이미지화 또는 분자 이미지화를 포함하는 진단 기술과 관련하여 이미지화 향상을 허용할 수 있는 임의의 화합물, 조성물 또는 입자이다. 적합한 진단제의 예는, 예를 들어, 자철석 나노입자, 요오드화된 화합물, 예컨대 Iomeprol®, 또는 상자성 이온 복합체, 예컨대 소수성 가돌리늄 복합체이다.
본 발명에 따르면, 혈관 경련 억제자 (VI)의 투여는 치료적 처리 US-MV와 조합하여 투여된 상기 생체활성제의 치료/진단 효과를 향상시킬 수 있다.
생체활성제의 치료/진단 효과의 향상은 상기 언급된 바와 같이 상이한 메커니즘을 통해 혈관 경련 억제자에 의해 부여된다. 예를 들어, 혈관 경련 억제자는 (1) 표적 영역의 혈관 구획에서 생체활성제의 농도 (예를 들어, 치료제 또는 조영제), (2) 혈관을 통한 그것의 유출, (3) 그것의 세포내 전달 및/또는 (4) 혈액 관류를 향상시킬 수 있다.
상기 생체활성제는 기체-충전된 미세소포와 별개의 제제로서 투여될 수 있고 및/또는 기체-충전된 미세소포의 구조 내에 포함될 수 있다.
이전의 경우에 생체활성제는, 예를 들어, 주사에 의해, 조합 US-MV 치료적 처리에 대해 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
생체활성제는 생체활성 분자 (또는 생체활성 분자의 혼합물)일 수 있거나 또는 생체활성 분자(들)를 포함하는 적합한 약학적 조성물, 예컨대 시판 중인 상업적으로 이용 가능한 제제의 형태로 되어있거나 또는 생체활성 분자를 적합한 수성 담체와 혼합함으로써 얻어진 즉각적인 조제물일 수 있으며, 이것은 바람직하게는 생리학적으로 허용 가능하고, 물 (바람직하게는 멸균수), 수용액, 예컨대 식염수 (이것은 유리하게는 주사용 최종 생성물이 저장성이 아니도록 균형을 이룰 수 있다), 또는 하나 이상의 장성 조절 물질의 용액을 포함한다. 장성 조절 물질은 염 또는 당, 당 알콜, 글리콜 또는 다른 비-이온성 폴리올 물질 (예를 들어, 글루코스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 키토산 유도체, 예컨대 카르복시메틸 키토산, 트리메틸 키토산 또는 겔화 화합물, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 포함한다.
생체활성제는 대상체에게 유효 용량으로 투여되며, 상기 유효 용량은 생체활성제의 치료적 효과를 발휘하는데 적합한 용량이다.
생체활성제는 지속적인 주입으로 또는 대상체에게 특정 부피의 현탁액의 적어도 하나의 볼루스를 주사함으로써 투여될 수 있으며; 더 바람직하게는 기체-충전된 미세소포의 상기 현탁액은 대상체에게 적어도 하나의 볼루스로 투여된다.
구체예에서, 본 발명의 약물 전달 프로토콜은 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위한 방법과 관련이 있으며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a') 대상체의 혈관계에 생체활성제를 투여하는 단계;
a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계.
본 발명의 구체예에서, 개시된 방법의 단계 a') 및 단계 a)는 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
구체예에서, 단계 a') 및 단계 a)는 동시에 수행된다.
또 다른 구체예에서, 단계 a') 및 단계 a)는 순차적으로 수행된다.
원칙적으로, 단계 a), a') 및/또는 b)는 동시 (상기 단계 중 단 2개의) 및 순차적 투여 프로토콜의 조합을 포함하는 특정 치료 및 프로토콜에 따라 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다.
예를 들어, 단계 a) 및/또는 a')는 단계 b)에 관하여 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
구체예에서, 단계 a) 및/또는 단계 a')는 단계 b)와 동시에 수행된다.
대안의 구체예에서, 단계 a) 및/또는 단계 a')는 단계 b)에 대해 순차적으로 수행된다. 예를 들어, 단계 a)/a')는 단계 b) 전 1초 내지 15분에, 더 바람직하게는 5초 내지 12분 전에, 더 바람직하게는 적어도 10분 전에 (서로 동시에 또는 순차적으로) 수행된다.
추가의 구체예에서, 단계 a') 및 b)는 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세소포 현탁액은 생체활성제를 함유할 수 있으며; 상기 현탁액은 VI와 동시에 또는, 예를 들어, VI 투여 후 순차적으로 투여될 수 있다.
추가의 구체예에서, 생체활성제는 상이한 메커니즘을 통해 기체-충전된 미세소포의 구조 내에 포함될 수 있다: i) 그것은 공유 결합을 통해 기체-충전된 미세소포의 양친매성 분자에 결합될 수 있고; ii) 물리적 및/또는 정전기 상호작용을 통해 기체-충전된 미세소포에 적합하게 회합될 수도 있고, iii) 기체-충전된 미세소포 구조에 결국 포함되도록 기체-충전된 미세소포를 형성하는 구성요소와 혼합된 화합물일 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 약물 전달 프로토콜은 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
b) 상기 기체-충전된 미세소포의 구조 내에 포함되는 생체활성제를 포함하는 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 대상체의 혈관계에 투여하는 단계;
c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계.
본 발명의 구체예에서, 개시된 방법의 단계 a) 및 단계 b)는 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
구체예에서, 단계 a)는 단계 b)와 동시에 수행된다.
대안의 구체예에서, 단계 a)는 단계 b)에 대해 순차적으로 수행된다. 바람직하게는, 단계 a)는 단계 b) 전 1초 내지 15분에, 더 바람직하게는 5초 내지 12분 전에, 더 바람직하게는 적어도 10분 전에 수행된다.
