ES2952104T3 - Microburbujas lipídicas y proceso de elaboración de las mismas - Google Patents

Microburbujas lipídicas y proceso de elaboración de las mismas Download PDF

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Abstract

Se divulga una suspensión de microburbujas llenas de gas en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable que comprende una mezcla de lípidos de un primer lípido que tiene una temperatura de transición de aproximadamente 41 °C tal como DPPC o DPPG, un segundo lípido que tiene una temperatura de transición de aproximadamente 55 °C tal como DSPC o DSPG, y un DSPE PEGilado tal como DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000, y métodos de preparación de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Microburbujas lipídicas y proceso de elaboración de las mismas
Antecedentes de la invención
La ecografía mejorada con contraste es la aplicación de un medio de contraste ecográfico a la ecografía médica tradicional. Los medios de contraste disponibles comercialmente son microburbujas llenas de gas que se administran por vía intravenosa a la circulación sistémica. Hay diversos agentes de contraste a base de microburbujas. Las microburbujas difieren en la constitución de la cubierta, la constitución del núcleo de gas y en si están dirigidas o no. Independientemente de la composición de la cubierta o el núcleo de gas, el tamaño de las microburbujas es bastante uniforme. Se encuentran dentro del intervalo de 1-5 μm de diámetro. Tales agentes de contraste ecográfico a base de microburbujas pueden circular bien en el torrente sanguíneo y proporcionan una significativa mejora écográfica de la perfusión en la obtención de imágenes ecográficas. El artículo "Development of fluorous lipid-based nanobubbles for efficiently containing perfluoropropane" de Yusuke Oda et al. (International Journal of Pharmaceutics 487 (2015) páginas 64-71) describe fluorolípidos que se usan como tensioactivos para generar liposomas que encapsulan nanoburbujas, de tal modo que los lípidos sirven como estabilizadores entre las fases de gas fluoroso y agua. El documento EP 2104488 A2 describe microvesículas llenas de gas que comprenden una envoltura límite que contiene un gas, en donde dichas microvesículas comprenden: un primer componente unido a dicha envoltura que tiene afinidad de unión por una región Fc de un anticuerpo; y un segundo componente que comprende una región Fc de un anticuerpo unido a dicho primer componente a través de dicha región Fc, en donde dicho segundo componente comprende un ligando selectivo o un agente terapéutico. El documento WO 2005/063305 A1 describe un conjunto que comprende una microvesícula llena de gas y una entidad estructural que es capaz de asociarse a través de una interacción electrostática a la superficie externa de dicha microvesícula (componente asociado a microvesículas -MAC) y modificar así las propiedades fisicoquímicas de la misma, en donde dicho MAC puede comprender opcionalmente un ligando selectivo, un agente bioactivo, un agente de diagnóstico o cualquier combinación de los mismos, en donde el conjunto de la invención puede estar formado por microburbujas o microglobos llenos de gas y un MAC con un diámetro de menos de 100 μm, en particular una micela, y se utiliza como componente activo en formulaciones con actividad diagnóstica y/o terapéutica, en particular para mejorar la obtención de imágenes en el campo de la obtención de imágenes ecográficas con contraste, incluida la ecografía dirigida, la administración de fármacos mediada por ecografía y otras técnicas de obtención de imágenes como la obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) o la obtención de imágenes nucleares.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona una suspensión de microburbujas llenas de gas en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable, en donde dichas microburbujas comprenden (a) una mezcla de lípidos que consta de un primer lípido con una temperatura de transición de 41 °C, un segundo lípido con una temperatura de transición de 55 °C y una 1,2-diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) PEGilada, y (b) un gas biocompatible, en donde dicho gas se selecciona del grupo que consta de perfluorocarburos, SF6, Ar y N2 , en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos.
En un aspecto, en este documento se proporciona un vial sellado que comprende una suspensión de microburbujas llenas de gas como se define en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas de la invención se describen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada que describe realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos acompañantes, en donde:
Las figuras 1A-B exponen las concentraciones (1A) y el tamaño medio (1B) de las microburbujas formadas a partir de las muestras con los números 1a-8a con cantidades diversas de DPPC.
Las figuras 2A-B exponen las concentraciones (2A) y el tamaño medio (2B) de las microburbujas formadas a partir de las muestras con los números 1b-8b con cantidades diversas de DPPG.
La figura 3 expone el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en cada una de las muestras 1a a 8a preparadas con mezclas de los lípidos DPPC, DSPC y DSPE-PEG-2000.
La figura 4A ilustra los resultados de las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 1a a 8a preparadas con mezclas de los lípidos DPPC, DSPC y DSPE-PEG-2000.
La figura 4B ilustra los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a a 8a preparadas con mezclas de los lípidos DPPC, DSPC y DSPE-PEG-2000, en donde el valor de la intensidad acumulativa relativa de 1a se normaliza como el 100 %.
La figura 5 expone el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en cada una de las muestras 1b a 8b preparadas con mezclas de los lípidos DPPG, DSPC y d Sp E-PEG-2000.
La figura 6A ilustra los resultados de las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 1b a 8b preparadas con mezclas de los lípidos DPPG, DSPC y DSPE-PEG-2000.
La figura 6B ilustra los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1b a 8b preparadas con mezclas de los lípidos DPPG, DSPC y DSPE-PEG-2000, en donde el valor de la intensidad acumulativa relativa de 1b se normaliza como el 100 %.
Las figuras 7A-B exponen las concentraciones de las microburbujas formadas a partir de las muestras 1a, 3a, 6a, 3c, 6c (7A) y 1a, 3b, 6b, 3d, 6d (7B).
Las figuras 8A-B exponen el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en cada una de las muestras 3a, 6a, 3c, 6c (8A) y 3b, 6b, 3d, 6d (8B).
Las figuras 8C-D ilustran los resultados de las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 3a, 6a, 3c, 6c (8C) y 3b, 6b, 3d, 6d (8D).
Las figuras 8E-F ilustran los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a, 3a, 6a, 3c, 6c (8E) y 1 a, 3b, 6b, 3d, 6d (8F), en donde el valor de la intensidad acumulativa relativa de 1a se normaliza como el 100 %.
