CZ28999A3

CZ28999A3 - Použití kontrastního prostředku

Info

Publication number: CZ28999A3
Application number: CZ99289A
Authority: CZ
Inventors: David Johnson; Jonny Ostensen; Morten Eriksen; Audun Tornes; Sigmund Frigstad; Harald Dugstad; Jo Klaveness; Pál Rongved; Roald Skurtveit; Jorunn Braenden
Original assignee: Nycomed Imaging As
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-04
Publication date: 1999-07-14
Also published as: WO1998005364A3; WO1998005364A2; KR20000029780A; IL128345A0; CN1227502A; EP0918546B1; CA2262908A1; JP2000517296A; MXPA99001053A; US7892522B2; JP3634869B2; JP2004002453A; NO990276D0; IL128345A; NZ334365A; NO990276L; AU3780497A; KR100593873B1; CN1104911C; DE69739047D1

Description

Vynález se týká použití kontrastního prostředku s obsahem mikrobublinek plynu pro výrobu prostředku pro ultrazvukové 5 zobrazování, konkrétněji ultrazvukové zobrazování jater, umožněné jejich prodlouženou dobou zdržení v játrech.

If •íl

I <

Dosavadní stav techniky

Rakovina, jako jsou hepatomy a metastatická šíření do jater, io jsou hlavními příčinami smrti v průmyslovém světě, a proto trvá potřeba zlepšených způsobů detekce tumoru. Vyšetření jater je například možno provádět rentgenovým zobrazováním, například po podání injekce jódované rentgenové kontrastní látky zapouzdřené v lipozomech. Tak např. jak se popisuje ve WO-A-8809165, tyto lipozomy se fixují v játrech a slezině interakcí s retikuloendoteliálním systémem a dovolují tak rentgenové vyšetření těchto orgánů; tumorová tkáň má obecně odlišný systém cév než zdravá tkáň a/nebo místa nižší absorpce než zdravá tkáň a může tak být detekována jako oblast se změněným kontrastem.

2o Jak se uvádí v WO-A-8809165, rentgenové vyšetření jater typicky vyžaduje přítomnost jódované rentgenové kontrastní látky v játrech v koncentraci 2 až 2,5 mg jódu/g tkáně, tj. v celkovém množství přibližně 3,5 g v případě jater dospělého člověka o hmotnosti přibližně 1,5 kg. Uvádí se, že zachycení lipozomů v játrech je typicky přibližně 40 %, takže pro vytvoření této hladiny bude nutná injekce kontrastního prostředku s obsahem přibližně 9 g jódu. To může znamenat současnou injekci až do 9 g lipidu, což může vést k nežádoucím vedlejším účinkům. Velký význam má potenciálně

-2Φ · φ • «φφ « φ φφ φ φφφ φ · φ φ φ φ ultrazvukové vyšetření jater v důsledku podstatně snížených nákladů na ultrazvukové skanery ve srovnání se skanery využívajícími rentgenové a počítačové tomografie (CT), nepoužití ionizujícího záření (potenciální zvýšení bezpečnosti pacientů i personálu) a snížených nutných dávek kontrastních prostředků. V tomto posledním hledisku je tedy dobře známo, že zvláště účinné jsou kontrastní prostředky obsahující disperze mikrobubiinek plynů a/nebo těkavých kapalin, kde se účinného zpětného rozptylu ultrazvuku dosahuje nízkou hustotou a snadnou stlačitelnosti mikrobubiinek; tyto disperze mikrobubiinek, pokud jsou vhodně stabilizovány, mohou dovolit vysoce účinné ultrazvukové zviditelnění · například cévního systému a mikroskopického cévního systému tkání, často s výhodně nízkými dávkami. Zatímco se však tyto kontrastní prostředky typicky z cévního systému odstraňují zachycením retikuloendoteliálním systémem, například v játrech, slezině nebo lymfatických uzlinách, použití existujících metod pro zobrazování těchto orgánů je omezeno.

US-A-5425366 uvádí, že i když jsou různé typy ultrazvukových kontrastních prostředků založených na mikročásticích, například obsahujících polymerní mikropouzdra zachytávány játry, neumožňují

2o účinné zobrazení s použitím běžných technik B-modu. Autoři se domnívají, že vyzářený ultrazvukový signál má pouze malou hloubku průniku do jaterní tkáně v důsledku kumulativního odrazu kontrastním prostředkem, což vede k rovnoměrnému stínování. Stejně pravděpodobná je však možnost zeslabení vyzářeného ultrazvukového signálu interakcí se strukturním materiálem mikročástic, což například vede k absorpci signálu a jeho přeměně na teplo.

V US-A-5425366 se uvádí domněnka, že ačkoliv tyto mikročásticové kontrastní prostředky zachycené v orgánech jako jsou játra jsou v podstatě bez pohybu, mohou být přesto zviditelněny

3o barevnými Dopplerovými technikami. Uvádí se, že vyšší energetické hladiny ozáření spojené s barevným Dopplerovým vyšetřením může způsobit praskání mikročástic a tím generovat Doppler-senzitivní

Β ·«

Β Β · · • · • · • Β

Β Β Β «ΒΒΒ \

• Β · » ♦··· *

-3signály popisované jako „akusticky stimulovaná akustická emise“, ačkoliv se zdá pravděpodobné, že v praxi detektor interpretuje zmizení mikročástice jako pohyb s vysokou rychlostí a vytváří odpovídající zobrazení. Dále je třeba zdůraznit, že výrazná destrukce mikročástic přijatým ultrazvukovým signálem umožní penetrací signálu při pokračujícím vyšetření hlouběji do tkáně.

Nevýhodou tohoto způsobu je vysoké zeslabení vyvolané kontrastními prostředky zapouzdřenými v polymeru, jaké se popisují v patentu. To může být v důsledku relativní tuhosti zapouzdřujícího materiálu, což zabraňuje vytváření homogenních úrovní signálu ve hmotě jater. Doby skanování jsou proto nutně dlouhé a může být nesnadné interpretovat získanou informaci. Tato technika není proto vhodná pro ultrazvukovou tomografii. Nevýhodou je také ztráta informace a kvality zobrazení, ke které nevyhnutelně dochází v důsledku použití přístrojového vybavení pro barevné Dopplerovo zobrazování pro detekci ve skutečnosti anomálních výsledků z částic, které se v podstatě nepohybují. Barevný displej takového přístroje je zaměřen pro mapování rychlostí spíše než pro zobrazení intenzit signálu, takže informace týkající se intenzity může být jednoduše ztracena nebo může být zkreslena, například použitím filtrů typu horní propusti pro vyloučení signálů pocházejících z pomalu se pohybující tkáně.

