JP2000512281A

JP2000512281A - 超音波画像化剤としての耐圧性タンパク質ミクロスフェア

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Publication number: JP2000512281A
Application number: JP10500865A
Authority: JP
Inventors: ジー．ジャブロンスキ，エドワード
Original assignee: モレキュラーバイオシステムズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2000-09-19
Also published as: DE69732568T2; US5976501A; WO1997046264A3; CA2253734A1; EP0907380A2; ATE289520T1; EP0907380B1; ES2238724T3; AU3478097A; WO1997046264A2; DE69732568D1

Abstract

(57)【要約】従来の超音波画像化方法が記載され、これはミクロスフェアの水性懸濁液の使用を含む。これらのミクロスフェアは、ペルフルオロアルカン蒸気の存在において形成されたタンパク質シェルによってカプセル化された気体コアからなるとしてさらに特徴づけられる。形成の間の蒸気の存在は、シェルの特徴を変化させ、従って周囲の水性環境に気体が可溶化するのを防ぐ。さらに、形成の間のペルフルオロアルカン蒸気の存在はまた、血管画像化適用のための改善されたエコー原性特性を提供し得る。

Description

【発明の詳細な説明】超音波画像化剤としての耐圧性タンパク質ミクロスフェア技術分野本発明は、従来のグレースケール超音波画像化を実施する方法の分野に関する。より詳細には、本発明は、生体適合性タンパク質のシェルによってカプセル化された気体コアを含むミクロスフェアを含む、超音波画像化剤の使用に関する。ミクロスフェアは、ミクロスフェア形成の間にペルフルオロアルカンを含有させることによって耐圧性および有効性を与えられる。これらのミクロスフェアは、心筋のような組織および器官を灌流してグレースケール画像における可視化を増強するための超音波画像化剤としての使用に特によく適している。背景従来の超音波画像化は、音波のエネルギーが目的の領域に焦中され得、そしてその画像を生じるような様式で反射され得るという原理に基づいている。使用する超音波スキャナーは、画像化される領域に横たわる体表面上に置かれ、そして音波はその領域に向けられる。スキャナーは反射した音波を検出し、そしてデータをビデオ画像に変換する。超音波エネルギーが物質を通過して伝達される場合、反射したエネルギーの量は、伝達速度および物質の音響特性に依存する。物質の音響特性の変化（例えば、音響インピーダンスの変動）は、液体-固体または液体-気体のように異なる音響密度の界面において最も顕著である。従って、超音波エネルギーが組織に向けられた場合、器官構造は、超音波スキャナーによる検出のための音反射信号を生み出す。これらの信号は、造影剤の適切な使用によって増大され得る。 OphirおよびParker,Ultrasound in Medicine and Biology 15(4):319〜333(19 89)は、種々のタイプの気体含有超音波造影剤を記載している。OphirおよびPark erによって記載されている１つの主要なクラスの気体含有超音波造影剤は、カプセル化された気体微小泡またはミクロスフェアである。その気泡は、タンパク質または他の生体適合性物質から構成されるシェルで囲まれている。現在市販のミクロスフェア造影剤は、ヒト血清アルブミンでカプセル化された空気ミクロスフ米国特許第4,572,203号および同第4,844,882号を参照のこと。しかし、空気ミクロスフェアは、インビボ注射および循環の間に遭遇するような圧力150mmHgを受けるとき、エコー原性を迅速に喪失することが示されている(deJong,N．らUltra sound Med.Biol. 19:279〜288,1993)。圧力不安定性の問題を解決するためには、最近の教示はシェルを改良することに集中している。というのは、ミクロスフェアシェルまたは「膜」は、圧力下では非常に壊れやすくまたは傷つきやすく、インビボにおいて迅速な崩壊を生じると考えられるからである。Glddey(PCT WO92/105806)は「膜の剛性のために、例えば、血流を通じて移動する間にミクロスフェアがさらされ得る突然の圧力変化（これらの変化または圧力は心臓の拍動による）に、膜は耐え得ない。」と記載した。シェルの剛性を克服するために、Giddeyは、大きな割合の粘稠化剤(40％〜80％のポリオール)を含有するタンパク質溶液において空気を予め乳化することを提案し、そしてそれを高速ブレンダーで機械的剪断にさらしている。適切なサイズの泡を回収し、そして軟性のシェル中にそれらを安定化させるために適切な界面活性剤でコートする。 Holmes(PCD WO 92/17213)は、生分解性化学架橋試薬でシェルを強化することによって、タンパク質ミクロスフェアのインビボ安定性を増強することを提案した。 Bichonら(欧州特許出願458,745A1)およびSchneiderら(Inv.Radiol.27:134〜15 9,1992)は、多孔性(5〜2000nmの孔サイズ)ポリマー「マイクロバルーン」の生成を記載している。彼らは、欧州特許出願において「マイクロバルーンの包膜の微細孔構造が、弾性の要因である。すなわち、ミクロスフェアは崩壊することなく圧力変化を容易に受け入れ得る」と報告している。 ErbelおよびZotz(米国特許第5,190,982号)は、空気を捕獲した架橋ポリマーマイクロカプセルを記載している。ミクロスフェア安定性を改良する他の努力は、シェル内部の気体に集中しており、そして特に不溶性気体の組み込みに集中している。ヘンリーの法則によると、溶液中での所定の気体の溶解性は、圧力が増すほど大きくなる。溶液中の気泡が圧力にさらされる場合、周囲の溶液中での気体の溶解度は圧力量に比例して大きくなる。気泡をシェルで囲んだ場合、すなわちミクロスフェアの形態である場合、気体溶解性の効果がなお観測される。なぜなら、ミクロスフェアシェルは、ミクロスフェア中の気体と周囲の溶液との間の接触を完全には排除しないからである。それゆえ、溶液に懸濁されたミクロスフェアが圧力にさらされた場合、ミクロスフェア内部の気体は、最終的に周囲の溶液中に溶解されるようになり、ミクロスフェアの崩壊を生じる。気体が周囲の溶液に不溶性であればあるほど、ミクロスフェアは血液系または組織に完全に溶解されるようになることに対してより耐性になる。 _gas≦0.0031を有する気体とすることによって、ミクロスフェアの耐圧性が改善され得ることを指摘している。ここで、S_gasはその気体の水溶解度(l/l)であり、そしてMW_gasは気体の平均分子量（ダルトン）である。この特許により示唆されている気体に包含されているのは、比較的不溶性であるペルフルオロアルカン CF₄、C₂F₆、およびC₄F₁₀である。 PCT出願WO 95/01187は、熱不溶化フィルム原性(filmogenic)タンパク質によってカプセル化された気体ミクロスフェアを記載しており、そのカプセル化された気体は全く水不溶性の気体である。気体の中でも、特に言及されているものは、ペルフルオロアルカンCF₄、C₂F₆、C₃F₈およびC₄F₁₀である。