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Diese Erfindung betrifft neue gashaltige
Kontrastmittel zur Verwendung bei der diagnostischen Bilderzeugung,
genauer gesagt derartige Kontrastmittel, die Phospholipid-stabilisierte
Gas-Mikroblasen umfassen, und ein neues Verfahren für die Herstellung
dieser Kontrastmittel.
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Es ist gut bekannt, daß die Ultraschall-Bildgewinnung
ein potentiell wertvolles diagnostisches Werkzeug darstellt, beispielsweise
in Untersuchungen des Gefäßsystems,
insbesondere in der Kardiographie, und des Gewebe-Mikrogefäßsystems.
Eine Vielzahl von Kontrastmitteln ist vorgeschlagen worden, um die
so erhaltenen akustischen Bilder zu verstärken, einschließlich Suspensionen
von festen Teilchen, emulgierten Flüssigkeitströpfchen, Gasblasen und eingekapselten
Gasen oder Flüssigkeiten.
Es wird allgemein akzeptiert, daß niedrigdichte Kontrastmittel,
welche leicht komprimierbar sind, besonders effizient hinsichtlich
der akustischen Rückstreuung,
welche sie erzeugen, sind, und deswegen ist beträchtliches Interesse an der
Herstellung von gashaltigen und gaserzeugenden Systemen gezeigt
worden.
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Es ist ebenfalls bekannt, daß gashaltige
Kontrastmedien effektiv bei der Magnetresonanz(MR)-Bilderzeugung
sind, z. B. als Suszeptibilitäts-Kontrastmittel,
welche wirken werden, die MR-Signalintensität zu verringern. Sauerstoffhaltige
Kontrastmedien repräsentieren
ebenfalls potentiell nützliche
paramagnetische MR-Kontrastmittel.
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Weiterhin ist auf dem Gebiet der
Röntgenbilderzeugung
beobachtet worden, daß Gase,
wie Kohlendioxid, als negative orale Kontrastmittel oder intravaskuläre Kontrastmittel
verwendet werden können.
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Die Verwendung von radioaktiven Gasen,
z. B. radioaktiven Isotopen von Inertgasen, wie Xenon, ist ebenfalls
in der Szintigraphie, zum Beispiel zur Abbildung des Blut-Pools,
vorgeschlagen worden.
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Anfängliche Untersuchungen, beinhaltend
freie Gasblasen, erzeugt in vivo durch intrakardiale Injektion von
physiologisch annehmbaren Substanzen, haben die potentielle Effizienz
derartiger Blasen als Kontrastmittel bei der Echographie aufgezeigt;
solche Techniken sind jedoch in der Praxis durch die kurze Lebensdauer der
freien Blasen stark eingeschränkt.
Folglich wurde Interesse an Verfahren zur Stabilisierung von Gasblasen für die Echokardiographie
und andere Ultraschalluntersuchungen, beispielsweise unter Verwendung
von Emulgatoren, Ölen,
Verdickungsmitteln oder Zuckern, oder durch Mitführen oder Einkapseln des Gases
oder eines Vorläufers
davon in einer Vielzahl von Systemen, z. B. als poröse gashaltige
Mikroteilchen oder als eingekapselte Gasmikroblasen, gezeigt.
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Es gibt ein Gebiet des Stands der
Technik, welches auf die Verwendung von Phospholipiden als Komponenten
von gashaltigen Ultraschallkontrastmitteln Bezug nimmt. So wird
zum Beispiel die Verwendung von Phospholipidliposomen, in welchen
eine Lipid-Doppelschicht eine eingegrenzte Zusammensetzung, einschließlich eines
Gases oder Gasvorläufers,
umgibt, als Ultraschallkontrastmittel in der US-A-4 900 540 offenbart.
Das eingekapselte Material ist typischerweise ein Gasvorläufer, wie
wäßriges Natriumbicarbonat,
welches behauptetermaßen
Kohlendioxid im Anschluß an
die Verabreichung durch Aussetzen an den Körper-pH-Wert erzeugt. Die Kerne
der resultierenden Liposomen werden deswegen dazu neigen, Flüssigkeit
zu umfassen, enthaltend äußerst kleine
Gas-Mikroblasen, welche aufgrund ihrer kleinen Größe lediglich
begrenzte Echogenizität
aufzeigen werden.
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Die WO-A-91 15244 offenbart Ultraschallkontrastmedien,
umfassend Mikroblasen aus Luft oder einem anderen Gas, gebildet
in einer Suspension von Flüssigkeits-gefüllten Liposomen,
wobei die Liposomen die Mikroblasen offenbar stabilisieren. Solche
Systeme sind unterschiedlich von denjenigen der obenstehend erwähnten US-A-4
900 540, in welcher sich die Luft oder ein anderes Gas innerhalb
der Liposomen befinden.
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Die WO-A-92 11873 beschreibt wäßrige Präparationen,
welche zum Absorbieren und Stabilisieren von Mikroblasen entworfen
sind, und welche dadurch als Ultraschallkontrastmittel dienen, wobei
die Zusammensetzungen Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Polymere und
negativ geladene Phospholipide umfassen. Das Gewichtsverhältnis von
Polymer zu Phospholipid beträgt
typischerweise etwa 3 : 1.
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Ultraschallkontrastmittel, umfassend
gasgefüllte
Liposomen, d. h. Liposomen, welche im wesentlichen in ihrem Inneren
frei von Flüssigkeit
sind, und ihre Herstellung durch ein Vakuumtrocknungs-Gasinstillations-Verfahren
werden in der WO-A-92 22247 beschrieben. Die Herstellung derartiger
gasgefüllter
Liposomen durch ein Gelzustand-Schüttelgas-Instillationsverfahren
wird in der WO-A-94 28780 beschrieben. Ein Bericht über gasgefüllte Lipid-Doppelschichten,
zusammengesetzt aus Dipalmitoylphosphatidylcholin als Ultraschallkontrastmittel,
wird von Unger et al. in Investigative Radiology 29, Supplement
bzw. Ergänzungsband
2, S.134–S.136
(1994), präsentiert.
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Die WO-A-94 09829 offenbart injizierbare
Suspensionen von Gasmikroblasen in einer wäßrigen Trägerflüssigkeit, umfassend mindestens
einen Phospholipid-Stabilisator, wobei die Konzentration an Phospholipiden
im Träger
geringer als 0,01% w/w, aber gleich zu oder über der Menge ist, bei welcher
Phospholipidmoleküle
lediglich an der Gasmikroblasen-Flüssigkeits-Grenzfläche vorhanden
sind. Die Menge an Phospholipid kann deshalb so niedrig, wie diejenige
sein, welche zur Bildung einer einzelnen Monoschicht von Tensid
um die Gasmikroblasen herum nötig
ist, wobei die resultierende filmartige Struktur die Blasen gegen
Kollaps oder Verschmelzung stabilisiert. Mikroblasen mit einer liposomenartigen
Tensid-Doppelschicht werden behauptetermaßen nicht erhalten, wenn derartige
niedrige Phospholipidkonzentrationen verwendet werden.
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Ein weiterer Bereich des Stands der
Technik betrifft die Auswahl von Gasen für Gasmikroblasen-haltige Ultraschallkontrastmittel,
um Eigenschaften, wie ihre Stabilität und die Dauer des echogenen
Effekts, zu verstärken.
So schlägt
beispielsweise die WO-A-93 05819 die Verwendung von freien Mikroblasen
von Gasen mit einem Koeffizient Q größer als 5 vor, wobei
Q = 4,0 × 10–7 × ρ/CSD
(worin ρ die Dichte des Gases in kg·m–3 ist,
Cs die Wasserlöslichkeit des Gases in Mol·l–1 ist,
und D das Diffusionsvermögen
des Gases in Lösung
in cm3·sec –1 ist).
Eine umfassende Liste von Gasen, welche diese Anforderung behauptetermaßen erfüllen, wird
präsentiert.
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Die EP-A-0554213 schlägt vor,
daß man
gasgefüllten
Mikroblasen eine Beständigkeit
gegen Kollaps unter Druck vermitteln kann durch Einführung mindestens
eines Gases in selbige, dessen Löslichkeit
in Wasser, ausgedrückt
in Litern Gas/Liter Wasser unter Standardbedingungen, dividiert
durch die Quadratwurzel seines Molekulargewichts, 0,003 nicht überschreitet.
Bevorzugte Gase schließen
behauptetermaßen
Schwefelhexafluorid, Selenhexafluorid und verschiedene Freons® ein. Derartige
Gase können
unter anderem in Phospholipid-haltigen Zusammensetzungen des Typs,
beschrieben in der obenstehend erwähnten WO-A-92 15244, verwendet
werden.
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Schneider et al. beschreiben in Investigative
Radiology 30(8), S. 451–457
(1995), ein neues Ultrasonographie-Kontrastmittel, basierend auf
Schwefelhexafluorid-gefüllten
Mikroblasen, welche offenbar durch eine Kombination aus Polyethylenglycol
4000 und einer Mischung der Phospholipide Distearoylphosphatidylcholin
und Dipalmitoylphosphatidylglycerol stabilisiert werden. Die Verwendung
von Schwefelhexafluorid anstatt von Luft gewährt behauptetermaßen eine
verbesserte Beständigkeit
gegen Druckerhöhungen,
welche während
der Systole im linken Herz auftreten.
