ES2197986T3

ES2197986T3 - Mejoras introducidas en o relacionadas con agentes de contraste.

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Publication number: ES2197986T3
Application number: ES97905222T
Authority: ES
Inventors: Harald Nycomed Imaging a/s DUGSTAD; Jo Nycomed Imaging a/s KLAVENESS; Pal Nycomed Imaging a/s RONGVED; Roald Nycomed Imaging a/s SKURTVEIT; Jorun Nycomed Imaging a/s BRAENDEN
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1996-02-19
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2017-02-19
Also published as: EE9800249A; CZ262598A3; HU229090B1; JP2000511510A; AU1884797A; EA199800745A1; CA2246779C; AU726503B2; HK1014872A1; DE69721235T2; TR199801613T2; CZ293986B6; KR19990082669A; SK284200B6; EP0881915B1; NZ331509A; OA10839A; US20030202942A1; EA001135B1; US6221337B1

Abstract

UNAS DISPERSIONES DE MICROBURBUJAS ESTABILIZADAS POR FOSFOLIPIDOS QUE INCLUYEN PREDOMINANTEMENTE MOLECULAS QUE DE FORMA INDIVIDUAL PRESENTAN UNA CARGA NETA GLOBAL, MUESTRAN UNA ESTABILIDAD VENTAJOSA, LO CUAL LES HACE UTILES COMO AGENTES DE CONTRASTE EFICACES. TAMBIEN SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO MEJORADO PARA PREPARAR AGENTES DE CONTRASTE QUE CONTIENEN MICROBURBUJAS, QUE INCLUYE LIOFILIZAR UNA DISPERSION ACUOSA DE MICROBURBUJAS DE GAS ESTABILIZADA POR UNO O MAS LIPIDOS FORMADORES DE MEMBRANAS, PARA PRODUCIR UN PRODUCTO SECO QUE PUEDE SER RECONSTITUIDO EN UN VEHICULO LIQUIDO INYECTABLE PARA GENERAR UN AGENTE DE CONTRASTE QUE CONTIENE MICROBURBUJAS.

Description

Mejoras introducidas en o relacionadas con agentes de contraste.

Esta invención se refiere a nuevos agentes de contraste que contienen gas para uso en imágenes de diagnóstico, más particularmente a agentes de contraste tales que comprende microburbujas de gas estabilizadas con fosfolípidos y a un nuevo método para la preparación de estos agentes de contraste.

Es bien sabido que las imágenes ultrasónicas son una herramienta de diagnóstico potencialmente valiosa por ejemplo en estudios del sistema vascular, particularmente en cardiografía y de la microvasculatura de tejidos. Se ha propuesto una diversidad de agentes de contraste para mejorar las imágenes acústicas obtenidas de esta forma, incluyendo suspensiones de partículas sólidas, gotitas líquidas emulsionadas, burbujas de gas y gases encapsulados o líquidos. Es generalmente aceptado que los agentes de contraste de baja densidad que son fácilmente comprimibles son particularmente eficaces en términos de la retrodispersión acústica, y por lo tanto se han mostrado como de un interés particular en la preparación de sistemas que contienen gas y que generan gas.

También se sabe que los medios de contraste que contienen gas son eficaces en imágenes por resonancia magnética (MR), por ejemplo como ejemplos de contraste de susceptibilidad que actúan para reducir la intensidad de la señal de RM. Los medios de contraste que contienen oxígeno también representan agentes de contraste de MR paramagnéticos potencialmente útiles.

Además en el campo de las imágenes por rayos X se ha observado que gases tales como el dióxido de carbono pueden usarse como agentes de contraste orales negativos o agentes de contraste intravasculares.

El uso de gases radioactivos, por ejemplo isótopos radioactivos o gases inertes tales como xenón, también se ha propuesto en escintigrafía, por ejemplo para imágenes de la reunión sanguínea por retardo de la circulación venosa.

Los estudios iniciales implican burbujas sin gas generadas in vivo por inyección intracardiaca o sustancias fisiológicamente aceptables han demostrado la potencial eficacia de tales burbujas como agentes de contraste en ecografía; tales técnicas están muy limitadas en la práctica, sin embargo por al corto tiempo de vida de las partículas libres. Por consiguiente se ha mostrado interés en métodos de burbujas estabilizadoras de gas para ecocardiografía y otros estudios ultrasónicos, por ejemplo usando emulsionantes, aceites, espesantes o azúcares o por embarque o encapsulación del gas o un precursor del mismo en una diversidad de sistemas, por ejemplo como micropartículas que contienen gas porosas o microburbuja encapsuladas.

Hay un cuerpo técnico antecedente con respecto al uso de fosfolípidos como componentes de agentes de contraste ultrasónico que contienen gas. De esta forma, por ejemplo, el uso de un medio de contraste ultrasónico o liposomas fosfolípidos en el que una bicapa lipídica rodea una composición confinada que incluye un gas o precursor de gas como se describe en el documento US-4900540. El material encapsulado es típicamente un precursor de gas tal como un bicarbonato sódico acuoso, que es adecuado para generar dióxido de carbono después de la administración y la exposición al pH corporal. Los núcleos de los liposomas resultantes por lo tanto tenderán a comprimir el líquido que contiene microburbujas de gas extremadamente pequeñas que muestran sólo ecogenicidad limitada en virtud de su pequeño tamaño.

El documento WO-A-9115244 describe medios de contraste ultrasónicos que comprende microburbujas de aire u otro gas formadas en una suspensión o liposomas cargados de líquido, los liposomas aparentemente estabilizan las microburbujas. Tales sistemas se diferencian de los del documento US-A-4900540 mencionado anteriormente en que el aire u otro gas está dentro de los liposomas.

El documento WO-A-9211873 describe preparaciones acuosas diseñadas para absorber y estabilizar microburbujas y por lo tanto sirve como agentes de contraste ultrasónico, las composiciones comprenden polímeros de polioxietileno/polioxipropileno y fosfolípidos cargados negativamente. La relación de peso del polímero al fosfolípido típicamente es de aproximadamente 3:1.

Los agentes de contraste ultrasónicos comprenden liposomas cargados de gas es decir, liposomas que están sustancialmente libres de líquido en el interior de los mismos, y su preparación por un método de instilación de gas secado al vacío se describe en el documento WO-A-9222247. La preparación de tales liposomas cargados de gas por un gas en agitación en estado de gel se describe en el documento WO-A-9428780. Un informe de compuestos bicapa lipídicos cargado con gas de dipalmitoilfosfatidilcolina como agentes de contraste ultrasónicos se presenta por Unger et al., en Investigative Radiology 29, Supplement. 2, S134-S136 (1994).

El documento WO-A-9409829 describe suspensiones inyectables de microburbujas de gas en un líquido vehículo acuoso que comprende al menos una estabilizador fosfolipídico, siendo la concentración de fosfolípidos en el vehículo menor del 0,01% p/p pero igual o inferior a la cantidad a la que están presentes las moléculas de fosfolípidos solamente en la interfase de microburbuja de gas-líquido. La cantidad de fosfolípido por lo tanto puede ser menor que la necesaria para la formación de una monocapa sencilla de tensioactivo alrededor de las microburbujas de gas, la estructura similar película resultante estabilizando las burbujas frente al colapso o coalescencia. La microburbujas con una bicapa de tensioactivos similar al liposomas no se obtienen cuando se usa tan concentración de fosfolípidos.

Un cuerpo adicional de la técnica se refiere a la selección de gases de medios de contraste ultrasónicos que contienen microburbujas de gas con el fin de mejorar propiedades tales como su estabilidad y duración de efecto ecogénico. De esta forma, por ejemplo el documento WO-A-9305819 propone el uso de microburbujas sin gas que tienen un coeficiente Q mayor de 5, donde

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Q = 4,0 x 10 ^{-7}  x
p/C _{S} D\cr}

(donde p es la densidad del gas en Kg.m^{-3}, C_{S} es la solubilidad acuosa del gas en moles por I^{-1} y D es la difusivilidad del gas en solución en cm^{3} x seg^{-1}). Se presenta una lista extensa de gases para cumplir este requisito.

El documento EP-A-0554213 sugiere que uno puede impartir resistencia contra el colapso bajo presión a microvesículas cargadas de gas por la introducción en el mismo de al menos un gas que sea soluble en agua, expresado en litros de gas/litros de agua en condiciones convencionales, dividido por la raíz cuadrada de su peso molecular no exceda de 0,003. Los gases preferidos son aquellos que incluyen hexacloruro de azufre, hexafloruro de selenio y diversos Freones®. Tales gases pueden, entre otros usarse en composiciones que contienen fosfolípidos del tipo descrito en el documento WO-A-9215244 descrito anteriormente.

