CZ262598A3

CZ262598A3 - Vodné disperze mikrobublinek plynu a kontrastní prostředek

Info

Publication number: CZ262598A3
Application number: CZ982625A
Authority: CZ
Inventors: Harald Dugstad; Jo Klaveness; Päl Rongved; Roald Skurtveit; Jorun Braenden
Original assignee: Nycomed Imaging A/S
Priority date: 1996-02-19
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 1999-05-12
Also published as: AP9801319A0; IL125748A; CZ293986B6; HK1014872A1; EP1331013A3; KR100500334B1; EE9800249A; JP2000511510A; ES2197986T3; PL328406A1; KR19990082669A; PT881915E; US20030202942A1; TR199801613T2; CN1278740C; OA10839A; CN1213972A; BG102758A; CA2246779A1; EP0881915A1

Description

Oblast tefchniky s X /, .^Vynález se týká vodné disperze mikrobublinek v plynu a kontrastního prostředku pro diagnostické zobrazování, který tuto' disperzi obsahuje.

‘ · ^! ·<“ , ' ^:· '· X-· ’’ : .

· · X . ' · '· ''

Dosavadní stav techniky

Jjé známo, že zobrazování pomocí ultrazvuku je potenciálně, cenným diagnostickým prostředkem, zvláště při zobrazování, cévního systému, zejména při kardiografii a při sledování cévního zásobení tkání. Byla navržena celá řada kontrastních Činidel pro zvýraznění obrazu, získaného tímto způsobem, šlo zejména oj suspenze pe vnycřrčč.sttc—emui-gavané— kapičky kapaliny, bublinky plynu a zapouzdřené plyny nebo kapaliny. Obecně se uznává,.; že. kontrastní Činidla s nízkou hustotou, která jsou .snadno stlačitelná, jsou zvláště účinná při zintenzivnění vytvořeného' obrazu. Z tohoto důvodu se zájem soustředí na přípravu.systémů, které obsahují plyn nebo v nichž se plyn v^váří.j>:

Je známo, . že kontrastní, .prostředky s obsahem plynu jsou účinné také při zob rázování' pomocí, .magnetické rezonance MR vzhledem k tomu, že kontrastní činidla mohou snížit, intenzitu signálu při magnetické rezonanci. K tomuto účelu jsou zvláště vhodné prostředky s obsahem- kyslíku, „zvláště při provádění paramagnetické. magnetické rezonance...

Také při zobrazování pomocí rtg-záření bylo prokázáno, že plyny, například oxid uhličitý je možno.užít'jako perorální kontrastní prostředky nebo·, pro zobrazování cévního systému. 7.

Φ Φ

ΦΦΦ «

- 2 Μ . ΦΦ • Φ. Φ' Φ

Φ Φ, Φ

ΦΦΦ • φ Φ »9 ΦΦΦΦ

Bylo rovněž navrhováno použití radioaktivních plynů, například radioaktivních isotopů inertních plynů, jako xenonu pro scintigrafii, zejména pro zobrazování cév.

Počáteční studie, při nichž byly užívány volné bublinky plynu, vytvořené in vivo při intrakardiální injekci fyziologicky přijatelných látek prokázaly potenciální účinnost takových bublinek jako kontrastních činidel při zobrazování pomocí ultrazvuku. Tyto postupy jsou však při praktickém pro——vádění-jyelíni omezeny krátkou životností volných bublinek. Zájem byl proto soustředěn na stabilizaci bublinek plynuj například použitím emulgátorů, olejů, zahuštovadel nebo cukrů nebo také zapouzdřením plynu nebo prekurzoru plynu do různých systémů, například do mikročástic nebo ve formě mikrobublinek zapouzdřeného plynu.

Byla publikována celá řada zpráv, týkajících se použití fosfolipidů, jako složek kontrastních činidel s obsahem plynu pro zobrazování pomocí ultrazvuku. Například v US-A-4 900 540 se popisuje použití fosfolipidových liposomů, v nichž obklopuje lipidová dvojvrstva látku, tvořenou plynem nebo prekurzorem plynu, jako kontrastní prostředek pro zobrazování pomocí ultrazvuku. Zapouzdřeným materiálem je v typických případech prekurzor plynu, například vodný hydrogenuhličitan sodný, který uvolní oxid uhličitý po podání do organismu a po vystavení pH v lidském organismu. Jádra výsledných liposomů pak budou obsahovat kapalinu s obsahem velmi malých mikrobublinek v plynu, které však budou jen málo přispívat ke zvýšení kontrastu obrazu vzhledem ke svým malým rozměrům.

V patentové přihlášce WO-A-91/15 244 se popisuje kontrastní prostředek pro zobrazování ultrazvukem, který obsahuje mikrobublinky vzduchu nebo jiného plynu, vytvořené v suspenzi liposomů, naplněných kapalinou, přičemž ♦ · ···· • ft ftft ftftft..· · · ft ftftftft ftft ft ftft ft ftftftft • ft · ftft ft '«.ft ftftft ftftft • ftft ftftftft · · fte ftftftft ftft ftft ftft ftft

-3 liposomy zcela zřejmě stabilizují vytvořené mikrobublinky. Takové systémy jsou odlišné od systému podle svrchu uvedeného US patentového spisu, podle nějž se bublinky plynu nebo vzduchu nacházejí uvnitř liposomů.

V patentové přihlášce WO-A-92/11 873 se popisují vodné prostředky pro absorpci a stabilizaci mikrobublinek, které je možno použít jako kontrastní látky pro zobrazování pomocí ultrazvuku, prostředek obsahuje polymery poly. o xy.e-t hy. l.e.nu_a. polyoxypropylenu a negat i vně nabité fosfolipidy. Hmotnostní poměr polymerů k fosfolipidu je v typických případech 3:1,

Kontrastní činidla pro zobrazování ultrazvukem, obsahující liposomy, naplněné plynem , to znamená liposomy, ‘v^odsTaťě*“pro^_s-té~kapai-iny-5—věe-t-ně—způsobu—vý.ro.b.V—tjchto činidel jsou popsána v patentové přihlášce WO-A-92/22 247. Příprava liposomů s obsahem plynu ve stavu gelu vstřikováním plynu je popsána v patentové přihlášce WO-A-94/28 780. Lipidové dvojvrstvy, tvořené dipalmitoylfosfatidylcholinem,, naplněné plynem jsou jako kontrastní činidla pro zobrazování ultrazvukem popsány v publikaci Unger a další, Investigative Radiology 29, doplněk 2, str. 134 až 136, 1994.

V patentové přihlášce W0-A-94/09 829 se popisuje suspenze mikrobublinek v plynu pro injekční podání ve vodném nosném prostředí, obsahujícím nejméně jeden fosfolipid jako stabilizátor, přičemž koncentrace fosfolipidu v nosném prostředí je nižší než 0,01 °/o hmotnostních, je však vyšší nebo rovna množství, v němž jsou fosfolipidové molekuly přítomny na rozhraní mikrobublinek plynu a kapaliny. Množství fosfolipidu tedy může být pouze takové, aby bylo dostatečné pro tvorbu jednoduché vrstvy povrchově aktivní látky kolem mikrobublinek plynu, přičemž výsledná, filmu podobná struktura *

Vf «* • · «« · · • · ♦ · · · ·

4 · · · 4 · 4 4

-4 stabilizuje bublinky proti praskání nebo spojování bublinek. V případě, že se užije uvedených nízkých koncentrací fosfolipidů, uvádí se, že nedochází ke vzniku mikrobublinek typu liposomů s dvojvrstvou povrchově aktivní látky.

Dalším problémem, rovněž již dříve řešeným, je volba plynu v mikrobublinkách kontrastního prostředku pro zobrazování tak, aby bylo dosaženo co největší stability a trvání echogenního účinku. Například v patentové přihlášce W0-A-9-3-/-Q5-8-l-9-se-navrhuj.e_p.O-UŽití volných mikrobublinek plynů s koeficientem Q vyšším než 5, přičemž

Q = 4,0 χ 10⁷ x p/C D s kde p je hustota plynu v kg.m , C je rozpustnost plynu ve vodě v mol/1 a D je ďifusivi tar^lynu~*v^_roz'toku—v—em—/-s-.—— V publikaci se uvádí řada plynů, splňujících tento požadavek.

V EP-A-0554213 se navrhuje stabilizovat mikrobublinky plynu proti praskání pod tlakem s malou rozpustností ve vodě, melo by jít o plyn, jehož rozpustnost ve vodě, vyjádřená v litrech plynu na litr vody za standardních podmínek, dělená čtvercem molekulové hmotnosti plynu nepřevyšuje hodnotu 0,003. Výhodnými plyny jsou například fluorid sírový, fluorid selenový a různé freony. Tyto plyny mohou být použity také v prostředcích s obsahem fosfolipidů, tak jak byly popsány ve svrchu uvedené patentové přihlášce W0-A-92/15244.

V publikaci Schneider a další, Investigative Radiology, 30(8), str. 451 až 457, 1995 se popisuje nové kontrastní činidlo pro použití při zobrazování ultrazvukem, jde o mikrobublinky s obsahem fluoridu sírového, stabilizované kombinací polyethylenglykolu 4000 a směsí fosfolipidů distearoyl»·*· • * φ tt » · Φ » φ φ φ » · φ φ • « Φ φφ φ ·»».

• ‘φ φ ΦΦ φ · · ΦΦΦΦΦΦ φ Φ Φ ΦΦΦΦ Φ · * φφ 5S95 ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·φ I λ

- 5 fosfatidylcholínu a dipalmitoylfosfatidylglycerolu. Uvádí se, že v případě použití fluoridu sírového místo vzduchu je možno dosáhnout zlepšené odolnosti při vyšším tlaku, k němuž dochází například v levém srdci v průběhu systoly.