La figura 9A expone las concentraciones de las microburbujas formadas a partir de las muestras 1a, 3a, 6a, 3e y 6e.
La figura 9B expone el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en cada una de las muestras 3a, 6a, 3e y 6e.
La figura 9C ilustra los resultados de las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 3a, 6a, 3e y 6e.
La figura 9D ilustra los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a, 3a, 6a, 3e y 6e, en donde el valor de la intensidad acumulativa relativa de 1a se normaliza como el 100 %.
La figura 10A expone las concentraciones de las microburbujas formadas a partir de las muestras 1a, 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3.
La figura 10B expone el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en las muestras 1a, 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3.
La figura 10C ilustra los resultados de las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3.
La figura 10D ilustra los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a, 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3, en donde el valor de la intensidad acumulativa relativa de 1a se normaliza como el 100 %.
La figura 11A expone las concentraciones de las microburbujas formadas a partir de las muestras 1a, 3a, 5a, 3f y 5f.
La figura 11B expone el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en cada una de las muestras 3a, 5a, 3f y 5f.
La figura 11C ilustra los resultados de las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 3a, 5a, 3f y 5f.
La figura 11D ilustra los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a, 3a, 5a, 3f y 5f, en donde el valor de la intensidad acumulativa relativa de 1a se normaliza como el 100 %.
Descripción detallada de la invención
El solicitante ha encontrado ahora inesperadamente las composiciones específicas a través de un método preferido para producir las microburbujas de la invención, que tienen una excelente estabilidad térmica y una prolongada estabilidad in vivo, lo que aumenta la duración del tiempo efectivo como agentes de contraste ecográfico.
Se sabe en la técnica que las aplicaciones de obtención de imágenes requieren relativamente pocas microburbujas, por ejemplo, del orden de 106-108 microburbujas por inyección. Actualmente, las microburbujas disponibles tienen un diámetro relativamente grande y son inestables en la circulación sanguínea, por lo que es difícil alcanzar una acumulación suficiente en el tejido diana en un tiempo limitado
La presente invención descubre inesperadamente una suspensión de microburbujas llenas de gas en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable, de alta concentración y excelente perfil de estabilidad.
En particular, la presente invención proporciona una suspensión de microburbujas llenas de gas en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable que comprende (a) una mezcla de lípidos que consta de un primer lípido con una temperatura de transición de 41 °C, tal como DPPC o DPPG, un segundo lípido con una temperatura de transición de 55 °C, tal como DSPC o DSPG, y una 1,2-diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) PEGilada, tal como DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000, y (b) un gas biocompatible, en donde dicho gas se selecciona del grupo que consta de perfluorocarburos, SF6, Ar y N2 , en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos. En ciertas realizaciones, dicho primer lípido es DPPC o DPPG. En ciertas realizaciones, la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 50 % al 63 % en peso, del 40 % al 60 % en peso, del 50 % al 60 % en peso o del 40 % al 50 % en peso. En ciertas realizaciones, dicho primer lípido es DPPC. En ciertas realizaciones, dicho primer lípido es DPPG. En ciertas realizaciones, dicho segundo lípido es DSPC o DSPG. En ciertas realizaciones, dicho segundo lípido es DSPC. En ciertas realizaciones, dicho segundo lípido es DSPG. En ciertas realizaciones, dicha DSPE PEGilada es DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000. En ciertas realizaciones, dicha DSPE PEGilada es DSPE-PEG2000. La cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos. En ciertas realizaciones, la cantidad de DSPE PEGilada es de aproximadamente el 12,5 % en peso. En ciertas realizaciones, la suspensión está en un vial sellado. En ciertas realizaciones, dicha suspensión o vial sellado comprende además del 1 % al 20 % de glicerol. En ciertas realizaciones, dicha suspensión o vial sellado comprende además el 5 % de glicerol. Dicho gas se selecciona del grupo que consta de perfluorocarburos, SF6, Ar y N2. En ciertas realizaciones, dicho gas perfluorocarburo es C3 F8 , C4 F10 o C5 F12.
En algunas realizaciones, se proporciona una suspensión de microburbujas llenas de gas que comprende (a) una mezcla de lípidos que consta de un primer fosfolípido con una temperatura de transición de 41 °C (tal como DPPC o DPPG), un segundo fosfolípido DSPC o DSPG y una DSPE PEGilada tal como DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000, y (b) un gas biocompatible como se define en las reivindicaciones, en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos. En ciertas realizaciones, la suspensión está en un vial sellado. En algunas realizaciones, se proporciona una suspensión de microburbujas llenas de gas que comprende (a) una mezcla de lípidos que consta de un primer lípido DPPC o DPPG, un segundo lípido con una temperatura de transición de 55 °C (tal como DSPC o DSPG) y una DSPE PEGilada tal como como DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000, y (b) un gas biocompatible como se define en las reivindicaciones, en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos. En ciertas realizaciones, la suspensión está en un vial sellado.
En algunas realizaciones, se proporciona una suspensión de microburbujas llenas de gas que comprende (a) una mezcla de lípidos que consta de un primer fosfolípido DPPC o DPPG, un segundo fosfolípido DSPC o DSPG y una DSPE-PEGilada DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE- PEG5000, y (b) un gas biocompatible como se define en las reivindicaciones, en donde la cantidad de dicho primer fosfolípido está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos. En ciertas realizaciones, la suspensión está en un vial sellado.
En algunas realizaciones, se proporciona una suspensión de microburbujas llenas de gas que comprende (a) una mezcla de lípidos que consta de un primer fosfolípido con una temperatura de transición de 41 °C (tal como DPPC o DPPG), un segundo fosfolípido DSPC o DSPG y DSPE-PEG2000, (en donde DSPE-2000 puede sustituirse por DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000), y (b) un gas biocompatible como se define en las reivindicaciones, en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos. En ciertas realizaciones, la suspensión está en un vial sellado. En algunas realizaciones se proporciona una suspensión de microburbujas llenas de gas que comprende (a) una mezcla de lípidos que consta de DPPC o DPPG, DSPC o DPPG, y una DSPE PEGilada seleccionada de entre DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 y DSPE-PEG5000, y (b) un gas biocompatible como se define en las reivindicaciones, en donde la cantidad de DPPC o DPPG está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % a 15 % en peso en la mezcla de lípidos. En ciertas realizaciones, la suspensión está en un vial sellado.