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Die WO-A-95 03835 schlägt die Verwendung
von Mikroblasen vor, enthaltend eine Gasmischung, deren Zusammensetzung
auf Erwägungen
der Gaspartialdrücke
sowohl innerhalb als auch außerhalb
der Mikroblasen beruht, so daß osmotische
Effekte auf die Mikroblasengröße berücksichtigt
werden. Repräsentative
Mischungen umfassen ein Gas mit einem niedrigen Dampfdruck und beschränkter Löslichkeit
in Blut oder Serum (z. B. einen Fluorkohlenstoff) in Kombination
mit einem anderen Gas, welches rascher mit Gasen ausgetauscht wird,
welche in normalem Blut oder Serum vorhanden sind (z. B. Stickstoff,
Sauerstoff, Kohlendioxid oder Mischungen hiervon).
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Die WO-A-95 16467 schlägt die Verwendung
von Ultraschallkontrastmedien vor, enthaltend ein Gemisch der Gase
A und B, wobei Gas B in einer Menge von 0,5–41% v/v vorhanden ist, ein
Molekulargewicht größer als
80 Dalton aufweist und eine wäßrige Löslichkeit
unter 0,0283 ml/ml Wasser unter Standardbedingungen aufweist, wobei
es sich bei dem Rest der Mischung um Gas A handelt. Repräsentative
Gase A schließen
Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid und Mischungen hiervon
ein. Repräsentative
Gase B schließen fluorhaltige
Gase, wie Schwefelhexafluorid und verschiedene perfluorierte Kohlenwasserstoffe,
ein. Bevorzugte Stabilisatoren in derartigen Kontrastmedien schließen Phospholipide
ein.
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Phospholipide, welche behauptetermaßen nützlich in
Kontrastmitteln nach dem Stand der Technik sind, schließen Lecithine
(d. h. Phosphatidylcholine), zum Beispiel natürliche Lecithine, wie Eidotter-Lecithin oder
Sojabohnen-Lecithin, und synthetische oder semisynthetische Lecithine,
wie Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin
oder Distearoylphosphatidylcholin; Phosphatidinsäuren; Phosphatidylethanolamine;
Phosphatidylserine; Phosphatidylglycerole; Phosphatidylinositole;
Cardiolipine; Sphingomyeline; Mischungen von jedweden der vorstehenden
und Mischungen mit anderen Lipiden, wie Cholesterin, ein. Lecithin-Derivate
scheinen im allgemeinen die am häufigsten
verwendeten Phospholipide zu sein, möglicherweise dank ihrer leichten
Verfügbarkeit
aus natürlichen
Quellen. Die Verwendung von Additiven, wie Cholesterin, in Mengen
von bis zu 50% w/w, wird offenbart in der WO-A-91 15244 und WO-A-94
09829, während
die Einbindung wenigstens eine kleine Menge (z. B. ca. 1 Mol-%)
von negativ geladenem Lipid (z. B. Phosphatidylserin oder einer
Fettsäure)
zur Erhöhung
der Stabilität
in der WO-A-92 22247 vorgeschlagen wird. Eine bevorzugte Phospholipidzusammensetzung
gemäß WO-A-94
28780 umfaßt
Dipalmitoylphosphatidylcholin, Polyethylenglycol 5000-substituiertes
Dipalmitoylphosphatidylethanolamin und Dipalmitoylphosphatidinsäure in Molverhältnissen
von etwa 87 : 8 : 5. Typische gemischte Phospholipidzusammensetzungen
gemäß WO-A-94 09829
und WO-A-95 16467 umfassen Diarachidoylphosphatidylcholin und Dipalmitoylphosphatidinsäure in Gewichtsverhältnissen
von etwa 100 : 4, obwohl die letztgenannte Patentschrift ebenfalls
die Verwendung von gleichen Gewichts-Mengen an Distearoylphosphatidylcholin
und Dipalmitoylphosphatidylglycerol exemplifiziert.
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Aus dem vorausgehenden wird offensichtlich
sein, daß in
existierenden phospholipidhaltigen Mikroblasensuspensionen, welche
zur Verwendung als Kontrastmedien vorgeschlagen wurden, mindestens
50% des Phospholipidgehaltes neutrale Phospholipide, wie Lecithine,
umfassen. Am häufigsten
ist nur ein geringerer Anteil, z. B. ca. 5%, an geladenen Phospholipiden
vorhanden.
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Die vorliegende Erfindung beruht
auf dem Befund, daß die
Verwendung von vorwiegend geladenen Phospholipiden als im wesentlichen
einzige amphiphile Komponente von Mikroblasen-enthaltenden Kontrastmitteln
wertvolle und unerwartete Vorteile hinsichtlich Parametern, wie
der Produktstabilität
und den akustischen Eigenschaften, gewähren kann. Während wir
nicht wünschen,
durch theoretische Erwägungen
gebunden zu sein, wird angenommen, daß die elektrostatische Abstoßung zwischen
geladenen Phospholipidmembranen die Bildung von stabilen und stabilisierenden
Monoschichten an Mikroblasen-Trägerflüssigkeit-Grenzflächen fördert; die
Flexibilität
und Verformbarkeit solcher dünner
Membranen wird die Echogenizität
von Produkten gemäß der Erfindung
im Verhältnis
zu gasgefüllten
Liposomen, umfassend eine oder mehrere Lipid-Doppelschichten, vergrößern.
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Wir haben ebenfalls festgestellt,
daß die
Verwendung geladener Phospholipide die Bereitstellung von Mikroblasenkontrastmitteln
mit vorteilhaften Eigenschaften hinsichtlich beispielsweise Stabilität, Dispergierbarkeit
und Beständigkeit
gegen Verschmelzen ohne Zuhilfenahme von Additiven, wie weiteren
Tensiden und/oder Viskositätsverstärkern ermöglichen
kann, wodurch gewährleistet
wird, daß die
Anzahl von an den Körper
eines Subjektes bei Injektion der Kontrastmittel verabreichten Komponenten
auf einem Minimum gehalten wird. So können beispielsweise die geladenen
Oberflächen
der Mikroblasen deren Aggregation als Ergebnis von elektrostatischer
Abstoßung
minimieren oder verhindern.
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Somit wird gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ein Kontrastmittel zur Verwendung bei
diagnostischen Untersuchungen vorgesehen, umfassend eine Dispersion
in einer injizierbaren, wäßrigen Trägerflüssigkeit
von Mikroblasen aus biokompatiblem Gas, stabilisiert druch amphiphiles
Material, im wesentlichen bestehend aus Phospholipid, das vorwiegend
Moleküle
umfaßt,
welche einzeln eine Gesamtnettoladung besitzen.
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Erwünschterweise bestehen mindestens
75%, vorzugsweise im wesentlichen das gesamte Phospholipidmaterial
in den Kontrastmitteln der Erfindung aus Molekülen, welche eine Gesamtnettoladung
unter den Bedingungen der Herstellung und/oder Anwendung tragen,
wobei die Ladung positiv oder weiter bevorzugt negativ sein kann.
Repräsentative
positiv geladene Phospholipide schließen Ester von Phosphatidinsäuren, wie Dipalmitoylphosphatidinsäure oder
Distearoylphosphatidinsäure,
mit Aminoalkoholen, wie Hydroxyethylendiamin, ein. Beispiele von
negativ geladenen Phospholipiden schließen natürlich vorkommende (z. B. Sojabohnen-
oder Eidotterabgeleitet), semisynthetische (z. B. teilweise oder
vollständig
hydrierte) und synthetische Phosphatidylserine, Phosphatidylglycerine,
Phosphatidylinsitole, Phosphatidinsäuren und Kardiolipine ein.
Die Fettacylgruppen derartiger Phospholipide werden typischerweise
jeweils etwa 14–22
Kohlenstoffatome, zum Beispiel wie in Palmitoyl- und Stearoyl-Gruppen,
enthalten. Die Lyso-Formen solcher geladenen Phospholipide sind
gemäß der Erfindung
ebenfalls nützlich,
wobei der Begriff "Lyso" Phospholipide bezeichnet,
welche nur eine Fettacylgruppe enthalten, wobei diese vorzugsweise
an das 1-Position-Kohlenstoffatom der Glyceryleinheit Ester-gebunden
ist. Solche Lyso-Formen von geladenen Phospholipiden können vorteilhafterweise
in Mischung mit geladenen Phospholipiden, welche zwei Fettacylgruppen
enthalten, verwendet werden.
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Phosphatidylserine repräsentieren
besonders bevorzugte Phospholipide zur Verwendung in Kontrastmitteln
gemäß der Erfindung
und bilden vorzugsweise einen wesentlichen Teil, z. B. mindestens
80% des anfänglichen
Phospholipidgehaltes davon, zum Beispiel 85–92%, obwohl dies anschließend etwas,
z. B. auf ca. 70%, in einer anschließenden Verarbeitung, wie einer
Hitzesterilisation, reduziert werden kann. Es ist davon auszugehen,
daß eine
derartige Verarbeitung zur Bildung von Nicht-Phospholipid-Abbauprodukten,
wie freien Fettsäuren,
z. B. bei Spiegeln bis zu 10%, führen
kann; hierin erfolgende Bezugnahmen auf amphiphiles Material, bestehend
im wesentlichen aus Phospholipid, sollen derartig ausgelegt werden,
daß sie
Phospholipide, enthaltend solche freien Fettsäuren, umfassen. Während wir
nicht wünschen,
durch theoretische Erwägungen gebunden
zu sein, kann es sein, daß eine
ionische Brückenbildung
zwischen den Carboxyl- und
Aminogruppen von benachbarten Serineinheiten zur Stabilität von Phosphatidylserin-enthaltenden
Systemen beiträgt, zum
Beispiel wie durch ihre gute Druckstabilität gezeigt wird. Bevorzugte
Phosphatidylserine schließen
gesättigtes
(z. B. hydriertes oder synthetisches) natürliches Phosphatidylserin und
synthetische oder semisynthetische Dialkanoylphosphatidylserine,
wie Distearoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin und
Diarachidoylphosphatidylserin, ein.