생체활성제를 포함하는 기체-충전된 미세소포의 현탁액은 지속적인 주입으로 또는 대상체에게 특정 부피의 현탁액의 적어도 하나의 볼루스를 주사함으로써 투여될 수 있으며; 더 바람직하게는 기체-충전된 미세소포의 상기 현탁액은 대상체에게 적어도 하나의 볼루스로서 투여된다.
생체활성제를 포함하는 기체 충전된 미세소포의 현탁액은 대상체에게 유효 용량으로 투여되며, 상기 유효 용량은 기체 충전된 미세소포 및 그 구조에 포함되는 생체활성제 둘 다가 치료적 효과를 발휘하기에 적합한 용량으로 투여되는 것이다.
다음 실시예는 본 발명의 추가로 예시하는 것을 돕는다.
실시예
재료 및 방법
제제 P01의 제조
Ref. 17 (실시예 2 참조)에서 기재된 절차에 따라 제제 P01을 제조하였다. 제제 내 양친매성 물질은 각각 9:1의 분자비의 DSPC:DPPE-PEG5000이다. 용액 중의 MV의 농도를 Coulter Counter 방법 (예를 들어, Coulter Counter Multisizer 3, Multisizer 3 소프트웨어로 장착됨)으로 평가하였다.
제제 P02의 제조
Ref. 16의 작용예에서 예시된 절차를 제제 (P02)를 제조하는데 사용하였다.
간략히 말하면, 약 90 mg/L의 DSPC, 7 mg/L의 팔미트산, 60 mg/L의 DPPE-PEG5000 및 100 g/L의 PEG4000을 함유하는 사이클로옥탄 및 물 (약 1.5/100 v/v)의 에멀젼을 제조하고 (Megatron MT3000, Kinematica; 10'000 rpm) DIN8R 바이알에 샘플링하였다 (약 1 mL/바이알).
바이알을 진공 하에서 -50℃에서 냉각시킨 다음 동결건조시킨 후 이어서, 물과 용매가 완벽하게 제거될 때까지 (0.5 중량% 미만) 실온 이상에서 2차 건조시켰다. 동결건조 과정이 끝나면, 바이알의 빈 공간을 C4F10/N2의 35/65 혼합물로 포화시키고 바이알을 마개로 막고 밀봉하였다. 기체의 존재 하에서 부드럽게 교반하면서 NaCl 용액 (0.9%)에서 동결건조된 조제물을 복원하여 (15 mg/mL의 농도로) 미세소포 용액을 얻었다. 복원물의 부피는 동물 체중에 대해 충분한 주사 부피를 얻기 위해 조정된다.
Definity®/Luminity®의 제조
미세소포를 제조사의 권고에 따라 활성화시켰다. 미세소포의 농도를 Coulter counter 방법 (예를 들어, Coulter Counter Multisizer 3, Multisizer 3 소프트웨어로 장착됨)에 의해 한정하였다.
투여
미세소포 현탁액의 부피를 필요한 경우 희석하여 래트에 대해 200-500 μL, 마우스에 대해 50-200 μL를 포함하는 볼루스를 얻었다. 각각의 주사에 이어서 식염수로 세척한다.
처리 기간이 20min일 때, 볼루스는 5 min 간격이었다.
미세소포의 용량은 프로토콜, 모델 및 종에 따라 kg 당 미세소포 총 수로 표시된다. 전체 용량을 프로토콜에 따라 여러 볼루스로 분할할 수 있다.
실시예 1
기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리의 효능의 향상
모델 및 동물 제조
사용된 모델은 NMU 래트 종양 모델이었다. 사춘기 전의 래트 (암컷, Sprague Dawley)는 50 mg/kg의 NMU (N-니트로소-N-메틸요소, Sigma, Switzerland)의 단일 복강내 주사를 받았다. 종양이 발생한 래트를 프로토콜에 등록하였다. NMU 모델에서, 동물은 미세소포 및 치료용 초음파를 받은 종양; 및 동일한 동물에서 초음파 입사 없는 (미처리라고 불림) 종양을 가질 수 있도록 여러 종양을 발달시킬 수 있다. 래트를 마취시키고 배면와위(dorsal decubitus)로 배치하였다. 카테터를 꼬리 정맥에 배치하여 약물 및 미세소포를 주사하였다. US 치료용 변환기를 종양의 5 cm (물 탱크 간격)에 배치하였다. 관류 후 대조 초음파 검사 (C10-3v 프로브, EpiQ 7G, Philips)하였고, 종양 근처에 40-45도 각도로 배치하였다.
분자 유출의 효율을 평가하기 위해서, Cyⓒ5.5 형광단으로 라벨링된 150 kDa-덱스트란을 초음파 및 미세소포로 치료적 처리하기 직전에 주사하였다.
다섯 가지 실험 조건을 테스트하였다:
i) 래트의 제1 군 (미처리)은 US-MV에 노출되지 않았고 (CY5.5h의 기저 유출);
ii) 종양의 제2 군은 MV 단독으로 투여되었고;
iii) 제3 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV로 투여되었고;
iv) 래트의 제4 군은 US-MV 처리에 노출되었고
v) 제5 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리에 노출되었다.
US+MV 처리를 위해서, 치료용 US를 600 kPa의 음압으로 적용하였으며, 펄스 계획은 20분의 기간 동안 1ms ON/10s OFF였다.
연구를 위해서, 2개의 MV 제제, 즉, P02 (재료 및 방법에 따라 제조됨) 또는 Definity가 8 μl 기체/kg의 용량으로 투여되고, 4개의 볼루스로 나누어지고, 각각 5분 간격을 두었다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 등가물은 P02 제제에 대해 1.2x108/kg 및 Definity에 대해 5.2 x109/kg에 상응하였다.