En algunas realizaciones, algunos ejemplos de un primer lípido adecuado con una Tm de 41 °C son 1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (DPPG) o similares, especialmente en el intervalo de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 63 % en peso en la mezcla de lípidos descrita en este documento. En algunas realizaciones, la cantidad está en el intervalo del 50 % al 63 % en peso, del 40 % al 60 % en peso, del 50 % al 60 % en peso o del 40 % al 50 % en peso en la mezcla de lípidos descrita en este documento.
Según el hallazgo inesperado de esta invención, la cantidad de DPPC está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos descrita en este documento para proporcionar una alta concentración de microburbujas con un perfil de estabilidad excelente. En ciertas realizaciones, la cantidad de DPPC está en el intervalo del 50 % al 60 % en peso.
Del mismo modo, la sustitución de DPPC por el lípido cargado DPPG también proporciona una alta concentración de microburbujas con un perfil de estabilidad excelente. En algunas realizaciones, la cantidad de DPPG está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos descrita en este documento. En ciertas realizaciones, la cantidad de DPPG está en el intervalo del 40 % al 60 %, del 40 % al 50 % o del 50 % al 60 % en peso.
Según la práctica de esta invención, se usa 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), nombre IUPAC, 2-(trimetilazaniumil)etilfosfato de [(2fí)-2,3-di(octadecanoiloxi)propilo], o 1,2-dioctadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-racglicerol) (DSPG) en la mezcla de lípidos preferida descrita en este documento para una suspensión de microburbujas llenas de gas que proporciona los resultados superiores inesperados. Tanto DSPC como DSPG tienen una temperatura de transición (Tm) de 55 °C, por lo que se espera que otros lípidos con propiedades y Tm similares proporcionen los mismos o similares resultados inesperados.
Inesperadamente, se ha encontrado que, contrariamente a los hallazgos anteriores (por ejemplo, la publicación de los EE. UU. n.° 2009/0263330), el alto contenido de un lípido modificado con un polímero (por ejemplo, DSPE-PEG2000, al 12,5 % p/p en la mezcla de lípidos descrita en este documento) no afecta negativamente a la cantidad de microburbujas obtenidas. Sorprendentemente, la mezcla del 10 % al 15 % p/p (por ejemplo, el 12,5 % p/p) de DSPE-PEG2000 con las composiciones preferidas de un lípido de baja Tm (por ejemplo, DPPC y DPPG) y un lípido de alta Tm (DSPC o DSPG) proporciona inesperadamente microburbujas estabilizadas.
La modificación con polímeros, específicamente las conjugaciones lípido-polietilenglicol (PEG), se conocen en la técnica. Un lípido PEGilado descrito en este documento se refiere a un lípido conjugado lípido-polietilenglicol (PEG), por ejemplo, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi(polietilenglicol)-3000] (DSPE-PEG3000), 1,2-diestearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi (polietilenglicol)-5000] (DSPE-PEG5000) o similares.
Dado que DSPE-PEG3000 y DSPE-PEG5000 actúan de manera similar con respecto a las funciones de DSPE-PEG2000, una DSPE PEGilada, en algunos casos, los resultados inesperados descritos en este documento se extienden a estos dos lípidos PEGilados. El ejemplo 4 muestra resultados inesperados similares al usar DSPE-PEG5000 en lugar de DSPE-PEG2000. En algunas realizaciones, la cantidad de DSPE PEGilada, tal como DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000, en la mezcla de lípidos es de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 15 % en peso. En ciertas realizaciones, la cantidad de DSPE PEGilada, tal como DSPE-PEG2000, DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000, es de aproximadamente el 12,5 % en peso.
Los gases descritos en este documento adecuados para uso en microburbujas incluyen, por ejemplo, aire, O2 , N2 , H2 , CO2 , N2O, SFs, gases nobles, gases de hidrocarburo, perfluorocarburos, otros gases fluorados y combinaciones de los mismos.
El gas utilizado en la suspensión del vial sellado se selecciona del grupo que consta de gases perfluorocarburos, tales como C3 F8 , C4F10, C5 F12 o SFs, Ar o N2.
En algunas realizaciones, el vial sellado o la suspensión descritos en este documento comprenden además del 1 % al 20 % de glicerol. En ciertas realizaciones, el vial sellado o la suspensión comprenden además el 5 % de glicerol. El glicerol adicional se usa según los métodos conocidos en el campo para preparaciones de microburbujas.
Ejemplos no limitados de vehículos líquidos adecuados son agua, normalmente agua estéril apirógena (para evitar en la medida de lo posible la contaminación en el producto liofilizado intermedio), soluciones acuosas tales como solución salina (que puede equilibrarse ventajosamente para que el producto final para inyección no sea hipotónico) o soluciones acuosas de una o más sustancias ajustadoras de la tonicidad tales como sales o azúcares, alcoholes de azúcar, glicoles u otros polioles no iónicos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares).
En algunas realizaciones, el glicerol comprendido adicionalmente puede sustituirse, por ejemplo, por polietilenglicol, péptidos, albúmina, aminoácidos, alcoholes de azúcar, butano-1,3-diol, propano-1,2,3-triol, propano-1,2-diol, propano-1,3-diol, propan-1 -ol, etano-1,2-diol, etanol, metanol y dimetilsulfóxido, o una combinación de los mismos.
Otros excipientes, si se usan, pueden comprender, por ejemplo, lactosa, almidón (por ejemplo, almidón de maíz), almidón de maíz desnaturalizado, manitol, lactosa, sorbitol, celulosa de madera, celulosa microcristalina, combinaciones de los mismos o similares.
Los aglutinantes, si se usan, pueden comprender, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico y saponificados parciales de estos, que pueden usarse solos o combinados.
