JPH11507294A

JPH11507294A - 疎水性バリアを含む不溶性のガス充填マイクロスフェア

Info

Publication number: JPH11507294A
Application number: JP9501846A
Authority: JP
Inventors: ローマン，ロルフ
Original assignee: モレキュラーバイオシステムズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-29
Also published as: DE69616086T2; US5730955A; EP0871498B1; ATE206933T1; WO1996040283A1; US6063362A; ES2162080T3; CA2220706A1; AU6262296A; EP0871498A1; CA2220706C; DE69616086D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、マイクロスフェア殻内に液体または固体の疎水性バリアを含む、不溶性のガス充填圧力耐性マイクロスフェアを製造するプロセス、およびこのプロセスの産物に関する。このバリアは、マイクロスフェアとマイクロスフェアを取り囲む水性環境との間のガス交換の速度を減少するために供せられ、そしてそれ故ガス交換に起因する圧力耐性を増大する。

Description

【発明の詳細な説明】疎水性バリアを含む不溶性のガス充填マイクロスフェア関連出願に対する相互参照本出願は、同時継続中の出願、1995年６月７日に提出された米国特許出願第08 /477,510号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/477,510号は、1994年８月２日に提出された米国特許出願第08/284,782号の一部継続出願である。技術分野本発明は超音波造影の分野に関する。より詳細には、本発明は、超音波造影に有用なマイクロスフェアの疎水性を増加するプロセスに関する。殻(shell)によりカプセル化された不溶性ガスの微小泡を含むマイクロスフェアは、マイクロスフェアシェルの内部表面上に形成される液体または固体の疎水性バリアを含む、生体適合性の、両親媒性物質により構成される。このバリアは、マイクロスフェアとマイクロスフェアを取り囲む水性環境との間のガス交換の速度を減少するために供され、そしてそれ故ガス交換に起因する圧力不安定性に対する耐性を増加する。背景診断超音波造影は、音エネルギー波が目的の領域上に焦点合わせされ、そしてその像を生成するような方法で反射され得るという原理に基づいている。超音波トランスデューサーが、造影される領域の上に横たわる身体表面上に配置され、そして音波の形態にある超音波エネルギーをその領域に向かって方向づける。超音波エネルギーが身体を通じて進むにつれ、エネルギーの速度および身体組織の音響学的性質およびエネルギーに遭遇する物質が、超音波エネルギーの吸収の程度、散乱、透過および反射を決定する。次いで、トランスデューサーが、反射された超音波エネルギーの量および特徴を検出し、そしてデータを像に変換する。超音波が、１つの物質を通じて別の物質に移動するとき、界面である程度の反射がある。反射の程度は、界面を規定する物質の音響学的性質に関係する。これらの音響学的性質が、液体-固体、液体-液体または液体-ガス界面のように異なる場合、反射の程度が増大される。この理由により、ガスを含むコントラスト剤は、超音波を反射するとき、特に効果的である。従って、このようなコントラスト剤は、遭遇する物質の反射性の程度を強め、そして超音波造影の明瞭度を増大する。 OphirおよびParkerは、２つの型のガスを含む造影剤を記載している：(1)遊離ガス泡；および(2)カプセル化ガス泡(Ultrasound in Medicine and Biology 15( 4)：319-333(1989))、後者は、前者を用いて遭遇する不安定性および毒性問題を克服する試みで開発された。