ES2352087T3 - Agentes de contraste para ultrasonido y procedimiento para la preparación de los mismos. - Google Patents

Abstract

Método para preparar una matriz liofilizada que, tras entrar en contacto con un líquido portador acuoso y un gas, es reconstituible en una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso incluyendo agua, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible con agua; iii) una composición emulsionante de materiales anfífilos que comprende más del 50% en peso de un fosfolípido y iv) un agente lioprotector; b) liofilizar dicha mezcla emulsionada, para obtener una matriz liofilizada que comprende dicho fosfolípido.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una formulación liofilizada o seca útil para preparar un gas que contiene agente de contraste que puede usarse en la obtención de imágenes de diagnóstico y a un procedimiento para preparar dicho gas que contiene agente de contraste.

La invención también incluye formulaciones secas preparadas mediante este procedimiento, que pueden reconstituirse para formar suspensiones de agente de contraste útiles en la obtención de imágenes de diagnóstico. La invención incluye además suspensiones de microburbujas llenas de gas útiles en la obtención de imágenes de diagnóstico preparadas usando formulaciones secas de la invención así como envases o kits de dos componentes que contienen las formulaciones secas de la invención.

Antecedentes de la invención

El rápido desarrollo de los agentes de contraste para ultrasonido en los últimos años ha generado varias formulaciones diferentes, que son útiles en la obtención de imágenes por ultrasonido de órganos y tejido del cuerpo humano o de animales. Estos agentes están diseñados para usarse fundamentalmente como productos inyectables intravenosos o intra-arteriales conjuntamente con el uso de equipos ecográficos médicos que emplean, por ejemplo, obtención de imágenes en modo B (basándose en la distribución espacial de las propiedades de tejidos de retrodispersión) o procesamiento de señales Doppler (basándose en el procesamiento Doppler de impulsos o de onda continua de ecos ultrasónicos para determinar parámetros de flujo de un líquido o la sangre).

Una clase de formulaciones inyectables útiles como agentes de contraste para ultrasonido incluye suspensiones de burbujas

de gas que tienen un diámetro de unas pocas micras dispersadas en un medio acuoso.

El uso de suspensiones de burbujas de gas en un líquido portador, como reflectores de ultrasonido eficientes se conoce bien en la técnica. El desarrollo de suspensiones de microburbujas como productos farmacéuticos para ecografía para mejorar la obtención de imágenes por ultrasonido siguió las observaciones tempranas de que inyecciones intravenosas rápidas de disoluciones acuosas pueden provocar que gases disueltos salgan de la disolución formando burbujas. Debido a su diferencia sustancial en impedancia acústica en relación con la sangre, se encontró que estas burbujas de gas intravasculares eran reflectores excelentes de ultrasonido. La inyección de suspensiones de burbujas de gas en un líquido portador en la corriente sanguínea de un organismo vivo refuerza fuertemente la obtención de imágenes por ecografía de ultrasonido, mejorando así la visualización de los órganos internos. Dado que la obtención de imágenes de órganos y tejidos arraigados profundamente puede ser crucial en el establecimiento de un diagnóstico médico, se ha dedicado un gran esfuerzo al desarrollo de suspensiones estables de burbujas de gas altamente concentradas que al mismo tiempo serían fáciles de preparar y administrar, contendrían una cantidad mínima de especies inactivas y podrían tener un almacenamiento largo y una distribución simple.

Sin embargo, la dispersión simple de burbujas de gas libres en el medio acuoso es de interés práctico limitado, dado que, en general, estas burbujas no son suficientemente estables para ser útiles como agentes de contraste para ultrasonido.

Por consiguiente, se ha mostrado interés en métodos de estabilización de burbujas de gas para ecografía y otros estudios ultrasónicos, por ejemplo usando emulsionantes, aceites, espesantes o azúcares, o atrapando o encapsulando el gas o un precursor del mismo en una variedad de sistemas. Estas burbujas de gas estabilizadas se denominan generalmente en la técnica “microvesículas”, y pueden dividirse en dos categorías principales.

Una primera categoría de microvesículas o burbujas estabilizadas se denomina generalmente en la técnica “microburbujas” e incluye suspensiones acuosas en las que las burbujas de gas están unidas en la interfase gas/líquido por una envoltura muy delgada que implica un tensioactivo (es decir un material anfífilo) dispuesto en la interfase gas-líquido. Una segunda categoría de microvesículas se denomina generalmente en la técnica “microglobos” o “microcápsulas” e incluye suspensiones en las que las burbujas de gas están rodeadas por una envoltura de material sólido formada por polímeros sintéticos o naturales. Se dan a conocer ejemplos de microglobos y de la preparación de los mismos, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0458745. Otro tipo de agente de contraste para ultrasonido incluye suspensiones de micropartículas porosas de polímeros u otros sólidos, que portan burbujas de gas atrapadas dentro de los poros de las micropartículas. La presente invención se refiere particularmente a agentes de contraste para la obtención de imágenes de diagnóstico que incluyen una suspensión acuosa de microburbujas de gas, es decir microvesículas que se estabilizan esencialmente por una capa de material anfífilo.

Normalmente, las suspensiones de microburbujas se preparan poniendo en contacto materiales anfífilos en polvo, por ejemplo liposomas preformados liofilizados o suspensiones de fosfolípidos secadas por pulverización o liofilizadas, con aire u otro gas y después con un portador acuoso, agitando para generar una suspensión de microburbujas que entonces debe administrarse poco después de su preparación.

Pueden encontrarse ejemplos de suspensiones acuosas de microburbujas de gas y la preparación de las mismas, por ejemplo, en los documentos US 5.271.928, US 5.445.813, US 5.413.774, US 5.556.610, 5.597.549, US 5.827.504.

El documento WO97/29783 da a conocer un procedimiento alternativo para preparar suspensiones de microburbujas de gas, que comprende generar una dispersión de microburbujas de gas en un medio acuoso que contiene fosfolípido apropiado y después someter la dispersión a liofilización para producir un producto

reconstituible secado. Los productos secados así preparados son reconstituibles en medios acuosos requiriendo sólo mínima agitación. Tal como se menciona en dicho documento, el tamaño de las microburbujas así generadas puede reproducirse de manera consistente y en la práctica es independiente de la cantidad de energía de agitación aplicada durante su reconstitución, determinándose por el tamaño de las microburbujas formadas en la dispersión de microburbujas inicial. Sin embargo, el solicitante ha observado que la cantidad de energía de agitación aplicada para generar la dispersión de microburbujas de gas en el medio acuoso que contiene fosfolípido puede ser excesivamente alta, particularmente cuando deben obtenerse microburbujas de diámetro pequeño (por ejemplo 23000 rpm durante 10 minutos, para obtener una dispersión de burbujas que tienen un diámetro medio en

volumen de aproximadamente 3 m). Esta alta energía de agitación puede determinar un sobrecalentamiento local en la dispersión acuosa de microburbujas, lo que a su vez puede provocar una degradación de los fosfolípidos contenidos en el medio acuoso. Además, en general los efectos de una energía de agitación excesivamente alta son difíciles de controlar y pueden dar como resultado una distribución de tamaño incontrolable de las microburbujas finales. Además, este procedimiento implica un flujo continuo de gas hacia el medio acuoso durante la generación de las microburbujas, requiriendo por tanto el uso de cantidades relevantes de gases.

El documento WO 94/01140 da a conocer un procedimiento adicional para preparar suspensiones de microvesículas reconstituibles en un medio acuoso, que comprende liofilizar emulsiones acuosas que contienen emulsionantes parenteralmente aceptables, líquidos no polares y “formadores de estructura” insolubles en agua o solubles en lípidos. Los poloxámeros y fosfolípidos se mencionan como emulsionantes parenteralmente aceptables, aunque se emplean mezclas de estos dos en los ejemplos de trabajo. El colesterol es el formador de estructura insoluble en agua preferido, que se emplea en los ejemplos de trabajo. Entonces, el producto liofilizado se reconstituye en

agua, para dar una suspensión acuosa de microvesículas llenas de gas. Por tanto, las microvesículas llenas de gas que resultan de la etapa de reconstitución están definidas por una envoltura de diferentes materiales, incluyendo emulsionantes tales como poloxámeros y formadores de estructura insolubles en agua tales como colesterol.

Se dice que el procedimiento da como resultado una emulsión con tamaño de las partículas inferior a 4 m, preferiblemente inferior a 2 m, hasta 0,5 m. Sin embargo, el solicitante ha notado que aunque la etapa de reconstitución puede dar como resultado finalmente microvesículas que tienen un diámetro medio numérico inferior a 2 m, la distribución de tamaño correspondiente de la población de microvesículas es, no obstante, relativamente amplio. Además, la etapa de conversión de las micropartículas de la emulsión, obtenidas según el procedimiento anterior, en microburbujas de gas da como resultado un rendimiento bastante bajo.

El documento WO 98/42384 da a conocer composiciones para el suministro de agentes bioactivos a una región de un paciente que comprenden un precursor gaseoso que puede experimentar una transición de fase para dar un gas. Las composiciones pueden comprender además un material estabilizante.

Ahora, el solicitante ha encontrado que puede obtenerse una distribución mucho más estrecha del tamaño de las microburbujas si se usa un fosfolípido como el emulsionante principal de la emulsión anterior y si se lleva a cabo el procedimiento anterior en ausencia sustancial de los formadores de estructura insolubles en agua anteriores. Además, la ausencia sustancial de dichos formadores de estructura insolubles en agua permite que se aumente sustancialmente el rendimiento de conversión de micropartículas de la emulsión en microburbujas de gas. Además, el solicitante ha observado que el procedimiento anterior puede dar como resultado una distribución de tamaño más estrecha adicional de las microburbujas y un aumento del rendimiento si el fosfolípido es esencialmente el único emulsionante presente en la emulsión.

Además, el solicitante ha encontrado que aplicando una energía de agitación bastante baja a una emulsión acuosa- orgánica durante el procedimiento tal como se especificó anteriormente, es posible obtener microburbujas que tienen un diámetro muy pequeño y una distribución de tamaño reducida.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar una matriz liofilizada que, tras entrar en contacto con un líquido portador acuoso y un gas, es reconstituible en una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible con agua; iii) una composición emulsionante de materiales anfífilos que comprende más del 50% en peso de un fosfolípido y iv) un agente de lioprotección;

b) liofilizar dicha mezcla emulsionada, para obtener una matriz liofilizada que comprende dicho fosfolípido. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un

procedimiento para preparar un agente de contraste inyectable que comprende una suspensión acuosa líquida de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, que comprende las etapas de:

a) preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible con agua; iii) una composición emulsionante de materiales anfífilos que comprende más del 50% en peso de un fosfolípido y iv) un agente de lioprotección;

b) liofilizar dicha emulsión, para obtener una matriz liofilizada que comprende dicho fosfolípido. c) poner en contacto dicha matriz liofilizada con un gas biocompatible; d) reconstituir dicha matriz liofilizada disolviéndola en un líquido portador acuoso fisiológicamente aceptable, para

obtener una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por dicho fosfolípido. Preferiblemente, la etapa a) de preparar la emulsión

comprende:

a1) preparar una suspensión dispersando la composición emulsionante de materiales anfífilos y el agente lioprotector en el medio acuoso;

a2) mezclar la suspensión obtenida con el disolvente orgánico; a3) someter la mezcla a agitación controlada, para obtener una emulsión.

Preferiblemente, la agitación controlada según la etapa a3) se obtiene usando un homogeneizador de alta presión o más preferiblemente un homogeneizador de rotor y estator.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un agente de contraste inyectable que comprende una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas por una capa estabilizante predominantemente que comprende un fosfolípido en un líquido portador acuoso, en la que dichas microburbujas

tienen un diámetro medio en número (DN) inferior a 1,70 m y una mediana del diámetro en volumen (DV50) tal que razón de DV50/DN es de aproximadamente 2,00 o inferior.

Descripción detallada de la invención

Tal como se mencionó anteriormente, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar una matriz liofilizada de una suspensión reconstituible de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, comprendiendo dicho método la preparación de una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible con agua; iii) un fosfolípido y iv) un agente de lioprotección, y la posterior liofilización de dicha emulsión.

El medio acuoso es preferiblemente un portador fisiológicamente aceptable. La expresión “fisiológicamente aceptable” incluye a cualquier compuesto, material o formulación

que puede administrarse, en una cantidad seleccionada, a un paciente sin afectar negativamente a o modificar sustancialmente el funcionamiento normal o sano de su organismo (por ejemplo sin determinar ningún estado de toxicidad inaceptable, provocar ninguna respuesta alergénica incontrolable o extrema o determinar ninguna enfermedad o estado patológico anómalo).

Portadores líquidos acuosos adecuados son agua, normalmente agua libre de pirógenos estéril (para impedir tanto como sea posible la contaminación en el producto liofilizado intermedio), disoluciones acuosas tales como solución salina (que puede equilibrarse ventajosamente de manera que el producto final para inyección no sea hipotónico), o disoluciones acuosas de una o más sustancias de ajuste de la tonicidad tales como sales o azúcares, alcoholes de azúcar, glicoles u otros materiales de poliol no iónicos (por ejemplo glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares).

El disolvente orgánico

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente inmiscible con agua” en referencia al disolvente orgánico significa que, cuando dicho disolvente se mezcla con agua, se forman dos fases separadas. Los disolventes inmiscibles con agua también se conocen generalmente en la técnica como disolventes no polares o apolares, en oposición a los disolventes polares (tales como agua). En general, los disolventes inmiscibles con agua son sustancialmente insolubles en agua. Para los fines de la presente invención, los disolventes orgánicos adecuados para que se emulsionen con el disolvente acuoso son normalmente aquellos disolventes que tienen una solubilidad en agua inferior a aproximadamente 10 g/l. Preferiblemente, la solubilidad de dicho disolvente en agua es de aproximadamente 1,0 g/l o inferior, de manera más preferible aproximadamente 0,2 g/l o inferior y de manera mucho más preferible aproximadamente 0,01 g/l o inferior. Disolventes particularmente preferidos son aquéllos que tienen una solubilidad en agua de 0,001 g/l o inferior. Disolventes

orgánicos particularmente insolubles (por ejemplo perfluorocarbonos) pueden tener una solubilidad hasta aproximadamente 1,0·10-6 g/l (por ejemplo perfluorooctano, 1,66·10-6 g/l).

El disolvente orgánico es preferiblemente liofilizable, es decir dicho disolvente tiene una presión de vapor suficientemente alta a las temperaturas de liofilización, por ejemplo entre -30ºC y 0ºC, para permitir una evaporación/sublimación completa y eficaz en el plazo de tiempos aceptables, por ejemplo 24-48 horas. Preferiblemente, la presión de vapor del disolvente orgánico es superior a aproximadamente 0,2 kPa a 25ºC.

El disolvente orgánico puede seleccionarse de una amplia gama de disolventes y cualquier entidad química que sea inmiscible con agua y liofilizable, tal como se indicó anteriormente, y que es preferiblemente líquido a temperatura ambiente (25ºC). Si se usa un disolvente que tiene un punto de ebullición inferior a la temperatura ambiente, el recipiente que contiene la mezcla emulsionante puede enfriarse ventajosamente por debajo del punto de ebullición de dicho disolvente, por ejemplo hasta 5ºC o 0ºC. Puesto que dicho disolvente se eliminará completamente durante la etapa de liofilización, no existe ninguna restricción particular excepto porque no debe contener contaminantes que no puedan eliminarse a través de la liofilización o que no sean aceptables para su uso en una composición inyectable.