Navíc v důsledku uvedeného vysokého zeslabení ultrazvukových kontrastních prostředků na bázi mikročástic jako jsou mikročástice zapouzdřené v polymeru popisované v US-A-5425366, je nezbytně poměr zpětný rozptyl : zeslabení poměrně nízký. To nevyhnutelně omezuje účinnost ultrazvukového zobrazování jiných částí těla, například cévního systému, které by mohlo být žádoucí pro studie spojené se zobrazováním jater.

Je tedy potřeba vyvinout nová kontrastní činidla použitelná pro metody ultrazvukového zobrazování, které dovolují efektivní \

-4 zviditelnění ledvin pomocí různých zobrazovacích technik, například včetně běžného B-modu a harmonického zobrazení.

Podstata vynálezu s Předkládaný vynález je založen na zjištění, že kontrastní látky obsahující mikrobublinky plynů stabilizované opsonizovatelnými amfifilními materiály mohou vykazovat prodlouženou dobu zdržení vytvářející kontrast v játrech a slezině. Zatímco by se dalo očekávat, že takovéto mikrobublinky stabilizované amfifilním materiálem budou io fagocytovány makrofágy jater a sleziny, a zatímco v praxi je možno vybírat amfifilní materiály, jak se podrobněji popisuje dále, pro umožnění jejich rychlé absorpce játry, například Kupfferovými buňkami retikuloendoteliálního systému, je extrémně překvapující, že jejich kontrast vyvolávající účinky mohou přetrvat, například po dobu několika hodin, protože by bylo možno očekávat rychlou destrukci kontrastních prostředků a ztrátu echogenicity po fagocytóze.

Podle jednoho hlediska vynálezu se tedy poskytuje způsob ultrazvukového zobrazování, který zahrnuje podávání člověku nebo zvířeti kontrast zvyšující množství kontrastního činidla obsahujícího mikrobublinky biokompatibilního plynu stabilizovaného opsonizovatelným amfifilním materiálem, což umožňuje absorpci alespoň části uvedených mikrobublinek v játrech pacienta a vytváření ultrazvukového obrazu alespoň části jater.

Vynález dále zahrnuje výše definované kontrastní prostředky pro použití při ultrazvukovém zobrazování jater stejně jako použití mikrobublinek biokompatibilního plynu stabilizovaného opsonizovatelným amfifilním materiálem při výrobě zobrazovacích činidel pro použití při ultrazvukovém zobrazování jater u člověka a zvířat.

• ·

Opsonizovatelný amfifilní materiál, který může být v případě potřeby fluorovaný, může být například zvolen z opsonizovatelných amfifilních lipidů, opsonizovatelných amfifilních proteinů a opsonizovatelných amfifilních přírodních a syntetických polymerů.

Opsonizovatelný amfifilním lipidový materiál může například obsahovat jeden nebo více lipidů vytvářejících membrány, přičemž tento termín se zde používá pro označení amfifilních lipidů schopných tvořit ve vodném prostředí kapalné dvojvrstvy v krystalickém nebo gelovém stavu; tyto amfifilní lipidy také tvoří monovrstvy nebo jednoduché dvojvrstvy na rozhraní plyn-voda, například jak je tomu u Langmuir-Blodgetových filmů. Tento termín tedy zahrnuje lipidy jaké se nalézají v biologických membránách, které jsou charakterizovány nízkou rozpustností ve vodě, takže vytvářejí ve vodném prostředí kapalné krystalické nebo gelové dvojvrstvy i při nízkých koncentracích a schopností podstatně snižovat povrchové napětí ve vodných roztocích, například až téměř k nule. Tyto lipidy budou tvořit v kontrastních prostředcích pro použití podle vynálezu zapouzdřující monovrstvy, dvojvrstvy nebo jejich seskupení kolem mikrobublinek plynu.

Příklady těchto lipidů vytvářejících membrány jsou lipopeptidy, lipofilně derivatizované uhlohydráty, například nesoucí jednu nebo více mastných acylových skupin, mono- a diglyceridové estery mastných kyselin, sfingolipidy, glykolipidy, glycerolipidy a výhodněji fosfolipidy, například fosfatidové kyseliny, fosfatidylcholiny, fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylethanolaminy, fosfatidylinozitoly, kardiolipiny a jejich odpovídajících lyzo {tj. monoacylované, š výhodou 1-acylované) analogy.

Opsonizovatelný amfifilní materiál kontrastních prostředků používaný podle vynálezu může například obsahovat jeden nebo více

3o těchto lipidů vytvářejících membrány (membránotvorných lipidů), popřípadě spolu s dalšími látkami, které modifikují vlastnosti • · « ft membrány jako stabilitu, disperzibilitu, sklon k agregaci, biologickou aktivitu, pružnost nebo polaritu. Mezi příklady takových přídavných látek patří lipidy nevytvářející membrány, například steroly jako je cholesterol.

S výhodou alespoň část, například alespoň 5 %, alespoň 20 %, s výhodou alespoň 50 % jakéhokoliv lipidového materiálu tvořícího membránu se skládá z molekul, které jednotlivě nesou za podmínek přípravy a/nebo použití čistý celkový negativní náboj. Zdá se tedy pravděpodobné, že elektrické odpuzování mezi nabitými lipidovými io membránami umožní tvorbu stabilních a stabilizujících lipidových monovrstev kolem plynových mikrobublinek; pružnost a deformovatelnost těchto tenkých membrán výrazně zvyšuje echogenicitu kontrastních prostředků vzhledem k systémům, u nichž je plyn zapouzdřen jednou nebo více lipidovými dvojvrstvami. Navíc vykazují tyto jednovrstevné systém podstatně snížené zeslabení ve srovnání s dvojvrstvými systémy a umožňují tak větší penetraci vstupujícího ultrazvukového signálu a tím umožňují zobrazení jater do větší hloubky.

Přítomnost negativně nabitého lipidového materiálu vytvářejícího

2o membrány také umožňuje rozpoznání kontrastních činidel Kupfferovými buňkami a tím zvýšení absorpce játry jak může být potvrzeno elektronovou mikroskopií jater např. krys po intravenózní injekci kontrastních prostředků s obsahem takového lipidového materiálu.

Příklady negativně nabitých lipidů tvořících membrány jsou negativně nabité fosfolipidy jako v přírodě se vyskytující (například sojové nebo odvozené z vaječného žloutku), polosyntetické (např.

