ES2506142T3 - Péptidos de unión a KDR y a VEGF/KDR y su uso en diagnóstico - Google Patents

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Karen E. Linder
Edmund R. Marinelli
Palaniappa Nanjappan
Adrian D. Nunn
Radhakrishna K. Pillai
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Kondareddiar Ramalingam
Ajay Shrivastava
Bo Song
Rolf E. Swenson
Mathew A. Von Wronski
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Abstract

Un compuesto que comprende un macador óptico conjugado directamente o por mediación de un engarce o un espaciador con al menos un polipéptido que tiene la capacidad de unirse a KDR o a complejo VEGF/KDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: AGDSWCSTEYTYCEMIGTGGGK (SEC ID N.º: 4), AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK (SEC ID N.º: 5), AGVWECAKTFPFCHWFGTGGGK (SEC ID N.º: 6), AGWVECWWKSGQCYEFGTGGGK (SEC ID N.º: 7), AGWIQCNSITGHCTSGGTGGGK (SEC ID N.º: 8), AGWIECYHPDGICYHFGTGGGK (SEC ID N.º: 9), AGSDWCRVDWYYCWLMGTGGGK (SEC ID N.º: 10), AGANWCEEDWYYCFITGTGGGK (SEC ID N.º: 11), AGANWCEEDWYYCWITGTGGGK (SEC ID N.º: 12), AGPDWCEEDWYYCWITGTGGGK (SEC ID N.º: 13), AGSNWCEEDWYYCYITGTGGGK (SEC ID N.º: 14), AGPDWCAADWYYCYITGTGGGK (SEC ID N.º: 15), AGPEWCEVDWYYCWLLGTGGGK (SEC ID N.º: 16), AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17), AGSKWCEQDWYYCWLLGTGGGK (SEC ID N.º: 18), AGRNWCEEDWYYCFITGTGGGK (SEC ID N.º: 19), AGVNWCEEDWYYCWITGTGGGK (SEC ID N.º: 20), AGANWCEEDWYYCYITGTGGGK (SEC ID N.º: 21), AGQAWVECYAETGYCWPRSWGTGGGK (SEC ID N.º: 22), AGQAWIECYAEDGYCWPRSWGTGGGK (SEC ID N.º: 23), AGVGWVECYQSTGFCYHSRDGTGGGK (SEC ID N.º: 24), AGDWWVECRVGTGLCYRYDTGTGGGK (SEC ID N.º: 25), AGDSWVECDAQTGFCYSFLYGTGGGK (SEC ID N.º: 26), AGERWVECRAETGFCYTWVSGTGGGK (SEC ID N.º: 27), AGGGWVECRAETGHCQEYRLGTGGGK (SEC ID N.º: 28), AGVAWVECYQTTGKCYTFRGGTGGGK (SEC ID N.º: 29), AGEGWVECFANTGACFTYPRGTGGGK (SEC ID N.º: 30), GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31), GDDSYCMMNEKGWWNCYLYDPGGGK (SEC ID N.º: 32), GDPAQCWESNYQGIFFCDNPDPGGGK (SEC ID N.º: 33),

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos de unión a KDR y a VEGF/KDR y su uso en diagnóstico
Antecedentes de la invención 5
En el embrión en desarrollo, la principal red vascular se establece mediante diferenciación in situ de las células mesodérmicas en un proceso que se denomina vasculogénesis. No obstante, tras la vasculogénesis embrionaria se cree que toda la posterior generación de nuevos vasos sanguíneos, en el embrión o en adultos, está dirigida por el brote o nacimiento de nuevos capilares en la vasculatura preexistente en un proceso denominado angiogénesis 10 (Pepper, M. y col., 1996. Enzyme Protein, 49: 138-162; Risau, W., 1997. Nature, 386: 671-674). La angiogénesis no solo está implicada en el desarrollo embrionario y el crecimiento y reparación normal de los tejidos, también está implicada en el ciclo reproductor femenino, establecimiento y mantenimiento del embarazo y en la reparación de heridas y fracturas. Además de la angiogénesis que tiene lugar en el individuo normal, los acontecimientos angiogénicos están implicados en una serie de procesos patológicos, principalmente crecimiento y metástasis 15 tumoral y otras afecciones en la que aumenta la proliferación de vasos sanguíneos, tales como retinopatía diabética, psoriasis y artropatías. La angiogénesis es tan importante en la transición de un tumor desde crecimiento hiperplásico a neoplásico, que la inhibición de la angiogénesis se ha convertido en una terapia activa contra el cáncer (Kim, K. y col., 1993. Nature, 362: 841-844).
20
Se piensa que la angiogénesis inducida por tumores depende de la producción de factores de crecimiento proangiogénicos por las células tumorales, que superan otras fuerzas que tienden a mantener a los vasos existentes quiescentes y estables ((Hanahan, D. y Folkman, J., 1996. Cell, 86: 353-364). El mejor caracterizado de estos agentes proangiogénicos es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Neufeld, G. y col., 1999. FASEB J., 13: 9-22). 25
El VEGF se produce de forma natural en varios tipos de células en respuesta a hipoxia y algunos otros estímulos. Muchos tumores también producen grandes cantidades de VEGF y/o inducen a las células estromales cercanas para que fabriquen VEGF (Fukumura, D. y col., 1998. Cell, 94: 715-725). El VEGF, también denominado VEGF-A, se sintetiza como cinco diferentes isoformas de corte y empalme de 121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos. El 30 VEGF121 y el VEGF165 son las formas principales producidas, particularmente en tumores (véase Neufeld, G. y col., 1999, ant.). El VEGF121 carece de un dominio básico codificado por los exones 6 y 7 del gen de VEGF y no se une a la heparina o a la matriz extracelular, al contrario que el VEGF165.
Los miembros de la familia del VEGF actúan principalmente uniéndose a las tirosina cinasas receptoras. En general, 35 las tirosina cinasas receptoras son glicoproteínas que tienen un dominio extracelular capaz de unirse a uno o más factores de crecimiento específicos, un dominio transmembrana (normalmente una hélice alfa), un dominio yuxtamembranal (en el que el receptor puede estar regulado mediante, por ejemplo, fosforilación), un dominio tirosina cinasa (el componente catalítico del receptor) y una cola carboxiterminal, que en muchos receptores, está implicada en el reconocimiento y unión de los sustratos por la tirosina cinasa. Existen tres tirosina cinasas receptoras 40 específicas de las células endoteliales que se sabe que se unen al VEGF: VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR o Flk-1) y VEGFR-3 (Flt4). Flt-1 y KDR se han identificado como los principales receptores de VEGF de alta afinidad. Aunque Flt-1 tiene una mayor afinidad por VEGF, KDR muestra una expresión más abundante en las células endoteliales (Bikfalvi, A. y col., 1991. J. Cell. Physiol., 149: 50-59). Además, se piensa que el KDR domina la respuesta angiogénica y por tanto, es de mayor interés terapéutico y diagnóstico (véase Neufeld, G. y col., 1999, ant.). La 45 expresión de KDR está muy regulada por incremento en los vasos angiogénicos, especialmente en tumores que inducen una fuerte respuesta angiogénica (Veikkola, T. y col., 2000. Cancer Res., 60: 203-212).
El documento WO 99/58162 divulga agentes de contraste para ultrasonidos que se unen a KDR que comprenden un péptido cíclico. Por tanto, estos ligandos son estructuralmente diferentes de los de la presente invención. 50
KDR está formado por 1336 aminoácidos en su forma madura. Debido a la glucosilación, migra en un gel de SDS-PAGE con un peso molecular aparente de aproximadamente 205 kDa. KDR contiene siete dominios de tipo inmunoglobulina en su dominio extracelular, de los que los primeros tres son los más importantes en la unión a VEGF (Neufeld, G. y col., 1999, ant.). El propio VEGF es un dímero de omh capaz de unirse a dos moléculas de 55 KDR de forma simultánea. El resultado es que dos moléculas de KDR se han dimerizado tras la unión y se autofosforilan, convirtiéndose en mucho más activas. El incremento de la actividad cinasa a su vez inicia una vía de señalización que media en los efectos biológicos específicos de KDR del VEGF.
A partir de lo anterior, se puede ver que la actividad de unión a VEGF de KDR in vivo no solo es crítica para la 60 angiogénesis sino que la capacidad para detectar regulación por aumento de KDR sobre las células endoteliales o para detectar complejos de unión VEGF/KDR sería extremadamente beneficiosa en la detección o monitorización de la angiogénesis, con particulares aplicaciones diagnósticas tales como detectar el crecimiento de un tumor maligno. También sería beneficioso en aplicaciones terapéuticas, tales como agentes tumoricidas dirigidos o inhibidores de la angiogénesis en un sitio tumoral o dirigiendo KDR, VEGF/KDR, o agonistas de la angiogénesis a un sitio deseado. 65
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto que comprende un marcador óptico de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas útil para detectar y dirigir a receptores primarios sobre las células endoteliales para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), es decir, el receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular 5 (VEGFR-2, también conocido como región del dominio cinasa (KDR) y cinasa 1 hepática fetal (Flk1)) y para obtener imágenes de complejos formados por VEGF y KDR. La implicación de VEGF y KDR en la angiogéneis hace de los polipéptidos de unión VEGF/KDR y KDR de la presente invención particularmente útiles para la obtención de imágenes de importantes sitios de la angiogénesis, por ejemplo tumores neoplásicos.
10
Se ha descubierto un grupo de polipéptidos que se unen a KDR o al complejo VEGF/KDR (en el presente documento denominados "polipéptidos de unión a KDR" o "restos de unión a KDR" y homólogos de los mismos). Tales polipéptidos de unión a KDR y VEGF/KDR se concentrarán en los sitios de angiogénesis, de modo que proporcionan un medio para detectar y obtener imágenes de sitios de angiogénesis activa, que pueden incluir sitios de crecimiento de tumores neoplásicos. Tales polipéptidos de unión a KDR y VEGF/KDR proporcionan nuevos 15 productos terapéuticos para inhibir o estimular, por ejemplo, la angiogénesis. La preparación, uso y rastreo de dichos polipéptidos, por ejemplo como agentes de formación de imágenes o como parejas de fusión para productos terapéuticos de guiado a KDR o a VEGF/KDR se describen con detalle en el presente documento.
En respuesta a la necesidad de materiales y métodos mejorados para detectar, localizar, medir y posiblemente, 20 inhibir afectando, por ejemplo, angiogénesis, los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente siete familias de polipéptidos que no se dan en la naturaleza que se unen específicamente a KDR o al complejo VEGF/KDR. El marcaje adecuado de dichos polipéptidos proporciona agentes de formación de imágenes detectables que se pueden unir a, por ejemplo, una concentración elevada, a células endoteliales que expresan KDR o células que exhiben complejos de VEGF/KDR, proporcionando agentes formación de imágenes 25 específicos de la angiogénesis. Los polipéptidos de unión a KDR y VEGF/KDR de la presente invención pueden usarse así en la detección y diagnóstico de dichos trastornos relacionados con la angiogénesis. La conjugación o fusión de dichos polipéptidos con agentes eficaces tales como inhibidores de VEGF o agentes tumoricidas también se pueden usar para tratar tumores patogénicos, causando, por ejemplo, el conjugado o fusión para “guiar” al sitio de la angiogénesis activa, proporcionando de este modo un medio eficaz para tratar afecciones patogénicas 30 asociadas con la angiogénesis.
Esta invención pertenece a al menos un polipéptido de unión a KDR y a VEGF/KDR, que comprende un marcador óptico conjugado directamente o por mediación de un engarce o un espaciador a dicho al menos un polipéptido, e incluye el uso de un único polipéptido de unión como monómero o en una construcción multimérica o polimérica, así 35 como el uso de más de un polipéptido de unión de la invención en construcciones multiméricas o poliméricas. Los polipéptidos de unión de acuerdo con la presente invención son útiles en cualquier aplicación en la que la unión, detección o aislamiento de KDR o complejo VEGF/KDR, o fragmentos de los mismos que conservan el sitio de unión al polipéptido, es ventajosa. Un uso particularmente ventajoso de los polipéptidos de unión divulgados en el presente documento está en un método de obtención de imágenes de la angiogénesis in vivo. El método abarca el uso de 40 polipéptidos de unión específica de acuerdo con la invención para detectar un sitio de angiogénesis, donde los polipéptidos de unión se han marcado de forma detectable para usar como agentes de formación de imágenes, incluyendo agentes de formación de imágenes ópticos.
Otro uso ventajoso de los polipéptidos de unión a KDR y a los complejos VEGF/KDR divulgados en el presente 45 documento es dirigir los agentes terapéuticos (incluidos compuestos capaces de proporcionar un efecto terapéutico, radioterapéutico o citotóxico) o vehículos de liberación para productos terapéuticos (incluidos fármacos, material genético, etc.) a sitios de la angiogénesis u otro tejido que expresa KDR.
Las construcciones que comprenden dos o más polipéptidos de unión a KDR y a los complejos VEGF/KDR 50 muestran capacidad mejorada para unirse a la molécula diana en comparación con los correspondientes polipéptidos de unión monoméricos. Por ejemplo, como se muestra en el experimento 5, las construcciones tetraméricas de los polipéptidos de unión a KDR proporcionados en el presente documento mostraron mejor capacidad para unirse a células 293H transfectadas con KDR. La combinación de dos o más polipéptidos de unión en una sola construcción molecular parece mejorar la avidez de la construcción sobre los polipéptidos de unión 55 monoméricos como se muestra mediante una disminución de la KD.
Además, como se ha demostrado en el presente documento, se fabricaron construcciones que comprenden dos o más polipéptidos de unión específicos por epítopos diferentes de KDR y/o KDR/VEGF (p. ej., construcciones “heteroméricas” o “heteromultiméricas”, véase la solicitud de EE.UU. número 60/440.201 publicada como documento 60 US 2004018974). Cabe esperar que las construcciones que comprenden dos o más polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento bloqueen múltiples sitios en KDR o VEGF/KDR. Las construcciones heterodiméricas muestran una capacidad de unión superior a la de ambos monómeros correspondientes, así como las construcciones multiméricas que comprenden múltiples copias del mismo polipéptido de unión. Además, las construcciones heterodiméricas que comprenden dos o más péptidos de unión específicos de diferentes epítopos, 65 junto con un péptido control, también pudieron unirse con eficacia a las células 293H transfectadas con KDR. Por
tanto, la inclusión de dos o más polipéptidos de unión que reconocen diferentes epítopos mejora además la avidez de la construcción por la molécula diana, como se demuestra mediante una disminución de la KD.
Por tanto, la presente invención está dirigida a construcciones que comprenden dos o más polipéptidos de unión. En una realización, las construcciones multiméricas comprenden dos o más copias de un único polipéptido de unión. En 5 otra realización, las construcciones multiméricas de la presente invención comprenden dos o más polipéptidos de unión, de modo que al menos dos de los polipéptidos de unión en la construcción son específicos para diferentes epítopos de KDR y/o KDR/VEGF. Estas construcciones también se denominan en el presente documento “construcciones heterodiméricas”, “heteromultímeros”, etc. Las construcciones de la presente invención también pueden incluir péptido control o no relacionado. Las construcciones pueden incluir dos o más, tres o más, o cuatro o 10 más polipéptidos de unión. En base a las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, un experto en la técnica puede ensamblar los polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento en construcciones multiméricas y seleccionar construcciones multiméricas que tienen propiedades mejoradas, tales como mejor capacidad para unirse a la molécula diana. Tales construcciones multiméricas que tienen propiedades mejoradas están incluidas en la presente invención, como se define en las reivindicaciones. 15
El examen de la información de la secuencia y los datos de unión identifican una serie de polipéptidos de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR que pueden formar estructuras de bucle.
Los polipéptidos de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR descritos con anterioridad pueden tener opcionalmente 20 aminoácidos adicionales unidos a uno o los dos extremos N y C-terminales.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a modificaciones de los polipéptidos anteriores para proporcionar agentes de formación de imágenes de angiogénesis específicos mediante marcaje detectable de un polipéptido de acuerdo con la presente invención. Dicho marcaje detectable implica conjugación con pigmentos ópticos. 25
Estos y otros aspectos de la presente invención se pondrán de manifiesto por referencia a la siguientes descripción detallada.
Además, se describen métodos de detección selectiva de polipéptidos identificados mediante expresión en fagos 30 según su capacidad para unirse a células que expresan la diana. Estos métodos permiten la detección selectiva rápida de la capacidad de unión de los polipéptidos, incluyendo polipéptidos con afinidades monoméricas que son demasiado bajas para evaluación en ensayos de unión celular estándar. Adicionalmente, estos métodos se pueden usar para evaluar rápidamente la estabilidad de los péptidos en presencia de suero.
35
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 (paneles A y B) son gráficos que ilustran las curvas de unión de saturación de la unión de complejos péptido/neutravidina-HRP. La figura 1A ilustra la curva unión de saturación para la SEC ID N.º: 5 y la SEC ID N.º: 31. La figura 1B ilustra la curva de unión de saturación para la SEC ID N.º: 17 y la SEC ID N.º: 66. Todos los péptidos 40 tenían una biotina C-terminal y un espaciador JJ.
La figura 2 es un gráfico que ilustra la unión de los complejos péptido/neutravidina-HRP: control (biotinilado con espaciador y las SEC ID N.º: 5, 31, 17 y 66) a células 293H transfectadas con KDR y transfectadas de forma simulada a una única concentración (5,55 nM). Todos los péptidos tenían una biotina en C-terminal y un espaciador 45 JJ.
La figura 3 ilustra estructuras peptídicas con y sin espaciador (ácido di(8-amino-3,6-dioxaoctanoico) “JJ”) y biotina analizada en el ejemplo 5((a) la SEC ID N.º: 5 biotinilada con un espaciador JJ; (b) la SEC ID N.º: 5 con una biotina en N-termina; (c) la SEC ID N.º: 31 biotinilada con el espaciador JJ (d) biotinilado SEC ID N.º: 31). 50
La figura 4 ilustra estructuras peptídicas con y sin espaciador (ácido di(2,78-amino-3,6-dioxaoctanoico) “JJ”) y biotina analizada en el ejemplo 5((a) la SEC ID N.º: 5 biotinilada con un espaciador JJ; (b) la SEC ID N.º: 5 con una biotina en N-termina; (c) la SEC ID N.º: 31 biotinilada con el espaciador JJ (d) biotinilado SEC ID N.º: 31).
55
La figura 5 es un gráfico de barras que ilustra unión específica (unión a células transfectadas con KDR menos la unión a células transfectadas de forma simulada) de los complejos péptido/neutravidina-HRP con y sin suero de rata al 40 %. (a) SEC ID N.º: 31; (b) SEC ID N.º: 5; (c) SEC ID N.º: 17; (d) SEC ID N.º: 66. La concentración de soluciones de péptido/avidina HRP fue 6,66 nM para (a) y (b), 3,33 nM (c) y 2,22 nM para (d). ). Todos los péptidos tenían una biotina en C-terminal y un espaciador JJ. 60
La figura 6 es un gráfico de barras que ilustra la unión de soluciones de polipéptido/avidina-HRP (SEC ID N.º: 31 y/o SEC ID N.º: 5) a células transfectadas simuladas o con KDR representada como la absorbancia a 450 nm. Las proporciones de los péptidos control y de unión a KDR usadas para formar cada complejo tetramérico están indicadas en la leyenda para cada multímero analizado. 65
La figura 7 es un gráfico de barras que ilustra la unión específica de una SEC ID N.º: 5 biotinilada con un espaciador JJ/complejo avidina-HRP a células transfectadas con KDR (restada la unión de fondo a células transfectadas simuladas), representada como la absorbancia a 450 nm. Al ensayo se añadieron concentraciones crecientes (como se indica en el eje X) de péptidos sin forma complejos como se indica en la leyenda. Solo la SEC ID N.º: 5 libre fue capaz de disminuir la unión del complejo de la SEC ID N.º: 5 a las células transfectadas con KDR. 5
La figura 8 ilustra estructuras de las secuencias polipeptídicas de unión analizadas en el ejemplo 6. SEC ID N.º: 31 y 76-80.
La figura 9 es un gráfico de barras que ilustra la unión de perlas fluorescentes a células transfectadas con KDR o 10 transfectadas de forma simulada. Las perlas recubiertas con neutravidina con los ligandos biotinilados indicados unidos se analizaron para detectar la unión a células 293H que expresan y que no expresan KDR.
La figura 10 es un gráfico de barras que ilustra el porcentaje de inhibición de la unión de VEGF marcado con 125I por polipéptidos de unión (a) SEC ID N.º: 31 acetilada (sin el extremo C modificado, "P6", 15 GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDP; SEC ID N.º: 81; (b) SEC ID N.º: 4 (sin el extremo C modificado, "P4", AGDSWCSTEYTYCEMIGT; SEC ID N.º: 82); (c) SEC ID N.º: 5 biotinilada con un espaciador JJ y (d) SEC ID N.º: 17 (biotinilada con el espaciador JJ) a dos concentraciones (30 mM y 0,3 mM), a transfectantes 293H que expresan KDR.
20
La figura 11 representa la detección quimioluminiscente sobre película que demuestra que la DR activada (fosforilada) no se detectaba en inmunoprecipitados de HUVEC no estimuladas (-V), pero fue abundante en inmunoprecipitados de HUVEC (+V) estimuladas con VEGF (panel superior). Volver a sondear la transferencia con anti-KDR demostró que las cantidades comparables del KDR total estaban presentes en ambos inmunoprecipitados (panel inferior). 25
La figura 12 representa la detección quimioluminiscente sobre película que demuestra la capacidad de un anticuerpo anti-KDR (1 g/ml) para bloquear parcialmente la fosforilación mediada por VEGF.
La figura 13 representa la detección quimioluminiscente sobre película que demuestra la capacidad de un 30 polipéptido de unión a KDR SEC ID N.º: 38 (10 M) para bloquear la fosforilación de KDR mediada por VEGF.
La figura 14 es un gráfico que muestra el porcentaje de inhibición de la unión a VEGF marcado con 125I por los péptidos P12-XB (SEC ID N.º: 17) D2, D1, D3 y P13-D (AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGG; SEC ID N.º: 83) a tres concentraciones diferentes (10 M, 0,3 M y 0,03 M) en las células 293H transfectadas con KDR. Los resultados 35 proceden de un experimento llevado a cabo por triplicado +/-S.D.
La figura 15 es una fotografía que muestra la capacidad de D1 para bloquear completamente la fosforilación inducida por VEGF de KDR en HUVEC a 10 nM y la mayoría de la fosforilación a 1 nM. Volver a sondar la transferencia para el KDR total (panel inferior) demostró que los efectos de los compuestos analizados no se debían 40 a la menor carga de la muestra. Los homodímeros compuestos por las dos secuencias de unión contenidas en D1 no interfirieron en la fosforilación a hasta 100 nM.
La figura 16 es un gráfico que muestra que D1 bloquea de forma potente la migración/invasión de las células endoteliales inducida por VEGF. Las células en migración se cuantificaron por medición de la fluorescencia tras 45 tinción de las células migradas con un pigmento fluorescente.
La figura 17 es un gráfico del aclaramiento en plasma en forma de porcentaje de la dosis inyectada por ml frente al tiempo.
50
La figura 18 muestra los perfiles de SE-HPLC de plasma de la columna peptídica Superdex. Panel superior, muestra inyectada; seguido por 0 minutos, 30 minutos y 90 minutos. El inserto dentro de cada panel muestra el punto de tiempo, el número de animal y el volumen inyectado para el análisis de HPLC.
La figura 19 es un gráfico que muestra los resultados de analizar los péptidos KDR en un ensayo de proliferación 55 HUVEC. A: D6; B: SEC ID N.º: 17; C: SEC ID N.º: 84 (AEGTGDLHCYFPWVCSLDPGPEGGGK; control negativo); F: SEC ID N.º: 84; control negativo.
La figura 20 muestra el análisis cinético de D1 (véase la figura 25), que se une a KDR-Fc murino. Todos los sensogramas se adaptan al modelo de analito bivalente. 60
La figura 21 muestra el análisis cinético de D7, un heterodímero de SEC ID N.º: 5 y SEC ID N.º: 31. Todos los sensogramas se adaptan al modelo de analito bivalente.
La figura 22 muestra el análisis cinético de la SEC ID N.º: 18 marcada con fluoresceína que se une a KDR-Fc 65 murino. Todos los sensogramas se adaptan al modelo de Langmuir 1:1.
La figura 23 muestra un engarce oxima. Los aminoácidos que contienen una función aminoalcohol (4) y que contienen una función alcoxiamino (5) se incorporan en la cadena peptídica, no necesariamente al final de la cadena peptídica.
La figura 24 muestra estructuras fosfolipídicas. 5
La figura 25 muestra el dímero 1 (D1; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(SEC ID N.º: 17)[(BiotinaJK-(O=)C(CH2)3C (=O)-JJ-NH(CH2)4-(S)-CH((Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG(SEC ID N.º: 78))-NH)CONH2]-NH2).
La figura 26 muestra el dímero 2 (D2; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(SEC ID N.º: 17)[(BiotinaJK-10 (O=)C(CH2)3C (=O)-JJ-NH(CH2)4-(S)-CH((Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTJ (SEC ID N.º: 50))-NH)CONH2]-NH2).
La figura 27 muestra el dímero 3 (D3; Ac-AVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 49)[(BiotinaJK-(O=)C(CH2)3C (=O)-JJ-NH(CH2)4-(S)-CH((Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG(SEC ID N.º: 78))-NH)CONH2]-NH2).
15
La figura 28 muestra el dímero 4 (D4; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTJK (SEC ID N.º: 50)[(DOTA-JK-(O=)C(CH2)3C (=O)-JJ-NH(CH2)4-(S)-CH((Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG(SEC ID N.º: 78))-NH)CONH2]-NH2).
La figura 29 muestra el dímero 5 (D5; Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 49) (JJ-C(=O)(CH2)3C(=O)-K-NH (CH2)4-(S)-CH((Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGG (SEC ID N.º: 85))-NH)CONH2]-NH2). 20
La figura 30 muestra el dímero 8 (D8; Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK (SEC ID N.º: 66) ){Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK (SEC ID N.º: 66)(J-Glut-)-NH2} K(Biotina-JJ)-NH2).
La figura 31 muestra el dímero 9 (D9; Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK (SEC ID N.º: 66) {[Ac-25 GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31)(JJ-Glut-)-NH2} K-NH2).
La figura 32 muestra el dímero 10 (D10; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) {[Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31) (JJ-Glut-NH(CH2)4-(S)-CH(PnAO6-Glut-NH)(C=O-)]-NH2}-NH2). 30
La figura 33 muestra el dímero 11 (D11; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) {Ac-VCWEDSWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 97) (JJ-Glut-NH(CH2)4-(S)-CH(DOTA-JJ-NH-)(C=O-)]-NH2}-NH2).
35
La figura 34 muestra el dímero 12 (D12; Ac-AGPTWCEDDYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 98) {[PnAO6-Glut-K(Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(SEC ID N.º: 49)(-C(=O)CH2(OCH2CH2)2OCH2C(=O)-)-NH2]}-NH2).
La figura 35 muestra el dímero 13 (D13; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) {Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 49) [JJ-Glut-K(BOA)]-NH2}-NH2). 40
La figura 36 muestra el dímero 14 (D14; Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK (SEC ID N.º: 66) {PnAO6-Glut-K[Ac-GSDRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(SEC ID N.º: 99) (JJ-Glut)NH2]}-NH2).
La figura 37 muestra el dímero 15 (D15; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) {[[Ac-45 GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGKJJ (SEC ID N.º: 31)-Glut]-NH2]-K(PnAO6-Glut)}-NH2).
La figura 38 muestra el dímero 16 (D16; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK (SEC ID N.º: 17) {[PnAO6-Glut-K(Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31)(-C(=O)CH2O(CH2CH2O)2OCH2C(=O)-MH(CH2)3O.
50
(CH2CH2O)2(CH2)3NH C(=O)CH2O(CH2CH2O)2CH2C(=O)-]-NH2]}-NH2).
La figura 39 muestra el dímero 17 (D17; Ac-AQDWYYDEILJGRGGRGGRGGK (SEC ID N.º: 100) {K[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(SEC ID N.º: 31)(JJ-Glut)-NH2]}-NH2).
55
La figura 40 muestra el dímero 18 (D18; Ac-AGPTWCDYDWEYCWLGTFGGGK (SEC ID N.º: 101){PnAO6-Glut-K[Ac-GVDFRCEWSDWGEVGCRSPDYGGGK (SEC ID N.º: 106)(JJ-Glut)-NH2]}-NH2).
La figura 41 muestra el dímero 19 (D19; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 31) {Biotina-K[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ-Glut)-NH2}-NH2) (SEC ID N.º: 49). 60
La figura 42 muestra el dímero 20 (D20; (-JJAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK (SEC ID N.º: 102)-NH2)-Glut-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG(SEC ID N.º: 78)-NH2).
La figura 43 muestra el dímero 21 (D21; [-JJAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK (SEC ID N.º: 102)(PnAO6-Glut)-65 NH2]-Glut-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG (SEC ID N.º: 78)-NH2).
La figura 44 muestra el dímero 22 (D22; Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31) {JJ-Glut-JJ-AGPTWCEDDWYYCWLFTGGGK (SEC ID N.º: 103) -NH2}-NH2).
La figura 45 muestra el dímero 23 (D23; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) {Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 49) [JJ-Glut-K(SATA)]-NH2}-NH2). D23 es también D5 funcionalizado 5 con el grupo SATA (S-acetiltioacetilo).
La figura 46 muestra el dímero 24 (D22; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) {SATA-JJK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(SEC ID N.º: 49)(JJ-Glut)-NH2}-NH2).
10
La figura 47 muestra el dímero 25 (D25; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) {Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31) (JJ-Glut-NH(CH2)4-(S)-CH(NH2)C(=O)-]-NH2}-NH2).
La figura 48 muestra el dímero 26 (D26; AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK (SEC ID N.º: 17) {(-Glut-JJ-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG (SEC ID N.º: 78) -NH2)-K}-NH2). 15
La figura 49 muestra el dímero 27 (D27; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK (SEC ID N.º: 17) {Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 49) [S(GalNAc(Ac)3-alpha-D)-G-S(GalNAc(Ac)3-alfa-D)-Glut-S(GalNAc(Ac)3-alfaD)-G-S(GalNAc(Ac)3-alfa-D)-NH(CH2)4-(S)-CH(Biotina-JJNH-)C(=O)-]-NH2}-NH2).
20
La figura 50 muestra un péptido de unión dimérico de la invención.
La figura 51 muestra un péptido de unión dimérico de la invención.
La figura 52 muestra que D26 (cuadrados) con su glicosilación y espaciador modificado puede bloquear los efectos 25 del VEGF en el ensayo de migración para bloquear la migración estimulada por VEGF incluso con mayor potencia que D24 (rombos) que carece de dichas modificaciones químicas.
La figura 53 muestra que el Auxiliar A aumenta la potencia de D6 en el bloqueo de los efectos biológicos de VEGF en un ensayo de migración con HUVEC cultivados. Rombos: D6 solo a las concentraciones indicadas. Cuadrados: 30 D6 a las concentraciones indicadas más Adjunto A 100 nM (constante).
La figura 54 es un diagrama que muestra el Esquema 1 (síntesis del péptido 2).
La figura 55 es un diagrama que muestra el Esquema 2 (síntesis del péptido 4). 35
La figura 56 es un diagrama que muestra el Esquema 3 (síntesis de D26).
Definiciones 40
En las secciones siguientes, el término “recombinante” se usa para describir ácidos nucleicos manipulados o alterados de un modo no natural, las células huésped transfectadas con ácidos nucleicos exógenos o polipéptidos expresados de un modo no natural a través de manipulación de ADN aislado y transformación de las células huésped. Recombinante es un término que abarca específicamente moléculas de ADN que se han construido in vitro usando técnicas de ingeniería genética y el uso del término “recombinante” como adjetivo para describir una 45 molécula, construcción, vector, célula, polipéptido o polinucleótido excluye específicamente dichas moléculas, construcciones, vectores, células, polipéptidos o polinucleótidos naturales.
El término “bacteriófago” se define como un virus bacteriano que contiene un núcleo de ADN y una cubierta protectora creada por la agregación de una serie de moléculas proteicas diferentes. Los términos “bacteriófago” y 50 “fago” se usan en el presente documento de forma intercambiable.
El término “polipéptido” se usa para hacer referencia a un compuesto de dos o más aminoácidos unidos a través de la cadena principal (en oposición a la cadena lateral) por un enlace amida peptídico ((-C(:O)NH-). El término “péptido” se usa en el presente documento de forma intercambiable con “polipéptido”, pero en general se usa para 55 hacer referencia a polipéptidos que tienen menos de 40 y preferentemente, menos de 25 aminoácidos.
El término “polipéptido de unión”, como se usa en el presente documento se refiere a cualquier polipéptido capaz de formar un complejo de unión con otra molécula. Un término equivalente usado en ocasiones en el presente documento como “resto de unión”. “Polipéptido de unión a KDR” es un polipéptido que forma un complejo in vitro o in 60 vivo con el receptor-2 del factor de crecimiento endotelial vascular (o KDR, Flk-1); “polipéptido de unión al complejo VEGF/KDR” es un polipéptido que forma un complejo in vitro o in vivo con un complejo de unión formado entre el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y KDR, en concreto el complejo de VEGF homodimérico y uno o dos moléculas KDR que se cree que se forman en la superficie de las células endoteliales durante la angiogénesis. Ejemplos específicos de polipéptidos de unión a KDR y VEGF/KDR incluyen, entre otros, los péptidos presentados 65 en las tablas 1-7 a continuación e incluyen polipéptidos híbridos y quiméricos que incorporan dichos péptidos.
También incluidos dentro de la definición de polipéptidos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR son los polipéptidos que están modificados u optimizadas como se divulga en el presente documento.
Ejemplos específicos de dichas modificaciones se tratan con detalle más adelante, pero incluyen la sustitución de aminoácidos por aquellos en la secuencia polipeptídica parental para optimizar las propiedades, obstruir un sitio de 5 escisión enzimática etc.; sustituciones o elongaciones de aminoácidos en C o N terminal, por ejemplo para el fin de unir el polipéptido a un marcador de formación de imágenes detectable u otro sustrato, ejemplos de los cuales incluyen, por ejemplo, la adición de una “cola” de polihistidina con el fin de ayudar a la purificación; truncamientos; cambios en los enlaces amida; translocaciones; péptidos retroinversos; peptoides, retroinversopeptoides; el uso de modificaciones o engarces en N terminal o C terminal, tales como segmentos de poliglicina o polilisina; alteraciones 10 para incluir grupos funcionales, principalmente funcionalidades hidracina (-NH-NH2) o el engarce en C terminal -Gly-Gly-Gly-Lys (SEC ID N.º: 18), para ayudar a la inmovilización de los péptidos de unión de acuerdo con la presente invención sobre soportes sólidos o para la unión de pigmentos fluorescentes; modificaciones farmacocinéticas, modificaciones estructurales para retener las características estructurales; formación de sales para aumentar la solubilidad en agua o facilitar la formulación y similares. 15
Además de los marcadores detectables descritos más adelante en el presente documento, otros sustratos adecuados para los polipéptidos de unión incluyen un agente tumoricida o enzima, un liposoma (p. ej., cargado con un agente terapéutico, un gas adecuado para ultrasonidos o ambos) o un soporte sólido, pocillo, placa, perla tubo, portaobjetos, filtro o placa. Además, se pueden formar dímeros o multímeros de uno o más polipéptidos dé unión a 20 KDR o VEGF/KDR. Dichas construcciones pueden exhibir, por ejemplo, una mayor capacidad para unirse a KDR. Todos estos polipéptidos dé unión modificados también se consideran polipéptidos dé unión a KDR o al complejo VEGF/KDR siempre que retengan la capacidad para unirse a las dianas de KDR o VEGF/KDR.