혈관 경련 억제자로의 전처리를 위해서, 니모디핀 (Sigma Aldrich, Switzerland) 분말을 먼저 DMSO (40mg/ml)에 희석하였고; 주사된 용량 (1.4mg/kg)을 NaCl 0.9%에서 즉극 제조하고 처리 전 10 min에 주사하였다.
그 다음에 종양을 희생된 동물로부터 수확하고; 형광성을 생체 외에서(ex vivo) (Fluobeam® 700) 획득한 이미지 상에서 정량화하였다. 형광성을 ImageJ 소프트웨어에 의해 정량화하였다.
결과
결과는 니모디핀의 투여가 조합 치료적 처리 US-MV의 약물 전달 효능을 향상시킬 수 있다는 것을 나타냈다. MV-US의 조합 사용 전에 VI의 전처리는 종양 조직에서 Cy®5.5 염료의 유출을 다른 조건에서 얻어진 유출과 비교하여 거의 2배 증가시켰다. 특히, 제1 군 (CY5.5h 단독)에서 평균 형광 신호는 1020 RFU/px/ms이고, 제2 군 (MV 단독)에서 930 RFU/px/ms이고, 제3 군 (VI+MV)에서 1030 RFU/px/ms이고 제4 군 (US-MV)에서 990 RFU/px/ms인 것이 발견되었다. 놀랍게도, 제5 군에서 VI의 사전 투여에 이은 US-MV 이후에 평가된 평균 형광 값은 2060 RFU/px/ms인 것이 발견되었으며, 즉, 다른 군에 대해 2배의 형광 값이었다.
실시예 2
혈관 경련 유도시 상이한 US 파라미터의 평가
모델 및 동물 제조
이들 실험에 사용된 모델은 장간막 래트 미세순환이다. 간략히 말하면, 마취된 동물을 제조하여 장 루프를 시각화하였다. 주사는 꼬리 정맥에서 이루어졌다.
래트를 X20 대물렌즈 (최종 배율: 200)가 장착된 도립현미경 (Olympus® X2) 아래에 배치하였다. 공개 출처 소프트웨어에 의해 구동되는 수치 카메라는 프로토콜에 따라 필요한 각 시점에서 30 s 비디오를 획득하고 기록했다.
조제물 01을 이 연구를 위해 투여하였다.
US 처리를 실험적 단일 요소 변환기 (비집속, 평면, 1.5 MHz)로 전달하였다. 표 1은 각각의 프로토콜에 대해, 펄스 계획, 음압 및 US 적용 기간을 포함한, 테스트된 US 파라미터를 보고한다. 변환기는 광학용 대물렌즈에 초점을 맞추고 5 cm의 각각의 작용 거리를 준수하도록 배치하였다.
처리 전에, 동안에 및 후에 연속 영상을 획득하였다. 혈관 경련 해상도를 모니터링하기 위해 US노출 시작 후 40 min까지 5 min 마다 추가적인 획득을 수행할 수 있었다. 미세혈관 (즉, 세정맥, 세동맥 또는 모세혈관)의 루멘의 감소, 및/또는 혈류 감소 및/또는 혈류 중단이 관찰되는 경우 (대조군 조건과 비교하여) 혈관 경련이 입증된다.
결과:
표 1에서 보고된 바와 같이, 결과에서는 모든 조사된 처리 기간 (2, 5 및 20 min), 미세소포 용량 및 투여 방식 (하나 또는 다수의 볼루스)에 대해 임의의 테스트된 음압에서 제1 초음파 펄스 직후 혈관 경련이 발생했다는 것이 확인되었다. 표현 "초음파 펄스"는 초음파 변환기에 의해 전송되고 매체 내에서 전파되는 다주기 초음파를 나타낸다. "Time ON" (예를 들어, 1 ms ON)이라고 불리는 기간, 주파수, 진폭을 특징으로 한다.
Figure pct00001
실시예 3
혈관 경련 유도시 상이한 유형의 기체-충전된 미세소포의 평가
모델 및 동물 제조
이들 실험에 사용된 모델은 장간막 래트 미세순환이었다. 모델 및 동물 제조는 실시예 2에 기재되어 있다.
이 연구는 혈관 경련 유도시 상이한 유형의 기체-충전된 미세소포의 평가를 목표로 하였다. 이 목적을 위해서, 상이한 음압 (400kPa에서 최대 800 kPa)에서 상이한 미세소포 제제, 즉, 제제 P02 및 Luminity® (Lantheus)를 조사하였다. 표 2는 조사된 실험 조건을 보고한다.
결과
표 2에서 나타난 바와 같이, 결과에서는 제1 초음파 펄스 직후 임의의 테스트된 음압에서 기체-충전된 미세소포의 임의의 조사된 제제로의 혈관 경련의 발생이 확인되었다.
Figure pct00002
실시예 4
비-종양 모델에서 칼슘 채널 차단제에 의해 매개된 혈관 경련 억제의 연구
모델 및 동물 제조
이들 실험에 사용된 모델은 장간막 래트 미세순환이었다. 모델 및 동물 제조는 실시예 2에서 기재되어 있다.
이 연구는 혈관 경련 억제자 화합물, 특히 디하이드로피리딘 칼슘 채널 차단제 니모디핀에 의해 유도된 혈관 경련의 억제의 평가를 목표로 하였다.
이 목적을 위해서, 래트는 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 처리 전 10분에 니모디핀으로 전처리를 받았다.
니모디핀 (Sigma Aldrich, Switzerland) 분말을 먼저 DMSO (40 mg/ml)에 희석하고; 주사된 용량 (1.4 mg/kg)을 NaCl 0.9%에서 즉각 제조하고 처리 전 10 min에 주사하였다.
혈관 경련의 생성을 얻기 위해 치료 파라미터를 이전 연구에 따라 선택하였다. P01 제제를 이 연구를 위해 투여하였다.
