DE69534990T2

DE69534990T2 - Kontrastmittel

Info

Publication number: DE69534990T2
Application number: DE69534990T
Authority: DE
Inventors: US.F. Larry San Francisco MARGERUM; Brian Luecadia CAMPION; Douglas Jere Livermore FELLMANN; Martha San Clemente GARRITY; John Sunnyvale VARADARAJAN
Original assignee: Amersham Health Salutar Inc
Current assignee: Amersham Health Salutar Inc
Priority date: 1994-04-20
Filing date: 1995-04-20
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2015-04-21
Also published as: DE69534990D1; WO1995028967A1; JPH09512265A; EP0755269A1; CN1148813A; US6010681A; AU2263295A; CA2188292A1; EP0755269B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf diagnostische Bildgebungs-Kontrastmittel und insbesondere auf Bloodpool-Mittel, d.h. Kontrastmittel, die eine lange Verweilzeit in der Vaskulatur besitzen.
Medizinische Bildgebungsmodalitäten, wie MR-Bildgebung, Röntgenstrahlung, PET, SPECT, Magnetotomographie, EIT, gamma-Szintigraphie und CT-Scanning, werden extrem wichtige Werkzeuge bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten. Einige Bildgebungstechniken können sich vollständig auf die inhärenten Eigenschaften von Körperkomponenten verlassen, wie Knochen und weiches Gewebe, um eine Differenzierung in den Bildern zwischen derartigen Komponenten zu erreichen, andere erfordern die Verabreichung von Mitteln (Kontrastmittel), um eine derartige Differenzierung zu erlauben oder den Bildkontrast zwischen verschiedenen derartigen Komponenten oder zwischen lebensfähigem und geschädigtem Gewebe zu verbessern.
Die Verwendung von Kontrastmitteln ist in den meisten Bildgebungsmodalitäten gut etabliert.
Die Wirksamkeit eines Kontrastmittels hängt jedoch nicht nur von seiner inhärenten Kapazität ab, den Bildkontrast in der besagten Bildgebungsmodalität zu verbessern, sondern auch von seiner Pharmakokinetik, d.h. seinem räumlichen und zeitlichen Verteilungsmuster nach der Verabreichung.
Für Kontrastmittel, die in der systemischen Vaskulatur verabreicht werden, verteilen sich als eine allgemeine Regel hydrophile Moleküle niedrigen Molekulargewichts (z.B. einem Molekulargewicht unter 5000 D) in das extrazelluläre Fluid (ECF) und werden relativ schnell durch die Nieren durch glomeruläre Filtration ausgeschieden, wohingegen Partikel, Liposomen oder lipophile Moleküle dazu neigen, relativ schnell in der Leber zu akkumulieren.
Mehrere ECF- und Leber-Kontrastmittel werden vermarktet oder sind in der klinischen Entwicklung. Jedoch ist, während verschiedene Bloodpool-Mittel (d.h. Mittel, die sich nicht in das ECF verteilen und doch relativ lange Verweilzeiten im Bloodpool haben) vorgeschlagen wurden, ihre Entwicklung noch nicht sehr weit fortgeschritten.
So schlossen im Gebiet der MR-Bildgebung frühe Vorschläge für Bloodpool-Mittel paramagnetische Chelat-Makromolekül-Konjugate ein, z.B. wo das Makromolekül ein lösliches biotolerierbares Material wie Dextran war, mit einem Molekulargewicht über dem Nieren-Schwellenwert und wo das Chelat z.B. GdDTPA war. Spätere Vorschläge schlossen den Vorschlag ein, dass Polychelatbildner, wasserlösliche Spezien hohen Molekulargewichts, die zum Chelatieren von vielen, z.B. 20 bis 100, paramagnetischen Metallionen fähig sind, verwendet werden.
Die vorgeschlagenen Materialien stießen auf Probleme einer schlechten Charakterisierung, einer nicht vorhersehbaren Biodistribution, nicht zufriedenstellenden Bloodpool-Verweilzeiten, Leber-Akkumulation und inadäquate Bioeliminierung durch glomeruläre Filtration.
Die Notwendigkeit für wirksame und tolerierbare Bloodpool-Mittel existiert daher noch.