Los disgregantes, si se usan, pueden comprender, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución, carmelosa, carboxialmidón sódico, carmelosa cálcica, glicolato de almidón sódico, Kollidon CL, almidón de maíz, almidón parcialmente alfatizado, croscarmelosa sódica, hidroxipropilcelulosa, crospovidona (como crospovidona XL-10), combinaciones de los mismos o similares.
Los lubricantes, si se usan, pueden comprender, por j l t t d i á id t á i á id lmítico, estearato de calcio, talco, una combinación de los mismos o similares.
El término "aceptable" con respecto a una formulación, composición o ingrediente, como se usa en este documento, significa que no tiene un efecto perjudicial persistente sobre la salud general del sujeto que se trata.
El término "vehículo", como se usa en este documento, se refiere a compuestos o agentes químicos relativamente no tóxicos que facilitan la incorporación de un compuesto en células o tejidos.
El término "diluyente" se refiere a compuestos químicos que se utilizan para diluir el compuesto de interés antes de su administración. Los diluyentes también pueden usarse para estabilizar compuestos porque pueden proporcionar un entorno más estable. En la técnica se utilizan como diluyentes sales disueltas en soluciones tamponadas (que también pueden proporcionar control o mantenimiento del pH), que incluyen, pero no se limitan a una solución salina tamponada con fosfato.
El término "sujeto" o "paciente" abarca a los mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a cualquier miembro de la clase de los mamíferos: humanos, primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como vacas, caballos, ovejas, cabras y cerdos; animales domésticos tales como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores, tales como ratas, ratones y cobayas, y similares. En una realización, el mamífero es un ser humano.
En ciertas realizaciones, las suspensiones acuosas de la invención pueden incluir uno o más polímeros como agentes de suspensión. Los polímeros incluyen polímeros solubles en agua tales como polímeros celulósicos, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, y polímeros insolubles en agua tales como polímeros reticulados que contienen carboxilo. Ciertas composiciones farmacéuticas descritas en este documento incluyen un polímero mucoadhesivo, seleccionado de entre, por ejemplo, carboximetilcelulosa, carbómero (polímero de ácido acrílico), poli(metacrilato de metilo), poliacrilamida, policarbófilo, copolímero de ácido acrílico/acrilato de butilo, alginato de sodio y dextrano.
Todas las diversas realizaciones u opciones descritas en este documento pueden combinarse en cualquiera y en todas las variaciones. Los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar la invención y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes de la misma.
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparación de microburbujas mediante formulaciones de la invención de mezclas de lípidos a base de DSPC
Diseño: Para reducir la Tm total de la mezcla de lípidos utilizada en una suspensión de microburbujas llenas de gas, se utilizó un lípido con una Tm más baja, de aproximadamente 41 °C (por ejemplo, DPPC o DPPG, o similares) junto con un lípido con una Tm más alta, de aproximadamente 55 °C (por ejemplo, DSPC o DSPG, o similares).
Etapa 1: Preparación de la mezcla de lípidos antes del llenado de gas. Disolver las mezclas de lípidos constituidas por un primer lípido (por ejemplo, DPPC o DPPG), un segundo lípido (por ejemplo, DSPC o DSPG) y un lípido PEGilado (por ejemplo, DSPE-PEG2000) según las composiciones de las muestras con los números que se exponen en las tablas 1 y 2 en un disolvente orgánico adecuado como cloroformo o metanol en cada vial. Después de la eliminación del disolvente orgánico, se forma una película homogénea de la mezcla de lípidos. Añadir una solución salina que contenga del 1 al 20 % de glicerol, tal como PBS (por ejemplo, PBS con glicerol al 5 %) a la mezcla de lípidos resultante. Calentar la mezcla acuosa de lípidos, si es necesario, para generar una solución de liposomas homogénea. Dispensar 0,8 ml de las soluciones de liposomas en viales de vidrio de 2 ml. La concentración de las mezclas de lípidos en cada vial se fijó en 4 mg/ml.
Etapa 2: Llenado de gas. Sellar los viales preparados en la etapa 1 en una cámara cerrada que contenga un gas perfluorocarburo, tal como C3 F8 , C4 F10, C5 F12, o SF6 o Ar o N2. Como alternativa, los viales pueden purgarse con el gas deseado antes de sellarlos. A continuación, los viales llenos de gas se almacenan a temperatura ambiente o refrigerados en espera de la formación de burbujas posterior en el punto de uso.
Etapa 3: Justo antes de cada uso o prueba, colocar los viales en un agitador para agitar la solución de liposomas a temperatura ambiente (20-30 °C) hasta que se forme una solución de microburbujas.
Tabla 1. Composiciones de muestras de mezclas de lípidos que constan de DPPC, DSPC y DSPE-PEG2000.
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Tabla 2. Composiciones de muestras de mezclas de lípidos que constan de DPPG, DSPC y DSPE-PEG2000.
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Ejemplo 2. Mediciones de las microburbujas formadas a partir de las formulaciones de ejemplo
Las microburbujas formadas en cada vial se evaluaron mediante Multisizer para determinar su tamaño medio y concentración. Los resultados se muestran en las tablas 3 y 4 y las figuras 1 y 2.
Tabla 3. Tamaño medio y concentración de las microburbujas preparadas a partir de mezclas de los lípidos DPPC, DSPC y DSPE-PEG2000.
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Tabla 4. Tamaño medio y concentración de las microburbujas preparadas a partir de mezclas de los lípidos DPPG, DSPC y DSPE-PEG2000.
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Las figuras 1A-B exponen las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas por las muestras con los números 1a-8a. Las figuras 2A-B exponen las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas por las muestras con los números 1b-8b.
Como se observa claramente, las muestras con el 40 % al 62,5 % p/p de DPPC (Tm = 41 °C, un lípido de carga neutra), utilizado junto con DSPC (Tm = 55 °C) y DSPE-PEG-2000, proporcionaron mejores resultados, sobre la base de las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas.
De manera similar, las muestras con el 40 % al 62,5 % p/p de DPPG (Tm = 41 °C, un lípido cargado), utilizado junto con DSPC (Tm = 55 °C) y DSPE-PEG-2000, proporcionaron mejores resultados, sobre la base de las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas.