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Ein wichtiger Vorteil der Verwendung
derartiger Phosphatidylserin-basierender Kontrastmittel besteht darin,
daß der
Körper
gealterte rote Blutzellen und Plättchen
durch hohe Konzentrationen an Phosphatidylserin auf ihrer Oberfläche erkennt
und so derartige Kontrastmittel auf eine ähnliche Weise zur Eliminierung
von roten Blutzellen aus dem Blutstrom eliminieren kann. Fernerhin
können,
da die Oberfläche
derartiger Kontrastmittel vom Körper
als endogen registriert werden kann, sie die Herbeiführung von
nachteiligen systemischen Nebenwirkungen, wie hämodynamischen Effekten und
anderen anaphylaktischen Reaktionen verhindern, welche die Verabreichung
von manchen Liposomenpräparationen
begleiten können
(siehe z. B. WO-A-95 12386). Unterstützend hierfür, hat man keine akuten toxischen
Effekte wie Änderungen
des Blutdrucks oder der Herzgeschwindigkeit in Tierversuchen an
Hunden, welche intravenöse
Injektionen mit Arznei-Boli von Kontrastmitteln gemäß der Erfindung
bei Dosierungen von bis zu dem zehnfachen einer normalen Bilderzeugungsdosis
erhielten, beobachtet.
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Jedwedes biokompatible Gas kann in
den Kontrastmitteln der Erfindung verwendet werden, wobei davon
ausgegangen wird, daß der
Begriff "Gas", wie hierin verwendet,
jedwede Substanzen (einschließlich
Mischungen), die bei der normalen menschlichen Körpertemperatur von 37°C substantiell
oder vollständig
in gasförmiger
(einschließlich
dampfartiger) Form vorliegen, einschließt. Das Gas kann daher beispielsweise
Luft; Stickstoff; Sauerstoff; Kohlendioxid; Wasserstoff, Stickstoff(I)-oxid;
ein Inertgas, wie Helium, Argon, Xenon oder Krypton; ein Schwefelfluorid,
wie Schwefelhexafluorid, Dischwefeldecafluorid oder Trifluormethylschwefelpentafluorid;
Selenhexafluorid; ein wahlfrei halogeniertes Silan, wie Tetramethylsilan;
einen niedermolekulargewichtigen Kohlenwasserstoff (z. B. enthaltend
bis zu 7 Kohlenstoffatome), zum Beispiel ein Alkan, wie Methan,
Ethan, ein Propan, ein Butan oder ein Pentan, ein Cycloalkan, wie
Cyclobutan oder Cyclopentan, ein Alken, wie Propen oder ein Buten,
oder ein Alkin, wie Acetylen; einen Ether; ein Keton; einen Ester;
einen halogenierten niedermolekulargewichtigen Kohlenwasserstoff
(z. B. enthaltend bis zu 7 Kohlenstoffatome); oder eine Mischung
von beliebigen der vorstehenden umfassen. Vorteilhafterweise sind
wenigstens einige der Halogenatome in halogenierten Gasen Fluoratome.
Somit können
biokompatible halogenierte Kohlenwasserstoffgase beispielsweise
gewählt
werden aus Bromchlordifluormethan, Chlordifluormethan, Dichlordifluormethan, Bromtrifluormethan,
Chlortrifluormethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortetrafluorethan
und Perfluorkohlenstoffen, z. B. Perfluoralkanen, wie Perfluormethan,
Perfluorethan, Perfluorpropane, Perfluorbutane (z. B. Perfluor-n-butan,
gegebenenfalls in Vermischung mit anderen Isomeren, wie Perfluorisobutan),
Perfluorpentane, Perfluorhexane und Perfluorheptane; Perfluoralkenen,
wie Perfluorpropen, Perfluorbutene (z. B. Perfluorbut-2-en) und
Perfluorbutadien; Perfluoralkine, wie Perfluorbut-2-in; und Perfluorcycloalkane,
wie Perfluorcyclobutan, Perfluormethylcyclobutan, Perfluordimethylcyclobutane,
Perfluortrimethylcyclobutane, Perfluorcyclopentan, Perfluormethylcyclopentan,
Perfluordimethylcyclopentane, Perfluorcyclohexan, Perfluormethylcyclohexan
und Perfluorcycloheptan. Andere halogenierte Gase schließen fluorierte,
z. B. perfluorierte, Ketone, wie Perfluoraceton, und fluorierte,
z. B. perfluorierte, Ether, wie Perfluordiethylether, ein.
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Es kann vorteilhaft sein, in Kontrastmitteln
der Erfindung fluorierte Gase, wie Schwefelfluoride oder Fluorkohlenwasserstoffe
(z. B. Perfluorkohlenstoffe) zu verwenden, welche bekanntermaßen besonders
stabile Mikroblasensuspension bilden (siehe zum Beispiel den Artikel
von Schneider et al., auf den obenstehend Bezug genommen wurde).
Gasmischungen, welche auf Erwägungen
der Partialdrücke
sowohl innerhalb als auch außerhalb
der Mikroblasen und darauffolgender osmotischer Effekte auf die
Mikroblasengröße, z. B.
wie beschrieben in der WO-A-95 03835, basieren, können nach
Wunsch angewandt werden, zum Beispiel eine Mischung eines relativ
Blut-löslichen
Gases, wie Stickstoff oder Luft, und eines relativ Blut-unlöslichen
Gases, wie einem Perfluorkohlenstoff.
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Wir haben jedoch festgestellt, daß Kontrastmittel
der Erfindung, zum Beispiel umfassend Mikroblasen eines Perfluoralkans,
wie Perfluorbutan, stabilisiert durch Phosphatidylserin, hinsichtlich
der Größe im Anschluß an eine
intravenöse
Verabreichung an ein Subjekt überraschend
stabil sind und nicht die zuvor beschriebene Neigung von Mikroblasen
von solchen Gasen aufzeigen, unkontrollierbar als Ergebnis der einwärts gerichteten
Diffusion von Blutgasen, wie Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid
zu wachsen, wobei sie anstattdessen schnell eine Maximumgröße erreichen, über welche
hinaus ein weiteres Wachstum nicht beobachtet wird. Diese Vermeidung
von unbegrenzten Größenzuwächsen, welche
zu einer unerwünschten
und potentiell hochgefährlichen
Blockierung von Blutgefäßkapillaren
führen
könnte,
ist ein Hauptvorteil von Kontrastmitteln gemäß der Erfindung.
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Man hat festgestellt, daß Kontrastmittel
der Erfindung, umfassend Perfluoralkane, wie Perfluorbutan, überraschenderweise
eine hohe Stabilität
unter ähnlichen
Drücken
zu denjenigen aufweisen, welche typischerweise in vivo angetroffen
werden, wobei zum Beispiel eine im Wesentlichen vollständige (z.
B. mindestens 90%ige) Wiederherstellung bzw. Rückkehr zur normalen Größenverteilung
und zu echogenen Eigenschaften nach Aussetzen an Überdrücke (z.
B. von Luft) von bis zu 300 mm Hg während 90 Sekunden aufgezeigt
wird.
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Die Kontrastmittel der Erfindung
können
in einer Vielzahl von diagnostischen Bilderzeugungstechniken verwendet
werden, einschließlich
Szintigraphie, Lichtbildgewinnung, Ultraschall, MR- und Röntgen-(einschließlich weicher
Röntgen-)Bildgewinnung.
Ihre Verwendung in der diagnostischen Ultraschall-Bilderzeugung
und in der MR-Bilderzeugung, z. B. als Suszeptibilitäts-Kontrastmittel,
stellen bevorzugte Merkmale der Erfindung dar. Eine Vielzahl von
Bilderzeugungstechniken kann bei Ultraschallanwendungen eingesetzt
werden, beispielsweise einschließlich der fundamentellen und
harmonischen B-Modus-Bilderzeugung und der fundamentel len und harmonischen
Doppler-Bildgewinnung; falls gewünscht
können
dreidimensionale Bilderzeugungstechniken angewandt werden. Die Kontrastmittel
können
auch in Ultraschall-Bildgewinnungsverfahren
eingesetzt werden, welche auf Korrelationstechniken beruhen, zum
Beispiel wie beschrieben in der US-A-5 601 085 und der Internationalen
Patentveröffentlichung
Nr. WO-A-97 12551 (Anmeldungs-Nr. PCT/GB 96/02413).
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In vivo-Ultraschalltests in Hunden
haben gezeigt, daß Kontrastmittel
gemäß der Erfindung
eine Erhöhung
der Rückstreuungssignalintensität aus dem
Myokard von 15–25
dB im Anschluß an
intravenöse
Injektion von so niedrigen Dosen wie 1–20 nl Mikroblasen/kg Körpergewicht
hervorrufen können.