本明細書で以後「マイクロスフェア」と呼ばれるカプセル化されたガス泡は、タンパク質またはその他の生体適合性材料の殻により取り囲まれるガスの微小泡から構成される。１つのこのような造影剤は、空気 Biosystems,Inc.,San Diego,California)である。一般に、特定ガスのマイクロスフェアは、同じガスの遊離の泡と比較したとき、改善されたインビボ安定性を示す。しかし、しかし、大部分の泡は、造影剤としてのそれらの有用性を危うくする比較的短いインビボ半減期をなお有している。このインビボにおける不安定性は、マイクロスフェアからのガスの急速な拡散を生じる圧力下の殻の崩壊または破壊から生じると考えられていた。従って、多くの最近の努力は、インビボ安定性を増加する方法として殻に対する改良を中心としていた。タンパク質の殻を有するマイクロスフェアに関係する既知の改良は、界面活性剤を用いるタンパク質殻の被覆(Giddy,WO92/05806)、およびタンパク質殼の化学的架橋(Holmesら、WO92/17213)を含む。マイクロスフェア安定性を改良することに向けたさらなる努力は、非タンパク質性の殻を形成する材料の使用を含む。Bichonら(欧州特許出願458,745A1)およびSchneiderら(Inv.Radiol.27:134-139(1992))は、二酸化炭素、亜酸化窒素、メタン、フレオン、ヘリウムおよびその他の希ガスのような種々のガスをカプセル化する界面に沈着されたポリマーから作成されるポリマー「マイクロバルーン」の生産を記載する。Klaveness(WO92/17212)は、「空気、窒素、酸素、水素、亜酸化窒素、二酸化炭素、ヘリウム、アルゴン、六フッ化硫黄および低分子量の必要に応じてフッ素化された、メタン、アセチレンまたは四フッ化炭素のような炭化水素」をカプセル化する化学的に結合した非タンパク質性両親媒性成分の使用を記載する。Erbelら(米国特許第5,190,982号)は、ポリアミノ-ジカルボン酸-コ -イミド誘導体の使用を記載する。より最近、Schneiderら(米国特許出願第5,413,774号)は、特定の物理的性質を備えたガスを含むマイクロスフェアが改善された安定性を有することを示した。マイクロスフェア不安定性は、一旦マイクロスフェアが循環系中に導入されるとそれらが曝される圧力の増加により引き起こされることが理論付けられている。 Schneiderらは、彼らの増加した圧力耐性の観察に関係する機構について推察していないが、本発明者らは、これは、水性環境とのガス交換の速度に対するガス溶解度の影響に起因すると考えている。ヘンリーの法則によれば、溶液中の所定のガスの溶解度は、圧力が増加するにつれて増加する。溶液中のガスの泡が圧力を受けるとき、泡中のガスと周辺溶液との間のガス交換の速度は、圧力の量に比例して増加し、そしてガスの泡は、最終的に、完全に溶解するようになる。周辺溶液中の不溶性ガスが多くなるほど、泡が完全に溶解するようになるのにより長くかかる。ガスの泡が殻により取り囲まれる場合、即ち、マイクロスフェアの形態では、ガス交換の影響がなお観察される。何故なら、マイクロスフェアの殻がマイクロスフェア中のガスと周辺溶液との間の接触を完全に排除しないからである。それ故、溶液中に懸濁されたマイクロスフェアが圧力を受けるとき、マイクロスフェア内側のガスは、最終的に、周辺溶液中に溶解するようになり、これによりマイクロスフェアの崩壊が生じる。マイクロスフェアの中心にあるガスの周辺水性環境との交換を阻害するために、本発明は、マイクロスフェアシェルの内部表面上に固体または液体の疎水性バリアを形成することによりマイクロスフェアの疎水性を増加するためのプロセスを記載する。この方法により形成されたマイクロスフェアは、減少した水透過性、そしてそれ故ガス交換に起因する圧力不安定性に対して増加した耐性を示す。発明の開示本発明は、マイクロスフェアの全体の疎水性を増加する、マイクロスフェア殻の内部表面上の液体または固体の疎水性バリアを含む不溶性のガス充填マイクロスフェアを提供する。