EA001135B1

EA001135B1 - Усовершенствования в области контрастных агентов

Info

Publication number: EA001135B1
Application number: EA199800745A
Authority: EA
Inventors: Харальд Дугстад; Йо Клавенесс; Поль Ронгвед; Роальд Скуртвейт; Йорун Бренден
Original assignee: Нюкомед Имагинг А/С
Priority date: 1996-02-19
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2000-10-30
Also published as: CZ262598A3; SK112698A3; OA10839A; ES2197986T3; EP0881915A1; JP4418033B2; EP0881915B1; CN1213972A; HU229090B1; EA199800745A1; US20010010811A1; HUP9900813A3; KR19990082669A; IL125748A0; EP1331013A2; AP9801319A0; EE9800249A; IL125748A; US20050201942A1; WO1997029783A1

Description

Изобретение касается новых газосодержащих контрастных агентов, используемых при получении изображений для диагностики, более конкретно - таких контрастных веществ, содержащих газовые микропузырьки, стабилизированные фосфолипидами, и нового способа получения газосодержащих контрастных веществ.

Хорошо известно, что получение изображений при действии ультразвука (ультразвуковых изображений) представляет собой потенциально ценный диагностический инструмент, например, при исследовании сердечно-сосудистой системы, особенно в кардиографии, и капиллярных сосудов в тканях. Были предложены различные контрастные вещества, чтобы улучшить качество полученных таким образом акустических изображений, в том числе суспензии твердых частиц, эмульгированные капли жидкости, газовые пузырьки и капсулированные газы или жидкости. Обычно считают, что контрастные вещества с низкой плотностью, которые легко сжимаемы, особенно эффективны благодаря создаваемому ими обратному рассеянию, и поэтому проявился значительный интерес к получению газосодержащих и газообразующих систем.

Известно также, что газосодержащие контрастные среды эффективны при получении изображений методом магнитного резонанса (МР), например, в качестве контрастных веществ, влияющих на чувствительность, которые могут действовать, уменьшая интенсивность сигнала МР. Кислородсодержащие контрастные среды также можно потенциально использовать в качестве парамагнитных контрастных веществ для МР.

Кроме того, в области получения рентгеновских изображений было сделано наблюдение, что газы, такие как диоксид углерода, можно использовать в качестве негативных контрастных веществ для орального применения или контрастных веществ для введения в кровь.

Использование радиоактивных газов, например радиоактивных изотопов инертных газов, таких как ксенон, было также предложено для сцинтиграфии, например, для получения изображений кровяного депо.

Первые исследования, в которых изучались свободные газовые пузырьки, образующиеся ίη νίνο в результате внутрисердечного введения физиологически приемлемых веществ, показали потенциальную эффективность таких пузырьков в качестве контрастных веществ в эхографии, однако, такие методики на практике жестко ограничены коротким временем жизни свободных пузырьков. Соответственно возник интерес к способам стабилизации газовых пузырьков для эхо-кардиографии и других ультразвуковых исследований, например, с помощью эмульгаторов, масел, загустителей или сахаров, или путем захвата или капсулирования газа или его предшественника в различных системах, например, в виде пористых газосодержащих микрокапсул или в виде капсулированных газовых микропузырьков.

Имеется некоторое количество работ, относящихся к использованию фосфолипидов в качестве компонентов газосодержащих контрастных веществ для получения ультразвуковых изображений (ультразвуковых контрастных веществ). Так, например, использование контрастной среды для получения ультразвуковых изображений, состоящей из фосфолипидных липосом, в которой липидный бислой окружает заключенную внутри него композицию, содержащую газ или предшественник газа, описано в патенте США А-4900540. Капсулированное вещество обычно является предшественником газа, таким как водный раствор бикарбоната натрия, который после его применения выделяет диоксид углерода в результате попадания в среду с рН, характерным для организма. Поэтому ядра образующихся липосом будут содержать жидкость, содержащую чрезвычайно малые микропузырьки газа, которые будут проявлять только ограниченную эхогенность из-за их малого размера.

В международной заявке А-9115244 описана контрастная среда для ультразвука, содержащая микропузырьки воздуха или другого газа, образующиеся в суспензии липосом, заполненных жидкостью, причем липосомы очевидно стабилизируют микропузырьки. Такие системы отличаются от систем, описанных в упомянутом выше патенте США А-4900540, в котором воздух или другой газ находится внутри липосом.

В международной заявке А-9211873 описаны водные препараты, предназначенные для адсорбции и стабилизации микропузырьков и поэтому служащие в качестве контрастных веществ для ультразвука, причем композиции содержат полимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена и отрицательно заряженные фосфолипиды. Весовое соотношение полимера к фосфолипиду обычно составляет около 3:1.

Ультразвуковые контрастные вещества, содержащие газонаполненные липосомы, т. е. липосомы, которые практически не содержат жидкости внутри, и их получение методом медленного впуска газа при вакуумной сушке описаны в международной заявке А-9222247. Получение таких газонаполненных липосом методом впуска газа при встряхивании в гелеобразном состоянии описано в международной заявке А9428780. Сообщение о газонаполненных липидных бислоях, состоящих из дипальмитоилфосфатидилхолина, применяемых в качестве ультразвуковых контрастных веществ, представлено в работе ипдег с1 а1., 1пуек1щаЦуе Καάίοίοβν. 29, 8ирр1етеп1 2, 8. 134-136 (1994).

В международной заявке А-9409829 описаны применяемые для инъекций суспензии газовых микропузырьков в водной жидкости, служащей носителем, которая содержит, по крайней мере, один фосфолипидный стабилизатор, причем концентрация фосфолипидов в носителе составляет менее 0,01 вес.%, но равна или выше количества, при котором молекулы фосфолипидов присутствуют исключительно на межфазной поверхности газовый пузырек жидкость. Поэтому количество фосфолипида может быть таким, которое только необходимо для образования одного слоя поверхностноактивного вещества (ПАВ) вокруг газовых микропузырьков, и образовавшаяся пленкоподобная структура стабилизирует пузырьки, предохраняя их от разрушения или коалесценции. Микропузырьки с липосомоподобным бислоем ПАВ не могут быть получены при использовании таких низких концентраций фосфолипида.

Еще одна группа предыдущих работ касается выбора газов для содержащих газовые микропузырьки ультразвуковых контрастных сред, с тем, чтобы улучшить такие их свойства, как стабильность и продолжительность эхогенного эффекта. Так, например, в международной заявке А-9305819 предлагается использовать свободные микропузырьки газов, имеющих коэффициент О больше 5, где

О = 4,0 х 10^-7 х ρ/Ο₃Ό, (здесь ρ - плотность газа в кг-м³, С, - растворимость газа в воде в моль-л^-1 и Ό - коэффициент диффузии газа в растворе в см³-с^-1). Приведен обширный список газов, которые, как указано, удовлетворяют этому требованию.

В европейском патенте А-0554213 предполагается, что можно придать устойчивость против разрушения под давлением газонаполненным микровезикулам путем введения в них, по крайней мере, одного газа, растворимость которого в воде, выраженная в литрах газа на литр воды при нормальных условиях, деленная на корень квадратный из его молекулярного веса, не превышает 0,003. Указано, что предпочтительные газы включают гексафторид серы, гексафторид селена и различные фреоны. Такие газы можно, между прочим, использовать в фосфолипидсодержащих композициях такого типа, как описано в упомянутой выше международной заявке А-9215244.

8с1тс1бсг с1 а1. в журнале Iηνοδίί^αΐίνο Вабю1о§у 30(8), рр. 451-457 (1995) описали новые контрастные вещества для ультразвуковой эхографии на основе микропузырьков, заполненных гексафторидом серы, по-видимому, стабилизированных комбинацией полиэтиленгликоля 400 и смеси фосфолипидов дистеароилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилглицерина. Указано, что использование гексафторида серы, а не воздуха, обеспечивает улучшенную устойчивость против повышения давления, такого, которое происходит в левом желудочке сердца во время систолы.

В международной заявке А-9503835 предлагается использовать микропузырьки, содер жащие газовую смесь, состав которой основан на рассмотрении парциальных давлений газов как внутри, так и снаружи микропузырьков так, чтобы учитывать осмотические эффекты, зависящие от размера микропузырька. Типичные смеси содержат газ, имеющий низкое давление пара и ограниченную растворимость в крови или плазме (например, фторуглерод) в сочетании с другим газом, который более быстро обменивается с газами, присутствующими в нормальной крови или плазме (например, с азотом, кислородом, диоксидом углерода или их смесями).