Los disolventes orgánicos adecuados incluyen pero no se limitan a alcanos, tales como alcanos (C5-C10) ramificados o, preferiblemente, lineales, por ejemplo pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano; alquenos, tales como alquenos (C5-C10), por ejemplo 1-penteno, 2-penteno, 1-octeno; ciclo-alcanos, tales como cicloalcanos (C5-C8) opcionalmente sustituidos con uno o dos grupos metilo, por ejemplo ciclopentano, ciclohexano, ciclooctano, 1-metil-ciclohexano; hidrocarburos aromáticos, tales como benceno y derivados de benceno sustituidos con uno o dos grupos metilo o etilo, por ejemplo benceno, tolueno, etilbenceno, 1,2-dimetilbenceno, 1,3-dimetilbenceno; alquil

éteres y cetonas tales como di-butil éter y di-isopropilcetona; éteres o hidrocarburos halogenados, tales como cloroformo,

tetracloruro

de carbono, 2-cloro-1-(difluorometoxi)-1,1,2

trifluoroetano

(enflurano), 2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1

trifluoroetano

(isoflurano), tetracloro-1,1-difluoroetano, y

particularmente éteres o hidrocarburos perfluorados, tales como perfluoropentano, perfluorohexano, perfluoroheptano, perfluorometilciclohexano, perfluorooctano, perfluorononano, perfluorobenceno y perfluorodecalina, metilperfluorobutil éter, metilperfluoroisobutil éter, etilperfluorobutil éter, etilperfluoroisobutil éter; y mezclas de los mismos.

La cantidad de disolvente está comprendida generalmente desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 50% en volumen con respecto a la cantidad de agua usada para la emulsión. Preferiblemente dicha cantidad es desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 20%, más preferiblemente desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 15% e incluso más preferiblemente desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 10%. Si se desea, puede usarse una mezcla de dos o más de los disolventes orgánicos enumerados anteriormente, estando la cantidad global del disolvente orgánico en la mezcla emulsionante dentro del intervalo anterior.

Agente lioprotector

La expresión agente lioprotector o “lioprotector” se refiere a un compuesto que, cuando se incluye en una formulación que va a liofilizarse, protegerá los compuestos químicos de los efectos nocivos de la congelación y el sometimiento a vacío, tales como aquéllos que acompañan habitualmente a la liofilización, por ejemplo daño, adsorción y pérdida debido al vacío utilizado en la liofilización. Además, tras la etapa de liofilización, dicho agente lioprotector da como resultado preferiblemente una matriz sólida (“masa”) que soporta el fosfolípido liofilizado.

La presente invención no se limita al uso de un lioprotector específico, y ejemplos de lioprotectores adecuados

incluyen, pero no se limitan a, hidratos de carbono tales como los sacáridos, mono, di o polisacáridos, por ejemplo glucosa, galactosa, fructosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, lactosa, amilosa, amilopectina, ciclodextrinas, dextrano, inulina, almidón soluble, hidroxietil-almidón (HES), alcoholes de azúcar por ejemplo manitol, sorbitol y poliglicoles tales como polietilenglicoles. Una lista sustancial de agentes con efectos lioprotectores se proporciona en Acta Pharm. Technol. 34(3), págs., 129-139 (1988). Dichos agentes lioprotectores pueden usarse individualmente o como mezclas de uno o más compuestos.

Los lioprotectores preferidos incluyen manitol y polisacáridos tales como dextranos (en particular aquéllos con pesos moleculares por encima de 1500 daltons), inulina, almidón soluble e hidroxietil-almidón.

Las mezclas de manitol o polisacáridos tales como dextranos, inulina, almidón soluble, hidroxietil-almidón con sacáridos tales como glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa y eritritol también proporcionan excelentes resultados.

Igualmente, la presente invención no se limita a ninguna cantidad particular de lioprotector usada. Sin embargo, la óptima concentración en peso de agentes lioprotectores en la emulsión antes de la liofilización está comprendida entre aproximadamente el 1 y aproximadamente el 25%, preferiblemente entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 20%, e incluso más preferiblemente entre aproximadamente el 5 y aproximadamente el 10%.

Puede emplearse una cantidad superior si también es necesario proporcionar una “masa” deseada al producto liofilizado.

El agente lioprotector se añade preferiblemente a la mezcla acuosa-orgánica antes de la emulsificación de la misma y en este caso por tanto la emulsificación de la mezcla acuosa-orgánica se lleva a cabo en presencia de los agentes lioprotectores. Alternativamente, el lioprotector puede añadirse a la mezcla acuosa-orgánica tras la emulsificación de la misma. En el primer caso, el lioprotector se añade preferiblemente al medio acuoso,

antes de mezclarlo con el disolvente orgánico. Si se desea, también es posible combinar los dos, por ejemplo añadiendo parte del agente lioprotector a la fase acuosa usada para la preparación de la emulsión y parte a la emulsión así obtenida. Si se desea, también pueden añadirse además agentes crioprotectores, tales como glicerol, a la emulsión para proteger los compuestos químicos de los efectos nocivos de la congelación.

Fosfolípidos

Según la presente descripción y reivindicaciones, el término fosfolípido pretende abarcar cualquier compuesto fosfolipídico anfífilo, cuyas moléculas pueden formar una película de material (normalmente en forma de una capa monomolecular) en la interfase del límite gas-agua en la suspensión de microburbujas final. Por consiguiente, estos materiales también se denominan en la técnica “fosfolípidos formadores de película”. De manera similar, en la mezcla emulsionada, estos compuestos anfífilos se disponen normalmente en la interfase entre el medio acuoso y el disolvente orgánico sustancialmente insoluble en agua, estabilizando así las microgotitas de disolvente emulsionadas. La película formada por estos compuestos en la interfase gas-agua o agua-disolvente puede ser o bien continua o bien discontinua. En el último caso, sin embargo las discontinuidades en la película no deben ser tales que perjudiquen la estabilidad (por ejemplo resistencia a la presión, resistencia a la coalescencia, etc.) de las microburbujas suspendidas o de las microgotitas emulsionadas, respectivamente.

La expresión “compuesto anfífilo” tal como se usa en el presente documento incluye compuestos que tienen una molécula con una parte de cabeza polar hidrófila (por ejemplo un grupo iónico o polar), que puede interaccionar con un medio acuoso, y una parte de cola orgánica hidrófoba (por ejemplo una cadena hidrocarbonada), que puede interaccionar por ejemplo con un disolvente orgánico. Por tanto, estos compuestos actúan generalmente como “agente tensioactivo”, es decir compuestos que

pueden estabilizar mezclas de materiales de otro modo generalmente inmiscibles, tales como mezclas de dos líquidos inmiscibles (por ejemplo agua y aceite), mezclas de líquidos con gases (por ejemplo microburbujas de gas en agua) o mezclas de líquidos con partículas insolubles (por ejemplo nanopartículas de metal en agua).

Los compuestos de fosfolípido anfífilos contienen normalmente al menos un grupo fosfato y al menos uno, preferiblemente dos, grupo hidrocarbonado de cadena larga lipófilo.

Ejemplos de fosfolípidos adecuados incluyen ésteres de glicerol con uno o preferiblemente dos residuos (iguales o diferentes) de ácidos grasos y con ácido fosfórico, en el que a su vez el residuo de ácido fosfórico está unido a un grupo hidrófilo, tal como colina (fosfatidilcolinas -PC), serina (fosfatidilserinas -PS), glicerol (fosfatidilgliceroles -PG), etanolamina (fosfatidiletanolaminas -PE), inositol (fosfatidilinositol) y grupos similares. Los ésteres de fosfolípidos con sólo un residuo de ácido graso se denominan generalmente en la técnica las formas “liso” del fosfolípido. En general, los residuos de ácidos grasos presentes en los fosfolípidos son ácidos alifáticos de cadena larga, que contienen normalmente desde 12 hasta 24 átomos de carbono, preferiblemente desde 14 hasta 22; la cadena alifática puede contener una o más insaturaciones o preferiblemente está saturada completamente. Ejemplos de ácidos grasos adecuados incluidos en los fosfolípidos son, por ejemplo, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Preferiblemente, se emplean ácidos grasos saturados tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido araquídico.

Ejemplos adicionales de fosfolípido son ácidos fosfatídicos, es decir los diésteres de glicerol-ácido fosfórico con ácidos grasos; esfingolípidos tales como esfingomielinas, es decir esos análogos de fosfatidilcolina en los que se reemplaza el residuo de diéster de glicerol con ácidos grasos por una

cadena de ceramida; cardiolipinas, es decir los ésteres de 1,3difosfatidilglicerol con un ácido graso; glicolípidos tales como gangliósidos GM1 (o GM2) o cerebrósidos; glucolípidos; sulfátidos y glicoesfingolípidos.

Tal como se usa en el presente documento, el término fosfolípidos incluye productos o bien que se producen de manera natural, semisintéticos o bien preparados sintéticamente que pueden emplearse o bien individualmente o bien como mezclas.

Ejemplos de fosfolípidos que se producen de manera natural son lecitinas naturales (derivados de fosfatidilcolina (PC)) tales como, normalmente, lecitinas de soja o yema de huevo.

Ejemplos de fosfolípidos semisintéticos son los derivados parcial o completamente hidrogenados de las lecitinas que se producen de manera natural. Fosfolípidos preferidos son diésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o de esfingomielina.

Ejemplos de fosfolípidos preferidos son, por ejemplo, dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoil-fosfatidilcolina (DPDPC), 1-miristoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (MPPC), 1palmitoil-2-miristoil-fosfatidilcolina (PMPC), 1-palmitoil-2estearoil-fosfatidilcolina (PSPC), 1-estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (SPPC), 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC), 1-oleil-2-palmitoil-fosfatidilcolina (OPPC), dilauroilfosfatidilglicerol (DLPG) y sus sales de metales alcalinos, diaraquidoilfosfatidilglicerol (DAPG) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metales alcalinos, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metales alcalinos, dioleoil-fosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metales alcalinos, ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido dipalmitoil-fosfatídico (DPPA) y sus sales de metales alcalinos,

ácido diestearoil-fosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoilfosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil-fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoil-fosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoilesfingomielina (DPSP) y diestearoilesfingomielina (DSSP).

El término fosfolípido incluye además fosfolípido modificado, por ejemplo fosfolípidos en los que a su vez el grupo hidrófilo está unido a otro grupo hidrófilo. Ejemplos de fosfolípidos modificados son fosfatidiletanolaminas modificadas con polietilenglicol (PEG), es decir fosfatidiletanolaminas en las que el resto de etanolamina hidrófilo está conectado a una molécula de PEG de peso molecular variable por ejemplo desde 300 hasta 5000 daltons, tales como DPPE-PEG o DSPE-PEG, es decir DPPE (o DSPE) que tiene un polímero de PEG unida a la misma. Por ejemplo, DPPE-PEG2000 se refiere a DPPE que tiene unida a la misma un polímero de PEG que tiene un peso molecular promedio medio de aproximadamente 2000. Tal como se explica en detalle a continuación, estos fosfolípidos modificados con PEG se usan preferiblemente en combinación con fosfolípidos no modificados.

Pueden emplearse satisfactoriamente tanto fosfolípidos neutros como cargados en el procedimiento de la presente invención, así como mezclas de los mismos. Tal como se usa en el presente documento y en la técnica anterior, el término “cargado” en relación con “fosfolípidos” significa que las moléculas de fosfolípido individuales tienen una carga neta global, que es positiva o, más frecuentemente, negativa.

Ejemplos de fosfolípidos que llevan una carga negativa global son derivados, en particular diésteres de ácidos grasos, de fosfatidilserina, tales como DMPS, DPPS, DSPS; de ácido fosfatídico, tales como DMPA, DPPA, DSPA; de fosfatidilglicerol tales como DMPG, DPPG y DSPG. También pueden usarse fosfolípidos

modificados, en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, tales como DMPE-PEG750, DMPE-PEG1000, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000, DMPE-PEG5000, DPPE-PEG750, DPPEPEG1000, DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG750, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPEPEG4000, DSPE-PEG5000, DAPE-PEG750, DAPE-PEG1000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000, DAPE-PEG4000 o DAPE-PEG5000 como moléculas cargadas negativamente. También puede usarse ventajosamente la forma liso de los fosfolípidos citados anteriormente, tal como derivados de lisofosfatidilserina (por ejemplo liso-DMPS, -DPPS o -DSPS), derivados de ácido lisofosfatídico (por ejemplo liso- DMPA, -DPPA o -DSPA) y derivados de lisofosfatidilglicerol (por ejemplo liso-DMPG, -DPPG o -DSPG), como compuesto cargado negativamente.

Ejemplos de fosfolípidos que llevan una carga positiva global son derivados de etilfosfatidilcolina, en particular ésteres de etilfosfatidilcolina con ácidos grasos, tales como 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC o DSEPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DPPC

o DPEPC).

Preferiblemente, se emplean combinaciones de dos o más fosfolípidos, al menos uno con una carga neutra y al menos uno con una carga neta global. Más preferiblemente, se emplean combinaciones de dos o más fosfolípidos, al menos uno con carga neutra y al menos uno con carga negativa. La cantidad de fosfolípido cargado, puede variar desde aproximadamente el 95% hasta aproximadamente el 5% en peso, con respecto a la cantidad total de fosfolípido, preferiblemente desde el 80% hasta el 20% en peso. La presencia de al menos cantidades minoritarias, tales como del 5% al 20% en peso con respecto al peso total de fosfolípido, de un fosfolípido cargado (negativamente) puede ayudar a impedir la agregación de burbujas o gotitas de la emulsión. Sin embargo, es posible usar un solo fosfolípido, neutro o cargado, o una combinación de dos o más fosfolípidos, todos neutros o todos con una carga neta global.

Fosfolípidos preferidos son DAPC, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS, DPPE, DSPE, DSPG, DPPG y etil-DSPC. Los más preferidos son DSPA, DPPS o DSPS.

Mezclas preferidas de fosfolípidos son mezclas de DPPS con DPPC, DSPC o DAPC (desde 95/5 hasta 5/95 p/p), mezclas de DSPA con DSPC o DAPC (desde 95/5 hasta 5/95 p/p), mezclas o DSPG o DPPG con DSPC o mezclas de DSPC con etil-DSPC. Las más preferidas son mezclas de DPPS/DSPC (desde 50/50 hasta 10/90 p/p) o DSPA/DSPC (desde 50/50 hasta 20/80 p/p).

La cantidad de fosfolípido está comprendida generalmente entre aproximadamente el 0,005 y aproximadamente el 1,0% en peso con respecto al peso total de la mezcla emulsionada. Por supuesto, pueden emplearse cantidades mayores pero considerando que el producto final es un agente de contraste inyectable, se prefiere no usar un exceso de aditivos a menos que sea estrictamente necesario para proporcionar un producto adecuado y estable. En general, con el uso de una cantidad de fosfolípido mayor que la indicada como el límite superior del intervalo anterior, se observa esencialmente ninguna o una mejora muy insignificante en cuanto una población de burbujas, distribución de tamaño de burbujas y estabilidad de las burbujas. Normalmente, se requieren cantidades superiores de fosfolípido cuando se usan volúmenes superiores de disolvente orgánico. Por tanto, cuando el volumen de disolvente orgánico asciende a aproximadamente el 50% del volumen de la fase acuosa, puede añadirse ventajosamente una cantidad de aproximadamente el 1% p/p de fosfolípido a la emulsión. Preferiblemente la cantidad de fosfolípido está comprendida entre el 0,01 y el 1,0% en peso con respecto al peso total de la mezcla emulsionada y más preferiblemente entre aproximadamente el 0,05% y el 0,5% en peso.

Tal como se mencionó anteriormente, las microburbujas producidas según el procedimiento de la invención están estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, tal como se definió anteriormente. En particular, la envoltura que rodea las microburbujas llenas de gas está formada por más del 50% (p/p), preferiblemente por al menos el 80%, y mucho más preferiblemente

por al menos el 90% de un material de fosfolípido tal como se definió anteriormente. Convenientemente, la totalidad sustancial de la envoltura estabilizante de las microburbujas está formada por un fosfolípido.

Sin embargo, pueden mezclarse otros materiales anfífilos con los fosfolípidos que forman la envoltura estabilizante de las microburbujas llenas de gas, en cantidades inferiores al 50% del peso total de la composición emulsionante.

