ES2238724T3 - Microesferas proteicas resistentes a la presion como agentes para ecografias. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS CLASICOS DE IMAGENES POR ULTRASONIDOS QUE INCLUYEN EL USO DE SUSPENSION ACUOSA DE MICROESFERAS. ESTAS MICROESFERAS SE CARACTERIZAN ADEMAS PORQUE CONSISTEN EN NUCLEOS DE GAS ENCAPSULADOS POR UNA ENVUELTA DE PROTEINA, QUE SE FORMAN EN PRESENCIA DE VAPORES DE PERFLUORALCANOS. LA PRESENCIA DEL VAPOR DURANTE LA FORMACION CAMBIA LAS CARACTERISTICAS DE LA ENVOLTURA Y, DE ESE MODO, PROTEGE AL GAS, IMPIDIENDO SU SOLUBILIZACION EN EL ENTORNO ACUOSO CIRCUNDANTE. ADEMAS, LA PRESENCIA DEL VAPOR DE PERFLUORALCANO DURANTE LA FORMACION PODRIA PROPORCIONAR TAMBIEN MEJORES PROPIEDADES ECOGENICAS PARA APLICACIONES DE OBTENCION DE IMAGENES VASCULARES.

Description

Microesferas proteicas resistentes a la presión como agentes para ecografías.

Campo técnico

La invención se refiere al campo de los procedimientos para realizar ecografías convencionales en escala de grises. En particular, tiene que ver con el uso de agentes de ecografía que comprenden microesferas que contienen núcleos de gas encapsulado por una cubierta de una proteína biocompatible. Las microesferas se hacen resistentes a la presión y eficaces incluyendo un perfluoroalcano durante la formación de las microesferas. Estas microesferas son particularmente apropiadas como agentes de ecografías para perfundir tejidos y órganos, como el miocardio, para mejorar la visualización de una imagen en escala de grises.

Antecedentes

La ecografía convencional se basa en el principio de que la energía de las ondas sónicas puede concentrarse sobre un área de interés y reflejarse de tal modo que se produzca una imagen de ella. El ecoescáner utilizado se coloca sobre una superficie corporal suprayacente al área que hay que representar en una imagen y las ondas sónicas se dirigen hacia esa área. El escáner detecta las ondas sónicas reflejadas y traduce los datos en imágenes de vídeo. Cuando la energía ultrasónica se transmite a través de una sustancia, la cantidad de energía reflejada depende de la velocidad de la transmisión y las propiedades acústicas de la sustancia. Cambios en las propiedades acústicas de la sustancia (por ejemplo, variaciones en la impedancia acústica) son más prominentes en las interfaces de densidades acústicas diferentes, como líquido-sólido o líquido-gas. Por consiguiente, cuando la energía ultrasónica se dirige a través del tejido, las estructuras orgánicas generan señales de reflexión sónica para la detección por el ecoescáner. Estas señales pueden intensificarse mediante el uso adecuado de un agente de contraste.

Ophir y Parker, Ultrasound in Medicine and Biology 15(4):319-333 (1989), describen varios tipos de agentes de contraste ecográfico que contienen gas. Una clase principal de agentes de contraste ecográfico que contienen gas descrita por Ophir y Parker son las microburbujas o microesferas de gas encapsulado. La burbuja de gas está rodeada por una cubierta compuesta de una proteína u otro material biocompatible. Un agente de contraste de microesfera comercializado actual es ALBUNEX® (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA) que está compuesto de microesferas de aire encapsulado de seroalbúmina humana. Véanse las patentes de EE.UU. núm. 4,572,203 y 4,844,882. Sin embargo, se ha demostrado que las microesferas de aire pierden rápidamente la ecogenicidad cuando se someten a presiones de 150 mm Hg, como se encontraría durante la inyección y la circulación in vivo (deJong, N. y col., Ultrasound Med. Biol. 19:279-288, 1993).

En un esfuerzo para resolver el problema de presión-inestabilidad, enseñanzas recientes se han centrado en mejorar la cubierta, porque se cree que las cubiertas o "membranas" de las microesferas son demasiado frágiles o quebradizas bajo presión, lo que resulta en un rápido colapso in vivo. Giddey (documento PCT WO 92105806) dijo: "debido a su rigidez, las membranas no pueden soportar las variaciones súbitas de presión a las que pueden ser sometidas las microesferas, por ejemplo, durante el desplazamiento a través del flujo sanguíneo, si estas variaciones de la presión se deben a la pulsación cardíaca". Para vencer la rigidez de la cubierta, propuso preemulsionar el aire en una disolución proteica que contenga un elevado porcentaje de un agente viscosificante (40%-80% de polioles) y someterlo a esfuerzo mecánico en un mezclador de alta velocidad. Las burbujas del tamaño apropiado se recogen y se cubren con un agente tensioactivo adecuado para estabilizarlas en una cubierta suave.

Holmes (documento PCT WO 92/17213) propuso mejorar la estabilidad in vivo de las microesferas proteicas reforzando la cubierta con reactivos reticulantes químicos biodegradables.

Bichon y col. (solicitud de patente europea 458,745A1) y Schneider y col. (Inv. Radiol. 27:134-159, 1992) describen la producción de "microglobos" poliméricos porosos (tamaño del poro de 5 a 2.000 nm). Afirman en la solicitud de patente europea que "la estructura microporosa de la cubierta del microglobo es un factor de resiliencia, es decir, las microesferas pueden aceptar fácilmente la variación de presión sin romperse".

Erbel y Zotz (patente de EE.UU. núm. 5,190,982) describen una microcápsula polimérica reticulada en la que el aire está atrapado.

Otros esfuerzos para mejorar la estabilidad de las microesferas se han concentrado en el gas del interior de la cubierta, y, en particular, se han centrado en la incorporación de gases insolubles. De acuerdo con la ley de Henry, la solubilidad de un gas concreto en disolución aumenta conforme aumenta la presión. Cuando una burbuja de gas en disolución se somete a presión, la solubilidad del gas de la disolución circundante aumentará en proporción con la cantidad de presión. Si la burbuja de gas está rodeada por una cubierta, es decir, en forma de microesfera, todavía se observan los efectos de la solubilidad del gas, ya que las cubiertas de las microesferas no eliminan por completo el contacto entre el gas de la microesfera y la disolución circundante. Por tanto, cuando las microesferas suspendidas en disolución se someten a presión, el gas del interior de las microesferas acaba solubilizándose en la disolución circundante, lo que resulta en el colapso de las microesferas. Cuanto más insoluble sea el gas en la disolución circundante, más resistentes serán las microesferas a solubilizarse por completo en el sistema sanguíneo o los tejidos.

En el documento U.S. 5,413,774 se indica que la resistencia a la presión de las microesferas puede mejorarse teniendo al menos una porción del gas que está encapsulado que sea un gas que tiene un S_{gas} \sqrt{MW_{gas}} \leq 0,0031, donde S_{gas} es la hidrosolubilidad del gas en litros/litro y MW_{gas} es el peso molecular medio del gas en dáltons. Incluidos en los gases sugeridos por esta patente están los perfluoroalcanos relativamente insolubles CF_{4}, C_{2}F_{6} y C_{4}F_{10}.

En la solicitud de la PCT WO 95/01187 se describen microesferas de gas encapsulado por una proteína filmogénica insolubilizada por el calor en la que el gas encapsulado es un gas completamente insoluble en agua. Entre los gases mencionados específicamente están los perfluoroalcanos CF_{4}, C_{2}F_{6}, C_{3}F_{8} y C_{4}F_{10}. Estas microesferas se preparan sometiendo una mezcla de una disolución acuosa de la proteína y el gas insoluble a cavitación ecográfica o mecánica en ausencia de oxígeno sonicando o moliendo la mezcla en un sonicador/molino que está cerrado a la atmósfera.

