KR101658439B1 - 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 높은 KLDR 결합 친화도를 갖는 펩티드 벡터 및 이러한 벡터를 제조하는 방법을 제공한다. 펩티드 벡터는 포스포리피드에 컨쥬게이팅될 수 있으며, 초음파 조영제 조성물에 포함된다. 이러한 초음파 조영제는 특히, 치료학적 및 예방학적 방법 예컨대, KDR-함유 조직의 이미지화, 및 종양성 질환과 관련된 혈관신생생성 과정의 평가 및 치료에 유용하다. 본 발명은 또한, 고도로 순수한 다이머 및 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 및 이러한 컨쥬게이트를 형성하는데 사용된 전구체 물질의 대규모 생성을 위한 공정을 제공한다. 본 발명은 추가로, TFA 수준이 매우 낮은 고도로 순수한 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 대규모 생성 공정을 추가로 제공한다.

Description

표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트 {TARGETING VECTOR-PHOSPHOLIPID CONJUGATES}
본 발명은 치료학적 및 예방학적 조성물에 유용한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트 특히, 표적화 펩티드-포스포리피드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트를 포함하는 표적화된 초음파 조형제, 특히 표적화된 마이크로버블을 포함한다.
혈관신생생성 즉, 새로운 혈관의 생성은 배발달 및 정상 조직 성장 및 복구 동안 뿐만 아니라, 암컷의 번식주기, 임신의 성립 및 유지, 상처 및 골절의 복구 동안에 발생한다. 정상적인 개체에서 발생하는 혈관신생생성 이외에, 혈관신생생성은 많은 병리학적 과정 특히, 종양 성장 및 전이, 및 혈관 증식이 증가하는 다른 질병 예컨대, 당뇨병성 망막병증, 건선 및 관절병에 관련된다. 또한, 혈관신생생성은 증식성 성장에서 종양성 성장으로의 종양의 전이에 중요한 역할을 한다. 결론적으로, 혈관신생생성의 억제는 활성 암 치료 연구 분야에 속한다.
종양 유도된 혈관신생생성은 종양 세포에 의한 혈관신생 촉진 성장 인자의 생성에 의존적인 것으로 여겨지며, 이는 존재하는 혈관을 무활동화시키고 안정화시키는데 작용하는 다른 동력을 압도한다. 이러한 혈관신생 촉진제 또는 성장 인자의 가장 우수하게 특징지어진 것은 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF)이다 (Cohen et al., FASEB J. 13: 9-22 (1999)). VEGF는 저산소증 및 일부 다른 자극에 반응하는 다양한 세포 유형에 의해 자연적으로 생성된다. 많은 종양 또한, 다량의 VEGF를 생성하고/거나 스트로마 세포 근처에서 VEGF를 유도한다 (Fukumura et al., Cell, 94:715-725 (1998)). VEGF-A로서 불리는 VEGF는 121, 145, 165, 189 및 206개 아미노산의 5개의 상이한 스플라이스 이성체로서 합성된다. VEGF121 및 VEGF165는 특히, 종양에서 생성되는 주요 형태이다 (문헌 [Cohen et al. 1999, supra] 참조). VEGF121는 VEGF 유전자의 엑손 6 및 7에 의해 엔코딩된 기본 도메인이 결여되어 있으며, VEGF165와 달리 헤파린 또는 세포외 매트릭스에 결합하지 않는다. 본 문단에서 언급된 문헌 각각은 그 전체가 본원에 참고로 인용되었다.
VEGF 패밀리 구성원은 주로, 수용체 티로신 키나아제에 결합함으로써 작용한다. 일반적으로, 수용체 티로신 키나아제는 하나 이상의 특이적 성장 인자, 트랜스멤브레인 도메인 (일반적으로, 알파 헬릭스), 막근접 도메인 (여기서, 수용체는 예를 들어, 포스포릴화에 의해 조절될 수 있음), 티로신 키나아제 도메인 (수용체의 촉매 성분), 및 많은 수용체에서 티로신 키나아제에 대한 기질의 인식 및 결합에 관여하는 카르복시-말단 테일에 결합할 수 있는 세포외 도메인을 갖는 당단백질이다. VEGF에 결합하는 것으로 공지된 3개의 내피세포-특이적 수용체 티로신이 있다: VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR 또는 Flk-1) 및 VEGFR-3 (Flt4). Flt-1 및 KDR (또한, VEGFR-2 또는 Flk-1, 이는 본원에서 혼용되어 사용됨)는 일차 고친화도 VEGF 수용체로서 확인되었다. Flt-1은 VEGF에 대해 더 높은 친화도를 가지지만, KDR은 더 많은 내피세포 발현을 나타낸다 (Bikfalvi et al., J.Cell. Physiol., 149: 50-59 (1991)). 게다가, KDR은 혈관신생 반응을 지배하는 것으로 여겨지며, 따라서, 치료학적 및 진단학적으로 더욱 흥미롭다 (문헌 [Cohen et al. 1999, supra] 참조). KDR의 발현은 혈관신생 혈관 특히, 강한 혈관신생 반응을 유도하는 암종에서 고도로 상향조절된다 (Veikkola et al., Cancer Res., 60:203-212 (2000)). 혈관신생생성에서 KDR의 중요한 역할은 동형 KDR 넉아웃 마우스 배아에서 혈관 발생의 완전한 결여에 의해 두드러진다 (Folkman et al., Cancer Medicine, 5th Edition (B.C. Decker In.; Ontario, Canada, 2000) pp. 132-152).
KDR (키나아제 도메인 영역)은 이의 성숙 형태에서 1336개의 아미노산으로 이루어진다. KDR의 글리코실화된 형태는 약 205kDa의 겉보기 분자량으로 SDS-PAGE 겔상에서 이동한다. KDR은 이의 세포외 도메인에서 7개의 면역글로불린형 도메인을 함유하며, 이의 처음 3개는 VEGF 결합에서 가장 중요하다 (Cohen et al. 1999, supra). VEGF 자체는 동시에 두개의 KDR 분자에 결합할 수 있는 호모다이머이다. 결과는 두개의 KDR 분자가 결합 및 자동포스포릴화시 다이머화되며, 더욱 더 활성화된다. 증가된 키나아제 활성은 이어서 VEGF의 KDR-특이적 생물학적 효과를 매개하는 시그널 경로를 개시한다.
이와 같이, 혈관신생생성에 중요한 생체내 KDR의 VEGF 결합 활성 뿐만 아니라, 내피세포상에서 KDR 상항조절을 검출하거나 VEGF/KDR 결합 복합물을 검출하는 능력이 혈관신생생성을 검출하거나 모니터링하는데 매우 이로울 것이다.
기체 충전된 초음파 조형제가 초음파조영술에 대해 특히 효과적인 초음파 반사경이라는 것은 널리 공지되어 있다. 이러한 초음파 조영제는 예를 들어, 기체-충전된 미세소포 예컨대, 기체-충전된 마이크로버블 및 기체 충전된 마이크로벌룬을 포함한다. 기체 충전된 마이크로버블이 특히 바람직한 초음파 조영제이다. (본 문헌에서, 용어 "마이크로버블"은 특히 포스포리피드에 의해 둘러쌓이거나 안정화된 기체 버블을 나타낸다). 예를 들어, 담체 액체중의 공기- 또는 기체-충전된 마이크로버블의 현탁물의 생체 혈류내로 주입은, 초음파 조영 이미지를 강화시켜, 내부 해부학적 구조의 가시화를 돕는다. 혈관 및 내부 기관의 이미지화는 예를 들어, 신생물 형성, 심혈관 및 기타 질환의 검출을 위한 의학적 진단을 도울 수 있다.
진단 및 치료 목적에 있어서, 목적하는 표적에 대해 높은 결합 친화도를 나타내는 표적화 벡터 조성물 (예를 들어, KDR 또는 VEGF/KDR 복합물)을 기체 충전된 초음파 조영제로 혼입시키는 것이 특히 유리할 것이다. 예를 들어, 표적화 벡터 - 포스포리피드 컨쥬게이트 및 특히, 표적화 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트는 표적화된 기체 충전된 초음파 조영제를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 고도로 정제된 형태의 이러한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트의 대량 생성 방법이 특히 유리할 것이다. 이러한 조성물 및 방법은 진단학적 또는 치료학적 적용 예를 들어, 표적 부위로 리포터 부분, 종양억제제 또는 혈관신생형성 억제제를 정확히 표적화시키는데 사용하기 위한 조성물의 생성을 가능하게 할 것이다.
본 발명은 펩티드 다이머 TFA 염을 음이온 교환을 통해 아세테이트 염으로 전환시키고; 펩티드 다이머를 포스포리피드와 컨쥬게이팅시키는 단계를 포함하여, TFA 수준이 낮은 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 제조하는 방법 및 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트와 TFA 이온을 크기 배제 칼럼에서 용리시키는 것을 포함하여, TFA 수준이 낮은 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
발명의 요약
본 발명은 기체 충전된 조영제의 제조에 유용한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트 및 특히, 표적화 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 표적화 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트는 높은 KDR 결합 친화도를 나타내는 표적화 펩티드를 포함하며, 따라서 혈관신생생성 과정의 이미지화를 위한 조영제의 유용한 성분이다.
본 발명은 또한, 기체 충전된 초음파 조영제, 및 특히, KDR를 표적화시키고 혈관신생 과정의 이미지화에 사용될 수 있는 초음파 조영제의 제조에 유용한 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (또한, 본원에서 리포펩티드로서 칭함)를 제공한다.
본 발명은 또한, 고도로 순수한 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트, 특히 높은 KDR 결합 친화도를 갖는 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 대량 생성을 위한 방법 및 공정을 제공한다.
본 발명은 또한, 최소 수준의 트리플루오로아세트산 (TFA)을 갖는 고도로 순수한 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 대량 생성을 위한 방법 및 공정을 제공한다.
본 발명은 또한, 고순도의 단량체 펩티드 및 다중 펩티드 서브-유닛으로부터의 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 작제물을 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 고친화도로 KDR 또는 VEGF/KDR 복합물과 결합하는 단량체 펩티드 및 이러한 단량체 펩티드를 합성하고 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 이러한 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트로부터 제조된 표적화된 초음파 조영제를 제공한다. 이러한 표적화된 초음파 조영제는 표적-함유 조직을 이미지화하는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 표적화된 초음파 조영제는 높은 KDR 결합 친화도를 나타내는 표적화 펩티드를 포함하는 표적화된 마이크로버블 및 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트이며, 따라서, KDR-함유 조직의 이미지화 특히, 종양 및 혈관신생생성 과정의 이미지화를 위한 조영제의 유용한 성분이다. 이러한 표적화된 초음파 조영제를 제조하고 사용하는 방법이 또한 제공된다.
본 출원인은 표적화된 초음파 조영제를 생성하는데 유용하며, 뛰어난 KDR 결합 효율성을 갖는 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 뜻밖에도 발견하였다. 이러한 화합물중 둘은 KDR에 고친화도로 결합하는 선형 펩티드 단량체를 포함하는 단량체 펩티드 포스포리피드이며, 다른 하나는 KDR에 각각 결합하는 두개의 별개의 단량체 서브유닛을 포함하는 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트이다. 또한, 정제된 형태의 이러한 컨쥬게이트 및 전구체 물질의 대쥬모 생성에 매우 효과적인 방법이 발견되었다. 이러한 방법은 최소 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 생성하는 방법을 포함한다.
포스포리피드는 포스파티딜에탄올아민 및 변형된 포스파티딜에탄올아민으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 포스포리피드는 친수성 중합체를 결합시킴으로써 변형시킨 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 변형된 포스파티딜에탄올아민의 예로는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 변형된 포스파티딜에탄올아민 (PE), 간단하게는, "PE-PEG" 즉, 포스파티딜에탄올아민이 있으며, 여기서, 친수성 에탄올아민 부분이 다양한 분자량의 PEG 분자 (예를 들어, 300 내지 500 달톤)에 결합하며, 예컨대, DPPE-PEG, DSPE-PEG, DMPE-PEG 또는 DAPE-PEG가 있다. DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3400, DPPE-PEG2000 및 DPPE-PEG3400이 바람직하며, DSPE-PEG2000이 특히 바람직하다. 염 형태의 포스포리피드 예를 들어, 트리메틸 암모늄 염, 테트라메틸암모늄 염, 트리에틸암모늄 염, 나트륨 염 등이 사용될 수 있다.
이들 화합물은 기체 충전된 조영제 예를 들어, 기체 충전된 마이크로버블로 혼입되어 표적-함유 조직의 탁월한 이미지화를 제공하는 조영제를 형성할 수 있다. 바람직한 구체예에서, KDR에 높은 친화도로 결합하는 표적화 펩티드를 포함하는 표적화 벡터-포스포리피드 컨쥬게이트는 표적화된 마이크로버블로 혼입된다. 본원에 도시된 바와 같이, 이러한 표적화된 마이크로버블은 KDR-함유 조직에 선택적으로 국소화되어, 이러한 조직의 이미지화, 특히 종양 및 신행물 형성과 관련된 과정을 포함하는 혈관신생생성 과정의 이미지화를 허용한다.
단량체 컨쥬게이트
일반적 사항
표 1은 도 1, 2, 9 및 10에 도시된 식별화 라벨에 대한 설명이다.
Figure 112013073468602-pat00001
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, (l) N-아세틸-L-아르기닐-L-알라닐-L-글루타미닐-L-아스파르틸-L-트립토필-L-트립토필-L-아스파르틸-L-이소류실-L-글루타밀-L-류실-L-세리닐-L-메티오닐-L-알라닐-L-아스파르틸-L-글루타미닐-L-류실-L-아르기닐-L-히스티딜-L-알라닐-Ll-페닐알라닐-L-류실-L-세리닐-글리실-글리실-글리실-글리실-글리실-{N6-[1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노카르복닐옥시-(PEG2000)-아미노글루타릴]}-L-리신아미드는 포스포리피드 컨쥬게이트이다. 이러한 컨쥬게이트는 또한, Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2 (SEQ ID NO. 1) 및 Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2로서 불린다. 이는 Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NEb (SEQ ID NO. 2) 및 Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2로서 불리는 29개 아미노산 선형 펩티드 단량체 (2) N-아세틸-L-아르기닐-L-알라닐-L-글루타미닐-L-아스파르틸-L-트립토필-L-트립토필-L-아스파르틸-L-이소류실-L-글루타밀-L-류실-L-세리닐-L-메티오닐-L-알라닐-L-아스파르틸-L-글루타미닐-L-류실-Ll-아르기닐-L-히스티딜-L-알라닐-L-페닐알라닐-L-류실-L-세리닐-글리실-글리실-글리실-글리실-글리실-L-리신아미드를 포함한다. 이러한 신규한 펩티드 단량체는 KDR에 고친화도로 결합한다. 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) 및 선형 펩티드 단량체 (2)의 유사체 및 유도체가 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
도 10은 또 다른 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (31), 즉, N-아세틸-L-알라닐-L-글루타미닐-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-이소류실-L-류실-L-세릴-L-메티오닐-L-알라닐-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-류실-L-아르기닐-L-히스티딜-L-알라닐-L-페닐알라닐-L-류실-L-세릴-글리실-글리실-글리실-글리실-글리실-{N6-[1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아미노카르보닐옥시-(PEG2000)-아미노글루타릴]}-L-리신-아미드, 포스포리피드 컨쥬게이트의 구조를 제공한다. 이러한 컨쥬게이트는 또한, Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2 (SEQ ID NO. 4) 및 Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2로서 불린다. 도 9에 도시된 바와 같이, 컨쥬게이트는 28개 아미노산 선형 펩티드 단량체 (32) 즉, N-아세틸-L-알라닐-L-글루타미닐-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-이소류실-L-류실-L-세릴-L-메티오닐-L-알라닐-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-류실-L-아르기닐-L-히스티딜-L-알라닐-L-페닐알라닐-L-류실-L-세릴-글리실-글리실-글리실-글리실-글리실-L-리신아미드를 포함하며, 이는 또한, Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2 (SEQ ID NO. 5) 및 Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2로서 불린다. 2003년 9월 11일에 출원된 공동 계류중인 출원 U.S. 출원 10/661,156에 도시된 바와 같이, 본 펩티드 단량체는 고친화도로 KDR에 결합한다. 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 및 선형 펩티드 단량체의 유사체 및 유도체는 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에 도시된 바와 같이, 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) 및 (31)로 포뮬레이팅된 초음파 조영제 예컨대, 기체 충전된 마이크로버블은 높은 KDR 결합을 나타내었으며, 이는 래빗에서 VX2 종양의 조영 시험을 사용하여 확인되었다.
이상적으로, 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) 또는 (31)의 생성을 촉진하기 위해, 선형의 펩티드 단량체 (2) 또는 (32)는 대량으로 제조되어야 한다. 그 후, 링커 디숙시닐이미딜 글루타레이트 (DSG)를 통한 정제된 선형 펩티드 단량체 (2) 또는 (32)의 포스포리피드로 예컨대, 염 형태의 페그화된 포스포리피드 예를 들어, DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (4)으로의 컨쥬게이션은 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) 또는 (31)를 제공하는데 사용될 수 있다.
단량체 펩티드- 포스포리피드 컨쥬게이트의 제조 방법
단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) 및 (31)의 제조에서, 본 발명에 따른 방법은 적어도 하기 이점을 제공한다:
증가된 수율의 펩티드 합성; 저하된 라세미체화; 합성 동안 종래 관찰된 피페리딘 아미드 형성의 회피, 펩티드 단량체 (2) 및 (32)의 효과적인 정제, 펩티드 단량체 (2) 및 (32)의 대규모 컨쥬게이션 공정의 개발; 및 출발 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (4)으로부터 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) 및 (31)의 신속한 분리를 허용하는 정제 프로토콜의 개발.
단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트는 하기 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 합성의 대표적 설명에 관련된 수치 값은 대표적인 값임이 자명하다.
선형 펩티드 단량체는 SPPS에 의해 제조될 수 있다. 선형 펩티드 단량체의 서열의 Pal-Peg-PS-수지 (치환 수준: 0.2 mmol/g)에 대한 C-말단 카르복스아미드로서 작제될 수 있다. 펩티드 합성은 SONATA®/파일롯 펩티드 합성기 (Pilot Peptide Synthesizer)에서 Fmoc 화학작용에 의해 달성될 수 있다. 본 공정으로 종래 관찰된 문제점은 라세미체화, 불완전한 커플링 및 피페리딘 아미드 형성이 있으며, 이들 각각으로 인해 준최적의 수율 및 순도가 유도된다. 피페리딘 아미드 형성의 현격한 감소는 Fmoc 제거용 시약으로서 HOBt (0.1M)을 함유하는 DMF중의 25% 피페리딘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 라세미체화는 대부분의 커플링에 대한 활성화제로서 DIC/HOBt를 사용함으로써 현저하게 저하될 수 있다; 무수성 DMF (6x)로 중간 세척한 사전활성화된 4배 과량의 Fmoc-아미노산을 사용한 3h 커플링 시간. Nα-Fmoc 아미노산을 커플링되기 직전에 용해시키고, 4분 동안 DMF중의 DIC/HOBt로 사전활성화시키고, 반응 용기로 옮겼다. 이는 고형 Fmoc-아미노산을 소나타 기구 (Sonata instrument)의 아미노산 용기로 로딩하고, 용액을 버블링시키면서 DMF, HOBt/DMF 및 DIC/DMF를 연속적으로 첨가하도록 기구를 프로그래밍함으로써 달성될 수 있다.
수율을 최적화시키기 위해, 최적의 결합 시약이 사용되는 경우에도 발생할 수 있는 더 긴 펩티드의 합성 동안 수지의 응집 문제가 처리될 수 있다. 펩티드 어셈블리 동안 응집을 감소시키기 위해, X와 Thr 또는 X와 Ser의 연속 커플링 대신에 디펩티드로서 X-Thr 또는 X-Ser을 혼입시키기 위해 슈도프롤린 디펩티드를 사용하는 방법이 이용될 수 있다. 선형 펩티드 단량체에 있어서는, Leu11-Ser12 및 Leu22-Ser23의 연속 커플링이 슈도프롤린 디펩티드의 단일 커플링 즉, Fmoc-Leu-Ser(ψMe , Mepro)-OH에 의해 대체될 수 있다. 추가적인 최적화는 Fmoc-Gly-OH의 일련의 커플링 대신에 Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH 및 Fmoc-Gly-Gly-OH를 사용함으로써 커플링 수를 저하시킴으로써 달성될 수 있다. -Gly-Gly-OH 세그먼트의 활성화는 활성화된 산 작용부를 원위 아미드 작용부와 고리화시켜 불활성화 디케토피페라진을 생성시킬 수 있다; 이는 시간 의존적 방식으로 커플링 수율을 저하시킬 수 있다. 이러한 문제는 반응 용기에 Fmoc-Glyn-OH(n=2,3)을 첨가하고, HOBt 및 DIC를 연속 첨가함으로써 회피될 수 있으며; 활성화된 Fmoc-Glyn-OH의 활성화는 디케토피페라진으로의 상당한 고리화가 발생하기 전에 수지-결합된 아미노 기에 의해 차단될 수 있다. 이렇게 개선된 선형 펩티드 단량체의 합성이 10mmol 합성 규모로 소나타 펩티드 합성기에서 달성될 수 있다.
사슬 연장 후, Fmoc는 N-말단으로부터 제거될 수 있다. 펩티드 및 유리 아미노기는 아세틸화될 수 있다. 그 후, 펩티드 서열은 4h 동안 "시약 B" (TFA:물:페놀:트리이소프로필살린, 88:5:5:2, v/v/w/v)를 사용하여 수지로부터 절단되고 탈보호될 수 있다. 절단 반응 후, 미정제 펩티드는 휘발물질의 증발, 잔류물의 디에틸 에테르와의 분쇄 및 이렇게 수득된 고형물을 동일한 용매를 사용하여 세척함으로써 고형물로서 분리될 수 있다. 또 다른 변형에서, 펩티드는 디에틸 에테르를 반응 혼합물에 첨가함으로써 반응 혼합물로부터 침전되고, 이렇게 형성된 고형물을 수집하고, 동일한 용매로 세척될 수 있다.
