CN103079599B - 靶向气体填充微囊 - Google Patents

Abstract

气体填充微囊与包含氨基酸序列的多肽结合，所述序列显示出对于选择素特别是p‑选择素的结合亲和力。气体填充微囊可以用于超声成像中。

Description

靶向气体填充微囊

技术领域

本发明一般而言涉及特别用于在诊断方法中使用的靶向气体填充微囊和含有所述微泡的水混悬液。

发明背景

近年来造影剂的快速发展已生成许多不同制剂，其在人或动物体的器官和组织的对比增强成像中是有用的。

最近以来，已关注了所谓的“分子成像”，其中合适的靶特异性组分用于造影剂的制剂中，用于允许器官或组织的选择性对比增强成像。此外，任选与分子成像组合的造影剂制剂的治疗用途也已得到描述。

特别对于超声对比成像有用的造影剂类别包括在水介质中分散的纳米和/或微米大小的气泡悬液。特别有利的是其中气泡例如通过使用乳化剂、油、增稠剂或糖，或者通过在多种系统中诱陷或封装气体或其前体得到稳定化的那些制剂。这些稳定化的气泡一般在本领域中由多种术语提及，一般取决于用于其制备的稳定化材料；这些术语包括例如“微球体”、“微泡”、“微胶囊”或“微球”。如本文使用的术语“气体填充微囊”或简短地“微囊”包括上述术语中的任何。

气体填充微囊的制剂可以适当地进行修饰，用于改善诊断效应（例如通过分子成像）和/或用于治疗目的，例如药物递送和/或血栓溶解。例如，微囊可以与治疗剂和/或特异性组分结合（例如通过包括在其边界外壳中），所述特异性组分能够连接至在患者体内的确定靶（称为“靶向配体”）。靶向配体的例子包括例如肽、蛋白质、抗体、适体或碳水化合物，其能够与在致病过程例如血管生成、炎症或血栓形成期间由器官或组织表达的特异性受体结合。

选择素（特别是P-、L-和E-选择素）是在炎症过程期间尤其通过血管内皮表达的细胞粘附分子。选择素配体且特别是P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1：GenBank登记号Q14242.1）在所有白细胞（嗜中性细胞、单核细胞和大多数淋巴细胞）和髓样细胞上组成性表达。像这样，它在这些细胞与表达P-选择素以及E和L-选择素（尽管具有更低亲和力）的活化血小板或内皮的栓系中起关键作用。P-选择素配体的例子例如公开于美国专利号5,840,679中。

国际专利申请公开号WO 2008/131217公开了包含针对P-选择素的靶向配体的微泡组合物。特别地，靶向配体是包含P-选择素配体和二聚结构域的融合蛋白。在特定实施方案中，该申请公开了重组P-选择素配体的用途，其由在融合至人IgG₁（rPSGL-Ig）的Fc部分的选择素结合糖形中的PSGL-1的氨基末端区域组成，以经由与含生物素微泡结合的生物素-链霉亲和素缀合。虽然所述申请未公开P-选择配体的任何确切序列，但它参考由美国专利申请公开号2003/0166521公开的P-选择配体及其片段的例子。

US 2003/0166521公开了通过截短成熟PSGL-1的N末端47个氨基酸且将所述PSGL-1的N末端47个氨基酸连接至人免疫球蛋白G-1（IgG₁）的Fc部分产生的PSGL-1融合蛋白（dimPSGL-1），也称为重组PSGL-Ig（或rPSGL-Ig）。

申请人目前已观察到当与荷有完全蛋白质的微囊相比较时，仅荷有所述rPSGL-1蛋白质的片段的微囊可以具有一些优点，例如在结合功效方面和/或在含有微囊的水混悬液的稳定性方面。

发明概述

本发明的一个方面涉及与多肽结合的气体填充微囊的水混悬液，所述多肽由至多200个氨基酸残基的序列组成，且包含如SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸5-16。

优选地，所述多肽更优选通过共价键与微囊的组分结合。

优选地，所述多肽包含如SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸1-19，更优选如SEQ IDNO:1中所示的至少氨基酸5-41，且甚至更优选如SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸1-47。

根据优选实施方案，所述多肽包含至多100个氨基酸残基，更优选至多75个氨基酸残基。

根据优选实施方案，所述多肽由式（I）的氨基酸序列组成：

（X^A）_n–Y–（X^B）_m （I）

其中：

（X^A）_n代表n个氨基酸X^A的序列，包含如SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸5-16，其中：

p是12–199的整数；和

X^A代表除了赖氨酸外的任何氨基酸；

（X^B）_m代表m个氨基酸X^B的序列，其中；

m是0–10的整数，条件是总和m+n至多是199；和

X^B代表除了赖氨酸和半胱氨酸外的任何氨基酸；和

Y代表包含用于使多肽与微囊的组分结合的反应部分的氨基酸。

优选地，Y残基的反应部分是–NH₂或–SH；更优选地Y是赖氨酸或半胱氨酸，甚至更优选赖氨酸。

根据进一步优选实施方案，所述多肽由式（II）的序列代表：

（X¹）_p–[（C–（X²）_a]_q–[（C–（X³）_b]_r–Y–（X⁴）_s

（II）

其中

C代表半胱氨酸；

Y代表赖氨酸或半胱氨酸，优选赖氨酸；

（X¹）_p代表p个氨基酸X¹的序列，包含如SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸5-16，（X²）_a代表a个氨基酸X²的序列，（X³）_b代表b个氨基酸X³的序列，（X⁴）_s代表s个氨基酸X²的序列，其中：

X¹、X²、X³、X⁴独立地代表除了赖氨酸和半胱氨酸外的任何氨基酸；

n是12–199的整数，优选12–99，更优选12-74；

a和b独立地是0–50，优选0–20且更优选0–10的整数；

q和r独立地是0或1，至少是1；和

s是0–10的整数；

条件是总和p+（a·q）+（b·r）+s至多是199，优选至多是99且甚至更优选74。

上文举例说明的多肽优选包含与序列的氨基酸结合的至少一个O-聚糖部分和/或至少一个硫酸残基。

根据本发明的优选实施方案，上文举例说明的多肽是二聚体形式，优选是同源二聚体形式。

根据特别优选的实施方案，所述多肽由如SEQ ID NO:3中所示的序列组成。优选地，序列的两个半胱氨酸残基可以结合相应序列的分别半胱氨酸残基，以提供以二聚体形式的多肽。

本发明进一步涉及以干粉或冻干残渣形式的所述气体填充微囊的前体。通过使其与生理学可接受的含水载体接触，所述前体特别是可重构的，以在气体的存在下在混合物搅动后形成所述气体填充微囊的水混悬液。

本发明的进一步方面涉及包含所述气体填充微囊的前体和生理学可接受的含水载体的药物试剂盒。

发明详述

术语“气体填充微囊”包括包含由稳定化材料的外壳或层（包括成膜层）围绕的微米或纳米大小的气体泡的任何结构。该术语包括本领域称为气体填充脂质体、微泡、微球体、微球或微胶囊的那种。微囊一般悬浮于含水载体中，特别是生理学可接受的含水载体中。稳定化材料可以是本领域一般已知的任何材料，包括例如表面活性剂、脂质、鞘脂、寡聚脂、磷脂、蛋白质、多肽、碳水化合物和合成或天然聚合材料。

术语“微泡”包括悬浮于含水载体中的气体泡，其在气体/液体界面由极薄的外壳（薄膜）结合，涉及沉积在气体与液体界面上的稳定化两性分子材料（本领域有时也称为“消失式”外壳）。微泡混悬液可以通过下述进行制备：使其合适前体例如粉末状两性分子材料（例如冷冻干燥的预形成的脂质体或冷冻干燥的或喷雾干燥的磷脂分散体或溶液）与空气或其他气体接触，且随后与含水载体接触，同时搅动以生成微泡混悬液，其随后可以施用，优选在其制备后不久。气体微泡的水混悬液、其前体及制备的例子公开于例如US5,271,928、US5,445,813、US5,413,774、US5,556,610、5,597,549、US5,827,504和WO04/069284中，其通过引用整体合并入本文。

术语“微球”或“微胶囊”包括其中气体泡由天然或合成聚合物的脂质的固体材料外壳围绕的混悬液。微球及其制备的例子公开于例如US5,711,933和US6,333,021中。

如本文使用的术语多肽包括氨基酸的序列，其可以是合成的或优选是天然氨基酸。

术语“靶向配体”包括在体内具有或能够促进针对组织和/或受体的靶向活性的任何化合物、部分或残基。靶向配体可以与之结合的靶包括组织例如心肌组织（包括心肌细胞和心肌细胞（cardiomyocytes））、膜组织（包括内皮和上皮）、薄层、结缔组织（包括间质组织）或肿瘤；血块；和受体例如关于肽激素、神经递质、抗原、补体片段和免疫球蛋白的细胞表面受体。该术语特别包括包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列显示出对于选择素特别是P-选择素的结合亲和力（“活性序列”）；所述活性序列包括例如如SEQID NO:1中所示的氨基酸5-16、1-19、5-41和1-47。

术语“靶向气体填充微囊”包括在其配制中包含至少一种靶向配体的任何气体填充微囊。

短语“靶向气体填充微囊的中间产物”包括任何气体填充微囊，其可以转换成靶向气体填充微囊。此类中间产物可以包括例如包括合适的反应部分（例如马来酰亚胺）的气体填充微囊（或其前体），其可以与连接至靶向配体的相应互补反应物（例如硫醇）反应。

表达“Fc区”指示由通过二硫键彼此连接的两条重链的羧基末端一半组成的免疫球蛋白（Ig）的可结晶片段。Fc片段对于每个免疫球蛋白种类（即IgG、IgM、IgA等）和类型（IgG₁、IgG₂等）是不同的。

术语“全长Fc结构域”指示由两条重链组成的结构域，取决于抗体的类别，其包含两个或三个恒定结构域。通过与特异性蛋白质结合，Fc结构域确保每个抗体对于给定抗原生成合适的免疫应答。这个Fc结构域还与多种细胞受体例如Fc受体和其他免疫分子例如补体蛋白质结合。通过实现这点，它介导不同生理效应包括调理作用，细胞裂解以及肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的去粒。全长Fc结构域序列包含未经修饰的（原始）氨基酸序列，或其中一个或多个非必需氨基酸已突变的相应氨基酸序列。例如，SEQ ID NO:4的氨基酸序列49–272对应于IgG₁免疫球蛋白的全长Fc结构域，其中氨基酸59和62两个例外（其中原始Fc序列的Leu和Gly残基都已替换为Ala残基）。