částečně nebo úplně hydrogenované) a syntetické fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinozitoly, fosfatidové kyseliny a kardiolipiny; skupiny mastných acylů těchto fosfolipidů budou typicky

4 ·· ·» • 4 4 4 « ·

4 4 4 4 4 * · 4 4 444· · ··· ·4·

4 4 4 4 4 4 4

- «44 4444 44 · ·· ·· obsahovat vždy přibližně 14 - 22 atomů uhlíku, například jak je tomu u palmitoylových a stearoylových skupin.

Kontrastní prostředky obsahující fosfatidylseriny jsou zvláště výhodné, protože Kupfferovy buňky a makrofágy sleziny rozpoznávají s starší červené krvinky a destičky podle přítomnosti vysokých koncentrací fosfatidylserinu na jejich povrchu. Budou tedy stejně rozpoznávat a provádět fagocytózu těchto kontrastních prostředků obsahujících fosfatidylserin v játrech a slezině.

Lipid tvořící membránu a jiný opsonizovatelný amfifilní materiál io může být s výhodou zvolen tak, aby byl v podstatě nepropustný pro plyn obsažený v kontrastním prostředku, alespoň v průběhu transportu kontrastního prostředku krevním řečištěm do jater. Toho je například možno dosáhnout použitím plynů s relativně nízkou mírou difúze lipidovými a podobnými membránami. Příklady takových plynů jsou halogenidy síry jako je fluorid sírový nebo fluorid dvojsírový; fluorované uhlovodíky jako jsou perfluorované uhlovodíky; fluorované (například perfluorované) ketony jako je perfluoraceton; a fluorované (například perfluorované) ethery jako je perfluordiethylether. Reprezentativní perfluorované uhlovodíky, které mohou obsahovat 20 například až do sedmi atomů uhlíku, zahrnují pefiuoralkany jako je perfluormethan, perfluorethan, perfluorpropany, perfluorbutany (například perfluor-n-butan, popřípadě ve směsi s dalšími izomery jako je perfluorizobutan), perfluorpentany, perfluorhexany a perfluorheptany; perfluoralkany jako je perfluorpropen, perfluorbuteny 25 (například perfluorbut-2-en) a perfluorbutadien; perfluoralkiny jako perfluorbut-2-in; perfluorcykloalkany jako je perfluorcyklobutan, perfluormethylcyklobutan, perfluordimethylcyklobutany, perfluortrimethylcyklobutany, perfluorcyklopentan, perfluormethylcyklopentan, perfluordimethylcyklopentany, perfluorcyklohexan, perfluormethylcyklohexan a perfluorcykloheptan;

a směsi kterýchkolív z předcházejících látek včetně směsí s plyny • ftft « ♦ * · • * \

-8·· « · • * · · • · * · • ·· · ··· • · ·· Η pronikajícími membránou ve větší míře jako je vzduch, dusík, oxid uhličitý, kyslík atd., například směsi obsahující až 90 % takových plynů s větší permeabilitou pro membránu.

Použití kontrastních prostředků obsahujících mikrobublinky perfluoralkanu jako je perfluorbutan zapouzdřeného jedním nebo více fosfatidylserinů tvoří zvláště výhodné , provedení tohoto hlediska předkládaného vynálezu.

Alternativně je možno zvolit lipid tvořící membránu nebo jiné opsonizovatelné amfifilní materiály, které mají relativně nízkou ío permeabilitu vůči plynům jako je vzduch, dusík, oxid uhličitý, kyslík apod. Tak například fluorované lipidy tvořící membrány, například ve kterých jsou fluorovány, popřípadě perfluorovány skupiny mastných acylů, mohou být použity pro zapouzdření širokého rozmezí biokompatibilních plynů (tento termín zahrnuje látky včetně směsí, které jsou za normální tělesné teploty 37 °C z podstatné části nebo úplně ve formě plynu/páry) v kontrastních prostředcích použitelných podle vynálezu. Příklady těchto plynů jsou dusík, vzduch, kyslík, oxid uhličitý, atom vodíku, oxid dusný, inertní plyny (například hélium, argon, xenon nebo krypton), popřípadě halogenované sílaný (například tetramethylsilan), popřípadě halogenované nízkomolekulární uhlovodíky (například s obsahem až sedmi atomů uhlíku, například alkany jako methan, ethan, propany, butany nebo pentany; cykloalkany jako cyklobutan nebo cyklopentan; alkeny jako propen nebo buteny; alkiny jako acetylen; ethery; ketony; estery a halogenované varianty uvedených sloučenin včetně perfluoruhlovodíků jako jsou výše uvedené látky), halogenidy síry (například fluorid sírový nebo fluorid dvojsírový) a směsi kterýchkoli z předcházejících látek.

Bude zřejmé, že lipidové nebo podobné membrány nemusí nezbytně zůstat nepropustné a/nebo stabilizující mikrobublinky plynu po zachycení a/nebo absorpci kontrastního činidla játry, například zachycením na povrchových plochách (například specifickou interakcí • · * · • « • · \

-9s receptory) nebo po absorpci buňkami známými způsoby. Echogenicita po takovém zachycení/absorpci se může odvozovat z mikrobublinek plynu stabilizovaných úrovním lipidem tvořícím membránu nebo jiným opsonizovatelným materiálem, mikrobublinek, u nichž je alespoň část amfifilního materiálu nahrazena endogenními fosfolipidy, mikrobublinek volného plynu uvolněného z kontrastního prostředku (jestliže se nerozpouští nebo jinak nevylučuje játry) nebo kombinacemi jakýchkoliv z předcházejících způsobů. Dále bude zřejmé, že stabilizace mikrobublinek plynu se může zvyšovat, jestliže má plyn nižší rozpustnost ve vodě než normální krevní plyny jako je kysiík, oxid uhličitý a dusík.

Mikrobublinky kontrastních činidel použitých podle vynálezu mohou mít průměrnou velikost 0,1 až 10 pm, například 1 až 7 pm a tím umožnit volný průchod plicním systémem a eventuální pohlcení orgány is jako jsou játra a slezina po intravenózním podávání. Takové mikrobublinky mají nicméně dostatečnou velikost pro vyvolání podstatné echogenicity (vlastnost závisející na velikosti). Použití mikrobublinek této velikosti pro zesilování zobrazení jater může být v kontrastu s domněnkami podle dosavadního stavu techniky, jako například WO-A-9109629, že pro dosažení průchodu kapilárními průchody do jater jsou nutné velikosti 30 až 100 nm; mikrobublinky plynu o této velikosti budou mít výrazně nižší echogenicitu než mikrobublinky s výhodným rozmezím velikostí uvedeným výše.

