KR101893423B1 - 표적화 기체-충전 미세소포 - Google Patents

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Abstract

셀렉틴, 특히 P-셀렉틴에 대한 결합 친화력을 나타내는 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드와 회합된 기체-충전 미세소포. 기체-충전 미세소포는 초음파 이미지화에 사용될 수 있다.

Description

표적화 기체-충전 미세소포{TARGETED GAS-FILLED MICROVESICLES}
본 발명은 일반적인 용어로 표적화 기체-충전 미세소포, 그리고 특히 진단 방법에서 사용하기 위한 상기 미세소포를 함유하는 수성 현탁액에 관한 것이다.
근년에 조영제의 급속한 개발은 사람 또는 동물 몸체의 기관 및 조직의 콘트라스트-향상 이미지화에 유용한 수많은 다른 조제물들을 발생시켰다.
더 최근에, 적합한 표적 특이적 성분들이 기관 또는 조직의 선택적인 콘트라스트-향상 이미지화를 허용하기 위한 조영제의 조제물에 사용되는, 소위 "분자 이미지화"에 관심이 집중되었다. 게다가, 선택적으로 분자 이미지화와 조합하여 조영제 조제물의 치료적 사용이 또한 기술되었다.
초음파 콘트라스트 이미지화에 특히 유용한, 조영제의 부류는 수성 매질에 분산된 나노- 및/또는 미크로-미터 크기의 기체 기포의 현탁액을 포함한다. 예를 들어, 유화제, 오일, 증점제 또는 당을 사용함으로써, 또는 다양한 시스템에서 기체 또는 그것의 전구체를 포집화 또는 캡슐화함으로써, 기체 기포가 안정화되는 이들 조제물에 특별한 흥미가 있다. 이들 안정화된 기체 기포는 그것의 제조를 위해 사용된 안정화 재료로부터 전형적으로 의존하는, 다양한 용어로 본 분야에서 일반적으로 언급되며; 이들 용어는, 예를 들어 "미소구체", "미세기포", "미세캡슐" 또는 "미세풍선"을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기체-충전 미세소포", 또는 단순히 "미세소포"는 상기 용어 중 어떤 것도 포함한다.
기체-충전 미세소포의 조제물은 진단 효과를 개선하기 위해(예를 들어, 분자 이미지화를 통함), 및/또는 약물 전달 및/또는 혈전용해와 같이 치료 목적을 위해 적합하게 변형될 수 있다. 예를 들어, 미세소포는 치료제 및/또는 환자의 신체 내의 결정된 표적과 연결가능한 특정 성분("표적 리간드"로서 알려짐)과 회합될 수 있다(예를 들어, 그것들의 경계 엔벨로프(envelope)에 포함에 의함). 표적 리간드의 예는, 예를 들어 신생혈관생성, 염증 또는 혈전 형성과 같은 병원성 과정 동안 기관 또는 조직에 발현된 특정 수용체에 결합가능한, 예를 들어 펩티드, 단백질, 항체, 압타머 또는 탄수화물을 포함한다.
셀렉틴(특히, P-, L- 및 E-셀렉틴)은 특히 염증 과정 동안 혈관 내피에 의해 발현되는 세포 부착 분자이다. 셀렉틴 리간드 및 특히, P-셀렉틴 글리코단백질 리간드-1(PSGL-1: GenBank Acc. N° Q14242.1)은 모든 백혈구(중성 백혈구, 단핵 백혈구 및 대부분의 림프구) 및 골수 세포에 본질적으로 발현된다. 이런 이유로, 이것은 E 및 L-셀렉틴에는 낮은 친화력을 가지지만, P-셀렉틴을 발현하는 활성화된 혈소판 또는 내피에 이들 세포를 묶는데 중요한 역할을 한다. P-셀렉틴 리간드의 예는, 예를 들어 미국 특허 제5,840,679호에 개시된다.
국제 특허 출원 공보 WO 2008/131217호는 P-셀렉틴으로 향하는 표적 리간드를 포함하는 미세기포 조성물을 개시한다. 특히, 표적 리간드는 P-셀렉틴 리간드 및 이합체화 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 실제 구체예에서, 이 출원은 비오틴 함유 미세기포에 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 콘주게이트되는, 사람 IgG1(rPSGL-Ig)의 Fc 부분에 융합된 셀렉틴-결합 글리코폼에서 PSGL-1의 아미노 말단 영역으로 구성된 재조합 P-셀렉틴 리간드의 사용을 개시한다. 상기 출원이 P-셀렉틴 리간드의 어떤 정확한 서열을 개시하지 않은 한편, 그것은 미국 특허 출원 공개 제2003/0166521호에 의해 개시된 P-셀렉틴 리간드 및 그것의 단편의 예를 언급한다.
미국 제2003/0166521호는 성숙 PSGL-1의 N-말단 47의 아미노산을 절단하고 PSGL-1의 상기 N-말단 47개의 아미노산을 사람 면역글로불린 G-1(IgG1)의 Fc 부분에 연결시킴으로써 생성된, 재조합 PSGL-Ig(또는 rPSGL-Ig)로도 언급되는, PSGL-1 융합 단백질(dimPSGL-1)을 개시한다.
본 출원인은 이제, 예를 들어 미세소포를 함유하는 수성 현탁액의 안정성 및/또는 결합 효능에 관하여 완전 단백질을 지니는 미세소포와 비교할 때, 단지 상기 rPSGL-1 단백질의 단편을 지니는 미세소포가 어떤 이점을 가질 수 있다는 것을 관찰하였다.
본 발명의 양태는 최대 200개의 아미노산 잔기의 서열로 구성되고 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-16을 포함하는, 폴리펩티드와 회합된 기체-충전 미세소포의 수성 현탁액에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 미세소포의 성분과 회합되고, 더 바람직하게는 공유 결합을 통해 회합된다.
바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 1-19, 더 바람직하게는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-41, 및 훨씬 더 바람직하게는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 1-47을 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 폴리펩티드는 최대 100개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 최대 75개의 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 폴리펩티드는 하기 식 (I)의 아미노산 서열로 구성되며:
(XA)n-Y-(XB)m (I)
여기서:
(XA)n은 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-16을 포함하는, n개의 아미노산의 서열 XA를 나타내며:
n은 12 내지 199의 정수이고;
XA는 리신을 제외한 어떤 아미노산을 나타내고;
(XB)m은 m개의 아미노산 XB의 서열을 나타내며;
합계 m+n은 최대 199인 조건으로, m은 0 내지 10의 정수이고;
XB는 리신 및 시스테인을 제외한 어떤 아미노산을 나타내고;
Y는 폴리펩티드를 미세소포의 성분에 회합하기 위한 반응성 부분을 포함하는 아미노산을 나타낸다.
바람직하게는 Y 잔기의 반응성 부분은 -NH2 또는 -SH이고; 더 바람직하게는 Y는 리신 또는 시스테인이고, 훨씬 더 바람직하게는 리신이다.
추가 바람직한 구체예에 따르면, 상기 폴리펩티드는 하기 식 (II)의 서열로 나타내며:
(X1)p-[(C-(X2)a]q-[(C-(X3)b]r-Y-(X4)s (II)
여기서
C는 시스테인을 나타내고;
Y는 리신 또는 시스테인, 바람직하게는 리신을 나타내고;
(X1)p는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-16을 포함하는 p개의 아미노산 X1의 서열을 나타내고, (X2)a는 a개의 아미노산 X2의 서열을 나타내고, (X3)b는 b개의 아미노산 X3의 서열을 나타내고, (X4)s는 s개의 아미노산 X2의 서열을 나타내며:
X1, X2, X3, X4는 독립적으로 리신 및 시스테인을 제외한 어떤 아미노산을 나타내고;
p는 12 내지 199, 바람직하게는 12 내지 99, 더 바람직하게는 12 내지 74의 정수이고;
a 및 b는 독립적으로 0 내지 50, 바람직하게는 0 내지 20 및 더 바람직하게는 0 내지 10의 정수이고;
q 및 r은 독립적으로 0 또는 1이고, 적어도 하나는 1이며;
s는 0 내지 10의 정수이고;
합계 p+(a·q)+(b·r)+s는 최대 199, 바람직하게는 최대 99 및 훨씬 더 바람직하게는 74인 조건을 가진다.
상기 예시된 폴리펩티드는 바람직하게는 서열의 아미노산에 결합된 적어도 하나의 황산 잔기 및/또는 적어도 하나의 O-글리칸 부분을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 예시된 폴리펩티드는 이합체 형태, 바람직하게는 동종이합체 형태이다.
특히 바람직한 구체예에 따르면, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3에 제시된 서열로 구성된다. 바람직하게는, 서열 중 2개의 시스테인 잔기는 대응하는 서열의 각 시스테인 잔기에 결합하여, 이합체 형태의 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
본 발명은 추가로 건조 분말 또는 동결건조된 잔류물의 형태의 상기 기체-충전 미세소포의 전구체에 관한 것이다. 상기 전구체는 구체적으로 기체의 존재하에서 혼합물의 교반시에 상기 기체-충전 미세소포의 수성 현탁액을 형성하도록 그것을 생리적으로 허용가능한 수성 담체와 접촉함으로써 복원가능하다.
본 발명의 추가 양태는 상기 기체-충전 미세소포의 전구체 및 생리적으로 허용가능한 수성 담체를 포함하는 약학적 키트에 관련된다.
용어 "기체-충전 미세소포"는 안정화 재료의 엔벨로프 또는 층(필름-형성 층을 포함)에 의해 둘러싸인 미크로미터 또는 나노미터 크기의 기체의 기포를 포함하는 어떤 구조를 포함한다. 용어는 기체-충전 리포솜, 미세기포, 미소구체, 미세풍선 또는 미세캡슐로서 본 분야에 알려진 것을 포함한다. 미세소포는 수성 담체, 특히 생리적으로 허용가능한 수성 담체에 전형적으로 부유된다. 안정화 재료는, 예를 들어 계면활성제, 지질, 스핑고지질, 올리고지질, 인지질, 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 및 합성 또는 자연 중합체 재료를 포함하는 본 분야에 전형적으로 알려진 어떤 재료일 수 있다.
용어 "미세기포"는 액체 계면에 대한 기체에 배치된 안정화 양친매성 재료를 포함하는 매우 얇은 엔벨로프(필름)(때때로 본 분야에서 "소실성" 엔벨로프로 언급됨)에 의해 기체/액체 계면에서 결합되는, 수성 담체에 부유된 기체의 기포를 포함한다. 미세기포 현탁액은, 교반하면서, 그것의 적합한 전구체, 예컨대 분말 양친매성 재료(예를 들어, 동결-건조 사전 형성된 리포솜 또는 동결-건조 또는 분무-건조 인지질 분산물 또는 용액)를 공기 또는 다른 기체와 접촉한 다음 수성 담체와 접촉함으로써 제조되어, 그 다음 바람직하게는 그것의 제조 후 간단하게 투여될 수 있는 미세기포 현탁액을 발생시킬 수 있다. 기체 미세기포의 수성 현탁액, 전구체 및 그것의 제조의 예는, 예를 들어 미국 제5,271,928호, 미국 제5,445,813호, 미국 제5,413,774호, 미국 제5,556,610호, 미국 제5,597,549호, 미국 제5,827,504호 및 WO 04/069284호에 개시되며, 그것들의 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.
용어 "미세풍선" 또는 "미세캡슐"은 기체의 기포가 자연 또는 합성 중합체 혹은 지질의 고체 재료 엔벨로프에 의해 둘러싸인 현탁액을 포함한다. 미세풍선 및 그것의 제조의 예는, 예를 들어 미국 제5,711,933호 및 미국 제6,333,021호에 개시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리펩티드는 합성 또는 바람직하게는 자연 아미노산일 수 있는 아미노산의 서열을 포함한다.
용어 "표적 리간드"는 생체 내 조직 및/또는 수용체를 향한 표적 활성을 갖거나 또는 촉진시킬 수 있는 어떤 화합물, 모이어티 또는 잔기를 포함한다. 표적 리간드가 회합될 수 있는 표적은 조직, 예를 들어 심근 조직(심근 세포를 포함), 막 조직(내피 및 상피를 포함), 라미나(laminae), 연결 조직(세포간 조직을 포함) 또는 종양; 혈액 응고; 그리고 수용체, 예를 들어 펩티드 호르몬, 신경전달물질, 항원, 보완 단편 및 면역글로불린을 위한 세포-표면 수용체를 포함한다. 용어는 셀렉틴, 특히 P-셀렉틴에 대한 결합 친화력("활성 서열")을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특히 포함하며; 상기 활성 서열은, 예를 들어 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 5-16, 1-19, 5-41 및 1-47을 포함한다.
용어 "표적화 기체-충전 미세소포"는 그것의 조제물에 적어도 하나의 표적 리간드를 포함하는 어떤 기체-충전 미세소포를 포함한다.
문구 "표적화 기체-충전 미세소포의 중간체"는 표적화 기체-충전 미세소포로 전환될 수 있는 어떤 기체-충전 미세소포를 포함한다. 이러한 중간체는, 예를 들어 표적 리간드에 연결된 대응하는 보완적인 반응성(예를 들어, 티올)과 반응할 수 있는 적합한 반응성 부분(예를 들어, 말레이미드)을 포함하는 기체-충전 미세소포(또는 그것의 전구체)를 포함할 수 있다.
표현 "Fc 영역"은 이황화 결합에 의해 서로 연결된 중쇄 둘 다의 카르복시-말단 절반들로 구성된 면역글로불린(Ig)의 결정화가능 단편을 나타낸다. Fc 단편은 각 면역글로불린 부류(즉, IgG, IgM, IgA, 등) 및 타입(IgG1, IgG2 등)에 대해 다르다.
용어 "전체 길이 Fc 도메인"은 항체의 부류에 의존하는, 2개 또는 3개의 일정한 도메인을 포함하는 2개의 중쇄로 구성된 도메인을 나타낸다. 특정 단백질에 결합함으로써, Fc 도메인은 각 항체가 주어진 항원에 적당한 면역 반응을 발생시키는 것을 보장한다. 이 Fc 도메인은 또한 다양한 세포 수용체, 예컨대 Fc 수용체, 그리고 다른 면역 분자, 예컨대 보완 단백질과 결합한다. 이것을 수행함으로써, 그것은 옵소닌화, 세포 용해, 그리고 마스트(mast) 세포, 호염기성 백혈구 및 호산성 백혈구의 탈과립화를 포함하는 다른 생리학적 효과를 조정한다. 전체 길이 Fc 도메인 서열은 미변성(본래) 아미노산 서열, 또는 하나 이상의 비필수 아미노산이 돌연변이된 대응하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 49 내지 272는, 아미노산 59 및 62의 2가지(본래 Fc 서열의 Leu 및 Gly 잔기는 둘 다 Ala 잔기에 의해 치환되었음)를 제외한, IgG1 면역글로불린의 전체 길이 Fc 도메인에 해당한다.