术语“治疗剂”在其含义内包括任何化合物、部分或残基，其可以用于任何治疗应用中，例如在用于治疗患者中的疾病的方法中，以及在体外和/或体内能够发挥或负责发挥生物效应的任何物质。治疗剂因此包括能够在患者中的任何病理状态（包括不适、痛苦、疾病、损害或损伤）的治疗（包括预防、减轻、疼痛缓解或治愈）中使用的任何化合物或材料。治疗剂的例子是药物、药剂、生物活性剂、细胞毒素剂、化学治疗剂、放射治疗剂、蛋白质、天然或合成肽包括寡肽和多肽、维生素、类固醇和遗传材料包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和质粒。

表达“生理学可接受的含水载体”包括一般用于注射的液体载体，例如水，一般为无菌、无热原水（以尽可能地预防中间冻干产物中的污染），水溶液例如盐水（其可以有利地如此平衡，从而使得用于注射的最终产物不是低渗的），或一种或多种张力调整物质例如盐或糖、糖醇、二醇或其他非离子多元醇材料（例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等）的水溶液。

气体填充微囊

根据本发明的一个实施方案，如上定义的与靶向配体结合的气体填充微囊是微泡。

适合于形成微泡的稳定化外壳的组分包含例如磷脂；溶血磷脂；脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；荷有脂质的聚合物例如壳多糖、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇（PEG）也称为“聚乙二醇化脂质”；荷有脂质的磺酸化单、二、寡或多糖；胆固醇、胆固醇硫酸酯或胆固醇半琥珀酸酯；生育酚半琥珀酸酯；具有醚或酯连接的脂肪酸的脂质；聚合脂质；双乙酰磷酸；双十六烷基磷酸；神经酰胺；聚氧乙烯脂肪酸酯（例如聚氧乙烯脂肪酸硬脂酸酯）、聚氧乙烯脂肪醇、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯、乙氧基化大豆固醇、乙氧基化蓖麻油或环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）嵌段共聚物；固醇脂肪族酸酯包括胆固醇丁酸酯、胆固醇异丁酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇硬脂酸酯、羊毛甾醇乙酸酯、麦角固醇棕榈酸酯、或植物固醇正丁酸酯；糖酸的固醇酯包括胆固醇葡萄糖醛酸苷、羊毛甾醇葡萄糖醛酸苷、7-脱氢胆固醇葡萄糖醛酸苷、麦角固醇葡萄糖醛酸苷、胆固醇葡萄糖酸酯、羊毛甾醇葡萄糖酸酯、或麦角固醇葡萄糖酸酯；糖酸和醇的酯包括月桂基葡萄糖醛酸苷、硬脂酰葡萄糖醛酸苷、肉豆蔻酰葡萄糖醛酸苷、月桂酰葡萄糖酸酯、肉豆蔻酰葡萄糖酸酯、或硬脂酰葡萄糖酸酯；糖与脂肪族酸的酯包括蔗糖月桂酸酯、果糖月桂酸酯、蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸或聚糖醛酸；皂苷包括萨洒皂草配基、菝葜配基、常春藤苷配基、齐墩果酸或洋地黄毒苷配基；甘油或甘油酯包括甘油三棕榈酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕榈酸酯；长链醇包括正癸醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或正十八醇；6-（5-胆甾烯-3β-基氧基）-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；二半乳糖甘油二酯；6-（5-胆甾烯-3β-基氧基）己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷；6-（5-胆甾烯-3β-基氧基）己基-6-氨基-6-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃甘露糖苷；12-（（（7’-二乙基氨基香豆素-3-基）羰基）甲基氨基）十八烷酸；N-[12-（（（7’-二乙基氨基香豆素-3-基）羰基）甲基氨基）十八酰基]-2-氨基棕榈酸；N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺；1,2-二油酰-sn-甘油；1,2-二棕榈酰-sn-3-琥珀酰甘油；1,3-二棕榈酰-2-琥珀酰甘油；1-十六烷基-2-棕榈酰甘油-磷酸乙醇胺或棕榈酰高半胱氨酸；包含至少一条（C₁₀-C₂₀）、优选（C₁₄-C₁₈）烷基链的烷基胺或烷基铵盐，例如N-硬脂酰胺、N,N’-二硬脂酰胺、N-十六烷基胺、N,N’-双十六烷基胺、N-硬脂酰氯化铵、N,N’-二硬脂酰氯化铵、N-十六烷基氯化铵、N,N’-双十六烷基氯化铵、二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；包含通过（C₃-C₆）烷撑桥连接至N-原子的一条或优选两条（C₁₀-C₂₀）、优选（C₁₄-C₁₈）酰基链的叔或季铵盐，例如1,2-二硬脂酰-3-三甲铵丙烷（DSTAP）、1,2-二棕榈酰-3-三甲铵丙烷（DPTAP）、1,2-油酰-3-三甲铵丙烷（DOTAP）、1,2-二硬脂酰-3-二甲铵丙烷（DSDAP）；及其混合物或组合。

取决于组分的组合和微泡的制造过程，上文列出的示例性化合物可以用作主要化合物用于形成微泡的外壳，或用作简单添加剂，从而仅以少量存在。

根据优选实施方案，形成微泡的外壳的化合物中的至少一种是两性分子化合物（即包含亲水和亲脂部分的有机分子），优选磷脂，任选与其他上文引用材料中的任何混合。根据本说明书，术语磷脂预期包含任何两性分子磷脂化合物，其分子能够在最终微泡混悬液中的气体-水结合界面上形成材料的稳定化薄膜（一般以单分子层的形式）。相应地，这些材料在本领域中也称为“成膜磷脂”。

两性分子磷脂化合物一般含有至少一个磷酸基和至少一个优选两个亲脂长链烃基团。

合适磷脂的例子包括甘油与脂肪酸的一个或优选两个（相等或不同）残基和磷酸的酯，其中磷酸残基依次与亲水基团结合，例如胆碱（磷脂酰胆碱–PC）、丝氨酸（磷脂酰丝氨酸–PS）、甘油（磷脂酰甘油–PG）、乙醇胺（磷脂酰乙醇胺–PE）、肌醇（磷脂酰肌醇–PI）。磷脂与脂肪酸的仅一个残基的酯在本领域一般被称为“溶血”形式的磷脂或“溶血卵磷脂”。存在于磷脂中的脂肪酸残基一般是长链脂肪族酸，一般含有12–24个碳原子，优选14–22个；脂肪族链可以含有一个或多个不饱和或优选是完全饱和的。在磷脂中包括的合适脂肪酸的例子是例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。优选地，采用饱和脂肪酸例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。

磷脂的进一步例子是磷脂酸，即甘油磷酸与脂肪酸的二酯；鞘脂例如鞘磷脂，即其中具有脂肪酸的甘油二酯的残基替换为神经酰胺链的那些磷脂酰胆碱类似物；心磷脂，即具有脂肪酸的1,3-二磷脂酰甘油的酯；糖脂例如神经节苷脂GM1（或GM2）或脑苷酯；葡萄糖脂（glucolipids）；硫苷脂和糖鞘脂。

如本文使用的，术语磷脂包括天然存在的、半合成或合成制备的产物，其可以单独采用或作为混合物采用。

天然存在的磷脂的例子是天然卵磷脂（磷脂酰胆碱（PC）衍生物），例如一般为大豆或蛋黄卵磷脂。

半合成磷脂的例子是天然存在的卵磷脂的部分或完全氢化的衍生物。优选磷脂是磷脂酰胆碱、乙基磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或鞘磷脂的脂肪酸二酯。

优选磷脂的例子是例如二月桂酰磷脂酰胆碱（DLPC）、二肉豆蔻磷脂酰胆碱（DMPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二花生酰磷脂酰胆碱（DAPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、1,2二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（乙基-DSPC）、双十五酰-磷脂酰胆碱（DPDPC）、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱（MPPC）、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-磷脂酰胆碱（PMPC）、1-棕榈酰-2-硬脂酰-磷脂酰胆碱（PSPC）、1-硬脂酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱（SPPC）、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱（POPC）、1-油酰-2-棕榈酰-磷脂酰胆碱（OPPC）、二月桂酰-磷脂酰甘油（DLPG）及其碱金属盐、二花生酰磷脂酰甘油（DAPG）及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）及其碱金属盐、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）及其碱金属盐、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）及其碱金属盐、二硬脂酰磷脂酸（DSPA）、二花生酰磷脂酸（DAPA）及其碱金属盐、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、二花生酰磷脂酰乙醇胺（DAPE）、二亚油酰磷脂酰乙醇胺（DLPE）、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、二花生酰磷脂酰丝氨酸（DAPS）、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸（DSPS）、二油酰磷脂酰丝氨酸（DOPS）、二棕榈酰鞘磷脂（DPSP）、和二硬脂酰鞘磷脂（DSSP）、二月桂酰磷脂酰肌醇（DLPI）、二花生酰磷脂酰肌醇（DAPI）、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇（DMPI）、二棕榈酰磷脂酰肌醇（DPPI）、二硬脂酰磷脂酰肌醇（DSPI）、二油酰磷脂酰肌醇（DOPI）。

合适的磷脂进一步包括通过与之连接亲水聚合物例如聚乙二醇（PEG）或聚丙二醇（PPG）而修饰的磷脂。优选的聚合物修饰的磷脂包括“聚乙二醇化磷脂”，即与PEG聚合物结合的磷脂。聚乙二醇化磷脂的例子是聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺（简言之“PE-PEG”），即其中亲水乙醇胺部分与可变分子量（例如300-20000道尔顿、优选500-5000道尔顿）的PEG分子连接的磷脂酰乙醇胺，例如DPPE-PEG（或DSPE-PEG、DMPE-PEG、DAPE-PEG或DOPE-PEG）。例如DPPE-PEG2000指具有与之附着的具有约2000平均分子量的PEG聚合物的DPPE。

特别优选的磷脂是DAPC、DSPC、DSPG、DPPA、DSPA、DMPS、DPPS、DSPS和乙基-DSPC。最优选的是DSPG或DSPC。

还可以使用磷脂的混合物，例如DSPE、DPPE、DPPC、DSPC和/或DAPC与DSPS、DPPS、DSPA、DPPA、DSPG、DPPG、Ethyl-DSPC和/或乙基-DPPC的混合物。

在优选实施方案中，磷脂是微泡的稳定化外壳的主要组分，总计形成气体填充微泡的外壳的组分总量的至少50%（w/w）。在一些优选实施方案中，基本上全体外壳（即按重量计至少80%至高达100%）可以由磷脂形成。

磷脂可以方便地与上文列出化合物中的任何混合使用。因此，例如，物质例如胆固醇、麦角固醇、植物固醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、没食子酸丙酯或抗坏血酸棕榈酸酯，脂肪酸例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸及其衍生物或丁羟甲苯和/或其他非磷脂化合物可以任选以范围为按重量计零至50%，优选高达25%的比例加入上述磷脂中的一种或多种中。特别优选的是两亲分子化合物例如C₁₀-C₂₀羧酸，优选棕榈酸。