Se han descrito varios otros ejemplos de microesferas que contienen gas insoluble que contienen perfluoroalcanos con un punto de ebullición elevado, como el perfluoropentano, como material núcleo. En el documento PCT WO 95/23615 se describen microesferas que se preparan mezclando perfluoropentano líquido con el material que forma la cubierta y convirtiéndolo ulteriormente en un gas. En el documento PCT WO 96/04018 se describen microesferas con cubiertas que contienen flúor y que encapsulan gases insolubles, como el perfluoropentano. Porter y col. (Journal of Amer. College of Cardiology, Abstract núm. 955-57, febrero, 1995) describen microesferas de albúmina-dextrosa hechas con perfluoropentano evaporado.

En otra bibliografía de patentes se describen agentes de contraste ecográfico de tipo no microesférico que incluyen perfluoroalcanos con un punto de ebullición elevado. En la patente de EE.UU. núm. 5,393,524 se describen microburbujas de gas libre de varios gases que exhiben un aumento de la resistencia a la presión con respecto a las microburbujas de aire libre. El perfluoropentano está entre los numerosos gases mencionados en la Tabla IV de esa solicitud. En el documento PCT WO 94/16739 se describen agentes de contraste ecográfico que son emulsiones líquido-líquido en las que el líquido dispersado tiene un punto de ebullición por debajo de la temperatura fisiológica. Cuando se administra la emulsión, el líquido dispersado hierve. El perfluoropentano está incluido en la lista de compuestos que pueden utilizarse como líquido dispersado.

La discusión anterior está relacionada con los diversos agentes de contraste que son útiles para la ecografía convencional que implica la formación de imágenes a partir de la cantidad de señal ultrasónica reflejada. Recientemente, se ha descrito una técnica diferente para generar una ecografía que implica detectar cambios en la frecuencia armónica de la señal ultrasónica reflejada debido a la resonancia del agente de ecografía. Esta técnica, que se denomina "ecografía armónica", es descrita por Uhlendorf, y col. (patente de EE.UU núm. 5,410,561). Puesto que los objetos relativamente sólidos resuenan menos tras la aplicación de energía ultrasónica, las microburbujas libres son mejores en la ecografía armónica que las microesferas encapsuladas. En el documento PCT WO 96/09793 se describen las microburbujas libres, estabilizadas por agentes tensioactivos, que contienen material gaseoso diverso que experimentan cambios de volumen tras la aplicación de energía ultrasónica, lo que resulta en una mejor ecografía armónica.

Aunque la ecografía armónica puede proporcionar algunas mejoras sobre la ecografía convencional para ciertas aplicaciones, todavía se prefiere la ecografía convencional por razones prácticas, ya que los aparatos capaces de realizar ecografías armónicas no están ampliamente disponibles. Por consiguiente, es un objeto de esta invención proporcionar un procedimiento de ecografía que utilice microesferas que están especialmente adaptadas y son útiles para la ecografía convencional de tejidos u órganos.

Las microesferas que son útiles en esta invención contienen un gas soluble, biocompatible, como el aire en una cubierta proteica que se forman en presencia de un vapor calentado de perfluoroalcano. El perfluoroalcano interactúa con la proteína durante la formación para hacer la cubierta de la microesfera más impermeable al ambiente acuoso y también se cree que representa un papel importante en la formación de la cubierta, lo que resulta en una mejora de la eficacia de la ecografía. Incluyendo el vapor calentado de perfluoroalcano durante la formación de microesferas, un gas relativamente soluble, como el aire, es inesperadamente protegido de la solubilización en el ambiente acuoso circundante. Por consiguiente, las microesferas de esta invención exhiben resistencia a la presión más allá de lo esperado para la microesfera equivalente hecha en ausencia del perfluoroalcano. El resultado es un producto in vivo de vida extremadamente larga capaz de ecogenicidad sostenida utilizando procedimientos ecográficos convencionales.

Descripción de la invención

Esta invención proporciona el uso de una suspensión de microesferas en la fabricación de un agente de contraste para el uso en un procedimiento de ecografía convencional. Las microesferas se preparan utilizando un gas como material nuclear que es encapsulado por una cubierta de proteína insolubilizada por calor formada en presencia de un vapor calentado de perfluoroalcano. El gas es soluble. El vapor se proporciona preferiblemente a una temperatura por encima de su punto de ebullición, próxima a la temperatura de desnaturalización de la proteína, lo que facilita la formación de las cubiertas de las microesferas y resulta en una mejora de la eficacia de la ecografía. Se empieza la ecografía de un sujeto y luego se administra la suspensión de microesferas al sujeto. La suspensión de microesferas puede administrarse como un bolo o puede administrarse de manera continua durante un periodo de tiempo. También se contempla que la suspensión de microesferas pueda envasarse en jeringas precargadas que están preparadas para el uso.

La ecografía se continúa mientras las microesferas llegan al lugar de los tejidos u órganos que se examinan. En general, la ecografía se continúa hasta que la intensidad de la imagen del tejido u órgano que se examina ha vuelto a la intensidad previa a la administración. Las ecografías se generan a partir de la energía ultrasónica reflejada.

El método de ecografía puede utilizarse para estudiar la perfusión vascular de tejidos y órganos, que proporciona una evaluación del flujo sanguíneo a través de los tejidos u órganos. El procedimiento es particularmente útil para estudiar la perfusión miocardíaca. La ecografía miocardíaca implica la ecografía del miocardio antes de la administración de la suspensión de microesferas, la administración de la suspensión de microesferas y la continuación de la ecografía a medida que las microesferas entran en las cavidades ventriculares izquierdas, perfunden el tejido miocardíaco, salen de la cavidad ventricular y por último salen del tejido miocardíaco.

El método de ecografía puede realizarse utilizando equipo ecográfico bidimensional o multidimensional (por ejemplo, tridimensional) convencional. Además, el procedimiento puede realizarse con ultrasonido aplicado de manera continua o pulsada.

Preferiblemente, la suspensión de microesferas contendrá microesferas en el intervalo de 1 \times 10^{7} a 1 \times 10^{10} por mL de suspensión. Además, las microesferas tendrán preferiblemente un diámetro medio en el intervalo de 0,1 y 10 micrómetros, más preferiblemente de 1 a 6 micrómetros, y más preferiblemente de 2 a 5 micrómetros.

El núcleo de la microesfera puede consistir en cualquier gas que sea biocompatible y soluble. Se prefieren gases como el aire. El valor de perfluoroalcano puede ser la forma vaporosa de un perfluoroalcano lineal, ramificado o cíclico, con preferencia por los perfluoroalcanos lienales como el perfluoropentano, el perfluorohexano y el perfluoroheptano. La cantidad de vapor de perfluoroalcano liberada en el proceso de formación de microesferas está relacionada con su peso molecular, requiriéndose menos vapor de perfluoroalcano a medida que aumenta el peso molecular. Sin embargo, la fase gaseosa (el gas y el vapor de perfluoroalcano) deben consistir en al menos 50% de gas para evitar producir microesferas negativamente flotantes menos eficaces.

La proteína que forma la cubierta es insolubilizable por calor. Preferiblemente, la proteína que forma la cubierta es albúmina, y más preferiblemente es seroalbúmina humana. Además, la cubierta puede modificarse para incluir porciones que hacen las microesferas menos inmunogénicas y/o histoespecíficas u organoespecíficas.

