MXPA97009564A - Emulsiones de gas estabilizadas con eteres fluorados que tienen coeficientes bajos de ostwald - Google Patents

Abstract

Las emulsiones de gas de larga duración para la mejora del contraste de la reproducción de imágenes de ultrasonidos y de resonancia magnética utilizan compuestos de fluoromonoéteres y fluoropoliéteres con coeficientes bajos de Ostwald. Las emulsiones de gas que comprenden preparaciones de microburbujas en donde las microburbujas contienen fluoroéteres como perfluorodiglime (CF3(OCF2CF2)2OCF3), perfluoromonoglime (CF3OCF2CF2OCF3),éter perfluorodietílico C2F5OC2F5,éter perfluoroetilmetílico CF3OC2F5,éter de perfluorodimetilo CF3OCF3, asícomo CF3OCF2OCF3, y fluoropoliéteres CF3(OCF2)2OCF3, CF3(OCF2)3OCF y CF3(OCF2)4OCF3.

Description

EMULSIONES DE GAS ESTABILIZADAS CON ÉTERES FLUORADOS QUE TIENEN COEFICIENTES BAJOS DE OSTWALD ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la Invención La presente invención incluye un método para preparar emulsiones de gas estables, de larga vida para mejora del contraste de ultrasonidos y otros usos y para composiciones de las emulsiones de gas así preparadas. Además, la presente invención incluye precursores para preparar dichas emulsiones. 2. Antecedentes del Arte La tecnología de ultrasonidos proporciona una alternativa importante y más económica para las técnicas de reproducción de imágenes las cuales emplean radiación ionizante. Aunque numerosas tecnologías de reproducción de imágenes convencionales están disponibles, por ejemplo, reproducción de imágenes de resonancia magnética, tomografía computarizada (TC) y tomografía de emisión positrónica (TEP) , cada una de estas técnicas emplean equipo extremadamente caro. Además, la TC y la TEP utilizan radiación ionizante. A diferencia de estas técnicas, el equipo de reproducción de imágenes de ultrasonidos es relativamente económico. Además, la reproducción de imágenes de ultrasonidos no emplea radiación ionizante. La reproducción de imágenes de ultrasonidos hace uso de las diferencias en la densidad y composición de los tejidos que afectan la reflexión de ondas sonoras por esos tejidos.

Las imágenes son especialmente nítidas cuando hay distintas variaciones en la densidad o compresibilidad de los tejidos, como en las zonas interfaciales de los tejidos. Con el ultrasonido se reproducen fácilmente las imágenes de las zonas interfaciales entre los tejidos sólidos, el sistema esquelético y varios órganos y/o tumores. En consecuencia, en muchas aplicaciones de reproducción de imágenes, el ultrasonido se realiza de una manera adecuada sin el uso de agentes de mejora del contraste; sin embargo, para otras aplicaciones, como la visualización de la sangre fluyendo, se han hecho esfuerzos progresivos para desarrollar estos agentes a fin de proporcionar la mejora del contraste. Una aplicación particularmente importante para estos agentes de contraste es en la área de reproducción de imágenes de perfusión. Dichos agentes de contraste de ultrasonidos podrían mejorar la reproducción de imágenes de la sangre fluyendo en el músculo del corazón, ríñones, hígado y otros tejidos. Esto, a su vez, facilitaría la investigación, diagnóstico, cirugía y terapia en relación con las imágenes reproducidas de los tejidos. Un agente de contraste de la sangre permitiría también la reproducción de imágenes en base al contenido de la sangre (por ejemplo, tumores y tejidos inflamados) y ayudaría en la visualización de la placenta y feto mejorando sólo la circulación materna. Se ha propuesto una gran variedad de agentes de mejora del contraste de ultrasonidos. Los más satisfactorios han consistido generalmente en dispersiones de pequeñas burbujas de gas que pueden inyectarse en forma intravenosa. Las burbujas son inyectadas al flujo sanguíneo de un cuerpo viviente cuya imagen será reproducida proporcionando con ello una emulsión en la sangre fluyendo que es de una densidad diferente y una compresibilidad mucho más alta que el tejido líquido y la sangre circundantes. Como resultado, la imagen de estas burbujas puede reproducirse fácilmente con el ultrasonido. Desafortunadamente, ha sido difícil la creación de burbujas que son dispersores de ultrasonidos efectivos in vivo . Varias explicaciones son aparentes. En primer lugar, estas burbujas tienden a contraerse rápidamente debido a la difusión del gas ocluido en el líquido circundante. Esto es especialmente cierto en burbujas que contienen aire o sus gases componentes (como el nitrógeno) los cuales son altamente solubles en agua. Podría esperarse que el tiempo de vida de las burbujas puede mejorarse aumentando simplemente el tamaño de las burbujas así más gas tiene que escapar antes de que las burbujas desaparezcan. Sin embargo, se ha probado que este método es insatisfactorio debido a que las burbujas más grandes que 10 µm de diámetro son eliminadas del flujo sanguíneo por los pulmones, evitando su circulación más lejos. Además, las burbujas más grandes no pueden circular a través de vasos sanguíneos y vasos capilares más pequeños. Las microburbujas con rendimiento ip vivo satisfactorio también deberán poseer características biológicas ventajosas. En primer lugar, los compuestos que forman el gas adentro de las microburbujas deberán ser biocompatibles. Finalmente, las microburbujas que contienen la fase gaseosa se desintegrarán y la fase gaseosa será liberada a la sangre como un gas disuelto o como gotas submicrométricas del líquido condensado. Por lo tanto, los gases serán eliminados principalmente del cuerpo a través de la respiración pulmonar o a través de una combinación de respiración y otras vías metabólicas en el sistema reticuloendotelial . Aun cuando la persistencia de las burbujas es suficiente para permitir varias pasadas a través del sistema circulatorio de un animal o humano, la absorción de microburbujas por las células fagocíticas reticuloendoteliales del hígado puede limitar la efectividad del agente de contraste. Las reacciones adversas del sistema inmune también pueden reducir los tiempos de vida in vivo de la burbuja y deberán evitarse. Por ejemplo, se ha demostrado que las microburbujas "desnudas" producen respuestas adversas como la activación del complemento (Ver, por ejemplo, K.A. Shastri y otros (1991) Undersea Biomed.

Res . , 18, 157). Sin embargo, como se sabe en el arte, estas respuestas no deseadas pueden ser reducidas a través del uso de agentes encapsulantes adecuados. En consecuencia de ello, los esfuerzos por mejorar el tiempo de vida in vivo de las microburbujas han incluido el uso de la estabilidad y por lo tanto los diversos materiales encapsulantes. Por ejemplo, se han usado gelatinas o microesferas de albúmina que se forman inicialmente en suspensión líquida y las cuales atrapan gas durante la solidificación. También se ha explorado el uso de surfactantes y agentes estabilizadores para dispersiones de burbujas de gas, como en las Patentes Estadounidenses Números 4,466,442 de Hilmann y otros y 5,352,436 de heatley y otros. Algunos agentes de mejora del contraste que contienen surfactantes atrapan burbujas de gas en el núcleo acuoso de liposomas como en la Patente Estadounidense Número 5,334,381 de Unger y la Patente Estadounidense Número 4,900,540 de Ryan y otros.

Recientemente, los efectos del gas atrapado en el tiempo de vida de las burbujas han recibido mayor atención.

Además del aire y sus componentes, se han usado varios gases nobles como el criptón y el argón. Actualmente la atención se ha enfocado en gases biocompatibles que tienen poca solubilidad en el agua. Se ha demostrado teóricamente que la poca solubilidad es un factor importante en la estabilidad de las burbujas de gas. En Epstein y Plesset, On the Stability of Gas Bubbles in Liquid-Gas Solutions (En la Estabilidad de Burbujas de Gas en Soluciones de Líquido y Gas) , (1950) J". Chem. Phys . 18(11), 1505-1509, la velocidad de contracción de las burbujas de gas se derivó como una función de la densidad de gas, solubilidad y difusividad en el medio circundante. También se ha demostrado que la estabilidad de las emulsiones de dos líquidos aumenta con la solubilidad decreciente de la fase dispersa (Kabalnov y Shchukin, Ostwald Ripening Theory: Applications to Fluorocarbon Emulsión Stability, Advances in Colloid and Interface Science, 38:69-97, 1992). Con ciertas suposiciones de simplificación, la fórmula de Epsteín y Plesset conduce a la fórmula para el tiempo de vida de las burbujas (t) dado por Quay en la Patente Estadounidense 5,393,524: t a p/DC (1) donde p es la densidad del gas atrapado, D es la difusividad del gas en el medio circundante y C es la solubilidad del gas en el medio circundante. Basado en esta fórmula, Quay forma burbujas usando gases seleccionados en la base de ser un gas a presión atmosférica (37°C) y tener solubilidad en agua reducida, densidad más alta y difusividad de gas reducida en la solución en comparación con el aire. En la misma vena, Schneider y otros en EP0554213A1 revelan gases elegidos en la base de poca solubilidad en el agua y alto peso molecular. Específicamente los gases revelados incluyen SF6 y SeF6, así como varios hidrocarburos perfluorados. A pesar de que la solubilidad en agua y difusividad reducidas pueden afectar la velocidad a la cual el gas sale de la burbuja (según lo originalmente pronosticado por Epstein y Plesset) , los criterios de selección de gases de Quay y Schneider son inexactos en que dan como resultado la inclusión de ciertos gases inadecuados y la exclusión de ciertos, gases óptimamente adecuados. Por ejemplo, en la Patente Estadounidense Número 5,393,524, Quay sugiere la elección de gases de microburbujas en base a un cálculo del valor de Q para el gas propuesto, en donde: Q = 4 x 10'7 x p/DC (2) p es la densidad del gas (kg/m3) , C es la solubilidad en agua del gas (M) y D es la difusividad del gas en la solución (cm2/s) . Quay explica que el valor de Q deberá ser por lo menos de 30 para ser un gas útil para la mejora del contraste de ultrasonidos. Un estimado usando datos de solubilidad en agua de literatura (E. ilhelm, R. Battino y R.J. Wilcock, Chemical Reviews, 1977, v. 77, pág. 219) muestra que los valores de Q de prácticamente todos los gases conocidos (con la excepción del hidrógeno y el helio) se aproximan a este valor o lo exceden. A 25 grados C, el oxígeno por ejemplo, tiene un valor de Q de 20 y el nitrógeno tiene un valor de Q de 35. La revelación de Quay, por lo tanto, proporciona poca orientación para la selección de gases de microburbujas efectivos. Además, el criterio del coeficiente Q de Quay, así como la revelación de Schneider en EP0554213A1 dejan de considerar ciertas causas importantes de la contracción de las burbujas, especialmente, los efectos de la tensión superficial de las burbujas, los efectos de surfactantes y agentes osmóticos gaseoso y el potencial para la condensación del gas de relleno a líquido. Sobre todo, la presión parcial del gas de relleno debe ser lo suficientemente alta para oponerse al exceso de presión de Laplace adentro de las burbujas. Si la presión de vapor saturado es baja, el gas de relleno puede condensarse a líquido y la habilidad de contraste se perderá.

En consecuencia, existe la necesidad en el arte de agentes de mejora del contraste estabilizados que sean biocompatibles, se preparen fácilmente y proporcionen una excelente mejora de contraste in vivo en la reproducción de imágenes de ultrasonidos. También existe la necesidad de precursores de microburbujas y métodos para preparar y usar estos agentes de mejora del contraste. Sumario de la Invención La presente invención utiliza compuestos de fluoroéteres con coeficientes bajos de Ostwald para proporcionar emulsiones de gas de larga duración comprendiendo preparaciones de microburbujas para la mejora del contraste de reproducción de imágenes de ultrasonidos y de resonancia magnética. Cuando las preparaciones de microburbujas se hacen usando los compuestos de la presente invención, pueden obtenerse imágenes del corazón y otros órganos internos de una duración más larga que la que haya sido posible antes. En esta invención, las emulsiones de gas que comprenden una clase previamente no incluida de compuestos los cuales combinan una solubilidad en agua reducida sin una presión de vapor saturado considerablemente reducida (y por lo tanto se revelan coeficientes sorprendentemente bajos de Ostwald) . La alta presión de vapor además ayuda a reducir la pérdida del contraste debido a la condensación del gas de relleno a líquido. Estos compuestos son monoéteres y poliéteres fluorados. Cuando los perfluoropoliéteres son comparados con sus análogos de perfluocarburos con el mismo número de átomos de carbono, la adición de oxígeno de éter no afecta de manera considerable la presión de vapor, mientras que la solubilidad en agua disminuye por un factor de aproximadamente 2-3. Esto es inesperado y sorprendente en que la conversión de hidrocarburo a éteres da como resultado aumentos considerables en la solubilidad en agua. Por lo tanto, se revela una emulsión de gas para la mejora del contraste de ultrasonidos que comprende una pluralidad de burbujas de gas en un medio líquido, con el gas comprendiendo un fluoromonoéter o fluoropoliéter, o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, el gas comprende un compuesto que tiene un coeficiente de Ostwald de menos de alrededor de 100 x 10"6 a 37 grados C, conduciendo a una mejora del contraste in vivo especialmente larga. Se ha encontrado que el vapor de éter de perfluorodietilo, éter de perf luorodimetilo, éter de perf luoromet iletilo , perfluoromonoglime , perfluorodiglime , c4G10O3 , C5F1204 , C6F1405 es especialmente conveniente. Las burbujas de gas de la presente invención pueden estar rodeadas por una capa de surfactantes la cual de preferencia comprende un primer surfactante y un segundo surfactante, el primer surfactante constando esencialmente de un fosfolípido o una mezcla de fosfolípidos teniendo por lo menos una cadena de acilos la cual contiene al menos 10 átomos de carbono y comprendiendo por lo menos alrededor del 5% w/w del surfactante total, con el segundo surfactante siendo más soluble en agua que el primer surfactante . Más preferentemente, el primer surfactante comprende una fosfatidilcolina con una o más cadenas de acilos, por lo menos una cadena conteniendo de 12 a 18 átomos de carbono y el segundo surfactante comprende una fosfatidilcolina con una o más cadenas de acilos, por lo menos una cadena conteniendo de 6 a 12 átomos de carbono. Además, en un aspecto amplio la presente invención proporciona precursores de microburbujas y métodos para formar emulsiones de gas. Las personas especializadas en el arte apreciarán que las preparaciones de microburbujas de la presente invención pueden prepararse empleando diferentes técnicas. Por ejemplo, las microburbujas pueden formarse usando los compuestos de fluoroéteres revelados en conjunto con polvos, microesferas de proteína, microesferas deshidratadas por aspersión, partículas que contienen huecos, particulados, liposomas, soluciones de azúcar saturada, etc.