В международной заявке А-9516467 предложено использование контрастных сред для ультразвука, содержащих смесь газов А и В, где газ В присутствует в количестве 0,5-41 об.%, имеет молекулярный вес более 80 дальтон и имеет растворимость в воде ниже 0,0283 мл/мл воды при нормальных условиях, а остальную часть смеси составляет газ А. Типичными примерами газов А являются воздух, кислород, азот, диоксид углерода и их смеси. Типичными примерами газов В являются фторсодержащие газы, такие как гексафторид серы и различные перфторированные углеводороды. Предпочтительными стабилизаторами в таких контрастных средах являются фосфолипиды.

Фосфолипиды, которые использовались в контрастных веществах в предыдущих работах, включают лецитины (т.е. фосфатидилхолины), например, природные лецитины, такие как лецитин желтка куриного яйца или лецитин сои, и синтетические или полусинтетические лецитины, такие как димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин или дистеароилфосфатидилхолин; фосфатидные кислоты; фосфатидилэтаноламины; фосфатидилсерины; фосфатидилглицерины; фосфатидилинозиты; кардиолипины; сфингомиелины; смеси любых из вышеперечисленных веществ и смеси с другими липидами, такими как холестерин. Производные лецитина обычно являются наиболее часто используемыми фосфолипидами, возможно, благодаря легкости их получения из природных источников. Использование добавок, таких как холестерин, в количествах до 50 вес.% описано в международных заявках А-9115244 и А-9409829, тогда как введение, по крайней мере, небольшого количества (например, около 1 мол.%) отрицательно заряженного липида (например, фосфатидилсерина или жирной кислоты) для увеличения стабильности предложено в международной заявке А-9222247. Предпочтительная фосфолипидная композиция согласно международной заявке А-9428780 содержит дипальмитоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилдиэтаноламин, замещенный полиэтиленгликолем 5000, и дипальмитоилфосфатидную кислоту, в молярном соотношении около 87:8:5. Типичные смешанные фосфолипидные композиции согласно международным за явкам А-9409829 и А-9516467 содержат диарахидоилфосфатидилхолин и дипальмитоилфосфатидную кислоту в весовом соотношении примерно 100:4, хотя в последней заявке также приводятся примеры использования равных весовых количеств дистеароилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилглицерина.

Из предыдущего описания очевидно, что в существующих суспензиях микропузырьков, содержащих фосфолипиды, предлагаемых для использования в качестве контрастных сред, по крайней мере 50% фосфолипидов представляют собой нейтральные фосфолипиды, такие как лецитины. Чаще всего присутствует только незначительная доля, например около 5% заряженных фосфолипидов.

Настоящее изобретение основано на том обнаруженном факте, что использование преимущественно заряженных фосфолипидов в качестве практически единственного компонента содержащих микропузырьки контрастных веществ может дать ценные и неожиданные преимущества, выраженные в таких параметрах, как стабильность продукта и акустические свойства. Мы не хотим быть связанными какими-либо теоретическими соображениями, но можно полагать, что электростатическое отталкивание между заряженными фосфолипидными мембранами способствует образованию стабильных и стабилизирующих монослоев на межфазных поверхностях между микропузырьками и жидкостью-носителем; гибкость и деформируемость таких тонких мембран будет повышать эхогенность продуктов, полученных согласно этому изобретению, по сравнению с газонаполненными липосомами, содержащими один или более липидных бислоев.

Мы также обнаружили, что использование заряженных фосфолипидов может дать возможность получения микропузырьковых контрастных веществ с улучшенными свойствами, что касается, например, стабильности, диспергируемости и устойчивости к коалесценции, без введения добавок, таких как дополнительные ПАВ и/или вещества, повышающие вязкость, и тем самым быть уверенными, что число компонентов, вводимых в организм при инъекции контрастных веществ, сводится к минимуму. Так например, заряженные поверхности микропузырьков могут свести к минимуму или предотвратить их агрегацию, в результате электростатического отталкивания.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, дается контрастное вещество для использования в диагностических исследованиях, содержащее суспензию в водном жидком носителе, пригодном для инъекций, газовых микропузырьков, стабилизированных содержащим фосфолипиды амфифильным веществом, характеризующееся тем, что указанное амфифильное вещество состоит в основном из фосфолипида, преимущест венно содержащего молекулы с избыточными (пе!) зарядами.

Желательно, чтобы, по крайней мере, 75%, предпочтительно, практически все фосфолипиды в контрастных веществах этого изобретения состояли из молекул, несущих избыточный общий заряд в условиях приготовления и/или использования, и этот заряд может быть положительным или, более предпочтительно, отрицательным. Типичными примерами положительно заряженных фосфолипидов являются эфиры фосфатидных кислот, таких как дипальмитоилфосфатидная кислота или дистеароилфосфатидная кислота, с аминоспиртами, такими как гидроксиэтилендиамин. Примерами отрицательно заряженных фосфолипидов являются природные (например, получаемые из сои или яичного желтка), полусинтетические (например, частично или полностью гидрированные) и синтетические фосфатидилсерины, фосфатидилглицерины, фосфатидилинозиты, фосфатидные кислоты и кардиолипины. Ацильные группы жирных кислот в таких фосфолипидах могут обычно содержать каждая около 14-22 атомов углерода, например, как в пальмитоильной и стеароильной группах. Лизоформы таких заряженных фосфолипидов также используются согласно этому изобретению, причем термин лизо обозначает фосфолипиды, содержащие только одну ацильную группу жирной кислоты, предпочтительно, присоединенную сложноэфирной связью к атому углерода в остатке глицерина в положении 1 . Такие лизоформы заряженных фосфолипидов могут с успехом использоваться в смеси с заряженными фосфолипидами, содержащими две ацильные группы жирных кислот.

Фосфатидилсерины представляют собой особенно предпочтительные фосфолипиды, используемые в контрастных веществах согласно этому изобретению, и предпочтительно составляют основную часть, например, по крайней мере, 80% первоначально содержащихся в них фосфолипидов, например 85-92%, хотя их содержание может в дальнейшем несколько снизиться, например, приблизительно до 70% при последующей обработке, такой как стерилизация при нагревании. Можно понять, что такая обработка может привести к образованию продуктов разложения, не являющихся фосфолипидами, таких как свободные жирные кислоты, например, в концентрациях до 1 0%; указания в этом описании на амфифильный материал, состоящий в основном из фосфолипидов, следует понимать так, что они относятся и к фосфолипидам, содержащим такие свободные жирные кислоты. Хотя мы не хотим быть связанными теоретическими соображениями, возможно, что образование ионных связей между карбоксильными и аминогруппами соседних остатков серина способствует стабильности систем, содержащих фосфатидилсерин, например, как видно по их хорошей стабильности при действии дав ления. Предпочтительные фосфатидилсерины включают насыщенный (например, гидрированный или синтетический) природный фосфатидилсерин и синтетические или полусинтетические диалканоилфосфатидилсерины, такие как дистеароилфосфатидилсерин, дипальмитоилфосфатидилсерин и диарахидоилфосфатидилсерин.

Важное преимущество использования таких контрастных веществ на основе фосфатидилсеринов состоит в том, что организм распознает старые эритроциты и тромбоциты по высоким концентрациям фосфатидилсерина на их поверхности и таким образом может удалить такие контрастные вещества из кровяного русла аналогично тому, как удаляются эритроциты. Кроме того, так как поверхность таких контрастных веществ может быть определена организмом как эндогенная, они могут не вызывать вредные системные побочные эффекты, такие как гемодинамические эффекты и другие анафилактические реакции, которые могут сопровождать применение некоторых липосомных препаратов (см., например, международную заявку А-9512386). В подтверждение этого не наблюдалось никаких острых токсических эффектов, таких как изменения кровяного давления или частоты сердечных сокращений в испытаниях на животных, при инъекции собакам внутривенно контрастных веществ согласно этому изобретению при дозах, превышающих вплоть до десяти раз обычную дозу, применяемую при получении изображений.