Signale können
sogar bei niedrigeren Dosierungen unter Anwendung empfindlicherer
Techniken beobachtet werden, wie Farb-Doppler- oder Doppler-abgeleiteten
Techniken, z. B. Amplituden-basierenden Doppler- oder nicht-linearen
Techniken, wie sie von Tucker et al. in Lancet (1968), S. 1253,
von Miller in Ultrasonics (1981), S. 217–224, und von Newhouse et al.
in J. Acoust. Soc. Am. 75, S. 1473–1477 (1984), beschrieben werden.
Bei diesen geringen Dosen ist die Attenuation in blutgefüllten Kompartimenten,
wie den Herzkammern, festgestelltermaßen ausreichend niedrig, um
eine Visualisierung von Regionen von Interesse im Myokard-Gefäßsystem
zu gestatten. Tests haben auch gezeigt, daß solche intravenös injizierten
Kontrastmittel über
den gesamten Blutpool hinweg verteilt werden, wodurch das Echoerzeugungsvermögen aller
vaskularisierten Gewebe verstärkt
wird, und daß sie
rezirkuliert werden. Es ist ebenfalls festgestellt worden, daß sie nützlich als
allgemeine Doppler-Signalverstärkungshilfsmittel
sind, und darüber
hinaus nützlich
bei der Ultraschall-Computertomographie und bei physiologisch ausgelöster oder
diskontinuierlicher Bilderzeugung sind.
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Für
Ultraschallanwendungen, wie Echokardiographie, kann es, um den freien
Durchtritt durch das Lungensystem zu gestatten und eine Resonanz
mit den bevorzugten Abbildungsfrequenzen von etwa 0,1–15 MHz zu
erzielen, zweckmäßig sein,
Mikroblasen mit einer durchschnittlichen Größe von 0,1–10 μm, z. B. 1–7 μm zu verwenden. Wir haben festgestellt,
daß Kontrastmittel
gemäß der Erfindung
mit einer sehr engen Größenverteilung
für die
Mikroblasendispersion innerhalb des für Echokardiographie bevorzugten
Bereiches hergestellt werden können,
wodurch ihre Echogenizität
sowie ihre Sicherheit in vivo in großem Maße erhöht werden, und die Kontrastmittel
besonders vorteilhaft für
solche Anwendungen gemacht werden, wie Blutdruckmessungen, Blutstrom-Tracing
und Ultraschalltomographie. So können
beispielsweise Produkte, in welchen über 90% (z. B. mindestens 95%,
vorzugsweise mindestens 98%) der Mikroblasen Durchmesser im Bereich
von 1–7 μm aufweisen
und weniger als 5% (z. B. nicht mehr als 3%, vorzugsweise nicht
mehr als 2%) der Mikroblasen Durchmesser über 7 μm aufweisen, leicht hergestellt
werden.
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In Ultraschallanwendungen können die
Kontrastmittel der Erfindung zum Beispiel in solchen Dosierungen
verabreicht werden, daß die
Menge an injiziertem Phospholipid im Bereich von 0,1–10 μg/kg Körpergewicht,
z. B. 1–5 μg/kg im Falle
der Grundzustand-B-Modus-Bilderzeugung, liegt. Es wird davon auszugehen sein,
daß die
Verwendung derartig niedriger Spiegel an Phospholipid von wesentlichem
Vorteil bei der Minimierung möglicher
toxischer Nebenwirkungen ist. Darüber hinaus können die
niedrigen Spiegel an Phospholipiden, vorhanden in effektiven Dosierungen,
Dosierungserhöhungen
gestatten, um die Beobachtungszeiten ohne nachteilige Effekte zu
verlängern.
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Die Gesamtkonzentration an Phospholipid
in injizierbaren Formen von Kontrastmitteln gemäß der Erfindung kann zweckmäßigerweise
im Bereich von 0,01–2%
w/w, beispielsweise 0,2– 0,8%
w/w, liegen bzw. vorteilhafterweise etwa 0,5% w/w betragen.
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Im allgemeinen haben wir festgestellt,
daß es
unnötig
ist, Additive, wie Emulgiermittel und/oder Viskositätserhöher, welche üblicherweise
in vielen existierenden Kontrastmittelformulierungen verwendet werden,
in die Kontrastmittel der Erfindung einzubringen. Wie obenstehend
angemerkt, ist dies von Vorteil dabei, die Anzahl von Komponenten,
welche an den Körper
eines Subjektes verabreicht werden, auf einem Minimum zu halten,
und zu gewährleisten,
daß die
Viskosität
der Kontrastmittel so niedrig wie möglich ist. Da die Herstellung
der Kontrastmittel typischerweise einen Gefriertrocknungsschritt,
wie hierin nachstehend ausführlicher
erörtert,
beinhaltet, kann es jedoch vorteilhaft sein, ein oder mehrere Mittel
mit kryoprotektiver und/oder lyoprotektiver Wirkung und/oder ein
oder mehrere Füllstoffmittel,
beispielsweise einen Alkohol, z. B. einen aliphatischen Alkohol,
wie t-Butanol; ein Polyol, wie Glycerol; eine Aminosäure, wie
Glycin; ein Kohlenhydrat, z. B. einen Zucker, wie Saccharose, Mannitol,
Trehalose, Glucose, Lactose oder ein Cyclodextrin, oder ein Polysaccharid,
wie Dextran; oder ein Polyglycol, wie Polyethylenglycol, einzuschließen. Eine
beträchtliche
Auflistung von Mitteln mit kryoprotektiven und/oder lyoprotektiven
Effekten wird in Acta Pharm. Technol. 34(3), S. 129–139 (1988)
angegeben, wobei der Inhalt davon hierin durch den Bezug darauf
einbezogen ist. Die Verwendung von physiologisch guttolerierten
Zuckern, wie Saccharose, z. B. in einer solchen Menge, um das Produkt
isotonisch oder geringfügig
hypertonisch zu machen, wird bevorzugt.
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Mikroblasen-enthaltende Kontrastmittel
nach dem Stand der Technik, zum Beispiel wie beschrieben in der
WO-A-94 09829, werden typischerweise durch Kontaktieren von pulverisiertem
Tensid, z. B. gefriergetrockneten vorausgehend gebildeten Liposomen
oder gefriergetrockneten oder sprühgetrockneten Phospholipidlösungen,
mit Luft oder einem anderen Gas und danach mit wäßrigem Träger, und Schütteln zur
Erzeugung einer Mikroblasensuspension, welche dann kurz nach ihrer
Herstellung verabreicht werden muß, hergestellt. Derartige Verfahren
leiden jedoch unter den Nachteilen, daß eine wesentliche Bewegungsenergie übermittelt werden
muß, um
die erforderliche Dispersion zu erzeugen, und daß die Größe und Größenverteilung der Mikroblasen
abhängig
von der aufgebrachten Energiemenge sind und somit in der Praxis
nicht kontrolliert werden können.
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Wir haben nun festgestellt, daß Kontrastmittel
gemäß der Erfindung
in vorteilhafter Weise durch Erzeugen einer Gasmikroblasendispersion
in einem geeigneten phospholipidhaltigen wäßrigen Medium hergestellt werden
können,
welches, falls gewünscht,
vorausgehend autoklaviert oder anderweitig sterilisiert worden sein
kann, und danach durch Unterziehen der Dispersion unter eine Lyophilisierung,
vorzugsweise in Gegenwart eines Kryoschutzmittels und/oder Lyoschutz mittels
, um ein getrocknetes rekonstituierbares Produkt zu erhalten. Falls
das getrocknete Produkt ein oder mehrere kryoprotektive und/oder
lyoprotektive Mittel enthält, kann
es beispielsweise eine lyophilisierte Mikroblasen-freisetzende Kryoschutzmittel-
und/oder Lyoschutzmittel(z. B. Kohlenhydrat)-Matrix, enthaltend
gasgefüllte,
im wesentlichen sphärische
Hohlräume
oder Vakuolen, umgeben von einer oder mehreren Schichten des amphiphilen
Materials, umfassen.
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Genauer gesagt, haben wir festgestellt,
daß derartig
hergestellte getrocknete Produkte besonders leicht in wäßrigen Medien,
wie Wasser, einer wäßrigen Lösung, wie
Kochsalzlösung
(welche vorteilhafterweise so ausgeglichen werden kann, daß das Endprodukt
zur Injektion nicht hypotonisch ist), oder einer wäßrigen Lösung von
einer oder mehreren tonizitätseinstellenden
Substanzen, wie Salzen (z. B. von Plasmakationen mit physiologisch
tolerierbaren Gegenionen), oder Zuckern, Zuckeralkoholen, Glycolen
und anderen nichtionischen Polyolmaterialien (z. B. Glucose, Saccharose,
Sorbitol, Mannitol, Glycerin, Polyethylenglycole, Propylenglycole
und dergleichen) rekonstituierbar sind, wobei lediglich eine minimale
Bewegung, wie beispielsweise durch vorsichtiges Schütteln von
Hand vorgesehen werden kann, erforderlich ist. Die Größe der derartig
erzeugten Mikroblasen ist konsistent reproduzierbar und ist in der
Praxis unabhängig
von der Menge der aufgebrachten Bewegungsenergie, wobei sie von
der Größe der Mikroblasen,
gebildet in der anfänglichen
Mikroblasendispersion abhängig
ist, wobei dieser Größenparameter überraschenderweise
im wesentlichen in dem lyophilisierten und rekonstituierten Produkt
beibehalten wird. Da die Größe der Mikroblasen
in der anfänglichen Dispersion
leicht durch Verfahrensparameter kontrolliert werden kann, wie das
Verfahren, die Geschwindigkeit und die Dauer des Bewegens, kann
die letztendliche Mikroblasengröße somit
einfach reguliert werden.