결과:
표 3은 치료용 초음파 및 기체-충전된 미세소포의 현탁액이 조합으로 사용된 동물의 100%에서 VI로의 전처리가 또한 혈관 경련의 발생을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00003
실시예 5
기체-충전된 미세소포와 조합된 US-매개된 요법의 종양 관류에 대한 효과 (DA3 종양 모델).
동물 모델 및 제조
마우스 DA3 종양 모델을 이들 연구에 사용하였다. US 처리를 Verasonic ® 시스템 (프로브 P4-2)에 의해 전달하였다. 프로브를 종양으로부터 5 cm에 배치하였다 (물 탱크의 간격, 탈기된 물로 채워짐).
그 다음에, 기체-충전된 미세소포 (P01)의 일련의 볼루스 주사를 수행하고 종양을 치료적 초음파 입사 (표 4에서 명시된 주파수, 음압 및 펄스 특성)에 제출하였다. 각 종양의 관류에 이어서 미세소포의 초음파 검사 신호 (Verasonic ® 시스템)가 뒤따른다. 신호를 기록하고 Vuebox® 소프트웨어로 사후 분석하였다. 혈관 경련의 발생은 관류의 감소 (즉, 대조군 조건과 비교하여 미세소포 신호 강도의 감소 및/또는 US 펄스 이후 보충 시간의 증가)에 의해 입증되었다.
표현 "보충 시간"은 각각의 US 펄스에 의해 유발되는 MV의 실질적인 파괴 이후, 혈관이 있는 초음파 빔 아래 영역에 신선한 기체-충전된 미세소포를 공급하는데 필요한 시간을 나타낸다.
표현 "MV 파괴"는 US에 의한 MV의 음향 활성화에 의해 유발된 MV의 온전성 또는 구조의 손실에 해당한다. 이것은, 예를 들어, MV 붕괴 또는 기체 소멸에 의해 유발될 수 있고 음향 신호 추적 검사에 의해 모니터링될 수 있다.
미세소포 및 초음파 처리에 관한 모든 파라미터는 고정되어 있다 (표 4 참조). 치료적 초음파 입사 파라미터는 DA3 종양에서 혈관 투과화를 얻기 위해 이전의 연구에 따라 선택되었다. P01 용량은 종양의 안정한 관류를 허용하도록 선택되었다 (1.3E+09 미세소포/kg; 4개의 볼루스로 나누어짐, 6 min 마다 주사됨). 동물의 2개의 군을 테스트하였다: 한 군을 VI로 전처리하고 (니모디핀, 1.4 mg/kg, iv, 스톡 용액으로부터 제조됨, 처리 전 10 min) NaCl 0.9% 단독으로 투여된 군과 비교하였다.
결과
식염수로 처리된 동물의 100%에서 각각의 US 펄스 사이에서 관류의 감소를 관찰하였다. VI로 전처리 후, 테스트된 동물의 100%에서 종양 관류는 안정하였으며, 혈관 경련의 억제를 시사한다. 결과는 표 4에서 요약된다.
더욱이, 도 1은 US+MV로 처리 동안에 종양 관류의 정량화를 보고하고 VI 전처리 없이 얻어진 결과 (상부 패널)를 VI 전처리 (니모디핀 1.4mg/kg IV)로 얻어진 것들 (하부 패널)과 비교한다. 결과는 VI 투여 후 얻어진 종양 관류의 개선을 확인하였다. 실제로, VI로의 전처리는 US 펄스에 의한 파괴 이후 임의의 전처리 없이 얻어진 것들보다 더 일정한 미세소포의 보충을 확인할 수 있다.
Figure pct00004
실시예 6
기체-충전된 미세소포와 조합된 US-매개된 요법의 종양 관류에 대한 효과 (NMU 종양 모델)
모델 및 동물 제조
사춘기 전의 래트 (암컷, Sprague Dawley)는 50 mg/kg의 NMU (N-니트로소-N-메틸요소, Sigma, Switzerland)의 단일 복강내 주사를 받았다. 모델은 실시예 1에서 기재되어 있다.
기체-충전된 미세소포의 일련의 볼루스 주사 (표 5에서 명시됨)를 수행하고 종양을 치료적 초음파 입사 (이후의 실시예에서 명시된 주파수, 음압 및 펄스 특성)에 제출하였다.
처리 중에 종양의 관류를 실시예 5에서 기재된 바와 같이 평가하였다.
미세소포 및 초음파 처리에 관한 모든 파라미터는 고정되어 있다 (표 5 참조). 치료적 초음파 입사 파라미터는 NMU 종양에서 혈관 투과화를 얻기 위해 이전의 연구에 따라 선택되었다. P02 용량은 종양의 안정한 관류를 허용하도록 선택되었다 (1.2E+09 미세소포/kg; 4개의 볼루스로 나누어짐, 5 min 하나의 볼루스).
동물을 니모디핀으로 전처리하고 (1.4mg/kg, iv, 스톡 용액으로부터 제조됨, 처리 전 10 min, 실시예 3에서 상세히 설명됨) NaCl 0.9%의 주사와 비교하였다.
결과
첫 번째 US펄스 이후 대조 신호의 감소를 관찰하였다. 모든 종양은 첫 번째 펄스 이후 관류의 결함을 제공하였다.
그럼에도, 디하이드로피리딘 칼슘 채널 차단제 니모디핀 (1.4 mg/kg, 10 min 전)으로 전처리된 래트는 처리 전반에 걸쳐 안정한 종양 관류를 나타냈으며, 혈관 경련의 억제를 시사한다.
Figure pct00005
실시예 7
혈관 경련의 유도시 상이한 약리학적 클래스의 혈관 경련 억제자의 평가
모델 및 동물 제조
이들 실험에 사용된 모델은 장간막 래트 미세순환이었다. 모델 및 동물 제조는 실시예 2에 기재되어 있다.