根据优选实施方案，根据本发明的微泡的外壳包括荷有总体（正或负）净电荷的化合物。所述化合物可以是荷电的两性分子材料，优选脂质或磷脂。

荷有总体负电荷的磷脂的例子是下述的衍生物，特别是脂肪酸二酯衍生物：磷脂酰丝氨酸例如DMPS、DPPS、DSPS；磷脂酸例如DMPA、DPPA、DSPA；磷脂酰甘油例如DMPG、DPPG和DSPG，或磷脂酰肌醇例如DMPI、DPPI或DPPI。另外，修饰的磷脂特别是PEG修饰的磷脂酰乙醇胺例如DPPE-PEG或DSPE-PEG可以用作带负电的分子。此外，溶血形式的上文引用的磷脂例如磷脂酰丝氨酸衍生物（例如溶血-DMPS、-DPPS或–DSPS）、溶血磷脂酸衍生物（例如溶血-DMPA、-DPPA或–DSPA）和磷脂酰甘油衍生物（例如溶血-DMPG、-DPPG或–DSPG）可以有利地用作带负电的化合物。带负电的化合物的其他例子是胆汁酸盐例如胆酸盐、脱氧胆酸盐或甘胆酸盐；和（C₁₂-C₂₄），优选（C₁₄-C₂₂）脂肪酸盐例如棕榈酸盐、硬脂酸盐、1,2-二棕榈酰-sn-3-琥珀酰甘油盐或1,3-二棕榈酰-2-琥珀酰甘油盐。

优选地，带负电的化合物选自DPPA、DPPS、DSPG、DPPG、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG5000或其混合物中。

带负电的组分一般与相应正抗衡离子结合，其可以是单（例如碱金属或铵）、二（例如碱土金属）或三价（例如铝）的。优选地，抗衡离子选自碱金属阳离子中，例如Na⁺或K⁺，更优选Na⁺。

荷有总体正电荷的磷脂的例子是乙基磷脂酰胆碱的衍生物，特别是乙基磷脂酰胆碱与脂肪酸的二酯，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（乙基-DSPC或DSEPC）、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（乙基-DPPC或DPEPC）。负抗衡离子优选卤化物离子，特别是氯化物或溴化物离子。可以掺入微泡外壳内的带正电的化合物的例子是包含至少一条（C₁₀-C₂₀）、优选（C₁₄-C₁₈）烷基链，具有卤化物抗衡离子（例如氯化物或溴化物）的单、二、三或四烷基铵盐，例如单或双硬脂酰氯化铵、单或双十六烷基氯化铵、二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）或十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。可以掺入微泡外壳内的带正电的化合物的进一步例子是包含通过（C₃-C₆）烷撑桥连接至N-原子的一条或优选两条（C₁₀-C₂₀）、优选（C₁₄-C₁₈）酰基链，具有卤化物抗衡离子（例如氯化物或溴化物）的叔或季铵盐，例如1,2-二硬脂酰-3-三甲铵丙烷（DSTAP）、1,2-二棕榈酰-3-三甲铵丙烷（DPTAP）、1,2-油酰-3-三甲铵丙烷（DOTAP）、或1,2-二硬脂酰-3-二甲铵丙烷（DSDAP）。

DSEPC、DPEPC和/或DSTAP优选用作在微泡外壳中的带正电的化合物。

带正电的组分一般与相应负抗衡离子结合，其可以是单（例如卤化物）、二（例如硫酸盐）或三价（例如磷酸盐）的。优选地，抗衡离子选自卤化物离子中，例如F^-（氟）、Cl^-（氯）或Br^-（溴）。

中性和荷电化合物特别是磷脂和/或脂质的混合物，可以满意地用于形成微泡外壳。荷电脂质或磷脂的量可以从约95摩尔%-约0.1摩尔%不同，就脂质和磷脂的总量而言，优选80摩尔%-0.5摩尔%。

中性磷脂和荷电脂质或磷脂的优选混合物是例如DPPG/DSPC、DSTAP/DAPC、DPPS/DSPC、DPPS/DAPC、DPPE/DPPG、DSPA/DAPC、DSPA/DSPC和DSPG/DSPC。

用于形成气体填充微囊的稳定化外壳的上文举例说明的组分中的任何，特别是磷脂，优选聚乙二醇化磷脂，可以通过在其中插入合适的反应部分进行修饰，以便允许结合合适的化合物，例如包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的靶向配体。例如，聚乙二醇化磷脂（例如DSPE-PEG2000）可以包含能够与包含上文序列的化合物上的相应反应部分（共价）反应的末端反应部分（例如马来酰亚胺，简言之“mal”，从而形成DSPE-PEG-mal组分）。另外的合适反应部分的例子在这个说明书的下文中举例说明。

根据备选实施方案，靶向配体组分可以与气体填充微胶囊结合。微胶囊的优选例子是具有稳定化外壳的那些，所述稳定化外壳包含任选与生物可降解的聚合物混合的聚合物，优选生物可降解的聚合物，或生物可降解的水不溶性脂质（例如三棕榈精）。合适微胶囊及其制备的例子公开于例如通过引用整体合并入本文的US5,711,933和US6,333,021中。还可以采用具有蛋白质性质外壳，即由天然蛋白质（白蛋白、血红蛋白）制成的微胶囊，例如在US-A-4,276,885或EP-A-0324938（通过引用合并入本文）中描述的那些。靶向配体可以通过下述掺入微胶囊内：例如根据上文举例说明的制备方法，使其与微胶囊的外壳形成组分结合，或通过混合形成微胶囊外壳的组分和与靶向配体共价结合的两性分子组分，如先前举例说明的那些。

其他赋形剂或添加剂可以存在于微囊的干燥制剂中，或可以与用于其重构的含水载体一起加入，而无需涉及（或仅部分涉及）微囊稳定化外壳的形成中。这些包括pH调节剂（例如组氨酸）、摩尔渗透压浓度调整剂、粘度增强剂、乳化剂、填充剂等，并且可以以常规量使用。例如，可以使用化合物如聚氧化丙烯二醇和聚氧化乙烯二醇以及其共聚物。粘度增强剂或稳定剂的例子是选自线性和交联多和寡糖、糖和亲水聚合物例如聚乙二醇的化合物。

因为气体填充微囊的制备可以涉及冷冻干燥或喷雾干燥步骤，所以在制剂中包括冻干添加剂可以是有利的，例如具有冷冻保护和/或冻干保护效应的试剂和/或填充剂，例如氨基酸例如甘氨酸；碳水化合物例如糖例如蔗糖、甘露醇、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖或环糊精，或多糖例如右旋糖酐；或聚氧化亚烷基二醇例如聚乙二醇。一般地，冻干添加剂的量可以范围为约10–约1000倍（w/w）微囊形成组分的量。

任何生物相容的气体、气体前体或其混合物可以用于填充上述微囊（下文也鉴定为“微囊形成气体”）。

气体可以包含例如空气；氮；氧；二氧化碳；氢；氧化氮；稀有或惰性气体例如氦、氩、氙或氪；放射性气体例如Xe¹³³或Kr⁸¹；超极化稀有气体例如超极化氦、超极化氙或超极化氖；低分子量烃（例如含有高达7个碳原子），例如烷烃例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷或异戊烷、环烷烃例如环丁烷或环戊烷，链烃例如丙烯、丁烯或异丁烯，或炔烃例如乙炔；醚；酮；酯；卤化气体，优选氟化气体例如或卤化、氟化或全氟化低分子量烃（例如含有高达7个碳原子）；或前述任何的混合物。当使用卤代烃时，优选所述化合物中的至少一些、更优选全部卤素原子是氟原子。

氟化气体是优选的，特别是全氟化气体，尤其是在超声成像领域中。氟化气体包括含有至少一个氟原子的材料，例如氟化烃（含有一个或多个碳原子和氟的有机化合物）；硫六氟化物；氟化，优选全氟化酮例如全氟丙酮；和氟化优选全氟化醚例如全氟化二乙醚。优选化合物是全氟化气体，例如SF₆或全氟碳（全氟化烃），即其中所有氢原子替换为氟原子的烃，其已知形成特别稳定的微泡混悬液，如例如通过引用合并入本文的EP0554213中公开的。

术语全氟碳包括饱和、不饱和和环状全氟碳。生物相容的、生理学可接受的全氟碳的例子是：全氟烃例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷（例如全氟正丁烷，任选与其他同分异构体例如全氟异丁烷混合）、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟链烯烃例如全氟丙烯、全氟丁烯（例如全氟丁-2烯）或全氟丁二烯；全氟炔烃（例如全氟丁-2-炔）；和全氟环烷烃（例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷和全氟环庚烷）。优选的饱和全氟碳包括例如CF₄、C₂F₆、C₃F₈、C₄F₈、C₄F₁₀、C₅F₁₂和C₆F₁₂。

使用以任何比例的上述气体中的任何的混合物也是有利的。例如，混合物可以包含常规气体例如氮、空气或二氧化碳和形成稳定微泡混悬液的气体，例如如上所示的碳六氟化物或全氟碳。合适气体混合物的例子可以例如在通过引用合并入本文的WO94/09829中找到。下述组合是特别优选的：气体（A）和（B）的混合物，其中气体（B）是选自先前已举例说明的那些中的氟化气体，包括其混合物，并且（A）选自空气、氧、氮、二氧化物或其混合物。气体（B）的量可以代表约0.5%-约95%v/v的总混合物，优选约5%-80%。

特别优选的气体是SF₆、C₃F₈、C₄F₁₀或其混合物，任选与空气、氧、氮、二氧化碳或其混合物混合。

在特定情况下，可能希望包括气体物质的前体（即能够在体内转换为气体的材料）。优选地，气体前体和由其衍生的前体是生理学可接受的。气体前体可以是pH活化、光活化、温度活化的等。例如，特定全氟碳可以用作温度活化的气体前体。这些全氟碳例如全氟戊烷或全氟己烷具有超过室温（或在其下产生和/或贮存试剂的温度）但低于体温的液/气相转变温度；因此，它们经历液/气相转变并且在人体内转换为气体。