特に、本発明は、少なくとも１つの生体適合性不溶性ガスの微小泡を取り囲む両親媒性の、生体適合性材料から形成される殻、およびこのマイクロスフェア殻の内部表面で形成される液体または固体の疎水性化合物バリアとを備えるマイクロスフェアを生成するプロセスを提供し、このバリアは、殻の透過性およびマイクロスフェアを取り囲む水性環境とのガス交換の速度を減少する。本発明では、本発明との使用に適切な生体適合性の不溶性ガスは、室温以上の沸点を有する疎水性の「シーラー(sealer)」化合物で飽和される。室温まで冷却するに際し、この疎水性化合物は、マイクロスフェアの疎水性の殻内部表面上に凝縮し、それによって、付加的な疎水性バリアを生成し、そしてマイクロスフェア殻の全体の疎水性を増加する。この疎水性化合物は不活性であり得、そして一連の炭化水素、ハロゲン化炭化水素またはパーフルオロカーボンのメンバーを含むが、これらに限定されない。この疎水性化合物は、直線上、分岐または環状の分子構造を有し得る。本発明に入る疎水性化合物は、水不溶性ガスにより導入されるとき、反応性であり得、そして殻のタンパク質中の反応性のアミノ酸側鎖に共有結合し得る。反応性材料のいくつかが、それがタンパク質性殻と共有結合する機会を有する前に、加水分解する場合、得られる加水分解産物もまた、マイクロスフェアの内部表面上に疎水性沈着物を形成し得、そしてシーラーとして作用する。あるいは、重合可能な、低沸点モノマーが、水不溶性ガスとともに導入され得る。本発明に入る疎水性モノマーは、マイクロスフェア内側で、必要に応じて化学的開始剤または光を用いる反応の結果として重合し、マイクロスフェアの内部表面上にポリマー層を形成する。形成されるポリマー材料は、置換されたポリエチレン、ポリスチレンなどを含むがこれらに限定されない。好ましいポリマー材料は、ポリアクリレートおよびポリメタクリレートを含む。上記の場合では、タンパク質を含む殻の内部表面に化学的および/または物理的に付着している疎水性の層が形成される。本発明の別の局面では、疎水性化合物は、タンパク質性殻内でスポンジ様構造を形成し、マイクロスフェア内の特定の空間またはすべての空間を占め、そして間隙内に生体適合性の不溶性ガスを含む。殻内に導入される疎水性化合物の量は、マイクロスフェア殻の水性環境への透過性を減少させるに十分な量である。殻の透過性における減少は、水性環境とのガス交換のより遅い速度を生じ、そしてマイクロスフェア増加した圧力耐性により証明される。不溶性ガスによりマイクロスフェア中に導入される疎水性化合物の量は、その蒸気分圧により制御され得る。液体の疎水性化合物を含む浴の温度を高めまたは低めることは、疎水性層のサイズを、それぞれ、増加または減少する。蒸気分圧は、疎水性化合物を含む浴の温度に依存する。例えば、不溶性ガスは、温度浴中に放置することにより75℃で維持されているパーフルオロデカリンを通してガスをバブリングすることによりパーフルオロデカリン(沸点は760mmHg で142℃)で飽和され得る。達成される蒸気分圧は約100mmHgである。次いで飽和されたガスを、１%ヒト血清アルブミンと混合し、キャビテーションプロセスによりマイクロスフェアを形成する。超音波処理により形成されるマイクロスフェアは、一般に、３〜５ミクロンの平均直径、および約20nmの殻厚さを有する。マイクロスフェアの透過性を減少させるために必要な疎水性化合物の特定の量は、疎水性化合物およびガスにより変化し、ガスは一般に疎水性化合物で飽和されるべきであり、約10〜約650mmHgの範囲、好ましくは約50〜約250mmHgの範囲の分圧を与える。増加する沸点とともに、シーラー化合物はより効果的になり、そしてそれ故、より少ない量が同じ安定化効果を得るために必要とされ得ることが予期される。この理由は、より高い沸点化合物が、マイクロスフェアの自然に疎水性の内部表面により強く吸着されることである。本発明の使用に適切なガスは、薬学的に受容可能でかつ不溶性であり、そして六フッ化硫黄、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパンおよびパーフルオロブタンなどを含むがこれらに限定されない。適切なマイクロスフェア殻材料は、タンパク質および合成アミノ酸ポリマーを含む。