Любой биосовместимый газ можно использовать в контрастных веществах этого изобретения, причем следует определить, что термин газ, используемый здесь, включает любые вещества (в том числе смеси), в основном или полностью находящиеся в газообразной (включая парообразную) форме при нормальной температуре человеческого тела 37°С. Так например, этот газ может представлять собой воздух; азот; кислород; диоксид углерода; водород; закись азота; инертный газ, такой как гелий, аргон, ксенон или криптон; фторид серы, такой как гексафторид серы, ди(пентафторид серы) или пентафторид трифторметилсеры; гексафторид селена; силан (необязательно галогенированный), такой как тетраметилсилан; низкомолекулярный углеводород (например, содержащий до 7 атомов углерода), например, алкан, такой как метан, этан, пропан, бутан или пентан, циклоалкан, такой как циклобутан или циклопентан, алкен, такой как пропен или бутен, или алкин, такой как ацетилен; простой эфир; кетон; сложный эфир; галогенированный низкомолекулярный углеводород (например, содержащий до 7 атомов углерода); или смесь любых перечисленных выше веществ. По крайней мере, некоторые из атомов галогена в галогенсодержащих газах предпочтительно являются атомами фтора. Таким образом, биосовместимые га логенированные углеводородные газы могут, например, быть выбраны из бромхлордифторметана, хлордифторметана, дихлордифторметана, бромтрифторметана, хлортрифторметана, хлорпентафторэтана и перфторуглеродов, например, перфторалканов, таких как перфторметан, перфторэтан, перфторпропаны, перфторбутаны (например, перфтор-н-бутан, возможно в смеси с другими изомерами, такими как перфтор-изобутан), перфторпентаны, перфторгексаны и перфторгептаны; перфторалкенов, таких как перфторпропен, перфторбутены (например, перфторбут-2-ен) и перфторбутадиен; перфторалкинов, таких как перфторбут-2-ин; и перфторциклоалканов, таких как перфторциклобутан, перфторметилциклобутан, перфтордиметилциклобутаны, перфтортриметилциклобутаны, перфторциклопентан, перфторметилциклопентан, перфтордиметилциклопентаны, перфторциклогексан, перфторметилциклогексан и перфторциклогептан. Другие галогенированные газы включают фторированные, например, перфторированные кетоны, такие как перфторацетон, и фторированные, например, перфторированные простые эфиры, такие как перфтордиэтиловый эфир.

Возможно, лучше всего в контрастных веществах этого изобретения использовать фторированные газы, такие как фториды серы или фторуглероды (например, перфторуглероды), которые, как известно, образуют особенно стабильные суспензии микропузырьков (см., например, статью 8сйие1бег с1 а1., упомянутую выше. Можно при желании использовать газовые смеси, полученные на основе рассмотрения парциальных давлений как внутри, так и снаружи микропузырьков, и следующих из них осмотических эффектов, зависящих от размера микропузырьков, например, как описано в международной заявке А-9503835, например, смесь относительно растворимого в крови газа, такого как азот или воздух, и относительно нерастворимого в крови газа, такого как перфторуглерод.

Однако мы нашли, что контрастные вещества этого изобретения, например, содержащие микропузырьки перфторалкана, такого как перфторбутан, стабилизированные фосфатидилсерином, к нашему удивлению сохраняют стабильные размеры после внутривенного введения в организм, и не проявляют описанной ранее тенденции к неконтролируемому росту, наблюдавшейся для микропузырьков таких газов, в результате диффузии внутрь пузырьков газов, содержащихся в крови, таких как кислород, азот и диоксид углерода, а вместо этого быстро достигают максимального размера, после чего дальнейший рост не наблюдается. Это устранение нелимитированного увеличения размера, которое может привести к нежелательному и потенциально очень опасному блокированию капиллярных кровеносных сосудов, является главным преимуществом контрастных веществ этого изобретения.

Кроме того, было найдено, что контрастные вещества этого изобретения, содержащие перфторалканы, такие как перфторбутан, проявляют неожиданно высокую стабильность при давлениях, аналогичных тем, которые обычно встречаются ίη νίνο, например, показывая практически полное (например, по крайней мере, до 90%) восстановление нормального распределения по размеру и эхогенных свойств после воздействия избыточных давлений (например, воздуха) до 300 мм Нд в течение 90 с.

Контрастные вещества этого изобретения можно использовать в самых различных методах получения изображений в диагностических целях, включая сцинтиграфию, получение оптических изображений, получение изображений при ультразвуковых, МР и рентгеновских (включая действие мягких рентгеновских лучей) исследованиях. Их использование при получении диагностических ультразвуковых изображений и при получении МР-изображений, например, в качестве влияющих на чувствительность контрастных веществ, составляет предпочтительные существенные признаки настоящего изобретения. Можно использовать разнообразные методы получения ультразвуковых изображений, например, включающие получение изображений с использованием основной Вмоды и высших гармоник В-моды, а также получение изображений с использованием основных доплеровских частот и доплеровских гармоник; при желании можно использовать методы получения трехмерных изображений. Контрастное вещество можно также использовать в методах получения ультразвуковых изображений, основанных на корреляционных методиках, например, как описано в патенте США А5601085 и в международной заявке по договору о патентной кооперации РСТ/СВ96/02413.

Ультразвуковые испытания ίη νίνο на собаках показали, что контрастные вещества согласно настоящему изобретению могут дать увеличение интенсивности сигнала обратного рассеяния от миокарда на 15-20 дб после внутривенного введения уже при дозах 1 -20 нл микропузырьков на кг веса тела. Сигналы можно наблюдать даже при более низких дозах, используя более чувствительные методы, такие как цветной эффект Доплера, или методы, производные от эффекта Доплера, например, эффект Доплера на основе амплитуды или нелинейные методы, такие как описаны в статьях Тискег е! а1., Ьапсе! (1968), р. 1253, МШег, ИЙга8ошс8 (1981), рр.217-224, и Иетейоиве е! а1., 1. Асои81. 8ос. Ат., 75, рр. 1473-1477 (1984). Было найдено, что при таких низких дозах ослабление (затухание) ультразвука в заполненных кровью объемах, таких как полость сердца, достаточно низкое, чтобы можно было видеть представляющие интерес участки в кровеносных сосудах миокарда. Испытания показали также, что такие введенные внутривенно контрастные вещества должны распределяться по всему кровяному депо, увеличивая в результате этого эхогенность всех тканей, в которых расположены кровеносные сосуды, и должны рециркулировать. Также было найдено, что они могут использоваться в качестве веществ, увеличивающих общий доплеровский сигнал, и, кроме того, могут использоваться в ультразвуковой компьютерной томографии и при получении физиологически включаемых или прерываемых изображений.

Для ультразвуковых приложений, таких как эхокардиография, для того, чтобы обеспечить свободное прохождение через легочную систему и чтобы достичь резонанса на предпочтительных для получения изображений частотах 0,1-15 МГц, может быть удобно использовать микропузырьки, имеющие средний размер 0,11 0 мкм, например, 1 -7 мкм. Мы нашли, что контрастные вещества согласно этому изобретению можно получать с очень узким распределением по размеру частиц в дисперсии микропузырьков, в пределах, предпочтительных для эхокардиографии, и при этом значительно возрастает их эхогенность, а также их безопасность ίη νίνο, и контрастные вещества приобретают особые преимущества при их применении в таких областях как измерение кровяного давления, прослеживание тока крови и ультразвуковая томография. Так например, можно легко получить продукты, в которых свыше 90% (например, по крайней мере, 95%, предпочтительно, по крайней мере, 98%) микропузырьков имеют диаметры в диапазоне 1-7 мкм, и менее 5% (например, не более 3%, предпочтительно не более 2%) микропузырьков имеют диаметры выше 7 мкм.

В применениях для ультразвуковых исследований контрастные вещества этого изобретения можно применять, например, в таких дозах, чтобы количество введенного фосфолипида находилось в пределах 0,1-10 мкг/кг веса тела, например, 1-5 мкг/кг в случае получения изображений на основной В-моде. Можно оценить, что использование таких низких концентраций фосфолипида является существенным преимуществом, позволяющим свести к минимуму возможные токсические побочные эффекты. Более того, низкое содержание фосфолипидов, присутствующих в эффективных дозах, может позволить увеличить дозировку, чтобы пролонгировать время наблюдения без вредных эффектов.

Общая концентрация фосфолипида в пригодных для инъекций формах контрастных веществ согласно этому изобретению может быть в пределах 0,01-2 вес.%, например, 0,2-0,8 вес.%, оптимально 0,5 вес.%.