V patentové přihlášce V0-A-95/03 835 se popisuje použití mikrobublinek, obsahujících směs plynů, jejíž složení ' závisí na parciálním tlaku plynu uvnitř a vně mikrobublinek, tak, aby byl brán zřetel na osmotické vlivy na rozměr mikro—b.ubl.ínj5.k.._yhodné směsi plynů obsahují plyn s nízkým tlakem par a omezenou rozpustností v krvi nebo krevním séru, například fluorovaný uhlovodík v kombinaci s dalším plynem, k jehož výměně rychle dochází s plyny, přítomnými v normální krvi nebo krevním séru, jde například o dusík, kyslík, oxid uhličitý nebo směsi těchto plynů.

V patentové přihlášce WO-A-95/16 467 se navrhuje použití kontrastních prostředků, Obsahujících směs plynů A a B, přičemž plyn B je přítomen v množství 0,5 až 41 % objemových, má molekulovou hmotnost vyšší než 80 a rozpustnost ve vodě nižší než 0,0283 ml/ml vody za běžných podmínek, zbytek směsi tvoří plyn A, Jako příklad plynů typu A je možno uvést vzduch, kyslík, dusík, oxid uhličitý a směsi těchto plynů. Jako příklad plynu B je možno použít plyny s obsai, hem fluoru, jako fluorid sírový a různé perfluorované uhlovodíky. Výhodnými stabilizátory pro takové kontrastní pro> středky jsou například fosfolipidy.

Fosfolipidy, o nichž bylo prokázáno, že jejich použití je v kontrastních prostředcích užitečné, jsou například lecithiny, to znamená fosfatidylcholiny, například přírodní lecithiny, jako lecithin ze sóji nebo vaječného žloutku a syntetické nebo polosyntetické lecithiny, napří^ř klad dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin nebo distearoylfosfatidylcholin, fosfatidové kyseliny,

- 6 φφ φ · • · * φ φ • φ · • φ φφφ φφφ ·

II 99 Φ φ 95 ·· φφφφ fosfatidylethanolaminy, fosfatidylseríny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, kardiolipiny, sfingomyeliny, a směsi těchto látek i jejich směsi s dalšími lipidy, například cholesterolem. Použití jiných přísad, například cholesterolu v množství až 50 % hmotnostních bylo popsáno v patentových přihláškách WO-A-91/15 244 a W0-A-94/09 829, použití malého množství, například 1 mol % negativně nabitého lipidu, jako fosfatidylserinu nebo mastné kyseliny pro zvýšení stability je navrhováno ve W0-A-92/22 247. Výhodná —směs—fosfolip-i-dů_.je podle WO-A-94/28 780 dipalmitoylfosfatidylcholin, dipalmitoyfosfatidylethanolamin, substituovaný polyethylenglykolem 5000 a dipalmitoylfosfatidová kyselina v molárnim poměru přibližně 87 : 8 : 5. Typické prostředky s obsahem směsi fosfolipidů podle W0-A-94/09 829 a WO-A-95/16 467 obsahují diarachidoylfosfatidylcholin a dipalmitovrfbšf aťi~dovou~-kyse~li~nu—v—hmo-tnos-tním—p.ome.ru.....přibližně 100 : 4, ve druhé z uvedených přihlášek bylo rovněž užito stejné hmotnostní množství distearoylfosfatidylcholinu a dipalmitoylfosfatidylglycerolu.

Je zřejmé, že ve známých navrhovaných prostředcích, obsahujících suspenzi mikrobublínek plynu s fosfolipidem jsou obsaženy neutrální fosfolipidy, například lecithiny.

V běžných případech je přítomno jen malé množství, například 5 % fosfolipidů, nesoucích náboj.

Vynález je založen na zjištění, že při použití fosfolipidů s obsahem náboje ve větším množství, například jako v podstatě jediné amfifilní složky kontrastního prostředku s obsahem mikrobublínek mohou být získány cenné a neočekávané parametry, například zvýšená stálost produktu a dobré akustické vlastnosti. Aniž by bylo žádoucí se vázat na teoretické úvahy, je pravděpodobné, že elektrostatické odpuzování mezi nabitými fosfolipidovými membránami

0 1« ·*«* ·· «« • 00.· 0 0 0 0 00 0 • 0 · 0 0 · 0 0 0 0

0 · 00 0. 00 000000

0.0 0 0 0 0 0 0

53ÍS 0· 00 00 00 napomáhá tvorbě stálých a stabilizujících jednoduchých vrstev na rozhraní mikrobublinky a nosné kapaliny, přičemž ohebnost a óeformovatelnost těchto tenkých membrán přispívá k echogenitě produktu podle vynálezu ve srovnání s prostředkem s obsahem liposomů, naplněných plynem a obsahujících jednu nebo větší počet dvojvrstev.lipidů.

Bylo rovněž prokázáno, že při použití fosfolipídů, nesoucích náboj je možno připravit kontrastní prostředky s ^_výho_dnými vlastnostmi, pokud jde o stálost, dispergovatelnost a odolnost proti spojování bublinek, a to bez dalších přísad, jako dalších smáčedel a/nebo látek pro úpravu viskozity, čímž je možno zajistit, že množství cizorodých složek, přiváděných do organismu bude co nejmenší. Nabité povrchy mikrobublinek mohou bránit jejich shlukování pouze v dů~sred'ku~e±ektro-s-tat-i-ckého—odpuzování........

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří vodná disperze mikrobublinek.-, stabilizovaná amfifilním materiálem, tvořeným v podstatě fosfolipidem, převážně obsahující molekuly s definovaným celkovým nábojem.

Je žádoucí, aby alespoň 75 % a s výhodou veškerý fosfolipidový materiál v kontrastním prostředku byl tvořen molekulami, které za podmínek přípravy a/nebo použití jednotlivě nesou určitý náboj, který může být positivní, avšak s výhodou je negativní. Jako příklad positivně nabitých fosfolipidů je možno uvést estery fosfatidových kyselin, například estery dipalmitoylfosfatidové kyseliny nebo disteroyl«* ** * · ·

V · · * · · « · ·

* ³ 9 ff ? > ss if fosfatidové kyseliny s aminoalkoholy, například s hydroxyethylendiaminem. Jako příklad negativně nabitých fosfolipidů je možno uvést přirozeně se vyskytující (například v sóji nebo vaječném žloutku), polosyntetické (například částečně nebo zcela hydrogenované) a syntetické fosfatidýlseriny, fosfatídylglyceroly, fosfatidylinositoly, fosfatidové kyseliny a kardiolipiny. Acylové skupiny mastných kyselin v těchto fosfolipidech budou typicky obsahovat 14 až 22 atomů uhlíku a můře například jít o palmitoylovou nebo stearoylovou skupinu. Použitelné jsou také lysoformy nabitých fosfolipidů, přičemž pojem lyso~bž'na'čuje—fosfo-l-i-p-i-dy-,—které-o.b.s.ahur_ jí acylovou skupinu pouze jedné mastné kyseliny, která je s výhodou vázána esterovou vazbou na uhlíkový atom v poloze 1 glycerylové skupiny. Takové lysoformy nabitých fosfolipidů je s výhodou možno užít ve směsi s nabitými fosfolipidy, .obsahujícími dvě acylové skupiny mastných kyselin.

Fosfatidýlseriny představují zvláště výhodnou skupinu fosfolipidů pro použití v kontrastních prostředcích podle vynálezu a s výhodou tvoří podstatnou část, například nejméně 80 % počátečního obsahu fosfolipidů v těchto prostředcích, například 85 až 92 %, přestože toto množství může být poněkud sníženo v průběhu následného zpracování, například při sterilizaci působením tepla, například na přibližně 70 %.

I když není žádoucí se vázat na teoretické úvahy, je pravděpodobné, že iontové síly mezi karboxylovou skupinou a aminoskupinami přilehlých serinových skupin přispívají ke stabilitě těchto systémů. Výhodnými fosfatidýlseriny jsou například nasycené (například hydrogenované nebo syntetické) přírodní fosfatidýlseriny a syntetické nebo polosyntetické dialkanoylfosfatidylseriny, jako distearoylfošfatidylserin, dipalmitoylfosfatidylserin a diarachiodylfosfatidylserin.

Důležitá výhoda použití kontrastních prostředků na bázi fosfatidylserinů spočívá v tom, že lidský organismus *

» · • * 9 9 ♦ · • 9 · · · · ·· ···« ·· rozpoznává staré Červené krvinky .a destičky podle vysokých koncentrací fosfatidylserinu na jejich povrchu, takže může odstranit uvedené kontrastní prostředky z krevního objemu podobným způsobem, jako staré krevní elementy. Mimoto vzhle óem k tomu, že povrch takového kontrastního prostředku může být vnímán jako organismu vlastní, nemusí dojít k nepříznivým systemickým .účinkům, například hemodynamickým účinkům a dalším anafylaktickým reakcím, které mohou doprovázet podávání některých prostředků typu liposomů, jak je uvedeno například ve W0-A-95/12386.

Při zkouškách na toxicitu na psech nebylo možno po nitrožilní injekci kontrastního Činidla podle vynálezu v dávkách, převyšujících až desetkrát dávky, běžně užívané při zobrazování prokázat žádné akutní toxické příznaky, jako...změnu krevního tlaku nebo srdeční frekvence.