Los datos demuestran que las muestras de ejemplo con el 40 % al 62,5 % en proporción peso/peso del primer lípido (con o sin carga) que tiene una temperatura de transición más baja (Tm = 41 °C), junto con un segundo lípido DSPC (Tm más alta, de 55 °C) y el 12,5 % p/p de DSPE-PEG-2000, proporcionan altas concentraciones de microburbujas de tamaño medio pequeño.
Ejemplo 3. Evaluación de la estabilidad de las microburbujas formadas a partir de las formulaciones de ejemplo
La estabilidad de las microburbujas formadas en cada vial se analizó a 37 °C (condición de aplicación en seres humanos). Las microburbujas se diluyeron 8.000 veces con solución salina y se colocaron en un simulador a 37 °C. La temperatura se mantuvo durante todo el ensayo. A continuación, se tomó la imagen de la solución de microburbujas resultante cada minuto en condiciones de obtención de imágenes ecográficas con contraste para registrar la intensidad de cada muestra mediante el modelo para ecografía clínica Philips CX-50. Para tratar las imágenes adquiridas, se usó el software Matlab, en donde la intensidad de contraste se calculó a partir del nivel de color de cada píxel y se presentó posteriormente en unidades arbitrarias (u. a.).
La figura 3 expone el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en cada una de las muestras 1a a 8a. Se calculó la intensidad de contraste de las imágenes ecográficas de cada muestra (1a-8a) y se acumuló a lo largo del tiempo para comparar el rendimiento ecográfico de las muestras.
El objetivo de la presente invención era proporcionar un agente de contraste robusto a base de burbujas para la obtención de imágenes ecográficas. Deben considerarse conjuntamente dos aspectos clave, es decir, la mejora del contraste en la obtención de imágenes ecográficas y la persistencia de las burbujas (semivida efectiva de las burbujas para la obtención de las imágenes). En la práctica clínica, lo que se busca es una buena mejora ecográfica con una persistencia prolongada. Por ejemplo, para el diagnóstico de una lesión hepática local se recomienda una semivida efectiva para la obtención de imágenes superior a 10 minutos. Por lo tanto, en la presente invención se usó el método de acumulación para describir el rendimiento ecográfico total de cada formulación en lugar de usar las intensidades de contraste iniciales.
En primer lugar, se cuantificó la intensidad de contraste de las imágenes ecográficas en cada muestra y luego se acumuló a lo largo del tiempo. Se acumuló la intensidad de contraste de cada minuto. El intervalo de tiempo se fijó en 50 minutos. Una burbuja con buena mejora del contraste y persistencia implicaría una mayor intensidad acumulativa en el último punto de tiempo, es decir, a los 50 minutos.
Las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 1a a 8a que se basan en el valor de la intensidad de contraste acumulada durante 50 minuto ción), se proporcionan en la figura 4A.
Tabla 5. Intensidad acumulativa de 1a a 8a.
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Al normalizar el valor de la intensidad acumulativa de 1a como el 100 %, se obtienen los resultados comparativos de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a a 8a que se exponen en la figura 4B.
Los resultados indican que las muestras 3a, 4a, 5a y 6a, que oscilan entre el 40 % y el 62,5 % de DPPC en peso en la mezcla de lípidos, presentan una diferencia y una mejora significativas con respecto a las muestras 1 a, 2a, 7a y 8a.
Los resultados de la prueba de estabilidad demuestran que el 40 % al 62,5 % p/p de DPPC (Tm = 41 °C, lípido neutro), utilizado junto con DSPC (Tm = 55 °C) y DSPE-PEG-2000, proporciona microburbujas estables útiles para la obtención de imágenes. Según este hallazgo, la temperatura de transición (Tm) de las microburbujas preparadas a partir de mezclas de los lípidos DPPC, DSPC y DSp E-PEG-2000 oscila entre 45 y 49,5 °C. Los resultados también indican que el 40 % al 60 % p/p de DPPC, utilizado junto con DSPC/DSPE-PeG-2000, proporciona microburbujas aún más estables, útiles para la obtención de imágenes. La temperatura de transición (Tm) de las microburbujas estabilizadas preferidas preparadas a partir de mezclas de los lípidos DPPC, DSPC y DSp E-PEG-2000 oscila entre 46,6 y 49,5 °C.
La figura 5 expone el cambio de intensidad de la imagen de las microburbujas con el tiempo en cada una de las muestras 1b a 8b. Se calculó la intensidad de contraste de las imágenes ecográficas de cada una de las muestras (1 b-8b) basadas en las formulaciones preparadas a partir de mezclas de los lípidos DPPG, DSPC y DSPE-PEG-2000 y se acumuló a lo largo del tiempo para comparar el rendimiento ecográfico de las muestras.
Las curvas de acumulación de intensidad con el tiempo de las muestras 1b a 8b, que se basan en el valor de la intensidad de contraste acumulada durante 50 minutos desde el comienzo del estudio (véase la tabla 6 a continuación), se proporcionan en la figura 6A.
Tabla 6. Intensidad acumulativa de las muestras 1b a 8b.
Figure imgf000009_0002
Al normalizar el valor de la intensidad acumulativa de 1b como el 100 %, se obtienen los resultados de la intensidad acumulativa relativa de cada una de las muestras 1b a 8b que proporciona la figura 6B.
Los resultados indican que las muestras 3b, 4b, 5b y 6b, que oscilan entre el 40 % y el 62,5 % de DPPG en peso, presentan una diferencia y una mejora significativas con respecto a las muestras 1b, 2b, 7b y 8b.
De manera similar, los resultados de la prueba de estabilidad demuestran que el 40 % al 62,5 % p/p de DPPG (Tm = 41 °C, lípido cargado), utilizado junto con DSPC (Tm = 55 °C) y DSPE-PEG-2000, proporciona microburbujas estables útiles para la obtención de imágenes. Según este hallazgo la temperatura de transición (Tm) de las microburbujas preparadas a partir de las mezclas de los lípidos DPPG, DSPC y DSPE-PEG2000 oscila entre 45 y 49,5 °C. En algunas realizaciones, el 62,5 % p/p de DPPG, utilizado junto con DSPG y DSPE-PEG2000, proporciona microburbujas aún más estables, útiles para la obtención de imágenes.