Schneider et al, en investigative Radiology 30(8), páginas 451-457 (1995) describe un nuevo agente de contraste ultrasonográfico basado en microburbujas cargadas con hexafluoruro de azufre aparentemente estables por una combinación de polietilenglicol 4000 y una mezcla de los fosfolípidos diasteroilfosfatidilcolina y dipalmitolilfosfatidilglicerol. El uso de hexafluoruro de azufre en lugar de aire se realiza con el fin de proporcionar una mejor resistencia a los incrementos de presión que se producen en el reposo del corazón durante el movimiento sistólico.

El documento WO-A-9503835 propone el uso de microburbujas que contienen una mezcla de gas, cuya composición se basa en las consideraciones de las presiones parcial de gas tanto fuera como dentro de las microburbujas, así como que tiene en cuenta los efectos osmóticos sobre el tamaño de las microburbujas. Las mezclas representativas comprenden un gas que tiene una baja presión de vapor y una solubilidad limitada en sangre o suero (por ejemplo un fluorocarburo) en combinación con otro gas que se intercambia más rápidamente con gases presentes en la sangre o suero normal (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono o mezclas de los mismos).

El documento WO-A-9516467 sugiere el uso de medios de contraste de ultrasonidos que contienen una mezcla de gases aire, donde el gas B está presente en una cantidad del 0,5 al 41% v/v, tiene un peso molecular mayor de 80 Daltons y tiene una solubilidad en agua por debajo de 0,0283 ml/ml de agua en condiciones convencionales, siendo el resto de la mezcla gas A. Los gases A representativos incluyen aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono y mezclas de los mismos. Los gases representativos incluyen gases que contienen flúor tales como hexafluoruro de azufre y diversos hidrocarburos perfluorados. Los estabilizadores preferidos en tales medios de contraste incluyen fosfolípidos.

Los fosfolípidos que se dice que son útiles en los agentes de contraste de la técnica anterior incluyen lecitinas (es decir, fosfatidilcolinas), por ejemplo, lecitinas naturales tal como lecitina de yema de huevo o lecitina de soja y lecitinas sintéticas o semisintéticas tales como dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmatoil fosfatidilcolina o diestearoil fosfatidilcolina; ácido fosfatídicos; fosfatidiletalonaminas; fosfatidilserinas; fosfatidilgliceroles; fosfatidilinositoles; cardiolipinas; exfingomiolinas; mezclas de cualquiera de los anteriores y mezclas con otros lípidos tales como colesterol. Los derivados de lecitina generalmente parecen ser los fosfolípidos usados más comúnmente, posiblemente en virtud de su disponibilidad a partir de fuentes naturales. El uso de aditivos tales como colesterol en cantidades de hasta un 50% p/p se describe en el documento WO-A-9115244 y WO-A-9409829, mientras que la incorporación de al menos una pequeña cantidad (por ejemplo, aproximadamente un 1% en moles) del lípido cargado negativamente (por ejemplo, fosfatidilserina o un ácido graso) para mejorar la estabilidad se sugiere en el documento WO-A-9222247. Una composición de fosfolípido preferida de acuerdo con el documento WO-A-9428780 comprende dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina sustituida con polietilenglicol 5000 y ácido de palmitoil fosfatídico en proporciones molares de aproximadamente 87:8:5. Las composiciones de fosfolípidos mixtas típicas de acuerdo con los documentos WO-A-9409829 y WO-A-9516467 comprenden diaraquiloilfosfatidilcolina y ácido de palmitoilfosfatídico en proporciones de peso de aproximadamente 100:4, aunque la última memoria descriptiva también ilustra el uso de cantidades iguales en peso de diestearoilfosfatidilcolina y dipalmitoilfosfatidilglicerol.

Por lo anterior, será evidente que en las suspensiones de microburbujas que contienen fosfolípidos existentes propuestos para uso como medio de contraste, al menos un 50% del contenido de fosfolípidos comprende fosfolípidos neutros tales como lecitinas. Lo más común es que sólo esté presente una proporción minoritaria, por ejemplo, aproximadamente un 5% de fosfolípidos cargados.

La presente invención se basa en el hallazgo de que el uso de fosfolípidos predominantemente cargados como esencialmente el único componente anfífilo de agentes de contraste que contienen microburbujas puede proporcionar ventajas valiosas e inesperadas en términos de parámetros tales como la estabilidad del producto y propiedades acústicas. Aunque no se desea limitación por ninguna consideración teórica, se cree que la repulsión electroestática entre las membranas de fosfolípidos cargadas induce la formación de monocapas estables y estabilizadoras en las interfases de microburbuja-vehículo líquido; la flexibilidad y deformabilidad de tales membranas finas mejorará la ecogenicidad de productos de acuerdo con la invención con respecto a los liposomas rellenos de gas que comprenden una o más bicapas lipídicas.

También se ha descubierto que el uso de fosfolípidos cargados puede permitir la disposición de agentes de contraste de microburbujas con propiedades ventajosas con respecto a, por ejemplo, la estabilidad, dispersibilidad y resistencia a la coalescencia sin recurrir a aditivos tales como tensioactivos adicionales y/o potenciadores de la viscosidad, asegurando de esta manera que el número de componentes administrados al cuerpo de un sujeto tras la inyección de los agentes de contraste se mantiene en un mínimo. De esta manera, por ejemplo, las superficies cargadas de las microburbujas pueden minimizar o prevenir su agregación como resultado de la repulsión electroestática.

De esta manera, de acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona una agente de contraste para uso en estudios de diagnóstico que comprende una dispersión en un vehículo acuoso inyectable líquido de microburbujas de gas biocompatible estabilizado por un material anfífilo que consta esencialmente de moléculas que comprenden predominantemente fosfólipidos que tienen individualmente una carga neta total.

Deseablemente, al menos el 75%, preferiblemente sustancialmente todo el material de fosfolípidos en los agentes de contraste de la invención consta de moléculas que llevan una carga total neta en las condiciones de preparación y/o uso, carga que puede ser positiva o, más preferiblemente negativa. Los fosfolípidos cargados positivamente representativos incluyen ésteres de ácidos fosfatídicos tales como ácido dipalmitoilfosfatídico o ácido diesteaeroilfosfatídico con aminoalcoholes tales como hidroxietilendiamina. Los ejemplos de fosfolípidos cargados negativamente incluyen fosfatidilserinas naturales (por ejemplo, derivadas de soja o de yema de huevo), semisintéticas (por ejemplo, parcial o totalmente hidrogenadas y sintéticas), fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos y cardiolipinas. Los grupos de acilo graso de tales fosfolípidos típicamente contendrán aproximadamente 14-22 átomos de carbono, por ejemplo, como en grupos palmitoilo y estearoilo. Las formas liso de tales fosfolípidos cargados también son útiles de acuerdo con la invención, denotando el término ``liso'' fosfolípidos que contienen sólo un grupo acilo graso, siendo este preferiblemente un éster unido al átomo de carbono en posición 1 del resto de glicerilo. Tales formas liso de fosfolípidos cargados pueden usarse ventajosamente en mezcla con fosfolípidos cargados que contienen dos grupos acilo graso.

Las fosfatidilserina representan fosfolípidos particularmente preferidos para uso en agentes de contraste de acuerdo con la invención, y preferiblemente constituyen una parte sustancial, por ejemplo, al menos un 80% del contenido de fosfolípido inicial del mismo por ejemplo un 85-92%, aunque esto puede reducirse posteriormente en alguna medida, por ejemplo, hasta aproximadamente un 70% en el procesamiento posterior tal como la esterilización por calor. Se apreciará que tal procesamiento puede conducir a la formación de productos de degradación no fosfolípidos tales como ácidos grasos libres, por ejemplo, a niveles de un 10%; las referencias en este documento a material anfífilo que consta esencialmente de fosfolípidos deben considerarse como que incluyen fosfolípidos que contienen tales ácidos grasos libres. Aunque no se desea limitación por ninguna consideración teórica, puede ser que la unión iónica entre los grupos carboxilo y amino de restos de serina adyacentes contribuya a la estabilidad de los sistemas que contienen fosfatidilserina, por ejemplo, como se demuestra por su buena estabilidad ante la presión. Las fosfatidilserinas preferidas incluyen fosfatidilserina natural saturada (por ejemplo hidrogenada o sintética) y dialcanoil fosfatidilserina sintéticas o semisintéticas tales como diasterorilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina y de aralquiloilfosfatidilserina.