Cada uno de estos materiales estructurales pueden además usarse para proporcionar precursores de microburbujas deshidratadas cuando un fluoroéter se dispersa en los mismos.

En la adición de un medio líquido, de preferencia agua, pueden formarse emulsiones de gas. En una realización preferida, las microburbujas son producidas mediante la deshidratación por aspersión de una formulación líquida que contiene un material membranógeno biocompatible para formar un polvo de microesferas de la misma, combinando las microesferas con los compuestos de fluoroéteres con coeficientes bajos de Ostwald revelados en el presente y mezclando una fase acuosa con el polvo. El polvo de microesferas se disuelve substancialmente en la fase acuosa para formar microburbujas. De preferencia, las microburbujas están cubiertas con una monocapa de surfactante. Además, la presente invención proporciona métodos de reproducción de imágenes, incluyendo reproducción de imágenes de ultrasonidos por armónicas empleando las emulsiones de gas reveladas. Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes para aquellas personas especializadas en el arte considerando la siguiente descripción detallada de las realizaciones ejemplares preferidas de la presente invención tomadas en conjunto con las Figuras las cuales se describirán primero de manera breve . Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una gráfica de la intensidad de la señal de impulsos Doppler in vivo como una función de tiempo de dos emulsiones de gas de fluoroéteres de acuerdo con la presente invención contra el aire. Las Figuras 2a, 2b y 2c son representaciones gráficas de la desintegración de señales de ultrasonidos con el tiempo después de la inyección de medios de contraste de emulsiones de gas a un conejo. Cada representación gráfica individual está arreglada de tal manera que las preparaciones de microburbujas que comprenden fluoroéteres sean comparadas con las preparaciones de microburbujas del arte anterior que contienen análogos de fluocarburos . Las Figuras 3a, 3b y 3c muestran cada una dos imágenes de ultrasonido del corazón de cerdo antes de la inyección de los medios de contraste de burbujas (Fig. 3a) , 1 minuto (Fig. 3b) y 6 minutos (Fig. 3c) después de la inyección. En las Figuras, la imagen superior (distinta a las imágenes de control) se genera usando una preparación de microburbujas que comprende un perfluoropoliéter, C5F1204, mientras que la imagen inferior se generó usando una preparación de microburbujas que comprende perfluohexano, C6F14. Descripción Detallada de la Invención I. General Como se usan en el presente, las microburbujas se consideran burbujas de gas en un medio acuoso que tiene un diámetro entre alrededor de 0.5 y 300 µm, de preferencia teniendo un diámetro de no más de alrededor de 200, 100, ó 50 µm. Las microburbu as pueden o no tener una capa o recubrimiento en la zona interfacial de gas/líquido. Si está presente, el recubrimiento puede tener un espesor de una o más moléculas. Además, las microburbujas pueden ser ocluidas por una capa bimolecular (como en el caso de liposomas unilaminares) , o pueden ser ocluidas por varias capas de bicapas (vesículas multilaminares) . Las microburbujas de la presente invención también pueden estar rodeadas por estructuras concoideas más permanentes como las proteínas desnaturalizadas . Mientras que las emulsiones se caracterizan generalmente como una dispersión de dos o más fluidos inmiscibles estabilizados por una zona interfacial de surfactante, el surfactante conteniendo realizaciones de la presente invención, son en esencia emulsiones de gas, con la fase descontinua de la emulsión siendo un gas, y no un líquido. En consecuencia, el término "emulsión de gas", como se usa en el presente, comprende una dispersión de una pluralidad de microburbujas de gas en un medio acuoso con o sin una zona interfacial de surfactante. Es decir, las emulsiones de gas de la presente invención son simplemente preparaciones de microburbujas que comprenden un fluoroéter.

Para uso intravascular, el tamaño óptimo de las burbujas es determinado por dos asuntos relevantes. Las burbujas más pequeñas son efectivas en la circulación a través de vasos sanguíneos y vasos capilares pequeños, sin embargo la ecogenicidad de ultrasonidos depende totalmente del tamaño de las burbujas. Las microburbujas adecuadas para la mejora del contraste de ultrasonidos vasculares tienen por lo tanto, de preferencia, alrededor de 1 - 10 µm de diámetro; en especial se prefiere con 3-5 µm.

II. Selección de gases de microburbu as y combinaciones de gases El tiempo de vida corto de muchas preparaciones de microburbujas es causado en parte por la presión del gas aumentada adentro de la burbuja, lo cual resulta de las fuerzas de tensión superficial que actúan en la burbuja. Esta presión interna elevada aumenta conforme el diámetro de la burbuja es reducido. La presión interna del gas aumentada fuerza al gas adentro de la burbuja a disolverse, dando como resultado una desintegración de la burbuja cuando el gas es introducido a la fuerza a una solución. La ecuación de Laplace, ?P=2s/r (donde ?P es la presión del gas aumentada adentro de la burbuja, s es la tensión superficial de la película de la burbuja y r es el radio de la burbuja) , describe la presión ejercida en una burbuja de gas por la superficie o película de la burbuja circundante. La presión de Laplace es inversamente proporcional al radio de la burbuja; por lo tanto, cuando la burbuja se contrae, la presión de Laplace aumenta, aumentando la velocidad de difusión del gas afuera de la burbuja y la velocidad de contracción de la burbuja. La fórmula de Quay para el tiempo de vida de las burbujas (Ecuación 1) ignora este factor. Resultan diferentes conclusiones con respecto a la adaptabilidad del gas cuando uno considera el efecto de la presión de Laplace de las burbujas en conjunto con el hecho de que la sangre contiene naturalmente ciertos gases, como el nitrógeno, a una presión atmosférica cercana. Más específicamente, lleva a la conclusión de que una mezcla de gas de un "gas modificador primario" como el nitrógeno, o aire, u otro gas naturalmente abundante en la sangre, en combinación con un "agente osmótico gaseoso" de poca solubilidad en agua y alta presión de vapor da como resultado un tiempo de vida óptimo de las burbujas. Algunas realizaciones de estas mezclas de gas se describen en los Números de Serie de Solicitud de Patente de los Estados Unidos 08/099,951; 08/284,083; y 08/395,680 incorporados en el presente por referencia. La influencia de estabilización de combinaciones de gases adecuadas pueden entenderse más fácilmente a través de una discusión de ciertas burbujas hipotéticas en solución acuosa. Puede considerarse que todas las burbujas discutidas están rodeadas por una capa de surfactante reductor de la tensión superficial. Sin embargo, se considerarán los efectos del gas o combinaciones de gases con solubilidades, permeabilidades de la capa de la membrana del surfactante y concentraciones externas diferentes.

Las interacciones físicas del gas modificador primario, agente osmótico secundario y medio pueden incorporarse a una teoría general del comportamiento de las burbujas. En una solución que contiene una concentración relativamente alta del gas modificador primario (en comparación con la concentración en solución del agente osmótico gaseoso) , la vida de las burbujas puede determinarse teóricamente como una función de ciertas características físicas del agente osmótico gaseoso secundario. Considere una microburbuja de radio r, conteniendo dos gases ideales: aire (nitrógeno) (na moles) y agente osmótico (nF moles) . La microburbuja está en un medio de agua infinito, el cual no contiene agente osmótico y está saturado con un suministro infinito de aire. El aire es mucho más soluble en agua y se difunde rápidamente afuera de la microburbuja. Tratando la microburbuja de una manera análoga a una membrana semipermeable, podemos considerar que el potencial químico del aire en la microburbuja es el mismo que en el infinito, tomando en cuenta que el potencial químico del fluocarburo en la microburbuja es más alto que en el infinito. Se asume que el equilibrio mecánico con la gradiente de presión a través de la zona interfacial es rápido. Por lo tanto, es la difusión del agente osmótico afuera de la microburbuja lo que determina el tiempo de vida de la microburbuja. La presión adentro de la microburbuja es la suma de las presiones parciales del aire y el fluocarburo: pb=pbF+Pba (3) Debido a que el aire es muy soluble en el medio de agua y se difunde adentro y afuera de la burbuja rápidamente, el flujo de masa neto del aire es pequeño y la presión parcial del aire adentro de la microburbuja es aproximadamente igual a la presión atmosférica del aire aplicada al medio de agua. Esto significa que el exceso de presión de Laplace se debe únicamente al agente osmótico: 2s nF P° = RF r 4 —pr3 (4) Además, el flujo de masa de difusión en un estado estable J (mol/s) del agente osmótico de una partícula esférica al medio con concentración cero en el medio es igual a : CF su sup J= pr2D r (5) Aquí D es el coeficiente de difusión en agua del agente osmótico y CF/8Ub8up es la concentración subsuperficial en agua del agente osmótico en equilibrio. Asumimos que la concentración subsuperficial del agente osmótico en agua está en equilibrio con el fluocarburo en la microburbuja. Debido a que el vapor está hiposaturado, la concentración subsuperficial del agente osmótico de la microburbuja es más baja que su concentración saturada y se relaciona con la presión interna del vapor del agente osmótico como sigue: P^ 2s L-F, subsup= ^-F, sat l -L ' = *-F, sat ' ' PF, sat (T) PF, sat (T) r (6) De la Ecuación 4, 5 y 6, se deriva que: dt - F, sat (7) -F, sat RT- Note que la combinación PF,sat es adimensional y tiene dentro de ella la relación de la presión de vapor saturado del agente osmótico a la solubilidad en agua del agente osmótico en equilibrio correspondiente. Esta relación se conoce como el coeficiente de Ostwald (a menudo denotado "L") . El cuadrado del radio de la microburbuja disminuye con el tiempo a una velocidad proporcional al coeficiente de Ostwald del agente osmótico gaseoso. En consecuencia de ello, los agentes osmóticos gaseosos con coeficientes bajos de Ostwald proporcionan una excelente longevidad de la burbuja. El coeficiente de Ostwald del agente osmótico gaseoso es de preferencia menor que alrededor de 500 x 10"6, 100 x 10"6, o 50 x 10"6, más preferentemente menor que alrededor de 40 x 10" 6, 30 x 10~6, 20 x 10"6, 10 x 10"6, 5 x 10"6, o 1 x 10~6. gas de relleno p.e. ? atm LxlO4 02 -183 31110 N2 -196 15880 SF; -68 23.5 5950 CF4 -128 159 5172 C3F6 -78 26.2 1273 CF3OCF3 -59 10.9 932 n-C2F? -37 6.8 583 CF3OC2F3 -21.5 3.9 316 n~C4F10 -2 2.2 212 1 1.9 73 CF2OC3F4OCF3 17 1.16 36 (perfluoromonoglime) n-C5F12 29 0.84 66 CF3OC2F4OC2F3 38.5 0.55 9.0 n-C6F14 57 0.27 24 C3F2OC3F7 56 0.30 6.7 CF30 (CF2CF20) 2CF3 64 0.20 0.9 (perf luorodiglime) T. M. Reed, III, en: Fluorine Chemistry, J. H. Simons, Ed., V. 5, Academic Press, Nueva York y Londres, 1964, pág. 133; A. A. oolf, J. Fluorine Chem., 63 (1993) 19; V. V. Berenblit, Yu. F. Dolnakov, V. P. Sass, L. N. Senyushov y S. V. Sokolov, Zh. Org. Khim. , 10 (1974) 2031 y medidas experimentales. Si no están presentes en Refs. 1, se calculan con el modelo de D. D. Lawson, J. Moscanin, K. V. Scherer, Jr. T. F. Terranova y J. D. Jugham, J. Fluorine Chem., 12 (1978) 221. Los primeros 4 valores son informados por E. Wilhelm, R. Battino y R. J. Wilcock, Chem. Rev., 77 (1977) 219. Los demás son calculados como se describe en: A. S. Kabalnov, K. N. Makarov y E. V. Shcherbukova, J. Fluorine Chem., 50 (1990) 271. N.T. : p.e. = punto de ebullición. Tabla 1. Coeficientes de Ostwald y presiones de vapor a 25 grados C La Tabla 1 muestra las solubilidades, presiones de vapor y coeficientes de Ostwald de diversos compuestos, incluyendo algunos fluocarburos biocompatibles. La Tabla 1 ilustra que el perfluobutano y perfluopentano, los cuales son gases a temperatura corporal y presión atmosférica y los cuales son contemplados como gases de burbujas por Quay y Schneider, tienen coeficientes bajos de Ostwald y por lo tanto también se desempeñan de manera adecuada como agentes osmóticos gaseosos en conjunto con un gas modificador primario. Sin embargo, la habilidad de considerar compuestos candidatos los cuales son líquidos a temperatura corporal y presión atmosférica permite la selección de algunos compuestos óptimos con coeficiente bajo de Ostwald que de ninguna manera se han considerado anteriormente adecuados para preparaciones del microburbujas. Deberá recordarse que la Ecuación 7 es válida para burbujas que contienen combinaciones de gases, donde uno de los gases ya está presente en el flujo sanguíneo y donde ese gas (el "gas modificador primario") puede difundirse a través de la zona interfacial de gas/líquido mucho más rápido que el otro gas (el "agente osmótico gaseoso") en la combinación. Entonces la presión parcial del agente osmótico gaseoso en la burbuja es igual sólo a la presión de Laplace y no a la presión total adentro de la burbuja. Debido a que la presión de Laplace puede ser menor que 1 atmósfera (por lo menos para un porcentaje grande de tiempo de vida de una burbuja) , es posible usar agentes osmóticos gaseosos que son líquidos a temperatura corporal y presión atmosférica. Estos compuestos no formarían burbujas en lo absoluto sin la presencia adicional del gas modificador primario. Por otra lado, a pesar de que el agente osmótico gaseoso puede ser un líquido a temperatura corporal, su presión de vapor saturado debe ser lo suficientemente grande para que la presión de Laplace no fuerce inmediatamente el agente osmótico gaseoso en la burbuja para condensarlo a un líquido. La presión de vapor saturado del agente osmótico gaseoso es de preferencia más grande que aproximadamente 100 torr. Los hidrocarburos perfluorados previamente contemplados como gases de relleno de microburbujas tienen solubilidades en agua y presiones de vapor saturado generalmente correlacionadas. Es decir, elegir un fluocarburo con solubilidad en agua reducida también significó elegir un fluocarburo con presión de vapor saturado reducida. En esta invención, revelamos una clase previamente no considerada de compuestos que combinan una solubilidad en agua reducida sin una presión de vapor saturado reducida de manera considerable y por lo tanto estos compuestos tienen coeficientes de Ostwald sorprendentemente bajos. Estos compuestos son los monoéteres y poliéteres fluorados. Se sabe que los monoéteres y poliéteres fluorados son seguros y no tóxicos. También se sabe en el arte (D. D. Lawson y otros, J".