용어 "치료제"는, 어떤 치료 용도, 예컨대 환자의 질환을 치료하기 위한 방법, 그뿐만 아니라 시험관 내 및/또는 생체 내에 생물학적 효과를 행사할 수 있거나 또는 행사하는데 책임이 있는 어떤 물질에 사용될 수 있는, 어떤 화합물, 모이어티 또는 잔기를 그것의 의미 내에 포함한다. 따라서 치료제는 환자의 어떤 병적 상태(만성병, 통증, 질환, 병변 또는 부상을 포함)의 치료(예방, 경감, 통증 완화 또는 치료를 포함)에 사용될 수 있는 어떤 화합물 또는 재료를 포함한다. 치료제의 예는 약물, 약제, 생활성제, 세포독성 약제, 화학치료제, 방사치료제, 단백질, 자연 또는 합성 펩티드, 예컨대 올리고펩티드 및 폴리펩티드, 비타민, 스테로이드, 그리고 유전 재료, 예컨대 누클레오시드, 누클레오티드, 올리고누클레오티드, 폴리누클레오티드 및 플라스미드이다.
표현 "생리적으로 허용가능한 수성 담체"는, 예를 들어 물, 전형적으로는 멸균수, 발열원 없는 물(중간 동결건조 생성물에서 가능한 한 많이 오염을 방지함), 수용액, 예컨대 염수(주사를 위한 최종 생성물이 저긴장성이지 않도록 이롭게 균형이 맞춰질 수 있음), 혹은 하나 이상의 긴장성 조정 물질, 예컨대 염 또는 당, 당 알콜, 글리콜 또는 다른 비이온성 폴리올 재료(예를 들어, 글루코스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)의 수용액과 같이, 주사를 위해 일반적으로 사용되는 액체 담체를 포함한다.
기체-충전 미세소포
본 발명의 구체예에 따르면, 상기 정의된 바와 같이, 표적 리간드와 회합된 기체-충전 미세소포는 미세기포이다.
미세기포의 안정화 엔벨로프를 형성하는데 적합한 성분은, 예를 들어 인지질; 리소인지질; 지방산, 예컨대 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산 또는 올레산; 중합체를 지니는 지질, 예컨대 키틴, 히알루론산, 폴리비닐피롤리돈 또는 "페길화 지질"로서도 언급된 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 술폰화된 단-, 이-, 올리고- 또는 다당류를 지니는 지질; 콜레스테롤, 콜레스테롤 황산염 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트; 토코페롤 헤미숙시네이트; 에테르 또는 에스테르-연결 지방산을 갖는 지질; 중합 지질; 디아세틸 포스페이트; 디세틸 포스페이트; 세라미드; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(예컨대, 폴리옥시에틸렌 지방산 스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 지방 알콜, 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 폴리옥시에틸화 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 리시놀리에이트, 에톡실화 대두 스테롤, 에톡실화 피마자 오일 또는 에틸렌 옥시드(EO)와 프로필렌 옥시드(PO) 블록 공중합체; 스테롤 지방족산 에스테르, 예컨대 콜레스테롤 부티레이트, 콜레스테롤 이소-부티레이트, 콜레스테롤 팔미테이트, 콜레스테롤 스테아레이트, 라노스테롤 아세테이트, 에르고스테롤 팔미테이트, 또는 피토스테롤 n-부티레이트; 당산의 스테롤 에스테르, 예컨대 콜레스테롤 글루코로니드, 라노스테롤 글루코로니드, 7-디히드로콜레스테롤 글루코로니드, 에르고스테롤 글루코로니드, 콜레스테롤 글루코네이트, 라노스테롤 글루코네이트, 또는 에르고스테롤 글루코네이트; 당산 및 알콜의 에스테르, 예컨대 라우릴 글루코로니드, 스테아로일 글루코로니드, 미리스토일 글루코로니드, 라우릴 글루코네이트, 미리스토일 글루코네이트, 또는 스테아로일 글루코네이트; 당의 지방족산과의 에스테르, 예컨대 수크로스 라우레이트, 프룩토스 라우레이트, 수크로스 팔미테이트, 수크로스 스테아레이트, 글루쿠론산, 글루콘산 또는 폴리우론산; 사포닌, 예컨대 사르사사포게닌, 스밀라게닌, 헤드라게닌, 올레아놀산, 또는 디기톡시게닌; 글리세롤 또는 글리세롤 에스테르, 예컨대 글리세롤 트리팔미테이트, 글리세롤 디스테아레이트, 글리세롤 트리스테아레이트, 글리세롤 디미리스테이트, 글리세롤 트리미리스테이트, 글리세롤 디라우레이트, 글리세롤 트리라우레이트, 글리세롤 디팔미테이트; 긴 쇄 알콜, 예컨대 n-데실 알콜, 라우릴 알콜, 미리스틸 알콜, 세틸 알콜, 또는 n-옥타데실 알콜; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)-1-티오-β-D-갈락토피라노시드; 디갈락토실디글리세리드; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥시-1-티오-β-D-갈락토피라노시드; 6-(5-콜레스텐-3β-일옥시)헥실-6-아미노-6-데옥실-1-티오-β-D-만노피라노시드; 12-(((7'-디에틸아미노쿠마린-3-일)카르보닐)-메틸아미노)옥타데칸산; N-[12-(((7'-디에틸아미노쿠마린-3-일)카르보닐)-메틸아미노)-옥타데카노일]-2-아미노팔미트산; N-숙신일디올레일포스파티딜에탄올아민; 1,2-디올레일-sn-글리세롤; 1,2-디팔미토일-sn-3-숙신일글리세롤; 1,3-디팔미토일-2-숙신일글리세롤; 1-헥사데실-2-팔미토일글리세로포스포에탄올아민 또는 팔미토일호모시스테인; 적어도 하나의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18)의 알킬 쇄를 포함하는 알킬아민 또는 알킬암모늄염, 예를 들어 N-스테아릴아민, N,N'-디스테아릴아민, N-헥사데실아민, N,N'-디헥사데실아민, N-스테아릴암모늄 클로리드, N,N'-디스테아릴암모늄 클로리드, N-헥사데실암모늄 클로리드, N,N'-디헥사데실암모늄 클로리드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로미드(DDAB), 헥사데실트리메틸암모늄 브로미드(CTAB); (C3-C6) 알킬렌 다리를 통해 N-원자에 연결된 1개 또는 바람직하게는 2개의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18)의 아실 쇄를 포함하는 3차 또는 4차 암모늄염, 예를 들어 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(DPTAP), 1,2-올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판(DSDAP); 및 그것들의 혼합물 또는 조합을 포함한다.
성분들의 조합 및 미세기포의 제조 방법에 의존하는, 상기 열거된 예시적인 화합물은 미세기포의 엔벨로프를 형성하기 위한 주된 화합물로서 또는 간단한 첨가제로서 사용되고, 따라서 단지 작은 양으로 존재할 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 미세기포의 엔벨로프를 형성하는 적어도 하나의 화합물은 양친매성 화합물(즉, 친수성 및 친유성 부분 둘 다를 포함하는 유기 분자), 바람직하게는 선택적으로 다른 상기 언급된 재료 중 어떤 것과 혼합한 인지질이다. 본 설명에 따르면, 용어 인지질은 어떤 양친매성 인지질 화합물을 망라하는 것으로 의도되며, 이것의 분자는 최종 미세기포 현탁액의 기체-물 경계면에서 재료의 안정화 필름(전형적으로 단분자층의 형태)을 형성할 수 있다. 따라서, 이들 재료는 본 분야에 "필름-형성 인지질"로서 또한 언급된다.
양친매성 인지질 화합물은 적어도 1개의 인산기 및 적어도 1개, 바람직하게는 2개의 친유성 긴-쇄 탄화수소기를 전형적으로 함유한다.
적합한 인지질의 예는 지방산의 1개 또는 바람직하게는 2개(동일한 또는 다름)의 잔기 및 인산과 글리세롤의 에스테르를 포함하며, 인산 잔기는 친수성기, 예를 들어 콜린(포스파티딜콜린-PC), 세린(포스파티딜세린-PS), 글리세롤(포스파티딜글리세롤-PG), 에탄올아민(포스파티딜에탄올아민-PE), 이노시톨(포스파티딜이노시톨-PI)에 차례로 결합한다. 지방산의 단지 하나의 잔기와 인지질의 에스테르는 일반적으로 인지질의 "리소" 형태 또는 "리소인지질"로서 본 분야에 언급된다. 인지질에 존재하는 지방산 잔기는 12개 내지 24개, 바람직하게는 14개 내지 22개의 탄소 원자를 전형적으로 함유하는 일반적으로 긴 쇄 지방족산이며; 지방족 쇄는 하나 이상의 불포화를 함유할 수 있거나 또는 바람직하게는 완전히 포화된다. 인지질에 포함된 적합한 지방산의 예는, 예를 들어 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산이다. 바람직하게는, 포화 지방산, 예컨대 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 아라키드산이 사용된다.
인지질의 추가 예는 포스파티드산, 즉 지방산과 글리세롤-인산의 디에스테르; 스핑고지질, 예컨대 스핑고미엘린, 즉 지방산과 글리세롤 디에스테르의 잔기가 세라미드 쇄에 의해 치환된 그것들의 포스파티딜콜린 유사체; 카르디올리핀, 즉 지방산과 1,3-디포스파티딜글리세롤의 에스테르; 당지질, 예컨대 강글리오시드 GM1(또는 GM2) 또는 세레브로시드; 당지질; 술파티드 및 글리코스핑고지질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 인지질은 자연 발생, 반합성, 또는 합성으로 제조된 생성물 중 하나를 포함하는데, 이것은 홀로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.
자연 발생 인지질의 예는 자연 레시틴(포스파티딜콜린(PC) 유도체), 예컨대 전형적으로, 대두 또는 난황 레시틴이다.
반합성 인지질의 예는 자연 발생 레시틴의 부분적 또는 전체 수소화 유도체이다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린, 에틸포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 또는 스핑고미엘린의 지방산 디-에스테르이다.
바람직한 인지질의 예는, 예를 들어 디라우로일-포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일-포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린(DPPC), 디아라키도일-포스파티딜콜린(DAPC), 디스테아로일-포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일-포스파티딜콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(Ethyl-DSPC), 디펜타데카노일-포스파티딜콜린(DPDPC), 1-미리스토일-2-팔미토일-포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일-포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일-포스파티딜콜린(PSPC), 1-스테아로일-2-팔미토일-포스파티딜콜린(SPPC), 1-팔미토일-2-올레일포스파티딜콜린(POPC), 1-올레일-2-팔미토일-포스파티딜콜린(OPPC), 디라우로일-포스파티딜글리세롤(DLPG)과 그것의 알칼리 금속염, 디아라키도일포스파티딜-글리세롤(DAPG)과 그것의 알칼리 금속염, 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)과 그것의 알칼리 금속염, 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG)과 그것의 알칼리 금속염, 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG)과 그것의 알칼리 금속염, 디올레오일-포스파티딜글리세롤(DOPG)과 그것의 알칼리 금속염, 디미리스토일 포스파티드산(DMPA)과 그것의 알칼리 금속염, 디팔미토일 포스파티드산(DPPA)과 그것의 알칼리 금속염, 디스테아로일 포스파티드산(DSPA), 디아라키도일포스파티드산(DAPA)과 그것의 알칼리 금속염, 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디스테아로일 포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 디올레일포스파티딜-에탄올아민(DOPE), 디아라키도일포스파티딜-에탄올아민(DAPE), 디리놀레일포스파티딜에탄올아민(DLPE), 디미리스토일 포스파티딜세린(DMPS), 디아라키도일 포스파티딜세린(DAPS), 디팔미토일 포스파티딜세린(DPPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 디팔미토일 스핑고미엘린(DPSP), 그리고 디스테아로일스핑고미엘린(DSSP), 디라우로일-포스파티딜이노시톨(DLPI), 디아라키도일포스파티딜이노시톨(DAPI), 디미리스토일포스파티딜이노시톨(DMPI), 디팔미토일포스파티딜이노시톨(DPPI), 디스테아로일포스파티딜이노시톨(DSPI), 디올레오일-포스파티딜이노시톨(DOPI)이다.
적합한 인지질은 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜(PPG)을 거기에 연결함으로써 변성된 인지질을 더 포함한다. 바람직한 중합체-변성 인지질은 "페길화 인지질", 즉 PEG 중합체에 결합된 인지질을 포함한다. 페길화 인지질의 예는 페길화 포스파티딜에탄올아민(간단히 "PE-PEG"), 즉 친수성 에탄올아민 부분이 가변적인 분자량(예를 들어, 300 내지 20000달톤, 바람직하게는 500 내지 5000달톤)의 PEG 분자에 결합된 포스파티딜에탄올아민, 예컨대 DPPE-PEG(또는 DSPE-PEG, DMPE-PEG, DAPE-PEG 또는 DOPE-PEG)이다. 예를 들어, DPPE-PEG2000은 약 2000의 평균 분자량을 가진 PEG 중합체가 부착된 DPPE를 의미한다.
특히 바람직한 인지질은 DAPC, DSPC, DSPG, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS 및 Ethyl-DSPC이다. DSPG 또는 DSPC가 가장 바람직하다.
인지질의 혼합물은 또한, 예를 들어 DSPE, DPPE, DPPC, DSPC 및/또는 DAPC의 DSPS, DPPS, DSPA, DPPA, DSPG, DPPG, Ethyl-DSPC 및/또는 Ethyl-DPPC와의 혼합물과 같이 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 인지질은 기체-충전 미세기포의 엔벨로프를 형성하는 성분의 총량의 적어도 50%(w/w)에 달하는, 미세기포의 안정화 엔벨로프의 주성분이다. 일부 바람직한 구체예에서, 실질적으로 엔벨로프의 전체(즉, 적어도 80 중량% 및 100 중량% 이하)는 인지질로 형성될 수 있다.