선형 펩티드 단량체는 하기 기술된 바와 같이 정제될 수 있다. 또한, 관련 수치는 대표적인 것이다. 미정제 선형 펩티드 단량체 (0.5g)는 CH3CN (40mL/g)중에 용해될 수 있으며, 이 용액은 물로 100mL의 최종 부피로 희석될 수 있다. 그 후, 용액은 여과될 수 있다. 여과된 용액은 물 (0.1% THF)중의 10% CH3CN으로 평형화된 분취용 HPLC 칼럼 (워터스, 엑스테라 (Waters, XTerra®) Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50x250nm)에 로딩될 수 있다. 로딩 후, 용리제 조성물이 1분에 걸쳐 20% CH3CN-물 (0.1% TFA)로 램핑되고, CH3CN (0.1% TFA)의 물(0.1% TFA)로의 선형 구배가 0.6%/min 속도로 개시되고, 50분 동안 진행될 수 있다. 용리된 분획물은 분석용 역상 C18 칼럼 (워터스 엑스테라 MS-C18, 10μ, 120Å, 4.6x50mm)상에서 순도가 체크될 수 있고, 95% 초과 순도의 생성물을 함유하는 분획물은 혼합되고 냉동 건조될 수 있다. 0.5g의 미정제 펩티드의 각각의 정제를 위해, 0.12g (24%)의 선형 펩티드 단량체가 일관되게 분리될 수 있어, 동일 수율 및 순도의 펩티드가 제공될 것이다.
단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 합성은 하기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 관련 수치는 대표적인 것이다. 합성의 마지막 단계는 포스포리피드 예를 들어, 페그화된 포스포리피드 예컨대, DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염의 선형 펩티드 단량체로의 컨쥬게이션일 수 있다. DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (4)의 PEG2000 부분은 공칭상 45개 에틸렌 글리콜 유닛으로 이루어진다. 그러나, 이러한 물질은 중심이 45개 에틸렌옥시 유닛을 함유하는 공칭 화합물인 PEG 함유 종의 분산물이다. 선형 펩티드 단량체와 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염의 컨쥬게이션은 선형 펩티드 단량체의 글루타르산 모노아미드 모노 NHS 에스테르를 제조하고, 이를 포스포리피드 암모늄 염의 유리 아미노기와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 이와 같이, 선형 펩티드 단량체는 30분 동안 DIEA (5 당량)의 존재하에 DMF중의 DSG (4 당량)와 반응할 수 있다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트로 희석되며, 이는 펩티드 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르의 침전을 유도할 수 있다. 비반응된 DSG를 함유하는 상청액은 경사 분리되고, 중간체 펩티드 모노-NHS 에스테르를 에틸 아세테이트로 수차례 세척하여 미량의 DSG는 제거될 수 있다. 질량 스펙트럼 데이타에 의해 깨끗한 생성물로서 펩티드 모노-NHS 에스테르의 형성이 확인된다. 고형의 모노-NHS 에스테르는 DMF에 용해되고, 이는 24h 동안 DIEA (4 당량)의 존재하에 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (0.9 당량)과 반응될 수 있다. 포스포리피드 암모늄 염의 소모가 최대화시키기 위해 선형 펩티드 단량체 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르가 과량으로 사용될 수 있으며, 그 이유는 유리 포스포리피드 암모늄 염이 고도로 순수한 형태의 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 분리를 복잡하게 할 수 있기 때문이다.
반응 혼합물은 1:1의 물 (0.1% TFA)과 CH3CN-CH3OH의 혼합물 (1:1, v/v) (0.1% TFA) (~100mL)로 희석되고, 역상 C2 칼럼 (크로마실 (Kromasil®) Prep C2, 10μ, 300Å, 50 x 250mm, 유속 100mL/min)에 가해지고, 칼럼은 3:1의 물 (0.1% TFA)과 CH3CN-CH3OH (1:1, v/v) (0.1% TFA) 혼합물로 용리되어 친수성 불순물이 제거될 수 있다. 그 후, 생성물은 CH3CN-CH3OH (1:1) (0.1% TFA)에서 물 (0.1% TFA)로의 구배를 이용하여 용리될 수 있다 (더욱 상세한 내용은 실시예 참조). 수집된 분획물은 ELS 검출기를 이용한 역상 HPLC에 의해 분석될 수 있으며, 이는 매우 적은 UV 흡광도를 갖는 종종 분리하기 어려운 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드와 목적 생성물의 검츨을 가능하게 한다. 이는 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트와 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드의 분명한 분리를 나타낸다. 순수한 생성물-함유 분획물이 수집되고, 회전 증발기에서 농축되고 (메탄올의 함량을 저하시키기 위해), 냉동 건조되어 무색 고형물로서 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 필요한 양의 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 제공하기 위해, 0.5g 내지 1.0g의 선형의 펩티드 단량체를 사용하여 수 차례 진행될 수 있다. 모든 경우에, 표적 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트는 고수율 및 고순도로 분리될 수 있다 (예를 들어, 57-60% 수율 및 99% 초과의 순도).
다이머 컨쥬게이트
일반적 사항
표 2에는 도 3, 4 및 5에 도시된 식별 라벨에 대한 설명이 제공된다.
Figure 112013073468602-pat00002
이들 도면에 도시된 바와 같이, 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11) 아세틸-L-알라닐-글리실-L-프롤릴-L-트레오닐-L-트립토필-L-시스티닐-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-시스티닐-L-트립토필-L-류실-L-페닐알라닐-글리실-L-트레오닐-글리실-글리실-글리실-L-리실[아세틸-L-발릴-L-시스티닐-L-트립토필-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-세릴-L-트립토필-글리실-글리실-L-글루타밀-L-발릴-L-시스티닐-L-페닐알라닐-L-아르기닐-L-티로실-L-아스파르틸-L-프롤릴-글리실-글리실-글리실-L-리실(디스테아릴포스포에탄올아미노카르보녹시-PEG2000-아미노-8-아미노-3,6-디옥사옥타노일-8-아미노-3,6-디옥사옥타노일-글루타릴-L-리실) 아미드 시클릭 (2-12) 디설피드]-아미드 시클릭 (6-13) 디설피드는 KDR에 결합하는 두개의 단량체 펩티드 사슬로 이루어진다: 글루타릴 링커에 의해 구속된 22개 아미노산 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (12) 아세틸-L-알라닐-글리실-L-프롤릴-L-트레오닐-L-트립토필-L-시스티닐-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-시스티닐-L-트립토필-L-류실-L-페닐알라닐-글리실-L-트레오닐-글리실-글리실-글리실-L-리신아미드 시클릭 6-13 디설피드 및 21개 아미노산 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (13) 아세틸-L-발릴-L-시스티닐-L-트립토필-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-세릴-L-트립토필-글리실-글리실-L-글루타밀-L-발릴-L-시스티닐-L-페닐알라닐-L-아르기닐-L-티로실-L-아스파르틸-L-프롤릴-글리실-글리실-글리실-L-리실(8-아미노-3,6-디옥사옥타노일-8-아미노-3,6-디옥사옥타노일)아미드 시클릭 (2-12) 디설피드. 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11) 및 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (12) 및 (13)의 유사체 및 유도체는 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)로 포뮬레이팅된 초음파 조영제 (예를 들어, 기체 충전된 마이크로버블)는 높은 KDR 결합을 나타내며, 이는 래빗에서 VX2 종양의 조영 시험을 이용하여 확인되었다.
다이머 - 포스포리피드 컨쥬게이트의 제조 방법
다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)의 합성을 달성하기 위해, 본 목적을 위해 사용된 단량체는 최적으로 대규모 제조되어야 한다. 그 후, 단량체는 링커로서 디-숙시니미딜 글루타레이트를 사용하여 서로 구속되어 전구체 다이머 펩티드 (16), 아세틸-L-알라닐-글리실-L-프롤릴-L-트레오닐-L-트립토필- L-시스티닐-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-시스티닐-L-트립토필-L-류실-L-페닐알라닐-글리실-L-트레오닐-글리실-글리실-글리실-L-리실[아세틸-L-발릴-L-시스티닐-L-트립토필-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-세릴-L-트립토필-글리실-글리실-L-글루타밀-L-발릴-L-시스티닐-L-페닐알라닐-L-아르기닐-L-티로실-L-아스파르틸-L-프롤릴-글리실-글리실-글리실-L-리실(8-아미노-3,6-디옥사옥타노일-8-아미노-3,6-디옥사옥타노일-글루타릴-L-리실)아미드 시클릭 (2-12) 디설피드]-아미드 시클릭 (6-13) 디설피드를 형성한다. 그 후, 디숙시니미딜 글루타레이트를 통해 정제된 전구체 다이머 펩티드 (16)와 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (18)이 컨쥬게이션되어 표적 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 제공할 수 있다.
다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)을 제조하는데 있어서, 본 발명에 따른 방법은 적어도 하기 이점을 제공한다: 펩티드 서열의 자동화된 사슬 연장의 증가된 수율; 합성 동안 직면하게되는 라세미체화의 수준 감소; 펩티드 단량체 (13)의 합성 동안 종래 관찰된 피페리딘 아미드 형성의 회피; 효과적이고 실제적인 샘플 핸들링을 허용하는 멀티그램 규모로 보정가능한 공정을 이용한 (12) 및 (13)의 선형 디-시스테인 함유 펩티드 전구체의 고리화; 단량체 펩티드 (12) 및 (13)의 효과적인 정제; 최대화된 수율 및 순도의 전구체 다이머 펩티드 (16); 대규모의 전구체 다이머 펩티드 (16)의 컨쥬게이션을 위한 공정 개발; 및 포스포리피드 암모늄 염 (18)으로부터 표적 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)의 신속한 분리를 허용하는 정제 프로토콜의 개발.
다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)는 펩티드 단량체 (12), Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드, 및 (13), Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드의 자동화된 합성법에 의해 제조될 수 있으며, 디숙시니미딜 글루타레이트 (DSG)를 사용한 이들의 유효한 커플링은 ivDde 보호된 다이머 즉, 이의 탈보호물을 제공하며, 글루타릴 결합을 통한 DSPE-PEG2000-NH2로의 후속 커플링을 제공한다. 본 발명에 따른 공정을 이용하여, 단량체 펩티드는 복잡하기 않게 10mmol 규모로 합성될 수 있으며, HPLC 정제 후, 약 20% 수율 및 95% 초과 순도로 수득될 수 있다. 이러한 방법에 의한 다이머 형성 반응 및 포스포리피드 성분으로의 후속 컨쥬게이션에 의해 그램 스케일로 수행되는 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)의 형성을 가능하게 한다. 전구체 다이머 펩티드 (16)는 약 32% 수율 및 95% 초과의 순도로 일정하게 단량체 펩티드로부터 수득될 수 있다. 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)는 57-60% 수율 및 99% 초과 순도로 전구체 다이머 펩티드 (16)로부터 생성될 수 있다.
다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트는 하기 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 합성의 이러한 대표적인 설명과 관련된 수치 값은 대표적인 것임이 자명하다.
하기에는 펩티드 단량체 (12) Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp- Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2 시클릭 (6- 13) 디설피드, 및 펩티드 단량체 (13), Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드의 고체상 합성 및 디설피드 고리화의 대표적인 방법이 기술되어 있다.
펩티드는 Pal-Peg-PS-수지 (치환 수준: 0.2 mmol/g)상에 이들의 C-말단 카르복스아미드로서 작제될 수 있다. 사슬 연장은 최적화된 탈보호 및 10mmol 합성 규모로 소나타®/파일롯 펩티드 합성기상에서의 커플링 프로토콜을 사용한 Fmoc 화학작응에 의해 달성될 수 있다. 자동화된 SPSS에 의한 펩티드의 최적화된 합성은 수득된 펩티드의 전체적인 수율 및 순도에 대한 프로토콜의 특정 요소의 변화 효과 및 펩티드 불순물의 연구에 의해 개발될 수 있다.
단량체 펩티드의 비최적화된 합성으로부터 수득된 불순물 분석은 주요 문제가 라세미체화, 불완전한 커플링 및 피페리딘 아미드 형성 (추정상, 중간체 아스파르트이미드 또는 글루타르이미드 중간체를 통한)임을 나타내며, 이들 각각은 준최적의 수율 및 순도의 원인이다. 피페리딘 아미드 형성의 극적인 감소는 fmoc 제거용 시약으로서 HOBt (0.1M)를 함유하는 DMF중의 25% 피페리딘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 라세미체화는 대부분의 결합을 위한 활성화제로서 DIC/HOBt를 사용하고, 무수성 DMF (6x)로 중간 세척하면서 사전-활성화된 4배 과량의 Fmoc-아미노산을 사용한 3h 커플링 시간을 이용하여 현저하게 저하될 수 있다. N-αFmoc 아미노산을 이들의 결합 직전에 용해시키고, DMF중에 DIC/HOBt로 4분 동안 사전활성화시키고, 반응 용기로 옮겼다. 이는 고형 Fmoc-아미노산을 소나타 기구 (Sonata instrument)의 아미노산 용기로 로딩하고, DMF, HOBt/DMF 및 DIC/DMF를 연속적으로 첨가하고, 각각의 첨가 후, 용액을 버블링시키도록 기구를 프로그래밍함으로써 달성될 수 있다.
수율을 최적화시키기 위해, 최적의 결합 시약이 사용되는 경우에도 발생할 수 있는, 더 긴 펩티드의 합성 동안 수지의 응집 문제가 처리될 수 있다. 펩티드 어셈블리 동안 응집을 감소시키기 위해, X와 Thr 또는 X와 Ser의 연속 커플링 대신에 디펩티드로서 X-Thr 또는 X-Ser (X는 서열의 아미노산의 n-1을 나타냄)을 혼입시키는 슈도프롤린 디펩티드를 사용한 방법이 이용될 수 있다. 이와 같이, 단량체 (12), Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드에 있어서, 적합하게 보호된 Thr 및 Gly (상기 굵은체로 나타냄)의 연속 결합은 슈도프롤린 디펩티드 Fmoc-Gly- Thr(ψMc , Mc, pro)-OH의 단일 결합에 의해 대체될 수 있다. 유사하게는, 단량체 (13), Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp - Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드의 합성에서, 슈도프롤린 디펩티드, Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe , Mepro)-OH를 사용하여 적합하게 보호된 Ser 및 Asp의 연속 커플링 (상기 굵은체로 나타냄)을 대체할 수 있다. 추가의 최적화는 Fmoc-Gly-OH의 일련 결합 대신에 Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH 및 Fmoc-Gly-Gly-OH를 사용하여 커플링 수를 저하시킴으로써 달성될 수 있다. -Gly-Gly-OH 세그먼트의 활성화는 활성화된 산 작용부를 원위 아미드 작용부로 고리화시켜 불활성화 디케토피페라진을 생성시킬 수 있다; 이는 시간 의존적 방식으로 커플링 수율을 저하시킬 수 있다. 이러한 문제는 반응 용기에 Fmoc-Glyn-OH(n=2,3)을 첨가하고, HOBt 및 DIC를 연속 첨가함으로써 회피될 수 있으며; Fmoc-Glyn-OH의 활성화는 디케토피페라진으로의 상당한 고리화가 발생하기 전에 수지-결합된 아미노 기에 의해 차단될 수 있다. 사슬 연장이 완료된 후, N-말단 Fmoc 보호기는 각각의 펩티드로부터 제거될 수 있으며, 유리 아미노기는 아세틸화될 수 있다.
슈도-오르토고날 보호된 유도체 Fmoc-Lys (ivDde)-OH에 의해 단량체 및 다이머 펩티드의 C-말단 리신의 ε-아민의 선택적 비마스킹(unmasking) 및 이들의 후속적 작용기화가 가능하며, 이는 또한, 최적화될 수 있다. 각 펩티드 단량체의 C-말단 리신의 ε-아민상의 ivDde 기는 DMF중의 10% 히드라진을 사용하여 제거될 수 있다. 단량체 (13)에 있어서 Fmoc-Adoa 또는 단량체 (12)에 있어서 Lys(ivDde)는 10h 동안 DMF중의 4당량의 각각 DIC 및 HOBt 및 4당량의 Fmoc 아미노산을 사용하여 노출된 리신 ε-아미노기에 추가될 수 있다. 합성 완료 후, 펩티드 서열은 수지로부터 절단될 수 있으며, "시약 B" (TFA:물:페놀:트리이소프로필실란, 88:5:5:2, v/v/w/v)를 사용하여 4h 동안 탈보호될 수 있다. 절단 반응이 완료된 후, 펩티드는 침전되고, 디에틸 에테르로 세척되고 건조될 수 있다.
선형 디-시스테임 함유 펩티드의 고리화의 하기 공정을 이용하여 최적의 규모 증가된 단량체 펩티드를 제공할 수 있다. 일반적으로, 선형 디-시스테인 펩티드의 공기 산화는 약 0.5-5mg/mL의 농도에서 수행될 수 있다 (기술된 펩티드 단량체에 있어서, 펩티드중 ~0.18-1.8mM, 시스테인 티올중의 ~0.36-3.6mM). 현저하게 더 높은 농도에서 작업하기 위해, 디-시스테인 펩티드의 DMSO-관련 고리화는 ~50mL 정도의 적은 용액중에 우수한 수율로 ~10g의 선형 펩티드의 고리화를 허용한다. 따라서, 미정제 선형 디-시스테인 펩티드는 실온 및 pH 8.5에서 95% DMSO-H2O (5mL/g)중에서 고리화될 수 있다. 고리화의 진행에 이어 일정하게 질량 분석 및 HPLC가 수행된다. 고리화는 본질적으로 ~36h내에 완료되지만, 반응 혼합물은 일반적으로 48h 까지 교반될 수 있다. 시클릭 디설피드 펩티드는 반응 혼합물을 CH3CN으로 희석함으로써 침전될 수 있으며, 생성된 회백색 미정제 고형 펩티드는 여과에 의해 수집될 수 있다. 이는 미정제 시클릭 펩티드로부터 DMSO를 제거하는 통상적인 방법이다.
단량체 펩티드 (12) Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK [K(ivDde)]-NH2의 정제 및 분리는 하기 기술된 바와 같이 달성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표시 "C*"는 디설피드 결합에 기여하는 시스테인 잔기를 나타낸다. 물 (0.1% TFA)중의 300mL 이하의 30% CH3CN중에 0.5g의 미정제 펩티드를 용해시키고자 하는 시도는 성공적이지 못하였다. 따라서, 대안으로, 미정제 펩티드 (0.5g)은 DMSO (5mL/g)중에 용해될 수 있으며, 이러한 용액은 20% CH3CN-물로 100mL의 최종 부피로 희석될 수 있다. 이 용액이 여과될 수 있다. 여과된 용액은 물 (0.1% TFA)중의 10% CH3CN (0.1% TFA)으로 평형화된 분취용 HPLC 칼럼 (워터스, 엑스테라® Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50x250mm)에 로딩될 수 있으며, 칼럼은 물 (0.1% TFA)중의 10% CH3CN (0.1% TFA)으로 용리되어 칼럼으로부터 DMSO를 세척한다. 그 후, 용리제 조성물이 1분에 걸쳐 35% CH3CN-물 (0.1% TFA)로 램핑되고, CH3CN (0.1% TFA)로부터 물 (0.1% TFA)로의 선형 구배가 0.5%/min 속도로 개시되고, 50분 동안 진행된다. 용리된 분획물은 분석용 역상 C18 칼럼 (워터스 엑스테라 MS-C18, 10μ, 120Å, 4.6x50mm)상에서 순도가 체크될 수 있고, 95% 초과 순도의 생성물을 함유하는 분획물이 혼합되고 동결 건조될 수 있다. 0.5g의 미정제 펩티드의 각각의 정제에 있어서, 0.1g (20%)의 (12), Ac-AGPTWC*EDD WYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2가 분리될 수 있다. 반복된 정제에 의해 동일 수율 및 순도의 펩티드가 일관되게 제공될 것이다.
펩티드 단량체 (13), Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2는 대상 펩티드가 DMSO-함유 희석물 대신에 0.1% 수성 TFA (0.5g 펩티드/100mL)중의 20% CH3CN (0.1% TFA)중에 용해될 수 있다는 것을 제외하고는 펩티드 단량체 (12)에 대해 기술된 것과 같이 정제되고 분리될 수 있다. 미정제 펩티드의 생성 용액을 물 (0.1% TFA)중의 10% CH3CN으로 평형화된 분취용 HPLC 칼럼 (워터스, 엑스테라® Prep MS C18, 10μ, 300Å, 50x250mm)에 로딩될 수 있다. 칼럼은 10% CH3CN (0.1% TFA)/물 (0.1% TFA)로 100mL/min으로 5분 동안 용리될 수 있다. 그 후, 용리제 조성물이 1분에 걸쳐 30% CH3CN/물 (0.1% TFA)로 램핑되고, 물 (0.1% TFA)로의 CH3CN (0.1% TFA)의 선형 구배가 0.5%/min 속도로 개시될 수 있으며, 목적하는 펩티드가 칼럼으로부터 완전히 용리될 때 까지 유지될 수 있다. 생성물-함유 분획물은 워터스 엑스테라 분석용 역상 C18 칼럼 (10μ, 120Å)상에서 분석되고, 95% 초과 순도의 생성물을 함유하는 분획물이 풀링되고, 동결 건조되어 95% 초과 순도의 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (13) (0.12g, 24% 수율)를 제공할 수 있다. 10g의 미정제 펩티드 단량체가 이러한 방식으로 연속적으로 정제될 수 있다.