この物質は好ましくはタンパク質であり、そしてより好ましくはヒト血清アルブミンである。本発明のマイクロスフェアは、音波処理、粉砕(milling)装置を用いる機械的キャビテーション、またはエマルジョン技法のような従来のガス充填マイクロスフェアを作成するために用いられる既知の方法により作成され得る。発明を実施する様式不溶性ガスを含むマイクロスフェアは、可溶性ガスを含む等価なマイクロスフェアより圧力耐性であることが知られている。これは、周辺水性環境とのガスの交換速度が、不溶性ガスについて可溶性ガスより遅いからである。しかし、不溶性ガスでさえ、最終的には水性環境に逃れ、これは不溶性ガスを含むマイクロスフェアの寿命を短くする。本発明は、不溶性ガスを含むマイクロスフェアの安定性が、マイクロスフェア殻をより疎水性にし、水性環境がマイクロスフェアのガスコアと接触する能力を小さくすることにより改善され得るという発見に関する。これは、マイクロスフェア殻の内部表面上に液体または固体の疎水性バリアを生成することによりマイクロスフェアの疎水性を増加するマイクロスフェアを作成するプロセスを用いることにより達成される。このようなバリアは、本発明での使用に適切な不溶性ガスを、高温で、炭化水素またはパーフルオロカーボンなどのような疎水性化合物で飽和することにより生成される。次いで、マイクロスフェアを、従来のキャビテーション技法を用いて調製し、そしてガス中に飽和された疎水性化合物は、凝縮および/または殻物質と反応し、そしてマイクロスフェア殻の内部表面上に液体または固体の疎水性バリアを形成する。本発明における適切な疎水性化合物は、オクタン(沸点=126℃)またはイソオクタン(沸点=99℃)のような一般式Ｃ_nＨ_2n+2(ここでn=６〜12である)の炭化水素、パーフルオロペンタン(沸点=29℃)、パーフルオロヘキサン(沸点=60℃)、パーフルオロヘプタン(沸点=80℃)、パーフルオロオクタン(沸点=100℃)または1-ブロモパーフルオロオクタン(沸点=142℃)のような一般式Ｃ_nＦ_2n+2(ここでn=５〜12 である)の直線状または分岐パーフルオロカーボン、およびパーフルオロメチルシクロヘキサン(沸点=76℃)、パーフルオロデカリン(沸点=142℃)、およびオクタフルオロトルエン(沸点=105℃)のような環状パーフルオロカーボンを含むがこれに限定されない。本発明における不活性な疎水性化合物は、１Ｈ，１Ｈ-ヘプタフルオロ-1-ブタノール(沸点=96℃)、１Ｈ，１Ｈ,７Ｈ-ドデカフルオロ-1-ヘプタノール(沸点=170℃)のような過フッ素化アルコール、2,3,4,5,6-ペンタフルオロアニソールのようなエーテル、およびアルキルパーフルオロアルカノエートのようなエステルを含むがこれらに限定されない。反応性の疎水性化合物は、ヘキサノイルクロライド(沸点=152℃)のような、一般式Ｃ₂Ｈ_2n+1ＣＯＣｌ(ここでn=4〜10)またはパーフルオロオクタノイルクロライド(沸点=132℃)のような、一般式Ｃ_nＦ_2n+1ＣＯＣｌ(ここでn=２〜10)を有する直線状のアルキルトリフルオロアセテートまたはアシルクロライドのような活性エステル、およびペンタフルオロベンゾイルクロライド(沸点=159℃)のような環状化合物を含むがこれらに限定されない。テトラフルオロスクシニルクロライド、ヘキサフルオログルタリルクロライドおよびオクタフルオロアジポイルクロライドのような、二官能性でありかつタンパク質を含む材料と架橋し得る、いくつかのパーフルオロアルカン二酸の酸クロライドもまた、疎水性化合物として供し得る。本発明における重合可能な疎水性化合物は、ペンタフルオロスチレン( 沸点=140℃)のようなスチレン、アルキルアクリレート、ＣＨ₂=ＣＨＣＯＯＲ(ここでＲ=Ｃ_nＨ_2n+1またはＣ_nＦ_2n+1、ここで_n=１〜６)および対応するアルキルメタクリレートおよびフルオロアルキルメタクリレートを含むがこれらに限定されない。本発明にはアルキル-2-シアノアクリレートもまた含まれる。適切な殻物質は、両親媒性、即ち疎水性部分と親水性部分の両方を含まねばならない。