Ejemplos de materiales anfífilos estabilizantes de envoltura adicionales adecuados incluyen, por ejemplo, lisolípidos; ácidos grasos, tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido behénico, ácido oleico, ácido linoleico o ácido linolénico, y sus sales respectivas con metales alcalinos o álcali; lípidos que llevan polímeros, tales como quitina, ácido hialurónico, polivinilpirrolidona o polietilenglicol (PEG), también denominados “lípidos pegilados”; lípidos que llevan mono, di, oligo o polisacáridos sulfonatados; lípidos con ácidos grasos con uniones éster o éter; lípidos polimerizados; fosfato de diacetilo; fosfato de dicetilo; estearilamina; ceramidas; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno (tal como estearatos de ácido graso de polioxietileno); alcoholes grasos de polioxietileno; éteres de alcoholes grasos de polioxietileno; ésteres de ácidos grasos de sorbitano polioxietilado; ricinoleato de polietilenglicol y glicerol; esteroles de soja etoxilados; aceite de ricino etoxilado; copolímeros de bloque de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO); ésteres de ácidos de azúcares de esteroles incluyendo glucurónidos de colesterol, glucorónidos de lanosterol, glucorónido de 7-deshidrocolesterol, glucorónido de ergosterol, gluconato de colesterol, gluconato de lanosterol o gluconato de ergosterol; ésteres de ácidos de azúcares y alcoholes incluyendo glucorónido de laurilo, glucorónido de estearoílo, glucorónido de miristoílo, gluconato de laurilo, gluconato de miristoílo o gluconato de estearoílo; ésteres de azúcares con ácidos alifáticos incluyendo laurato de sacarosa, laurato de fructosa, palmitato de sacarosa, estearato de

sacarosa, ácido glucurónico, ácido glucónico o ácido poliurónico; ésteres de glicerol con ácidos grasos dicarboxílicos (C12-C24), preferiblemente (C14-C22) y sus sales respectivas con sales de metales alcalinos o álcali, tales como 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol o 1,3-dipalmitoil-2succinilglicerol; saponinas incluyendo sarsasapogenina, esmilagenina, hederagenina, ácido oleanólico o digitoxigenina; alcoholes de cadena larga (C12-C24), incluyendo alcohol ndecílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol

cetílico o alcohol n-octadecílico; 6-(5-colesten-3-iloxi)-1tio--D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido; 6-(5colesten-3-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxi-1-tio--Dgalactopiranósido; 6-(5-colesten-3-iloxi)hexil-6-amino-6desoxil-1-tio--D-manopiranósido; ácido 12-(((7’

dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanoico; ácido N-[12-(((7’-dietilaminocumarin-3il)carbonil)metilamino)octadecanoil]-2-aminopalmítico; Nsuccinil-dioleilfosfatidiletanolamina; 1-hexadecil-2palmitoilglicerofosfoetanolamina; palmitoilhomocisteína; sales de alquilamonio que comprenden al menos una cadena alquilo (C10C20), preferiblemente (C14-C18), tal como, por ejemplo, cloruro de estearilamonio, cloruro de hexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio cuaternario o terciario que comprenden uno o preferiblemente dos residuos de éster acílico (C10-C20), preferiblemente (C14-C18), tal como, por ejemplo, 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2-oleoil-3trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-diestearoil-3-dimetilamoniopropano (DSDAP): y mezclas o combinaciones de los mismos.

Pequeñas cantidades de ácidos grasos y formas liso de los fosfolípidos también pueden formarse como productos de degradación de los productos de fosfolípido originales, por ejemplo como consecuencia del calentamiento de la emulsión.

Los materiales anfífilos estabilizantes de envoltura adicionales preferidos son aquellos compuestos que comprenden

uno o dos residuos de ácido graso en su molécula, en particular una o dos cadenas acilo (C10-C20), preferiblemente acilo (C14-C18) lineales, tales como, por ejemplo, los ácidos grasos enumerados anteriormente, sus sales y derivados respectivos.

Los materiales anfífilos estabilizantes de envoltura adicionales particularmente preferidos son aquellos compuestos que pueden conferir una carga neta global a la envoltura estabilizante, es decir compuestos que llevan una carga neta positiva o negativa global. Ejemplos de compuestos cargados negativa o positivamente adecuados son, por ejemplo, lisofosfolípidos, es decir la forma liso de los fosfolípidos citados anteriormente, tales como derivados de lisofosfatidilserina (por ejemplo liso-DMPS, -DPPS o -DSPS), derivados de ácido lisofosfatídico (por ejemplo liso-DMPA, -DPPA o -DSPA) y derivados de lisofosfatidilglicerol (por ejemplo liso-DMPG, DPPG o -DSPG); sales de ácidos biliares tales como sales de ácido cólico, sales de ácido desoxicólico o sales de ácido glicocólico; sales de ácidos grasos (C12-C24), preferiblemente (C14-C22) tales como, por ejemplo, sal de ácido palmítico, sal de ácido esteárico, sal de 1,2-dipalmitoil-sn-3-succinilglicerol o sal de 1,3-dipalmitoil-2-succinilglicerol; sales de alquilamonio con un contraión de halógeno (por ejemplo cloro o bromo) que comprenden al menos una cadena de alquilo (C10-C20), preferiblemente cadena alquilo (C14-C18), tal como, por ejemplo cloruro de estearilamonio, cloruro de hexadecilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB); sales de amonio cuaternario o terciario con un contraión de halógeno (por ejemplo cloro o bromo) que comprenden una o preferiblemente dos cadenas acilo (C10-C20), preferiblemente residuo de éster acílico (C14-C18), tal como, por ejemplo, 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetilamonio-propano (DPTAP), 1,2oleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), 1,2-diestearoil-3dimetilamonio-propano (DSDAP).

Si se desea obtener agentes de contraste para ultrasonido “dirigidos”, es decir agentes de contraste que contienen microburbujas que pueden unirse selectivamente a un sitio

específico tras su administración in vitro o in vivo, según el procedimiento de la presente invención también es posible partir directamente de un fosfolípido al menos parte del cual se ha modificado mediante la introducción de un ligando de direccionamiento seleccionado adecuado o alternativamente, y preferiblemente, partir de un fosfolípido al menos parte del cual contiene un grupo reactivo posiblemente protegido que puede acoplarse en una etapa posterior con el ligando de direccionamiento seleccionado de manera adecuada que contiene una función reactiva complementaria (por ejemplo enlace avidinabiotina).

Por tanto, en este contexto específico, el término “fosfolípido” pretende abarcar fosfolípidos tanto modificados como no modificados, incluyendo así fosfolípidos modificados conectando un ligando de direccionamiento o un grupo reactivo protector a la molécula anfífila del fosfolípido.

La expresión “ligando de direccionamiento” incluye dentro de su significado cualquier compuesto, resto o residuo que tiene, o puede promover, una actividad de direccionamiento de las microburbujas de la invención hacia cualquier sitio patológico o biológico dentro de un organismo vivo. Los materiales o sustancias que pueden servir como ligandos de direccionamiento incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a proteínas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas de receptor, moléculas de unión a receptor, glicoproteínas y lectinas; péptidos, incluyendo oligopéptidos y polipéptidos; peptidomiméticos; sacáridos, incluyendo mono y polisacáridos; vitaminas; esteroides, análogos de esteroides, hormonas, cofactores, agentes bioactivos y material genético, incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos. Las dianas a las que puede asociarse el ligando de direccionamiento incluyen tejidos tales como, por ejemplo, tejido miocárdico (incluyendo células miocárdicas y cardiomiocitos), tejidos membranosos (incluyendo endotelio y epitelio), láminas, tejido conjuntivo (incluyendo tejido intersticial) o tumores; coágulos sanguíneos; y receptores tales como, por ejemplo, receptores de superficie celular para hormonas peptídicas, neurotransmisores,

antígenos, fragmentos del complemento, e inmunoglobulinas y receptores citoplasmáticos para hormonas esteroideas.

Se dan a conocer ejemplos de dianas adecuadas y ligandos de direccionamiento, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º

6.139.819.

En una realización preferida, los ligandos de direccionamiento pueden unirse a las moléculas anfífilas que forman la envoltura estabilizante a través de un enlace covalente.

En un caso de este tipo, el resto reactivo específico que necesita estar presente en la molécula de lípido o fosfolípido cuando se desea una molécula anfífila de direccionamiento, dependerá del ligando de direccionamiento particular que va a acoplarse a la misma. Como ejemplo, si el ligando de direccionamiento puede conectarse a la molécula anfífila a través de un grupo amino, restos reactivos adecuados para la molécula anfífila pueden ser grupos isotiocianato (que formarán un enlace tiourea), ésteres reactivos (para formar un enlace amida), grupos aldehído (para la formación de un enlace imina que va a reducirse a un enlace alquilamina), etc.; si el ligando de direccionamiento puede conectarse a la molécula anfífila a través de un grupo tiol, restos reactivos complementarios adecuados para la molécula anfífila incluyen derivados de haloacetilo o maleimidas (para formar un enlace tioéter); y si el ligando de direccionamiento puede conectarse a la molécula anfífila a través de un grupo carboxílico, restos reactivos adecuados para la molécula anfífila pueden ser aminas e hidrazidas (para formar enlaces amida o alquilamida). El resto reactivo puede conectarse o bien directamente a la molécula de fosfolípido o bien a un resto modificante (por ejemplo PEG) conectado al fosfolípido.

Tal como se indicó anteriormente, en una realización preferida, cuando se desea un agente de contraste que contiene microburbujas dirigidas, al menos parte del fosfolípido de partida contendrá un resto reactivo adecuado y el ligando de direccionamiento que contiene la funcionalidad complementaria se conectará al mismo o bien en cualquier etapa antes de la

liofilización, añadiendo el ligando de direccionamiento que contiene la funcionalidad complementaria en la fase que contiene los fosfolípidos/lípidos funcionalizados, o bien antes de, durante o tras la generación de la emulsión, o justo antes de la etapa de reconstitución. En este último caso será posible aprovechar completamente la flexibilidad del sistema puesto que las microburbujas que contienen al menos parte de los fosfolípidos formadores de película, o de los lípidos asociados, funcionalizados adecuadamente, entonces pueden unirse a cualquier ligando de direccionamiento deseado, que comparte el mismo grupo complementario reactivo.

Sin embargo, no necesariamente el ligando de direccionamiento necesita unirse a las moléculas anfífilas a través de un enlace covalente. Los ligandos de direccionamiento también pueden asociarse adecuadamente a las microburbujas por medio de tipos físicos y/o electrostáticos de interacciones. Como ejemplo, puede introducirse un resto funcional que tiene una selectividad y afinidad alta por un resto complementario en la molécula de fosfolípido, mientras que el resto complementario se conectará al ligando de direccionamiento. Por ejemplo, un resto de avidina (o estreptavidina) (que tiene una alta afinidad por la biotina) puede conectarse covalentemente a un fosfolípido estabilizante de microburbujas mientras que el resto de biotina complementario puede incorporarse en un ligando de direccionamiento adecuado, por ejemplo un péptido o un anticuerpo. Por tanto, el ligando de direccionamiento marcado con biotina se asociará a la microburbuja marcada con avidina por medio del sistema de acoplamiento avidina-biotina. Según una realización alternativa, un fosfolípido que contiene biotina puede usarse como un compuesto para formar la envoltura estabilizante de una microburbuja; entonces se hace reaccionar primero el fosfolípido que contiene biotina incorporado en la envoltura estabilizante con avidina (o neutravidina) y después con un ligando que contiene biotina. También se dan a conocer ejemplos de marcaje con biotina/avidina de fosfolípidos y péptidos en el documento US 6.139.819 citado anteriormente. Alternativamente, interacciones de van der Waals, interacciones

electrostáticas y otros procesos de asociación pueden asociar o unir el ligando de direccionamiento a las moléculas anfífilas.

Ejemplos de dianas específicas adecuadas a las que pueden dirigirse las microburbujas de la invención son, por ejemplo, fibrina, el receptor v3 o el receptor GPIIbIIIa en plaquetas activadas. De hecho, la fibrina y las plaquetas están presentes generalmente en “trombos”, es decir coágulos que pueden formarse en la corriente sanguínea y provocar una obstrucción vascular. Se dan a conocer péptidos de unión adecuados, por ejemplo, en el documento US 6.139.819 citado anteriormente. Se dan a conocer péptidos de unión adicionales específicos para su direccionamiento a fibrina, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 02/055544.

Otros ejemplos de dianas importantes incluyen receptores en placas vulnerables y receptores específicos de tumor, tales como región de dominio de cinasa (KDR) y complejo de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular)/KDR. Se dan a conocer péptidos de unión adecuados para KDR o complejo de VEGF/KDR, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 03/74005 y WO 03/084574.

Procedimiento

La etapa de emulsionar a) del procedimiento de la presente invención puede llevarse a cabo sometiendo el medio acuoso y el disolvente de núcleo en presencia de al menos un fosfolípido a cualquier técnica de generación de emulsión apropiada conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, sonicación, agitación, homogeneización de alta presión, micromezclado, emulsificación de membrana, agitación de alta velocidad o mezclado de alta cizalladura, por ejemplo usando un homogeneizador de rotor y estator. Por ejemplo, se emplea un homogeneizador de rotor y estator, tal como Polytron® PT3000. Puede seleccionarse la velocidad de agitación del homogeneizador de rotor y estator dependiendo de los componentes de la emulsión, el volumen de la emulsión y del diámetro del recipiente que contiene la emulsión y el diámetro final deseado de las microgotitas de disolvente en

la emulsión. En general, se ha observado que, cuando se usa un homogeneizador de rotor y estator que tiene una sonda de aproximadamente 3 cm de diámetro sumergida en un mezcla de 50-80 ml contenida en vaso de precipitados de 3,5-5 cm de diámetro, normalmente es suficiente una velocidad de agitación de aproximadamente 8000 rpm para obtener microgotitas que tienen un diámetro numérico medio suficientemente reducido para dar como resultado, tras liofilización y reconstitución de la matriz liofilizada, microburbujas llenas de gas que tienen un diámetro inferior a aproximadamente 1,8 m. Al aumentar la velocidad de agitación a aproximadamente 12000 rpm, en general es posible obtener microburbujas llenas de gas que tienen un diámetro medio en número inferior a aproximadamente 1,5 m, mientras que con una velocidad de agitación de aproximadamente 14000-15000 rpm, pueden obtenerse generalmente microburbujas llenas de gas que tienen un diámetro medio en número de aproximadamente 1,0 mo menos. En general, se ha observado que al aumentar la velocidad de agitación por encima de aproximadamente 18000 rpm, se obtiene una ligera reducción adicional del tamaño de las microburbujas.

Alternativamente, también puede emplearse una técnica de micromezclado para emulsionar la mezcla. Tal como se conoce, una micromezcladora normalmente contiene al menos dos entradas y al menos una salida. Por tanto, se introduce el disolvente orgánico en la mezcladora a través de una primera entrada (a una velocidad de flujo de por ejemplo 0,05-5 ml/min.), mientras que la fase acuosa se introduce a través de la segunda entrada (por ejemplo a una velocidad de flujo de 2-100 ml/min.). Entonces se conecta la salida de la micromezcladora al recipiente que contiene la fase acuosa, de manera que la fase acuosa extraída de dicho recipiente en instantes posteriores e introducida en la micromezcladora contiene cantidades crecientes de disolvente emulsionado. Cuando se ha añadido el volumen completo de disolvente, puede mantenerse la emulsión procedente del recipiente en recirculación a través de la micromezcladora durante un periodo de tiempo predeterminado adicional, por

ejemplo 5-120 minutos, para permitir que se complete la emulsión.

Dependiendo de la técnica de emulsión, puede introducirse gradualmente el disolvente orgánico durante la etapa de emulsificación o de una vez antes de iniciar la etapa de emulsificación. Alternativamente, puede añadirse gradualmente el medio acuoso al disolvente inmiscible con agua durante la etapa de emulsificación o de una vez antes de iniciar la etapa de emulsificación. Preferiblemente, se dispersa el fosfolípido en el medio acuoso antes de que este último se mezcle con el disolvente orgánico. Alternativamente, puede dispersarse el fosfolípido en el disolvente orgánico o puede añadirse por separado a la mezcla acuosa-orgánica antes de o durante la etapa de emulsificación.