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Lyophilisierte Mikroblasen-freisetzende
Matrixprodukte gemäß der Erfindung
haben sich unter Umgebungsbedingungen während mehreren Monaten als
aufbewahrungsstabil erwiesen. Die nach Rekonstitution in einer injizierbaren
wäßrigen Trägerflüssigkeit
erzeugten Mikroblasendispersionen können mindestens 12 Stunden
lang stabil sein, was eine beträchtliche
Flexibilität
dahingehend zuläßt, wann
das getrocknete Produkt vor der Injektion rekonstituiert wird.
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Gemäß dieser Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung eines Kontrastmittels,
wie hierin zuvor definiert, vorgesehen, umfassend die Schritte:
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- i) Dispergieren von Gas in einem wässrigen Medium, enthaltend
amphiphiles Material, bestehend im Wesentlichen aus Phospholipid,
das vorwiegend Moleküle
umfasst, welche einzeln eine Gesamtnettoladung besitzen, zur Bildung
einer Dispersion von Gasmikrobläschen,
welche durch das amphiphile Material stabilisiert sind;
- ii) Lyophilisieren der Dispersion in Gegenwart eines Kryoschutzmittels
und/oder Lyoschutzmittels zur Erzielung eines getrockneten Produkts,
umfassend eine Kryoschutzmittel- und/oder Lyoschutzmittel-Matrix,
enthaltend biokompatible, gasgefüllte,
im Wesentlichen sphärische
Hohlräume
oder Vacuolen, umgeben durch eine oder mehrere Schichten aus dem
amphiphilen Material; und
- iii) Rekonstituieren des getrockneten Produkts in einer wässrigen,
injizierbaren Trägerflüssig keit.
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Die Erfindung umfaßt auch
ein rekonstituierbares, getrocknetes Produkt, welches gemäß den Schritten
(i) und (ii) dieses Verfahrens erhältlich ist, d. h. eine lyophilisierte
Mikroblasenfreisetzende Matrix, umfassend ein Matrixstrukturmaterial
(z. B. ein Kryoschutzmittel/Lyoschutzmittel), enthaltend eine Mehrzahl
von mit biokompatiblem Gas gefüllten,
im wesentlichen kugelförmigen
Hohlräumen
oder Vacuolen, umgeben von einer oder mehreren Schichten aus amphiphilem
Material, bestehend im wesentlichen aus Phospholipid, das vorwiegend
Moleküle
umfasst, welche einzeln eine Gesamtnettoladung besitzen.
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Der Schritt (i) kann beispielsweise
durch Unterziehen des lipidhaltigen wäßrigen Mediums unter jedwede
geeignete Emulsionserzeugungstechnik, beispielsweise Beschallung,
Schütteln,
Hochdruck-Homogenisieren, Hochgeschwindigkeits-Rühren oder Hochschermischen,
z. B. unter Verwendung eines Rotor-Stator-Homogenisators, in Gegenwart
des gewählten
Gases bewirkt werden. Das wäßrige Medium
kann, falls gewünscht,
Additive enthalten, welche als Viskositätserhöher und/oder als Löslichkeitshilfen
für das
Lipid dienen, wie Alkohole oder Polyole, z. B. Glycerol und/oder
Propylenglycol.
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Das im Emulgierungsschritt verwendete
Gas muß nicht
dasjenige sein, welches im Endprodukt gewünscht wird. Somit kann der
Großteil
dieses Gasgehaltes während
des nachfolgenden Lyophilisierungsschrittes entfernt werden, und
das restliche Gas kann durch Evakuieren des getrockneten Produktes
entfernt werden, auf welches danach eine Atmosphäre des gewünschten Endproduktgases angewandt
werden kann. Das Emulgiergas kann deshalb rein dahingehend ausgewählt werden,
um die Emulgier-Verfahrensparameter zu optimieren, ohne Rücksicht
auf Endprodukt-Erwägungen.
Wir haben festgestellt, daß die
Emulgierung in Gegenwart eines Schwefelfluorids, wie Schwefelhexafluorid,
oder eines fluorierten Kohlenwasserstoffgases, wie einem Perfluoralkan
oder Perfluorcycloalkan, vorzugsweise mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen,
besonders vorteilhaft in Hinsicht auf die letztendliche Gewinnung
von Endprodukten mit konsistent und eng verteilten Mikroblasengrößen ist.
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Die Emulgierung wird zweckmäßigerweise
etwa bei Umgebungstemperatur, z. B. bei ca. 25 ± 10°C bewirkt. Es kann notwendig
sein, das wäßrige Medium
anfänglich
zu erwärmen,
um die Hydratisierung und somit Dispersion des Phospholipids zu
erleichtern, und es dann vor der Emulgierung auf Umgebungstemperatur äquilibrieren
zu lassen.
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Gemäß des Schrittes (i) hergestellte
Dispersionen können
in vorteilhafter Weise einem oder mehreren Waschschritten vor der
Kontrastmittel-Verwendung oder vor dem Lyophilisierungsschritt (ii)
unterzogen werden, um Additive, wie Viskositätsverstärker und Löslichkeitshilfsmittel, sowie
unerwünschtes
Material, wie nicht-gashaltige kolloidale Teilchen und untergroße und/oder übergroße Mikroblasen,
abzutrennen und zu entfernen. Ein solches Waschen kann in einer
per se bekannten Weise bewirkt werden, wobei die Mikroblasen unter
Anwendung von Techniken wie Flotation oder Zentrifugation getrennt
werden. Die Fähigkeit,
auf diese Weise Additive zu entfernen und auch Mikroblasendispersionen
mit einer besonders engen Größenverteilung zu erhalten,
stellen wichtige Vorteile des Verfahrens der Erfindung dar, insbesondere
da, wie obenstehend erwähnt,
die resultierende Größenverteilung
nach Lyophilisation und Rekonstituieren im wesentlichen beibehalten
wird. Folglich wird es besonders bevorzugt, ein Verfahren anzuwenden,
umfassend Gasdispersions-, Wasch/Trennungs-, Lyophilisierungs- und
Rekonstitutionsschritte.
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Es können nach der Größe fraktionierte
Mikroblasendispersionen hergestellt werden, worin mindestens 90%
der Mikroblasen Größen innerhalb
eines 2-μm-Bereichs
aufweisen, wobei die Mikroblasen vorzugsweise einen volumenmittleren
Durchmesser innerhalb des Bereiches von 2–5 μm besitzen.
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Falls ein oder mehrere kryoprotektive
und/oder lyoprotektive Mittel verwendet werden, können diese in
vorteilhafter Weise nach den Waschschritten, vor der Lyophilisierung,
zugesetzt werden.
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Die Lyophilisierung der Gasdispersion
kann beispielsweise durch anfängliches
Einfrieren derselben und danach Lyophilisieren der gefrorenen Gasdispersion,
beispielsweise auf eine per se im allgemeinen bekannte Weise, bewirkt
werden. Die Mikroblasen können
vorzugsweise vor dem Einfrieren größenfraktioniert werden, wobei
die freigegebenen Mikroblasen vorzugsweise einen volumenmittleren
Durchmesser innerhalb des Bereichs von 2–5 μm aufweisen. Derartige Produkte
können
gefroren aufbewahrt und nach Bedarf aufgetaut werden, z. B. durch
einfaches Erwärmen
und/oder durch Zugeben einer Trägerflüssigkeit,
um die Mikroblasendispersionen zu regenerieren, welche als Kontrastmittel
gemäß der Erfindung
nützlich
sind.
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Da das getrocknete Produkt normalerweise
gemäß des obenstehend
Schrittes (iii) vor der Verabreichung rekonstituiert werden wird,
kann die Gasdispersion vorteilhafterweise vor der Lyophilisierung
in verschließbare
Gefäße abgefüllt werden,
so daß Gefäße erhalten
werden, welche jeweils eine angemessene Menge, z. B. eine Einzeldosierungseinheit,
an lyophilisiertem getrockneten Produkt für die Rekonstitution zu einer
injizierbaren Form enthalten. Durch Lyophilisieren der Gasdispersion
in einzelnen Gefäßen anstatt
in loser bzw. unverpackter Form, werden der Umgang mit der empfindlichen
Honigwaben-ähnlichen
Struktur des lyophilisierten Produktes und das Risiko, diese Struktur
zumindest teilweise zu zersetzen, vermieden. Im Anschluß an die
Lyophilisierung und jedwede wahlfreie weitere Evakuierung von Gas
und Einführung
von Gas, welches erwünschtermaßen als
Mikroblasen in dem letztendlich formulierten Kontrastmittel vorhanden
sein soll, in den Kopfraum können
die Gefäße mit einem
geeigneten Verschluß verschlossen
werden. Es wird davon auszugehen sein, daß die Fähigkeit, den Endproduktgasgehalt
zu wählen,
gekoppelt mit der Fähigkeit,
unabhängig
davon die Endprodukt-Mikroblasengröße durch Auswahl von geeigneten
Verfahrensparametern während
des anfänglichen
Dispersionsschrittes und einem beliebigen nachfolgenden Wasch/Trennungs-Schritt
zu kontrollieren, die unabhängige
Auswahl von Mikroblasengröße und Gasgehalt
ermöglichen,
wodurch zugelassen wird, daß die
Produkte an jeweilige Anwendungen angepaßt werden.