인지질은 상기 열거된 화합물 중 어떤 것과의 혼합에 편리하게 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 물질, 예컨대 콜레스테롤, 에르고스테롤, 피토스테롤, 시토스테롤, 라노스테롤, 토코페롤, 프로필 갈레이트 또는 아스코르빌 팔미테이트, 지방산, 예컨대 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산 및 그것의 유도체 또는 부틸화 히드록시톨루엔 및/또는 다른 비인지질 화합물은 선택적으로 하나 이상의 하기 인지질에 0 내지 50 중량%, 바람직하게는 25 중량% 이하의 범위의 비율로 첨가될 수 있다. 양친매성 화합물, 예컨대 C10-C20의 카르복시산, 바람직하게는 팔미트산이 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따르는 미세기포의 엔벨로프는 전체(양성 또는 음성) 실제 하전을 지니는 화합물을 포함한다. 상기 화합물은 하전된 양친매성 재료, 바람직하게는 지질 또는 인지질일 수 있다.
전체 음하전을 지니는 인지질의 예는 유도체, 특히 포스파티딜세린, 예컨대 DMPS, DPPS, DSPS; 포스파티드산, 예컨대 DMPA, DPPA, DSPA; 포스파티딜글리세롤, 예컨대 DMPG, DPPG 및 DSPG 또는 포스파티딜이노시톨, 예컨대 DMPI, DPPI 또는 DPPI의 지방산 디-에스테르 유도체이다. 또한 변성된 인지질, 특히 PEG-변성 포스파티딜에탄올아민, 예컨대 DPPE-PEG 또는 DSPE-PEG는 음하전된 분자로서 사용될 수 있다. 또한 상기 언급된 인지질의 리소-형태, 예컨대 리소포스파티딜세린 유도체(예를 들어, 리소-DMPS, -DPPS 또는 -DSPS), 리소포스파티드산 유도체(예를 들어, 리소-DMPA, -DPPA 또는 -DSPA), 및 리소포스파티딜글리세롤 유도체(예를 들어, 리소-DMPG, -DPPG 또는 -DSPG)는 음하전된 화합물로서 이롭게 사용될 수 있다. 음하전된 화합물의 다른 예는 담즙산염, 예컨대 콜산염, 데옥시콜산염 또는 글리코콜산염; 그리고 (C12-C24), 바람직하게는 (C14-C22) 지방산염, 예를 들어 팔미트산염, 스테아르산염, 1,2-디팔미토일-sn-3-숙신일글리세롤염 또는 1,3-디팔미토일-2-숙신일-글리세롤염이다.
바람직하게는, 음하전된 화합물은 DPPA, DPPS, DSPG, DPPG, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG5000 또는 그것들의 혼합물 중에서 선택된다.
음하전된 성분은, 일가(예를 들어, 알칼리 금속 또는 암모늄), 이가(예를 들어, 알칼리 토금속) 또는 삼가(예를 들어, 알루미늄)일 수 있는, 해당하는 양성 반대 이온과 전형적으로 회합된다. 바람직하게는 반대 이온은 알칼리 금속 양이온 중에서, 예컨대 Na+ 또는 K+, 더 바람직하게는 Na+로 선택된다.
전체 양하전을 지니는 인지질의 예는 에틸포스파티딜콜린의 유도체, 특히 에틸포스파티딜콜린의 지방산과의 디-에스테르, 예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(Ethyl-DSPC 또는 DSEPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(Ethyl-DPPC 또는 DPEPC)이다. 음성 반대 이온은 바람직하게는 할로겐화 이온, 특히 염화 또는 브롬화 이온이다. 미세기포의 엔벨로프에 혼합될 수 있는 양하전된 화합물의 예는 적어도 하나의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18)의 알킬 쇄를 포함하는 할로겐화 반대 이온(예를 들어, 염화 또는 브롬화)을 갖는 모노-, 디- 트리-, 또는 테트라-알킬암모늄염, 예를 들어 모노- 또는 디-스테아릴암모늄 클로리드, 모노- 또는 디-헥사데실암모늄 클로리드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로미드(DDAB) 또는 헥사데실트리메틸암모늄 브로미드(CTAB)이다. 미세기포의 엔벨로프에 혼합될 수 있는 양하전된 화합물의 추가 예는, (C3-C6) 알킬렌 다리를 통해 N-원자에 연결된 1개 또는 바람직하게는 2개의 (C10-C20), 바람직하게는 (C14-C18)의 아실 쇄를 포함하는 할로겐화물 반대 이온(예를 들어, 염화 또는 브롬화)을 갖는 3차 또는 4차 암모늄염, 예를 들어 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(DPTAP), 1,2-올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 또는 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판(DSDAP)이다.
DSEPC, DPEPC 및/또는 DSTAP는 미세기포 엔벨로프에서 양하전된 화합물로서 바람직하게 사용된다.
양하전된 성분은, 일가(예를 들어, 할로겐화물), 이가(예를 들어, 황산염) 또는 삼가(예를 들어, 인산염)일 수 있는, 해당하는 음성 반대 이온과 전형적으로 회합된다. 바람직하게는 반대 이온은 할로겐화 이온, 예컨대 F-(불소), Cl-(염소) 또는 Br-(브롬) 중에서부터 선택된다.
중성과 하전된 화합물들의, 특히 인지질 및/또는 지질의 혼합물은 미세기포 엔벨로프를 형성하도록 만족스럽게 사용될 수 있다. 하전된 지질 또는 인지질의 양은 지질 및 인지질의 총량에 대하여 약 95 mol% 내지 약 0.1 mol%, 바람직하게는 80 mol% 내지 0.5 mol%로 다양할 수 있다.
중성 인지질과 하전된 지질 또는 인지질의 바람직한 혼합물은, 예를 들어 DPPG/DSPC, DSTAP/DAPC, DPPS/DSPC, DPPS/DAPC, DPPE/DPPG, DSPA/DAPC, DSPA/DSPC 및 DSPG/DSPC이다.
기체-충전 미세소포, 특히 인지질, 바람직하게는 페길화 인지질의 안정화 엔벨로프를 형성하는데 유용한 상기 예시된 성분들 중 어떤 것은, SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는 표적 리간드와 같이 적합한 화합물을 결합하는 것을 허용하기 위해, 거기에 적합한 반응성 부분을 삽입함으로써 변성될 수 있다. 예를 들어, 페길화 인지질(예를 들어, DSPE-PEG2000)은, 상기 서열을 포함하는 화합물에서 대응하는 반응성 부분과 (공유적으로)반응할 수 있는 말단 반응성 부분(예를 들어, 말레이미드, 간단히 "mal", 따라서 DSPE-PEG-mal 성분을 형성함)을 포함할 수 있다. 추가 적합한 반응성 부분의 예는 하기 명세서에 예시된다.
대안의 구체예에 따르면, 표적 리간드 성분은 기체-충전 미세캡슐과 회합될 수 있다. 미세캡슐의 바람직한 예는 중합체, 바람직하게는 생분해성 중합체, 또는 선택적으로 생분해성 중합체와 혼합한 생분해성 물-불용성 지질(예컨대, 트리팔미틴)을 포함하는 안정화 엔벨로프를 갖는 것들이다. 적합한 미세캡슐 및 그것의 제조의 예는, 예를 들어 미국 제5,711,933호 및 미국 제6,333,021호에 개시되며, 그것들의 전체가 참고자료로 본원에 포함된다. 단백성 엔벨로프를 갖는, 즉 미국-A-4,276,885호 또는 유럽-A-0 324 938호(본원에 참고자료로 포함됨)에 기술된 것들과 같이 자연 단백질(알부민, 헤모글로빈)로 만들어진 미세캡슐이 또한 사용될 수 있다. 표적 리간드는, 예를 들어 상기 예시된 제조 방법에 따르는 미세캡슐의 엔벨로프-형성 성분에 그것을 결합시킴으로써, 또는 이전에 예시된 것들과 같이 표적 리간드에 공유 결합된 양친매성 성분인 미세캡슐 엔벨로프를 형성하는 성분에 혼합함으로써 미세캡슐에 혼합될 수 있다.
다른 부형제 또는 첨가제는 미세소포의 건조 조제물에 존재하거나, 또는 그것의 재구성을 위해 사용된 수성 담체와 함께 첨가될 수 있지만, 미세소포의 안정화 엔벨로프의 형성에 반드시 포함되지는 않는다(또는 단지 부분적으로 포함됨). 이것들은 pH 조절제(예컨대, 히스티딘), 오스몰 농도 조정제, 점도 향상제, 유화제, 벌크화제, 등을 포함하고, 종래의 양으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥시프로필렌 글리콜 및 폴리옥시에틸렌 글리콜 같은 화합물, 그뿐만 아니라 그것들의 공중합체가 사용될 수 있다. 점도 향상제 또는 안정제의 예는 선형 및 가교-연결 폴리- 및 올리고-당류, 당 그리고 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 화합물이다.
기체-충전 미세소포의 제조가 동결 건조 또는 분무 건조 단계를 포함할 수 있기 때문에, 동결 건조 첨가제, 예컨대 동결방지제 및/또는 동결방지 효과를 갖는 물질 및/또는 벌크화제, 예를 들어 아미노산, 예컨대 글리신; 탄수화물, 예를 들어 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 말토스, 트레할로스, 글루코스, 락토스 또는 시클로덱스트린, 또는 다당류, 예컨대 덱스트란; 또는 폴리옥시알킬렌글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 조제물에 포함하는 것이 이로울 수 있다. 전형적으로, 동결 건조 첨가제의 양은 미세소포-형성 성분의 양의 약 10배 내지 약 1000배(w/w)의 범위일 수 있다.
어떤 생체 적합성 기체, 기체 전구체 또는 그것들의 혼합물은 상기 미세소포(이하에 "미세소포-형성 기체"로도 정의됨)를 채우기 위해 사용될 수 있다.
기체는, 예를 들어 공기; 질소; 산소; 이산화탄소; 수소; 아산화질소; 영족 또는 비활성 기체, 예컨대 헬륨, 아르곤, 크세논 또는 크립톤; 방사성 기체, 예컨대 Xe133 또는 Kr81; 과분극화 영족 기체, 예컨대 과분극화 헬륨, 과분극화 크세논 또는 과분극화 네온; 저분자량 탄화수소(예를 들어, 7개 이하의 탄소 원자를 함유), 예를 들어 알칸, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 이소부탄, 펜탄 또는 이소펜탄, 시클로알칸, 예컨대 시클로부탄 또는 시클로펜탄, 알켄, 예컨대 프로펜, 부텐 또는 이소부텐, 또는 알킨, 예컨대 아세틸렌; 에테르; 케톤; 에스테르; 할로겐화 기체, 바람직하게는 불화 기체, 예컨대 할로겐화, 불화 또는 과불화 저분자량 탄화수소(예를 들어, 7개 이하의 탄소 원자를 함유); 또는 상기 중 어떤 것의 혼합물을 포함할 수 있다. 할로겐화 탄화수소가 사용된 경우, 바람직하게는 상기 화합물에서 할로겐 원자들 중 적어도 일부, 더 바람직하게는 모두가 불소 원자이다.
불화 기체가 바람직하고, 특히 초음파 이미지화의 분야에서는 과불화 기체가 특히 바람직하다. 불화 기체는 적어도 하나의 불소 원자, 예를 들어 불화 탄화수소(하나 이상의 탄소 원자 및 불소를 함유하는 유기 화합물); 육불화황; 불화, 바람직하게는 과불화 케톤, 예컨대 퍼플루오로아세톤; 및 불화, 바람직하게는 과불화 에테르, 예컨대 퍼플루오로디에틸 에테르를 함유하는 재료를 포함한다. 바람직한 화합물은 과불화 기체, 예컨대 SF6 또는 퍼플루오로탄소(과불화 탄화수소), 즉 예를 들어 유럽 제0554 213호에 개시된 바와 같이, 모든 수소 원자가 특히 안정한 미세기포 현탁액을 형성하는 것으로 알려진 불소 원자로 치환된 탄화수소이며, 그 출원은 참고자료로 본원에 포함된다.
용어 퍼플루오로탄소는 포화, 불포화, 및 환형 퍼플루오로탄소를 포함한다. 생체 적합성, 생리적으로 허용가능한 퍼플루오로탄소의 예는 퍼플루오로알칸, 예컨대 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄(예를 들어, 선택적으로 퍼플루오로-이소부탄과 같이 다른 이성질체와 혼합한, 퍼플루오로-n-부탄), 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산 또는 퍼플루오로헵탄; 퍼플루오로알켄, 예컨대 퍼플루오로프로펜, 퍼플루오로부텐(예를 들어, 퍼플루오로부트-2엔) 또는 퍼플루오로부타디엔; 퍼플루오로알킨(예를 들어, 퍼플루오로부트-2-인); 및 퍼플루오로시클로알칸(예를 들어, 퍼플루오로시클로부탄, 퍼플루오로메틸시클로부탄, 퍼플루오로디메틸시클로부탄, 퍼플루오로트리메틸시클로부탄, 퍼플루오로시클로펜탄, 퍼플루오로메틸시클로펜탄, 퍼플루오로디메틸시클로펜탄, 퍼플루오로시클로헥산, 퍼플루오로메틸시클로헥산 및 퍼플루오로시클로헵탄)이다. 바람직한 포화 퍼플루오로탄소는, 예를 들어 CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12 및 C6F12를 포함한다.
상기 기체들 중 어떤 것의 혼합물을 어떤 비율로 사용하는 것이 또한 이로울 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 종래의 기체, 예컨대 질소, 공기 또는 이산화탄소 그리고 안정한 미세기포 현탁액을 형성하는 기체, 예컨대, 상기 나타낸 바와 같이, 육불화황 또는 퍼플루오로탄소를 포함할 수 있다. 적합한 기체 혼합물의 예는, 예를 들어 WO 94/09829호에서 알아낼 수 있고, 그 내용은 참고자료로 본원에 포함된다. 하기 기체 (A)와 (B)의 혼합물의 조합이 특히 바람직한데: 기체 (B)는 이전에 예시된 것들 중에서 선택된 불화 기체와 그것들의 혼합물을 포함하고, (A)는 공기, 산소, 질소, 이산화탄소 또는 그것들의 혼합물로부터 선택된다. 기체 (B)의 양은 총혼합물의 약 0.5% 내지 약 95% v/v, 바람직하게는 약 5% 내지 80%를 나타낼 수 있다.