对于在MRI中的使用，微囊优选含有超极化稀有气体例如超极化氖、超极化氦、超极化氙或其混合物，任选与空气、二氧化碳、氧、氮、氦、氙或如上定义的卤代烃中的任何混合。

对于在闪烁法中的使用，微囊优选含有放射性气体例如Xe¹³³或Kr⁸¹或其混合物，任选与空气、二氧化碳、氧、氮、氦、氪或如上定义的卤代烃中的任何混合。

靶向配体

与根据本发明的微囊结合的多肽包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的至少部分，其显示出对于选择素特别是特别是P-选择素的结合亲和力。特别地，所述多肽包含SEQ ID NO:1的至少氨基酸5-16，对应于“P-选择素糖蛋白配体-1”（PSGL-1，GenBank登记号Q14242.1）的氨基酸46-57。根据优选实施方案，靶向配体包含如SEQID NO:1中所示的至少氨基酸1-19，更优选至少氨基酸5-41，且甚至更优选至少氨基酸1-47（这些后者对应于“P-选择素糖蛋白配体-1”的氨基酸42-88）。

“P-选择素糖蛋白配体-1”和包含上文举例说明的活性序列的多肽包括SEQ IDNO:1，优选包含与所述序列中的至少一个氨基酸结合的聚糖残基。

术语“聚糖残基”包含O联聚糖残基（连接至氨基酸残基例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟酪氨酸或羟脯氨酸的羟基的氧原子）和N联聚糖残基（连接至氨基酸例如天冬酰胺的叔氨基的氮原子）。

O联聚糖一般包含糖残基例如N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖（Man）、己糖、木糖、唾液酸或其混合物。O联聚糖优选由唾液酸基路易斯x结构（sLe^x，唾液酸-吡喃半乳糖-岩藻糖-N-乙酰葡萄糖胺）。

N联聚糖一般包含五糖核心（Man3GlcNAc2）。复杂型链可以存在单、二、三（2,4和2,6分支的）、四和五触角结构。它们可以进一步包含多种糖例如半乳糖、唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、岩藻糖及其组合。

与本发明的微囊结合的多肽优选含有与序列的氨基酸结合的下述聚糖中的一个或多个（或其混合物）：

其中：

R是键或代表如上定义的任何其他聚糖；NeuAc是神经氨酸；Gal是半乳糖；GlcNAc是N-乙酰葡萄糖胺并且Fuc是岩藻糖。

可以任选荷有如上定义的聚糖残基的SEQ ID NO:1的氨基酸残基包含：（a）在位置16、25、26、28、29、32、36、39、40或41中的氨基酸，优选荷有O联聚糖残基；和/或（b）在位置24中的氨基酸，优选荷有N联聚糖残基。

有利地，SEQ ID NO:1可以包含与在位置16上的苏氨酸结合的唾液酸基路易斯x（sLe^x）（参见例如R.D Cumming，“Structure and function of selectin ligand PSGL-1”，Braz.J.Biol.Res.，32（5）1999，第520-528页）。

此外，在SEQ ID NO:1的位置5、7和/或10中的至少一个酪氨酸残基可以任选地硫酸化的（TyrSO₃）。更优选地，至少两个和甚至更优选所有三个酪氨酸残基可以含有硫酸基团。

多肽是长度12–200个、更优选12–100个氨基酸残基的氨基酸序列，并且它包含能够与微囊的组分的相应反应部分反应的部分。特别优选的是12–75个氨基酸残基的氨基酸序列，甚至更优选12–50个残基。

根据优选实施方案，多肽包含荷有反应部分的氨基酸。所述氨基酸优选选自：半胱氨酸和/或碱性氨基酸，优选赖氨酸。优选地，所述反应部分在多肽的C末端位置上，优选地它是赖氨酸。在优选实施方案中，在多肽序列的C末端上的单个反应部分（特别是赖氨酸）的存在允许所述基团的控制官能化和用于与微囊的组分上的相应反应基团的后续有效反应条件。另一方面，在肽链上的多个反应赖氨酸基团的存在（例如在SEQ ID NO:4的Fc部分的情况下）可以致使所述基团的官能化更随机，结果是对肽的多个反应基团与微囊的组分结合具有低得多的控制。

优选的多肽是由式（I）和更优选地式（II）表示的那些，如先前举例说明的。

在优选实施方案中，多肽包含连接至氨基酸序列SEQ ID NO:2或其N末端片段的SEQ ID NO:1的氨基酸，其中所述片段对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-20、1-15、1-10、1-5或1-4。

当N末端片段是单个氨基酸残基时，所述氨基酸优选是脯氨酸（Pro）。

特别优选的实施方案由具有SEQ ID NO:3且由与SEQ ID NO:2共价结合的SEQ IDNO:1组成的融合多肽表示。

融合多肽可以通过rPSGL-Ig的酶促蛋白酶解，例如通过在合适内切蛋白酶的存在下温育蛋白质获得。在优选实施方案中，使用切割在赖氨酸残基的C末端侧面上的肽键的内切蛋白酶（例如内切蛋白酶Lys-C）。蛋白质与内切蛋白酶Lys-C一起温育特别允许从成熟蛋白质rPSGL-Ig中去除基本部分的Fc结构域，提供对于二聚体的每个序列含有单个（C末端）赖氨酸残基（SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的位置71中的氨基酸）的二聚体序列，其可以有利地用于多肽与合适微囊的组分的后续结合程序。

可替代地，多肽可以通过由定制DNA生产重组蛋白质获得。简言之，通过将所需多肽的cDNA序列插入质粒载体中制备质粒。随后使质粒载体与用于生产重组多肽的合适的表达系统结合（例如如SEQ ID NO:3中所示）。合适表达系统的例子包括哺乳动物细胞，例如CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）、HEK293细胞（人胚肾293细胞）、Sp2/0细胞（小鼠骨髓瘤细胞系）、MEL细胞（小鼠红白血病细胞）或COS细胞（携带SV40遗传材料的猴肾细胞）；昆虫细胞例如Sf9细胞系；含病毒细胞例如BEVS细胞（杆状病毒表达载体系统）；或基于植物的表达系统，例如烟草叶、玉米、稻细胞或转基因马铃薯。最优选地，稳定表达核心-2β1,6N-乙酰葡萄糖氨基转移酶（C2GlcNAcT-I）和α-1,3-岩藻糖基转移酶-VII（fucT-VII）的CHO细胞用编码多肽的cDNA转染。选择永久表达重组多肽的细胞。随后，将这些细胞转移至生物反应器以允许多肽的大规模生产。

在优选实施方案中，重组多肽以二聚体形式特别是以同源二聚体形式获得。一般而言，肽二聚化是在表达重组多肽的细胞中发生的天然过程，一般在多肽的翻译后修饰（PTM）过程中。

上文重组制备技术可以用于制备根据本发明的多肽，其包含显示出对于选择素特别是p-选择素的结合亲和力的任何活性序列氨基酸，如先前所示（包括如SEQ ID NO:3中所示的多肽），优选是二聚体形式。在特别优选的实施方案中，该方法可以用于制备包含单个赖氨酸氨基酸的多肽（优选在末端位置中，特别是在C末端位置中），且包含上文举例说明的活性序列中的任何。

为了提供与微囊结合的优选二聚体形式，多肽优选在其序列中包含一个或多个半胱氨酸残基，其与相应多肽序列上的一个或多个各自半胱氨酸残基结合，以便在两个序列之间形成至少一个（优选至少两个）二硫桥。

在备选实施方案中，与微囊结合的多肽可以以单体形式采用。所述单体形式可以根据常规程序获得，通过单体形式的直接制备或通过二聚体多肽中的二硫键还原。例如，合适单体形式的靶向配体可以通过还原二聚体形式例如如SEQ ID NO:3中所示的序列的半胱氨酸残基的二硫键获得。二硫键还原可以根据常规技术执行，例如通过在合适还原剂例如TCEP的存在下温育二聚体形式的混悬液。二硫键的还原具有提供配体中的合适反应基团（-SH）的进一步优点，用于与微囊的组分（例如PE-PEG-马来酰亚胺）上的相应部分的后续结合，而无需在多肽中引入（硫醇化）反应基团。

在本发明的一个实施方案中，多肽可以通过接头与气体填充微囊的组分结合。合适的接头优选是亲水残基，一般含有在主链中的重复氧乙烯单位。

根据实施方案，接头是式（III）的部分：

-X–（CH₂）_f–[O–（CH₂）_g]_h–[O–（CH₂）_j]_k–Y-（III）

其中

f、g、h和j独立地代表1–4的整数，k代表0–4的整数，并且X和Y各自代表用于使接头在一个末端上与多肽和另一个末端上与微囊的组分结合的各自反应部分。

接头在其各自末端上包含合适的反应部分，用于在一个侧面上与微囊的组分上的相应互补反应部分和在另一个侧面上与多肽上例如式（I）的多肽的Y残基上的相应互补反应部分共价结合。

所述反应部分的例子包括氨基（-NH₂，形成–NH-结合残基）、羧基（-COOH，形成–CO-结合残基）或硫醇基团（-SH，形成-S-结合残基）。优选地，所述结合部分是氨基或羧基。

式III的接头的优选例子是：

–CO–CH₂–[O–（CH₂）₂]₂–NH–（Adoa）

–CO–CH₂–[O–（CH₂）₂]₂–CO–（Tuda）

–NH–CH₂–（CH₂–O–CH₂）₃–CH₂–NH–（Ttda）

-CO–CH₂–[O–（CH₂）₂]₂–CO–NH–CH₂–（CH₂–O–CH₂）₃–CH₂–NH–（Ddhh）

优选地，所述接头通过由上式定义的两个相等或不同部分形成。

组合接头的例子是：

–Adoa–Adoa–或-Ddhh-（其由Ttda-和Tuda-接头组成）。

含有合适反应结合部分的多糖是合适接头的进一步例子。

包含SEQ ID NO:1或其活性片段的序列和所需接头可以根据常规肽合成方法进行制备。

如上举例说明的多肽可以根据本领域已知的任何程序与微囊结合，包括例如共价结合、亲和结合对的非共价相互作用（例如在一个侧面上的抗生物素蛋白或链霉亲和素和在另一个侧面上的生物素之间的相互作用）、静电相互作用（例如离子或氢键）或疏水作用（例如在亲脂烃链之间）。

优选地，多肽与气体填充微囊的各自组分共价结合。

例如，如果多肽包括反应氨基（例如赖氨酸的伯氨基），那么它可以与含有合适相应反应部分的微囊的组分反应，例如异硫氰酸酯基团（以形成硫脲键）、反应酯（以形成酰胺键）、或醛基（以形成亚胺键，其可以还原为烷基胺键）。

备选地，当靶向配体包括反应硫醇基团时，在微囊的组分上的合适互补反应基团可以包括卤乙酰衍生物、马来酰亚胺（以形成硫醚键）或包含以2-吡啶硫代（PDT）基团（在与衍生自靶向配体的硫醇反应后，其导致稳定二硫键的形成）形式的硫化物的混合二硫化物。