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Im allgemeinen kann die gefrorene
Gasdispersion oder das getrocknete Produkt aus Schritt (ii), z.
B. nach jedweder notwendigen und/oder erwünschten Ergänzung oder Austausch des Gasgehalts,
durch Zusetzen einer geeigneten sterilen wäßrigen injizierbaren Trägerflüssigkeit,
wie sterilem pyrogenfreiem Wasser zur Injektion, einer wäßrigen Lösung, wie
Kochsalzlösung
(welche vorteilhafterweise so abgestimmt werden kann, daß das Endprodukt
für die
Injektion nicht hypotonisch ist), oder einer wäßrigen Lösung von einer oder mehreren
Tonizitäts-einstellenden
Substanzen (z. B. wie hierin zuvor beschrieben), rekonstituiert
werden. Falls das getrocknete Produkt in einem Gefäß enthalten
ist, wird dieses zweckmäßigerweise
mit einer Scheidewand versiegelt, durch welches die Trägerflüssigkeit
unter Verwendung einer wahlfrei vorausgehend gefüllten Spritze injiziert werden
kann; alternativ dazu können
das getrocknete Produkt und die Trägerflüssigkeit zusammen in einer
Doppelkammervorrichtung, wie einer Doppelkammerspritze, bereitgestellt
werden. Es kann vorteilhaft sein, das Produkt im Anschluß an die
Rekonstitution zu mischen oder vorsichtig zu schütteln. Wie obenstehend angegeben,
kann jedoch in den stabilisierten Kontrastmitteln gemäß der Erfindung
die Größe der Gasmikroblasen
im wesentlichen unabhängig
von der Menge an Bewegungsenergie, welche an dem rekonstituierten getrockneten
Produkt aufgebracht wird, sein. Folglich kann nicht mehr als ein
vorsichtiges Schütteln
von Hand erforderlich sein, um reproduzierbare Produkte mit konsistenter
Mikroblasengröße zu ergeben.
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Bestimmte Gasdispersionen, ähnlich zu
denjenigen, welche gemäß des obenstehenden
Schrittes (i) erhältlich
sind, werden in unserer Internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO-A-96 40275 als Zwischenstufen zur Verwendung bei der Herstellung
von diagnostischen Kontrastmitteln offenbart, welche Mikroblasen
aus Gas umfassen, stabilisiert durch ein oder mehrere Membranbildende
Lipide, welche in ihrem hydrophilen Abschnitt vernetzt oder polymerisiert
sind. Es wird richtig eingeschätzt
werden, daß diese
Dispersionen, dadurch daß sie
Zwischenstufen sind, nicht in injizierbarer (d. h. steriler und
physiologisch annehmbarer) Form hergestellt worden sind, anders
als bei den Kontrastmitteln der vorliegenden Erfindung.
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Die folgenden nicht-einschränkenden
Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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In den begleitenden Zeichnungen:
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repräsentiert die 1 eine Auftragung des prozentualen Überlebens
der Volumenkonzentration im Anschluß an Lyophilisierung und Rekonstituierung
gegen die relative Menge an geladenem Phospholipid in den Membranen
von Kontrastmitteln gemäß Beispiel
1;
-
Die 2 repräsentiert
Auftragungen von Attenuierungsspektren für den Frequenzbereich 1,5– 8 MHz von
Kontrastmitteln gemäß Beispiel
2(a), gemessen a) vor dem Drucktesten; b) während des Drucktestens, und
c) nach dem Drucktesten, wie beschrieben im Beispiel 6;
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Die 3 zeigt
die prozentuale Wiederherstellung der Attenuierung bei 3,5 MHz von
Kontrastmittel gemäß Beispiel
2(a) im Anschluß an
90 Sekunden lange Anwendungen von Überdrücken von 0–300 mm Hg, wie beschrieben
in Beispiel 6; und
-
die 4 zeigt
die Volumengrößenverteilungen
für Kontrastmittel
gemäß Beispiel
2(a), ge messen durch Coulter-Analyse a) ohne Anwenden von Überdruck
(✦), b) nach 90 Sekunden Überdruck bei 150 mm Hg (Δ), und c)
nach 90 Sekunden Überdruck
bei 300 mm Hg (∎), wie beschrieben in Beispiel 6.
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Beispiel 1
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Effekte von relativen
Mengen von geladenen Phospholipiden
-
Dispersionen von Mikroblasen, stabilisiert
durch verschiedene Phospholipide oder Phospholipidmischungen, wurden
gemäß des nachstehend
beschriebenen allgemeinen Vorgehens unter Verwendung der in der
entenstehenden Tabelle 1.1 angegebenen Verfahrensparameter hergestellt.
-
Lösungen
von ausgewählten
Phospholipiden oder Phospholipidmischungen in Wasser, enthaltend 5,4%
(w/w) einer Mischung aus Propylenglycol und Glycerin (3 : 10 w/w),
was eine Phospholipidkonzentration von 2–5 mg/ml ergab, wurden hergestellt
(für Phosphatidylethanolamin
wurde das Wasser auf pH = 10,5 mit Natriumhydroxid eingestellt),
wobei die Phospholipide durch Ultraschallbehandlung und/oder Erwärmen auf ungefähr 80°C für die angegebene
Zeit (Tabelle 1.1) hydratisiert wurden und vor der Anwendung auf
Raumtemperatur gekühlt
wurden. Ein gegebenes Volumen dieser Lösung wurde zwischen mehreren
2-ml-Chromatographiegefäßen geteilt,
wobei 0,8–1
ml Lösung
pro Gefäß verwendet
wurden. Der Kopfraum jedes Gefäßes wurde
mit Perfluorbutangas gefüllt,
und die Gefäße wurden
sicher verschlossen und 45 Sekunden lang unter Verwendung eines
Espe CapMix® (Mixer
für zahnmedizinische
Materialien) geschüttelt.
Die resutierenden Mikroblasendispersionen wurden in ein größeres Gefäß überführt und
5 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert, wodurch man eine trübe untere
Phase unterhalb einer flottierenden Schicht von Mikroblasen erhielt.
Die untere Phase wurde durch eine Spritze entfernt und mit einem
gleichen Volumen an Wasser bei neutralem pH-Wert ersetzt. Der Waschschritt
wurde wiederholt, aber jetzt wurde die untere Schicht durch 10%
(w/w) Saccharose, ersetzt, 2-ml-Portionen der gewaschenen Dispersion
wurden zwischen 10 ml großen
Flachbodengefäßen, welche
speziell für
das Lyophilisieren entworfen waren, aufgeteilt, und die Gefäße wurden
auf –47°C gekühlt und
ungefähr
48 Stunden lang lyophilisiert, wodurch man ein weiße flockige
feste Substanz erhielt. Die Gefäße wurden
in eine Vakuumkammmer überführt, und
Luft wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt und durch Perfluorbutangas
ersetzt. Vor der Verwendung wurde Wasser zugegeben, und die Gefäße wurden
von Hand während
einigen Sekunden vorsichtig geschüttelt, wodurch Mikroblasendispesionen
erhalten wurden, welche als Ultraschallkontrastmittel geeignet sind.
-
Die Größenverteilung und Volumenkonzentration
der Mikroblasen wurden unter Verwendung einer Coulter-Counter Mark
II-Vorrichtung, augestattet mit einer 50-μm-Öffnung mit einem Meßbereich
von 1–30 μm, gemessen.
20-μl-Proben
wurden in 200 ml Kochsalzlösung
verdünnt,
gesättigt
mit Luft bei Raumtemperatur, und 3 Minuten lang vor der Messung äquilibrieren
gelassen. Die Messungen wurden an Mikroblasendispersionen vor der
Lyophilisierung (gewaschene Blasendispersion) und nach der Lyophilisierung
(rekonstituiert mit Wasser auf das gleiche Vo lumen wie vor der Lyophilisierung)
vorgenommen. Die Daten sind nachstehend in der Tabelle 1.2 dargestellt.
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Die Effizienz der Lyophilisierung
für die
verschiedenen Phospholipid-stabilisierten Mikroblasendispersionen
wurde als der Prozentgehalt des Überlebens
der Volumenkonzentration im Anschluß an Lyophilisierung und Rekonstitution
berechnet. Eine Auftragung (siehe 1 der
Zeichnungen) zeigt, wie dieser Parameter mit der relativen Menge
an geladenem Phospholipid in der Membran variiert. Wie ersehen werden
kann, steigt die Effizienz der Lyophilisierung mit einer erhöhten Menge
des geladenen Phospholipids in der Membran, wobei sie am höchsten für Membranen
ist, welche lediglich geladenes Phospholipid enthalten.
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Tabelle
1.1 (Fortsetzung)
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Beispiel 2
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a) Herstellung von Perfluorbutan-Mikroblasendispersionen
durch Schütteln
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25,3 mg hydriertes Eier-Phosphatidylserin
wurde zu 12,5 ml Wasser zugesetzt, enthaltend 5,4% (w/w) einer Mischung
von Propylenglycol und Glycerin (3 : 10 w/w). Das Phospholipidmaterial
wurde durch Erwärmen
auf 70°C
während
ungefähr
30 Minuten, gefolgt von Abkühlen
auf Raumtemperatur, hydratisiert. 11 ml der Dispersion wurden in
1-ml-Portionen zwischen elf 2-ml-Gefäßen aufgeteilt,
und der Kopfraum der Gefäße wurde
mit Perfluor-n-butangas gefüllt.