하기 기술된 것은 전구체 다이머 펩티드 (16), Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드]-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드를 제조하기 위한 대표적인 방법이다. 전구체 다이머 펩티드의 제조는 단량체 펩티드를 두단계 공정으로 구속시킴으로써 달성될 수 있다. 먼저, Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK-[K(ivDde)]-NH2 (12)는 DIEA (5 당량)의 존재하에 30분 동안 DMF중의 디숙시니미딜 글루타레이트 (DSG, 5 당량)와 반응할 수 있다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트로 희석되어, 펩티드의 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르를 침전시킬 수 있다. 비반응된 DSG를 함유하는 상청액이 경사분리되고, 모노-NHS 에스테르는 에틸 아세테이트로 수회 세척되여 미량의 DSG가 제거될 수 있다. 질량 스펙트럼 데이타에 의해 깨끗한 생성물로서 모노-NHS 에스테르의 형성을 확인한다. 이는 DMF에 재용될 수 있으고, DIEA (5 당량)의 존재하에 단량체 펩티드 Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2 (13)와 반응될 수 있다. HPLC 및 MS 결과 단일 주요 생성물로서 ivDde-함유 다이머가 형성된 것으로 나타난다. 다이머의 Lys의 ε-아민상의 ivDde 보호기는 20분 동안 DMF중에 히드라진 (10%)과의 반응 혼합물을 교반시킴으로써 제거될 수 있다. 그 후, 용액은 TFA로 산성화되고, 10% CH3CN (0.1% TFA)-물 (0.1% TFA)로 희석되고, 분취용 역상 C18 HPLC 칼럼에 가해지고, 아세토니트릴 (0.1% TFA)에서 0.1% 수성 TFA로의 구배 용리에 의해 정제될 수 있다. 필요량의 전구체 다이머 펩티드를 제공하기 위해, 0.5g 내지 1g 정도의 많은 양의 단량체 펩티드를 사용하여 반응이 수행될 수 있다. 모든 경우에, 필요한 전구체 다이머 펩티드는 ~32% 수율 및 95% 초과 순도로 분리될 수 있으며, 이는 공정의 재현성 및 확장성을 확인시켜준다.
합성의 최종 단계는 전구체 다이머 펩티드로의 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (18)의 컨쥬게이션이다. 상기 언급된 바와 같이, DSPE-PEG2000-NH2의 PEG2000 부분은 공칭상 45개 에틸렌 글리콜 유닛으로 이루어진다. 그러나, 이러한 물질은 중심이 45개 에틸렌옥시 유닛을 함유하는 공칭 화합물인 PEG 함유 종의 분포물이다.
전구체 다이머 펩티드로의 DSPE-PEG2000-NH2의 컨쥬게이션은 전구체 다이머의 글루타르산 모노아미드 모노 NHS 에스테르를 제조하고, 이를 포스포리피드 암모늄 염의 유리 아미노기와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 이와 같이, ivDde 함유 전구체 다이머 펩티드 (16)는 DIEA (5 당량)의 존재하에 30분 동안 DMF중의 DSG (4 당량)와 반응될 수 있다. 전구체 다이머 펩티드의 제조에서와 같이, 용액은 에틸 아세테이트로 희석되어 고형물로서 다이머 (17)의 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르를 침전시킬 수 있다. 상청액은 경사분리되어 비반응된 DSG를 제거할 수 있다. 다이머 펩티드 (17)의 고형의 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르는 에틸 아세테이트로 수차례 세척되어 미량의 DSG를 제거할 수 있다. 질량 스펙트럼 결과 깨끗한 생성물로서 펩티드 다이머의 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르가 형성되었음이 확인된다.
다이머 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르 (17)는 DMF-CH2Cl2 (8:2)중에 용해되고, 24시간 동안 DIEA (4 당량)의 존재하에 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (0.9 eq.)과 반응할 수 있다. 포스포리피드 암모늄 염의 소모를 최대화시키기 위해 NHS 에스테르 (17)는 과량으로 사용될 수 있으며, 그 이유는 유리 포스포리피드가 최종 생성물의 정제 및 분리를 복잡하게 할 수 있기 때문이다. 반응 혼합물은 물 (0.1% TFA)-CH3CN-CH3OH(1:1) (0.1% TFA) (~100mL)로 희석되고, 역상 C4 칼럼 (크로마실 (Kromasil®) Prep C4, 10μ, 300Å, 50 x 250mm, 유속 100mL/min)에 가해지고, 칼럼은 물 (0.1% TFA)-CH3CN-CH3OH (1:1) (0.1% TFA) 용매 혼합물로 용리되어 친수성 불순물이 제거될 수 있다. 그 후, 생성물은 CH3CN-CH3OH (1:1) (0.1% TFA)에서 물 (0.1% TFA)로의 구배를 이용하여 용리될 수 있다. 수집된 분획물은 ELS 검출기를 이용한 역상 HPLC에 의해 분석될 수 있으며, 이는 강한 UV 발색단을 갖지 않는 종종 불리하기 어려운 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염과 목적 생성물의 검츨을 가능하게 한다. 이는 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 및 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염의 분명한 분리를 나타낸다. 순수한 생성물-함유 분획물이 수집될 수 있으며, 이는 회전 증발기에서 농축되고 (메탄올의 함량을 저하시키기 위해), 동결건조되어 무색 고형물로서 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트가 제공될 수 있다.
필요량의 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 제조하기 위해, 0.5g 내지 1.0g의 전구체 다이머 펩티드를 사용하여 수회 진행될 수 있다. 모든 경우에, 표적 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트는 57-60% 수율 및 99% 초과의 순도로 분리될 수 있다. 상기 기술된 일련의 진행으로부터 수득된 대량의 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트는 t-부탄올-아세토니트릴-물 (1:1:3)중에 개별적 진행으로부터 생성물이 용해된 후, 동결건조됨으로써 수득될 수 있다. 유리 티올의 정량적 추정을 위한 엘만 (Ellman) 공정이 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 대량 샘플에 적용될 수 있다; 유리 티올은 존재하는 경우, 검출 한계 미만으로 존재할 것이다. 아미노산 조성물 분석은 지정된 구조의 펩티드 유도체를 지지하는 허용가능한 한계내의 결과를 보여준다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석은 추정된 구조의 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 지지한다.
TFA 수준이 낮거나 무시해도 좋을 정도의 수준인 다이머 - 포스포리피드 컨쥬게이트의 제조 방법
본 발명은 매우 낮은 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트를 생성하는 방법을 제공한다. 그램 규모로 이러한 컨쥬게이트를 합성하고 정제하기 위한 특정 방법이 제공되지만, lyso-버젼의 컨쥬게이트 형성은 5℃에서 동결건조된 물질의 저장시 또는 컨쥬게이트 수용액의 저장시 관찰될 수 있다. lyso-화합물은 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트중의 포스포리피드 지방산 에스테르중 하나의 TFA-조장된 산 가수분해에 의해 형성된다.
약제학적으로 허용가능한 반대이온을 갖는 안정한 물질로서 포스포리피드 펩티드를 수득하기 위해, 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트의 TFA 염 또는 임의의 적합한 전구체(들)을 약제학적 아세테이트 염(들) 유사체로 전환시키는, 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트를 수득하기 위한 매우 효과적인 방법이 밝혀졌다. 이들 방법의 대표적인 구체예가 하기에 제공되어 있다.
표 3은 도 6, 7 및 8에 도시된 식별 라벨에 대한 기술을 제공한다.
Figure 112013073468602-pat00003
여기서, m, n, x, y, z는 냉동건조 조건에 따라 변화가능하다.
도 6 및 7에 있어서, 특정 구체예에서, 헤테로다이머 펩티드 (27)의 단량체 펩티드 성분 즉, TFA 염 화합물 (22) 및 (25)는, 암모늄 아세테이트의 단계 구배를 이용하여 마크로포러스 설폰산 양이온 교환 수지 AG MP-50상에서 이온 교환 크로마토그래피되어 이의 아세테이트 염으로 전환된다. 그 후, 두개의 펩티드 단량체 아세테이트 (23) 및 (26)은 글루타릴 링커를 통해 서로 구속되어 아세테이트 염으로서 다이머 (27)를 형성할 수 있다. 10mM NH4OAc를 각각 함유하는 CH3CN/H2O를 사용한 선형 구배 방법을 이용한 C-18 분취용 HPLC에 의해 (27)의 미정제 다이머 아세테이트 염 (27)을 정제하여 순수한 다이머 아세테이트 (27)를 제공한다. 이러한 다이머를 DSPE-PEG2000-NH2 (29)에 컨쥬게이션시키고, 미정제 혼합물을 CH3CN/H2O/NH4OAc를 이용한 C-3 분취용 HPLC에 의해 최종 정제하여 아세테이트 염으로서 화합물 (21)을 제공한다.
더욱 특히, 화합물 (22), (25) 및 (27)은 모두 측쇄 카르복실산 및 아미노기를 함유한다. AG MP-50, 마크로포러스 양이온-교환 수지는 펩티드를 수지에 전체 침투시키고, 이의 염기성 (아미노 및 구아니딘) 기를 통해 펩티드를 고정화시키는데 사용될 수 있다. 펩티드의 TFA 염은 AG MP-50 칼럼 (설폰산 형태)에 흡착될 수 있으며, 칼럼은 물로 세척되고, 펩티드의 용해도에 따라 0 또는 30% CH3CN/H2O중에서 NH4OAc의 단계 구배로 용리된다. 펩티드는 약 600mM NH4OAc로 용리될 수 있으며, 그 후, 아세테이트 형태의 펩티드가 순수한 형태로 수득될 수 있다. IC 불소 분석 및 CE TFA 반대이온 분석은 일관되게 낮은 TFA 함량의 펩티드를 나타낸다.
바람직한 방법은 또한, 최종 펩티드를 수차례 재용해/재동결건조하여 잔여 NH4OAc를 제거하는 것을 포함한다. 다르게는, 펩티드중에 존재하는 잔여량의 NH4OAc는 DIEA의 존재하에 유리 암모니아를 발생시킬 수 있다. 이는 단량체 (23) 및 (26)으로부터 (27), 또는 (27)의 아세테이트 염으로부터 최종 포스포리피드-펩티드 컨쥬게이트 (21)의 후속 제조시 주요 생성물로서 원하지 않는 펩티드-Glut-아미드의 형성을 초래한다.
도 7에 있어서, 또 다른 구체예에서는 마크로포러스 설폰산 양이온 교환 수지 AG MP-50상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 다이머 (27)의 TFA 염이 이의 아세테이트 염 유사체로 전환된다. 그 후, 이러한 다이머 아세테이트는 DSPE-PEG2000-NH2와 컨쥬게이팅되고 이어서, CH3CN/H2O/NH4OAC를 사용한 C-3 분취용 칼럼에 의해 미정제 물질을 정제하여 아세테이트 염으로서 최종 화합물 (21)을 제공한다.
상기 및 도 6 및 7에 기술된 방법이 탁월한 결과를 제공하는 반면, 이러한 제 2 방법은 더 적은 단계가 요구된다는 이점을 갖는다. 더욱 상세한 내용은 실시예에 제공된다.
도 8에 있어서, 또 다른 구체예에서는 포스포리피드-펩티드 컨쥬게이트 (21)과 TFA 이온간의 크기 차이를 이용하여 최소량을 TFA를 갖는 다이머 컨쥬게이트를 제공하는 방법을 제공한다. 본 구체예에서, 21ㆍnTFA 부산물은 암모늄 중탄산염 완충제의 존재하에 크기 배제 칼럼 아래로 용리될 수 있다. 미정제 21ㆍnTFA는 아세토니트릴로부터 물로의 선형 구배를 이용하여 조르박스 C-3 칼럼 (Zorbaz C-3 column)상에서 분취용 HPLC에 의해 lyso-화합물이 유리될 수 있다. 두 상은 10mM 암모늄 아세테이트로 완충될 수 있다. 이에 의해 분석용 HPLC에 의해 나타난 바와 같이 lyso-화합물이 분리된다.
TFA의 양을 추가로 감소시키기 위해, 본 물질은 세파덱스 G-25 칼럼에 가해지고, 암모늄 중탄산염 수용액으로 용리될 수 있다. 용리제는 HPLC에 의해 모니터링될 수 있다. 생성물 함유 분획물은 풀링되고, 냉동 건조되어 본질적으로 TFA를 함유하지 않는 목적 물질 (21)을 높은 회수율로 제공할 수 있다. 더욱 상세한 내용은 실시예에 제공되었다.
본원에 기술된 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트는 초음파 조영제 예를 들어, 기체 충전된 미세소포로 혼입될 수 있다. 이러한 기체 충전된 미세소포는 예를 들어, 기체 충전된 마이크로버블, 기체 충전된 마이크로벌룬, 기체 충전된 마이크로캡슐 등을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트는 기체 충전된 마이크로버블을 포함하는 초음파 조영제에 혼입될 수 있다. 포스포리피드 및 포스포리피드 컨쥬게이트로부터의 기체 충전된 마이크로버블의 제조 방법은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 마이크로버블은 하기 특허중 하나에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다: EP 554213, WO 04/069284, U.S. Pat. No. 5,413,774, U.S. Pat. No. 5,578,292, EP 744962, EP 682530, U.S. Pat. No. 5,556,610, U.S. Pat. No. 5,846,518, U.S. Pat. No. 6,183,725, EP 474833, U.S. Pat. No. 5,271,928, U.S. Pat. No. 5,380,519, U.S. Pat. No. 5,531,980, U.S. Pat. No. 5,567,414, U.S. Pat. No. 5,658,551, U.S. Pat. No. 5,643,553, U.S. Pat. No. 5,911,972, U.S. Pat. No. 6,110,443, U.S. Pat. No. 6,136,293, EP 619743, U.S. Pat. No. 5,445,813, U.S. Pat. No. 5,597,549, U.S. Pat. No. 5,686,060, U.S. Pat. No. 6,187,288, 및 U.S. Pat. No. 5,908,610; 이들은 본원에 참고문헌으로 인용됨. WO 04/069284에 기술된 방법이 특히 바람직하다.
적합한 포스포리피드는 지방산 (동일하거나 상이함) 및 인산의 하나 또는 두 분자를 갖는 글리세롤의 에스테를 포함하며, 여기서 인산 잔기는 친수성 기 예컨대, 콜린, 세린, 이노시톨, 글리세롤, 에탄올아민 등의 기에 결합된다. 포스포리피드중에 존재하는 지방산은 포화되거나 하나 이상 불포화기를 함유할 수 있는 일반적으로, 12 내지 24개 탄소 원자, 바람직하게는, 14 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 장쇄 지방족 산이다. 적합한 지방산의 예로는 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 올레산, 리놀산 및 리놀렌산이 있다. 포스포리피드의 모노 에스테르는 포스포리피드의 "lyso" 형태로서 당해분야에 공지되어 있다.
포스포리피드의 추가의 예로는 포스파티드산 즉, 지방산을 갖는 글리세롤-포스포르산의 디에스테르, 스핑고미엘린 즉, 지방산을 갖는 글리세롤 디에스테르의 잔기가 세라미드 사슬로 대체된 포스파티딜콜린 유사체, 카르디오리핀 즉, 지방산을 갖는 1,3-디포스파티딜글리세롤의 에스테르, 강글리오시드, 세레브로시드 등이 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 포스포리피드는 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있는 천연 발생, 반합성 또는 합성에 의해 제조된 생성물을 포함한다.
천연 발생 포스포리피드의 예로는 천연 레시틴 (포스파티딜콜린 (PC) 유도체) 예컨대, 전형적으로, 대두 또는 노른자 레시틴이 있다. 반합성 포스포리피드의 예로는 천연 발생 레시틴의 부분적으로 또는 전체적으로 수소화된 유도체가 있다.
합성 포스포리피드의 예로는 예를 들어, 디라우릴로일-포스파티딜콜린 ("DLPC"), 디미리스토일포스파티딜콜린 ("DMPC"), 디팔미토일-포스파티딜콜린 ("DPPC"), 디아라키도일포스파티딜콜린 ("DAPC"), 디스테아로일-포스파티딜콜린 ("DSPC"), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린 ("MPPC"), 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린 ("PMPC"), 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린 ("PSPC"), 1-스테아로일-2-팔미토일-포스파티딜콜린 ("SPPC"), 디올레오일포스파티딜콜린 ("DOPC"), 1,2 디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (에틸-DSPC), 디라우릴로일-포스파티딜글리세롤 ("DLPG") 및 이의 알칼리 금속 염, 디아라키도일포스파티딜글리세롤 ("DAPG") 및 이의 알칼리 금속 염, 디미리스토일포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 이의 알칼리 금속 염, 디팔미토일-포스파티딜글리세롤 ("DPPG") 및 이의 알칼리 금속 염, 디스테아로일포스파티딜글리세롤 ("DSPG") 및 이의 알칼리 금속 염, 디올레오일포스파티딜글리세롤 ("DOPG") 및 이의 알칼리 금속 염, 디미리스토일 포스파티드산 ("DMPA") 및 이의 알칼리 금속 염, 디팔미토일 포스파티드산 ("DPPA") 및 이의 알칼리 금속 염, 디스테아로일 포스파티드산 ("DSPA"), 디아라키도일 포스파티드산 ("DAPA") 및 이의 알칼리 금속 염, 디미리스토일 포스파티딜-에탄올아민 ("DMPE"), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민 ("DPPE"), 디스테아로일 포스파티딜-에탄올아민 ("DSPE"), 디미리스토일 포스파티딜세린 ("DMPS"), 디아라키도일 포스파티딜세린 ("DAPS"), 디팔미토일 포스파티딜세린 ("DPPS"), 디스테아로일포스파티딜세린 ("DSPS"), 디올레오일포스파티딜세린 ("DOPS"), 디팔미토일 스핑고미엘린 ("DPSP"), 및 디스테아로일 스핑고미엘린 ("DSSP")이 있다.
적합한 포스포리피드로 추가로, 친수성 중합체에 결합함으로써 변형된 포스포리피드를 포함한다. 변형된 포스포리피드의 예로는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 변형된 포스파티딜에탄올아민 (PE), 간단하게는, "PE-PEG", 즉, 포스파티딜에탄올아민 (여기서, 친수성 에탄올아민 부분은 가변 분자량 (예를 들어, 300 내지 5000 달톤)의 PEG 분자에 결합됨), 예컨대, DPPE-PEG, DSPE-PEG, DMPE-PEG 또는 DAPE-PEG (여기서, DAPE는 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민임)이 있다. 조성물은 또한, 예를 들어, 지방산 예컨대, 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산 또는 올레산; 스테롤 예컨대, 콜레스테롤, 또는 지방산 또는 당 산을 갖는 스테롤의 에스테르; 글리세롤 또는 글리세롤 에스테르 예컨대, 글리세롤 트리팔미테이트, 글리세롤 디스테아레이트, 글리세롤 트리스테아레이트, 글리세롤 디미리스테이트, 글리세롤 트리미리스테이트, 글리세롤 디라우레이트, 글리세롤 트리라우레이트, 글리세롤 디팔미테이트; 3차 또는 4차 알킬-암모늄 염, 예컨대, 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DSTAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DPTAP), 및 이의 혼합물 또는 조합물을 포함하는 다른 친양쪽성 화합물을 함유할 수 있다.
바람직하게는, 제형은 전체적인 순 전하를 갖는 하나 이상의 성분 예를 들어, 포스파티드산, PE-PEG, 팔미트산, 스테아르산, 에틸-DSPC 또는 DSTAP를 바람직하게는, 약 50% 미만의 몰양으로 포함한다. 특히 바람직한 포물레이션은 하기 성분중 2개 이상의 혼합물을 포함할 수 있다: DSPC, DPPG, DPPA, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, 팔미트산 및 스테아르산. 일부 바람직한 포스포리피드 및 포뮬레이션은 실시예에 기술되어 있다. 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 기체가 사용될 수 있으며; 그러나, 불활성 기체, 예컨대, SF6 또는 퍼플루오로카르본 예컨대, CF4, C3F8 및 C4F10이 바람직하며, 이는 선택적으로, 다른 기체 예컨대, 공기, 질소, 산소 또는 이산화탄소와 혼합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 마이크로버블 현탁액은 본원에 참고문헌으로 인용된 EP 554213; WO 04/069284; U.S. Pat. No. 5,413,774; U.S. Pat. No. 5,578,292; EP 744962; EP 682530; U.S. Pat. No. 5,556,610; U.S. Pat. No. 5,846,518; U.S. Pat. No. 6,183,725; EP 474833; U.S. Pat. No. 5,271,928; U.S. Pat. No. 5,380,519; U.S. Pat. No. 5,531,980; U.S. Pat. No. 5,567,414; U.S. Pat. No. 5,658,551; U.S. Pat. No. 5,643,553; U.S. Pat. No. 5,911,972; U.S. Pat. No. 6,110,443; U.S. Pat. No. 6,136,293; EP 619743; U.S. Pat. No. 5,445,813; U.S. Pat. No. 5,597,549; U.S. Pat. No. 5,686,060; U.S. Pat. No. 6,187,288; 및 U.S. Pat. No. 5,908,610에 기술된 공정을 이용하거나 적합한 용매중에서 미정제 포스포리피드를 동결-건조 또는 분무-건조와 같은 공지된 공정으로 처리함으로써 포스포리피드로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 국제 특허 출원 WO 04/069284에 기술된 바와 같이, 불수용성 유기 용매 및 물의 에멀션중에 분산된 동결건조 보호제 (예를 들어, 본원에 상세하게 지시된 바와 같은 카르보히드레이트, 당 알코올, 폴리글리콜 및 이들의 혼합물) 및 선택적으로, 기타 친양쪽성 물질 (예컨대, 스테아르산)과 혼합된 포스포리피드 (예를 들어, DSPC 및/또는 DSPA)를 함유하는 마이크로에멀션이 제조될 수 있다. 바람직한 유기 용매는 1.0g/l 이하 바람직하게는, 약 0.01g/l 보다 낮은 수중 용해도를 갖는 용매이며, 예를 들어, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 1-펜텐, 2-펜텐, 1-옥텐, 시클로펜탄, 시클로헥산, 시클로옥탄, 1-메틸-시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 1,2-디메틸벤젠, 1,3-디메틸벤젠, 디-부틸 에테르 및 디-이소프로필케톤, 클로로포름, 사염화탄소, 2-클로로-1-(디플루오로메톡시)-1,1,2-트리플루오로에탄 (엔플루란), 2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로에탄 (이소플루란), 테트라클로로-1,1-디플루오로에탄, 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산, 퍼플루오로헵탄, 퍼플루오로노난, 퍼플루오로벤젠, 퍼플루오로데칼린, 메틸퍼플루오로부틸에테르, 메틸퍼플루오로이소부틸에테르, 에틸퍼플루오로부틸에테르, 에틸퍼플루오로이소부틸에테르 및 이의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트는 마이크로에멀션중에서 미세소포 엔벨로프를 형성하는 포스포리피드와 함께 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 및 PE-PEG (예를 들어, DSPE-PEG2000)의 수성 현탁액이 먼저 제조되며, 그 후, 이는 포스포리피드와 동결건조보호제를 포함하는 수성 유기 에멀션과 혼합된다. 바람직하게는, 상기 혼합은 예를 들어, 약 40℃ 내지 80℃에서 가열하에 수행된다.