En resumen, los datos demuestran que el 40 % al 62,5 % en proporción p/p del lípido de baja Tm, con o sin carga (por ejemplo, DPPC y DPPG, Tm = 41 °C) junto con un lípido de mayor Tm como DSPC (Tm = 55 °C) y aproximadamente el 12,5 % p/p de DSPE-PEG2000 proporcionan microburbujas con muy buen perfil de estabilidad en las condiciones de aplicación en seres humanos (por ejemplo, a 37 °C).
Ejemplo 4. Evaluación de la estabilidad de las microburbujas formadas por las formulaciones que contienen DSPE pegilada
La estabilidad de las microburbujas formadas en cada vial se analizó a 37 °C (condición de aplicación en seres humanos) como se describe en el ejemplo 3. En este caso, el estudio tiene como objetivo determinar si una DSPE PEGilada similar, como DSPE-PEG3000 o DSPE-PEG5000, utilizada en la mezcla de lípidos puede proporcionar resultados inesperados similares. En el estudio se utilizó DSPE-PEG5000 como ejemplo.
Las mezclas de lípidos se prepararon según las composiciones que se exponen en las tablas 7 y 8.
Tabla 7. Composiciones de muestras de mezclas de lípidos que constan de un primer lípido DPPC, un segundo lípido DSPC y DSPE-PEG2000 o DSPEPEG5000.
Figure imgf000010_0001
Tabla 8. Composiciones de muestras de mezclas de lípidos que constan de un primer lípido DPPG, un segundo lípido DSPC y DSPE-PEG-2000 o DSPE-PEG5000.
Figure imgf000010_0002
Las microburbujas formadas en cada vial se evaluaron mediante Multisizer para determinar su tamaño medio y concentración. Los resultados se muestran en las tablas 9 y 10.
Tabla 9. Tamaño medio y concentración de las microburbujas de las muestras 3a, 6a, 3c y 6c.
Figure imgf000010_0003
Tabla 10. Tamaño medio y concentración de las microburbujas de las muestras 3b, 6b, 3d y 6d.
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Como se expone en la tabla 9, las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas a partir de las muestras 3a y 3c son muy similares y comparables; las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas a partir de las muestras 6a y 6c también son muy similares y comparables. Especialmente, como se expone en la figura 7A, donde se comparan las concentraciones de microburbujas de 1a, 3a, 6a, 3c y 6c, el grupo de 3a, 6a, 3c y 6c presenta una concentración superior a la de 1 a.
Como se expone en la Tabla 10, las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas a partir de las muestras 3b y 3d son muy similares y comparables; las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas a partir de las muestras 6b y 6d también son muy similares y comparables. Especialmente, como se expone en la figura 7B, donde se comparan las concentraciones de microburbujas de 1a, 3b, 6b, 3d y 6d, el grupo de 3b, 6b, 3d y 6d presenta una concentración superior a la de 1 a.
A continuación, se tomó la imagen de la solución de microburbujas resultante de 1 a, 3a, 6a, 3c y 6c, respectivamente, cada minuto en condiciones de obtención de imágenes ecográficas con contraste para registrar la intensidad de cada muestra. Los resultados se exponen en la figura 8A. Los resultados similares para 1 a, 3b, 6b, 3d y 6d, respectivamente, se exponen en la figura 8B.
Se calculó la intensidad de contraste de las imágenes ecográficas de las muestras 3a, 6a, 3b, 6b, 3c, 6c, 3d y 6d, respectivamente, y se acumuló a lo largo del tiempo para comparar el rendimiento ecográfico de cada muestra. La curva de acumulación de intensidad con el tiempo de cada muestra, que se basa en el valor de la intensidad de contraste acumulada durante 50 minutos desde el comienzo del estudio (véanse las tablas 11 y 12 a continuación), se proporciona en las figuras 8C y 8D.
Tabla 11. Intensidad acumulativa de las muestras 3a, 6a, 3c y 6c, con DSPE-PEG2000 o DSPE-PEG5000 en la mezcla de lípidos.
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Tabla 12. Intensidad acumulativa de las muestras 3b, 6b, 3d y 6d, con DSPE-PEG2000 o DSPE-PEG5000 en la mezcla de lípidos.
Figure imgf000011_0003
Al normalizar el valor de la intensidad acumulativa de 1a como el 100 %, se obtienen los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1 a, 3a, 6a, 3c y 6c que se exponen en la figura 8E, donde el grupo de 3a, 3c, 6a y 6c proporciona una intensidad acumulativa relativa superior en comparación con la de 1a. Los resultados demuestran que las muestras 3a y 6a (DPPC con DSPE-PEG2000) no presentan una diferencia significativa con las muestras 3c y 6c (DPPC con DSPE-PEG5000) en cuanto a que proporcionan un perfil de alta estabilidad similar.
Al normalizar el valor de la intensidad acumulativa de 1a como el 100 %, se obtienen los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a, 3b, 6a, 3d y 6d que se exponen en la figura 8F, donde las muestras 3b, 6a, 3d y 6d proporcionan una intensidad acumulativa relativa superior en comparación con la de 1a. Los resultados demuestran que las muestras 3b y 6b (DPPG con D on las muestras 3d y 6d (DPPG con DSPE-PEG5000) en cuanto a que proporcionan un perfil de alta estabilidad similar.
Por lo tanto, está claro que el beneficio inesperado del uso de DSPE-PEG2000 puede extenderse a los componentes similares DSPE-PEG3000 y DSPE-5000.
Ejemplo 5. Comparación de la estabilidad de las microburbujas entre formulaciones que contienen DSPC o DSPG
La estabilidad de las microburbujas formadas en cada vial se analizó a 37 °C, (condición de aplicación en seres humanos) como se describe en el ejemplo 3. En este caso, se usó un segundo fosfolípido DSPG con la misma Tm en la mezcla de lípidos para preparar las microburbujas por el mismo proceso de elaboración en condiciones similares. La prueba es para evaluar si los resultados inesperados expuestos en los ejemplos 1-4 pueden extenderse a un segundo fosfolípido diferente con la misma o similar Tm.