Otro aspecto de esta invención es un procedimiento para preparar microesferas que sean útiles en la ecografía convencional, lo que implica mezclar una fase gaseosa que consiste en un gas y un vapor calentado de perfluoroalcano con una disolución de proteína insolubilizable por calor bajo condiciones que cavitan la mezcla e insolubilizan por calor la proteína para formar microesferas, seguida por el enfriamiento de las microesferas para condensar al menos una porción del perfluoroalcano en la cubierta. Este paso hace que el perfluoroalcano se asocie con la superficie y/o la estructura interna de la cubierta para crear una barrera hidrófoba. Además, las propiedades acústicas de la cubierta se alteran en el proceso, haciendo una microesfera más eficaz.

Las microesferas pueden formarse por cavitación utilizando energía ultrasónica o fuerzas mecánicas como las producidas en un molino coloidal.

Un aspecto adicional de la invención son las composiciones que son útiles para la ecografía convencional que consisten en microesferas que tienen núcleos de gas encapsulado por proteína insolubilizada por calor que se forman en presencia de vapores calentados de perfluoroalcano. Las microesferas exhiben mejor resistencia a la presión, como resistencia a una presión de 68,95 kPa (10 psi). Otras características de las composiciones de las microesferas de esta invención se describen en la discusión anterior.

Breve descripción de las figuras

En la Figura 1 se ilustra el cambio en la densidad óptica a 600 nm tras la aplicación de 68,95 kPa (10 psi) de presión de una suspensión de microesferas con 100% de aire como la fase gaseosa.

En la Figura 2 se ilustra el cambio en la densidad óptica a 600 nm tras la aplicación de 68,95 kPa (10 psi) de presión de una suspensión de microesferas con 100% de perfluoropropano como la fase gaseosa.

En la Figura 3 se ilustra el cambio en la densidad óptica a 600 nm tras la aplicación de 68,95 kPa (10 psi) de presión de una suspensión de microesferas con 50% de aire y 50% de perfluoropano como la fase gaseosa.

En la Figura 4 se ilustra el cambio en la densidad óptica a 600 nm tras la aplicación de 68,95 kPa (10 psi) de presión de una suspensión de microesferas de albúmina con 50% de aire y 50% de vapor de perfluoropentano como la fase gaseosa.

En la Figura 5 se ilustra el cambio en la densidad óptica a 600 nm tras la aplicación de 68,95 kPa (10 psi) de presión de una suspensión de microesferas de albúmina con 66,6% de aire y 33,3% de vapor de perfluoropentano como la fase gaseosa.

En la Figura 6 se ilustra el cambio en la densidad óptica a 600 nm tras la aplicación de 68,95 kPa (10 psi) de presión de una suspensión de microesferas de albúmina preparadas con cantidades variables de aire y vapor de perfluoropentano como la fase gaseosa.

Modos de realizar la invención

Las microesferas que son útiles en la ecografía consisten en núcleos de gas encapsulado por proteína insolubilizada por calor, y se forman en presencia de vapores calentados de perfluoroalcano. Tienen un tamaño adecuado para el paso transpulmonar, con un diámetro nominal medio según las mediciones con un contador/medidor de partículas Multisizer II de Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL) en el intervalo de 0,1 a 10 micrómetros, preferiblemente de 2 a 6 micrómetros.

El exterior de la microesfera es definido por una cubierta proteica delgada. El material de la cubierta proteica incluye proteínas filmogénicas naturales, así como proteínas producidas por metodologías de ADN recombinante y polímeros aminoácidos sintéticos, que en este documento se denominan colectivamente "proteínas". La proteína debe ser capaz de formar una cubierta o película alrededor del material nuclear cuando la proteína es insolubilizada. Las proteínas naturales adecuadas incluyen albúmina, gammaglobulina (humana), apotransferrina (humana), J-lactoglobulina, ureasa y lisozima. Particularmente adecuada para esta invención es la albúmina y, más en particular, la albúmina humana.

Los materiales que forman la cubierta adecuados para uso en la formación de las microesferas, o las microesferas resultantes, pueden ser químicamente modificados con el propósito de dirigirse al órgano/tejido o suprimir la actividad inmunogénica (por ejemplo, modificación con anticuerpos o polietilenglicol).

Los gases adecuados para uso en la formación de las microesferas en esta invención son solubles y farmacológicamente aceptables, es decir, biocompatibles y mínimamente tóxicos para los seres humanos. El término "biocompatible" significa la capacidad del gas de ser metabolizado sin la formación de derivados tóxicos. El gas puede estar compuesto de un único compuesto o una mezcla de compuestos. Ejemplos de gases adecuados para uso en esta invención son aire, O_{2}, N_{2}, H_{2}, CO_{2} y N_{2}O; gases nobles como el argón, el helio y el xenón, y gases hidrocarbónicos como el metano, el etano, el propano, el n-butano, el isobutano y el pentano. El término "soluble" significa un gas que tiene una solubilidad de más de 0,01 ml de gas por ml de agua a 101,325 kPa (presión atmosférica) y una temperatura de 25ºC. Los gases insolubles son también adecuados para uso e incluyen sin límite perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano y perfluoroisobutano, así como mezclas de gases solubes y/o gases insolubles.

Las microesferas que son útiles en esta invención están además caracterizadas por formarse en presencia de un vapor calentado de perfluoroalcano. El término "perfluoroalcano" significa un hidrocarburo de cadena lineal o ramificado que está parcial o totalmente sustituido por flúor y puede contener opcionalmente otros sustituyentes, como O, OH, S, NO y similares. El perfluoroalcano tendrá preferiblemente un punto de ebullición relativamente elevado, es decir, por encima de los 20ºC a presión normal. Se prefieren el perfluoropropano, el perfluorohexano y el perfluoroheptano. El término "vapor" significa la fase gaseosa de un líquido formado elevando la temperatura del líquido por encima de su punto de ebullición. El vapor calentado de perfluoroalcano interactúa con la proteína que forma la cubierta durante la formación y el ulterior enfriamiento para hacer la cubierta resultante de la microesfera menos permeable al exterior acuoso. Eso ayuda a impedir el contacto entre el núcleo interno de gas y el ambiente acuoso circundante, que protege el gas de solubilizarse en el ambiente acuoso, en especial cuando el núcleo de gas comprende un gas soluble. Los efectos de la pérdida del núcleo de gas debida a la solubilización se observan como inestabilidad de la presión. Las microesferas de esta invención exhiben resistencia a la presión más allá de lo esperado para una microesfera equivalente que no se forma en presencia de un vapor calentado de perfluoroalcano. Otros hidrocarburos con propiedades similares a las descritas para los perfluoroalcanos (es decir, punto de ebullición, capacidad térmica, densidad de vapor y peso molecular) se incluyen también en esta invención.

Las microesferas se forman mezclando primero el gas y el vapor calentado de perfluoroalcano (en este documento denominado colectivamente la "fase gaseosa"). Luego esta mezcla se mantiene a una temperatura elevada, preferiblemente por encima del punto de ebullición del perfluoroalcano, y preferiblemente próxima a la temperatura de desnaturalización térmica de la proteína que forma la cubierta, hasta que es puesta en contacto con la disolución proteica en un aparato apropiado de formación de microesferas (normalmente una cámara de sonicación o un molino coloidal). De forma alternativa, el gas y el vapor calentado de perfluoroalcano pueden introducirse por separado. "Punto de ebullición" significa la temperatura a la que el perfluoroalcano pasa de la fase líquida a la fase vaporosa a una presión determinada. Cuando el perfluoroalcano se mantiene a presiones elevadas, este punto de ebullición será necesariamente más elevado de lo que sería a 1 atm. A menos que se indique de otro modo, el término "punto de ebullición" como se utiliza en este documento significa el punto de ebullición a 1 atm.