备选地，根据本发明的实施方案，含有胺反应部分（例如仲氨基，特别是末端–NH₂基团）的靶向配体可以首先与含硫化合物反应，以在靶向配体中引入反应硫醇部分，其随后与如上文举例说明的微囊的组分上的相应互补部分反应。用于在含有反应氨基部分中引入反应硫醇部分的合适含硫化合物的例子包括例如：thioimidate（例如Traut’s试剂）N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）、N-琥珀酰亚胺-S-乙基硫代丙酸酯（SATP）或N-琥珀酰亚胺3-（2-吡啶二硫代）丙酸酯（SPDP）。含S试剂和各自的硫醇化反应的详细描述可以例如在通过Greg T.Hermanson：“Bioconjugate Techniques”，Elsevier编辑的书，第2版（2008年4月），第1章，章节4-1中找到。例如，可以制备马来酰亚胺衍生的磷脂（例如磷脂酰乙醇胺–PE或聚乙二醇化PE）且使其与靶向配体（例如SEQ ID NO:3）反应，其中仲氨基（例如末端赖氨酸的–NH₂）先前已与含硫化合物（例如先前举例说明的那些）反应，以引入反应硫醇部分；所得到的化合物随后可以用于靶向气体填充微囊的制备中。

根据进一步备选方案，当靶向配体包括反应羧酸基团时，在微囊的组分上的合适反应部分可以是胺和酰肼（以形成酰胺或N-酰基，N’-烷基酰肼官能团）。

根据优选实施方案，含有氨基反应部分（例如在赖氨酸残基上）的靶向配体可以首先与含马来酰亚胺化合物反应，以在靶向配体中引入反应马来酰亚胺部分，其随后与在微囊的组分上的相应互补部分反应。对于在含有反应氨基部分的靶向配体中引入反应马来酰亚胺部分有用的含马来酰亚胺试剂和添加马来酰亚胺基团的各自反应是本领域众所周知的。合适的含马来酰亚胺化合物的例子包括例如：AMAS（N-（α-马来酰亚胺乙酰氧基）琥珀酰亚胺酯）、BMPS（N-（β-马来酰亚胺丙氧基）琥珀酰亚胺酯）、EMCS（N-（ε-马来酰亚胺癸氧基）琥珀酰亚胺酯）、GMBS（N-（γ-马来酰亚胺丁酰氧基）琥珀酰亚胺酯）、LC-SMCC（琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧基-（6-氨基己酸酯））、MBS（m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯）、SMCC（琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸酯）、SMPB（琥珀酰亚胺-4-（p-马来酰亚胺苯基）丁酸酯）、SM（PEG）n试剂（琥珀酰亚胺-（N-马来酰亚胺丙酰胺基）-乙二醇）酯）、SMPH（琥珀酰亚胺-6-（（β-马来酰亚胺丙酰胺基）己酸酯））、磺基-EMCS（N-（ε-马来酰亚胺癸氧基）磺基琥珀酰亚胺酯）、磺基-GMBS（N-（γ-马来酰亚胺丁酰氧基）磺基琥珀酰亚胺酯）、磺基-KMUS（N-（κ-马来酰亚胺十一酰氧基）-磺基琥珀酰亚胺酯）、磺基-MBS（m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基-琥珀酰亚胺酯）、磺基-SMCC（磺基琥珀酰亚胺4-（N-马来酰亚胺甲基）-环己烷-1-羧酸酯）、磺基-SMPB（磺基琥珀酰亚胺4-（p-马来酰亚胺苯基（丁酸酯））。根据特别优选的实施方案，可以使含硫醇磷脂（例如硫醇化磷脂酰乙醇胺-PE或聚乙二醇化PE）与靶向配体（例如SEQ ID NO:3）反应，其中仲氨基（例如末端赖氨酸的NH₂）先前已与含马来酰亚胺化合物（例如先前举例说明的那些）反应，以在其中引入反应马来酰亚胺部分；所得到的化合物随后可以用于微囊的制备中。含硫醇磷脂可以例如通过使附着至磷脂的2-吡啶二硫代（PDT）基团与还原剂（例如TCEP（三（2-羧乙基）膦盐酸盐）反应获得，以生成在磷脂上的反应硫醇部分。含硫醇磷脂的例子包括钠1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸硫代乙醇（Phosphothioethanol）（来自Avanti Polar Lipids，IUPAC：（R）-2,3-双（棕榈酰氧基）丙基（2-巯乙基）膦酸钠），或可通过各自吡啶硫代前体的化学还原获得的那些，例如：（R）-2,3-双（棕榈酰氧基）丙基（2-（3-巯基）乙基）磷酸钠（来自钠1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[3-（2-吡啶二硫代）丙酸酯]，Avanti Polar Lipids）、（R）-2,3-双（油氧基）丙基（2-（3-巯基丙酰胺基）乙基）磷酸钠（来自1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[3-（2-吡啶二硫代）丙酸钠]，Avanti polar Lipids）或（R）-2,3-双（硬脂酰氧基）丙基（2-（（（2-（3-巯基丙酰胺基）聚乙二醇2000）羰基）氨基）乙基）磷酸铵（来自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[PDP（聚乙二醇）-2000]，Avanti Polar Lipids）。

在备选实施方案中，可以将生物素残基引入多肽上（例如通过使羟基琥珀酰亚胺生物素与肽的C末端反应），并且随后使生物素化的肽与包含荷有链霉亲和素（或荷有抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或extravidin）组分，例如含有链霉亲和素（抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或extravidin）残基的聚乙二醇化磷脂的微囊反应。

靶向气体填充微囊

根据本发明的组合物的靶向微囊可以根据本领域的任何已知方法产生，如上文引用的专利文件中举例说明的。

例如，微泡的制造方法可以涉及包含如上所述的两性分子材料的干燥粉末状材料的制备，优选通过包含所述材料的含水和/或有机悬液/乳状液的冻干（冷冻干燥）。在本说明书中鉴定且称为气体填充微囊的“前体”的所述干燥粉末状材料随后在所需气体的存在下与生理学可接受的溶液接触，以在混合物搅动后形成气体填充微囊的所需悬液。

根据WO91/15244中所述的制备方法，成膜两性分子化合物可以首先通过用于形成脂质体的任何方法转换成层状形式。为此，包含成膜脂质和任选其他添加剂（例如粘度增强剂、非成膜表面活性剂、电解质等）的水溶液可以提交给在声学或超声频率下的高速机械匀浆化或超声处理，并且随后冷冻干燥以形成自由流动粉末，其随后在气体的存在下贮存。如例如US5,597,549中公开的任选的洗涤步骤可以在冷冻干燥之前执行。

根据备选实施方案（例如在US5,597,549中描述的），成膜化合物和亲水稳定剂（例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、乙醇酸、苹果酸或麦芽醇）可以溶解于有机溶剂（例如叔丁醇、2-甲基-2-丁醇或C₂Cl₄F₂）中，并且溶液可以冷冻干燥以形成干粉。

优选地，如例如国际专利申请WO2004/069284中公开的，磷脂（选自上文引用的那些中且包括上文鉴定的荷电磷脂中的至少一种）和冻干保护剂（例如先前列举的那些，特别是碳水化合物、糖醇、聚二醇（polyglycols）、聚氧化亚烷基二醇及其混合物）可以在搅动下分散在水与水不能混合的有机溶剂（例如分支或线性烷烃、链烯烃、环烷烃、芳香烃、烷基醚、酮、卤代烃、全氟化烃或其混合物）的乳状液中。乳状液可以通过在至少一种磷脂的存在下将水介质和溶剂提交给本领域已知的任何合适的乳状液生成技术获得。优选地，磷脂在水介质与有机溶剂混合之前分散在水介质中。备选地，磷脂可以分散在有机溶剂中，或它可以在乳化步骤之前或过程中分开加入水-有机混合物中。含有由磷脂材料（和任选的其他两性分子成膜化合物和/或添加剂）围绕且稳定的溶剂微滴的如此获得的微乳液，随后根据常规技术冻干，以获得冻干材料，将其贮存（例如在合适气体的存在下在小瓶中）并且随后用含水载体重构以最终给出气体填充微泡混悬液，其中微泡的尺度和大小分布基本上可与微滴悬液的尺度和大小分布比较。

用于制备气体填充微泡的进一步过程包含生成气体微泡分散体，通过在所需气体的存在下将包含磷脂（和任选的其他两性分子成膜化合物和/或添加剂）的水介质提交给控制的高搅动能量（例如借助于转子定子混合器或通过超声处理），且像这样使用所获得的混合物或对所获得的分散体实施冻干以获得干燥的可重构产物。这个过程的例子例如在通过引用在此处附上的WO97/29782中给出。

喷雾干燥技术（如例如US5,605,673中公开的）也可以用于获得在与生理学含水载体接触后可重构的干粉，以获得气体填充微泡。

由任何上述技术获得的以干燥或冻干形式的前体一般以粉末或块的形式，并且可以与所需气体接触贮存（例如在小瓶中）。在所需气体的存在下，在合适的生理学可接受的含水液体载体中，前体是可容易重构的，所述含水液体载体一般是可注射的，以在悬液的轻轻搅动后形成气体填充微泡。合适的生理学可接受的液体载体是无菌水，水溶液例如盐水（其可以有利地如此平衡，从而使得用于注射的最终产物不是低渗的），或一种或多种张力调节物质例如盐或糖、糖醇、二醇或其他非离子多元醇材料（例如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等）的溶液。

根据本发明的一个实施方案，靶向构建体（即包含与微囊的组分结合的靶向配体）可以像这样与制剂的其他组分混合，以便在根据上文制备方法中的任何获得的冷冻干燥的材料重构后掺入稳定化外壳内。

备选地，微泡的起始制剂可以含有适当的中间官能化组分（例如含马来酰亚胺磷脂酰乙醇胺），以产生含有所述中间产物的冷冻干燥的材料；含有合适互补反应部分（例如硫醇）的靶向配体随后通过反应各自的反应部分连接至已掺入重构微泡的外壳中的中间官能化化合物。

在公开于WO2004/069284的过程的情况下，包含与微囊的组分结合的靶向配体的靶向构建体也可以与起始混合物的组分混合，经历乳化和冻干步骤。备选地，可以分开制备靶向构建体的微团悬液，且随后优选在加热下加入已形成的乳状液（含有其他成膜组分）中。如上，代替形成的构建体，可以备选使用官能化中间产物，其随后可以在过程的任何步骤时（例如在乳化时期中或在冻干化合物的重构后）与含有互补反应部分的靶向配体反应。根据实施方案，官能化的外壳形成组分（或外壳形成/间隔物中间构建体）作为微团悬液在搅动下加入形成的乳状液中。靶向配体（含有互补反应部分）随后加入所获得的乳状液中。