수성 담체중에 분산되어 마이크로버블 현탁물이 형성되기 전에, 동결 건조되거나 분무 건조된 포스포리피드 분말은 공기 또는 기타 기체와 접촉된다. 수성 담체와 접촉되는 경우, 구조가 파괴된 분말화된 포스포리피드는 박막화된 세그먼트를 형성할 것이며, 이는 여기에 분산된 기체 마이크로버블을 안정화시킬 것이다. 이러한 방법으로 장기간 동안 보관할 경우에도 안정하며, 쉐이킹 또는 격렬한 교반 없이 건조된 박막 포스포리피드 (요망된 기체하에 저장된)를 단순하게 용해시킴으로써 수득되는 마이크로버블 현탁물이 생성된다.
대안적으로, 마이크로버블은 예를 들어, WO 97/29783에 기술된 바와 같이 높은 진탕 속도에서 수용액으로 기체를 현탁시킴으로써 제조될 수 있다. 포스포리피드의 존재하에 수성 매질중의 유기 용매 에멀션을 제조하고, 이어서 선택적인 세척 및/또는 여과 단계 후 상기 에멀션을 동결건조시키는 것을 포함하는 마이크로버블의 추가의 제조 공정은 본원에 참고문헌으로 인용된 WO2004/069284에 기술되어 있다. 일부 바람직한 제조 방법은 실시예에 기술되어 있다.
기체 충전된 마이크로버블을 제조하기 위한 포뮬레이션은 유리하게는, 추가로 동결건조 첨가제 예컨대, 동결방지 및/또는 동결건조보호 효과를 갖는 제제 및/또는 팽창제 예를 들어, 아미노산 예컨대, 글리신; 카르보히드레이트 예를 들어, 당 예컨대, 수크로오스, 만니톨, 말토오스, 트레할로스, 글루코오스, 락토오스 또는 시클로덱스트린, 또는 폴리사카라이드 예컨대, 덱스트란; 또는 폴리글리콜 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG-4000)을 포함할 수 있다.
이러한 초음파 조성물은 가능한한 혈액과 등장성이어야 한다. 따라서, 주입전에, 소량의 등장화제가 상기 임의의 초음파 조영제 현탁액에 첨가될 수 있다. 등장화제는 의약에서 통상적으로 사용되는 생리학적 용액이며, 이들은 염수 수용액 (0.9% NaCl), 2.6% 글리세롤 용액, 5% 덱스트로스 용액 등을 포함한다. 추가적으로, 초음파 조성물은 예를 들어, 에멀션화제, 점도 조절제, 동결방지제, 동결건조보호제, 팽창제 등을 포함하는 표준의 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다.
생체적합성 기체가 본 발명의 초음파 조영제에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "기체"는 일반적인 인간 체온에서 실질적으로 기체 형태인 임의의 물질 (혼합물 포함)을 포함한다. 이러한 기체는 예를 들어, 공기, 질소, 산소, CO2, 아르곤, 제논 또는 크립톤, 플루오르화된 기체 (예를 들어, 퍼플루오로카본, SF6, SeF6 포함), 저분자량 히드로카본 (예를 들어, 1 내지 7개 탄소 원자 함유) 예를 들어, 알칸 예컨대, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 또는 펜탄, 시클로알칸 예컨대, 시클로프로판, 시클로부탄 또는 시클로펜텐, 알켄 예컨대, 에틸렌, 프로펜, 프로파디엔 또는 부텐, 또는 알킨 예컨대, 아세틸렌 또는 프로핀 및/또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 그러나, 플루오르화된 기체가 바람직하다. 플루오르화된 기체는 하나 이상의 불소 원자를 함유하는 물질 예컨대, SF6, 프레온 (하나 이상의 탄소 원자 및 불소를 함유하는 유기 화합물 즉, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, CBrF3, CCl2F2, C2ClF5, 및 CBrClF2) 및 퍼플루오로카본을 포함한다. 용어 퍼플루오로카본은 탄소 및 불소 원자만을 함유하는 화합물을 나타내며, 특히, 포화, 불포화 및 시클릭 퍼플루오로카본을 포함한다. 일반적으로 바람직한 포화된 퍼플루오로카본은 화학식 CnFn + 2을 가지며, 여기서, n은 1 내지 12, 바람직하게는, 2 내지 10, 가장 바람직하게는, 3 내지 8, 심지어 더욱 바람직하게는, 3 내지 6이다. 적합한 퍼플루오로카본은 예를 들어, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4F10, C5F12, C6F2, C7F14, C8F18, 및 C9F2O을 포함한다. 가장 바람직하게는, 기체 또는 기체 혼합물은 SF6, 또는 C3F8, C4F8, C4F10, C5F2, C6F12, C7F14, C8F18로 구성된 군으로부터 선택된 퍼플루오로카본을 포함하며, C4F10이 특히 바람직하다. 또한, WO 97/29783, WO 98/53857, WO 98/18498, WO 98/18495, WO 98/18496, WO 98/18497, WO 98/18501, WO 98/05364, WO 98/17324 참조. 바람직한 구체예에서, 기체는 선택적으로, 공기, 질소, 산소 또는 이산화탄소와 혼합된 C4F1O 또는 SF6를 포함한다.
특정 상황에서, 기체 물질에 대한 전구체를 포함하는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 생체내에서 기체로 전환될 수 있는 물질, 종종 "기체 전구체"로서 불림). 바람직하게는, 기체 전구체 및 이것이 생성하는 기체는 생리학적으로 허용가능하다. 기체 전구체는 pH-활성화, 광-활성화, 온도 활성화 등으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 특정 퍼플루오로카본은 온도 활성화된 기체 전구체로서 사용될 수 있다. 이러한 퍼플루오로카본 예컨대, 퍼플루오로펜탄은 실온 (또는 시제가 생성되고/거나 저장되는 온도) 초과 체온 미만인 액체/기체상 전이 온도를 가지며; 따라서, 이들은 체온내에서 상전이되어 기체로 전환된다.
상기 기술된 바와 같이, 기체는 기체 혼합물을 포함할 수 있다. 하기 조합이 특히 바람직한 기체 혼합물이다: 기체 (A)와 (B)의 혼합물 여기서, 0.5-41 부피%의 양으로 존재하는 하나 이상의 기체 (B)는 80 달톤 초과의 분자량을 가지며, 플루오르화된 기체이며, (A)는 공기, 산소, 질소, 이산화탄소 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되며, 혼합물의 나머지는 기체 A이다.
특별한 저장 조건이 요구되는 것으로 공지된 초편극된 기체를 함유하지 않는 경우, 동결건조된 생성물은 이의 환경의 온도를 조절할 필요 없이 저장되고 수송될 수 있으며, 특히, 특별한 저장 장치 필요없이 즉석 투여가능한 현탁액으로 현장에서 제형화시키기 위한 것으로 병원 및 의사에게 공급될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 경우, 이는 두 성분 키트의 형태로 공급될 수 있으며, 이는 두개의 분리된 컨테이너 또는 이중 챔버 컨테이너를 포함할 수 있다. 전자의 경우, 바람직하게는, 컨테이너는 통상적인 셉텀 밀봉된 바이알이며, 여기서, 단계 b)의 동결건조된 잔류물을 함유하는 바이알이 셉텀으로 밀봉되며, 셉텀을 통해 담체 액체가 선택적으로 사전충전된 주사기를 사용하여 주입될 수 있다. 이러한 경우, 제 2 성분의 컨테이너로서 사용된 주사기가 또한 조영제 주입을 위해 사용된다. 후자의 경우, 바람직하게는, 이중 챔버 컨테이너는 이중 챔버 주사기이며, 동결건조물이 재구성되고 안정하게 혼합되거나 완만하게 쉐이킹되면, 컨테이너가 조영제 주입에 직접 사용될 수 있다. 두 경우 모두, 컨테이너의 내용물로 충분한 버블 형성 에너지의 적용을 유도하거나 허용하는 수단이 제공된다. 그러나, 상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 안정화된 조영제에서, 기체 마이크로버블의 크기는 실질적으로, 재구성된 건조된 생성물에 가해진 교반 에너지의 양에 의존적이다. 따라서, 일반적으로 일관된 마이크로버블 크기를 갖는 재생가능한 생성물을 제공하는데 단지 완만한 수동 쉐이킹만이 요구된다.
멸균 방식으로 수용액과 건조된 분말을 혼합시킬 수 있는 다른 2-챔버 재구성 시스템이 본 발명의 범위내에 있음이 자명하다. 이러한 시스템에서, 수성상이 불수용성 기체와 환경 사이에 위치하는 경우, 생성물의 저장 수명을 증가시키는 것이 특히 유리하다. 조영제 형성에 필요한 물질이 컨테이너에 이미 존재하지 않는 경우 (예를 들어, 재구성 동안 포스포리피드에 결합시키고자 하는 표적화 리간드), 이는 키트의 다른 성분과 함께 바람직하게는, 키트의 다른 성분과의 신속한 혼합을 조장하기에 적합한 형태 또는 컨테이너로 패키징될 수 있다.
비특이적 컨테이너, 바이알 또는 연결 시스템이 요구된다; 본 발명은 통상적인 컨테이너, 바이알 및 어댑터를 사용할 수 있다. 단지 요구되는 것은 스탑퍼와 컨테이너간의 우수한 밀봉이다. 따라서, 밀봉이 최우선적 고려대상이며; 완전 밀봉이 파괴되는 경우 바람직하지 못한 물질이 바이알에 유입된다. 밀봉을 보장하는 것 이외에, 안정하고 적합한 재구성화를 확실히 하기 위해 진공 유지가 대기압 또는 감압하에 차단된 생성물에 필수적이다. 스탑퍼는 엘라스토머를 기재로 하는 화합물 또는 다성분 포뮬레이션 예컨대, 폴리(이소부틸렌) 또는 부틸 고무일 수 있다.
초음파 적용시, 포스포리피드 안정화된 마이크로버블에 의해 형성된 조영제는 예를 들어, 주입된 포스포리피드의 양이 0.1 내지 200㎍/kg 체중, 바람직하게는, 약 0.1 내지 30㎍/kg이 되게 하는 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 초음파 이미지 기법은 칼라 도플러 (Doppler), 파워 도플러, 도플러 진폭, 자극된 어코스틱 이미지, 및 이차원 또는 삼차원 이미지 기법과 같은 공지된 기법을 포함한다. 이미지화는 하모니 (공명 주파수) 또는 기본 모드로 수행될 수 있으며, 이차 하모니 모드가 바람직하다.
본 발명의 초음파 조영제는 추가로, 다양한 치료학적 이미지화 방법에 사용될 수 있다. 용어 치료학적 이미지화는 환자의 질환 치료 방법을 포함한다는 것을 내포하고 있으며, 이는 이미지화 조영제의 사용을 포함하며 (예를 들어, 치료학적 제제의 선택된 수용체 또는 조직으로 전달하기 위함), 실험관내 및/또는 생체내에서 생물학적 효력을 발휘할 수 있거나 생물학적 효력의 발휘를 유도할 수 있다. 치료학적 이미지화는 유리하게는, 예를 들어, 높은 음압 (전형적으로, 비파괴적 진단성 이미지화 방법에 일반적으로 사용된 것보다 더 높음)하에서 초음파 폭발에 의한 기체 충전된 미세소포의 제어된 국소화된 파괴와 관련있을 수 있다. 이러한 제어된 파괴는 예를 들어, 혈전의 치료법 (혈전용해술로서 또한 공지된 기법)에 사용될 수 있으며, 선택적으로, 적합한 치료제의 국소화된 방출과 함께 이용될 수 있다. 대안적으로, 상기 치료학적 이미지화는 미세소포의 국소화된 폭발에 의해 유도된 세포 수준에서의 일시적 막 투과의 결과, 치료제의 세포로의 전달을 포함할 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어, 유전자 물질의 세포로의 효과적 전달에 이용될 수 있다; 선택적으로, 약물은 유전자 물질과 함께 국소적으로 전달되어, 환자의 혼합된 약제/유전자 치료를 가능하게 한다 (예를 들어, 종양 치료의 경우).
용어 "치료제"는 예컨대, 환자의 질환 치료 방법에서 치료학적 적용에 사용될 수 있는 임의의 물질, 조성물 또는 입자, 및 실험관내 및/또는 생체내에서 생물학적 효력을 발휘하거나 이러한 효력을 유도할 수 있는 물질을 포함한다. 이와 같이, 치료제는 환자의 병리학적 상태 (질병, 고통, 질환 병변 또는 상처)의 치료 (진단, 예방, 완화, 통증 경감 또는 치료 포함)에 사용될 수 있는 화합물 또는 물질을 포함한다. 치료제의 예로는 약물, 약제, 생활성제, 세포살상제, 화학치료제, 방사선치료제, 단백질, 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 천연 또는 합성 펩티드, 비타민, 스테로이드 및 누클레오시드, 누클레오티드, 올리고누클레오티드, 폴리누클레오티드 및 플라스미드를 포함하는 유전자 물질이 있다.
재료 및 분석 방법
반응, 크로마토그래피 정제 및 HPLC 분석용 용매는 VWR 코포레이션 (West Chester, PA)로부터의 이. 머크 옴니 (E. Merk Omni) 등급 용매 이다. N- 메틸피롤리디논 (NMP) 및 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)는 팜코 프로덕츠 인크. (Pharmco Products Inc.) (Brookfield, CT)로부터 수득되며, 펩티드 합성 등급 또는 낮은 물/아민 비함유 바이오테크 등급이다. 피페리딘 (시퀀싱 등급, 재증류된 99+%) 및 트리플루오로아세트산 (TFA) (스펙트로포토미터 등급 또는 시퀀싱 등급)을 시그마-알드리히 코포레이션 (Milwaukee, WI) 또는 시그마-알드리히 코포레이션의 플루카 케미칼 디비젼 (Fluka Chemical Division of Sigma-Alrich Corporation)으로부터 수득되었다. N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 페놀 (99%), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA) 및 트리이소프로필실란 (TIS)을 시그마-알드리히 코포레이션으로부터 구입하였다. Fmoc-보호된 아미노산, 슈도프롤린 디펩티드, Fmoc-Asp(O-tBu)-Ser(ψMe , Mepro)-OH 및 Fmoc-Gly-Thr(ψMe , Mepro)-OH 및 N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 노바바이오켐 (Novabiochem) (San Diego, CA)으로부터 수득하였다. Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥타노산 (Adoa)을 네오MPS 코프 (NeoMPS Corp) (San Diego, CA) 또는 수벤 라이프 사이언스 (Suven Life Sciences) (Hyderabad, India)로부터 수득하였다. 디숙시니미딜 글루타레이트 (DSG) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민-N-[아미노 (폴리에틸렌글리콜)2000] 암모늄 염, [DSPE-PEG2000-NH2]를 각각 피어스 케미칼 코. (Pierce Chemical Co.) (Rockford, IL.) 및 안반티®폴라 리피드 (Avanti® Polar Lipids) (Alabaster, AL)로부터 수득하였다. Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH 및 Fmoc-Gly-Gly-OH를 Fmoc-OSu와의 반응에 의해 상응하는 트리글리신 또는 디글리신으로부터 사내 제조하였다. AG MP-50 이온-교환 수지를 바이오-라드 (Bio-Rad) (Hercules, CA)로부터 수득하였다.
분석용 HPLC 데이타는 일반적으로, 워터스 엑스테라 MS-C18 4.6 x 50mm 칼럼 (입자 크기: 5μ; 120Å 포어 크기)을 사용한 시마드주 LC-10AT VP 이중 펌프 구배 시스템 (Shimadzu LC-10AT VP dual pump gradient system) 및 용리제 A로서 물을 사용하고, 용리제 B로서 CH3CN (0.1% TFA) 또는 CH3CN-CH3OH (1:1, v/v) (0.1% TFA)를 사용한 구배 또는 등용매 용리 시스템을 사용하여 수득되었다. 화합물의 검출은 220 및 254nm의 UV를 사용하여 달성된다. 포스포리피드-PEG-펩티드 유도체의 순도는 UV 검출기와 SEDEX 55 라이트 스캐터링 디텍터 (Light Scattering Detector: LSD)를 사용하여 YMC C-4 (5μM, 300Å, 4.6x250mm) 칼럼 또는 조르박스 (Zorbax) 300 SB-C3 (3.5μM; 300Å, 3x150mm) 칼럼에서 측정하였다.
분취용 HPLC를 분취용 유동 세포에 맞춰진 SPD-10AV UV 검출기가 구비된 시마드주 LC-8A (Shimadzu LC-8A) 이중 덤프 구배 시스템상에서 수행하였다. 일반적으로, 미정제 펩티드를 함유하는 용액을 분취용 시마드주 LC-8A 이중 펌프 구배 시스템에 부착된 제 3 펌프를 사용하여, 화합물 특징에 따라 역상 C18, C4 또는 C3 칼럼에 로딩하였다. 미정제 생성 혼합물의 용액을 분취용 HPLC 칼럼에 가한 후, 반응 용매 및 희석제로서 사용된 용매 예컨대, DMF 또는 DMSO를 낮은 유기상 조성으로 칼럼으로부터 용리시켰다. 그 후, 목적 생성물을 용리제 B로부터 용리제 A로의 구배 용리를 이용하여 용리시켰다. 생성물 함유 분획물을 분석용 HPLC 및 질량 스펙트럼 분석에 의해 측정된 바와 같은 이들의 순도에 기초하여 조합하였다. 조합된 분획물을 동결 건조하여 목적 생성물을 제공하였다.
아미노산 조성물 검정을 케크 바이오테크놀로지 리소스 라보라토리 (the Keck Biotechnology Resource Laboratory at Yale University, New Haven, CT.)에서 수행하였다. 질량 스펙트럼 데이타를 MScan Inc. (606 Brandywine Parkway, West Chester PA 19380)로부터 획득하거나, 어질런트 LC-MSD 1100 매스 스펙트로미터 (Agilent LC-MSD 1100 Mass Spectrometer)상에서 사내 수득하였다. 분획 선택 및 생성물의 특성결정을 위해, 음이옴 모드에서 API-ES를 사용하여 질량 스펙트럼 값을 수득하였다. 일반적으로, 표적 펩티드의 분자량은 ~3000이며; 질량 스펙트럼은 일반적으로, [M-H]- 보다는 이중 또는 삼중으로 음으로 하전된 이온 질량 값을 나타내었다. 이는 HPLC 정제 동안 순수한 펩티드를 수득하기 위해 수집 및 조합을 위한 분획 선택에 일반적으로, 이용되었다. 일부 경우에, 분획물은 질량 스펙트럼에서 [M-2H]/2 + 57 또는 [M-2H]/2 + 114에 기인한 우세 피크를 나타내었다. 이들 피크는 펩티드 분자당 1 또는 2개의 트리플루오로아세트산 분자의 부산물의 형성으로 인한 것이다. MS 결과와 HPLC 순도 비교에 의한 분획물의 조심스러운 수집 및 동결 건조 공정 후, 소량의 분리된 솜털깥은 고형물을 물 (0.5mg/mL)중에 용해시키고, 수성 N-메틸-D-글루카민 (~ 0.5 M) 방울로 처리하였다. 이러한 용액을 정제된 펩티드의 최종 순도 결과를 위해 HPLC 및 MS에 의해 분석하였다. N-메틸-D-글루카민의 존재하에 펩티드 용액은 질량 스펙트럼에서 [M-2H]/2 + 57 또는 [M-2H]/2 + 114 질량값 피크를 나타내지 않았으며, 대신 예상된 [M-2H]/2 또는 [M-3H]/3 피크가 관찰되었다.
하기 비제한적 실시예는 고도로 정제된 형태의 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 대량으로 수득하는데 사용된 효과적인 공정에 대한 추가적인 상세한 내용을 제공한다. 이러한 비제한적인 실시예는 또한, 이들 단량체 및 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 포함하는 대표적인 표적화된 마이크로버블의 제법을 기술하고 있다. 이들 실시예는 또한, KDR-트랜스펙션된 세포상의 정적 결합 시험 및 rh VEGF-R2/Fc 키메라 단백질상에서의 동적 결합 시험에서 이러한 표적화된 마이크로버블의 용도를 기술한다. 실시예는 추가로, 래빗 VX2 종양 모델에서 KDR 결합 리포펩티드를 함유하는 초음파 조영제의 평가를 기술하고 있다.