それはまた、カプセル化されたガスのまわりに薄い層または皮膚を形成し得なければならず、それは、一般に、親水性基が外側に向き、そして疎水性基が内側に向く。マイクロスフェアが不溶性ガスを含むように生成されるとき、この配向は、マイクロスフェア形成の間に不溶性ガスの存在により増大されると考えられる。タンパク質殻はまた、必要に応じて、タンパク質、アミノ酸ポリマー、炭水化物、脂質、ステロール、または殻の剛直性、弾性、生分解性および/または生体分布特性を改変するために有用なその他の物質を取り込み得る。殻の剛直性はまた、例えば、照射を用いた架橋により増加され得る。タンパク質殻材料は、天然に存在するタンパク質および合成のアミノ酸ポリマーの両方を含み、本明細書では、両方が、一般に、「タンパク質」として記載された殻材料のクラスであるとして呼ばれる。天然に存在するタンパク質の例は、ガンマ-グロブリン(ヒト)、アポートランスフェリン(ヒト)、ベーターラクトグロブリン、ウレアーゼ、リゾチーム、および血清アルブミンを含む。合成アミノ酸ポリマーは、必要に応じて、疎水性および親水性アミノ酸の両方を同一または異なる鎖中に組み合わせるブロックまたはランダムコポリマーの形態であり得る。さらに、アミノ酸ポリマーは、必要に応じて、フッ素化され得る。本発明はまた、マイクロスフェアの外側殻物質への標的特異的部分の付着を意図する。本発明におけるマイクロスフェアは、マイクロスフェアの増加した安定性に起因するこのような標的特異的部分のための優れた送達賦形剤(vehicle)を提供する。このような増加したインビボ安定性は、投与の長い経路を経由する、標的特異的部分の標的器官または細胞への送達を確実にする。殻中の疎水性化合物の導入は、20℃を超える沸点を有する疎水性化合物で飽和された不溶性ガスの存在下高温でマイクロスフェアを形成することにより達成される。例えば、パーフルオロプロパンは、パーフルオロペンタン(沸点=30℃)、パーフルオロヘキサン(沸点=60℃)、パーフルオロヘプタン(沸点=80℃)、パーフルオロオクタン(沸点=100℃)またはパーフルオロデカリン(沸点=142℃)で飽和され得る。飽和されたガスは、浴温度を超える温度で維持され、そして１〜５％ヒト血清アルブミンと混合され、キャビテーション技法によりマイクロスフェアを形成する。炭化水素バリアを含むマイクロスフェアは、音波処理、粉砕装置を用いる機械的キャビテーション、またはエマルジョン技法のような、従来のガス充填マイクロスフェアを作成するために用いる公知の方法により作成され得る。このような技法は、本明細書に参考として援用される、米国特許第4,957,656号；第5,137,9 28号；第5,190,982号；第5,149,543号：PCT出願 WO/9217212；WO92/18164；WO91 /09629；WO 89/06978；WO 92/17213；GB 91/00247；およびWO 93/02712：および EPA第458,745号および第534,213号に例示されている。本発明における使用に適切なガスは、薬理学的に受容可能な、即ち、生体適合性かつヒトに対する毒性が最小であり、ならびに不溶性である。本明細書で用いられる用語「不溶性ガス」は、完全に不溶性であるガスおよびガスの混合物、ならびに小量の(20%v/v以下)空気のような可溶性ガスを含むガスの混合物を意図する。不溶性のガスは、水性環境とのガス交換の所望の遅い速度を達成するために必要である。用語「生体適合性」は、毒性の副産物を形成することなく、蒸発または代謝されるガスの能力を意味する。用語「ガス」は、ガスである、または造影が実施されている温度(代表的には通常の生理学的温度)で、または超音波エネルギーの付与に際し、ガスを形成し得る任意の化合物をいう。ガスは、単一の化合物または化合物の混合物であり得る。好ましくは、ガスは、水に不溶性であるパーフルオロカーボンであり、このことは、大気圧および25℃の温度で、水１mL あたり0.01mLのガスより少ない溶解度を意図する。本明細書における使用に適したパーフルオロカーボンガスの例は、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタンおよびパーフルオロイソブタンである。この程度の不溶性は、インビトロでの最大安定性およびインビボでの持続性を生じる。可溶性は、任意の適切な方法により測定され得る。例えば、Wen-Ya ng Wenら(1979)J.Solubility Chem.8(3)：225-246を参照のこと。本発明のプロセスにより作成されるマイクロスフェアはエコー源性であり(即ち、音波を反射し得る)、血液または組織の音響学的性質とは顕著に異なる音響学的性質を有する材料から構成される。マイクロスフェアの最大サイズ(平均直径)は、肺毛細管を通過するサイズにより規定される。ヒトの場合、そのサイズは代表的には、約10マイクロメーターより小さい。対応して、最小サイズは、超音波造影に代表的に用いられる超音波周波数で効果的な音響学的散乱を提供するサイズである。(周波数は造影の様式、例えば、経胸腔的、経食道、により異なり得、そして通常２〜12MHzの範囲である)。最小サイズは、代表的には、約0.1 マイクロメーターである。本発明で用いられるマイクロスフェアの代表的な平均サイズは、約２〜約７マイクロメーターである。このサイズは、必要であれば、造影される領域に到達する前に濾過されることなく(例えば、抹消静脈注入部位が用いられる場合)、毛細管を通じるそれらの通過を可能にする。従って、本発明におけるマイクロスフェアは、動脈または造影される領域中に直接に注入されることなく、組織を灌流し得、そして組織、器官および良く灌流された組織と乏しく灌流された組織との間の任意の差分の増大した像を生成し得る。従って、これらは、抹消静脈またはその他の身体の所定の領域中に注入され得、血管造影に必要な動脈注入よりかなり侵入的でない。マイクロスフェア懸濁液は、製造後、滅菌ガラスバイアル中に貯蔵され得、またはそれらは、マイクロスフェア懸濁液を投与する使用に準備されたシリンジ中に貯蔵され得る。本発明におけるプロセスにより作成されるマイクロスフェアは、広範な領域を造影するために用いられ得る。これらの領域は、心筋組織、肝臓、脾臓、腎臓、および現在超音波技法により造影されているその他の組織および器官を含むがこれらに限定されない。本発明におけるマイクロスフェアの使用は、このような現在得られ得る像の造影の増強を生じ得る。操作の方法に関して、本発明のマイクロスフェアの使用は、従来の超音波コントラスト剤の使用と同じであり得る。用いられるマイクロスフェアの量は、液体キャリア(水、糖溶液など)の選択、所望の混濁度の程度、造影されるべき身体の領域、注入の部位および注入の数を含む、多くの因子に依存し得る。しかし、すべての例では、十分なマイクロスフェアが液体キャリア中で用いられ、超音波走査の使用により識別し得る像の画質を高めることを達成する。従来のまたは調和超音波造影における使用のために、マイクロスフェアの懸濁液は、抹消静脈中に、ボーラスとしてまたは所定の時間にわたって連続的に注入する(例えば、１〜10分、約0.05〜0.5cc/kg体重で)のいずれかで抹消静脈中に注入される。超音波エネルギーは、連続的にまたは間欠的に(即ちパルスとして)のいずれかで、造影される組織/器官に付与され、そして反射されたエネルギーは、集められ、そして従来の市販の超音波造影装置を用いて像に変換される。二次元(2-D)または多次元(例えば、三次元(3-D))の超音波心臓検査装置および手順を用いて像を獲得し得る。このような手順および装置は公知である。3-D像を獲得するために用いられる３つの技法は以下のようである：第１に、標準的なトランスデューサーを用いて断層撮影像を収集する。トランスデューサーはトラック上に取り付けられ、そしてそれがトラックに沿って移動するにつれて像を収集する。トラックに沿った移動の速度は、断層撮影像間の間隔が既知であるように規定される。次いで、スライスの収集を一緒に組み合わせ3-D像を得る。第２に、標準的なトランスデューサーをまた用いて断層撮影像を収集する。トランスデューサーに、トランスデューサーの空間的位置を報告し得るセンサーが取り付けられる結果、種々の像の相対的配向が既知であり、そして像が一緒に組み合わされて3-D像を生成し得る。