V případě potřeby může být před, v průběhu nebo po podání kontrastního činidla podána látka schopná stimulovat průtok krve játry, například glukagon a/nebo látka schopná zvyšovat absorpci játry stimulací fagocytózy, například protilátka, fragment protilátky nebo fibronectin.

Výhodné kontrastní prostředky s obsahem fosfolipidů použitelné 30 podle vynálezu mohou být například podávány v takových dávkách, že množství vstříknutého fosfolipidů je v rozmezí 0,1 až 10 pg/kg tělesné \

- 10«0 00 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

0 0 0

000« 0Φ ·

00

0 0

0 ·

0 0 0 0 0

0 «· 0· hmotnosti, například 1 až 5 pg/kg, Bude zřejmé, že použití těchto nízkých hladin fosfolipidu je podstatnou výhodou při minimalizaci možných toxických vedlejších účinků.

Pro rychlou absorpci výhodných kontrastních činidel použitelných podle vynálezu v játrech, například Kupfferovými buňkami, musí být zobrazení jater pacienta provedeno již 5 až 10 min po podání kontrastního prostředku, ačkoliv je možno s výhodou vyšetření pozdržet, například až do přibližně 30 min po podání pro umožnění maximální absorpce kontrastního prostředku. Prodloužené ío doby zdržení echogenního kontrastního prostředku v játrech umožňují účinné provedení vyšetření několik hodin (například 2 až 8 hodin) po podání.

Ultrazvukové zobrazování jater je možno například provádět použitím zobrazovacích frekvenci přibližně 0,1 až 15 MHz, např. 1 až

10 MHz.

Vhodnými zobrazovacími technikami použitelnými podle vynálezu jsou zobrazování v M-modu, B-modu, Dopplerovo zobrazování se spojitou vlnou, Dopplerovy techniky s pulzní vlnou, jako je barevné nebo výkonové Dopplerovo zobrazování, harmonické zobrazování a kombinace jakýchkoliv z předcházejících metod. Pružná povaha amfiftlně stabilizovaných mikrobublinkových kontrastních prostředků použitých podle vynálezu dovoluje jejich zvláště výhodné použití technikami harmonického zobrazování založenými na nelineárních účincích jako jsou vyšší harmonické (například 2, 3, 4...

násobky zobrazovací frekvence), subharmonické (například 1/2, 1/3, 2/3, 3/4... zobrazovací frekvence) a ultraharmonické (například 3/2, 5/4... násobky zobrazovací frekvence), jak se například popisuje v USΑ-541Ό516; zvláště výhodné může být použití zobrazování druhou harmonickou.

U harmonického zobrazování je typicky nutná expozice mikrobublinkových kontrastních činidel ultrazvukovému ozáření \

- 11 • Φ· ·« * • · · · φ · • · φ φ φ · • φ · φ ΦΦ* φ φ φ · φ

ΦΦ φφφφ ΦΦ φ

Φ· ·· φ φ φ φ « φ φ φ • φ ·Φ · · « φ φ • φ ΦΦ s vysokou intenzitou pro uskutečnění účinné přeměny na harmonickou ultrazvukovou energii, Protože ve velkých oblastech tkání jako jsou játra má prostorová distribuce sklon k vysoké nehomogenitě v důsledku nehomogenit v dopadajícím ultrazvukovém paprsku a akustickém zeslabení tkání, může být pro dosažení dostatečné intenzity zpětného signálu ze vzdálenějších částí zobrazené tkáně nutno použít velmi vysoké intenzity dopadajícího záření; to může vést k rychlé ztrátě kontrastního účinku v oblastech tkáně přilehlých k převodníku, kde může vysoká intenzita ultrazvukového záření podporovat rozpouštění plynu ve formě mikrobublinek do okolních tkáňových kapalin a následnou ztrátu kontrastního účinku v průběhu již jedné sekundy od počátku ozáření. To nevyhnutelně omezuje užitečnost takových technik při zajištění úplného přehledu nějaké tkáňové oblasti.

Pružná povaha kontrastních prostředků použitých podle předkládaného vynálezu však způsobuje vysokou účinnost přeměny harmonické energie i při nízkých intenzitách dopadajícího ultrazvuku, což způsobuje jejich užitečnost při harmonickém zobrazování v hloubce umístěných oblastí jater při nízkých intenzitách ultrazvuku,

2o které neindukují jev destrukce mikrobublinek v oblastech jater bližších k převodníku. Obecněji dovoluje pružná povaha kontrastních činidel jejich použití v řadě způsobů zobrazování při nízkých hladinách ultrazvukové energie, které kontrastní činidlo nepoškozují a tím umožňují větší počet vyšetření zajímavých obtastí v játrech, například pro účely potvrzení nálezu nebo s použitím různých zobrazovacích způsobů.

Jestliže je třeba, může být však také použito vyšší intenzity ultrazvuku a kontrast může být detekován metodami, které detekují destrukci mikrobublinek. Příklady těchto způsobů jsou fázově citlivé

3o techniky, jako je barevné Dopplerovo zobrazení (jak se například popisuje v US-A-5425366) nebo výkonové Dopplerovo zobrazení a techniky necitlivé na fázi, jak se například popisují v US-A-5456257.

- 12• ·« ·· * ·« ·· • · « · ♦ ♦ · · · * • · ···· ··'· • * » · · *»·· · ··· ··· • · · · » · · ··«·«* ·· v ♦♦ ♦ ·

Na rozdíl od typických mikrobublinek zapouzdřených v polymeru, používaných jako kontrastní prostředky podle US-A-5425366, kontrastní prostředky podle vynálezu mohou být snadno navrženy tak, aby byly extrémně citlivé na dopadající ultrazvukovou energii, například použitím stabilizujícího amfifilního materiálu ve formě monovrstev. Destrukce mikrobublinek může být potom vyvolána překvapivě nízkými hladinami použité ultrazvukové energie, což umožní účinné pseudo Doppierovo zobrazování jater nebo jejich částí s velmi nízkou hladinou dopadající ultrazvukové energie.

Tím je možno použít způsobů detekce, mezi které patří neDopplerovy techniky založené na korelaci jako je barevné rychlostní zobrazování a jiné techniky založené na nízké korelaci mezi následnými pulzy ultrazvuku zpracované v časové nebo frekvenční doméně, například použitím signálů RF, popřípadě smíšených s jinými signály, amplitudově demodulováných signálů RF nebo signálů RF zpracovaných s použitím jiných technik. Detekce skutečné nebo zdánlivé destrukce mikrobublinek může být také provedena nelineárními technikami, například analýzou signálů mimo šířku pásma základní frekvence emitovaného ultrazvukového pulzu, jako jsou vyšší

2o harmonické, subharmonické nebo ultraharmonické nebo součtové nebo rozdílové frekvence, odvozené například z emitovaného pulzu a jeho harmonických.