Liposomen mit modifizierten Eigenschaften für eine lange Zirkulation sind bekannt von z.B. Torchilin et al., Journal of controlled release, Band 28, 1994, Amsterdam NL. Seiten 45–58, „Targeted delivery of diagnostic agents by surface-modified liposomes". Hier sind offenbart Liposomen, die mit monoklonalen Antikörpern, PEG, Polysacchariden und chelatierenden Polymeren in verschiedenen Kombinationen Oberflächenmodifiziert sind, die für eine kontrollierte und gezielte Verabreichung von auf Schwermetall basierenden Pharmazeutika verwendet werden können. Es ist auch offenbart, dass lange zirkulierende PEG-beschichtete Liposomen, d.h. die PEG-beschichteten Liposomen, weniger opsonisierbar sind.
Weiter schlägt Torchilin et al. in Vysokomol Soedin., Ser. A. Ser. B, Bd. 36, Nr. 11, 1994, Seiten 1880–1893, „Polymers on the surface of nanocarriers: Modulation of carrier properties and biodistribution" vor, dass die Kontrasteigenschaften von Gd-enthaltenden Liposomen, die z.B. bei der MR-Bildgebung verwendet werden, durch gleichzeitigen Einbau von Gd-enthaltendem Chelat und PEG in die liposomale Membran verbessert werden könnten. Allgemein kann eine Oberflächenmodifikation mit verschiedenen Polymeren verwendet werden, um Liposomen mit erwünschten Eigenschaften zu entwerfen.
Wir schlagen nun eine neue Klasse von Bloodpool-Kontrastmitteln vor, die Opsonisierungs-regelnde Einheiten besitzen, die an eine Makrostruktur gebunden ist, die chelatierte paramagnetische oder Schwermetall-Ionen trägt.
Von einem Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung deshalb ein Bloodpool-Kontrastmittel mit einem Gesamtmolekulargewicht von mindestens 10 KD (bevorzugt mindestens 15 KD und speziell ungefähr 20 KD oder größer) bereit, umfassend eine nicht-liposomale Makrostruktur, an die eine Mehrzahl von Opsonisierungs-inhibierenden Einheiten gebunden ist, und die chelatierte ionische paramagnetische oder Schwermetall-Einheiten trägt.
Opsonisierung ist der Prozess, durch den sich Blut-Proteine an Fremdmaterial in der Vaskulatur binden, um die schnelle Aufnahme eines derartigen Materials durch das retikuloendotheliale System (RES), primär Leber, Milz und Knochenmark, zu vereinfachen.
Verschiedene Opsonisierungs-Inhibitoren können gemäß der Erfindung verwendet werden, aber im allgemeinen werden sie amphiphile Polymere sein, gegebenenfalls terminal modifiziert, z.B. für das Binden an die Makrostruktur. Mit einem amphiphilen Polymer ist ein Polymer gemeint, das Wiederholungseinheiten mit lipophilen und hydrophilen Segmenten besitzt. Ein bevorzugtes Beispiel eines derartigen Polymers ist Polyethylenglykol, das eine [CH₂CH₂O]-Wiederholdungseinheit hat, wobei die Alkylenkette das lipophile Segment bereitstellt und der Ether-Sauerstoff das hydrophile Segment bereitstellt.
Daher sind die Opsonisierungs-Inhibitoreinheiten, die gemäß der Erfindung verwendet werden, günstigerweise von der Formel I -A-(R₁R₂)_n-B (I) wobei A eine Bindung oder eine funktionelle Gruppe ist, die eine Anlagerung an die Makrostruktur, z.B. dem Rest einer Gruppe mit einem labilen Wasserstoff oder einem/einer anderen ersetzbaren Atom oder Gruppe, z.B. dem Rest einer Carboxyl-, Hydroxy-, Amin-, Succinyl-, Nitrophenylcarbamat- oder Thiol-Gruppe, oder einer Phosphor-, Schwefel-, oder Bor-Oxysäure, gekoppelt an (R₁R₂)_n durch eine Bindung oder eine Linkereinheit ermöglicht, z.B. eine C_1-8-Alkylenkette; eine Gruppe von R₁ und R₂ eine lipophile Einheit ist, z.B. eine C_1-8-Alkylenkette, die gegebenenfalls ungesättigt und gegebenenfalls substituiert oder unterbrochen durch eine Aryl- oder Cycloalkylgruppe, z.B. Phenyl oder Cyclohexyl, ist und die andere Gruppe von R₁ und R₂ eine hydrophile Einheit ist, z.B. eine Oxa-, Thia- oder Aza-Gruppe oder eine C_1-8-Alkylenkette, die unterbrochen oder substituiert ist durch Gruppen, die ausgewählt sind aus Oxa, Aza, Thia, Amin, Thiol, Hydroxy, Oxo, Thio, Imido, Sulfinyl, Sulfonyl und Phosphono; n eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 200, speziell 5 bis 100, spezieller 10 bis 80 ist; und B eine endständige Gruppe ist, z.B. ein Wasserstoffatom oder eine hydrophile oder hydrophobe Gruppe oder eine paramagnetische oder Schwermetall-Chelat-Einheit.