La emulsificación de la etapa a) se lleva a cabo convenientemente a temperatura ambiente, por ejemplo a una temperatura de 22ºC  5ºC, o a temperaturas superiores, por ejemplo 50ºC-60ºC (por ejemplo en el caso de disolventes de núcleo con puntos de ebullición altos) o a temperatura inferior, por ejemplo 0ºC-10ºC (por ejemplo en el caso de disolventes de núcleo con puntos de ebullición cercanos a temperatura ambiente). Se mantiene preferiblemente la temperatura por debajo de la temperatura de ebullición del disolvente orgánico, preferiblemente al menos 5ºC por debajo de dicha temperatura, más preferiblemente al menos 10ºC por debajo. Puesto que una exposición prolongada de la mezcla a altas temperaturas (por ejemplo 90ºC o más) puede provocar posibles degradaciones de los fosfolípidos, con la consiguiente formación de los respectivos derivados liso, en general se prefiere evitar tal calentamiento prolongado a altas temperaturas.

Si es necesario, puede someterse el medio acuoso que contiene los fosfolípidos a calentamiento controlado, con el fin de facilitar la dispersión de los mismos. Por ejemplo, puede calentarse la suspensión acuosa que contiene fosfolípido a aproximadamente 60-70ºC durante aproximadamente 15 minutos y

entonces se permite que se enfríe a la temperatura a la que después se lleva a cabo la etapa de emulsión.

Tal como se mencionó previamente, también pueden introducirse materiales anfífilos adicionales, tales como los enumerados previamente, en la mezcla emulsionante que contiene el fosfolípido. La cantidad de dichos compuestos anfífilos adicionales preferiblemente no es superior a aproximadamente el 50% en peso con respecto al peso total de material anfífilo, más preferiblemente no superior al 20% en peso, hasta una cantidad de por ejemplo aproximadamente el 0,1%.

Si se desea, el medio acuoso puede contener además uno o más excipientes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “excipiente” se refiere a cualquier aditivo útil en la presente invención, tal como los aditivos empleados para aumentar la estabilidad de la emulsión o del producto intermedio de liofilizado y/o para proporcionar composiciones finales estables y farmacéuticamente aceptables.

A este respecto, excipientes a modo de ejemplo son, por ejemplo, potenciadores de viscosidad y/o adyuvantes de solubilidad para los fosfolípidos.

Los potenciadores de viscosidad y adyuvantes de solubilidad que pueden emplearse adecuadamente son, por ejemplo, mono o polisacáridos, tales como glucosa, lactosa, sacarosa y dextranos, alcoholes alifáticos, tales como alcohol isopropílico y alcohol butílico, polioles tales como glicerol, 1,2propanodiol y agentes similares. En general, sin embargo se ha encontrado que es innecesario incorporar aditivos tales como potenciadores de viscosidad, que se emplean comúnmente en muchas formulaciones de agente de contraste existentes, en los agentes de contraste de la presente invención. Ésta es una ventaja adicional de la presente invención puesto que el número de componentes administrados al organismo de un sujeto se mantiene en una cantidad mínima y la viscosidad de los agentes de contraste se mantiene tan baja como sea posible.

Tal como se mencionó anteriormente, el solicitante ha encontrado sustancialmente innecesario, añadir formadores de

estructura insolubles en agua, tales como colesterol, a la mezcla emulsionante. De hecho, se ha observado que una cantidad del 0,05% (p/p con respecto al peso total de la mezcla emulsionante) de colesterol reduce drásticamente el rendimiento de conversión de microgotitas en microvesículas llenas de gas, dando como resultado además una dispersión amplia del tamaño de las vesículas. La cantidad de compuestos insolubles en agua en la mezcla emulsionante, particularmente de aquellos compuestos que no comprenden uno o dos residuos de ácido graso en su estructura, por tanto es preferiblemente inferior al 0,050%, más preferiblemente inferior a aproximadamente el 0,030% en peso con respecto al peso total de la emulsión.

Las emulsiones producidas según la etapa a) pueden someterse ventajosamente a una o más etapas de lavado, antes de la liofilización de la etapa b), con el fin de eliminar un exceso de fosfolípidos en la fase acuosa (no asociada a la emulsión) y separar y eliminar aditivos opcionales tales como potenciadores de viscosidad y adyuvantes de solubilidad, así como material no deseado tal como partículas coloidales, y gotitas de la emulsión de menor tamaño y/o de mayor tamaño. Puede efectuarse tal lavado de manera conocida per se, separándose la emulsión usando técnicas tales como decantación, flotación, centrifugación, filtración de flujo cruzado y similares.

Si se prevén etapas de lavado, y si estuvo presente un agente lioprotector en la fase acuosa original antes de la generación de la emulsión, pueden realizarse dichas etapas de lavado con disoluciones acuosas que contienen uno o más agentes lioprotectores para sustituir la cantidad de agentes lioprotectores eliminados parcialmente con los lavados. Por otro lado, si no estuvo presente ningún lioprotector en la mezcla acuosa-orgánica emulsionada, puede lavarse la emulsión formada con una disolución acuosa que contiene lioprotector, con el fin de introducir el lioprotector en la mezcla emulsionada o, alternativamente, puede añadirse el lioprotector tras las etapas de lavado, antes de la liofilización.

Si se desea, puede someterse la emulsión (o bien como tal o bien tras la etapa de lavado) a una etapa de microfiltración o ultrafiltración antes de la liofilización, con el fin de reducir adicionalmente la cantidad de microburbujas de gran tamaño en la suspensión reconstituida final. Durante la microfiltración, por

ejemplo con un filtro de 5 mo3 m, de hecho el filtro retiene las microgotitas de gran tamaño y se separan del resto de las microgotitas de pequeño tamaño, impidiendo así la formación de microburbujas de gran tamaño tras la reconstitución del material liofilizado. Puede llevarse a cabo la microfiltración según técnicas convencionales tales como filtración positiva, filtración a vacío o filtración en línea. Las membranas de filtración pueden ser de nailon, fibra de vidrio, celulosa, papel, membranas de policarbonato o poliéster (Nuclepore®).

Según una realización alternativa, puede añadirse un compuesto anfífilo adicional tras la formación de la emulsión según las enseñazas anteriores, o bien con o bien sin las etapas de lavado. En particular, se añade una suspensión acuosa del compuesto deseado a la emulsión formada, preferiblemente con agitación y calentamiento (preferiblemente a menos de 80ºC, por ejemplo 40ºC-80ºC, en particular 50-70ºC), con el fin de añadir dicho compuesto a la envoltura estabilizante. Esta realización alternativa es particularmente útil para introducir posteriormente en la capa estabilizante compuestos anfífilos que pueden afectar de otro modo negativamente a las propiedades del producto final si se introducen en la mezcla inicial de la emulsión. Ejemplos de compuestos anfífilos que convenientemente pueden introducirse posteriormente como componentes adicionales de la envoltura estabilizante tras la preparación de la emulsión inicial son, por ejemplo, fosfolípidos modificados con PEG, en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, tales como DMPE-PEG750, DMPE-PEG1000, DMPE-PEG2000, DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000, DMPE-PEG5000, DPPE-PEG750, DPPE-PEG1000, DPPEPEG2000, DPPE-PEG3000, DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000, DSPE-PEG750, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000, DSPEPEG5000, DAPE-PEG750, DAPE-PEG1000, DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000,

DAPE-PEG4000 o DAPE-PEG5000. De manera similar, convenientemente también pueden introducirse posteriormente fosfolípidos modificados con PEG que llevan restos reactivos o ligandos de direccionamiento (por ejemplo que contienen biotina, maleimida o maleimida-péptido) según este método. Además, también puede usarse esta técnica para añadir posteriormente a la composición de la capa estabilizante otros componentes, tales como lipopéptidos o tensioactivos poliméricos. Ejemplos de tensioactivos poliméricos que pueden añadirse convenientemente tras la formación de la emulsión son, por ejemplo, copolímeros de bloque de óxido de etileno-óxido de propileno, tales como Pluronic F68, Pluronic F108, Pluronic F-127 (Sigma Aldrich, Missouri, EE.UU.); alquil éteres polioxietilados tales como Brij® 78 (Sigma Aldrich, Missouri, EE.UU.); ésteres de ácidos grasos de polioxietileno tales como Mirj® 53 o Mirj® 59 (Sigma Aldrich, Missouri, EE.UU.); éster de ácido graso de polioxietilensorbitano tal como Tween® 60 (Sigma Aldrich, Missouri, EE.UU.); o terc-octilfenil éter de polietilenglicol tal como Triton®X-100 (Sigma Aldrich, Missouri, EE.UU.).

De hecho, el solicitante ha observado que el uso de una mezcla que contiene cantidades limitadas (por ejemplo menos del 10% en peso) de un fosfolípido modificado con PEG (por ejemplo DSPE-PEG o DPPE-PEG) junto con un fosfolípido formador de película (por ejemplo DPPS o una mezcla 50:50 de DAPC/DPPS) para preparar una emulsión según el procedimiento de la invención, puede determinar una ampliación sustancial de la distribución de tamaño en el producto final, con respecto a la distribución de tamaño de las microburbujas obtenidas a partir de una emulsión que contiene sólo el fosfolípido formador de película. Por otro lado, si se prepara en primer lugar una emulsión que contiene sólo el fosfolípido formador de película y entonces se añade posteriormente una suspensión acuosa del fosfolípido modificado con PEG a la emulsión obtenida (por ejemplo con agitación durante 1 hora, a una temperatura de aproximadamente 60ºC), se ha observado que puede incorporarse una cantidad bastante alta (normalmente más del 30% en peso) del fosfolípido modificado con

PEG en la envoltura estabilizante, sin afectar sustancialmente a la distribución de tamaño del producto final.

Según una realización preferida, la emulsión se somete a un tratamiento de calentamiento adicional controlado antes de la etapa de liofilización. El calentamiento adicional de la emulsión se realiza preferiblemente en un recipiente sellado. El tratamiento con calor puede variar desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 90 minutos, a temperaturas comprendidas desde aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 125ºC, preferiblemente desde aproximadamente 80ºC hasta aproximadamente 120ºC. En general, cuanto mayor es la temperatura, más corto será el tiempo del tratamiento térmico. Durante el calentamiento, la emulsión puede mantenerse opcionalmente con agitación.

Tal como observa el solicitante, aunque este tratamiento térmico adicional puede dar como resultado una degradación parcial de los fosfolípidos (por ejemplo con un contenido de aproximadamente el 5-20% p/p en lisolípidos en el producto final, cuando se calienta la emulsión a aproximadamente 100120ºC durante aproximadamente 30 min.), no obstante tiene la gran ventaja de permitir un estrechamiento sustancial de la distribución de tamaño y un aumento del número total de microburbujas en la suspensión final, independientemente de las condiciones de trabajo de la etapa de emulsificación inicial (por ejemplo el tipo de disolvente orgánico, la técnica de emulsificación, las etapas de lavado opcionales, etc.).

La emulsión tratada térmicamente puede someterse entonces directamente a liofilización, normalmente sin la necesidad de etapas de lavado adicionales.

Puede llevarse a cabo la liofilización de la emulsión según la etapa b) congelando inicialmente la emulsión y liofilizando después la emulsión congelada, mediante métodos y dispositivos conocidos generalmente per se. Dado que el producto liofilizado secado se reconstituirá normalmente mediante la adición de un líquido portador antes de su administración, pueden llenarse ventajosamente viales sellables con la emulsión antes de la liofilización de manera que se proporcionan viales que

contienen, cada uno, una cantidad apropiada, por ejemplo una única unidad de dosificación, de producto secado liofilizado para su reconstitución en una forma inyectable. Liofilizando la emulsión en viales individuales en lugar de a granel, se evitan la manipulación de la estructura similar a un panal delicada del producto liofilizado y el riesgo de degradar al menos parcialmente esta estructura.

Tras la liofilización, puede retirarse el vacío en el liofilizador introduciendo el gas deseado para formar las microburbujas en la formulación final del agente de contraste. Esto permitirá que se llene el espacio libre de los viales con el gas deseado y entonces que se sellen los viales con un cierre apropiado. Alternativamente, puede mantenerse el vial a vacío y sellarse, mientras que se añade el gas en una etapa posterior, por ejemplo justo antes de su administración, por ejemplo cuando el gas es un gas radioactivo o hiperpolarizado.

Por tanto, puede almacenarse de manera estable el producto liofilizado así obtenido en presencia del gas adecuado durante varios meses antes de reconstituirse disolviéndolo en un líquido portador acuoso, para obtener una suspensión de microburbujas llenas de gas.

Puede emplearse cualquier gas biocompatible, gas precursor

o mezcla de los mismos para llenar las microvesículas anteriores, seleccionándose el gas dependiendo de la modalidad elegida.

El gas puede comprender, por ejemplo, aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; un gas inerte o noble tal como helio, argón, xenón o criptón; un gas radioactivo tal como Xe133 o Kr81; un gas noble hiperpolarizado tal como helio hiperpolarizado, xenón hiperpolarizado o neón hiperpolarizado; un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo que contiene hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo un alcano tal como metano, etano, propano, butano, isobutano, pentano o isopentano, un cicloalcano tal como ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como propeno, buteno o isobuteno, o un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; gases halogenados, preferiblemente gases fluorados, tales como

hidrocarburos de bajo peso molecular halogenados, fluorados o perfluorados (por ejemplo que contienen hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Cuando se usa un hidrocarburo halogenado, preferiblemente al menos algunos, más preferiblemente todos, de los átomos de halógeno en dicho compuesto son átomos de flúor.

Se prefieren gases fluorados, en particular gases perfluorados, especialmente en el campo de la obtención de imágenes por ultrasonido. Los gases fluorados incluyen materiales que contienen al menos un átomo de flúor tal como, por ejemplo, hidrocarburos fluorados (compuestos orgánicos que contienen uno o más átomos de carbono y flúor); hexafluoruro de azufre; cetonas fluoradas, preferiblemente perfluoradas, tales como perfluoroacetona; y éteres fluorados, preferiblemente perfluorados, tales como perfluorodietil éter. Compuestos preferidos son gases perfluorados, tales como SF6 o perfluorocarbonos (hidrocarburos perfluorados), es decir, hidrocarburos en los que todos los átomos de hidrógeno se sustituyen por átomos de flúor, que se sabe que forman suspensiones de microburbujas particularmente estables, tal como se da a conocer, por ejemplo, en el documento EP 0554 213.

El término perfluorocarbono incluye perfluorocarbonos saturados, insaturados y cíclicos. Ejemplos de perfluorocarbonos fisiológicamente aceptables, biocompatibles son: perfluoroalcanos, tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (por ejemplo perfluoro-nbutano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tales como perfluoro-isobutano), perfluoropentanos, perfluorohexanos o perfluoroheptanos; perfluoroalquenos, tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos (por ejemplo perfluorobut-2eno) o perfluorobutadieno; perfluoroalquinos (por ejemplo perfluorobut-2-ino); y perfluorocicloalcanos (por ejemplo perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano). Los

perfluorocarbonos saturados preferidos tienen la fórmula CnFn+2, en la que n es desde 1 hasta 12, preferiblemente desde 2 hasta 10, lo más preferiblemente desde 3 hasta 8 e incluso más preferiblemente desde 3 hasta 6. Los perfluorocarbonos adecuados incluyen, por ejemplo, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12, C6F12, C6F14, C7F14, C7F16, C8F18 y C9F20.

Gases particularmente preferidos son SF6 o perfluorocarbonos seleccionados de CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10 o mezclas de los mismos; se prefieren particularmente SF6, C3F8 o C4F10.

También puede ser ventajoso usar una mezcla de cualquiera de los gases anteriores en cualquier razón. Por ejemplo, la mezcla puede comprender un gas convencional, tal como nitrógeno, aire o dióxido de carbono y un gas que forma una suspensión de microburbujas estable, tal como hexafluoruro de azufre o un perfluorocarbono tal como se indicó anteriormente. Pueden encontrarse ejemplos de mezclas de gases adecuados, por ejemplo, en el documento WO 94/09829, que se incorpora en el presente documento como referencia. Se prefieren particularmente las siguientes combinaciones: una mezcla de gases (A) y (B) en la que el gas (B) es un gas fluorado, preferiblemente seleccionado de SF6, CF4, C2F6, C3F6, C3F8, C4F6, C4F8, C4F10, C5F10, C5F12 o mezclas de los mismos, y (A) se selecciona de aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono o mezclas de los mismos. La cantidad del gas

(B) puede representar desde aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 95% v/v de la mezcla total, preferiblemente desde aproximadamente el 5% hasta el 80%.