В общем, мы нашли, что нет необходимости вводить добавки, такие как эмульгаторы или вещества, повышающие вязкость, которые обычно используются во многих существующих рецептурах контрастных веществ, в контрастные вещества этого изобретения. Как отмечено выше, это дает преимущество в том, что в организм вводится минимальное число компонентов, и гарантирует, что вязкость контрастных веществ будет возможно более низкой. Так как получение контрастных веществ обычно включает стадию лиофильной сушки (сушки вымораживанием), как обсуждается более подробно ниже, может оказаться полезным, однако, включить в композицию одно или несколько веществ, обладающих криозащитным и/или лиозащитным действием, и/или один или более наполнителей, например, спиртов, например, алифатический спирт, такой как трет-бутанол; полиол, такой как глицерин; аминокислоту, такую как глицин; углевод, например, сахар, такой как сахароза, маннит, трегалоза, глюкоза, лактоза, или циклодекстрин, или полисахарид, такой как декстран; или полигликоль, такой как полиэтиленгликоль. Основной список веществ, дающих криозащитный и/или лиозащитный эффект, приведен в статье, помещенной в Лс1а Рйагт. Тес1то1. 34(3), рр. 129-139 (1988), содержание которой включено сюда через ссылку. Использование физиологически хорошо переносимых (толерантных) сахаров, таких как сахароза, например, в таком количестве, чтобы сделать продукт изотоническим или отчасти гипертоническим, является предпочтительным.

Описанные в предыдущих работах содержащие микропузырьки контрастные вещества, например, такие как описано в международной заявке А-9409829, обычно получают путем контактирования порошкообразного ПАВ, например, высушенных вымораживанием заранее приготовленных липосом или высушенных вымораживанием или распылением растворов фосфолипидов, с воздухом или другим газом и затем с водным носителем, и перемешивания, чтобы получить суспензию микропузырьков, которую затем необходимо применять через короткое время после ее приготовления. Однако такие процессы страдают тем недостатком, что необходимо затратить значительную энергию на перемешивание, чтобы образовалась требуемая дисперсия, и что размеры и распределение по размеру микропузырьков зависят от количества затраченной энергии, и поэтому их на практике невозможно контролировать.

В настоящее время мы нашли, что контрастные вещества согласно этому изобретению можно успешно получить путем образования дисперсии газовых микропузырьков в соответствующей водной среде, содержащей фосфолипиды, которую можно при желании предварительно стерилизовать в автоклаве или стерилизовать другим способом, и последующей лиофилизации этой дисперсии с тем, чтобы получить сухой продукт, который можно превратить обратно в дисперсию. Такие продукты, например, содержащие лиофилизованный остаток суспензии газовых микропузырьков в содержащей амфифильное вещество водной среде, где амфифильное вещество состоит в основном из фосфолипида, содержащего преимущественно молекулы с избыточными зарядами, составляет еще один существенный признак настоящего изобретения. Когда высушенный продукт содержит одно или более криозащитных и/или лиозащитных веществ (криопротекторов и/или лиопротекторов), он может, например, содержать матрицу криозащитного и/или лиозащитного вещества (например, углевода), выделяющую микропузырьки, которая содержит газонаполненные, в основном сферические полости или вакуоли, окруженные одним или несколькими слоями амфифильного вещества.

Более конкретно, мы нашли, что сухие продукты, полученные таким образом, особенно легко могут снова превращаться в суспензию в водной среде, такой как вода, в водном растворе, таком как солевой раствор (который оптимально может быть сбалансирован так, что конечный продукт, предназначенный для инъекций, не будет гипотоническим), или в водном растворе одного или более веществ, регулирующих осмотическое давление Дошсйу), таких как соли (например, соли катионов плазмы с физиологически приемлемыми противоионами), или сахара, спирты - производные сахаров, гликоли и другие неионные вещества типа полиолов (например, глюкоза, сахароза, сорбит, маннит, глицерин, полиэтиленгликоли, пропиленгликоли и т. п.), для чего требуется лишь минимальное перемешивание, такое, которое, например, можно обеспечить мягким встряхиванием на руках. Размер микропузырьков, полученных таким образом, постоянно воспроизводится и практически не зависит от количества приложенной к системе энергии перемешивания; он определяется размером микропузырьков, образующихся в первоначальной дисперсии микропузырьков, причем неожиданно оказалось, что этот размер в основном сохраняется в лиофилизованном и вновь превращенном в дисперсию продукте. Таким образом, поскольку размер микропузырьков в первоначальной дисперсии можно легко регулировать при помощи параметров процесса приготовления дисперсии, таких как способ, скорость и продолжительность перемешивания, конечный размер микропузырьков можно легко контролировать.

Лиофилизованные продукты согласно этому изобретению оказались стабильными при хранении в течение нескольких месяцев при обычных условиях. Дисперсии микропузырьков, повторно приготовленные в воде или в водном растворе, могут быть стабильными, по крайней мере, в течение 1 2 ч, что обеспечивает значительную гибкость, когда сухой продукт вновь превращают в дисперсию перед инъекцией.

Описанный выше способ приготовления контрастных веществ согласно этому изобрете нию обычно применим к приготовлению контрастных веществ, представляющих собой суспензии в пригодном для инъекций водном жидком носителе газовых микропузырьков, стабилизированных мембранообразуюшими липидами, включая как нейтральные, так и заряженные липиды (например, фосфолипиды), а также их смеси.

Такой способ, включающий следующие стадии:

ί) образование дисперсии газовых микропузырьков в водной среде, содержащей мембранообразующий липид;

ίί) лиофилизацию полученной таким образом стабилизированной липидами газовой дисперсии с получением сухого продукта, содержащего липиды; и ϊϊΐ) обратное превращение указанного сухого продукта в дисперсию в пригодном для инъекций водном жидком носителе составляет еще один существенный признак настоящего изобретения, так как в соответствии со стадиями (ί) и (ίί) этого способа получают сухой продукт, который можно вновь превратить в дисперсию, например, продукт, содержащий матрицу, выделяющую микропузырьки (например, состоящую из криозащитного и лиозащитного веществ), содержащую газонаполненные, в основном сферические полости или вакуоли, окруженные слоями мембранообразующего липидного вещества.

Стадию (ί) можно, например, осуществлять, используя для обработки водной среды, содержащей липиды, любой метод, пригодный для получения эмульсии, например, ультразвуковую обработку, встряхивание, гомогенизацию при высоком давлении, высокоскоростное перемешивание или смешение при высоких усилиях сдвига, например, используя роторстаторный гомогенизатор (коллоидную мельницу) в присутствии выбранного газа. Водная среда может, если желательно, содержать добавки, которые служат для повышения вязкости и/или в качестве вспомогательных веществ для повышения растворимости липидов, такие как спирты или полиолы, например, глицерин и/или пропиленгликоль.

Газ, используемый на стадии получения эмульсии, не должен быть тем же, который будет содержаться в конечном продукте. Поэтому большую часть этого газа можно удалить во время следующей стадии лиофилизации, и оставшийся газ можно удалить путем вакуумирования сухого продукта, который затем можно поместить в атмосферу газа, который должен содержаться в конечном продукте. По этой причине газ для получения эмульсии можно выбрать исключительно из тех соображений, чтобы оптимизировать параметры процесса эмульгирования, без учета требований, касающихся конечного продукта. Мы обнаружили, что эмульгирование в присутствии фторида се ры, такого как гексафторид серы, или газообразного фторированного углеводорода, такого как перфторалкан, или перфторциклоалкан, предпочтительно, содержащего 4 или 5 атомов углерода, особенно благоприятно с точки зрения получения конечных продуктов с постоянными и имеющими узкое распределение размерами микропузырьков.

Эмульгирование удобно проводить при комнатной температуре, например, приблизительно при 25±10°С. Может оказаться необходимым вначале нагреть водную среду, чтобы облегчить гидратацию и, тем самым, диспергирование фосфолипида, и затем дать ей остыть до температуры окружающей среды перед эмульгированием.

Газовые дисперсии, получаемые согласно стадии (ί), особенно водные дисперсии газовых микропузырьков, стабилизированных амфифильным веществом, состоящим в основном из фосфолипида, преимущественно содержащего молекулы с избыточным зарядом, составляют существенный признак этого изобретения. Некоторые такие дисперсии описаны в нашей международной заявке А-9640275 как промежуточные продукты, используемые для приготовления диагностических контрастных веществ, содержащих газовые микропузырьки, стабилизированные одним или более мебранообразующими липидами, сшитыми или полимеризованными в гидрофильной части их молекул. Эти промежуточные дисперсии, в которых амфифильное вещество содержит дипальмитоилфосфатидилсерин, более конкретно, в форме его натриевой соли, или один или в сочетании с дипальмитоилфосфатидилхолином, и газ представляет собой смесь воздуха с перфторпентаном, смесь воздуха с перфторгексаном или смесь перфторбутана с перфторгексаном, здесь не заявлены.