Es wird von dem oben erläuterten anerkannt werden, dass die chelatierte paramagnetische oder Schwermetall-Einheit im diagnostischen Mittel der Erfindung an die Makrostruktur direkt oder über eine intermediäre Gruppe gebunden sein kann, und dass, während derartige intermediäre Gruppen einfach als Linker fungieren, sie auch als Opsonisierungs-Inhibitoren fungieren können.
Speziell bevorzugt als Opsonisierungs-Inhibitoren sind Einheiten, die als die Wiederholungseinheit R₁R₂-Alkylenoxy-, Alkylenthio- und Alkylenimino-Gruppen enthalten und insbesondere derartige Gruppen, in denen die Alkyleneinheit Ethylen oder Propylen ist. Am meisten besonders bevorzugt sind auf Polyethylenglykol (PEG) basierende Opsonisierungs-Inhibitoren. Auch Ganglioside, wie Gm₁ sind in dieser Hinsicht wirksam.
Verfahren für die Anlagerung von PEG und PEG-Derivaten sind z.B. in Crit. Rev. in Therapeutic Drug Design 9:249 (1992) und Rev. Macromol. Chem. Phys. C25:325 (1985) besprochen.
Die Kettenlänge des Inhibitors beeinflusst seine Fähigkeit, die Opsonisierung zu inhibieren und mit PEG-ähnlichen Inhibitoren scheint das optimale Molekulargewicht wahrscheinlich im Bereich von 1 bis 10 KD zu liegen.
Als eine Alternative zu den amphiphilen Polymeren, wie PEG, können Glykosaminoglykan-Einheiten alternativ als die Opsonisierungs-Inhibitoren verwendet werden. In dieser Hinsicht können besonders erwähnt werden Heparin, Heparan, Dermatan, Keratan und Chondroitin, und insbesondere Chondroitin-4-sulfat. Diese können natürlich für die Anlagerung an die Makrostruktur, oder wo sie auf Chelatstrukturen anwendbar sind, derivatisiert sein. Im allgemeinen werden die verwendeten Glykosaminoglykane ungefähr 10–100, insbesondere 20–60 Disaccharid-Einheiten in der Länge sein. Derartige Materialien sind z.B. von Sigma kommerziell erhältlich.
Andere Polymere wie Polyole, Folyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und weitere Inhibitoren, wie beschrieben in GB 9407812.8 (eine Kopie davon wird hiermit eingereicht) und Derivate davon, können als die Opsonisierungs-Inhibitoren verwendet werden. Was allgemein erforderlich ist, damit eine Funktion durch ein Polymer aus geführt wird, ist: Wasserlöslichkeit, geringe Wechselwirkung mit der Makrostruktur, z.B. mit dem Kern einer Aggregat-Makrostruktur; niedrige Toxizität; geringe Wechselwirkung mit Plasmaproteinen; und die Fähigkeit, eine „Bürsten"- oder „gewundene" Struktur zu bilden, die sich auswärts von der Makrostruktur erstreckt, die die Proteinbindung behindert.
Die Makrostruktur in den Kontrastmitteln der Erfindung kann von einheitlichem Bau sein, z.B. ein Partikel, ein Polychelatbildner oder ein dendrimäres Polymer, oder alternativ kann es eine Mehrzahl individueller Komponenten umfassen, die durch physikochemische Effekte zusammengehalten werden, z.B. ein Molekularaggregat.