Překvapivě bylo zjištěno, že zobrazovací techniky, u kterých se normálně předpokládá, že zahrnují destrukci mikrobublinek, mohou být prováděny s kontrastními prostředky podle předkládaného vynálezu opakovaně. Mohlo by se tedy zdát, že tyto techniky mohou reverzibilně měnit akustické vlastnosti současně používaných kontrastních prostředků namísto destrukce mikrobublinek a tím umožňují provedení opakovaného vyšetření.

Bylo také překvapivě zjištěno, že i po prodloužené době zdržení v játrech mohou kontrastní prostředky podle vynálezu produkovat *· ··· ♦ ·

-13- ··· ···· ·· · ·· ··

Dopplerovy signály s výrazněji širším spektrem, než signály vznikající pohybem krve a tkáně. To může dovolit detekci nezávislou na zbytcích rušivého pohybu použitím nastavení vyšších filtrů než se normálně používají při Dopplerově zobrazování. Může být také použito nastavení vyššího zisku a tím umožnění vytvoření zobrazení s homogenní detekcí kontrastu v celém zobrazení.

Kontrastní prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmkoliv vhodným způsobem, s výhodou způsobem zahrnujícím kroky:

i) vytvoření disperze mikrobublinek plynu ve vodném médiu obsahujícím opsonizovatelný amfifilní materiál, jako je lipid vytvářející membránu;

ii) lyofilizaci takto získané amfifilně stabilizované disperze plynu za získání sušeného produktu; a iii) rekonstituci uvedeného sušeného produktu v injikovatelné nosné kapalině.

Krok (i) může být například uskutečněn vystavením vodného prostředí s obsahem amfifilní látky vhodné emulgační technice, například působení ultrazvuku, třepání, vysokotlaké homogenizaci,

2o vysokorychlostnímu míchání nebo míchání s vysokými střižnými silami, například s použitím homogenizátoru rotor-stator, v přítomnosti zvoleného plynul. Vodné prostředí může v případě potřeby obsahovat další látky, které slouží pro zvýšení viskozity a/nebo jako látky napomáhající zvýšení rozpustnosti amfifilních látek jako jsou alkoholy nebo polyoly, například glycerol a/nebo propylenglykol.

Plynem použitým v kroku emulgace nemusí být plyn, který má být obsažen v hotovém produktu. Většina tohoto obsahu plynu může být odstraněna v průběhu následného kroku lyofiiizace a zbylý plyn může být odstraněn působením vakua na usušený produkt, na který se potom může působit atmosférickým tlakem nebo přetlakem

- 14 V ··

4* 4 • · • ·

4

4 4 IIM ·

4 · • 4*4

WW ▼ w * 4 4 · • 4 4 « •44 44·

4

44 požadovaného plynu hotového produktu. Plyn pro emulgaci může tak být zvolen čistě pro optimalizaci parametrů emulgačního procesu bez ohledu na požadavky na konečný produkt. Emulgace v přítomnosti fluoridů síry, jako je například fluorid sírový nebo fluorovaných plynných nízkomolekulárních uhlovodíků jako jsou perfluoralkany nebo perfluorcykloalkany, s výhodou s obsahem čtyř nebo pěti atomů uhlíku, může být zvláště výhodná z hlediska konečného získání hotových produktů, u kterých se spolehlivě opakovaně získá velikost mikrobublinek s úzkou distribucí.

io Emulgace se pohodlně provádí při přibližně pokojové teplotě, například při přibližně 25 ± 10 ^ŮC. Může být nutné zahřát na počátku vodné médium pro umožnění hydratace a tím dispergace amfifilní látky a její ekvilibrace na pokojovou teplotu před emulgaci.

Disperze vytvořené podle kroku (i) mohou být s výhodou vystaveny jednomu nebo více kroků praní před krokem lyofilizace (ii) pro oddělení a odstranění přídavných látek jako látek zvyšujících viskozitu a látek napomáhajících solubilizaci stejně jako nežádoucích látek jako jsou koloidní částice neobsahující plyn a mikrobublinky s velikostí větší nebo menší než je velikost požadovaná. Toto praní může být uskutečněno o sobě známým způsobem, kdy se mikrobublinky separují s použitím techniky jako například flotace nebo céntrifugace. Tímto způsobem je možno připravit disperze mikrobublinek tříděných podle velikosti, kde alespoň 90 % mikrobublinek má velikosti v rozmezí 2 pm, tedy například se středním objemovým průměrem v rozmezí 2 až 5 pm.

Může být výhodné provádět krok (ii) v přítomnosti jedné nebo více kryoprotektivních a/nebo lyoprotektivních a/nebo zbytňujících látek, kde tyto látky se s výhodou přidávají po krocích praní před lyofilizací. Obsáhlý seznam prostředků s kryoprotektivními a/nebo lyoprotektivními účinky se uvádí v Acta Pharm. Technol. 34(3), str. 129 - 139 (1988), který je zařazen odkazem. Příklady těchto prostředků

- 15• · · · » · « · · · · * · · • ··*··· “·· »· > t « » · « «· * ·· ·· jsou například alkoholy (například alifatické alkoholy jako t-butanol), polyoly jako glycerol, aminokyseliny jako glycin, uhlohydráty (například cukry jako sacharóza, mannitol, trehaíóza, glukóza, laktóza a cyklodextriny nebo polysacharidy jako dextran) a polyglykoly jako polyethylenglykol, přičemž výhodné je použití fyziologicky dobře snášených cukrů jako je sacharóza (například v množství pro dosažení izotonicity nebo mírné hypertonicity roztoku).

Lyofilizace disperze plynu může být například prováděna nejprve zmrazením a potom lyofilizací zmrazené disperze plynu, například io obecně známými způsoby. Tyto zmrazené disperze plynu mohou být skladovány ve zmrazeném stavu a roztaveny v případě potřeby, například jednoduchým zahřátím a/nebo přídavkem nosné kapaliny pro regeneraci disperzí mikrobublinek použitelných jako kontrastní prostředky podle vynálezu.