“Homólogos” de los polipéptidos dé unión descritos en el presente documento se pueden producir usando cualquiera 25 de las técnicas de modificación u optimización descritas en el presente documento o conocidos para los expertos en la técnica. Dichos polipéptidos homólogos se entenderá que entran dentro del alcance de la presente invención y la definición de polipéptidos dé unión a KDR y al complejo VEGF/KDR siempre que la sustitución, adición o deleción de aminoácidos u otra de estas modificaciones no elimine su capacidad para unirse a KDR o al complejo VEGF/KDR. El término “homólogo”, como se usa en el presente documento, se refiere al grado de similitud de secuencia entre dos 30 polímeros (es decir, moléculas polipeptídicas o moléculas de ácido nucleico). Cuando el mismo residuo de nucleótido o de aminoácido o uno con propiedades sustancialmente similares (Es decir, una sustitución conservadora) ocupa una posición en la secuencia en los dos polímeros en comparación, los polímeros son homólogos en dicha posición. Por ejemplo, si los residuos de aminoácidos en las posiciones 60 de 100 aminoácidos en dos secuencias polipeptídicas coinciden o son homólogos, las dos secuencias son homólogos e un 60 %. Las 35 cifras de porcentaje de homología a las que se hace referencia en el presente documento reflejan la máxima homología posible entre los dos polímeros, es decir el porcentaje de homología cuando los dos polímeros están tan alineados que tienen el mayor número de posiciones coincidentes (homólogas). Los polipéptidos homólogos dentro del alcance de la presente invención serán al menos un 70 % y preferentemente más del 80 %, homólogos con al menos una de las secuencias de unión a KDR o a VEGF/KDR divulgadas en el presente documento. 40
El término “unión” se refiere a la determinación mediante ensayos estándar, incluidos los descritos en el presente documento, de que un polipéptido de unión reconoce y se une de forma reversible a una diana dada. Dichos ensayos estándar incluyen, entre otros, diálisis en equilibrio, filtración en gel y la monitorización de cambios espectroscópicos que son el resultado de la unión. 45
El término “especificidad” se refiere a un polipéptido de unión que tiene una afinidad de unión mayor para una diana sobre otra. El término “especificidad por KDR” se refiere a un resto de unión a KDR que tiene una afinidad de unión mayor para KDR sobre una diana irrelevante. El término “especificidad por VEGF/KDR ” se refiere a un resto de unión al complejo VEGF/KDR que tiene una afinidad de unión mayor por un complejo VEGF/KDR sobre una diana 50 dada. La especificidad de unión se puede caracterizar por una constante de disociación en equilibrio (KD) o una constante de asociación en equilibrio (Ka) para los dos materiales diana dados o puede ser cualquier medida de fuerza de unión relativa. Los polipéptidos de unión de acuerdo con la presente invención son específicos de KDR o el complejo VEGF/KDR y tienen, preferentemente, una KD por KDR o el complejo VEGF/KDR que es menor de 10 mM, más preferentemente menor de 1,0 M, más preferentemente menor de 0,5 M o incluso menor. 55
El término “paciente,” como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier mamífero, especialmente seres humanos.
La expresión vehículo o excipiente “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo o excipiente no tóxico que 60 se pueden administrar a un paciente, junto con un compuesto de la presente invención y que no destruye la actividad biológica o farmacológica del mismo.
A lo largo de la presente memoria se usan las siguientes abreviaturas habituales: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (fmoc o Fmoc), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), anhídrido acético (Ac2O), (4,4-dimetil2,6-65 dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutilo (ivDde), ácido trifluoroacético (TFA), Reactivo B
(TFA:H2O:fenol:triisopropilsilano, 88:5:5:2), N,N-diisopropiletilamina (DIEA), hexafluorofosfato de O-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio (HBTU), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), N-hidroxisuccinimida (NHS), síntesis peptídica en fase sólida SPFS), dimetilsulfóxido (DMSO), diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF) y N-metilpirrolidinona (NMP).
5
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona al menos un polipéptido que comprende un marcador óptico conjugado directamente o por mediación de un engarce o un espaciador a dicho al menos un polipéptido que está unido a KDR o a un complejo de VEGF y KDR como se define en las reivindicaciones. Dichos restos de unión hacen posible la 10 detección eficiente, obtención de imágenes y localización de células endoteliales activadas que exhiben expresión de KDR regulada por aumento y unión a VEGF. Dichas células endoteliales son características de la angiogénesis activa y por tanto, los polipéptidos descritos en el presente documento proporcionan un medio de detección, monitorización y localización de sitios de angiogénesis. En particular, los polipéptidos de unión de la presente invención, cuando se marcan adecuadamente, son útiles para detectar, obtener imágenes y localizar angiogénesis 15 inducida por tumor. Por tanto, los polipéptidos de unión se pueden usar para formar diversos agentes diagnósticos para diagnosticar el crecimiento de tumores neoplásicos u otros casos patogénicos de la angiogénesis.
Polipéptidos marcados de unión específicos de KDR y del complejo de VEGF y KDR de acuerdo con la presente invención se aislaron inicialmente mediante detección selectiva de bibliotecas de expresión en fagos, es decir, 20 poblaciones de bacteriófagos recombinantes transformados para expresar un péptido exógeno sobre su superficie, Con el fin de aislar nuevos restos de unión polipeptídica para una diana concreta, tal como KDR o VEGF/KDR, detección selectiva de bibliotecas peptídicas grandes, usando, por ejemplo, técnicas de expresión en fagos, es especialmente ventajosa, en cuanto a que se pueden analizar cifras muy grandes (p. ej., 5 x 109) de potenciales aglutinantes y y se pueden aislar los aglutinantes satisfactorios en un corto periodo de tiempo. 25
Con el fin de preparar una biblioteca de fagos de expresión de polipéptidos para detección selectiva de polipéptidos de unión tales como polipéptidos de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR, se selecciona un dominio de unión candidato para servir como molde estructural para los péptidos a expresarse en la biblioteca. La biblioteca de fagos está hecha de una multiplicidad de análogos del dominio parental o molde. El molde del dominio de unión puede ser 30 una proteína natural o sintética, o una región o dominio de una proteína. El molde del dominio de unión puede seleccionarse en base a los conocimientos de una interacción conocida entre el molde del dominio de unión y la diana de unión, pero esto no es crítico. De hecho, no es esencial que el dominio seleccionado para actuar como molde para la biblioteca tenga cualquier afinidad por la diana: Su objetivo es proporcionar una estructura de la que se pueda generar una multiplicidad (biblioteca) de polipéptidos de estructura similar (análogos), en la que la 35 multiplicidad de análogos incluirán uno o más análogos que exhiben las propiedades de unión deseadas (y cualquier otra propiedad por la que se detectan).
En la selección del dominio de unión parental o molde sobre el que basar las variadas secuencias de aminoácidos de la biblioteca, la consideración más importante es como los diversos dominios peptídicos se presentarán a la 40 diana, es decir en qué conformación los análogos peptídicos entrarán en contacto con la diana. En las metodologías de expresión en fagos, por ejemplo, los análogos se generarán mediante inserción de ADN sintético que codifica los análogos en fagos, lo que tiene como resultado la expresión del análogo sobre las superficies del fago. Dichas bibliotecas de fagos, tal como el fago M13, que muestran una amplia variedad de polipéptidos diferentes, se pueden preparar usando técnicas como las descritas en, por ejemplo, Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins: A 45 Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y documento US 5.223.409 (Ladner y col.).
Al aislar los polipéptidos específicos marcados de acuerdo con la presente invención se usaron siete bibliotecas de péptidos cíclicos (o “bucles”), designadas TN8/IX, TN12/I y una biblioteca lineal, designada Lin20. Cada biblioteca se construyó para la expresión de diversos polipéptidos en el fago M13. Las siete bibliotecas que tienen una 50 designación “TN” se diseñaron para expresar un bucle peptídico exógeno variegado corto de 6, 7, 8, 9, 10, 12 o 13 aminoácidos, respectivamente, sobre la superficie del fago M13, en el extremo amino de la proteína III. Las bibliotecas se designan TN8/IX (que tienen una potencial de 2,2 x 1015 diversidad de secuencia de aminoácidos), TN12/I (que tiene una diversidad de secuencia de 4,6 x 1019) y Lin20 (que tiene una potencial diversidad de secuencia de aminoácidos de 3,8 x 1025). 55
La biblioteca TN8/IX se construyó para expresar un único bucle de unión a microproteína contenido en un molde de 14 aminoácidos. La biblioteca TN8/IX usó una secuencia de molde de Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa5- Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14. Los aminoácidos en la posición 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13 y 14 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoácido salvo cisteína (Cys). 60
La biblioteca TN12/I se construyó para expresar un único bucle de unión a microproteína contenido en un molde de 18 aminoácidos. La biblioteca TN12/I usó una secuencia de molde de Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Xaa5- Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18. Los aminoácidos en la posición 1, 2, 17 y 18 en el molde se variaron para permitir cualquier aminoácido seleccionado de un grupo de 12 aminoácidos. A, D, F, G, H, L, 65 N, P, R, S, W o Y). Los aminoácidos en las posiciones 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 16 se variaron para
permitir cualquier aminoácido salvo cisteína (Cys).
La biblioteca Lin20 se construyó para expresar un único péptido lineal en un molde de 20 aminoácidos. Los aminoácidos en cada posición en el molde se variaron para permitir cualquier aminoácido salvo cisteína (Cys).
5
Los polipéptidos de unión marcados proporcionados en el presente documento pueden incluir adiciones o truncamientos en los extremos N y/o C. Cabe esperar que dichos polipéptidos de unión modificados se unan a KDR o al complejo VEGF/KDR. Por ejemplo, el engarce -GGGK presente en el extremo N de algunos de los polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento es un engarce opcional. Por tanto, los polipéptidos que tienen la misma secuencia, salvo sin las secuencias -GGGK terminales en la medida en que se describe en las 10 reivindicaciones, también están englobados en la presente invención. Además, cabe esperar que los polipéptidos de unión que comprenden la porción en bucle de los moldes y secuencias como se ha descrito en el presente documento se unen a KDR o al complejo VEGF/KDR. La porción en bucle de los moldes y secuencias incluye las secuencias entre e incluidos los dos residuos de cisteína que cabe esperar que formen un enlace disulfuro, de modo que se genera una estructura de bucle peptídico. Además, los polipéptidos de unión de la presente invención 15 pueden incluir residuos de aminoácidos adicionales en los extremos N y/o C.
Las bibliotecas de expresión en fagos se crearon fabricando una serie diseñada de mutaciones o variaciones dentro de una secuencia de codificación para el molde polipeptídico, codificando cada secuencia mutante un análogo peptídico correspondiente en estructura general al molde a excepción de que tiene una o más variaciones de 20 aminoácidos en la secuencia del molde. El nuevo ADN variegado (mutado) proporciona una diversidad de secuencia y cada fago transformante muestra una variante de la secuencia de aminoácidos del molde inicial codificados por el ADN, que conduce a una población de fagos (biblioteca) que muestra un gran número de secuencias de aminoácidos diferentes pero relacionadas estructuralmente.
25
Como se ha indicado anteriormente, las técnicas tratadas en Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego, 1996) y el documento US 5.223.409 son particularmente útiles en la preparación de una biblioteca de aglutinantes potenciales correspondientes al molde parental seleccionado. Las bibliotecas a las que se ha hecho referencia anteriormente se prepararon de acuerdo con estas técnicas y se sometieron a detección selectiva de los polipéptidos de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR contra un agente 30 inmovilizado, como se ha explicado en los ejemplos siguientes.
En una detección selectiva típica, se pone en contacto una biblioteca de fagos y se permite que se unan a la diana, o a un subcomponente concreto de la misma. Para facilitar la separación de los aglutinantes y no aglutinantes, es conveniente inmovilizar la diana sobre un soporte sólido. Los fagos portadores de un resto de unión a la diana 35 forman un complejo con la diana sobre el soporte sólido, mientras que los fagos que no se unen permanecen en solución y se pueden lavar con exceso de tampón. Después, los fagos unidos se liberan de la diana cambiando el tampón a un pH extremo (pH 2 o pH 10), cambiando la fuerza iónica del tampón, añadiendo desnaturalizantes u otros medios conocidos. Para aislar el fago de unión que exhibe los polipéptidos de la presente invención se realizó una elución proteica, es decir se eluyó algunos fagos de la diana usando VEGF en solución (elución competitiva) y 40 también, fagos de unión de afinidad muy alta que no podían eliminar por competición incubando con VEGF durante la noche se capturaron usando el fago todavía unido al sustrato para infección de las células E. coli.
El fago recuperado se puede amplificar después mediante infección de células bacterianas y se repite el proceso de detección selectiva con el nuevo grupo que ahora carece de no aglutinantes y está enriquecido en aglutinantes. La 45 recuperación de incluso unos pocos fagos de unión es suficiente para completar el proceso. Después de unos pocos ciclos de selección, las secuencias génicas que codifican los restos de unión derivados de clones de fagos seleccionados en el grupo de unión se determinan mediante métodos convencionales, que se describen más adelante, lo que revela la secuencia peptídica que imparte afinidad de unión del fago a la diana. Cuando el proceso de selección funciona, la diversidad de la secuencia de la población entra con cada ronda de selección hasta que 50 permanecen los aglutinantes deseables. Las secuencias convergen en un número pequeño de aglutinantes relacionados, normalmente 10 - 50 de los más de 10 millones de candidatos originales de cada biblioteca. Un incremento en el número de fagos recuperados en cada ronda de selección y por supuesto, la recuperación de secuencias estrechamente relacionadas, son buenos indicadores de que la convergencia de la biblioteca se ha producido en un cribado. Después de identificar un conjunto de polipéptidos de unión, la información de la secuencia 55 se puede usar para diseñar otras bibliotecas de fagos secundarias, sesgadas para los miembros que tienen propiedades deseadas adicionales.
La formación del bucle de unión disulfuro es ventajosa porque conduce a un incremento de la afinidad y la especificidad para dichos péptidos. No obstante, en suero, el enlace disulfuro se podría abrir mediante cisteínas 60 libres u otras moléculas que contienen tiol. Por tanto, puede ser útil modificar los residuos de cisteína para sustituir la reticulación del disulfuro con otro enlace menos reactivo. La reticulación -CH2-S-S-CH2- tiene una geometría preferida en la que el enlace dihédrico entre azufres es cercano a los 90 grados, pero la geometría exacta se determina mediante el contexto de otros grupos laterales y el estado de unión de la molécula. Modificaciones preferidas de la reticulación de cierre del bucle de unión conservarán las longitudes y los ángulos globales del enlace 65 lo más posible. Dichas reticulaciones alternativas adecuadas incluyen enlaces tioéter tales como -CH2-SCH2-CH2-,
-CH2CH2-S-CH2-, -CH2-CH2-S-CH2-CH2-; enlaces lactama tales como -CH2-NH-CO-CH2- y -CH2-CO-NHCH2-; enlaces éter tales como -CH2-CH2-O-CH2-CH2-; puentes de alquileno tales como -(CH2)n-(en la que n = 4, 5, o 6); el enlace -CH2-NH-CO-NH-CH2- y grupos similares conocidos en la técnica.
La síntesis directa de los polipéptidos de la invención se puede conseguir usando técnicas convencionales, incluida 5 la síntesis peptídica en fase sólida, la síntesis en fase de solución etc. Se prefiere la síntesis en fase sólida. Véase Stewart y col., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco, 1989); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963); Bodanszky y Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Nueva York, 1984).
10
Los polipéptidos de acuerdo con la invención también se pueden preparar comercialmente a través de empresas que proporciona síntesis peptídica como servicio (p. ej., BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA). También se dispone de máquinas de síntesis peptídica automáticas, tales como las fabricadas por Perkin-Elmer Applied Biosystems.
15
El compuesto polipeptídico se purifica, preferentemente, una vez que se ha aislado o sintetizado mediante técnicas recombinantes o químicas. Con fines de purificación hay muchos métodos estándar que se pueden usar, incluida cromatografía líquida de alta presión y de fase inversa (RP-HPLC) usando una columna de sílice alquilada tal como sílice C4-, C8- o C18. Generalmente se usa una fase móvil en gradiente de contenido orgánico creciente para alcanzar purificación, por ejemplo acetonitrilo en un tampón acuoso, que normalmente contiene una pequeña 20 cantidad de ácido trifluoroacético. También se puede usar cromatografía de intercambio iónico para separar los péptidos en base a su carga. El grao de pureza del polipéptido se puede determinar mediante varios métodos, incluida la identificación de un gran pico principal en la HPLC. Se prefiere un polipéptido que produzca un único pico que sea al menos el 95 % del material de entrada en una columna HPLC. Incluso más preferible es un polipéptido que produzca un único pico que sea al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 99,5 % o 25 más del material de entrada en una columna HPLC.
Con el fin de garantizar que el péptido obtenido usando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente es el péptido deseado para usar en composiciones de la presente invención se pueden llevar a cabo análisis de la composición peptídica. Dicho análisis de la composición se puede realizar usando espectrometría de masas de alta 30 resolución para determinar el peso molecular del péptido. Como alternativa, el contenido en aminoácidos del péptido se puede confirmar hidrolizando el péptido en ácido acuoso y separando, identificando y cuantificando los componentes de la mezcla usando HPLC o un analizador de aminoácidos. También se pueden usar secuenciadores proteicos, que degradan secuencialmente el péptido e identifican los aminoácidos en orden, para determinar la secuencia del péptido. 35
Los polipéptidos marcados de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR de acuerdo con la presente invención también se pueden producir usando técnicas de ADN recombinante, usando ácidos nucleicos (polinucleótidos) que codifican los polipéptidos de acuerdo con la presente invención y expresándolos después de forma recombinante, es decir manipulando células huésped mediante la introducción de moléculas de ácido nucleico exógenas de modos 40 conocidos para hacer que dichas células huésped produzcan los polipéptidos de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR deseados. Tales procedimientos entran dentro de la capacidad de los expertos en la técnica (véase Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). La producción recombinante de péptidos cortos, tales como los descritos en el presente documento, puede no ser práctica en comparación con la síntesis directa, no obstante, medios de producción recombinante pueden ser muy ventajosos cuando se incorpora un resto de unión a 45 KDR o al complejo VEGF/KDR de la presente invención en un polipéptido híbrido o proteína de fusión.
En la práctica de la presente invención, una determinación de la afinidad de resto de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR por KDR o el complejo VEGF/KDR respecto a otra proteína o diana es una medida útil y se denomina especificidad por KDR o por el complejo VEGF/KDR. Ensayos estándar para cuantificar la unión y determinar la 50 afinidad incluyen diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel o la monitorización de numerosos cambios espectroscópicos (tales como un cambio en la polarización de la fluorescencia) que puede ser el resultado de la interacción del resto de unión y su diana. Estas técnicas miden la concentración de ligando unido y libre como una función de la concentración del ligando (o proteína). La concentración del polipéptido unido ([Unido]) está relacionada con la concentración del polipéptido libre ([Libre]) y la concentración de los sitios de unión para el 55 polipéptido, es decir sobre KDR o el complejo VEGF/KDR, (N), como se describe en la siguiente ecuación.
[Unido] = N x [Libre] /((1/Ka) + [Libre)
Una solución de los datos de esta ecuación da la constante de asociación, Ka, una medida cuantitativa de la afinidad 60 de unión. La constante de asociación, Ka, es la recíproca de la constante de disociación, KD. La KD se notifica con mayor frecuencia en las mediciones de afinidad. Polipéptidos de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR preferidos tienen una KD por KDR o al complejo VEGF/KDR en el intervalo de 1 nanomolar (nM) a 100 micromolar (M), que incluye los valores KD de menos de 10 nM, menos de 20 nM, menos de 40 nM, menos de 60 nM, menos de 80 nM, menos de 1 M, menos de 5 M, menos de 1 M, menos de 20 M, menos de 40 M, menos de 60 M y menos de 65 80 M.
Cuando los polipéptidos de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR se usan como agentes de obtención de imágenes, otros aspectos de especificidad de unión pueden ser más importantes. Los agentes de obtención de imágenes operan en un sistema dinámico en el que la unión del agente obtención de imágenes a la diana (KDR o el complejo VEGF/KDR, por ejemplo en el endotelio activado) pueden no estar en un estado de equilibrio estable durante el procedimiento de obtención de imágenes. Por ejemplo, cuando el agente de obtención de imágenes se 5 inyecta inicialmente, la concentración del agente de obtención de imágenes y del complejo agente-diana aumenta rápidamente. No obstante, poco después de la inyección, el agente de obtención de imágenes en circulación (libre) comienza a eliminarse por los riñones o el hígado y la concentración en plasma del agente de obtención de imágenes comienza a descender. Este descenso en la concentración del agente de obtención de imágenes libre en el plasma termina causando la disociación del complejo agente-diana. La utilidad de un agente de obtención de 10 imágenes depende de la diferencia en la velocidad de disociación agente-diana respecto a la tasa de aclaramiento del agente. Idealmente, la velocidad de asociación será lenta en comparación con la tasa de aclaramiento, lo que tiene como resultado un largo tiempo de obtención de imágenes durante el que existe una elevada concentración del complejo agente-diana y una concentración baja del agente de obtención de imágenes libre (señal de fondo) en plasma. 15
La medición cuantitativa de las velocidades de disociación se puede realizar fácilmente usando varios métodos conocidos en la técnica, tal como fluorimetría de fibra óptica (véase, por ejemplo, Anderson & Miller, Clin. Chem., 34 (7): 1417-21 (1988)), resonancia de plasmón superficial (véase, Malmborg y col., J. Immunol. Methods, 198 (1): 51-7 (1996) y Schuck, Current Opinion in Biotechnology, 8: 498-502 (1997)), resonancia especular y guía de ondas 20 planares acoplada a injerto (véase, por ejemplo, Hutchinson, Molec. Biotechnology, 3: 47-54 (1995)). Comercialmente se dispone de biosensores automáticos para medir la cinética de unión. Sensor de resonancia de plasmón superficial BIAcore (Biacore AB, Uppsala SE), sensor de resonancia especular IAsys (Fisons Applied Sensor Technology, Cambridge GB), sensor de guía de ondas planas acoplada a injerto BIOS-1 (Artificial Sensor Instruments, Zurich CH). 25
Métodos de detección selectiva de polipéptidos identificados mediante expresión en fagos por su capacidad para unirse a células que expresan la diana:
Además, se describen métodos de detección selectiva de polipéptidos de unión identificados mediante expresión en 30 fagos según su capacidad para unirse a células que expresan la diana (y no a células que no expresan la diana). Estos métodos abordan un problema significativo asociado con la detección selectiva de péptidos identificados mediante expresión en fagos: Con frecuencia, los péptidos identificados de este modo no tienen una afinidad suficiente para la detección selectiva de la diana contra células que expresan la diana en ensayos convencionales. No obstante, determinar si un péptido identificado en fago concreto se une a las células que expresan la diana (y no 35 se une a las células que no la expresan) es una información esencial para la identificación de péptidos de unión que son potenciales restos de unión in vivo. El método aprovecha el incremento de afinidad y de avidez asociado con la unión multivalente y permite la detección selectiva de polipéptidos con bajas afinidades contra las células que expresan la diana.
40
El método generalmente consiste en la preparación y detección selectiva de construcciones multiméricas, incluidos uno o más polipéptidos de unión. Por ejemplo, los polipéptidos identificados mediante expresión en fagos como de unión a una diana se biotinilan y forman complejos con avidina, estreptavidina o neutravidina para formar construcciones tetraméricas. Estas construcciones tetraméricas se incuban después con células que expresan la diana deseada y las células que no lo hacen y se detecta la unión de la construcción tetramérica. La unión se puede 45 detectar usando cualquier método de detección conocido en la técnica. Por ejemplo, para detectar la unión, la avidina, estreptavidina o neutravidina se pueden conjugar a un marcador detectable (p. ej., un marcador radioactivo, un marcador fluorescente o un marcador enzimático que sufre un cambio de color, tal como HRP (peroxidasa de rábano), TMB (tetrametilbencidina) o fosfatasa alcalina.
50
Los péptidos biotinilados preferentemente forman complejos con neutravidina-HRP. La neutravidina exhibe menor unión inespecífica a las moléculas que las otras alternativas debido a la ausencia de restos carbohidratos de unión a lectinas y el dominio RYD de unión al receptor de adhesión celular en neutravidina. Véanse Hiller y col., Biochem. J., 248:167-171 (1987); Alon y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 170:1236-41 (1990).
55
Las construcciones tetraméricas se pueden someter a detección selectiva contra las células que expresan de forma natural la diana o las células que se han sometido a ingeniería mediante tecnologías de ADN recombinante para expresar la diana (p. ej., transfectantes, transformantes etc.). Si se usan las células que se han transfectado para expresar la diana, las células transfectadas de forma simulada (es decir, las células transfectadas sin el material genético que codifica la diana) se pueden usar como control. 60
Los complejos tetraméricos se pueden someter a detección selectiva opcionalmente en presencia de suero. Por tanto, el ensayo también puede usarse para evaluar rápidamente el efecto del suero sobre la unión de los péptidos a la diana.
65
Los métodos divulgados en el presente documento son particularmente útiles en la preparación y evaluación de
combinaciones de distintos polipéptidos de unión para usar en construcciones dirigidas diméricas o multiméricas que contienen dos o más polipéptidos de unión. El uso de complejos de biotina/avidina permite una preparación relativamente fácil de las construcciones tetraméricas que contienen de uno a cuatro péptidos de unión diferentes. Además, ahora se ha descubierto que la afinidad y la avidez de una construcción dirigida se pueden aumentar mediante la inclusión de dos o más restos dirigidos que se unen a diferentes epìtopos en la misma diana. Los 5 métodos de detección selectiva descritos en el presente documento son útiles en la identificación de combinaciones de polipéptidos de unión que pueden tener una mayor afinidad cuando se incluyen en dichas construcciones multiméricas.
Los métodos de detección selectiva descritos en el presene documento se pueden usar para detectar 10 selectivamente polipéptidos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR identificados mediante expresión en fagos, tales como los descritos en el presente documento. Como se describe con más detalle en el ejemplo 5 más adelante, estos métodos se pueden usar para evaluar la unión específica de los polipéptidos de unión a KDR a las células que expresan KDR o que se han sometido a ingeniería para expresar KDR. Complejos tetraméricos de polipéptidos marcados de unión a KDR de la invención y neutravidina-HRP se pueden preparar y someter a 15 detección selectiva contra células transfectadas para expresar KDR así como células transfectadas de forma simulada (sin ningún KDR).
Como se muestra en el ejemplo 5, el ensayo se puede usar para identificar los polipéptidos unión a KDR que se unen específicamente a las células que expresan KDR (y que no se unen a células que no expresan KDR), incluso 20 cuando la Kd monodentada del polipéptidos es del orden de 200nM-300nM. El ensayo se puede usar para la detección selectiva de construcciones homotetraméricas que contienen cuatro copias de un único polipéptido de unión a KDR de la invención, así como construcciones heterotetraméricas que contienen dos o más polipéptidos de unión a KDR diferentes. Los métodos descritos en el presente documento son particularmente útiles para evaluar combinaciones de polipéptidos de unión a KDR para usar en construcciones multiméricas, particularmente 25 construcciones que contienen dos o más polipéptidos de unión a KDR que se unen a diferentes epítopos de KDR.
El ensayo también puede usarse para evaluar el efecto del suero rápidamente el efecto del suero en los polipéptidos de unión a KDR. De hecho, usando los métodos de detección selectiva divulgados en el presente documento, se identificaron polipéptidos de unión a KDR, tales como las SEC ID N.º: 4 y 31, cuya unión no se ve afectada 30 significativamente por el suero.
Sustitución de enlaces amida
Un tipo de modificación dentro del alcance de la patente es sustituir los enlaces amida dentro de la estructura del 35 polipéptido. Por ejemplo, para reducir o eliminar la proteólisis indeseada u otras vías de degradación que disminuyen la estabilidad en suero, lo que tiene como resultado una reducción o anulación de la bioactividad o para restringir o incrementar la flexibilidad conformacional, es frecuente sustituir los enlaces amida dentro de la estructura de los péptidos con una funcionalidad que imite la conformación existente o altere la conformación del modo deseado. Dichas modificaciones pueden producir un incremento de la afinidad de unión o un mejor comportamiento 40 farmacocinético. Se entiende que los que conocen la técnica de la síntesis peptídica pueden realizar los siguientes cambios del enlace amida para cualquier enlace amida que conecta dos aminoácidos con la expectativa de que los péptidos resultantes puedan tener la misma o mejor actividad: Inserción de alfa-N-metilamidas o de tioamidas en la estructura de la amida peptídica, eliminación del carbonilo para producir las aminas secundarias afines, sustitución de un aminoácido con un aza-aminoácido para producir derivados de semicarbazona y uso de E-olefinas y E-45 olefinas sustituidas como sustitutos del enlace amida.
Modificaciones para mejorar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas
También se entiende que el uso del polipéptido de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR en una aplicación 50 concreta puede requerir modificaciones del péptido o formulaciones del péptido para mejorar el comportamiento farmacocinético y farmacodinámico. Cabe esperar que las propiedades del péptido se puedan modificar mediante unión de los restos que se piensa que den lugar a las propiedades físicas o químicas deseadas. Dichos restos pueden añadirse al péptido usando ácidos o aminas, mediante enlaces amida o enlaces de urea, respectivamente, al extremo N o C del péptido, o al grupo amino colgante de una lisina o derivado de lisina localizada 55 adecuadamente, ácido 2,3-diaminopropiónico, ornitina u otro aminoácido en el péptido que posee un grupo amina colgante o un grupo alcoxiamina o hidracina colgante. Los restos introducidos pueden ser grupos que son grupos aromáticos o alquilo hidrófilos, básicos o no polares dependiendo de péptido de interés y los requisitos existentes para la modificación de sus propiedades.
60
Glicosilación de los residuos de aminoácidos
Otra modificación más dentro del alcance de la invención es emplear residuos de aminoácidos glicosilados (p. ej., residuos de serina, treonina o asparragina), solos o en combinación en cualquiera de los restos de unión o del resto engarce o ambos. La glicosilación, que se puede llevar a cabo usando condiciones convencionales, se puede usar 65 para potenciar la solubilidad, alterar la farmacocinética y la farmacodinámica o para potenciar la unión mediante una
interacción específica o no específica que implica el resto glicosídico. En otro enfoque, los aminoácidos glicosilados tales como O-(2-acetamido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-β-D-glucopiranosil) serina o el derivado análogo de treonina (los aminoácidos D o L) se pueden incorporar en el péptido durante la síntesis peptídica en fase sólida manual o automática o en síntesis peptídica en fase sólida manual o automática. De un modo similar se puede usar la D o L-N-(2-acetamido-2-desoxi-3,4,6-tri-O-acetil-β-D-glucopiranosilo)asparragina. Se ha previsto el uso de aminoácidos 5 glicosilados en una función colgante de oxígeno, nitrógeno o azufre colgante mediante la agencia de restos de hidratos de carbono activados y adecuadamente funcionalizados que se pueden emplear en glicosilación. Dichas funciones de hidratos de carbono podrían ser monosacáridos, disacáridos o incluso ensamblajes más grandes de oligosacáridos (Kihlberg, Jan. (2000) Glycopeptide synthesis. En: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis -A Practical Approach (Chan, W.C. and White, P.D. Eds) Oxford University Press, Nueva York, NY Cap. 8, pág.195-213). 10
También se ha previsto la anexión de las funciones carbohidrato a los aminoácidos por otros medios distintos a la glicosilación mediante la activación de un grupo saliente del carbono anomérico. La unión del aminoácido al glicósido no se limita a la formación de un enlace con el carbono anomérico del la función carbohidrato. En su lugar, la unión del resto carbohidrato al aminoácido podría producirse a través de cualquier átomo de oxígeno, átomo de 15 nitrógeno, átomo de carbono suficientemente reactivo u otro átomo colgante de la función carbohidrato mediante métodos empleados para la formación de enlaces C-heteroátomo, C-C o heteroátomo-heteroátomo (ejemplos son S-S, O-N, N-N, P-O, P-N) conocidos en la técnica.
Formación de sales 20
También entra dentro del alcance de la invención formar diferentes sales que pueden incrementar la solubilidad en agua o la facilidad de la formulación de estos péptidos. Estas pueden incluir, entre oteas, N-metilglucamina (meglumina), acetato, oxalatos, ascorbatos etc.
25
1.) Engarce oxima
El resto oxima se ha usado como engarce por los investigadores en una serie de contextos. De los más interesantes es el trabajo realizado por Mutter y col., (Wahl y Mutter, Tetrahedron Lett., 37:6861-6864 (1996)). Los aminoácidos 4 que contienen una función aminoalcohol y 5 que contienen una función alcoxiamino se incorporan en la cadena 30 peptídica, no necesariamente al final de la cadena peptídica (figura 27). Tras la formación del péptido se eliminan los grupos protectores de la cadena lateral. El grupo aldehído está desenmascarado y se forma un enlace oxima.
2.) Engarce de lantionina
35
Las lantioninas son sulfuros cíclicos en los que el enlace disulfuro (S-S) está sustituido por un enlace carbono-azufre (C-S). Por tanto, la labilidad a la reducción es mucho menor. Las lantioninas se han preparado mediante varios métodos desde 1971.
Engarces 40
Modificaciones adicionales dentro del alcance de la invención incluyen la introducción de engarces o espaciadores entre la secuencia diana del péptido de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR y el marcador detectable. El uso de estos engarces/espaciadores puede mejorar las propiedades relevantes del péptido de unión (p. ej., incrementar la estabilidad en el suero, etc.). Estos engarces pueden incluir, entre otros, cadenas alquilo sustituidas o insustituidas, 45 derivados de polietilenglicol, espaciadores aminoacídicos, azúcares o espaciadores alifáticos o aromáticos comunes en la técnica. Además, los engarces que son combinaciones de los restos descritos anteriormente también se pueden usar para conferir una ventaja especial a las propiedades del péptido. Las moléculas lipídicas con engarces se pueden unir para permitir la formulación de burbujas de ultrasonidos, liposomas u otras construcciones basadas en agregación. Dichas construcciones podrían usarse como agentes para dirigir y liberar un indicador diagnóstico, 50 un agente terapéutico (p. ej., “misil” químico para terapia) o una combinación de estos.