이 연구는 혈관 경련 억제에 대한 임상에서 현재 사용되는 상이한 약리학적 클래스의 혈관 경련 억제 약물의 효능을 평가하는 것을 목표로 하였다.
미세소포 및 초음파 처리에 관한 모든 파라미터는 표 6에서 나타난 바와 같이 고정되어 있다. 선택된 혈관 경련 억제 약물 및 그것들의 관련된 용량은 표 6에서 보고된다. 전처리와 미세소포 및 초음파 처리의 주사 사이의 기간은 각각의 약물의 약동학 및 약역학에 따랐다.
결과
표 6에서 보고된 바와 같이, 결과는 디하이드로피리딘 칼슘 차단제, 예컨대 니모디핀 및 니페디핀, 마그네슘 및 니트로 혈관 확장제, 예컨대 트리니트린이 혈관 경련을 억제하기 위한 양호한 능력을 나타냈다는 것을 보여주었다. α-아드레날린 수용체 안타고니스트 파라조신은 더 낮은 능력을 나타냈지만, 비-디하이드로피리딘 칼슘 차단제 딜티아젬 및 ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제자 카프토프릴은 혈관 경련의 발생에 대한 어떠한 관련된 억제 활성도 나타내지 않았다.
Figure pct00006
실시예 8
기체-충전된 미세소포 및 초음파의 조합 치료적 처리의 향상된 효능을 나타내는 추가적인 실험
8.1 혈전의 붕괴
사용된 모델은 뇌 반구 중 하나의 중대뇌 동맥이 폐색된 건강한 래트이다. 이 폐색은 상응하는 반구에서 혈액 관류를 감소시키며 컴퓨터 단층촬영술에 의해 측정된 전체 혈관 부피의 경사를 특징으로 한다. 혈전 붕괴에 대한 US-MV의 효율을 평가하기 위해서, US-MV 처리 후 전체 혈관 부피를 기준값 (즉, MCA 폐색 전과 후의 전체 혈관 부피)과 비교하였다.
여섯 가지 실험 조건을 테스트한다:
i) 래트의 제1 군 (미처리)은 US에 노출되고 (혈전 용해에 대한 US의 기저 효과);
ii) 래트의 제2 군은 혈관 경련 억제자로 전처리되고 US에 노출되고;
iii) 래트의 제3 군은 MV 단독으로 투여되고;
iv) 제4 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV로 투여되고;
v) 래트의 제5 군은 US-MV 처리에 노출되고;
vi) 제6 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리에 노출된다.
US 요법이 폐색된 MCA에 적용되며 주파수는 약 0,25 내지 2 MHz (예를 들어, 1MHz)이고 음압은 약 0.4 내지 1.5MPa (예를 들어, 0.6 MPa)이고, 펄스 길이는 대략 수 ms 최대 수 초 ON (예를 들어, 10 ms)이다.
혈관 경련 억제자로의 전처리를 위해서, 혈관 경련 억제자 (예를 들어, 니모디핀, 약 40mg/kg)를 절차 전에, 예를 들어, MV의 투여 전 5분에 투여한다.
MV 제제를 약 0,1 내지 50 μl 기체/kg (예를 들어, 1 μl 기체/kg, 2.108 MV/kg)의 용량으로 투여한다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 동등물은 약 2x107/kg 최대 10x109 MV/kg에 상응한다.
혈관 경련 억제자의 투여는 상기 예시된 바와 같이 조합 치료적 처리 US-MV에 의해 유도된 재관류의 효능을 향상시킬 수 있다. 실제로, MV-US의 조합 사용 전에 VI로의 전처리는 다른 조건들과 비교하여 전체 혈관 부피를 크게 증가시킨다. 재관류를 US+MV 단독으로 처리된 동물에서 낮은 정도로 관찰할 수 있었고 US 또는 US+VI로 처리된 동물에 대해서는 훨씬 더 낮은 정도로 관찰할 수 있었다. 군 US 및 US+VI에 대해서 유사한 재관류가 얻어진다. 다른 군에서는 재관류에 대한 실질적인 효과가 관찰되지 않았다: MV 단독 또는 MV+VI.
8.2 BBB 개방
사용된 모델은 건강한 래트 또는 뇌 종양 함유 래트이다. BBB 개방에 대한 US+MV의 효능을 평가하기 위해서, 모든 동물은 초음파 처리를 받기 전에 블루 에반스 염료(Blue Evan's Dye) 용액의 주사를 받는다. 뇌에서 유출된 염료의 양은 혈액 뇌 장벽의 증가된 투과성 (BBB 개방)과 연관성이 있다.
여섯 가지 실험 조건을 테스트한다:
i) 래트의 제1 군 (미처리)은 US에 노출되고 (BBBO에 대한 US의 기저 효과);
ii) 래트의 제2 군은 혈관 경련 억제자로 전처리되고 US에 노출되고;
iii) 래트의 제3 군은 MV 단독으로 투여되고;
iv) 제4 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV로 투여되고;
v) 래트의 제5 군은 US-MV 처리에 노출되고
vi) 제6 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리에 노출된다
혈관 경련 억제자로의 전처리를 위해서, 혈관 경련 억제자 (예를 들어, 니모디핀, 약 40mg/kg)를 절차 전에, 예를 들어, MV의 투여 전 5분에 투여한다.
MV 제제 (약 0.1 내지 50 μl 기체/kg; 예를 들어, 1 μl 기체/kg)를 US 적용 직전에 투여한다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 동등물은 약 2x107/kg 최대 10x109 MV/kg (예를 들어, 2.108 MV/kg)에 상응한다.