Protože požadovaný produkt se bude normálně rekonstituovat podle kroku (iii) popsaného výše před podáním, disperze plynu může být s výhodou plněna před lyofilizací do uzavíratelných lahviček tak, aby v každé lahvičce bylo obsaženo vhodné množství, například jednotková dávka, lyofilizovaného sušeného produktu pro rekonstituci do injikovatelné formy. Lyofilizací disperze plynu v jednotlivých lahvičkách namísto v celém objemu se zabrání manipulaci s jemnou voštinovou strukturou lyofilizovaného produktu a riziku alespoň částečné degradace této struktury. Po lyofilizací a případné další evakuaci plynu a zavedení plynu, který má být přítomen v mikrobublinkách hotového kontrastního prostředku, mohou být lahvičky uzavřeny vhodným uzávěrem. Obecně může být zmrazená disperze plynu nebo sušený produkt z kroku (ii) například po jakémkoliv nezbytném a/nebo požadovaném doplnění nebo výměně plynového obsahu rekonstituována přídavkem vhodné injikovatelné nosné kapaliny, jako je sterilní apyrogenní voda nebo fyziologický roztok pro injekce. Jestliže je sušený produkt obsažen v lahvičce, může být lahvička vhodně uzavřena šeptem, kterým může být • * φ φ φ

φφφ

- 16• φ · · φ * · * * « » ΦφΦ· v stříkačkou vstříknuta nosná kapalina. Může být výhodné míchat nebo mírně třepat produkt po rekonstituci; pro poskytnutí reprodukovatelných produktů s pevnou velikostí mikrobublinek by mělo stačit mírné třepání v ruce.

Další způsob přípravy kontrastních prostředků použitelných podle vynálezu zahrnuje uvedení práškového opsonizovatelného amfifilního materiálu do styku s plynem, smísení práškové amfifilní látky s vodnou nosnou kapalinou za vytvoření suspenze plynem plněných mikrobublinek, ponechání mikrobublinek vytvořit vrstvu, oddělení této vrstvy a promytí oddělených mikrobublinek (jak se popisuje například v U5-A-5445813. Daiší použitelná metoda zahrnuje třepání vodného roztoku s obsahem opsonizovatelného amfifilního materiálu v přítomnosti plynu (jak se například popisuje v WO-A9428780).

Přehled obrázků na výkresech

Na přiložených výkresech:

Obr. 1A je elektronová mikrofotografie vzorku jater kontrolní krysy, které byl podán fyziologický roztok, získaného podle popisu v příkladu 7;

Obr. 1B je zvětšení vyznačené části obr. 1A;

Obr. 1C je elektronová mikrofotografie vzorku jater krysy, které bylo podáno kontrastní činidlo, získaného podle popisu v příkladu 7; a

Obr. 1D je zvětšení vyznačené části obr. 1C.

Pro ilustraci vynálezu slouží následující neomezující příklady.

- 17Příklady provedení vynálezu

A - Výroba kontrastních činidel

Příklad 1

a) Výroba perfluorbutanovych mikrobublinkovvch disperzi třepáním

25,3 mg hydrogenovaného vaječného fosfatidylserinu se přidá do 12,5 ml vody s obsahem 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu a glycerolu (3 : 10 hmotnostních). Fosfolipidový materiál se hydratuje zahříváním na 70 °C přibližně 30 min a potom se ochladí na pokojovou teplotu. 11 ml disperze se rozdělí po 1 ml do jedenácti 2 ml lahviček io a zbylý prostor v lahvičkách se naplní plynným perfluor-n-butanem. Lahvičky se pevně uzavřou a třepají 45 s na zařízení Espe CapMix® (mixér pro zubní materiály). Získané disperze mikrobubiinek se spojí do čtyř větších lahviček a centrifugují při 2000 ot/min 5 min za získání dolní zakalené vrstvy kapaliny a na ní plovoucí vrstvy mikrobubiinek.

Dolní vrstva kapaliny se odstraní stříkačkou a nahradí stejným objemem vody za neutrálního pH. Krok praní se opakuje, ale dolní vrstva kapaliny se nyní nahradí roztokem sacharózy 10 % hmotnostních. 2 ml části získané disperze se rozplní do 10 ml lahviček s plochým dnem určených pro lyofilizaci a zkumavky se ochladí na

2o -47 °C a lyofilizují přibližně 48 hodin za poskytnutí bílé lehké pevné látky. Lahvičky se přenesou do vakuové komory, vzduch se odstraní vývěvou a nahradí plynným perfluor-n-butanem. Před použitím se přidá voda a zkumavky se mírně několik sekund třepají v ruce za získání disperzí mikrobublin vhodných jako ultrazvuková kontrastní činidla.

b) Výroba perfluorbutanovych mikrobublinkovvch disperzí míšením na zařízení rotor stator

500,4 mg hydrogenovaného vaječného fosfatidylserinu se přidá do 100 ml vody s obsahem 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu ·

- 18 - ·ί· ·!·· **·* · ·· * a glycerolu (3 : 10 hmotnostních). Směs se třepá a zahřívá na 80 °C 5 minut, ponechá se ochladit na pokojovou teplotu, znovu třepá a před použitím se ponechá stát přes noc.

ml získaného roztoku se převede do baňky s kulatým dnem s kuželovým hrdlem. Baňka se opatří skleněným pláštěm se vstupem a výstupem pro řízení teploty připojeným k vodní lázni udržované na 25 °C. Míchací vřeteno typu rotor stator se zavede do roztoku a pro zabránění úniku plynu se prostor mezi stěnou hrdla a míchacím vřetenem utěsní speciálně navrženou kovovou zátkou opatřenou io připojením vstupu a výstupu plynu pro nastavení obsahu planu a řízení tiaku. Výstup plynu je připojen na vývěvu a roztok se odplyňuje jednu minutu. Potom se vstupem plynu přivede atmosféra plynného perfluorn-butanu.

Roztok se homogenizuje při 23 000 ot/min 10 min při udržování míchacího vřetena typu rotor stator v takové poloze, že otvory se nacházejí mírně nad povrchem kapaliny. Získá se bíle zbarvená krémovitá disperze, která se převede do uzavíratelného zásobníku a propláchne perfluor-n-butanem. Disperze se potom převede do dělicí nálevky a centrifuguje při 12 000 ot/min 30 minut za získání krémovité vrstvy bublinek nahoře a dolní vrstvy zakalené kapaliny. Dolní zakalená kapalina se odstraní a nahradí vodou. Centrifugace se potom dvakrát opakuje, ale nyní při 12 000 ot/min 15 minut. Po poslední centrifugaci se supernatant nahradí roztokem sacharózy 10 % hmotnostních. Části po 2 ml získané disperze se rozdělí do 10 ml lyofilizačních lahviček s plochým dnem a lahvičky se ochladí na -47 °C a lyofilizují přibližně 48 hodin za získání lehké bílé pevné látky. Lahvičky se převedou do vakuové komory, vzduch se odstraní vývěvou a nahradí plynným perfluor-n-butanem. Před použitím se přidá voda a lahvičky se mírně třepou v ruce několik sekund za získání disperze

3o mikrobublinek vhodné jako ultrazvuková kontrastní činidla.