Fluorine Chem. 12, pág. 221 (1978)) que estos compuestos tienen una presión de vapor muy alta y punto de ebullición bajo en un determinado número de átomos de carbono. Por lo tanto, el punto de ebullición y la presión de vapor saturado de un poliéter fluorado son casi iguales al punto de ebullición y la presión de vapor saturado de su análogo de fluocarburo con el mismo número de carbono. Sin embargo, la solubilidad en agua y por lo tanto el coeficiente de Ostwald, de los fluoroéteres son más bajos que la solubilidad en agua y el coeficiente de Ostwald de los análogos de fluocarburos - el valor disminuye por un factor de 2 - 3 con cada átomo de oxígeno agregado. Normalmente, se esperaría que la adición de un átomo de oxígeno capaz del enlace de hidrógeno al agua ocasionara un aumento en la solubilidad. Se ha encontrado de manera experimental que las emulsiones de gas de mejora del contraste especialmente de vida larga pueden prepararse cuando las burbujas de gas contienen aire o nitrógeno mezclados con un fluoromonoéter o fluoropoliéter. En consecuencia, se ha encontrado que perfluorodiglime, CF3 (OCF2CF2) 2OCF3, perfluoromonoglime CF2OCF2CF2CF3, éter de perfluorodietilo, C2F5OC2F5, éter perfluoroetilmetílico, CF3OC2F5, éter de perfluorodimetilo, CF3OCF3 y perfluoropoliéteres, como CF3OCF2OCF3, CF3 (OCF2) 2OCF3, CF3 (OCF2) 3OCF y CF3 (OCF2) 4OCF3 son agentes osmóticos gaseosos especialmente adecuados. Una amplia variedad de éteres fluorados tienen las propiedades antes descritas las cuales los hacen especialmente adecuados como agentes osmóticos gaseosos para estabilizar las emulsiones de gas. Dependiendo del número de átomos de carbono, los éteres fluorados pueden ser gases o líquidos a temperatura corporal y presión atmosférica. Esos éteres fluorados los cuales son gases a temperatura corporal y presión atmosférica también son útiles como el único componente gaseoso de una preparación de emulsiones de gas. Un gas modificador primario, aunque mejora la eficacia de las emulsiones de gas hechas con todos los agentes osmóticos gaseosos, no es requerido si el éter fluorado usado es un gas a temperatura corporal y presión atmosférica. Además, los agentes osmóticos de éteres fluorados útiles pueden estar completa o sólo parcialmente fluorados . Algunos de los éteres fluorados parcialmente hidrogenados los cuales son útiles como agentes osmóticos gaseosos de acuerdo con la presente invención son: CH3CH2OCF2CHF2, CH3 , CH2 , OCF2CF3 , CHF2,CH2,OCF2,CHF2, CF3CH2OCF2CH2F, CF3CH2OCH2, CF3, CF3CH2 , OCF2CHF2 , CHF2CH2OCF2CF3 , CF3CH2OCF2CF3 , CH3OCH2CF2CHF2 , CH3OCH2CF2CF3 , CH3OCF2CF2CHF2, CH3 ,OCF2CHFCF3, CH3OCF2CF2CF3 , CHF2OCH2CF2CHF2, CHF2OCH2CF2CF3, CF3OCH2CF2CHF2, CF3OCH2CF2CF3, CH3OCH(CF3)2, CH3OCF(CF3)2, CHF2OCH (CF3) 2, CH3OCH2CHF2, CH3OCF2CH2F, CH3OCH2CF3, CH3OCF2CHF2, CHF2OCH2CHF2 , CHF2OCF2CH2F, CHF2OCH2CF3, CHF2OCHFCF3, CF3OCH2CHF2, CH3OCF2CF3, CF3OCH2CF3 y CF3OCHFCF3. Una vez que se elige un gas con coeficiente bajo de Ostwald adecuado, de preferencia un éter fluorado, de diversas maneras pueden formarse microburbujas que se incorporan al gas, tanto con y sin revestimiento o capa de zona interfacial de surfactante, como se describe detalladamente más adelante. III. Formación de microburbuias y encapsulación Los métodos de preparación de microburbujas incluyen la formación de microesferas particuladas a través de la ultrasonicación de la albúmina u otra proteína como se describe en las Solicitudes de Patente Europea 0,359,246 y 0,633,030 por Molecular Biosystems, Inc.; el uso de tensiones y agentes para aumentar la viscosidad como se describe en la Patente Estadounidense Número 4,446,442; las microburbujas no de liposomas recubiertas de lípidos como se describe en la Patente Estadounidense Número 4,684,479; liposomas que tienen gases atrapados como se describe en las Patentes Estadounidenses Números 5,088,499 y 5,123,414; el uso de compuestos anfipáticos como se describe en la Patente Estadounidense Número 5,445,813; el uso de suspensiones de lípidos como se describe en la solicitud publicada PCT WO 96/08234; el uso de surfactantes laminarizados como se describe en las Patentes Estadounidenses Números 5,271,928 y 5,380,519; el uso de microparticulados como se describe en las Patentes Estadounidenses Números 4,442,843, 5,141,738 y 4,657,756; y el uso de microesferas particuladas de albúmina como se describe en la Patente Estadounidense Número 4,718,433. Por medio del presente la revelación de cada una de las patentes y solicitudes anteriores se incorpora por referencia. Además las personas especializadas en el arte apreciarán que las emulsiones de gas de la presente invención incluyen preparaciones de microburbujas de gas libre comprendiendo fluoroéteres. Es decir, en realizaciones seleccionadas, las emulsiones de gas de la presente invención pueden formarse sin el uso de un surfactante como se describe en las Patentes Estadounidenses Números 5,393,524 y 5,049,688 las cuales se incorporan en el presente por referencia. En realizaciones preferidas, las preparaciones de microburbujas pueden prepararse empleando la sonicación. La sonicación puede realizarse de diferente maneras. Por ejemplo, un frasco que contiene una solución de surfactante y gas en el espacio de cabeza del frasco puede ser sonicada a través de una membrana delgada. De preferencia, la membrana es menor que alrededor de 0.5 ó 0.4 mm de espesor y más preferentemente menor que 0.3 o hasta 0.2 mm de espesor, es decir, más delgada que la longitud de onda del ultrasonido en el material, con el fin de proporcionar una transmisión aceptable y disminuir el calentamiento de la membrana. La membrana puede estar hecha de materiales como hule, teflón, mylar, uretano, película de aluminio, o alguna otra película de polímero sintético o natural sónicamente transparente o material peliculígeno. La sonicación puede hacerse tocando o hasta apretando la membrana con un sonda ultrasónica o con un "haz" de ultrasonidos focalizados. La sonda ultrasónica puede ser desechable. En cualquier caso, la sonda puede colocarse contra la membrana o insertarse a través de ella y adentro del líquido. Una vez que se realiza la sonicación, la solución de microburbujas puede ser retirada del paciente y el frasco entregado al mismo. La sonicación también se pueden hacer dentro de una jeringa con un dispositivo aspirador ultrasónicamente vibrado de baja potencia en la jeringa, similar a una impresora de inyección de tinta. También, una jeringa o un frasco se puede colocar en un baño ultrasónico de baja potencia y sonicar dentro del mismo el cual concentra su energía en un punto dentro del recipiente. También se contempla la formación mecánica de microburbujas. Por ejemplo, las burbujas se pueden formar con una válvula mecánica de excelente corte (o doble aguja de jeringa) y dos jeringas, o un dispositivo aspirador en una jeringa. Se puede usar hasta un simple agitación. Las técnicas de contracción de las burbujas descritas más adelante son particularmente adecuadas para burbujas formadas mecánicamente, teniendo entrada de energía más baja que las burbujas sonicadas. Estas burbujas normalmente tendrán un diámetro mucho más grande que el agente de reproducción de imágenes biocompatible finalmente deseado, pero se puede hacer para contraer a un tamaño adecuado en conformidad con la presente invención. En otro método, las microburbujas se pueden formar a través del uso de una emulsión de agente osmótico líquido sobresaturada con un gas modificador a presión elevada introducida en una solución de surfactante. Este método de producción trabaja de igual manera cuando se abre una bebida gaseosa, donde el gas hace espuma al liberar la presión formando las burbujas . En otro método, las burbujas pueden formarse igual a la formación de espuma de la crema de afeitar, con perfluobutano, freón, u otro material similar que bulle cuando la presión es liberada. Sin embargo, en este método es conveniente que el líquido emulsionado bulla lo suficientemente bajo o que contenga numerosos sitios de nucleación de burbujas para evitar el sobrecalentamiento y sobresaturación de la fase acuosa. Esta sobresaturación conducirá a la generación de un pequeño número de burbujas grandes en un número limitado de sitios de nucleación y no el número grande deseado de burbujas pequeñas (una por cada gota) . En la alternativa, una pastilla liofilizada de surfactante y reactivos de aumento de volumen producidos con una estructura de poro fino o que contiene huecos puede colocarse en un frasco con una solución estéril y tener en espacio de cabeza una mezcla de gas osmótico. La solución puede congelarse rápidamente para producir una estructura ' de cristales de hielo fino y, por lo tanto, en la liofilización produce poros finos (huecos donde los cristales de hielo fueron removidos) . Alternativamente, pueden usarse estructuras o materiales disolubles o solubles que forman huecos, como azúcares en polvo o granulada. No es necesario que los materiales estructurales definan una pluralidad de huecos antes de la adición de un medio líquido. Además, mientras que es preferible que las estructuras que forman huecos comprendan un surfactante, éste no es requerido para practicar la presente invención. En esta realización, cuando el material que forma huecos no está hecho de surfactante o no contiene el mismo, tanto el surfactante, como el líquido son suministrados al recipiente con las estructuras y el gas o gases deseados. En la reconstitución, estos huecos ocluyen el gas osmótico y, con la disolución de la pastilla o polvo sólido, forman microburbujas con el gas o gases en ellos. En otro método, las partículas secas que contienen huecos u otras estructuras (como esferas huecas o agujeros) que se disuelven o se hidratan rápidamente, de preferencia en una solución acuosa, por ejemplo, albúmina, cristales de azúcar microfina, azúcar hueca deshidratada por aspersión, esferas huecas de surfactante, esferas de polímero poroso deshidratado, esferas de ácido hialurónico poroso deshidratado, o esferas de ácido hialurónico substituido, o hasta microesferas de lactosa deshidratadas disponible en el mercado, pueden estabilizarse con un agente osmótico gaseoso. Además, mientras que las microesferas de proteína desnaturalizada no son particularmente solubles, son compatibles con la presente invención y pueden usarse como estructuras que contienen huecos en conformidad con la enseñanzas en el presente. En consecuencia, en un aspecto amplio, la presente invención proporciona composiciones de precursores de microburbujas que comprenden: un material estructural que define una pluralidad de huecos; un gas o mezcla de gases que comprende un fluoroéter disperso en los huecos; y un surfactante, en donde el material estructural, el gas o mezcla de gases y el surfactante están adaptados entre sí para formar microburbujas en la adición de un líquido al recipiente. Se apreciará que, como se usa en el presente, el término "material estructural" deberá significar cualquier material definiendo una pluralidad de huecos que promueve la formación de burbujas en combinación con un medio líquido.