US 요법이 두개골을 통해 적용되며 (약 0.2 MHz 내지 2 MHz, 예를 들어, 0.25 MHz) 음압 범위는 약 150 kPa 내지 1.8MPa (예를 들어, 400kPa)이고 펄스 길이는 약 수 μs 내지 수십 ms ON (예를 들어, 10 ms ON)이다.
다른 조건들과 비교하면 US+MV 처리와 조합된 혈관 경련 억제자의 투여는 뇌 실질에서 유출된 에반스 블루의 양을 증가시키며 혈액 뇌 장벽의 더 높은 개방을 반영한다. BBBO는 US+MV로 처리된 동물에서 낮은 정도로 관찰될 수 있고 다른 군에서는 BBBO가 관찰되지 않는다: US 또는 MV 단독; 혈관 경련 억제자와 조합된 US 또는 MV.
8.3 MV 증강 열 절제
모델은 건강한 토끼이다. 열 절제의 효능은 초음파에 노출될 때 뒷다리 근육의 온도의 평가 및 절개 후 이 조직 내 열 병변의 관찰에 의해 강조된다. 절차 동안 올라가는 온도는 근육 다발의 초음파 처리된 영역에 삽입된 열전대 프로브를 사용하여 추적된다.
여섯 가지 실험 조건을 테스트한다:
i) 토끼의 제1 군 (미처리)은 US에 노출되고 (열 절제에 대한 US의 기저 효과);
ii) 토끼의 제2 군은 혈관 경련 억제자로 전처리되고 US에 노출되고;
iii) 토끼의 제3 군은 MV 단독으로 투여되고;
iv) 토끼의 제4 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV로 투여되고;
v) 토끼의 제5 군은 US-MV 처리에 노출되고
vi) 제6 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리에 노출된다.
혈관 경련 억제자로의 전처리를 위해서, 혈관 경련 억제자 (예를 들어, 니모디핀 약 40mg/kg)은 절차 전에 (예를 들어, 5분) 투여된다.
MV 제제 (약 0.1 내지 50 μl 기체/kg, 예를 들어, 5 μl 기체/kg)는 US 적용 직전에 투여된다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 동등물은 약 2x107/kg 최대 10x109 MV/kg (예를 들어, 10x108 MV/kg)에 상응한다.
US 요법이 근육 조직에 적용되며 (약 0.25 MHz 내지 2 MHz, 예를 들어, 0.5 MHz) 음압 범위는 약 수백 kPa 내지 수 MPa (예를 들어, 2.,7 MPa)이고 펄스 길이는 약 수 ms 최대 수 초 ON (예를 들어, 15 s)이다.
열 병변을 유발하는 온도 증가는 US 또는 US+VI 또는 US+MV 또는 US+MV+VI를 사용하여 얻어진다. 2개의 군 US와 US+VI 사이에서 차이가 관찰되지 않았다. 하지만, US 또는 US+VI와 비교하면, US+MV의 사용은 더 높고 빠른 온도 증가 및 이러한 온도 증가를 달성하고 이러한 열 병변을 유도하는데 필요한 에너지 수준의 감소를 허용한다. 이 관찰된 효과는 혈관 경련 억제자가 US+MV와 조합으로 투여될 때 모든 다른 군과 비교하여 향상된다. 다른 군에서는 열 병변이 관찰되지 않았다: MV 단독 또는 혈관 경련 억제자와 조합된 MV.
8.4 신경조절
사용된 동물 모델은 래트이다. US+MV에 의해 유도된 신경 기능의 조절을 몸 감각 대뇌 피질에 위치한 뉴런의 전기적 활성의 변형을 측정함으로써 평가한다. 사용된 방법은 자극-구동된 몸 감각 유발된 전위 (SSEP)라고 명명된다. 이 방법은 앞발의 전기적 자극에 의해 유도되는 SSEP 파형 (진폭 및 잠복기)을 측정하여 뇌 신경 반응을 평가한다. 본원에서 발명자들은 US+MV에 의해 유도되는 파형의 변화를 비교한다.
여섯 가지 실험 조건을 테스트한다:
i) 래트의 제1 군 (미처리)은 신경 반응에 대한 US의 효과를 평가하기 위해 US에 노출되고;
ii) 래트의 제2 군은 혈관 경련 억제자로 전처리되고 US에 노출되고;
iii) 래트의 제3 군은 MV 단독으로 투여되고;
iv) 제4 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV로 투여되고;
v) 래트의 제5 군은 US-MV 처리에 노출되고
vi) 래트의 제6 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리에 노출된다.
모든 실험을 위해서 자극에 의해 유도되는 파형의 변화를 평가하기 위해 베이스라인 신호를 절차 전에 기록한다.
혈관 경련 억제자로의 전처리를 위해서, 혈관 경련 억제자 (예를 들어, 니모디핀 약 40 mg/kg)를 절차 전에 (예를 들어, 5분) 투여한다.
MV 제제 (약 μl 기체/kg, 예를 들어, 1μl 기체/kg)를 US 적용 직전에 투여한다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 동등물은 약 2x107/kg 최대 10x109 MV/kg, 예를 들어, 2.108 MV/kg에 상응한다.
US 요법이 뇌에 적용되며 (약 0.25 MHz 내지 2 MHZ, 예를 들어, 0.5 MHz) 음압 범위는 약 수백 kPa 내지 수 MPa (예를 들어, 0.4 MPa)이고 펄스 길이는 약 수 ms 최대 수 초 ON (예를 들어, 10 ms)이다.
US+MV에 의한 몸 감각 피질의 자극은 SEPP 신호 진폭의 감소 및 베이스라인 신호와 비교하여 잠복기의 증가를 유도한다. US+MV 자극과 조합된 VI의 투여는 US+MV와 비교하여 SEPP 진폭의 더 큰 감소 및 신호 잠복기의 더 큰 증가를 유도한다. 이러한 신호 변형을 유도하기 위해 필요한 에너지의 수준은 또한 다른 군과 비교하여 US+MV+VI로 처리된 군에서 더 낮다. US 또는 US+VI 또는 MV 또는 US+VI에 대해서 파형의 변화가 관찰되지 않았다.