Las microesferas se forman por cavitación a una temperatura suficientemente elevada como para calentar suficientemente e insolubilizar la proteína que forma la cubierta para encapsular la fase gaseosa. Es también importante para la temperatura durante la formación de la microesfera estar por encima de la temperatura a la que el vapor de perfluoroalcano se condensaría. Después de que se formen las microesferas, el ulterior enfriamiento hasta por debajo del punto de ebullición del vapor de perfluoroalcano (29ºC para el perfluoropentano, 60ºC para el perfluorohexano y 80ºC para el perfluoroheptano) después de la formación de las microesferas condensa al menos una porción del vapor en el interior de la proteína de la cubierta para actuar como barrera hidrófoba. Esta barrera puede también incluir una capa monomolecular líquida de perfluoroalcano en la interfase gas-cubierta.

Además de formar una barrera hidrófoba, las moléculas de perfluoroalcano son en general grandes con respecto a las moléculas de gas, en particular las moléculas de los gases solubles de peso molecular bajo, y actúan para aislar más el núcleo del ambiente acuoso exterior ocupando el espacio en el interior de la cubierta y actuando como una barrera física a la difusión del gas.

Además, el vapor de un perfluoroalcano con un punto de ebullición elevado tiene también una elevada capacidad térmica con respecto a los gases menos densos, como el aire. Esta propiedad permite que el vapor transporte calor adicional hacia el proceso de cavitación, fomentando la desnaturalización térmica de la proteína circundante. Por consiguiente, se incorporan más moléculas de proteínas a la cubierta durante al proceso de formación de la cubierta debido al mayor grado de desnaturalización de la proteína local atribuible a la presencia del vapor calentado de perfluoroalcano. Estas cubiertas proteicas más gruesas o más densas resultan en propiedades superiores en términos de ecogenicidad y estabilidad in vivo, y además sirven también para restringir la exposición del núcleo de gas al medio circundante.

Además, se cree que la naturaleza hidrófoba del vapor de perfluoroalcano, así como el calor proporcionado por el mismo, permite también la formación de material de la cubierta con nuevas propiedades externas, dirigiendo la orientación de los grupos hidrófobos hacia dentro y la orientación de los grupos hidrófilos hacia fuera a medida que la cadena proteica experimenta desnaturalización térmica y formación de la cubierta. Eso crea microesferas proteicas con la propiedad inesperada y caracterizadora de interacción con las paredes de los vasos circulatorios del miocardio y otros órganos. Las microesferas proteicas llenas de gas preparadas en presencia del vapor calentado de los perfluoroalcanos con un punto de ebullición elevado persisten en el miocardio mucho después de lavar la cámara cardíaca cuando se prueba in vivo. Las microesferas proteicas preparadas sólo con gases no persisten en el tejido miocardíaco tras ser eliminadas del ventrículo izquierdo por el flujo cardíaco.

La introducción de demasiado aditivo de perfluoroalcano aumenta la densidad de las microesferas individuales, lo que resulta en partículas negativamente flotantes, que sedimentan en la suspensión en 1% de albúmina en varias horas. Estas partículas negativamente flotantes contienen una cantidad excesiva de perfluoroalcano líquido. La presencia de demasiado perfluoroalcano líquido puede resultar en microesferas de tamaño inestable, indeterminado e irregular. Estas preparaciones negativamente flotantes de microesferas no cruzan eficientemente los pulmones que filtran las partículas por encima de 10 \mum de diámetro. El material que no puede cruzar los pulmones es ineficaz como agente de contraste ecográfico intravenoso. Por consiguiente, la cantidad de vapor de perfluoroalcano utilizada en el proceso debe ser suficiente para mejorar la estabilidad de la presión sin resultar en flotabilidad negativa.

La cantidad de perfluoroalcano que hay que introducir depende de su pesomolecular. Cuanto mayor sea el peso molecular, menos perfluoroalcano puede ser introducido sin formar microesferas negativamente flotantes. Las cantidades adecuadas pueden expresarse como un porcentaje en volumen por volumen (v/v) de la "fase gaseosa" que se introduce, es decir, la cantidad total de gas más vapor de perfluoroalcano. Para el perfluoropentano, esta cantidad es aproximadamente 20-50%; para el perfluorohexano, es aproximadamente 10-20%, y para el perfluoroheptano es aproximadamente 7-15%. Las cantidades adecuadas para otros perfluoroalcanos pueden determinarse fácilmente basándose en la flotabilidad y la resistencia a la presión. Se entiende también que la cantidad que es necesaria es relativamente independiente del gas nuclear elegido.

Las microesferas de la invención exhiben una mejora inesperada de la resistencia a la presión cuando el núcleo es un gas soluble. Si las microesferas se preparan con 50% de aire y 50% de gas perfluoropropano o de vapor de perfluoropentano (v/v) como la fase gaseosa, cabría esperar que estas microesferas exhibieran la misma resistencia a una presión de 68,95 kPa (10 psi) para muestras equivalentes de aproximadamente 1 \times 10^{7} microesferas por ml. Eso se debe a que no cabría esperar que la solubilidad del aire en el núcleo o la difusión a través de la cubierta disminuyeran por la presencia del perfluoroalcano. Por consiguiente, se esperaría que las microesferas hechas con la misma cantidad de aire perdieran la fracción de aire tras ser sometidas a una presión suficiente para solubilizar sólo la fracción de aire y sufrieran destrucción parcial. Sin embargo, las microesferas de esta invención exhiben una resistencia inesperada a la presión. En contra de lo que cabría esperar, las microesferas hechas con 50% de aire y 50% de vapor de perfluoropropano (v/v) exhiben un colapso parcial debido a la pérdida de la fracción de aire. Las microesferas preparadas con perfluoropropano son resistentes a 68,95 kPa (10 psi). Véase Ejemplo 2.

Las microesferas se utilizan en forma de suspensión en un vehículo líquido estéril, acuoso e inyectable. Esos vehículos líquidos son muy conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. La concentración de microesferas en la suspensión estará normalmente en el intervalo de 1 \times 10^{7} a 1 \times 10^{10}, más habitualmente de 1 \times 10^{8} a 1 \times 10^{9}, por ml de medio de suspensión. Un uno por ciento de seroalbúmina humana en solución salina es un vehículo líquido preferido. Cuando están en suspensión, las microesferas son monodispersadas y no se combinan. Las suspensiones se almacenan preferiblemente a 4º-23ºC, hasta el uso. Naturalmente, las microesferas pueden mantenerse en suspensiones más concentradas o más diluidas de lo especificado anteriormente y luego ser reformuladas para la inyección.

Las microesferas se preparan sometiendo una mezcla de una disolución acuosa de una proteína insolubilizable por calor y la fase gaseosa a cavitación ultrasónica o mecánica a temperaturas elevadas, para provocar que la proteína se desnaturalice simultáneamente y encapsule la fase gaseosa, a lo que sigue el enfriamiento del producto a 15-18ºC. La concentración de proteína en la disolución está en el intervalo de alrededor de 0,1 a 10% p/v, preferiblemente alrededor de 1 a 5% p/v, y más preferiblemente alrededor de 1% p/v. Se prefiere la cavitación mecánica, como ocurre en un molino coloidal. De forma alternativa, la cavitación mecánica puede provocarse forzando la fase gaseosa o la disolución proteica a través de aberturas de un tamaño que es apropiado para hacer microesferas en un intervalo de tamaño útil. Utilizando la cavitación mecánica en un molino coloidal, la disolución acuosa de la proteína insolubilizable por calor es suministrada al molino a una temperatura necesaria para alcanzar la temperatura de desnaturalización incipiente durante la ulterior cavitación mecánica de la disolución. La temperatura de desnaturalización de la proteína en disolución estará normalmente en el intervalo de 50 a 100ºC. Puede obtenerse de las tablas de desnaturalización térmica de la proteína en la bibliografía, o experimentalmente por cualquier método conocido. Por ejemplo, para determinar la temperatura de desnaturalización experimentalmente, puede calentarse una disolución proteica en un baño María mientras se remueve. La temperatura de desnaturalización es la temperatura a la que el material insoluble se observa por primera vez. Nótese que la temperatura de desnaturalización es afectada por la naturaleza, la pureza y el origen de la proteína, la concentración de proteína en la disolución, el pH, el tampón, la fuerza iónica, la presencia de estabilizadores y la presencia de desnaturalizantes químicos o detergentes. Por tanto, es necesario determinar la temperatura de desnaturalización de la proteína en el ambiente en el que se utilizará para hacer microesferas. Si se desea, pueden utilizarse aditivos como detergentes o disolventes polares para cambiar la temperatura a la que la desnaturalización tiene lugar.