これらのミクロスフェアは、酸素非存在下で、タンパク質の水溶液および不溶性気体の混合物を、その雰囲気に近いソニケータ／ミルにおいてその混合物を超音波処理またはミルすることによって、超音波または力学的空洞化にさらすことにより作製した。不溶性気体含有ミクロスフェアの様々な他の例が記載されてきた。それらは、コア物質としてペルフルオロペンタンのような高沸点のペルフルオロアルカンを含有する。PCT WO 95/23615は、液体ペルフルオロペンタンとシェル形成物質を混合し、続いてそれを気体に変換することにより作製されるミクロスフェアについて記載している。PCT WO 96/04018は、ペルフルオロペンタンのような不溶性気体をカプセル化するフッ素含有シェルを有するミクロスフェアについて記載している。Porterらは、気化したペルフルオロペンタンで作製されたデキストロースアルブミンミクロスフェアについて記載している（Journal of Amer.College of Cardiology,Abstract No.955-57,February,1995）。他の特許文献は、高沸点ペルフルオロアルカンを含む非ミクロスフェア型超音波造影剤についての記載している。米国特許第5,393,524号は、遊離空気微小泡と比較して増加した耐圧性を示す様々な気体の遊離気体微小泡について記載している。ペルフルオロペンタンはその出願の表IVに言及されている多数の気体の内の１つである。PCT WO 94/16739は、分散した液体が生理学的温度より低い沸点を有する液体-液体エマルジョンである超音波造影剤について記載している。このエマルジョンが投与されるとき、分散した液体は沸騰する。ペルフルオロペンタンは、分散した液体として使用され得る化合物の一覧に含まれる。前記の考察は、反射された超音波シグナルの量から画像の形成を包含する従来の超音波画像化に有用な様々な造影剤に関する。最近、画像化剤の共鳴に起因する、反射された超音波信号の調和振動数の変化を検出することを包含する超音波画像を生成するための異なる技術が記載されている。「調和画像化」と呼ばれるこの技術は、Uhlendorfらによって記載されている（米国特許第5,410,561号）。比較的硬い物体は超音波エネルギーの適用の際より弱く共鳴するので、遊離微小泡は、調和画像化において、カプセル化したミクロスフェアより良好である。PC T WO 96/09793は、界面活性剤によって安定化した遊離微小泡について記載している。その微小泡は、超音波エネルギーの適用の際に容量変化を起こし、その結果増強した調和画像化を生じる様々な気体状物質を含有する。調和画像化は、特定の適用について、従来の超音波画像化に優るいくつかの改良を提供するが、調和画像化を実施し得る装置が広く入手可能でないので、実用的な理由のために、未だ従来の画像化が好ましい。従って、組織または器官の従来の超音波画像化に特に適合しそして有用なミクロスフェアを用いた画像化法を提供することが、本発明の目的である。本発明に有用なミクロスフェアは、タンパク質シェル中の空気のような可溶性で生体適合性の気体を含み、これは加熱されたペルフルオロアルカン蒸気の存在下で形成される。ペルフルオロアルカンは、形成の間にタンパク質と相互作用し、ミクロスフェアシェルを水性環境に対してより不浸透性にする。そして、ペルフルオロアルカンは、改善された画像化効力を生じるシェル形成において重要な役割を担うとも考えられている。ミクロスフェア形成の間に加熱したペルフルオロアルカン蒸気を含有させることによって、空気のような比較的可溶性の気体は、周囲の水性環境中での可溶化から予想外に保護される。従って、本発明のミクロスフェアは、ペルフルオロアルカンの非存在下で作製される相当するミクロスフェアに予期される耐圧性を越える耐圧性を示す。この結果は、従来の超音波手順を用いてエコー原性を維持し得る、インビボで非常に長く生存する生成物である。発明の開示本発明は、従来の超音波画像化において、造影剤として、ミクロスフェアの懸濁液を用いる方法を提供する。ミクロスフェアは、加熱したペルフルオロアルカン蒸気の存在下で形成される熱不溶化タンパク質シェルによってカプセル化されたコア物質として気体を用いることにより調製される。気体は、好ましくは可溶性である。蒸気は、好ましくは、沸点を越えた、タンパク質の変性温度に近い温度で提供される。そうすることで、ミクロスフェアシェルの形成が容易になり、超音波の効力が増大する。被験体の超音波画像化は、ミクロスフェア懸濁液を被験体に投与後、開始される。ミクロスフェア懸濁液は、ボーラス投与され得るか、または所定の期間にわたって連続的に投与され得るかのいずれかである。ミクロスフェア懸濁液は使用の容易な、予め充填されたシリンジ中にパッケージされ得ることもまた意図される。画像化は、ミクロスフェアが、試験される組織または器官の部位に到達する間継続される。画像化は一般的に、試験される組織または器官の画像強度が、投与前の強度に戻るまで継続される。超音波画像は、反射された超音波エネルギーから作成される。本発明の１つの局面には、組織および器官の血管灌流を研究するために本発明の方法を使用することである。その使用は、組織または器官を通る血液の流れの評価を提供する。本発明の方法は、心筋灌流の研究に特に有用である。心筋画像化は、ミクロスフェア懸濁液を投与する前に心筋を画像化する工程、ミクロスフェア懸濁液を投与する工程、およびミクロスフェアが左心室腔に入り心筋組織を灌流し心室腔を出てそして最後に心筋組織を出る間、画像化を続ける工程を包含する。本発明の画像化方法は、従来の２次元または多次元（例えば３次元）超音波装置を使用して実施され得る。さらに、本方法は、連続適用超音波またはパルス超音波のいずれかで実施され得る。好ましくは、ミクロスフェア懸濁液は、１mlの懸濁液当たり1×10⁷〜1×10¹⁰ の範囲でミクロスフェアを含む。さらに、ミクロスフェアは、好ましくは0.1〜1 0ミクロン、より好ましくは２〜６ミクロンの範囲の平均直径を有する。ミクロスフェアコアは、生体適合性である任意の気体（空気のような可溶性気体が好ましい）から成り得る。ペルフルオロアルカン蒸気は、直鎖、分岐、または環状ペルフルオロアルカン（ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、およびペルフルオロヘプタンのような直鎖ペルフルオロアルカンが好ましい）の蒸気形態であり得る。ミクロスフェア形成プロセスに送達されるペルフルオロアルカン蒸気の量は、ペルフルオロアルカンの分子量と関係があり、分子量が増加するにつれて、必要とされるペルフルオロアルカン蒸気は減少する。しかし、気相（気体およびペルフルオロアルカン蒸気）は、より有効でない負の浮遊性のミクロスフェアを生成するのを防ぐために、少なくとも50％の気体から成るべきである。シェル形成タンパク質は熱不溶化可能である。好ましくは、シェル形成タンパク質はアルブミンであり、より好ましくはヒト血清アルブミンである。さらに、シェルは、ミクロスフェアをより低い免疫原性にし、そして/または組織または器官に特異性にする部分を含有するように改変され得る。本発明の別の局面は、従来の超音波画像化に有用であるミクロスフェアを作製するためのプロセスである。そのプロセスは、気体および加熱したペルフルオロアルカン蒸気からなる気相と熱不溶化可能タンパク質の溶液とを、その混合物を空洞化し、そしてタンパク質を熱不溶化する条件下で混合してミクロスフェアを形成する工程、続いてミクロスフェアを冷却してシェル中にペルフルオロアルカンの少なくとも一部を液化させる工程を包含する。この工程で、ペルフルオロアルカンがシェルの表面および/または内部構造に結合するようになり、疎水性バリアーを作る。さらに、シェルの音響特性は、このプロセスで改変され、より有効なミクロスフェアを作る。