특히 바람직한 기체는 선택적으로 공기, 산소, 질소, 이산화탄소 또는 그것들의 혼합물과 혼합한 SF6, C3F8, C4F10 또는 그것들의 혼합물이다.
특정 경우에서, 전구체를 기체상 물질(즉, 생체 내에서 기체로 전환될 수 있는 재료)에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는 기체상 전구체 및 거기로부터 유도된 기체가 생리적으로 허용가능하다. 기체상 전구체는 pH-활성화, 광-활성화, 온도 활성화, 등이 될 수 있다. 예를 들어, 특정 퍼플루오로탄소는 온도 활성화 기체상 전구체로서 사용될 수 있다. 이들 퍼플루오로탄소, 예컨대 퍼플루오로펜탄 또는 퍼플루오로헥산은 실온(또는 물질이 생성되거나 및/또는 저장되는 온도) 위 그러나 체온 아래에서 액체/기체 상 전이 온도를 가지고; 따라서, 그것은 액체/기체 상 전이를 받고 인체 내에서 기체로 전환된다.
MRI에서 사용하기 위해, 미세소포는 과분극화 영족 기체, 예컨대 과분극화 네온, 과분극화 헬륨, 과분극화 크세논, 또는 그것들의 혼합물을, 선택적으로 공기, 이산화탄소, 산소, 질소, 헬륨, 크세논, 또는 상기 정의된 할로겐화 탄화수소 중 어떤 것과 혼합하여 바람직하게 함유할 것이다.
신티그래피에 사용하기 위해, 미세소포는 방사성 기체, 예컨대 Xe133 또는 Kr81 또는 그것들의 혼합물을, 선택적으로 공기, 이산화탄소, 산소, 질소, 헬륨, 크립톤 또는 상기 정의된 할로겐화 탄화수소 중 어떤 것과 혼합하여 바람직하게 함유할 것이다.
표적 리간드
본 발명에 따른 미세소포와 회합된 폴리펩티드는 셀렉틴, 특히 P-셀렉틴에 대한 결합 친화력을 나타내는, SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산의 서열의 적어도 부분을 포함한다. 특히, 상기 폴리펩티드는 "P-셀렉틴 글리코단백질 리간드-1"(PSGL-1, GenBank Acc. N° Q14242.1)의 아미노산 46-57에 해당하는, SEQ ID NO:1의 적어도 아미노산 5-16을 포함한다. 바람직한 구체예에 따르면, 표적 리간드는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 1-19, 더 바람직하게는 적어도 아미노산 5-41 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 아미노산 1-47을 포함한다(이들 마지막은 "P-셀렉틴 글리코단백질 리간드-1"의 아미노산 42-88에 해당함).
"P-셀렉틴 글리코단백질 리간드-1" 및 SEQ ID NO:1을 포함하는 상기 예시된 활성 서열을 포함하는 폴리펩티드은 바람직하게는 상기 서열의 적어도 하나의 아미노산에 결합된 글리칸 잔기를 포함한다.
용어 "글리칸 잔기"는 O-연결 글리칸 잔기(세린, 트레오닌, 티로신, 히드록시티로신 또는 히드록시프롤린과 같은 아미노산 잔기의 히드록실기의 산소 원자에 연결됨) 및 N-연결 글리칸 잔기(아스파라긴과 같은 아미노산의 3차 아미노기의 질소 원자에 연결됨)를 포함한다.
O-연결 글리칸은 당 잔기, 예컨대 N-아세틸갈락토사민, N-아세틸클루코사민(GlcNAc), 푸코스, 글루코스, 만노스(Man), 육탄당, 크실로스, 시알산 또는 그것들의 혼합물을 전형적으로 포함한다. O-연결 글리칸은 바람직하게는 시알릴 루이스 x 구조(sLex, 시알산-갈락토피라노실-푸코스-N-아세틸클루코사민)로 구성된다.
N-연결 글리칸은 오탄당 코어(Man3GlcNAc2)를 전형적으로 포함한다. 복합체 타입 쇄는 1개-, 2개-, 3개-(2,4 및 2,6 분기됨), 4개-, 및 5개-안테나 구조(antennary structure)를 제공할 수 있다. 그것들은 다양한 당류, 예컨대 갈락토스, 시알산, N-아세틸클루코사민, 만노스, 푸코스 및 그것들의 조합을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 미세소포와 회합된 폴리펩티드는 서열의 아미노산에 결합된 하나 이상의 하기 글리칸(또는 그것의 혼합물)을 바람직하게 함유하며:
Figure 112017093088819-pat00001
여기서:
R은 결합이거나 또는 상기 정의된 어떤 다른 글리칸을 나타내고; NeuAc는 뉴라민산이고; Gal은 갈락토스이고; GlcNAc는 N-아세틸클루코사민이고, Fuc는 푸코스이다.
상기 정의된 바와 같이 선택적으로 글리칸 잔기를 나를 수 있는 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기는 (a) 위치 16, 25, 26, 28, 29, 32, 36, 39, 40 또는 41에서 바람직하게는 O-연결 글리칸 잔기를 지니는 아미노산; 및/또는 (b) 위치 24에서 바람직하게는 N-연결 글리칸 잔기를 지니는 아미노산을 포함한다.
이롭게, SEQ ID NO:1은 위치 16에서 트레오닌에 결합된 시알릴 루이스-x(sLex)를 포함할 수 있다(예를 들어, R.D Cumming, "Structure and function of selectin ligand PSGL-1", Braz. J. Biol. Res., 32(5) 1999, pp. 520-528 참고).
더욱이, SEQ ID NO:1의 위치 5, 7 및/또는 10에서 적어도 하나의 티로신 잔기는 선택적으로 황산화(TyrSO3)될 수 있다. 더 바람직하게는 3개의 티로신 잔기 중 적어도 2개 및 훨씬 더 바람직하게는 모두 황산기를 함유할 수 있다.
폴리펩티드는 길이에서 12개 내지 200개, 더 바람직하게는 12개 내지 100개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열이고, 이것은 미세소포의 성분의 대응하는 반응성 부분과 반응할 수 있는 반응성 부분을 포함한다. 12개 내지 75개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 12개 내지 50개의 잔기의 아미노산 서열이 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에 따르면, 폴리펩티드는 반응성 부분을 지니는 아미노산을 포함한다. 상기 아미노산은 시스테인 및/또는 염기성 아미노산, 바람직하게는 리신으로 구성된 군으로부터 바람직하게 선택된다. 바람직하게는, 상기 반응성 부분은 폴리펩티드의 C-말단 위치에 있고, 바람직하게 그것은 리신이다. 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드 서열의 C-말단에서 단일 반응성 부분(특히, 리신)의 존재는 상기 기의 제어된 관능화를 위해, 그리고 미세소포의 성분에서 대응하는 반응성기와 후속 효과적인 반응 상태를 위해 허용한다. 한편, 펩티드 쇄에서(예컨대, SEQ ID NO:4의 Fc 부분의 경우) 복수의 반응성 리신기의 존재는 훨씬 더 임의로 상기 기의 관능화를 만들 수 있고, 펩티드의 다양한 반응성기들 중에서 미세소포의 성분에 결합할 훨씬 더 낮은 제어를 갖는 결과를 가진다.
바람직한 폴리펩티드는, 이전에 예시된 바와 같이, 식 (I) 및 더 바람직하게는 식 (II)로 나타낸 것들이다.
바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:2 또는 거기의 N-말단 단편에 연결된 SEQ ID NO:1의 아미노산을 포함하는데, 상기 단편은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-20, 1-15, 1-10, 1-5 또는 1-4에 해당한다.
N-말단 단편이 단일 아미노산 잔기일 때, 상기 아미노산은 바람직하게는 프롤린(Pro)이다.
특히 바람직한 구체예는 SEQ ID NO:3를 갖고 SEQ ID NO:2에 공유 결합된 SEQ ID NO:1으로 구성된, 융합 폴리펩티드로 나타난다.
융합 폴리펩티드는 rPSGL-Ig의 효소 단백질분해, 예를 들어 적합한 내부단백분해효소의 존재하에 단백질을 배양함으로써 얻어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 리신 잔기의 C-말단 면에서 펩티딜 결합을 분할하는 내부단백분해효소(예를 들어, 내부단백분해효소 Lys-C)가 사용된다. 단백질의 내부단백분해효소 Lys-C와의 배양은 성숙 단백질 rPSGL-Ig로부터 Fc 도메인의 실질적인 부분의 제거를 특히 허용하여, 이합체의 각 서열에 대한 단일(C-말단) 리신 잔기(SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4의 위치 71의 아미노산)를 함유하는 이합체 서열을 제공하는데, 이것은 폴리펩티드를 적합한 미세소포의 성분에 후속 결합하는 과정을 위해 이롭게 사용될 수 있다.
대안으로, 폴리펩티드는 맞춤식 DNA로부터 재조합 단백질의 생성에 의해 얻어질 수 있다. 간단히, 플라스미드는 원하는 폴리펩티드의 cDNA 서열을 플라스미드 벡터에 삽입함으로써 제조된다. 그 다음 플라스미드 벡터는 재조합 폴리펩티드(예를 들어, SEQ ID NO:3에 제시됨)를 생성하기 위한 적합한 발현 시스템과 회합된다. 적합한 발현 시스템의 예는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포(중국 햄스터 난소 세포), HEK293 세포(사람 배아 신장 293 세포), Sp2/0 세포(마우스 골수종 세포주), MEL 세포(마우스 적백혈병 세포) 또는 COS 세포(SV40 유전 재료를 지니는 원숭이의 신장 세포); 곤충 세포, 예컨대 Sf9 세포주; 바이러스 함유 세포, 예컨대 BEVS(바큘로바이러스 발현 벡터 시스템) 세포; 또는 식물-기반 발현 시스템, 예컨대 담배잎, 옥수수, 쌀 세포 또는 형질전환 감자를 포함한다. 가장 바람직하게는, 코어-2β1,6N-아세틸글루코사미닐전달효소(C2GlcNAcT-I) 및 α-1,3-푸코실전달효소-VII(fucT-VII)를 안전하게 발현하는 CHO 세포는 폴리펩티드에 대한 cDNA 코드화로 감염된다. 재조합 폴리펩티드를 영구히 발현하는 세포가 선택된다. 그 다음, 이들 세포는 폴리펩티드의 큰 스케일 생성을 허용하도록 생반응기로 옮겨진다.
바람직한 구체예에서, 재조합 폴리펩티드는 이합체 형태, 특히 동종이합체 형태로 얻어진다. 일반적으로, 펩티드 이합체화는 전형적으로 폴리펩티드의 번역 후 변성(PTM) 동안에, 재조합 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 일어나는 자연 과정이다.
상기 재조합 제조 기술은, 이전에 제시된 바와 같이(SEQ ID NO:3에 제시된 폴리펩티드를 포함), 셀렉틴, 특히 P-셀렉틴에 대한 결합 친화력을 나타내는 어떤 활성 서열 아미노산을 바람직하게는 이합체 형태로 포함하는, 본 발명에 따르는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 방법은 단일 리신 아미노산을(바람직하게는 말단 위치, 특히 C-말단 위치에) 함유하고, 상기 예시된 활성 서열 중 어떤 것을 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
미세소포와 회합된 바람직한 이합체 형태를 제공하기 위해, 폴리펩티드는 대응하는 폴리펩티드 서열에서 하나 이상의 각 시스테인 잔기에 결합되는 하나 이상의 시스테인 잔기를 그것의 서열에 바람직하게 포함해서, 2개의 서열 사이에 적어도 1개(바람직하게는 적어도 2개)의 이황화 다리를 형성한다.
대안의 구체예에서, 미세소포와 회합된 폴리펩티드는 단량체 형태로 사용될 수 있다. 상기 단량체 형태는 단량체 형태의 직접 제조 또는 이합체 폴리펩티드에서 이황화 결합의 환원에 의한, 종래의 과정에 따라 얻어질 수 있다. 예를 들어, 표적 리간드의 적합한 단량체 형태는, 예를 들어 SEQ ID NO:3로서 제시된 서열인, 이합체 형태의 시스테인 잔기의 이황화 결합을 환원시킴으로써 얻어질 수 있다. 이황화 결합 환원은 종래의 기술에 따르는, 예를 들어 TCEP와 같은 적합한 환원제의 존재하에 이합체 형태의 현탁액을 배양시킴으로써 수행될 수 있다. 이황화 결합의 환원은 미세소포의 성분(예를 들어, PE-PEG-말레이미드)의 대응하는 부분에 후속 결합하기 위해, 리간드에서 적합한 반응성기(-SH)를 제공하는 추가 이점을 가져, 폴리펩티드에서 (티올화)반응성기를 도입할 필요가 없다.
본 발명의 구체예에서, 폴리펩티드는 링커를 통해 기체-충전 미세소포의 성분에 결합될 수 있다. 적합한 링커는 바람직하게는 백본 쇄에서 반복하는 옥시에틸렌 단위를 전형적으로 함유하는 친수성 잔기이다.
구체예에 따르면, 링커는 식 (III)의 하기 부분이며:
-X-(CH2)f-[O-(CH2)g]h-[O-(CH2)j]k-Y- (III)
여기서
f, g, h 및 j는 독립적으로 1 내지 4의 정수를 나타내고, k는 0 내지 4의 정수를 나타내고, X 및 Y는 각각 한 단부에서는 폴리펩티드에, 그리고 다른 단부에서는 미세소포의 성분에 링커를 결합시키기 위한 각 반응성 부분을 나타낸다.
링커는, 한 면에서 미세소포의 성분의 대응하는 보완적인 반응성 부분에, 그리고 다른 면에서 폴리펩티드의 대응하는 보완적인 반응성 부분에, 예를 들어 식 (I)의 폴리펩티드의 Y 잔기에 공유 결합하기 위해, 그것의 각 단부에서 적합한 반응성 부분을 포함한다.
상기 반응성 부분의 예는 아미노기(-NH2, -NH- 결합 잔기를 형성), 카르복실기(-COOH, -CO- 결합 잔기를 형성) 또는 티올기(-SH, -S- 결합 잔기를 형성)를 포함한다. 바람직하게는 상기 결합 부분은 아미노기 또는 카르복실기이다.