Можно отметить, что поскольку эти дисперсии были промежуточными, они не были получены в стерильной, физиологически приемлемой форме, тогда как газовые дисперсии, полученные на стадии (1) согласно настоящему изобретению, могут быть получены в стерильной, физиологически приемлемой форме (например, с использованием стерильной апирогенной воды или солевого раствора в качестве водного жидкого носителя), если они предназначены для использования непосредственно в качестве контрастных веществ.

Дисперсии, полученные на стадии (1), желательно подвергнуть одной или более операциям промывки перед тем, как использовать их в качестве контрастных веществ или перед стадией лиофилизации (и) для того, чтобы отделить и удалить добавки, такие как вещества, повышающие вязкость, и вещества, улучшающие растворимость, а также нежелательные примеси, такие как не содержащие газа коллоидные частицы и микропузырьки, слишком маленького и/или слишком большого размера; полученные таким образом промытые дисперсии микропузырьков составляют существенный признак этого изобретения. Такую промывку можно осуществить известным способом, причем микропузырьки отделяются при помощи таких методов, как флотация или центрифугирование. Возможность удалить добавки таким образом, а также получить дисперсии микропузырьков с особо узким распределением по размеру частиц являются важными преимуществами способа этого изобретения, особенно потому, что, как отмечено выше, полученное распределение по размеру частиц в основном сохраняется после лиофилизации и обратного превращения в дисперсию. Соответственно, особенно предпочтительно использовать способ, включающий стадии диспергирования газа, промывки и разделения, лиофилизации и обратного превращения в дисперсию.

Можно приготовить фракционированные по размеру дисперсии микропузырьков, в которых, по крайней мере, 90% микропузырьков имеют размеры внутри диапазона 2 мкм, причем микропузырьки предпочтительно имеют средний по объему диаметр в диапазоне 2-5 мкм. Такие дисперсии, и замороженные и лиофилизированные продукты, полученные из них, например, как описано ниже, представляют дополнительные существенные признаки этого изобретения.

В тех случаях, когда используются одно или более криозащитных и/или лиозащитных веществ, их можно добавлять лучше всего после операций промывки перед лиофилизацией.

Лиофилизацию газовой дисперсии можно, например, осуществлять, вначале замораживая ее, а затем проводя лиофилизацию замороженной газовой дисперсии общеизвестными способами. Такие замороженные газовые дисперсии, т. е. замороженные, выделяющие микропузырьки водные дисперсии, содержащие газовые микропузырьки, стабилизированные амфифильными веществами, состоящими в основном из фосфолипидов, содержащих преимущественно молекулы, которые каждая в отдельности имеют общий избыточный заряд, составляют еще один существенный признак этого изобретения. Микропузырьки могут быть, предпочтительно, фракционированы по размерам перед замораживанием, причем выделяющиеся микропузырьки, предпочтительно, имеют среднеобъемный диаметр в интервале 2-5 мкм. Такие продукты можно хранить замороженными и оттаивать, когда потребуется, например, путем простого нагревания и/или путем добавления жидкого носителя, чтобы регенерировать дисперсии микропузырьков, используемые в качестве контрастных веществ в соответствии с этим изобретением.

Так как сухой продукт обычно превращают снова в дисперсию согласно стадии (ш), как описано выше, перед применением газовую дисперсию целесообразно залить в герметизируемые ампулы перед лиофилизацией так, чтобы каждая ампула содержала соответствующее количество, например, однократную дозу лиофилизованного сухого продукта для превращения в пригодную для инъекций форму дисперсии. Посредством лиофилизации газовой дисперсии в индивидуальных ампулах, а не в общем объеме, можно избежать прикосновения к деликатной сотоподобной структуре лиофилизованного продукта и риска, по крайней мере, частичного разрушения этой структуры. После лиофилизации и любой возможной дополнительной откачки газа и введения в свободный объем ампул того газа, который должен присутствовать в виде микропузырьков в полученном готовом контрастном веществе, ампулы можно герметично закрыть подходящим способом. Можно оценить, что возможность выбрать содержание газа в конечном продукте, наряду с возможностью независимо контролировать размер микропузырьков в конечном продукте путем подбора соответствующих параметров процесса во время начальной стадии диспергирования и последующей стадии промывки и разделения, позволяет независимо подобрать размер пузырьков и содержание газа, и благодаря этому дает возможность сделать продукты пригодными для конкретных применений.

В общем, замороженная газовая дисперсия или сухой продукт со стадии (и), например, после любого необходимого и/или желаемого дополнения или изменения содержания газа может быть снова превращена в дисперсию путем добавления соответствующей стерильной водной жидкости-носителя, пригодной для инъекций, такой как стерильная апирогенная вода для инъекций, водный раствор, такой как солевой раствор (который можно сбалансировать так, чтобы конечный продукт, предназначенный для инъекций, не был гипотоническим) или водный раствор одного или более веществ, регулирующих осмотическое давление (например, тех, которые описаны здесь ранее). Когда сухой продукт содержится в ампулах, их удобно герметично закрывать перепонкой (зер!ит), через которую можно вводить жидкий носитель при помощи, возможно, предварительно заполненного шприца; альтернативно сухой продукт и жидкий носитель могут поставляться совместно в двухкамерном устройстве, таком как двухкамерный шприц. Может быть целесообразно перемешивать или мягко встряхивать продукт после повторного получения дисперсии. Однако, как отмечено выше, в стабилизированных контрастных веществах, полученных согласно этому изобретению, размер газовых микропузырьков может быть практически независимым от количества энергии, приложенной для перемешивания сухого продукта, превращаемого в дисперсию. В соответствии с этим может потре боваться не более чем мягкое ручное встряхивание для того, чтобы получить воспроизводимые продукты с постоянным размером микропузырьков.

Последующие, не ограничивающие изобретение, примеры служат для иллюстрации этого изобретения.

На сопровождающих изобретение чертежах показано следующее.

На фиг. 1 представлен график зависимости процента сохранения объемной концентрации после лиофилизации и повторного получения дисперсии от относительного количества заряженного фосфолипида в мембранах контрастных веществ, полученных согласно примеру 1 .

На фиг. 2 представлены спектры ослабления ультразвука в интервале частот 1,5-8 МГц для контрастного вещества, полученного согласно примеру 2(а), измеренные а) перед испытанием на давление; в) во время испытания на давление; и с) после испытания на давление, как описано в примере 6.

На фиг. 3 показан процент уменьшения ослабления ультразвука на частоте 3,5 МГц для контрастного вещества согласно примеру 2(а) после приложения избыточного давления 0-300 мм Нд в течение 90 с, как описано в примере 6.

На фиг. 4 показаны объемные распределения по размерам для контрастных веществ согласно примеру 2 (а), измеренные методом Культера, а) без приложения избыточного давления (♦), в) после действия избыточного давления 150 мм Нд в течение 90 с (Δ), и с) после действия избыточного давления 300 мм Нд в течение 90 с (), как описано в примере 6.

Пример 1. Влияние относительных количеств заряженных фосфолипидов.

Дисперсии микропузырьков, стабилизированные различными фосфолипидами или смесями фосфолипидов, были получены по общей методике, описанной ниже, с использованием параметров процесса, приведенных в таблице Ι.Ι, которая дана ниже.

Были приготовлены растворы выбранных фосфолипидов в воде, содержащей 5,4% вес. смеси пропиленгликоля и глицерина (3:10 по весу), дающие концентрацию фосфолипидов 2-5 мг/мл (для фосфатидилэтаноламина в воде было установлено рН=10,5 путем добавления гидроксида натрия), причем фосфолипиды были гидратированы путем ультразвуковой обработки и/или нагревания до приблизительно 80°С в течение определенного времени (таблица II) и охлаждены до комнатной температуры перед использованием. Заданный объем этого раствора был распределен между несколькими хроматографическими ампулами объемом 2 мл, причем в каждую ампулу помещали 0,8-2 мл раствора. Пространство над жидкостью в каждой ампуле заполняли газообразным перфторбутаном, и ампулы надежно закрывали и встряхивали в течение 45 с в аппарате Екре СарМ1х® (смесителе для зубоврачебных материалов). Полученные дисперсии микропузырьков переносили в более крупную ампулу и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, и получали нижний слой - мутную жидкость и плавающий сверху слой микропузырьков. Жидкость удаляли шприцем и заменяли равным объемом воды с нейтральным рН. Операцию промывки повторяли, но теперь находящуюся внизу жидкость заменяли 1 0%-ным (по весу) раствором сахарозы. Порции промывной дисперсии по 2 мл распределяли между плоскодонными ампулами емкостью по 10 мл, специально предназначенными для лиофилизации, ампулы охлаждали до -47°С и проводили лиофилизацию в течение приблизительно 48 ч, получая белое пушистое твердое вещество. Ампулы переносили в вакуумную камеру, воздух удаляли откачкой вакуумным насосом и заменяли его газообразным перфторбутаном. Перед использованием добавляли воду, ампулы мягко встряхивали вручную в течение нескольких секунд, и получали дисперсии микропузырьков, пригодные в качестве контрастных веществ для ультразвуковых исследований.