ミクロスフェアは、超音波エネルギーを用いる空洞化またはコロイドミル中で生じるような機械的力によって形成され得る。本発明のさらなる局面は、加熱したペルフルオロアルカン蒸気の存在下で形成される熱不溶化タンパク質によってカプセル化された気体コアを有するミクロスフェアからなる、従来の画像化に有用な組成物である。ミクロスフェアは、増強された耐圧性（例えば、10psiの圧力に対する耐性）を示す。本発明のミクロスフェア組成物の他の特徴は、前記考察に記載される。図面の簡単な説明図１は、気相として100％空気を有するミクロスフェアの懸濁液の、圧力10psi を加えた際の600nmでの光学密度変化を示す。図２は、気相として100％ペルフルオロプロパンを有するミクロスフェアの懸濁液の、圧力10psiを加えた際の600nmでの光学密度変化を示す。図３は、気相として50％空気および50％ペルフルオロプロパン(perfluoropane )を有するミクロスフェアの懸濁液の、圧力10psiを加えた際の600nmでの光学密度変化を示す。図４は、気相として50％空気および50％ペルフルオロペンタン蒸気を有するアルブミンミクロスフェアの懸濁液に、圧力10psiを加えた際の600nmでの光学密度変化を示す。図５は、気相として66.6％空気および33.3％ペルフルオロペンタン蒸気を有するアルブミンミクロスフェアの懸濁液に、圧力10psiを加えた際の600nmでの光学密度変化を示す。図６は、気相として変化する量の空気およびペルフルオロペンタン蒸気を有して調製されたアルブミンミクロスフェアの懸濁液の、圧力10psiを加えた際の600 nmでの光学密度変化を示す。発明を実施するための形態本発明の方法に有用であるミクロスフェアは、熱不溶化タンパク質によってカプセル化された気体コアからなり、そして加熱したペルフルオロアルカン蒸気の存在下で形成される。ミクロスフェアは、経肺経路に適したサイズであり、Coul ter Multisizer II particle counter/sizer(Coulter Electronics，Hialeah，F L)で計測した場合の平均公称直径が、0.1〜10ミクロン、好ましくは２〜６ミクロンの範囲である。ミクロスフェアの外側は、薄いタンパク質シェルで規定される。タンパク質シェル物質は、組換えDNA方法論によって生成されるタンパク質である天然に存在するフィルム原性タンパク質、および合成アミノ酸ポリマーの両方を含む。これらは、本明細書中で集合的に「タンパク質」と呼ばれる。このタンパク質は、タンパク質が不溶化される場合、コア物質の囲りにシェルまたはフィルムを形成し得なければならない。適切な天然に存在するタンパク質は、アルブミン、γ-グロブリン（ヒト）、アポトランスフェリン（ヒト）、Ｊ-ラクトグロブリン、ウレアーゼ、およびリゾチームを含む。本発明に特によく適しているのはアルブミンであり、そしてより具体的にはヒトアルブミンである。ミクロスフェアの形成における使用に適切なシェル形成物質または得られるミクロスフェアは、器官/組織を標的するかまたは免疫原性活性をクエンチする目的で、化学的に改変され得る（例えば、抗体またはポリエチレングリコールによる改変）。本発明のミクロスフェアを形成することにおける使用に適した気体は、好ましくは可溶性で、そして薬理学的に受容可能（すなわち、ヒトに対して生体適合性および最小限の毒性）である。用語「生体適合性」は、気体が毒性副産物を生成することなく代謝され得ることを意味する。気体は、単一化合物または化合物の混合物から構成され得る。本発明における使用に適した気体の例は、空気、Ｏ₂ 、Ｎ₂、Ｈ₂、ＣＯ₂、Ｎ₂Ｏ；アルゴン、ヘリウム、キセノンのような希ガス；ならびにメタン、エタン、プロパン、n-ブタン、イソブタン、およびペンタンのような炭化水素ガスである。用語「可溶な」は、気体が大気圧および25℃の温度において、水１mLあたり気体0.01mLより大きい溶解度を有することを意味する。不溶性気体もまた使用に適しており、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロイソブタン、ならびに可溶性気体および／または不溶性気体の混合物を包含するが、これらに限定されない。本発明に有用であるミクロスフェアは、加熱したペルフルオロアルカン蒸気の存在下で形成されることでさらに特徴づけられる。用語「ペルフルオロアルカン」は、部分的にもしくは全体的にフッ素置換された直鎖または分岐鎖炭化水素を意図し、そしてＯ、ＯＨ、Ｓ、ＮＯなどのような他の置換基を随意に含み得る。ペルフルオロアルカンは、好ましくは比較的高い（すなわち、標準圧力で20℃を越える）沸点を有する。ペルフルオロプロパン、ペルフルオロヘキサン、およびペルフルオロヘプタンが好ましい。用語「蒸気」は、液体温度を沸点より高くに上昇させることにより形成される、その液体の気相を意味する。加熱したペルフルオロアルカン蒸気は、形成およびそれに引き続く冷却の間にシェル形成タンパク質と相互作用し、得られるミクロスフェアシェルを水性外部に対してより浸透性でなくする。これは、内部気体コアと周囲の水性環境との間の接触を防ぐのに役立ち、このことは、特に気体コアが可溶性気体を含む場合、気体が水性環境に可溶化されるようになることを防ぐ。可溶化に起因する気体コアの損失の効果は、圧不安定性として観測される。本発明のミクロスフェアは、加熱されたペルフルオロアルカン蒸気の存在下で形成されない相当するミクロスフェアについて予期される耐圧性を越える耐圧性を示す。ペルフルオロアルカンについて記載された特性（すなわち、沸点、熱容量、蒸気密度、および分子量）に類似の特性を有する他の炭化水素もまた、本発明中に含まれる。ミクロスフェアは、気体および加熱したペルフルオロアルカン蒸気（本明細中では集合的に「気相」と呼ばれる）をまず混合することによって形成される。次いで、この混合物は、それが適切なミクロスフェア形成装置（通常、超音波処理チャンバーまたはコロイドミル）においてタンパク質溶液と接触させられるまで、高い温度、好ましくはペルフルオロアルカンの沸点を越える温度、そして好ましくはシェル形成タンパク質の熱変性温度に近い温度で維持される。あるいは、気体および加熱したペルフルオロアルカン蒸気は、別々に導入され得る。「沸点」は、所定の圧力でペルフルオロアルカンが液相から蒸気相に移動する温度を意図する。ペルフルオロアルカンが高い圧力で保たれる場合、この沸点は、１atmでの沸点より必ず高い。別に指示されない限り、本明細書で用いられる用語「沸点」は、１atmでの沸点を意図する。ミクロスフェアは、シェル形成タンパク質を十分に加熱および不溶化するのに十分な高温度で空洞化して気相をカプセル化することによって形成される。ミクロスフェア形成の間の温度が、ペルフルオロアルカン蒸気が液化する温度より高いことも重要である。ミクロスフェアが形成された後、その後の、ミクロスフェア形成後にペルフルオロアルカン蒸気の沸点（ペルフルオロペンタンについては 29℃、ペルフルオロヘキサンについては60℃、およびペルフルオロヘプタンについては80℃）より低く冷却する工程は、疎水性バリアーとして作用させるために、シェルタンパク質中に蒸気の少なくとも一部を液化させる。このバリアーは、気体-シェル界面でのペルフルオロアルカンの液体単層もまた含み得る。疎水性バリアーを形成することに加えて、ペルフルオロアルカン分子は、一般的に気体分子（特に低分子量の可溶性気体の分子）に比して大きく、そしてさらに、シェル内の空間を占めること、および気体拡散に対する物理的バリアーとして作用することによって外部の水性環境からコアを隔離するために作用する。