Una ventaja importante del uso de tales agentes de contraste basados en fosfatidilserina es que el cuerpo reconoce glóbulos rojos envejecidos y plaquetas por las altas concentraciones de fosfatidilserina en su superficie, y de esta manera pueden eliminar tales agentes de contraste de la corriente sanguínea de una manera similar a la eliminación de los glóbulos rojos. Además, como la superficie de tales agentes de contraste puede registrarse como endógena por el cuerpo, pueden evitar la inducción de efectos secundarios sistémicos adversos tales como efectos hemodinámicos y otras reacciones anafilácticas que pueden acompañar a la administración de algunas preparaciones de liposomas (véase por ejemplo el documento WO-A-9512386). En apoyo de esto, no se han observado efectos tóxicos agudos tales como cambios en la presión sanguínea o en el ritmo cardiaco en ensayos animales realizados con perros inyectados con dosis intravenosas en embolada de agentes de contraste de acuerdo con la invención a dosis de hasta 10 veces la dosis normal para formar imágenes.

En los agentes de contraste de la invención puede emplearse cualquier gas biocompatible, apreciándose que el término ``gas'', como se usa en este documento, incluye cualquier sustancia (incluyendo mezclas) sustancialmente o completamente en forma gaseosa (incluyendo vapor) a la temperatura normal del cuerpo humano de 37ºC. De esta manera, el gas puede comprender aire, nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; un gas inerte tal como helio, argón, hexeno o criptón; un fluoruro de sulfuro tal como hexafluoruro de sulfuro, decafluoruro de disulfuro o pentafluoruro de trifluorometilsulfuro; hexafluoruro de selenio; un silano opcionalmente halogenado tal como tetrametilsilano; un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo, que contiene hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo un alcano tal como metano, etano, un propano, un butano o un pentano, un cicloalcano tal como ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como propeno o un buteno, o un alquilo tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; un hidrocarburo de bajo peso molecular halogenado (por ejemplo, que contiene hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Al menos algunos de los átomos de halógeno en los gases halogenados ventajosamente son átomos de flúor. De esta manera, los gases de hidrocarburo halogenado biocompatibles pueden seleccionarse, por ejemplo, entre bromoclorodifluorometano, clorodifluorometano, diclorodifluorometano, bromotrifluorometano, cloroetilofluorometano, cloropentafluoroetano, diclorotetrafluoroetano, hiperfluorocarburos, por ejemplo, perfluoroalcanos tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (por ejemplo, perfluoro-n-butano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tales como perfluoroisobutano), perfluoropentanos, perfluorohexanos y perfluoroheptanos; perfluoroalquenos tales como perfluoropropeno, perfluorbutenos (por ejemplo, perfluorobutano-2-eno) y perfluorbutadina; perfluoroalquinos tales como perfluorobut-2-uno; y perfloruocicloalcanos tales como perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluordimetilciclobutanos, perfluorotrimetoilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluormetilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano. Otros gases halogenados incluyen cetonas fluoradas, por ejemplo perfluoradas, tales como perfluoroacetona y éteres fluorados, por ejemplo perfluorados, tales como perfluorodietil éter.

En los agentes de contraste de la invención puede ser ventajoso emplear gases fluorados tales como fluoruros de azufre o fluorocarburos (por ejemplo perfluorocarburos) que se sabe que forman suspensiones de microburbujas particularmente estables (véase, por ejemplo, el artículo de Schneider et al, mencionado anteriormente). Si se desea, pueden emplearse mezclas de gas basándose en consideraciones de presiones parciales tanto dentro como fuera de las microburbujas y los efectos osmóticos consiguientes sobre el tamaño de las microburbujas, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9503835, por ejemplo, una mezcla de un gas relativamente soluble en sangre tal como nitrógeno o aire y un gas relativamente insoluble en sangre tal como un perfluorocarburo.

Sin embargo, se ha descubierto que los agentes de contraste de la invención, por ejemplo, que comprenden microburbujas y un perfluoroalcano tal como perfluorobutano estabilizadas por fosfatidilserina, son sorprendentemente estables en tamaño después de la administración intravenosa a un sujeto, y no presentan la tendencia descrita previamente de las microburbujas de tales gases a crecer de forma incontrolada como resultado de la difusión hacía el interior de gases sanguíneos tales como oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono, en lugar de alcanzar rápidamente un tamaño máximo por encima del cual no se observa crecimiento. Esta forma de evitar el aumento de tamaño ilimitado que conduciría a un bloqueo indeseable y potencialmente peligroso de los capilares sanguíneos es una ventaja importante de los agentes de contraste de acuerdo con la invención.

También se ha descubierto que los agentes de contraste de la invención que comprenden perfluoroalcanos tales como perfluorobutano presentan una estabilidad sorprendentemente alta a presiones similares a las encontradas típicamente in vivo, por ejemplo, mostrando una recuperación sustancialmente completa (por ejemplo de al menos un 90%) a la distribución de tamaños normal y propiedades ecogénicas después de la exposición a presiones excesivas (por ejemplo de aire) de hasta 300 mm Hg durante 90 seguidos.

Los agentes de contraste de la invención pueden usarse en una diversidad de técnicas de formación de imágenes de diagnóstico, incluyendo escintigrafía, formación de imágenes ópticas, ultrasonidos, MR y rayos X (incluyendo rayos X blandos). Su uso en la formación de imágenes de ultrasonidos de diagnóstico y en la formación de imágenes MR, por ejemplo, como agentes de contraste de susceptibilidad, constituye características preferidas de la invención. En aplicaciones de ultrasonidos pueden emplearse una diversidad de técnicas de imágenes, por ejemplo, incluyendo la formación de imágenes de modo B fundamental y armónica y la formación de imágenes Doppler fundamental y armónica; si se desea pueden usarse técnicas de formación de imágenes tridimensionales. El agente de contraste también puede usarse en métodos de formación de imágenes de ultrasonidos basados en técnicas de correlación, por ejemplo, como se describe en el documento US-A-5601085 y la publicación de patente internacional Nº WO-A-9712551 (solicitud Nº PCT/GB96/02413).

Los ensayos de ultrasonidos in vivo en perros han demostrado que los agentes de contraste de acuerdo con la invención pueden producir un aumento en la intensidad de señal de retrodispersión del miocardio de 15-25 dB después de la inyección intravenosa de dosis tan bajas como de 1-20 ml de microburbujas/kg de peso corporal. Las señales pueden observarse a dosis incluso inferiores usando técnicas más sensibles tales como técnicas de color Doppler o derivadas de Doppler, por ejemplo, técnicas Doppler basadas en la amplitud o técnicas no lineales tales como las descritas por Tucker et al, en Lancet (1968) página 1253, por Miller en Ultrasonics (1981) páginas 217-224, y por Newhouse et al, en J. Acoust, Soc. Am. 75, páginas 1473-1477 (1984). A estas bajas dosis, la atenuación en compartimentos rellenos de sangre tales como las cámaras del corazón se ha considerado suficientemente baja como para permitir la visualización de regiones de interés en la vasculatura del miocardio. Ciertos ensayos también han demostrado que tales agentes de contraste inyectados por vía intravenosa se distribuyen a lo largo de la sangre entera, mejorando de esta manera la ecogenicidad de todos los tejidos vascularizados, y que se recirculariza. También se han considerado útiles como adyuvantes de señal Doppler generales, y además pueden ser útiles en la tomografía computerizada de ultrasonidos y en una formación de imágenes intermitente o inducida fisiológicamente.

Para aplicaciones de ultrasonidos tales como ecocardiografía, para permitir el paso libre a través del sistema pulmonar y conseguir resonancia con las frecuencias de imágenes preferidas de aproximadamente 0,1-15 MHz, puede ser conveniente emplear microburbujas con un tamaño medio de 0,1-10 \mum, por ejemplo 1-7 \mum. Se ha descubierto que los agentes de contraste de acuerdo con la invención pueden producirse con una distribución de tamaños muy estrecha para la dispersión de las microburbujas dentro del intervalo preferido para la ecocardiografía, mejorando en gran medida su ecogenicidad así como su seguridad in vivo, y haciendo que los agentes de contraste tengan una ventaja particular en aplicaciones tales como la medición de la presión sanguínea, el seguimiento del flujo sanguíneo y la tomografía de ultrasonidos. De esta manera, por ejemplo, ciertos productos en los que más del 90% (por ejemplo al menos el 95%, preferiblemente al menos el 98%) de las microburbujas tienen diámetros en el intervalo de 1-7 \mum y menos del 5% (por ejemplo no más del 3%, preferiblemente no más del 2%) de las microburbujas tienen diámetros por encima de 7 \mum pueden prepararse fácilmente.