Las mezclas de lípidos se prepararon según las composiciones que se exponen en la tabla 13, donde se utilizó DPPC como primer lípido junto con DSPE-PEG2000.
Tabla 13. Composiciones de muestras de mezclas de lípidos que constan de un primer lípido DPPC, un segundo lípido DSPC o DSPG y DSPE-PEG-2000.
Figure imgf000012_0001
Las microburbujas formadas en cada vial se evaluaron mediante Multisizer para determinar su tamaño medio y concentración. Los resultados se muestran en la tabla 14.
Tabla 14. Tamaño medio y concentración de las microburbujas de las muestras 3a, 6a, 3e y 6e.
Figure imgf000012_0002
Como se expone en la tabla 14, las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas a partir de las muestras 3a y 3e son muy similares y comparables; las concentraciones y el tamaño medio de las microburbujas formadas a partir de las muestras 6a y 6e son también muy similares y también. Especialmente, como se expone en la figura 9A, donde se comparan las concentraciones de microburbujas de las muestras 1a, 3a, 6a, 3e y 6e, el grupo de las muestras 3a, 6a, 3e y 6e presenta una concentración superior a la de 1a.
A continuación, se tomó la imagen de la solución de microburbujas resultante de 3a, 6a, 3e y 6e, respectivamente, cada minuto en condiciones de obtención de imágenes ecográficas con contraste para registrar la intensidad de cada muestra. Los resultados se exponen en la figura 9B.
Se calculó la intensidad de contraste de las imágenes ecográficas de las muestras 3a, 6a, 3e y 6e, respectivamente, y se acumuló a lo largo del tiempo para comparar el rendimiento ecográfico de cada muestra. La curva de acumulación de intensidad con el tiempo de cada muestra, que se basa al valor de la intensidad de contraste acumulada durante 50 minutos desde el inicio del estudio (véase la tabla 15), se proporciona en la figura 9C.
Tabla 15. Intensidad acumulativa de las muestras 3a, 6a, 3e y 6e con DSPC o DSPG en la mezcla de lípidos
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Al normalizar el valor de la intensidad acumulativa de 1a como el 100 %, se obtienen los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1 a, 3a, 6a, 3e y 6e que se exponen en la figura 9D, donde el grupo de 3a, 3e, 6a y 6e proporciona una intensidad acumulativa relativa superior en comparación con la de 1a. Los resultados demuestran que el grupo de las muestras 3a y 6a (con DSPC) no presenta diferencia significativa con el grupo de las muestras 3e y 6e (con DSPG).
Por lo tanto, está claro que el beneficio inesperado del uso de DSPC puede extenderse al componente similar DSPG.
Ejemplo 6. Prueba de estabilidad de las formulaciones de la invención en comparación con la formulación conocida con un lípido pegilado diferente
Las formulaciones de ejemplo (por ejemplo, las muestras 6a y 6e) se sometieron además a una prueba de estabilidad en comparación con las formulaciones conocidas descritas en la publicación de los EE. UU. n.° 2014328767. Las formulaciones seleccionadas y la formulación de ejemplo de la invención tienen una Tm total de las mezclas de lípidos de 45 °C. El método de preparación de cada muestra analizada fue el mismo en las condiciones que se exponen en el ejemplo 1. La composición de cada muestra se expone en la tabla 16.
Tabla 16. Composiciones de muestras de mezclas de lípidos que constan de un primer lípido DPPC, un segundo lípido DSPC o DSPG y DSPE-PEG-2000 o PEG40S
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Las microburbujas formadas en cada muestra se evaluaron mediante Multisizer para determinar su tamaño medio y concentración. Los resultados se muestran en la tabla 17. La figura 10A expone las concentraciones de las microburbujas formadas a partir de las muestras 1 a, 6a, 6e y PEG40S_2 y PEG40S_3.
Tabla 17. Estudio de la estabilidad de las microburbujas de ejemplo preparadas a partir de las muestras 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3.
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Como se expone en la Tabla 17, las microburbujas formadas a partir de las muestras 6a y 6e, donde se utilizó DSPE-PEG-2000, proporcionan una alta concentración inesperada mucho mejor que la de las muestras PEG40S_2 y PEG40S_3.
Se observa claramente que las muestras 6a y 6e tienen una concentración más alta que PEG40S_2 y PEG40S_3, mientras que el tamaño medio en estas muestras está en un intervalo similar de 1,2 a 1,5 μm. A pesar de que todas tienen una Tm total de 45 °C, las formulaciones de ejemplo de la invención (por ejemplo, las muestras 6a y 6e) proporcionan una concentración de 2 a 3 veces mayor. Es inesperado ver que un lípido PEGilado diferente (es decir, DSPE-PEG2000) en una cantidad similar desempeña un papel muy importante en la creación de más microburbujas.
Estas muestras también se sometieron a la misma evaluación de la estabilidad que se expone en el ejemplo 3. La imagen de la solución de microburbujas resultante de las muestras 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3, respectivamente, se tomó cada minuto en condiciones de obtención de imágenes ecográficas con contraste para registrar la intensidad de cada muestra. Los resultados se exponen en la figura 10B.
Se calculó la intensidad de contraste de las imágenes ecográficas de las muestras 6a 6e PEG40S 2 y PEG40S_3, respectivamente, y se acumuló a lo largo del tiemp a. La curva de acumulación de intensidad con el tiempo de cada muestra, que se basa en el valor de la intensidad de contraste acumulada durante 50 minutos desde el comienzo del estudio (véase la tabla 18 a continuación), se proporciona en la figura 10C.
Tabla 18. Intensidad acumulativa de las muestras 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3.
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Al normalizar el valor de la intensidad acumulativa de 1a como el 100 %, se obtienen los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1 a, 6a, 6e, PEG40S_2 y PEG40S_3 que se exponen en la figura 10D.