さらに、高沸点ペルフルオロアルカンの蒸気はまた、空気のようなより低い密度の気体に比して高い熱容量を有する。この特性によって、蒸気による空洞化プロセスへのさらなる熱の輸送が可能になり周囲のタンパク質の熱変性を増強する。従って、加熱したペルフルオロアルカン蒸気の存在によるより高い度合いの局所的なタンパク質変性に起因して、より多くのタンパク質分子が、シェル形成プロセスの間にシェル中に取り込まれる。これらのより厚いかまたはより高密度のタンパク質シェルは、エコー原性およびインビボ安定性の点においてより優れた特性を生じ、そしてさらに気体コアの周囲媒体への曝露を限定することに貢献もする。さらに、ペルフルオロアルカン蒸気による疎水性性質およびペルフルオロアルカン蒸気により提供される熱はまた、タンパク質鎖が熱変性およびシェル形成を経るにつれて疎水性基の内向き配向および親水性基の外向き配向が導かれることにより、シェル物質が新たな外部特性を有するように形成されることを可能にする。このことは、心筋および他の器官の循環血管の壁との相互作用の、予期しない規定特性を有するタンパク質ミクロスフェアを作製する。高沸点ペルフルオロアルカンの加熱した蒸気の存在下で調製した気体充填タンパク質ミクロスフェアは、インビボで試験される場合、心臓の区画(chamber)を通して洗浄した後心筋に長く残存する。気体のみで調製されたタンパク質ミクロスフェアは、心拍出によって左心室から除去された後心筋組織に残存しない。多すぎるペルフルオロアルカン添加物の導入は、個々のミクロスフェアの密度を高め、負の浮遊性粒子を生じる。その負の浮遊性粒子は、数時間で１％アルブミン中で懸濁液から分離して沈殿する。これらの負の浮遊性粒子は、過剰量の液体ペルフルオロアルカンを含む。多すぎる液体ペルフルオロアルカンの存在は、不安定で、不確定な、そして不規則なサイズのミクロスフェアを生じ得る。そのようなミクロスフェアの負の浮遊性調製物は、直径10μｍを越える粒子を濾過させる肺を効率的に通過しない。肺を通過し得ない物質は、静脈内超音波造影剤としては効果的でない。従って、本プロセスで用いられるペルフルオロアルカン蒸気の量は、負の浮遊性を生じることなく圧力安定性を増強するのに十分でなければならない。導入されるペルフルオロアルカンの量はその分子量に依存する。分子量が大きければ大きいほど、負の浮遊性ミクロスフェアを形成することなく導入され得るペルフルオロアルカンはより少なくなる。適切な量は、導入される「気相」（すなわち、気体およびペルフルオロアルカン蒸気の総量）の体積／体積(v/v)パーセントとして表され得る。ペルフルオロペンタンについては、この量は約20〜50 ％；ペルフルオロヘキサンについては、この量は約10〜20％；そしてペルフルオロヘプタンについては、この量は約7〜15％である。他のペルフルオロアルカンの適切な量は、浮遊性および耐圧性に基づいて容易に決定され得る。必要な量は、選択されたコア気体とは相対的に独立していることもまた理解される。本発明のミクロスフェアは、コアが可溶性気体である場合、予想外に増強された耐圧性を示す。ミクロスフェアを、気相として50％空気および50％のペルフルオロプロパンガスまたはペルフルオロペンタン蒸気のいずれか(v/v)で調製する場合、これらのミクロスフェアは、約１×10⁷ミクロスフェア/mLの相当サンプルについて圧力10psiに対する同じ耐性を示すことが期待される。これは、コア中の空気の溶解性またはシェルを通じての拡散が、ペルフルオロアルカンの存在により減少すると予想されないためである。従って、等量の空気を用いて作製されるミクロスフェアは、空気画分のみを可溶化するのに十分な圧力にさらされた後、空気画分を失いそして部分的な破壊を受けることが予期される。しかし、本発明のミクロスフェアは、圧力に対し予想外の耐性を示す。予想に反して、50％空気および50％ペルフルオロプロパン蒸気(v/v)を用いて作製されるミクロスフェアは、圧力10psiに対しほぼ完全な耐性を示す。逆に、50％空気および50％ペルフルオロプロパンを用いて調製されるミクロスフェアは、空気画分の損失により部分的な崩壊を示す。ペルフルオロプロパンを用いて調製されるミクロスフェアは、圧力10psiに対し耐性である（実施例２を参照のこと）。ミクロスフェアは、滅菌した水性の注射用ビヒクル中で、懸濁液の形態で使用される。そのようなビヒクルは、薬学的処方物の分野で周知である。懸濁液中のミクロスフェアの濃度は、懸濁媒質１mLあたり、通常１×10⁷〜１×10¹⁰個の範囲であり、より通常には１×10⁸〜１×10⁹個の範囲である。生理食塩水溶液中１％ヒト血清アルブミンは、好ましいビヒクルである。懸濁液中にある場合、ミクロスフェアは単分散され、そして合体しない。懸濁液は、使用まで好ましくは４ ℃〜23℃で保管される。当然、ミクロスフェアは、上記より濃縮された懸濁液またはより希釈した懸濁液で保存され得、次いで注入用に再処方され得る。ミクロスフェアは、熱不溶化可能タンパク質の水溶液と気相の混合物を、高い温度で超音波または機械的空洞化に供して、タンパク質に変性および気相のカプセル化を同時に引き起こし、続いて生成物を15℃〜18℃に冷却することによって作製される。溶液中のタンパク質の濃度は、約0.1％w/v〜10％w/vの範囲であり、好ましくは約１％w/v〜５％w/vであり、そして最も好ましくは約１％w/vである。コロイドミル中で起こるような、機械的空洞化が好ましい。あるいは、機械的空洞化は、気相またはタンパク質溶液のいずれかを、有用なサイズの範囲内のミクロスフェアを生成するのに適したサイズの孔(aperture)に強制的に通すことによって達成され得る。コロイドミルにおける機械的空洞化を用いることで、熱不溶化可能タンパク質の水溶液が、続く溶液の機械的空洞化の間に初期の変性温度を達成するのに必要な温度でミルに提供される。溶液中のタンパク質の変性温度は、普通50℃〜100℃の範囲である。変性温度は、文献中の熱タンパク質変性の表から、または任意の公知の方法によって経験的に得られ得る。例えば、経験的に変性温度を決定するためには、タンパク質溶液は水浴中で撹拌しながら加熱され得る。変性温度は、不溶性物質が最初に観察される温度である。変性温度は、タンパク質の性質、純度、および供給源、溶液中のタンパク質の濃度、pH、緩衝液、イオン強度、安定化剤の存在、ならびに化学的変性剤または界面活性剤の存在により影響を受けることに注意する。それゆえに、ミクロスフェアを生成するためにタンパク質が使用される環境におけるそのタンパク質の変性温度を決定することが必要である。所望であれば、界面活性剤または極性溶媒のような添加物が、変性が起こる温度を変えるために使用され得る。次の表は、上記のように経験的に決定した、いくつかの天然に存在するタンパク質の変性温度を示す。*TRIS=2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール **MES=2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 ***DTT=ジチオスレイトールタンパク質溶液/コア物質混合物を空洞化するために用いられる各装置は、溶液に対して発揮される機械的剪断力によって、タンパク質溶液の特定の量のさらなる加熱を引き起す。その熱は、気相界面でのタンパク質の局所的変性を引き起こすのに十分でなければならない。従って、タンパク質溶液が装置に導入される温度がそのような局所的熱変性を達成するように調整され得るように、装置によって引き起こされる温度上昇の量を決定することは重要である。詳細には、装置中の液体のバルク温度は、空洞化の直前の初期の変性温度に一致していなければならない。