본 발명에 따른 컨주게이트 및 이를 포함하는 초음파 조영제는 특히, 치료학적 및 예방학적 방법 예컨대, KDR-함유 조직의 이미지화, 및 종양성 질환과 관련된 혈관신생생성 과정의 평가 및 치료에 유용하다. 본 발명은 또한, 고도로 순수한 다이머 및 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 및 이러한 컨쥬게이트를 형성하는데 사용된 전구체 물질의 대규모 생성을 위한 공정을 제공한다.
도 1은 선형 펩티드 단량체 (2)로부터 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)의 생성 방법을 나타낸다.
도 2는 KDR에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 펩티드를 포함하는 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)를 나타낸다.
도 3은 펩티드 단량체로부터 전구체 다이머 펩티드 (16)의 생성 방법을 나타낸다.
도 4는 KDR에 대해 고친화도로 결합하는 펩티드를 함유하는 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 제조하기 위한 DSPE-PEG2000-NH2로 도 1에 도시된 전구체 다이머 펩티드를 컨쥬게이팅시키는 방법을 나타낸다.
도 5는 KDR에 고친화도로 결합하는 펩티드를 함유하는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 나타낸다.
도 6은 최소 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (예컨대, (21))의 생성 방법을 나타낸다.
도 7은 최소 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (예컨대, (21))의 또 다른 생성 방법을 나타낸다.
도 8은 최소 수준의 TFA를 갖는 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트의 또 다른 생성 방법을 나타낸다.
도 9는 KDR에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 또 다른 대표적인 단량체 펩티드 (32)를 나타낸다.
도 10은 도 9에 도시된 단량체 펩티드를 포함하는 또 다른 단량체 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (31)를 나타낸다.
도 11A-C는 1) 기준선 (도 11A)에서; 2) 25분 후 (도 11B); 및 3) 기준선 및 자유로운 순환 버블을 감한 후 (도 11C)에 조영제중의 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (11) (도 52에 도시됨)를 사용함으로써 수득된 이미지를 나타낸다.
도 12A-C는 1) 기준선 (도 12A)에서; 2) 25분 후 (도 12B); 및 3) 기준선 및 자유로운 순환 버블을 감한 후 (도 12C)에 조영제중의 단량체 포스포리피드 펩티드 컨쥬게이트 (1) (도 2에 도시됨)를 사용함으로써 수득된 이미지를 나타낸다.
하기 실시예 1-2는 도 2에 도시된 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 이러한 화합물을 합성하는 공정은 도 1에 도시되어 있다. 이들 실시예는 더욱 특히, 도 2에 도시된 화합물을 합성하는 공정에 관한 것이지만, 유사한 공정이 도 10에 도시된 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 및 도 9에 도시된 선형 펩티드 단량체 (32)와 기타 단량체 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트를 제조하는데 이용될 수 있다. 또한, 공동계류중인 U.S. 출원 10/661,156 (2003년 9월 11일 출원)에는 펩티드 단량체의 제조 방법이 기술되어 있으며, 이는 본원에 참고문헌으로 인용되었다.
실시예 1
선형 펩티드 단량체 (2) Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2, (SEQ ID NO. 2) Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2; N-아세틸-L-알라닐-L-글루타미닐-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-이소류실-L-류실-L-세릴-L-메티오닐-L-알라닐-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-류실-L-아르기닐-L-히스티딜-L-알라닐-L-페닐알라닐-L-류실-L-세릴-글리실-글리실-글리실-글리실-글리실-L-리신아미드의 고체상 합성 (SPPS) 및 정제
선형 펩티드 단량체 (2)를 DMF중의 Fmoc-Pal-Peg-PS 수지 (0.2mmol/g), Fmoc-보호된 아미노산 및 DIC-매개된 HOBt 에스테르 활성화를 이용하여 소나타®/파일롯 펩티드 합성기상에서 확립된 자동화 프로토콜에 따라 합성하였다. 펩티드 서열을 통상, 10mmol 규모로 Fmoc-Pal-Peg-PS 수지상의 SPPS 방법에 의해 단계식으로 합성하였다. DMF중의 DIC-MHOBt 시약 쌍과 각 4배 과량의 아미노산으로 아미노산 커플링을 수행하였다.
전형적인 아미노산 커플링에서, 수지 그램당 5mL의 무수 DMF를 사용하였다. 사용된 수지에 기초하여 계산된 DMF의 총 부피를 용액 제조용 아미노산, HOBt 및 DIC중에 할당하였다. 예를 들어, 50g (10mmol 스케일) 수지를 포함하는 합성에서, 계산된 부피의 250mL DMF를 아미노산 (150 mL), HOBt (50 mL) 및 DIC (50 mL)중에 분배시켰다. 소나타 파일롯 펩티드 합성기상의 아미노산 용기를 고형의 무수 아미노산 (수지에 대해 4배 과량)으로 충전시켰다. 커플링 단계 시작시, 장치의 소프트웨어를 사용하여 선택된 부피의 DMF (아미노산 희석용), DMF중의 HOBt (4 당량) 및 DMF중의 DIC (4 당량)를 연속적으로 전달하고, 질소 버블링 혼합을 개시하고, 4분 동안 수행하였다. 이는 아미노산를 사전-활성화시키고, 혼합물의 모든 성분의 완전한 용해를 보장한다. 활성화 후, 소프트웨어는 활성화된 Fmoc-아미노산 용액의 수지를 함유하는 반응 용기로의 전달을 매개하였다. 전달이 완료된 후, 용기를 순환 질소 버블링하에 3시간 동안 교반하였다. 3시간의 커플링 시간 후, 수지를 DMF (5 mL/g, 6x)로 완전히 세척하고, HOBt (0.1M) (2x10분)를 함유하는 DMF (5 mL/g)중의 25% 피페리딘으로 Fmoc-기의 절단을 수행하였다. 수지를 DMF (5 mL/g, 6x)로 완전히 세척하여 계속되는 아미노산 커플링을 위한 준비시 수지로부터 피페리딘의 완전한 제거를 보장하였다. Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH 및 Fmoc-Gly-Gly-OH의 경우, 본문에 논의된 바와 같이 활성화 시간 동안 디케토피페라진의 형성을 최소화하기 위해 아미노산 병중에서의 사전 활성화를 수행하지 않았다. 따라서, 두 경우에서, 아미노산, HOBt 및 DIC의 용액을 반응 용기에 차례로 첨가하고, 커플링 공정을 본래 장소에서의 활성화로 수행하였다.
사슬 연장 완료 후, N-말단 아미노산의 Fmoc 기를 표준 방식으로 제거하고, DMF로 표준 세척하였다 (상기 참조). 그 후, N-말단 아미노산을 새로 제조된 아세틸화 혼합물 (DMF/6mL/수지 g중의 0.5M 아세트산 무수물, 0.125M DIEA 및 0.015M HOBt), 2 x 20 min로 처리함으로써 캡핑하였다. 펩티드 합성 완료 후, 수지를 절단 칵테일 '시약 B' (TFA:물:페놀:트리이소프로필실란, 88:5:5:2, v/v/w/v) (10 mL/수지 g)으로 4시간 동안 처리하였다. 휘발 물질을 제거하고, 수득된 페이스트를 에테르로 분쇄하여 고형물을 수득하고, 이를 중간에 원심분리하면서 (상청액을 경사분리하기 위해 현탁된 고형물을 압축시키기 위해) 에테르 (3x)로 세척하고, 진공하에 건조하여 회백색 고형물로서 요망되는 펩티드를 제공하였다. 선형의 펩티드 단량체 (2)의 10mmol 규모의 합성에 의해 33.82g (이론값의 103%)의 미정제 펩티드를 수득하였다. 이론적 수득량보다 더 많은 것은 아마도 수분 및 잔여 용매로 인한 것으로 보인다.
선형 펩티드 단량체 (2) Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2 (SEQ ID NO. 2); Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 ; N-아세틸-L-알라닐-L-글루타미닐-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-이소류실-L-류실-L-세릴-L-메티오닐-L-알라닐-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-류실-L-아르기닐-L-히스티딜-L-알라닐-L-페닐알라닐-L-류실-L-세릴-글리실-글리실-글리실-글리실-글리실-L-리신아미드의 정제
미정제 선형 펩티드 단량체 (2)의 ~0.5g을 최소량의 CH3CN (~20 mL)중에 용해시켰다. 용액 부피를 물로 ~100 mL로 조절하고, 제 3 펌프를 사용하여, 용액을 물중의 10% CH3CN (0.1% TFA)으로 사전평균화시킨 역상 C18 분취용 칼럼 (워터스, 엑스테라스® Prep MS C18, 10μ, 3O0Å, 50 x 250 mm, 유속 100 mL/min)상에 로딩하였다. 칼럼을 샘플 용액의 적용 동안에는 평균화 용리제로 용리시키지 않았다. 샘플 용액을 칼럼에 가한 후, 용리제의 조성물을 1분에 걸쳐 20% CH3CN-물 (0.1% TFA)로 램핑시키고, 0.6%/분의 속도로 CH3CN (0.1% TFA)의 물 (0.1% TFA)로의 선형 구배를 개시하고, 50분 동안 유지하였다. 분획물 (15mL)을 생성물 용리 지시제로서 220nm UV를 이용하여 수동으로 수집하였다. 수집된 분획물을 워터스 엑스테라 분석용 역상 C-18 칼럼 (5μ 입자, 120Å 포어)상에서 분석하고, 95% 초과 순도의 생성물 함유 분획물을 풀링시키고 동결 건조하여 상응하는 순수한 선형 펩티드 단량체 (2)를 수득하였다. 전형적으로, 0.5g의 미정제 (2)를 정제하면 0.12g (25% 수율)의 목적 생성물 (95% 초과 순도)을 수득하였다.
실시예 2
단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2 (SEQ ID NO. 1); Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2; N-아세틸-L-아르기닐-L-알라닐-L-글루타미닐-L-아스파르틸-L-트립토필-L-트립토필-L-아스파르틸-L-이소류실-L-글루타밀-L-류실-l-세리닐-L-메티오닐-L-알라닐-L-아스파르틸-L-글루타미닐-L-류실-L-아르기닐-L-히스티딜-L-알라닐-L-페닐알라닐-L-류실-L-세리닐-글리실-글리실-글리실-글리실-글리실-L-리신아미드의 정제
단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1), Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2 (SEQ ID NO. 1)를 (3) 즉, 펩티드 단량체 (2)의 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르를 DSPE-PEG2OOO-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (4)과 컨쥬게이션시킴으로써 제조하였다.
자석 교반 막대 및 셉텀 캡이 장착된 둥근 바닥 플라스크를 무수성 디메틸포름아미드 (7.5 mL), 디숙시니미딜 글루타레이트 (DSG, 0.25 g, 0.75 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.10 g, 0.78 mmol)으로 교반하면서 연속하여 충전시켰다. 고체 선형 펩티드 단량체 (2) (0.5 g, 0.152 mmol)를 상기 용액에 2분에 걸쳐 적가하고; 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 무수성 에틸 아세테이트로 ~50mL으로 희석하였으며; 그 결과, 중간체 모노-NHS 에스테르 (3) 즉, 펩티드 단량체 (2)의 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르가 침전되었다. 용액을 원심분리하여 무색 고형물로서 모노-NHS 에스테르 (3)가 아래에 모이도록 하였다. 과량의 DSG를 함유하는 상청액을 압축된 고형의 모노-NHS 에스테르 (3)로부터 경사분리하고, 상기 에스테르를 다시 에틸 아세테이트중에 분산시키고, 원심분리하고, 2회 초과로 세척하여 잔류하는 미량의 DSG를 제거하였다. 이와 같이 수득된 고형의 중간체 모노-NHS 에스테르 (3)를 무수성 DMF (10.0mL)중에 용해시키고; 디이소프로필에틸아민 (0.10 g, 0.78 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 교반하였다.
한편, DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (4) (0.38 g, 0.14 mmol, 0.9 당량)을 별도 플라스크의 무수 디클로로메탄 (2 mL)중에 현탁하고, 트리플루오로아세트산 (2 방울)을 첨가하여 디클로로메탄중의 포스포리피드 암모늄 염의 고형화를 촉진하는 포스포디에스테르 산소를 양성자화시켰다. 그 후, 투명한 용액을 회전 증발기상에서 증발시켜 휘발 물질을 제거하고, 진공하에 추가로 건조시켰다.
고형의 포스포리피드 암모늄 염 (4)을 DMF (5 mL)중에 용해시키고, 모노-NHS 에스테르 (3)의 교반된 용액에 옮기고, 생성 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 100mL의 CH3OH 및 CH3CN-물 (1:1, v/v)의 1:1 혼합물로 희석하고, 불용물을 여과하였다. 여과된 용액의 반을 100mL/분의 유속으로 물 (0.1% TFA)와 CH3OH-CH3CN (1:1, v/v, 0.1%TFA)의 3:1 (v/v) 혼합물로 사전-평균화시킨 역상 C2 분취용 칼럼 (크로마실® Prep C2, 10μ, 300Å, 50 x 250 mm)상에 로딩하였다. 샘플의 로딩 동안에는 평균화 용리제로 칼럼을 용리시키지 않았다. 샘플 용액을 로딩한 후, DMF 플러그가 용리될 때 까지 칼럼을 평균화 용리제로 세척하였다. 용리제의 조성물을 9분에 걸쳐 70% CH3OH-CH3CN (1:1, 0.1% TFA)로 램핑시키고, CH3OH-CH3CN (1:1, 0.1%TFA)의 물 (0.1% TFA)로의 0.75%/분의 선형 구배를 개시하여, 40분 동안 진행시켰다. 분획물 (15mL)을 생성물 용리에 대한 개시제로서 UV (220 nm)를 이용하여 수집하였다. 220nm에서의 UV를 사용한 분석용 HPLC 시스템 (칼럼: YMC C-4, 5μ, 300Å, 4.6 x 250 mm) 및 증기화 광산란 검출기 (ELSD)에서 순도를 체크하였다. 후자의 검출기 (ELSD)를 사용하여, 220nm에서 매우 적은 UV 흡광도를 갖는 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (4)을 검출하였다. 98% 초과 순도를 가지며, DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (4)이 결여된 생성물 함유 분획을 조합하고, 회전 증발기에서 농축하여 CH3OH의 함량을 저하시켰다. 그 후, 농축된 용액을 미량의 솜털같은 침전물이 형성될 때 까지 물중의 10% CH3CN으로 희석하였다. 생성 용액을 동결 건조하여 무색 고형물로서 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)를 수득하였다. 미정제 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)의 제 2 부분을 상기 기술된 바와 같이 정제하였다. 표적 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)의 조합된 수득량은 0.40g (47% 수율)이었다.
하기 실시예 3-5는 도 5에 도시된 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 다이머 컨쥬게이트를 합성하는 대표적인 방법은 도 3, 4, 6, 7 및 8에 도시되어 있다.
실시예 3
단량체 펩티드 (12) Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2 및 (13) Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2의 고체상 합성 (SPPS), 고리화 및 정제
선형 펩티드를 DMF중의 Fmoc-Pal-Peg-PS 수지 (0.2mmol/g), Fmoc-보호된 아미노산 및 DCI-매개된 HOBt 에스테르 활성화를 이용하여 소나타®/파일롯 펩티드 합성기상에서 확립된 자동화 프로토콜에 따라 합성하였다. 펩티드 서열을 통상, 10mmol 규모로 Fmoc-Pal-Peg-PS 수지상에서 SPPS 방법에 의해 단계식으로 합성하였다. DMF중의 DIC-MHOBt 시약과 각 4배 과량의 아미노산으로 아미노산 커플링을 수행하였다.
전형적인 아미노산 서열 커플링에서, 수지 그램당 5mL의 무수 DMF를 사용하였다. 사용된 수지에 기초하여 계산된 DMF의 총 부피를 용액 제조용 아미노산, HOBt 및 DIC중에 할당하였다. 예를 들어, 50g (10mmol 스케일) 수지를 포함하는 합성에서, 계산된 부피 250mL DMF를 아미노산 (150 mL), HOBt (50 mL) 및 DIC (50 mL)중에 분배시켰다. 소나타® 파일롯 펩티드 합성기상의 아미노산 용기를 고체 건조 아미노산 (수지에 대해 4배 과량)으로 충전시켰다. 커플링 단계 시작시, 선택된 부피의 DMF, DMF중의 HOBt (4 당량) 및 DMF중의 DIC (4 당량)를 연속적으로 전달하고, 각각의 전달 후, 질소 버블링 혼합을 수행하였다. 마지막 시약 전달 후, 질소 버블링 혼합물 개시하고 4분 동안 수행하였다. 이는 아미노산를 사전-활성화시키고, 혼합물의 모든 성분의 완전한 용해를 보장한다.
활성화 후, 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 수지를 함유하는 반응 용기로의 전달하였다. 전달이 완료된 후, 용기를 순환 질소 버블링하에 3시간 동안 교반하였다. 3시간의 커플링 시간 후, 수지를 DMF (5 mL/g, 6x)로 완전히 세척하고, HOBt (0.1M)를 함유하는 DMF (5 mL/g)중의 25% 피페리딘으로 Fmoc-기의 절단을 수행하였다 (2x10분). 수지를 DMF (5 mL/g, 6x)로 완전히 세척하여 아미노산 커플링을 위한 준비시 수지로부터 피페리딘의 완전한 제거를 보장하였다. Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH 및 Fmoc-Gly-Gly-OH의 경우, 본문에 논의된 바와 같이 활성화 시간 동안 디케토피페라진의 형성을 최소화하기 위해 아미노산 병중에서의 사전 활성화를 수행하지 않았다. 따라서, 두 경우에서, 아미노산, HOBt 및 DIC의 용액을 반응 용기에 차례로 첨가하고, 커플링 공정을 본래 장소에서의 활성화로 수행하였다. 사슬 연장 완료 후, N-말단 아미노산의 Fmoc 기를 표준 방식으로 제거하고, DMF로 표준 세척하였다 (상기 참조). 그 후, N-말단 아미노산을 새로 제조된 아세틸화 혼합물 (DMF - 6mL/수지 g중의 0.5M 아세트산 무수물, 0.125M DIEA 및 0.015M HOBt), 2 x 20 min로 처리함으로써 캡핑하였다.
단량체 펩티드 (필요에 따라, Fmoc-Adoa 또는 Fmoc-Lys(ivDde)를 가짐)의 C-말단 리신 부분의 ε-아미노기의 작용기화를 먼저 ε-아미노기의 ivDde 기를 새로 제조된 DMF중의 10% 히드라진 (5mL/수지 g - 2 x 10분)으로 제거함으로써 달성하였다. Fmoc-Adoa 또는 Fmoc-Lys(ivDde)를 추가하기 위해서, 커플링 시간을 10시간으로 증가시켰다. 펩티드 합성 완료 후, 수지를 절단 칵테일 '시약 B' (TFA:물:페놀:트리이소프로필실란, 88:5:5:2, v/v/w/v) (10 mL/수지 g)으로 4시간 동안 처리하였다. 진공하에 휘발 물질을 증발시킨 후, 페이스트를 에테르로 분쇄하여 고형물을 수득하고, 이를 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켰다. (12), Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2의 10mmol 규모 합성에 의해 30 g (이론값의 103%)의 미정제 펩티드를 수득하였다. (13), Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2의 경우, 10mmol 규모 합성에 의해 28 g (이론값의 107%)의 미정제 펩티드를 수득하였다. 이론적 수득량보다 더 많은 것은 아마도 수분 및 잔여 용매로 인한 것으로 보인다.
선형 디-시스테인 펩티드의 시클릭 디설피드 펩티드로의 고리화
시클릭 디설피드 펩티드를 DMSO/물 (95/5, v/v)를 사용하여 DMSO-보조된 산화에 의해 상응하는 선형 디시스테인 펩티드로부터 제조하였다. 미정제 선형 펩티드를 입구가 넓은 비이커에서 용매 혼합물 (5mL/g)중에 용해시키고, 고형 N-메틸-D-글루카민을 나누어서 첨가함으로써 용액의 pH를 8.5로 조절하였다. 생성 혼합물을 실온에서 36시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 아세토니트릴 (50mL/g)으로 희석하고, 혼합물을 2분 동안 교반하였다. 고체 시클릭 디설피드 펩티드를 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조하였다.
단량체 펩티드의 정제
펩티드 단량체 (12) Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2; Ac- Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys[Lys(ivDde)]-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드
미정제 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (12)의 ~0.5g을 최소량의 DMSO (~3 mL)중에 용해시켰다. 용액 부피를 20% CH3CN-물로 ~100 mL로 조절하고, 제 3 펌프를 사용하여, 용액을 물 (0.1% TFA)중의 10% CH3CN으로 사전평균화시킨 역상 C18 분취용 칼럼 (워터스, 엑스테라® Prep MS C18, 10μ, 3O0Å, 50 x 250 mm, 유속 100 mL/min)상에 로딩하였다. 칼럼에 샘플 용액을 적용하는 동안에는 분취용 HPLC 시스템으로부터의 평균화 용리제의 흐름을 중단시켰다. 샘플 용액을 칼럼에 가한 후, 구배 HPLC 시스템으로부터의 평균화 용리제의 흐름을 재개시하고, DMSO가 용리될 때 까지 칼럼을 10% CH3CN-물 (0.1% TFA)로 용리하였다. 그 후, 용리제 조성물을 1분에 걸쳐 35% CH3CN-물 (0.1% TFA)로 램핑시키고, 0.5%/분의 속도로 CH3CN (0.1% TFA)의 물 (0.1% TFA)로의 선형 구배를 개시하고, 50분 동안 유지하였다. 분획물 (15mL)을 생성물 용리 지시제로서 220nm UV를 이용하여 수동으로 수집하였다. 수집된 분획물을 워터스 엑스테라 분석용 역상 C-18 칼럼 (5μ 입자, 120Å 포어)상에서 분석하고, 95% 초과 순도의 생성물 함유 분획을 풀링시키고 동결 건조하여 상응하는 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (12)를 수득하였다. 전형적으로, 0.5g의 미정제 펩티드 단량체 (12)를 정제하면 0.1g (20% 수율)의 목적 생성물 (95% 초과 순도)을 수득하였다.