La siguiente tabla proporciona las temperaturas de desnaturalización de varias proteínas naturales que se determinaron experimentalmente como se ha descrito antes:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2

1

	* TRIS =	2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol
	** MES =	ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico
	*** DTT =	ditiotreitol

Cada aparato empleado para cavitar la disolución proteica/mezcla de material nuclear provocará una cierta cantidad de calentamiento adicional de la disolución proteica debido a las fuerzas de cizallamiento mecánico ejercidas sobre la disolución. Ese calor debe ser suficiente para provocar la desnaturalización localizada de la proteína en una interfase de fase gaseosa. Por tanto, es importante determinar la cantidad de aumento de temperatura provocado por el aparato para que pueda ajustarse la temperatura a la que la disolución proteica se introduce en el aparato para alcanzar esta desnaturalización térmica local. Específicamente, la temperatura total del líquido en el aparato debe coincidir con la temperatura de desnaturalización incipiente inmediatamente previa a la cavitación. El acontecimiento de cavitación genera el calor adicional necesario para desnaturalizar localmente la proteína. La temperatura de desnaturalización incipiente se define como la temperatura a la que la proteína está al borde de la desnaturalización, pero la disolución no contiene ninguna proteína desnaturalizada. Esta temperatura está justo por debajo, normalmente de 1 a 5ºC por debajo, de la temperatura de desnaturalización. Si es necesario, la disolución proteica inicial puede precalentarse antes de ser introducida en el aparato a una temperatura que permita alcanzar la temperatura de desnaturalización
incipiente.

Una vez se ha alcanzado la temperatura inicial adecuada de la disolución proteica, la disolución se combina con la fase gaseosa, por ejemplo introduciendo la fase gaseosa en la disolución proteica antes del proceso de cavitación o directamente durante éste a una proporción en volumen por volumen en el intervalo alrededor de 1:20 a 2:1 fase gaseosa:líquida, preferiblemente alrededor de 1:5 a 1:1. La proporción fase gaseosa:líquida adecuada dependerá de la geometría del aparato y puede ajustarse para optimizar el rendimiento.

La fase gaseosa y la disolución proteica se combinan y se someten a cavitación bajo condiciones que producen microesferas. Eso se realiza utlizando un aparato en el que pueden producirse cizallamiento mecánico y cavitación hidrodinámica, como mezcladores de alta velocidad, molinos, fluidificadores y similares. Un aparato preferido es un molino coloidal.

Ejemplos de aparatos de molido específicos que pueden utilizarse son los siguientes:

Modelo #2 1/2 (Bematek, Beverly, MA)

Modelo W250V (Greerco, Hudson, NH)

Modelo 2F (APV Gaulin, Everett, MA)

Modelo L4R (Silverson, Chesham, Reino Unido)

Modelo Polytron PT3000 (Kinematica, Littaw, Suiza)

Al utilizar un molino coloidal, la velocidad del rotor, el tamaño de la abertura y la proporción fase gaseosa:líquida son los principales parámetros del proceso que afectan a las características (tamaño medio, distribución del tamaño y concentración de microesferas) del producto. Esos parámetros se ajustan empíricamente para proporcionar un producto que tenga las características deseadas.

Después de pasar por el molino, el producto se enfría, normalmente a 15-18ºC. El paso del enfriamiento resulta en la condensación de una porción del vapor de perfluoroalcano en la cubierta de la microesfera. Las microesferas resultantes pueden medirse utilizando un contador de partículas como un contador de partículas Multisizer II de
Coulter.

La composición de las micropartículas de esta invención es útil para la ecografía convencional de tejidos corporales u órganos, como el corazón, el hígado, el riñón y el encéfalo. Más particularmente, es útil para realizar ecografías de los tejidos u órganos, como el tejido miocardíaco, por perfusión vascular de las microesferas. Para la ecografía del miocardio (así como la perfusión orgánica en general), la ecografía se inicia antes de la administración de las suspensiones de microesferas, y se continúa durante la administración y después de ésta, y hasta que la intensidad de la imagen del tejido miocardíaco vuelve a la intensidad "de base" previa a la administración. El periodo de tiempo durante el que la intensidad de la imagen del tejido aumenta se denomina a veces "introducción", y el periodo de tiempo desde que la intensidad de la imagen del tejido ha alcanzado el máximo hasta el momento en el que vuelve a la línea de base se denomina "lavado". Las características de la ecografía durante la introducción y el lavado (como el nivel de intensidad máxima y el tiempo necesario para alcanzar la intensidad máxima) pueden relacionarse con estados patológicos en los tejidos y órganos que se están examinando.

Para uso en ecografía convencional, la suspensión de microesferas se inyecta en una vena periférica, tanto como bolo como por infusión continua durante un periodo de tiempo, como de uno a diez minutos, a aproximadamente 0,005 a 0,1 cc por kg de masa corporal. La energía ultrasónica se aplica de manera continua o intermintente (es decir, pulsada) al tejido/órgano que hay que representar en una imagen, y la energía reflejada se recoge y se traduce en una imagen utilizando un equipo de ecografía convencional, comercializado.

El equipo y los procedimientos de ecocardiografía bidimensional (2-D) o multidimensional (por ejemplo, tridimensional (3-D)) pueden utilizarse para obtener la imagen. Estos procedimientos y equipo son convencionales. Las tres técnicas utilizadas para obtener imágenes 3-D son las siguientes: en la primera, se utiliza un transductor convencional para recoger imágenes tomográficas. El transductor se monta sobre un raíl y recoge imágenes a medida que se mueve a lo largo del raíl. Se define la velocidad de movimiento a lo largo del raíl, de modo que se conoce el espaciado entre imágenes tomográficas. La colección de placas se mezcla entonces para obtener una imagen 3-D. En la segunda, se utiliza también un transductor convencional para recoger imágenes tomográficas. Asociado al transductor hay un sensor que es capaz de informar sobre la posición espacial del transductor, de manera que se conoce la orientación relativa de diversas imágenes y las imágenes pueden mezclarse para generar una imagen 3-D. En la tercera, el transductor consiste en un conjunto bidimensional de elementos. Un conjunto unidimensional de elementos es capaz de adquirir una imagen tomográfica; la dimensión añadida permite explorar en la tercera dimensión.

El método de ecografía se ha realizado en modelos animales. En estas pruebas, las microesferas utilizadas en el método de ecografía proporcionaron retrodispersión excelente, atenuación reducida y exhibieron una duración más larga de los efectos de contraste que cualquiera de las microesferas llenas de gas que se probaron.

La invención se ilustra con más detalle con los siguientes ejemplos. Con estos ejemplos no se pretende limitar la invención de ninguna manera.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de microesferas

El molido coloidal produce microesferas de albúmina por el proceso de cavitación mecánica. El molino Gaulin utiliza un disco plano de 50,8 mm (2'') que rota a 20.000 rpm. El espacio entre el rotor y el estator se fija en 0,0432 mm (0,0017''). Se diluye una disolución de seroalbúmina humana al 5% para inyección a un 1% con solución salina USP para inyección y se bombea a 300 ml/min a través de una bobina de acero inoxidable de 6,35 mm (1/4'') sumergida en un baño María termostatizado a 60ºC. La disolución calentada de albúmina entra en la cabeza del molino a través de un puerto especializado.