Kontrastní látkou pro zobrazování pomocí ultrazvuku může být jakákoliv fyziologicky přijatelná echogenní látka ve formě mikrobublinek, avšak s výhodou budou mikrobublinky obsahovat plyn nebo prekursor plynu, například sloučeninu nebo směs sloučenin, která je v podstatě v plynné formě (včetně par) při teplotě lidského těla 37 C. Je možno použít jakýkoliv biokompatibilní plyn, prekursor plynu nebo směs plynů nebo prekursorů. Může jít například o vzduch, dusík, kyslík, oxid uhličitý, vodík, oxid dusnatý, inertní plyn, jako helium, argon, xenon nebo krypton, fluoridy síry, jako hexafluorid síry, fluorid dvojsírový nebo pentafluorid trifluormethylsíry, hexafluorid selenu a silany, popřípadě halogenované, například tetraměthylsilan, dále uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností až do obsahu 7 atomů uhlíku, může jít například o alkan, jako methan, ethan, propan, butan nebo pentan, o cykloalkan, jako cyklobutan n_;ebo cyklo* · · • · » * · · · • » *· 4*4*

pentan, o alken, jako propen nebo buten, o. alkin, jako acetylen, dále je možno použít ethery, ketony, estery, halogenované uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností do obsahu například 7 atomů uhlíku nebo směsi těchto látek. Při nejmenším některé halogenované atomy v halogenovaných plynech s výhodou nesou atomy fluoru. Tyto'biokompatibilní plynné halogenované uhlovodíky se volí například ze skupiny bromchlordífluormethan, chlordífluormethan, dichlordifluormethan, bromtrífluormethan, chlortrifluormethan, chlorpentafluor—e-t-han-,—d-ičh 1 or_t.e.traf.l.uorethan, perfluorované uhlovodíky, například perfluoralkany, jako perfluormethan, perfluorethan, perfluorpropan, perfluorbutany, například perfluor-n-butan, popřípadě ve směsi s dalšími isomery, jako perfluorisobutanem, perfluorpentany, perfluorhexany a perfluorheptaný, dále perfluoralkeny, například perfluorpropen, perfluorbuteny, napři klad perf luOrbut-g-=en—a-pe-r-f-luo-rbu-tadlen..—p.er-.......

fluoralkiny, jako perflúorbut-2-in a perfluoralkany, jako perfluorcyklobutan, perfluormethylcyklobutan, perfluordimethylcyklobutany, perfluortrimethylcyklobutany, perfluorcyklopentan, perfluormethylcyklopentan, perfluordimethylcyklopentany, perfluorcyklohexan, perfluormethylcyklohexan a perfluorcykloheptan. Z dalších halogenovaných plynů je možno uvést fluorované, například perfluorovené ketony, jako perfluoraceton a fluorované, například perfluorované ethery, jako perfluordiethylether.

V kontrastních prostředcích podle vynálezu může být výhodné použít fluorované plyny, například fluoridy síry nebo fluorované uhlovodíky, například perfluorované uhlovodíky, o nichž je známo ze svrchu uvedené publikace Schneider a dalších, že vytvářejí zvláště stálé suspenze mikrobublinek. Je také možno použít směsi plynů v závislosti na parciálním tlaku uvnitř a vně mikrobublinek a v důsledku toho v závislosti na vlivu osmotického tlaku na rozměr mikrobublinek, fe,a > fe *·*

-11 ··· fe ·· jak je popsáno ve WO-A-95/O3 835. Může například jít o směs plynu, relativně rozpustného v krvi, například dusíku něho vzduchu a plynu, který je v krvi poměrně nerozpustný, například fluorovaného uhlovodíku.

Bylo prokázáno, že kontrastní činidla podle vynálezu, obsahující například mikrobublinky perfluoralkanu, například perfluorbutanu, stabilizované fosfatidylserinem mají překvapivě stálé rozměry po nitrožilním podání a nemají tendenci se zvětšovat, jak bylo dříve popisováno, v důsledku difúze krevních plynů, jako kyslíku, dusíku a oxidu uhličitého do vnitřního prostoru mikrobublinek. Místo toho mikrobublinky po předchozím malém a rychlém zvětšení dosáhnou maximálního rozměru a pak se již nezvětší. Tímto způsobem je odstraněno nebezpečí zvětšování mikrobublinek až na rozměr, který by~m'oh±~b±okov-a-t·-k-ap-i-l-á-rná—k-re-vni-cévy-, ~ods.tr an.ění....tohoto nebezpečí je hlavní výhodou prostředku podle vynálezu.

Kontrastní prostředky podle vynálezu, obsahující perfluoralkany, například perfluorbutan, mají také překvapivě vysokou stálost při zvýšeném tlaku, podobném tlaku, jemuž mohou být vystaveny in vivo, například po vystavení přetlaku až 300 mm rtuti na dobu 90 sekund, například při použití vzduchu je možno pozorovat alespoň 90 % zbývajících bublinek s původní distribucí středního- průměru.

Kontrastní prostředky podle vynálezu je možno použít pro různé diagnostické zobrazování včetně scintigrafie, zobrazováni ultrazvukem, MR a zobrazování rtg-zářením, včetně použití měkkého záření. Výhodné je zejména použití při zobrazování ultrazvukem a pomocí MR. Při zobrazování ultrazvukem je možno použít různých postupů, jako základního postupu, harmonického B-způsobu zobrazování a harmonického Dopplerova zobrazování nebo i trojrozměrného postupu. Tyto kontrastní prostředky je možno využít i pro zobrazování ultrazvukem

- 12 ·>)· \ * Λ'ί «Φ φφ φφ ΦΦΦΦ W» «V • · « φ φ « φ Φφφ» • φ φ φφφ φφφφ φ φ φ φφ φ φφ ΦΦΦΦΦΦ φφφ φ φφφ φ φ φφ 55*4 *· φφ φφ » na bázi korelačních postupů, které byly pospány například v US-A-56/01085 a v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB96/02413.

Při pokusech na psech bylo prokázáno, že při zobrazování ultrazvukem může při použití kontrastních prostředků podle vynálezu dojít ke zvýšení intenzity signálu ultrazvuku, odraženého od srdečního svalu o 15 až 25 dB po nitrožilní injekci malých dávek, jako 1 až 20 nl mikrobublinek na kg tělesné hmotnosti. Signály je možno pozorovat i při nižších dávkách při použití citlivější techniky, například Dopplerovy amplitudové nebo nelineární techniky podle publikací Tucker a další, Lancet, 1968, str. 1253, Miller, Ultrasonics, 1981, str. 217 až 224 a Newhouse a další, J. Acoust. Soc. Am., 75, str. 1473 až 1477, 1984. Při těchto nízkých “d-áv-k-ác-h—se—do..stává^n apříklad do srdečních komor dostatečné množství mikrobublinek ke zviditelnění požadovaných oblastí v srdečním svalu. Bylo také prokázáno, že po nitrožilní injekci kontrastního prostředku dojde k jeho distribuci v celém krevním oběhu a je tedy možno zobrazit cévní zásobení jakékoliv tkáně. Tyto kontrastní prostředky také obecně zesílí Dopplerův signál a je možno je použít k provádění počítačové tomografie při použití ultrazvuku.

Při zobrazování pomocí ultrazvuku, například při echokardiografii je vhodné, aby mikrobublinky volně procházely plicním systémem a současně bylo dosaženo výhodných frekvencí pro zobrazování v rozmezí 0,1 až 15 MHz a je tedy vhodné užít mikrobublinky se středním průměrem 0,1 až 10, například 1 až 7 mikrometrů. Mikrobublinky mohou být připraveny při velmi úzkém rozmezí distribuce průměrů v oblasti, výhodné pro echokardiografii, čímž je možno podstatně zvýšit jejich odraz ultrazvuku a současně také bezpečnost jejich použití in vivo, takže tyto kontrastní prostředky mají zvláštní výhodu při některých typech použití, například fl · flfl · · · fl

- 13 • · · · · · • I · · · ♦ • · · · « · * · ♦ fl fl fl • fl ···· «· • fl «· • · « · fl • · · fl • · ··« flfl· fl fl » flfl flfl měření krevního tlaku, měření průtoku krve a při ultrazvukové tomografii. Tímto způsobem je možno získat dobré výsledky zvláště při použití produktů, v nichž více než 90 % mikrobublinek (například nejméně 95 a s výhodou nejméně 98 %) má průměr v rozmezí 1 až 7 mikrometrů a méně než 5 % mikrobublinek (například nejvýše 3 a s výhodou nejvýše 2 %) mají průměr vyšší než 7 mikrometrů.

Kontrastní prostředky pro zobrazování ultrazvukem “j'e^—napříki^_ad^_možno^—podávat^-v^-takových—dávkách—že- množstvípoužitého materiálu pro tvorbu membrán, například fosfolipidu je v rozmezí 0,1 až 10, s výhodou 1 až 5 mikrogramů na kg tělesné hmotnosti. Je zřejmé, že použití takových nízkých dávek materiálu pro tvorbu- membrán znamená podstatnou výhodu zejména v tom, Že se na co nejmenší míru snižuje možnost výskytu toxických vedlejších účinků.

Celková koncentrace materiálu pro tvorbu membrán v prostředku, připraveném pro použití ze sušeného produktu podle vynálezu se bude s výhodou pohybovat v rozmezí 0,01 až 5, zvláště výhodně 0,05 až 2,0 % hmotnostních, velmi výhodný je zejména prostředek s obsahem 0,5 % hmotnostních tohoto materiálu.

Bylo prokázáno, že není zapotřebí do prostředků podle vynálezu přidávat další přísady, například emulgátory a/nebo látky pro úpravu viskozity, tak jak se obvykle užívají v celé řadě známých kontrastních prostředků. Jak již bylo svrchu uvedeno, je výhodné podávat co nejmenší množství složek, které jsou pro organismus cizorodé a současně je nutno udržet viskozitu kontrastního prostředku na co nejnižších hodnotách. Vzhledem k tomu, že příprava kontrastních činidel typicky zahrnuje lyofilizaci, jak bude dále podrobněji uvedeno, může

0 0 0 0 0

- 14 * · · 0 • 0 0

0«

0000

00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • · 00 000 000 0*00 β a ·· 00 00 0 » být výhodné přidat jedno nebo větší počet kryoprotektivních a/nebo lyoprotektivních látek a/nebo jedno nebo větší počet činidel pro zvětšení objemu, například alkohol, jako alifatický alkohol, například terč.butanol, polyol, jako glycerol, aminokyselinu, jako glycin, uhlohydrát, například cukr, jako sacharozu, mannitol, trehalosu, glukosu, laktosu nebo cyklodextrin nebo také polysacharid, jako dextran nebo polyglykol, jako polyethylenglykol. Řada látek s kryoprotektivním a/nebo lyoprotektivním účinkem je uvedena v publikaci Acta Pharm.