空洞化事象は、局在的にタンパク質を変性させるために必要な追加の熱を生成する。初期の変性温度は、タンパク質が変性する寸前だが溶液は変性したタンパク質を全く含まない温度として規定される。この温度は、変性温度のまさに下、代表的には１℃〜５℃下の温度である。必要であれば、初期変性温度が達成されることを可能にする温度まで、開始タンパク質溶液を装置に導入する前に予め加熱し得る。一旦タンパク質溶液の適切な開始温度が達成されると、溶液は例えば、約１： 20〜２：１、好ましくは約１：５〜１：１の気相：液体の範囲の容積対容積比で、気相を事前にタンパク質溶液に導入するまたは直接空洞化プロセスに導入することにより気相と組み合わされる。適切な気相：液体の比は装置の形状に依存し、そして最適な出力に調整され得る。気相およびタンパク質溶液は、組み合わされ、そしてミクロスフェアを生成する条件下で空洞化に供される。これは、高速ミキサー、ミル、フルイダイザーなどのような、機械的剪断および流体力学的空洞化が生成され得る装置を使用して達成される。好ましい装置は、コロイドミルである。使用され得る具体的なミル装置の例は以下のとおりである： Model #2 1/2（Bematek，Beverly，MA） Model W250V（Greerco，Hudson，NH） Model 2F（APV Gaulin，Everett，MA） Model L4R（Silverson，Chesham，UK） Model Polytron PT3000（Kinematica，Littaw，Switzerland）コロイドミルを使用する場合、回転子速度、ギャップサイズ、および気相：液体比は、生成物の特性（平均サイズ、サイズ分布、およびミクロスフェアの濃度）に影響を及ぼす主要なプロセスパラメータである。これらのパラメータは、所望の特性を有する生成物を提供するように経験的に調整される。ミルを通過した後、生成物は、代表的には15℃〜18℃に冷却される。この冷却工程は、ペルフルオロアルカン蒸気の一部のミクロスフェアシェルへの凝縮を生じる。生じるミクロスフェアはCoulter Multisizer II粒子計数機のような粒子計数機を使用してサイズ分けされ得る。本発明の方法は、心臓、肝臓、腎臓、および脳のような体組織または器官の従来の超音波画像化に有用である。より特定すると、本発明の方法は、ミクロスフェアの血管環流を介する、心筋組織のような組織または器官を画像化するために有用である。心筋画像化（および一般の器官環流）については、超音波検査はミクロスフェア懸濁液の投与の前に開始され、そして投与間および投与後に、そして心筋組織における画像強度が投与前の「ベースライン」の強度に戻るまで続けられる。その間に組織の画像強度が増加する期間は、時々「ウォッシュイン(was h-in)」といわれ、そして組織の画像強度がピークになる時からそれがベースラインに戻るような時間までの期間を「ウォッシュアウト(wash-out)」という。ウォッシュインおよびウォッシュアウトの間の超音波画像の特性（例えば、ピーク強度レベルおよびピーク強度に到達するのに必要な時間）は、検査される組織および器官の病理学的状態に関連し得る。従来の超音波画像化における使用については、ミクロスフェアの懸濁液は、ボーラスまたは一定期間（例えば、１分〜10分）にわたっての連続的注入のいずれかで、体重1kg当たり約0.005cc〜0.1ccで、末梢静脈に注射される。超音波エネルギーは、継続的または断続的（すなわちパルス状）のいずれかで、画像化されるべき組織／器官にかけられ、そして反射されたエネルギーは、従来の市販の超音波画像化装置を使用して収集され、そして画像に転換される。２次元(2-D)または多次元（例えば、３次元(3-D)）心エコー検査装置および手順が、画像を得るために使用され得る。このような手順および装置は、従来のものである。3-D画像を得るために使用される３つの技術は以下の通りである：第１に、標準トランスデューサーが断層撮影画像を収集するために使用される。トランスデューサーは、トラック上に設置され、そしてそれがトラックに沿って移動しながら画像を収集する。トラックに沿った移動の速度は規定され、その結果断層撮影画像間の間隔が知られる。次いで、断片(slice)の収集物は、3-D画像を得るために一緒に融合される。第２に、標準トランスデューサーもまた断層撮影画像を収集するために使用される。トランスデューサーの空間的位置を報告し得るセンサーが、トランスデューサーに接続される。その結果、種々の画像の相対的配向が知られ、そして画像が3-D画像を生成するために一緒に融合され得る。第３に、トランスデューサーは、エレメントの２次元配列からなる。エレメントの１次元配列は、断層撮影画像を獲得し得る；さらなる次元は、３次元でのスキャニングを可能にする。本発明の画像化方法は、動物モデルにおいて実施されている。これらの試験において、画像化方法において使用されるミクロスフェアは、優れた後方散乱を提供し、減衰を減少させ、そして試験されたいかなる気体充填ミクロスフェアよりも長いコントラスト効果の持続を示した。本発明は、さらに以下の実施例によって説明される。これらの実施例は、いかにしても、本発明を限定するようには意図されない。実施例実施例１：ミクロスフェアの調製コロイドミルは、機械的空洞化のプロセスによってアルブミンミクロスフェアを生成する。Gaulinミルは、20,000rpmで回転する２"の平面ディスクを使用する。回転子と固定子との間のギャップを、0.0017"に固定する。注射用の５％ヒト血清アルブミン溶液を、注射用のUSP生理食塩水で１％に希釈し、そして60℃の恒温水沿中に浸した1/4"ステンレススチールコイルを通して300mL/分でポンプで流す。温めたアルブミン溶液が、専用ポートを介してミル頭部に入る。すべての気体および蒸気供給ラインは、温度調節されたステンレススチールである。高圧シリンダーからの純粋な空気（または別の適切な気体）を専用ポートを通してミルに送達する。空気を、100cc/分の流速（これは、較正質量／流量メーターによりモニターされる）で、30psiに調節する。液体ペルフルオロペンタン(300mL)を弁が取り付けられた小さなスチールシリンダー中に注ぎ、そして温水浴(92℃）中に置く。ペルフルオロペンタン蒸気を30psiに調節し、そして100c c/分（1g/分）で第２の較正質量／流量メーターを通して指向させる。ペルフルオロペンタン蒸気を「Ｔ」で空気流と合流させる。蒸気と空気とを、ミル頭部のすぐ上流の温度調節された９"静的気体ミキサーの通路により混合する。熱電対は、気体/蒸気混合物の温度をモニターし、これを70〜90℃に維持する。液相および気相を、76.5℃±１℃の処理温度で、ミル中で合流させる。ミクロスフェアは、１％アルブミン溶液の懸濁液中での機械的空洞化によって形成される。生成物を、インライン冷却装置を通過させることによって、即座に15〜18℃ に冷却する。生成物は、冷却装置からガラス容器または収集バックに出現する。全部の液体懸濁液を冷蔵下で一晩貯蔵し、撹拌によって再懸濁し、そして個々のガラスバイアルまたはシリンジ中に充填する。生成物は、静置に際して密な白い浮遊相および透明の下相(undernate)に分離する。このプロセスに従って生成されるミクロスフェアは、４〜７ミクロンの平均サイズでの４〜９×10⁸/mLの濃度、および懸濁液1mL当たり70〜200mLの全気体容量を有する。ガスクロマトグラフィーのデータは、約0.5mg/mLのペルフルオロペンタン含量を示す。