펩티드 단량체 (13) Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2; Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드
펩티드 단량체 (12)의 HPLC 정제에 이용된 공정 후, 20% CH3CN-물 혼합물 (100mL)중에 용해된 미정제 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (13) Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2 (0.5g)를 물 (0.1% TFA)중의 10% CH3CN (0.1% TFA)으로 사전평균화시킨 역상 C18 분취용 칼럼 (워터스, 엑스테라® Prep MS C18, 10μ입자, 3O0Å 포어, 50 x 250 mm, 유속 100 mL/min)상에 로딩하였다. 칼럼에 샘플 용액을 적용하는 동안에는 분취용 HPLC 시스템으로부터의 평균화 용리제의 흐름을 중단시켰다. 샘플 용액을 칼럼에 가한 후, 구배 HPLC 시스템으로부터의 평균화 용리제의 흐름을 재개시하고, 칼럼을 10% CH3CN-물 (0.1% TFA)로 5분 동안 용리하였다. 그 후, 용리제 조성물을 1분에 걸쳐 30% CH3CN (0.1% TFA)-물 (0.1% TFA)로 램핑시키고, 0.5%/분의 속도로 CH3CN (0.1% TFA)의 물 (0.1% TFA)로의 선형 구배 용리를 개시하고, 50분 동안 유지하였다. 분획물 (15mL)을 생성물 용리 지시제로서 220nm UV를 이용하여 수동으로 수집하였다. 분획물을 워터스 엑스테라 분석용 역상 C-18 칼럼 (4.6mm i.d. x 50mm, 5μ 입자, 120Å 포어)상에서 분석하고, 95% 초과 순도의 생성물 함유 분획을 풀링시키고 동결건조하여 상응하는 시클릭 디설피드 펩티드 단량체 (13)를 수득하였다. 전형적으로, 0.5g의 미정제 펩티드 단량체 (13)를 정제하여 0.12g (24% 수율)의 목적 생성물 (95% 초과 순도)을 수득하였다.
실시예 4
전구체 다이머 펩티드 (16) Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드]-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드; Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys[Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(-Adoa-Adoa-Glut-Lys)]-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드]-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드의 제조 및 정제
도 3에 도시된 바와 같이, 디숙시니미딜 글루타레이트 (DSG, 0.28 g, 0.86 mmol)를 교반된 무수성 디메틸포름아미드 (2.0 mL)중에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (0.11 g, 0.85 mmol)을 한번에 첨가하였다. 그 후, 고체 펩티드 단량체 (12) Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK-[K(ivDde)]-NH2 (0.50 g, 0.17 mmol)를 2분에 걸쳐 DSG의 교반된 용액에 나누어서 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 교반 후, 용액을 무수성 에틸 아세테이트로 ~50mL로 희석하였다 (이는 중간체 모노-NHS 에스테르 (14)를 침전시킴). 전체 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 경사분리하여 무색 고형물로서 중간체 모노-NHS 에스테르 (14)를 남겨두었다. 고형물을 에틸 아세테이트중에 재현탁시키고; 현탁된 고체 모노-NHS 에스테르 (14)를 함유하는 용액을 원심분리하여 고형물을 분리해내고, 상청액을 다시 경사분리하였다. 이러한 세척 단계를 2회 반복하여 과량의 DSG를 완전히 제거하였다.
고체 모노-NHS 에스테르 (14)를 교반된 무수성 디메틸포름아미드 (2.0mL) 중에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (0.11g, 0.85mmol)을 첨가하였다. 그 후, 고체 펩티드 단량체 (13), Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2 (0.50 g, 0.19 mmol, 1.12 eq.)를 교반된 용액에 3분에 걸쳐 나누어서 첨가하고, 생성 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 반응을 질량 분광계로 모니터링하고; 펩티드 단량체 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르 (14)가 완전하게 소모된 것을 확인한 후, 순수한 히드라진 (0.1mL)을 첨가하여 ivDde-함유 다이머 (15)의 ivDde 보호기를 제거하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다.
그 후, 용액을 TFA를 적가함으로써 산성화시키고, 혼합물을 물 (0.1% TFA)중의 10% CH3CN (0.1% TFA)으로 100mL로 희석하였다. 용액을 여과하여 입자를 제거하고, 정화된 용액의 반을 물 (0.1% TFA)중의 10% CH3CN으로 사전평균화시킨 역상 C18 분취용 칼럼 (워터스, 엑스테라® Prep MS C18, 10μ, 50 x 250 mm, 유속 100 mL/min)상에 로딩하였다. 칼럼에 샘플 용액을 적용하는 동안에는 분취용 HPLC 시스템으로부터의 평균화 용리제의 흐름을 중단시켰다. 샘플 용액을 칼럼에 가한 후, 구배 HPLC 시스템으로부터의 평균화 용리제의 흐름을 재개시하고, 칼럼으로부터 DMF를 플러싱하기 위해 칼럼을 10% CH3CN-물 (0.1% TFA)로 용리하였다. 그 후, DMF 플러그의 용리가 완료된 후, 용리제 조성물을 1분에 걸쳐 20% CH3CN으로 증가시키고, 0.6%/분의 CH3CN (0.1% TFA)의 물 (0.1% TFA)로의 선형 구배 속도로 용리를 계속하였다. 분획물 (15mL)을 생성물 용리 지시제로서 220nm UV를 이용하여 수집하였다. 분획물을 역상 C18 칼럼 (워터스 MS C18, 4.6mm i.d. x 50mm, 5μ 입자, 120Å 포어)상에서 분석하고, 95% 초과 순도의 생성물 함유 분획을 풀링시키고 동결 건조하여 무색의 솜털같은 고형물로서 전구체 다이머 펩티드 (16)를 수득하였다. 나머지 미정제 전구체 다이머 펩티드 (16)를 동일한 방식으로 정제하였다. 0.5g의 각각의 단량체 펩티드 (12) 및 (13)으로부터, 320mg (전체 수율 33%)의 목적하는 다이머 (16)를 수득하였다 (95% 초과 순도).
실시예 5
KDR-결합 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11) 아세틸-L-알라닐-글리실-L-프롤릴-L-트레오닐-L-트립토필-L-시스티닐-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-아스파르틸-L-트립토필-L-티로실-L-티로실-L-시스티닐-L-트립토필-1-류실-L-페닐알라닐-글리실-L-트레오닐-글리실-글리실-글리실-L-리실[아세틸-L-발릴-L-시스티닐-L-트립토필-L-글루타밀-L-아스파르틸-L-세릴-L-트립토필-글리실-글리실-L-글루타밀-L-발릴-L-시스티닐-L-페닐알라닐-L-아르기닐-L-티로실-L-아스파르틸-L-프롤릴-글리실-글리실-글리실-L-리실(디스테아릴포스포에탄올아미노카르보녹시-PEG2000-아미노-8-아미노-3,6-디옥사옥타노일-8-아미노-3,6-디옥사옥타노일-글루타릴-L-리실) 아미드 시클릭 (2-12) 디설피드]-아미드 시클릭 (6-13) 디설피드; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK {Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드}-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드; Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys{Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val- Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys[-Adoa-Adoa-Glut-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-]-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드}-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드의 제조.
KDR-결합 다이머 (11)는 도 4에 도시된 바와 같이, 전구체 다이머 펩티드 (16), Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드]-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드를 DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (18)과 컨쥬게이션시킴으로써 제조될 수 있다.
고형 전구체 다이머 펩티드 (16) (0.5 g, 0.092 mmol)를 3분에 걸쳐 교반하면서, 무수성 DMF (3.0mL)중의 디숙시니미딜 글루타레이트 (DSG, 0.15 g, 0.46 mmol), 및 디이소프로필에틸아민 (0.06 g, 0.47 mmol) 용액에 나누어서 첨가하였다. 그 후, 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 무수성 에틸 아세테이트로 ~50mL로 희석하였으며; 이에 의해 다이머 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르 (17), 즉, 전구체 다이머 펩티드 (16)의 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르가 침전되었다. 용액을 원심분리하여 펠렛 6 (m/z, 음이온, 1887.3 (M-3H)/3, 1415.1 (M-4H)/4, 1131.9 (M-5H)/5)을 무색 고형물로서 수득하였다. 과량의 DSG를 함유하는 상청액 에틸 아세테이트 층을 압축된 고체 다이머 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르 (17)로부터 경사분리하고, 상기 에스테르를 다시 에틸 아세테이트중에 재현탁시키고, 원심분리하고, 2회 초과로 세척하여 잔여량의 DSG를 제거하였다. 이렇게 수득된 고형의 중간체 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르 다이머 유도체 (17)를 무수성 DMF/CH2Cl2 (8:2, v/v) (3.0 mL)중에 용해시키고; 디이소프로필에틸아민 (0.06 g, 0.47 mmol)을 첨가하고, 용액을 교반하였다.
한편, DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (18) (0.235 g, 0.084 mmol, 0.9 eq.)을 별도 플라스크에서 무수 디클로로메탄 (2mL)중에 현탁시키고, TFA (2 방울)를 첨가하여 포스포디에스테르 산소를 양성자화시키고, 디클로로메탄중의 포스포리피드 암모늄 염 (18)의 가용화를 조장하였다. 투명한 용액을 농축시켜 휘발물질을 제거하고, 진공하에 추가로 건조시켰다.
고체 포스포리피드 암모늄 염 (18)을 DMF (2 mL)중에 용해시키고, 글루타르산 모노아미드 모노-NHS 에스테르 다이머 유도체 (17)의 교반된 용액에 전달하고, 생성 혼합물을 실온하에서 24h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 50% CH3OH, 25% CH3CN 및 25% 물 (1:1)의 용액으로 ~ 100mL로 희석하고, 불수용물을 여과시켰다. 여과된 용액의 반을 100mL/min의 유속으로 CH3OH과 CH3CN (1:1, O.1% TFA) 및 물 (0.1% TFA)의 1:1 혼합물로 사전평균화시킨 역상 C4 분취용 칼럼 (크로마실® Prep C4, lOμ, 300Å, 50 x 250 mm)에 로딩하였다. 칼럼에 샘플 용액을 적용하는 동안에는 분취용 HPLC 시스템으로부터의 평균화 용리제의 흐름을 중단시켰다. 샘플 용액을 로딩시킨 후, 평균화 용리제의 흐름을 재개시하고, DMF 플러그가 용리될 때 까지 칼럼을 세척하였다.
그 후, 용리제의 조성물을 1분에 걸쳐 70% CH3OH-CH3CN (1:1, 0.1% TFA)-물 (0.1% TFA)로 램핑시키고, CH3OH-CH3CN (1:1, 0.1%TFA)의 물 (0.1% TFA)로의 0.75%/분의 선형 구배를 개시하였다. 칼럼으로부터의 생성물의 완전한 용리를 달성하기 위해 100% B 도달 후 용리를 계속하였다. 분획물 (15mL)을 생성물 용리 지시제로서 220nm UV를 이용하여 수집하고, 주요 생성물을 용리시킨 후, 미량의 출발 포스포리피드 암모늄 염 (18)의 용리를 확실히 하기 위해 수분 동안 분획물 수집을 계속하였다. 분획물의 순도를, 220nm UV 및 증기화 광산란 검출기 (ELSD)를 이용하여 분석용 HPLC 시스템 (칼럼: YMC C4, 5μM, 300Å, 4.6x250nm)상에서 체크하였다. 후자 검출기를 사용하여, 220nm에서 약한 발색단을 갖는 DSPE-PEG2000-NH2를 검출하였다. 98% 초과 순도를 가지며, DSPE-PEG2000-NH2 포스포리피드 암모늄 염 (8)이 결여된 생성물 함유 분획을 조합하고, 농축하여 CH3OH의 함량을 저하시켰다. 그 후, 용액을 미량의 솜털같은 침전물이 형성될 때 까지 물중의 10% CH3CN으로 희석하였다. 생성 용액을 냉동 건조하여 무색 고형물로서 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 수득하였다. 미정제 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)의 제 2 부분을 상기 기술된 바와 같이 정제하였다. 표적 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)의 조합된 수득량은 0.39g (57% 수율)이었다. 여러 진행된 샘플 정제로부터의 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)의 샘플을 함께 풀링하고, 3차-부탄올-아세토니트릴-물 혼합물중에 용해시키고, 재동결건조하여 무색의 솜털같은 고형물로서 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 제공하였으며, 이를 진공하에 추가로 건조시켰다.
하기 실시예 6-8은 도 5에 도시된 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트의 제조에 관한 것이며, 여기서, 다이머 컨쥬게이트는 매우 낮은 수준의 TFA를 함유한다. 도 6-8은 하기 실시예에 기술된 방법을 설명해준다.
실시예 6
글루타릴 링커를 사용한 TFA 수준이 낮은 다이머 컨쥬게이트의 제조
AG MP-50 이온 교환 수지에 의한 (22), (25) 및 다이머 펩티드 27ㆍnTFA 염의 아세테이트로 전환에 의해 (23), (26) 및 다이머 펩티드 (27)의 제조.
화합물 (23)에 있어서, AG MP-50 이온-교환 수지 (1.5 meq/mL 수지 베드)를 20%의 CH3CN/H2O중에 현탁시켰다. 현탁물을 3 x 30cm 글래스 칼럼에 패킹하였으며, 최종 부피는 150mL이었다. 칼럼을 펌프 및 전도도 측정기에 연결시켰다. 전도도가 1μs/cm 미만이 될 때까지 17mL/min의 유속으로 20%의 CH3CN/H2O로 세척하였다. 화합물 (22) (210mg)을 20%의 CH3CN/H2O (80 mL)중에 용해시키고, 생성 용액을 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 이의 전도도가 1μs/cm 미만이 될 때까지 동일한 용리제로 다시 세척하였다. 20%의 CH3CN/H2O중의 NH4OAc 구배를 각각 200mM, 400 mM, 600 mM 및 800 mM에서 250 mL으로 적용하였다. 화합물이 600nm NH4OAc에서 발생하였다. 분획물을 HPLC에 의해 분석하고, 화합물을 함유하는 것을 혼합하고, 물질 중량이 일정하게 될 때 까지 수차례 동결건조하였다. 176 mg의 순수한 물질 (23)을 백색의 솜털같은 고형물로서 수득하였다. 수율은 83.8%이었다.
추가적인 변수 및 결과는 다음과 같다: HPLC : 체류 시간: 5.6 분; 검정 > 98% (영역 %); 칼럼: 워터스 엑스테라 MS-C18, 4.6 x 50 mm, 5μ 입자, 120 Å 포어; 용리제: A: H2O (0.1% TFA), B: CH3CN (0.1% TFA); 용리제: 초기 조건: 15% B, 8분에 걸쳐 선형 구배 15-50% B; 유속: 3 mL/min; 검출: UV 220 nm; 질량 스펙트럼: API-ES; 모드: 음이온; 1441.7 [M-2H]/2, 960.9 [M-3H]/3. CE 검정(반대이온 %wt./wt): 0.3%인 것으로 추정되는 TFA; 아세테이트 1.1%.
화합물 (26)에 있어서, 화합물 (23)의 동일 공정 후, 80mL 물중의 300mg의 펩티드 TFA 염 (25)를 17mL/min으로 150mM의 AG MP-50 칼럼에 로딩하고, 이를 H2O로 세척하여 1㎲/cm의 전도도가 되게 하였다. 그 후, 로딩 후 칼럼을 다시 H2O로 세척하고, 화합물 (23)의 이온 교환을 위해 사용된 것과 동일한 수성 NH4OAc로부터 H2O로의 단계식 구배를 적용하였다. 조합된 분획물을 일정 중량으로 동결건조하여 백색의 솜털같은 고형물로서 200mg의 아세테이트 (26)를 수득하였다. 수율은 66.7%이다.
추가적인 변수 및 결과는 다음과 같다: HPLC: 체류 시간: 5.6 분; 검정 97.0% (영역 %); 칼럼: 워터스 엑스테라 MS-C18, 4.6 x 50 mm, 5μ 입자, 120Å 포어; 용리제: A: H2O (0.1% TFA), B: CH3CN (0.1%TFA); 용리: 초기 조건: 15% B, 8분에 걸친 선형 구배 15-50% B; 유속: 3 mL/min; 검출: UV 220 nm; 질량 스펙트럼: API-ES; 모드: 음이온; 1336.9 [M-2H]/2, 890.8 [M-3H]/3; CE 분석 (반대이온 %wt./wt): 0.4%인 것으로 추정되는 TFA; 아세테이트 4.2%; IC 분석 (F%): 0.26.
다이머 펩티드 (27) 아세테이트 염에 있어서, 화합물 (23)에 대한 공정과 유사하게, AG MP-50 칼럼 (100mL 습식 부피)을 전도도가 1㎲/cm 미만이 될 때까지 30% CH3CN/H2O로 세척하였다. TFA 염 (30% CH3CN/H2O 80mL중의 120mg)으로서의 화합물 (27)을 칼럼에 로딩하고, 칼럼을 전도도가 1μs/cm에서 안정화될 때까지 동일한 용리제로 세척하였다. 30% CH3CN/H2O중의 NH4OAc의 30% CH3CN/H2O로의 단계식 구배를 화합물 (23)에 대해 수행하고, 화합물을 약 600 mM NH4OAc에서 용리시켰다. 혼합된 분획물을 동결건조하고, 이 물질이 일정한 중량을 나타날 때 까지 동결건조를 수차례 수행하여 아세테이트 염으로서 104mg의 순수한 물질 (27)을 제공하였다. 수율은 86.7%이었다.
추가적인 변수와 결과는 다음과 같다: HPLC : 체류 시간: 5.2 분; 검정 > 99% (영역 %); 칼럼: 워터스 엑스테라 MS-C18, 4.6 x 50 mm, 5μ 입자, 120 Å 포어; 용리제: A: H2O (0.1% TFA), B: CH3CN (0.1% TFA); 용리제: 초기 조건: 20% B, 8분에 걸쳐 선형 구배 20-60% B; 유속: 3 mL/min; 검출: UV 220 nm; 질량 스펙트럼: API-ES; 모드: 음이온; 1816.3 [M-3H]/3, 1362.0 [M-4H]/4, 1089.2 [M-5H]/5; CE 검정(반대이온 %wt./wt): 0.2%인 것으로 추정되는 TFA; 아세테이트 0.15%.
화합물 (23) 및 화합물 (26)으로부터 다이머 펩티드 (27) 아세테이트 염의 제조 및 정제
무수성 DMF (0.1mL)중의 디숙시니미딜 글루타레이트 (18mg, 0.055mmol) 용액에 무수성 DMF 0.2mL중의 화합물 (23) (61mg, 0.021mmol) 용액을 적가하였다 (pH8, DIEA에 의해 중화됨). 투명한 용액을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC 및 MS에 의해 반응의 완료를 확인하였다. 진공하에 용매를 제거하고, EtOAc (8 mL)를 첨가하여 중간체 (24)를 침전시켰다. 혼합물을 원심분리하고, 경사분리하여 과량의 글루타레이트를 제거하였다. 이러한 EtOAc 세척을 3회 넘게 반복하고, 생성된 고형물을 무수 질소 스트림으로 건조시켰다. 그 후, 0.3mL의 무수성 DMF중에 용해시켰다. 화합물 (26) (56mg, 0.021mmol)을 첨가하고, 용액의 pH를 DIEA를 첨가하여 8로 조절하였다. 용액을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, HPLC 및 MS 분석에 의해 반응의 완료를 확인하였다. 30μL 분취량의 NH2NH2를 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하여 ivDde 기를 절단하였다. 반응 혼합물을 HPLC 및 MS에 의해 분석하였으며, 그 결과, ivDde 기가 완전하게 제거된 것으로 나타났다.
다이머 펩티드 (27) 아세테이트의 정제 전에, TFA-비함유 용리제 즉, CH3CN/H2O/1OmM NH4OAc로 칼럼을 포함하는 전체 분취용 HPLC 시스템을 조심스럽게 세척해야 한다. 그 후, 미정제 반응 혼합물을 15% B (A: H2O중의 10mM NH4OAc; B: CH3CN/H2O중의 10mM NH4OAc, 9/1, v/v)로 사전평균화시킨 역상 C-18 분취용 칼럼 (아틀란티스 (Atlantis) C-18, 5μm 미입자, 100Å 포어, 30 x 150 mm, 유속 30 mL/min)에 가하였다. 칼럼을 DMF 플러그가 용리될 때 까지 동일한 용리제로 세척하였다. 용리제 조성물을 2분에 걸쳐 25% B로 증가시키고, 40분에 걸쳐 65% B로 램핑시켰다. 분획물을 분석용 역상 C-18 칼럼 (워터스 MS C-18, 4.6 x 50 mm, 5μm 미립자, 100 Å 포어, 유속 3 mL/min)에서 분석하고, 95% 초과 순도의 생성물 함유 분획물을 풀링하고, 동결 건조하여 25mg의 다이머 펩티드 (27)를 이의 아세테이트 염으로서 솜털같은 백색 고형물 형태로 수득하였다. 수율은 21.8%이었다.
추가적인 변수와 결과는 다음과 같다: HPLC : 체류 시간: 5.2 분; 검정 > 99% (영역 %); 칼럼: 워터스 엑스테라 MS-C18, 4.6 x 50 mm, 5μ 미립자, 120 Å 포어; 용리제: A: H2O (0.1% TFA), B: CH3CN (0.1% TFA); 용리제: 초기 조건: 20% B, 8분에 걸쳐 선형 구배 20-60% B; 유속: 3 mL/min; 검출: UV 220 nm; 질량 스펙트럼: API-ES; 모드: 음이온; [M-3H]/3, 1362.0 [M-4H]/4, 1089.2 [M-5H]/5; CE 검정(반대이온 %wt./wt): 0.2%인 것으로 추정되는 TFA; 아세테이트 1.1%.