Technol,, 34(3), str. 129 až 139, 1988. Výhodné je zvláště použití fyziologicky přijatelných cukrů, jako je -sacharosa, například v množství, které zajistí isotonicitu nebo mírnou hypertonicitu výsledného produktu.

Známá kontrastní Činidla, například činidlo, popsané:

_ve—W0-A-94/09—82-9—se—p-ři-pravu-j-í—tak-,-—že—se—p-ráškov-é—smáčed-——— lo, například lyofilizované předem vytvořené liposomy nebo roztoky fosfolipidů s obsahem vzduchu nebo jiného plynu a vodným nosičem míchají k vytvoření suspenze mikrobublinek, kterou je pak nutno podat krátce po přípravě. Tyto postupy však mají tu nevýhodu, že je nutno při míchání použít značné množství energie k dosažení požadované disperze, přičemž rozměr a distribuce velikosti mikrobublinek závisí na množství energie, vynaložené při míchání, takže velikost bublinek prakticky nelze řídit.

Nyní bylo zjištěno, že kontrastní prostředky uvedeného typu je možno s výhodou připravit tak, že se vytvoří disperze mikrobublinek v plynu ve vodném prostředí, obsahujícím fosfolipidy, popřípadě po předchozí sterilizaci, například v autoklávu a tato disperze se lyofilizuje za vzniku sušeného rekonstituovatelného, produktu. Tyto produkty, které například obsahují lyofilizovaný zbytek suspenze mikrobublinek v plynu ve vodném prostředí, obsahujícím amfifilní materiál,

· ·« i · ♦ · · • ·' 9 ft ·*· ·♦♦ * ft

9999 tvořený převážně molekulami, nesoucími náboj, představuje další provedení vynálezu. V případě, že sušený produkt obsahuje kryoprotektivní a/nebo lyoprotektivní látky, může jít o matrici těchto látek, například uhlohydrátů, jejíž dutiny jsou vyplněny plynem, obklopeným nejméně jednou vrstvou amfifilního materiálu.

Sušený produkt bude obvykle mít formu prášku, který se snadno rozpouští ve vodě, může však jít také o vodný roztok nebp o roztok ve fyziologickém roztoku tak, aby vstřikovaný^-iirjekch'í^—ro'z't'o'k^—nebyl^-hypO't'0'nícKý^-; nebo^-může^-jít^-o^-roz^ tok s obsahem několika solí pro úpravu osmotického tlaku, může jít například o běžné kationty krevní plasmy a odpovídající fyziologicky přijatelné anionty, prostředek může také obsahovat cukry, alkoholy odvozené od cukrů, glykoly a další neiontové materiály typu polyolů, například glukosu, sacharosu, sorbitol, mannitol, glycerol, polyethylenglykoly, propylenglykoly a podobně. Rekonstituce obvykle vyžaduje jen mírné míchání, obvykle stačí ruční protrepávání. Rozměr takto vytvořených mikrobublinek je dobře reprodukovatelný a prakticky nezávislý na množství energie, použité při protrepávání vzhledem k tomu, že je určován rozměrem mikrobublinek v počáteční disperzi. Je neočekávané, že uvedený rozměr je v podstatě stálý v lyofilizovaném i rekonstituovaném produktu. Vzhledem k tomu, že rozměr mikrobublinek v počáteční disperzi je možno snadno řídit parametry použitého postupu, jako je rychlost a délka míchání, je možno snadno řídit také konečný rozměr mikrobublinek.

Bylo prokázáno, že lyofilizované produkty podle vynálezu jsou stálé při skladování několik měsíců za běžných podmínek. Disperze mikrobublinek, vznikající po rekonstituci ve vodě nebo jiné kapalině, jak bylo uvedeno svrchu, může být ještě stálá po poměrně dlouhou dobu, například nejméně 12 hodin, takže není nutno pospíchat s vyšetřením po rekonstituci suchého produktu před podáním injekce.

• v · « * «

- 16 • · · · * · · · « · • * · · * · ♦♦ ·* ·* ·· • · · • · . * ··· ···

Svrchu uvedený způsob výroby kontrastních látek podle vynálezu je možno obecně aplikovat na výrobu kontrastních látek, tvořených suspenzí mikrobublinek kapaliny nebo plynu ve vodném nosiči pro injekční podání, stabilizovaných lipidy, vytvářejícími membránu, včetně neutrálních lipidů a lipidů, nesoucích náboj, například fosfolipidů a směsí těchto látek. Tento postup spočívá v tom, že se:

i) vytvoří disperze mikrobublinek plynu ve vodném prostředí, obsahujícím lipid, schopný vytvořit membránu, 'i'i“)^_ “ťakťo^-zí“skan'á^—d'i'sp'e'rze^—ρΐγηαζ stabTld7zdvaná^l'ipTdy se lyofilizuje za vzniku sušeného produktu, obsahujícího lipid, načež se iii) sušený produkt rekonstituuje ve vodném nosném prostředí, vhodném pro injekční podání.

Tento postup, rovněž tvoří součást podstaty vynálezu, stejně jako rekonstítuovatelný sušený produkt, získaný v prvních dvou stupních tohoto postupu, například produkt, tvořený matricí pro uvolnění mikrobublinek, například z kryoprotektivní nebo lyoprotektivní látky, obsahující v podstatě kulovité dutiny nebo vakuoly, naplněné plynem a obklopené vrstvou lipidového materiálu, který vytváří membránu .

Stupeň i) je možno uskutečnit například tak, že se vodné prostředí s obsahem lipidu zpracovává tak, aby vznikla emulze, například působením ultrazvuku, protřepáváním, homogenizací při vysokém tlaku, mícháním s vysokou rychlostí nebo za vysokého střihového namáhání, například při použití homogenizátoru se statorem a rotorem v přítomnosti zvoleného plynu. Vodné prostředí může ještě obsahovat další přísady, například látky pro úpravu viskosity a/nebo pomocná rozpouštědla pro lipid, například alkoholy nebo polyoly, jako glycerol a/nebo propylenglykol.

• ft ftftftft • ft ftft • ftftft ftft •A · · ·* • · ftftftft ftftft ftft¹ • ft ftft·· ft· • ft ·« ftft · ft · · · · .

• · ftftft ··· • a a * ft· ·· ··

Plyn, použitý v emulgačním stupni nemusí být plyn, požadovaný ve výsledném produktu. Většina tohoto plynu bude totiž odstraněna v průběhu následné lyofilizace a případný zbytek plynu může být odstraněn z výsledného produktu podtlakem, načež je možno použít požadovaný plyn. Plyn v emulgačním stupni se tedy vybírá pouze tak, aby došlo k co nejlepší emulgaci bez ohledu na výsledný produkt. Bylo zjištěno, že emulgace zvláště výhodně probíhá v přítomnosti fluoridu síry, jako fluoridu sírového nebo fluorovaného uhlovodíku, jako perfluoralkanu nebo perfluorcykloalkanu, s výhodou obsahujícího 4 nebo 5 atomů uhlíku, zejména pokud jde o výtěžek výsledného produktu s homogenně distribuovanými mikrobublinkami s úzkou distribucí středního průměru výsledných bublinek.

Emulgace......dobře., probíhá...při.....teplo tě ..okol í,.......například přibližně 25 ± 10 °C. Na začátku může být zapotřebí vodné prostředí zahřát k usnadnění hydratace a tím i disperze fosfolipidu, pak je možno nechat směs stát při teplotě místnosti k dosažení rovnovážného stavu před emulgaci.

Předmětem vynálezu je také disperze plynů, vytvořená ve stupni i), zvláště vodná disperze mikrobublinek plynu, stabilizovaných amfifilním materiálem, tvořeným v podstatě fosfolipidem, převážně obsahujícím molekuly s definovaným nábojem. Podobné disperze byly popsány v mezinárodní patentové přihlášce W0-A-96/4O275 (Nycomed), týkající se meziproduktů pro použití při výrobě diagnostických kontrastních Činidel, obsahujících mikrobublinky plynu, stabilizované alespoň jedním lipidem pro tvorbu membrány, zesítěným nebo polymerovaným v hydrofilní části. V těchto disperzích obsahuje amfifilní materiál dipalmitoylfosfatidylserin, zvláště ve formě sodné soli jako takový nebo v kombinaci s dipalmitoylfosfatidylcholinem a plyn je směsí vzduchu s perfluorpentanem, směsí vzduchu s perfluorhexanem nebo směsí per-18 «· ·· « · · · • ♦ · » · · » 9 ·· *·· ·· ··· • * · * » · • · · • · »« ·· ·· • · · a • · · · ·· ··· » A • · a a fluorbutanu s perfluorhexanem, Tyto známé meziprodukty, užité pro výrobu kontrastních látek netvoří součást tohoto vynálezu.

Vzhledem k tomu, že uvedené disperze jsou meziprodukty, nemusí být připraveny ve sterilní, fyziologicky přijatelné formě, kdežto disperze plynů, připravené ve stupni i) způsobu podle vynálezu budou připravovány ve sterilní, fyziologicky přijatelné formě, například s použitím sterilní bezpyrogenní vody nebo fyziologického roztoku chloridu sodného v případě, že mají být přímo použity jako kontrastní činidla.