• 9

c) Výroba perfluorbutanovvch mikrobublinkovych disperzi sonikací

500,4 mg hydrogenovaného vaječného fosfatidylserinu se přidá do 100 ml vody s obsahem 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu a glycerolu (3:10 hmotnostních). Směs se třepá a zahřívá na 80 °C

5 minut, ponechá se ochladit na pokojovou teplotu, znovu třepá a před použitím se ponechá stát přes noc.

Tento roztok se čerpá čtyřmililitrovou průtokovou celou sonikátoru a vystaví se působení ultrazvuku 20 kHz s amplitudou 90 pm. Průměr sondy sonikátoru je 1,3 cm, vnitřní průměr cely je io 2,1 cm a vzdálenost mezi sondou a dnem cely je 1 cm. Roztok lipidu se smísí před vstupem do cely sonikátoru s perfluor-n-butanem v poměru 1 : 2 objemových (20 ml/min roztoku lipidu a 40 ml/min plynného perfluor-n-butanu). Teplota se udržuje na 33 °C. Získá se bílá krémovitá disperze, která se plní do zásobníku a propláchne ís perfluor-n-butanem.

Charakterizace

Distribuce velikosti a objemová koncentrace mikrobublinek se měří na přístroji Coulter Counter Mark II opatřeném kapilárou 50 pm pro měřicí rozsah 1 až 30 pm. Vzorky 20 pí se zředí ve 200 ml fyziologického roztoku nasyceného vzduchem při pokojové teplotě a ponechá se ekvilibrovat před měřením 3 minuty.

Ultrazvuková charakterizace se provede při experimentálním uspořádání podle de Jong, N. a Hoff, L. jak se popisuje v “Ultrasound scattering properties of Albunex microspheres“, Ultrasonics 31(3), str. 175 - 181 (1993) s mírně modifikovaným postupem. Přístroje měří schopnost zředěné suspenze kontrastního činidla zeslabovat ultrazvuk v rozmezí frekvencí 2 až 8 MHz. V průběhu měření zeslabení se provede test tlakové stability vystavením vzorku přetlaku 16 kPa

3o (120 mm Hg) 90 sekund. Typicky se 2 - 3 pí vzorku zředí 55 ml

0

-20·«··

I 0 0···

I · 0

0· *

000 ··· • 0 ·* přípravku Isoton II a zředěná suspenze vzorku se před analýzou míchá 3 min. Jako primární parametr odezvy se použije zeslabení při 3,5 MHz spolu s hodnotou zeslabení při 3,5 MHz získanou po uvolnění přetlaku.

Tabulka 1.1

Charakteristiky disperzí bublinek vytvořených podle příkladu 1 (a) - (c) in vitro. V tabulce jsou uvedeny číselné a objemové vážené koncentrace a objemové střední průměry. Akustické vlastnosti byly io měřenv Dodle nonisu nvedAného výše.

Způsob výroby (přlkl. No.)	Číselná koncentrace [10⁶/ml]	Objemová koncentrace [%]	Objemový střední průměr [pm]	Zeslabení při 3,5 MHz [dB/cm]	Přežití po přetlaku [%]	Frekvence pří max. zeslabení [MHz]
1(a)	1 519	1,45	3,91	30,46	100	4,1
1{b)	10 518	6,51	3,16	150,4	96	4,3
1(c)	23 389	9,57	3,83	117	100	3,5

Příklad 2

Výroba různých disperzí mikrobublinek míšením na zařízení typu rotor stator, lyofilizací a záměnou plynu

Plyn obsažený v pěti vzorcích připravených podle příkladu 1 (b) výše se nahradí vzduchem, perfluorbutanem, fluoridem sírovým, pentafluoridem trifluormethyísírovým, popřípadě tetramethylsilanem následujícím způsobem:

Dva vzorky s obsahem lyofiližovaného produktu z příkladu 1(b) se umístí do exikátoru opatřeného vstupem a výstupem plynu. Exikátor se připojí na zařízení pro řízení vakua a destilaci Biichi 168, které ·: .Cp..:

-21- ·:··:·· *··’ ^: ·· ·· dovoluje řízenou evakuaci vzorků a přívod zvoleného plynu. Vzorky se evakuují tlakem přibližně 1 kPa 5 minut a potom se tlak zvýší na atmosférický tlak přivedením zvoleného plynu a lahvičky se opatrně uzavřou. Postup se opakuje s dalšími páry vzorků pro každý ze zvolených plynů.

Do každé lahvičky se přidají 2 ml destilované vody a lahvičky se před použitím mírně protřepou rukou. Získané disperze mikrobublinek se charakterizují co se týče měření distribuce velikosti bublinek jak je popsáno v příkladu 1. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.1.

Tabulka 2.1

Charakterizace mikrobublinkových disperzí stabilizovaných fosfatidylserinem vyrobených podle příkladu 2. V tabulce jsou uvedeny číselné a objemové vážené koncentrace a objemové střední průměry.

- 22 • ···· *· ·· • · · • · · •ft* ··· v · • ft ··

Plyn	Číselná koncentrace [10^s/ml]	Číselný střední průměr [pm]	Objemová koncentrace l%]	Objemový střední průměr [pm]
perfluorbutan	9 756	1,8	4,9	5,8
pentafluorid trifluormethyl- sírový	10 246	1,9	5,9	3,5
fluorid sírový	9 927	1,9	5,7	3,2
tetramethylsilan	9 947	1,9	6,1	3,7
vzduch	9 909	1,9	6,4	4,0

Jak bude vidět z uvedených výsledků, záměnou plynu nedojde k významné změně distribuce velikosti, což ukazuje, že předem vytvořená velikost mikrobublinek se během jak lyofilizace, tak i rekonstituce v podstatě zachová.

B - Způsob ultrazvukového zobrazování jater

Příklad 3 ío Zobrazování jater u králíka

Kontrastní činidla vyrobená podle příkladu 1 byla intravenózně vstříknuta v dávce 5 pg fosfolipidu/kg králíkům, kterým bylo intramuskulárně podáno 0,65 mg/kg směsi hydrochloridu xylazinu a hydrochloridu ketaminu jako sedativ. Ultrazvukový převodník byl is umístěn na oholenou kůži nad oblastí jater. Transabdominální studie provedené zobrazením v B-modu (5 - 7 MHz), barevném Dopplerově zobrazení, zobrazením druhou harmonickou, výkonovým Dopplerovým zobrazením, kombinacemi harmonického a barevného Dopplerova zobrazení a kombinacemi harmonického a výkonového Dopplerova zobrazení ukázaly přítomnost implantovaných tumorů VX2 v játrech

-23• · · a byly v korelaci s výsledky získanými rentgenovou radiografií s použitím arteriálně podaným ethiodolem jako kontrastním prostředkem.