실시예 7 - 도 7
이온 교환 수지를 통해 TFA 수준이 낮은 다이머 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트의 제조
다이머 펩티드 (27) 아세테이트 염으로부터 포스포리피드 펩티드 컨쥬게이트 (21)를 이의 아세테이트 염으로서 제조 및 정제
무수성 DMF (0.1mL)중의 디숙시니미딜 글루타레이트-DSG (3.7mg, 11.3μmol)의 용액에 무수성 DMF (0.2mL)중의 중성화된 다이머 펩티드 (27) 아세테이트 염 용액 (15mg, 2.75μmol)을 적가하였다. 반응 용액을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 워터스 엑스테라 C-18 칼럼 및 MS로의 HPLC 분석 결과 반응이 완료되었다. 용매를 증발시키고, EtOAc (8mL)를 첨가하여 중간물질 (28)을 침전시켰다. 침전된 중간물질 (28)을 함유하는 용기를 원심분리하고, 액체층을 경사분리하였다. 이러한 공정을 3회 반복하여 과량의 DSG를 제거하였다. 고형물을 무수 질소 스트림으로 건조시킨 후, 0.3mL 무수성 DMF중에 용해시켰다. DSPE-PEG2000-NH2 암모늄 염 (29) (6.5 mg, 2.33 μmol)을 고체 형태로 첨가하고, 혼합물의 pH를 (28)로 조절하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 조르박스 300 SB-C3 칼럼이 구비된 HPLC 및 MS로 분석하였으며, 그 결과 반응이 완료되었다.
TFA로의 생성물의 잠재적 오염을 최소화하기 위해, 미정제 반응 혼합물을 TFA에 노출되지 않았던 새로운 조르박스 300SB-C3 칼럼 (21.2 x 150 mm, 5μ 미립자)을 사용하여 장착된 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. HPLC 시스템을 CH3CN/H2O/NH4OAc에 의해 광범위하게 사전세척하여 미량의 TFA를 제거하였다. 반응 혼합물을 30 mL/min 유속으로 20% B (A: 10mM H2O중의 NH4OAc; B: 10mM CH3CN/H2O중의 NH4OAc, 9/1 v/v)로 칼럼에 로딩시켰다. 칼럼을 DMF 플러그가 용리될 때 까지 동일한 용리제로 30mL/min으로 용리시켰다. 그 후, 용리 조성을 3분에 걸쳐 40% B로 증가시킨 후, 50분에 걸쳐 90% B로 램핑시켰다. 수집된 분획물을 분석용 역상 C-3 칼럼 (조르박스 300SB-C3, 3 x 150 mm, 3.5μm 미립자, 300 Å 포어, 유속: 0.5 mL/min)에서 분석하였으며, 여기서 검출은 220nm UV 및 증기화 광산란 검출기 (ELSD)로 수행하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고 동결건조시켰다. 6.5mg의 최종 생성물 (21) 아세테이트 염을 수득하였다. 수율은 33.0%이었다.
추가적인 변수와 결과는 다음과 같다: HPLC : 체류 시간: 13.3 분; 검정 > 99% (영역 %); 칼럼: 조르박스 300SB-C3, 3 x 150 mm, 3.5㎛, 300 Å 포어; 용리제: A: H2O (0.1% TFA), B: CH3CN/MeOH 1/1 (0.1% TFA); 용리제: 초기 조건: 60% B, 3분에 걸쳐 선형 구배 60-90% B로 선형 구배; 유속: 5 mL/min; 검출: UV 220nm 및 ELSD; CD 분석(반대이온 %wt./wt): %wt. TFA: 0.3%; %wt 아세테이트 0.4%.
*실시예 8 - 도 8
조르박스 C-3 RP 분취용 HPLC 및 세파덱스 G-25 겔 투과 크로마토그래피를 사용한 연속 정제를 통해 TFA 수준이 낮은 다이머 컨쥬게이트 제조
분석용 HPLC 시스템에 사용된 재료 및 조건은 하기를 포함한다: 칼럼: 조르박스 300SB C-3; 3mm i.d. x 150 mm; 3.5μm 미립자; 용리제 A : H2O (HPLC 그레이드, 0.1부피% TFA); 용리제 B: CH3CN (0.1부피% TFA). 용리: 초기 조건: 50% B, 그 후 3분에 걸쳐 50-90% B로 선형 구배, 90% B에서 11분 유지; 유속: 0.5 mL/min; 검출: UV 220nm. 체류 시간: (화합물 (21)): 6.77 min, Rt (lyso): 4.06 min.
(21)로부터의 lyso-화합물을 제거하기 위해 분취용 조르박스 C-3 칼럼을 사용한 분취용 HPLC
미정제 화합물을 30% 용리제 B 농도에서 로딩하였다. 사용된 재료 및 조건은 하기를 포함한다: 조건: 칼럼: 워터스 조르박스 300SB C-3; 21.2 mm i.d. x 150 mm; 3.5μm 미립자; 용리: 용리제 A: H2O (HPLC 그레이드, 10 mM NH4OAc); 용리제 B: CH3CN/H2O, 9/1 (최종 NH4OAc 농도: 10 mM ).
그 후, 용리제의 조성물을 2분에 걸쳐 45% B로 변화시킨 후, 칼럼을 40분에 걸쳐 45-100%의 선형 구배로 용리하였다; 유속:30mL/min; 검출: UV 220nm.
미정제 화합물 (100mg)을 25mL의 30% B 용액에 용해시켰다. 분취용 HPLC 시스템을 30% B로 평균화시켰다. 화합물을 조르막스 C-3 칼럼에 로딩하였다. 이동상 조성물을 2분에 걸쳐 45% B로 램핑시켰다. 40분에 걸쳐 45-100% B의 선형 구배를 이용하여 (21)을 용리하였다. 생성물은 26.5-33분에 용리되었다.
함유된 포획물 (21)을 조합하고, 동결건조하여 백색의 솜털같은 고형물을 수득하였다. 이를 물-아세토니트릴중에 용해시킨 후, 다시 동결건조하였다. 이에 의해 lyso-화합물이 결여된 70mg 생성물을 수득하였다. 회수율은 약 70%이다. 크로마토그래피 완료 후, 시스템을 30mL/분의 유속으로 15분 동안 95% B로 세척하였다. 그 후, 칼럼을 15mL/분의 유속으로 30분 동안 CH3CN/H2O (50/50, TFA 또는 완충제 비함유)로 세척하였다. 그 후, 칼럼을 추가 사용을 위해 실온에서 저장하였다. 분석용 HPLC에 의해 분리된 물질중의 lyso-화합물의 부재를 확인하였다. 추가의 분석에 의해 실온에서 5일 후에 lyso-화합물이 형성되지 않았음을 확인하였다. 물질은 여전히 현저한 양 (4.2 wt%)의 TFA를 포함하고 있었다.
세파덱스 G-25상에서 겔 투과 크로마토그래피에 의한 TFA 형성물 (21)의 제거
세파덱스 G-25 칼럼 (100g 수지, 비드 크기 20-80㎛, 총 겔 부피 ~500mL, 칼럼 높이: 27cm)를 4L의 50mM 암모늄 중탄산염으로 평균화시켰다. 그 후, (21) (70mg)을 10% 수성 아세토니트릴중의 60mM 암모늄 중탄산염 30mL (최종 부피)에 용해시켰다. 용액을 여과한 후, 세파덱스 G-25 칼럼상에 로딩하였다. 칼럼을 50mM 암모늄 중탄산염 완충제로 용리하면서 10mL 분획물을 수집하였다. 수집된 분획물을 분석용 HPLC (220nm에서 UV 검출)에 의해 모니터링하였다. 결과는 하기 표 4에 제공되었다.
분획 # 부피 (mL) (분획물의 HPLC 분석에 의한) 화합물 존재 여부
1 10 없음
3 10 없음
6 10 없음
9 10 없음
12 10 없음
15 10 없음
18 10 없음
19 10 없음
20 10 있음
21 10 있음
24 10 있음
27 10 있음
28 10 있음
29 10 없음
분획물 20-28을 풀링하고 동결건조하였다. 수득된 동결건조된 물질을 소량의 물중에 재용해시키고, 용액을 냉동시키고, 동결건조하여 잔여량의 암모늄 중탄산염을 제거하였다. 목적 물질의 최종 중량은 58mg이었다. 회수율은 83%이었다.
TFA의 효과적인 제거를 보장하기 위해, 샘플을 TFA 및 아세테이트 이온에 대한 CE 분석으로 처리하였다. TFA는 상기 검정에 따른 출발 물질중에 명백히 존재한 반면 (4.2%), 겔 투과 공정 후에는 거의 검출되지 않았다 (0.2%). 아세테이트 이온은 검출되지 않았다.
일련의 조르박스 C-3 분취용 HPLC 및 세파덱스 G-25 겔 투과 크로마토그래피에 의해 수득된 (21)에 대한 분석 데이타
분석 데이타를 수집하기 위해 사용된 재료 및 조건: 불소 분석 (QTI에 의한 IC): 751 ppm (0.15% TFA wt/wt); 질량 스펙트럼: 방법: MALDI-TOF; 모드: 양이온; 검출된 평균 분자량은 8461이며, 전형적인 PEG2000 질량 분포 곡선이 관찰되었다. HPLC: 시스템 A: 칼럼: 조르박스 300SB C-3; 3 mm i.d. x 150 mm; 3.5 μm 미립자; 용리제 A : 물 (HPLC 그레이드, 0.1 부피% TFA); 용리제 B: 아세토니트릴 (0.1 부피% TFA). 초기 조건: 50% B; 용리: 3분에 걸쳐 50-90% B로 선형 구배, 11분 동안 90% B로 유지; 유속: 0.5 mL/min; 검출: UV 220 nm. 체류 시간: 6.77 min; 영역%: 99.6%. 시스템 B: 칼럼: 조르박스 300SB C-3; 3 mm i.d. x 150 mm; 3.5 μm 미립자; 용리제 A: 물 (HPLC 그레이드, 0.1 부피% TFA); 용리제 B: 아세토니트릴 (0.1 부피% TFA). 초기 조건: 50% B; 용리: 3분에 걸쳐 50 - 90% B로 선형 구배, 12분에 걸쳐 100% B로 램핑. 유속: 0.5 mL/min; 검출: LSD; 체류 시간: 13.98 min. 영역 %: 99.3%.
표 5는 실시예 9-12에서 관련된 재료의 공급원 및 사용된 약어에 대한 정의를 제공한다.
DSPA.Na (젠자임) IUPAC: 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포파티드산, 나트륨 염
DPPG.Na (젠자임) IUPAC: 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, 나트륨 염
DPPE (젠자임) IUPAC:1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민
DSPC 디스테아로일-글리세로-포스파티딜콜린 (젠자임)
IUPAC: 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린
DSPG.Na (젠자임) IUPAC: 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, 나트륨 염
DSPE-PEG1000 디스테아로일-글리세로-포스포에탄올아민-N-메톡시 (폴리에틸렌 글리콜) 1000 (아반티 폴라 (Avanti Polar))
DSPE-PEG2000 디스테아로일-글리세로-포스포에탄올아민-N-메톡시 (폴리에틸렌 글리콜) 2000 (아반티 폴라)
스테아레이트* 나트륨 스테아레이트 (플루카 (Fluka))
PEG4000 (폴리에틸렌 글리콜) MW 4000 (플루카)
만니톨 (플루카)
* 산 형태 즉, 스테아르산이 또한 본원의 마이크로버블 제조에 사용될 수 있다.
실시예 9
DSPC / DPPG 엔벨로프를 갖는 표적화된 마이크로버블의 제조
실시예 9A
DSPC/DPPG/ 및 도 5에 도시된 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트의 혼합물 (몰비 49.75/49.75/0.5, 각각 187.1, 176.4 및 19.8 mg의 세 성분에 상응) 383mg 및 PEG-4000 (22.6 g)를 수조에서 60℃에서 120g의 t-부틸 알코올중에 가용화시켰다. 바이알을 0.8mL의 각각의 용액으로 충전시켰다. 샘플을 -45℃로 냉각시키고, 동결건조하였다. 헤드스페이스의 공기를 C4F10/질소 (50/50)의 혼합물로 대체하고, 바이알을 밀봉하고, 크림핑하였다. 동결건조된 샘플을 바이알당 5mL H2O로 재구성하였다.
실시예 9B
실시예 9A를 DSPC/DPPG 및 도 10에 도시된 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (31)의 혼합물 (몰비 49.5/49.5/1, 각각 세 성분 182.8, 172.3 및 28.2 mg에 상응)을 사용하여 반복하였다
실시예 10
DPPE / DPPG 엔벨로프를 갖는 표적화된 마이크로버블의 제조
실시예 10A
DSPE-PEG1000 (0.43mg - 0.24μmol)의 수성 현탁액 및 도 10에 도시된 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (31) (3.0mg - 0.5μmol)의 수성 현탁액을 60℃에서 500μL의 증류수중에 제조하여 미셀 현탁액을 수득하였다.
별도로, DPPE (15.8 mg - 22.8 μmoles) 및 DPPG (4.2 mg - 5.7 μmoles)를 20분 동안 70℃에서 증류수 (20mL)중의 10% 만니톨 용액에 분산시켰다. 그 후, 분산액을 실온으로 냉장시켰다. 퍼플루오로헵탄 (1.6mL)을 1분 동안 10500rpm에서 고속 균질기 (폴리트론 (Polytron) PT3000, 프로브 직경 3cm)를 사용하여 수성상으로 에먼션화시켜 에멀션을 수득하였다.
미셀 현탁액을 상기 에멀션에 첨가하고, 생성 혼합물을 교반하에 1시간 동안 60℃에서 가열하였다. 실온으로 냉장 (1시간) 후, 수득된 에멀션을 50mL 둥근 바닥 플라스크에 4mL 분획물로 나누었다. 에멀션을 5분 동안 -45℃에서 냉동시키고, 24시간 동안 0.2mBar에서 동결 건조하였다 (프리즈-드라이어 크리스트 베타 (Freeze-Drier Christ Beta) 1-8K).
재분산 전에, 동결건조물을 C4F10/질소 (50/50 부피)에 노출시켰다. 그 후, 동결건조된 생성물을 완만하게 수동으로 쉐이킹하면서 초기 생성물 2배 부피의 물중에 분산시켰다.
실시예 10B
DSPE-PEG 1000 (0.5 mg - 0.27 μmole) 및 도 5에 도시된 다이머 펩티드포스포리피드 컨쥬게이트 (11) (5.3 mg - 0.63 μmole)의 수성 현탁액을 60℃에서 500μL의 증류수중에 제조하여 미셀 현탁액을 수득하였다.
별도로, DPPE (15.8 mg - 22.8 μmoles) 및 DPPG (4.2 mg - 5.7 μmoles)를 20분 동안 70℃에서 증류수 (20mL)중의 10% PEG4000 용액에 분산시켰다. 그 후, 분산액을 실온으로 냉장시켰다. 퍼플루오로헵탄 (1.6mL)을 1분 동안 10000rpm에서 고속 균질기 (폴리트론 PT3000, 프로브 직경 3cm)를 사용하여 수성상에서 에먼션화시켜 에멀션을 수득하였다.
미셀 현탁액을 에멀션에 첨가하고, 생성 혼합물을 교반하에 1시간 동안 80℃에서 가열하였다. 실온으로 냉장 (1시간) 후, 수득된 에멀션을 원심분리 (200g/10분 - 시그마 원심분리 3K10)에 의해 1회 세척하여, 과량의 포스포리피드를 제거하였다. 분리된 펠렛 (용매의 에멀션화된 미세소적 함유)을 회수하고, 초기 부피의 10% PEG4000 수용액으로 재현탁시켰다.
수득된 에멀션을 DIN8R 바이알 (1mL/바이알)로 샘플링하였다. 그 후, 바이알을 -50℃ (크리스트 엡실론 (Christ Epsilon) 2-12DS 프리즈 드라이어 (Freeze Dryer))에서 냉각시키고, -25℃ 및 0.2mBar에서 12시간 동안 동결 건조하고, 최종 건조 단계는 30℃에서 0.1mBar에서 7시간 동안 수행하였다. 바이알을 C4F10/질소 (35/65 부피)를 함유하는 대기에 노출시키고, 밀봉하였다. 동결건조된 생성물을 수동으로 완만하게 쉐이킹하면서 초기 생성물의 2배 부피의 물에 재분산시켰다.
실시예 11
DSPC / DSPA 엔벨로프를 갖는 표적화된 마이크로버블의 제조
실시예 11A
DSPE-PEG1000 (2.5 mg - 1.4 μmole) 및 도 5에 도시된 다이머 펩티드 컨쥬게이트 (11) (7.0 mg - 0.84 μmole)의 수성 현탁액을 60℃에서 1mL 증류수중에서 제조하여 미셀 현탁액을 수득하였다.
별도로, DSPC (16.3mg - 20.6 μmoles) 및 DSPA (3.7 mg - 5.15 μmoles)를 시클로옥탄 (1.6 mL)중에 80℃에서 용해시켰다. 유기상을 8000rpm에서 1분 동안 고속 균질기 (폴리트론 T3000, 프로브 직경 3cm)를 사용하여 물 (20mL)중의 PEG4000 10% 용액에 첨가하여 에멀션을 수득하였다.
미셀 현탁액을 에멀션과 혼합하고, 생성 혼합물을 진탕하에 1시간 동안 80℃에서 가열하였다. 실온으로 냉장 (1시간) 후, 수득된 에멀션을 원심분리 (1500g/10min - 시그마 원심분리 3K10)에 의해 1회 세척하여 과량의 포스포리피드를 제거하였다. 분리된 상청액 (에멀션화된 미세소적 용매 함유)을 회수하고, 초기 부피의 2배 부피의 10% PEG 4000 수용액에 재현탁시켰다.
수득된 현탁액을 DIN8R 바이알 (1mL/바이알)로 샘플링하였다. 그 후, 바이알을 -50℃로 냉각하고 (크리스트 엡실론 2-12DS 프리즈 드라이어), 12시간 동안 -25℃ 및 0.2 mbar에서 동결 건조시키고, 최종 건조 단계는 30℃ 및 0.1 mbar에서 7시간 동안 수행하였다. 바이알을 C4F10/질소 (35/65 부피)를 함유하는 대기에 노출시키고 밀봉하였다. 동결건조된 생성물을 완만하게 수동으로 쉐이킹하면서 초기 부피의 두배 부피의 물중에 현탁시켰다.
실시예 11B
실시예 11A를 반복하였으며, 단 0.7mg의 DSPE-PEG2000 (0.26 μmoles) 및 1.6 mg의 도 2에 도시된 단량체 펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 (1) (0.26 μmole)를 사용하여 미셀 현탁액을 제조하였다.
실시예 11C
DSPC (16.3 mg - 20.6 μmoles), DSPA (3.7 mg - 5.15 μmoles) 및 도 1에 도시된 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1) (1.6 mg - 0.26 μmole)를 시클로옥탄 (1.6 mL)중에 80℃에서 용해시켰다. 이러한 유기상을 8000rpm에서 1분 동안 고속 균질화기 (폴리트론 PT3000, 프로브 직경 3 cm)를 사용하여 PEG4000 10% 수성상 (20mL)중에 에멀션화시켜 에멀션을 수득하였다.
생성 에멀션을 교반하에 1시간 동안 80℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각 (1시간) 후, 수득된 에멀션을 20ml의 PEG4000 10% 수용액으로 희석하였다.
에멀션을 DIN8R 바이알 (1mL/바이알)로 샘플링하였다. 그 후, 바이알을 -50℃로 냉각시키고 (크리스트 엡실론 2-12DS 프리즈 드라이어), -25℃ 및 0.2mbar에서 12시간 동안 동결 건조시키고, 최종 건조 단계는 30℃ 및 0.1mbar에서 7시간 동안 수행하였다. 바이알을 C4F10/질소 (35/65 부피)를 함유하는 대기에 노출시키고, 밀봉하였다. 동결건조된 생성물을 완만하게 수동으로 쉐이킹하면서 초기 부피의 2배 부피의 물중에 분산시켰다.
실시예 12
DSPC / 스테아레이트 엔벨로프를 갖는 표적화된 마이크로버블의 제조
실시예 12A
DSPE-PEG2000 (2.5 mg - 0.9 μmoles) 및 도 5에 도시된 다이머 포스포리피드 컨쥬게이트 (11) (2.5 mg - 0.3 μmoles)의 수성 현탁액을 60℃에서 660μL의 증류수중에서 제조하여 미셀 현탁액을 수득하였다.
별도로, DSPC (18.2mg - 23.1 μmoles) 및 스테아레이트 (1.8 mg - 5.8 μmoles)를 시클로옥탄 (1.6 mL)중에 80℃에서 용해시켰다. 유기상을 9000rpm에서 1분 동안 고속 균질기 (폴리트론 T3000, 프로브 직경 3cm)를 사용하여 물 (20mL)중의 PEG4000 10% 용액에 첨가하여 에멀션을 수득하였다.
미셀 용액을 에멀션과 혼합하고, 생성 혼합물을 진탕하에 1시간 동안 80℃에서 가열하였다. 실온으로 냉장 (1시간) 후, 수득된 에멀션을 원심분리 (1500g/10min - 시그마 원심분리 3K10)에 의해 1회 세척하여 과량의 포스포리피드를 제거하였다. 분리된 상청액 (에멀션화된 미세소적 용매 함유)을 회수하고, 초기 부피의 2배 부피의 10% PEG 4000 수용액에 재현탁시켰다.