Construcciones multiméricas de polipéptidos de unión a KDR y VEGF/KDR
También se contemplan construcciones que usan dímeros, multímeros o polímeros de uno o más polipéptidos de 55 unión a VEGF o VEGF/KDR de la invención. De hecho, existen muchas pruebas en la literatura de que la unión de péptidos o de moléculas pequeñas de baja potencia o se puede aumentar sustancialmente mediante la formación de dímeros y multímeros. Por tanto, las construcciones diméricas y multiméricas (tanto homogéneas como heterogéneas) están dentro del alcance de la presente invención. De hecho, como se ha tratado con más detalle en los ejemplos, entra dentro del alcance de la presente invención incluir múltiples secuencias de polipéptidos de unión 60 a KDR o al complejo VEGF/KDR en una construcción dimérica o multimérica. Además, como se muestra en el ejemplo 4 más adelante, estas construcciones pueden exhibir una unión mejorada en comparación con una construcción monomérica. Las secuencias polipeptídicas en las construcciones diméricas se pueden unir por su extremo N o C o en el nitrógeno N-épsilon de un resto lisina colocado adecuadamente (u otra función portadora de un grupo derivable selectivamente tal como un grupo oxiamino colgante u otro nucleofílico) o se pueden unir 65 mediante uno o más engarces que usan la química de unión adecuada. Esta química de acoplamiento puede incluir
amida, urea, tiourea, oxima o aminoacetilamida (de derivados de cloro o bromoacetamida, pero no limitados a estos). Por ejemplo, se puede usar cualquiera de los métodos siguientes para preparar construcciones diméricas o multiméricas de KDR o del complejo VEGF/KDR de la invención.
Método A 5
Los péptidos de unión a KDR completamente protegidos se pueden crear en un resina de captura de seguridad de tipo Elman usando protocolos de síntesis peptídica de Fmoc automática o manual. Backes y col., J. Am. Chem. Soc., 118(12):3055-56 (1996). Por separado, usando métodos estándar conocidos en la técnica de la síntesis peptídica se puede construir un derivado de di-lisina sobre resina de 2-clorotritilo. Véanse, por ejemplo, Fields y col., "Principles 10 and Practice of Solid Phase Synthesis" in Synthetic Peptides, A Users Guide, Grant, Ed. (W.H. Freeman Co., Nueva York, 1992), Cap. 3, pág. 77-183; Barlos y col., "Convergent Peptide Synthesis" in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. and White, P.D., Eds. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), Capt. 9, pág. 215-228. La liberación de este de la resina de 2-clorotritilo sin eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral, activación del grupo carboxilo y acoplamiento a cualquier grupo de marcaje funcionalizado con amina proporciona un 15 derivado de di-lisina cuyos átomos de nitrógeno colgantes protegidos puede desenmascararse para dar dos grupos amino libres. La resina de captura de seguridad mencionada anteriormente se activa y el derivado de d-lisina funcionalizado con un grupo de marcaje N-desprotegido deseado se añade a la resina de captura de seguridad activada. Los grupos amino colgantes se acilan mediante el extremo carboxi del péptido unido a la resina de captura de seguridad que ahora se suelta de la resina y una parte integral de la estructura de la di-lisina. Se puede usar un 20 exceso del péptido unido a la resina de captura de seguridad para garantizar una reacción completa de los grupos amino de la construcción de di-lisina. La optimización de la proporción de las parejas de reacción en este esquema optimiza el rendimiento. Los grupos protectores en los péptidos de unión a KDR se eliminan usando protocolos de escisión a base de ácido trifluoroacético.
25
La síntesis de construcciones diméricas y multiméricas en las que dos o más péptidos de unión a KDR están presentes en una construcción se consigue con facilidad. Se pueden usar esquemas de protección ortogonal (tales como un grupo aliloxicarbonilo en un nitrógeno y un grupo Fmoc en el otro o usando el grupo Fmoc junto con el grupo protector iV-Dde en el otro, por ejemplo) para distinguir los átomos de nitrógeno colgantes de los derivados de di-lisina descritos anteriormente. Desenmascarar uno de los grupos amino, seguido de la reacción del producto 30 resultante con un péptido de unión a KDR unido a la resina de captura de seguridad como se ha descrito anteriormente proporciona una construcción de di-lisina que tiene un único péptido de unión a KDR unido. La eliminación del segundo grupo protector desenmascara el nitrógeno que queda. Véase también, Mellor y col., "Synthesis of Modified Peptides" in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. and White, P.D., Eds.. (Oxford University Press, Nueva York, 2000), Capt. 6, pág. 169-176. El producto resultante se puede hacer reaccionar con 35 una segunda resina de captura de seguridad portadora de otro péptido de unión a KDR para proporcionar una construcción homodimérica completamente protegida que, después de la eliminación de los grupos protectores con ácido trifluoroacético, proporciona el material deseado.
Método B 40
Un péptido de unión a KDR se ensambla en una resina de Rink-amida mediante métodos de acoplamiento peptídico automáticos o manuales que normalmente emplean protocolos de síntesis peptídica de Fmoc. El péptido puede poseer un extremo C o un extremo N funcionalizado con un engarce o una construcción de engarce-grupo de marcaje que puede poseer un grupo nucleofílico adicional tal como el grupo ε-amino de un resto lisina, por ejemplo. 45 La escisión de los grupos protectores se consigue usando ácido trifluoroacético con los modificadores adecuados dependiendo de la naturaleza del péptido. El péptido completamente desprotegido se hace reaccionar con un gran exceso de un electrófilo bifuncional, tal como el bis-N-hidroxisuccinimida éster de ácido glutárico disponible comercialmente (Tyger Scientific, Inc.). El éster de mono-N-hidroxisuccinimidilo monoamidado resultante de ácido glutárico se trata después con un equivalente adicional del mismo péptido, o un equivalente de un péptido de unión a 50 KDR diferente. La purificación del material resultante mediante HPLC da la construcción homodimérica deseada portadora de un grupo marcador adecuado.
Método C 55
Se puede usar un esquela modular para preparar construcciones diméricas o multiméricas superiores portadores de grupos marcadores adecuados como se ha definido anteriormente. En una sencilla ilustración, la resina fmoc-lisina (IC-Dde) de Rink se trata con piperidina para eliminar el resto fmoc. Después, una función marcadora, tal como biotina, 5-carboxifluoresceína o N,N-dimetil-Gly-Ser(O-t-Bu)-Cys(Acm)-Gly-OH está acoplada al átomo de nitrógeno. Después, la resina se trata con hidracina para eliminar el grupo iV-Dde. Después de un lavado exhaustivo, la resina 60 se trata con cloruro cianúrico y una base impedida tal como diisopropiletilamina en un disolvente adecuado, tal como DMF, NMP o diclorometano, para proporcionar una diclorotriazina monofuncionalizada unida a la resina. El desplazamiento sucesivo posterior de los átomos de cloro que quedan por dos equivalentes de un péptido de unión a KDR proporciona una construcción funcionalizada con grupo marcador homodimérico unido a la resina. Falorni y col., Tetrahedron Lett., 39(41):7607-7610 (1998); Johnson y col., Tetrahedron Lett., 54(16):4097-4106 (1998); 65 Stankova y col., Mol. Diversity, 2(1/2):75-80 (1996). Los péptidos entrantes pueden estar protegidos o desprotegidos
según la situación lo justifique. La escisión de los grupos protectores se consigue usando reactivos de desprotección basados en ácido trifluoroacético como se ha descrito anteriormente y los materiales deseados se purifican mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.
Se entiende que en cada uno de estos métodos se puede usar en serie derivados de lisina para aumentar la 5 multiplicidad de los multímeros. El uso de moléculas relacionadas más rígidas potadoras del número requerido de átomos de nitrógeno enmascarados o protegidos ortogonalmente para que actúen como armazones para variar la distancia entre los péptidos de unión a KDR, para incrementar la rigidez de la construcción (restringiendo el movimiento y las posiciones relativas de los péptidos de unión a KDR unos respecto de otros y el indicador) está enteramente dentro del alcance de los métodos A-C y todos los demás métodos descritos en el presente 10 documento.
Usos de polipéptidos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR
Los restos de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR de acuerdo con la presente invención serán extremadamente 15 útiles para la obtención de imágenes de KDR o al complejo VEGF/KDR in vitro o in vivo y particularmente, para la detección y/o la obtención de imágenes de sitios de angiogénesis, en los que el VEGF y el KDR están íntimamente implicados, como se ha explicado anteriormente.
In vitro: 20
Para la detección de KDR o al complejo VEGF/KDR en solución, un polipéptido de unión de acuerdo con la invención se puede marcar de forma detectable, por ejemplo se puede marcar de manera fluorescente, después poner en contacto con la solución y después se puede detectar la formación de un complejo entre el polipéptido de unión y la diana KDR o al complejo VEGF/KDR. Como ejemplo, un péptido marcado de manera fluorescente de 25 unión a KDR o al complejo VEGF/KDR se puede usar para ensayos in vitro de detección de KDR o de complejo VEGF/KDR, en los que el péptido se añade a una solución para la que se tiene que hacer una prueba de KDR o complejo VEGF/KDR en condiciones que permitan que se produzca la unión. El complejo entre el péptido marcado de manera fluorescente de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR y la diana de KDR o de complejo VEGF/KDR se puede detectar y cuantificar mediante la medición de la mayor polarización de fluorescencia que surge del péptido 30 unido a KDR o al complejo VEGF/KDR con relación a la del péptido libre.
Para la detección de KDR o de complejo VEGF/KDR solubles en o procedente de una solución, se pueden inmovilizar polipéptidos de unión de la invención sobre un sustrato sólido tal como un soporte cromatográfico u otro material de matriz, después el aglutinante inmovilizado se puede cargar o poner en contacto con la solución en 35 condiciones adecuadas para la formación de un complejo polipéptido de unión : KDR o un complejo polipéptido de unión : VEGF/KDR. La porción que no se une de la solución se puede retirar y se puede detectar el complejo, o la diana de KDR o de complejo VEGF/KDR se puede liberar del resto de unión en condiciones apropiadas de elución.
La biología de la angiogénesis y el papel del VEGF y de la KDR en iniciarla y mantenerla han sido investigados por 40 muchos investigadores y continúan siendo un campo activo para la investigación y el desarrollo.
In vivo: OBTENCIÓN DE IMÁGENES DIAGNÓSTICA 45
Un uso particularmente preferido para los polipéptidos marcados de acuerdo con la presente invención es para crear imágenes visualmente legibles de tejido que expresa KDR, tal como, por ejemplo, tumores neoplásicos, que requieren angiogénesis para supervivencia y metástasis, u otros sitios de actividad angiogénica. Los polipéptidos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR divulgados en el presente documento se pueden convertir en reactivos de 50 formación de imágenes conjugando los polipéptidos con un marcador adecuado para detección diagnóstica, opcionalmente con un engarce. Preferentemente, un péptido que exhibe especificidad mucho mayor para KDR o el complejo VEGF/KDR que para otras proteínas séricas se conjuga o une a un marcador adecuado para la metodología de detección que se va a usar. Por ejemplo, el polipéptido de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR se puede conjugar con o sin un engarce a un pigmento de formación de imágenes óptico. 55
Los engarces adecuados pueden ser cadenas alquilo sustituido o insustituido, cadenas de aminoácidos (p. ej., poliglicina), polietilenglicoles, poliamidas y otros simples engarces poliméricos conocidos en la técnica.
En general, la técnica de usar un resto de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR marcado de forma detectable se 60 basa en la condición de que el marcador genera una señal que se puede detectar fuera del cuerpo del paciente. Por ejemplo, cuando el resto de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR marcado de forma detectable se administra al paciente en el que es deseable detectar, por ejemplo, angiogénesis, la elevada afinidad del resto de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR hace que el resto de unión se una al sitio de la angiogénesis y se acumule en el sitio de la angiogénesis. Se permite suficiente tiempo para que el resto de unión marcado localice en el sitio de la 65 angiogénesis. La señal generada por el péptido marcado se detecta mediante un dispositivo de barrido que variará
de acuerdo con el tipo marcador usado y la señal se convierte después en una imagen del sitio de la angiogénesis.
OBTENCIÓN DE IMÁGENES ÓPTICA, OBTENCIÓN DE IMÁGENES SONOLUMINISCENTE O FOTOACÚSTICA
De acuerdo con la presente invención, se pueden emplear un cierto número de parámetros ópticos para determinar 5 la posición de KDR o complejo VEGF/KDR con la obtención in vivo de imágenes mediante luz tras la inyección del sujeto con un polipéptido ópticamente marcado de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR. Los parámetros ópticos que se han de detectar en la preparación de una imagen pueden incluir radiación transmitida, absorción, emisión fluorescente o fosforescente, reflexión de luz, cambios de la amplitud de la absorbancia o de la absorbancia máxima, y radiación elásticamente dispersada. Por ejemplo, el tejido biológico es relativamente traslúcido a la luz en el 10 intervalo de longitud de onda del infrarrojo cercano (NIR) de 650-1000 nm. La radiación NIR puede penetrar el tejido hasta varios centímetros, permitiendo el uso de los polipéptidos de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR de la presente invención para la obtención de imágenes óptica de KDR o de complejo VEGF/KDR in vivo.
Los polipéptidos de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR se pueden conjugar con fotomarcadores, tales como pigmentos ópticos, incluyendo fluoróforos o cromóforos orgánicos, que tienen extensos sistemas de anillo 15 deslocalizados y que tienen máximos de absorción o emisión en el intervalo de 400-1500 nm. El polipéptido de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR se puede derivatizar alternativamente con una molécula bioluminiscente. El intervalo preferido de máxima de absorción para fotomarcadores es entre 600 y 1000 nm para minimizar la interferencia con la señal procedente de la hemoglobina. Preferiblemente, los marcadores por fotoabsorción tienen absorvatividades molares altas, por ejemplo > 105 cm-1 M-1, mientras que los pigmentos ópticos fluorescentes 20 tendrán altos rendimientos cuánticos. Los ejemplos de pigmentos ópticos incluyen, pero no están limitados a, los descritos en los documentos WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524 y WO 98/47538 y las referencias citadas en ellos. Los fotomarcadores se pueden unir por enlace covalente directamente al péptido de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR o se pueden unir al péptido de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR por mediación de un aglutinante, como se describió 25 previamente.
Tras la inyección del resto ópticamente marcado de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR, el paciente se explora electrónicamente con una o más fuentes de luz (por ejemplo un láser) en el intervalo de longitud de onda apropiado para el fotomarcador empleado en el agente. La luz usada puede ser monocromática o policromática y continua o 30 pulsada. La luz transmitida, dispersada o reflejada es detectada por mediación de un fotodetector sintonizado para una o múltiples longitudes de onda para determinar la posición de KDR o complejo VEGF/KDR en el sujeto. Los cambios en el parámetro óptico se pueden monitorizar a lo largo del tiempo para detectar una acumulación del reactivo ópticamente marcado en el lugar de la angiogénesis. Se pueden usar dispositivos estándar de detección y de procesamiento de imágenes, en combinación con reactivos de obtención de imágenes óptica de la presente 35 invención.
Los reactivos de obtención de imágenes óptica descritos anteriormente también se pueden usar para la obtención de imágenes acústico-óptica o sonoluminiscente realizada con agentes ópticamente marcados de obtención de imágenes (véanse los documentos US 5.171.298 y WO 98/57666 y las referencias citadas en ellos). En la obtención 40 de imágenes acústico-óptica, una radiación de ultrasonidos se aplica al sujeto y afecta a los parámetros ópticos de la luz transmitida, emitida o reflejada. En la obtención de imágenes sonoluminiscente, el ultrasonido aplicado verdaderamente genera la luz detectada. En el documento WO 98/57666 se describen métodos adecuados de obtención de imágenes que usan tales técnicas.
45
OTRAS APLICACIONES TERAPÉUTICAS (SOLO PARA REFERENCIA)
Los polipéptidos marcados de unión a KDR o VEGF/KDR de la presente invención se pueden usar para monitorizar la actividad de los agentes terapéuticos tales como agentes antiangiogénicos o tumoricidas contra angiogénesis indeseada, tal como la que se produce en los tumores neoplásicos. 50
Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, entre otros: agentes antineoplásicos, tales como compuestos de platino (p. ej., espiroplatino, cisplatino y carboplatino), metotrexato, adriamicina, mitomicina, ansamitocina, bleomicina, citosina, arabinósido, arabinosiladenina, mercaptopolilisina, vincristina, busulfán, clorambucilo, melfalán (p. ej., PAM, L-PAM, o mostaza de fenilalanina), mercaptopurina, mitotano, procarbazina clorhidrato, dactinomicina 55 (actinomicina D), clorhidrato de daunorubcina, clorhidrato de doxorubicina, taxol, mitomicina, plicamicina (mitramicina), aminoglutetimida, estramustina fosfato sódico flutamida, leuprólido acetato, megestrol acetateo tamoxifeno citrato, testolactona, trilostana, amsacrinA (m-AMSA), asparraginasa (L-asparraginasa), asparraginasa de Erwina, etopósido (VP-16), interferón cx-2a, Interferón cx-2b, tenipósido (VM-26, vinblastina sulfato (VLB), vincristina sulfato, bleomicina sulfato, adriamicina y arabinosilo; agentes antiangiogénicos tales como inhibidores de 60 la tirosina quinas con actividad frente a las moléculas de señalización importantes en la angiogénesis y/o el crecimiento del tumor, tal como SU5416 y SU6668 (Sugen/Pharmacia & Upjohn), endostatina (EntreMed), angiostatina (EntreMed), Combrestatina (Oxigene), ciclosporina, 5-fluorouracilo, vinblastina, doxorubicina, paclitaxel, daunorubcina, inmunotoxinas; factores de coagulación, antivirales, tales como aciclovir, amantadina azidotimidina (AZT o Zidovudina), ribavirina y monohidrato de vidarabina (adenina arabinósido, ara-A); antibióticos, antipalúdicos, 65 antiprotozoos, tales como cloroquina, hidroxicloroquina, quimina y antimonato de meglumina, antiinflamatorios tales
como diflunisal, ibuprofeno, indometacina, meclofenamato, ácido nefenámico, naproxeno, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, ácido acetilsalicílico y salicilatos
Los polipéptidos de unión y las construcciones de los mismos se pueden administrar por cualquier vía adecuada. Vías de administración adecuadas incluyen, pero nos están limitadas a aplicación tópica, transdérmica, parenteral, 5 gastrointestinal, intravaginal y transalveolar. Las composiciones de la vía de administración deseada se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en las técnicas farmacéuticas, por ejemplo como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª ed., Lippincott, Williams and Wilkins, 2000.
Para aplicación tópica, los polipéptidos de unión pueden estar suspendidos, por ejemplo, en una crema, un gel o un 10 enjuague que permita que los polipéptidos o las construcciones penetren en la piel y entren en el torrente sanguíneo, para una entrega sistémica, o contacten con el área de interés, para una entrega localizada. Las composiciones adecuadas para una aplicación tópica incluyen cualquier base farmacéuticaemnte aceptable en la que los polipéptidos sean al menos mínimamente solubles.
15
Para aplicación transdérmica, los polipéptidos se pueden aplicar en una suspensión farmacéuticamente aceptable junto con un dispositivo transdérmico adecuado o “parche”. Ejemplos de dispositivos transdérmicos adecuados para la administración de los polipéptidos de la presente invención se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 6.165.458, otorgada el 26 de diciembre de 2000 a Foldvari y otros, y la patente de EE.UU. nº 6.274.166 B1, otorgada el 4 de agosto de 2001 a Sintov y otros. 20
Para administración parenteral, los polipéptidos se pueden inyectar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, agua estéril, solución salina y solución salina tamponada (incluidos los tampones como fosfato o acetato), alcohol, aceites 25 vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina etc. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizarte y un anestésico local, tal como lidocaína, para disminuir el dolor en el lugar de la inyección, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales, lubricantes etc., siempre que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos. De un modo similar, la composición puede comprender excipientes convencionales, es decir sustancias portadoras 30 orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para aplicación parenteral, enteral o intranasal que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos. En general, los ingredientes son suministrados por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria como, por ejemplo, polvo liofilizado seco o concentrado sin agua, en un contenedor sellado herméticamente, tal como una ampolla o un sobre, indicando la cantidad de agente activo en unidades de actividad. Cuando la composición se va a administrar mediante infusión, se puede 35 dispensar con un bote de infusión que contiene “agua para inyectables” o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyectables o solución salina de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.
40
Para administración gastrointestinal e intravaginal, los polipéptidos se pueden incorporar en polvos, píldoras o líquidos para su ingestión, y supositorios para su administración rectal o vaginal, farmacéuticamente aceptables.
Para administración transalveolar, bucal o pulmonar, los polipéptidos pueden estar suspendidos en un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para su pulverización e inhalación o como enjuague bucal. Dispositivos 45 adecuados para administración transalveolar tales como atomizadores y vaporizadores también están incluidos dentro del alcance de la invención. Formulaciones adecuadas para una entrega por aerosol de polipéptidos usando rutas buales o pulmonares se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 6.312.665 B1, otorgada el 6 de noviembre de 2001 a Pankaj Modi.
50
Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden administrar por vía nasal u ocular, en cuyo caso el polipéptido está suspendido en un agente líquido farmacéuticamente aceptable adecuado para una dosificación por gotas.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden administrar de tal manera que el polipéptido se libera en el 55 individuo a lo largo de un periodo extenso de tiempo (liberación sostenida o controlada). Por ejemplo, el polipéptido puede estar formulado como una composición tal que una única administración proporciona una entrega del polipéptido durante al menos una semana, o a lo largo de un período de un año o más. Los sistemas de liberación controlada incluyen microcápsulas monolíticas o de tipo depósito, implantes de recipiente, bombas osmóticas, vesículas, micelas, liposomas, parches transdérmicos y dispositivos iontoforéticos. En una realización, los 60 polipéptidos de la presente invención están encapsulados o mezclados en un polímero no tóxico de degradación lenta. En la patente de EE.UU. nº 4.391.797, otorgada el 5 de julio de 1983 a Folkman y otros, se describen formulaciones adicionales adecuadas para una liberación controlada de los polipéptidos proporcionados en el presente documento.
65
El aislamiento de restos de unión a KDR o al complejo VEGF/KDR de acuerdo con la presente invención se ilustrará
adicionalmente en los ejemplos siguientes. Los parámetros específicos incluidos en los ejemplos siguientes se pretende que ilustren la práctica de la invención y no se presentan para limitar de ningún modo el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.
Ejemplos (la materia objeto no reivindicada está presente solo a efectos de referencia) 5 Ejemplo 1: Detección selectiva de la biblioteca contra las dianas KDR y el complejo KDR/VEGF
Las fusiones quiméricas de la región Fc de Ig con KDR humano (n.º 357-KD-050), KDR murino (n.º 443-KD-050), VEGFR-1 humano (n.º 321-FL-050), VEGFR-3 humano (n.º 349-F4-050) y Trail R4 humano (n.º 633-TR-100) se 10 adquirieron en forma sin vehículo (sin BSA) de R & D Systems (Minneapolis, MN). La Fc de Trail R4 es una proteína de fusión de Fc irrelevante con la misma región de fusión de Fc como fusión Fc diana (Fc de KDR) y se usa deplecionando las bibliotecas de aglutinantes de Fc. VEGF165 (n.º 100-20) se adquirió en forma sin vehículo de Peprotech (Rocky Hill, NJ). Las perlas magnéticas de proteína A (n.º 100,02) se adquirieron de Dynal (Oslo, Noruega). La heparina (n.º H-3393) se obtuvo de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Un sistema de 15 tetrametilbencidina de 2 componentes se adquirió de KPL (Gaithersburg, MD).
En los siguientes procedimientos, las placas de microtitulación se lavaron con un lavador de placas Bio-Tek 404 (Winooski, VT). Las señales de ELISA se leyeron con un lector de placas Bio-Tek (Winooski, VT). La agitación de las placas de 96 pocillos se realizó en un agitador LabQuake (Labindustries, Berkeley, CA). 20
Se prepararon ocho bibliotecas de expresión en el fago M13 para detección selectiva contra las dianas de KDR y VEGF/KDR inmovilizados. Bibliotecas de expresión de péptidos cíclicos TN6/VI, TN7/IV, TN8/IX, TN9/IV, TN10/IX, TN12/I y MTN13/I y una biblioteca de expresión lineal, Lin20. El diseño de estas bibliotecas se ha descrito anteriormente. 25
El ADN que codifica la biblioteca se sintetizó con ADN constante en cualquier lado de modo que el ADN se puede amplificar mediante PCR usando la ADN polimerasa Taq (Perkin-Elmer, Wellesley, MA), escindida con NcoI y PstI y ligada en un vector de expresión en fagos sometido a una escisión similar. Las células XL1-Blue MFR’ de E. coli se transformaron con el ADN ligado. Todas las bibliotecas se construyeron del mismo modo. 30
Protocolo de selección de KDR en presencia de heparina
Perlas magnéticas de proteína a se bloquearon una vez con 1X PBS (pH 7,), Tween-20 0,01%, HSA al 0,1 % (tampón de bloqueo) durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron cinco veces con 1X PBS (pH 35 7,), 0,01 % de Tween-20, 5 g/ml de heparina (tampón PBSTH).
Las bibliotecas de péptido cíclico, o “bucle constreñido”, se agruparon para la detección selectiva inicial en dos grupos: TN6/VI, TN7/IV y TN8/IX estaban en un grupo; TN9/IV, TN10/IX y TN12/I estaban en el segundo grupo. Las dos bibliotecas combinadas y la biblioteca lineal (Lin20) se deplecionaron contra la fusión Trail R4 Fc (una Fc de 40 fusión irrelevante (y después se seleccionaron contra la fusión de Fc de KDR. 1011 UNIDADES FORMADORAS DE PLACAS (ufp) de cada biblioteca por 100 l de PBSTH se combinaron juntos, por ejemplo 3 bibliotecas combinadas tendrían como resultado un volumen total de  350 l en PBSTH.
Preparando las perlas de fusión de Fc irrelevantes, a 1000 l de perlas magnéticas de proteína A bloqueadas y 45 lavadas se añadió la fusión Trail R4-Fc (0,1 g/l de la reserva en PBST (sin heparina)). La fusión se dejó unirse a las perlas durante la noche con agitación a 4 ºC. Al día siguiente, las perlas magnéticas se lavaron 5 veces con PBSTH. Cada conjunto de fagos se incubó con 50 l de perlas de fusión Trail R4 Fc en un agitador Labquake durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Después de incubar, el sobrenadante del fago se eliminó e incubó con otros 50 l de perlas Trail R4. Esto se repitió para un total de 5 rondas de depleción eliminando la fusión de Fc 50 inespecífico y el fago de unión de la perla desde las bibliotecas.
Preparando las perlas diana de KDR, a 500 l de perlas lavadas bloqueadas se añadieron 500 l de de la fusión KDR-Fc (0,1 g/l de reserva en PBST (sin heparina)). La fusión KDR-Fc se dejó unirse a las perlas durante la noche con agitación a 4 ºC. Al día siguiente, las perlas magnéticas se lavaron 5 veces con PBSTH. Cada 55 combinación de bibliotecas deplecionadas se añadió a 100 l de perlas KDR-Fc y se dejaron incubar en un agitador Labquake durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Después, las perlas se lavaron lo más rápidamente posible con 5 x 1 ml de PBSTH usando reposo magnético (PROMEGA) separando las perlas del tampón de lavado. El fago todavía unido a las perlas después del lavado se eluyó una vez con 250 l de VEGF (50 g/ml, 1 M) en in PBSTH durante 1 hora a TA en un agitador Labquake. La elución de 1 hora se retiró y se guardó. Después de la primera 60 elución, las perlas se incubaron de nuevo con 250 l de VEGF (50 g/l,  1 M) durante la noche a TA en un agitador LabQuake. Las dos elusiones de VEGF se mantuvieron aparte y se tomó un pequeño alícuota de cada uno para titulación Cada elución se mezcló con un alícuota de XL1-Blue MRF’ (u otra línea celular F’) de células de E. coli que se habían enfriado en hielo después de haberse cultivado hasta la fase semilogarítmica, Las perlas que quedan tras la elución de VEGF se mezclaron también con células amplificando el fago todavía unido a las perlas, 65
es decir el fago de unión a KDR que no se había eliminado por competición mediante las dos incubaciones con VEGF (elusiones de 1 hora y durante la noche O/N)). Después de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, las mezclas fago/célula se extendieron en placas Bio-Assay (243 X 243 X 18 mm, Nalge Nunc) que contienen 250 ml de agar NZCYM con 50 g/ml de ampicilina. La placa se incubó durante la noche a 37 ºC. Al día siguiente, cada cultivo de fagos amplificado se recogió de su correspondiente placa. Al día siguiente, los cultivos de 5 entrada, salida de fagos y amplificados se titularon para su FOI (es decir, fracción de entrada= salida de fagos dividida por entrada de fagos).
En la primera ronda, cada combinación dio tres eluatos amplificados. Estos eluatos se cribaron durante 2-3 rondas adicionales más de selección usando  1010 fagos de entrada/ronda de acuerdo con el mismo protocolo como se ha 10 descrito anteriormente. Para cada ronda adicional, las perlas de KDR-Fc se prepararon la noche antes de iniciar la ronda. Para la etapa de elución en las posteriores rondas, la repetición del cribado de elución amplificada en las pelas de KDR-Fc siempre se eluyó del mismo modo y todas las demás elusiones se trataron como lavados. Por ejemplo, para la elución amplificada recuperada usando las perlas todavía unidas infectando a E. coli, se realizaron elusiones de 1 hora y durante la noche de VEGF y después se descartaron como lavados. Después, las perlas se 15 usaron infectando de nuevo E. coli y producir la siguiente elución amplificada. Usando este procedimiento, cada combinación de bibliotecas dio tres elusiones finales al final de la selección. Dos combinaciones y una biblioteca lineal dieron un total de 9 eluciones finales al final de la selección.
Este procedimiento de selección se repitió para todas las bibliotecas en ausencia de heparina en todos los tampones 20 de unión, es decir sustituyendo PBST (PBS (pH 7,5), 0,01 % Tween-20) por PBSTH en todas las etapas.
Protocolo de selección del complejo KDR:VEGF en presencia de heparina
Las perlas magnéticas de proteína A se bloquearon una vez con tampón de bloqueo durante 30 minutos a 25 temperatura ambiente y después se lavaron cinco veces con PBSTH.
Dos grupos de bibliotecas de bucles restringidos y una biblioteca lineal (Lin20) se prepararon como antes y después se deplecionaron contra la fusión de KDR Fc sola en lugar de la fusión Trail-R4 Fc eliminando los aglutinantes del receptor sin VEGF unido. Una vez deplecionadas, las bibliotecas se seleccionaron contra el complejo KDR:VEGF165. 30
Preparando las perlas de fusión de KDR-Fc a 1 ml de perlas bloqueadas y lavadas se añadió 1 ml de la fusión KDR-Fc (0,1 g/l de la reserva en PBST (sin heparina)). La fusión se dejó unirse a las perlas durante la noche con agitación a 4 ºC. Al día siguiente, las perlas magnéticas se lavaron 5 veces con PBSTH. Cada conjunto de fagos se incubó con 50 l de perlas de fusión KDR-Fc en un agitador Labquake durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). 35 Después de incubar, el sobrenadante del fago se eliminó e incubó con otros 50 l de perlas KDR-Fc. Esto se repitió durante un total de 5 rondas de depleción.
Preparando las perlas del complejo KDR:VEGF, 300 l de las perlas de fusión KDR-Fc anteriores se incubaron con 15 l de VEGF (1 mg/ml). El VEGF se dejó unir durante 1 hora a TA. Las perlas se lavaron 5 veces con PBSTH. 40 Cada combinación de bibliotecas deplecionadas se añadió a 100 l de perlas del complejo KDR:VEGF y se dejaron incubar en un agitador Labquake durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Después, las perlas se lavaron lo más rápidamente posible con 5 x 1 ml de PBSTH usando reposo magnético (PROMEGA) separando las perlas del tampón de lavado. Eluyendo el fago todavía unido después de lavar, las perlas se mezclaron con células amplificando el fago todavía unido a las perlas. Después de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, 45 las mezclas fago/célula se extendieron en placas Bio-Assay (243 X 3,243 X 18 mm, Nalge Nunc) que contienen 250 ml de agar NZCYM con 50 g/ml de ampicilina. La placa se incubó durante la noche a 37 ºC. Al día siguiente, cada cultivo de fagos amplificado se recogió de su correspondiente placa. Al día siguiente, los cultivos de entrada, salida de fagos y amplificados se titularon para su FOI. Este protocolo de selección se repitió durante dos rondas adicionales usando 1010 fagos de entrada de cada elución amplificada. 50
Ensayo de detección selectiva con KDR y KDR/VEGF
Se añadieron 100 l de la fusión KDR-Fc o la fusión Trail R4-Fc (1 g/ml) a placas por duplicado Immulon II a cada pocillo y se dejaron incubar a 4 ºC durante la noche. Cada placa se lavó dos veces con PBST (PBS, 0,05 % Tween-55 20). Los pocillos se llenaron hasta arriba con 1X PBS, 1 % de BSA y se dejaron incubar a TA durante 2 horas. Cada placa se lavó una vez con PBST (PBS, 0,05 % Tween-20).
Evaluando la unión al complejo KDR:VEGF se preparó otro conjunto de placas de KDR como antes y después a cada pocillo con KDR se añadieron 100 l de VEGF (1 g/l) en PBST y se dejaron incubar a TA durante 30 60 minutos. Cada placa se lavó después con PBST (PBS, 0,05 % Tween-20).
Una vez preparadas las palcas, cada cultivo de fagos durante la noche se diluyó a 1:1 (o hasta 1010 ufp si se usa la reserva de fagos purificados) con PBS, 0,05 % de Tween-20, 1 % de BSA. Se añadieron 100 l de cada cultivo diluido y se dejaron incubar a TA durante 2-3 horas. Cada placa se lavó 5 veces con PBST. El fago de unión se 65
visualizó añadiendo 100 l de una dilución a 1:10.000 del conjugado HRP-anticuerpo anti-M13 ((Pharmacia), se diluyó en PBST, a cada pocillo, incubando después a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada placa se lavó 7 veces con PBST (PBS, 0,05 % Tween-20), después las placas se desarrollaron con sustrato de HRP ( 10 minutos) y la señal de absorbancia (630 nm) se detectó con un lector de placas.