식 (III)의 링커의 바람직한 예는:
-CO-CH2-[O-(CH2)2]2-NH- (Adoa)
-CO-CH2-[O-(CH2)2]2-CO- (Tuda)
-NH-CH2-(CH2-O-CH2)3-CH2-NH- (Ttda)
-CO-CH2-[O-(CH2)2]2-CO-NH-CH2-(CH2-O-CH2)3-CH2-NH- (Ddhh)이다.
바람직하게는, 상기 링커는 상기 식에 의해 정의된 2개의 동일한 또는 다른 부분에 의해 형성된다.
조합된 링커의 예는:
-Adoa-Adoa- 또는 -Ddhh-(Ttda- 및 Tuda- 링커도 포함)이다.
적합한 반응성 결합 부분을 함유하는 다당류는 적합한 링커의 추가 예이다.
SEQ ID NO:1을 포함하는 서열, 또는 그것의 활성 단편, 및 원하는 링커는 종래의 펩티드 합성 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 예시된 바와 같이, 폴리펩티드는, 예를 들어 공유 결합, 친화 결합 쌍의 비공유 상호작용(예를 들어, 한 면의 아비딘 또는 스트렙타비딘과 다른 면의 비오틴 사이의 상호작용), 정전기 상호작용(예를 들어, 이온성 또는 수소 결합) 또는 소수성 상호작용(예를 들어, 친유성 탄화수소 쇄들 사이)을 포함하는 본 분야에 알려진 과정 중 어떤 것에 따르는 미세소포와 회합될 수 있다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 기체-충전 미세소포의 각 성분에 공유 결합된다.
예를 들어, 폴리펩티드가 반응성 아미노기(예를 들어, 리신의 1차 아미노기)를 포함한다면, 그것을 적합한 대응 반응성 부분, 예컨대 이소티오시아네이트기(티오우레아 결합을 형성), 반응성 에스테르(아미드 결합을 형성), 또는 알데히드기(알킬아민 결합으로 환원될 수 있는 이민 결합을 형성)를 함유하는 미세소포의 성분과 반응시킬 수 있다.
대안으로, 표적 리간드가 반응성 티올기를 포함할 때, 미세소포의 성분에서 적합한 보완적인 반응성 부분은 할로아세틸 유도체, 말레이미드(티오에테르 결합을 형성), 또는 2-피리딜티오(PDT)기의 형성(표적 리간드로부터 유도된 티올과의 반응에서, 안정한 이황화 결합의 형성을 가져옴)에서 황화물을 포함하는 혼합된 이황화를 포함할 수 있다.
대안으로, 본 발명의 구체예에 따르면, 아미노 반응성 부분(예를 들어, 2차 아미노기, 특히 말단 -NH2기)을 함유하는 표적 리간드를 황-함유 화합물과 먼저 반응하여, 표적 리간드에서 반응성 티올 부분을 도입시킨 다음, 상기 예시된 미세소포의 성분에서 대응하는 보완적인 부분과 반응시킬 수 있다. 반응성 아미노 부분을 함유하는 표적 리간드에서 반응성 티올 부분을 도입시키기에 유용한, 적합한 황-함유 화합물의 예는, 예를 들어: 티오이미데이트(예컨대, 트라우트 시약) N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트(SATP) 또는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)를 포함한다. S-함유 물질 및 각 티올화 반응의 구체적인 설명은, 예를 들어 Greg T. Hermanson: "Bioconjugate Techniques", Elsevier ed., 2nded.(Apr. 2008), 1장, 섹션 4-1에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 한가지는 말레이미드-유도화 인지질(예를 들어, 포스파티딜에탄올아민-PE - 또는 페길화 PE)를 제조하고, 2차 아미노기(예를 들어, 말단 리신의 -NH2)가 황-함유 화합물(예컨대, 이전에 예시된 것들)과 이전에 반응한 표적 리간드(예를 들어, SEQ ID NO:3)와 그것을 반응시켜, 반응성 티올 부분을 도입시킬 수 있으며; 그 다음 얻어진 화합물을 표적화 기체-충전 미세소포의 제조에서 사용할 수 있다.
추가 대안에 따르면, 표적 리간드가 반응성 카르복실기를 포함할 때, 미세소포의 성분에서 적합한 반응성 부분은 아민 및 히드라지드(아미드 또는 N-아실, N'-알킬히드라지드 관능을 형성)일 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 아미노 반응성 부분을(예를 들어, 리신 잔기에) 함유하는 표적 리간드는 말레이미드-함유 화합물과 먼저 반응하여, 표적 리간드에서 반응성 말레이미드 부분을 도입시킨 다음, 미세소포의 성분에서 대응하는 보완적인 부분과 반응시킨다. 반응성 아미노 부분을 함유하는 표적 리간드에서 반응성 말레이미드 부분을 도입시키는데 유용한 말레이미드-함유 물질, 그리고 말레이미드기의 부가의 각 반응은 본 분야에 잘 알려져 있다. 적합한 말레이미드-함유 화합물의 예는, 예를 들어: AMAS(N-(α-말레이미도아세톡시)숙신이미드 에스테르), BMPS(N-(β-말레이미도프로폭실)숙신이미드 에스테르), EMCS(N-(ε-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드 에스테르), GMBS(N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르), LC-SMCC(숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트)), MBS(m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), SMCC(숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트), SMPB(숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), SM(PEG)n 시약(숙신이미딜-(N-말레이미도프로피온아미도)-에틸렌글리콜) 에스테르), SMPH(숙신이미딜-6-((β-말레이미도프로피온아미도) 헥사노에이트)), Sulfo-EMCS(N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드 에스테르), Sulfo-GMBS(N-(γ-말레이미도부티로일옥시)술포숙신이미드 에스테르), Sulfo-KMUS(N-(κ-말레이미도운데카노일옥시)-술포숙신이미드 에스테르), Sulfo-MBS(m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포-숙신이미드 에스테르), Sulfo-SMCC(술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트), Sulfo-SMPB(술포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐(부티레이트))를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 한가지는 티올-함유 인지질(예를 들어, 티올화 포스파티딜에탄올아민-PE - 또는 페길화 PE)을, 2차 아미노기(예를 들어, 말단 리신의 -NH2)가 말레이미드-함유 화합물(이전에 예시된 것들과 같음)과 이전에 반응한 표적 리간드(예를 들어, SEQ ID NO:3)와 반응시켜, 거기에 반응성 말레이미드 부분을 도입시킬 수 있고; 그 다음 얻어진 화합물은 미세소포의 제조에 사용될 수 있다. 티올-함유 인지질은, 예를 들어 인지질에 부착된 2-피리딜디티오(PDT)기를 환원제(예컨대, TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염)와 반응시킴으로써 얻어져, 인지질에 반응성 티올 부분을 발생시킬 수 있다. 티올-함유 인지질의 예는 나트륨 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티오에탄올(Avanti Polar Lipids로부터, IUPAC: 나트륨 (R)-2,3-비스(팔미토일옥시)프로필(2-메르캅토에틸)포스포네이트), 또는 각 피리딜티오-전구체의 화학적 환원에 의해 얻을 수 있는 것들, 예컨대: 나트륨 (R)-2,3-비스(팔미토일옥시)프로필(2-(3-메르캅토프로판아미도)에틸) 포스페이트(나트륨 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트]로부터, Avanti Polar Lipids), 나트륨 (R)-2,3-비스(올레오일옥시)프로필(2-(3-메르캅토프로판아미도)에틸) 포스페이트(나트륨 1,2-디올레오일-sn -글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트]로부터, Avanti Polar Lipids) 또는 암모늄 (R)-2,3-비스(스테아로일옥시)프로필(2-(((2-(3-메르캅토프로판아미도) 폴리에틸렌 글리콜 2000)카르보닐)아미노)에틸) 포스페이트(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[PDP(폴리에틸렌 글리콜)-2000]으로부터, Avanti Polar Lipids)를 포함한다.
대안의 구체예에서, 비오틴 잔기는 폴리펩티드에 도입될 수 있고(예를 들어, 히드로숙신이미도비오틴을 펩티드의 C-말단과 반응함으로써), 그 다음 비오틴화 펩티드를 스트렙타비딘-지니는(또는 아비딘-, 누트라비딘- 또는 엑스트라비딘-지니는) 성분, 예컨대 스트렙타비딘(또는 아비딘, 누트라비딘 또는 엑스트라비딘) 잔기를 함유하는 페길화 인지질을 포함하는 미세소포와 반응시킨다.
표적화 기체-충전 미세소포
본 발명에 따른 조성물의 표적화 미세소포는, 상기 언급된 특허 문헌에 예시된 바와 같이, 본 분야에서 어떤 알려진 방법에 따라 생성될 수 있다.
예를 들어, 미세기포의 제조 방법은 상기 나타낸 양친매성 재료를 포함하는 건조된 분말 재료의 제조를, 바람직하게는 상기 재료를 포함하는 수성 및/또는 유기 현탁액/에멀션의 동결 건조(냉동 건조)에 의해 포함할 수 있다. 그 다음, 기체-충전 미세소포의 "전구체"로서 본 명세서 및 청구범위에서 확인된, 상기 건조된 분말 재료를 원하는 기체의 존재하에 생리적으로 허용가능한 용액과 접촉시켜, 혼합물의 교반시에 기체-충전 미세소포의 원하는 현탁액을 형성한다.
WO 91/15244호에 기술된 제조 방법에 따르면, 필름-형성 양친매성 화합물은 리포솜의 형성을 위해 사용된 어떤 방법에 의해 라멜라(lamellar) 형태로 먼저 전환될 수 있다. 이것을 위하여, 필름 형성 지질 및 선택적으로 다른 첨가제(예를 들어, 점도 향상제, 비필름 형성 계면활성제, 전해질 등)를 포함하는 수용액은 고속 기계적 균질화 또는 음파 또는 초음파 하에서 초음파 처리를 받은 다음 동결 건조되어, 자유 유동성 분말을 형성시킨 다음, 기체의 존재하에 저장될 수 있다. 예를 들어, 미국 제5,597,549호에 개시된 바와 같이, 선택적인 세척 단계가 동결 건조 전에 수행될 수 있다.
대안의 구체예(예를 들어, 미국 제5,597,549호에 기술됨)에 따르면, 필름 형성 화합물 및 친수성 안정제(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 글리콜산, 말산 또는 말톨)를 유기 용매(예를 들어, 3차 부탄올, 2-메틸-2-부탄올 또는 C2Cl4F2)에 용해시킬 수 있고, 용액은 동결-건조되어 건조 분말을 형성할 수 있다.
바람직하게는, 예를 들어 국제 특허 출원 WO 2004/069284호에 개시된 바와 같이, 인지질(상기 언급되고, 적어도 하나의 상기-정의된 하전된 인지질을 포함하는 것들 중에 선택됨) 및 동결방지제(예컨대, 이전에 열거된 것들, 특히 탄수화물, 당 알콜, 폴리글리콜, 폴리옥시알킬렌 글리콜 및 그것들의 혼합물)를, 물 비혼합 유기 용매(예를 들어, 분기된 또는 선형 알칸, 알켄, 시클로-알칸, 방향족 탄화수소, 알킬 에테르, 케톤, 할로겐화 탄화수소, 과불화 탄화수소 또는 그것들의 혼합물)를 갖는 물의 에멀션에서 교반하에 분산시킬 수 있다. 에멀션은 본 분야에 알려진 어떤 적당한 에멀션-발생 기술로 적어도 하나의 인지질의 존재하에 수성 매질 및 용매를 받음으로써 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 인지질은 이 마지막이 유기 용매로 혼합되기 전에 수성매질에 분산된다. 대안으로, 인지질을 유기 용매에 분산시키거나 또는, 유화 단계 전에 또는 동안에, 그것을 수성-유기 혼합물에 별도로 첨가할 수 있다. 그 다음, 인지질 재료에 의해(및 선택적으로 다른 양친매성 필름-형성 화합물 및/또는 첨가제에 의해) 둘러싸이고 안정화된 용매의 미세점적을 함유한, 그렇게 얻어진 미세에멀션은 종래의 기술에 따라 동결건조되어, 저장되고(예를 들어, 적합한 기체의 존재하에 바이알에) 수성 담체로 재구성될 수 있는 동결건조된 재료를 얻어서, 최종적으로 미세기포의 치수 및 크기 분포가 미세점적의 현탁액의 치수 및 크기 분포와 실질적으로 비교가능한 기체-충전 미세기포 현탁액을 얻는다.
기체-충전 미세기포를 제조하기 위한 추가 과정은 원하는 기체의 존재하에 제어된 높은 교반 에너지(예를 들어, 회전자 고정자 혼합기 또는 초음파 처리에 의함)로 인지질(및 선택적으로 다른 양친매성 필름-형성 화합물 및/또는 첨가제)을 포함하는 수성 매질을 받음으로써 기체 미세기포 분산물을 발생시키는 단계, 및 이런 이유로 얻어진 혼합물을 사용하는 단계 또는 얻어진 분산물을 동결 건조하여 건조된 재구성가능한 생성물을 얻는 단계를 포함한다. 이 과정의 예는, 예를 들어 WO 97/29782호에 주어지고, 본원에 참고자료로 포함된다.
분무 건조 기술(예를 들어, 미국 제5,605,673호에 기술한 바와 같음)은 기체-충전 미세기포를 얻는 생리적 수성 담체와 접촉하여 재구성가능한, 건조된 분말을 얻는데 또한 사용될 수 있다.
상기 기술 중 어떤 것으로 얻어진, 건조된 또는 동결건조된 형태의 전구체는 일반적으로 분말 또는 케이크의 형태일 것이고, 원하는 기체와 접촉하여 저장(예를 들어, 바이알에)될 수 있다. 전구체는 원하는 기체의 존재하에, 전형적으로 주사가능한, 적합한 생리적으로 허용가능한 수성 액체 담체에 쉽게 재구성가능하여, 현탁액의 약한 교반시에 기체-충전 미세기포를 형성한다. 적합한 생리적으로 허용가능한 액체 담체는 멸균수, 수용액, 예컨대 식염수(주사를 위한 최종 생성물이 저긴장성이지 않도록 이롭게 균형잡혀질 수 있음), 또는 하나 이상의 긴장성 조정 물질, 예컨대 염 또는 당, 당 알콜, 글리콜 또는 다른 비이온성 폴리올 재료(예를 들어, 글루코스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)의 용액이다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 구조물(즉, 미세소포의 성분에 결합된 표적 리간드를 포함)은 이런 이유로 조제물의 다른 성분과 혼합될 수 있어서, 상기 제조 방법 중 어떤 것에 따라 얻어진 동결-건조 재료의 재구성에서 안정화 엔벨로프로 혼합될 수 있다.