Disperze, získané ve stupni i) je s výhodou možno ještě nejméně jednou promývat před použitím jako kontrastní 4-áť-k-y~nebo~p-řed-Tyo-fi4-i-z-ae-í—-νΌ“5ΐορηί“-1-ί-)-ί—tak-;—aby—by-l-o——~ možno oddělit nebo odstranit různé přísady, například látky pro úpravu viskozity a pomocná rozpouštědla a také některé nežádoucí materiály, například koloidní částice, které neobsahují plyn a mikrobublinky s příliš velkými a/nebo příliš malými rozměry. Promyté disperze mikrobublinek rovněž tvoří součást podstaty vynálezu. Promývací stupeň je možno uskutečnit známým způsobem, mikrobublinky je možno oddělit například flotací nebo odstředěním. Možnost oddělit tímto způsobem různé přísady a také získat disperzi mikrobublinek se zvláště úzkou distribucí jejich rozměrů představuje důležitou výhodu způsobu podle vynálezu vzhledem k tomu, že, jak již bylo uvedeno svrchu, výsledná distribuce rozměru bublinek zůstává v podstatě uchována i po lyofilizaci a rekonstituci. Je tedy zvláště výhodné použít postup, který spočívá v dispergování plynu, promývání a dělení a pak v lyofilizaci a rekonstituci.

φφ φφφφ

- 19 φφ φ φ • ΦΦΦ · φ φ · · • 9 9 9 Φ » 9 Φ φΦ ΦΦΦΦ

Φ Φ β «

Φ Φ

9 .9

ΦΦ ·« • Φ Φ · • «ΦΦ •ΦΦ ΦΦ» » ΐ

Φ · Φ Φ

Je možno připravit také disperze mikrobublinek, frakcionované na základě svého rozměru, například disperze, v nichž nejméně 90 % mikrobublinek má rozměr v rozmezí 2 mikrometry, přičemž mikrobublinky s výhodou mají objemový střední průměr v rozmezí 2 až 5 mikrometrů. Takové disperze a také zmrazené a lyofilizované produkty, odvozené od těchto disperzí, tak jak budou dále popsány, rovněž představují součást řešení.

_V případě, že se přidává alespoň jedna kryoprotektivní a/nebo lyoprotektivní látka, přidávají se tyto látky s výhodou po promývacích stupních před následnou lyofilizací.

Lyofilizaci vodné disperze je možno uskutečnit nap ř ík-lad“ t akT“ ž e ~s e-d Isp er ze~ ž m r a z í~a~p-ak~ly o f rlřz uj’e'7~na'^:=~“ příklad známým způsobem. Takové zmrazené disperze plynu, to znamená zmrazené vodné disperze, uvolňující mikrobublinky plynu, stabilizované amfifilním materiálem, tvořeným v podstatě fosfolipidem, převážně obsahujícím molekuly, které jednotlivě mají definovaný náboj rovněž tvoří součást podstaty vynálezu. Je výhodné frakcionovat mikrobublinky podle jejich rozměru před zmrazením tak, aby uvolněné mikrobublinky s výhodou mely objemový střední průměr v rozmezí 2 až 5 mikrometrů. Takové produkty je možno skladovat ve zmrazeném stavu a podle potřeby opět rozmrazit například jednoduchým zahřátím a/nebo přidáním vodné kapaliny a tak regenerovat disperzi mikrobublinek, použitelnou jako kontrastní Činidlo.

Vzhledem k tomu, že sušený produkt bude ve stupni iii) rekonstituován před podáním, může být disperze plynu s výhodou plněna před lyofilizaci do uzavíratelných lékovek tak, aby v každé lékovce bylo určité množství disperze, například jednotlivá dávka sušeného lyofilizovaného produktu

4»··

-20 »4 ·4 «4 4 • 4 ·

4 · • · 4

4* »·»♦

4 4 • 4 · * 4 4 • * * ♦ »· 44 ·· ·· * 4 4 4 • 4 4.4'

44 4 4 » * a «4 4 4 pro rekonstituci na lékovou formu. Tím, že se disperze plynu lyofilizuje v jednotlivých lékovkách a nikoliv vcelku, je možno šetrněji manipulovat s lyofilizovaným produktem, čímž se snižuje riziko částečné degradace struktury disperze. Po lyofilizaci a případné evakuaci plynu a přivedení jiného zvoleného plynu do prázdného prostoru lékovky je možno lékovky uzavřít. Je zřejmé, že možnost volit konečný obsah plynu a současně nezávisle řídit velikost mikrobubliněk volbou příslušných parametrů postupů v průběhu počátečního dispergování, popřípadě promývání dává k dispozici možnost nezávislého výběru velikosti mikrobublinek a obsahu plynu a úpravy výsledného produktu pro jakoukoliv požadovanou aplikaci.

Obvykle je možno zmrazenou disperzi plynu nebo sušený—produk*t—z-e—·5-ΪΉρηβ—i-i-J-y—nap-ř-í-k-l-ád—po—do p-lněn-í—nebo—výměně— plynu rekonstituovat přidáním příslušné sterilní vodné nosné kapaliny pro injekční podání, například sterilní bezpyrogenní vody pro injekční podání, vodného roztoku, například fyziologického roztoku chloridu sodného, s výhodou vyváženého tak, aby konečný produkt pro injekční podání nebyl hypotonický nebo vodného roztoku nejméně jedné látky pro úpravu osmotického tlaku, například jak bylo svrchu popsáno.

V případě, že je sušený produkt uložen do lékovky, je možno tuto lékovku uzavřít přepážkou, kterou je možno vstřiknout nosnou kapalinu, popřípadě při použití předem naplněné injekční stříkačky. Sušený produkt a nosnou kapalinu je také možno dodávat v pomůckách s dvojitou komorou, například ve formě injekční stříkačky se dvěma komorami. Po rekonstituci je výhodné produkt promísit nebo jemně protřepat. Jak již bylo uvedeno, je v tomto případě výsledný průměr mikrobublinek plynu v podstatě nezávislý na energii při míchání. K získání produktu s homogenním průměrem mikrobublinek postačí jemné protřepání rukou.

Vynález bude dále osvětlen v souvislosti s přiloženými výkresy.

• 9 ·· ·· • 9 « » 9 * • · · 9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

9999 99

9·· fl· 99 9 9 9 9 9 < 9 9 9 -9

9 999 999 * ^9 »1 99

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je graficky znázorněno množství mikrobublinek, které přetrvávají po lyofilizací a rekonstituci ve vztahu k relativnímu.množství nabitého fosfolipidu v membránách kontrastního prostředku v příkladu 1, údaje jsou uvedeny v % objemových.

Na obr. 2 je uvedeno zeslabení ultrazvuku v oblasti frekvencí 1,5 až 8 MHz pro kontrastní činidlo podle příkladu 2(a). Měření bylo prováděno a) před testem pod tlakem, b) v průběhu testu pod tlakem a c) po ukončení testu pod —t-l-akem-r-j-ak—bude—popsáno—v—př-í-k-l-adu—6-ϊ--——----Na obr. 3 je znázorněna regenerace zeslabení při 3,5 MHz pro kontrastní činidlo podle příkladu 2(a) po době 90 sekund přetlaku v rozmezí 0 až 300 mm Hg, jak je popsáno v příkladu 6.

Na obr. 4 je znázorněna objemová distribuce průměru částic pro kontrastní činidlo z příkladu 2(a) při měření Coulterovou analýzou a) bez použití přetlaku (vyplněný kosočtverec), b) po 90 sekundách přetlaku při 150 mm Hg (prázdný trojúhelník) a c) po 90 sekundách přetlaku při 300 mm Hg (vyplněný čtverec) jak bude dále popsáno v příkladu 6.

Φ Φ 9

- 22 • « ΦΟ * * * *

Φ · Φ *93

Φ * |·ί>·

9 φ

ΦΦ ΦΦΦΦ

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vliv relativního množství nabitých fosfolipidů

Podle obecného postupu, který bude dále popsán, byly připraveny disperze mikrobublinek, stabilizované různými fosfolipidy nebo směsí fosfolipidů při použití parametrů, které budou dále uvedeny v tabulce 1.1.

Byly připraveny roztoky zvolených fosfolipidů nebo směsí fosfolipidů ve vodě, obsahující 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu a glycerolu v hmotnostním poměru 3 : 10, byly užity koncentrace fosfolipidů 2 až 5 mg/ml, pro fosfatidylethanolamin bylo pH upraveno na 10,5 přidá-_ ním hydroxidu sodného. Fosfolipidy byly hydratovány působením ultrazvuku a/nebo zahřátím na přibližně 80 °C na předem určenou dobu, jak je zřejmé z tabulky 1.1 a pak zchlazeny před použitím na teplotu místností. Daný objem tohoto roztoku byl rozdělen do několika chromatografických nádobek s objemem 2 ml při použití 0,8 až 1 ml roztoku na nádobku.

Prázdný prostor v nádobkách byl vyplněn perfluorbutanem a lékovky byly těsně uzavřeny a protřepávány 45 sekund při použití mísícího zařízení Espe CapMix . Výsledná disperze mikrobublinek byla přenesena do větší nádobky a odstředěna 5 minut při 2000 ot/min za vzniku vrstvy plovoucích mikrobublinek nad zakalenou vrstvou kapaliny. Tato kapalina byla odstraněna pomocí injekční stříkačky a nahrazena stejným objemem vody s neutrálním pH. Promývací stupeň byl opakován, avšak nyní byla kapalina nahrazena roztokem sacharosy s koncentrací 10 % hmotnostních. 2 ml podíly promyté disperze byly rozděleny do 10 ml lahviček s plochým dnem, určených pro lyofilizaci, materiál byl zchlazen na -47 °C a lyofilizován • ftft ft

- 23 ftft ftftftft · • ft ftftftft ftft • ftft ftftftft • ft ftftft· ftft ftft přibližně 48 hodin, čímž byl získán bílý vločkovitý materiál. Lahvičky byly přeneseny do podtlakové komory, vzduch byl vyčerpán vakuovým čerpadlem a nahrazen plynným perfluorbutanem. Před použitím byla přidána voda a lahvičky byly opatrně ručně protřepávány několik sekund, čímž vznikla disperze mikrobublinek, vhodná pro použití jako kontrastní činidlo při zobrazování ultrazvukem.