5
Se recuperaron los fagos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR, se amplificaron y las secuencias de los péptidos de expresión responsables de la unión se determinaron mediante métodos de secuenciación de ADN estándar.
Tras el aislamiento de los aislados de KDR y al complejo VEGF/KDR en las rondas de selección iniciales se seleccionaron ciertos aislados para actuar como moldes para la construcción de bibliotecas secundarias de las que 10 se aislaron polipéptidos de unión de alta afinidad adicionales. En una biblioteca secundaria de TN8, la secuencia del aislado del fago PKWCEEDWYYCMIT (SEC ID N.º: 1) se usó como molde construyendo una biblioteca que permitió mutaciones de una, dos y tres bases en la secuencia parental en cada codón variable. En una biblioteca secundaria de TN12, la secuencia del aislado del fago RVCWEDSWGGEVCFRY (SEC ID N.º: 3) se usó como molde construyendo una biblioteca que permitió mutaciones de una, dos y tres bases en la secuencia parental en cada 15 codón variable. En otra biblioteca secundaria de TN8, un motivo recurrente de las secuencias de TN8 iniciales se mantuvo constante (WVEC---TG-C---) y todas las demás posiciones del codón (es decir, en "-") se dejaron variar (todos los 20 posibles aminoácidos) usando la sustitución del codón NNK, en el que N es cualquier nucleótido y K representa cualquier nucleótido ceto (G o T).
20
Usando un método de optimización peptídica por aleatorización suave como han descrito Fairbrother y col., Biochemistry, 37(51):17754-17764 (1998), se prepararon dos bibliotecas en base a las secuencias de la SEC ID N.º: 1 y la SEC ID N.º: 3. En cada posición del residuo, cada nucleótido dentro de un codón concreto se dejó evolucionar añadiendo cantidades fijas de los otros tres nucleótidos que no correspondían al nucleótido del codón parental. Esta mezcla de nucleótidos se consigue en la síntesis del ADN molde usado fabricando la biblioteca. Para estas 25 bibliotecas, el nucleótido parental dentro de cada codón se mantuvo al 64 % para la SEC ID N.º: 1 y al 67 % para la SEC ID N.º: 3, mientras que los otros nucleótidos se añadieron a la frecuencia que queda dividida por tres. Dado que los nucleótidos parentales están en la mayoría, la secuencia consenso global para toda la biblioteca debería contener la secuencia parental. No obstante, la inspección de aislados individuales muestra que son posibles múltiples mutaciones de modo que se permite la selección de péptidos con mejor capacidad de unión en 30 comparación con la secuencia parental.
Para la tercera biblioteca, el motivo TN8 descrito anteriormente se mantuvo constante y todas las demás posiciones se dejaron variar con sustitución NNK en el oligonucleótido molde. Extendiendo la sustitución también se permitió diversidad de NNK en las dos posiciones de aminoácidos flanqueantes, de modo que se añaden posiciones de 35 aminoácidos variables en N-terminal y C-terminal al péptido de expresión. Al contrario que las dos bibliotecas anteriores en las que la secuencia consenso sigue siendo la secuencia parental, esta biblioteca fue bastante diversa en todas las posiciones permitidas y solo se asemejó al motivo parental en los residuos que se mantuvieron constantes.
40
Un total de 2 x 1011 ufp de cada biblioteca se usó como antes a excepción de que se cambió la estrategia de elución. Se realizó elución por competición del fago unido usando el péptido parental (50 M) que se usó fabricando la biblioteca secundaria concreta (es decir, los péptidos de las SEC ID N.º: 21, 88 y 40, respectivamente).Los fagos de unión se eluyeron a través de tres etapas: (1) elución durante 1 hora a temperatura ambiente, siendo usado el fago eluido infectando las células para amplificación, (2) elución durante la noche, en la que se añadió péptido de elución 45 por competición fresco al fago unido y se incubó a 4 ºC durante la noche con mezclado, usándose el fago eluido infectando células para amplificación y (3) las perlas que quedan (portadoras del fago de unión sin eluir) infectando las células directamente. Se realizaron tres rondas de selecciones. Las placas se escogieron de las rondas 2 y 3 y se analizaron mediante ELISA y secuenciación. Los aislados positivos para KDR se analizaron además según la competición con péptido parental libre 50 mM. Los péptidos que mostraban una competición mínima con el péptido 50 parental se consideraron aglutinantes de mayor afinidad y se sintetizaron.
Ejemplo 2: Síntesis peptídica y marcaje con fluoresceína
Determinados péptidos de unión a KDR o a complejo VEGF/KDR correspondientes a aislados de fagos positivos se 55 sintetizaron en fase sólida usando los protocolos de 9-dluorenilmetoxicarbonilo y se purificaron mediante cromatografía de fase inversa. Las masas peptídicas se confirmaron mediante espectrometría de masas por electropulverización y los péptidos se cuantificaron mediante absorbancia a 280 nm. Para la síntesis, se conservaron dos aminoácidos en N-terminal y dos en C-terminal de la secuencia del vector del fago de la que se escindió el péptido y se añadió un engarce -Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 al extremo C de cada péptido. Cada péptido se aciló en el 60 extremo N. Para los péptidos con residuos de lisina seleccionados, estos se protegieron con 1-(4,4-dimetil-2,6dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutilo (ivDde), lo que permite el acoplamiento selectivo a la lisina en C-terminal, no se elimina durante la escisión peptídica y se puede eliminar tras el acoplamiento con hidracina al 2 % en DMF o hidroxilamina 0,5M, a pH 8, en agua.
65
Cada péptido se marcó con fluoresceína en la lisina en C-terminal usando fluoresceína (derivado de N-
hidroxisuccinimida éster) i isotiocianato de fluoresceína (FITC) en DMF, diisopropilamina al 2 % (DIPEA). Si el péptido contenía una lisina protegida con ivDde, la reacción se inactivó mediante la adición de hidracina al 2 %, que reacciona con toda la NHS-fluoresceína libre y elimina el grupo protector interno. Para todos los demás péptidos, la reacción se inactivó mediante la adición de un volumen igual de hidroxilamina 0,5M, pH 8. Las reacciones inactivadas se diluyeron después con agua hasta menos de 10 % de DMF y después se purificaron usando 5 cromatografía de fase inversa de C18. Los péptidos se caracterizaron según la pureza y la masa corregida en un sistema de CL-EM (HP1100 HPLC con espectrómetro de masas de un cuadrapol SCIEX AP150 integrado).
Ejemplo 3: Mediciones de la anisotropía de fluorescencia y ensayos BiaCore
10
Las mediciones de la anisotropía de fluorescencia se realizaron en microplacas de 384 pocillos en un volumen de 10 l en tampón de unión (PBS, 0,01 % Tween-20, pH 7,5) usando un lector de placas de polarización de fluorescencia Tecan Polarion. En algunos casos, al tampón de unión se añadió heparina (0,5 g/ml) o 10 % de suero humano (datos no mostrados). La concentración del péptido marcado con fluoresceína se mantuvo constante (20 nM) y la concentración de KDR-Fc (o de una diana similar) se varió. 15
Las mezclas de unión se equilibraron durante 10 minutos en la microplaca a 30 ºC antes de la medición. El cambio observado en la anisotropía se ajustó a la siguiente ecuación mediante regresión no lineal obteniendo la KD aparente. Esta ecuación (1) supone que el péptido sintético y el KDR forman un complejo reversible en solución con estequiometría a 1:1. 20
En la que robs es la anisotropía observada, rlibre es la anisotropía del péptido libre, runido es la anisotropía del péptido unido, KD es la constante de disociación aparente, KDR es la concentración total de KDR y P es la concentración de 25 péptido marcado con fluoresceína total. KD se calculó en un ensayo de unión directa (KD.B) (véase la tabla 1) y por tanto, estos valores representan la unión de KDR al péptido marcado con fluoresceína.
Para las determinaciones BiaCore de KD, KDR-Fc (u otras dianas proteicas) se cruzó con la superficie de dextrano de un circuito sensor de CM5 mediante el procedimiento de acoplamiento de amina estándar (soluciones 0,5 mg/ml 30 diluidas a 1:20 con acetato 50 mM, pH 6,0, RL KDR-Fc = 12859). Los experimentos se realizaron en tampón HBS-P (HEPES 0,01m, pH 7,4, NaCl 0,15M, 0,005 % de polisorbato 20 (v/v). Las soluciones peptídicas cuantificadas mediante el coeficiente de extinción se diluyeron a 40 nM en HBS-P. Se realizaron diluciones en serie produciendo soluciones de 200, 100, 50 y 25 nM. Para asociación, los péptidos se inyectaron a 20 ml/min durante 1 minuto usando el programa kinject. Tras disociación de 1 minuto, cualquier péptido que quedase se raspó de la superficie 35 diana con una inyección rápida de NaCl 1M durante 25 segundos a 50 l/min. Todas las muestras se inyectaron por duplicado. Entre cada serie de péptido, una inyección de tampón y una inyección de péptido de unión no diana sirvió como controles adicionales. Los sensogramas se analizaron usando el programa de ajuste de ka/KD simultáneo en el software BIAevaluation 3.1. La KD aparente mediante este método se indica como BiaKD en la tabla 1. Al contrario que los experimentos anteriores de anisotropía por fluorescencia, el péptido sin marcar se usó para todas las 40 pruebas usando este ensayo y por tanto, estos valores representan la unión de KDR al péptido no marcado. Las afinidades de unión determinadas para los polipéptidos sintetizados se indican en la tabla 1 más adelante. Los supuestos restos de péptidos cíclicos constreñidos por disulfuro de los polipéptidos están subrayados.
Tabla 1: Afinidades de unión para péptidos sintetizados 45
Secuencia
KD.B (μM) BiaKD (μM) SEC ID Nº
TN8
AGDSWCSTEYTYCEMIGTGGGK
>2 4
AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK
0,28 0,027 5
AGVWECAKTFPFCHWFGTGGGK
2,60 6
AGWVECWWKSGQCYEFGTGGGK
1,3 7
AGWIQCNSITGHCTSGGTGGGK
0,24 8
AGWIECYHPDGICYHFGTGGGK
0,32 0,32 9
AGSDWCRVDWYYCWLMGTGGGK
0,064 10
AGANWCEEDWYYCFITGTGGGK
0,310 11
AGANWCEEDWYYCWITGTGGGK
0,097 12
AGPDWCEEDWYYCWITGTGGGK
0,075 13
AGSNWCEEDWYYCYITGTGGGK
0,046 14
AGPDWCAADWYYCYITGTGGGK
0,057 15
AGPEWCEVDWYYCWLLGTGGGK
0,075 16
AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK
0,0032 0,079 17
AGSKWCEQDWYYCWLLGTGGGK
0,400 18
AGRNWCEEDWYYCFITGTGGGK
0,190 19
AGVNWCEEDWYYCWITGTGGGK
0,260 20
AGANWCEEDWYYCYITGTGGGK
0,180 21
AGQAWVECYAETGYCWPRSWGTGGGK
0,71 22
AGQAWIECYAEDGYCWPRSWGTGGGK
1,40 23
AGVGWVECYQSTGFCYHSRDGTGGGK
1,30 24
AGDWWVECRVGTGLCYRYDTGTGGGK
0,93 25
AGDSWVECDAQTGFCYSFLYGTGGGK
2,30 26
AGERWVECRAETGFCYTWVSGTGGGK
2,10 27
AGGGWVECRAETGHCQEYRLGTGGGK
1,60 28
AGVAWVECYQTTGKCYTFRGGTGGGK
2 29
AGEGWVECFANTGACFTYPRGTGGGK
2,10 30
TN12
GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK
0,069 0,12 31
GDDSYCMMNEKGWWNCYLYDPGGGK
1,3 32
GDPAQCWESNYQGIFFCDNPDPGGGK
2,3 33
GDGWACAKWPWGGEICQPSDPGGGK
1,0 1,5 34
GDSSVCFEYSWGGEVCFRYDPGGGK
0,058 104
GDSRVCWEYSWGGQICLGYDPGGGK
0,32 105
Lin20
AQQVQYQFFLGTPRYEQWDLDKGGK
1,7 35
AQEPEGYAYWEVITLYHEEDGDGGK
0,27 0,73 36
AQAFPRFGGDDYWIQQYLRYTDGGK
0,53 0,25 37
AQGDYVYWEIIELTGATDHTPPGGK
0,18 38
AQRGDYQEQYWHQQLVEQLKLLGGK
0,31 5,3 39
AQRSWYLGPPYYEEWDPIPNGGK
1,8 40
AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGK
0,05 41
Para el análisis de los péptidos que se unen específicamente al complejo KDR/VEGF, de cada péptido se analizó su unión al complejo en ambos ensayos (anisotropía de fluorescencia /Biacore) como anteriormente. En el ensayo de anisotropía, el complejo KDR-VEGF se formó mezclando un exceso molar por dos de VEGF con KDR-Fc. Esta mezcla se usó después en la titulación de la unión directa usando un péptido marcado con fluoresceína como se ha 5 hecho anteriormente. Como control, cada péptido también se analizó según su unión a KDR y VEGF solos evaluando su especificidad por el complejo. Dado que ninguno de los péptidos se unió a VEGF en ninguna medida,
la presencia de exceso de VEGF en el ensayo no debería afectar a la determinación de la KD. Como se muestra en la tabla 2, más adelante, todos los péptidos mostraron una espectacular preferencia de unión, la unión por el complejo KDR/VEGF sobre por VEGF. No obstante, algunos de ellos sí mostraron alguna unión residual al KDR libre. Para confirmar los resultados de anisotropía, los péptidos no marcados se analizaron en Biacore como antes, a excepción de que el circuito estaba saturado con VEGF formando el complejo KDR/VEGF anterior a la inyección de 5 los péptidos. En los péptidos analizados, la BiaKD estaba dentro de al menos 2 veces la medición de la anisotropía.
Tabla 2: Péptidos específicos del complejo KDR/VEGF
SEC ID Nº
Secuencia KD, B (KDR) KD, B (VEGF) KD, B (KDR/VEGF) BiaKD (KDR/VEGF)
42
AQAPAWTFGTNWRSIQRVDSLTGGGGGK NB NB 0,84
43
AQEGWFRNPQEIMGFGDSWDKPGGGGGK NB NB 1,4
MÉTODOS PARA LOS EJEMPLOS 4-10 10
Los métodos siguientes se usaron en los ejemplos 4-10. Se usan las siguientes abreviaturas habituales. 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), N-metilpirrolidinona (NMP), anhídrido acético (Ac2O), (4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutilo (ivDde), ácido trifluoroacético (TFA), Reactivos B (TFA: H2O fenol: Triisopropilsilano 88:5:5:2) diisopropiletilamina (DIEA), O-(1H-15 benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HBTU),O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU), N-hidroxisuccinimida (NHS), síntesis peptídica en fase sólida SPFS), dimetilsulfóxido (DMSO), diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF) y N-metilpirrolidinona (NMP), seroalbúmina humana (HSA) y pureza radioquímica (RCP).
20
Método 1 para los sintetizadores ACT 357 MPS y ACT 496 MOS
Los péptidos se sintetizaron en una resina NovaSyn TGR (amida de Rink) (0,2 mmol/g) usando los sintetizadores Advanced ChemTech ACT 357 o ACT 496 que usan protocolos de síntesis peptídica de Fmoc, usando específicamente HOBt/DIC como los reactivos de acoplamiento y NMP como el disolvente. El Fmoc se eliminó 25 tratando el péptido unido a la resina Nova-Syn TGR (amida de Rink disponible en NovaBiochem, San Diego CA) con 25 % de piperidina en DMF dos veces (4 minutos y 10 minutos). Todos los aminoácidos se disolvieron en NMP (se añadió DMF cuando el aminoácido no era soluble en NMP puro). La concentración del aminoácido fue 0,25M y las concentraciones para HOBt y DIC fueron, respectivamente, 0,5M. Para una síntesis a escala de 0,04 mmol:
30
Un ciclo de acoplamiento de aminoácido típico (no incluido en las etapas de lavado) era dispensar solución de piperidina (2,4 ml) a cada pocillo y mezclar durante 4 minutos, después vaciar todos los pocillos. En cada pocillo se dispensaron NMP (320 l), solución HOBt (320 l, 4 eq.), aminoácido (640 l. 4 eq.) y DIC (320 l, 4 eq.). El tiempo de acoplamiento fue de 2 horas; después se lavó la resina. El ciclo se repitió para cada aminoácido. Después del acoplamiento del último aminoácido, el péptido unido a resina se trató con 25 % de piperidina eliminando el grupo 35 protector Fmoc. Después de lavar, el péptido unido a resina se taponó con Ac2O 1,0M (1,2 ml por pocillo) y diisopropilmetilamina en DMF, incluyendo opcionalmente varias cantidades de HOBt en la mezcla durante 30 minutos, La resina se lavó con metanol y después diclorometano y se secó, La escisión de los péptidos de la resina y la desprotección de la cadena lateral se consiguió usando reactivo B durante 4,5 horas. Las soluciones de escisión se recogieron y las resinas se lavaron con un alícuota adicional de reactivo B. Las soluciones combinadas se 40 concentraron hasta sequedad. Se añadió éter al residuo con agitación suave o agitación precipitando los péptidos. El éter se decantó y se recogió el sólido. Este procedimiento se repitió 2-3 veces para eliminar las impurezas. Los péptidos lineales brutos se disolvieron en mezclas de agua y DMSO y se purificaron mediante HPLC (columna: Waters Associates Xterra C18, 19 3 50 mm; disolventes: H2O con 0,1 % TFA y CH3CN con 0,1 % TFA; UV 220 m; Caudal: 50-60 ml/min). Las soluciones que contienen el péptido se liofilizaron dando los péptidos deseados como 45 liofilizados esponjosos blancos (pureza > 90 %). Los péptidos que contienen di-cisteína lineal purificada se disolvieron en agua, las mezclas de agua-acetonitrilo o las mezclas de agua-DMSO a concentraciones entre 0,1 mg/ml y 2,0 mg/ml. La elección del disolvente fue una función de la solubilidad del péptido bruto en el disolvente. El pH de la solución se ajustó a un pH 7,5-8,5 con amoníaco acuoso, carbonato amónico acuoso o bicarbonato amónico acuoso. La mezcla se agitó enérgicamente en aire durante 24 - 48 horas. En el caso de los sistemas de 50 disolventes que no contienen DMSO, el pH de la solución se ajustó a pH 2 con ácido trifluoroacético acuoso. La mezcla se liofilizó proporcionando el péptido que contiene disulfuro cíclico bruto. El péptido disulfuro cíclico se disolvió después hasta un volumen de 1 - 2 ml en acuosa (0,1 % de TFA) que contiene un mínimo de acetonitrilo (0,1 % TFA). La solución resultante se cargó en una columna de fase inversa y el compuesto deseado obtenido mediante una elución por gradiente de acetonitrilo en agua, usando una columna para HPLC preparativa o 55 semipreparativa de fase inversa de C 18 o C 8. En el caso de las soluciones que contienen DMSO, la solución se diluyó hasta que la concentración de DMSO fue mínima sin precipitación del péptido. La mezcla resultante se acidificó rápidamente hasta un pH 2 con ácido trifluoroacético diluido y se cargó en el sistema de HPLC de fase inversa y se purificó como se ha descrito. Las fracciones que contienen los materiales deseados se combinaron y los péptidos se aislaron mediante liofilización. 60
Método 2 para los sintetizadores ACT 357 MPS y ACT 496 MOS
Los péptidos se sintetizaron como en el método 1 con los siguientes cambios. Se usó HBTU/HOBt/DIEA como reactivo de acoplamiento y NMP como el disolvente. Una nueva carga ( 0,2 mmol/g de Fmoc-GGGK(Boc)-NovSyn-TGR-resina preparada de la resina Nova-Syn TGR descrita anteriormente se usó para la síntesis peptídica a escala 5 de 0,01 mmol. Para una síntesis a escala de 0,01 mmol:
Una vez eliminado el grupo Fmoc, un procedimiento de acoplamiento estándar usó una solución de HOBt (720 l, 6 eq.), aminoácido (804 l, 6,6 eq.), HBTU (720 l, 6 eq.) y DIEA (798 l, 13,3 eq). La mezcla se agitó durante 15 minutos, se vació y la resina se lavó. Después de todos los acoplamientos y tras la escisión y purificación como 10 anteriormente, las soluciones que contienen los péptidos lineales deseados se liofilizaron dando los péptidos (pureza > 90 %) como sólidos blancos esponjosos. Los péptidos que contienen di-cisteína lineal bruta precipitada en éter se ciclaron mediante disolución en agua, mezclas de acetonitrilo acuoso (0,1 % de TFA) o DMSO acuoso y ajuste del pH de la solución hasta un PH 7,5 - 8,5 mediante la adición de amoníaco acuoso, carbonato amónico acuoso o solución de bicarbonato amónico acuoso. La concentración del péptido estaba entre 0,1 y 2,0 mg/ml. La mezcla se 15 agitó al aire durante 24 - 48 horas, se acidificó hasta un pH de 3 con ácido trifluoroacético acuoso y después se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa usando un gradiente de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contienen el material deseado se combinaron y los péptidos se aislaron mediante liofilización.
Método 3 para el sintetizador ACT 496 MOS 20
Los péptidos se sintetizaron usando un sintetizador Advanced ChemTech ACT 496 MOS como en el método 1. La carga baja ( 0,2 mmol/g) de resina GGGK(Boc)-NovaSyn-TGR se usó para la síntesis peptídica. El disolvente de acoplamiento fue NMP/DMSO 8:2. La síntesis se realizó a escala de 0,02 mmol usando un tiempo de acoplamiento de 3 horas. Los péptidos lineales brutos se procesaron adicionalmente como se ha descrito para el método 1. 25
Método 4 para el sintetizador ACT 496 MOS
Los péptidos se sintetizaron usando el método 3 en el ACT 496 con HBTU/DIEA como los reactivos de acoplamiento y NMP como el disolvente. Como la base se usó 2,4,6-colidina como una solución 1M. La baja carga de resina 30 Fmoc-GGGK (ivDde)-Novsyn-TGR ( 0,2 mmol/f) para la síntesis peptídica. El tiempo de acoplamiento fue de 30 minutos. Los péptidos lineales brutos se procesaron adicionalmente como se ha descrito para el método 1.
Método 5 para el sintetizador ABI 433A 35
La síntesis de los péptidos se llevó a cabo en una escala de 0,25 mmol usando el protocolo FastMoc (Applied Biosystems Inc). En cada ciclo de este protocolo se disolvió 1,0 mmol de un aminoácido protegido seco en un cartucho en una solución de 0,9 mmol de HBTU, 2 mmol de DIEA y 0,9 mmol de HOBt en DMF con NMP adicional añadido.
40
Los péptidos se fabricaron usando 0,1 mmol de resina NovaSyn TGR (amida de Rink) (sustitución de resina 0,2 mmol/f). El tiempo de acoplamiento en este protocolo fue de 21 min. La desprotección de Fmoc se llevó a cabo con 20 % de piperidina en NMP. Al final del último ciclo, el péptido sintetizado se acetiló usando anhídrido acético/DIEA/HOBt/NMP. La resina peptídica se lavó y se secó para manipulaciones adicionales o se escindió de la resina (usando el reactivo B). En general, los péptidos escindidos se ciclaron como en el método 1 antes de la 45 purificación.
Método 6: Biotinilación de péptidos unidos a resina
Los péptidos se prepararon usando el método 5. El grupo protector ivDde de la lisina en C-terminal se eliminó de 50 forma selectiva mediante tratamiento con 10 % de hidracina en DMF. La resina se trató después con una solución de biotina-éster N-hidroxisuccinimidílico en DMF en presencia de DIEA. Después de lavar, se secó la resina y se realizó la escisión usando reactivo B. La resina se filtró y el filtrado se concentró hasta sequedad. El péptido biotinilado se disolvió en DMSO neto y se trató con DIEA y se agitó durante 4 - 6 efectuando la ciclación de disulfuro. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa. 55
En un experimento típico, 200 mg de péptido unido a la resina se trataron con 10 % de hidracina en DMF (2 X 20 ml) y se lavaron con DMF (2 x 20 ml) y después con diclorometano (1 x 20 ml). La resina se resuspendió en DMF (10 ml) y se trató con una solución de éster de biotina-NHS (0,2 mmol, 5 equivalentes) y DIEA (0,2 mmol) y la resina se mezcló con los reactivos durante 4 horas. La finalización de la reacción se comprobó mediante la prueba de la 60 ninhidrina. Después, el péptido se liberó de la resina mediante tratamiento con reactivo B (10 ml) durante 4 horas. La resina se filtró, se eliminó el reactivo B al vacío y el péptido se precipitó mediante la adición de éter anhidro. Se recolectó el sólido formado, se lavó con éter y se secó. El sólido se disolvió en DMSO anhidro y la mezcla se ajustó hasta un pH 7,5 co DIEA y se agitó durante 4 - 6 efectuando la ciclación de disulfuro. La reacción de ciclación se monitorizó mediante HPLC analítica. Después de la finalización de la ciclación, la solución de la mezcla se diluyó 65
con 25 % de acetonitrilo en agua y se purificó directamente mediante HPLC en una columna de C18 de fase inversa usando un gradiente de acetonitrilo en agua (ambos con 0,1 % de TFA). Las fracciones se analizaron mediante HPLC analítica y las que contienen el producto puro se recolectaron y liofilizaron obteniendo el péptido biotinilado requerido.
5
Método 7: Biotinilación de péptidos purificados
El péptido purificado (10 mg, preparado mediante los métodos 1-5) que contiene un grupo amino libre se disolvió en DMF o DMSO anhidro (1 ml) y se añadió biotina-NHS-éster (5 equivalentes) y DIEA (5 equivalentes). La reacción se monitorizó mediante HPLC y tras la finalización de la reacción (1 - 2 horas), la mezcla de reacción bruta se purificó 10 directamente mediante HPLC preparativa. Las fracciones se analizaron mediante HPLC analítica y las que contienen el producto puro se recolectaron y liofilizaron obteniendo el péptido biotinilado requerido.
Método 8: Biotinilación de péptidos unidos a resina que contienen engarces 15
En un experimento típico, 400 mg del péptido que contiene resina (fabricado usando el sintetizador ABI 433A y portando una lisina protegida con ivDde) se trataron con 10 % de hidracina en DMF (2 X 20 ml). La resina se lavó con DMF (2 x 20 ml) y DCM (1 x 20 ml). La resina se resuspendió en DMF (2 X 20 ml) y se trató con Fmoc-ácido aminodioxaoctanoico (0,4 mmol), HOBt (0,4 mmol), DIC (0,4 mmol), DIEA (0,8 mmol) mezclando durante 4 horas. Después de la reacción, la resina se lavó con DMF (2 X 10 ml) y con DCM (1 x 10 ml). La resina se trató después 20 con 20 % de piperidina en DMF (2 x15 ml) durante 10 minutos cada vez. La resina se lavó y el acoplamiento con Fmoc-ácido diaminodioxaoctanoico y la eliminación del grupo protector Fmoc se repitieron una vez más. La resina resultante, que contiene un péptido con un grupo amino libre, se trató con una solución de biotina-NHS éster (0,4 mmol, 5 equivalentes) y DIEA (0,4 mmol, 5 equivalentes) en DMF durante 2 horas. La resina-péptido se lavó y se secó como se ha descrito anteriormente y después se trató con el reactivo B (20 ml) durante 4 horas. La mezcla se 25 filtró y el filtrado se concentró hasta sequedad. El residuo se agitó con éter produciendo un sólido que se recogió, se lavó con éter y se secó. El sólido se disolvió en DMSO anhidro y el pH se ajustó hasta 7,5 con DIEA. La mezcla se agitó durante 4 - 6 horas efectuando la reacción de ciclación con disulfuro, que se monitorizó mediante HPLC analítico. Tras la finalización de la ciclación, la solución de DMSO se diluyó con 25 % de acetonitrilo en agua y se aplicó directamente a una columna C-18 de fase inversa. La purificación se efectuó usando un gradiente de 30 acetonitrilo en agua (ambos con 0,1 % de TFA). Las fracciones se analizaron mediante HPLC analítica y las que contienen el producto puro se recolectaron y liofilizaron proporcionando el péptido biotinilado requerido.
Método 9: Formación de péptidos marcados con 5-carboxifluoresceína 35
La resina-péptido obtenida mediante el método 5, que contiene un grupo protector ivDde en el nitrógeno épsilon de la lisina, se mezcló con una solución de hidracina en DMF (10 % de hidracina/DMF, 2 x 10 ml, 10 min) eliminando el grupo ivDde. El nitrógeno épsilon de la lisina se marcó con fluoresceína-5-isotiocianato (0,12 mmol) y diisopropiletilamina (0,12 mmol) en DMF.
40
La mezcla se agitó durante 12 horas (compuestos que contienen fluoresceína se protegieron de la luz). La resina se lavó después con DMF (3 x 10 ml) y dos veces con CH2Cl2 (10 ml) y se secó en nitrógeno durante 1 hora. El péptido se escindió de la resina usando el reactivo B durante 4 horas y la solución se recogió mediante filtración. Los volátiles se eliminaron a presión reducida y el residuo se secó al vacío. El péptido se precipitó con éter, se recolectó y el precipitado se secó en una corriente de nitrógeno. El precipitado se añadió a agua (1 mg/ml) y el pH de la 45 mezcla se ajustó hasta 8 con 10 % de meglumina acuosa. La ciclación del péptido se llevó a cabo durante 48 horas y la solución se liofilizó. El péptido cíclico bruto se disolvió en agua y se purificó mediante RP-HPLC en una columna de C 18 con un gradiente lineal de acetonitrilo en agua (ambas fases contenían 0,1 % de TFA). Las fracciones que contienen el producto bruto se recogieron y se liofilizaron. Los péptidos se caracterizaron mediante ES-EM y la pureza se determinó mediante RP-HPLC (gradiente lineal de acetonitrilo en agua/0,1 % de TFA). 50
Método 11: Formación de péptidos mercaptoacetilados usando N-hidroxisuccinimida éster de ácido S-acetiltioglicólico
A una solución de un péptido (0,005 mmol, obtenido mediante los métodos 1 -5 con una amina libre) en DMF (0,25 55 ml) se añadió N-hidroxisuccinimida de éster de ácido S-acetiltioglicólico (SATA) (0,0055 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. Las fracciones que contienen el producto bruto se recogieron y se liofilizaron, dando el péptido mercaptoacetilado. El péptido mercaptoacetilado se caracterizó mediante ES-EM y la pureza se determinó mediante análisis HPLC de fase inversa usando un gradiente lineal de acetonitrilo en agua (ambos con 0,1 % de TFA). 60
Método 12:
La formación de los péptidos mercaptoacetilados usando péptidos purificados de ácido S-acetiltioglicólico purificado del método 5, tras la ciclación de disulfuro se acopló con ácido S-acetiltioglicólico (1,5 - 10 eq.)/HOBt (1,5-10 eq.)/DIC (1,5-10 eq.) en NMP durante 2-16 horas a temperatura ambiente. La mezcla se purificó después mediante 5 HPLC preparativa; las fracciones que contienen péptido puro se combinaron y se liofilizaron. En el caso de los compuestos con otra lisina protegida por un grupo ivDde, la reacción de desprotección empleó 2 % de hidracina en DMSO durante 3 horas a temperatura ambiente. La purificación de la mezcla de reacción dio el péptido puro.
En el caso de cuando se prepara un compuesto con ácido S-acetiltioglicólico acoplado a dos grupos de ácido 10 aminodioxaoctanoico y el péptido, el péptido purificado del método 5 (que tiene un grupo amino libre) se acopló a AcSCH2CO-(NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO)2-OH (30 eq.)/HOBt (30 eq.)/DIC (30 eq.) en NMP durante 40 horas a temperatura ambiente. La mezcla se purificó y el grupo ivDde se eliminó. Una segunda purificación dio el producto final como un liofilizado blanco.
15
Como alternativa, el Fmoc-ácido aminodioxaoctanoico se acopló dos veces de forma sucesiva al péptido (producido mediante el método 5) seguido de la eliminación de Fmoc y acoplamiento a ácido S-acetiltioglicólico.
Método 13: Preparación de homo y heterodímeros 20
Los péptidos purificados requeridos se prepararon mediante SPPS usando el método 5. Preparando los homodímeros, la mitad del péptido necesario para preparar el dímero se disolvió en DMF y se trató con 10 equivalentes de bis-N-hidroxisuccinimidiléster de ácido glutárico. La progresión de la reacción se monitorizó mediante análisis HPLC y espectroscopia de masas. Al finalizar la reacción se eliminaron los volátiles al vacío y al residuo se lavó con acetato de etilo eliminando el bis-NHS-éster sin reaccionar. El residuo se secó, se redisolvió en 25 DMF anhidro y se trató con otra media porción del péptido en presencia de 2 equivalentes de DIEA. La reacción se dejó proceder durante 24 horas. Esta mezcla se aplicó directamente a una columna de HPLC de fase inversa Waters Associates C-18 XTerra y se purificó mediante elución con un gradiente lineal de acetonitrilo en agua (conteniendo ambos 0,1 % de TFA).
30
En el caso de los heterodímeros, uno de los monómeros reaccionó con el bis-NHS-éster de ácido glutárico y tras lavar el exceso del bis-NHS-éster se añadió el segundo péptido en presencia de DIEA. Tras la reacción la mezcla se purificó mediante HPLC preparativa.
Ejemplo 4: Preparación de polipéptidos de unión a KDR y VEGF/KDR 35
Usando los métodos expuestos con anterioridad se prepararon las versiones biotiniladas de los polipéptidos de unión a KDR y el complejo de VEGF/KDR expuestos en la tabla 3. La letra “J” en las secuencias peptídicas hace referencia a un grupo espaciador o engarce, 8-amino-3,6-dioxaoctanoílo.
40
La capacidad de los polipéptidos biotinilados (con el espaciador JJ) para unirse a KDR se evaluó usando el ensayo expuesto en el ejemplo 5, siguiendo los procedimientos divulgados en el mismo. Varios péptidos biotinilados se unieron bien a las células que expresan KDR. SEC ID N.º: 66 (KD 1,81 nM +/- 0,27), SEC ID N.º: 5 (KD 14,87+/-5,0 nM, media de cuatro experimentos), SEC ID N.º: 31 + espaciador (KD 10,00+/-2,36 nM, media de cuatro experimentos), SEC ID N.º: 49 (KD 6,94+/-1,94 nM, un experimento) y SEC ID N.º: 52 (KD 3,02+/-0,75 nM, un 45 experimento).