En algunos ejemplos, puede ser deseable incluir un precursor para una sustancia gaseosa (es decir, un material que puede convertirse en un gas in vivo). Preferiblemente, el precursor gaseoso y el gas derivado del mismo son fisiológicamente aceptables. El precursor gaseoso puede activarse por pH, fotoactivarse, activarse por temperatura, etc. Por ejemplo, pueden usarse ciertos perfluorocarbonos como precursores gaseosos activados por temperatura. Estos perfluorocarbonos, tales como perfluoropentano o perfluorohexano, tienen una temperatura de transición de fase

líquido/gas por encima de la temperatura ambiente (o la temperatura a la que se producen y/o almacenan los agentes) pero por debajo de la temperatura corporal; por tanto, experimentan una transición de fase líquido/gas y se convierten en un gas dentro del cuerpo humano. Además, el término “gas” tal como se usa en el presente documento incluye mezclas en forma de vapor a la temperatura del cuerpo humano normal de 37ºC. Por tanto, también pueden usarse compuestos que son líquidos a la temperatura de 37ºC en cantidades limitadas en mezcla con otros compuestos gaseosos, para obtener una mezcla que está en una fase de vapor a 37ºC.

Para la ecografía ultrasónica, el gas biocompatible o la mezcla de gases se selecciona preferiblemente de aire, nitrógeno, dióxido de carbono, helio, criptón, xenón, argón, metano, hidrocarburos halogenados (incluyendo gases fluorados tales como perfluorocarbonos y hexafluoruro de azufre) o mezclas de los mismos. Ventajosamente, pueden usarse perfluorocarbonos (en particular C4F10 o C3F8) o SF6, opcionalmente en mezcla con aire o nitrógeno.

Para el uso en MRI, las microburbujas contendrán preferiblemente un gas noble hiperpolarizado tal como neón hiperpolarizado, helio hiperpolarizado, xenón hiperpolarizado o mezclas de los mismos, opcionalmente en mezcla con aire, CO2, oxígeno, nitrógeno, helio, xenón o cualquiera de los hidrocarburos halogenados tal como se definió anteriormente.

Para su uso en gammagrafía, las microburbujas según la invención contendrán preferiblemente gases radioactivos tales como Xe133 o Kr81 o mezclas de los mismos, opcionalmente en mezcla con aire, CO2, oxígeno, nitrógeno, helio, criptón o cualquiera de los hidrocarburos halogenados tal como se definió anteriormente.

Entonces puede reconstituirse muy fácilmente la composición liofilizada en contacto con el gas mediante la adición de un líquido portador fisiológicamente aceptable e inyectable acuoso estéril apropiado tal como agua libre de pirógenos estéril para inyección, una disolución acuosa tal como solución salina (que puede equilibrarse ventajosamente de manera que el producto

final para inyección no sea hipotónico), o una disolución acuosa de una o más sustancias de ajuste de la tonicidad tales como sales (por ejemplo de cationes plasmáticos con contraiones fisiológicamente tolerables), o azúcares, alcoholes de azúcar, glicoles y otros materiales de poliol no iónicos (por ejemplo glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares), requiriendo sólo una agitación mínima tal como, por ejemplo, puede proporcionarse mediante agitación manual suave.

Tal como observa el solicitante, las microburbujas reconstituidas así obtenidas tienen generalmente un diámetro medio en número que es ligeramente inferior al diámetro medio en número medido para las microgotitas de la emulsión. En general, el diámetro en número medio de las microburbujas es desde aproximadamente el 60% hasta aproximadamente el 90% del diámetro en número medio de las microgotitas de la emulsión. En la mayoría de casos, se ha observado un diámetro en número medio de las microburbujas de aproximadamente el 70-75% del diámetro en número medio de las microgotitas.

Cuando el producto secado está contenido en un vial, éste se sella convenientemente con un tabique a través del cual puede inyectarse el líquido portador usando una jeringa opcionalmente llenada previamente; alternativamente, el producto secado y el líquido portador pueden suministrarse juntos en un dispositivo de doble cámara tal como una jeringa de doble cámara. Puede ser ventajoso mezclar o agitar suavemente el producto tras su reconstitución. Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, en los agentes de contraste estabilizados según la invención el tamaño de las microburbujas de gas puede ser sustancialmente independiente de la cantidad de energía de agitación aplicada al producto secado reconstituido. Por consiguiente, puede requerirse no más que una agitación manual suave para proporcionar productos reproducibles con un tamaño de microburbujas constante.

Las suspensiones de microburbujas generadas tras su reconstitución en agua o una disolución acuosa pueden ser estables durante al menos 12 horas, permitiendo así una

flexibilidad considerable respecto a cuándo se reconstituye el producto secado antes de su inyección.

A menos que contenga un gas hiperpolarizado, que se sabe que requiere condiciones de almacenamiento especiales, puede almacenarse y transportarse el residuo liofilizado sin necesidad de un control de temperatura de su entorno y en particular puede suministrarse a hospitales y médicos para su formulación en el sitio en una suspensión administrable lista para usar sin requerir que tales usuarios tengan instalaciones de almacenamiento especiales.

En un caso de este tipo, preferiblemente puede suministrarse en forma de un kit de dos componentes.

Dicho kit de dos componentes puede incluir dos envases separados o un envase de doble cámara. En el primer caso, preferiblemente el envase es un vial sellado con tabique convencional, en el que el vial que contiene el residuo liofilizado de la etapa b) está sellado con un tabique a través del cual puede inyectarse el líquido portador usando una jeringa opcionalmente llenada previamente. En un caso de este tipo, la jeringa usada como envase del segundo componente también se usa después para inyectar el agente de contraste. En el último caso, preferiblemente el envase de doble cámara es una jeringa de doble cámara y una vez que se ha reconstituido el liofilizado y después mezclado adecuadamente o agitado suavemente, el envase puede usarse directamente para inyectar el agente de contraste. En ambos casos se proporcionan medios para dirigir o permitir la aplicación de suficiente energía formadora de burbujas en el contenido del envase. Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, en los agentes de contraste estabilizados según la invención el tamaño de las microburbujas de gas es sustancialmente independiente de la cantidad de energía de agitación aplicada al producto secado reconstituido. Por consiguiente, se requiere generalmente no más que una agitación manual suave para proporcionar productos reproducibles con tamaño de microburbujas constante.

Un experto en la técnica puede apreciar que otros sistemas de reconstitución de dos cámaras que pueden combinar el polvo

secado con la disolución acuosa de manera estéril también están dentro del alcance de la presente invención. En tales sistemas, es particularmente ventajoso si la fase acuosa puede interponerse entre el gas insoluble en agua y el entorno, para aumentar la vida útil del producto. Cuando un material necesario para formar el agente de contraste ya no está presente en el envase (por ejemplo un ligando de direccionamiento que va a unirse al fosfolípido durante la reconstitución), puede envasarse con los otros componentes del kit, preferiblemente en una forma o envase adaptado para facilitar una fácil combinación con los otros componentes del kit.

No se requiere ningún envase, vial o sistema de conexión específico; la presente invención puede usar envases, viales y adaptadores convencionales. El único requisito es una buena obturación entre el tapón y el envase. Por tanto, la calidad de la obturación se convierte en un asunto de preocupación principal; cualquier degradación de la integridad de la obturación puede permitir que sustancias indeseables entren en el vial. Además, para garantizar la esterilidad, es esencial el mantenimiento del vacío para productos tapados a presiones ambiente o reducida para garantizar una reconstitución apropiada y segura. Respecto al tapón, puede ser una formulación multicomponente o de un compuesto que se basa en un elastómero, tal como poli(isobutileno) o caucho de butilo.

Pueden usarse los agentes de contraste obtenibles mediante el procedimiento de la presente invención en una variedad de técnicas de obtención de imágenes de diagnóstico, incluyendo en particular ultrasonido y resonancia magnética. Otras posibles aplicaciones de la obtención de imágenes de diagnóstico incluyen gammagrafía, obtención de imágenes por luz y obtención de imágenes por rayos X, incluyendo obtención de imágenes por contraste de fases de rayos X.

Su uso en la obtención de imágenes de diagnóstico por ultrasonido y en la obtención de imágenes por RM, por ejemplo como agentes de contraste de susceptibilidad y como burbujas de gas hiperpolarizado, constituyen características preferidas de la invención. Puede emplearse una variedad de técnicas de

obtención de imágenes en aplicaciones de ultrasonido, por ejemplo incluyendo obtención de imágenes en modo B armónico y fundamental, obtención de imágenes por inversión de fase o pulso y obtención de imágenes por efecto Doppler armónico y fundamental; si se desea pueden usarse técnicas de obtención de imágenes tridimensionales.

Las pruebas de ultrasonido in vivo en conejos, perros y cerdos han demostrado que los agentes de contraste según la invención pueden producir un aumento en la intensidad de señales retrodispersadas del miocardio de 15-25 dB tras la inyección intravenosa de dosis de tan sólo 0,001 ml/kg de peso corporal. Pueden observarse las señales a incluso dosis inferiores usando técnicas más sensibles tales como inversión de pulso de potencia

o Doppler a color. A estas dosis bajas, se ha encontrado que la atenuación en compartimentos llenos de sangre tales como las cámaras del corazón es suficientemente baja como para permitir la visualización de regiones de interés en la vasculatura miocárdica. Las pruebas también han demostrado que tales agentes de contraste inyectados por vía intravenosa se distribuyen por todo el conjunto de sangre completa, mejorando así la ecogenicidad de todos los tejidos vascularizados, y se recirculan. También se ha encontrado que son útiles como adyuvantes de mejora de la señal Doppler generales, y pueden ser útiles adicionalmente en la tomografía computarizada por ultrasonido y en la obtención de imágenes intermitente o desencadenada fisiológicamente.

Para aplicaciones de ultrasonido tales como ecocardiografía, con el fin de permitir el paso libre a través del sistema pulmonar y lograr resonancia con las frecuencias de obtención de imágenes preferidas de aproximadamente 0,1-15 MHz, se emplean generalmente microburbujas que tienen un tamaño

promedio de 0,1-10 m, por ejemplo 0,5-7 m. Tal como se describió anteriormente, pueden producirse agentes de contraste según la invención con una distribución de tamaño muy estrecha para la dispersión de microburbujas dentro del intervalo preferido para la ecocardiografía, mejorando enormemente de ese

modo su ecogenicidad así como su seguridad in vivo, y haciendo que los agentes de contraste sean de particular ventaja en aplicaciones tales como mediciones de la tensión arterial, seguimiento del flujo sanguíneo y tomografía por ultrasonido.

En las aplicaciones de ultrasonido, los agentes de contraste de la invención, por ejemplo, pueden administrarse en dosis tales que la cantidad de fosfolípido inyectado está en el intervalo de 0,1-200 g/kg de peso corporal, normalmente 10-200 g/kg en ausencia de una etapa de lavado para la emulsión y 0,130 g/kg si se ha lavado la emulsión antes de la liofilización. Se apreciará que el uso de tales niveles bajos de fosfolípido es de ventaja sustancial en la minimización de posibles efectos secundarios tóxicos. Además, los niveles bajos de fosfolípidos presentes en dosis eficaces pueden permitir aumentos de

dosificación

para prolongar los tiempos de observación sin

efectos adversos.

Según

una realización preferida de la invención, el

procedimiento de la invención permite obtener microburbujas llenas de gas de diámetro pequeño que muestran una distribución de tamaño extremadamente estrecha. Por tanto, seleccionando adecuadamente los componentes de la mezcla y en particular la cantidad de energía de agitación aplicada durante la emulsión de la mezcla acuosa-orgánica, es posible obtener microburbujas llenas de gas con la distribución de tamaño y el diámetro medio numérico deseados.

En particular, aprovechando el procedimiento según la presente invención es posible obtener agentes de contraste que comprenden microburbujas de gas de tamaño pequeño estabilizadas por fosfolípido caracterizadas por que tienen dimensiones medias relativamente pequeñas y una distribución de tamaño controlada y estrecha particularmente útil.

Tal como conocen los expertos en la técnica, pueden caracterizarse las dimensiones de las micro/nano-partículas y su respectiva distribución de tamaño mediante varios parámetros, siendo los más frecuentemente usados el diámetro medio en número DN, la mediana del diámetro en número DN50, el diámetro medio en

volumen DV y la mediana del diámetro en volumen DV50. Mientras que los diámetros en número proporcionan una indicación de la dimensión en número media de las partículas, el diámetro en volumen proporciona información sobre cómo se distribuye el volumen total de las partículas entre la población completa. Puesto que la presencia de muy pocas partículas de gran volumen en una población de, por lo demás, partículas de pequeño volumen puede provocar que el correspondiente valor de Dv se desplace hacia valores altos, algunas veces es más conveniente usar el valor de DV50 para evaluar la distribución de una población de partículas. DV50 es un valor calculado que indica que la mitad del total del volumen interno de las partículas está presente en partículas que tienen un diámetro inferior a DV50; esto permite que se reduzcan los efectos de partículas de gran volumen formadas accidentalmente en la evaluación de la distribución de tamaño. Claramente, las partículas de un sólo tamaño muestran valores de DN, DN50, DV y DV50 idénticos. Por otro lado, una ampliación creciente de la distribución de partículas dará como resultado una diferencia mayor entre estos diversos valores con una variación correspondiente de la respectiva razón de los mismos (por ejemplo aumento de la razón de DV/DN). Por ejemplo, poblaciones de partículas que contienen fundamentalmente partículas pequeñas (por ejemplo partículas con un diámetro de

aproximadamente 2 m) con no obstante un pequeño porcentaje de partículas grandes (por ejemplo partículas con un diámetro por encima de 8 m) muestran valores de DV o DV50 superiores en comparación con el valor de DN, con razones de DV/DN o DV50/DN correspondientemente superiores.

Por tanto, se ha encontrado que el procedimiento de la presente invención es particularmente adecuado para preparar microburbujas que tienen un diámetro medio en número (DN) inferior a 1,70 m y una mediana del diámetro en volumen (DV50) tal que la razón de DV50/DN es de aproximadamente 2,30 o inferior, preferiblemente inferior a 2,10. Preferiblemente dicho valor de DN es de 1,60 m o inferior, más preferiblemente de 1,50 m o inferior, mucho más preferiblemente de 1,30 mo

inferior. Pueden obtenerse fácilmente microburbujas con valores inferiores de DN, por ejemplo de aproximadamente 1 m, o incluso inferiores, por ejemplo 0,85 m y hasta 0,80 m, con el procedimiento de la invención. La razón de DV50/DN es

preferiblemente de aproximadamente 1,80 o inferior, más preferiblemente de aproximadamente 1,60 o inferior, mucho más preferiblemente de aproximadamente 1,50 o inferior. Pueden obtenerse fácilmente microburbujas con valores inferiores de la razón de DV50/DN, por ejemplo 1,20, e incluso inferiores, por ejemplo 1,05.

Además, en las suspensiones de microburbujas con distribución estrecha de tamaño pequeñas obtenibles según el procedimiento de la invención, se ha observado que la cantidad

de microburbujas con un diámetro mayor que 3 m (expresado como el porcentaje de partículas con respecto al número total de partículas), en particular para microburbujas que tienen un DN inferior a aproximadamente 1,5 m y una razón de DV50/DN inferior a aproximadamente 2,00, normalmente es inferior a aproximadamente el 3% con respecto al número total de microburbujas en la suspensión, preferiblemente inferior a aproximadamente el 2%, más preferiblemente inferior a aproximadamente el 1%. En general, la concentración de microburbujas en la suspensión reconstituida es de al menos 1x108 partículas por mililitro, preferiblemente de al menos 1x109 partículas por mililitro.

Los valores anteriores de DV50, DN y el número de microburbujas se refieren a una medición realizada usando un aparato de Coulter counter Mark II equipado con una abertura de

30 m, con un intervalo de medición de 0,7 a 20 m.

Esta categoría específica de agentes de contraste es particularmente valiosa en la obtención de imágenes por ultrasonido, en particular para las técnicas de obtención de imágenes que se basan en la dispersión no lineal de microburbujas, tal como se explica a continuación.