根据优选实施方案，以二聚体形式的如SEQ ID NO:3中所示的肽序列首先与硫醇化试剂（选自例如先前举例说明的那些中）反应，以在C末端赖氨酸残基的伯氨基上引入反应硫醇基团。硫醇化试剂优选以就赖氨酸残基而言的摩尔过量使用，优选约5–200倍摩尔过量，更优选20–100倍且甚至更优选约50倍。硫醇化的肽随后加入气体填充微囊的含马来酰亚胺组分（例如马来酰亚胺修饰的聚乙二醇化磷脂，例如DSPE-PEG-马来酰亚胺）的混悬液中。随后将混合物温育，并且所获得的构建体（含有SEQ ID NO:3和微囊的组分）可以用于气体填充微囊的后续制备步骤，如上文举例说明的。

与微囊表面结合的靶向配体的量这样选择，以便优选提供多价微囊，即在其表面上包含多个靶向配体的微囊。一般而言，微囊包含至少200个靶向分子/μm²微囊表面，优选至少500个分子/μm²，更优选至少1000个分子/μm²，且甚至更优选至少2000个分子/μm²。另一方面，因为在微囊的表面上不一定需要太高浓度的靶向配体，所以微囊一般包含小于15000个靶向分子/μm²微囊表面，优选小于12000个分子/μm²，更优选小于10000个分子/μm²，且甚至更优选小于8000个分子/μm²。

在微囊表面上结合的靶向配体的量可以根据本领域已知的普通技术进行测定。例如，例如通过库尔特计数器测量，可以首先测定在微囊悬液中微囊外壳的总表面。随后，例如通过液相色谱质谱法（LCMS），例如通过测量靶向配体（例如唾液酸或特异性氨基酸）的化学接头的总量，可以测定微囊悬液中靶向配体的分子总量。随后可以容易地计算在微囊表面上的靶向配体密度。

靶向微囊的用途

本发明的靶向气体填充微囊可以用于要求检测能够与上文鉴定的靶向配体结合的受体的任何体外或体内分析中，例如表达选择素受体优选E-选择素和/或P-选择素受体，更优选p-选择素受体的组织或细胞。特别地，本发明的微囊在用于检测血管内皮和更一般而言表达P-选择素和/或E-选择素的任何器官或组织的可能病理学状况的诊断方法中是有用的，所述可能病理学状况特别是与炎症过程结合的（例如急性冠脉综合征、血管生成、类风湿性关节炎、克罗恩氏病等）。此外，根据本发明的微囊可以在患有炎性疾病或病理状态的患者的（治疗）处理过程中用作有效的诊断工具，其中“在……过程中”包括在治疗开始前的任何时间，在所述治疗的过程中和/或在所述治疗的结束时。例如，本发明的微囊可以有利地用于抗炎治疗（例如上文引用疾病或病理状态的任何中）的监控和/或随访中，例如测定或评估抗炎或炎症抑制剂药物的施用对疾病或病理状态的作用。在优选实施方案中，在治疗过程中，在施用本发明的微囊后对患者的目的区域实施超声成像，例如以规律时间间隔，在每次药物施用或治疗干预后和/或在选择数目的药物施用或治疗后的预定时间间隔；目的区域的最终成像随后优选在治疗终止或结束时执行。

本发明的气体填充微囊可以进一步用于治疗相关成像方法中，所述治疗相关成像包括用于治疗患者中的疾病的任何方法，其包括对比显像剂的使用（例如用于将治疗化合物递送给所选受体或组织）并且在体外和/或体内能够发挥或负责发挥生物效应。治疗相关成像可以有利地与气体填充微囊的控制局限性破坏结合，例如借助于在高声压下的超声波（一般高于通常用于非破坏性诊断成像方法中的那种）。这种控制破坏可以例如用于治疗血块（也称为超声溶栓的技术），任选与造影剂结合的合适治疗化合物的释放组合。备选地，所述治疗相关成像可以包括治疗剂递送到细胞内，由于通过微囊的局限性爆炸或激活诱导的在细胞水平的瞬时膜渗透化。这种技术可以例如用于将遗传材料有效递送到细胞内；备选地，药物可以任选与遗传材料组合局部递送，从而允许患者的组合药物/遗传治疗（例如在肿瘤治疗的情况下）。治疗剂可以与根据常规方法的气体填充微囊结合，或可以作为组合物的分开化合物施用。

一般地，将有效量的造影剂施用于（例如通过注射）有此需要的患者，并且对待成像或治疗的患者的身体部分或组织（“目的区域”）实施所需成像方法。优选地，将造影剂静脉内施用。术语患者包括经历造影剂施用的任何受试者（人或动物），用于诊断/治疗目的或用于实验目的（包括例如在实验室动物中的造影剂使用，例如以跟踪实验治疗处理）。

根据优选实施方案，一般通过其悬液的注射，将有效量的靶向微囊施用于患者。目的区域的成像因此通过与目的区域中的受体结合的微囊的存在得到增强。

多种成像技术可以用于超声应用中，例如包括基础和非线性（例如谐波）B模式成像、脉冲或倒相成像和基础和非线性多普勒成像；需要时，可以使用三或四维成像技术。此外，还考虑了需要气体填充微囊破坏（例如借助于以高声压的超声波）的诊断技术，其是高度灵敏的检测方法。

根据本发明的微囊一般可以以约0.01–约5.0μl气体（诱陷在微囊内）/kg患者的浓度施用，取决于例如其各自组成、待成像的组织或器官和/或选择的成像技术。这种一般浓度范围当然可以取决于特异性成像应用而改变，例如当信号可以在极低剂量观察到时，例如在彩色多普勒或功率脉冲倒转中。可能的其他诊断成像应用包括闪烁法、光学成像、光声成像、磁共振成像和X射线成像，包括X射线相位差成像。

下述实施例将帮助进一步举例说明本发明。

实施例

下述材料和缩写已用于下述实施例中。

DSPC 二硬脂酰卵磷脂（Genzyme）

棕榈酸 棕榈酸，十六烷酸（Fluka）

DSPE-PEG2000 由PEG2000修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，钠盐（Genzyme）

DSPE-PEG2000- 由PEG2000-马来酰亚胺修饰的二硬脂酰磷脂酰

mal 乙醇胺（Avanti Polar lipids）

DSPE-PEG2000- 1,2 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[3-（2-

PDP 吡啶二硫代）丙酸酯（聚乙二醇）-2000]铵盐（Avanti Polar Lipids）

PDP 吡啶二硫代丙酰

Traut试剂 2-亚氨基硫烷盐酸盐（Pierce）

SATA N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸酯（Pierce）

磺基-SMCC （磺基琥珀酰亚胺 4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯）（Pierce）

羟胺.HCl 盐酸羟胺（Fluka）

EDTA.4Na 乙二胺四乙酸，四钠盐（Fluka）

PEG4000 来自Clariant的聚二醇4000S

环辛烷 Fluka

TCEP 三（2-羧乙基）-膦盐酸盐（Pierce）

rPSGL-Ig 根据US2003/0166521，实施例1获得的糖基化的SEQ ID NO: 4

Lys-C 内切蛋白酶Lys-C（Pierce，#90051）

Fr-1 rPSGL-Ig（SEQ ID NO:3）的纯化片段

实施例1

用于制备Fr-1的rPSGL-Ig的酶促消化

将溶于200 μL消化缓冲液（Tris.HCl 25 mM - EDTA 1 mM -pH 8.5）中的2 mgrPSGL-Ig置于微量离心管中，向其中加入Lys-C溶液（溶于50 μL蒸馏水中的40 μg）。将含有粉末的小瓶用50 μL蒸馏水清洗，并且加入微量离心管中。随后，将混合物在37℃在干块加热器（Dry Block Heater）中温育18小时。

实施例2

通过阴离子交换色谱法分离Fr-1

将色谱分离柱（来自Bio-Rad的Econo柱，Vt=3.6mL，高度9.4cm）填充ANX琼脂糖凝胶（GE Healthcare），并且在含有乙酸钠0.05M-NaCl0.05M（pH4.0）的缓冲液中平衡。将柱用3-4体积的起始缓冲液运行，以允许凝胶沉降。流速为约0.23mL/分钟。

将290μL含有实施例1中获得的消化蛋白质的混悬液用440μL乙酸盐0.05M-NaCl0.05M-pH4.0缓冲液稀释。将这种混合物施加于柱，并且将柱用乙酸盐0.05M/NaCl缓冲液pH=4.0以范围为0.05-1M的渐增NaCl浓度洗脱。

在洗脱过程中收集2mL馏分。通过在280nm（OD280）的OD（光密度）测量评估每种馏分中的蛋白质含量，并且通过间苯二酚滴定测定糖残基的存在。Fr-1在以1MNaCl浓度洗脱的馏分中回收。收集含有Fr-1的馏分且用于后续制备。含Fr-1馏分的纯度通过SDS-PAGE分析和LC-UV进行评估。Fr-1的平均分子量（约32千道尔顿）通过MALDI-ToF（基质辅助激光解吸/电离–飞行时间）进行测定。

实施例3

rPSGL-Ig的硫醇化（比较）

将rPSGL-Ig原液的等分试样（789μL–15.1mg rPSGL-Ig–188.75nmoles）用200μLPBE（磷酸盐缓冲液25mM，150mM盐水，1mM EDTA，pH8）稀释。

在PBE中制备Traut试剂（2.76mg/mL–20mM）的溶液，并且将75μL这种溶液加入rPSGL-Ig溶液中。将所得到的混合物在室温在搅拌下温育1小时。将这种溶液旋转通过在磷酸盐缓冲液20mM pH6中平衡的旋转柱（Zeba旋转柱5mL，Pierce，#89891）。溶液的最终体积是约1.2mL（硫醇化rPSGL-Ig浓度：约111nmoles/mL）。

最终溶液中的rPSGL-Ig含量通过UV光谱法在280nm处进行测定。

硫醇化的rPSGL-Ig在纯化后立即使用，以限制硫醇基团的可能氧化。

实施例4

具有rPSGL-Ig配体（比较）的微囊的制备

将DSPE-PEG-马来酰亚胺（6.6mg-2.24μmoles）在45℃伴随搅动（涡旋）溶解于磷酸盐缓冲液20mM pH6（0.5mL）中，以获得澄清溶液。随后将0.5mL所得到的溶液加入59.5mLPEG400010%溶液中。

将60mg DSPC/棕榈酸（按摩尔计80/20）混合物在70℃溶解于环辛烷（4.8mL）中。

通过使用高速匀浆器（Megatron MT3000）5分钟（11’500rpm）混合上文制备的水和有机溶液，以获得乳状液。将所得到的乳状液在搅拌下在60℃加热1小时，随后在室温（约22℃）冷却。将乳状液在聚丙烯管（Falcon-15mL）中分成10mL馏分。