Tabla 3: Polipéptidos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR
SEC ID Nº
Estructura (o) Secuencia P. Mol. EM
31
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK-NH2 2801,98 1399,6 [M-H]-
5
Ac-AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK-NH2 2361 -
7
Ac-AGWVECWWKSGQCYEFGTGGGK-NH2 2474,06 -
44
Ac-AQEGWFRNPQEIMGFGDSWDKPGGGK-NH2 2934,35 -
31
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (Biotina)-NH2 3030,29 1512,4 [M2-]
45
Ac-AQRGDYQEQYWHQQLVEQLK(iv-Dde) LLGGGK-NH2 3318,71 1659,1 [M2-]
45
Ac-AQRGDYQEQYWHQQLVEQLKLLGGGK-NH2 3112,58 -
46
Ac-AGWYWCDYYGlGCK(iv-Dde)WTGGGK-NH2 2673,18
47
Ac-AGWYWCDYYGIGCKWTGTGGGK-NH2 2467,05
48
Ac-AQWYYDWFHNQRKPPSDWIDNLGGGK-NH2 3218,51 -
5
Ac-AGPK(iv-Dde)WCEEDWYYCMITGTGGGK-NH2 2698,11 2695,7 [M-H]-; 1347,8 [M-2H]2-/2
5
Ac-AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK (Biotina)-NH2 2718,13 2833,4 (M-H)-
5
Ac-AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3008,44 1502,6,4 [M-2H]2-/2
5
Ac-AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK (AcSCH2C(=O)-)-NH2 2608,96 1304, [M-2H]2-/2
31
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (Biotina-JJ-)-NH2 3316,4 1657,8, [M-2H]2-/2
31
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (AcSCH2C(=O)-)-NH2 2917,15 1457,4, [M-2H]2-/2
31
Biotina-JJGDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK-NH2 3272,34 1636,7, [M-2H]2-/2
5
Ac-AGPKWCEEDWYYCMITGT-GGGK (AcSCH2C(=O)-JJ-)-NH2 2899,28 1449,2, [M-2H]2-/2
17
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3066,27 1532,8, [M-2H]2-/2
49
Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 2903,24 1449,3, (M-2H)2-/2; 965,8, (M-3H)3-/3
50
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTJK(Biotina-JJ-)-NH2 3042,44 1519,7, (M-2H)2-/2-; 1012,8 (M-3H)3-/3
31
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (AcSCH2C(=O)-JJ-)-NH2 3208,48 1602,6, [M-2H]2-/2
17
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (AcSCH2C(=O)-JJ-)-NH2 2907,29 1453,1, [M-2H]2-/2
51
Ac-AQAHMPPWRPVAVDALFDWVEGG-GGGK (Biotina-JJ-)-NH2 3404,64 1701,6, [M-2H]2-/2
52
Ac-AQAHMPPWWPLAVDAQEDWFEGG-GGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3493,59 1746,2, [M-2H]2-/2
53
Ac-AQAQMPPWWPLAVDALFDWFEGG-GGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3487,64 1743,2, [M-2H]2-/2
54
Ac-AQDWYWREWMPMHAQFLADDWGG-GGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3751,64 1874,3, [M-2H]2-/2
55
Ac-AQPVTDWTPHHPK(iv-Dde)APDVWLFYT-GGGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3781,86 1890,4, [M-2H]2-/2
56
Ac-AQDALEAPK(iv-Dde)RDWYYDWFLNHSP-GGGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3897,85 1948,0, [M-2H]2-/2
57
Ac-KWCEEDWYYCMITGTGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 2781,2 1390,0, [M-2H]2-/2
58
Ac-AGPKWCEEDWYYCMIGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 2747,15 1373,5, [M-2H]2-/2
59
Ac-KWCEEDWYYCMIGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 2522,04 1260,8, [M-2H]2-/2
60
Ac-AQPDNWK(iv-Dde)EFYESGWK(iv-Dde)YPSLYK(iv-Dde)PLGGGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 4377,2 2188,4, [M-2H]2-/2
61
Ac-AQMPPGFSYWEQVVLHDDAQVLGG-GGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3499,7 1749,2, [M-2H]2-/2
62
Ac-AQARMGDDWEEAPPHEWGWADGG-GGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3480,5 1740,2, [M-2H]2-/2
63
Ac-AQPEDSEAWYWLNYRPTMFHQLGG-GGGK(Biotina-JJ-)-NH2 3751,7 1875,8, [M-2H]2-/2
64
Ac-AQSTNGDSFVYWEEVELVDHPGG-GGGK (Biotina-JJ-)-NH2 3554,6 1776,4, [M-2H]2-/2
65
Ac-AQWESDYWDQMRQQLK(iv-Dde)TAYMK (iv-Dde)VGGGGGK(Biotina-JJ-)-NH2 4187,02 2093,0, [M-2H]2-/2
66
Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK (Biotina-JJ)-NH2 3641,69 1820,9, [M-2H]2-/2
Los supuestos restos de péptidos cíclicos constreñidos por disulfuro están subrayados.
Ejemplo 5: Unión del complejo de los péptidos de unión a KDR/avidina HRP a células 293H transfectadas con KDR 5
Determinando la unión de los péptidos identificados mediante expresión en fagos al KDR expresado en células 293H transfectados de forma transitoria se desarrolló un nuevo ensayo que mide la unión de péptidos biotinilados en complejo con neutravidina HRP a KDR sobre la superficie de las células transfectadas. Este ensayo se usó detectando de forma selectiva los péptidos biotinilados indicados en el ejemplo 4. La neutravidina HRP se usó en lugar de estreptavidina o avidina porque tiene menor unión inespecífica a otras moléculas distintas a biotina debido a 10 la ausencia de restos de hidratos de carbono de unión a lectinas y también debido a la ausencia del dominio TYD de unión al receptor de adhesión celular en neutravidina.
En los experimentos descritos en el presente documento se prepararon complejos tetraméricos de los péptidos de unión a KDR SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 66 y un péptido control, que no se une a 15 KDR y se analizó su capacidad de unirse a las células 293H que se transfectaron de forma transitoria con KDR. Los
cuatro complejos tetraméricos de los péptidos de unión a KDR se biotinilaron y contenían el espaciador JJ y se unieron a células que expresaban KDR; no obstante, la SEC ID N.º: 66 exhibió la mejor KD (1,81nM). Los complejos tetraméricos de los péptidos de unión a KDR SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 5, exhibieron mejor unión sobre los monómeros de los mismos péptidos. Además, la inclusión de un espaciador entre el péptido de unión a KDR y se mostró que la biotina mejoraba la unión en el experimento B. 5
En el experimento C se mostró que este ensayo se puede usar evaluando el efecto del suero sobre la unión de péptidos como se usa en la invención a KDR y al complejo VEGF/KDR. La unión de las SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 31 y SEC ID N.º: 66 no se vio significativamente afectada por la presencia de suero, mientras que la unión de la SEC ID N.º: 17 se redujo más del 50 % en presencia de suero. 10
En el experimento D se demostró que este ensayo es útil en la evaluación de distintas combinaciones de polipéptidos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR para usar en construcciones dirigidas multiméricas que contienen más de un polipéptido de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR. Además, los experimentos D y E establecen que las construcciones tetraméricas que incluyen dos o más péptidos de unión a KDR que se unen a 15 diferentes epítopos exhibieron mejor unión a construcciones tetraméricas “puras” de los péptidos dirigidos solos.
Experimento A Preparación de ARNm y biblioteca de ADNc preparada 5’ RACE 20
Las células HUVEC se cultivaron hasta casi un 80 % de confluencia en matraces de cultivo tisular de 175 cm2 (Becton Dickinson, Biocoat, N.º: de cat. 6478) y después se añadieron 10 ng/ml de bFGF (Oncogene, N.º: de cat. PF003) durante 24 horas induciendo expresión de KDR. El ARNm se aisló usando el kit micro-fast track 2.0 de Invitrogen (N.º: de cat. K1520-02). Se obtuvieron 12 g de ARNm (medido mediante absorbancia a 260 nM) de dos 25 matraces (Aproximadamente 30 millones de células) siguiendo las instrucciones del kit. Se realizó transcripción inversa generando ADNc con 2 g de ARNm, cebador oligo dT ((5’-(T)25GC-3’) y/o oligo smart II ((5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3’) (SEC ID N.º: 67) usando la transcriptasa inversa del virus de leucemia murina Moloney (MMLV). La reacción se realizó en un volumen total de 20 l y la mezcla de reacción contenía 2 l de ARN, 1 l de oligo smart II, 1 l del cebador oligo dT, 4 l de 5x tampón de la primera hebra (Tris 30 HCl250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 30 mM) 1 l de DTT (20 mM, también suministrado con transcriptasa inversa), 1 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP en ddH2O, Stratagene, N.º: de n.º de cat. 200415), 9 l de ddH2O y 1 l de transcriptasa inversa de MMLV (Clonetech, n.º de cat. 8460-1). La reacción de transcripción inversa se realizó durante 90 minutos a 42 ºC y la reacción se detuvo añadiendo 250 l de tampón oftricina-EDTA (tricina 10 mM, EDTA 1,0 mM). El producto de la transcripción inversa, una biblioteca de 35 ADNc preparada 5’ RACE, se puede almacenar durante 3 meses a -20º C. Obsérvese que toda el agua usada para la aplicación de ADN y ARN estaba libre de DNAsa y RNAsa de USB (N.º: n.º de cat. 70783).
Clonación de s-KDR en el vector TOPOII 40
Con el fin de clonar s-KDR, se usaron un 5’ oligo (G ATG GAG AGC AAG GTG CTG CTG G) (SEC ID N.º: 68) y un oligo 3’ (C CAA GTT CGT CTT TTC CTG GGC A) (SEC ID N.º: 69). Estos se diseñaron para amplificar el dominio extracelular completo de KDR ( 2,2 kpb) de la biblioteca de ADNc preparada 5’ RACE (preparada anteriormente) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con ufp de polimerasa (Stratagene, n.º: de cat. 600135). La reacción de PCR se realizó en un volumen total de 50 l y la mezcla de reacción contenía 2 l de la biblioteca de 45 ADNc preparada 5’ RACE, 1 l de 5’ oligo (10 M), 1 l de 3’ oligo (10 M), 5 l de 10X tampón para PCR [tampón para PCR (Tris-HCl 200 mM, pH 8,8, MgSO4 20 mM, KCl 100 mM, (NH4)2SO4) 100 mM suministrado con ufp de enzima más 1 % de DMSO y 8 % de glicerol], 1 l de mezcla de dNTP (10 mM) y 40 l de ddH2O. La reacción de PCR se realizó usando un programa fijado para 40 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 68 ºC y 4 minutos a 72 ºC. El producto de la PCR se purificó mediante extracción con 1 volumen de fenol, seguido de extracción con 1 volumen 50 de cloroformo y se precipitó usando 3 volúmenes de etanol y 1/10 volúmenes de acetato sódico 3M. El producto de la PCR se resuspendió en 17 l de ddH2O, los 2 l de 10 x tampón de Taq polimerasa (Tris-HCLO 100 Mm, pH 8,8, KCl 500 mM, MgCl2 15 mM , 0,01 % de gelatina) y 1 l de Taq polimerasa (Stratagene, N.º: de cat. 600131) se añadieron generando un saliente A en cada extremo del producto. Después de incubar durante 1 hora a 72 ºC, el producto modificado se clonó directamente en un vector TOPOII (InVitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo 55 del fabricante dando TOPO-sKDR. El vector TOPO permite la fácil clonación de los productos de PCR por el saliente A en los productos de la PCR tratados con la Taq (enzima de PCR).
Clonación de los dominios transmembrana y citoplasmático de KDR en el vector TOPO II 60
Con el fin de clonar los dominios transmembrana y citoplasmático de KDR se usaron un 5’ oligo (TCC CCC GGG ATC ATT ATT CTA GTA GGC ACG GCG GTG)) (SEC ID N.º: 70) y un oligo 3’ (C AGG AGG AGA GCT CAG TGT GGT C) (SEC ID N.º: 71). Estos se diseñaron para amplificar los dominios transmembrana y citoplasmático de KDR ( 1,8 kpb) de la biblioteca de ADNc preparada 5’ RACE (descrita anteriormente) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con ufp de polimerasa. Las condiciones de la reacción de PCR y el programa eran exactamente 65
los mismos que se ha descrito anteriormente para s-KDR. Justo como con la secuencia de s-KDR, el producto de PCR se purificó usando extracción en fenol-cloroformo, se trató con la Taq polimerasa y se clonó en el vector TOPO II de Invitrogen dando TOPO-CYTO.
Clonación de KDR de longitud total en el vector pcDNA6 5
Creando el receptor de longitud total se amplificaron el dominio extracelular y el dominio citoplasmático (con el dominio transmembrana) mediante PCR aparte de TOPO-sKDR y TOPO-CYTO respectivamente y se ligaron más tarde creando el receptor de longitud total. Se usaron un oligo con un sitio Not 1 en el extremo 5’ y un oligo complementario al extremo 3’ del dominio extracelular (A TAA GAA TGC GGC CGC AGG ATG GAG AGC AAG GTG 10 CTG CTG G) (SEC ID N.º: 72) y un oligo complementario al extremo 3’ del dominio extracelular (TTC CAA GTT CGT CTT TTC CTG GGC ACC) (SEC ID N1 73) amplificando por PCR el dominio extracelular de TOPO-sKDR De un modo simular, el oligo en 5’ (ATC ATT ATT CTA GTA GGC ACG GCG GTG) (SEC ID N.º: 74) y el oligo en 3’ con un sitio Not1 (A TAA GAA TGC GGC CGC AAC AGG AGG AGA GCT CAG TGT GGT C) (SEC ID N.º: 75) se usaron amplificando por PCR el dominio citoplasmático de KDR (con dominio transmembrana) de TOPO-CYTO. Ambos 15 productos de PCR se digirieron con Not1 y se ligaron juntos creando el receptor de longitud completa. El ADNc que codifica el receptor de longitud completa se purificó en gel de agarosa y se ligó en el sitio Not I del vector pcDNA6/V5-HisC. La purificación del ADN y la unión se realizaron como se ha descrito anteriormente para psKDR. La reacción de unión se usó transformando un cultivo de bacterias DH5 y una serie de clones individuales se analizaron determinando la presencia y orientación del inserto por análisis de restricción del plásmido purificado de 20 cada clon con la enzima EcoRI.
Cultivo celular
Las células 293H se obtuvieron de Invitrogen (N.º: n.º de cat. 11631) y se cultivaron en cultivo de monocapa en su 25 medios recomendados más 1 ml/l de pen/strep (Invitrogen, N.º: n.º de cat. 15140-148). Todas las células se cultivaron en presencia de antibiótico para cultivo diario, pero se dividieron en medio sin antibiótico durante 16 - 20 horas antes de la transfección.
Preparación del ADN para transfección 30
Bacterias DH5 de E. coli que contenían pf-KDR se sembraron en LB con 50 g/ml de ampicilina (agar LB de US biologicals, n.º de cat 75851 y ampicilina de Sigma, n.º de cat. A2804) de una reserva de glicerol y las placas se dejaron en un incubador a 37 ºC creciendo durante la noche. A la mañana siguiente se escogió una única colonia de la placa y se cultivó en 3 ml de medio LB/ampicilina (LB de US biologicals, n.º de cat. US75852) a 37°C. Tras 8 35 horas,100 l de cultivo bacteriano del tubo de 3 ml se transfirieron a 250 ml de medio LB/ampicilina para incubación durante la noche a 37 ºC. Las bacterias se cultivaron con agitación circular en un frasco de 50º ml (Beckman, n.º de cat. 355605) a 220 rpm en un incubador agitador Lab-Line. Al día siguiente, el cultivo bacteriano se procesó usando el kit maxi-prep (QIAGEN, n.º de cat. 12163). Generalmente se obtuvo aproximadamente 1 mg de ADN plasmídico (cuantificado mediante la absorbancia a 260 nm) de 250 ml de cultivo bacteriano. 40
Transfección de células 293H en una placa de 96 pocillos
La transfección se realizó como se recomienda en el protocolo de lipofectamina 2000 (Invitrogen, n.º de cat. 11668-019) usando una placa de 96 pocillos revestida con poli-D-lisina. Se usaron 320 ng de ADN de KDR (pc-DNA6-45 fKDR)/por pocillo en 0,1 ml para la transfección en 96 pocillos. La transfección se realizó en medio con suero, la mezcla de reactivos de transfección se eliminó de las células tras 6-8 horas y se sustituyó con medio con suero habitual. La transfección se realizó en placas de 96 pocillos negras/transparentes (Becton Dickinson, n.º de cat. 354640). La mitad izquierda de la placa (48 pocillos) se transfectó de forma simulada (sin ADN) y la mitad derecha de la placa se transfectó con ADNc de KDR. Las células fueron un 80 - 90 % confluentes en el momento de la 50 transfección y completamente confluentes al día siguiente, en el momento del ensayo, o el ensayo se detuvo.
Preparación de medio M199
Con el fin de preparar medio M199 para el ensayo, a 950 ml de ddH2O se añadió un paquete de medio M199 55 (GIBCO, n.º de cat. 31100-035), 20 ml de HEPES 1 mM (GIBCO, n.º de cat. 15630-080) y 2 g de gelatina DIFCO (DIFCO, cat. y el pH de la solución se ajusto a 7,4 añadiendo aproximadamente 4 ml de NaOH 1N. Después de ajustar el pH, el medio M199 se calentó hasta 37 ºC en un baño de agua durante 2 horas disolviendo la gelatina, después se esterilizó por filtración usando filtros de 0,2 m (Corning, n.º de cat. 43109), y se almacenó a 4 ºC para usar más tarde en el ensayo. 60
Preparación de avidina-sefarosa de liberación suave SoftLink
La avidina-sefarosa de liberación suave SoftLink se preparó centrifugando la sefarosa obtenida en Promega (n.º de cat. V2011) a 12.000 rpm durante 2 minutos, lavando dos veces con agua helada (centrifugando entremedias de los lavados) y resuspendiendo el sedimento en agua helada obteniendo una pasta al 50 % en ddH2O. Para cada 5 experimento se preparó una pasta fresca al 50 % de avidina-sefarosa-
Preparación de la solución péptido/neutravidina HRP
Los péptidos biotinilados SEC ID N.º: 294, 264, 277, 356 y el péptido control biotinilado de no unión se usaron 10 preparando soluciones de reserva de 250 M en 50 % DMSO y una solución de reserva 33 M de neutravidina-HRP mediante disolución de 2 mg de neutravidina-HRP (Pierce, n.º de cat. 31001) en 1 ml de ddH2O (todos los polipéptidos contenían el espaciador JJ). Las soluciones de reserva de péptidos se almacenaron a -20 ºC, mientras que la solución de reserva de neutravidina-HRP se almacenó a -80º C. Preparando complejos de péptido/neutravidina-HRP, a 1 ml de medio M199 se añadieron 10 l de solución de reserva de péptido biotinilado 15 250 M y 10 l de la 33 M de neutravidina-HRP. Esta mezcla se incubó en un rotador a 4 ºC durante 60 minutos, seguido de la adición de 20 ml de sefarosa-avidina de liberación suave (50 % de pasta en ddH2O) para eliminar el exceso de péptidos y otra incubación durante 30 minutos en un rotador a 4 ºC. Por último, la avidina-sefarosa de liberación suave se sedimentó mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante resultante se usó para los ensayos. Para cada experimento se prepararon complejos frescos de 20 péptido/neutravidina-HRP.
Preparación de diluciones de péptido/neutravidina HRP para el ensayo
Para los experimentos de unión por saturación se añadieron 120 l, 60 l, 20 l, 10 l, 8 l, 6 l, 4 l y 1 l del 25 complejo péptido/neutravidina HRP a alícuotas de 1,2 ml de medio M199 creando diluciones con concentraciones finales de 33,33 nM, 16,65 nM, 5,55 nM, 2,78 nM, 1,67 nM, 1,11 nM y 0,28 nM del complejo, respectivamente.
Preparación de solución de bloqueo para células 293H transfectadas 30
La solución de bloqueo se preparó añadiendo 20 ml de medio M199 a 10 mg de neutravidina sin marcar liofilizada Pierce, n.º de cat. 31000). Se usó solución de bloqueo fresca para cada experimento.
Ensayo para detectar la unión de péptido/neutravidina-HRP 35
24 horas después de la transfección cada pocillo de las células 293H se lavó una vez con 100 l de medio M199 y se incubó con 80 l de solución de bloqueo a 37 ºC. Tras una hora, las células se lavaron dos veces con 100 l de medio M199 y se incubaron con 70 l de diluciones de péptido/neutravidina-HRP del péptido control, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 31, SECU N1 17 y SEC ID N.º: 66 durante dos horas y media a temperatura ambiente. Cada dilución se añadió a tres pocillos distintos de células 293H transfectadas de forma simulada y con KDR (se usaron dos placas 40 para cada experimento de unión por saturación). Tras incubación a temperatura ambiente, se transfirieron las placas a 4 ºC durante otra media hora de incubación. Después, las células se lavaron 5 veces con medio M199 helado y una vez con PBS helado (en este orden). Después de lavado final, 100 l de solución de RMB helada (KPL, cat. Se añadieron a cada pocillo y cada placa se incubó durante 30 minutos a 37 ºC en un incubador de aire. Por último, la reacción de la enzima HRP se detuvo añadiendo 50 l de ácido fosfórico 1N a cada pocillo y la unión se cuantificó 45 midiendo la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas (BioRad Model 3550).
Unión del péptido/neutravidina HRP a las células transfectadas con KDR
En este ensayo, los complejos del péptido control, SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 66, 50 cada uno biotinilado con el espaciador JJ y conjugado con neutravidina-HRP, se prepararon como se ha descrito anteriormente y se analizó su capacidad para unirse a las células 293H que se habían transfectado de forma transitoria con KDR. Durante la preparación del complejo péptido/neutravidina se usó un exceso por 7,5 de péptidos biotinilados sobre la neutravidina HRP garantizando que los cuatro sitios de unión a biotina sobre neutravidina estaban ocupados. Después de la formación del complejo, el exceso de péptidos biotinilados libres se retiró usando 55 avidina-sefarosa de liberación suave evitando cualquier competición entre los péptidos biotinilados libres y los péptidos biotinilados en complejo con neutravidina HRP. El experimento se realizó a varias concentraciones diferentes de péptido/neutravidina-HRP, de 0,28 nM a 33,33 Nm, generando curvas de unión por saturación para las SEC ID N.º: 5 y SEC ID N.º: 31 (figura 1A) y 0,28 a 5,55 nM generando curvas de unión por saturación para las SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 66 (figura 1B). Con el fin de dibujar la curva de unión por saturación, la unión de fondo a las 60 células y transfectadas simuladas se restó de la unión a células transfectadas con KDR para cada complejo péptido/neutravidina HRP distinto a cada concentración analizada. Por tanto, la absorbancia en el eje Y de la figura 1 (más adelante) es absorbancia diferencial (KDR menos simulado) y no la absorbancia absoluta. El análisis de los datos de unión por saturación en la figura 1 usando el software Graph Pad Prism (versión 3.0) dio una KD de 10,00 nM (+/-2,36) para la SEC ID N.º: 31 tetramérica, 14,87 nM (+/-5,066) para la SEC ID N.º: 5 tetramérica, 4,031 nM (+/-65
0,86) para los complejos peptídicos de la SEC ID N.º: 17 tetramérica y 1,814 nM (+/-0,27) para la SEC ID N.º: 66 tetramérica. Estas constantes de unión son, como cabe esperar, menores que las medidas mediante FP contra la construcción KDRFc para los péptidos monodentados relacionados de SEC ID N.º: 31 (69 nM), SEC ID N.º: 5 (280 nM), SEC ID N.º: 42 (51 nM), pero similares al péptido monodentado de SEC ID N.º: 17 (3 nM). Como se esperaba, no se observó ninguna saturación de unión para el complejo péptido/neutravidina HRP de control (no aglutinante). 5 La unión de los complejos péptido/neutravidina HRP (figura 2) con una única concentración (5,55 nM) se representó gráficamente para demostrar que se puede usar un experimento de una sola concentración para diferenciar entre un péptido de unión a KDR (SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 31 y SEC ID N.º: 17) y un péptido que no se une.
Experimento B 10
El experimento B se diseñó para el requisito del espaciador (JJ, tabla 3) entre las secuencias de unión a KDR (SEC ID N1 31 y 5) y biotina. En este experimento se analizaron los péptidos biotinilados con y sin espaciador JJ (p. ej., SEC ID N.º: 5 biotinilada con espaciador JJ, SEC ID N.º: 5 sin el espaciador JJ, SEC ID N.º: 31 con un espaciador y SEC ID N.º: 31 sin el espaciador) y un péptido control biotinilado de no unión a KDR (con y sin espaciador, 15 preparado como se ha indicado anteriormente) se usó como control. La estructura peptídica de todas las secuencias de unión a KDR se analizó en este experimento y se muestra en la figura 3.
Este experimento se realizó como se indica en el experimento A descrito anteriormente a excepción de que solo se realizó a una única concentración de 2,79 nM. 20
Resultados: A partir de los resultados mostrados en la figura 4 es evidente que el espaciador potencia la unión de la SEC ID N.º: 31 y la SEC ID N.º: 5, El espaciador entre la secuencia de unión y la biotina puede ser útil en la potenciación de la unión a la molécula diana mediante múltiples mecanismos. Primero, podría ayudar a reducir la hidrancia estérica entre cuatro péptidos biotinilados tras su unión a una única molécula de avidina. En segundo 25 lugar, podría proporcionar longitud adicional necesaria para alcanzar múltiples sitios de unión disponibles en una única célula.
Experimento C 30
El experimento C se diseñó buscando el efecto del suero en la unión de las SEC ID N.º: 31, 5, 17 y 66. En este procedimiento, los complejos péptido biotinilado/avidina HRP se SEC ID N.º: 31, 5, 17 y 66 se analizaron en medio M199 (como se ha descrito anteriormente en el experimento A) con y sin 40 % de suero de rata. Este experimento se realizó como se describe en el experimento A a excepción de que solo se realizó a una única concentración de 6,66 nM para las SEC ID N.º: 31 y 5, 3,33 nM para la SEC ID N.º: 17 y 2,22 nM para la SEC ID N.º: 66. Cada uno de 35 los polipéptidos estaba biotinilado y tenía el espaciador JJ.
Resultados: Los resultados de la figura 5 indican que la unión de las SEC ID N.º: 5, SEC ID N.º: 31 y SEC ID N.º: 66 no se vio significativamente afectada por el 40 % de suero de rata, mientras que la unión de la SEC ID N.º: 17 fue más del 50 % menor en presencia de 40 % de suero de rata. Se observó un descenso de más de un 80 % en la 40 unión de la SEC ID N.º: 17 marcada con Tc con Tc-quelato en presencia de 40 % de suero de rata (figura 24). Dado que el efecto del suero sobre la unión de la SEC ID N.º: 17 marcada con Tc es imitado en el ensayo de avidina HRP divulgado en el presente documento, este ensayo se puede usar evaluando rápidamente el efecto del suero sobre la unión del péptido(s) a KDR.
45
Experimento D
El experimento D se diseñó evaluando la unión de complejos tetraméricos de polipéptidos de unión a KDR y al complejo VEGF/KDR SEC ID N.º: 31 y la SEC ID N.º: 5, particularmente cuando las construcciones incluyeron al menos dos polipéptidos de unión a KDR. Los péptidos de unión a KDR y el péptido de unión control se prepararon 50 como se ha descrito anteriormente. Este experimento se realizó usando el protocolo expuesto para el experimento A, a excepción de que los procedimientos indicados más adelante era únicos para este experimento.
Preparación de soluciones de péptido/neutravidina Las soluciones de reserva de 250 M de los péptidos biotinilados SEC ID N.º: 5, 31 y el péptido control se prepararon en 50 % de DMSO y una solución de reserva 33 M de 55 neutravidina-HRP mediante disolución de 2 mg de neutravidina-HRP (Pierce, n.º de cat. 31001) en 1 ml de ddH2O. Las soluciones de reserva del péptido se almacenaron a -20 ºC, mientras que la solución de reserva de neutravidina-HRP se almacenó a -80 ºC. Las secuencias de los péptidos biotinilados se muestran anteriormente. Preparando complejos de péptido/neuravidina HRP, a 1 ml de medio M199 se añadió un total de 5,36 l de la solución de reserva del péptido biotinilado (o una mezcla de soluciones peptídicas, dando moléculas peptídicas cuatro veces el 60 número de moléculas de avidina HRP) y 10 l de neutravidina HRP 33 m. Esta mezcla se incubó en un rotador a 4 ºC durante 60 minutos, seguido de la adición de 50 l de avidina-sefarosa de liberación suave (50 % de pasta en ddH2O) eliminando el exceso de péptidos y otra incubación durante 30 minutos en un rotador a 4 ºC. Por último, la avidina-sefarosa de liberación suave se sedimentó centrifugando a 12.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante resultante se usó para los ensayos. Para cada experimento se prepararon complejos 65
frescos de péptido/neutravidina-HRP.
Ensayo para detectar la unión de péptido/neutravidina-HRP: 24 horas después de la transfección, cada pocillo de las células 293H se lavó una vez con 100 l de medio M199 y se incubó con 80 l de solución de bloqueo a 37 ºC. Tras una hora, las células se lavaron dos veces con 100 l de medio M199 y se incubaron con 70 l de péptido 3,33 nM 5 (o mezcla de péptidos)/neutravidina HRP (preparadas mediante la adición de 10 l de reserva preparada anteriormente a 1 ml de medio M199) durante dos horas y media a temperatura ambiente. Cada dilución se añadió a tres pocillos distintos de células 293H transfectadas de forma simulada y con KDR. Tras incubación a temperatura ambiente, se transfirieron las placas a 4 ºC durante otra media hora de incubación. Después, las células se lavaron cinco veces con medio M199 helado y una vez con PBS helado (en este orden). Después del lavado fina, se 10 añadieron a cada pocillo 100 l de solución TMB helada (KPL, Gaithersburg, MD) y cada palca se incubó durante 30 minutos a 37 ºC en un incubador de aire. Por último, la reacción de la enzima HRP se detuvo añadiendo 50 l de ácido fosfórico 1N a cada pocillo y la unión se cuantificó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas (BioRad Model 3550).
15
Resultados: Este experimento establece que las SEC ID N.º: 31 y la SEC ID N.º: 5 se unen a KDR de un modo multimérico y colaboran entre sí por la unión a KDR en células 293H transfectadas. Se usó un péptido control biotinilado que no se une a KDR. Como cabía esperar, un complejo tetramérico del péptido control con avidina-HRP no mostró un aumento de la unión a las células transfectadas con KDR. Los complejos tetraméricos de las SEC ID N.º: 31 y la SEC ID N.º: 5 se unieron a las células transfectadas con KDR significativamente mejor de lo que lo 20 hacen las células transfectadas de forma simulada (véase la figura 6). No obstante, los tetrámeros de la SEC ID N.º: 31 se unieron mucho mejor que los tetrámeros de la SEC ID N.º: 5. Si el péptido control se añadió a la mezcla de péptidos usada formando los complejos tetraméricos, la unión a las células transfectadas con KDR disminuyó. La proporción de unión específica del tetrámero al monómero, dímero y trímero se calculó dividiendo la unión específica (obtenida restando la unión a las células transfectadas de forma simulada de las células transfectadas con KDR) del 25 tetrámero, trímero y dímero de la del monómero. Los resultados indican que existe un efecto de colaboración de la multimerización de las SEC ID N1 5, 31 y 67 sobre la unión de las células transfectadas con KDR.
Tetrámero Trímero Dímero
SEC ID N.º: 5
45,4 5 7, 4,3
SEC ID N.º: 31*
38,6 1 2,7
SEC ID N.º: 17
1 1,1 1,1
SEC ID N.º: 66
16 5,7 2,3
*la unión del péptido monomérico a 2,22 nM fue cero, por lo que las proporciones se calcularon usando la unión a 5,55 nM.
30
Una mezcla de 25 % de péptido control que no se une con 75 % de la SEC ID N.º: 5 no se unió significativamente sobre el fondo a las células transfectadas con KDR, lo que indica que la unión multivalente es crucial para el complejo SEC ID N.º: 5/avidina-HRP para permanecer unido a KDR a lo largo del ensayo. Este fenómeno también se mantuvo para la SEC ID N.º: 31, en la que la sustitución del 50 % del péptido con péptido control en el complejo tetramérico anuló casi toda la unión a KDR en las células transfectadas. 35
Sorprendentemente, una mezcla peptídica compuesta por el 50 % del péptido control con 25 % de la SEC ID N.º: 31 Y 25 % de la SEC ID N.º: 5 se unió bastante bien a las células transfectadas con KDR respecto a las células trasnfectadas de forma simulada, lo que indica que hay una gran ventaja apuntando a dos sitios o epítopos sobre la misma molécula diana. Además, se observó que los complejos tetraméricos que contienen diferentes proporciones 40 de la SEC ID N.º: 31 y la SEC ID N.º: 5 (3:1, 2:2 y 1:3) todos se unieron mucho mejor a las células transfectadas con KDR que los tetrámeros putos en cualquier péptido, de acuerdo con la idea de que apuntar a dos sitios distintos sobre una molécula diana es superior a la unión multimérica a un solo sitio. Esto puede deberse a que la unión multimérica a una única diana requiere que la entidad de unión multimérica abarque dos o más moléculas diana distintas que estén lo bastante cercanas para que se una a ellas de forma simultánea, mientras que un engarce 45 multimérico que se puede unir a dos o más sitios distintos en una única molécula diana no depende de hallar otra molécula diana dentro de su alcance para conseguir una unión multimérica.
Experimento E 50
El experimento E se diseñó para confirmar que la SEC ID N.º: 31 y la SEC ID N.º: 5 se unen a distintos sitios (epítopos) en KDR. Si estos péptidos se unen al mismo sitio en LDR deberán poder competir entre sí, aunque si se unen a diferentes sitios no competirán. Este experimento se realizó usando una única concentración de la solución de SEC ID N.º: 5 /avidina HRP (3,33 nM) en cada pocillo y añadiendo una concentración variable (0-2,5 mM) de péptido control biotinilado con espaciador, SEC ID N.º: 31 y la SEC ID N.º: 5, ninguna de ellas formaba complejo con 55 avidina.
Resultados: A partir de la figura 7 es evidente que la SEC ID N.º: 5 no compite con la solución de SEC ID N.º: 5
/avidina HRP por la unión a células transfectadas con KDR, mientras que el péptido control y la SEC ID N.º: 31 no compiten con la solución de SEC ID N.º: 5 /avidina HRP por la unión a células transfectadas con KDR. Por tanto, la SEC ID N.º: 5 y la SEC ID N.º: 31 se unen a distintos sitios y complementarios en KDR.
Ejemplo 6: Unión de análogos de un péptido de unión a KDR a células que expresan KDR 5
Se realizaron truncamientos en los extremos N y C de un polipéptido de unión a KDR y los polipéptidos truncados se analizaron determinando su unión a células que expresan KDR. Los polipéptidos sintetizados se muestran en la figura 8. La unión de los polipéptidos a células que expresan KDR se determinó siguiendo los procedimientos del ejemplo 3. 10
Todos los péptidos se acetilaron en el extremo N y se fluoresceinaron determinando la KD evidente siguiendo el método descrito anteriormente (Ejemplo 3). Los resultados indican que para el polipéptido de la SEC ID N.º: 31 (figura 8), los residuos en C terminal fuera del núcleo constreñido de disulfuro contribuyen a la unión a KDR.