第３に、トランスデューサーは、要素の二次元アレイ(array)からなる。要素の１つの次元アレイが断層撮影像を得ることができ；別の次元が第３の次元における走査を可能にする。本発明は、以下の実施例によりさらに例示される。これらの実施例は、いかなる方法においても本発明を制限することを意図しない。本出願で参照される刊行物、特許、特許出願、および公開された特許明細書は、本明細書に、参考として本開示中に援用される。実施例１：機械的キャビテーションによるマイクロスフェアの作成方法 (A) ガスの飽和不溶性ガスを、疎水性化合物で、それを、一定温度の浴中に維持されている疎水性化合物に通じる溶解ガス分散チューブを経由してバブリングすることにより飽和させる。温度を適切なレベルまで調節し、必要な蒸気分圧を維持する。キャビテーションチャンバーに至るガスラインの温度は、疎水性化合物がチャンバーに到達する前にガス-蒸気混合物から凝縮することを防ぐために、浴温度またはそれ以上の温度に維持されねばならない。 (B) マイクロスフェアの調製５%のヒトアルブミン溶液(USP)を、連続的真空下で２時間脱気する。真空は、からの容器を上記(A)で記載したキャリアガスで満たすことにより解除する。溶液を、インライン熱交換器を経由したキャビテーションに際しアルブミンの局所的変性を達成するために必要な温度(約68℃)に調節し、そして約100mL/分で、コロイドミル、例えば、２インチコロイドミル(Greerco,Hudson NH，model W250V またはAF Gaulin，Everett，MA，model 2F)中にポンプで送る。ガス-蒸気混合物を、入口ポートのすぐ上流の液体送りに、約120〜220mL/分の流速で添加する。ローターと固定子との間の間隙を約2/1000インチに調節し、そしてアルブミン溶液を、約7000rpmで、約73℃のプロセス温度で連続的に粉砕する。このように形成されたマイクロスフェアの濃い白い溶液を、熱交換器によりすぐに約10℃の温度まで冷却し、そしてガラスバイアルに収集する。バイアルはすぐに密封する。実施例２：音波キャビテーションによるマイクロスフェアの作成方法 Cerny(米国特許第4,957,656号)により記載されるように、１％ヒト血清アルブミン(80mL/分の流速)を用いる連続的音波処理を実施する前に、42mL/分の流速でパーフルオロプロパンを、実施例１で記載のように34℃でパーフロオロヘキサンで飽和した。このように形成されたマイクロスフェアの濃い白い溶液を、熱交換器により急速に約10℃の温度まで冷却し、そしてガラスバイアル中に収集した。このバイアルをすぐに密封した。放置に際し、このマイクロスフェアは、白い上部層中に浮遊した。平均の粒子サイズは、8.5×10⁸濃度で3.6ミクロンであった。表Ｉは、この方法を用いて、異なるバッチ温度で、種々の疎水性化合物を用いたマイクロスフェアを調製したガス相中の予想された蒸気分圧を示す。実施例３：種々のマイクロスフェア調製物のインビトロ超音波効力超音波造影剤としての使用のためのマイクロスフェアの効力は、所定時間にわたる体温でのエコー源性を示すそれらの能力に基づいて予言され得る。以下の実験は、ほぼインビボ条件を近似する条件下で効力を試験するために設計された： 37℃で、空気で飽和された一定速度で連続的に攪拌される生理食塩水を800mL含む１リットルのプラスチックビーカー中に、マイクロスフェア懸濁液のアリコートをピペットで入れ、最終濃度を約１×10⁴マイクロスフェア/mLとした。エコー源性を、HP Sonos 100超音波機械、および５MHzのトランスデューサーを用いて試験した。試験は、超音波の連続的または間欠的適用下、30%の出力設定で実施した。像をビデオテープ上に記録し、そして種々の時間間隔で１セットの標準に対して像密度についてスコアした。表１１は、種々の浴温度に維持された異なる疎水性化合物で飽和されたパーフルオロプロパンガスを用い、実施例１中に記載されたように作成された種々のマイクロスフェア調製物の比較を示す。