En aplicaciones de ultrasonidos, los agentes de contraste de la invención pueden administrarse, por ejemplo, en dosis tales que la cantidad de fosfolípido inyectado esté en el intervalo de 0,1-10 \mug/kg de peso corporal, por ejemplo, 1-5 \mug/kg en el caso de la formación de imágenes de modo B fundamental. Se apreciará que el uso de tales bajos niveles de fosfolípido tiene una ventaja sustancial en la minimización de posibles efectos secundarios tóxicos. Además, los bajos niveles de fosfolípidos presentes en las dosis eficaces puede permitir aumentos de la dosificación para prolongar los tiempos de observación sin efectos adversos.

La concentración global de fosfolípido en las formas inyectables de agentes de contraste de acuerdo con la invención convenientemente puede estar en el intervalo del 0,01 al 2% p/p, por ejemplo del 0,2 al 0,8% p/p, ventajosamente de aproximadamente un 0,5% p/p.

En general, se ha descubierto que no es necesario incorporar aditivos tales como agentes emulsionantes y/o potenciadores de la viscosidad que se emplean comúnmente en muchas formulaciones de agente de contraste existentes en los agentes de contraste de la invención. Como se ha indicado anteriormente, esto es ventajoso para mantener en un mínimo el número de componentes administrados al cuerpo de un sujeto y asegurar que la viscosidad del agente de contraste es tan baja como sea posible. Como la preparación de los agentes de contraste típicamente implica una etapa de liofilización como se discute con más detalle más adelante, sin embargo, puede ser ventajoso incluir uno o más agentes con efecto crioprotector y/o lioprotector y/o uno o más agentes voluminosos, por ejemplo, un alcohol, por ejemplo, un alcohol alifático tal como t-butanol; un poliol tal como glicerol; un aminoácido tal como glicina; un carbohidrato, por ejemplo un azúcar tal como sacarosa, manitol, trealosa, glucosa, lactosa o una ciclodextrina, o un polisacárido tal como dextrano; o un poliglicol tal como polietilenglicol. En Acta Pharm. Technol. 34\cdot), páginas 129-139 (1988), se proporciona una lista sustancial de agentes con efectos crioprotectores y/o lioprotectores, cuyo contenido se incorpora en este documento como referencia. El uso de azúcares fisiológicamente bien tolerados tales como sacarosa, por ejemplo, en una cantidad tal para hacer que el producto sea isotónico o algo hipertónico, es preferido.

Los agentes de contraste que contienen microburbujas de la técnica anterior, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9409829, típicamente se preparan poniendo en contacto un tensioactivo en polvo, por ejemplo, liposomas preformados liofilizados o soluciones de fosfolípido liofilizadas o secadas por aspersión, con aire y otro gas y después con un vehículo acuoso, agitando para generar una suspensión de microburbujas que después debe administrarse poco después de su preparación. Sin embargo, tales procesos tienen el inconveniente de que debe impartirse una energía de agitación sustancial para generar la dispersión requerida y que el tamaño y la distribución de tamaños de las microburbujas dependen de la cantidad de energía aplicada y de esta forma en la práctica no puede controlarse.

Se ha descubierto que los agentes de contraste de acuerdo con la invención pueden prepararse ventajosamente generando una dispersión de microburbujas de gas en un medio acuoso que contiene fosfolípido apropiado, que si se desea, puede haberse esterilizado en autoclave o de otra forma previamente y posteriormente sometiendo la dispersión a liofilización, preferiblemente en presencia de un crioprotector y/o lioprotector, para producir un producto reconstituible seco. Cuando el producto seco contiene uno o más agentes crioprotectores y/o lioprotectores, por ejemplo, puede comprender una matriz de crioprotector y/o lioprotector que libera microburbujas liofilizadas (por ejemplo un carbohidrato que contiene cavidades sustancialmente esféricas rellenas de gas o vacuolas rodeadas por una o más capas de el material anfífilo.

Más particularmente, se ha descubierto que los productos secos preparados de esta forma son especialmente reconstituibles en medios acuosos tales como agua, una solución acuosa tal como solución salina (que ventajosamente puede equilibrarse de forma que el producto final para la inyección no sea hipotónico) o una solución acuosa de una o más sustancias de ajuste de la tonicidad tales como sales (por ejemplo de cationes de plasma con contraiones fisiológicamente tolerables) o azúcares, alcoholes de azúcares, glicoles y otros materiales poliólicos no iónicos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, glicerol, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares, requiriendo sólo una agitación mínima tal como la que puede proporcionarse, por ejemplo, por agitación manual suave. El tamaño de las microburbujas generadas de esta manera es consistentemente reproducible y en la práctica e independiente de la cantidad de energía agitacional aplicada, determinándose por el tamaño de los microtúbulos formados en la dispersión de microburbujas inicial, manteniéndose este parámetro sorprendentemente en el producto liofilizado y reconstituido. De esta manera, como el tamaño de las microburbujas en la dispersión inicial puede controlarse fácilmente por parámetros de proceso tales como el método, velocidad y duración de agitación, el tamaño de las microburbujas puede controlarse fácilmente.

Los productos de matriz de liberación de microburbujas liofilizadas de acuerdo con la invención han resultado ser estables durante el almacenamiento durante varios meses en condiciones ambientales. Las dispersiones de microburbujas generadas tras la reconstitución en un vehículo líquido acuoso inyectable pueden ser estables durante al menos 12 horas, permitiendo una flexibilidad considerable cuando el producto seco se reconstituye antes de la inyección.

De acuerdo con esta realización de la invención, se proporciona un proceso para la preparación de un agente de contraste como el definido anteriormente, que comprende las etapas:

i): dispersar gas en un medio acuoso que contiene un material anfífilo que consta esencialmente de moléculas que comprenden predominantemente fosfolípidos que tienen individualmente una carga neta global, para formar una dispersión de microburbujas de gas estabilizadas por dicho material anfífilo;

ii): liofilizar dicha dispersión en presencia de un crioprotector y/o lioprotector para producir un producto seco que comprende una matriz de crioprotector y/o lioprotector que contiene cavidades o vacuolas sustancialmente esféricas rellenas de gas biocompatibles rodeadas por una o más capas de dicho material anfífilo;

iii): reconstituir dicho producto seco en un vehículo líquido inyectable acuoso.

La invención también incluye un producto seco reconstituible que se puede obtener de acuerdo con las etapas (i) e (ii) del proceso, es decir, una matriz de liberación de microburbujas liofilizadas que comprende un material estructural de matriz (por ejemplo un crioprotector/lioprotector) que contiene una pluralidad de cavidades esféricas sustancialmente rellenas de gas biocompatibles después de cavidades esféricas o vacuolas rodeadas por una o más capas de material anfífilo que constan esencialmente de moléculas que comprenden predominantemente fosfolípidos que pueden tener individualmente una carga lenta global.

La etapa (i) puede realizarse, por ejemplo, sometiendo en medio acuosos que contiene lípidos a cualquier técnica de generación de emulsión apropiada, por ejemplo, sonicación, agitación, homogenización de alta presión, agitación de alta velocidad o mezcla de alto acizallamiento, por ejemplo, usando un homogeneizador rotor-stator, en presencia del gas seleccionado. Si se desea, el medio acuoso puede contener aditivos que sirven como potenciadores de la viscosidad y/o como adyuvantes de la solubilidad para el lípido, tales como alcoholes o polioles, por ejemplo, glicerol y/o propilenglicol.