Příklad 4

Zobrazení jater u amerických svišťů lesních

Byly použity postupy z příkladu 3 pro detekci přítomnosti přirozeně se vyskytujících jaterních tumorů u svišťů. Výsledky byly v korelaci s histologickým vyšetřením jater.

Příklad 5

Vyšetření jater u psů pl 1 % mikrobublinkové disperze vyrobené podle příkladu 1 (a) bylo vstříknuto intravenózně hybridnímu psu. Před a 10 minut po injekci bylo provedeno zobrazení jater druhou harmonickou s použitím skaneru ATL HDI-3000 s vybavením pro zobrazování druhou harmonickou, s emisní frekvenci 2,5 MHz a převodníkem typu P5-3 phased array sector scan transducer. Výstupní výkon skaneru byl nastaven na nízkou úroveň s mechanickým indexem (Ml) 0,3.

Převodník byl umístěn v podžeberní oblasti blízko střední čáry. Kontrastně indukované zvýraznění jater v získaných zobrazeních po injekci bylo stabilní a zdálo se, že se s časem nesnižuje bez ohledu na trvalé ultrazvukové skanování. Ve srovnání se základním zobrazováním získaným před injekcí mohlo být vidět zřetelné zesílení kontrastu celých jater do hloubky více než 10 cm.

»0 ·

-24«·· ··*· ·* » 0 0 · ι · 0 ·

000 ···

Přiklad 6

Zobrazení tumoru v lidských játrech μΙ 1 % disperze mikrobublinek připravené stejně jako v příkladu 1(a) bylo vstříknuto intravenózně pacientce. Základní 5 zobrazení jater v B-modu provedené skanerem ATL HD1-3000 jasně ukázalo zvýraznění cév v okolí metastatických poškození. 15 min po injekci měla poškození, která měla v základním zobrazení stejný odraz jako okolní tkáň a byla tak zpočátku nesnadno viditelná, zvýšenou viditelnost v důsledku zvýšení odrazu okolní normální jaterní tkáně, ío Tento efekt byl ještě výraznější 30 minut po injekci, což ukazuje přetrvávající a zvýšené kontrastní účinky po prodloužené době zdržení kontrastního prostředku v játrech.

Příklad 7

Buněčná distribuce kontrastního činidla po absorpcí v játrech krysy in vivo

Tři neanestetizované krysy dostaly vždy jednu intravenózní injekci 1 % disperze mikrobublinek připravené jako v příkladu 1(a) (50 μΙ mikrobublinek na kg tělesné hmotnosti, což odpovídá několikasetnásobku typické zobrazovací dávky u lidi) do ocasní žíly. Kontrolní krysy dostaly podobně injekci fyziologického roztoku. Po injekci byly krysy anestetizovány. Deset minut po injekci byla rozříznuta stěna břicha a hrudníku a játra byla promývána pufrem (100 mM HEPES, pH 7,4), dokud nezbledla a potom stejným pufrem s obsahem glutaraldehydu (2 % obj.), dokud neztvrdla. Játra byla potom vyříznuta a nařezána na tenké řezy. Vzorky tkáně byly zpracovány do epoxidové pryskyřice a polotenké (přibližně 1 pm) řezy byly nařezány pro vyšetření světelnou mikroskopií. Světelnou mikroskopií byly vybrány vhodné oblasti a z nich byly vyříznuty malé

3o oblasti ultratenkých řezů, které byly obarveny oxidem osmičelým pro

-25*··’ · ··* ·' elektronovou mikroskopii.

Kontrolní elektronové míkrofotografie vzorků krys ošetřených fyziologickým roztokem (viz obr. 1A a jeho zvětšení obr. 1B) neukázaly žádnou vakuolizaci v Kupfferových buňkách, endoteliálních buňkách nebo parenchymatických buňkách. Elektronové míkrofotografie vzorků z krys po podání kontrastního činidla (viz obr. 1C a zvětšení na obr. 1D) ukázaly, že některé Kupfferovy buňky mají uvnitř mikročástice nebo mikrobublinky („p“). Žádné takové mikročástice nebo mikrobublinky nebyly prokázány v parenchymatických nebo endoteliálních buňkách. Navíc mohl být na hranicích některých těchto mikročástic nebo mikrobublinek pozorován hustěji obarvený materiál, o kterém se předpokládá, že jde o fosfoiipidický materiál („PL“).

Claims

1. Použití mikrobublinek biokompatibilního plynu stabilizovaného opsonizovatelným amfifilním materiálem pro výrobu kontrastních činidel pro použití při ultrazvukovém zobrazování jater člověka a zvířat.

2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedený opsonizovatelný amfifilní materiál obsahuje lipid vytvářející membránu.

3. Použití podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e uvedený lipid vytvářející membránu obsahuje fosfolípíd.

4. Použití podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e uvedený lipid vytvářející membránu obsahuje alespoň

50 % záporně nabitého fosfolipidů.

5. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, ž e uvedený záporně nabitý fosfolípíd obsahuje alespoň jeden fosfatidylserin.

6. Použití podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že uvedený biokompatibilní plyn obsahuje fluorid sírový, fluorid dvojsírový, fluorovaný keton, fluorovaný ether nebo perfluorovaný uhlovodík.

-27·· • * · · • · » · < ··♦ • · *· ··

7. Použití podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e perfluorovaným uhlovodíkem je perfluorbutan.

8. Použití podle některého z nároků 1až5, vyznačující se tím, že uvedený amfifilní materiál je fluorovaný a uvedený biokompatibilní plyn je zvolen ze vzduchu, dusíku, oxidu uhličitého, kyslíku, vodíku, oxidu dusného, inertního plynu, popřípadě halogenovaného sílánu, popřípadě halogenovaného nízkomolekulárního uhlovodíku, halogenidu síry a jejich směsí,

9. Použití podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že před, v průběhu nebo

15 po podání uvedeného kontrastního činidla se podá látka schopná stimulovat krevní průtok v játrech a/nebo látka schopná zvýšit jaterní absorpci stimulací fagocytózy.

10. Použití podle některého z předcházejících nároků,

20 vyznačující se tím, že ultrazvukové zobrazení je vytvářeno zobrazením druhou harmonickou.