15
Ejemplo 7: Ensayo de unión para confirmar la capacidad de los péptidos identificados mediante expresión en fagos para unirse a células que expresan KDR
Se realizaron los siguientes procedimientos para evaluar la capacidad de los péptidos de unión a KDR para unirse a las células que expresan KDR. En este procedimiento, los péptidos de unión a KDR que contienen la SEC ID N.º: 45 20 se conjugaron con perlas fluorescentes y se evaluó su capacidad para unirse a las células 293 H que expresan KDR. Los experimentos muestran que estos péptidos se pueden usar para unirse a partículas tales como las perlas en los sitios que expresan KDR. Los resultados indican que la unión de ambas secuencias de unión a KDR mejoraba con la adición de un espaciador.
25
Protocolo
Biotinilación de un anticuerpos anti-KDR Anti-KDR de Sigma (V-9134), como fluido ascítico, se biotiniló usando un kit de Molecular Probes (F-6347) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
30
Preparación de perlas fluorescentes conjugadas con péptido: 0,1 ml de una solución de reserva 0,2 mM de cada péptido biotinilado (preparado como se indica anteriormente, en 50n% de DMSO) se incubó con 0,1 ml de microesferas fluorescentes rojas recubiertas con neutravidina (diámetro de 2 micrómetros, solicitados de Molecular Probes) y 0,2 ml de MES 50Mm (Sigma M-8250), pH 6,0 durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotador. Como control positivo, el anticuerpo anti-KDR biotinilado se incubó con las perlas recubiertas con neutravidina como 35 anteriormente, salvo que se usaron 0,03 mg de la preparación de anticuerpo biotinilado en PBS (Gibco n.º 14190-136) en lugar de la solución peptídica. Las perlas se pueden almacenar a 4 ºC hasta que se necesiten durante hasta 1 semana.
Ensayo de unión: De las preparaciones de perlas anteriores, 0,12 ml se agitaron durante 10 minutos a 2.000 rpm en 40 una microcentrífuga a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó y se añadieron 0,06 ml de MES a pH 6,0. Cada solución de perlas se agitó en vórtex después y se sonicó en un baño de agua durante 15 minutos. A 1,17 ml de DMEM, rico en glucosa (GIBCO n.º 11965-084) con 1 x MEM solución de aminoácidos no esenciales (NEAA) (GIBCO 11140-050) y 40 % de PBS (Hyclone SH30070,02).
45
se añadieron 0,03 ml de las preparaciones de perlas sonicadas. Placas de 96 pocillos sembradas con células 293H que se han transfectado de forma simulada en las columnas 1 a 6 y trasnfectadas con KDR en las columnas 7 a 13 (como en el ejemplo 5) se drenaron y lavaron una vez con DMEM, rico en glucosa con 1X NEAA y 49 % de FBS. A cada pocillo se añadieron 0,1 ml de solución de perlas, seis pocillos por preparación de perlas. Tras incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, los pocillos se drenaron invirtiendo las placas y se lavaron cuatro veces 50 con 0,1 ml de PBS con Ca++Mg++ (GIBCO n.º 14040-117) con agitación a temperatura ambiente durante 5 minutos cada lavado. Después de drenar se añadieron 0,1 ml de PBS por pocillo. Después se leyeron las placas en un fluorómetro Packard FluoroCount a una excitación 550 nm/emisión 620nm Las perlas de neutravidina no conjugadas se usaron como control negativo, mientras que las perlas conjugadas con un anticuerpo anti-KDR biotinilado se usaron como control positivo del ensayo. 55
Calculando el número de perlas unidas por pocillo se incluyó una curva estándar con números crecientes de las mismas perlas fluorescentes en cada placa de ensayo. La curva estándar se usó calculando el número de perlas unidas por pocillo basado en la intensidad de la fluorescencia de cada pocillo.
60
Resultados: Las perlas control positivo con anti-KDR se unieron claramente preferentemente a las células que expresan KDR, mientras que las perlas de avidina sin nada no se unieron a ningún tipo de célula (figura 9). Las perlas de la SEC ID N1 6 biotiniladas no se unieron a las células transfectadas con KDR significativamente más que a las células transfectadas de forma simulada, pero añadiendo un espaciador hidrófilo entre el resto peptídico y el grupo de biotina (SEC ID N.º: 5 biotinilada con perlas espaciadoras JJ) potenció la unión a las células con KDR sin 65 incrementar la unión a las células transfectadas de forma simulada. Las perlas de la SEC ID N.º: 31 biotiniladas
mostraron mayor unión a las células transfectadas con KDR y añadiendo un espaciador hidrófilo, la porción peptídica y la biotina de la molécula (SEC ID N.º: 31 biotinilada con espaciador JJ) mejoró significativamente la unión específica al KDR en las células transfectadas. Por tanto, las secuencias peptídicas de las SEC ID N.º: 5 y la SEC ID N.º: 31 se pueden usar uniendo partículas tales como perlas a sitios de expresión de KDR. La adición de un espaciador hidrófilo entre el péptido y el grupo usado para la unión a la partícula debería analizarse de forma 5 rutinaria con nuevas moléculas dirigidas, ya que mejoró la unión para ambos péptidos evaluados en el presente documento.
Ejemplo 8: Competición de los péptidos de unión y el VEGF marcado con 125I por la unión a las células 293H transfectadas con KDR 10
Los polipéptidos de unión a KDR se evaluaron después por su capacidad para competir con VEGF marcado con 125I por la unión a LDR expresado por las células 293H transfectadas. Los resultados indican que el polipéptido de unión a KDR SEC ID N.º: 4 (AcAGDSWCSTEYTYCEMIGTGGGK-NH2) no compitió significativamente con VEGF marcado con 125I y las SEC ID N.º: 31, 5 y la SEC ID N.º: 17 compitieron muy bien con VEGF marcado con 125I, inhibiendo 15 96,292,97 % y 104,482,074 % de la unión del VEGF marcado con 125I.
Transfección de células 293H: Células 293H se transfectaron usando el protocolo descrito en el ejemplo 5. La transfección se realizó en placas de 96 pocillos negras/transparentes (Becton Dickinson, n.º de cat. 354640). La mitad izquierda de las placas (48 pocillos) se transfectó de forma simulada (sin ADN) y la mitad derecha de las 20 placas se transfectó con ADNc de KDR. Las células fueron un 80 - 90 % confluentes en el momento de la transfección y completamente confluentes al día siguiente, en el momento del ensayo, o el ensayo se detuvo.
Preparación de medio M199: El medio M199 se preparó como se ha descrito en el ejemplo 5.
25
Preparación de soluciones peptídicas: Las soluciones de reserva 3 mM de los péptidos SEC ID N.º: 31, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5 y SEC ID N.º: 17 se prepararon como se ha descrito anteriormente en 50 % de DMSO.
Preparación d solución de VEGF marcado con 125I para el ensayo 25 mCi de VEGF marcado con 125I liofilizado (Amersham, n.º de cat. IM274) se reconstituyeron con 250 l de ddH2O creando una solución de reserva, que se 30 almacenó a -80 ºC para su uso posterior. Para cada ensayo se realizó una solución de 300 pM de VEGF marcado con 125I fresca diluyendo la solución de reserva anterior en medio M199. La concentración del VEGF marcado con 125I se calculó a diario en base a la actividad específica del material ese día.
Preparación de solución peptídica 30 M y 0,3 M en 300 pM de VEGF marcado con 125I: Para cada placa de 96 35 pocillos se prepararon 10 ml de 300 pM de VEGF marcado con 125I en medio M199 a 4 ºC. Cada solución peptídica (3 mM, preparada como se ha descrito anteriormente) se diluyó a 1:100 y 1:10000 en 300 l de VEGF marcado con 125I preparando soluciones peptídicas 30 M y 0,3 M que contienen 300 pM de VEGF marcado con 125I. Una vez preparadas, las soluciones se mantuvieron en hielo hasta su uso. La dilución de los péptidos en medio M199 que contiene 300 pM de VEGF marcado con 125I se realizó de forma fresca para cada experimento. 40
Ensayo para detectar competición con VEGF marcado con 125I en células 293H: Las células se usaron 24 horas después de la transfección y preparando las células para el ensayo se lavaron 3 veces con medio M199 a temperatura ambiente y se introdujeron en el refrigerador. Tras 15 minutos, el medio M199 se eliminó de la placa y se reemplazó con 75 ml de 300 pM de VEGF marcado con 125I en medio M199 (preparado como se ha indicado 45 anteriormente) con los polipéptidos. Cada dilución se añadió a tres pocillos distintos de células 293H transfectadas de forma simulada y con KDR. Después de incubar a 4 ºC durante 2 horas, las placas se lavaron 5 veces con tampón de unión frío, suavemente se secaron y se comprobaron con un microscopio detectando pérdida de células. A cada pocillo se añadieron 100 l de solución solubilizante (2 % de Tritón X-100, 10 % Glicerol, 0,1 % BSA) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución solubilizante en cada pocillo se mezcló 50 pipeteando arriba y abajo y se transfirió a tubos de 1,2 ml. Cada pocillo se lavó dos veces con 100 l de solución solubilizante y los lavados se añadieron a los correspondientes tubos de 1,2 ml. Cada tubo de 1,2 ml se transfirió después a un tubo de 15,7 x 100 cm contando en un contador LKB Gamma usando el programa 54 (ventana de 125I durante 1 minuto).
55
Competición de los péptidos con VEGF marcado con 125I en células 293H: La capacidad de los péptidos de unión a KDR SEC ID N.º: . 31, SEC ID N.º: 4, SEC ID N.º: 5 y SEC ID N.º: 17 para bloquear específicamente la unión de VEGF marcado con 125I a KDR se evaluó en células transfectadas de forma simulada y en células transfectadas con KDR. La SEC ID N.º: 4 se usó en el ensayo como control negativo, ya que exhibió poca unión a KDR en los ensayos de FO descritos en el presente documento y por tanto, no se esperaría que desplazara o compitiera con VEGF. 60 Calculando la unión específica a KDR, la unión de VEGF marcado con 125I a células transfectadas de forma simulada se restó de la de las células transfectadas con KDR. Por tanto, la unión de VEGF marcado con 125I a otros sitios distintos a KDR (que pueden o no estar presentes en las células 293H) no se incluye cuando se calcula la inhibición de la unión de VEGF marcado con 125I a las células 293H mediante los péptidos de unión a KDR. El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula [(Y1-Y2)* 100/Y 1], en la que Y1 es la unión específica a las 65
células 293H transfectadas con KDR en ausencia de péptidos e Y2 es la unión específica a las células 293H transfectadas con KDR en presencia de péptidos o de DMSO. La unión específica a las células 293H transfectadas con KDR se calculó restando la unión a las células 293H transfectadas de forma simulada de la unión a las células 293H transfectadas con KDR.
5
Como se muestra en la figura 10, en las células 293, la SEC ID N.º: 5, que debido a su KD (>2 mM) relativamente alta se usó como control negativo no compitió significativamente con VEGF marcado con 125I, 12,697,18 % a 30 mM y -5,459,37 % a 0,3 mM (figura 10). Al mismo tiempo, las SEC ID N.º: 294 y 277 compitieron muy bien con VEGF marcado con 125I, inhibiendo 96,292,97 % y 104,482,074 % de la unión de VEGF marcado con 125I a 30 mM y 52,273,78 % y 80,963,8 % a 0,3 mM (figura 10) respectivamente. El porcentaje de inhibición con la SEC ID N.º: 10 5 fue 47,955,09 % de la unión de VEGF marcado con 125I a 30mM y 24,418,43 % a 0,3 mM (figura 10). Por tanto, los tres polipéptidos de unión a KDR sí compitieron con VEGF y su potencia aumentó con su afinidad de unión. Este ensayo será útil identificando péptidos que se unen estrechamente a KDR pero que no compiten con VEGF, una característica que puede ser útil para la obtención de imágenes en tumores, en los que hay con frecuencia una concentración local elevada de VEGF que, de otro modo, bloquearía la unión de las moléculas dirigidas a KDR. 15
Ejemplo 9: Inhibición de la activación del receptor de KDR inducido por KDR por los péptidos identificados mediante expresión en fagos
La capacidad de los péptidos de unión a KDR identificados por expresión en fagos inhibiendo la activación inducida 20 por VEGF (fosforilación) de KDR se evaluó usando el ensayo siguiente. Se mostró que una serie de péptidos de la invención inhibían la activación de KDR en construcciones monoméricas y/o tetraméricas. Como se ha tratado anteriormente, los péptidos que inhiben la activación de KDR pueden ser útiles como agentes antiangiogénicos.
Protocolo 25
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (Biowhittaker n.º de catálogo CC-2519) se obtuvieron congeladas en hielo seco y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su descongelación. Estas células se descongelaron, se pasaron y se mantuvieron como ha descrito el fabricante en medio EGM-MV (Biowhittaker n.º de catálogo CC-3125). Las células sembradas en placas de 100 mm se dejaron hasta la confluencia, después se 30 cultivaron durante la noche en medio EBM basal sin suero (Biowhittaker n.º de catálogo CC-3121). A la mañana siguiente, el medio en las placas se reemplazó con 10 ml de medio EBM fresco a 37 ºC que no contiene aditivos (control negativo), 5 ng/ml de VEGF (Calbiochem n.º de catálogo 676472 o Peprotech n.º de catálogo 100-20) (control positivo), o 5 ng/ml de VEGF más la concentración indicada del péptidos de unión a KDR (preparado como se ha descrito anteriormente). En algunos casos se usó un anticuerpo anti-KDR neutralizante (n.º de catálogo 35 AF357, R&D Systems) como control positivo inhibidor de la activación. En estos casos, el anticuerpo se preincubó con las células de ensayo durante 30 minutos a 37 ºC antes de la adición de medio fresco que contiene VEGF y el anticuerpo. Después de incubar las placas 5 minutos en un incubador de cultivo tisular a 37 ºC se lavaron tres veces con D-PBS helado que contiene calcio y magnesio y se introdujeron en hielo sin eliminar los últimos 10 ml de la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS). La primer aplaca de un conjunto se drenó y se 40 añadieron 0,5 ml de tampón de lisis Tritón (Tris 20 mM base pH 8,0, NaCl 137 mM, 10 % de glicerol, 1 % Tritón X-100, EDTA 2 mM (ácido etilendiaminatetraacético), PMSF (fenilmetilsulfonifluoruro) 1 mM, ortovanadato sódico 1 mM, NaF 100 mM, pirofosfato sódico 50 mM, 10 g/ml de leupeptina, 10 g/ml de aprotinina). Las células se rasparon rápidamente al tampón de lisis usando un raspador celular (Falcon, n.º de catálogo 353087), se dispersaron pipeteando brevemente y el lisado resultante se transfirió a la segunda placa drenada del par. Se usaron 45 otros 0,5 ml de tampón de lisis aclarando la primera placa, después se transfirió a la segunda placa, que después también se raspó y se dispersó. El lisado combinado de las dos placas se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. El procedimiento anterior se repitió para cada uno de los controles y muestras de ensayo (péptidos de unión a KDR), uno cada vez). Los lisados se almacenaron en hielo hasta que todas las muestras se hubieron procesado. En este punto, las muestras se almacenaron a -70 ºC o se procesaron hasta el fin del ensayo sin interrupción. 50
Los lisados preparados recientemente o congelados y descongelados se prelavaron mediante adición de 20 l de perlas de proteína A-sefarosa (Sigma 3391, prehinchadas en D-PBS, se lavaron tres veces con un exceso grande de D-PBS y se reconstituyeron con 6 ml de D-PBS generando una pasta del 50 %) y agitando a 4 ºC durante 30 minutos. Las perlas se sedimentaron mediante centrifugación durante 2 minutos en una Picofuge (Stratagene, n.º de 55 catálogo 400550) a 2.000 x g y los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos de 1,5 ml. A cada tubo se añadieron veinte g de anticuerpo anti-Flk-1 (Santa Cruz Biotechnology, n.º de catálogo sc-504) y los tubos se incubaron durante la noche(16-18 h) a 4 ºC en un rotador inmunoprecipitando el KDR. Al día siguiente se añadieron a los tubos 40 l de perlas proteína A-sefarosa y después se incubaron a 4 ºC durante 1 hora en un rotador. Las perlas de cada tuno se lavaron después tres veces mediante centrifugación durante 2 minutos en una Picofuge, 60 descartando el sobrenadante y dispersando las perlas en 1 ml de tampón TBST añadido recientemente (Tris base 20 mM pH 7,5, 137 mM NaCl y 0,1 % de Tween 20). Después de centrifugar y eliminar el líquido del último lavado, a cada tuno se añadieron 40 l de tampón de muestra Laemmli SDS-PAGE (Bio-Rad, n.º de catálogo 161-0737), se taparon los tubos y se llevaron a ebullición durante 5 minutos. Después de enfriar, las perlas de cada tubo se sedimentaron mediante centrifugación y los sobrenadantes que contienen el KDR inmunoprecipitado se transfirieron 65
a tibis nuevos y se usaron inmediatamente o se congelaron y almacenaron a -70 ºC para su posterior análisis.
La detección de KDR fosforilado además del KDR total en los inmunoprecipitados se llevó a cabo mediante análisis de inmunotransferencia. La mitad (20 l) de cada inmunoprecipitado se resolvió en un Ready Gel (Bio-Rad, n.º de catálogo 161-1154) pre-vertido al 7,5 % mediante SDS-PAGE de acuerdo con el método de Laemmli (Nature, 5 227:680-685 (1970)).
Usando un aparato Bio-Rad mini-Protean 3 (n.º de catálogo 165-3302). Las proteínas resueltas en cada gel se sometieron a electrotransferencia en una membrana de PVDF (Bio-Rad, n.º de catálogo 162-0174) en una Bio-Rad mini Trans-Blot (n.º de catálogo 170-3930) en tampón CAPS (CAPS 10 mM, Sigma n.º de catálogo C-6070, 1 % de 10 metanol de calidad ACS, pH 11,0) durante 2 horas a 140 mA de acuerdo con el método de Matsudaira (J. Biol. Chem., 262:10035-10038 (1987)).
Las transferencias se bloquearon a temperatura ambiente en 5 % de Blotto-TBS (Pierce n.º de catálogo 37530) precalentado a 37 ºC durante 2 horas.Las bandas se sondearon primero con un anticuerpo antifosfotirosina 15 (Transduction Labs, n.º de catálogo P11120), diluido 1:200 en Blotto-TBS al 5 % con Tween 20 al 0,1 % añadido durante 2 horas. a temperatura ambiente. El anticuerpo no unido se retiró lavando las bandas cuatro veces con D-PBS conteniendo Tween 20 al 0,1 % (D-PBST), 5 min. por lavado. Subsiguientemente, las bandas se sondearon con un anticuerpo anti-ratón de oveja conjugado con HRP (Amersham Biosciences n.º de catálogo NA931) diluido 1:25,000 en Blotto-TBS al 5 % con Tween 20 al 0,1 % añadido durante 1 hora a temperatura ambiente y lavado 20 cuatro veces con D-PBST. Finalmente, las bandas se incubaron con 2 ml de un sustrato quimioluminiscentes (ECL Plus, Amersham n.º de catálogo RPN2132) disperso en la parte superior durante 2 minutos, se drenaron por goteo bien, se situaron en protector de lámina de plástico (C-Line Products, N.º de catálogo 62038) y se expusieron a película de rayos X (Kodak BioMax ML, número de catálogo 1139435) durante duraciones temporales variantes logrando contraste óptimo. 25
Confirmando que se compararon en el ensayo cantidades similares de KDR, las bandas se quitaron incubando durante 30 minutos a 37 °C en TBST con su pH ajustado a 2,4 con HCl, se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con Blotto-TBS al 5 % con Tween 20 al 0,1 % (Blotto-TBST) y se volvieron a sondear con un anticuerpo policlonal anti-Flk-1 (N.º de catálogo sc-315 de Santa Cruz Biotech), 1:200 en Blotto-TBS al 5 % con suero de cabra 30 normal al 1 % (Life Tech N.º de catálogo 16210064) durante 2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo no unido se retiró lavando las bandas cuatro veces con D-PBST, 5 min. por lavado. Subsiguientemente, las bandas se volvieron a sondear con un anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con HRP (Amersham Biosciences N.º de catálogo NA934) diluido 1:10.000 en Blotto-TBS al 5 % durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron cuatro veces con D-PBST. Finalmente, las bandas se incubaron con 2 ml de sustrato quimioluminiscente y se 35 expusieron a película de rayos X como se describe anteriormente.
Resultados: inmunotransferencias de inmunoprecipitados de KDR preparadas a partir de HUVEC con o sin estimulación anterior de VEGF demostraron que el KDR activado (fosforilado) podría detectarse cuando las HUVEC se estimularon con VEGF. Un anticuerpo antifosfotirosina (PY-20) no detectó ninguna proteína fosforilada cerca de 40 la posición de migración de KDR a partir de HUVEC no estimuladas en las bandas, pero después de cinco minutos de estimulación de VEGF, se observó consistentemente una franja en la localización esperada (figura 11, panel superior). Cuando las bandas se retiraron de anticuerpos unidos por incubación en solución ácida después se volvieron a poner a prueba con un anticuerpo anti-KDR (sc-315), se confirmó que la identidad de la banda de proteína fosforilada era KDR. Además, se observe que los inmunoprecipitados de HUVEC no estimulada contenían 45 aproximadamente tanto KDR total como los inmunoprecipitados de KDR a partir de HUVEC con estimulación por VEGF (figura 11, panel inferior).
Los resultados precedentes indican que el KDR fosforilado detectado se formó a partir de KDR pre-existente por autofostorilación de dímeros KDR que resultan de unión de VEGF, ya que cinco minutos no es tiempo suficiente 50 para sintetizar y procesar un receptor de superficie celular glucosilado grande tal como KDR.
La capacidad de este ensayo detectando agentes capaces de bloquear la activación de VEGF de KDR se valoró añadiendo una serie de compuestos a HUVEC en combinación con VEGF y midiendo fosforilación de KDR con el ensayo de inmunotransferencia descrito anteriormente. Como controles positivos y negativos, se probaron también 55 en cada ensayo inmunoprecipitados de HUVEC no estimuladas y de HUVEC estimuladas con VEGF en ausencia de cualesquiera compuestos de prueba. Cuando un anticuerpo anti-KDR neutralizante (N.º de catálogo AF-357 de R&D Systems) se combinó con el VEGF, el grado de fosforilación de KDR se redujo grandemente (figura 12, panel superior), indicando que el anticuerpo fue capaz de interferir con la capacidad de VEGF para unir a y activar KDR. Este resultado se esperaba dado que la capacidad del anticuerpo para bloquear síntesis de ADN inducida por VEGF 60 es parte de la realización de pruebas de control de calidad del fabricante del anticuerpo. Volver a sondear la banda con un anticuerpo anti-KDR (figura 12, panel inferior) indicó que ligeramente menos del KDR total estuvo presente en el carril de material tratado con VEGF + anticuerpo (+V+-KDR) en relación al carril de material tratado solamente con VEGF (+V), pero la diferencia no fue lo suficientemente grande para dar cuenta de la mucho menor abundancia de KDR fosforilado en el carril de material tratado con anticuerpo. 65
Repitiendo el ensayo anterior, los siguientes polipéptidos mostraron al menos una inhibición del 50 % de la
fosforilación de KDR inducida por VEGF a 10 μM:
Ac-AGWIECYHPDGICYHFGTGGGK-NH2 (SEC ID N.º: 9)
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK-NH2 (SEC ID N.º: 31) 5
Ac-AQEPEGYAYWEVITLYHEEDGDGGK-NH2 (SEC ID N.º: 36)
Ac-AQAFPRFGGDDYWIQQYLRYTDGGK-NH2 (SEC ID N.º: 37)
10
Ac-AQGDYVYWEIIELTGATDHTPPGGK-NH2 (SEC ID N.º: 38)
Las SEQ ID Nº: 9 y 31 fueron los compuestos más potentes en el ensayo, ya que produjeron una inhibición de al menos un 50 % de la fosforilación de KDR inducida por VEGF a 1 μM:
15
Los siguientes péptidos se analizaron en el ensayo y no produjeron una inhibición significativa de la activación de KDR a 10 μM:
Ac-AGPK(ivDde)WCEEDWYYCMITGTGGGK-NH2 (SEC ID N.º: 5)
20
Ac-AQRGDYQEQYWHQQLVEQLK(ivDde)LLGGGK-NH2 (SEC ID N.º: 45)
Además, los complejos tetraméricos de derivados biotinilados de las SEC ID N.º: 31 y 17 (preparados como se ha descrito anteriormente) produjeron una inhibición de al menos un 50 % de la fosforilación de KDR inducida por VEGF a 10 μM: 25
Ejemplo 11: Preparación de péptidos y construcción de péptido dimérico
Los siguientes métodos se usaron para la preparación de péptidos individuales y construcciones de péptidos diméricos descritos en los ejemplos siguientes (11-15). 30
Síntesis peptídica automática
La síntesis de los péptidos se llevó a cabo en un sintetizador ABI-433A Synthesizer (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) a escala de 0,25 mmol usando el protocolo FastMoc. En cada ciclo de este protocolo se realizó la 35 preactivación mediante disolución de 1,0 mmol del aminoácido protegido de cadena lateral N-Fmoc seco requerido en un cartucho con una solución de 0,9 mmol de HBTU, 2 mmol of DIEA y 0,9 mmol de HOBt en una mezcla de DMF-NMP. Los péptidos se ensamblaron en una resina NovaSyn TGR (amida de Rink) (nivel de sustitución 0,2 mmol/f). El acoplamiento se llevó a cabo durante 21 min. La desprotección de Fmoc se llevó a cabo con 20 % de piperidina en NMP. Al final del último ciclo, el grupo Fmoc en N-terminal se eliminó y el péptido unido a la resina 40 completamente protegido se acetiló usando anhídrido acético/DIEA/HOBt/NMP.
Escisión, desprotección de la cadena lateral y aislamiento de péptidos brutos
La escisión de los péptidos de la resina y la desprotección de la cadena lateral se consiguió usando reactivo B 45 durante 4,5 horas a temperatura ambiente, Las soluciones de escisión se recolectaron y las resinas se lavaron con un alícuota adicional de reactivo B. Las soluciones combinadas se concentraron hasta sequedad. Se añadió éter dietílico al residuo con agitación suave o agitación precipitando los péptidos. La fase líquida se decantó y se recogió el sólido. Este procedimiento se repitió 2-3 veces para eliminar impurezas y componentes de la mezcla de escisión residual. 50
Ciclación de los péptidos de di-cisteína
Los péptidos que contienen di-cisteína lineal bruta precipitada en éter se ciclaron mediante disolución en agua, mezclas de acetonitrilo acuoso (0,1 % de TFA), DMSO acuoso o 100 % de DMOS y ajuste del pH de la solución 55 hasta un PH 7,5 - 8,5 mediante la adición de amoníaco acuoso, carbonato amónico acuoso o DIEA.
La mezcla se agitó al aire durante 16 - 48 horas, se acidificó hasta un pH de 3 con ácido trifluoroacético acuoso y después se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa usando un gradiente de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contienen el material deseado se combinaron y los péptidos purificados se aislaron mediante 60 liofilización.
Preparación de péptidos que contienen engarces
En un experimento típico, 400 mg del péptido unido a la resina que contiene resina que porta una lisina protegida 65 con ivDde) se trataron con 10 % de hidracina en DMF (2 X 20 ml). La resina se lavó con DMF (2 x 20 ml) y DCM (1 x
20 ml). La resina se resuspendió en DMF (10 ml) y se trató con ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (0,4 mmol), HOBt (0,4 mmol), DIC 0,4 mmol) y DIEA (0,8 mmol) con mezclado durante 4 horas.
(Tras la reacción, la resina se lavó con DMF (2 x 10 ml) y DCM (1 x 10 ml). La resina se trató después con 20 % de piperidina en DMF (2 x15 ml) durante 10 minutos cada vez. La resina se lavó y el acoplamiento con ácido Fmoc-5 diaminodioxaoctanoico y la eliminación del grupo protector Fmoc se repitieron una vez más.
El péptido unido a la resina resultante con un grupo amino libre se lavó y secó y después se trató con el reactivo B (20 ml) durante 4 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró hasta sequedad. El residuo se agitó con éter produciendo un sólido que se lavó con éter y se secó. El sólido se disolvió en DMSO anhidro y el pH se ajustó hasta 10 7,5 con DIEA. La mezcla se agitó durante 16 horas efectuando la reacción de ciclación con disulfuro y la reacción se monitorizó mediante HPLC analítico. Tras la finalización de la ciclación, la mezcla de reacción se diluyó con 25 % de acetonitrilo en agua y se aplicó directamente a una columna C-18 de fase inversa. La purificación se efectuó usando un gradiente de acetonitrilo en agua (ambos con 0,1 % de TFA). Las fracciones se analizaron mediante HPLC y las que contienen el producto puro se combinaron y liofilizaron proporcionando el péptido requerido. 15
Preparación de péptidos biotinilados que contienen engarces
En un experimento típico, 400 mg del péptido unido a la resina que contiene resina que porta una lisina protegida con ivDde) se trataron con 10 % de hidracina en DMF (2 X 20 ml). La resina se lavó con DMF (2 x 20 ml) y DCM (1 x 20 20 ml). La resina se resuspendió en DMF (10 ml) y se trató con ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico (0,4 mmol), HOBt (0,4 mmol), DIC 0,4 mmol) y DIEA (0,8 mmol) con mezclado durante 4 horas.
Tras la reacción, la resina se lavó con DMF (2 x 10 ml) y DCM (1 x 10 ml). La resina se trató después con 20 % de piperidina en DMF (2 x15 ml) durante 10 minutos cada vez. La resina se lavó y el acoplamiento con ácido Fmoc-25 diaminodioxaoctanoico y la eliminación del grupo protector Fmoc se repitieron una vez más.
El péptido unido a la resina resultante con un grupo amino libre se trató con una solución de éster de biotina-MHS (0,4 mmol, 5 rq.) y DIEA (0,4 mmol, 5 eq.) en DMF durante 2 horas. La resina se lavó y se secó como se ha descrito anteriormente y después se trató con el reactivo B (20 ml) durante 4 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se 30 concentró hasta sequedad. El residuo se agitó con éter produciendo un sólido que se recogió, se lavó con éter y se secó. El sólido se disolvió en DMSO anhidro y el pH se ajustó hasta 7,5 con DIEA. La mezcla se agitó durante 4 - 6 horas efectuando la reacción de ciclación con disulfuro, que se monitorizó mediante HPLC. Tras la finalización de la ciclación, la mezcla de reacción se diluyó con 25 % de acetonitrilo en agua y se aplicó directamente a una columna C-18 de fase inversa. La purificación se efectuó usando un gradiente de acetonitrilo en agua (ambos con 0,1 % de 35 TFA). Las fracciones se analizaron mediante HPLC y las que contienen el producto puro se recolectaron y liofilizaron proporcionando el péptido biotinilado requerido.
Preparación de péptidos conjugados con DOTA para marcar con determinados isótopos de gadolinio o indio 40
En un experimento típico, 400 mg del péptido unido a la resina que contiene resina que porta una lisina protegida con ivDde) se trataron con 10 % de hidracina en DMF (2 X 20 ml). La resina se lavó con DMF (2 x 20 ml) y DCM (1 x 20 ml). La resina se resuspendió en DMF (2 X 20 ml) y se trató con Fmoc-ácido aminodioxaoctanoico (0,4 mmol), HOBt (0,4 mmol), DIC (0,4 mmol), DIEA (0,8 mmol) mezclando durante 4 horas. Después de la reacción, la resina se lavó con DMF (2 X 10 ml) y con DCM (1 x 10 ml). La resina se trató después con 20 % de piperidina en DMF (2 x15 45 ml) durante 10 minutos cada vez. La resina se lavó y el acoplamiento con ácido Fmoc-diaminodioxaoctanoico y la eliminación del grupo protector Fmoc se repitieron una vez. El péptido unido a la resina resultante con un grupo amino libre se resuspendió en DMF (10 ml) y se trató con una solución de ácido 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacético, éster 1,4,6-tris-t-butílico (éster DOTA-tris-t-butílico,0,4 mmol, 5 equiv.), HOBt (0,4 mmol), DIC (0,4 mmol) y DIEA (0,8 mmol) en DMF (10 ml) con mezclado durante 4 horas, Tras la finalización de la reacción, la 50 resina se lavó con DMF (2 x 10 ml) y con DCM (1 x 10 ml) y se trató con el reactivo B (20 ml) durante 4 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró hasta sequedad El residuo se agitó con éter produciendo un sólido que se recogió, se lavó con éter y se secó. El sólido se disolvió en DMSO anhidro y el pH se ajustó hasta 7,5 con DIEA. La mezcla se agitó durante 16 horas efectuando la reacción de ciclación con disulfuro, que se monitorizó mediante HPLC. Tras la finalización de la ciclación, la mezcla se diluyó con 25 % de acetonitrilo en agua y se aplicó 55 directamente a una columna C-18 de fase inversa. La purificación se efectuó usando un gradiente de acetonitrilo en agua (ambos con 0,1 % de TFA). Las fracciones se analizaron mediante HPLC y las que contienen el producto puro se combinaron y liofilizaron proporcionando el péptido biotinilado requerido.
Los siguientes péptidos monoméricos de la tabla 4 se prepararon mediante los métodos anteriores, "PnAO6", como 60 se usa en el presente documento, se refiere a 3-(2-amino-3-(2-hidroxiimino-1,1-dimetil-propilamino)-propilamino)-3-metil-butan-2-ona oxima.
Tabla 4. Secuencia o estructura de los péptidos monoméricos y derivados peptídicos
Estructura o secuencia
SEC ID N.º o dímero
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(Biotina-JJ-K)-NH2
17
Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(Biotina-JJK)-NH2
49
Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ)-NH2
49
Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(J)-NH2 derivado de la sec. 12
66
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ)-NH2 derivado de la sec. 5
31
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ)-NH2 derivado de la sec. 5
31/D10
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[(PnAO6-C(=O)(CH2)3C(=O)-K]-NH2 A derivado de la sec. 11
17/D10
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[(DOTA-JJK(iV-Dde)]-NH2 A derivado de la sec. 11
17/D11
Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK-NH2 A derivado de la sec. 5 específicamente: Sec. 5 residuos 5-25
49/D12
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[K(BOA)]-NH2 derivado de la sec. 11
17/D13
Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK[PnAO6-C(=O)(CH2)3C(=O)-K(iV-Dde)]-NH2 Aplicación derivado de la sec. 12
66/D 14
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ)-NH2 Sec. 5 engarce derivado de la sec. 5 = Glut
31/D15
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK-[PnAO6-C(=O)(CH2)3C(=O)-K]-NH2 A derivado de la sec. 11, nueva secuencia
17/D16
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(Biotina-K)-NH2, A derivado de la sec. 11
31/D19
JJAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(iV-Dde)-NH2 (SEC ID N.º: 17)
17/D20
JJAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK(iV-Dde)-NH2
17/D21
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ)-NH2
31/D24
Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(NH2-Ser(GalNAc(Ac)3-alpha-D)-Gly-Ser(GalNAc (Ac)3-alfa-D)-NH2
49/D26
Ejemplo 12: Preparación de construcciones que contienen homodímero 5
Los monómeros peptídicos purificados mencionados anteriormente en el ejemplo 8 se usaron en la preparación de varias construcciones homodiméricas y heterodiméricas.