疎水性化合物なしで調製されたパーフルオロプロパン充填マイクロスフェアは、「コントロール」マイクロスフェアとして示されている。ガス流速は、意図される粒子サイズを考慮するために個々に調節された。平均粒子サイズ、濃度、および連続的または間欠的超音波処理下(5MHz トランスデューサー)のそれらの超音波信号の寿命が示される。間欠的な音波処理は、代表的には、15分毎に実施され、そして記録する間約10秒の継続期間を有していた。示されるように、疎水性化合物を用いて調製されたすべてのマイクロスフェア調製物は、増加したシグナル寿命を示した。実施例４：インビボ診断造影実施例１に記載のように調製されたマイクロスフェアを、以下のように診断造影で用いる：体重約25kgのイヌに対して、１mLあたり５×10⁷〜５×10⁹のマイクロスフェアを含む1.0mL容量のマイクロスフェア懸濁液を、0.3mL/秒の流速で、抹消(頭部)静脈中に注入した。心臓の像を、Hewlett Packard Sonos 1500(Andov er,MA)を用い、Bモードの超音波検査像を経胸腔的な5.0 mHzトランスデューサーを用いて得た。像を、手順を通じて30フレーム/秒のフレーム速度で記録し、そして後の処理のためにS-VHSテープ上に貯蔵した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．殻、および該殻内に含まれる疎水性バリアを有する、ガス充填圧力耐性マイクロスフェアの作成プロセスであって： (a) 不溶性ガスを、室温を超える沸点を有する疎水性化合物で飽和する工程； (b) 該飽和されたガスを、マイクロスフェア殼材料の溶液と、室温を超える温度で混合する工程； (c) キャビテーションによりマイクロスフェアを形成する工程；および (d) 該マイクロスフェアを該沸点未満に冷却し、該疎水性化合物を凝縮させて疎水性バリアを形成する工程、を包含する、プロセス。２．前記疎水性化合物が、一般式Ｃ_nＨ_2n+2(ここでn=６〜12である)の直線状若しくは分岐した炭化水素、または一般式Ｃ_nＦ_2n+2(ここでｎ=５〜12である)の直線状若しくは分岐したパーフルオロカーボン、または環状のパーフルオロカーボン、または過フッ素化アルコール若しくはエーテル、または一般式Ｃ_nＨ_2n+1 ＣＯＣｌ(ここでn=４〜10)のアルキルトリフルオロアセテート若しくはアシルクロライド、または一般式Ｃ_nＦ_2n+1ＣＯＣｌ(ここでn=４〜10)の過フッ素化アシルクロライド、または重合可能なスチレン若しくはＣＨ₂=ＣＨＣＯＯＲ(ここでＲ=Ｃ_nＨ_2n+1若しくはＣ_nＦ_2n+1、ここでn₌１〜６)および対応するアルキルメタクリレートおよびフルオロアルキルメタクリレートである、請求項１に記載のプロセス。３．前記疎水性化合物がパーフルオロペンタンである、請求項１に記載のプロセス。４．前記疎水性化合物がアルキルアクリレートである、請求項１に記載のプロセス。５．前記疎水性化合物がアルキルメタクリレートである、請求項１に記載のプロセス。６．前記ガスがパーフルオロカーボンガスである、請求項５に記載のプロセス。７．前記バリアが、前記マイクロスフェア殼の内部表面に共有結合する層である、請求項１に記載のプロセス。８．前記バリアが、前記マイクロスフェア殼の内部表面上に凝縮する不活性層である、請求項１に記載のプロセス。９．前記バリアが、前記マイクロスフェア殻の内部表面上に形成される重合された層である、請求項１に記載のプロセス。１０．前記バリアが、前記マイクロスフェア殻内に形成される、スポンジ様構造である、請求項１に記載のプロセス。１１．前記キャビテーションが機械的に達成される、請求項１に記載のプロセス。１２．前記キャビテーションが音波処理により達成される、請求項１に記載のプロセス。１３．前記キャビテーションがコロイドミルの使用により達成される、請求項１に記載のプロセス。１４．少なくとも１つの標的特異的成分を、前記マイクロスフェア殻に共有結合する工程をさらに包含する、請求項１に記載のプロセス。１５．請求項１に記載のプロセスに従って作成されたマイクロスフェア懸濁液を含む超音波造影剤として使用するための組成物。