根据实施例3制备的硫醇化rPSGL-Ig（15nmoles）加入10mL乳状液，并且将所得到的混合物在22℃搅动2小时30分钟。最后将所获得的乳状液用10mL10%PEG4000溶液稀释两次，并且在DIN4R小瓶中取样（300μL/小瓶）。将小瓶在-50℃冷冻2小时（ChristEpsilon冷冻干燥机），随后在-25℃和0.2mbar冷冻干燥12小时。随后使冻干产物暴露于含有全氟正丁烷和空气（35/65v/v）的大气中，并且将小瓶密封。

在使用前通过轻轻手摇将产物分散在盐水体积（1mL，150mMNaCl）中。

实施例5

Fr-1的硫醇化

将来自实施例2的干燥Fr-1（17.1nmoles）溶解于160μL PBE（磷酸盐缓冲液25mM，150mM盐水，1mM EDTA，pH8）中。在无水DMSO中制备SATA10mg/mL溶液，并且将4μL（10当量的SATA）这种溶液加入Fr-1溶液中。将所得到的溶液在室温温育30分钟。随后将溶液用PBE（150μL）稀释。将这种溶液旋转通过在PBE（使用50μL PBE作为堆叠剂（stacker））中平衡的旋转柱（Zeba旋转柱2mL，Pierce，#89890）。溶液的最终体积是约360μL。

在PBE（15mL）中制备盐酸羟胺（0.696g）和EDTA.四钠盐（0.19g）的溶液。用NaOH10N将这种溶液的pH调整至7.3，并且体积完成为20mL。将这种脱乙酰溶液的等分试样（40μL）加入Fr-1溶液（360μL）中。将所得到的溶液在室温温育2小时。将这种溶液旋转通过在磷酸盐缓冲液20mM pH6（使用50μL PBE作为堆叠剂）中平衡的旋转柱（Zeba旋转柱2mL，Pierce，#89890）。溶液的最终体积是约450μL（硫醇化Fr-1浓度：约33nmoles/mL）。

硫醇化的Fr-1在纯化后立即使用，以限制硫醇基团的可能氧化。

实施例6

具有Fr-1的微囊的制备

将DSPE-PEG-马来酰亚胺（6.6mg-2.24μmoles）在45℃伴随搅动（涡旋）溶解于磷酸盐缓冲液20mM pH6（0.5mL）中，以获得澄清溶液。随后将0.5mL所得到的溶液加入59.5mLPEG400010%溶液中。

将60mg DSPC/棕榈酸（按摩尔计80/20）混合物在70℃溶解于环辛烷（4.8mL）中。

通过使用高速匀浆器（Megatron MT3000）5分钟（11’500rpm）混合上文制备的水和有机溶液，以获得乳状液。将所得到的乳状液在搅拌下在60℃加热1小时，随后在室温（约22℃）冷却。将乳状液在PP管（Falcon-15mL）中分成10mL馏分。

Fr-1（根据实施例5制备，13nmoles）加入10mL乳状液，并且将所得到的混合物在22℃轻轻搅拌2小时30分钟。最后将所获得的乳状液用10%PEG4000溶液稀释两次，并且在DIN4R小瓶中取样（300μL/小瓶）。将小瓶在-50℃冷冻2小时（Christ Epsilon冷冻干燥机），随后在-25℃和0.2mbar冷冻干燥12小时。随后使冻干产物暴露于含有全氟正丁烷和空气（35/65v/v）的大气中，并且将小瓶密封。

在使用前通过轻轻手摇将产物分散在盐水体积（1mL，150mMNaCl）中。

实施例7

用TCEP：单体Fr-1还原Fr-1

将干燥的Fr-1（根据实施例1和实施例2由3mg rPSGL-Ig断裂且纯化的）溶解于250μL缓冲液（Tris/HCl50mM，50mM EDTA，pH6.8）中。

在相同缓冲液中制备TCEP（2.86mg/mL–10mM）的溶液，并且将28μL这种溶液加入片段溶液中。将所得到的混合物在37℃在搅拌下温育1小时。在用100μL缓冲液稀释后，将这种溶液旋转通过在磷酸盐缓冲液20mM pH6中平衡的旋转柱（Zeba旋转柱2mL，Pierce）。溶液的最终体积是约0.4mL。

获得还原的单体Fr-1，并且这种化合物在纯化后立即使用（以限制硫醇基团的可能再氧化）。

实施例8

具有单体Fr-1的微囊的制备（在TCEP还原后）

根据实施例6制备微囊，差异是将Fr-1溶液替换为根据实施例7制备的单体Fr-1（100nmol）的溶液。

实施例9

Fr1-SMCC的制备

将来自实施例2的Fr-1（76.5nmoles）溶解于500μL缓冲液（磷酸盐缓冲液200mM，50mM盐水，1mM EDTA，pH7.5）中。在无水DMSO中制备磺基-SMCC55mg/mL溶液，并且将62μL（100当量的磺基-SMCC）这种溶液加入Fr-1溶液中。将所得到的溶液在室温温育45分钟。将这种溶液旋转通过在磷酸盐缓冲液20mM pH6中平衡的旋转柱（Zeba旋转柱5mL，Pierce，#89890）。溶液的最终体积是约660μL。

实施例10

DSPE-PEG-SH的制备

将DSPE-PEG2000-PDP（4.4mg–1473nmoles）在40℃伴随搅动（涡旋）溶解于400μL磷酸盐缓冲液（100mM pH6）中，以获得澄清溶液。加入溶于缓冲液（125μL）中的25mM TCEP溶液。将所获得的溶液在室温伴随搅拌温育45分钟。

将溶液的样品在缓冲液中稀释且检查2-吡啶硫酮的不存在。

将这种溶液旋转通过在磷酸盐缓冲液20mM pH6中平衡的旋转柱（Zeba旋转柱5mL，Pierce，#89890）。溶液的最终体积是约620μL。

实施例11

DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC缀合物的制备

将630μL在实施例9中获得的Fr1-SMCC溶液（70nmoles）加入在实施例10中获得的470μL DSPE-PEG-SH溶液（1050nmoles）中。将溶液在室温伴随搅拌（转轮）温育三小时。

随后通过阴离子交换色谱法用ANX琼脂糖凝胶（GE Healthcare）纯化溶液。

将含有纯化的Fr-1缀合物（2.6mL）的溶液旋转通过在磷酸盐缓冲液20mM pH6中平衡的旋转柱（Zeba旋转柱10mL，Pierce，#89893）且用于后续制备。

实施例12

具有DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC缀合物的微囊的制备

将10mg DSPC和棕榈酸（按摩尔计80/20）混合物在70℃溶解于环辛烷（0.8mL）中。

分开地，将根据实施例11制备的DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC缀合物溶液（0.75mL–20nmoles）加入9.25mL PEG400010%溶液中。

通过使用高速匀浆器（Polytron PT3000）1分钟（8’000rpm）混合上文制备的有机和水溶液，以获得乳状液。将所得到的乳状液在搅拌下在60℃加热1小时，随后在室温（约22℃）冷却。

将所获得的乳状液用10%PEG4000溶液稀释两次，并且在DIN4R小瓶中取样（300μL/小瓶）。将小瓶在-50℃冷冻2小时（ChristEpsilon冷冻干燥机），随后在-25℃和0.2mbar冷冻干燥12小时。随后使冻干产物暴露于含有全氟正丁烷和空气（35/65v/v）的大气中，并且将小瓶密封。

通过轻轻手摇将产物分散在盐水体积（1mL，150mM NaCl）中。

实施例13

具有DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC缀合物的微囊的制备

将10mg DSPC和棕榈酸（按摩尔计80/20）混合物在蒸馏水（10mL）中在70℃分散15分钟，并且随后冷却至室温；随后将根据实施例11制备的DSPE-PEG-SH/Fr-1-SMCC缀合物溶液（20nmoles）在搅拌下加入分散体中。

通过使用高速匀浆器（Polytron PT3000）1分钟（8’000rpm）使环辛烷（0.8mL）与所获得的分散体混合。将所得到的乳状液在搅拌下在60℃加热1小时，随后在室温（约22℃）冷却。

将乳状液用20%PEG4000溶液稀释两次，并且在DIN4R小瓶中取样（300μL/小瓶）。将小瓶在-50℃冷冻2小时（Christ Epsilon冷冻干燥机），随后在-25℃和0.2mbar冷冻干燥12小时。随后使冻干产物暴露于含有全氟正丁烷和空气（35/65v/v）的大气中，并且将小瓶密封。

通过轻轻手摇将产物分散在盐水体积（1mL，150mM NaCl）中。

实施例14

具有rPSGL-Ig配体的微囊的制备（比较）

将DSPE-PEG-mal（0.44mg–0.15μmole）在45℃伴随搅动（涡旋）溶解于磷酸盐缓冲液20mM pH6（0.1mL）中，以获得澄清溶液。将根据实施例3制备的硫醇化rPSGL-Ig（16nmoles–144μL–0.8nmoles/mL乳状液）加入溶液中，并且将所获得的混合物在22℃搅动2小时30分钟。随后将0.25mL溶液加入19.75mL PEG400010%溶液中。

将20mg DSPC/棕榈酸（按摩尔计80/20）混合物在70℃溶解于环辛烷（1.6mL）中。

通过使用高速匀浆器（Polytron PT3000）1分钟（11’000rpm）混合上文制备的水和有机溶液，以获得乳状液。将所得到的乳状液在搅拌下在60℃加热1小时，随后在室温（约22℃）冷却。

最后将所获得的乳状液用10%PEG4000溶液稀释两次，并且在DIN4R小瓶中取样（300μL/小瓶）。将小瓶在-50℃冷冻2小时（ChristEpsilon冷冻干燥机），随后在-25℃和0.2mbar冷冻干燥12小时。随后使冻干产物暴露于含有全氟正丁烷和空气（35/65v/v）的大气中，并且将小瓶密封。

实施例15

具有Fr-1的微囊的制备

微囊根据实施例14进行制备，除了将硫醇化rPSGL-Ig替换为硫醇化Fr-1（25nmoles，根据实施例5制备）外。

实施例16

在含配体微囊分散后的物理化学表征

通过在盐水体积（1mL，150mM NaCl）中轻轻振荡分散在比较实施例14中获得的冷冻干燥产物，以便获得准备用于静脉内注射的等渗微囊悬液。在悬液制备后立即（时间=0分钟）和在制备后30分钟（时间=30分钟），对微囊悬液实施大小分析。微囊的大小分布和浓度用配备30μm口管的Multisizer^TM3Coulter 进行测量（稀释：在100mL NaCl0.9%溶液中的50μL微囊悬液–分析体积：100μL）。将制剂表征以测定微囊数目中的平均直径和微囊体积中的直径中值（以μm表示的Dn和Dv50），以及获得其以数目表示的浓度。