Распределение по размерам и объемную концентрацию микропузырьков измеряли при помощи счетчика Культера СоиИег Соии1ег Магк II, имеющего отверстие 50 мкм, с пределами измерений 1-30 мкм. Пробы объемом 20 мкм разбавляли в 200 мл солевого раствора, насыщенного воздухом при комнатной температуре, и выдерживали в течение 3 мин перед измерением для установления равновесия. Измерения проводили на дисперсиях микропузырьков перед лиофилизацией (промытая дисперсия пузырьков) и после лиофилизации (дисперсия, полученная вновь путем добавления воды до того же объема, как перед лиофилизацией). Полученные данные представлены в таблице Ι.ΙΙ, приведенной ниже.

Эффективность лиофилизации для различных дисперсий микропузырьков, стабилизированных фосфолипидами, рассчитывали как процент сохранения (выживания) объемной концентрации после лиофилизации и обратного превращения в дисперсию. На графике (см. фиг. 1 ) показано, как этот параметр изменяется в зависимости от относительного количества заряженного фосфолипида в мембране. Как можно видеть, эффективность лиофилизации увеличивается с увеличением количества заряженного фосфолипида в мембране и достигает самой высокой величины для мембран, содержащих только заряженные фосфолипиды.

юсфолипидами, как описано в примере 1

Таблица Ι.Ι. Состав композиций и параметры процесса, использованные при получении дисперсий пузырьков газообразного перфтор-н-бутана, стабилизированных (

Фосфолипиды и соотношения (по весу)	Количество ΡΕ (мг/мл)	Количество водного растворителя (мл)	Обработка ультразвуком (мин)	Тепловая обработка (мин)	Объем обрабатываемой порции (мл)	Объем жидкости в каждой ампуле (мл)
ΌΡΡΕ	20	10	-	30	10	0,8
НФС/Н-Ρδ (9:1)	45,5	9,1	10	2	9	0,9
НФС/Н-Ρδ (4:1)	14,0	7	10	2	7	1
ϋδΡΟΟδΡδ (4:1)	10,4	5,2	10	2	4	1
ϋδΡΟϋδΡΟ (1:1)	15,2	7,6	10	2	7	1
ΌΡΡδ	24,9	12,5	-	30	11	1
ΌδΡδ	24,8	12,5	-	30	11	1
ΌδΡΟ/ΌΡΡΆ (10:1)	20,2	10	-	10	10	0,8
ΌδΡΟ/ΌΡΡΆ (1:1)	52,0	10,4	-	10	8	0,8

Условные обозначения:

РЬ - фосфолипид;

ΌΡΡΕ - дипальмитоилфосфатидилэтаноламин;

Н-РС - гидрированный яичный фосфатидилхолин; Н-Ρδ - гидрированный яичный фосфатидилсерин; О8РС - дистеароилфосфатидилхолин;

ΌδΡδ - дистеароилфосфатидилсерин;

Ό8ΡΟ - дистеароилфосфатидилглицерин;

ΌΡΡδ - дипальмитоилфосфатидилсерин;

ΌΡΡΆ - дипальмитоилфосфатидная кислота.

Таблица Ι.ΙΙ. Выход, выраженный через объемную концентрацию пузырьков (в процентах от общего объема дисперсии) (1) после промывания дисперсии и (п) после лиофилизации и повторного получения дисперсии

Фосфолипиды и соотношения (по весу)	% заряженного липида в мембране	Объемная конц.(%) до лиофилизации	Объемная конц.(%) после лиофилизации	Количество дисперсии, сохранившееся после лиофилизации (% от начальной об. конц.)
ΌΡΡΕ	0	0,7	0,1	16,4
НФС/Н-?8(9:1)	10	6,4	0,9	14,1
НФС/Н-?8(4:1)	20	1,0	0,2	20,0
ΌδΡ^δΡδ(4:1)	20	4,8	1,0	20,8
ΌδΡΟΌδΡΟ(1:1)	50	0,3	0,1	33,3
ΌΡΡδ	100	0,7	0,4	57,1
ΌδΡδ	100	1,0	0,5	50,0
ΌδΡΟ/ΌΡΡΆ(10:1)	100	1,4	0,7	52,9
ΌδΡΟ/ΌΡΡΆ(1:1)	100	4,3	1,8	41,9

Условные обозначения: см. таблицу Ι.Ι.

Пример 2.

а) Приготовление дисперсий микропузырьков перфторбутана путем встряхивания.

25,3 мг гидрированного яичного фосфатидилсерина добавляли к 12,5 мл воды, содержащей 5,4% вес. смеси пропиленгликоля и глицерина (3:10 по весу). Фосфолипидный материал гидратировали путем нагревания до 70°С в течение приблизительно 30 мин, после чего охлаждали до комнатной температуры. 11 мл дисперсии разделяли на порции по 1 мл, которые помещали в одиннадцать ампул объемом по 2 мл, и свободный объем над жидкостью в ампулах заполняли газообразным перфтор-нбутаном. Ампулы надежно закрывали и встряхивали в течение 45 с, используя аппарат Ехрс СарМ1х® (смеситель для зубоврачебных материалов). Полученные дисперсии микропузырь ков объединяли, помещали в четыре ампулы большего размера и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, получая в результате нижний слой - мутную жидкость и плавающий на ней слой микропузырьков. Нижний слой жидкости удаляли шприцем и заменяли равным объемом воды с нейтральным рН. Операцию промывки повторяли, но на этот раз нижний слой жидкости заменяли 10%-ным (по весу) раствором сахарозы. Порции полученной дисперсии объемом по 2 мл распределяли по ампулам с плоским дном объемом по 1 0 мл, специально предназначенным для лиофилизации, эти ампулы охлаждали до -47°С и проводили лиофилизацию в течение приблизительно 48 ч, и получали белое пушистое твердое вещество. Ампулы переносили в вакуумную камеру, удаляли воздух откачкой вакуумным насосом и заменяли его газообразным перфтор-н-бутаном. Перед использованием добавляли воду, ампулы мягко встряхивали вручную в течение нескольких секунд, и получали дисперсии микропузырьков, пригодные в качестве контрастных веществ для ультразвуковых исследований.

в) Приготовление дисперсий микропузырьков перфторбутана путем перемешивания роторно-статорной мешалкой.

500,4 мг гидрированного яичного фосфатидилсерина добавляли к 100 мл воды, содержащей 5,4% (по весу) смеси пропиленгликоля и глицерина (3:10 по весу). Смесь встряхивали и нагревали до 80°С пять минут, давали остыть до комнатной температуры, снова встряхивали и оставляли стоять на ночь перед использованием.

мл полученного раствора переносили в круглодонную колбу с коническим горлом. Колба была снабжена стеклянной рубашкой, имеющей входной и выходной патрубки для регулирования температуры, соединенные с водяным термостатом, в котором поддерживалась температура 25°С. В раствор вводили вал роторно-статорной мешалки, и чтобы предотвратить утечку газа, зазор между стенкой горловины колбы и валом мешалки закрывали специально сконструированной металлической пробкой, снабженной патрубками для входа и выхода газа, соединенными с газовой линией, для регулирования содержания газа и контроля давления. Патрубок для выхода газа соединяли с вакуумным насосом, и раствор дегазировали в течение одной минуты. Затем через патрубок для входа газа вводили газообразный перфторн-бутан для создания атмосферы этого газа.