Die Gefäße wurden
sicher verschlossen und 45 Sekunden lang unter Anwendung eines Espe
CapMix® (Mixer
für zahnmedizinische
Materialien) geschüttelt.
Die resultierenden Mikroblasen-Dispersionen wurden in vier größeren Gefäßen vereinigt
und 5 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert, wodurch eine trübe untere
Phase unterhalb einer flottierenden Schicht von Mikroblasen erhalten
wurde. Die untere Phase wurde durch eine Spritze entfernt und mit
einem gleichen Volumen an Wasser bei neutralem pH-Wert ersetzt.
Der Waschschritt wurde wiederholt, aber jetzt wurde die untere Schicht
durch 10% (w/w) Saccharose ersetzt. 2-ml-Portionen der resultierenden
Dispersion wurden zwischen 10-ml-Flachbodengefäßen, welche speziell für das Lyophilisieren
entworfen waren, aufgeteilt, und die Gefäße wurden auf –47°C gekühlt und
ungefähr
48 Stunden lang lyophilisiert, wodurch man ein weiße flockige
feste Substanz erhielt. Die Gefäße wurden
in eine Vakuumkammer überführt, und
Luft wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt und durch Perfluor-n-butan-Gas ersetzt. Vor
der Verwendung wurde Wasser zugegeben, und die Gefäße wurden
von Hand während
einigen Sekunden vorsichtig geschüttelt, wodurch Mikroblasendispersionen
erhalten wurden, welche als Ultraschallkontrastmittel geeignet sind.
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b) Herstellung von Perfluorbutan-Mikroblasendispersionen
durch Rotor/Stator-Mischen
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500,4 mg hydriertes Eier-Phosphatidylserin
wurden zu 100 ml Wasser zugesetzt, enthaltend 5,4% (w/w) einer Mischung
von Propylenglycol und Glycerin (3 : 10 w/w). Die Mischung wurde
geschüttelt
und 5 Minuten lang auf 80°C
erwärmt,
auf Raumtemperatur abkühlen
gelassen, erneut geschüttelt
und vor der Anwendung über
Nacht stehen gelassen.
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50 ml der resultierenden Lösung wurden
in einen Rundbodenkolben mit einem konischen Hals überführt. Der
Kolben war mit einem Glasmantel ausgestattet, welcher einen Temperatursteuerungs-Einlaß und -Auslaß aufwies,
angeschlossen an ein Wasserbad, welches bei 25°C gehalten wurde. Ein Rotor/Stator-Mischerschaft
wurde in die Lösung
eingeführt,
und um Gas-Auslaufen
zu vermeiden, wurde der Raum zwischen der Halswand und dem Mischungsschaft
mit einem speziell entworfenen Metallstöpsel verschlossen, welcher
mit einer Gas-Einlaß/Auslaß-Kupplung für die Einstellung
des Gasgehaltes und die Druckkontrolle ausgestattet war. Der Gasauslaß wurde
an eine Vakuumpumpe angeschlossen, und die Lösung wurde 1 Minute lang entgast.
Dann wurde eine Atmosphäre
von Perfluor-n-butangas durch den Gaseinlaß eingebracht.
-
Die Lösung wurde 10 Minuten lang
bei 23000 U/min homogenisiert, wobei der Rotor/Stator-Mischerschaft
so gehalten wurde, daß die Öffnungen
geringfügig über der
Oberfläche
der Flüssigkeit
waren. Es wurde eine weißgefärbte cremige
Dispersion erhalten, welche in einen verschließbaren Behälter überführt und mit Perfluor-n-butan
gespült
wurde. Die Dispersion wurde dann in einen Trenntrichter überführt und
30 Minuten lang bei 12000 U/min zentrifugiert, wodurch eine cremige
Schicht von Blasen an der Oberseite und eine trübe untere Phase erhalten wurden.
Die untere Phase wurde entfernt und mit Wasser ersetzt. Die Zentrifugation wurde
dann zweimal wiederholt, jedoch nun 15 Minuten lang bei 12000 U/min.
Nach der letzten Zentrifugation wurde der Überstand durch 10% (w/w) Sacchasrose
ersetzt. 2-ml-Portionen der resultierenden Dispersion wurden zwischen
10-ml-Flachbodengefäßen, welche
speziell für
das Lyophilisieren entworfen waren, aufgeteilt, und die Gefäße wurden
auf –47°C gekühlt und
ungefähr
48 Stunden lang lyophilisiert, wodurch man ein weiße flockige
feste Substanz erhielt. Die Gefäße wurden
nun in eine Va kuumkammer überführt, und
Luft wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt und durch Perfluor-n-butan-Gas ersetzt.
Vor der Verwendung wurde Wasser zugegeben, und die Gefäße wurden
von Hand während
einigen Sekunden vorsichtig geschüttelt, wodurch Mikroblasendispesionen
erhalten wurden, welche als Ultraschallkontrastmittel geeignet sind.
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c) Herstellung von Perfluorbutan-Mikroblasendispersionen
durch Schallbehandlung
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500,4 mg hydriertes Eier-Phosphatidylserin
wurden zu 100 ml Wasser zugesetzt, enthaltend 5,4% (w/w) einer Mischung
aus Propylenglycol und Glycerin (3 : 10 w/w). Die Mischung wurde
geschüttelt
und 5 Minuten lang auf 80°C
erwärmt,
auf Raumtemperatur abkühlen
gelassen, erneut geschüttelt
und, vor der Anwendung, über
Nacht stehen gelassen.
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Die Lösung wurde durch eine 4-ml-Sonicator-Durchflußzelle gepumpt
und Ultraschall bei 20 kHz mit einer Amplitude von 90 μm ausgesetzt.
Der Durchmesser des Sonicator-Hornes belief sich auf 1,3 cm, der
Innendurchmesser der Zelle betrug 2,1 cm, und der Abstand zwischen
dem Horn und dem Zellenboden belief sich auf 1 cm. Die Lipidlösung wurde
mit Perfluor-n-butan bei einem Verhältnis von 1 : 2 v/v gemischt,
bevor sie in die Sonicatorzelle eintrat (20 ml/min Lipidlösung und
40 ml/min Perfluor-n-butangas). Die Temperatur wurde auf 33°C gehalten.
Es wurde eine weiße
und cremige Dispersion erhalten, welche in einen Container gefüllt und
mit Perfluor-n-butan gespült
wurde.
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Charakterisierung
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Die Größenverteilung und Volumenkonzentration
der Mikroblasen wurden unter Verwendung einer Coulter Counter Mark
II-Vorrichtung, ausgestattet mit einer 50-μm-Öffnung mit einem Meßbereich
von 1–30 μm gemessen.
20-μl-Proben
wurden in 200 ml Kochsalzlösung
verdünnt,
gesättigt
mit Luft bei Raumtemperatur, und 3 Minuten lang vor der Messung äquilibrieren
gelassen.
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Die Ultraschall-Charakterisierung
auf einem Experimentaufbau durchgeführt, abgewandelt aus de Jong,
N., und Hoff, L., wie beschrieben in "Ultrasound scattering properties of
Albunex microspheres",
Ultrasonics 31(3), S. 175–181
(1993). Diese Gerätschaft
mißt die
Ultraschall-Attenuationseffizienz
im Frequenzbereich von 2–8
MHz einer verdünnten
Suspension von Kontrastmittel. Während
der Attenuationsmessung wurde ein Druckstabilitätstest durch Exponieren der
Probe an einen Überdruck
von 120 mm Hg während
90 Sekunden durchgeführt:
Typischerweise wurden 2–3 μl Probe in
55 ml Isoton II verdünnt,
und die verdünnte
Probensuspension wurde 3 Minuten lang, vor der Analyse, gerührt. Als
Hauptantwort-Parameter wurde die Attenuation bei 3,5 MHz, zusammen
mit dem Wiederherstellungs-Attenuationswert bei 3,5 MHz nach Ablassen des Überdrucks,
verwendet.
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Beispiel 3
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Effekte von Gasaustausch
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Der Gasinhalt von fünf Proben,
hergestellt gemäß des obenstehenden
Beispiels 2(b), wurde mit Luft, Perfluorbutan, Schwefelhexafluorid,
Trifluormethylschwefelpentafluorid bzw. Tetramethylsilan gemäß des folgenden
Vorgehens ersetzt:
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Zwei Proben, enthaltend lyophilisiertes
Produkt aus Beispiel 2(b) wurden in einen Exsikator gebracht, welcher
einen Gaseinlaß und
einen Gasauslaß besaß. Der Exsikator
wurde an eine Buchi 168-Vakuum/Destillator-Steuereinrichtung angeschlossen,
welche eine gesteuerte Evakuierung der Proben und den Einlaß eines
ausgewählten
Gases gestattete. Die Proben wurden bei ungefähr 10 mbar 5 Minuten lang evakuiert,
wonach der Druck durch den Einlaß des selektierten Gases auf
Atmosphärendruck
erhöht
wurde, gefolgt von vorsichtigem Verschließen der Gefäße. Das Vorgehen wurde unter
Verwendung weiterer Probenpaare für jedes der ausgewählten Gase
wiederholt.