Preparación de construcciones que contienen homodímero 10
Preparando compuestos homodiméricos, la mitad del péptido necesario preparando el dímero se disolvió en DMF y se trató con 10 equivalentes de bis-N-hidroxisuccinimidiléster de ácido glutárico. La progresión de la reacción se monitorizó mediante análisis HPLC y espectroscopia de masas. Al finalizar la reacción se eliminaron los volátiles al vacío y al residuo se lavó con acetato de etilo eliminando el bis-NHS-éster sin reaccionar. El residuo se secó, se redisolvió en DMF anhidro y se trató con otra media porción del péptido en presencia de 2 equivalentes de DIEA. La 15 reacción se dejó proceder durante 24 horas. Esta mezcla se aplicó directamente a una columna de HPLC de fase inversa YMC y se purificó mediante elución con un gradiente lineal de acetonitrilo en agua (conteniendo ambos 0,1 % de TFA).
Preparación de construcciones que contienen heterodímero 20
En el caso de los heterodímeros, uno de los monómeros ("A") reaccionó con el bis-NHS-éster de ácido glutárico y tras lavar el exceso del bis-NHS-éster (como se ha descrito para los compuestos homodiméricos) se añadió el segundo monómero (“B”) en presencia de DIEA. Tras la reacción la mezcla se purificó mediante HPLC preparativa. Normalmente, a una solución de bis-N-hidroxisuccinimidiléster de ácido glutárico ((0,02 mmol, 10 equivalentes) en 25 DMF (0,3 ml) se añadió una solución del péptido "A" y DIEA (2 equiv) en DMF (0,5 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas. La progresión de la reacción se monitorizó mediante análisis de HPLC y espectroscopia de masas. Al finalizar la reacción se eliminaron los volátiles al vacío y al residuo se lavó con acetato de etilo (3 x 1,0 ml) eliminando el bis-NHS-éster sin reaccionar. El residuo se secó, se redisolvió en DMF anhidro (0,5 ml) y se trató con una solución del péptido “B” y DIEA (2 equiv) en DMF (0,5 ml) durante 24 h. La mezcla se diluyó con agua (1:1,v/v) y se aplicó 30 directamente a una columna de HPLC de C18 de fase inversa YMC C-18 y se purificó mediante elución con un gradiente lineal de acetonitrilo en agua (ambos con 0,1 % de TFA). Las fracciones se analizaron mediante HPLC analítica y las que contienen el producto puro se combinaron y liofilizaron obteniendo el dímero requerido. Los dímeros representados en las figuras 25-49 se prepararon mediante este método (estructura, nombre, número de
referencia del compuesto como se describe en la “Breve Descripción de las Figuras").
Para la preparación del dímero D5, tras la reacción de acoplamiento de los péptidos individuales se añadieron 50 ml de hidracina a la mezcla de reacción (exponiendo el grupo Nε-amino de la lisina) y la solución se agitó durante 2 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con agua (1,0 ml) y el pH se ajustó a 2 con TFA. Esto se purificó después 5 mediante el método descrito anteriormente.
Los datos del análisis HPLC y los datos de espectros de masas para los péptidos diméricos se proporcionan en la tabla 5 siguiente.
10
Tabla 5. Datos analíticos para construcciones homodiméricas y heterodiméricas mediante el sistema de análisis de HPLC
Tiempo de retención (sistema) Datos de espectros de masas (API-ES, -ion)
D1
8,98 min. (A) 1987,7 (M-3H)/3, 1490,6 (M-4H)/4, 1192,3 (M-5H)/5
D2
16,17 min (B) 2035,3 (M-3H)/3, 1526,1 (M-4H)/4, 1220,7 (M-5H)/5
D3
8,74 min (C) 1933,6 (M-3H)/3, 1449,9 (M-4H)/4, 1159,4 (M-5H)/5
D4
10,96 min (D) 2032,8 (M-3H)/3
D5
6,57 min (E) 1816,2 (M-3H)/3, 1361,8 (M-4H)/4, 1089,4 (M-5H)/5, 907,7 (M-6H)/6
D8
4,96 min (F) 2379,3 [M-3H]/3
D9
5,49 min (G) 2146,4 [M-3H]/3
D10
5,44 min (H) 2082,7 [M-3H]/3, 1561,7 [M-4H]/4, 1249,1 [M-5H]/5, 1040,7 [M-6H]/6
D11
7,23 min (E) 2041,8 [M-3H]/3, 1531,1 [M-4H]/4, 1224,6 [M-5H]/5
D12
5,84 min (H) 1877,1 [M-3H]/3, 1407,6 [M-4H]/4, 1125,9 [M-5H]/5, 938,1 [M-6H]/6.
D13
5,367 min (E) 1965,3 [M-3H]/3, 1473,8 [M-4H]/4, 1178,8 [M-5H]/5, 982,2 [M-6H]/6
D14
4,78 min (I) 2275,0 [M-3H]/3, 1362,8 [M-5H]/5
D15
5,41 min (H) 1561,3 [M-4H]/4, 1249,1 [M-5H]/5, 1040,8 [M-6H]/6, 891,8 [M-7H]/7.
D16
5,44 min (J) 2150,8 [M-3H]/3, 1613,1 [M-4H]/4, 1289,9 [M-5H]/5, 1074,8 [M-6H]/6, 920,9 [M-7H]/7.
D17
4,78 min (K) 1789,4 [M-3H]/3, 1347,7 [M-4H]/4.
D18
4,74 min (L) 2083,1 [M-3H]/3, 1562,7 [M-4H]/4, 1249,5 [M-5H]/5.
D19
7,13 min (O) 1891,9 [M-3H]/3, 1418,4 [M-4H]/4, 1134,8 [M-5H]/5, 945,5 [M-6H]/6.
D20
9,7 min (P) 2700,4 [M-2H]/2, 1799,3[M-3H]/3
D21
6,1 min (P) 2891,3 [M-2H]/2,1927,2[M-3H]/3, 1445,1 [M-4H]/4, 1155,8 [M-5H]/5.
D22
6,23 min (Q) 1994,4 [M-3H]/3, 1495,7 [M-4H]/4, 1196,3 [M-5H]/5
D23
7,58 min (J) 1854,4 [M-3H]/3, 1390,8 [M-4H]/4, 1112,7 [M-5H]/5, 927 [M-6H]/6
D24
8,913 min (R) 1952,1 [M-3H]/3, 1463,4 [M-4H]/4, 1171,1 [M-5H]/5, 975,3 [M-6H]/6
D25
5,95 min (E) 1954,9 [M-3H]/3, 1466,1 [M-4H]/4, 1172,4 [M-5H]/5, 976,8 [M-6H]/6.
D26
6,957 min (S) 1759,1 [M-3H]/3, 1319,6[M-4H]/4, 1055,1 [M-5H]/5
D27
5,5 min (M) 2317,6 [M-3H]/3, 1737,2[M-4H]/4, 1389,3[M-5H]/5, 1157,7 [M-6H]/6.
Tabla 6: Secuencias de dímeros y engarces
Dímero nº
Secuencia
D8
Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK{Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(J-Glut-)-NH2}K(Biotina-JJ)-NH2
D9
Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK {[Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJGlut-)]-NH2}K-NH2
D10
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{[Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ-Glut-NH (CH2)4-(S)-CH(PnAO6-Glut-NH)(C=O-)]-NH2}-NH2
D11
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWEDSWGGEVCFRYDPGGGK[JJ-Glut-NH (CH2)4-(S)-CH(DOTA-JJ-NH-)(C=O)-]-NH2}-NH2
D12
Ac-AGPTWCEDDYCWLFGTGGGK{[PnAO6-Glut-K(Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-C(=O)CH2 (OCH2CH2)2CH2C(=O)-)-NH2]}-NH2
D13
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK[JJ-Glut-K (BOA)]-NH2}-NH2: Dímero 13 (D13)
D14
Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-GSDRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2
D15
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{[[Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGKJJ-Glut]-NH2]-K (PnAO6-Glut)}-NH2
D16
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFR YDPGGGK[-C(=O)CH2O(CH2CH2O)2CH2C(=O)NH(CH2)3O(CH2CH2O)2(CH2)3NH C(=O)CH2O(CH2CH2O)2CH2C (=O)-]-NH2]}-NH2
D17
Ac-AQDWYYDEILJGRGGRGGRGGK{K[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2
D18
Ac-AGPTWCDYDWEYCWLGTFGGGK{PnAO6-Glut-K[Ac-GVDFRCEWSDWGEVGCRSPDYGGGK (JJ-Glut)-NH2]}-NH2
D19
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Biotina-K[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2
D20
(-JJAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK-NH2)-Glut-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG-NH2
D21
[-JJAGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK(PnAO6-Glut)-NH2]-Glut-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG-NH2
D22
Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK{JJ-Glut-JJ-AGPTWCEDDWYYCWLFTGGGK-NH2}-NH2
D23
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK[JJ-Glut-K (SATA)]-NH2}-NH2
D24
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{SATA-JJK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(JJ-Glut)-NH2]}-NH2
D25
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK[JJ-Glut-NH(CH2) 4-(S)-CH(NH2)C(=O)-]-NH2}-NH2
D26
AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK{(-Glut-JJ-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGG-NH2)-K}-NH2
D27
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK[S(GalNAc (Ac)3- alpha-D)-G-S(GalNAc(Ac)3-alpha-D)-Glut-S(GalNAc(Ac)3-alpha-D)-G-S(GalNAc(Ac)3-alfa-D)-NH (CH2)4-(S)-CH(Biotina-JJNH-)C(=O)-]-NH2}-NH2
Sistemas de análisis por HPLC 5
Sistema A: Columna: YMC C - 4 (4,6 x 250 mm); Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 25 % B, gradiente lineal 25 - 60 % B en 10 min., Caudal: 2,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema B: Columna: YMC C - 4 (4,6 x 250 mm); Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 25 % B, gradiente lineal 25 - 60 % B en 20 min., Caudal: 2,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm. 10
Sistema C: Columna: YMC C - 4 (4,6 x 250 mm); Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 30 % B, gradiente lineal 30 - 60 % B en 10 min., Caudal: 2. 0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema D: Columna: YMC C - 4 (4,6 x 250 mm); Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 20 % B, gradiente lineal 20 - 60 % B en 10 min., Caudal: 2. 0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema E: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: 5 Condición inicial 10 % B, gradiente lineal 10 - 60 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema F: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: Acetonitrilo (0,1 %TFA); Elución: Condición inicial 30 % B, gradiente lineal 30 - 70 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm. 10
Sistema G: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 30 % B, gradiente lineal 30 - 75 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema H: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: 15 Condición inicial 20 % B, gradiente lineal 20 - 52 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema I: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 10 % B, gradiente lineal 10 - 65 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
20
Sistema J: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 20 % B, gradiente lineal 20 - 60 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema K: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 5 % B, gradiente lineal 5 - 60 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm. 25
Sistema L: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 5 % B, gradiente lineal 5 - 65 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema M: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: 30 Condición inicial 15 % B, gradiente lineal 15 - 50 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema N: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 10 % B, gradiente lineal 20 - 80 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
35
Sistema O: Columna: YMC - C18, 4,6 x 250 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 30 % B, gradiente lineal 30 - 60 % B en 10 min., Caudal: 2,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema P: Columna: YMC - C18, 4,6 x 250 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 20 % B, gradiente lineal 20 - 80 % B en 20 min., Caudal: 2,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm. 40
Sistema Q Columna: YMC - C18, 4,6 x 250 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 20 % B, gradiente lineal 20 - 60 % B en 6 min., Caudal: 2,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema R: Columna: YMC - C18, 4,6 x 250 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: 45 Condición inicial 25 % B, gradiente lineal 25 - 60 % B en 10 min., Caudal: 2,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Sistema S: Columna: YMC - C18, 4,6 x 100 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: ACN (0,1 % TFA); Elución: Condición inicial 10 % B, gradiente lineal 10 - 60 % B en 10 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
50
Ejemplo 13: Competición con 125I-VEGF por la unión a KDR en HUVEC y células transfectadas con KDR
El experimento siguiente evaluó la capacidad de los péptidos de unión a KDR para competir con VEGF marcado con 125I por la unión a KDR expresado por las células 293H transfectadas.
55
Protocolo:
Las células 293H se transfectaron con el ADNc de KDR o se transfectaron de forma simulada mediante técnicas estándar. Las células e incubaron con 125I-VEGF en presencia o ausencia de compuestos competidores (a 10 M, 0,3 M y 0,03 M). Después de lavar las células se cuantificó la radiactividad unida en un contador gamma. El 60 porcentaje de inhibición de la unión de VEGF se calculó usando la fórmula [(Y1-Y2)* 3.100/Y1], en la que Y1 es la unión específica a las células 293H transfectadas con KDR en ausencia de péptidos e Y2 es la unión específica a las células 293H transfectadas con KDR en presencia de péptidos competidores. La unión específica a las células 293H transfectadas con KDR se calculó restando la unión a las células 293H transfectadas de forma simulada de la unión a las células 293H transfectadas con KDR. 65
Resultados
Como se muestra en la figura 15, todos los péptidos de unión a KDR analizados pudieron competir con 125I-VEGF por la unión a células transfectadas con KDR. El heterodímero (D1) fue claramente el más eficaz en la competición con 125I-VEGF, incuso sobre los dos homodímeros (D2 y D3), lo que confirma la superior unión de D1. 5
Ejemplo 14: Ensayo de activación del receptor
La capacidad de los péptidos de unión a KDR inhibiendo la activación inducida por VEGF (fosforilación) de KDR se evaluó usando el ensayo siguiente. 10
Protocolo
Placas de HUVEC casi confluentes se colocaron en medio basal sin suero ni factores de crecimiento durante la noche. Las placas del grupo (c) siguiente se pretrataron después durante 15 minutos en medio basal con un péptido 15 de unión a KDR y después, las células en las placas de los grupos (a), (b) y (c) se colocaron en medio basal fresco que contenía:
(a) sin aditivos (control negativo),
20
(b) 5 ng/ml de VEGF (control positivo) o
(c) 5 ng/ml de VEGF más el supuesto péptido competidor/inhibidor.
Tras 5 minutos de tratamiento, los lisados se prepararon a partir de cada conjunto de placas. El KDR se 25 inmunoprecipitó de los lisados y se analizó secuencialmente mediante inmunotransferencia para fosforilación con un anticuerpo anti-fosfotirosina y para KDR total con un anticuerpo anti-KDR (controlando la carga de la muestra).
Resultados 30
Como se muestra en la figura 15, D1 pudo bloquear por completo la fosforilación inducida por VEGF de KDR en HUVEX A 10 nM. Más de la mitad de la fosforilación fue inhibida por el compuesto a 1 nM. Los homodímeros D2 y D3, generados de los restos de unión individuales que están contenidos en D1, no tuvieron ningún efecto sobre la fosforilación a hasta 100 nM, lo que demuestra el beneficio de los construcciones de heterodímeros en el bloqueo de una interacción receptor-ligando. En múltiples experimentos, la CI50 para D1 en este ensayo varió entre 0,5 y 1 nM. 35 Un heterodímero diferente que contiene secuencias de unión no relacionadas, un heterodímero cola-a-cola que comprende los polipéptidos de la SEC ID N.º: 36 y la SEC ID N.º: 37 (figura 51), no tuvo ningún efecto sobre la fosforilación a 100 nM a pesar de su elevada afinidad de unión 11 nM para KDR por SPR), lo que sugiere que la elección de restos de unión a KDR es importante a la hora de construir un multímero para competir con VEGF por la unión a KDR. Un experto en la técnica podría construir heteromultímeros adecuados usando los polipéptidos de 40 unión proporcionados en el presente documento y ensayos de detección selectiva de rutina.
Incluso aunque la afinidad de D1 por KDR es 10 veces mayor que la de D2 (mediante análisis SPR), la CI50 de D1 en el ensayo de activación es al menos 100 veces menor. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, esto sugiere que apuntar a dos epítopos distintos en KDR con una única molécula de unión puede generar mayor hidrancia 45 estérica que una molécula con afinidad similar que solo se une a un único epítopo en KDR y por tanto, mejora la capacidad para inhibir la actividad de KDR inducida por VEGF. De un modo similar deberá destacarse que los dos restos de unión a KDR dentro de D1, cuando se analizan como péptidos monoméricos libres (SEC ID N.º: 17 y SEC ID N.º: 49 en el ensayo de activación del receptor, tenían CI50 de 0,1 y 1 micromolar, respectivamente. La CI50 para los péptidos monoméricos libres fue de 100 a 1.000 veces mayor que la CI50 para D1 en el ensayo y de 14 a 30 50 veces mayor que las KD para los derivados fluoresceinados de los péptidos monoméricos. Por tanto, crear un dímero que contiene dos péptidos con débil actividad de bloqueo de VEGF ha tenido como resultado una molécula con actividad de bloqueo de VEGF muy potente mucho más allá que la afinidad de unión incrementada de D1.
Ejemplo 15: Ensayo de migración 55
El experimento siguiente evaluó la capacidad de D1 bloqueando la migración inducida por VEGF de HUVEC en cultivo.
Protocolo 60
HUVEC sin suero se colocaron, a 100.000 células por pocillo, en las cámaras superiores de placas de inserto de 24 pocillos FluoroBlok (n.º 354141).revestidas con matrigel. A la cámara inferior de los pocillos se añadió medio basal que no contenía nada o diferentes atrayentes tales como VEGF (10 ng/ml) o suero (5 % FBS) en presencia o ausencia de posibles compuestos bloqueantes/inhibidores de VEGF. Tras 22 horas se consiguió cuantificar la 65 migración/invasión celular por posmarcaje de células en las placas con inserto con un pigmento fluorescente y
midiendo la fluorescencia de las células invasoras/migrantes en un lector de placas de fluorescencia. La migración inducida por VEGF se calculó restando la migración que se había producido solo cuando se colocó medio basal en la cámara inferior de los pocillos.
Resultados: 5
El VEGF indujo un gran incremento de la migración de células endoteliales en el ensayo, que se bloqueó potentemente por D1. At 5 nM D1, el bloqueo de la migración de células endoteliales estimada por VEGF fue del 84 % (véase la figura 17). At 25 nM D1, esta migración se bloqueó casi por completo. En otros experimentos, un inhibidor de KDR conocido, SU-1498 (Strawn, L. y col., 1996, Cancer Res., 56:3540-3545) se analizó en el ensayo. 10 SU-1498 a 3 micromolar no bloqueó la migración inducida por VEGF así como D1 (47 % bloquead a 3 micromolar). D6 (estructura mostrada más adelante en el ejemplo 18), a 50 nM, también produjo inhibición esencialmente completa de la migración estimulada por VEGF. El suero fue un atrayente muy potente en el ensayo cuando se usó en lugar de VEGF, pero su efecto no disminuyó significativamente por D2, lo que indica que D1 inhibe específicamente la migración de células endoteliales inducida por VEGF. 15
Ejemplo 18: Análisis Biacore de la unión del heterodímero a KDR-Fc y determinación de la constante de afinidad
Un heterodímero peptídico (figura 50) compuesto por la SEC ID N.º: 17 y la SEC ID N.º: 31 se preparó como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 12 usando N-hidroxisuccinimidiléster de ácido glutárico. El heterodímero se 20 analizó por su unión a KDR-Fc usando Biacore y una constante de afinidad se determinó del siguiente modo:
Tres densidades de KDR-Fc se reticularon a la superficie de dextrano de un circuito sensor de CM5 mediante el procedimiento de acoplamiento de amina estándar (soluciones 0,5 mg/ml diluidas a 1:100 o 1:50 con acetato 50 mM, pH 6,0). El caudal 1 se activó y después se bloqueó para servir como resto de referencia. Niveles de inmovilización 25 finales alcanzados:
RL Fc 2 KDR-Fc = 1607
RL Fc 3 KDR-Fc = 3001 30
RL Fc 4 KDR-Fc = 6319
Los experimentos se realizaron en PBS (fosfato 5,5 mM, pH 7,65, NaCl 0,15M, 0,005 % de P -20 (v/v). D6 se diluyó a 250 nM en PBS y se realizaron diluciones en serie produciendo soluciones de 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8 y 3,9 nM. 35 Todas las muestras se inyectaron por duplicado. Para asociación, los péptidos se inyectaron a 20 ml/min durante 12,5 minuto usando el programa kinject. Tras disociación de 10 minuto, cualquier péptido que quedase se raspó de la superficie de KDR con una inyección rápida de NaCl 50 mM + NaCl 1 M durante 12 segundos a 75 l/min. Los sensogramas se analizaron usando el software de evaluación BIA 3.1 y una ecuación de regresión rectangular doble hiperbólica en SigmaPlot 6.0. Las afinidades de unión en el equilibrio del heterodímero (KDAV) se determinaron en las 40 tres densidades de inmovilización de KDR (tabla 7).
Tabla 7 - Resumen de los parámetros
KD1 (nM) Rmax1 KDAV (nM) RmaxA V R2*
D6
Vs. 1600RU 46 13,1 1,5 12,6 0,995
Vs. 3000RU
25,5 21,2 0,665 22,7 0,991
Vs. 6000RU
17 61,3 0,662 62,2 0,993
A partir de estos datos, parece que a las densidades de inmovilización más altas, el heterodímero se une a KDR con 45 una afinidad subnanomolar ( 0,6 nM).
Evaluando el aclaramiento in vivo de este heterodímero peptídico, una cantidad pequeña de material se yodó usando yodógeno y Na125I según los protocolos estándar (Pierce). Un tubo recubierto con el reactivo yodógeno se prehumidificó con 1 ml de Tris 25 mM, NaCl 0,4M, pH 7,5. Esto se desechó y se añadieron 100 l del mismo 50 tampón. Usando una jeringa de Hamilton, 11 l del 125I-NaI se transfirieron al tubo de reacción. En base a las estimaciones originales de la concentración de 125I-NaI de 143,555 mCi/ml, los 11 l, deberán contener aproximadamente 1,5 mCi. Tras la adición, se agitó suavemente la muestra y se dejó en una cola de cerdo incubando durante 6 minutos con una agitación cada 30 segundos. Tras 6 minutos, toda la muestras se transfirió a la proteína que estaba en un tubo de Eppendorf. La muestra se agitó suavemente y se dejó incubar durante 8 minutos 55 con una agitación suave cada 30 segundos. Tras 8 minutos, se inactivó (se terminó) la reacción con tirosina (10 mg/ml, una solución saturada), se dejó reposar durante 5 minutos y después se retiraron 2 l para un patrón.
Purificando se usó una columna de 10 ml de la D-sal de poliacrilamida 1800 separando el péptido marcado de la
tirosina marcada. La columna se lavó primero con 10 ml de solución salina, después 5 ml de Tris 25 mM, NaCl 0,4 M, pH 7,5 que contiene 2,5 % de HSA bloqueando los sitios inespecíficos. Después de lavar con el tampón de HSA, la columna se eluyó con 60 ml de Tris 25 mM, NaCl 0,4 M y la columna se almacenó durante la noche a 4 ºC. La muestra marcada contenía 1,355 mCo según determine el calibrador de dosis. La muestra de 2 l que se retiró como patrón contenía 8, mCi. La muestra de péptido se aplicó a la columna de D-sal 1800 y eluyó con el tampón Tris/NaCl 5 a pH 7,5. El flujo se controló aplicando alícuotas únicos de 0,5 ml para cada fracción, 1-4 y después, 1,0 ml para las fracciones 25-43. La figura 18 muestra el perfil de elución de la actividad frente a número de fracción. El máximo de la actividad en las fracciones 9, 10 y 11 se asumió que era el péptido. La radiactividad en de 24 a 40 es probable que sea de la tirosina marcada. A partir de esta purificación, las fracciones 9-12 se combinaron y se usaron para el posterior estudio de aclaramiento (concentración de 125I-D6 en grupos es de 7,023 g/ml; 100 l = 0,702 g con 8,6 10 Ci).
Se inyectó en un total de 15 ratones 100 l de 125I-D6 y se sacrificó a los ratones (en grupos de 3) en los puntos de tiempo siguientes: 0, 7, 15, 30, 90 minutos. Tras la inyección se encontró que quedaba en la jeringa más de 2 mCi, por lo que la actividad real inyectada fue de aproximadamente 6 mCi. Con los mCi inyectados, la correspondiente 15 proteína administrada fue de 0,5 g por animal. Una vez sacrificados se determinaron los recuentos en una muestra de 50 l de plasma de cada animal. Para cada grupo de tres animales en cada punto de tiempo se realizó la media de los recuentos, se convirtió a % de la dosis inyectada/ml de plasma (ID%/ml) y después se representó evaluando la tasa de aclaramiento (figura 18). Estos datos se van a ajustar en una ecuación de 4 o 5 parámetros determinando la semivida bifásica de esta molécula. El ajuste de 4 parámetros tuvo como resultado un T1/2 de 2,55 20 minutos y un T1/2β de 64,66 minutos. El ajuste de 5 parámetros tuvo como resultado un T1/2 de 2,13 minutos y un T1/2β de 23,26 minutos.
También se tomaron volúmenes mayores de plasma de ratones sacrificados a los puntos de tiempo de 0, 30 y 90 minutos. Estas muestras se inyectaron en una columna peptídica Superdex (Pharmacia) acoplada a un detector de 25 radiactividad evaluando la asociación del péptido con las proteínas séricas (figura 19). Como se ha mostrado, el péptido marcado sí se asocia con proteínas de mayor PM, lo que podría explicar el comportamiento de aclaramiento de la semivida bifásica.
Ayudando a evaluar la potencia del péptido como inhibidor anti-angiogénico, D6 se analizó en un ensayo de 30 proliferación de células endoteliales usando HUVEC y detección de BrdU. Brevemente, HUVEC recién aisladas (entre p3-6) se cultivaron en RPMI + 10 % FCS + 1 % antibióticos + 1 % L-glutamina + 0,4 % BBE (extracto de cerebro bovino) y se sembraron por pocillo 5000-10000/pocillo en 100 l. Las células se dejaron recuperar durante 24 horas antes de usar. Después, las células se lavaron con PBS dos veces y se trataron durante 48 horas con anticuerpo anti-VEGF (control positivo) o los péptidos A, B y C (0,1 y 10 ug/ml) en RPMI + 0,1 % BSA + 1 % L-35 glutamina. Las siguientes 6 variables se analizaron en 2 series (n=4):
Serie I: sin VEGF
Serie II: Con VEGF (30 ng/ml): 40
1. Medio estándar: RPMI + 10 % FCS + 1 % antibióticos + 1 % L-glutamina + 0,4 % BBE
2. Control negativo 1: RPMI (inanición verdadera)
45
3. Control negativo 2: RPMI + 0,1 % BSA + 1 % L-glutamina
4. Control positivo: anti-VEGF 10 g/ml in RPMI + 0,1 % BSA + 1 % L-glutamina
5. 0,1 g/ml de péptidos KDR en RPMI + 0,1 % BSA + 1 % L-glutamina 50
6. 10 g/ml de péptidos KDR en RPMI + 0,1 % BSA + 1 % L-glutamina
Protocolo: 55
1) las células se incuban durante 48 horas en varias condiciones
2) dilución de 10l BrdU (1:100 en EBM) se añade a cada pocillo a 24 horas
3) se incuban durante otras 24 horas (total 48 horas) 60
4) se aspira el medio de cultivo
5) se añaden 100 l de FixDenat (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) a cada pocillo, se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. 65
6) Se desecha la solución FixDenat
7) a cada pocillo se añaden 100 l de solución de anticuerpo (PBS 1 % BSA y anti-BrdU PO)
8) se incuban a TA durante 90 minutos. 5
9) se lava 3 veces con PBS, 200 l/pocillo, 5 minutos
10) se añade solución de sustrato (TMB), se incuba durante 10 - 30 minutos
10
11) se transfiere todo a una placa flexible
12) se detiene la reacción añadiendo H2SO4, 2M, 25 l/pocillo
13) se lleva absorbancia a 450 nm en 5 minutos desde la detención de la reacción. 15
La unión de fondo se determinó omitiendo el anticuerpo anti-BrdU en 4 pocillos con células control (cultivadas en medio completo; EBM + BulletKit (Clonetics, BioWhittaker, Inc., MD) y mediante marcaje completo de las células que no se habían expuesto a BrdU.
20
De los dos péptidos de unión a KDR analizados (D6 y SEC ID N.º: 17) como se muestra en la figura 19, D6 inhibe completamente la proliferación de HUVEC a 10 g/ml en presencia de VEGF, similar a un anticuerpo anti-VEGF (control positivo). Por otro lado, la SEC ID N.º: 17 (uno de los péptidos que generaron el heterodímero) no inhibió la proliferación en este ensayo a la concentración más alta analizada (10 g/ml). Como resultado en el heterodímero muestra una mayor capacidad compitiendo con VEGF en comparación con la SEC ID N.º: 17 sola. 25
Ejemplo 19: Análisis BIAcore de la unión a KDR-Fc murino de los dímeros peptídicos D1 y D7
Usando BIAcore se determinaron las constantes de unión de los dímeros peptídicos D1 (un heterodímero de la SEC ID N.º: 17 y la SEC ID N1 31 y D7 (un heterodímero de SEC ID N.º: 5 y la SEC ID N.º: 31, véase la figura 1) para 30 KDR-Fc murino.
Procedimiento
Tres densidades de KDR-Fc murino recombinante se reticularon a la superficie de dextrano de un circuito sensor de 35 CM5 mediante el procedimiento de acoplamiento de amina estándar (soluciones 0,5 mg/ml diluidas a 1:100 o 01:40:00 con acetato 50 mM, pH 6,0). El caudal 1 se activó y después se bloqueó sirviendo como resto de referencia. Niveles de inmovilización finales alcanzados:
RL Fc 2 KDR-Fc = 2770 40
RL Fc 3 KDR-Fc = 5085
RL Fc 4 KDR-Fc = 9265
45
Los experimentos se realizaron en tampón PBS (fosfato 5,5 mM, pH 7,65, NaCl 0,15M, 0,005 % de P -20 (v/v). La SEC ID N.º: 17 se usó como control y se diluyó hasta 125nM en PBS. Se realizaron diluciones en serie produciendo soluciones de 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8 y 3,9 nM. D1 y D6 se diluyeron a 50 nM en PBS y se realizaron diluciones en serie produciendo soluciones de 25, 12,5, 6,25 3,13, 1,56 y 0,78 y 0,39 nM. Todas las muestras se inyectaron por duplicado. Para asociación, los péptidos se inyectaron a 30 ml/min durante 3 minuto usando el programa kinject. 50 Tras disociación de 10 minuto, cualquier péptido que quedase se raspó de la superficie de rmKDR-Fc con una inyección rápida de NaCl 50 mM + NaCl 1 M durante 12 segundos a 75 l/min. .
Los sensogramas se analizaron usando el programa de ajuste de ka/KD simultáneo en el software BIAevaluation 3.1. Los resultados se muestran en la tabla 8 y las figuras 20-21. El hecho de que aproximadamente la misma constante 55 KD2 se alcanzó para ambos heterodímeros, incluso cuando la densidad del circuito sensor se había reducido a la mitad es consistente con unión multimérica de los heterodímeros a receptores invididuales en lugar de la unión de tipo reticulación entre receptores.
Tabla 8 - Resumen de los parámetros cinéticos
ka1 (1/Ms) Kd1 (1/s) ka2 (1/RUs) kd2 (1/s) KD1# (nM) KD2‡ (nM) Chi2*
D1
vs. 2700RU 7,94E+05 0,0139 3,31E-04 5,96E-04 17,5 0,751 0,077
vs. 5000RU
5,54E+05 8,88E-03 1,17E-04 4,57E-04 16,0 0,825 0,323
D7
vs. 2700RU 7,59E+05 0,011 3,36E-04 6,44E-04 14,5 0,848 0,082
vs. 5000RU
5,21E+05 7,39E-03 1,17E-04 4,68E-04 14,2 0,898 0,278
Fluoresceína SEC ID N.º: 277
vs. 2700RU 1,02E+06 0,037 - - 36,4 - 0,073
vs.5000R4
5,18E+05 0,0174 - - 33,6 - 0,167
# KD1 es una KD calculada en base a kd1/ka1
‡ KD2 es una KD calculada en base a kd12ka1 (es decir, factor de avidez) 5
* El valor de chi2 es una medida estadística estándar de lo cercano del ajuste. Para un buen ajuste a los datos ideales, chi2 es del mismo orden de magnitud que el ruido de instrumento en RU (normalmente < 2).
Ejemplo 20: Inhibición in vivo del crecimiento tumoral 10
Se describen condiciones que proporciona métodos para determinar la eficacia de tres (3) concentraciones para el artículo de ensayo (péptido de unión, D6) que se sospecha que tiene actividad antiangiogénica en células de carcinoma de colon humano SW-480 usando un modelo tumoral de xenoinjerto in vivo.
Los ratones atímicos son huéspedes aceptables para el crecimiento de células alogénicas y heterogénicas. Los 15 ratones atímicos se requieren en los Puntos a considerar en la caracterización de las líneas celulares usadas produciendo productos biológicos (Points to Consider in the Characterization of Cell Lines used to Produce Biologicals, FDA 1993).
D6 es un péptido heterodimérico sintético que se sospecha que tiene actividad anti-angiogénica. Este péptido se une 20 al receptor 2 de VEGF humano (KDR) con una afinidad elevada y compite con la unión de VEGF.
Células de carcinoma humano SW-480
Las células de carcinoma de colon, SW-480, (ATCC) se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) 25 suplementado con L-glutamina 4 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, gentamicina 50 mg/ml, fungixona 250 mg/ml y 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor a 37 ºC en 95 % de aire y 5 % de CO2.
Las células en crecimiento exponencial se recogieron, se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) eliminando todos los rastros de tripsina o suero. Las células se suspendieron en solución salina 30 equilibrada de Hanks (HBSS) para inyecciones.
La solución salina tamponada con fosfato estéril (BioWhittaker) se fabricó de acuerdo con los reglamentos de las BPCc y se analizó el cultivo celular asegurando la compatibilidad; teniendo un pH de 7,3-7,7 y una osmolalidad de 271-287 mOsm/kg. El PBS fue el vehículo usado reconstituyendo artículos de ensayo y para inyecciones de vehículo 35 control.