Los métodos de obtención de imágenes de contraste por ultrasonido más recientes se aprovechan de las características

de dispersión no lineal de los agentes de contraste para ultrasonido. A partir de la bibliografía (por ejemplo Eatock et al., Journal of the Acoustical Society of America, vol. 77(5), págs.1692-1701, 1985), se sabe que la dispersión no lineal es significativa sólo para las microburbujas que son más pequeñas que, o cercanas a, el tamaño de resonancia. En particular, pueden emplearse convenientemente microburbujas con dimensiones de la mitad del tamaño de resonancia. “La mitad del tamaño de resonancia” es el tamaño de una microburbuja con una frecuencia de resonancia que iguala dos veces la frecuencia central de la onda de ultrasonido transmitida (que para aplicaciones particulares puede ser de hasta aproximadamente 60 MHz). Cuando se obtienen imágenes de un volumen que contiene una agente de contraste para ultrasonido a base de microburbujas, la detectabilidad de los ecos de las microburbujas frente a los ecos del tejido se ve mejorada por el nivel de dispersión no lineal por las microburbujas, y se ve disminuida por la atenuación provocada por las microburbujas ubicadas entre la sonda y la región de interés. La atenuación a lo largo de la trayectoria de transmisión reduce la energía de ultrasonido disponible para generar una respuesta de las burbujas no lineal; la atenuación a lo largo de la trayectoria de recepción elimina la energía de los ecos que puede alcanzar la sonda de ultrasonido. En el caso de una suspensión que comprende un amplio intervalo de tamaños de microburbujas, las microburbujas al tamaño de resonancia, y mayores que el tamaño de resonancia, contribuyen principalmente a la atenuación de la transmisión- recepción, sin contribuir de un modo eficaz a la señales de eco no lineales. Por tanto, la respuesta acústica global para la obtención de imágenes no lineal se beneficia enormemente del uso de un conjunto calibrado de microburbujas que tienen una distribución de tamaño estrecha y un tamaño medio cercano a la mitad del tamaño de resonancia. Preferiblemente, se emplean preparaciones de microburbujas que tienen una distribución de tamaño que corresponde a una razón de DV50/DN de aproximadamente 2,30 o inferior, más preferiblemente de 2,10 o inferior y mucho más preferiblemente de 2,00 o inferior. Preferiblemente, el

tamaño medio de las microburbujas empleadas es de aproximadamente 10% de la mitad del tamaño de resonancia, más preferiblemente de aproximadamente 5% de la mitad del tamaño de resonancia.

El agente de contraste preparado según el método de la invención puede usarse en un método de obtención de imágenes de diagnóstico que comprende administrar a un sujeto una cantidad mejoradora del contraste de dicho agente de contraste que comprende microburbujas llenas de gas con el tamaño y la distribución de tamaño tal como se especificaron anteriormente y obtener imágenes de al menos una parte de dicho sujeto. En particular, dicha obtención de imágenes de diagnóstico incluye insonar dicho sujeto por medio de un dispositivo de ultrasonido que genera una onda de ultrasonido con una frecuencia de transmisión predeterminada, a partir de la que se determina un tamaño de resonancia correspondiente de las microburbujas, y administrar un agente de contraste que comprende microburbujas llenas de gas que tienen una distribución de tamaño estrecha y un tamaño medio cercano a la mitad del tamaño de resonancia. Preferiblemente, la distribución de tamaño estrecha y un tamaño medio de las microburbujas son tal como se definieron anteriormente. Por ejemplo, puede usarse una máquina de ultrasonidos HDI 5000 de Philips (por ejemplo en modo de inversión de pulso, con sonda L7-4 e índice mecánico de 0,07), en el método de obtención de imágenes de diagnóstico. Según este método, dicho sujeto es un vertebrado y dicho agente de contraste se introduce en la vasculatura o en el interior de una cavidad corporal de dicho vertebrado. Puede suministrarse dicho agente de contraste como un kit, tal como los descritos previamente, que comprende el producto liofilizado en contacto con el gas y un medio acuoso para su reconstitución.

Los siguientes ejemplos no limitativos se proporcionan para ilustrar mejor la invención.

Ejemplos

Se han empleado los siguientes materiales en los siguientes

ejemplos. FOSFOLÍPIDOS:

DPPS

Dipalmitoilfosfatidilserina (Genzyme)

IUPAC: 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3

fosfocolina

DPPG

Sal sódica de dipalmitoilfosfatidilglicerol

(Genzyme)

IUPAC: 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-[fosfo

rac-(1-glicerol)]

DSPA

Sal sódica de ácido diestearoil-fosfatídico

(Genzyme)

IUPAC: 1,2-Diestearoil-sn-glicero-3-fosfato

DSPG

Sal sódica de diestearoilfosfatidilglicerol

(Genzyme)

IUPAC: 1,2-Diestearoil-sn-glicero-3fosfoserina)

DSPC

Diestearoilfosfatidilcolina (Genzyme)

IUPAC: 1,2-Diestearoil-sn-glicero-3

fosfocolina

DSEPC

Diestearoiletilfosfatidilcolina (Avanti Polar

Lipids)

IUPAC: 1,2-diestearoil-sn-glicero-3

etilfosfocolina

DAPC

Diaraquidoilfosfatidilcolina (Avanti Polar Lipids)

IUPAC: 1,2-Diaraquidoil-sn-glicero-3

fosfocolina

DSTAP

Cloruro de 1,2-diestearoil-3-trimetilamonio

propano (Avanti Polar Lipids)

DSPE-PEG2000

Diestearoilfosfatidiletanolamina modificada con PEG2000, sal sódica (Nektar Therapeutics)

DSPE-PEG5000

Diestearoilfosfatidiletanolamina modificada con PEG5000, sal sódica (Nektar Therapeutics)

DSPE-PEG2000

Diestearoilfosfatidiletanolamina modificada

maleimida

con PEG2000-maleimida (Avanti Polar Lipids)

5

10

15

20

25

30

SATA S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (Pierce) H-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly

RGD-4C

NH2 (AnaSpec Inc.)

DISOLVENTES: Perfluoro-n-hexano (C6F14), de Fluka perfluorometilciclohexano (CF3-ciclo-C6F11), de Fluka perfluoro-n-heptano (C7F16), de Fluka perfluoro-n-nonano (C9F20), de Aldrich perfluorodecalina, de Aldrich Ciclohexano, de Fluka Ciclooctano, de Fluka n-Decano, de Fluka n-Octano, de Fluka meta-xileno, de Fluka Diisopropilcetona, de Fluka CCl4, de Fluka

LIOPROTECTORES: Manosa, de Fluka Glucosa, de Fluka Sorbitol, de Fluka Manitol, de Fluka Maltosa, de Fluka Dextrano 6000, de Fluka Dextrano 15000, de Fluka Dextrano 40000, de Fluka Inulina, de Fluka

CARACTERIZACIÓN DE MICROGOTITAS Y MICROBURBUJAS Se ha determinado la distribución de tamaño de las microgotitas de las emulsiones: a) por medio de un contador Coulter (aparato Counter Mark II equipado con una abertura de 30 m con un intervalo de medición de 0,7 a 20 m), cuando se ha sometido la emulsión a una etapa de lavado; se diluyeron 10 l de la

emulsión en 100 ml de solución salina a temperatura

ambiente y se dejaron equilibrar durante 3 minutos antes

de la medición;

b) por medio de un aparato de medición del tamaño de partícula

por dispersión de luz láser (Mastersizer de Malvern,

dilución 200x, longitud focal de 45 mm, presentación

convencional), si no se ha sometido la emulsión a una

etapa de lavado.

Se determinaron las distribuciones de tamaño, las concentraciones de volumen y el número de las microburbujas (tras liofilización y reconstitución con una fase acuosa) usando un aparato Coulter Counter Mark II equipado con una abertura de

30 m con un intervalo de medición de 0,7 a 20 m. Se diluyeron 50 l de las muestras de microburbujas en 100 ml de solución salina a temperatura ambiente y se dejaron equilibrar durante 3 minutos antes de la medición.

Se determinaron las cantidades de fosfolípidos en las preparaciones finales (emulsión de la suspensión de microburbujas) mediante análisis por HPLC-EM, con el siguiente sistema: cromatógrafo Agilent 1100 LC, columna MN CC 125/2 mm 5 C8 de Maherey Nagel, detector Agilent MSD G1946D.

LIOFILIZACIÓN

El aparato y la metodología de liofilización fueron tal como sigue. En primer lugar, se congela la emulsión (opcionalmente tras la etapa de lavado, si está presente) a -45ºC durante 5 minutos y entonces se seca por congelación (se liofiliza) a temperatura ambiente a una presión de 0,2 mbares, usando un secador por congelación Christ-Alpha 2-4.

Ejemplo 1 (preparaciones 1a-1n)

Se añaden 10 mg de DPPS a aproximadamente 10 ml de una disolución acuosa de manitol al 10% (p/p); se calienta la suspensión a 65ºC durante 15 minutos y entonces se enfría a temperatura ambiente (22ºC). Se añade perfluoroheptano (8% v/v) a esta fase acuosa y se emulsiona en un vaso de precipitados de

aproximadamente 4 cm de diámetro usando un homogeneizador de alta velocidad (Politron T3000, diámetro de sonda de 3 cm) durante 1 minuto a la velocidad indicada en la tabla 1. La mediana del diámetro en volumen (DV50) y un diámetro medio en 5 número (DN) resultantes de las microgotitas de la emulsión se muestran en la tabla 1. Entonces se centrifuga la emulsión (8001200 rpm durante 10 minutos, centrífuga Sigma 3K10) para eliminar el exceso del fosfolípido y se recuperaron los sedimentos separados (microgotitas) y se resuspendieron en el

10 mismo volumen inicial de una disolución acuosa de manitol al 10%. Entonces se recoge la emulsión lavada en un matraz de 100 ml para liofilización, se congela y entonces se seca por congelación según el procedimiento convencional anterior.

15 Entonces se expone el liofilizado a una atmósfera que contiene un 35% de perfluoro-n-butano y un 65% de nitrógeno y entonces se dispersa en un volumen de agua que es el doble del inicial mediante agitación manual suave. Se analiza la suspensión de microburbujas obtenida tras su reconstitución con agua destilada

20 usando un contador Coulter. La concentración de microburbujas en las suspensiones obtenidas era de aproximadamente 1x109 partículas por ml. La mediana del diámetro en volumen (DV50), el diámetro medio en volumen (DV), el diámetro medio en número (DN) de las microburbujas respectivas y la cantidad de microburbujas

25 con diámetro mayor de 3 m (porcentaje con respecto al número total de microburbujas) se facilitan en la tabla 1. Cuando se ha realizado más de un ejemplo a la misma velocidad de agitación, los valores indicados en la tabla 1 se refieren al valor calculado medio de cada parámetro.

30

TABLA 1

Ej.

EMULSIÓN Microburbujas llenas de gas

Agitación (rpm)

DV50 (m) DN (m) DV50 (m) DV (m) DN (m) DV50 /DN >3 m (%)

1a 1b

8000 9000 4,58 4,66 1,77 1,94 2,92 3,19 3,33 3,45 1,51 1,53 1,93 2,08 5,44 6,61

1c 1d 1e 1f 1g 1h 1i 1j 1k 1l

10000 11000 12000 12500 14000 14500 15000 15500 16000 17000 3,04 3,05 2,84 2,79 2,20 2,00 1,88 2,19 1,83 1,40 1,74 1,80 1,69 1,68 1,52 1,38 1,39 1,48 1,32 1,12 2,16 2,17 1,86 1,75 1,39 1,19 1,22 1,24 1,27 0,91 2,53 3,33 2,17 2,05 2,45 1,39 2,20 1,46 3,08 1,03 1,33 1,32 1,24 1,22 1,08 1,01 1,01 1,02 0,99 0,87 1,62 1,65 1,50 1,44 1,29 1,19 1,21 1,22 1,28 1,05 1,88 1,55 0,93 0,65 0,23 0,06 0,06 0,11 0,10 0,01

Ejemplo 2 (preparaciones 2a-2j)

Se sigue el mismo procedimiento adoptado para el ejemplo 1, con la única diferencia de que el fosfolípido es una mezcla de DPPS (20% p/p) y DSPC (80% p/p), permaneciendo sin cambios la cantidad total de fosfolípido. Los resultados se resumen en la tabla 2.

TABLA 2

EMULSIÓN

Microburbujas llenas de gas

Ej.

Agitación (rpm)

DV50 (m) DN (m) DV50 (m) DV (m) DN (m) DV50 /DN >3 m (%)

2a

6000 8,75 3,07 7,55 9,05 2,27 3,33 21,81

2b

10000 3,54 1,90 3,00 3,71 1,47 2,04 5,05

2c

12000 3,04 1,83 2,45 3,73 1,32 1,85 2,15

2d

12500 2,85 1,76 2,21 3,24 1,27 1,74 1,57

2e

13000 2,98 1,83 2,25 3,04 1,28 1,76 1,76

2f

13500 2,91 2,05 1,88 2,46 1,20 1,57 0,87

2g

14000 2,45 1,67 1,82 2,66 1,16 1,57 0,57

2h

14500 2,18 1,55 1,58 3,04 1,09 1,44 0,38

2i

15000 1,94 1,42 1,34 1,96 1,04 1,28 0,31

2j

16000 1,81 1,38 1,35 2,30 1,03 1,31 0,14

Ejemplo 3 (preparación 3a-3p)

Se sigue el mismo procedimiento adoptado para el ejemplo 2, con la única diferencia de que se varía la razón en peso de

50 DPPS/DSPC, tal como se notifica en la tabla 3. Los resultados se resumen en la tabla 3.

TABLA 3

Ej. 3a 3b 3c 3d 3e 3f 3g 3h 3i 3j 3k 3l 3m 3n 3o 3p

Razón de DPPS/ DSPC EMULSIÓN Microburbujas llenas de gas Agitación DV50 DN DV50 DN DV50 >3 m (rpm) (m) (m) (m) (m) /DN (%) 80/20 12000 2,44 1,54 1,68 1,19 1,41 0,48 75/25 12000 2,53 1,66 1,73 1,18 1,47 0,62 60/40 11000 3,53 1,86 2,75 1,45 1,90 4,00 60/40 12000 2,62 1,60 1,78 1,21 1,47 0,72 60/40 14000 2,36 1,60 1,59 1,13 1,41 0,36 50/50 12000 2,81 1,68 2,28 1,30 1,75 2,05 40/60 11000 3,00 1,72 2,44 1,32 1,85 2,31 40/60 12000 2,88 1,75 2,07 1,27 1,63 1,45 40/60 13000 2,61 1,69 1,76 1,16 1,52 0,57 40/60 14000 2,06 1,43 1,41 1,07 1,31 0,23 40/60 14500 2,39 1,67 1,64 1,15 1,43 0,49 30/70 11000 3,12 1,75 2,64 1,37 1,93 2,76 30/70 12000 3,08 1,81 2,38 1,34 1,78 2,45 25/75 11000 3,15 1,85 2,46 1,31 1,88 2,15 10/90 11000 3,72 2,26 3,14 1,47 2,13 4,60 5/95 11000 4,53 2,23 4,08 1,54 2,65 6,35

5

Ejemplo 4

Se sigue el mismo procedimiento adoptado para el ejemplo 2, con la única diferencia de que se prepararon mezclas de DSPA y DPPS con razones en peso diferentes. Los resultados se resumen

10 en la tabla 4.

TABLA 4

Razón de DSPA/ DPPS

EMULSIÓN Microburbujas llenas de gas

Agitación

DV50 DN DV50 DN DV50 >3 m

Ej.

(rpm) (m) (m) (m) (m) /DN (%)

4a

25/75 12000 2,61 1,63 1,94 1,24 1,56 1,07

4b

50/50 11000 2,81 1,86 2,35 1,39 1,69 2,67

4c

50/50 12000 2,35 1,57 1,84 1,19 1,55 0,74

4d

75/25 12000 2,50 1,65 2,11 1,27 1,66 1,45

Ejemplo 5 (preparaciones 5a-5i)

Se sigue el mismo procedimiento adoptado para el ejemplo 1, con la única diferencia de que se ha empleado una mezcla de

5 fosfolípidos 1/1 (p/p) de DPPG y DSPC (concentración total de 1,0 mg/ml) en mezcla con un 10% p/p (con respecto al peso total de fosfolípido) de ácido palmítico. Los resultados se resumen en la tabla 5.