Estos materiales estructurales, los cuales incluyen tanto estructuras que contienen huecos, como estructuras que forman huecos, pueden ser solubles o insolubles en un ambiente acuoso. Los materiales estructurales ejemplares que son compatibles con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, polvos deshidratados por aspersión, azúcares en polvo o granulada, microesferas de proteína incluyendo microesferas de proteínas desnaturalizadas, pastillas liofilizadas, polvos liofilizados, sales, esferas huecas de surfactante, esferas de polímero poroso deshidratado y ácido hialurónico poroso deshidratado. En realizaciones particularmente preferidas, el material estructural comprende un surfactante . De preferencia, las composiciones de emulsiones de gas que incorporan a los gases con coeficiente bajo de Ostwald se preparan mediante la deshidratación por aspersión de una dispersión acuosa la cual contiene un monómero o polímero hidrófilo o combinación de los mismos. Este procedimiento también se describe detalladamente en la Solicitud de Patente Estadounidense copendiente Número de Serie 08/405,477. En este caso, una composición que forma burbujas se forma mediante la deshidratación por aspersión de una dispersión acuosa de una mitad hidrófila como el almidón, de preferencia también incluyendo un surfactante, para formar un material estructural. Más particularmente, para formar un polvo de revestimientos huecos, porosos aproximadamente microesféricos de alrededor de 1 a 10 µm de diámetro, con espesores de revestimiento de alrededor de 0.2 µm. Los deshidratadores por aspersión disponibles en el mercado son bien conocidos por las personas especializadas en el arte y los ajustes adecuados para dispersiones de almidón/surfactante en particular pueden determinarse fácilmente a través de la prueba empírica estándar, con debida referencia a los ejemplos que siguen. Después de la formación, el gas deseado está hecho para penetrar el material estructural o microesferas secas colocando los microesferas en un frasco, evacuando el aire y reemplazando con el gas deseado o mezcla de gases . La mitad hidrófila en la solución que será deshidratada por aspersión puede, por ejemplo, ser un carbohidrato, como glucosa, lactosa, o almidón. También se contemplan los polímeros como PVA o PVP. Se ha encontrado que varios almidones y almidones derivados son especialmente adecuados . Los almidones particularmente preferidos para uso en la formación de microburbujas incluyen aquellos con un peso molecular de más de 500,000 daltons o un valor de equivalencia de dextrosa (ED) de menos de 12. El valor de ED es una medida cuantitativa del grado de hidrólisis del polímero de almidón. Es una medida del poder reductor en comparación con un estándar de dextrosa de 100. Mientras más alto sea el valor de ED, más grande será la extensión de la hidrólisis del almidón. Los almidones preferidos incluyen almidones vegetales de calidad apropiada para alimentos del tipo disponible en el mercado en la industria de alimentos, incluyendo los vendidos bajo las marcas N-LOK y CAPSULE por National Starch and Chemical Co., (Bridgewater, NJ) ; almidones derivados, como almidón de hidroxietilo (disponible bajo las marcas HETASTARCH y HESPAN de du Pont Pharmaceuticals, almidón de m-hidroxietilo de Ajinimoto, Tokio, Japón) . Sin embargo, debido a las características de estabilización particularmente convenientes, se prefieren los almidones con un peso molecular de 500,000 o más. (Note que los almidones de cadena corta se deshidratan bien por aspersión y pueden usarse para producir microburbujas en conformidad con la presente invención.) El monómero o polímero hidrófilo está presente en esta realización de la solución de precursores en una gama de alrededor de 0.1% a 10% w/v de solución, habiéndose encontrado que alrededor de 1% a 5% w/v es especialmente adecuado. De preferencia, la dispersión acuosa también incluye un surfactante o mezcla de surfactantes opcional, proporcionado alrededor de 0.01% a 20% w/v de la solución. Se conocen y pueden usarse muchos surfactantes y mezclas de surfactantes.

Los surfactantes pueden seleccionarse del grupo que consta de fosfolípidos, fosfocolinas, lisofosfolípidos, surfactantes no iónicos, surfactantes neutrales o aniónicos, surfactantes fluorados, los cuales pueden ser neutrales o aniónicos y combinaciones de los agentes emulsionantes o espumantes mencionados. Otros ejemplos específicos de surfactantes incluyen copolímeros de bloque de polioxipropileno y polioxietileno (un ejemplo de la clase de compuestos es Pluronic, como Pluronic F-68) , esteres de azúcar, alcoholes grasos, óxidos alifáticos de amina, esteres alifáticos de ácido hialurónico, sales de esteres alifáticos de ácido hialurónico, dodecil poli (etilenoxi) etanol, nonilfenoxi poli (etilenoxi) etanol, almidones derivados, esteres de ácidos grasos de almidón de hidroxietilo, sales de ácidos grasos, almidones vegetales para alimentos disponibles en el mercado, esteres de ácidos grasos de dextrano, esteres de ácidos grasos de sorbitol, gelatina, albúminas séricas y combinaciones de los mismos . También se contemplan los esteres de ácidos grasos de polioxietileno, como estearatos de polioxietileno, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, esteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilados, oxiestearatos de polietilenglicol de glicerina, ricinoleato de polietilenglicol de glicerina, esteróles de soya etoxilados, aceites de ricino etoxilados y los derivados hidrogenados de los mismos. Además, los alquilglucósidos no iónicos como Tweens®, Spans* y Brijs* también están dentro del alcance de la presente invención. Los Spans incluyen tetraoleato de sorbitán, tetraestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, tripalmitato de sorbitán, trioleato de sorbitán y diestearato de sorbitán. Los Tweens incluyen triestearato de sorbitán de polioxietileno, tripalmitato de sorbitán de polioxietileno, trioleato de sorbitán de polioxietileno. La familia Brij es otra categoría útil de materiales, la cual incluye éter de estearilo de polioxietileno 10. También se pueden usar otros surfactantes, particularmente ácidos grasos (o sus sales) que tienen de 6 a 24 átomos de carbono. Un ejemplo de un surfactante aniónico adecuado es el ácido oleico, o su sal, oleato sódico. También son adecuados los surfactantes catiónicos y sus sales, como cloruro de dodeciltrimetilamonio. Se apreciará de lo anterior que puede usarse una amplia gama de surfactantes. De hecho, se puede usar prácticamente cualquier surfactante (incluyendo aquellos que todavía se desarrollarán) o combinación de surfactantes en la presente invención. El surfactante óptimo para una aplicación determinada puede determinarse a través de estudios empíricos que no requieren excesiva experimentación. En consecuencia, una persona practicando el arte de la presente invención podría seleccionar un surfactante basándose principalmente en propiedades como la biocompatibilidad. Se ha encontrado especialmente adecuado que la solución contenga una mezcla de surfactantes incluyendo un fosfolípido hidrófobo como un primer surfactante y por lo menos un segundo surfactante adicional más hidrófilo. De preferencia, el fosfolípido hidrófobo tiene por lo menos una cadena de acilos con un total de por lo menos alrededor de 10 átomos de carbono (por ejemplo, un fosfolípido de didecanol) . En algunas realizaciones, el primer surfactante de fosfolípido tendrá cadenas de acilo de alrededor de 10 ó 14 a alrededor de 20 ó 24 átomos de carbono. Por ejemplo, puede usarse la dipalmitilfosfatidilcolina (comprendiendo dos cadenas de acilos, cada una conteniendo 16 átomos de carbono) . La cadena de acilos puede ser hidrogenada o fluorada. También se contemplan otros grupos de cabeza de fosfolípidos. Por ejemplo, las fosfatidilserinas, fosfatidilglicerinas, o fosfatidiletanolaminas tendrán propiedades adaptadas a la presente invención. Las combinaciones de estos fosfolípidos también pueden comprender el "primer surfactante", como puede derivarse naturalmente de productos de fosfolípidos como el huevo o la lecitina de soya, o surfactantes pulmonares.

Además, el primer surfactante de fosfolípido pueden complementarse con otros surfactantes muy insolubles en agua como diésteres, triésteres y tetraésteres de sacarosa. El colesterol también puede complementar el primer surfactante y se ha considerado útil en la promoción de la estabilidad cuando se proporciona en una gama de alrededor de 0.01 a 0.5 w/w de colesterol a fosfolípido. De preferencia, las cadenas de acilos del fosfolípido son saturadas, aunque los grupos acilo no saturados también están dentro del alcance de la presente invención. El primer surfactante es de preferencia proporcionado en una gama de alrededor de 0.005% a 20% w/v de la solución, más preferentemente en la gama de 0.02% a 10% w/v. Se ha encontrado que es conveniente usar una mezcla de fosfolípidos que comprende un fosfolípido de cadena de acilos larga relativamente hidrófobo en combinación con un fosfolípido de cadena más corta el cual es más hidrófilo que el primer fosfolípido. Como un ejemplo específico, un primer fosfolípido que tiene cadenas de acilos con 12 ó 14 átomos de carbono puede estar provisto con un segundo fosfolípido como un cosurfactante teniendo cadenas de acilos con ocho o diez átomos de carbono. Se ha encontrado particularmente conveniente proporcionar un fosfolípido que comprenda cadenas de acilos de 12 átomos de carbono como el primer surfactante o segundo surfactante. Por ejemplo, un fosfolípido con cadenas de acilos de 12 átomos de carbono puede comprender el primer surfactante y un éster de azúcar o compuesto Pluronic puede comprender el segundo surfactante. Como otra opción, un fosfolípido con cadenas de acilos de 16 átomos de carbono puede comprender el primer surfactante y un fosfolípido con cadenas de acilos de 12 átomos de carbono puede comprender el segundo surfactante. El producto deshidratado por aspersión finalmente fabricado es un productor de burbujas más efectivo si un agente inflador, de preferencia un fluocarburo como Freón 113, es dispersado en la solución de almidón/surfactante antes descrita. El agente inflador puede ser cualquier material que se convierta en un gas durante el proceso de deshidratación por aspersión. El agente inflador es dispersado en toda la solución de surfactante, usando, por ejemplo, un microfluidizador disponible en el mercado a una presión de alrededor de 5000 a 15,000 psi. Este proceso forma una emulsión convencional compuesta de gotas submicrométricas de Freón inmiscible en agua (u otro agente inflador) recubierto con una capa monomolecular de surfactante. La dispersión con esta técnica y otras es común y bien conocida por las personas especializadas en el arte. La inclusión de un agente inflador en la solución que será deshidratada por aspersión da como resultado una señal de ultrasonidos más grande por gramo del polvo deshidratado por aspersión formando un número mayor de microesferas huecas. El agente inflador forma un núcleo en la formulación de burbujas de vapor dentro de las gotas atomizadas de la solución que entra al deshidratador por aspersión cuando estas gotas se mezclan con la corriente de aire caliente dentro del deshidratador. Los agentes infladores adecuados son aquellos que sobresaturan la solución dentro de las gotas atomizadas con gas o vapor, a la temperatura elevada de las gotas en deshidratación (aproximadamente 100°C) . Los agentes adecuados incluyen: 1. Solventes disueltos de temperatura baja de ebullición (abajo de 100°C) con miscibilidad limitada con soluciones acuosas, como cloruro de metileno, acetona y disulfuro de carbono usadas para saturar la solución a temperatura ambiente. 2. Un gas, por ejemplo C02 o N¿, usado para saturar la solución a temperatura ambiente y presión elevada (por ejemplo 3 barios) . Las gotas son después sobresaturadas con el gas en 1 atmósfera y 100°C. 3. Emulsiones de líquidos inmiscibles de temperatura baja de ebullición (abajo de 100°C) como Freón 113, perfluopentano, perfluohexano, perfluobutano, pentano, butano, FC-11, FC-11B1, FC-11B2, FC-12BS, FC-21, FC- 21B1, FC-21B2, FC-31B1, FC-113A, FC-122, FC-123, FC- 132, FC-133, FC-141, FC-141B, FC-142, FC-151, FC-152, FC-1112, FC-1121 y FC-1131. Los agentes infladores son agregados a la solución de almidón/surfactante en cantidades de alrededor de 0.5% a 10% v/v de la solución de surfactante. Se ha encontrado que aproximadamente 3% v/v de agente inflador produce un polvo deshidratado por aspersión el cual forma microburbujas adecuadas. El agente inflador se evapora substancialmente durante el proceso de deshidratación por aspersión y por lo tanto no está presente en el polvo final deshidratado por aspersión en más que cantidades muy pequeñas .