El gas empleados en la etapa de emulsión no necesita ser el deseado en el producto final. De esta manera, la mayoría del contenido de gas puede retirarse durante la etapa de liofilización posterior y el gas residual puede retirarse por evacuación del producto seco, al que después se le puede aplicar una atmósfera del gas del producto final deseado. El gas de emulsión por lo tanto puede seleccionarse simplemente para optimizar los parámetros del proceso de emulsión, sin tener en cuenta las consideraciones del producto final. Se ha descubierto que la emulsión en presencia de fluoruro de azufre, tal como hexafluoruro de azufre o un gas hidrocarburo fluorado tal como perfluoroalcano o perfluorocicloalcano, preferiblemente que contiene 4 ó 5 átomos de carbono, es particularmente ventajosa en términos de producir finalmente productos finales con tamaños de microburbujas constantes y distribuidos de forma estrecha.

La emulsión convenientemente se realiza a aproximadamente la temperatura ambiente, por ejemplo, a aproximadamente 25\pm10ºC. Puede ser necesario calentar inicialmente el medio acuoso para facilitar la hidratación y de esta forma la dispersión del fosfolípido y después dejar que se equilibre a temperatura ambiente.

Las dispersiones producidas de acuerdo con la etapa (i) ventajosamente pueden someterse a una o más etapas de lavado antes del uso del agente de contraste o a la etapa de liofilización (ii), para separar y retirar aditivos tales como potenciadores de la viscosidad y adyuvantes de la solubilidad, así como materiales indeseados tales como partículas coloidales que no contienen gas y microburbujas infradimensionadas y/o sobredimensionadas. Tal lavado puede efectuarse de una manera conocida per se, separándose las microburbujas usando técnicas tales como flotación a centrifugación. La capacidad de retirar aditivos de esta forma y también de obtener dispersiones de microburbujas con una distribución de tamaños particularmente estrecha representa ventajas importantes del proceso de la invención especialmente porque, como se ha indicado anteriormente, la distribución de tamaños resultante se retiene sustancialmente después de la liofilización y reconstitución. Por consiguiente, es particularmente preferido usar un proceso que comprende las etapas de dispersión de gas, lavado/separación, liofilización y reconstitución.

Pueden prepararse dispersiones de microburbujas fraccionadas de tamaños donde al menos un 90% de las microburbujas tienen tamaños dentro de un intervalo de 2 \mum, teniendo preferiblemente las microburbujas un diámetro medio en volumen dentro del intervalo de 2 a 5 \mum.

Cuando se emplean uno o más agentes crioprotectores y/o lioprotectores, estos pueden añadirse ventajosamente después de las etapas de lavado, antes de la liofilización.

La liofilización de la dispersión de gas puede realizarse, por ejemplo, congelando inicialmente y después liofilizando la dispersión de gas congelado, por ejemplo, de una manera conocida generalmente per se. Las microburbujas preferiblemente pueden fraccionarse por tamaños antes de la congelación, teniendo preferiblemente las microburbujas liberadas un diámetro medio en volumen dentro del intervalo de 2-5 \mum. Tales productos pueden almacenarse congelados y descongelarse cuando se desee por ejemplo, por el simple calentamiento y/o por la adición de un vehículo líquido, para regenerar las dispersiones de microburbujas útiles como agentes de contraste de acuerdo con la invención.

Como el producto seco normalmente se reconstituirá de acuerdo con la etapa (III) anterior antes de la administración, la dispersión de gas puede introducirse ventajosamente en viales cerrables herméticamente antes de la liofilización para proporcionar viales que contienen, cada uno, una cantidad apropiada, por ejemplo, una sola unidad de dosificación de producto seco liofilizado para la reconstitución en una forma inyectable. Por medio de la liofilización de la dispersión de gas en viales individuales en lugar de a granel, se evita la manipulación de la estructura de tipo panal delicada del producto liofilizado y el riesgo de degradar al menos parcialmente esta estructura. Después de la liofilización y de cualquier evacuación opcional adicional del gas y la introducción en el espacio superior de gas que se desea que esté presente como microburbujas en el agente de contraste formulado finalmente, los viales pueden cerrarse herméticamente con un cierre apropiado. Se apreciará que la capacidad de seleccionar el contenido de gas del producto final, junto con la capacidad independientemente de controlar el tamaño de las microburbujas del producto final por la selección de parámetros de proceso apropiados durante la etapa de dispersión inicial y cualquier etapa de lavado/separación resultante, se permite la selección independiente del tamaño de las microburbujas y del contenido de gas, permitiendo de esta manera que los productos se puedan emplear en aplicaciones particulares.

En general, la dispersión de gas congelado o el producto seco de la etapa (ii), después de cualquier suplemento necesario y/o deseado o intercambio del contenido de gas, puede reconstituirse por la adición de un vehículo líquido inyectable acuosos estéril apropiado tal como agua sin pirógenos estéril para inyección, una solución acuosa tal como solución salina (que puede equilibrarse ventajosamente de forma que el producto final para la inyección no sea hipotónico) o una solución acuosa de una o más sustancias para ajustar la tonicidad (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente). Cuando el producto seco está contenido en un vial, este convenientemente se sella con un tabique a través del cual el vehículo líquido puede inyectarse usando una jeringa opcionalmente prerrellena, como alternativa, el producto seco y el vehículo líquido pueden suministrarse juntos en un dispositivo de cámara dual tal como una jeringa de cámara dual. Puede ser ventajoso mezclar o agitar suavemente el productos después de la reconstitución. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, en los agentes de contraste estabilizados de acuerdo con la invención, el tamaño de las microburbujas de gas puede ser sustancialmente independiente de la cantidad de energía agitacional aplicada al producto seco reconstituido. Por consiguiente, puede requerirse no más que una agitación suave para proporcionar productos reproducibles con un tamaño de microburbujas constante.

Ciertas dispersiones de gas similares a las obtenibles de acuerdo con la etapa (i) anterior se describen en la solicitud de patente internacional Nº WO-A-9640275 de los presentes solicitantes, como intermedios para uso en la preparación de agentes de contraste de diagnóstico que comprenden microburbujas de gas estabilizadas por uno o más lípidos formadores de membrana reticulados o polimerizados en su porción hidrófila. Se apreciará que, en virtud de que son intermedios, estas dispersiones no se habrá preparado en una forma inyectable (es decir estéril y fisiológicametne aceptable, a diferencia de los agentes de contraste de la presente invención.

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar la invención.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

La Fig. 1 representa un gráfico del porcentaje de supervivencia de concentración de volumen después de la liofilización y reconstitución frente a una cantidad relativa de fosfolípido cargado en las membranas de agentes de contraste de acuerdo con el ejemplo 1;

La Fig. 2 representa gráficos de espectros de atenuación para el intervalo de frecuencia 1,5-8 MHz de agente de contraste de acuerdo con el ejemplo 2 (a) medios a) antes del ensayo de la presión, b) durante el ensayo de la presión y c) después del ensayo de la presión, como se describe en el ejemplo 6;

La Fig. 3 muestra el porcentaje de recuperación en la atenuación a 3,5 MHz de un agente de contraste de acuerdo con el ejemplo 2a después de aplicaciones de 90 segundos de sobrepresiones de 0-300 mm Hg como se describe en el ejemplo 6; y

La Fig. 4 muestra distribuciones de tamaño de volumen para el agente de contraste de acuerdo con el ejemplo 2 (a) medido por análisis de Coulter a) sin la aplicación de sobrepresión (\blacklozenge), b) después de 90 segundos de sobrepresión a 150 mm Hg (\triangle) y c) después de 90 segundos de sobrepresión a 300 mm Hg (\blacksquare) como se describe en el ejemplo 6.

Ejemplo 1 Efectos de cantidades relativas de fosfolípidos cargados

Se obtuvieron dispersiones de microburbujas estabilizadas por diferentes fosfolípidos o mezclas de fosfolípido de acuerdo con el procedimiento general descrito más adelante, usando los parámetros del proceso proporcionados en la Tabla 1.1 presentada a continuación.