実施例２：ミクロスフェアの圧力安定性一定の範囲の異なる比率にわたって気相としてペルフルオロペンタン蒸気および空気を使用して、実施例１に従って調製した10の別々のロット由来のミクロスフェアを、通気したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に希釈して、600nmにおいて１の光学密度を有する懸濁液を得た。これは、約１×10⁷ミクロスフェア/mLに対応する。懸濁液を圧力キュベット中に置き、そして１分にわたる時間の関数として、光学密度をモニターした。雰囲気圧を最初の15秒間かけ、続いて次の15秒間に 10psiをかけた。最後の30秒間、圧力を解放し、雰囲気圧に戻した。圧力をかけることによって、ヘンリーの法則に従う気体コアの溶解度の増加が引き起こされる。空気（ペルフルオロペンタンよりずっと可溶性である）は、圧力をかけることによって非常により有効に溶液中に移動させられる。例えば、10 o，California)は、１×10⁷/mLにおいて10psiにより完全に破壊される（図１）。100％ペルフルオロプロパンで充填したミクロスフェアは、10psi加えた際の圧縮を示すが、圧力の解放に際して元の光学密度に戻る（図2)。気相として50％空気および50％ペルフルオロペンタンを用いて調製したミクロスフェアは、圧縮、および圧力解放に際しての不完全な回復を示す（図３）。空気画分は、周囲の溶液中に容易に溶解し、そして圧力の解放に際して再び入ることはない。これらのミクロスフェアの回復の程度は、存在する空気の画分に反比例する。気相として50％ペルフルオロペンタン蒸気および50％空気を用いて実施例１に従って調製したミクロスフェア、および耐圧性を上記のように決定した。これらのミクロスフェアは、予想外にも、10psiに供した後、ほぼ完全な回復を示した（図４）。より高い空気の比率を用いた調製物はまた、予想より大きい程度まで耐圧性を示す。図５は、気相中66％空気を用いて調製した空気：ペルフルオロペンタン蒸気ミクロスフェアのサンプルに対する10psiの効果を示す。これらのミクロスフェア調製物は、ほぼ完全な耐圧性を示す。空気画分が増加するにつれて耐圧性は減少するが、20％より多い、ペルフルオロペンタン蒸気の存在は、予想を越えて耐圧性を増強する。図６は、一定の範囲の調製物に対する圧力の効果を示す：０％、10％、25％、34％、50％、80％、および100％ペルフルオロペンタン蒸気。100％ペルフルオロペンタン蒸気を用いて調製したミクロスフェアは、負に浮遊性であり、そして10psiの圧力をかけることまたはその解放によって影響されない（すなわち、光学密度は変化しないままである）。液体は大部分非圧縮性であるので、このことは液体コアについて予想される。実施例３：左心室混濁形成のためのミクロスフェアのインビボにおける使用実施例１に記載のように（気相として50％ペルフルオロペンタン蒸気および50 ％空気）調製したミクロスフェア懸濁液1mLを、23kgの雄性目的繁殖イヌ雑種中に注射した。注射を、大腿静脈カテーテルを介して行い、続いて４〜８mLの生理食塩水をフラッシュした。薬剤は、15.8dBの画像明度におけるピーク変化を有して、完全な左心室混濁形成を生成した。この薬剤はまた、それぞれ1.0dBおよび0 .8dBのベースラインからのピーク変化を有して、隔壁および後壁心筋層を増強した。注射２分後において、左心室はベースラインの1.7dB上、および100％充填のままであった。後壁心筋層はベースラインの0.8dB上であり、そして隔壁においてはベースラインの3.9dB上であった。４分までに、心室および隔壁の両方の画像強度はベースラインに戻ったが、後壁はベースラインの0.2dB上のままであった。この薬剤の投与は、血行力学における有意な変化を引き起こさなかった。平均動脈圧における変化、および心拍数における変化は存在しなかった。動脈血液ガスまたはpHにおける有意な変化もまた存在しなかった。左心室の混濁形成は、注射後少なくとも４分間で観察された。注射後1.5分において、たとえ心室における混濁形成レベルがベースラインに戻っても、心筋層は混濁形成されたままであった。実施例４：心筋層のインビボにおける画像化効果実施例１に従って調製したミクロスフェア懸濁液は、心臓の標準的Ｂモード（基本的）画像化によって観測する場合、インビボにおいて強くそして持続的な超音波コントラストを示す。任意の心臓超音波像を使用し得るが、胸骨傍短軸像は、おおまかに中央断面像平面(midpoint cross sectional viewing plane)を可能にする。投与前は、左心室は濃灰色のおおまかに円状構造としてみえ、そして右心室は濃色の三日月状構造である。実施例１に従って作製した（気相として50％空気および50％ペルフルオロペンタン蒸気、平均直径５ミクロン）ミクロスフェア懸濁液0.5ccの麻酔したイヌへの静脈内注射に際して、ミクロスフェアは最初（数秒以内に）心臓の右心室に現れる。右心室の画像は、明るい白色にみえ、続いて、超音波源に近位である三日月型の頂部における明るい白色の縁を除いて、散在した黒い影（減弱）にみえる。数回の心拍の間に、白色物質は左心室中に旋回するように見え、左心室を完全に満たし、次いで心臓画像のより低い部分においてより多くの付影(shadowing)を生じる。ミクロスフェアは進行し、それらが冠状動脈から心筋血管系を満たすにつれて、心筋の灰色を実質的に明るくする。明るさの増加は、心室からの連続的な減弱（付影）のため、超音波源に最も近位の心臓組織の領域においてこの段階でのみ見られ得る。心室からの付影は、数秒間続き、心室を非常に明るい灰色にする。この段階で、心筋層は注射前の画像と強度において類似しており、そして注射前の画像よりずっと明るい灰色の影として観測される。ミクロスフェアは、まず右心室から空になり、次いで左心室から空になり、やがて心室をベースライン画像強度に戻す。注射の約３〜５分後、左心室では明るい灰色の「ドーナツ型」心筋層によって囲まれた濃灰色の円形として現われ、このことは、心臓組織の血管系中のミクロスフェアの持続を示す。明るくなった心筋層は、時間とともにゆっくりと薄くなり、約20〜30分間でベースライン強度に戻る。繰り返しの注射は、心拍、全身血圧、および動脈血液気体レベルに対する有害な効果が観測されることなしに、同じ結果を生じる。実施例５：インビボにおける器官環流 Hewlett Packard Sonos 1500機器で５MHz位相配列トランスデューサを使用して、３匹のラット、１羽のウサギ、および２匹のイヌの心臓の経胸郭、胸骨傍短軸像を、実施例１に記載のように調製したミクロスフェア懸濁液の静脈内注射後に、従来の超音波検査を使用して視覚的に評価した。これらの懸濁液は、ウサギおよびラットの心筋層(0.01〜0.1mL)、イヌの心筋層(0.5mL)、イヌの腎臓および肝臓(3.0mL)の延長した明るさを生じ、これは１〜３心拍の遠視野音響減弱に続いた。音響密度測定によって評価する場合は、心筋層のピーク輝度は、イヌ心筋層において７〜８dBの強度の変化、ウサギにおいて2.6dBの強度の変化、そしてラット心筋層において５〜6.4dBの強度の変化を示した。心筋層の輝度は、心室がクリアーになった後に持続した。この像は、明るくなった心筋層によって囲まれる中央におけるウォッシュアウトされた左心室を有して、ドーナツの像に例えられ得る。心筋層の視覚的輝度は、米国特許第4,957,656号に従って作製されたペルフルオロプロパン充填アルブミンミクロスフェアを用いた場合の0.5〜2.0分間と比較して、麻酔したイヌにおいて注射後約20〜30分間持続した。試験ミクロスフェア懸濁液のインビボスクリーニングにおいて測定した生理学的パラメータは、心拍数および平均動脈圧であった。動物被験体へのミクロスフェア懸濁液の投与後、生理学的に関連する変化は存在しなかった（５心拍/分または５mmHg以下）。