Se preparó cisplatino (American Pharmaceutical Partners, Inc.; Los Ángeles, CA) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El cisplatino se preparó en condiciones asépticas usando un capuchón de BL2 BioChem. 40
SISTEMA DE ENSAYO
A. Especie/Cepa: Mus musculus, ratones Crl:NU/NU-nuBR (ratones atímicos)
45
B. Sexo: Hembra
C. Edad: 6 - 8 semanas al inicio del tratamiento
D. Intervalo de pesos: No se requiere ningún peso 50
E. Fuente: Los animales se recibieron de Gnottobiotic Department en Charles River Laboratories, Wilmington, MA.
F. Número: Se recibió un total de 115 animales y fueron inyectados para este estudio, usándose 90 ratones en el estudio. 5
G. Método de identificación:
Se numeró a los ratones con un número único usando un sistema de marcaje de la oreja. Además, las jaulas se marcaron con tarjetas de jaulas que identifican como mínimo el número de grupo, el número de animal, el número 10 del estudio y el número de protocolo IACUC.
H. Aleatorización
Los animales se asignaron de forma aleatoria a grupos de tratamiento y usando el programa Microsoft® Excel 97 15 SR-1.
I. Atención de los animales por los seres humanos:
El tratamiento y cuidados de los animales se realizaron de acuerdo con procedimientos normalizados de trabajo de 20 los Charles River Laboratories, que cumplen los reglamentos destacados en el USDA Animal Welfare Act (9 CFR, Partes 1, 2 y 3) y la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
Este protocolo de estudio estaba cubierto por las guías de Charles River Laboratories Institutional Animal Care and Use Committee (Número de protocolo IACUC P071820011). 25
CUIDADOS DE ANIMALES
A. Dieta y agua de bebida
30
Los ratones recibieron ad libitum pienso para roedores irradiados con gamma . El agua corriente se esterilizó y suministró mediante un frasco y un tubo bebedor ad libitum.
B. Entorno del animal:
35
Los animales fueron estabulados por grupos en aisladores semirrígidos. Los ratones fueron estabulados en jaulas de fondo plano que contenían de cinco a diez animales. Las jaulas contenían lechos de contacto irradiados por gamma, El número de ratones de cada jaula se puede haber alterado debido al comportamiento de los ratones, se observaron cambios en el inventario del aislador. El alojamiento se adecúa a las recomendaciones expuestas en las Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Academy Press, Washington, D.C., 1996 y sus 40 revisiones posteriores.
Se establecieron controles ambientales manteniendo una temperatura de 16-26°C (70 6 8°F) con una humedad relativa de 30 - 70 . Se mantuvo un ciclo de luz:oscuridad de 12:12.
45
C. Aclimatación:
Una vez recibidos los animales, se dejaron aclimatar en el ambiente del laboratorio durante 24 horas antes del inicio del estudio. Se observó a los ratones en busca de signos de enfermedad, consumo no habitual de agua y/o comida u otros signos generales de mal estado. En el momento de la recepción del animal, se observó a los animales 50 clínicamente y parecían estar sanos.
DISEÑO EXPERIMENTAL
A. Descripción general 55
En este estudio se usaron ratones hembra atímicos (Crl:NU/NU-nuBR) de 6-8 semanas de edad. A un total de 115 ratones se inyectó por vía subcutánea en el lateral torácico derecho 5 x 106 SW-480, células de carcinoma de colon humano. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de ventana diana de aproximadamente 150 x 75 mg, 90 ratones portadores de tumores se seleccionaron al azar y se distribuyeron a uno de nueve grupos. Los artículos de 60 ensayo y el vehículo se administraron por vía intraperitoneal (IP), el cisplatino se administró por vía intravenosa (IV). Las mediciones de los tumores se registraron dos veces a la semana usando compases manuales. Se sometió a los animales a monitorización diaria para detectar signos de toxicidad y morbididad. Al finalizar el estudio se sacrificó a los animales con sobredosis de dióxido de carbono y se realizó la necropsia para obtener tejido.
65
B. Asignaciones de los grupos:
En este estudio se usó un total de nueve (9) grupos. Cada grupo contenía diez (10) ratones potadores de tumores. Los grupos 1 y 2 contenían ratones control negativo sin tratar y tratados con vehículo, respectivamente. Los grupos 3, 4 y 5 contenían ratones que recibieron una de tres diferentes concentraciones del péptido D6 antiangiogénico. El 5 grupo 9 contenía ratones que habían recibido cisplatino, un compuesto quimioterapéutico estándar como control positivo.
C. Niveles y pautas posológicas
10
Los niveles de dosis para cada grupo se proporcionan en la tabla 9. La dosificación comenzó el mismo día que los animales fueron asignados al azar a los grupos (Día 7 del estudio). Cada dosis se extrajo del vial de dosis usando una técnica aséptica para cada animal y el lugar de la inyección se limpió con una torunda en alcohol antes de administrar la dosis. Las dosis se administraron con una jeringuilla de 1,0 ml y una aguja de calibre 27 x ½ para cada ratón. 15
Los ratones tratados con el artículo de ensayo y con vehículo recibieron inyecciones diarias intraperitoneales (IP) durante 15 días. El cisplatino se administró en días laborables alternos para un total de cinco (5) dosis por vía intravenosa.
20
Tabla 9. Grupos de tratamiento del estudio
Grupo de cerdas
Artículo del ensayo Concentración mg/kg Número de animales
1
Sin tratar - 10
2
Vehículo 0 10
3
D6 0,05 10
4
D6 0,5 10
5
D6 5,0 10
9
Cisplatino 6,0 10
D. Observaciones clínicas de los animales:
Las observaciones clínicas de cada animal se realizaron y registraron al menos una vez al día determinando 25 toxicidad, morbididad y mortalidad. La morbididad incluyó signos de enfermedad tales como, entre otros, emaciación, deshidratación, letargo, postura encorvada, aspecto descuidado, disnea y orina o heces teñidas.
E. Mediciones del tumor:
30
De acuerdo con el protocolo se realizaron mediciones del tumor dos veces a la semana durante todo el estudio midiendo la longitud y la anchura de los tumores con compás calibrado. Las mediciones se realizaron separadas un mínimo de 3-4 días, salvo cuando se sacrificó a los animales y se realizaron mediciones; en ocasiones esto tuvo como resultado un intervalo inferior a 3 días. El peso del tumor se calculó usando la fórmula siguiente: mg = (L x W2)/2. Los animales se sacrificaron cuando el tumor pesaba ≥ 1000 mg por grupo durante dos (2) mediciones 35 consecutivas o s los tumores se ulceraron, alteraron la capacidad del animal para deambular u obtener alimentos y agua.
F. Eutanasia no programada y muertes inesperadas:
40
1. Eutanasia no programada:
Ninguno de los animales requirió eutanasia no programada durante el estudio.
2. Muertes inesperadas: 45
Ninguno de los animales murió durante el estudio.
G.Necropsia:
50
1. Eutanasia y solicitud de necropsia:
Todos los ratones en los grupos 1, 2, 3, 4 y 5 (50 total) se sometieron a la necropsia cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio diana del grupo de ≥ 1000 sobre dos (2) medidas consecutivas dentro de un grupo, Los animales se sometieron a la necropsia en el Charles River Laboratories Health Monitoring Laboratory (HM), Wilmington, MA. 55
Todos los animales fueron sacrificados el día 22 del estudio, más o menos recibieron el régimen de tratamiento completo de 28 días con los artículos de ensayo porque el tamaño medio del tumor era de ≥ 1000 mg en los grupos 3-8 tratados con el artículo de ensayo.
Todos los animales fueron sacrificados humanamente con inhalación de dióxido de carbono (CO2). 5
2. Recolección de tejido.
Se diseccionaron los tumores sin tejido circundante y sobre la piel. Adicionalmente se extirparon los riñones- Se registraron todas las anomalías en las superficies renales. 10
Se realizaron bloques congelados de tumores y riñones para cada animal. Se tomó una sección representativa del tejido (tumor, riñones). Las secciones renales incluyeron la corteza y la médula. Las secciones tisulares se colocaron en el fondo de un molde de congelación de plástico marcado. El tejido se incluyó en medio OCT. Los bloques se sumergieron en isopentano enfriado con hielo seco hasta que se congelaron. Los bloques se examinaron 15 brevemente según su calidad y se almacenaron en hielo seco.
Los bloques se marcaron con el número del animal y un código de letras correspondiente al tejido (A= riñón izquierdo; B= riñón derecho; C= masa). Los bloques de un animal se colocaron en una bolsa marcada.
20
RESULTADOS
A. Mediciones durante la vida y observaciones:
1. Declaración resumen de las observaciones clínicas, morbididad y mortalidad: 25
Todos los animales parecían sanos y estaban dentro de los límites normales a lo largo del estudio. D6 no mostró signos de toxicidad a las dosis usadas en este estudio.
Se sacarificó a los animales el día 22 del estudio. Todos los ratones, a excepción de los ratones del grupo 9, fueron 30 sacrificados antes de completar la administración del artículo de ensayo, dado que el tamaño medio del tumor era ≥ 1000 mg en los grupos 1-8. El grupo 9, animales tratados con cisplatino, fueron sacrificados el día 22 del estudio cuando el peso medio del tumor fue de 995 mg. Ningún animal murió durante el estudio.
2. Declaración resumen de la palpación de la masa: 35
Durante el estudio se detectaron las masas palpables en todos los ratones con tumores en crecimiento progresivo durante el estudio. Como cabe esperar, los tumores en ratones control negativos sin tratar y tratados con vehículo (Grupos 1 y 2) crecieron más rápido, alcanzando un tamaño medio del tumor de 1000 mg el día 20 del estudio o antes. Además, los animales tratados con cisplatino (grupo 9) desarrollaron tumores que crecieron los más lentos, 40 alcanzando un tamaño medio del tumor de 995 mg al finalizar el estudio (día 22).
En general, salvo por los ratones del grupo 3, todos los animales tratados con el artículo de ensayo dieron ligar a un crecimiento tumoral más lento (figura 54). Los animales del grupo 3, tratados co la dosis baja de D6 (0,05 mg/kg) tenían tumores que crecieron aproximadamente a la misma velocidad que los tumores en los animales no tratados y 45 tratados con vehículo en los grupos 1 y 2. Los animales tratados con dosis más altas de D6 (grupos 4 y 5) tenían tumores que crecían más lento; alcanzando un tamaño medio del tumor de 1000 mg el día 21 del estudio. Cuando se comparó con los ratones del grupo 1 y 2 control, el tratamiento con el artículo del ensayo dio lugar a un retraso del crecimiento del tumor de aproximadamente 1 día.
50
B. Conclusiones:
Los datos de este estudio validan el modelo usado porque los ratones portadores de tumores en los grupos 1 y 2 control negativo y el grupo 9 control positivo respondieron como se esperaba.
55
Durante el estudio, se observaron masas palpables en todos los grupos. Además, todos los animales parecían sanos y estaban dentro de los límites normales a lo largo del estudio. Además, D6 no afectó adversamente a los animales. Por tanto, estos datos sugerirían que los animales tratados con el artículo del ensayo D6 tenían tumores que crecieron más lentamente (aproximadamente 1 día más lento sobre el periodo de 22 días del estudio que los controles). Asimismo, dado que el artículo de ensayo no mostró ningún efecto tóxico significativo también se podían 60 usar concentraciones más altas del artículo de ensayo con regresión tumoral potencialmente mejor.
Tabla 10
5
Ejemplo 21: Ensayos de proliferación celular in vitro
Las células endoteliales microvasculares (MVEC, Cascade Biologics, Portland, OR) se usaron evaluando la eficacia in vitro de D6 y análogos relacionados por su capacidad inhibiendo la proliferación estimulada por VEGF. Las MVEC (pase 2) se cultivaron hasta 90 % de confluencia, se digirieron co tripsina y se sembraron en placas de 10 microtitulación de 96 pocillos revestidos con gelatina a una densidad de 4-8 x 103 células/pocillo. De dieciséis a 24 horas después de la siembra en placas se lavaron las placas una vez (200 l/pocillo) con medio desprovisto de suero bovino fetal pero con seroalbúmina bovina al 0,1 % (BSA). A cada pocillo se añadió medio con BSA fresco y las células se incubaron durante 24 horas adicionales. Tras este periodo de inanición de 24 horas, se añadió medio con BSA fresco (que contiene 25 ng/ml de VEGF) con o sin D6 y las células se incubaron durante 48 horas 15 adicionales a 37 ºC. Evaluando la respuesta a la dosis en este ensayo, las múltiples concentraciones de D6 se analizaron en pocillos por duplicado. Se retiró el medio y se añadió medio con BSA fresco con o sin BrdU y las células se incubaron durante 24 horas adicionales antes de determinar el nivel de incorporación exactamente como ha descrito el fabricante. Los resultados se muestran en la figura 62.
20
Ejemplo 22
El experimento siguiente evaluó la capacidad de D25 y D27 bloqueando la migración inducida por VEGF de HUVEC en cultivo y demostró que la glicosilación añadida y/o la distinta estructura del espaciador usado en D27 aumentaba su potencia. 25
Protocolo: HUVEC sin suero se colocaron, a 100.000 células por pocillo, en las cámaras superiores de placas de inserto de 24 pocillos FluoroBlok revestidas con fibronectina. A la cámara inferior de los pocillos se añadió medio basal con o sin VEGF (10 ng/ml) en presencia o ausencia de D25 o D27. Tras 22 horas se consiguió cuantificar la migración/invasión celular mediante posmarcaje de células en las placas con inserto con un pigmento fluorescente y 30 midiendo la fluorescencia de las células invasoras/migrantes en un lector de placas de fluorescencia. La migración inducida por VEGF se calculó para cada condición experimental restando la cantidad de migración que se había producido solo cuando se añadió medio basal en la cámara inferior de los pocillos.
Resultados: VEGF indujo un gran incremento de la migración de las células endoteliales en el ensayo, que fue 35 bloqueado potentemente por D25 y D27. D27 fue diez veces más potente que D25 (CI50 0,5 nM y 5 nM respectivamente), lo que indica que la glicosilación de D27 y/o sus distintas propiedades del espaciador ha aumentado su capacidad para unirse a KDR y bloquear los efectos de VEGF.
Ejemplo 23 40
En el experimento siguiente evaluó la capacidad de la construcción multimérica “Auxiliar A” del péptido TKPPR (se une a NP-1, un receptor de VEGF que potencia los efectos de VEGF mediado por KDR) potenciando la inhibición de la migración inducida por VEGF de HUVEC en cultivo producida por D6. Auxiliar A) 5CF-Gly-N{[CH2CH2C(=O)-Gly-N(CH2CH2C (=O)-Adoa-Thr-Lys-Pro-Pro-Arg-OH]2}2 en la que Adoa = 3,6-dioxa-8-aminooctanoílo, 5CF = 5-45 carboxifluoresceinilo.
Protocolo: HUVEC sin suero se colocaron, a 100.000 células por pocillo, en las cámaras superiores de placas de
inserto de 24 pocillos FluoroBlok revestidas con fibronectina. A la cámara inferior de los pocillos se añadió medio basal con o sin VEGF (10 ng/ml) en presencia o ausencia de concentraciones variables de D6 o concentraciones variables deD6 en combinación con un auxiliar A 100 nM constante (sintetizado como se ha descrito en el documento WO 01/91805 A2),. Tras 22 horas se consiguió cuantificar la migración/invasión celular mediante posmarcaje de células en las placas con inserto con un pigmento fluorescente y midiendo la fluorescencia de las 5 células invasoras/migrantes en un lector de placas de fluorescencia. La migración inducida por VEGF se calculó para cada condición experimental restando la cantidad de migración observada en ausencia de VEGF.
Resultados: El VEGF indujo un gran incremento de la migración de células endoteliales en el ensayo, que se bloqueó potentemente por D6 (CI50 aproximadamente 12,5 Nm), pero no por el auxiliar A solo 100 nM (figura 53). 10 No obstante, sorprendentemente, el Auxiliar A pudo aumentar la potencia de D6 por aproximadamente diez cuando se usó en el ensayo simultáneamente con D6 (CI50 aproximadamente 2,5 nM). Esto indica que los compuestos que contienen la secuencia TKPPR (o similar) encontrada en el Auxiliar A se puede usar aumentando la potencia de determinados compuestos tales como D6, que compiten con VEGF por la unión a KDR. Además, un heteromultímero que contiene las secuencias peptídicas encontradas en D6 o similar así como la secuencia TKPPR 15 (o similar) en una o más repeticiones probablemente posea una mayor actividad en este ensayo.
Ejemplo 24: Síntesis de D27 Síntesis de 1 y 3 (véanse las figuras 54 y 55) 20
La síntesis de los monómeros se realizó como se describe en el método 5 en una escala de 0,25 nmol que emplea como resina de partida la resina Fmoc-GGGK(iV-Dde)NH-PAL-PEG-PS. La resina peptídica se lavó y se secó antes de la escisión o posterior derivatización mediante métodos automáticos o manuales.
25
Procedimiento: síntesis del péptido 2 y el péptido 4 (véanse las figuras 54 y 55)
Se fijaron restos de Biotina-JJ, Lisilo, Glicilo y Serinil(GalNAc(Ac)3--D a 1 y 2 mediante SPPS manual tal como se describe en el método 6 y el método 8. El acoplamiento de los aminoácidos se realizó en DMF usando activación por HOBt/DIC (a excepción de Ser(GalNAc(Ac)3--D). La eliminación de Fmoc se llevó a cabo con 20 % de piperidina 30 en DMF. Todos los acoplamientos duraron 5-16 horas. Después de cada acoplamiento, la finalización se confirmó mediante la prueba de Kaise. En el caso de Ser (GalNAc(Ac)3--D, el acoplamiento se realizó en DMF empleando HATU/DIEA como agente de acoplamiento. En los casos en los que la prueba de Kaise indicó grupos amino sin reaccionar se repitió el acoplamiento. Se llevó a cabo la eliminación del grupo Fmoc en N-terminal y la escisión de la resina. El péptido bruto se precipitó en éter y se lavó dos veces con éter y se secó al vacío. El péptido bruto lineal se 35 cicló directamente disolviendo el péptido en DMSO (40 mg/ml). El pH de la solución se ajustó a 8 mediante la adición de N-metilglucamina acuosa y la solución se agitó al aire durante 48 horas a temperatura ambiente. Los péptidos se purificaron después usando HPLC de gradiente como se ha descrito en el Método 1 usando una columna preparativa Waters-YMC C-18 ODS (250 mm x 4,6 mm de diámetro). Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y liofilizaron proporcionando los péptidos necesarios. 40
Procedimiento: Síntesis de D27 - Compuesto 6
A una solución de bis-NHS-éster de ácido glutárico (0,122 mmol, Pierce Scientific Co.) en DMF anhidro se añadió gota a gota una solución de 4 en DMF (40 mg, 0,0122 mmol, DIEA se añadió neutralizando el ácido trifluoroacético 45 unido al péptido y la N-hidroxisuccinimida formada durante la reacción. Esta solución de 0,7 ml se agitó durante 4 horas. La reacción se monitorizó mediante análisis HPLC y espectroscopia de masas. El DMF se eliminó al vacío. El exceso de diéster se eliminó mediante la adición de acetato de etilo que precipitó el monoéster del péptido 5 al tiempo que disuelve el bis-NHS-éster de ácido glutárico. La mezcla se centrifugó y se decantó la porción líquida. Esto se repitió dos veces. El residuo se mantuvo al vacío durante 10 minutos. El residuo se disolvió en DMF y se 50 mezcló con una solución de 2 (37 mg, 0,009 mmol) en DMF (pH 7). Se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Los volátiles se eliminaron en alto vacío y las funciones acetato se eliminaron mediante tratamiento del residuo con 1 ml de hidracina/MeOH (15/85, v/v) con agitación durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Se añadió acetona inactivando el exceso de hidracina y los volátiles se eliminaron al vacío. El residuo resultante se disolvió en DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa como se ha descrito anteriormente proporcionando 9 mg del 55 material puro.
Datos de secuencia y analíticos para los péptidos 2, 4 y 6
Identificador de compuesto
Secuencia HPLC Tiempo de ret. (Sistema) Espectro de masas (ESI, ion. neg.)
Péptido 2: Nueva Sec., Derivado de la Sec. 11
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK {Biotina-JJK[NH2-Ser(GaNAc(Ac)3 --D)-Gly-Ser(GalNAc(Ac)3 --D]}-NH2 7,4 min (T) 2041,3 [M -2H]/2
Péptido 4: Nueva Sec., Derivado de la Sec. 5
Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (NH2 Ser(GalNAc(Ac)3 --D)-Gly-Ser (GalNAc(Ac)3 --D)-NH2 8,0 min (T) 1636,3 [M -2H]/2
D27
Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGGK {Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK[S(GalNAc--D)-G-S(GalNAc--D)-Glut-S(GalNAc--D)-G-S(GalNAc--D)-NH (CH2)4-(S)-CH(Biotina-JJNH-)C (=O)-]-NH2}-NH2 5,50 min (M) 1737,2 (M -4H)/4 1389,3 (M -5H)/5 1157,7 [M -6H]/6
5
Sistema T: Columna: Waters XTerra, 4,6 x 50 mm; Eluyentes: A: Agua (0,1 % TFA), B: Acetonitrilo (0,1 %TFA): Elución: Condición inicial 15 % B, gradiente lineal 15 - 50 % B en 8 min., Caudal: 3,0 ml/min; detección: UV @ 220 nm.
Ejemplo 41: Potenciar la residencia en suero de los péptidos de unión a KDR 10
En la técnica se sabe que los compuestos que contienen maleimida y otros grupos que pueden reaccionar con tioles reaccionan con tioles en proteínas séricas, especialmente seroalbúmina, cuando los compuestos se inyectan. Los aductos tienen tiempos de vida en suero simulares a los de la seroalbúmina, por ejemplo más de 14 días en seres humanos. 15
Conjugación con maleimida
Se dispone de métodos que permiten la síntesis directa de péptidos lineales marcados con maleimida abarcados dentro de la presente invención (Holmes, D. y col., 2000. Bioconjug. Chem., 11:439-444). 20
Los péptidos que incluyen disulfuros pueden derivarse con maleimida en uno de varios modos. Por ejemplo, se puede añadir una tercera cisteína al extremo carboxi, La cisteína añadida se protege con un grupo protector que es ortogonal para el tipo de grupos usados para las cisteínas que van a formar el disulfuro. El disulfuro se forma desprotegiendo de forma selectiva las cisteínas previstas y oxidando el péptido. Después, la cisteína final se 25 desprotege y el péptido reacciona con un exceso molar grande de una bis-maleimida. El compuesto resultante tiene una de las maleimidas libre para reaccionar con seroalbúmina u otras proteínas séricas que contienen tiol.
Como alternativa, un péptido cíclico de la presente invención se sintetiza con una extensión en C-terminal que contiene lisina, tal como -GGGK . Las lisinas del motivo de unión a KDR se protegen con ivDde y la lisina en C-30 terminal se desprotege. Esta lisina reacciona con un compuesto que contiene maleimida, tal como N -[e-maleimidocaproiloxi]succinimida éster (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) o N-(a-Maleimidoacetoxi)succinimida éster (Pierce Biotechnology).
Conjugación con un resto que se une a la seroalbúmina de forma no covalente 35
Los polipéptidos que tienen un peso molecular menor de 50-60 kDa se excretan rápidamente. Muchas moléculas pequeñas, como los ácidos grasos, se unen a la seroalbúmina. Los ácidos grasos que contienen de 10 a 20 átomos de carbono tienen una afinidad sustancial por la seroalbúmina. Se pueden usar ácidos grasos lineales y ramificados. Esta unión en el suero puede reducir la tasa de excreción. Usando métodos conocidos en la técnica, los restos de 40 unión a seroalbúmina se pueden conjugar a cualquiera de los péptidos divulgados en el presente documento. El resto de unión a seroalbúmina se puede unir al péptido de unión a KDR a través de un engarce. El engarce puede ser peptídico o, de otro modo, tal como PEG. Se prefieren los engarces de cero a aproximadamente treinta átomos. Se prefiere que el engarce sea hidrófilo. El resto de unión a seroalbúmina se puede conjugar al péptido de unión a KDR en cualquier extremo o a través de un grupo lateral de un aminoácido adyacente. Los grupos laterales 45 adecuados incluyen lisina y cisteína. Dichos compuestos pueden comprender también quelantes para radionúclidos, como se trata en el presente documento. Un péptido de unión a KDR unido a resto de unión a seroalbúmina se unirá a KDR.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que comprende un macador óptico conjugado directamente o por mediación de un engarce o un espaciador con al menos un polipéptido que tiene la capacidad de unirse a KDR o a complejo VEGF/KDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: 5
    AGDSWCSTEYTYCEMIGTGGGK (SEC ID N.º: 4),
    AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK (SEC ID N.º: 5),
    10
    AGVWECAKTFPFCHWFGTGGGK (SEC ID N.º: 6),
    AGWVECWWKSGQCYEFGTGGGK (SEC ID N.º: 7),
    AGWIQCNSITGHCTSGGTGGGK (SEC ID N.º: 8), 15
    AGWIECYHPDGICYHFGTGGGK (SEC ID N.º: 9),
    AGSDWCRVDWYYCWLMGTGGGK (SEC ID N.º: 10),
    20
    AGANWCEEDWYYCFITGTGGGK (SEC ID N.º: 11),
    AGANWCEEDWYYCWITGTGGGK (SEC ID N.º: 12),
    AGPDWCEEDWYYCWITGTGGGK (SEC ID N.º: 13), 25
    AGSNWCEEDWYYCYITGTGGGK (SEC ID N.º: 14),
    AGPDWCAADWYYCYITGTGGGK (SEC ID N.º: 15),
    30
    AGPEWCEVDWYYCWLLGTGGGK (SEC ID N.º: 16),
    AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17),
    AGSKWCEQDWYYCWLLGTGGGK (SEC ID N.º: 18), 35
    AGRNWCEEDWYYCFITGTGGGK (SEC ID N.º: 19),
    AGVNWCEEDWYYCWITGTGGGK (SEC ID N.º: 20),
    40
    AGANWCEEDWYYCYITGTGGGK (SEC ID N.º: 21),
    AGQAWVECYAETGYCWPRSWGTGGGK (SEC ID N.º: 22),
    AGQAWIECYAEDGYCWPRSWGTGGGK (SEC ID N.º: 23), 45
    AGVGWVECYQSTGFCYHSRDGTGGGK (SEC ID N.º: 24),
    AGDWWVECRVGTGLCYRYDTGTGGGK (SEC ID N.º: 25),
    50
    AGDSWVECDAQTGFCYSFLYGTGGGK (SEC ID N.º: 26),
    AGERWVECRAETGFCYTWVSGTGGGK (SEC ID N.º: 27),
    AGGGWVECRAETGHCQEYRLGTGGGK (SEC ID N.º: 28), 55
    AGVAWVECYQTTGKCYTFRGGTGGGK (SEC ID N.º: 29),
    AGEGWVECFANTGACFTYPRGTGGGK (SEC ID N.º: 30),
    60
    GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31),
    GDDSYCMMNEKGWWNCYLYDPGGGK (SEC ID N.º: 32),
    GDPAQCWESNYQGIFFCDNPDPGGGK (SEC ID N.º: 33), 65
    GDGWACAKWPWGGEICQPSDPGGGK (SEC ID N.º: 34),
    GDSSVCFEYSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 104),
    GDSRVCWEYSWGGQICLGYDPGGGK (SEC ID N.º: 105), 5
    AQQVQYQFFLGTPRYEQWDLDKGGK (SEC ID N.º: 35),
    AQEPEGYAYWEVITLYHEEDGDGGK (SEC ID N.º: 36),
    10
    AQAFPRFGGDDYWIQQYLRYTDGGK (SEC ID N.º: 37),
    AQGDYVYWEIIELTGATDHTPPGGK (SEC ID N.º: 38),
    AQRGDYQEQYWHQQLVEQLKLLGGK (SEC ID N.º: 39), 15
    AQRSWYLGPPYYEEWDPIPNGGK (SEC ID N.º: 40),
    AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGK (SEC ID N.º: 41),
    20
    AQAPAWTFGTNWRSIQRVDSLTGGGGGK (SEC ID N.º: 42),
    AQEGWFRNPQEIMGFGDSWDKPGGGGGK (SEC ID N.º: 43),
    AQEGWFRNPQEIMGFGDSWDKPGGGK (SEC ID N.º: 44), 25
    AQRGDYQEQYWHQQLVEQLKLLGGGK (SEC ID N.º: 45),
    Ac-AGWYWCDYYGIGCK(ivDde)WTGGGK-NH2 (SEC ID N.º: 46),
    30
    Ac-AGWYWCDYYGIGCKWTGTGGGK-NH2 (SEC ID N.º: 47),
    Ac-AQWYYDWFHNQRKPPSDWIDNLGGGK-NH2 (SEC ID N.º: 48),
    Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 49), 35
    Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTJK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 50),
    Ac-AQAHMPPWRPVAVDALFDWVEGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 51),
    40
    Ac-AQAHMPPWWPLAVDAQEDWFEGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 52),
    Ac-AQAQMPPWWPLAVDALFDWFEGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 53),
    Ac-AQDWYWREWMPMHAQFLADDWGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 54), 45
    Ac-AQPVTDWTPHHPK(ivDde)APDVWLFYT-GGGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 55),
    Ac-AQDALEA.PK(ivDde)RDWYYDWFLNHSP-GGGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 56),
    50
    Ac-KWCEEDWYYCMITGTGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 57),
    Ac-AGPKWCEEDWYYCMIGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 58),
    Ac-KWCEEDWYYCMIGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 59), 55
    Ac-AQPDNWK(ivDde)EFYESGWK(ivDde)-YPSLYK(ivDde)PLGGGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 60),
    Ac-AQMPPGFSYWEQVVLHDDAQVLGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 61),
    60
    Ac-AQARMGDDWEEAPPHEWGWADGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 62),
    Ac-AQPEDSEAWYWLNYRPTMFHQLGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 63),
    Ac-AQSTNGDSFVYWEEVELVDHPGG-GGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 64), 65
    Ac-AQWESDYWDQMRQQLK(iv-Dde)TAYMK(iv-Dde)VGGGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 65),
    Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 66),
    VCWEDSWGGEVCFGGGK (SEC ID N.º: 76), 5
    GDSRVCWEDSWGGEVCFGGGK (SEC ID N.º: 77),
    SRVCWEDSWGGEVCFRYGGGGK (SEC ID N.º: 79),
    10
    GDSRVCWEDSWGGEVCFRYGGGK (SEC ID N.º: 80),
    DWYYGGGK (SEC ID N.º: 95),
    AQDWYYDEILGRGRGGRGG (SEC ID N.º: 96), 15
    AGPTWEEDDWYYKWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 90),
    AGPTWKEDDWYYEWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 91),
    20
    AGPTWDprEDDWYYDWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 92),
    AGPTWDEDDWYYDprWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 93), y
    AGPTWDEDDWYYKWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 94); 25
    en las que J es el espaciador o grupo de engarce, 8-amino-3,6-dioxaoctanoílo y iv-Dde es 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metibutilo.
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el marcador óptico está conjugado directamente o por mediación de 30 un engarce o un espaciador a un compuesto dimérico o multimérico que comprende dos o más polipéptidos que tienen la capacidad de unirse a KDR o a complejo VEGF/KDR.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto comprende dos o más polipéptidos y los polipéptidos tienen especificidad por diferentes epítopos en KDR, en el que los polipéptidos preferiblemente están selecionados 35 de forma independiente del grupo que consiste en:
    AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK (SEC ID N.º: 5);
    GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31); 40
    AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGK (SEC ID N.º: 41);
    AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17);
    45
    AGDWWVECRVGTGLCYRYDTGTGGGK (SEC ID N.º: 25); y
    Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEQ ID N.º: 49).
  4. 4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, en el que uno o más de los polipéptidos no incluyen la 50 extensión GGGK C-terminal en su secuencia de aminoácidos.
  5. 5. El compuesto de la reivindicación 3, en el que los polipéptidos comprenden cualquiera de las combinaciones siguientes:
    55
    AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) y
    Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 49);
    AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17) y 60
    GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31);
    AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK (SEC ID N.º: 5) y
    65
    GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31); o
    AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGK (SEC ID N.º: 41) y
    Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 49).
    5
  6. 6. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende:
    AGPKWCEEDWYYCMITGTGGGK (SEC ID N.º: 5);
    AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK (SEC ID N.º: 17); 10
    GDSRVCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (SEC ID N.º: 31);
    AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGK (SEC ID N.º: 41); o
    15
    Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(biotina-JJ-)-NH2 (SEC ID N.º: 49).
  7. 7. Un compuesto que comprende un macador óptico conjugado directamente o por mediación de un engarce o un espaciador con un dímero, comprendiendo el dímero dos polipéptidos que tienen la capacidad de unirse a KDR o a complejo VEGF/KDR, y en el que el dímero está seleccionado del grupo que consiste en D1 (figura 25), D2 (figura 20 26), D3 (figura 27), D5 (figura 29), D6 (figura 50), D7 (figura 51), D8 (figura 30), D9 (figura 31), D17 (figura 39), D19 (figura 41), D20 (figura 42), D22 (figura 44), D23 (figura 45), D24 (figura 46), D25 (figura 47), D26 (figura 48) y D27 (figura 49).
  8. 8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido está unido al 25 marcador óptico por mediación de un engarce o un espaciador, en el que dicho engarce o espaciador está seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en una cadena de alquilo sustituida, una cadena de alquilo no sustituida, un derivado de polietilenglicol, un espaciador aminoácídico, un azúcar, un espaciador alifático, un espaciador aromático, una molécula lipídica o combinación de los mismos.
    30
  9. 9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el marcador óptico comprende un pigmento óptico, una molécula bioluminiscente, un marcador de fotoabsorción o una perla fluorescente.
  10. 10. El compuesto de la reivindicación 9, en el que el marcador óptico es un pigmento óptico tal como un fluóforo o cromóforo orgánico, tal como, por ejemplo, un compuesto fluorescente o en el que el marcador óptico es una perla 35 fluorescente.
  11. 11. El compuesto de la reivindicación 9, en el que el marcador óptico comprende una molécula bioluminiscente.
  12. 12. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para producir una 40 composición de diagnóstico para la obtención de imágenes, en particular para la obtención de imágenes de sitios importantes de angiogénesis, por ejemplo tumores neoplásicos.
  13. 13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha obtención de imágenes es para la monitorización de una terapia con un agnete tumoricida o un agente anti-angiogénesis. 45
  14. 14. Uso de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el que dicho marcador se detecta mediante un parámetro seleccionado de radiación transmitida, absorción, emisión fluorescente o fosforescente, reflexión de luz, cambios de la amplitud de la absorbancia o de la absorbancia máxima y radiación elásticamente dispersada.
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