Otros componentes opcionales de esta solución son varias sales u otros agentes dentro de la fase acuosa. Estos agentes pueden incluir de manera conveniente modificadores de viscosidad convencionales, tampones como tampones de fosfatos u otros tampones biocompatibles convencionales o agentes ajustadores de pH como ácidos o bases, agentes osmóticos (para proporcionar isotonicidad, hiperosmolaridad o hiposmolaridad) . Las soluciones preferidas tienen un pH de alrededor de 7 y son isotónicos. Estos ingredientes adicionales comprenden cada uno generalmente menos del 5% w/v de la solución. Los ejemplos de sales adecuadas incluyen fosfato de sodio (tanto monobásico, como dibásico) , cloruro de sodio, fosfato de calcio y otras sales fisiológicamente aceptables . Después de la deshidratación por aspersión, los diversos componentes individuales de las microesferas comprenden de preferencia las siguientes proporciones del producto final deshidratado por aspersión en % en peso: Material estructural hidrófilo 1% a 100% Surfactante 0% a 90% Sales, tampón, etc. 0% a 90% En realizaciones particularmente preferidas, la composición tiene las siguientes proporciones en % en peso: Material estructural hidrófilo 10% a 60% Surfactante 0.1% a 10% Sales, tampón, etc. 10% a 60% Como se mencionó anteriormente, el gas deseado está hecho para penetrar las microesferas secas colocándolas en un frasco, el cual se coloca en una cámara de vacío para evacuar el aire. El aire es después reemplazado con el gas o la mezcla de gases deseado. El gas después se difundirá a los huecos de las esferas. La difusión puede ser facilitada por la oscilación de presión o vacío. El frasco es después sellado a presión y de preferencia esterilizado con rayos gamma o calor. De preferencia, el primer gas modificador primario (el cual puede ser aire o alguno de sus gases componentes como nitrógeno) y el segundo gas estabilizador osmótico (de preferencia teniendo coeficiente bajo de Ostwald) están presentes respectivamente en una relación molar de alrededor de 1:100, 1:75, 1:50, 1:30, 1:20 ó 1:10 a alrededor de 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 75:1 ó 50:1. En una realización particularmente preferida, el gas es nitrógeno que ha sido saturado con perfluorodiglime a 20 grados C. IV. Empacado y uso Se apreciará que los estuches pueden prepararse para uso en la elaboración de preparaciones de microburbujas de la presente invención. Estos estuches pueden incluir un recipiente conteniendo el gas o gases descritos anteriormente para formar las microburbujas, el líquido y el surfactante. El recipiente puede contener todos los componentes secos estériles y el gas, en una cámara, con el líquido acuoso estéril en una segunda cámara del mismo recipiente.

Alternativamente, el surfactante puede ser solubilizado en el líquido antes de la adición. En consecuencia, en un aspecto amplio, la presente invención proporciona un método para preparar una emulsión de gas que comprende los siguientes pasos : proporcionar un recipiente teniendo un material estructural que define una pluralidad de huecos, un surfactante y un gas o mezcla de gases comprendiendo un fluoroéter disperso en los huecos; agregar un líquido acuoso al recipiente y mezclar el material estructural, el surfactante y el líquido acuoso, formando con ello una emulsión de gas en el recipiente, la emulsión de gas comprendiendo burbujas de gas o mezcla de gases rodeadas por una capa del surfactante. Los recipientes de dos cámaras adecuados están disponibles, por ejemplo, bajo las marcas WHEATON RS177FLW ó S-1702FL de Wheaton Glass Co. , (Millville, NJ) . Otro ejemplo se proporciona por el sistema de jeringa prellenada de Doble Cámara de 5+5 ml Líquido/Seco B-D HYPAK (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; descrito en la Patente Estadounidense Número 4,613,326). Las ventajas de este sistema incluyen: 1. Comodidad de uso; 2. El agente osmótico gaseoso insoluble en agua es sellado por una cámara de solución acuosa en un lado y una área extremadamente pequeña de elastómero sellando la aguja en el otro lado; y 3. Una aguja de filtración como Monoject #305 (Sherwood Medical, St . Louis, MO) puede adaptarse a la jeringa en el momento de la fabricación para asegurar que no se inyecten sólidos no disueltos. En el Ejemplo III se describe el uso de la jeringa de dos cámaras para formar microburbujas. Una persona de experiencia ordinaria en el arte podrá apreciar que otros sistemas de reconstitución de dos cámaras capaces de combinar el polvo deshidratado por aspersión con la solución acuosa de una manera estéril también están dentro del alcance de la presente invención. En estos sistemas, es particularmente conveniente si la fase acuosa puede interponerse entre el gas osmótico insoluble en agua y el ambiente, para aumentar la vida útil en almacenamiento del producto. Cuando un material necesario para formar las microburbujas todavía no está presente en el recipiente, puede empacarse con los otros componentes del estuche, de preferencia en una forma o recipiente adaptado para facilitar la combinación preparada con los demás componentes del estuche . Los ejemplos de usos en particular de las microburbujas de la presente invención incluyen la reproducción de imágenes de perfusión del corazón, el tejido miocárdico y la determinación de las características de la perfusión del corazón y sus tejidos durante pruebas de tensión o ejercicio, o defectos o cambios de perfusión debido a infarto miocardíaco. Similarmente, el tejido miocárdico puede verse después de la administración oral o venosa de medicamentos diseñados para aumentar el flujo sanguíneo a un tejido. También, puede mejorarse la visualización de cambios en el tej ido miocárdico debido a varias intervenciones o durante las mismas, como trasplante de vena de tejido coronario, angioplastia coronaria, o uso de agentes trombolíticos (TPA o estreptoquinasa) . Como estos agentes de contraste pueden administrarse de una manera conveniente a través de una vena periférica para mejorar la visualización de todo el sistema circulatorio, también ayudarán en el diagnóstico de patologías vasculares generales y en la habilidad de monitorear ultrasónicamente la viabilidad del tejido placentario. En una realización particularmente preferida, la presente invención proporciona un método para la reproducción de imágenes de ultrasonidos por armónicas usando las emulsiones de gas reveladas como los agentes de contraste.

Las burbujas de la presente invención son especialmente útiles en métodos de reproducción de imágenes por armónicas como los descritos en la solicitud de patente copendiente de los Estados Unidos 08/314,074. Optimizando la habilidad de las microburbujas reveladas de transformar la frecuencia de la radiación ultrasónica a la cual son sometidas (la frecuencia básica) , la reproducción de imágenes es mejorada. Por lo tanto, la presente invención proporciona de manera conveniente amplitudes estimulantes para el uso de microburbujas capaces de generar armónicas en ultrasonido médicamente útil. También deberá hacerse hincapié en que la presente invención tiene aplicaciones más allá de la reproducción de imágenes de ultrasonidos. De hecho, la invención es suficientemente amplia para comprender el uso de emulsiones de gas que contienen fosfolípidos en cualquier sistema, incluyendo aplicaciones no biológicas. Además se entenderá que pueden incluirse otros componentes en las formulaciones de microburbujas de la presente invención. Por ejemplo, pueden agregarse agentes osmóticos, estabilizadores, queladores, tampones, moduladores de viscosidad, modificadores de solubilidad de aire, sales y azúcares para modificar las suspensiones de microburbujas para máxima vida y efectividad de mejora del contraste. Estas consideraciones como la esterilidad, isotonicidad y biocompatibilidad pueden regir el uso de los aditivos convencionales a las composiciones inyectables. Las personas de experiencia ordinaria en el arte entenderán el uso de los agentes y las cantidades, relaciones y tipos específicos de agentes pueden determinarse empíricamente sin excesiva experimentación. Alguna de las preparaciones de microburbujas de la presente invención puede administrarse a una vertebrado, como un pájaro o un mamífero, como un agente de contraste para reproducir ultrasónicamente las imágenes de partes del vertebrado. De preferencia, el vertebrado es un humano, y la parte cuya imagen se reprodujo es la vasculatura del vertebrado. En esta realización, una pequeña cantidad de microburbujas (por ejemplo, 0.1 ml/Kg [2 mg/Kg de polvo deshidratado por aspersión] en base al peso corporal del vertebrado) se introduce intravasculármente al animal .

También se pueden usar otras cantidades de microburbujas, como de 0.005 ml/Kg a 1.0 ml/Kg. La reproducción de imágenes del corazón, arterias, venas y órganos con abundante sangre, como el hígado y los ríñones puede hacerse ultrasónicamente con esta técnica. V. Ejemplos La descripción anterior se entenderá de una manera más completa con referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos son, sin embargo, ejemplares de los métodos preferidos para practicar la presente invención y no son limitantes del alcance de la invención o las reivindicaciones anexadas al presente.

Ejemplo I Preparación de microburbuias a través de la sonicación Se prepararon microburbujas con un tamaño de número ponderado promedio de 5 mieras mediante la sonicación de una fase acuosa isotónica conteniendo 2% de Pluronic F-68 y 1% de estearato de sacarosa como surfactantes, aire como un gas modificador y perfluohexano como el agente osmótico gaseoso.

En este experimento, se agregó 1.3 ml de una solución de agua estéril conteniendo 0.9% de NaCl, 2% de Pluronic F-68 y 1% de sacarosa a un frasco de 2.0 ml . El frasco tenía un espacio de cabeza restante de 0.7 ml inicialmente conteniendo aire. Se usó aire saturado con vapor de perfluohexano (220 torr de perfluohexano con 540 torr de aire) a 25 grados C para lavar el espacio de cabeza del frasco. El frasco se selló con un septo delgado de politetrafluoetileno (PTFE) de 0.22 mm. El frasco se volteó horizontalmente y una sonda de sonicación de 1/8" (3 mm) fijada a un sonicador de 50 watts modelo VC50, disponible por Sonics & Materials se apretó suavemente contra el septo. En. esta posición, el septo separa la sonda de la solución. Después se aplico fuerza a la sonda y la solución se sónico durante 15 segundos, formando una solución blanca de microburbujas finamente divididas, teniendo un tamaño de número ponderado promedio de 5 mieras según lo medido por el analizador de partículas difundentes con luz láser Horiba LA-700. Ejemplo II Deshidratación por aspersión de solución gue contiene fosfolípidos Se preparó un litro de la siguiente solución en agua para inyección: 2.0% w/v de maltodextrina Maltrin M-100 (Grain Processing Corp. Muscatine, IA) , 0.95% w/v de cloruro de sodio (Mallinckrodt , San Luis, MO) , 1.0% de Superonic F-68 (Serva, Heidelberg, Alemania), 1.0% w/v de Estearato de Sacarosa S-1670 de Ryoto (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokio, Japón) y 0.5% de fosfolípido hidrogenado Lipoid E-100-3 (Ludwigshafen, Alemania) . Esta solución después se deshidrató por aspersión en un Deshidratador por Aspersión Portátil de Niro Atomizer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhague, Dinamarca) empleando los siguientes ajustes: Velocidad de flujo del aire caliente 39.5 pies cúbicos/min Temperatura del aire de entrada 245°C Temperatura del aire de salida 100°C Flujo de aire del atomizador 350 litros/minuto Velocidad de alimentación de líquido 1 litro/hora El producto esférico hueco, deshidratado tenía un diámetro entre 1 µM y alrededor de 15 µM y se recogió en el separador ciclónico que es estándar para este deshidratador. Las alícuotas de polvo (250 mg) se pesaron en frascos tubulares de 10 ml, se evacuaron y se rociaron con nitrógeno saturado de perfluohexano a 13°C y se sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluohexano pasándolo a través de tres botellas de lavado llenadas con perfluohexano sumergidas en un baño de agua de 13°C. En la reconstitución con 5 ml de agua para inyección, se observaron numerosas burbujas por microscopía óptica, variando en tamaño de 1 a 20 mieras. El hecho de que pudieran observarse muchas burbujas de aproximadamente 1 miera por un tiempo considerable demuestra la estabilidad agregada obtenida incluyendo un fosfolípido en la fórmula como un surfactante viscoelástico no newtoniano adicional. Ejemplo III Emulsión de gas de perfluorodiglime con éster de sacarosa/surfactante Poloxamer Un litro de cada una de las siguientes dos soluciones se preparó con los siguientes ingredientes para inyección: Solución 1 : 3.9% de peso en volumen de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 3.25% de peso en volumen de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) 2.83% de peso en volumen de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 0.42% de peso en volumen de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) Solución 2 : 2.11% de peso en volumen de Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ) 0.32% de volumen en peso de Estearato de Sacarosa S-1670 de Ryoto (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokio, Japón) 0.16% de volumen en peso de Estearato de Sacarosa S-570 de Ryoto (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokio, Japón) La Solución 2 se agregó a un mezclador de excelente corte y se enfrió en un baño de hielo. Se hizo una suspensión gruesa de 30 ml de 1, 1, 2-triclorotrifluoetano (Freón 113; EM Science, Gibbstown, NJ) en el litro de la solución 2. Esta suspensión se emulsionó usando un Microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modelo M-110F) a ,000 psi, 5°C por 5 pasadas. La emulsión resultante se agregó a la solución 1. Esta mezcla después se deshidrató por aspersión en un Deshidratador por Aspersión Portátil de Niro Atomizer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhague, Dinamarca) empleando los siguientes ajustes: Velocidad de flujo del aire caliente 31 pies cúbicos/min Temperatura del aire de entrada 370°C Temperatura del aire de salida 120°C Flujo de aire del atomizador 290 litros/minuto Velocidad de alimentación de emulsión 1.5 litros/hora El producto esférico hueco, deshidratado tenía .un diámetro entre 1 µM y alrededor de 15 µM y se recogió en el separador ciclónico que es estándar para este deshidratador.