臨床用末梢酸素濃度計によって測定した場合の、心拍数または平均動脈圧における変化も、動脈血酸素化における変化も、これらのミクロスフェア懸濁液を使用して、観測されていない。実施例６：音響特性微小泡(microbubble)型コントラスト剤は、気体の圧縮性のために、音響の後方散乱および減弱を提供する。しかし、これらの特性は、気体をカプセル化する固体シェルの存在によって改変される。種々の気体の圧縮性の差異はほとんど存在しないので、ミクロスフェアの内側における気体の差異は、音響特性にほとんど影響を有さないはずである。ミクロスフェア形成間のペルフルオロプロパン蒸気の存在がミクロスフェアシェルの物理的特性に影響を与えるかどうかを決定するために、実施例１に記載のように調製したミクロスフェア懸濁液(「試験」ミクロスフェア）の音響後方散乱および減弱を測定し、そして米国特許第4,957,65 6号に従って調製したペルフルオロプロパン充填アルブミンミクロスフェアクロスフェア，Molecular Biosystems，Inc.，San Diego，California)と比較した。ルチャンバーに加えた。ミクロスフェア懸濁液の均質性を保つために、サンプルチャンバーを温度制御水浴内に置き、そして25rpmで回転した。超音波突発波を放射するために、２つのPanametrics超音波トランスデューサ（中央周波数=2.25 MHzまたは5.0MHz）のうちのいずれか１つを、Panametrics Model 5800-101 Puls er/Receiverによって励起した。後方散乱された超音波を、トランスデューサで受信し、Pulser/Receiverにより検出し、そしてHewlett Packard Model 54505B デジタルオシロスコープによってデジタル化した。データ獲得プロセスをパーソナルコンピュータにより制御した。約50の後方散乱測定を各サンプルについて行い、そして複数のサンプルを各ロットから試験した。データ分析は、サンプルチャンバー内の深さの関数としての、積分した後方散乱力の対数を計算することを含んだ。各周波数においてデータに対する直線回帰を実施し、ｙ切片は散乱強度に比例し、そして勾配の大きさは試験ミクロスフェアの減弱に比例した。相関係数は2.5MHzで0.998であり、そして5.0MHzで0.994であった。試験ミクロスフェア懸濁液およびコントロールミクロスフェア懸濁液の音響後方散乱および音響減弱を計算した。これらの計算に、ミクロスフェア懸濁液のサイズ分布および濃度を含めた。その結果、ミクロスフェアのサイズおよび濃度とは独立している音響特性の比較がなされ得る。計算は、C.Church(J．Acoust．So c．Amer.，97(3)1510-1521(1995))によって記載される理論を用いて行った。粒子分析機を用いて測定したミクロスフェア懸濁液のサイズ分布および濃度に基づいた。２つの超音波周波数における減弱および後方散乱については、複数のロットのコントロールミクロスフェア懸濁液についての測定値および計算値の相関係数は、0.79〜0.98の範囲であった。この直線関係は、理論の妥当性を示した。この線の95％予測間隔を、2.25MHzおよび5.0MHzにおける減弱および後方散乱について決定した。試験ミクロスフェア懸濁液の後方散乱の計算値および測定値についてのデータ点は、両方の超音波周波数において予測間隔の外側になる。試験ミクロスフェア懸濁液の2.25MHzにおける減弱の計算値および測定値についてのデータ点もまた予測間隔の外側になった。この処方物の散乱強度および減弱は、等価なサイズ分布を有するコントロールミクロスフェアの散乱強度および減弱より統計的に有意に小さい。それゆえ、コントロールミクロスフェアの音響特性と比較しての試験ミクロスフェアの音響特性における観察される差異は、シェルの特性（例えば、厚さ、粘性、および/または剛性）における差異に帰因し得る。実施例７：従来の画像化対調和画像化の比較気相として50％ペルフルオロペンタン蒸気および50％空気を用いて実施例１に従って作製したミクロスフェア懸濁液(「試験」ミクロスフェア)を、米国特許第 4,957,656号に従って作製したペルフルオロプロパン充填アルブミンミクロスフェアの懸濁液と、従来の超音波画像化および調和画像化の両方を用いて比較した。従来の超音波画像化および調和画像化を用いて、イヌ心筋層を等価な用量の試験ミクロスフェアの注射後、実施例３に記載のように画像化した。画像を、試験ミクロスフェア懸濁液の投与前および投与後に得た。心筋層内の目的の領域（「 ROI」）を選択し、そしてこのROI内の画像強度を決定した。投与前のベースライン強度を減算した後のROIにおける投与後画像強度は29グレースケール単位であり、このことは従来の画像が試験ミクロスフェア懸濁液の投与後に増強されたことを示す。この実験を、調和画像化を用いて繰り返した。試験ミクロスフェア懸濁液の投与後に、画像強度の増強は観測されなかった。すなわち、画像強度は投与前のベースラインの強度を越えて増加しなかった。この実験は、試験ミクロスフェアが、調和画像化を用いて利用され得る共鳴特性を示さないことを実証する。比較して、コントロールミクロスフェア懸濁液は、調和画像化を用いて、画像の増強を示すことが報告されている。例えば、ペルフルオロプロパン充填アルブミンミクロスフェアが心筋層の調和画像を増強したことを報告した、Dittrichら(Abstract submitted to the American College of Cardiology，45th Annual Scientific Session，1996)を参照のこと。超音波コントラスト剤の分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための上記の態様の改変は、以下の請求の範囲内であることが意図される。本明細書中に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、これらの各刊行物、特許、または特許出願が、本明細書中で参考文献として具体的にそして個々に援用されるかのように、本明細書中で参考文献として援用される。

Claims

【特許請求の範囲】１．被験体の組織または器官を画像化する方法であって、以下の工程：（a）該被験体に、熱不溶化タンパク質のシェルによってカプセル化された気体コアを含むミクロスフェアの懸濁液を投与する工程であって、ここで該ミクロスフェアは、熱不溶化可能なタンパク質を加熱されたペルフルオロアルカン蒸気と接触させることによって形成される、工程；（b）該ミクロスフェアが、該組織または器官に到達しそしてそれらの中を灌流するために十分な長さの時間待つ工程；（c）超音波エネルギーを該被験体に適用する工程；および（d）該組織または器官から反射された該超音波エネルギーから超音波画像を作製する工程を包含する方法。２．前記組織または器官が、心筋層ならびに左心室腔および右心室腔を有する心臓であり、そして工程（b）は、前記ミクロスフェアが該心臓に到達し、該左心室腔を満たし、該心筋層を灌流し、該左心室腔から出て、そして該心筋層から出るために十分な長さの時間待つことをさらに包含する、請求項１に記載の方法。３．前記気体が、１大気圧で25℃にて１mLの水あたり0.01mL以上の気体の溶解度を有する、請求項１に記載の方法。４．前記気体が空気である、請求項３に記載の方法。５．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロペンタン蒸気である、請求項１に記載の方法。６．前記タンパク質がアルブミンである、請求項５に記載の方法。７．