Se observa claramente que las muestras 6a y 6e tienen mejor perfil de estabilidad que las muestras PEG40S_2 y PEG40S_3. Las formulaciones particulares de la invención proporcionan un perfil de estabilidad único e inesperado en comparación con las formulaciones conocidas, a pesar de que todas tienen una Tm total de 45 °C. Este inesperado y excelente perfil de estabilidad con alta concentración y excelente estabilidad de las microburbujas de la invención descritas en este documento permite numerosas aplicaciones en seres humanos.
Ejemplo 7. Estudio de comparación directa de los primeros lípidos de baja Tm
Para investigar más a fondo los potenciales lípidos adecuados para formar microburbujas con un alto perfil de estabilidad, se utilizó un lípido con un valor de Tm más bajo, es decir, 15:0 PC (1,2-dipentadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina, Tm = 35 °C) en la mezcla de lípidos para preparar las microburbujas, en comparación con las muestras con un primer lípido con una Tm de 41 °C. 15:0 PC es un fosfolípido sintético que tiene una estructura química similar a la de DPPC y DPPG (Tm = 41 °C) con una cadena carbonada más corta de 15 carbonos en lugar de los 16 carbonos de DPPC o DPPG.
Las mezclas de lípidos se prepararon según las composiciones que se exponen en la tabla 19, con un primer lípido DPPC o 15:0 PC, un segundo lípido DSPC y DSPE-PEG2000.
Tabla 19. Composiciones de las muestras 3a, 5a, 3f y 5f.
Figure imgf000014_0002
Las microburbujas formadas en cada vial se evaluaron mediante Multisizer para determinar su tamaño medio y concentración. Los resultados se exponen en la tabla 20.
Tabla 20. Tamaño medio y concentración de las microburbujas de las muestras 3a, 5a, 3f y 5f.
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Como se expone en la tabla 20, las concentraciones de las muestras 3f y 5f presentaron una diferencia significativa con respecto a las de 3a y 3b. Especialmente, como se expone en la figura 11A, donde se comparan las concentraciones de microburbujas de 1 a, 3a, 5a, 3f y 5f el grupo de 3a y 5a presenta una concentración superior a la de 3f y 5f, que es incluso menor que la de 1a. Las ba PC, es decir, 3f y 5f, no se activan satisfactoriamente en estas condiciones. El resultado también sugiere que las formulaciones de 3f y 5f no son adecuadas para generar burbujas con un perfil de alta estabilidad. Todas las formulaciones en esta prueba se sometieron además a exámenes de imágenes ecográficas.
Se tomaron imágenes de la solución de microburbujas resultante de las muestras 3a, 5a, 3f y 5f, respectivamente, cada minuto en condiciones de obtención de imágenes ecográficas con contraste para registrar la intensidad de cada muestra. Los resultados se exponen en la figura 11B.
Se calculó la intensidad de contraste de las imágenes ecográficas de las muestras 3a, 5a, 3f y 5f, respectivamente, y se acumuló a lo largo del tiempo para comparar el rendimiento ecográfico de cada muestra. La curva de acumulación de intensidad con el tiempo de cada muestra, que se basa en el valor de la intensidad de contraste acumulada durante 50 minutos desde el inicio del estudio (véase la tablas 21), se proporciona en la figura 10C.
Tabla 21. Intensidad acumulativa de las muestras 3a, 5a, 3f y 5f.
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Al normalizar el valor de la intensidad acumulativa de 1a como el 100 %, se obtienen los resultados de la intensidad acumulativa relativa de las muestras 1a, 3a, 5a, 3f y 5f que se exponen en la figura 11D. Las muestras 3f y 5f se comparan directamente con las muestras 3a y 5a una al lado de la otra. Los resultados demuestran que las muestras con un primer lípido con una temperatura de transición de aproximadamente 41 °C presentan un aumento de 2,44 a 11,62 veces en comparación con las muestras que usan 15:0 PC, con una Tm de 35 °C. Los resultados confirman además el beneficio inesperado de que un primer lípido con una temperatura de transición de aproximadamente 41 °C (por ejemplo, DPPC y DPPG) forma microburbujas lipídicas estables de larga duración. Aunque un primer lípido con una Tm inferior puede disminuir la Tm de la mezcla lipídica, no proporciona un resultado mejor.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una suspensión de microburbujas llenas de gas en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable, en donde dichas microburbujas comprenden (a) una mezcla de lípidos que consta de un primer lípido con una temperatura de transición de 41 °C, un segundo lípido con una temperatura de transición de 55 °C y una 1,2-diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) PEGilada, y (b) un gas biocompatible en donde dicho gas se selecciona del grupo que consta de perfluorocarburos, SF6, Ar y N2, en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 40 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos y en donde la cantidad de DSPE PEGilada es del 10 % al 15 % en peso en la mezcla de lípidos.
2. La suspensión de la reivindicación 1, en donde dicho primer lípido es 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) o 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (DPPG).
3. La suspensión de la reivindicación 1, en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 50 % al 63 % en peso en la mezcla de lípidos.
4. La suspensión de la reivindicación 1, en donde la cantidad de dicho primer lípido está en el intervalo del 40 % al 60 % en peso en la mezcla de lípidos.
5. La suspensión de la reivindicación 1, en donde dicho segundo lípido es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) o 1,2-dioctadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (DSPG).
6. La suspensión de la reivindicación 1, en donde dicha DSPE PEGilada es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi(polietilenglicol)-3000] (DSPE-PEG3000) o 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi (polietilenglicol)-5000] (DSPE -PEG5000).
7. La suspensión de la reivindicación 1, en donde dicho vehículo líquido es una solución acuosa de glicerol.
8. Un vial sellado que comprende una suspensión de microburbujas llenas de gas de la reivindicación 1.
9. El vial sellado de la reivindicación 8, en donde dicho primer lípido es 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) o 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (DPPG).
10. El vial sellado de la reivindicación 8, en donde dicho segundo lípido es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) o 1,2-dioctadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (DSPG).
11. El vial sellado de la reivindicación 8, en donde dicha DSPE PEGilada es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi(polietilenglicol)-3000] (DSPE-PEG3000) o 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-W-[metoxi (polietilenglicol)-5000] (DSPE-PEG5000).
12. El vial sellado de la reivindicación 8, en donde dicho vehículo líquido es una solución acuosa de glicerol.
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