Las alícuotas de polvo (200 mg) se pesaron en frascos tubulares de 10 ml, se rociaron con nitrógeno saturado de perfluorodiglime a 20°C y se sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluorodiglime pasándolo a través de tres botellas de lavado llenadas con perfluorodiglime sumergidas en un baño de agua de 20°C. La cantidad de vapor de perfluorodiglime por frasco fue de 12-14 mg. Los frascos se reconstituyeron con 5 ml de agua para inyección después de insertar una aguja calibre 18 como un orificio de respiración para reducir la presión cuando el agua se inyectó, formando aproximadamente 6 x 108 burbujas por ml las cuales estuvieron estables in vi tro por varios días. Un ml de la suspensión de microburbujas resultante se inyectó en forma intravenosa a un conejo de aproximadamente 3 kg con instrumentos para monitorear la señal de ultrasonido Doppler de su artería carótida. Un puño de flujo de 10 MHz (Tritón Technology Inc., San Diego, CA; modelo ES-10-20) conectado a un módulo de flujo Doppler System 6 (Tritón Technology Ine . ) suministró la señal Doppler RF a un osciloscopio LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY) . El valor eficaz de la tensión de la señal calculada por el osciloscopio se transfirió a una computadora y la curva resultante se ajustó para obtener la intensidad máxima de señal ecogénica y la vida media de las microburbujas en la sangre . Las señales antes del contraste fueron menores que 0.1 voltios de valor eficaz. 60 segundos después de la inyección, la intensidad de la señal fue de 1.1 V de valor eficaz, con una constante de desintegración de aproximadamente .00859 s"1. Ejemplo IV Emulsión de gas de perfluorodiglime con fosfolípido/surfactante Poloxamer Un litro de cada una de las siguientes dos soluciones se preparó con los siguientes ingredientes para inyección: Solución 1: 36 g de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 30 g de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) 26 g de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 3.9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) Solución 2 : 4.5 g de Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ) 4.5 g de fosfatidilcolina de dipalmitol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) La Solución 2 se agregó a un mezclador de excelente corte y se enfrió en un baño de hielo. Se hizo una suspensión gruesa de 30 ml de 1, 1, 2-triclorotrifluoetano (Freón 113; EM Science, Gibbstown, NJ) en el litro de la solución 2. Esta suspensión se emulsionó usando un Microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modelo M-110F) a 10,000 psi, 5°C por 5 pasadas. La emulsión resultante se agregó a la solución 1. Esta mezcla después se deshidrató por aspersión en un Deshidratador por Aspersión Portátil de Niro Atomizer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhague, Dinamarca) empleando los siguientes ajustes : Velocidad de flujo del aire caliente 31 pies cúbicos/min Temperatura del aire de entrada 325°C Temperatura del aire de salida 120°C Flujo de aire del atomizador 290 litros/minuto Velocidad de alimentación de emulsión 1.5 litros/hora El producto esférico hueco, deshidratado tenía un diámetro entre 1 µM y alrededor de 15 µM y se recogió en el separador ciclónico que es estándar para este deshidratador. Las alícuotas de polvo (200 mg) se pesaron en frascos tubulares de 10 ml, se rociaron con nitrógeno saturado de perfluorodiglime a 20°C y se sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluorodiglime pasándolo a través de tres botellas de lavado llenadas con perfluorodiglime sumergidas en un baño de agua de 20°C. La cantidad de vapor de perfluorodiglime por frasco fue de 12-14 mg. Los frascos se reconstituyeron con 5 ml de agua para inyección después de insertar una aguja calibre 18 como un orificio de respiración para reducir la presión cuando el agua se inyectó, formando aproximadamente 3 x 108 burbujas por ml las cuales estuvieron estables in vi tro por varios días. Un ml de la suspensión de microburbujas resultante se inyectó en forma intravenosa a un conejo de aproximadamente 3 kg con instrumentos para monitorear la señal de ultrasonido Doppler de su artería carótida. Un puño de flujo de 10 MHz (Tritón Technology Inc., San Diego, CA; modelo ES-10-20) conectado a un módulo de flujo Doppler System 6 (Tritón Technology Inc.) suministró la señal Doppler RF a un osciloscopio LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY) . El valor eficaz de la tensión de la señal calculada por el osciloscopio se transfirió a una computadora y la curva resultante se ajustó para obtener la intensidad máxima de señal ecogénica y la vida media de las microburbujas en la sangre. Las señales antes del contraste fueron menores que 0.1 voltios de valor eficaz. 60 segundos después de la inyección, la intensidad de la señal fue de 0.4 V de valor eficaz, con una constante de desintegración de aproximadamente .01835 s"1. Ejemplo V Emulsión de gas de perfluorodiglime con mezcla de fosfolípido y surfactante Un litro de cada una de las siguientes dos soluciones se preparó con los siguientes ingredientes para inyección: Solución 1 : 36 g de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 30 g de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) 26 g de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 3.9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) Solución 2 : 4.8 g de fosfatidilcolina de dipalmitol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) 3.4 g de fosfatidilcolina de dioctanol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) La Solución 2 se agregó a un mezclador de excelente corte y se enfrió en un baño de hielo. Se hizo una suspensión gruesa de 30 ml de 1, 1,2-triclorotrifluoetano (Freón 113; EM Science, Gibbstown, NJ) en el litro de la solución 2. Esta suspensión se emulsionó usando un Microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modelo M-110F) a ,000 psi, 5°C por 5 pasadas. La emulsión resultante se agregó a la solución 1. Esta mezcla después se deshidrató por aspersión en un Deshidratador por Aspersión Portátil de Niro Atomizer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhague, Dinamarca) empleando los siguientes ajustes : Velocidad de flujo del aire caliente 31 pies cúbicos/min Temperatura del aire de entrada 325°C Temperatura del aire de salida 120°C Flujo de aire del atomizador 290 litros/minuto Velocidad de alimentación de emulsión 1.5 litros/hora El producto esférico hueco, deshidratado tenía un diámetro entre 1 µM y alrededor de 15 µM y se recogió en el separador ciclónico que es estándar para este deshidratador. Las alícuotas de polvo (200 mg) se pesaron en frascos tubulares de 10 ml, se rociaron con nitrógeno saturado de perfluorodiglime a 13°C y se sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluorodiglime pasándolo a través de tres botellas de lavado llenadas con perfluorodiglime sumergidas en un baño de agua de 13°C. La cantidad de vapor de perfluorodiglime por frasco fue de 12-14 mg. Los frascos se reconstituyeron con 5 ml de agua para inyección después de insertar una aguja calibre 18 como un orificio de respiración para reducir la presión cuando el agua se inyectó, formando aproximadamente 2 x 108 burbujas por ml las cuales estuvieron estables in vitro por varios días. Un ml de la suspensión de microburbujas resultante se inyectó en forma intravenosa a un conejo de aproximadamente 3 kg con instrumentos para monitorear la señal de ultrasonido Doppler de su artería carótida. Un puño de flujo de 10 MHz (Tritón Technology Inc., San Diego, CA; modelo ES-10-20) conectado a un módulo de flujo Doppler System 6 (Tritón Technology Inc.) suministró la señal Doppler RF a un osciloscopio LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY) . El valor eficaz de la tensión de la señal calculada por el osciloscopio se transfirió a una computadora y la curva resultante se ajustó para obtener la intensidad máxima de señal ecogénica y la vida media de las microburbujas en la sangre . Las señales antes del contraste fueron menores que 0.1 voltios de valor eficaz. 60 segundos después de la inyección, la intensidad de la señal fue de 0.2 V de valor eficaz, con una constante de desintegración de aproximadamente .00387 s"1. Ejemplo VI Biocompatibilidad de Emulsiones de Gas Preparadas de Fosfolípidos Mezclados de Cadena Larga/Cadena Corta Un litro de la siguiente emulsión se preparó para deshidratación por aspersión como se describe en el Ejemplo II: 3.6% de peso en volumen de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 3.0% de peso en volumen de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) 2.6% de peso en volumen de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 0.39% de peso en volumen de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 0.22% de peso en volumen de fosfatidilcolina de dipalmitol (Syngena Ltd., Cambridge, MA) 0.31% de peso en volumen de fosfatidilcolina de dioctanol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) 3.0% v/v de 1, 1,2-triclorotrifluoetano (Freón 113; EM Science, Gibbstown, NJ) En estas relaciones de fosfatidilcolina de dipalmitol a fosfatidilcolina de dioctanol, los surfactantes sólo forman micelas mixtas. En la reconstitución con 5 ml de agua, se observaron aproximadamente 51 millones de gotas de emulsión de gas por ml, variando en tamaño de 1 a 20 mieras. Se determinó que la constante de desintegración de primer orden de la señal ecogénica de la emulsión de gas en conejos en una dosis de 5 mg/kg es de .0029 s"1. Esto corresponde a una vida media intravascular de 4 minutos . La emulsión de gas fue analizada para la activación de complemento usando un equipo de diagnóstico C3a in-vitro abastecido por Quidel Corp. (San Diego, CA) . No se observó ninguna diferencia entre la emulsión de gas y el control negativo (solución salina) , indicando que la emulsión de gas no activa el complemento. Es bien sabido que las microburbujas desnudas activan el complemento. Muestra Probada TC3a1 (ng/ml) Zymosan (control positivo) 43403 Solución salina (control negativo) 604 emulsión de gas 412 La emulsión de gas también fue analizada para cambios en la hemodinámica en perros anestesiados en una dosis de 20 mg/kg. No se observaron cambios en la presión arterial media o presión arterial pulmonar. Estos resultados indican que no se observan efectos hemodinámicos con la emulsión de gas a 10-100 veces la dosis clínicamente pertinente.

Tiempo (minutos) Presión Arterial Presión Arterial Media (mmHg) Pulmonar (mmHg) 0 109 . 4 13 . 3 1 109 . 2 14 . 2 2 110 .4 14 . 1 5 115.0 14.3 10 117.9 15.7 60 111.0 13.2 90 120.9 13.6 Por lo tanto, la excelente eficacia y biocompatibilidad se proporcionan en la misma formulación de emulsión de gas. Ejemplo VII Formación de microburbuias empleando un frasco de dos cámaras Se pesaron 800 mg de polvo deshidratado por aspersión en la cámara inferior de un frasco de dos cámaras de 20 ml Wheaton RS-177FLW. El frasco se lavó con nitrógeno saturado de perfluohexano a 13°C antes de insertar el sello entre las cámaras. La cámara superior se llenó con 10 ml de agua estéril para inyección. El tapón de la cámara superior se insertó para eliminar todas las burbujas de aire en la cámara superior. Al oprimir el tapón superior, el sello entre las cámaras se forzó a la cámara inferior, permitiendo que el agua fluya a la cámara inferior y reconstituya el polvo. Se formaron numerosas microburbujas estables como la demuestra la microscopía óptica. Este procedimiento demuestra la comodidad de esta forma de empacado y la eliminación de la necesidad de proporcionar un orificio de ventilación para eliminar la acumulación de presión cuando la fase acuosa es agregada al polvo.