Distribuce průměru Částic a objemová koncentrace mikrobublinek byla měřena zařízením Coulter Counter Mark II, opatřeným— ©-tvorem— 50- m-i-krometrů- při— rozmezí^- mořených^- prům'ě~ rů 1 až 30 mikrometrů. Vzorky s objemem 20 mikrolitrů byly zředěny ve 200 ml fyziologického roztoku chloridu sodného, nasyceného vzduchem, při teplotě místnosti a byly ponechány 3 minuty před měřením k dosažení rovnovážného stavu. Měřeni bylo prováděno na disperzi mikrobublinek před lyofilizací po promytí a pak po lyofilizací a rekonstituci vodou na původní objem před lyofilizací. Údaje jsou uvedeny v následující tabulce 1.2.

Účinnost lyofilizace pro různé disperze mikrobublinek, stabilizované fosfolipidem byla vypočítána jako procento přetrvávání objemové koncentrace po lyofilizací a rekonstituci. Z obr, 1 je zřejmé, že tento parametr se mění v závislosti na relativním množství nabitého fosfolipidu v membráně. Je zřejmé, že účinnost lyofilizace se zvyšuje se zvýšením množství nabitého fosfolipidů v membráně a je nejvyšší pro membrány, které obsahují pouze fosfolipidy, nesoucí náboj.

- 24 0 0 0 • 0 * ·· «00·

0*0 000

Tabulka 1.1

Složení a parametry postupu, použitého pro výrobu disperze bublinek plynného perluor-n-butanu, stabilizované fosfolipidem podle příkladu 1

PL a hmot. poměry	mnóžstv: PL (mg/ml]	množství vodného rozp.	ultrazvuková lázeř	působení tepla [min]	veli- kost vzorku (mil	objem v lahvičce
		[ml]	lil Jal J			[ml]
DPPE	20	10	-	30	10	0.8
H-PC / H-PS (9:1)	4S.5	9.1	10	2	9	0.9
— H- PG- -/--H-PS- (4:1)		γ	ΣΌ

DSPC / DSPS (4:1)	10.4	5.2	10	2	4	1
DSPC / DSPG (1:1)	15.2	7.6	10	2	7	1
DPPS	24.9	12.5	-	30	11	1
DSPS	24.S	12.5	-	30	11	1
DSPG / DPPA (10:1)	20.2	10	-	10	10	0.8
DSPG / DPPA (1:1)	52.0	10.4	-	10	9	0.8

·· 4 ·

-25 Tabulka 1.2 «· *· · · ♦ * · · · · · • · · * · · * * · · « · · * a » a š a a • · · · ·· «· « »

Výtěžek, měřený jako objemová koncentrace bublinek ( v % celkového dispergovaného objemu) i) po promytí disperze a ii) po lyofilizaci a rekonstituci

PL a hmot.	% nabitého	objemová	objemová	množství
poměry	lipidu v membráně	konct^- v^_%~ před lyofili- zací	kOTícT~v%' po lyofilizaci	zbylých bubljnek v % počat, objemové konc.
		.......Λ *T	0 1	1 C /1
Lfťrů	o
H-PC / H-PS 0:1)	10	6.4	0.9	14.1
H-PC / H-PS (4:1)	20	' 1.0	0.2	20.0
DSPC / DSPS (4:1)	20	4.8	1.0	20.8
DSPC / DSPG (1:1)	50	0.3	0.1	33.3
DPPS	100	0.7	0.4	57.1
DSPS	100	1.0	0.5	50.0
DSPG / DPPA (10:1)	100	1.4	0.7	52.9
DSPG / DPPA (1:1)	100	4.3	1.8	41.9

-26 ·« · ·»

Vysvětlivky k tabulkám:

PL = fosfolipid

DPPE = dipalmitoylfosfatidylethanolamin

H-PC = hydrogenovaný vaječný fosfatidylcholin

H-PS = hydrogenovaný vaječný fosfatidylserin

DSPC = distearoylfosfatidylcholin

DSPS = distearoylfosfatidylsérin ——ĎS-PG d-i-s-tear©y-l-fos-fa-t-i-dy-l-g-l-yee-r©-l-----—--—

DPPS = dipalmitoylfosfatidylserin

DPPA = dipalmitoylfosfatidová kyselina.

-------—P-F-ík-l-ad--2-----—-------------- —................... - .... ———........................—

a) Příprava disperze mikrobublinek perfluorbutanu protřepáváním

25,3 mg hydrogenovaného vaječného fosfatidylserinu se přidá do 12,5 ml vody, obsahující 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu a glycerolu v hmotnostním poměru 3:10. Fosfolipidový materiál se hydratuje zahřátím na 70 °C po dobu přibližně 30 minut a pak se zchladí na teplotu místnosti. Získaných 11 ml disperze se rozdělí po podílech s objemem 1 ml do 11 lahviček s objemem 2 ml a prázdný prostor v lahvičkách se vyplní plynným perfluor-n-butanem. Lahvičky se uzavřou a protřepou 45 sekund na mísícím zařízení Espe CapMix . Výsledná disperze mikrobublinek se slije do čtyř větších lahviček a odstředí 5 minut při 2000 ot/min, čímž vznikne zakalená vrstva kapaliny, na níž je uložena vrstva mikrobublinek. Kapalina se odstraní injekční stříkačkou a nahradí stejným objemem vody při neutrálním pH.

• •ftft

- 27 Promývací stupen se opakuje, avšak nyní se kapalný podíl nahradí sacharosou s koncentrací 10 % hmotnostních. Podíly výsledné disperze po 2 ml se rozdělí do lahviček s plochým dnem s objemem 10 ml, zvláště upravených pro lyofilizaci a lahvičky se zchladí na -47 °C a lyofilizují po dobu přibližně 48 hodin, Čímž se získá bílá vločkovitá pevná látka. Pak se lahvičky přenesou do podtlakové komory, vzduch se vyčerpá vakuovým čerpadlem a nahradí se plynným perfluor-n-butanem. Před použitím se přidá voda a lahvičky se opatrně nakolik sekund ručně protřepávají, čímž se získá disperze mikrobublinek, vhodná jako kontrastní Činidlo pro zobrazování pomocí ultrazvuku.

b) Příprava disperze mikrobublinek perfluorbutanu míšením v zařízení s rotorem a statorem

500,4 mg hydrogenovaného vaječného fosfatidylserinu se přidá do 100 ml vody, obsahující 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu a glycérolu v hmotnostním poměru 3 : 10. Směs se protřepe a zahřeje na 5 minut na 80 °C, pak se nechá zchladnout na teplotu místnosti, znovu se protřepe a před použitím se nechá stát přes noc.

ml výsledného roztoku se přenese do baňky s okrouhlým dnem a konickým hrdlem. Baňka se opatří skleněnou manžetou se vstupem a výstupem pro vodu, teplota lázně se udržuje na 25 °C. Míchadlo s rotorem a statorem se zavede do roztoku a aby nedocházelo k úniku plynu, vyplní se prostor mezi stěnou hrdla a hřídelí míchadla zvláště zkonstruovanou kovou zátkou, opatřenou vstupem a výstupem pro plyn, aby bylo možno upravovat obsah plynu a jeho tlak. Výstup plynu se spojí s vakuovým čerpadlem a roztok se po dobu jedné minuty zbavuje plynu. Pak se přivádí vstupem pro plyn plynný perfluor-n-butan.

·« fe * ·»···· * * · · .· * · * * · · fe fe fe fefe * · · fe · • fe · * fe * fe· ··««·« • fefe · · * · 9· • fe «>« ·· fe· fefe fefe

- 28 Roztok se homogenizuje 10 minut při 23 000 ot/min, přičemž hřídel míchadla je uložena tak, že otvory se nacházejí těsně nad povrchem kapaliny. Vznikne bílá krémovitá disperze, která se přenese do uzavíratelné nádobky a promyje perfluor-n-butanem. Pak se disperze přenese do dělicí nálevky a odstředí 30 minut při 12 000 ot/min, čímž vznikne horní krémovitá vrstva bublinek a zakalená spodní vrstva kapaliny, která se odstraní a nahradí se vodou. Pak se odstředění ještě dvakrát opakuje vždy 15 minut při .1.2_0_Q0_o_t./min___E.o_p.o.s.le.dním_o_ds_tře_rdění_s.e_kap.alný__po.díl____ nahradí sacharosou s koncentrací 10 % hmotnostních. Podíly výsledné disperze po 2 ml se rozdělí do lahviček s plochým dnem s objemem 10 ml, zvláště konstruovaných pro lyofilizaci, lahvičky se zchladí na -47 °C a lyofilizují přibližně 48 hodin, čímž se získá bílá vločkovitá pevná látka, Lahvičky “se“p‘řaněšbu~do~vaknbvé'“kbmbrýV'' vzdučfi~sě''Vyčerpá”vákuovým čerpadlem a nahradí se plynným perfluor-n-butanem.

Před použitím se přidá voda a lahvičky se několik sekund opatrně ručně protřepou, čímž vznikne disperze mikrobublinek, vhodná pro použití jako kontrastní činidlo pro zobrazování pomocí ultrazvuku.

c) Příprava disperze mikrobublinek perfluorbutanu působením ultrazvuku

500,4 mg hydrogenovaného vaječného fosfotidylserinu se přidá do 100 ml vody, obsahující 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu a glycerolu v hmotnostním poměru 3 : 10.

Směs se protřepe a 5 minut zahřívá na 80 °C, pak se nechá zchladnout na teplotu místnosti, znovu se protřepe a před použitím se nechá stát přes noc.

• b · · » t « · ·

- 29 ·· ·· 9» * * * * ♦ · • » · > · * * 5 * * * • · ···* ·· · ·

999

·'*

Roztok se čerpá přes průtokovou komůrku ultrazvukového zařízení s objemem 4 ml a vystaví se působení ultrazvuku s amplitudou 90 mikrometrů při 20 kHz. Průměr trubice zařízení pro ultrazvuk byl 1,3 cm, vnitřní průměr komůrky byl 2,1 cm a vzdálenost mezi trubicí a dnem komůrky byla 1 cm. Roztok lipidu byl smísen s perfluor-n-butanem v objemovém poměru 1 : 2 před přívodem do komůrky (20 ml/min roztoku lipidu a 40 ml/min plynného perfluor-n-butanu). Teplota byla udržována na 33 °C. Byla získána bílá krémovitá -d-i-spe-rze-,—k-te-rá—by-l-a-u-l-ožena-do-nádobky—a_pr-omy-.ta_pe.r-£l.uor=_ -n-butanem.