Todas las tuberías de suministro de gas y vapor son de acero inoxidable termorregulado. El aire puro (u otro gas adecuado) de un cilindro de alta presión se libera en el molino a través de un puerto especializado. El aire se regula a 206,8 kPa (30 psi), con una velocidad de flujo de 100 cc/min que se controla con un medidor de masa/flujo calibrado. El perfluoropentano líquido (300 ml) se vierte en un pequeño cilindro de acero equipado con una válvula y se coloca en un baño María caliente (92ºC). El vapor de perfluoropentano se regula a 206,8 kPa (30 psi) y se dirige a través de un segundo medidor de masa/flujo calibrado a 100 cc/min (1 g/min). El vapor de perfluoropentano se combina con el flujo de aire en una "T". El vapor y el aire se mezclan al pasar por un mezclador de gas estático de 9'' termorregulado justo corriente arriba de la cabeza del molino. Un termopar controla la temperatura de la mezcla gas/vapor, que se mantiene a 70-90ºC.

Las fases líquida y gaseosa se combinan en el molino a una temperatura de proceso de 76,5ºC \pm 1ºC. Se forman microesferas por cavitación mecánica en una suspensión de disolución de albúmina al 1%. El producto se enfría instantáneamente al pasar por un refrigerador del interior de la tubería a 15º-18ºC. El producto emerge del refrigerador en un recipiente de cristal o una bolsa colectora. El total de la suspensión líquida se almacena durante la noche bajo refrigeración, se resuspende por agitación y se llenan con él frascos de cristal o jeringas. El producto se segrega tras el reposo en una capa flotante blanca y densa y una clara debajo. Las microesferas hechas de acuerdo con este procedimiento tienen una concentración de 4-9 \times 10^{8}/ml con un tamaño medio de 4-7 \mum, y un volumen gaseoso total de gas de 70-200 ml/ml de suspensión. Los datos de la cromatografía en fase gaseosa indican un contenido de perfluoropentano de aproximadamente 0,5 mg/ml.

Ejemplo 2 Estabilidad de las microesferas a la presión

Se disolvieron microesferas de 10 lotes diferentes preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 utilizando vapor de perfluoropentano y aire como la fase gaseosa durante un intervalo de diferentes proporciones en tampón fosfato salino (PBS) ventilado para dar una suspensión con una densidad óptica de 1 a 600 nm. Eso corresponde a aproximadamente 1 \times 10^{7} microesferas/ml. La suspensión se colocó en una cubeta de presión y se controló la densidad óptica como una función de tiempo durante 1 minuto. Se aplicó presión ambiente durante los primeros 15 segundos, seguida por 68,95 kPa (10 psi) durante los 15 segundos siguientes. Se liberó presión y se volvió a ambiente durante los 30 segundos finales.

La aplicación de presión causa un aumento de la solubilidad del núcleo de gas de acuerdo con la ley de Henry. El aire, que es mucho más soluble que el perfluoropentano, se lleva a disolución de manera considerablemente más eficaz mediante la aplicación de presión. El 100% de las microesferas llenas de aire (ALBUNEX®, Molecular Biosystems, Inc., San Diego, California), por ejemplo, es totalmente destruido a 1 \times 10^{7}/ml por 68,95 kPa (10 psi) (Fig. 1). Las microesferas llenas al 100% de perfluoropropano exhiben compresión tras aplicación de 68,95 kPa (10 psi), pero recuperan la densidad óptica original tras la liberación de presión (Fig. 2). Las microesferas preparadas con 50% de aire y 50% de perfluoropropano como la fase gaseosa exhiben compresión y recuperación incompleta tras la liberación de presión (Fig. 3). La fracción de aire se disuelve fácilmente en la disolución circundante y no vuelve a entrar tras la liberación de presión. El grado de recuperación de estas microesferas es inversamente proporcional a la fracción de aire presente.

Se prepararon microesferas de acuerdo con el Ejemplo 1 con 50% de vapor de perfluoropentano y 50% de aire como la fase gaseosa, y se determinó la resistencia a la presión como se ha descrito anteriormente. Estas microesferas exhibieron inesperadamente una recuperación casi completa tras ser sometidas a 68,95 kPa (10 psi) (Fig. 4). Las preparaciones con porcentajes más elevados de aire también exhiben resistencia a la presión en un mayor grado del esperado. En la Figura 5 se muestra el efecto de 68,95 kPa (10 psi) en una muestra de microesferas de aire:vapor de perfluoropentano preparadas con 66% de aire en la fase gaseosa. Estas preparaciones de microesferas exhiben una resistencia casi completa a la presión. A medida que aumenta la fracción de aire, disminuye la resistencia a la presión, pero la presencia de más de 20% de vapor de perfluoropentano mejora la resistencia a la presión más allá de lo esperado. En la Figura 6 se muestra el efecto de la presión en un intervalo de preparaciones: 0%, 10%, 25%, 34%, 50%, 80% y 100% de vapor de perfluoropentano. Las microesferas preparadas con 100% de vapor de perfluoropentano son negativamente flotantes y no son afectadas por la aplicación o la liberación de una presión de 68,95 kPa (10 psi), es decir, la densidad óptica permanece inalterada. Cabría esperar eso para un núcleo líquido, ya que los líquidos son muy incomprimibles.

Ejemplo 3 Uso in vivo de las microesferas para la opacificación ventricular izquierda

Se inyectó un ml de suspensión de microesferas preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1 (50% de vapor de perfluoropentano y 50% de aire como la fase gaseosa) a un macho de 23 kg, perro de raza mestiza. La inyección se realizó a través de un catéter en la vena femoral seguido por un suero salino de 4-6 ml. El agente produjo la opacificación ventricular izquierda completa con un cambio máximo del brillo de la imagen de 15,8 dB. Este agente también estimuló el septo y la pared posterior del miocardio con un cambio máximo desde la línea de base de 1,0 y 0,8 dB, respectivamente. A los 2 minutos después de la inyección, la cámara ventricular izquierda permanecía 1,7 dB por encima de la línea de base, y 100% llena. La pared posterior del miocardio estaba 0,8 dB por encima de la línea de base y el septo, 3,9 dB por encima de la línea de base. A los 4 minutos, las intensidades de imagen tanto de la cámara como del septo habían vuelto a la línea de base, pero la pared posterior permanecía a 0,2 dB por encima de la línea de base. Esta dosificación del agente no provocó cambios significativos en la hemodinámica. No hubo cambios en la presión arterial media ni cambios en el ritmo cardíaco. Tampoco hubo cambios significativos en los gases o el pH de la sangre arterial. Se observó opacificación del ventrículo izquierdo durante al menos 4 minutos después de la inyección. A los 1,5 minutos después de la inyección, el miocardio permanecía opacificado aunque el nivel de opacificación de la cámara cardíaca había vuelto a la línea de base.