Ejemplo VIII Formación de microburbujas usando una jeringa de dos cámaras Se pesaron cien mg de polvo deshidratado por aspersión en una jeringa de doble cámara de 5 ml + 5 ml Líquido/Seco HYPAK (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se agitaron en la cámara de polvo (extremo de aguja) . El sello entre las cámaras después se colocó justo arriba del canal de derivación. Después una aguja que contiene un filtro de 5 µM se adaptó en la jeringa. La cámara que contiene el polvo después se llenó con el agente osmótico gaseoso colocando el equipo en una cámara de vacío, evacuando y llenando la cámara con el agente osmótico gaseoso, oxígeno saturado de perfluohexano a 13°C. La aguja con filtro permite la evacuación y el llenado de la atmósfera en la cámara que contiene el polvo. Después se colocó una cubierta sellante de aguja en la aguja. La cámara del líquido después se llenó con 4 ml de agua para inyección y el émbolo se asentó usando un orificio de ventilación temporal (alambre insertado entre el cuerpo de la jeringa de vidrio y el émbolo para eliminar todas las burbujas de aire. Para reconstituir, la cubierta sellante de aguja se retiró para eliminar la acumulación de presión en la cámara del polvo. Después el émbolo se oprimió, forzando el sello entre las cámaras a la posición de derivación la cual permitió que el agua fluyera alrededor del sello entre las cámaras a la cámara que contiene el polvo. El movimiento del émbolo se detuvo cuando toda el agua estaba en la cámara de polvo, la jeringa se agitó para disolver el polvo. El exceso de gas y las burbujas grandes fueron expulsados sosteniendo la jeringa, con el extremo de la aguja hacia arriba, y oprimiendo el émbolo. La solución que contiene numerosas microburbujas estabilizadas (como se observa en la microscopía óptica) después fue expulsada de la jeringa oprimiendo el émbolo hasta su límite. Ejemplo IX Eficacia in vivo de emulsiones de gas gue contienen fluoroéter contra emulsiones de gas gue contienen aire y fluoalcano Se preparó un litro de la dispersión A y se deshidrató por aspersión como se describe en el Ejemplo III. Se preparó un litro de dispersiones B y C y se deshidrató por aspersión como se describe en el Ejemplo V. A. Formulación de Microburbujas de Éster de Sacarosa ("AF0145" en la Tabla) 36 g de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 30 g de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) 26 g de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 3.9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 4.5 g de éster de sacarosa 11025003 (Alliance Pharmaceutical Corp., San Diego, CA) 19.5 g de Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ) 30 ml de 1, 2, 2-triclorotrifluoetano (Freón 113; EM Science, Gibbstown, NJ) Agua para inyección: 490 ml B. Formulación de Microburbujas de Mezcla de Fosfolípidos ("24b" en la Tabla) 36 g de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 30 g de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) 26 g de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 3.9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 4.5 g de fosfatidilcolina de dimiristol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) 4.5% g de fosfatidilcolina de dioctanol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) 5.8% v/v de perfluohexano (3M) Agua para inyección: 490 ml C. Formulación de Microburbujas de Mezcla de Fosfolípidos ("24f" en la Tabla) 36 g de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 30 g de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) 26 g de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 3.9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 3.4 g de fosfatidilcolina de dimiristol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) 4.8% g de fosfatidilcolina de dioctanol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) 5.8% v/v de perfluohexano (3M) Agua para inyección: 490 ml Se colocaron muestras de 100 mg de polvo deshidratado por aspersión en frascos de 10 ml y fueron gaseadas mediante ciclos repetidos de evacuación-gasificación de mezcla de perfluoroéter-aire con la ayuda de una aguja de jeringa equipada con una válvula de tres sentidos. Como los gases de relleno, se usaron éter de perfluorodimetilo (85%, Exfluor Research, Texas, Austin) , éter de perfluorometiletilo (80%, Exfluor Research, Texas, Austin) , éter perfluorodietilo (90&, Strem Chemicals, Newburyport, MA) , n-perfluopropano y n-perfluobutano (97%, PCR Incorporated) . En la Tabla aparece la cantidad de vapores de perfluoroéter y perfluocarburo por frasco. Después de reconstituirse con 5 ml de agua, se formaron las burbujas, las cuales estuvieron estables in vitro por varios días . Sus propiedades ecogénicas in vivo fueron evaluadas usando una Mejora de Señal de Impulsos Doppler Modelo para Conejo como se describe en el Ejemplo III. Las propiedades de las dispersiones de burbujas se resumen en la siguiente tabla.

Todas las muestras de perfluoroéter proporcionaron una señal de ultrasonido considerable de hasta 300 s después de la inyección al flujo sanguíneo. Las mismas preparaciones llenadas con aire no mostraron ecogenicidad 5 s después de la inyección. Además, las muestras llenadas con perfluoroéter tuvieron una eficiencia de 20-30% mejor que sus análogos de fluocarburos con el mismo número de átomos de carbono, aun cuando se aplicaron en cantidades más pequeñas. La figura ilustra la señal de impulsos Doppler en voltios como una función de tiempo para los experimentos 1 y 2 mostrados en la tabla anterior. Ejemplo X Ecogenicidad in vivo del corazón e hígado después de la administración de emulsión de gas de fluoroéter contra emulsión de gas gue contiene fluoalcano Las muestras 2 y 3 como se muestran en la Tabla del Ejemplo IX se inyectaron a una vena de oído de un conejo, después de lo cual la señal dispersa de ultrasonido se midió por un instrumento ACUSÓN 128XP con un transductor de 7 MHz. Justo después de la inyección, ambas composiciones condujeron a un contraste substancial de los vasos sanguíneos y el corazón. Este contraste se desvaneció gradualmente (en la escala de tiempos de varios minutos) y fue reemplazado contrastando el hígado, lo cual duró -10 minutos con perfluobutano (muestra 3) y -15 minutos con éter de perfluorometiletilo (muestra 2) . La presente invención proporciona una dispersión o emulsión de gas estable que es adecuada para uso como agentes de mejora del contraste de reproducción de imágenes de ultrasonidos y resonancia magnética en donde las burbujas tienen una longevidad prolongada in vivo . Los agentes normales de mejora del contraste de ultrasonidos sólo presentan un potencial de mejora del contraste para aproximadamente una pasada a través del sistema de las arterias, o de unos segundos a un minuto. En consecuencia, estos agentes generalmente no son circulados por la aorta en un paciente después de una inyección intravenosa. En comparación, los agentes de contraste estables preparados en conformidad con la presente invención continúan demostrando duración de mejora del contraste suficiente para pasadas múltiples a través de todo el sistema circulatorio de un paciente después de la inyección intravenosa. La vida de burbujas in vivo de varios minutos se demuestra fácilmente. Esta prolongación del potencial de mejora del contraste durante el ultrasonido es muy conveniente. Además, los agentes de mejora del contraste de la invención proporcionan una excelente reproducción de imágenes. Por ejemplo, se logran imágenes claras, vivas y nítidas de la sangre fluyendo a través del corazón, hígado y ríñones. Por lo tanto, pueden administrarse dosis pequeñas, no tóxicas de las composiciones de la presente invención en una vena periférica y usarse para mejorar las imágenes de todo el cuerpo. Ejemplo XI Eficacia in vivo de emulsiones de gas gue contienen perfluoroéter contra emulsiones de gas gue contienen perfluoalcano; modelo para conejo Se preparó un litro de la dispersión D y se deshidrató por aspersión como se describe en el Ejemplo V. Composición de la Dispersión D: 43.2 g de almidón de hidroxietilo m-HES (Ajinimoto, Tokio, Japón) 31.32 g de fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 4.68 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, San Luis, MO) 1.2 g de Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ) 6 g de fosfatidilcolina de dimiristol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) 61.2 g de perfluohexano (3M) 44.4 g de cloruro de sodio (Mallinckrodt, San Luis, MO) Agua para inyección: 945 ml Se colocaron muestras de 200 mg del polvo deshidratado por aspersión en frascos de 20 ml y se gasearon por una mezcla de agente • osmótico y nitrógeno, preparada preliminarmente en una bolsa de aire de 1 L. Los frascos con polvo fueron evacuados repetidamente y llenados con la mezcla de un agente osmótico y nitrógeno bajo la presión total de 1 atm; la presión parcial del agente osmótico ascendió a 0.13 ± 0.03 atm. Los agentes osmóticos estudiados se incluyen en la Tabla III.

Tabla III Agentes Osmóticos Usados en mezclas con nitrógeno con el Polvo D Fórmula (nombre) Fuente punto de Tiempo de ebullición, desintegración de la °C señal Doppler a la en n "C4F10 97%, PCR Incorporated -2 300 (perfluobutano) CF, -0-CF2CF2- O-CF, 99% , Exfluor 17 400 (perfluoromonoglime) Research, Austin, TX n-C3F12 97% , PCR Incorporated 29 400 (perfluopentano) CF3 - (OCF2) 3OCF3 95% , síntesis de 59 -1200 (C3F1204) aduana ^-C6F14 98% , 3M 57 600 (perfluohexano) CF3- (OCF2CF2) 2OCF3 99%, Exfluor 64 >1800 (perfluorodiglime) Research, Austin, TX Después de reconstituir el polvo con 10 ml de agua, se formaron las burbujas. Sus propiedades ecogénicas in vivo se evaluaron usando una Mejora de Señal de Impulsos Doppler Modelo para Conejo como se describe en el Ejemplo III, con la diferencia de que la dosis inyectada se redujo a 0.2 ml (cerca de 1 mg de polvo seco por kg de conejo) . Las figuras 2a, 2b y 2c comparan la desintegración de la señal de ultrasonido con el tiempo para diferentes gases de relleno a presiones parciales cercanas. Los datos se arreglan en pares para que las preparaciones de microburbujas que contienen perfluoroéteres (líneas gruesas) sean comparadas directamente con sus análogos de perfluocarburos (líneas delgadas) . De las gráficas, es evidente que las burbujas llenadas con perfluoroéter tengan una persistencia más larga en el flujo sanguíneo que sus análogos de fluocarburos. Ejemplo XII Eficacia in vivo de emulsiones de gas gue contienen perfluoroéter contra emulsiones de gas gue contienen perfluoalcano; modelo para cerdo El Polvo D se preparó como se describe en el Ejemplo XI y se llenó con mezcla de perfluohexano-N2 (28 mg de agente osmótico por frasco, presión parcial de 0.16 atm) y mezcla de C5F1204-N2 (22 mg de agente osmótico por frasco , presión parcial de 0.12 atm). Después de reconstituir el polvo con 10 ml de agua, se formaron las burbujas. A los cerdos anestesiados (14-16 kg) se les colocaron catéteres residentes en la arteria femoral y venas femoral y yugular para monitoreo hemodinámico y administración del agente de contraste. Las imágenes cardíacas de eje corto paraesternales en el nivel de los músculos papilares se obtuvieron usando una máquina de ultrasonido HP Sonos 2500.

Las imágenes se adquirieron en el modo de Segunda Armónica con una sonda lineal de alineamiento en fase con ancho de banda amplio emitiendo a 2 MHz y recibiendo a 4 MHz. La reproducción de imágenes era intermitente (desconectada cíclicamente) , activada en el diástole de extremo de cada ciclo cardíaco. Se diluyó 0.5 mL de agente de contraste reconstituido con 0.5 mL de solución salina y se instiló durante 1 minuto a través de la vena yugular. Las Figuras 3a, 3b y 3c representan una imagen del corazón antes de la instilación del agente de contraste (3a) , un minuto (3b) y seis minutos (3c) después de la inyección. El contraste substancial del corazón es evidente (Fig. 3b) para ambos gases de relleno un minuto después de la inyección. Sin embargo, mientras que todavía hay una gran cantidad de contraste de tejido en la imagen obtenida usando la preparación de microburbujas comprendiendo un perfluoroéter a seis minutos (Fig. 3c) , el contraste en la imagen obtenida usando una preparación de microburbujas comprendiendo perfluohexano ha disminuido notablemente. Esto demuestra que las microburbujas llenadas con perfluoropoliéter proporcionan claramente imágenes de contraste clínicamente útiles por un período extendido. La descripción anterior detalla ciertas realizaciones preferidas de la presente invención y describe el mejor modo contemplado. Sin embargo, se apreciará que no importa qué tan detallado aparece lo anterior en el texto, la invención puede practicarse de muchas maneras y la invención deberá interpretarse en conformidad con las Reivindicaciones anexadas y sus equivalentes.