수득된 현탁액을 DIN8R 바이알 (1mL/바이알)로 샘플링하였다. 그 후, 바이알을 -50℃로 냉각하고 (크리스트 엡실론 2-12DS 프리즈 드라이어), 12시간 동안 -25℃ 및 0.2 mbar에서 냉동 건조시키고, 최종 건조 단계는 30℃ 및 0.1 mbar에서 7시간 동안 수행하였다. 바이알을 C4F10/질소 (35/65 부피)를 함유하는 대기에 노출시키고 밀봉하였다. 동결건조된 생성물을 완만하게 수동으로 쉐이킹하면서 초기 부피의 두배 부피의 물중에 현탁시켰다.
실시예 12B
실시예 12A를 반복하였으며, 단 도 5에 도시된 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11) 대신에 동일한 상대 몰량의 도 2에 도시된 단량체 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)를 사용하였다.
실시예 12C
실시예 11C를 DSPC (18.2 mg - 23.1 μmoles), 나트륨 스테아레이트 (1.8 mg - 5.8 μmoles) 및 도 5에 도시된 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11) (2.2 mg - 0.26 μmole)를 사용하여 반복하였다. 에멀션화를 위한 교반 속도를 9000rpm으로 고정하였다. 실온으로 냉장시킨 (1시간) 후, 수득된 에멀션을 원심분리 (1500g/10min - 시그마 원심분리3K10)하여 과량의 포스포리피드를 제거하였다. 분리된 상청액 (에멀션화된 미세소적 용매 함유)을 회수하고, 초기 부피의 두배 부피의 10% PEG 4000 수용액에 재현탁시켰다.
실시예 13
KDR - 트랜스펙션된 세포에서 정적 결합 시험
플라스미드 생성 및 정제
전장 KDR을 pcDNA6 벡터로 클로닝하고, 플라스미드를 적당한 DH5α E. coli에서 증폭시켰다. 플라스미드 증폭 및 정제를 E. coli JM 109 및 퀴아겐 (Quiagen)으로부터의 키트를 사용하여 수행하였다.
써마녹스 (Thermanos®) 커버슬립상에서 293H 세포의 트랜스펙션
세포를 24-웰 플레이트에서 폴리-D-리신-코팅된 써마녹스® 원형 커버슬립상에서 성장시켰다. 0.1mL중에서 커버슬립 (1.3 cm2)당 1㎍의 DNA (pc-DNA6-fKDR)을 사용하여 리포펙트아민 2000 프로토콜 (인비트로겐, cat# 11668-019)에서 권고된 바대로 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션을 무혈청 배지중에서 수행하고, 2시간 후 세포로부터 트랜스펙션 시약을 제거하고, 보통의 혈청 함유 배지로 교체하였다. 세포-코팅된 커버슬립중 일부를 mock-트랜스펙션시켰다 (DNA 이외로). 다음날, KDR 수용체의 발현을 면역세포화학법으로 평가하고, 결합 분석을 수행하였다.
버블 결합 분석
트랜스펙션된 세포를 PBS중의 50% 인간 플라즈마중에 재현탁된 KDR-표적화된 마이크로버블과 인큐베이션하였다. 트랜스펙션된 세포와의 인큐베이션에 있어서, 작은 플라스틱 캡을 1.3 x 108 버블을 함유하는 현탁액으로 충전시키고, 캡을 써마녹스® 커버슬립으로 거꾸로 커버하여 트랜스펙션된 세포가 표적화된 마이크로버블과 접촉되게 하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 커버슬립을 트위저로 이동시키고, PBS중에 3회 린싱하고, 미세현미경하에 관찰하여 표적화된 마이크로버블의 결합을 평가하였다.
마이크로버블에 의해 커버링된 표면적 %의 측정
이미지를 디지탈 카메라 DC300F (Leica)로 찍고, 이미지화된 영역에서 결합된 마이크로버블에 의해 커버링된 표면적의 %를 소프트웨어 QWin 버젼 3.1 (Leica Microsystem AG, Basel, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 각 써마녹스®커버슬립의 사진을 찍었다. 실시예 9 및 10의 각각의 제조에 있어서, 결합 검정을 최소 2회 반복하여, 커버링된 표면의 평균 값을 구하였다.
하기 표 6, 및 7에서, 실시예 9 및 10에 따라 제조된 마이크로버블의 결합 활성도를 기록하였다.
표에 나타난 바와 같이, 마이크로버블의 안정한 엔벨로프를 형성하는 다양한 포스포리피드 포뮬레이션중에 (리포단백질로서) 포함되는 경우, 동일한 펩티드라도 다양한 결합 활성을 나타낸다. 본 발명의 KDR 결합 리포펩티드를 함유하는 마이크로버블은 특히 KDR-발현 세포에 특이적으로 결합하나, 이들은 mock 트랜스펙션된 세포에는 분명하게 결합하지 않았다.
실시예 14
rh VEGF - R2 / Fc 키메라 단백질에 대한 동적 결합 시험
Fc-VEGF-R2-코팅된 커버슬립의 제조
유리 커버슬립 (40mm 직경, Bioptechs Inc., Butler, PA, USA)를 하기 방법에 따라 재조합 인간 VEGF-R2/Fc 키메라 단백질 (R&D Systems)으로 코팅하였다.
표면적 14 x 25mm에 특정 마커 (Dako Pen)를 사용하여 글래스 커버슬립상에 경계를 그리고, PBS중의 4㎍/mL로 400μL의 Fc-VEGF-R2 용액을 상기 표면에 침전시켰다. 4℃에서 밤새 인큐베이션 한 후, 용액을 흡출하고, PBS-0.05% 트윈 80, pH 7.4중의 BAS 1% w/v 용액 0.5mL로 대체하고, 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 커버슬립을 5ml의 PBS-0.05% 트윈 80으로 3회 세척하였다.
결합 검정
표적화된 버블의 결합 연구를, 업사이드-다운 챔버 역위를 위한 맞춤형 어댑터와 0.25mm 두께의 챔버 가스켓이 구비된 병렬-플레이트 유동 챔버 (FCS2, Bioptech Inc., Butler, PA, USA)를 사용하여 수행하였다. 코팅된 커버슬립을 유동 챔버의 플레이트로서 삽입하였다. 마이크로버블 (PBS중의 50% 인간 플라즈마에서 5 x 106 버블/mL)을 조절가능한 주입 펌프 (Auto Syringe® AS50 Infusion Pump, Baxter, Deerfield, IL, USA)와 60 mL 주사기 (Terumo)를 사용하여 유동 챔버를 통해 유도하였다. 펌프 유속을 1mL/min로 조절하여 약 114s-1의 목적하는 전단 속도를 달성하였다. 10분 후, 유동을 중단시키고, 인버티드 올림푸스 IX 50 미세현미경에 연결된 40 x 대물렌즈 및 CCD 모노크롬 카메라 (F-View II, Soft Imaging Systems, Germany)를 사용하여 커버슬립 (약 0.025mm2의 영역)상의 다양한 위치에서 무작위로 사진을 찍었다.
각 사진상의 마이크로버블의 수를 측정하고, 사진 총 수에 대하여 평균내고, 수득된 값을 10으로 나누었다 ("슬로프" 즉, 분당 결합된 마이크로버블의 평균 양을 얻기 위해).
실시예 11 및 12의 각각의 제조에 있어서, 결합 검정을 4회 반복하여 슬로프의 평균 값을 얻었다.
슬로프는 표적 물질에 대한 버블 결합율을 나타낸다. 예를 들어, 슬로프 값 8은 평균 팔십 (80)개의 마이크로버블이 10분내에 코팅된 커버슬립상에 결합됨을 나타낸다. 더 높은 슬로프 값은 유동 조건하에 표적에 결합하는 더욱 우수한 버블의 결합력을 나타낸다.
하기 표 8 및 9에서는, 실시예 11 및 12에 따라 제조된 마이크로버블의 결합 활성을 설명한다.
표로부터 알 수 있는 바와 같이, 동일한 펩티드라도 마이크로버블의 안정한 엔벨로프를 형성하는 다양한 포스포리피드 포뮬레이션중에 포함되는 경우 (펩티드-포스포리피드 컨쥬게이트 또는 리포펩티드로서), 여러 결합 활성을 나타낼 수 있다.
실시예 KDR Mock KDR-Mock
9A 28.6% 0.4% 28.3%
9B 28.0% 0.3% 27.7%
실시예 KDR Mock KDR-Mock
10A 23.6% 0.2% 23.5%
10B 28.0% 0.0% 28.0%
실시예 슬로프
11A 8.2
11B 8.1
11C 5.8
실시예 슬로프
12A 9.0
12B 8.0
12C 7.8
실시예 15
KDR 이 표적이되는 초음파 조영제의 생체내 평가
생체내 KDR-발현 조직에 결합하는 본 발명의 KDR 결합 리포펩티드를 함유하는 초음파 조영제의 능력을 혈관신생생성의 공지된 모델을 사용하여 평가하였다: 래빗 VX2 종양 모델
혈관신생생성 조직의 공지된 모델을 이용하여 KDR-표적된 초음파 마이크로버블의 국소화시키는 능력을 시험하는데 사용하고, 혈관신생형성 조직의 이미지를 제공하였다.
VX2 래빗 칼시노마를 2.5/3kg 체중의 뉴질랜드 래빗 (Charles River Laboratories, France)의 등 근육에 연속 이식하였다.
종양 균질화물의 제조
종양을 수술로 제거하고, 10% 소태 혈청, 항생제, 1.5mM 글루타맥스 1을 함유하는 맥코이 (McCoy) 배양 배지에 위치시키고, 작은 조각으로 절단하고, 린싱하여 혈액 및 파편을 제거하였다. 그 후, 종양 조각 (3 내지 5cm3)을 5mL 완전 배지를 함유하는 50ml 팔콘 튜브에 위치시켰다. 고형물 조각이 보이지 않을 때까지 종양 조직을 분쇄하였다 (Polytron). 유체를 5분 동안 300g에서 원심분리하고, 상청액을 경사분리하였다. 7mL의 새로운 배지를 펠렛 5mL당 첨가하였다.
종양 이식
먼저 0.3mL 베트라퀼 (Vetranquil) (Acepromazine, Sanofi, 근내 주입)을 래빗에 제공하고, 케타미놀®5/자일라진 (Ketaminol®5/Xylazine) (Veterinaria AG/Sigma) 혼합물 (50/10 mg/mL, 0.7 mL/kg)을 근내 주입하여 마취시켰다. VX2 종양 균질화물 100 마이크로리터를 근내 주입하였다. VX2 종양 이식 후 15일에, 동물을 다시 상기 동일한 혼합물로 마취시키고, 이미지화 실험을 위해 50% 우레탄 (2mL/kg5 s.c.) (Sigma)을 피하내 주입하였다.
생체내 초음파 이미지화
*L7-4 선형 프로브가 구비된 초음파 이미지화 시스템 ATL HDI 5000 장치를 사용하여 VX2 종양 이미지화를 수행하였다. 고음파 (MI=0.9)에서 B-모드 진동 반전을 사용하여 인공혈관의 내피세포상에 발현된 KDR 수용체상의 표적화된 마이크로버블의 축적을 평가하였다. 선형 프로브를 이식된 종양위의 피부상에 직접 고정시켰다.
실시예 16 또는 실시예 17의 제조물을 사용하여 버블 주입 (0.1 μL/kg 기체) 후, 초음파입사를 중단하여 버블이 25분동안 축적되게 하였다. 초음파입사를 고음파 (MI 0.9)에서 재활성화시켜 종양에 존재하는 모든 버블을 파괴시켰다. 자유롭게 순환하는 버블의 양을 초음파입사 없이 20초 축적된 후 수득된 시그널을 기록함으로써 평가하였다.
VX2 종양 이미지화 실험으로부터의 비디오 프레임을 비디오-캡쳐로 캡쳐링하고, 이미지-프로 펄스 2.0 소프트웨어로 분석하였다. 자유롭게 순환하는 버블을 나타내는 이미지를 25분에 획득한 이미지로부터 감하여 결합된 버블을 나타내는 이미지를 제공하였다.
도 11 (실시예 16의 제조물에 대한 결과를 나타냄) 및 도 12 (실시예 17의 제조물에 대한 결과를 나타냄)를 참조로 하여, 도 11A 및 12A는 버블 주입 전의 이미지 (기준선)을 나타내며; 도 11B 및 12B는 주입 후 25분에 종양의 버블 조영제 보유를 나타내며; 도 11C 및 12C는 기준선 및 자유롭게 순환하는 버블을 감한 후 달성된 결과를 나타내며, 이는 본 발명에 따른 KDR 리포펩티드를 함유하는 결합된 마이크로버블을 나타낸다. 실시예 15-17 및 도 11 및 12는 이러한 KDR 결합 부분을 함유하는 초음파 조영제가 동물 모델에서 KDR 발현 (및 따라서, 혈관신생생성) 조직에 국소화됨을 확인하였다.
실시예 16
실시예 12A를 반복하였으며, 단 DSPE-PEG2000을 DSPE-PEG1000 (2.7mg, 1.54μmol)로 대체하고, 2.5mg (0.31μmol)의 도 5에 도시된 다이머 페티드 포스포리피드 컨쥬게이트 (11)를 사용하였다.
실시예 17
실시예 16을 반복하였으며, 단 다이머 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 도 2에 도시된 동일한 몰량의 단량체 포스포리피드 컨쥬게이트 (1)로 대체하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Nanjappan, et al. <120> Targeting Vector-Phospholipid Conjugates <130> 57637-1542 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ac <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> (DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2 <400> 1 Arg Ala Gln Asp Trp Tyr Tyr Asp Glu Ile Leu Ser Met Ala Asp Gln 1 5 10 15 Leu Arg His Ala Phe Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ac <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> NH2 <400> 2 Arg Ala Gln Asp Trp Tyr Tyr Asp Glu Ile Leu Ser Met Ala Asp Gln 1 5 10 15 Leu Arg His Ala Phe Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ac <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> (NHS-Glut)-NH2 <400> 3 Arg Ala Gln Asp Trp Tyr Tyr Asp Glu Ile Leu Ser Met Ala Asp Gln 1 5 10 15 Leu Arg His Ala Phe Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ac <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> (DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2 <400> 4 Ala Gln Asp Trp Tyr Tyr Asp Glu Ile Leu Ser Met Ala Asp Gln Leu 1 5 10 15 Arg His Ala Phe Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Ac <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> NH2 <400> 5 Ala Gln Asp Trp Tyr Tyr Asp Glu Ile Leu Ser Met Ala Asp Gln Leu 1 5 10 15 Arg His Ala Phe Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Lys 20 25

Claims (8)

  1. 펩티드 TFA(trifluoroacetic acid) 염을 음이온 교환을 통해 아세테이트 염으로 전환시키고; 펩티드를 포스포리피드와 컨쥬게이팅시키는 단계를 포함하여, 0.3 중량% 이하의 TFA를 갖는 펩티드 포스포리피드 컨쥬게이트를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드 다이머를 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 펩티드 다이머가 Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2 시클릭 (2-12) 디설피드]-NH2 시클릭 (6-13) 디설피드를 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 포스포리피드는 페길화된 것인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 포스포리피드가 DSPE-PEG2000-NH2인 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피는 암모늄 아세테이트 구배를 포함하는 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050100963A1 (en) 2002-03-01 2005-05-12 Dyax Corporation KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
US7985402B2 (en) * 2002-03-01 2011-07-26 Bracco Suisse Sa Targeting vector-phospholipid conjugates
US7794693B2 (en) 2002-03-01 2010-09-14 Bracco International B.V. Targeting vector-phospholipid conjugates
US7261876B2 (en) 2002-03-01 2007-08-28 Bracco International Bv Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
US8623822B2 (en) 2002-03-01 2014-01-07 Bracco Suisse Sa KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
WO2004078778A2 (en) * 2003-03-03 2004-09-16 Dyax Corp. PEPTIDES THAT SPECIFICALLY BIND HGF RECEPTOR (cMet) AND USES THEREOF
DE602005023429D1 (de) 2004-10-19 2010-10-21 Lonza Ag Verfahren zur festphasen-peptidsynthese
MX2008007321A (es) * 2005-12-09 2008-09-30 Bracco Int Bv Conjugados fosfolipido de vector dirigido.
WO2010117725A2 (en) * 2009-04-06 2010-10-14 Novetide, Ltd. Production of peptides containing poly-gly sequences using fmoc chemistry
CN101637613B (zh) * 2009-08-19 2011-09-14 王维 一种脂质靶向超声造影剂及其制备方法
KR101783653B1 (ko) * 2010-08-09 2017-10-10 브라코 스위스 에스.에이. 표적화 기체-충전 미세소포
CN102286076B (zh) * 2011-06-23 2014-03-12 成都圣诺科技发展有限公司 比伐卢定的制备方法
CN105026030B (zh) * 2012-12-21 2017-04-12 博莱科瑞士股份有限公司 充气微泡
ES2726924T3 (es) * 2014-12-18 2019-10-10 Bracco Suisse Sa Formulación de microvesículas dirigidas rellenas de gas
ES2952104T3 (es) * 2016-02-01 2023-10-27 Trust Bio Sonics Inc Microburbujas lipídicas y proceso de elaboración de las mismas
US20190365665A1 (en) * 2017-01-24 2019-12-05 Nuvox Pharma Llc Iso-osmotic and near iso-osmotic oxygen therapeutic formulations and methods thereof
EP3360884A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-15 Neuronax Improved process for the preparation of a dodecapeptide
CA3118523A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Bracco Suisse Sa Optimized process for dimeric peptide-phospholipid conjugate
US11717570B2 (en) 2019-05-15 2023-08-08 Bracco Suisse Sa Gas-filled microvesicles
US20200360289A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Bracco Suisse Sa Freeze-dried product and gas-filled microvesicles suspension
WO2023103963A1 (en) * 2021-12-06 2023-06-15 Westlake Therapeutics (Shanghai) Co., Limited Modified cells and uses thereof for delivering agents

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994000144A1 (en) * 1992-06-30 1994-01-06 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-aggregatory agents for platelets
WO1996040285A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Novel targeted compositions for diagnostic and therapeutic use

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5578292A (en) 1991-11-20 1996-11-26 Bracco International B.V. Long-lasting aqueous dispersions or suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles and methods for the preparation thereof
US5445813A (en) 1992-11-02 1995-08-29 Bracco International B.V. Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography
US5556610A (en) 1992-01-24 1996-09-17 Bracco Research S.A. Gas mixtures useful as ultrasound contrast media, contrast agents containing the media and method
IN172208B (ko) 1990-04-02 1993-05-01 Sint Sa
IL104084A (en) 1992-01-24 1996-09-12 Bracco Int Bv Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them
NZ276167A (en) 1993-12-15 1996-11-26 Bracco Research Sa Ultrasound contrast medium comprising two gases in aqueous suspension
IL116328A (en) 1994-12-16 1999-09-22 Bracco Research Sa Frozen suspension of gas microbubbles in frozen aqueous carrier for use as contrast agent in ultrasonic imaging
IL125748A (en) 1996-02-19 2002-05-23 Nycomed Imaging As Contrast-containing gases for use in diagnostic imaging
CZ28999A3 (cs) 1996-08-02 1999-07-14 Nycomed Imaging As Použití kontrastního prostředku
US6071532A (en) * 1996-10-15 2000-06-06 Emory University Synthesis of glycophospholipid and peptide-phospholipid conjugates and uses thereof
JP2001502349A (ja) 1996-10-21 2001-02-20 ニユコメド・イメージング・アクシエセルカペト 造影剤におけるまたはこれに関する改良
ATE314097T1 (de) 1996-10-28 2006-01-15 Amersham Health As Kontrastmittel
ES2264159T3 (es) 1996-10-28 2006-12-16 Amersham Health As Mejoras en/o relacionadas con agentes de diagnostico/terapeuticos.
WO1998018497A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Nycomed Imaging As Contrast agents
EP0963209A2 (en) 1996-10-28 1999-12-15 Marsden, John Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
WO1998018495A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Marsden, John, Christopher Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
US6245318B1 (en) 1997-05-27 2001-06-12 Mallinckrodt Inc. Selectively binding ultrasound contrast agents
GB9809084D0 (en) * 1998-04-28 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
US7109167B2 (en) * 2000-06-02 2006-09-19 Bracco International B.V. Compounds for targeting endothelial cells, compositions containing the same and methods for their use
US20050250700A1 (en) * 2002-03-01 2005-11-10 Sato Aaron K KDR and VEGF/KDR binding peptides
US20050100963A1 (en) * 2002-03-01 2005-05-12 Dyax Corporation KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy
US7666979B2 (en) * 2002-03-01 2010-02-23 Bracco International B.V. Methods for preparing multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications and methods of preparing the same
WO2003084574A1 (en) * 2002-03-01 2003-10-16 Bracco International Bv Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications
ES2398393T3 (es) * 2002-03-01 2013-03-15 Dyax Corp. Péptidos de unión a KDR y a VEGF/KDR y su uso en diagnóstico y terapia
WO2004069284A2 (en) 2003-02-04 2004-08-19 Bracco International B.V. Ultrasound contrast agents and process for the preparation thereof
FI20031528A0 (fi) * 2003-10-17 2003-10-17 Ctt Cancer Targeting Tech Oy Terapeuttinen liposomikoostumus ja menetelmä sen valmistamiseksi
MX2008007321A (es) * 2005-12-09 2008-09-30 Bracco Int Bv Conjugados fosfolipido de vector dirigido.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994000144A1 (en) * 1992-06-30 1994-01-06 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-aggregatory agents for platelets
WO1996040285A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Novel targeted compositions for diagnostic and therapeutic use

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130099251A (ko) 2013-09-05
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JP2013136608A (ja) 2013-07-11

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