대안으로, 미세기포의 처음 조제물은 적합하게 중간 관능화 성분(예를 들어, 말레이미드-함유 포스파티딜에탄올아민)을 함유하여, 상기 중간체를 함유하는 동결-건조 재료를 생성할 수 있고; 그 다음, 적합한 보완적인 반응성 부분(예를 들어, 티올)을 함유하는 표적 리간드는 각 반응성 부분을 반응시킴으로써, 재구성된 미세기포의 엔벨로프에 이미 혼합된 중간체 관능화 화합물에 연결된다.
WO 2004/069284호에 개시된 과정의 경우에, 미세소포의 성분에 결합된 표적 리간드를 포함하는 표적 구조물은 또한 처음 혼합물의 성분과 혼합되어, 에멀션 및 동결 건조 단계를 당할 수 있다. 대안으로, 표적 구조물을 함유하는 미셸 현탁액은 별도로 제조되고, 후속으로 이미 형성된 에멀션(다른 필름-형성 성분을 함유)에, 바람직하게는 가열하에서 첨가할 수 있다. 상기와 같이, 형성된 구조물 대신에, 관능화 중간체는 대안으로 사용될 수 있고, 그 다음, 과정 중 어떤 단계에서(예를 들어, 에멀션 상 또는 동결건조된 화합물의 재구성에서) 보완적인 반응성 부분을 함유하는 표적 리간드와 반응할 수 있다. 구체예에 따르면, 관능화 엔벨로프-형성 성분(또는 엔벨로프-형성/스페이서 중간 구조물)을 미셸 현탁액으로서 교반하에 형성된 에멀션에 첨가한다. 그 다음 표적 리간드(보완적인 반응성 부분을 함유)를 얻어진 에멀션에 첨가한다.
바람직한 구체예에 따르면, SEQ ID NO:3에 제시된 펩티드 서열은 이합체 형태로 먼저 티올화제(예를 들어, 이전에 예시된 것들 중에서 선택됨)와 반응시켜, C-말단 리신 잔기의 1차 아미노기에 반응성 티올기를 도입시킨다. 티올화제는 리신 잔기에 대하여, 바람직하게는 약 5배 내지 200배 몰 과량, 더 바람직하게는 20배 내지 100배, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 약 50배의 몰 과량으로 바람직하게 사용된다. 그 다음 티올화 펩티드를 기체-충전 미세소포의 말레이미드-함유 성분(예를 들어, 말레이미드-변성 페길화 인지질, 예컨대 DSPE-PEG-말레이미드)의 현탁액에 첨가한다. 그 다음 혼합물을 배양하고 얻어진 구조물(SEQ ID NO:3 및 미세소포의 성분을 포함)은, 상기 예시된 바와 같이, 기체-충전 미세소포의 후속 제조 단계를 위해 사용될 수 있다.
미세소포의 표면에 결합된 표적 리간드의 양은 다원자가 미세소포, 즉 복수의 표적 리간드를 그것의 표면에 포함하는 미세소포를 바람직하게 제공하기 위해 선택된다. 일반적으로, 미세소포는 미세소포 표면의 ㎛2당 적어도 200개의 표적 분자, 바람직하게는 적어도 500개의 분자/㎛2, 더 바람직하게는 적어도 1000개의 분자/㎛2, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 2000개의 분자/㎛2를 포함한다. 한편, 미세소포의 표면에 너무 높은 농도의 표적 리간드는 불필요하기 때문에, 미세소포는 미세소포 표면의 ㎛2당 15000개 미만의 표적 분자, 바람직하게는 12000개 미만의 분자/㎛2, 더 바람직하게는 10000개 미만의 분자/㎛2, 및 훨씬 더 바람직하게는 8000개 미만의 분자/㎛2를 일반적으로 포함한다.
미세소포의 표면에 결합된 표적 리간드의 양은 본 분야에 알려진 공통 기술에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 미세소포 현탁액에서 미세소포의 엔벨로프의 총 표면은, 예를 들어 Coulter Counter 측정에 의해 먼저 결정될 수 있다. 그 다음, 미세소포 현탁액에서 표적 리간드의 분자의 총량은, 예를 들어 표적 리간드의 화학적 마커(예를 들어, 시알산 또는 특정 아미노산)의 총량을 측정함으로써, 예를 들어 액체-크로마토그래피 질량분석기(LC-MS)에 의해 결정될 수 있다. 그 다음 미세소포 표면에서 표적 리간드의 밀도는 쉽게 계산될 수 있다.
표적 미세소포의 이용
본 발명의 표적화 기체-충전 미세소포는 상기 확인된 표적 리간드에 결합할 수 있는 수용체, 예컨대 셀렉틴 수용체, 바람직하게는 E-셀렉틴 및/또는 P-셀렉틴 수용체, 더 바람직하게는 P-셀렉틴 수용체를 발현하는 조직 또는 세포의 검출을 요하는 어떤 시험관 내 또는 생체 내 분석에 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 미세소포는, 염증 과정(예를 들어, 급성 관동맥 증후군, 신생혈관생성, 류마티스 관절염, 크론병, 등)과 특별히 연결하는 혈관 내피의, 더 일반적으로는 P-셀렉틴 및/또는 E-셀렉틴을 발현하는 어떤 기관 또는 조직의 가능한 병적 상태를 검출하기 위한 진단 방법에 유용하다. 더욱이, 본 발명에 따른 미세소포는 염증 질환 또는 병리소견을 겪는 환자의 (치료적)처치 동안에 효율적인 진단 도구로서 사용될 수 있는데, 여기서 "동안"은 치료의 시작 전, 상기 치료의 과정 및/또는 상기 치료의 종료의 어떤 시간을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 미세소포는 항염증 치료(예를 들어, 상기 언급된 질환 또는 병리소견 중의 어떤 것)의 관찰 및/또는 후속조치에 이롭게 사용되어, 예를 들어 질환 또는 병리소견에서 항염증 또는 염증-억제제 약물의 투여의 효과를 결정하거나 또는 평가할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 치료 동안에 환자의 관심 영역은 본 발명의 미세소포의 투여로 초음파 이미지화를 받고, 예를 들어 규칙적인 시간 간격에서, 각각의 약물 투여 또는 치료적 중재 후 및/또는 선택된 횟수의 약물 투여 또는 치료 후 정해진 시간 간격에서; 그 다음 관심 영역의 최종 이미지화가 바람직하게는 치료의 종료 또는 결말에 수행된다.
본 발명의 기체-충전 미세소포를 치료-관련 이미지화 방법에 더 사용할 수 있으며, 상기 치료-관련 이미지화는 환자에게, 콘트라스트 이미지화제(예를 들어, 치료 화합물을 선택된 수용체 또는 조직에 전달하기 위함)의 사용을 포함하고, 시험관 내 및/또는 생체 내의 생물학적 효과를 행사할 수 있거나 또는 행사하는데 책임이 있는, 질환의 치료를 위한 방법을 포함한다. 치료-관련 이미지화는, 예를 들어 고음압에서 초음파(전형적으로 비파괴 진단 이미지화 방법에서 일반적으로 사용된 것보다 높음)에 의해 기체-충전 미세소포의 제어된 국부 파괴와 이롭게 관련될 수 있다. 이 제어된 파괴를, 예를 들어 선택적으로 조영제와 회합된 적합한 치료 화합물의 방출과 조합한, 혈액 응고의 치료(또한, 초음파 혈전용해로서 알려진 기술)를 위해 사용할 수 있다. 대안으로, 상기 치료-관련 이미지화는 미세소포의 활성화 또는 국부 파열에 의해 유도된 세포 수준에서 일시적인 막 투과화의 결과로서, 치료제의 세포로의 전달을 포함할 수 있다. 이 기술을, 예를 들어 유전 재료의 세포로의 효과적인 전달을 위해 사용할 수 있으며; 대안으로, 약물을 선택적으로 유전 재료와 조합하여 국부로 전달시켜, 따라서 환자에게 조합된 약학적/유전 요법(예를 들어, 종양 치료의 경우)을 허용할 수 있다. 치료제는 종래의 방법에 따르는 기체-충전 미세소포와 회합되거나, 또는 조성물의 별도 화합물로서 투여될 수 있다.
전형적으로, 조영제의 효과적인 양은 그것을 필요로 하는 환자에게 투여되고(예를 들어, 주사에 의함), 이미지화된 또는 치료된 환자의 신체 부분 또는 조직("관심 영역")은 원하는 이미지화 방법을 받는다. 바람직하게는, 조영제가 정맥주사로 투여된다. 용어 "환자"는, 진단/치료 목적 또는 실험 목적(예를 들어, 실험의 치료적 처치를 따르도록, 예를 들어 실험실 동물에게 조영제의 사용을 포함)을 위해, 조영제의 투여를 받는 어떤 대상(사람 또는 동물)을 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, 표적화 미세소포의 효과적인 양은 전형적으로 그것의 현탁액의 주사에 의해 환자에게 투여된다. 따라서 관심 영역의 이미지화는 관심 영역에서 수용체와 결합된 미세소포의 존재에 의해 향상될 것이다.
원하는 3차원 또는 4차원 이미지화 기술을 사용할 수 있다면; 다양한 이미지화 기술을, 예를 들어 기본 및 비선형(예를 들어, 조화) B-모드 이미지화, 펄스 또는 상 반전 이미지화, 그리고 기본 및 비선형 도플러 이미지화를 포함하는 초음파 용도에 사용할 수 있다. 더욱이, 매우 민감한 검출 방법인, 기체-충전 미세소포의 파괴를 수반하는 진단 기술(예를 들어, 고음압에서 초음파에 의함)이 또한 고려된다.
본 발명에 따른 미세소포를, 예를 들어 그것들의 각 조성물, 이미지화된 조직 또는 기관 및/또는 선택된 이미지화 기술에 의존하여, 환자의 kg당 약 0.01 내지 약 5.0 ㎕의 기체(미세소포 내로 포집됨)의 농도로 전형적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 신호를 매우 낮은 투여량에서, 예컨대 색상 도플러 또는 전력 펄스 반전에서 관찰할 수 있을 때, 이 일반적인 농도 범위는 특정 이미지화 용도에 의존하여 물론 다양할 수 있다. 가능한 다른 진단 이미지화 용도는 신티그래피, 광학 이미지화, 광-음파 이미지화, 자기 공명 이미지화 및 X-선 이미지화, 예컨대 X-선 상 콘트라스트 이미지화를 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 추가 예시하는데 도움을 줄 것이다.
실시예
하기 재료 및 약어를 하기 실시예에서 사용하였다.
DSPC 디스테아로일포스파티딜콜린(Genzyme)
팔미트산 팔미트산, 헥사데칸산(Fluka)
DSPE-PEG2000 PEG2000,나트륨염으로 변성된 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(Genzyme)
DSPE-PEG2000-mal PEG2000-말레이미드로 변성된 디스테아로일포스파티딜에탄올아민
(Avanti Polar Lipids)
DSPE-PEG2000-PDP 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 암모늄염
(Avanti Polar Lipids)
PDP 피리딜디티오프로피오닐
트라우트 시약 2-이미노티올란 염산염(Pierce)
SATA N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(Pierce)
Sulfo-SMCC (술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트)(Pierce)
히드록실아민.HCl 히드록실아민 염산염(Fluka)
EDTA.4Na 에틸렌디아민 테트라아세트산, 테트라 나트륨염(Fluka)
PEG4000 Clariant로부터의 폴리글리콜 4000S
시클로옥탄 Fluka
TCEP 트리스(2-카르복시에틸)-포스핀 염산염(Pierce)
rPSGL-Ig 미국 제2003/0166521호 실시예 1에 따라 얻어진, 글리코실화 SEQ ID NO:4
Lys-C 내부단백분해효소 Lys-C(Pierce, #90051)
Fr-1 rPSGL-Ig(SEQ ID NO:3)의 정제된 단편
실시예 1
Fr-1의 제조를 위한 rPSGL-Ig의 효소적 소화
200 ㎕의 소화 완충액(Tris.HCl 25 mM - EDTA 1 mM - pH 8.5) 중의 2 mg의 rPSGL-Ig를 Lys-C의 용액(40 ㎍이 50 ㎕의 증류수에 용해됨)이 첨가된 미세원심분리 튜브에 위치시켰다. 분말을 함유하는 바이알을 50 ㎕의 증류수로 헹구고, 미세원심분리 튜브에 첨가하였다. 그 다음, 혼합물을 37℃ Dry Block Heater에서 18시간 배양하였다.
실시예 2
음이온 교환 크로마토그래피에 의한 Fr-1의 분리
크로마토그래피 분리 컬럼(Bio-Rad로부터의 Econo-컬럼, Vt = 3.6 mL, 높이 9.4 cm)을 ANX Sepharose 겔(GE Healthcare)로 충전하고, 아세트산나트륨 0.05 M - NaCl 0.05 M(pH 4.0)를 함유하는 완충액으로 평형화하였다. 컬럼을 3-4 부피의 시작 완충액으로 가동하여, 겔을 고정시켰다. 유속은 약 0.23 mL/분이었다.
실시예 1에서 얻어진 소화된 단백질을 함유하는 290 ㎕의 현탁액을 440 ㎕의 아세트산염 0.05M - NaCl 0.05M - pH 4.0 완충액에 희석하였다. 이 혼합물을 컬럼에 적용시키고, 컬럼을 아세트산염 0.05M/NaCl 완충액 pH = 4.0으로 0.05 내지 1 M의 범위로 증가시킨 NaCl 농도에서 용리시켰다.
2 mL의 분획들을 용리 동안에 수집하였다. 각 분획의 단백질 함량을 OD(광학 밀도) 측정에 의해 280 nm(OD280)에서 평가하였고, 당 잔기의 존재를 레조르시놀 적정에 의해 측정하였다. Fr-1을 1 M NaCl 농도에서 용리한 분획들에서 회수하였다. Fr-1을 함유하는 분획들을 수집하고 후속 제조를 위해 사용하였다. Fr-1-함유 분획들의 순도를 SDS-PAGE 분석 및 LC-UV에 의해 평가하였다. Fr-1의 평균 분자량(약 32 킬로달톤)을 MALDI-ToF(매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 - 비행시간형)에 의해 측정하였다.