8.5 비-열 절제
모델은 건강한 래트 또는 뇌 종양을 함유하는 래트이다. 조직을 절제하기 위해 뇌가 US에 노출된다. i) 조직 혈액역학의 변화, ii) 표적화된 조직에서 괴사 및 아폽토시스의 수준의 증가 및 iii) 수주에 걸친 종양 성장의 감소에 의해 강조된 바와 같이 처리 유도된 병변의 존재를 검출하여 절차의 효능을 평가한다.
여섯 가지 실험 조건을 테스트한다:
i) 래트의 제1 군 (미처리)은 US에 노출되고 (비-열 절제에 대한 US의 기저 효과);
ii) 래트의 제2 군은 혈관 경련 억제자로 전처리되고 US에 노출되고;
iii) 래트의 제3 군은 MV 단독으로 투여되고;
iv) 래트의 제4 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV로 투여되고;
v) 래트의 제5 군은 US-MV 처리에 노출되고
vi) 제6 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리에 노출된다.
혈관 경련 억제자의 전처리를 위해서, 혈관 경련 억제자 (예를 들어, 니모디핀 약 40 mg/kg)를 절차 전에 (예를 들어, 5분) 투여한다.
MV 제제 (약 0.1 내지 50 μl 기체/kg, 예를 들어, 1μl 기체/kg)를 US 적용 직전에 투여한다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 동등물은 약 2x107 MV/kg 최대 10x109 MV/kg (예를 들어, 2.108 MV/kg)에 상응한다.
US 요법이 조직에 적용되며 (약 0.25 MHz 내지 2 MHz, 예를 들어, 1 MHz) 음압 범위는 약 수백 kPa 내지 수 MPa (예를 들어, 1 MPa)이고 펄스 길이는 약 수 ms 최대 수 초 ON (예를 들어, 20ms)이다.
모든 다른 조건들과 비교하여 US+MV와 조합된 혈관 경련 억제자의 투여는 처리된 조직에서 혈류의 큰 감소 및 더 높은 수준의 괴사 및 아폽토시스를 허용한다. 이것은 모든 다른 군과 비교하여 1주일에 걸쳐 종양 성장의 더 큰 감소로 이어진다. US+MV로 처리된 동물에서 유사한 효과를 더 낮은 정도로 관찰하였다. 다음 군에서 병변이 관찰되지 않았다: US 또는 US +VI 또는 MV 또는 MV+VI.
8.6 방사선 감작
모델은 종양을 함유하는 래트이다. 목표는 US+MV를 사용하여 방사선 요법 (RT)이 효과를 향상시켜 종양을 치료하는 것이다. i) 조직 혈액역학의 변화, ii) US+RT에 노출된 조직에서 세포사 및 아폽토시스의 수준의 증가 및 iii) 수주에 걸친 종양 성장의 감소 및 생존의 증가에 의해 강조된 바와 같이 처리 유도된 병변의 존재를 검촐하여 절차의 효능을 평가하였다.
열 가지 실험 조건을 테스트한다:
i) 래트의 제1 군은 처리 단독의 효과를 평가하기 위해 RT에 노출되고;
ii) 제2 군 래트는 RT 및 혈관 경련 억제자에 노출되고;
iii) 래트의 제3 군은 US에 노출되고;
iv) 제4 군은 US 및 혈관 경련 억제자에 노출되고;
v) 래트의 제5 군은 MV 단독으로 투여되고;
vi) 제6 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV로 투여되고;
vii) 래트의 제7 군은 US-MV 처리에 노출되고;
viii) 제8 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리에 노출되고;
ix) 제9 군은 US-MV 및 RT 처리에 노출되고;
x) 제10 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 및 RT 처리에 노출된다.
혈관 경련 억제자 (예를 들어, 니모디핀 약 40mg/kg)로의 전처리를 위해서 절차 전에 (예를 들어, 5분) 투여된다.
MV 제제 (약 0.1 내지 50 μl 기체/kg, 예를 들어, 1 μl 기체/kg)를 US 적용 직전에 투여한다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 동등물은 약 2x107/kg 최대 10x109 MV/kg (예를 들어, 2.108 MV/kg)에 상응한다.
US 요법이 종양에 적용된다 (약 0.25 MHz 내지 2 MHz, 예를 들어, 0.25 MHz). US 요법은 약 수백 kPa 내지 수 MPa (예를 들어, 600 kPa)의 음압, 수 ms 최대 수 초 (예를 들어, 10 ms)의 펄스 길이로 조직에 적용된다.
방사선 요법은 US 처리 후 동일한 조직에 적용된다.
다른 조건들과 비교하면, RT+US+MV 전에 혈관 경련 억제자의 투여는 처리된조직에서 혈류의 더 큰 감소 및 더 높은 수준의 세포사 및 아폽토시스를 허용한다. 이것은 다른 군들과비교하여 감소된 종양 성장 및 더 높은 생존률로 이어진다. 더 낮은 수준에서 MV+US+RT 또는 MV+US+/-VI 또는 RT+/-VI는 또한 종양 조직에서 혈류를 감소시키고 세포사 및 아폽토시스를 유도하고 세포 성장의 감소를 유도한다. 이 효과는 MV+US와 비교하여 MV+US+VI로 처리된 군에서 우수하다. RT 또는 RT+VI 사이에서 차이는 관찰되지 않았다. MV 또는 MV+VI 또는 US 또는 US+VI로 처리된 군에서 효과가 관찰되지 않았다.
8.7 고체온
모델은 종양을 함유하는 토끼이다. 목표는 형광-세포독성제에 의해 종양을 치료하고 US 고체온-유도된 방법에 의해 약물 전달을 향상시키는 것이다.