类似地，还将实施例15中获得的冷冻干燥产物在相等体积的盐水中分散，并且如上所述测定悬液中的微囊大小和分布（时间=0或30分钟）。

结果在下表1中提供。

表1：微囊悬液的物理化学表征

如由上述结果可推断的，具有rPSGL-Ig配体的微囊具有在盐水中分散后聚集、随着时间过去逐步崩解的缺点，这对于可注射形式是不希望有的。相反，当比较T=0分钟和分散后的T=30分钟时，关于含Fr-1微囊的大小、分布和囊泡计数是基本上稳定的。

实施例17

在0.9%NaCl中重构后的微囊血液的图像分析

将根据实施例14和实施例15获得的微囊悬液在0.9%NaCl中稀释1/10，并且在光学显微镜（Leica Cambridge Ltd，配备20x物镜）下，将10μL等分试样引入Neubauer计数池（，Brand GmbH)内用于微囊图像采集。允许微囊上升至在Neubauer池之上的盖玻片（2–3分钟），并且在聚焦后用数码相机获得图像。随后用数学处理器分析图像，以测定未结合的微囊的量，基于图像中的纯环形对应于单个非聚集的微囊，而微囊的聚集产生无法检测的非环形的假定。为了检测灰度图像中的“纯环形”，在Matlab（The MathworksInc.，Natick，MA）中实现圆形Hough转化。该程序输出检测到的环形的中心位置和半径。观察到下述结果（表2）。

表2：通过Hough转化物体检测的图像分析

如由表2中的结果可推断的，含有Fr-1片段的微囊比含有完整蛋白质rPSGL-Ig的微囊更不倾向于聚集。

实施例18

靶向微囊的体外结合活性

为了测试有效结合，将根据比较实施例4制备的靶向微囊注射到包含小鼠Fc P-选择素（CD62P-Fc嵌合体，来自R&D Systems（Minneapolis，MN，USA）包衣的流动室设置中。将微囊（以80x10⁶/400μL TBS++的相等数目）以推注形式注射通过流动室（FCS2，Bioptech，USA），并且在溶于PBS中的50%人血浆的存在下（v:v，在柠檬酸盐上收集的Biomeda，参考ES1020P，Stehelin&Cie AG），以1.0mL/分钟的流速（714s^-1的剪切率）经过10分钟的时期评估其在小鼠P-选择素包衣层上的吸附。使用图像加工程序Analysis FIVE（SIS，德国），通过以2分钟间隔经过总共10分钟输注计数在观察区域中吸附的微囊数目来执行微囊累积的定量分析。在10分钟后，随机获得五张照片，并且测量结合微囊的数目，并且表示为在10分钟时的结合泡数目（NBB）。每个观察区域是183x137μm，如借助于镜台测微计测量的。测量在室的中间和出口之间执行。

类似地，如上所述将根据实施例6（Fr-1靶向配体）和根据实施例8（单体FR-1）制备的靶向微囊悬液注射到流动室中，并且根据上文程序测定其结合活性。

表3显示了三次测试的结果。

表3：在10分钟时的结合泡数目（NBM10分钟）

制剂	NBM10分钟
		实施例4	75±8
实施例6	98±7
		实施例8	88±9

如由上文结果可推断的，就含有单体Fr-1或完全蛋白质rPSGL-Ig的相应微囊制剂而言，含有Fr-1的微囊的结合活性更高。

实施例19

具有二聚体和单体Fr-1的微囊的体内性能

在炎症大鼠模型中比较根据实施例6和8制备的微囊。通过脂多糖（LPS，026:B6Sigma L-8274，2.1mg/kg）的肌内注射，在后肢中诱导炎症。通过在炎症过程诱导后24小时的超声成像估计靶向微囊的有效结合。使用配备15L8线性换能器（传递频率，7MHz；动态范围，83dB；深度，20mm；时间增益补偿（TGC）：线性）的Siemens Sequoia512扫描仪（SiemensMedical Systems，Issaquah，WA）执行超声成像。在得自实施例6和实施例8的微囊的单次剂量照射后10分钟，使用设计为定量目的区域（AOI）内的对比回收功率振幅的内部开发的定量软件（Bracco Suisse SA，Geneva，瑞士）执行微囊结合的定量分析。贮存框的AOI中的对比度增强表示为相对回波功率值（rms²），这与所选AOI中的微囊数目成比例。结果显示于表4中。

表4：发炎大鼠肌肉中的回波功率

制剂	回波功率10分钟（rms2）
		实施例6	43±18
实施例8	18±10

如由上文结果可推断的，就实施例8的微囊（具有单体Fr-1）而言，实施例6的微囊（具有二聚体Fr-1）导致更高的体内结合。

实施例20

监控用Fr-1微囊的抗炎疗法的效应

将根据实施例6制备的微囊施用于炎症大鼠模型中。通过脂多糖（LPS，026:B6Sigma L-8274，2.1mg/kg）的肌内注射，在后肢中诱导炎症。通过在LPS施用前二十四小时用依那西普（0.45mg/kg，Wyeth）或盐水的皮下注射预处理动物，执行抗炎治疗功效的监控。根据实施例19中所述的成像方案测定Fr-1微囊的体内结合活性。使用Fr-1微囊显现通过施用依那西普预防TNFα活性达到的已知炎症抑制（Campbell,S.J.，Jiang,Y.，Davis,A.E.，Farrands,R.，Holbrook,J.，Leppert,D.和Anthony,D.C.（2007），Immunomodulatoryeffects of etanercept in a model of brain injury act through attenuation ofthe acute-phase response.J.Neurochem.103，2245-2255）。与接受盐水的对照动物相比较，用依那西普预处理的动物显示Fr-1微囊累积中的下降。这个研究显示Fr-1微囊监控在用炎症抑制剂的抗炎治疗过程中在炎症部位中的选择素受体表达的能力。

Claims (30)

1.包含气体填充微囊的水混悬液，所述微囊包含靶向构建体，该靶向构建体包含：

a)两性分子化合物；和

b)同源二聚体多肽，所述同源二聚体多肽由两个多肽单体组成，其中每个多肽由至多200个氨基酸残基组成，包含单个赖氨酸残基、至少一个半胱氨酸残基和SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸1-19；

其中所述多肽单体通过各自的半胱氨酸残基形成二硫桥；

其中所述同源二聚体多肽通过所述赖氨酸残基上的氨基反应部分与所述两性分子化合物共价结合。

2.根据权利要求1的水混悬液，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸1-47。

3.根据前述权利要求1的水混悬液，其中所述多肽包含至多100个氨基酸残基。

4.根据前述权利要求1的水混悬液，其中所述多肽包含至多75个氨基酸残基。

5.根据前述权利要求2的水混悬液，其中所述多肽包含至多100个氨基酸残基。

6.根据前述权利要求2的水混悬液，其中所述多肽包含至多75个氨基酸残基。

7.根据权利要求1的水混悬液，其中所述多肽由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成。

8.根据权利要求1的水混悬液，其中所述多肽由式(I)的氨基酸序列组成：

(X^A)_n–Y–(X^B)_m (I)

其中：

(X^A)_n代表n个氨基酸X^A的序列，包含SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸1-19和至少一个半胱氨酸残基，其中：

n是12–199的整数；和

X^A是除了赖氨酸外的任何氨基酸；

(X^B)_m代表m个氨基酸X^B的序列，其中；

m是0–10的整数，条件是总和m+n至多是199；和

X^B是除了赖氨酸和半胱氨酸外的任何氨基酸；和

Y是半胱氨酸或赖氨酸。

9.根据权利要求8的水混悬液，其中(X^A)_n包含SEQ ID NO:1中所示的至少氨基酸1-47。

10.根据权利要求8的水混悬液，其中n是12–99的整数，并且m+n至多是99。

11.根据权利要求8的水混悬液，其中n是12–74的整数，并且m+n至多是74。

12.根据权利要求6－11中任一项的水混悬液，其中X^A包含两个半胱氨酸残基。

13.根据前述权利要求1–11中任一项的水混悬液，其中所述多肽是包含与序列的氨基残基结合的O-聚糖部分的糖基化的氨基酸序列。

14.根据权利要求13的水混悬液，其中所述O-聚糖部分包含唾液酸基路易斯x结构。

15.根据权利要求1–11中任一项的水混悬液，其包含与SEQ ID NO:1的位置16、24、25、26、28、29、32、36、39、40和/或41中的氨基酸结合的一个或多个聚糖残基。

16.根据权利要求13的水混悬液，其包含与SEQ ID NO:1的位置16、24、25、26、28、29、32、36、39、40和/或41中的氨基酸结合的一个或多个聚糖残基。

17.根据权利要求16的水混悬液，其中所述O-聚糖部分包含唾液酸基路易斯x结构。

18.根据前述权利要求1–11中任一项的水混悬液，其中所述多肽的氨基酸序列进一步包含与酪氨酸氨基酸残基结合的硫酸基团。

19.根据前述权利要求1－11中任一项的水混悬液，其中所述靶向构建体的所述两性分子化合物是磷脂。

20.根据前述权利要求1－11中任一项的水混悬液，其中所述微囊包含稳定化两性分子材料。

21.根据权利要求20的水混悬液，其中所述两性分子材料是磷脂。

22.根据前述权利要求1－11中任一项的水混悬液，其中所述微囊中含有的气体是任选与空气或氮混合的氟化气体。

23.根据前述权利要求1－11中任一项中定义的气体填充微囊的前体，所述前体是干燥粉末状形式，且包含与冻干添加剂组合的微囊形成材料，所述前体是可重构的，以在气体的存在下与含水载体接触和搅动后形成包含所述气体填充微囊的水混悬液。

24.根据权利要求23的前体，其中所述冻干添加剂是氨基酸、糖或聚亚烷基二醇。

25.根据权利要求24的前体，其中所述糖是多糖。

26.药物试剂盒，其包含根据权利要求23的前体和生理学可接受的含水载体。

27.根据权利要求26的药物试剂盒，其中所述前体与生物相容的气体接触。

28.根据权利要求27的药物试剂盒，其中所述气体是任选与空气或氮混合的氟化气体。

29.根据权利要求1－11中任一项的水混悬液在制备用于诊断成像的方法的药物试剂盒中的用途，所述诊断成像方法包括：

a)给患者施用有效量的根据权利要求1－11中任一项的气体填充微囊的混悬液；

b)对所述患者实施超声成像。

30.根据权利要求29的用途，其中所述成像对患有炎性疾病或病理状态的患者在其治疗过程中执行。