Se prepararon ciertas soluciones de los fosfolípidos seleccionados o mezclas de fosfolípidos en agua que contenían un 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p) que proporcionaba una concentración de fosfolípidos de 2-5 mg/ml (para la fosfatidiletanolamina, el agua se ajustó a pH = 10,5 con hidróxido sódico), hidratándose los fosfolípidos por tratamiento ultrasónico y/o calentamiento a aproximadamente 80ºC durante el tiempo indicado (Tabla 1.1) y enfriándose a temperatura ambiente antes del uso. Un volumen dado de esta solución se dividió entre varios viales de cromatografía de 2 ml, usando 0,8-1 ml de solución por vial. El espacio superior de cada vial se rellenó con gas perfluorobutano, y los viales se taparon de forma segura y se agitaron durante 45 segundos usando un Espe CapMix® (mezclador para materiales dentales). Las dispersiones de microburbuja resultantes se transfirieron a un vial de mayor tamaño y se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos, proporcionando un infranadante turbio por debajo de la capa de flotación de las microburbujas. El infranadante se retiro por medio de una jeringa y se reemplazó por un volumen igual de agua a pH neutro. La etapa de lavado se repitió, pero ahora el infranadante se reemplazó por sacarosa al 10% (p/p). Dos porciones de la dispersión lavada se dividieron entre 10 viales de fondo plano de 10 ml diseñados especialmente para la liofilización y los viales se enfriaron a -47ºC y se liofilizaron durante aproximadamente 48 h oras, proporcionando una sustancia sólida esponjosa blanca. Los viales se transfirieron a una cámara de vacío y el aire se retiró por medio de una bomba de vacío y se reemplazó por gas perfluorobutano. Antes del uso, se añadió agua y los viales se agitaron a mano suavemente durante varios segundos, proporcionando dispersiones de microburbujas adecuadas como agentes de contraste de ultrasonido.

La distribución de tamaños y la concentración de volumen de las microburbujas se midió usando un aparato Coulter Counter Mark II equipado con una apertura de 50 \mum con un intervalo de medición de 1-30 \mum. Se diluyeron muestras de 20 \mul en 200 ml de solución salina saturada con aire a temperatura ambiente y se dejaron equilibrar durante 3 minutos antes de la medición. las mediciones se realizaron sobre dispersiones de microburbuja antes de la liofilización (dispersión de burbujas lavadas) y después de la liofilización (reconstituida con agua hasta el mismo volumen que antes de la liofilización). Los datos se presentan en la Tabla 1.2 mostrada a continuación.

La eficacia de la liofilización para las diferentes dispersiones de microburbujas estabilizadas con fosfolípidos se calcularon como el porcentaje de supervivencia de la concentración del volumen después de la liofilización y reconstitución. Un gráfico (véase la Fig. 1 de los dibujos) muestra cómo varía este parámetro con la cantidad relativa de fosfolípido cargado en la membrana. Como puede verse, la eficacia de la liofilización aumenta al aumentar la cantidad de fosfolípido cargado en la membrana, siendo la máxima para membranas que contienen sólo fosfolípidos cargados.

TABLA 1.1

Composición y parámetros de proceso usados en la producción de
dispersiones de burbujas de gas de perfluoro-n-butano estabilizadas con
fosfolípidos como se describe en el Ejemplo 1
PLs y	Cantidad	Cantidad	Baño de	Tratamiento	Tamaño	Vol por
relaciones	de PL	de	sonicación	término	del Lote	vial [ml]
(en peso)	[mg/ml]	disolvente	[min]	[min]	[ml]
		acuoso
		[ml]
DPPE	20	10	-	30	10	0,8
H-PC/H-	45,5	9,1	10	2	9	0,9
PS (9:1)
H-PC/H-	14,0	7	10	2	7	1
PS (4:1)
DSPC/DS	10,4	5,2	10	2	4	1
PS (4:1)
DSPC/DS	15,2	7,6	10	2	7	1
PG (1:1)
DPPS	24,9	12,5	-	30	11	1
DSPS	24,8	12,5	-	30	11	1
DSPG/DP	20,2	10	-	10	10	0,8
PA (10:1)
DSPG/DP	52,0	10,4	-	10	8	0,8
PA (10:1)
Leyendas:
PL = fosfolípidos
DPPE = dipalmitoilfosfatidiletanolamina
H-PC = fosfatidilcolina de huevo hidrogenada
H-PS = fosfatidilserina de huevo hidrogenada
DSPC = diestearoilfosfatidilcolina
DSPS = diestearoilfosfatidilserina
DSPG = diesteroilfosfatidilglicerol
DPPS = dipalmitoilfosfatidilserina
DPPA = ácido dipalmitoilfosfatídico.

TABLA 1.2

Rendimiento medido como concentración en volumen de burbujas (en
porcentaje del volumen de dispersión total) (i) después de lavar la dispersión y
(ii) después de la liofilización y reconstitución
PLs y	% de lípido	Conc. vol. (%)	Conc. vol. (%)	Cantidad de
relaciones	cargado en la	antes de la	después de la	liofilización
(en peso)	membrana	liofilización	liofilización	superviviente
				[% de conc.
				vol. inicial]
DPPE	0	0,7	0,1	16,4
H-PC/H-PS	10	6,4	0,9	14,1
(9:1)
H-PC/H-PS	20	1,0	0,2	20,0
(4:1)
DSPC/DSPS	20	4,8	1,0	20,8
(4:1)
DSPC/DSPG	50	0,3	0,1	33,3
(1:1)
DPPS	100	0,7	0,4	57,1
DSPS	100	1,0	0,5	50,0
DSPG/DPPA	100	1,4	0,7	52,9
(10:1)
DSPG/DPPA	100	4,3	1,8	41,9
(1:1)
Leyenda: Véase Tabla 1.1

Ejemplo 2 a)Preparación de dispersiones de burbujas de perfluorobutano por agitación

Se añadieron 25,3 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 12,5 ml de agua que contenía un 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p). El material de fosfolípido se hidrató por calentamiento a 70ºC durante aproximadamente 30 minutos, seguido por refrigeración a temperatura ambiente. 11 ml de la dispersión se dividieron en porciones de 1 ml entre once viales de 2 ml, y el espacio superior de los viales se rellenó con gas perfluoro-n-butano. Los viales se taparon de forma segura y se agitaron durante 45 segundos usando un Espe CapMix® (mezclador para materiales dentales). Las dispersiones de microburbujas resultantes se combinaron en cuatro viales mayores y se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos, proporcionando un infranadante turbio por debajo de una capa de flotación de microburbujas. El infranadante se retiró por medio de una jeringa y se reemplazó con un volumen igual de agua a pH neutro. Se repitió la etapa de lavado, pero ahora el infranadante se reemplazó por sacarosa al 10% (p/p). Se dividieron porciones de 2 ml de la dispersión resultante entre viales de fondo plano de 10 ml diseñados especialmente para la liofilización, y los viales se enfriaron a -47ºC y se liofilizaron durante aproximadamente 48 horas, proporcionando una sustancia sólida esponjosa blanca. Los viales se transfirieron a una cámara de vacío y el aire se retiró por medio de una bomba de vacío y se reemplazó por gas perfluoro-n-butano. Antes del uso, se añadió agua y los viales se agitaron manualmente de forma suave durante varios segundos, proporcionando dispersiones de microburbujas adecuadas como agentes de contraste de ultrasonidos.

b)Preparación de dispersiones de microburbujas de perfluorobutano por mezcla en un rotor estator

Se añadieron 500,4 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 100 ml de agua que contenía un 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p). La mezcla se agitó y se calentó a 80ºC durante 5 minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente, se agitó de nuevo y se dejó en reposo durante una noche antes del uso.

50 ml de la solución resultante se transfirieron a un matraz de fondo redondo con un cuello cónico. El matraz se equipó con una camisa de vidrio que tenía una entrada y salida de control de la temperatura conectadas a un baño de agua mantenido a 25ºC. En la solución se introdujo un eje de mezcla rotor-estator y para evitar la salida de gas el espacio entre la pared del cuello y el eje de mezcla se selló con un tapón de metal diseñado especialmente equipado con una conexión de entrada/salida de gas para el ajuste del gas y el control de la presión. La salida de gas se conectó a una bomba de vacío y la solución se desgasificó durante un minuto. Después se aplicó una atmósfera de gas perfluoro-n-butano a través de la entrada de gas.