Ejemplo 4 Efectos de la ecografía in vivo del miocardio

Las suspensiones de microesferas preparadas de acuerdo con el Ejemplo 1 exhiben contraste ecográfico fuerte y persistente in vivo cuando se observan por ecografía de modo B estándar (fundamental) del corazón. Puede utilizarse cualquier ecografía del corazón, pero la perspectiva parasternal del eje corto permite aproximadamente un plano de visualización transversal semilunar de medio punto. Antes de la administración, la cámara ventricular izquierda aparece como una estructura gris oscuro aproximadamente circular y la cámara ventricular derecha es una estructura semilunar oscura. Tras la inyección intravenosa de 0,5 cc de una suspensión de microesferas hecha de acuerdo con el Ejemplo 1 (50% de aire y 50% de vapor de perfluoropentano como la fase gaseosa, con un diámetro medio de 5 \mum a un perro anestesiado, las microesferas aparecen primero (en unos pocos segundos) en la cámara ventricular derecha del corazón. La imagen de la cámara ventricular derecha aparece de color blanco brillante seguida por una sombra negra difusa (atenuación), excepto un margen blanco brillante en la parte superior de la forma semilunar, que es proximal a la fuente ultrasónica. En varios latidos cardíacos, el material blanco parece que gire hacia la cámara ventricular izquierda, llenándola completamente, y produce más oscurecimiento en la porción inferior de la imagen del corazón. Las microesferas empiezan a aclarar sustancialmente el color gris del miocardio a medida que llenan el sistema vascular miocardíaco desde las arterias coronarias. El aumento del brillo puede observarse sólo en este estadio en las áreas del tejido cardíaco más proximales a la fuente ultrasónica debido a la atenuación (oscurecimiento) continuada de la cámara ventricular. El oscurecimiento de la cámara dura varios segundos y deja el ventrículo gris muy claro. En este estadio, se observa que el miocardio tiene una intensidad similar y una sombra de gris mucho más clara que la imagen previa a la inyección.

Las microesferas se vacían primero de la cámara ventricular derecha y luego en la cámara ventricular izquierda, regresando a la vez las cámaras ventriculares a la intensidad de imagen de la línea de base. Alrededor de 3 a 5 minutos tras la inyección, la cámara ventricular izquierda aparece como un círculo gris oscuro rodeado por un miocardio "en forma de dónut" gris brillante, lo que indica la persistencia de microesferas en el sistema vascular del tejido cardíaco. El miocardio iluminado pierde intensidad lentamente con el tiempo, volviendo a la intensidad de base entre aproximadamente 20 y 30 minutos. Las inyecciones repetidas producen los mismos resultados sin observarse efectos adversos en el ritmo cardíaco, la presión sanguínea sistémica y los niveles de gas de la sangre arterial.

Ejemplo 5 Perfusión de órgano in vivo

Utilizando un transductor lineal en fase de 5 MHz en un instrumento Sonos 1500 de Hewlett Packard, se evaluaron visualmente las imágenes transtorácicas parasternales del eje corto del corazón de 3 ratas, 1 conejo y 2 perros utilizando ecografía convencional tras la inyección intravenosa de suspensiones de microesferas preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 1. Estas suspensiones produjeron brillo prolongado del miocardio del conejo y la rata (de 0,01 a 0,1 ml), el miocardio del perro (0,5 ml), el riñón y el hígado del perro (3,0 ml), que siguió a 1-3 latidos cardíacos de atenuación acústica en campo lejano. Al evaluarse por densitometría acústica, el brillo máximo del miocardio mostró cambios de intensidad de 7 a 8 dB en el miocardio del perro, 2,6 dB en el conejo y de 5 a 6,4 dB en el miocardio de la rata. El brillo miocardíaco persistía después de que las cámaras ventriculares se hubieran aclarado. Esta imagen puede compararse a la de un dónut, con la cámara izquierda lavada en el centro rodeada por el miocardio brillante. El brillo visual del miocardio persistió durante aproximadamente 20 ó 30 minutos tras las inyecciones en los perros anestesiados, en comparación con 0,5 a 2,0 minutos utilizando microesferas de albúmina llenas de perfluoropropano hechas de acuerdo con la patente de EE.UU. núm. 4,957,656.

Los parámetros fisiológicos medidos en el examen in vivo de las suspensiones de microesferas de prueba fueron el ritmo cardíaco y la presión arterial media. No hubo cambios fisiológicamente relevantes (no más de 5 latidos/min ni 666,6 Pa (5 mmHg)) después de la administración de las suspensiones de microesferas a los sujetos animales. No se han observado cambios en el ritmo cardíaco ni la presión arterial media, ni tampoco cambios en la oxigenación de la sangre arterial, medida por un oxímetro periférico clínico, utilizando estas suspensiones de microesferas.

Ejemplo 6 Propiedades acústicas

Los agentes de contraste de tipo microburbuja proporcionan retrodispersión y atenuación acústicas debido a la comprimibilidad del gas. Estas propiedades son modificadas, sin embargo, por la presencia de una cubierta sólida que encapsula el gas. Las diferencias en el gas del interior de la microesfera deben de tener poco efecto sobre las propiedades acústicas, ya que hay poca diferencia en la comprimibilidad de diferentes gases. Para determinar si la presencia de vapor de perfluoropropano durante la formación de microesferas afectaba a las propiedades físicas de la cubierta de la microesfera, se midieron la retrodispersión y atenuación acústicas de una suspensión de microesferas preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1 (microesferas "de prueba"), y se compararon con las microesferas de albúmina llenas de perfluoropropano preparadas de acuerdo con la patente de EE.UU. núm. 4,957,656 (microesferas "de control") y con ALBUNEX® (microesferas de albúmina llenas de aire, Molecular Biosystems, Inc., San Diego, California).

Se añadió una pequeña cantidad de muestra, 13 \mul - 25 \mul, a una cámara cilíndrica de muestras rellenada con 62 ml de Isoton® II. La cámara de muestras se colocó en un baño María controlado por temperatura y se rotó a 25 rpm para mantener la suspensión de microesferas homogénea. Cualquiera de los dos transductores ecográficos de Panametrics (frecuencia central = 2,25 MHz o 5,0 MHz) fue excitado por un generador de impulsos/receptor Modelo 5800-101 de Panametrics para emitir un estallido ecográfico. El ultrasonido retrodispersado fue recibido por el transductor, detectado por el generador de impulsos/receptor y digitalizado por un osciloscopio digital Modelo 54505B de Hewlett Packard. El proceso de obtención de datos fue controlado por un ordenador personal. Se hicieron aproximadamente 50 medidas de la retrodispersión de cada muestra y se probaron múltiples muestras de cada
lote.

El análisis de datos incluía calcular el logaritmo de la energía retrodispersada integrada como una función de la profundidad en el interior de la cámara de muestra. Se realizó una regresión lineal en los datos en cada frecuencia, con la interceptación y proporcional a la fuerza de dispersión y la magnitud de la pendiente proporcional a la atenuación para las microesferas de prueba. El coeficiente de correlación fue 0,998 a 2,5 MHz, y 0,994 a 5,0 MHz.

Se calcularon la retrodispersión y atenuación acústicas de las suspensiones de microesferas de prueba y de control. Estos cálculos incorporaban la distribución de tamaños y la concentración de las suspensiones de microesferas, de modo que pueden hacerse comparaciones de las propiedades acústicas que son independientes del tamaño y la concentración de microesferas. Los cálculos se realizaron utilizando la teoría descrita por C. Church (J. Acoust. Soc. Amer., 97(3) 1510-1521 (1995)). Los cálculos se basaron en las frecuencias ultrasónicas incidentales, la temperatura del baño María, la dilución y las distribuciones de tamaño y concentraciones de las suspensiones de microesferas que se midieron utilizando un analizador de partículas Multisizer de Coulter®.