실시예 3
rPSGL-Ig의 티올화(비교예)
rPSGL-Ig 저장액의 분취량(789 ㎕ - 15.1 mg의 rPSGL-Ig - 188.75 nmole)을 200 ㎕의 PBE(인산 완충액 25 mM, 150 mM 식염수, 1 mM EDTA, pH 8)로 희석하였다.
트라우트 시약의 용액(2.76 mg/mL - 20 mM)을 PBE에 제조하고, 75 ㎕의 이 용액을 rPSGL-Ig 용액에 첨가하였다. 결과되는 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하에 배양하였다. 이 용액을 인산 완충액 20 mM pH 6으로 평형화된 스핀-컬럼(Zeba 스핀 컬럼 5 mL, Pierce, #89891)을 통해 회전시켰다. 용액의 최종 부피는 약 1.2 mL(티올화 rPSGL-Ig 농도: 약 111 nmole/mL)였다.
최종 용액 중의 rPSGL-Ig 함량을 UV 분광법에 의해 280 nm에서 측정하였다.
티올화 rPSGL-Ig를 티올기의 가능한 산화를 제한하도록 정제 후 즉시 사용하였다.
실시예 4
rPSGL-Ig 리간드로 미세소포의 제조(비교예)
DSPE-PEG-말레이미드(6.6 mg - 2.24 mole)를 45℃에서 인산 완충액 20 mM pH 6(0.5 mL)에 교반(소용돌이)하면서 용해시켜 맑은 용액을 얻었다. 그 다음 0.5 mL의 결과되는 용액을 59.5 mL의 PEG4000 10% 용액에 첨가하였다.
60 mg의 DSPC/팔미트산(80/20 몰비) 혼합물을 70℃에서 시클로옥탄(4.8 mL)에 용해시켰다.
상기 제조된 수성 및 유기 용액을 고속 균질기(Megatron MT3000)를 사용하여 5분(11500 rpm)동안 혼합하여 에멀션을 얻었다. 결과되는 에멀션을 60℃에서 1시간 동안 교반하에 가열시킨 다음, 실온(약 22℃)으로 냉각하였다. 에멀션을 폴리프로필렌 튜브(Falcon-15mL)에 10 mL 분획들로 나누었다.
실시예 3에 따라 제조된 티올화 rPSGL-Ig(15 nmole)를 10 mL의 에멀션에 첨가하고, 결과되는 혼합물을 22℃에서 2시간 30분 동안 교반하였다. 얻어진 에멀션을 최종적으로 10 mL의 10% PEG4000 용액으로 2회 희석하고 DIN4R 바이알에 샘플링하였다(바이알당 300 ㎕). 바이알을 -50℃에서 2시간 동안 동결(Christ Epsilon 동결건조기)시킨 다음, -25℃ 및 0.2 mbar에서 12시간 동안 동결-건조하였다. 그 다음 동결건조된 생성물을 퍼플루오로-n-부탄 및 공기(35/65 v/v)를 함유하는 분위기에 노출시키고, 바이알을 밀봉하였다.
생성물을 사용 전에 부피의 식염수(1 mL, 150 mM NaCl)에 약한 수동 진탕으로 분산시켰다.
실시예 5
Fr-1의 티올화
실시예 2의 건조된 Fr-1(17.1 nmole)을 160 ㎕의 PBE(인산 완충액 25 mM, 150 mM 식염수, 1 mM EDTA, pH 8)에 용해시켰다. SATA의 용액 10mg/mL를 무수 DMSO에 제조하고, 4 ㎕(SATA의 10당량)의 이 용액을 Fr-1 용액에 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 그 다음 용액을 PBE(150 ㎕)로 희석하였다. 이 용액을 PBE(스태커로서 50 ㎕의 PBE를 사용함)로 평형화된 스핀-컬럼(Zeba 스핀 컬럼 2 mL, Pierce, #89890)을 통해 회전시켰다. 용액의 최종 부피는 약 360 ㎕였다.
히드록실아민 염산염(0.696 g) 및 EDTA.테트라나트륨염(0.19 g)의 용액을 PBE(15 mL)에 제조하였다. 이 용액의 pH는 NaOH 10 N로 7.3으로 조정하고, 부피를 20 mL로 만들었다. 이 탈아세틸화 용액의 분취량(40 ㎕)을 Fr-1 용액(360 ㎕)에 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 2시간 동안 배양시켰다. 이 용액을 인산 완충액 20mM pH 6(스태커로서 50 ㎕의 PBE를 사용함)으로 평형화된 스핀-컬럼(Zeba 스핀 컬럼 2mL, Pierce, #89890)을 통해 회전시켰다. 용액의 최종 부피는 약 450 ㎕(티올화 Fr-1 농도: 약 33 nmole/mL)였다.
티올화 Fr-1을 티올기의 가능한 산화를 제한하도록 정제 후 즉시 사용하였다.
실시예 6
Fr-1으로 미세소포의 제조
DSPE-PEG-말레이미드(6.6 mg - 2.24 mole)를 45℃에서 인산 완충액 20 mM pH 6(0.5 mL)에 교반(소용돌이)하면서 용해시켜 맑은 용액을 얻었다. 그 다음 0.5 mL의 결과되는 용액을 59.5 mL의 PEG4000 10% 용액에 첨가하였다.
60 mg의 DSPC/팔미트산(80/20 몰비)의 혼합물을 70℃에서 시클로옥탄(4.8 mL)에 용해시켰다.
상기 제조된 수성 및 유기 용액을 고속 균질기(Megatron MT3000)를 사용하여 5분(11500 rpm)동안 혼합하여 에멀션을 얻었다. 결과되는 에멀션을 60℃에서 1시간 동안 교반하에 가열시킨 다음, 실온(약 22℃)에서 냉각시켰다. 에멀션을 PP 튜브(Falcon-15mL)에 10 mL 분획들로 나누었다.
Fr-1(실시예 5에 따라 제조됨, 13 nmole)을 10 mL의 에멀션에 첨가하고, 결과되는 혼합물을 22℃에서 2시간 30분 동안 약하게 교반하였다. 얻어진 에멀션을 최종적으로 10% PEG4000 용액으로 2회 희석하고 DIN4R 바이알에 샘플링하였다(바이알당 300 ㎕). 바이알을 -50℃에서 2시간 동안 동결(Christ Epsilon 동결건조기)시킨 다음, -25℃ 및 0.2 mbar에서 12시간 동안 동결-건조하였다. 그 다음 동결건조된 생성물을 퍼플루오로-n-부탄 및 공기(35/65 v/v)를 함유하는 분위기에 노출시키고, 바이알을 밀봉하였다.
생성물을 사용 전에 부피의 식염수(1 mL, 150 mM NaCl)에 약한 수동 진탕으로 분산시켰다.
실시예 7
TCEP로 Fr-1의 환원: 단량체 Fr-1
건조된 Fr-1(실시예 1 및 실시예 2에 따라 3 mg의 rPSGL-Ig로부터 단편화되고 정제됨)을 250 ㎕의 완충액(Tris/HCl 50 mM, 50 mM EDTA, pH 6.8)에 용해시켰다.
TCEP의 용액(2.86 mg/mL - 10 mM)을 동일한 완충액으로 제조하고, 28 ㎕의 이 용액을 단편 용액에 첨가하였다. 결과되는 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 교반하에 배양하였다. 100 ㎕의 완충액으로 희석한 후, 이 용액을 인산 완충액 20 mM pH 6으로 평형화된 스핀-컬럼(Zeba 스핀 컬럼 2 mL, Pierce)을 통해 회전시켰다. 용액의 최종 부피는 약 0.4 mL였다.
환원된 단량체 Fr-1을 얻고, 이 화합물을 정제 후 즉시 사용하였다(티올기의 가능한 재산화를 제한하기 위함).
실시예 8
단량체 Fr-1으로 미세소포의 제조(TCEP 환원 후)
미세소포를 실시예 6에 따라 제조하였으나, Fr-1 용액은 실시예 7에 따라 제조된 단량체 Fr-1(100 nmol)의 용액으로 교체한 차이점을 가졌다.
실시예 9
Fr1-SMCC의 제조
실시예 2의 Fr-1(76.5 nmole)을 500 ㎕의 완충액(인산 완충액 200 mM, 50 mM 식염수, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 용해시켰다. Sulfo-SMCC의 용액 55mg/mL를 무수 DMSO에 제조하고, 62 ㎕의 이 용액(Sulfo-SMCC의 100당량)을 Fr-1 용액에 첨가하였다. 용액을 실온에서 45분 동안 배양시켰다. 이 용액을 인산 완충액 20 mM pH 6으로 평형화된 스핀-컬럼(Zeba 스핀 컬럼 5mL, Pierce, #89890)을 통해 회전시켰다. 용액의 최종 부피는 약 660 ㎕였다.
실시예 10
DSPE-PEG-SH의 제조
DSPE-PEG2000-PDP(4.4 mg - 1473 nmole)를 40℃에서 400 ㎕의 인산 완충액(100mM pH 6)에 교반(소용돌이)하면서 용해시켜 맑은 용액을 얻었다. 완충액(125 ㎕) 중의 TCEP 25 mM 용액을 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 45분 동안 교반하면서 배양하였다.
용액의 샘플을 완충액에 용해시키고, 2-피리딘 티온의 부재를 확인하였다.
용액을 인산 완충액 20 mM pH 6으로 평형화된 스핀-컬럼(Zeba 스핀 컬럼 5 mL, Pierce, #89890)을 통해 회전하였다. 용액의 최종 부피는 약 620 ㎕였다.
실시예 11
DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC 콘주게이트의 제조
실시예 9에서 얻어진 630 ㎕의 Fr1-SMCC 용액(70 nmole)을 실시예 10에서 얻어진 470 ㎕의 DSPE-PEG-SH 용액(1050 nmole)에 첨가하였다. 용액을 실온에서 3시간 동안 교반(회전 휠)하면서 배양하였다.
그 다음 용액을 ANX Sepharose 겔(GE Healthcare)을 갖는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
정제된 Fr-1 콘주게이트를 함유하는 용액(2.6 mL)을 인산 완충액 20 mM pH 6으로 평형화된 스핀-컬럼(Zeba 스핀 컬럼 10 mL, Pierce, #89893)을 통해 회전시키고, 후속 제조를 위해 사용하였다.
실시예 12
DSPE -PEG- SH / Fr -1- SMCC 콘주게이트로 미세소포의 제조
10 mg의 DSPC 및 팔미트산(80/20 몰비) 혼합물을 70℃에서 시클로옥탄(0.8 mL)에 용해시켰다.
별도로, 실시예 11에 따라 제조된 DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC 콘주게이트 용액(0.75 mL - 20 nmole)을 9.25 mL의 PEG4000 10% 용액에 첨가하였다.
상기 제조된 유기 및 수용액을 고속 균질기(Polytron PT3000)를 사용하여 1분(8000 rpm) 동안 혼합하여 에멀션을 얻었다. 결과되는 에멀션을 60℃에서 1시간 동안 교반하면서 가열한 다음, 실온(약 22℃)에서 냉각시켰다.
얻어진 에멀션을 10% PEG4000 용액으로 2회 희석하고 DIN4R 바이알에 샘플링하였다(바이알당 300 ㎕). 바이알을 -50℃에서 2시간 동안 동결(Christ Epsilon 동결건조기)시킨 다음, -25℃ 및 0.2 mbar에서 12시간 동안 동결-건조하였다. 그 다음 동결건조된 생성물을 퍼플루오로-n-부탄 및 공기(35/65 v/v)를 함유하는 분위기에 노출시키고, 바이알을 밀봉하였다.
생성물은 부피의 식염수(1 mL, 150 mM NaCl)에 약한 수동 진탕으로 분산시켰다.
실시예 13
DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC 콘주게이트로 미세소포의 제조
10 mg의 DSPC 및 팔미트산(80/20 몰비) 혼합물을 70℃에서 증류수(10 mL)에 15분 동안 분산시킨 다음, 실온에서 냉각시키고; 그 다음 실시예 11에 따라 제조된 DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC 콘주게이트 용액(20 nmole)을 분산물에 교반하에 첨가하였다.
시클로옥탄(0.8 mL)을 얻어진 분산물과 함께 고속 균질기(Polytron PT3000)를 1분(8000 rpm) 동안 사용함으로써 혼합하였다. 결과되는 에멀션을 60℃에서 1시간 동안 교반하에 가열한 다음, 실온(약 22℃)에서 냉각시켰다.
에멀션을 20% PEG4000 용액으로 2회 희석하고 DIN4R 바이알에 샘플링하였다(바이알당 300 ㎕). 바이알을 -50℃에서 2시간 동안 동결(Christ Epsilon 동결건조기)시킨 다음, -25℃ 및 0.2 mbar에서 12시간 동안 동결-건조하였다. 그 다음 동결건조된 생성물을 퍼플루오로-n-부탄 및 공기(35/65 v/v)를 함유하는 분위기에 노출시키고, 바이알을 밀봉하였다.
생성물은 부피의 식염수(1 mL, 150 mM NaCl)에 약한 수동 진탕으로 분산시켰다.
실시예 14
rPSGL-Ig 리간드로 미세소포의 제조(비교예)
DSPE-PEG-mal(0.44 mg - 0.15 mole)을 45℃에서 인산 완충액 20 mM pH 6(0.1 mL)에 교반(소용돌이)하면서 용해시켜 맑은 용액을 얻었다. 실시예 3에 따라 제조된 티올화 rPSGL-Ig(16 nmole - 144 ㎕ - 0.8 nmole/mL 에멀션)를 용액에 첨가하고, 결과되는 혼합물을 22℃에서 2시간 30분 동안 교반하였다. 그 다음 0.25 mL의 용액을 19.75 mL의 PEG4000 10% 용액에 첨가하였다.
20 mg의 DSPC/팔미트산(80/20 몰비) 혼합물을 70℃에서 시클로옥탄(1.6 mL)에 용해시켰다.
상기 제조된 수성 및 유기 용액을 고속 균질기(Polytron PT3000)를 1분(11000 rpm) 동안 사용함으로써 용해시켜 에멀션을 얻었다. 결과되는 에멀션을 60℃에서 1시간 동안 교반하에 가열한 다음, 실온(약 22℃)에서 냉각시켰다.