La solución se homogeneizó a 23000 rpm durante 10 minutos, manteniendo el eje de mezcla del rotor-estator de tal forma que las aberturas estuvieran ligeramente por encima de la superficie del líquido. Se obtuvo una dispersión cremosa de color blanco, que se transfirió a un recipiente cerrado herméticamente y se lavó abundantemente con perfluoro-n-butano. La dispersión después se transfirió a un embudo de separación y se centrifugó a 12000 rpm durante 30 minutos, produciendo una capa cremosa de burbujas en la parte superior y un infranadante turbio. El infranadante se retiró y se reemplazo con agua. Después, la centrifugación se repitió dos veces, pero ahora a 12000 rpm durante 15 minutos. Después de la última centrifugación, el sobrenadante se reemplazó por sacarosa al 10% (p/p). Se dividieron porciones de 2 ml de la dispersión resultante entre viales de fondo plano de 10 ml diseñados especialmente para la liofilización, y los viales se enfriaron a -47ºC y se liofilizaron durante aproximadamente 48 horas, proporcionando una sustancia sólida esponjosa blanca. Los viales después se transfirieron a una cámara de vacío, y el aire se retiró por una bomba de vacío y se reemplazo por gas perfluoro-n-butano. Antes del uso, se añadió agua y los viales se agitaron manualmente durante varios segundos, proporcionando dispersiones de microburbujas adecuadas como agentes de contraste de ultrasonidos.

c)Preparación de dispersiones de microburbujas de perfluorobutano por sonicación

Se añadieron 500,4 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 100 ml de agua que contenía 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (3:10 p/p). La mezcla se agitó y se calentó a 80ºC durante cinco minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente, se agitó de nuevo y se dejó en reposo durante una noche antes del uso.

Esta solución se bombeó a través de una celda de flujo de un sonicador de 4 ml y se expuso a ultrasonidos a 20kHz con una amplitud de 90 \mum. El diámetro del cuerno del sonicador fue de 1,3 cm, el diámetro interno de la célula fue de 2,1 cm y la distancia entre el cuerno y el fondo de la célula fue de 1 cm. La solución de lípidos se mezcló con perfluoro-n-butano a una relación de 1:1 v/v antes de que entrara en la célula del sonicador (20 ml/min de solución de lípido y 40 ml/min de gas perfluoro-n-butano). La temperatura se mantuvo a 33ºC. Se obtuvo una dispersión cremosa y blanca que se introdujo en un recipiente y se lavó abundantemente con perfluoro-n-butano.

Caracterización

La distribución de tamaño y la concentración del volumen de las microburbujas se midieron usando un aparato Coulter Counter Mark II equipado con una apertura de 50 \mul y un intervalo de medición de 1-30 \mum. Se diluyeron muestras de 20 \mul en 200 ml de solución salina saturada con aire a temperatura ambiente, y se dejaron equilibrar durante 3 minutos antes de la medición.

La caracterización de ultrasonidos se realizo en una preparación experimental ligeramente modificada a partir de la de Jong, N. y Hoff, L. como se describe en ``Ultrasound scattering properties of Albunex microspheres'', Ultrasonics 31 (3), págs. 175-181 (1993). La instrumentación mide la eficacia de la atenuación de ultrasonidos en el intervalo de frecuencia de 2-8 MHz de una suspensión diluida de agente de contraste. Durante la medición de la atenuación, se realizó un ensayo de estabilidad de presión exponiendo la muestra a una sobrepresión de 120 mm Hg durante 90 segundos. Típicamente, se diluyeron 2-3 \mul de muestra en 55 ml de Isoton II y la suspensión de muestra diluida se agitó durante 3 minutos antes del análisis. Como parámetro de respuesta primaria se usó la atenuación a 3,5 MHz, junto con el valor de atenuación de recuperación a 3,5 MHz después de la liberación de la sobrepresion.

TABLA 2.1

Características in vitro de dispersiones de burbujas producidas de acuerdo con
el Ejemplo 2(a)-(c) (concentraciones ponderadas con respecto al número y al
volumen y diámetros medios de volumen, así como propiedades acústicas
medidas de acuerdo con la descripción anterior)
Métodos	Conc.	Conc.	Diámetro	Atenuación	Supervivencia	Frec. a la
de	en	en	medio en	a 3,5 MHz	después de la	atenuación
Producción	número	Vol.	Vol. [\mum]	[dB/cm]	sobrepresión	máx.
(Ejemplo Nº)	[10^{6}/ml]	[%]			[%]	[MHz]
2(a)	1519	1,45	3,91	30,46	100	4,1
2(b)	10518	6,51	3,16	150,4	96	4,3
2(c)	23389	9,57	3,83	117	100	3,5

Ejemplo 3 Efectos del intercambio de gas

Los contenidos de gas de cinco muestras preparadas de acuerdo con el Ejemplo 2(b) anterior se reemplazaron con aire, perfluorobutano, hexafluoruro de azufre, pentafluoruro de trifluorometilazufre y tetrametilsilano respectivamente, de acuerdo con el siguiente procedimiento:

Dos muestras que contenían producto liofilizado del Ejemplo 2(b) se pusieron en un desecador que tenía una entrada de gas y una salida de gas. El desecador se conectó a un controlador de vacío/destilador Buchi 168 que permitió la evacuación controlada de las muestras y la entrada de un gas seleccionado. Las muestras se vaciaron a aproximadamente 10 mbar durante 5 minutos, después de lo cual la presión se aumentó a la atmosférica por la entrada del gas seleccionado, seguido de un tapado cuidadoso de los viales. El procedimiento se repitió usando pares adicionales de muestras para cada uno de los gases seleccionados.

Se añadieron 2 ml de agua destilada a cada vial y los viales se agitaron manualmente de forma suave antes del uso. Las dispersiones de microburbujas resultantes se caracterizaron con respecto a las mediciones de distribución de tamaño como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados se resumen en la Tabla 3.1.

TABLA 3.1

Características in vitro de dispersiones de microburbujas estabilizadas con
fosfatidilserina producidas de acuerdo con el Ejemplo 3 - concentraciones
ponderadas con respecto al número y al volumen y diámetros medios en volumen
Gas	conc. Número	Diám. medio	Conc. Vol.	Diámetro
	[10^{6}/ml]	Número [\mum]	[%]	medio vol. [\mum]
Perfluorobutano	9756	1,8	4,9	5,8
pentafluoro de	10243	1,9	5,9	3,5
trifluorometilazufre
Hexafluoruro de	9927	1,9	5,7	3,2
azufre
Tetrametilsilano	9947	1,9	6,1	3,7
Aire	9909	1,9	6,4	4,0

Como se verá por los resultados anteriores, no hubo cambios significativos en la distribución de tamaños tras el intercambio de gases.

Resultados in vivo

Un lote preparado con cada uno de los cinco gases se evaluó in vivo con respecto a las propiedades de potenciación Doppler a 10 MHz. Las dispersiones se inyectaron en conejos chinchilla a través de una vena de la oreja y se midieron usando una técnica Doppler donde se puso una sonda de ultrasonidos directamente en la arteria carótida. Las intensidades y la duración de las señales se registraron y se calculó la integral de la curva Doppler. Los resultados obtenidos (véase la Tabla 3.2 mostrada a continuación) demostraron que las microburbujas que contenían perfluorobutano proporcionaron la mayor potenciación de intensidad Doppler. Las microburbujas que contenían hexafluoruro de azufre, pentafluoruro de trifluorometilazufre o tetrametilsilano sólo fueron ligeramente menos eficaces como potenciadores Doppler que las que contenían perfluorobutano, dando integrales en el intervalo del 60-80% de la cifra para el perfluorobutano.

TABLA 3.2

Resultados para inyecciones i.v. de productos del Ejemplo 3 en ratones (los
valores se ajustan para llevarlos a la línea basal; la unidad Doppler se define
como el aumento de la señal Doppler con respecto a la de la sangre)
Gas	Potenciación Doppler Arterial
	Integrada (NDU.s)
Perfluorobutano^{*}	10361
Pentafluoruro de trifluorometilazufre	8006
Tetrametilsilano	6370
Hexafluoruro de azufre	6297
Aire	1024

*Promedio de dos inyecciones.

Ejemplo 4 Dispersiones congeladas y productos liofilizados

Se añadieron 250 mg de fosfatidilserina de huevo hidrogenada a 50 ml de agua para inyección que contenía un 5,4% (p/p) de una mezcla de propilenglicol y glicerol (7:20 p/p). La mezcla se agitó y se calentó a 80ºC durante cinco minutos, se dejó enfriar a temperatura ambiente, se agitó de nuevo y se dejó en reposo durante una noche antes del uso.

Se transfirieron 100 ml de la solución resultante a un matraz de fondo redondo con un cuello cónico y se procesaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2(b). Se formó una dispersión cremosa de color blanco. Esta dispersión se transfirió a un embudo de separación y se centrifugó a 12000 rpm durante 30 minutos, produciendo una capa cremosa de microburbujas en la parte superior y un infranadante turbio. El infranadante se retiró y se reemplazó con 50 ml de agua para inyección. Después, la centrifugación se repitió dos veces, pero ahora a 12000 rpm durante 15 minutos. A 6 ml de la dispersión resultante se le añadieron 6 ml de trehalosa al 30% (p/p); porciones de 2 ml de esta dispersión después se dividieron entre viales de fondo plano de 10 ml diseñados especialmente para la liofilización, y los viales se enfriaron a -47ºC y se almacenaron a esta temperatura durante un día.