Charakterizace _______ Distribuce průměrné velikosti a koncentrace mikrobublinek v .% objemových byly stanoveny pomocí přístroje Coulter Counter Mark II, opatřeného otvorem s'průměrem 50 mikrometrů při rozmezí měřeného průměru 1 až 30 mikrometrů. Vzorky po 20 mikrolitrech byly ředěny ve 200 ml fyziologického roztoku, nasyceného vzduchem, při teplotě místnosti, před měřením byl roztok 3 minuty ponechán v klidu k dosažení rovnovážného stavu.

Charakterizace ultrazvukem byla prováděna na mírně modifikovaném pokusném zařízení podle publikace Jong N. a Hoff L., Ultrasound scattering properties of Albunex microspheres, Ultrasonics, 31(3), str, 175 až 181, 1993. Tímto zařízením je možno měřit zeslabení ultrazvuku v oblasti frekvence 2 až 8 MHz na ředěné suspenzi kontrastního Činidla.

V průběhu tohoto měření byl také proveden test na stálost při vyšším tlaku tak, že vzorek byl vystaven na 90 sekund přetlaku 120 mm Hg. Při typicky prováděném postupu byly 2 až 3 mikrolitry vzorku zředěny 55 ml prostředku Isoton II a zředěné suspenze vzorku byly před analýzou 3 minuty míchány. Jako primární parametr pro odpověď bylo užito < fe « v ··· «··

-30 zeslabení při 3,5 MHz a současně byl sledován návrat po uvolnění přetlaku na určité hodnoty rovněž při 3,5 MHz.

Tabulka 2.1

Charakteristika disperze bublinek, připravené podle příkladů 2(a) až 2(c), uve.dena je číselná a objemová koncentrace a objemový střední průměr a také akustické vlastnosti, měřené svrchu uvedeným způsobem

Způsob podle	čísélná	objem.	objem.	zesla-	řegene-	fřekv.
	konc.	konc.	střední	bení	race po	při
příkladuč.			průměr	při	přetla-	max.
	[10«/	[VI		3.5Mhz	ku	zesla- bení
	tnl]		ígm]	[dB/cmJ
				ív]	[MHz]
2 (a)	1519	1.45	3.91	30.46	100	4.1
2 (b)	10518	6.51	3.16	150.4	96	4.3.
2<c)	23389	9.57	3.83	117	100	3.5

Příklad 3

Vliv výměny plynu

Plyn v pěti vzorcích, připravených podle přikladu 2(b) byl nahrazen vzduchem, perfluorbutaném, fluoridem sírovým, pentafluoridem trifluormethylsíry a tetramethylsilanem následujícím způsobem:

Dva vzorky, obsahující lyofilizovaný produkt z příkladu 2(b), byly uloženy do desikátoru se vstupem a výstupem

··« *1 * b' b » b 9 pro plyn. Desikátor byl připojen na vakuové a destilační řídící zařízení Bíichi 168, dovolující řízené vyčerpání plynu ze vzorků a přívod jiného zvoleného plynu. Vzorky byly zbaveny plynu 5 minut při přibližně 1 kPa, načež byl tlak zvýšen na atmosférický tlak přívodem zvoleného plynu a pak byly nádobky pečlivě uzavřeny. Pokus byl opakován při použití další dvojice vzorků pro každý ze zvolených plynů.

Do každé nádobky byly přidány 2 ml destilované vody a nádobky byly před použitím opatrně ručně protřepány. Výsledné disperze mikrobublinek byly charakterizovány distribucí průměru částic jako v příkladu 2. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.1.

' ~“T'ΊΓΈ“ΰ”ϊ k”á 3? 1~~

Charakterizace disperze mikrobublinek, stabilizované fosfatidylserinem a připravené podle příkladu 3 in vitro,

je uvedena číselná střední průměr	a objemová koncentrace	a objemový
plyn	Číselná	číselný	objemová	objemový
	koncent.	střední	konc.	střední
	10⁶/ml	průměr (/um)	(%)	průměr (/Um)

perfluorbutan	9756	1,8 .	4,9	5,8
pentafluorid tři- fluormethylsíry	10243	1,9	5,9	3,5
fluorid sírový	9927	1,9	5,7	3,2
tetraměthylsilan	9947	1,9	6,1	3,7
vzduch	9909	1,9	6,4	4,0

t· · * · *»«« · · • * * ♦ ·. « · «Ί · · » '· '# ♦ · ♦·· «»· • · 4 · · » 9 9 ft >·> ·· *« · · ♦ *

-32 Jak je zřejmé z uvedených výsledků, nebylo možno pozorovat po výměně plynu žádný statisticky významný rozdíl v distribuci průměru částic.

Výsledky in vivo

Vzorky z téže vsázky, připravené s každým z pěti uvedených plynů byly vyhodnoceny in vivo na Dopplerovo zesílení při 10 MHz. Disperze byly podány injekčně králíkům do ží-1-y—n-a-ok-ra-j-i— ucha— a— me-řen-í—by-l-o-prováděno—Dopp-ierovou— technikou pomocí ultrazvukové sondy, uložené přímo na krkavici. Byla zaznamenávána intenzita signálu a jeho trvání a byl vypočítán integrál Dopplerovy křivky. Získané výsledky, uvedené v následující tabulce 3.2 prokazují, že při použití mikrobublinek s obsahem perfluorbutanu je možno dosáhnout největšího Dopplerova zesílení intenzity. Mikrobublinky, obsahující fluorid sírový, pentafluorid trifluormethylsíry nebo tetramethylsilan byly jen o něco méně účinné než bublinky s obsahem perfluorbutanu (jejich integrály byly v oblasti 60 až 80 % hodnot pro perfluorbutan).

Tabulka 3.2

Výsledky, získané po nitrožilní injekci prostředku z příkladu 3 králíkům, hodnoty jsou upraveny na posun základní linie, Dopplerova jednotka je definována jako zvýšení Dopplerova signálu ve srovnání s krví

plyn integrované arteriální Dopplerovo zesílení (NDU.s) perfluorbutan

10361 pentafluorid trifluormethylsíry

8006 tetraměthylsílán

6370 fluorid sírový

6297 vzduch

1024 průměr ze dvou injekcí.

Příklad 4

Zmrazené disperze a lyofilizované produkty

250 mg hydrogenovaného vaječného fosfatidylserinu se^fpřidá do 50 ml vody pro injekční podání s obsahem 5,4 % hmotnostních směsi propylenglykolu a glycerolu v hmotnostním poměru 7 : 20. Směs se protřepe a na 5 minut zahřeje na 80 °C a pak se nechá zchladnout na teplotu místnosti, znovu protřepe a před použitím se nechá stát přes noc.

100 ml výsledného roztoku se uloží do baňky s okrouhlým dnem a konickým hrdlem a zpracovává způsobem podle příkladu 2(b). Vytvoří se bílá krémová disperze, která se přenese do dělicí nálevky a odstředí 30 minut při 12 000 ot/min, čímž vznikne krémovitá vrstva mikrobublinek a spodní zakalená vrstva kapalíny. Vrstva kapaliny se odstraní a nahradí se 50 ml vody pro injekční podání. Pak se směs ještě dvakrát odstředí vždy 15 minut při 12 000 ot/min. K 6 ml výsledné disperze se přidá 6 ml roztoku trehalosy s koncentrací 30 % ·· ♦« « *··· *· *· * · « · · '· · · » · « · *:l · * * * * '· • t »'<*·!· · * ··· ··· *' * 3 * » b i ·· «·*· ·· ·· ·* ** hmotnostních a podíly této disperze po 2 ml se uloží do lahviček s plochým dnem a objemem 10 ml, zvláště zkonstruovaných pro lyofilizaci, lahvičky se zchladí na -47 °C a při této teplotě se jeden den skladují.

Po této době se poloviny lahviček nechá roztát na homogenní krémovitou bílou disperzi mikrobublinek plynu, vhodnou pro použití jako kontrastní Činidlo pro zobrazování pomocí ultrazvuku. Po roztátí byly disperze charakterizovány měřením distribuce průměru Částic jako v příkladu 2, výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.1. Zbývající nádobky byly přibližně 48 hodin lyofilizovány za vzniku bílé vločkovité pevné látky. Pak byly nádobky přeneseny do podtlakové komory, vzduch byl vyčerpán vakuovým čerpadlem a nahrazen plynným perfluor-n-butanem. Před použitím byla přidána voda a

-nádobky— by-ly— opatrně—ručně—p-ro-třepávány-něko-l-i-k—sek-und-r-cím-žbyly získány disperze bublinek, vhodné pro použití jako kontrastní činidla pro zobrazování pomocí ultrazvuku. Rekonstituované produkty byly charakterizovány měřením distribuce průměrů částic a zeslabení akustického signálu stejně jako v příkladu 2. Výsledky jsou rovněž uvedeny v následující tabulce 4.1.

Tabulka 4.1

Koncentrace bublinek, jejich rozměry a akustické údaje pro disperze bublinek plynného perfluor-n-butanu, stabilizované hydrogenovaným fosfatidylserinem po zmrazení a rozmražení a po lyofilizaci • t ♦♦♦· ·* ♦· ·· ·*

zpracování	čísel.	objem.	objem.	zesla-	regene-	frekv.
vzorku	konc,	konc.	střed.	bení	race po	při max
	I0⁶/ml	%	průměr	při	přetla-	zesla-
		yum	3,5MHz	ku %	bení
			dÉ/cm		MHz

promytí	10390	10,4	3,8	n.a.	n.a.	n.a
zmrazení a
roztátí	10142	9,9	3,6	n. a.	n.a.	n.a
lyofilizace	7780	4,6	3,1	58,0	89	5,3

n.a. = nebylo provedeno

Příklad 5

Vystavení disperze mikrobublinek perfluorbutanu působení kapaliny, nasycené vzduchem

Lahvička s obsahem lyofilizovaného materiálu v atmosféře perfluorbutanu byla připravena způsobem podle příkladu 2(b). Před použitím byla k materiálu přidána voda, čímž vznikla disperze mikrobublinek.