Раствор гомогенизировали при скорости вращения 23000 об/мин в течение 10 мин, удерживая вал роторно-статорной мешалки в таком положении, чтобы отверстия были чуть выше поверхности жидкости. Получили кремоподобную дисперсию белого цвета, которую перенесли в плотно закрывающийся контейнер и заполнили его перфтор-н-бутаном. Затем дисперсию перенесли в делительную воронку и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин, в результате чего получили кремоподобный слой пузырьков на поверхности слоя находящейся под ним мутной жидкости. Эту жидкость удаляли и заменяли водой. Затем центрифугирование повторяли дважды, но теперь проводили его при 1 2000 об/мин по 1 5 мин. После последнего центрифугирования, отцентрифугированную жидкость заменяли 10%-ным (по весу) раствором сахарозы. Порции полученной дисперсии объемом по 2 мл распределяли по ампулам с плоским дном, объемом по 10 мл, специально предназначенным для лиофилизации, эти ампулы охлаждали до -47°С и проводили лиофилизацию в течение приблизительно 48 ч; получали белое пушистое твердое вещество. Далее ампулы переносили в вакуумную камеру, удаляли воздух путем откачки вакуумным насосом и заменяли его газообразным перфторн-бутаном. Перед использованием добавляли воду, и ампулы мягко встряхивали в руках в течение нескольких секунд; в результате получали дисперсии микропузырьков, подходящие для использования в качестве контрастных веществ.

с) Приготовление дисперсий микропузырьков перфторбутана путем ультразвуковой обработки.

500,4 мг гидрированного яичного фосфатидилсерина прибавляли к 1 00 мл воды, содержащей 5,4% (по весу) смеси пропиленгликоля и глицерина (3:10 по весу). Смесь встряхивали и нагревали до 80°С в течение пяти минут, давали остыть до комнатной температуры, снова встряхивали и оставляли стоять на ночь перед использованием.

Этот раствор прокачивали насосом через проточную ячейку объемом 4 мл ультразвукового генератора и подвергали действию ультразвука при 20 кГц с амплитудой 90 мкм. Диаметр ультразвукового излучателя был равен 1,3 см, внутренний диаметр ячейки - 2,1 см и расстояние между излучателем и дном ячейки 1 см. Липидный раствор смешивали с перфтор-нбутаном при соотношении 1 :2 по объему перед его введением в ячейку ультразвукового генератора (20 мл/мин липидного раствора и 40 мл/мин газообразного перфтор-н-бутана). Поддерживали температуру 33°С. Получили белую кремоподобную дисперсию, которой заполняли контейнер и вводили в него перфтор-н-бутан.

Определение характеристик полученных продуктов.

Распределение по размерам и объемную концентрацию микропузырьков определяли при помощи счетчика Культера СоиИег Соии1ег Магк II с отверстием 50 мкм и диапазоном измерений 1 -30 мкм. Пробы объемом 20 мкм разбавляли в 200 мл солевого раствора, насыщенного воздухом при комнатной температуре, и выдерживали для установления равновесия в течение 3 мин перед измерениями.

Определение ультразвуковых характеристик проводили на экспериментальной установке, слегка видоизмененной по сравнению с установкой, описанной в статье 1оид N. а об НоГГ Ь., иИгакоииб ксаРегшд ргорегИек оГ А1Ьииех шюгокрйегек. ИИгакошск, 31(3), рр.175-181 (1993). На этой аппаратуре измеряли эффективность ослабления ультразвука в интервале частот 2-8 МГц в разбавленной суспензии контрастного вещества. Во время измерения ослабления ультразвука проводили испытание на устойчивость к давлению, подвергая образец действию избыточного давления 120 мм Нд в течение 90 с. В обычном испытании 2-3 мкл пробы разбавляли в 55 мл раствора 1ко1ои II, и разбавленную пробу суспензии перемешивали в течение 3 мин перед анализом. В качестве основного измеряемого параметра использовали ослабле23 ние сигнала при 3,5 МГц, наряду с показателем восстановления прежней величины ослабления при 3,5 МГц после прекращения действия избыточного давления.

Таблица ΙΙ.Ι. Характеристики ίη νίίτο дисперсий пузырьков, полученных согласно примеру 2(а)-(с). (Числовые и объемные концентрации и среднеобъемные диаметры, а также акустические свойства, измерен ные согласно описанию, приведенному выше)

Метод получения (пример №)	Числовая конц. (10⁶/мл)	Объемная конц. (%)	Среднеобъемный диаметр (мкм)	Ослабление при 3,5 МГц (дБ/см)	Сохранение после действия давления (%)	Частота при максимальном ослаблении (МГц)
2 (а)	1519	1,45	3,91	30,46	100	4,1
2(в)	10518	6,51	3,16	150,4	96	4,3
2 (с)	23389	9,57	3,83	117	100	3,5

Пример 3. Эффект замены газа.

Газ, содержащийся в пяти образцах, приготовленных согласно примеру 2 (в), описанному выше, был заменен на воздух, перфторбутан, гексафторид серы, пентафторид трифторметилсеры и тетраметилсилан, соответственно, по следующей методике,

Два образца, содержащие лиофилизованный продукт из примера 2(в), помещали в эксикатор, имеющий патрубки для входа и выхода газа. Эксикатор присоединяли к регулятору вакуумной перегонки ВисЫ 168, который давал возможность проводить контролируемое вакуумирование образцов и введение выбранного

Таблица ΙΙΙ.Ι. Характеристики ίη νίίτο стабилизированных фосфатидилсерином дисперсий микропузырьков, полученных согласно примеру 3 - числовая и объемная концентрации и среднеобъемные диаметры газа. Образцы откачивали приблизительно при 10 мбар в течение 5 мин, затем давление повышали до атмосферного путем введения выбранного газа, после чего тщательно закрывали ампулы. Эту процедуру повторяли со следующими парами образцов для каждого из выбранных газов.

В каждую ампулу добавляли по 2 мл дистиллированной воды, и ампулы мягко встряхивали в руках перед использованием. Для полученных дисперсий микропузырьков определяли характеристики, относящиеся к распределению по размерам, как описано в примере 2. Результаты суммированы в таблице ΙΙΙ.Ι.

Газ	Числовая концентрация (10⁶/мл)	Среднечисленный диаметр (мкм)	Объемная концентрация (%)	Среднеобъемный диаметр (мкм)
Перфторбутан	9756	1,8	4,9	5,8
Пентафторид трифторметилсеры	10243	1,9	5,9	3,5
Гексафторид серы	9927	1,9	5,7	3,2
Т етраметилсилан	9947	1,9	6,1	3,7
Воздух	9909	1,9	6,4	4,0

Как можно видеть из приведенных выше результатов, при замене газа не происходит значительных изменений в распределении по размерам.

Результаты испытаний ίη νίνο.

По одной порции суспензии, приготовленной с каждым из пяти газов, испытывали ίη νίνο, измеряя усиление доплеровского сигнала при 1 0 МГц. Дисперсии вводили кроликам породы шиншилла путем инъекции в ушную вену, и проводили измерения по методике, основанной на эффекте Доплера, помещая ультразвуковой зонд непосредственно на сонную артерию. Записывали интенсивность сигнала и его продолжительность и рассчитывали интеграл доплеровской кривой. Полученные результаты (см. таблицу ΙΙΙ.ΙΙ, приведенную ниже) показали, что микропузырьки, содержащие перфторбутан, дают самое большое увеличение интенсивности доплеровского сигнала. Микропузырьки, содержащие гексафторид серы, пентафторид трифторметилсеры или тетраметилсилан, были лишь немного менее эффективными в качестве усилителей интенсивности доплеровского сигнала, чем микропузырьки, содержащие перфторбутан, давая величины интегралов, составляющие 60-80% от величины для перфторбутана.

Таблица ΙΙΙ.ΙΙ. Результаты инъекций ίη νίνο кроликам продуктов, полученных в примере 3 (величины скорректированы с учетом смещения нулевой линии; доплеровская единица определяется как увеличение доплеровского сигнала относительно сигнала от крови)

Газ	Увеличение интегрального доплеровского сигнала для артерий (число доплеровских единиц · сек)
Перфторбутан* Пентафторид триф-	10361
торметилсеры	8006
Тетраметилсилан	6370
Гексафторид серы	6297
Воздух	1024

* Среднее из двух инъекций

Пример 4. Замороженные дисперсии и лиофилизованные продукты.

250 мг гидрированного яичного фосфатидилсерина добавляли в 50 мл воды для инъекций, содержащей 5,4 вес.% смеси пропиленгликоля и глицерина (7:20 по весу). Смесь встряхивали и нагревали до 80°С в течение 5 мин, давали охладиться до комнатной температуры, снова встряхивали и оставляли стоять на ночь перед использованием.

100 мл полученного раствора переносили в круглодонную колбу с коническим горлом и обрабатывали по методике, описанной в примере 2(в). Получали кремоподобную дисперсию белого цвета. Эту дисперсию переносили в делительную воронку и центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин; получали кремоподобный слой микропузырьков на поверхности слоя мутной жидкости. Эту жидкость удаляли и заменяли на 50 мл воды для инъекций. Затем центрифугирование повторяли дважды, но теперь при 12000 об/мин по 15 мин. К 6 мл полученной дисперсии добавляли 6 мл 30%-ного (по весу) раствора трегалозы; эту дисперсию разделяли на порции по 2 мл, которые помещали в ампулы с плоским дном объемом 1 0 мл, специально предназначенные для лиофилизации, и эти ампулы охлаждали до -47°С и хранили при этой температуре в течение суток.