Claims (53)

1. REIVINDICACIONES 1. Una emulsión de gas para mejora del contraste de ultrasonidos, que comprende una pluralidad de burbujas de gas en un medio líquido, dichas burbujas de gas comprenden un fluoroéter.
2. 2. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde dichas burbujas de gas comprenden un perfluoroéter.
3. 3. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde dicho fluoroéter es seleccionado del grupo que consiste en CH3CH2OCF2CHF2, CH3CH2OCF2CF2_ CHF2CH2OCF2CHF2< CF3CH2OCF2CH2F_ CF3CH2OCH2CF3> CF3CH2OCF2CHF2/ CHF2CH2OCF2CF3? CF3CH2OCF2CF3 , CH3OCH2CF2CHF2/ CH3OCH2CF2CF3j CH3OCF2CF2CHF2/ CH3OCF2CHFCF3, CH3OCF2CF2CF3r CHF2OCH2CF2CHF2_ CHF2OCH2CF2CF3 , CF3OCH2CF2CHF2 , CF3OCH2CF2CF3 , CH3OCH(CF3)2, CH30CF (CF3) 2, CHF2OCH ( CF3 ) 2 , CH3OCH2CHF2, CH3OCF2CH2F, CH3OCH2CF3, CH3OCF2CHF2, CHF2OCH2CHF2 , CHF2OCF2CH2F, CHF2OCH2CF3, CHF2OCHFC3, CF3OCH2CHF2, CH3OCF2CF3, CF3OCH2CF3, CF3OCHFCF3, C3OCF2OCF3, CF3 (0CF2) 2OCF3, CF3 (0CF2) 3OCF3, CF3(OCF2)4OCF3 y mezclas de éstos.
4. 4. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde el fluoroéter es seleccionado del grupo que consiste en perf luorodiet iléteres , perf luorodimet iléteres , perfluorodiglimas, perfluorometiletiléteres y perf luoromonoglimas .
5. 5. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde las burbujas de gas adicionalmente comprenden aire o nitrógeno.
6. 6. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde las burbujas de gas son rodeadas por una capa de surfactante .
7. 7. La emulsión de gas de la Reivindicación 6, en donde la capa surfactante comprende un surfactante seleccionado del grupo que consiste en surfactantes no iónicos, surfactantes neutros, surfactantes aniónicos, surfactantes fluorados neutros, surfactantes fluorados aniónicos y combinaciones de los mismos.
8. 8. La emulsión de gas de la Reivindicación 6, en donde dicha capa de surfactante comprende un surfactante no Neotoniano.
9. 9. La emulsión de gas de la Reivindicación 6, en donde dicha capa surfactante comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en fosfolípidos, ácidos grasos, copolímeros de bloque y esteres de azúcar.
10. 10. La emulsión de gas de la Reivindicación 6, en donde la capa de surfactante comprende por lo menos un primer surfactante y un segundo surfactante, el primer surfactante constando esencialmente de un fosfolípido o una mezcla de fosfolípidos teniendo por lo menos una cadena de acilos la cual comprende por lo menos 10 átomos de carbono y comprendiendo por lo menos alrededor de 5% w/w del surfactante total y en donde el segundo surfactante es más soluble en agua que el primer surfactante.
11. 11. La emulsión de gas de la Reivindicación 10, en donde dicho segundo surfactante es seleccionado del grupo que consiste en ácidos grasos, sales de ácidos grasos, esteres de azúcar de ácidos grasos, copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno, alquilglucósidos no iónicos, polisorbato y combinaciones de éstos.
12. 12. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde dichas burbujas de gas son burbujas de gas libres.
13. 13. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde las burbujas de gas además comprenden microesferas.
14. 14. La emulsión de gas de la Reivindicación 13, en donde dichas microesferas comprenden proteína.
15. 15. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde las burbujas de gas además comprenden un liposoma.
16. 16. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde dichas burbujas de gas son formadas a través de la solubilidad de estructuras que contienen huecos.
17. 17. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde dichas burbujas de gas son formadas alterando la presión en un líquido emulsificado que comprende una fase acuosa y dicho fluoroéter.
18. 18. La emulsión de gas de la Reivindicación 1, en donde dichas microburbuj s son formadas a través del sonido.
19. 19. Un método para formar una emulsión de gas comprendiendo los siguientes pasos : proporcionar un recipiente teniendo un material estructural que define una pluralidad de huecos, un surfactante y un gas o una mezcla de gases comprendiendo un fluoroéter disperso en los huecos; agregar un líquido acuoso al recipiente y mezclar el material estructural, el surfactante y el líquido acuoso, formando con ello una emulsión de gas en el recipiente, la emulsión de gas comprendiendo burbujas del gas o la mezcla de gases rodeadas por una capa del surfactante. 20. El método de la Reivindicación 19, en donde dicrio material estructural es substancialmente soluble en agua. 21. El método de la Reivindicación 19, en donde dicho fluoroéter es seleccionado del grupo que consiste en
20. CH3CH2OCF2CHF2 , CH3CH2OCF2CF2> CHF2CH2OCF2CHF2< CF3CH2OCF2CH2F_ CF3CH2OCH2CF3j CF3CH2OCF2CHF2_ CHF2CH2OCF2CF3/ CF3CH2OCF2CF3 , CH3OCH2CF2CHF2< CH3OCH2CF2CF3j CH3OCF2CF2CHF2j CH3OCF,CHFCF, CH3OCF2CF2CF3, CHF2OCH2CF2CHF2, CHF2OCH2CF2CF3, CF3OCH2CF2CHF2,
21. CF3OCH2CF2CF3, CH3OCH(CF3)2, CH3OCF (CF3) 2, CHF2OCH (CF3) 2,
22. CH3OCH2CHF2, CH3OCF2CH2F, CH3OCH2CF3, CH3OCF2CHF2, CHF2OCH2CHF2 ,
23. CHF2OCF2CH2F, CHF2OCH2CF3, CHF2OCHFC3, CF3OCH2CHF2, CH3OCF2CF3, CF3OCH2CF3, CF3OCHFCF3, C3OCF2OCF3, CF3 (OCF2) 2OCF3, CF3 (OCF2) 3OCF3,
24. CF3 (OCF2)4OCF3 y mezclas de éstos. 22. El método de la Reivindicación 19, en donde el fluoroéter es seleccionado del grupo que consiste en perfluorodietiléteres, perfluorodimetiléteres, perfluorometiletiléteres perfluorodiglimas, y perfluoromonoglimas . 23. El método de la Reivindicación 19 en donde dicho material estructural comprende dicho surfactante. 24. El método de la Reivindicación 19, en donde la capa de surfactante comprende un surfactante seleccionado del grupo que consta de fosfolípidos, fosfocolinas, lisofosfolípidos, surfactantes no iónicos, surfactantes neutros, surfactantes aniónicos, surfactantes fluorados neutros, surfactantes fluorados aniónicos y combinaciones de los mismos. 25. El método de la Reivindicación 19, en donde dicho material es seleccionado del grupo que comprende estructuras que contienen huecos y estructuras solubles de formación de huecos . 26. El método de la Reivindicación 19, en donde dicho material estructural es seleccionado del grupo que consta de azúcares, microesferas deshidratadas por aspersión, polvos liofilizados, pastilla liofilizada, azúcares en polvo y granulada, microesferas de proteína y ácido hialurónico poroso deshidratado. 27. Una composición de precursores de microburbujas que comprende : un material estructural que define una pluralidad de huecos; un gas o una mezcla de gases que comprende un fluoroéter disperso en los huecos; y un surfactante, en donde dicho material, dicho gas o la mezcla de gases y dicho surfactante están adaptados entre sí para formar microburbujas en la adición de un líquido al recipiente. 28. La composición de la reivindicación 27, en donde dicho material estructural es substancialmente soluble en agua. 29. La composición de la Reivindicación 27, en donde dicho fluoroéter es seleccionado del grupo que consiste en CH3CH2OCF2CHF2, CH3CH2OCF2CF2; CHF2CH2OCF2CHF2j CF3CH2OCF2CH2F CF3CH2OCH2CF3_ CF3CH2OCF2CHF2_ CHF2CH2OCF2CF3/ CF3CH2OCF2CF3 ,
25. CH3OCH2CF2CHF2, CH3OCH2CF2CF3/ CH3OCF2CF2CHF2/ CH3OCF2CHFCF3/
26. CH3OCF2CF2CF3_ CHF2OCH2CF2CHF2j CHF2OCH2CF2CF3, CF3OCH2CF2CHF2,
27. CF3OCH2CF2CF3, CH3OCH(CF3)2, CH3OCF (CF3) 2, CHF2OCH (CF3) 2 , CH3OCH2CHF2, CH3OCF2CH2F, CH3OCH2CF3, CH3OCF2CHF2, CHF2OCH2CHF2 ,
28. CHF2OCF2CH2F, CHF2OCH2CF3, CHF2OCHFC3, CF3OCH2CHF2, CH3OCF2CF3,
29. CF3OCH2CF3, CF3OCHFCF3, C3OCF2OCF3, CF3 (OCF2) 2OCF3, CF3 (OCF2) 3OCF3,
30. CF3 (OCF2)4OCF3 y mezclas de éstos. 30. La composición de la Reivindicación 27, en donde el fluoroéter es seleccionado del grupo que consiste en perfluorodietiléteres, perfluorodimetiléteres, perfluorometiletiléteres perfluorodiglimas, y perfluoromonoglimas .
31. 31. La composición de la Reivindicación 27, en donde dicho material estructural comprende dicho surfactante.
32. 32. La composición de la Reivindicación 27 en donde el surfactante es seleccionado del grupo que consta de fosfolípidos, fosfocolinas, lisofosfolípidos, surfactantes no iónicos, surfactantes neutrales, surfactantes aniónicos, surfactantes fluorados neutrales, surfactantes fluorados aniónicos y combinaciones de los mismos.
33. 33. La composición de la Reivindicación 27 en donde ?l material estructural es seleccionado del grupo de estructuras que contienen huecos y estructuras solubles en agua que forman huecos .
34. 34. La composición de la Reivindicación 27 en donde el material estructural es seleccionado del grupo que consta de microesferas deshidratadas por aspersión, azúcares en polvo -y granulada, polvos liofilizados, pastillas liofilizadas, microesferas de proteína y ácido hialurónico poroso deshidratado.
35. 35. La composición de la Reivindicación 34 en donde el material estructural comprende microesferas deshidratadas por aspersión y estas microesferas deshidratadas por aspersión comprenden un compuesto seleccionado del grupo que consta de almidones, almidones derivados y esteres de azúcar.
36. 36. Un método para reproducir ultrasónicamente la imagen de un objeto o cuerpo comprendiendo los siguientes pasos : introducir el medio de contraste de la Reivindicación 1 en dicho objeto o cuerpo; y reproducir la imagen de por lo menos una parte de dicho objeto o cuerpo.
37. 37. El método de la Reivindicación 36 en donde dicha etapa de reproducción de imágenes comprende la reproducción de imágenes de ultrasonidos por armónicas.
38. 38. Un método para reproducir por resonancia magnética la imagen de un objeto o cuerpo comprendiendo los siguientes pasos : introducir el medio de contraste de la Reivindicación 1 al objeto o cuerpo; y reproducir la imagen de por lo menos una parte del objeto o cuerpo. 39. Una composición de microburbujas para su uso en la reproducción de imágenes, que comprende una pluralidad de microburbujas en un medio líquido biocompatible, en donde dichas microburbujas comprenden al menos un agente osmótico de gas de fluoroéter, y al menos un gas modificador. 40. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dicho agente osmótico de gas de fluoroéter comprende un perfluoroéter. 41. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dicho agente osmótico de gas de fluoroéter es seleccionado del grupo que consiste en CH3CH2OCF2CHF2, CH3CH2OCF2CF2_ CHF2CH2OCF2CHF2r CF3CH2OCF2CH2F; CF3CH2OCH2CF3/ CF3CH2OCF2CHF2r CHF2CH2OCF2CF3_ CF3CH2OCF2CF3 ,
39. CH3OCH2CF2CHF2j CH3OCH2CF2CF3_ CH3OCF2CF2CHF2; CH3OCF2CHFCF3/
40. CH3OCF2CF2CF3/ CHF2OCH2CF2CHF2_ CHF2OCH2CF2CF3, CF3OCH2CF2CHF2,
41. CF3OCH2CF2CF3, CH3OCH(CF3)2, CH3OCF (CF3) 2, CHF2OCH (CF3) 2, CH3OCH2CHF2, CH3OCF2CH2F, CH3OCH2CF3, CH3OCF2CHF2, CHF2OCH2CHF2,
42. CHF2OCF2CH2F, CHF2OCH2CF3, CHF2OCHFC3, CF3OCH2CHF2, CH3OCF2CF3,
43. CF3OCH2CF3, CF3OCHFCF3, C3OCF2OCF3, CF3 (OCF2) 2OCF3, CF3 (OCF2) 3OCF3,
44. CF3(OCF2)4OCF3 y mezclas de éstos. 42. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dichas microburbujas además comprenden microesferas . 43. La composición de microburbujas de la reivindicación 42, en donde dichas microesferas comprenden una proteína. 44. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dichas microburbujas además comprenden un liposoma.
45. 45. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dichas microburbujas son formadas a través de la solubilización de estructuras que contienen huecos .
46. 46. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dichas microburbujas son formadas alterando la presión en un líquido emulsificado que comprenda una fase acuosa y dicho agente osmótico de gas de fluoroéter.
47. 47. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dichas microburbujas son formadas a través del sonido.
48. 48. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dichas microburbujas además comprenden una capa surfactate.
49. 49. La composición de microburbujas de la reivindicación 48, en donde dicha capa de surfactante comprende un compuesto seleccionado del grupo que consta de surfactantes no iónicos, surfactantes neutros, surfactantes aniónicos, surfactantes fluorados neutros, surfactantes fluorados aniónicos y combinaciones de los mismos.
50. 50. La composición de microburbujas de la reividicación 48, en donde dicha capa de surfactante comprende un surfactante no Neotoniano.
51. 51. La composición de microburbujas de la reivindicació 48, en donde dicha capa de surfactante comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en fosfolípidos, ácidos grasos, copolímeros de bloque y esteres de azúcar.
52. 52. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dicho gas modificador comprende oxígeno.
53. 53. La composición de microburbujas de la reivindicación 39, en donde dicho gas modificador comprende nitrógeno.