200 ml prostředku Isoton II bylo ponecháno na vzduchu několik dnů při teplotě místnosti tak, aby roztok byl plně nasycen vzduchem. Dalších 200 ml kapaliny bylo zbaveno plynu při teplotě 60 °C po dobu 1 hodiny při použití vakuového čerpadla a pak byl materiál zchlazen na teplotu místnosti při zachování podtlaku. Přístup vzduchu byl umožněn až těsně před použitím.

Do každé kapaliny bylo přidáno vždy 10 mikrolitrů suspenze mikrobublinek a výsledné směsi byly inkubovány • ft'. ·· ft· ···· »·. «ft ftftft· ftí ft ft ftftftft ft( ft ft ftj · · · · ftj, ft • ft · ftft · ftft ftftft ftftft ftftft · · · * * i ft· ftftftft ftft ·· ·· ft* po dobu 5 minut, načež byly vzorky analyzovány a byl zjištěn střední průměr částic pomocí přístroje Coulter Multisizer Mark II.

V prostředí zbaveném plynů, v němž nebylo možno očekávat difúzi plynů z kapaliny do mikrobublinek, byl střední průměr mikrobublinek 1,77 mikrometrů, přičemž 0,25 % mikrobublinek mělo průměr větší než 5 mikrometrů. V kapalině, nasycené vzduchem byly odpovídající hodnoty-2,43 mikrometrů a 0,67 %. Opakovaná měření po dalších 5 minutách prokázala, že rozměry již dosáhly stálé hodnoty.

Tyto pokusy prokázaly, še střední průměr mikrobublinek se zvětšil pouze o 37 % v případě, že mikrobublinky byly vystaveny působení kapaliny, nasycené vzduchem a tedy analogické tepenné kryj, přičemž jen velmi malý počet mikrebublinek dosáhl rozměru, při němž by mohlo dojít k ucpání kapilárních krevních cév. Toto zjištění kontrastuje s mikrobublinkami s obsahem perfluorhexanu v obdobném prostředí, kterým byla vysoce zředěná disperze mikrobublinek ve vodě s obsahem rozpuštěného vzduchu, tato disperze je popsána v příkladu II mezinárodní přihlášky W0-A-95/03835, kde se také popisuje, že došlo ke dvojnásobnému zvětšení průměru bublinek v přítomnosti vzduchu.

Příklad 6

Stálost disperze mikrobublinek perfluorbutanu při zvýšeném tlaku

Nádobky s obsahem lyofilizovaného materiálu v atmosféře perfluorbutanu byly připraveny podle příkladu 2(a). Těsně před použitím byly do každé nádobky přidány 2 ml vody, čímž vznikla disperze mikrobublinek.

I* ftft-V ·· ·· ·· *·*· ··' ·* » ft « ft ft | ft ft * • ft ‘ft ft ft ft · • · ft ft ft ft ft · ft • · S * ·, . · 9 9 • ft ftVftft ·· ·* ·· ^Jftft

Zeslabení bylo sledováno při 1,5 až 8 MHz před, v průběhu a po aplikaci přetlaku vzduchu 300 mm Hg. Přetlak, byl uvolněn po 90 sekundách. Výsledky jsou znázorněny na obr. 2 a prokazují, že i když zeslabení při 4 MHz (nejvyšší hodnota pro kontrastní činidlo bez použití přetlaku) kleslo při přetlaku až jednu třetinu, došlo k téměř plné regeneraci (85 až 95 %>), jakmile byl přetlak uvolněn.

Přetlak vzduchu do hodnoty až 300 mmHg byl aplikován na 90 sekund, zeslabení bylo měřeno při 3,5 MHz. Výsledky jsou znázorněny na obr. 3 a prokazují dobrou regeneraci nejméně 95 % pro všechny vzorky po uvolnění tlaku.

Distribuce průměrů částic byla stanovena Coulterovou analýzou na vzorcích bez přetlaku a na vzorcích po působení pře11 aku _vzduc.hu_ 15.0._a_3Q.0,.mm„Hg_.po_dobu,9O._ sekund ..._Výsl_e.d=________.

ky jsou uvedeny na obr. 4 a prokazují, že neexistuje významný rozdíl mezí křivkami distribuce pro jednotlivé vzorky v rozmezí 1 až 10 mikrometrů.

Claims

1. Vodná disperze mikrobublinek plynu, vyznačující se tím, že je stabilizována amfifilním materiálem, tvořeným v podstatě fosfolipidem, převážně obsahujícím molekuly, které jednotlivě mají definovaný náboj.

2. Vodná disperze mikrobublinek podle nároku 1, vyznačující se tím, že v podstatě veškerý fosfolipid je tvořen molekulami, které jednotlivě mají celkový definovaný negativní náboj.

3. Vodná disperze mikrobublinek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že fosfolipid je z ne.jméně_.7,0tvořen .alespoň.je dní m _fosfat.idy 1 serlnem.______

4. Vodná disperze mikrobublinek podle některého z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje fluorid sírový nebo perfluorované uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností.

5. Vodná disperze mikrobublinek podle nároku 4, vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje perfluorhutan.

6. Kontrastní prostředek pro diagnostické zobrazování pomocí ultrazvuku, vyznačující se tím, že obsahuje disperzi mikrobublinek podle některého z nároků 1 až 5 v kapalném vodném nosném prostředí, vhodném pro injekční podání.

7. Způsob výroby kontrastního prostředku, vyznačující se tím, že se flfl ·· *» ··♦· ·· ·· fl · fl · * V fl flfl,·· • fl * flfl fl ·♦·-» • fl flfl fl ·» ·.»···· • a A ·. a a a· · ··· ·· ·· *· ··

i) disperguje plyn ve vodném prostředí, obsahujícím lipid pro tvorbu membrány za vzniku disperze mikrobublinek plynu, stabilizované lipidem, ii) vzniklá disperze se lyofilizuje v přítomnosti kryoprotektivní a/nebo lyoprotektivní látky za vzniku suchého produktu, který obsahuje kryoprotektivní a/nebo lyoprotektivní matrici s obsahem v podstatě sférických dutin nebo. vakuol, vyplněných plynem a obklopených nejméně jednou vrstvou lipidu, vytvářejícího membránu, načež se iii) suchý produkt rekonstituuje ve vodném nosném prostředí, vhodném pro injekční podání.

8. Způsob podle nároku 7, vyznač u. jící se t í m , že se ve stupni i) jako plyn použije fluorid sírový nebo perfluorovaný uhlovodík s nízkou molekulovou hmotností.

9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačuj ící se tím, že vodné prostředí s obsahem lipidu, užité ve stupni i) dále obsahuje nejméně jednu přísadu ze skupiny alkoholů a polyolů.

10. Způsob podle některého z nároků 7 až 9, v y značující se tím, že lipid pro tvorbu membrány je v podstatě tvořen fosfolipidem a převážně obsahuje molekuly, které jednotlivě mají celkový definovaný náboj.

11. Způsob podle některého z nároků 7 až 10, v y značující se tím, že se před stupněm ii) disperze, stabilizovaná lipidem a vytvořená ve stupni i) promyje a mikrobublinky se podrobí frakcionaci podle svého rozměru.

- 40 • 00 » 0 00 0

12. Způsob podle některého z nároků 7 až 11, v y značující se tím, že se jako kryoprotektivní a/nebo lyoprotektivní látka užije cukr, přijatelný z fyziologického hlediska.

jí

13. Lyof ilizovaný zbytek disperze mikrobublinek podle některého z nároků 1 až 5.

14. Matrice pro uvolnění mikrobublinek, vyznačuj í c í_s_e___t _í m , že je tvořena matricí strukturn__ ho materiálu s obsahem v podstatě sférických dutin nebo vakuol, vyplněných plynem a obklopených lipidovým materiálem pro tvorbu membrány,

15. Matrice podle nároku 14, vyznačující .——'T^že“ jako s t rukt urní“ma ťér i ál^‘o'bs'ahu j e-uhTohy dr‘á*t t ,

16. Matrice podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se tím, že se lipidový materiál pro tvorbu membrány je v podstatě tvořen fosfolipidem, převážně obsahujícím molekuly, které jednotlivě mají celkový definovaný náboj.

17. Matrice podle nároku 16, vyznačuj íc i· ~ setím, že v podstatě veškerý fosfolipid je tvořen molekulami, které jednotlivě mají celkový definovaný negativní náboj.

I^{* 1} (

I .

18. Matrice podle nároku 17, vyznačuj íc í s e t í m , že nejméně 70 % fosfolipidů je tvořena alespoň jedním fosfatidylserinem.

19. Matrice podle některého z nároků 14 až 18, vyzná č u j í c í se tím, že jako plyn obsahuje • * · « 0 0 « ·· 0 · 0 0 0 ·««· · 0 · *000 • 0 0 00 0 00 010 0 0 * 00 0 0« 000000

900 3090 · 0 V

00 00*0 00 ·♦ 00 ··

- 41 fluorid sírový nebo perfluorovaný uhlovodík s nízkou molekulovou hmotností.

20. Kontrastní prostředek pro zobrazování pomocí ultrazvuku, vyznačující se tím, že jako první složku obsahuje matrici podle nároku 18, v níž materiálem matrice je sacharosa a plynem je perfluorbutan a jako druhou složku obsahuje vodné nosné prostředí, vhodné pro injekční podání, přičemž první a druhá složka jsou v prostředku uchovávány v první a^dmhé-komoř-e-ohal.n-B-d-vn—--jitou komorou.