얻어진 에멀션을 최종적으로 10% PEG4000 용액으로 2회 희석하고 DIN4R 바이알에 샘플링하였다(바이알당 300 ㎕). 바이알을 -50℃에서 2시간 동안 동결(Christ Epsilon 동결건조기)시킨 다음, -25℃ 및 0.2 mbar에서 12시간 동안 동결-건조하였다. 그 다음 동결건조된 생성물을 퍼플루오로-n-부탄 및 공기(35/65 v/v)를 함유하는 분위기에 노출시키고, 바이알을 밀봉하였다.
실시예 15
Fr-1으로 미세소포의 제조
미세소포를 실시예 14에 따라 제조하였으나, 티올화 rPSGL-Ig는 티올화 Fr-1(25 nmole, 실시예 5에 따라 제조됨)으로 교체된 것을 제외하였다.
실시예 16
리간드-함유 미세소포의 분산 후 물리-화학적 특성
정맥 주사를 위해 준비된 등장성 미세소포 현탁액을 얻기 위해, 비교예 14에서 얻어진 동결-건조 생성물을 부피의 식염수(1 mL, 150 mM NaCl)에 약한 진탕에 의해 분산시켰다. 미세소포 현탁액은 현탁액의 제조 후 즉시(시간 = 0분), 그리고 제조 후 30분(시간 = 30분)에 크기 분석을 받았다. 미세소포의 크기 분포 및 농도를 30 ㎛ 애퍼처(aperture) 튜브가 장착된 MultisizerTM 3 Coulter Counter®(희석: 100 mL의 NaCl 0.9% 용액 중의 50 ㎕의 미세소포 현탁액 - 분석 부피: 100 ㎕)로 측정하였다. 제조는 평균 직경을 숫자로 그리고 중앙 직경을 미세소포의 부피로(㎛로의 Dn 및 Dv50) 측정하기 위해 특징지어졌고, 그뿐만 아니라 그것들의 농도를 숫자로 얻었다.
유사하게, 또한 실시예 15에서 얻어진 동결-건조 생성물을 동일한 부피의 식염수로 분산시키고, 현탁액에서 미세소포의 크기 및 분포를 상기 나타낸 바와 같이 측정하였다(시간 = 0 또는 30분).
결과를 하기 표 2에 제공한다.
미세소포 현탁액의 물리-화학적 특성
실시예 시간 [분] 직경
Dv50 [㎛]		 직경
Dn [㎛]		 미세소포 농도
[× 108 /mL]
14(비교예) 0 3.0 1.5 11.5
14(비교예) 30 2.5 1.3 18.3
15 0 2.7 1.3 16.8
15 30 2.6 1.3 15.8
상기 결과로부터 추론할 수 있는 바와 같이, rPSGL-Ig 리간드를 갖는 미세소포는 식염수에 분산 후 응집되었고, 점차 시간이 지남에 따라 분해하여, 주사가능한 형태로는 바람직하지 않았다. 반면, Fr-1 함유 미세소포에 대한 크기, 분포 및 소포 수는 분산 후 T = 0분 및 T= 30분에서 비교할 때 실질적으로 일정했다.
실시예 17
0.9% NaCl에서 재구성 후 미세소포 현탁액의 이미지 분석
실시예 14 및 실시예 15에 따라 얻어진 미세소포 현탁액을 0.9% NaCl에 1/10 희석하고, 10 ㎕의 분취량을 Neubauer 계수 세포(Blaubrand®, Brand GmbH)에 도입하여, 광학 현미경(Leica Cambridge Ltd, 20x 대물 렌즈가 장착됨)하에서 미세소포 이미지를 얻었다. Neubauer 세포의 상부에 덮게 슬립을 올리도록 미세소포를 허용하고(2분 내지 3분), 초점을 맞춘 후, 이미지를 디지털 카메라로 얻었다. 그 다음 이미지를 수학적 프로세서로 분석하여, 이미지에서 완전한 원형 형태는 단일 미응집된 미세소포에 해당하는 한편, 미세소포의 응집은 검출되지 않은 비원형 형태를 생성한다는 가정을 근거로, 미결합된 미세소포의 양을 결정하였다. 흑백 이미지에서 "완전한 원형 형태"를 검출하기 위해, 원형 허프 변환을 Matlab(The Mathworks Inc., Natick, MA)에서 실행하였다. 프로그램은 검출된 원형 형태의 중심 위치 및 반경을 출력한다. 하기 결과(표 3)가 관찰되었다.
허프 변환 대상 검출에 의한 이미지 분석
미응집된 미세소포의 수
제조 바이알 #1 바이알 #2 바이알 #3
실시예 14 157 131 172
실시예 15 332 354 352
표 3의 결과로부터 추론할 수 있는 바와 같이, Fr-1 단편을 함유하는 미세소포는 전체 단백질 rPSGL-Ig를 함유하는 미세소포보다 훨씬 적게 응집하기 쉽다.
실시예 18
표적화 미세소포의 시험관 내 결합 활성
효과적인 결합을 시험하기 위해, 비교예 4에 따라 제조된 표적화 미세소포를 마우스 Fc P-셀렉틴(CD62P-Fc Chimera, R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)로부터)의 코팅을 포함하는 흐름 챔버 설정에 주입하였다. 미세소포(80 × 106의 당량수/400 ㎕ TBS++에서)를 흐름 챔버(FCS2, Bioptech, USA)를 통해 볼러스 방식으로 주입하고, 마우스 P-셀렉틴 코팅층에 그것들의 부착을, PBS 중의 50% 사람 혈장(v:v, Biomeda, 시트르산염에서 수집됨, 참고자료 ES1020P, Stehelin & Cie AG)의 존재하에 1.0 mL/분(714 s-1의 전단 속도)의 유속에서 10분의 기간에 걸쳐 평가하였다. 미세소포 축적물의 정량 분석을 이미지 처리 프로그램 Analysis FIVE(SIS, Germany)를 사용하여 총 10분의 투입에 걸쳐 2분 간격으로 관찰된 영역에서 부착한 미세소포의 수를 계수함으로써 수행하였다. 10분 후, 5개의 사진을 임의로 선택하고, 결합된 미세소포의 수를 측정하고, 10분에 결합된 기포의 수(NBB)로서 표현하였다. 각각의 관찰된 영역은 현미경용 미크로미터의 도움으로 측정하여, 183 × 137 ㎛였다. 측정은 챔버의 가운데와 출구 사이에서 수행하였다.
유사하게, 실시예 6(Fr-1 표적 리간드) 및 실시예 8(단량체 FR-1)에 따라 제조된 표적화 미세소포의 현탁액을 상기 기술된 바와 같이 흐름 챔버에 주입하고, 그것들의 결합 활성은 상기 과정에 따라 측정하였다.
표 4는 3개의 시험 결과를 나타낸다.
10분에 결합된 미세소포의 수(NBM 10분)
제조 NBM 10분
실시예 4 75 ± 8
실시예 6 98 ± 7
실시예 8 88 ± 9
상기 결과로부터 추론할 수 있는 바와 같이, Fr-1을 함유하는 미세소포의 결합 활성은 단량체 Fr-1 또는 완전 단백질 rPSGL-Ig를 함유하는 미세소포의 대응하는 제조에 비하여 더 높다.
실시예 19
이합체 및 단량체 Fr-1과 미세소포의 생체 내 성능
실시예 6 및 8에 따라 제조된 미세소포를 염증성 래트 모델에서 비교하였다. 염증을 뒷다리에서 지질다당류(LPS, 026:B6 Sigma L-8274, 2.1 mg/kg)의 근육 내 주사에 의해 유도하였다. 표적화 미세소포의 효과적인 결합을 염증 과정의 유도 24시간 후 초음파 이미지화에 의해 평가하였다. 초음파 이미지화를 15L8 선형 변환기(송신 주파수, 7 MHz; 음량 범위, 83 dB; 깊이, 20 mm; 시간-이득 보상(TGC): 선형)가 장착된 Siemens Sequoia 512 스캐너(Siemens Medical Systems, Issaquah, WA)를 사용하여 수행하였다. 실시예 6 및 실시예 8로부터 얻어진 미세소포의 단일 투여 주사 10분 후, 미세소포 결합의 정량 분석을 관심 영역(AOI) 내의 콘트라스트 에코-파워 진폭을 정량하도록 설계된 사내에서 개발된 정량화 소프트웨어(Bracco Suisse SA, Geneva, Switzerland)를 사용하여 수행하였다. 저장된 프레임의 AOI의 콘트라스트 향상은, 선택된 AOI의 미세소포의 수에 비례하는, 상대 에코 파워 값(rms2)으로써 표현되었다. 결과를 표 5에 나타낸다.
염증이 생긴 래트 근육의 에코 파워
제조 에코 파워 10분(rms2)
실시예 6 43 ± 18
실시예 8 18 ± 10
상기 표로부터 추론할 수 있는 바와 같이, 실시예 6의 미세소포(이합체 Fr-1을 가짐)는 실시예 8의 미세소포(단량체 Fr-1을 가짐)에 비하여 더 높은 생체 내 결합을 가져온다.
실시예 20
Fr-1 미세소포의 항염증 요법의 효과 관찰
실시예 6에 따라 제조된 미세소포를 염증성 래트 모델에 투여하였다. 염증을 뒷다리에서 지질다당류(LPS, 026:B6 Sigma L-8274, 2.1 mg/kg)의 근육 내 주사에 의해 유도하였다. 항염증 치료 효능의 관찰을, 에타너셉트(etanercept)(0.45 mg/kg, Wyeth) 또는 식염수의 피하 주사로, LPS 투여 24시간 전에 사전 처리 동물에 의해 수행하였다. Fr-1 미세소포의 생체 내 결합 활성을 실시예 19에 기술된 이미지화 프로토콜에 따라 측정하였다. TNFα 활성을 방지하도록 에타너셉트의 투여에 의해 달성된 알려진 염증의 억제(Campbell,S.J., Jiang,Y., Davis,A.E., Farrands,R., Holbrook,J., Leppert,D., 및 Anthony,D.C.(2007), Immunodulatory effects of etanercept in a model of brain injury act through attenuation of the acute-phase response. J. Neurochem. 103, 2245-2255)를 Fr-1 미세소포를 사용하여 시각화하였다. 에타너셉트로 사전 처리된 동물은, 식염수를 받은 대조 동물과 비교하여, Fr-1 미세소포 축적물이 감소되었다. 이 연구는 염증 억제제로 항염증 치료 동안에 염증 부위에서 셀렉틴 수용체의 발현을 관찰하기 위한 Fr-1 미세소포의 능력을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> BRACCO SUISSE SA <120> Targeted Gas-Filled Microvesicles <130> B0591/064-EP-P0 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(47) <223> NH2 term mature P-selectin glycoprotein ligand-1 (GenBank Acc. N? Q14242) (fragment aa 42-88). <400> 1 Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr 1 5 10 15 Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr 20 25 30 Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg 35 40 45 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> spacer <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(24) <223> spacer: N-terminal fragment of Fc Human IgG region <400> 2 Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 <210> 3 <211> 71 <212> PRT <213> artificial <220> <223> fusion protein (SEQIDNO:1 + SEQIDNO:2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(71) <223> SEQIDNO:1 + SEQIDNO:2 <400> 3 Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr 1 5 10 15 Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr 20 25 30 Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro 35 40 45 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser 50 55 60 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 65 70 <210> 4 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PSGL-1 Fc region fusion protein <220> <221> SITE <222> (1)..(47) <223> P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), aa 42-88 GenBank Acc. N?Q14242. <220> <221> SITE <222> (48)..(71) <223> spacer <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(272) <223> IgG Fc region (from US2003/0166521) <400> 4 Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr 1 5 10 15 Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr 20 25 30 Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Pro 35 40 45 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser 50 55 60 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 65 70 75 80 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 85 90 95 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 100 105 110 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 115 120 125 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 130 135 140 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr 145 150 155 160 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 165 170 175 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 180 185 190 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 195 200 205 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 210 215 220 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 225 230 235 240 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 245 250 255 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 260 265 270

Claims (22)

  1. a) 양친매성 화합물과,
    b) 최대 200개의 아미노산 잔기로 구성되고 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-16을 포함하는 폴리펩티드
    로 이루어진 표적 구조물로서, 상기 폴리펩티드는 이합체 형태이고, 상기 양친매성 화합물과 공유적으로 회합되며, 상기 표적 구조물의 상기 양친매성 화합물은 인지질인, 표적 구조물.
  2. 제1 항에 있어서, 폴리펩티드는 시스테인 잔기, 리신 잔기, 또는 시스테인 잔기 및 리신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  3. 제2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 리신 잔기를 통해 상기 양친매성 화합물과 공유적으로 회합되는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  4. 제1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 1-19를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  5. 제1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-41을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  6. 제1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 1-47을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  7. 제1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 최대 100개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  8. 제1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 최대 75개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  9. 제1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3에 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  10. 제1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하기 식 (I)의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 표적 구조물:
    (XA)n-Y-(XB)m (I)
    여기서,
    (XA)n은 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-16을 포함하는, n개의 아미노산 XA의 서열을 나타내며,
    n은 12 내지 199의 정수이고,
    XA는 리신을 제외한 어떤 아미노산이고,
    (XB)m은 m개의 아미노산 XB의 서열을 나타내며,
    합계 m+n이 최대 199인 조건으로, m은 0 내지 10의 정수이고,
    XB는 리신 및 시스테인을 제외한 어떤 아미노산이고,
    Y는 시스테인 또는 리신이다.
  11. 제10 항에 있어서, (XA)n은 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 1-19를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  12. 제10 항에 있어서, (XA)n은 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 5-41을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  13. 제10 항에 있어서, (XA)n은 SEQ ID NO:1에 제시된 적어도 아미노산 1-47을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  14. 제13 항에 있어서, Y는 리신인 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  15. 제10 항에 있어서, n은 12 내지 99의 정수이고, m+n은 최대 99인 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  16. 제10 항에 있어서, n은 12 내지 74의 정수이고, m+n은 최대 74인 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  17. 제10 항에 있어서, XA는 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열의 아미노 잔기에 결합된 O-글리칸 부분을 포함하는 아미노산의 글리코실화 서열인 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  19. 제18 항에 있어서, 상기 O-글리칸 부분은 시알릴 루이스 x 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  20. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:1의 위치 16, 24, 25, 26, 28, 29, 32, 36, 39, 40 및 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 결합된 하나 이상의 글리칸 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  21. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 상기 아미노산 서열은 티로신 아미노산 잔기에 결합된 황산기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 구조물.
  22. 삭제
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