La mitad de los viales se descongelaron después de un día a -47ºC, proporcionando dispersiones blancas cremosas homogéneas de microburbujas de gas adecuadas como agentes de contraste de ultrasonidos. Las dispersiones descongelaran se caracterizaron midiendo la distribución de tamaños como se describe en el Ejemplo 2 anterior (véase la Tabla 4.1). Los demás viales se liofilizaron durante aproximadamente 48 horas, proporcionando una sustancia sólida esponjosa blanca. Los viales se transfirieron a una cámara de vacío y el aire se retiró por una bomba de vacío y se reemplazó por gas perfluoro-n-butano. Antes del uso, se añadió agua y los viales se agitaron manualmente de forma suave durante varios segundos, proporcionando dispersiones de burbujas adecuadas como agentes de contraste de ultrasonidos. Los productos reconstituidos se caracterizaron midiendo la distribución de tamaños y la atenuación acústica usando los métodos descritos en el Ejemplo 2 anterior. Los resultados se presentan en la Tabla 4.1.

TABLA 4.1

Concentración de burbujas, datos de tamaño y datos acústicos de dispersiones
de burbujas de gas de perfluoro-n-butano estabilizadas por fosfatidilserina
hidrogenada, tratadas por congelación – descongelación y liofilización
Tratamiento	Conc.	Conc.	Diámetro	Atenuación	Supervivencia	Frecuencia
de muestra	en	en	medio	a 3,5 Mhz	después de	a la
	Número.	vol.	en vol.	[dB/cm]	un exceso de	atenuación
	[10^{6}/ml]	[%]	[\mum]		presión [%]	máx.
						[MHz]
Lavada	10390	10,4	3,8	n.a.	n.a.	n.a.
Congelada-	10142	9.9	3,6	n.a.	n.a.	n.a.
descongelada
Liofilizada	7780	4,6	3,1	58,0	89	5,3
Leyenda:
n.a. = no analizado

Ejemplo 5 Exposición de dispersión de microburbujas de perfluorobutano a fluido saturado con aire

Se preparó un vial que contenía material liofilizado bajo una atmósfera de perfluorobutano como se describe en el Ejemplo 2(b). Se añadió agua al vial justa antes del uso para proporcionar una dispersión de microburbujas.

Se expusieron 200 ml de fluido Isoton II al aire durante varios días a temperatura ambiente para proporcionar una solución completamente saturada con aire. Otros 200 ml del fluido se desgasificaron en un matraz de vacío a 60ºC durante una hora y se enfriaron a temperatura ambiente mientras se mantenía el vacío. Se admitió aire en el matraz inmediatamente antes del uso.

Se añadieron porciones de 10 \mul de la suspensión de microburbujas a cada uno de los fluidos y las mezclas resultante se incubaron durante 5 minutos antes de la caracterización del tamaño (Coulter Multisizer Mark II).

En el medio desgasificado, donde no se esperaría la difusión de gases desde el fluido a las microburbujas, el diámetro medio de las microburbujas fue de 1,77 \mum y el 0,25% de las microburbujas eran mayores de 5 \mum. En el fluido saturado con aire, los valores correspondientes fueron 2,43 \mum y 0,67%; las mediciones repetidas realizadas después de 5 minutos más indicaron que los tamaños de las microburbujas habían alcanzado un valor estable.

Estos hallazgos demuestran que el diámetro medio de las microburbujas aumentó sólo en un 37% cuando se expusieron a un fluido saturado al aire análogo a la sangre arterial, alcanzando muy pocas burbujas un tamaño que pudiera causar el bloqueo de los vasos sanguíneos de los capilares sanguíneos. Esto puede contrastarse con la duplicación del tamaño de las microburbujas que contienen aire/perfluorohexano en un medio similar (es decir, una dispersión muy diluida de microburbujas en agua que contiene aire disuelto) presentada en el Ejemplo II del documento WO-A-9503835.

Ejemplo 6 Estabilidad de presión de dispersión de microburbujas de perfluorobutano

Se prepararon viales que contenían material liofilizado bajo una atmósfera de perfluorobutano como se describe en el Ejemplo 2(a). Se añadió agua (2 ml) a los viales justo antes del uso para proporcionar dispersiones de microburbujas.

Se registraron los espectros de atenuación para 1,5-8 MHz antes, durante y después de la aplicación de un exceso de presión de aire a 300 mm Hg; la presión se liberó después de 90 segundos. Los resultados se muestran en la Fig. 2 de los dibujos, e indican que aunque la atenuación a 4 MHz (el pico para el agente de contraste no presurizado) se redujo a menos de un tercio bajo presión, se restauró casi completamente (85%-95%) cuando se liberó la presión.

Se aplicaron sobrepresiones de aire de hasta 300 mm Hg durante 90 segundos de duración y la atenuación se midió a 3,5 MHz. Los resultados se muestran en la Fig. 3 de los dibujos e indican una buena recuperación de la atenuación (al menos aproximadamente 95%) después de la liberación de presión para todas las sobrepresiones usadas.

Las distribuciones de tamaño se determinaron por análisis Coulter para una muestra no presurizada y para muestras sometidas a sobrepresiones de aire a 150 y 300 mm Hg aplicadas durante 90 segundos. Los resultados se muestran en la Fig. 4 de los dibujos e indican que no hubo diferencias significativas entre las curvas de distribución en el intervalo de 1-10 \mum.

Claims

1. Un agente de contraste para uso en estudios de diagnóstico, que comprende una dispersión en un vehículo líquido acuoso inyectable de microburbujas de gas biocompatible estabilizadas por un material anfífilo que consta esencialmente de moléculas que comprenden predominantemente fosfolípidos que tienen individualmente una carga global.

2. Un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 1, donde al menos el 75% del fosfolípido consta de moléculas que tienen individualmente una carga negativa neta global.

3. Un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde una o más fosfatidilserinas constituyen al menos un 70% del fosfolípido.

4. Un agente de contraste de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el gas comprende hexafluoruro de azufre o un hicrocarburo perfluorado, que contiene hasta 7 átomos de carbono.

5. Un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 4, donde el gas es perfluorobutano.

6. Un proceso para la preparación de un agente de contraste de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho proceso las etapas de:

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6, donde una o más fosfatidilserinas constituyen al menos 3l 70% del fosfolípido.

8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, donde el gas empleado en la etapa (i)es hexafluoruro de azufre o un hidrocarburo perfluorado, que contiene hasta 7 átomos de carbono.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, donde el gas es perfluorobutano.

10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde el medio acuoso empleado en la etapa (i) contiene además uno o más aditivos seleccionados entre alcoholes y polioles.

11. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde, antes de la etapa (ii), la dispersión de microburbujas de gas formadas en la etapa (i) se lava y las microburbujas se fraccionan por tamaños.

12. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-11, donde el crioprotector y/o lioprotector es un azúcar tolerado fisiológicamente.

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, donde el crioprotector y/o lioprotector es sacarosa.

14. Una matriz de liberación de microburbujas liofilizadas que comprende un material estructural de matriz que contiene una pluralidad de cavidades esféricas o vacuolas sustancialmente rellenas de gas biocompatibles rodeadas por una o más capas de material anfífilo que consta esencialmente de moléculas que comprenden predominantemente fosfolípidos que tienen individualmente una carga neta global.

15. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 14, donde el material estructural de la matriz es un carbohidrato.

16. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, donde al menos el 75% del fosfolípido consta de moléculas que tienen individualmente una carga negativa neta global.

17. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 16, donde una o más fosfatidilserinas constituyen al menos un 70% del fosfolípido.

18. Una matriz de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde el gas comprende hexafluoruro de azufre o un hidrocarburo perfluorado, que contiene hasta 7 átomos de carbono.

19. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 18, donde el gas es perfluorobutano.

20. Una composición de agente de contraste de ultrasonidos que comprende, como primer componente, una matriz de acuerdo con la reivindicación 17, donde el material de matriz es sacarosa y el gas es perfluorobutano, y como segundo componente un vehículo líquido acuoso inyectable, estando contenidos dichos primer y segundo componente respectivamente dentro de una primera y segunda cámaras de medios de almacenamiento de cámaras dobles.