10 TABLA 5

Microburbujas llenas

EMULSIÓN

de gas

Ex

Agitación DV50 (rpm) (m)

DN (m) DV50 DN DV50 >3 m (m) (m) /DN (%)

5a

6000 10,02 2,64 6,87 2,07 3,32 18,00

5b

8000 5,31 2,49 3,73 1,62 2,30 7,97

5c

9000 5,04 2,69 3,20 1,55 2,06 6,22

5d

10000 3,82 2,02 2,85 1,38 2,07 2,65

5e

10500 3,36 1,96 2,51 1,32 1,89 2,44

5f

11000 3,22 1,87 2,31 1,28 1,81 1,41

5g

12000 2,69 1,61 1,74 1,14 1,53 0,52

5h

13000 2,28 1,56 1,56 1,07 1,46 0,23

5i

14000 2,00 1,44 1,30 1,00 1,30 0,26

Ejemplo 6

Se sigue el mismo procedimiento adoptado para el ejemplo 1, con la única diferencia de que se usa DSEPC como fosfolípido y 15 se usa perfluorohexano como disolvente orgánico. La velocidad de rotación aplicada es de 11000 rpm. Las dimensiones, la distribución de tamaño y el porcentaje de microburbujas con

diámetro mayor de 3 m eran tal como sigue.

DV50 DN DV50/DN >3 m (m) (m) (%) 1,65 1,11 1,49 0,30

Ejemplo 7 (preparaciones 7a-7l)

Se calienta agua destilada (10 ml) que contiene DPPS (10 mg) como fosfolípido a 70ºC durante 15 minutos y entonces se 5 enfría a temperatura ambiente. Se emulsionaron 0,8 ml de un disolvente orgánico tal como se especifica en la siguiente tabla 6 en esta fase acuosa usando un homogeneizador de alta velocidad (Politron T3000) a 10000 rpm durante 1 minuto. Se añade la emulsión a 10 ml de una disolución de dextrano 15000 al 15%, se 10 congela y se liofiliza (0,2 mbares, 24 horas). Tras la liofilización, se introduce aire en el liofilizador. Se analiza la suspensión de microburbujas obtenida tras su reconstitución con agua destilada usando un contador Coulter. La tabla 6 resume los resultados en cuanto a dimensiones y distribución de tamaño

15 de las microburbujas.

TABLA 6

Ej.

Disolvente DV50 (m) DN (m) DV50/DN

7a

C6F14 2,77 1,44 1,92

7b

CF3-ciclo-C6F11 2,24 1,30 1,72

7c

C7F16 2,48 1,40 1,77

7d

C9F20 2,46 1,36 1,81

7e

perfluorodecalina 3,76 1,52 2,47

7f

Ciclohexano 2,61 1,41 1,85

7g

Ciclooctano 2,43 1,35 1,80

7h

Decano 2,01 1,12 1,79

7i

Octano 2,87 0,96 2,99

7j

meta-xileno 2,45 1,21 2,02

7k

Diisopropil cetona 1,83 1,05 1,74

7l

CCl4 1,90 1,27 1,50

Ejemplo 8

Se repite el ejemplo 7 anterior con la misma metodología, usando perfluoro-hexano como disolvente orgánico y diferentes agentes de lioprotección a diferentes concentraciones tal como se explica resumidamente en la tabla 7. La tabla 7 resume los resultados en cuanto a dimensiones y distribución de tamaño de las microburbujas.

TABLA 7

Ej.

Lioprotector y concentración (p/p) DV50 (m) DN (m) DV50 /DN

8a

Manosa al 5% 4,35 1,90 2,29

8b

Glucosa al 5% 2,59 0,96 2,70

8c

Sorbitol al 5% 3,84 1,40 2,74

8d

Manitol al 10% 2,22 1,22 1,82

8e

Manitol al 5% 2,24 1,21 1,85

8f

Manitol al 4% 2,54 1,45 1,75

8g

Maltosa al 5% 3,42 0,99 3,45

8h

Dextrano 6000 al 7,5% 3,30 1,48 2,23

8j

Dextrano 15000 al 5% 2,55 1,31 1,95

8k

Dextrano 15000 al 7,5% 2,77 1,44 1,92

8i

Dextrano 40000 al 7,5% 2,54 1,32 2,29

81

Inulina al 5% 3,58 1,43 2,70

10 EJEMPLO 9 (preparaciones 9a-9e) Se repite el ejemplo 1 emulsionando la mezcla a una velocidad de 10000 rpm. Además, se repite el mismo ejemplo añadiendo diferentes cantidades de Pluronic F68 (un poloxámero que corresponde a Poloxámero 188) en la fase acuosa antes de la

15 emulsificación, tal como se explica resumidamente en la tabla 8. La tabla 8 muestra los resultados del experimento comparativo, en cuanto a distribución de tamaño y rendimiento de conversión de las microburbujas. Se facilita el rendimiento de conversión como el número en porcentaje de las microburbujas llenas de gas

20 formadas tras la reconstitución de la matriz liofilizada con respecto al número de microgotitas medidas en la emulsión.

TABLA 8

Ejemplo

Pluronic* (mg/ml) DV50 DN DV50/DN Rendimiento de conversión (%)

9a 9b 9c 9d 9e

0 0,25 0,5 1,0 2,0 2,42 4,64 13,85 12,59 15,80 1,38 1,75 1,97 2,36 1,38 10,04 1,49 8,45 1,23 12,85 28,0 18,8 7,3 3,2 0,5

*Concentración referida al

volumen de la fase acuosa

Los resultados anteriores demuestran que con una concentración de poloxámero que corresponde a la mitad de la

5 concentración del fosfolípido (es decir, aproximadamente el 33% de la cantidad total de tensioactivos en la mezcla), se ven afectados negativamente tanto los rendimientos de conversión como la distribución de tamaño de las microburbujas.

10 EJEMPLO 10 (preparaciones 10a-10d) Se repite el ejemplo 9, pero en lugar de añadir Pluronic F68 a la fase acuosa, se añadieron diferentes cantidades de colesterol (de Fluka) a la fase orgánica, antes de la emulsificación, tal como se explica resumidamente en la tabla 9.

15 La tabla 9 muestra los resultados del experimento comparativo, en cuanto a distribución de tamaño y rendimiento de conversión (de las microgotitas de la emulsión) de las microburbujas.

TABLA 9

Ejemplo

Colesterol* (mg/ml) DV50 DN DV50/DN Rendimiento de conversión (%)

10a 10b 10c 10d

0 0,10 0,25 0,50 2,42 1,38 3,79 1,31 1,35 1,05 14,02 1,70 1,75 2,89 1,28 8,25 28,0 17,8 5,7 0,8

*Concentración referida al volumen

de la fase acuosa

Los resultados anteriores demuestran que con una concentración del 0,050% (p/p) de colesterol en la fase acuosa, se ven afectados muy negativamente tanto el rendimiento de conversión como la distribución de tamaño de las microburbujas. Una concentración del 0,025%, aunque puede proporcionar

distribución de tamaño y

dimensiones aceptables de las

microburbujas,

todavía da como resultado un rendimiento de

conversión bastante bajo.

Ejemplo 11

Se calienta agua destilada (30 ml) que contiene 60 mg de DPPS y 3 g de manitol hasta 70ºC durante 15 minutos, entonces se enfría hasta temperatura ambiente.

Se emulsiona perfluoroheptano en esta fase acuosa usando un homogeneizador de alta velocidad (Politron®, 12500 rpm, 1 minuto).

Se lava una vez la emulsión resultante, que muestra una mediana del diámetro en volumen (DV50) de 2,3 m y un diámetro medio en número (DN) de 2,0 m, mediante centrifugación, se resuspende en 30 ml de una disolución al 10% de manitol en agua

destilada y entonces se divide en tres partes (3x10 ml).

Se usa la primera parte (A) como tal para la posterior etapa de liofilización. Se recoge la segunda parte (B) en una jeringa y se inyecta a mano a través de un filtro Nuclepore® de

5 m (47 mm -Policarbonato). Se filtra la tercera parte (C) a través de un filtro Nuclepore® de 3 m (47 mm -Policarbonato) con el mismo método.

Se congelaron las emulsiones en un balón de 100 ml (-45ºC durante 5 minutos), entonces se secaron por congelación (0,2 mbares, durante 72 horas).

Se restaura la presión atmosférica introduciendo una mezcla 35/65 de C4F10 y aire. Se dispersaron los respectivos liofilizados en agua destilada (10 ml). Se analizan las suspensiones de microburbujas así obtenidas usando un contador Coulter y los resultados se notifican en la siguiente tabla

DV50 DN DV50/DN

Parte A 1,71 1,12 1,53 Parte B 1,65 1,12 1,47 Parte C 1,57 1,09 1,44

Tal como se demuestra por los resultados anteriores, la etapa de filtración adicional permite que se reduzca adicionalmente la dimensión de las microburbujas y que se reduzca la distribución de tamaño respectiva.

5

Ejemplo 12

Se ha repetido el ejemplo 1, usando 10 mg de una mezcla 7/3 (p/p) de DSPC/DSTAP, a una velocidad de agitación de 11000 rpm. La caracterización de las gotitas y de las microburbujas la 10 emulsión fue tal como sigue:

Gotitas de la emulsión

Microburbujas llenas de gas

DV50

DN DV50 DN > 3 m

2,36

1,48 2,10 1,12 0,63

Ejemplo 13

Se repite la preparación del ejemplo 1, emulsionando la

15 mezcla a una velocidad de 10000 rpm (ejemplo 13a). Se repite la misma preparación, adicionalmente añadiendo aproximadamente 0,9 mg de DSPE-PEG2000 (aproximadamente el 8,3% de la cantidad total de fosfolípidos dispersados) a la suspensión acuosa inicial (ejemplo 13b).

20 No se realiza ningún lavado mediante centrifugación en ninguna de las dos preparaciones. La tabla 10 muestra la caracterización de las dos preparaciones, tanto de la emulsión como de la suspensión de microburbujas.

25 Tabla 10

Emulsión

Microburbujas

Ejemplo

DV50 (m) DN (m) DV50 (m) DN (m) DV50/DN Rendimiento de conversión (%)

13a

3,19 1,66 2,66 1,33 2,00 29,5

13b

4,32 1,43 5,81 1,18 4,92 18,8

Los resultados anteriores demuestran que con una concentración de DSPE-PEG inferior al 10% en peso (con respecto a la cantidad total de fosfolípidos), se ven afectados negativamente tanto los rendimientos de conversión como la distribución de tamaño de las microburbujas.

Ejemplo 14

Se repite la preparación del ejemplo 11, sustituyendo DPPS por la misma cantidad de una mezcla 1:1 (p/p) de DAPC/DPPS.

Se divide la emulsión resultante en tres partes de 10 ml, sin lavarla mediante centrifugación.

Se preparan por separado suspensiones acuosas de DSPEPEG2000 y de DSPE-PEG5000 dispersando 25 mg de la DSPE-PEG respectiva en 5 ml de una disolución de manitol al 10% con sonicación (sonda de sonicación de 3 mm, sonicador Branson 250, salida del 30%, durante 5 min.).

Entonces se añade una alícuota de 2,5 ml de una disolución de manitol al 10% a una primera parte de la emulsión (ejemplo 14a).

Se añade una alícuota de 2,5 ml de la suspensión de DSPEPEG2000 preparada a una segunda parte de la emulsión (ejemplo 14b).

Se añade una alícuota de 2,5 ml de la suspensión de DSPEPEG5000 preparada a una tercera parte de la emulsión (ejemplo 14c).

Se calientan las tres mezclas a 60ºC con agitación durante una hora. Tras enfriar a temperatura ambiente, se determina el tamaño de las microgotitas por medio de un aparato Mastersizer de Malvern. Los resultados se notifican en la tabla 11.

Entonces se secan por congelación las emulsiones según el procedimiento del ejemplo 11. Se restaura la presión atmosférica introduciendo una mezcla 35/65 de C4F10 y aire. Se dispersaron los liofilizados respectivos en agua destilada (10 ml). Se

analizaron las suspensiones de microburbujas así obtenidas usando un contador Coulter (véase la tabla 11). Entonces se lavan dos veces las suspensiones de microburbujas con agua destilada mediante centrifugación (180

5 g/10 min.) y se liofilizan de nuevo según el procedimiento anterior. Se determina la cantidad de DSPE-PEG en la composición secada por medio de HPLC-EM. Los resultados se facilitan en la siguiente tabla 11.

10 Tabla 11

Emulsión

Microburbujas

Ejemplo

DV50 (m) DN (m) DV50 (m) DN (m) DSPE-PEG (% p/p)

14a

2,6 2,3 1,9 1,1 0,0

14b

2,5 2,3 3,4 1,3 35,5

14c

2,5 2,3 2,2 1,2 37,9

Tal como puede inferirse a partir de los resultados anteriores, la posterior adición de una suspensión de DSPE-PEG a la emulsión formada permite la introducción de cantidades

15 relativamente altas de DSPE-PEG en la composición de la capa estabilizante (en este caso más del 30% del peso total de los fosfolípidos que forman la envoltura estabilizante), sin afectar negativamente a las propiedades finales de las microburbujas. Pueden obtenerse resultados similares con otros

20 fosfolípidos modificados con PEG, en particular DSPE-PEG2000biotina o DSPE-PEG2000-maleimida, y con fosfolípidos que llevan péptido, en particular DSPE-PEG2000-maleimida-SATA-RGD4C. Este último fosfolípido que lleva péptido puede prepararse según técnicas conocidas, haciendo reaccionar el péptido RGD-4C con

25 SATA, desprotegiendo el grupo tiol de SATA y haciendo reaccionar el RGD4C-SATA desprotegido con DSPE-PEG2000-maleimida. Puede usarse convenientemente el método de preparación descrito en “Development of EGF-conjugated liposomes for targeted delivery of boronated DNA-binding agents”, por Bohl Kullberg et al.,

30 Bioconjugate chemistry 2002, 13, 737-743, (que describe la

inserción de una proteína EGF en una molécula de DSPE-PEGmaleimida).

Ejemplo 15

Se añaden 10 mg de una mezcla de DPPS/DSPC 1:1 (p/p) a aproximadamente 10 ml de una disolución acuosa de manitol al 10% (p/p).

Se calienta la mezcla a 70ºC durante 15 minutos y entonces se enfría a temperatura ambiente (22ºC). Se añade ciclooctano a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. a través de una entrada de una micromezcladora (micromezcladora interdigital con hendidura convencional, que aloja SS 316Ti con incrustación de níquel

sobre cobre, 40 m x 300 m, Institut für Microtechnik Mainz GmbH) a la fase acuosa que circula a 20 ml/min. a temperatura ambiente, para una cantidad total del 7,4% (v/v) de disolvente orgánico. Tras completar la adición del disolvente orgánico, se recircula la emulsión en la micromezcladora durante otros 20 minutos.

Entonces se divide la emulsión en cinco alícuotas de 2 ml cada una y se introducen en cinco viales DIN8R. Se sellan cuatro viales y se calientan durante 30 minutos a temperaturas de 60, 80, 100 y 120ºC, respectivamente, tal como se indica en la tabla 12, mientras que el quinto no se calienta.

Entonces se enfrían las emulsiones hasta temperatura ambiente y se somete el contenido de los cinco viales a liofilización según el siguiente procedimiento. Se recoge 1 ml de cada emulsión en un vial DIN8R y se congela a -5ºC; se disminuye la temperatura hasta -45ºC durante 1 hora y entonces se seca por congelación la emulsión a -25ºC y 0,2 mbares durante 12 horas (liofilizador Liobeta35 de Telstar), con una etapa de secado final a 30ºC y 0,2 mbares durante 5 horas.

Entonces se expone el producto liofilizado a una atmósfera que contiene un 35% de perfluoro-n-butano y un 65% de nitrógeno y entonces se dispersa en un volumen de agua que es el doble del inicial mediante agitación manual suave. La tabla 12 muestra el

60 resultado de la caracterización de la suspensión final de las microburbujas.