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2 ml destilliertes Wasser wurden
in jedes Gefäß zugesetzt,
und die Gefäße wurden,
vor der Verwendung, vorsichtig mit der Hand geschüttelt. Die
resultierenden Mikroblasendispersionen wurden hinsichtlich Größenverteilungs-Messungen,
wie beschrieben in Beispiel 2, charakterisiert. Die Ergebnisse sind
in der Tabelle 3.1 zusammengefaßt.
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Wie aus den obenstehenden Ergebnissen
ersehen wird, bestand keine signifikante Änderung der Größenverteilung
nach Gasaustausch.
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In vivo-Ergebnisse
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Ein Ansatz, hergestellt mit jedem
der fünf
Gase wurde in vivo hinsichtlich Doppler-Verstärkungseigenschaften bei 10
MHz ausgewertet. Die Dispersionen wurden über eine Ohrvene in Chinchilla-Kaninchen
injiziert und unter Anwendung einer Doppler-Technik gemessen, wobei
eine Ultraschallsonde direkt auf einer Karotis-Arterie plaziert
wurde. Die Signalintensitäten
und die Dauer wurden aufgezeichnet und das Integral der Doppler-Kurve
wurde berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse (siehe nachstehende Tabelle
3.2) zeigten, daß Mikroblasen,
enthaltend Perfluorbutan, die stärkste
Doppler-Intensitätsverstärkung ergaben.
Mikroblasen, enthaltend Schwefelhexafluorid, Trifluormethylschwefelpentafluorid
oder Tetramethylsilan, waren als Doppler-Verstärker nur geringfügig weniger
effektiv als diejenigen, welche Perfluorbutan enthielten, wobei
Integrale im Bereich von 60–80%
des Wertes für
Perfluorbutan erhalten wurden.
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Beispiel 4
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Gefrorene Dispersionen
und lyophilisierte Produkte
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250 mg hydriertes Eier-Phosphatidylserin
wurden zu 50 ml Wasser zur Injektion gegeben, enthaltend 5,4% (w/w)
einer Mischung aus Propylenglycol und Glycerin (7 : 20 w/w). Die
Mischung wurde geschüttelt
und fünf
Minuten lang auf 80°C
erwärmt,
auf Raumtemperatur abkühlen
gelassen, erneut geschüttelt
und über Nacht,
vor der Verwendung, stehen gelassen.
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100 ml der resultierenden Lösung wurden
in einen Rundbodenkolben mit einem konischen Hals überführt und
gemäß der Vorgehensweise,
welche in Beispiel 2(b) beschrieben ist, verarbeitet. Eine weißgefärbte cremige
Dispersion wurde gebildet. Diese Dispersion wurde in einen Trenntrichter überführt und
30 Minuten lang bei 12000 U/min zentrifugiert, wodurch eine cremige
Schicht aus Mikroblasen an der Oberseite und eine trübe untere
Phase erhalten wurden. Die untere Phase wurde entfernt und mit 50
ml Wasser zur Injektion ersetzt. Die Zentrifugation wurde dann zweimal
wiederholt, jedoch nun bei 12000 U/min während 15 Minuten. Zu 6 ml der
resultierenden Dispersion wurden 6 ml 30% (w/w) Trehalose zugesetzt;
2-ml-Portionen dieser Dispersion wurden zwischen 10-ml-Flachbodengefäßen aufgeteilt,
welche speziell für
das Lyophilisieren entworfen sind, und die Gefäße wurden auf –47°C gekühlt und
einen Tag lang bei dieser Temperatur aufbewahrt.
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Die Hälfte der Gefäße wurden
nach einem Tag bei –47°C aufgetaut,
wobei homogene cremige weiße Dispersionen
von Gasmikroblasen erhalten wurden, welche als Ultraschallkontrastmittel
geeignet waren. Die aufgetauten Dispersionen wurden durch Messung
der Größenverteilung,
wie beschrieben im obenstehenden Beispiel 2, charakterisiert (siehe
Tabelle 4.1). Die verbleibenden Gefäße wurden ungefähr 48 Stunden
lang lyophilisiert, wodurch eine weiße flockige feste Substanz
erhalten wurde. Die Gefäße wurden
in eine Vakuumkammer überführt, und
die Luft wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt und durch Perfluor-n-butan-Gas
ersetzt. Vor der Verwendung wurde Wasser zugesetzt, und die Gefäße wurden
einige Sekunden lang vorsichtig mit der Hand geschüttelt, wodurch
als Ultraschallkontrastmittel geeignete Blasendispersionen erhalten
wurden. Die rekonstituierten Produkte wurden durch Messen der Größenverteilung
und der akustischen Attenuation unter Anwendung der Verfahren, wie
im obenstehenden Beispiel 2 beschrieben, charakterisiert. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle 4.1 dargestellt.
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Beispiel 5
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Exposition von Perfluorbutan-Mikroblasendispersion
an Luft-gesättigtes
Fluid
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Ein Gefäß, enthaltend lyophilisiertes
Material, unter einer Atmosphäre
von Perfluorbutan, wurde hergestellt, wie beschrieben im Beispiel
2(b). Wasser wurde dem Gefäß direkt
vor der Anwendung zugesetzt, wodurch eine Mikroblasendispersion
erhalten wurde.
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200 ml Isoton II-Fluid wurden mehrere
Tage lang bei Raumtemperatur an Luft ausgesetzt, um eine vollständig Luft-gesättigte Lösung zu
ergeben. Weitere 200 ml des Fluids wurden in einem Vakuumkolben
eine Stunde lang bei 60°C
entgast und bei Raumtemperatur gekühlt, wah rend das Vakuum beibehalten
wurde. Luft wurde unmittelbar vor der Verwendung in den Kolben gelassen.
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10-μl-Portionen der Mikroblasensuspension
wurden jedem der Fluide zugesetzt, und die resultierenden Mischungen
wurden 5 Minuten lang vor der Größencharakterisierung
(Coulter Multisizer Mark II) inkubiert.
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In der entgasten Umgebung, wo keine
Diffusion von Gasen aus dem Fluid in die Mikroblasen erwartet werden
würde,
belief sich der mittlere Mikroblasendurchmesser auf 1,77 μm, und 0,25%
der Mikroblasen waren größer als
5 μm. In
dem luftgesättigten
Fluid beliefen sich die entsprechenden Werte auf 2,43 μm und 0,67%;
nach weiteren 5 Minuten vorgenommene Wiederho lungsmessungen zeigten
an, daß die
Mikroblasengrößen einen
stabilen Wert erreicht hatten.
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Diese Befunde zeigen, daß der durchschnittliche
Durchmesser der Mikroblasen um lediglich 37% anstieg, wenn sie an
ein, zu arteriellem Blut analoges, luftgesättigtes Fluid exponiert worden
waren, wobei sehr wenige Mikroblasen eine Größe erreichten, welche eine
Blockierung von Kapillarblutgefäßen verursachen könnte. Dies
kann zu der Verdopplung der Größe von Luft/Perfluorhexan-enthaltenden
Mikroblasen in einer ähnlichen
Umgebung (d. h. einer stark verdünnten
Dispersion von Mikroblasen in Wasser, enthaltend gelöste Luft), über welche
im Beispiel II von WO-A-95 03835 berichtet wurde, in Gegensatz gestellt
werden.
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Beispiel 6
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Druckstabilität von Perfluorbutan-Mikroblasendispersion
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Gefäße, enthaltend lyophilisiertes
Material unter einer Atmosphäre
von Perfluorbutan, wurden hergestellt, wie beschrieben im Beispiel
2(a). Wasser (2 ml) wurde direkt vor der Verwendung zu den Gefäßen zugesetzt,
um Mikroblasendispersionen zu ergeben.
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Attenuierungsspektren wurden für 1,5–8 MHz vor,
während
und nach der Anlegung eines Überdrucks von
Luft bei 300 mm Hg aufgezeichnet; der Druck wurde nach 90 Sekunden
abgelassen. Die Ergebnisse sind in der 2 der Zeichnungen gezeigt und weisen
darauf hin, daß obwohl
die Attenierung bei 4 MHz (der Peak für nicht unter Druck gesetztes
Kontrastmittel) unter Druck auf weniger als ein Drittel fiel, sie
nahezu vollständig (85%–95%) wiederhergestellt
wurde, als der Druck abgelassen wurde.
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Luft-Überdrücke von bis zu 300 mm Hg wurden
während
einer Dauer von 90 Sekunden angelegt, und die Attenuierung wurde
bei 3,5 MHz gemessen. Die Ergebnisse sind in der 3 der Zeichnungen gezeigt und weisen
auf eine gute Wiederherstellung der Attenuierung (mindestens etwa
95%) im Anschluß an
das Druckablassen für
alle verwendeten Überdrücke hin.
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Die Größenverteilungen wurden durch
Coulter-Analyse für
eine nicht unter Druck gesetzte Probe und für Proben, welche für Zeitdauern
von 90 Sekunden angelegten Luft-Überdrücken bei
150 und 300 mm Hg unterzogen wurden, bestimmt. Die Ergebnisse sind
in der 4 der Zeichnungen
gezeigt und weisen darauf hin, daß keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Verteilungskurven im Bereich von 1–10 μm bestanden.