前記ペルフルオロペンタン蒸気が、前記気相の約20％〜50％（v/v）の間である、請求項５に記載の方法。８．前記ペルフルオロペンタン蒸気が前記気相の50％であり、そして前記タンパク質がアルブミンである、請求項７に記載の方法。９．前記気体が空気である、請求項８に記載の方法。１０．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロヘキサン蒸気である、請求項１に記載の方法。１１．前記タンパク質がアルブミンである、請求項１０に記載の方法。１２．前記ペルフルオロヘキサン蒸気が、前記気相の約10％〜20％（v/v）の間である、請求項１０に記載の方法。１３．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロヘプタン蒸気である、請求項１に記載の方法。１４．前記タンパク質がアルブミンである、請求項１３に記載の方法。１５．前記ペルフルオロヘプタン蒸気が、前記気相の約７％〜15％の間である、請求項１３に記載の方法。１６．前記ミクロスフェアが、１mLの懸濁液あたり１×10⁷〜１×10¹⁰の間のミクロスフェアの濃度で前記懸濁液中に存在する、請求項１に記載の方法。１７．前記ミクロスフェア懸濁液が、ボーラス注射として静脈内投与される、請求項１に記載の方法。１８．前記ミクロスフェア懸濁液が、少なくとも１分間の期間にわたり静脈内投与される、請求項１に記載の方法。１９．工程（d）が、２次元超音波画像を作製することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。２０．工程（d）が、３次元超音波画像を作製することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。２１．工程（c）が、連続超音波エネルギーを適用することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。２２．工程（c）が、パルス超音波エネルギーを適用することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。２３．工程（a）が、事前に満たされたシリンジから前記ミクロスフェア懸濁液を投与することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。２４．前記気体が、25℃および１大気圧にて１mLの水あたり0.01mL未満の溶解度を有する、請求項１に記載の方法。２５．前記気体がペルフルオロプロパンである、請求項２４に記載の方法。２６．熱不溶化タンパク質のシェルによってカプセル化された気体コアを有する、超音波画像化剤として有用なミクロスフェアを作製するためのプロセスであって、以下の工程：（a）気体および加熱したペルフルオロアルカン蒸気を含む気相と、熱不溶化可能なタンパク質の溶液とを混合する工程；（b）該タンパク質を熱不溶化することによってミクロスフェアを形成する条件下で該混合物を空洞化する工程；および（c）該ミクロスフェアを冷却して、該ペルフルオロアルカンの少なくとも１部分を該シェル中で液化させる工程を含む、プロセス。２７．前記気体が、１大気圧で25℃にて１mLの水あたり0.01mL以上の溶解度を有する、請求項２６に記載のプロセス。２８．前記気体が空気である、請求項２７に記載のプロセス。２９．前記タンパク質がアルブミンである、請求項２６に記載のプロセス。３０．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロペンタン蒸気である、請求項２６に記載のプロセス。３１．前記ペルフルオロペンタン蒸気が、前記気相の約20％〜50％（v/v）の間である、請求項３０に記載のプロセス。３２．前記ペルフルオロペンタン蒸気が前記気相の50％であり、そして前記タンパク質がアルブミンである、請求項３０に記載のプロセス。３３．前記気体が空気である、請求項３２に記載のプロセス。３４．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロヘキサン蒸気である、請求項２６に記載のプロセス。３５．前記ペルフルオロヘキサン蒸気が、前記気相の約10％〜20％（v/v）の間である、請求項３４に記載のプロセス。３６．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロヘプタン蒸気である、請求項２６に記載のプロセス。３７．前記ペルフルオロヘプタン蒸気が、前記気相の約７％〜15％の間である、請求項３６に記載のプロセス。３８．前記アルブミンが、１重量％以上５重量％以下の濃度で前記タンパク質の前記溶液中に存在する、請求項２９に記載のプロセス。３９．前記空洞化が、超音波エネルギーを適用することによって生じる、請求項２６に記載のプロセス。４０．前記空洞化が、力学的エネルギーを適用することによって生じる、請求項２６に記載のプロセス。４１．ミクロスフェアの懸濁液を含む、超音波画像化剤として使用するための組成物であって、該ミクロスフェアは、タンパク質シェルによってカプセル化された気体コアを含み、ここで該ミクロスフェアは、加熱されたペルフルオロアルカン蒸気の存在下で形成される、組成物。４２．前記気体が、１大気圧で25℃にて１mLの水あたり0.01mL以上の気体の溶解度を有する、請求項４１に記載の組成物。４３．前記気体が空気である、請求項４１に記載の組成物。４４．前記タンパク質がアルブミンである、請求項４１に記載の組成物。４５．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロペンタン蒸気である、請求項４１に記載の組成物。４６．前記ペルフルオロペンタン蒸気が、前記気相の約20％〜50％（v/v）の間である、請求項４５に記載の組成物。４７．前記ペルフルオロペンタン蒸気が前記気相の50％であり、そして前記タンパク質がアルブミンである、請求項４６に記載の組成物。４８．前記気体が空気である、請求項４７に記載の組成物。４９．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロヘキサン蒸気である、請求項４１に記載の組成物。５０．前記ペルフルオロヘキサン蒸気が、前記気相の約10％〜20％（v/v）の間である、請求項４９に記載の組成物。５１．前記ペルフルオロアルカン蒸気がペルフルオロヘプタン蒸気である、請求項４１に記載の組成物。５２．前記ペルフルオロヘプタン蒸気が、前記気相の約７％〜15％の間である、請求項５１に記載の組成物。５３．前記ミクロスフェアが、10psiで耐圧性を示す、請求項４１に記載の組成物。５４．前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項４４に記載の組成物。５５．前記ミクロスフェアが、0.1〜10ミクロンの範囲の平均直径を有する、請求項４１に記載の組成物。５６．前記ミクロスフェアが、１mLの懸濁液あたり１×10⁷〜１×10¹⁰のミクロスフェアの濃度で前記懸濁液中に存在する、請求項４１に記載の組成物。５７．前記ミクロスフェアが、１〜５ミクロンの範囲の平均直径を有する、請求項４１に記載の組成物。５８．前記シェルが、特定の組織または器官を標的化する部分を含むように改変される、請求項４１に記載の組成物。５９．ミクロスフェアの懸濁液を含む、超音波画像化剤として使用するための組成物であって、該ミクロスフェアは、熱不溶化タンパク質のシェルによってカプセル化された50％気体および50％ペルフルオロペンタン（v/v）の気相を含む、組成物。６０．前記気体が空気である、請求項５９に記載の組成物。