Tabla 12

Calentamiento

DV50 DN DV50/DN Número de burbujas por ml de emulsión

sin calentamiento

10,45 1,63 6,41 5,34 x 107

60ºC

4,85 1,32 3,67 7,83 x 107

80ºC

5,34 1,29 4,14 8,51 x 107

100ºC

6,96 1,66 4,19 4,92 x 108

120ºC

3,05 1,50 2,03 8,69 x 108

5

A partir de los resultados anteriores, parece que someter la emulsión formada a un tratamiento térmico permite que se estreche la distribución de tamaño de la suspensión de microburbujas final, mientras que se aumenta también el número

10 total de microburbujas. En particular, al aumentar la temperatura de calentamiento por encima de 100ºC, es posible obtener una distribución de tamaño relativamente estrecha de las microburbujas también en ausencia de cualquier etapa de lavado de la emulsión, así como un aumento del número total de

15 microburbujas en la suspensión.

Ejemplo 16

Se calienta agua destilada (10 ml) que contiene 10 mg de DPPS y 1 g de manitol hasta 70ºC durante 15 minutos, entonces se

20 enfría hasta temperatura ambiente. Se añade DPPE-MPB (sal de Na de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(pmaleimidofenil)-butiramida] -Avanti Polar Lipids) (4,8% en peso -0,5 mg). Se dispersa este fosfolípido en la fase acuosa usando un baño de ultrasonidos (Branson 1210 -3 minutos).

25 Se emulsiona perfluoroheptano (0,8 ml de Fluka) en esta fase acuosa (enfriada con un baño de hielo) usando un homogeneizador de alta velocidad (Politron® T3000, 15000 rpm, 1 minuto).

La emulsión resultante mostraba una mediana del diámetro en volumen (DV50) de 2,3 m y un diámetro medio en número (DN) de 2,1 m tal como se determinó con un aparato Mastersizer de Malvern.

Se lava dos veces la emulsión mediante centrifugación, entonces se resuspende en 9,5 ml de una disolución al 10% de manitol en agua destilada. Se congela la emulsión lavada (-45ºC, 5 minutos), entonces se seca por congelación (a 0,2 mBares, durante 24 horas).

Se restaura la presión atmosférica introduciendo una mezcla 35/65 de C4F10 y aire. Se dispersa el liofilizado en agua destilada (20 ml), se lavaron una vez las microburbujas mediante centrifugación y entonces se redispersaron en 4 ml de una solución salina tamponada con fosfato que contenía EDTA (composición molar: fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM, EDTA 10 mM), que contenía 3,4 mg de avidina tioacetilada, se

añadieron 400 l de una disolución de hidroxilamina (13,92 mg en PBS 50 mM, pH: 7,5) para desproteger el grupo tiol de la avidina

tioacetilada.

Se agita la suspensión

mediante inversión en un disco

rotatorio

(Fisher Scientific) durante 2 horas. Entonces se

añadieron 150 l de NaOH 1 N.

Se

lavaron las microburbujas marcadas con avidina así

obtenidas dos veces con PBS mediante centrifugación (10000 rpm, 10 minutos, centrífuga Sigma 3K10). Se analiza la suspensión de microburbujas obtenida usando un contador Coulter que muestra un

diámetro DV50 de 1,6 m y un DNde 1,2 m.

Se sometió a prueba la eficacia de la composición de microburbujas dirigidas tanto in vitro como in vivo. Experimento in vitro:

Para someter a prueba la unión eficaz de avidina acetilada a la superficie de las microburbujas, se prepararon dos conjuntos de pocillos que contenían fibrina. En el primer conjunto, está presente sólo una superficie de fibrina. En el segundo conjunto, se trata previamente la fibrina con un péptido antifibrina marcado con biotina (DX-278, dado a conocer en el

documento WO 02/055544). Se añadieron las suspensiones de microburbujas preparadas tal como anteriormente a los pocillos (5 x 108 microburbujas/pocillo). Tras 2 horas de incubación (al revés) y varios lavados, se observaron las superficies de fibrina en los dos conjuntos de pocillos por medio de un microscopio óptico. Mientras que esencialmente no pudo observarse ninguna microburbuja en los pocillos sin el péptido antifibrina biotinilado, se observó una cobertura masiva de microburbujas en los pocillos que contenían péptido antifibrina biotinilado.

Experimento in vivo: Se forma un trombo en la aorta abdominal de dos conejos mediante el método de FeCl3 (Lockyer et al, 1999, Journal of Cardiovascular Pharmacology, vol. 33, págs. 718-725).

Se realiza la ecografía con una máquina de ultrasonidos HDI 5000 (Philips), modo de inversión de pulso, sonda L7-4, IM: 0,07.

Entonces se inyecta por vía intravenosa un anticuerpo

biotinilado

(CD41 específico para el receptor GPIIB/IIIA de

plaquetas activadas) a los dos conejos.

Tras 30 minutos,

se inyecta por vía intravenosa la

suspensión de microburbujas que comprende microburbujas marcadas con avidina (1x109 microburbujas/ml) en el primer conejo. Quince minutos tras la inyección, se observa una fuerte opacificación del trombo para la suspensión. Esta opacificación todavía es visible tras al menos una hora desde la inyección.

Se inyecta por vía intravenosa la misma cantidad de la suspensión de microburbujas sin microburbujas marcadas con avidina en el segundo conejo. Se observa sólo una ligera opacificación del trombo.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para preparar una matriz liofilizada que, tras entrar en contacto con un líquido portador acuoso y un gas, es reconstituible en una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso incluyendo agua, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible con agua; iii) una composición emulsionante de materiales anfífilos que comprende más del 50% en peso de un fosfolípido y iv) un agente lioprotector;

   b) liofilizar dicha mezcla emulsionada, para obtener una matriz liofilizada que comprende dicho fosfolípido.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que la etapa a) de preparar la emulsión comprende las siguientes etapas: a1) preparar una suspensión dispersando la composición

   emulsionante y el agente lioprotector en el medio acuoso; a2) mezclar la suspensión obtenida con el disolvente orgánico; a3) someter la mezcla a agitación controlada, para obtener una emulsión.

3. 3.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua inferior a 10 g/l.

4. 4.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de 1,0 g/l o inferior.

5. 5.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de 0,2 g/l o inferior.

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de aproximadamente 0,01 g/l o inferior.

7. 7.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de 0,001 g/l o inferior.

8. 8.

   Método según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre alcanos lineales o ramificados, alquenos, ciclo-alcanos, hidrocarburos aromáticos, alquil éteres, cetonas, hidrocarburos halogenados, hidrocarburos perfluorados y mezclas de los mismos.

9. 9.

   Método según la reivindicación 8, en el que el disolvente se selecciona entre pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, 1-penteno, 2-penteno, 1-octeno, ciclopentano, ciclohexano, ciclooctano, 1-metilciclohexano, benceno, tolueno, etilbenceno, 1,2dimetilbenceno, 1,3-dimetilbenceno, di-butil éter y diisopropilcetona, cloroformo, tetracloruro de carbono, 2cloro-1-(difluorometoxi)-1,1,2-trifluoroetano (enflurano), 2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoroetano (isoflurano), tetracloro-1,1-difluoroetano, perfluoropentano, perfluorohexano, perfluoroheptano, perfluorononano, perfluorobenceno, perfluorodecalina, metilperfluorobutil éter, metilperfluoroisobutil éter, etilperfluorobutil éter, etilperfluoroisobutil éter y mezclas de los mismos.

10. 10.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de disolvente orgánico es desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 50% en volumen con respecto a la cantidad de agua.

11. 11.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de lioprotección se selecciona entre hidratos de carbono, alcoholes de azúcar, poliglicoles y mezclas de los mismos.

12. 12.

    Método según la reivindicación 11, en el que el agente de lioprotección se selecciona entre glucosa, galactosa, fructosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, lactosa, amilosa, amilopectina, ciclodextrinas, dextrano, inulina, almidón

    soluble, hidroxietil-almidón (HES), eritritol, manitol, sorbitol, polietilenglicoles y mezclas de los mismos.

13. 13.

    Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que la cantidad de agente de lioprotección es desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 25% en peso con respecto al peso del agua.

14. 14.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el fosfolípido se selecciona entre dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), 1,2-diestearoilsn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoilfosfatidilcolina (DPDPC), 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina (PMPC), 1-palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina (PSPC), 1-estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (SPPC), 1-palmitoil-2oleilfosfatidilcolina (POPC), 1-oleil-2-palmitoilfosfatidilcolina (OPPC), dilauroil-fosfatidilglicerol (DLPG) y sus sales de metales alcalinos, diaraquidoilfosfatidil-glicerol (DAPG) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metales alcalinos, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metales alcalinos, dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metales alcalinos, ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido dipalmitoil-fosfatídico (DPPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido diestearoil-fosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidil-etanolamina (DSPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE),

    dimiristoil-fosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DMPE-PEG), dipalmitoilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DPPE-PEG), diestearoil-fosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DSPE-PEG), dioleilfosfatidil-etanolamina modificada con polietilenglicol (DOPE-PEG), diaraquidoilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DAPE-PEG), dilinoleilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DLPE-PEG), dimiristoil-fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil-fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoilesfingomielina (DPSP) y diestearoilesfingomielina (DSSP) y mezclas de los mismos.

15. 15.

    Método según la reivindicación 1, en el que la composición emulsionante de materiales anfífilos comprende un fosfolípido y un material anfífilo que lleva una carga neta global.

16. 16.

    Método según la reivindicación 1, 2 ó 14, en el que la cantidad de fosfolípido es desde aproximadamente el 0,005% hasta aproximadamente el 1,0% en peso con respecto al peso total de la mezcla emulsionada.

17. 17.

    Método según la reivindicación 16, en el que la cantidad de fosfolípido es desde el 0,01% hasta el 1,0% en peso con respecto al peso total de la mezcla emulsionada.

18. 18.

    Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el fosfolípido incluye un ligando de direccionamiento o un grupo reactivo protector que puede reaccionar con un ligando de direccionamiento.

19. 19.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 15 ó 16, en el que la emulsión contiene además un material anfífilo seleccionado de lisolípidos; ácidos grasos y sus sales respectivas con metales alcalinos o álcali; lípidos que llevan polímeros; lípidos que llevan mono, di, oligo o polisacáridos sulfonatados; lípidos con ácidos grasos con

    uniones éster o éter; lípidos polimerizados; fosfato de diacetilo; fosfato de dicetilo; estearilamina; ceramidas; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno; alcoholes grasos de polioxietileno; éteres de alcoholes grasos de polioxietileno; ésteres de ácidos grasos de sorbitano polioxietilado; ricinoleato de polietilenglicol y glicerol; esteroles de soja etoxilados; aceite de ricino etoxilado; copolímeros de bloque de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO); ésteres de ácidos de azúcares de esteroles; ésteres de azúcares con ácidos alifáticos; ésteres de glicerol con ácidos grasos dicarboxílicos (C12-C24) y sus sales respectivas con sales de metales alcalinos o álcali; saponinas; alcoholes de cadena larga (C12-C24); 6-(5

    colesten-3-iloxi)-1-tio--D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido; 6-(5-colesten-3-iloxi)hexil-6amino-6-desoxi-1-tio--D-galactopiranósido; 6-(5-colesten3-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxil-1-tio--D-manopiranósido;

    á c i d o 1 2-(((7’-dietilaminocumarin-3il)carbonil)metilamino)octadecanoico; ácido N-[12-(((7’dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanoil]2-aminopalmítico; N-succinildioleilfosfatidiletanolamina; 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina; palmitoilhomocisteína; sales de alquilamonio que comprenden al menos una cadena de alquilo (C10-C20); sales de amonio cuaternario o terciario que comprenden al menos una cadena de acilo (C10-C20) unida al átomo de N a través de un puente de alquileno (C3-C6): y mezclas o combinaciones de los mismos.

20. 20.

    Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la emulsión acuosa-orgánica de la etapa a) se somete a una etapa de lavado antes de la etapa de liofilización b).

21. 21.

    Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la emulsión acuosa-orgánica de la etapa a) se somete a una etapa de microfiltración antes de la etapa de liofilización b).

22. 22.

    Método según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además añadir una suspensión acuosa que comprende un compuesto anfífilo adicional a la emulsión acuosa-orgánica obtenida según la etapa a), antes de la etapa de liofilización b), obteniendo así una segunda emulsión acuosa-orgánica que comprende dicho compuesto anfífilo adicional.

23. 23.

    Método según la reivindicación 22, que comprende además calentar la mezcla de dicha suspensión acuosa y de dicha emulsión acuosa-orgánica.

24. 24.

    Método según la reivindicación 23, en el que dicha mezcla se calienta a una temperatura de desde aproximadamente 40ºC hasta aproximadamente 80ºC.

25. 25.

    Método según la reivindicación 22, en el que dicho compuesto anfífilo es un fosfolípido modificado con PEG, un fosfolípido modificado con PEG que lleva un resto reactivo

    o un fosfolípido modificado con PEG que lleva un ligando de direccionamiento.

26. 26.

    Método según la reivindicación 1, 2 ó 22, que comprende además, antes de la etapa de liofilización b), someter la emulsión acuosa-orgánica a un calentamiento controlado.

27. 27.

    Método según la reivindicación 26, en el que dicho calentamiento controlado se efectúa a una temperatura de desde aproximadamente 60ºC hasta 125ºC.

28. 28.

    Método según la reivindicación 27, en el que dicho calentamiento controlado se efectúa a una temperatura de desde aproximadamente 80ºC hasta 120ºC.

29. 29.

    Método según la reivindicación 27, en el que dicha emulsión está contenida en un vial sellado.

30. 30.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además las etapas de: c) poner en contacto dicha matriz liofilizada con un gas

    biocompatible; y

    d) reconstituir dicha matriz liofilizada disolviéndola en un líquido portador acuoso fisiológicamente aceptable, para obtener una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por dicho fosfolípido.

31. 31.

    Método según la reivindicación 30, en el que el gas biocompatible se selecciona entre aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; gases inertes; un hidrocarburo de bajo peso molecular, incluyendo un alcano (C1-C7), un cicloalcano (C4-C7), un alqueno (C2-C7) y un alquino (C2-C7); un éter; una cetona; un éster; un éter, cetona o hidrocarburo (C1-C7) halogenado; o una mezcla de cualquiera de los anteriores.

32. 32.

    Método según la reivindicación 31, en el que el gas de hidrocarburo halogenado se selecciona entre bromoclorodifluoro-metano, clorodifluorometano, diclorodifluoro-metano, bromotrifluorometano, clorotrifluorometano, cloropentafluoroetano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismos.

33. 33.

    Método según la reivindicación 31, en el que el gas de hidrocarburo halogenado es un hidrocarburo perfluorado.

34. 34.

    Método según la reivindicación 33, en el que el gas de hidrocarburo perfluorado es perfluorometano, perfluoroetano, un perfluoropropano, un perfluorobutano, un perfluoropentano, un perfluorohexano, un perfluoroheptano; perfluoropropeno, un perfluorobuteno, perfluorobutadieno, perfluorobut-2-ino, perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, un perfluorodimetilciclobutano, un perfluorotrimetilciclobutano, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, un perfluorodimetilciclopentano, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano, perfluorocicloheptano o mezclas de los mismos.

35. 35.

    Método según una cualquiera de las reivindicaciones

    anteriores 30 a 34, en el que dichas microburbujas tienen un diámetro medio en número (DN) inferior a 1,70 m y una mediana del diámetro en volumen (DV50) tal que la razón de DV50/DN es de aproximadamente 2,00 o inferior.

36. 36.

    Método según la reivindicación 35, en el que dichas microburbujas tienen un valor de DN de 1,60 m o inferior,

    preferiblemente de 1,50 m o inferior, más preferiblemente de 1,30 m o inferior.

37. 37.

    Método según la reivindicación 35, en el que dichas microburbujas tienen una razón de DV50/DN de aproximadamente 1,80 o inferior, preferiblemente de aproximadamente 1,60 o inferior, más preferiblemente de aproximadamente 1,50 o inferior.