Половину ампул оттаивали после одних суток выдерживания при -47°С и получали гомогенные кремоподобные дисперсии газовых пузырьков, пригодные для использования в качестве ультразвуковых контрастных веществ. Дисперсии после оттаивания были охарактеризованы путем измерения параметров распределения по размерам, как описано выше в примере 2 (см. таблицу ΐν.Ι). Для остальных ампул проводили лиофилизацию в течение приблизительно 48 ч, и получали белое пушистое твердое вещество. Ампулы переносили в вакуумную камеру, воздух удаляли откачкой вакуумным насосом и заменяли газообразным перфтор-нбутаном. Перед использованием добавляли воду и ампулы мягко встряхивали в течение нескольких секунд; получали дисперсии пузырьков, пригодные для использования в качестве ультразвуковых контрастных веществ. Полученные дисперсии характеризовали путем измерения распределения по размерам и акустического ослабления сигнала, используя методы, описанные выше в примере 2. Результаты представлены в таблице ΐν.ΐ.

Таблица IV. I. Концентрация микропузырьков, данные по размерам и акустические данные для дисперсий микропузырьков газообразного перфтор-н-бутана, стабилизированных гидрированным фосфатидилсерином, обработанных путем замораживания - оттаивания и лиофилизации

Обработка образца	Числовая концентрация (10⁶/мл)	Объемная концентрация (%)	Среднеобъемный диаметр (мкм)	Ослабление при 3,5 МГц (Б/см)	Сохранение после действия давления (%)	Частота при максимальном ослаблении (МГц)
Промывка	10390	10,4	3,8	н.о.	н.о.	н.о.
Замораживание оттаивание	10142	9,9	3,6	н.о.	н.о.	н.о.
Лиофилизация	7780	4,6	3,1	58,0	89	5,3

Условные обозначения: н.о. = не определено.

Пример 5. Воздействие на дисперсию микропузырьков перфторбутана жидкости, насыщенной воздухом.

Ампулу, содержащую лиофилизованный материал в атмосфере перфторбутана приготовляли, как описано в примере 2(в). Воду добавляли в ампулу непосредственно перед использованием и получали дисперсию микропузырьков.

200 мл жидкости Ιδοΐοη II оставляли на воздухе в течение нескольких дней при комнатной температуре и получали раствор, полностью насыщенный воздухом. Другие 200 мл жидкости дегазировали в вакуумной колбе при 60°С в течение одного часа и охлаждали до комнатной температуры при сохранении вакуума. Воздух вводили в колбу непосредственно перед использованием.

Порции суспензии микропузырьков по 1 0 мкл добавляли в каждую из этих жидкостей, и полученные смеси выдерживали в течение 5 мин перед определением размеров частиц (на приборе СоиИег МиНыхсг Магк II).

В дегазированной среде, где нельзя ожидать никакой диффузии газов из жидкости в микропузырьки, средний диаметр микропузырька был равен 1,77 мкм, и 0,25% микропузырьков были больше 5 мкм. В жидкости, насыщенной воздухом, соответствующие величины составляли 2,43 мкм и 0,67%; повторные измерения, сделанные через 5 мин, показали, что размеры микропузырьков достигли постоянной величины.

Эти результаты показывают, что средний диаметр микропузырьков увеличивается только на 37%, если поместить их в насыщенную воздухом жидкость, аналогичную артериальной крови, причем очень мало пузырьков достигают размера, который может вызвать блокирование капиллярных кровеносных сосудов. Это вероятно контрастирует с удвоением размера микро пузырьков, содержащих смесь воздуха с перфторгексаном, в аналогичной среде (т.е. сильно разбавленной дисперсии микропузырьков в воде, содержащей растворенный воздух), о котором сообщается в примере II международной заявки А-9503835.

Пример 6. Устойчивость дисперсии микропузырьков перфторбутана к действию давления.

Ампулы, содержащие лиофилизованный материал, находящийся в атмосфере перфторбутана, были приготовлены, как описано в примере 2 (а). Воду (2 мл) добавляли в ампулу непосредственно перед использованием, чтобы получить дисперсии микропузырьков.

Спектры ослабления записывали на частотах 1,5-8 МГц до, во время и после приложения избыточного давления воздуха 300 мм Нд; действие давления прекращали через 90 с. Результаты, показанные на фиг. 2 (см. чертежи), указывают, что хотя величина ослабления сигнала при 4 МГц (пик для контрастного вещества, не подвергавшегося действию давления) уменьшается при действии давления менее чем до одной трети, она почти полностью (до 85-95%) восстанавливается, когда действие давления прекращается.

Были измерены величины ослабления на частоте 3,5 МГц при приложении избыточных давлений воздуха до 300 мм Нд, в течение 90 с. Результаты показаны на фиг. 3 и указывают на высокую степень восстановления ослабления (по крайней мере около 95%) после прекращения действия давления для всех величин приложенного избыточного давления.

Распределения по размерам определяли на приборе СоиИег для образца, не подвергавшегося давлению, и для образцов, подвергнутых действию избыточных давлений воздуха 150 и 300 мм Нд в течение 90 с. Результаты показаны на фиг. 4 и указывают, что между кривыми распределения в диапазоне 1 -1 0 мкм нет значительных различий.

Claims

1 . Способ получения контрастного агента, включающий следующие стадии:

а) диспергирование газа в водной среде, содержащей мембранообразующий липидный материал, таким образом, чтобы образовывалась дисперсия микропузырьков газа, стабилизированная липидами;

б) лиофилизация указанной дисперсии в присутствии криопротекторного и/или лиопротекторного материала таким образом, чтобы получить сухой продукт, включающий матрицу из криопротекторного и/или лиопротекторного материала, содержащую заполненные газом практически сферические полости или вакуоли, окруженные одним или несколькими слоями мембранообразующего липидного материала;

в) превращение указанного сухого продукта в дисперсию в водном инъецируемом жидком носителе.

2. Способ по п.1, где газ, используемый на стадии (а), является гексафторидом серы или фторированным низкомолекулярным углеводородом.

3. Способ по п.1 или 2, где липидосодержащая водная среда, используемая на стадии (а), дополнительно содержит одну или несколько добавок, выбранных из спиртов или полиолов.

4. Способ по любому из пп.1-3, где мембранообразующий липидный материал состоит в основном из фосфолипида и преимущественно содержит молекулы, которые имеют каждая индивидуально избыточный общий заряд.

5. Способ по любому из пп.1-4, где до стадии (б) стабилизированную липидами дисперсию, образованную на стадии (а), промывают, а микропузырьки фракционируют по размерам.

6. Способ по любому из пп.1-5, где криопротекторный и/или лиопротекторный материал представляет собой физиологически толерантный сахар.

7. Сухой продукт, способный генерировать микропузырьки газа при превращении в дисперсию в водном инъецируемом жидком носителе, включающий матрицу из криопротекторного/лиопротекторного материала, содержащую множество заполненных газом практически сферических полостей или вакуолей, окруженных одним или несколькими слоями мембранообразующего липидного материала.

8. Сухой продукт по п.7, где криопротекторный и/или лиопротекторный материал матрицы представляет собой физиологически толерантный сахар.

9. Сухой продукт по пп.7 или 8, где мембранообразующий липидный материал состоит в основном из фосфолипида, преимущественно содержащего молекулы, которые имеют каждая индивидуально избыточный общий заряд.

10. Сухой продукт по п.9, где практически весь фосфолипид состоит из молекул, которые имеют каждая индивидуально избыточный общий заряд.

11. Сухой продукт по п.10, где фосфолипид, по меньшей мере, на 70% состоит из одного или нескольких фосфатидилсеринов.

1 2. Сухой продукт по любому из пп.7-11, где газ включает гексафторид серы или перфорированный низкомолекулярный углеводород.

1 3. Сухой продукт по п. 11, где криопротекторный и/или лиопротекторный материал представляет собой сахарозу, а газ представляет перфторбутан.

14. Сухой продукт по п.13, представленный в виде образующего контрастный агент состава, находящегося в двухкамерном устройстве для хранения, причем камеры указанного устройства содержат, соответственно, указанный сухой продукт и инъецируемый водный жидкий носитель.