고체온은 MR 온도 측정법에 의해 종양의 온도를 모니터링하여, 처리된 영역에서 온도 지도를 허용함으로써 평가된다. 약물 전달의 효능은 형광분석법에 의해 얻어진 종양에서의 형광 축적의 정량화에 의해 평가된다.
실험 조건의 일곱 가지 설정을 테스트한다. 모든 군은 세포독성제를 받는다.
i) 제1 군은 세포독성제만을 받고 (종양에서 형광 신호의 기저 축적);
ii) 토끼의 제2 군은 US +/- 세포독성제로 처리되고;
iii) 토끼의 제3 군은 혈관 경련 억제자로 전처리되고 US +/- 세포독성제에 노출되고;
iv) 토끼의 제4 군은 MV +/- 세포독성제로 투여되고;
v) 토끼의 제5 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 MV +/- 세포독성제로 투여되고;
vi) 토끼의 제6 군은 US-MV 처리 +/- 세포독성제에 노출되고;
xvii) 제7 군은 혈관 경련 억제자로 전처리된 다음 US-MV 처리 +/- 세포독성제에 노출된다.
혈관 경련 억제자의 전처리를 위해서, 혈관 경련 억제자 (예를 들어, 니모디핀 약 40mg/kg)를 절차 전에 (예를 들어, 5분) 투여한다.
MV 제제 (예를 들어, 약 0.1 내지 50 μl 기체/kg)를 US 적용 직전에 투여한다. MV 수에 관하여, 기체 부피의 이 동등물은 약 2x107/kg 최대 10x109 MV/kg (예를 들어, 2.108 MV/kg)에 상응한다.
US 요법은 종양제 적용되며 (약 0.25 MHz 내지 2 MHz, 예를 들어, 0.5 MHz) 음압 범위는 약 200 kPa 내지 1MPa (예를 들어, 500kPa)이고 펄스 길이는 약 1 ms 최대 10초 ON (예를 들어, 10 ms)이다.
군 VI 또는 MV 또는 MV+VI 단독에 대해 실질적인 온도 증가는 관찰되지 않았다. 고체온은 US 또는 US+VI 또는 US+MV 또는 US+MV+VI를 사용하여 얻어진다. 고체온에 도달하고 유지하는데 필요한 에너지의 수준은 군 MV+US에서 감소되고 군 US+MV+VI에서 더 높은 정도로 감소된다.
고체온이 효과적인 모든 군에 대해, 형광 신호 축적의 증가가 측정된다. 이 효과는 MV+US와 비교하여 US+MV+VI에서 더 확연하며, US-MV 및 VI의 조합 사용으로 세포독성제의 더 높은 전달을 반영한다.
Figure pct00007
Figure pct00008

Claims (20)

  1. 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키는데 사용하기 위한 혈관 경련 억제자.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 혈관 경련 억제자는 디하이드로피리딘 칼슘 차단제, α-차단제 및 니트로 혈관 확장제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 경련 억제자.
  3. 제2 항에 있어서, 상기 혈관 경련 억제자는 니모디핀, 니페디핀, 마그네슘, 파라조신 및 니트로글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관 경련 억제자.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관 경련 억제자는 기체 충전된 미세소포의 현탁액의 투여에 관하여 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈관 경련 억제자.
  5. 제4 항에 있어서, 상기 혈관 경련 억제자는 기체-충전된 미세소포의 현탁액의 투여 전 1초 내지 15분에 미리 투여되는 것을 특징으로 하는 혈관 경련 억제자.
  6. 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
    b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
    c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  7. 제6 항에 있어서, 상기 혈관 경련 억제자는 디하이드로피리딘 칼슘 차단제, α-차단제 및 니트로 혈관 확장제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7 항에 있어서, 상기 혈관 경련 억제자는 니모디핀, 니페디핀, 마그네슘, 파라조신 및 니트로글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 기체-충전된 미세소포의 상기 현탁액은 지속적인 주입으로 또는 적어도 하나의 볼루스를 주사함으로써 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계 a) 및 단계 b)는 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 단계 a)는 단계 b) 전 1초 내지 15분에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제6 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 초음파는 100 내지 900 kPa에 포함되는 음압을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제6 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 초음파는 5 μs 내지 60 s에 포함되는 펄스 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제6 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 초음파는 1초 내지 170분에 포함되는 시간 동안 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제6 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 초음파는 20 kHz 내지 70 MHz에 포함되는 주파수를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    a') 대상체의 혈관계에 생체활성제를 투여하는 단계;
    a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
    b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
    c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  17. 기체-충전된 미세소포 및 치료용 초음파의 조합 치료적 처리의 효능을 향상시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
    b) 대상체의 혈관계에 생체활성제를 포함하는 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계로서, 상기 생체활성제는 상기 기체-충전된 미세소포의 구조 내에 포함되는, 단계;
    c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  18. 제1 항 내지 제5 항에 있어서, 상기 사용은
    a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
    b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
    c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관 경련 억제자.
  19. 제1 항 내지 제5 항에 있어서, 상기 사용은
    a') 대상체의 혈관계에 생체활성제를 투여하는 단계;
    a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
    b) 대상체의 혈관계에 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계;
    c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관 경련 억제자.
  20. 제1 항 내지 제5 항에 있어서, 상기 사용은
    a) 대상체의 혈관계에 혈관 경련 억제자를 투여하는 단계;
    b) 대상체의 혈관계에 생체활성제를 포함하는 기체-충전된 미세소포의 현탁액을 투여하는 단계로서, 상기 생체활성제는 상기 기체-충전된 미세소포의 구조 내에 포함되는, 단계;
    c) 대상체의 관심있는 영역에 치료용 초음파를 적용하는 단계.
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관 경련 억제자.
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