Para la atenuación y retrodispersión en las dos frecuencias ultrasónicas, el coeficiente de correlación de las mediciones y los cálculos para múltiples lotes de suspensiones de microesferas de control oscilaban entre 0,79 y 0,98. Esta relación lineal demostró lo apropiado de la teoría. El intervalo de predicción de 95% de esta línea se determinó para la atenuación y retrodispersión en 2,25 MHz y 5,0 MHz. Los puntos de datos para los cálculos y las mediciones de la retrodispersión de las suspensiones de microesferas de prueba quedan fuera del intervalo de predicción en ambas frecuencias ultrasónicas. Los puntos de datos para los cálculos y las mediciones de la atenuación a 2,25 MHz de las suspensiones de microesferas de prueba también quedaron fuera del intervalo de predicción. La fuerza de dispersión y la atenuación de esta formulación es por estadística significativamente menor que la de las microesferas de control con una distribución de tamaño equivalente.

Por consiguiente, las diferencias observadas en las propiedades acústicas de las microesferas de prueba comparadas con las de las microesferas de control son atribuibles a las diferencias en las propiedades de la cubierta, como el grosor, la viscosidad y/o la rigidez.

Ejemplo 7 Comparación de ecografía convencional frente a ecografía armónica

Se compararon suspensiones de microesferas hechas de acuerdo con el Ejemplo 1 con 50% de vapor de perfluoropentano y 50% de aire como la fase gaseosa (microesferas "de prueba") con suspensiones de microesferas de albúmina llenas de perfluoropropano hechas de acuerdo con la patente de EE.UU. núm. 4,957,656 (microesferas "de control") utilizando ecografía convencional y ecografía armónica.

Se representó en una imagen el miocardio de un perro como se ha descrito en el Ejemplo 3 tras la inyección de dosis equivalentes de microesferas de prueba con ecografía convencional y ecografía armónica. Se obtuvieron imágenes antes y después de la administración de la suspensión de microesferas de prueba. Se escogió una región de interés ("RDI") en el miocardio y se determinó la intensidad de imagen dentro de esta RDI. La intensidad de imagen posterior a la administración en la RDI después de restar la intensidad de la línea de base previa a la administración fue 29 unidades de la escala de grises, lo que indica que la imagen convencional mejoró después de la administración de la suspensión de microesferas de prueba. Este experimento se repitió utilizando ecografía armónica. No se observó ninguna mejora de la intensidad de imagen después de la administración de la suspensión de microesferas de prueba, es decir, la intensidad de imagen no aumentó por encima de la intensidad de la línea de base previa a la administración.

Este experimento demuestra que las microesferas de prueba no exhiben propiedades resonantes que puedan explotarse utilizando ecografía armónica. En comparación, se ha informado de que las suspensiones de microesferas de control exhiben mejora de la imagen utilizando ecografía armónica. Véase, por ejemplo, Dittrich y col. (Abstract enviado al American College of Cardiology, 45ª Sesión Científica Anual, 1996), que comunicaron que las microesferas de albúmina llenas de perfluoropropano mejoraban las ecografías armónicas del miocardio.

Claims (27)

1. Una composición para uso como agente de ecografía que comprende una suspensión de microesferas, comprendiendo las microesferas un núcleo de gas que comprende gas que tiene una solubilidad mayor o igual a 0,01 ml de gas por ml de agua a 25ºC y a 101,325 kPa (1 atmósfera de presión), estando el núcleo encapsulado por una cubierta proteica, y pudiéndose obtener las microesferas por un procedimiento que comprende:

(a) mezclar una fase gaseosa que comprende un gas y vapor de perfluoroalcano que se ha calentado a una temperatura por encima de su punto de ebullición y próxima a la temperatura de desnaturalización de la proteína, con una disolución de una proteína insolubilizable por calor;

(b) cavitar la mezcla bajo condiciones que permitan la formación de microesferas mediante la insolubilización por calor de la proteína, y

(c) enfriar las microesferas para condensar al menos una porción del perfluoroalcano en la cubierta.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el gas es aire.

3. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que la proteína comprende albúmina.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3 en la que la albúmina es seroalbúmina humana.

5. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el vapor de perfluoroalcano es vapor de perfluoropentano, perfluorohexano o perfluoroheptano.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 en la que el vapor de perfluoropentano está entre 20% y 50% (v/v) de la fase gaseosa y/o el vapor de perfluorohexano está entre 10% y 20% (v/v) de la fase gaseosa y/o el vapor de perfluoroheptano está entre 7% y 15% de la fase gaseosa.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 en la que el vapor de perfluoropentano es aproximadamente 50% de la fase gaseosa.

8. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que las microesferas exhiben resistencia a la presión a 68,95 kPa (10 psi).

9. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que las microesferas tienen un diámetro medio comprendido en el intervalo de 0,1 a 10 \mum.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9 en la que las microesferas tienen un diámetro medio en el intervalo de 1 a 6 \mum.

11. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que las microesferas están presentes en la suspensión en una concentración de 1 \times 10^{7} a 1 \times 10^{10} microesferas/ml de suspensión.

12. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que la cubierta se modifica para incluir una porción que se dirige a un tejido u órgano específico.

13. Una composición para uso como agente de ecografía que comprende una suspensión de microesferas, comprendiendo las microesferas una fase gaseosa de 50% de un gas que tiene una solubilidad mayor o igual a 0,01 ml de gas por ml de agua a 25ºC y a 101,325 kPa (1 atmósfera de presión) y 50% de perfluoropentano (v/v) encapsulado por una cubierta de proteína insolubilizada por calor.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13 en la que el gas es aire.

15. Una composición de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que es administrable por vía intravenosa.

16. Un procedimiento para preparar una composición que comprende microesferas, útil como agente de ecografía, que comprende un núcleo de gas encapsulado por una cubierta de una proteína insolubilizada por calor, comprendiendo el núcleo de gas que tiene una solubilidad mayor o igual a 0,01 ml de gas por ml de agua a 25ºC y a 101,325 kPa (1 atmósfera de presión), comprendiendo el procedimiento:

(a) mezclar una fase gaseosa que comprende un gas y vapor de perfluoroalcano que se ha calentado a una temperatura por encima de su punto de ebullición y próxima a la temperatura de desnaturalización de la proteína, con una disolución de una proteína insolubilizable por calor,

(b) cavitar la mezcla bajo condiciones que permitan la formación de microesferas mediante la insolubilización por calor de la proteína, y

(c) enfriar las microesferas para condensar al menos una porción del perfluoroalcano en la cubierta.

17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16 en el que la albúmina está presente en la disolución proteica en una concentración de 1% a 5% por peso, ambos incluidos.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17 en el que la cavitación ocurre aplicando energía ultrasónica o mecánica.

19. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 que produce una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15.

20. Una composición que comprende microesferas producidas por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

21. Uso de una composición para la producción de un agente de ecografía, comprendiendo la composición una suspensión de microesferas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para representar en una imagen un tejido u órgano de un sujeto en un método que comprende:

(i) esperar durante un periodo de tiempo suficiente para que las microesferas lleguen al tejido u órgano y perfundan en él después de la administración de la composición al sujeto;

(ii) aplicar energía ultrasónica al sujeto, y

(iii) generar una ecografía de la energía ultrasónica reflejada desde el tejido u órgano.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 en el que el tejido u órgano es tejido cardíaco o un corazón que tiene un miocardio y una cavidad ventricular izquierda y derecha, y el paso (ii) comprende además esperar durante un periodo de tiempo suficiente para que las microesferas lleguen al corazón, llenen la cavidad ventricular izquierda, perfundan el miocardio, salgan de la cavidad ventricular izquierda y salgan del miocardio.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22 en el que la composición se administra por vía intravenosa como una inyección de bolo.

24. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 en el que la composición se administra por vía intravenosa durante un periodo de al menos 1 minuto.

25. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 en el que el paso (iii) comprende generar una ecografía bidimensional o tridimensional.

26. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25 en el que el paso (ii) comprende aplicar energía ultrasónica continua o pulsada.

27. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26 en el que el paso (i) comprende la administración de la composición desde una jeringa precargada.