Die schließliche Bioeliminations-Route für zumindest die Metallchelat-Einheiten in den Kontrastmitteln der Erfindung ist bevorzugt renal, und daher ist es, wo die Makrostruktur schließlich durch das RES abgezogen wird, bevorzugt, dass die Chelat-Anlagerung über bio-abbaubare Bindungen stattfinden sollte, die bei der Spaltung Fragmente freisetzen, die renal ausscheidbar sind, z.B. mit einem Molekulargewicht von weniger als 20 KD, bevorzugt weniger als 10 KD, speziell 200–5000 D. Dies ist speziell wichtig, wo die Makrostruktur partikulär ist.
Die Makrostruktur in den Kontrastmitteln der Erfindung wird allgemein eine von drei Formen annehmen: ein Partikel; ein Molekülaggregat; oder ein Molekül eines hohen Molekulargewichts (z.B. ein Polychelatbildner, wie beschrieben in WO-90/12050).
Von diesen sind die letzeren zwei speziell bevorzugt aufgrund ihrer größeren Neigung, die renale Ausscheidung zu vereinfachen, im Vergleich zur RES-Aufnahme der Chelat-Einheiten.
Molekülaggregate sind besonders interessant in dieser Hinsicht, da sie die Möglichkeiten eines verlängerten Bloodpool-Verweilens, wie auch die renale Ausscheidung (durch Aggregat-Erosion, was den allmählichen Verlust von Aggregat-Komponenten verursacht, die unterhalb des Nieren-Filtrations-Schwellenwertes liegen) ermögli chen. Im allgemeinen können derartige Strukturen unter Verwenden von amphiphilen molekularen Komponenten der Formel II C-D-E (II) erzeugt werden, wobei C eine hydrophile Metallchelat-enthaltende Einheit ist, D eine Opsonisierungs-inhibierende Einheit ist und E eine hydrophobe Einheit ist.
In Formel II, wie in den anderen Materialien gemäß der Erfindung, umfasst die Metall chelatierende Einheit bevorzugt einen makrocyclischen Chelatbildner, z.B. wie beschrieben in WO-93/06868. Andere chelatbildende Einheiten können, natürlich, auch verwendet werden, und viele derartige Einheiten wurden in der wissenschaftlichen und Patentliteratur in Bezug insbesondere auf MR-Kontrastmittel beschrieben. Der Leser wird besonders auf die veröffentlichten Patentanmeldungen von Schering, Nycomed Salutar, Nycomed Imaging, Bracco, Mallinkrodt, Guerbet und Squibb verwiesen. Makrocyclische und acyclische chelatbildende Einheiten, wie beschrieben in GB 9407812.8 , sind speziell bevorzugt.
Der Opsonisierungs-inhibierende Linker in der Aggregat-Komponente ist bevorzugt ein Material, wie oben beschrieben, z.B. ein Polyalkylenglykol, speziell PEG, oder ein Glycosaminoglykan. Die hydrophobe Einheit umfasst bevorzugt eine Alkyl- oder Arylgruppe oder ein Steroid, Vitamin, Porphyrin oder Phthalocyanin.
Ein besonders bevorzugtes Molekülaggregat basiert auf Phthalocyanin, mit daran konjugierten Opsonisierungs-Inhibitorgruppen und gegebenenfalls, z.B. über derartige Inhibitorgruppen, paramagnetische oder Schwermetall-Chelatgruppen. Die Phthalocyanin-Einheit kann hier sowohl als hydrophobe Einheit, als auch als eine Metallchelatierende Einheit wirken.
Andere amphiphile Moleküle können jedoch verwendet werden, um derartige Aggregate zu bilden und werden im allgemeinen die Formel besitzen C-D-E oder C¹-E-D-B wobei C¹ eine Metallchelatgruppe ist, die an eine hydrophobe Gruppe E direkt oder über eine Linkereinheit angelagert ist, und C, B, D und E wie oben beschrieben sind. C¹ kann hydrophil oder hydrophob sein und kann eine herkömmliche Chelat-bildende Einheit wie oben für C in Formel II diskutiert sein. Von diesen zwei Strukturen ist die erstere, die die Chelateinheiten an die Peripherie des Aggregats anordnet, die bevorzugte Struktur für T₁MR-Kontrastmittel.
Im allgemeinen wird der Inhibitor 15–85%, insbesondere 30–80% des Gewichts der Aggregatkomponente bilden und das Gesamtmolekulargewicht der individuellen molekularen Komponenten der Molekülaggregate gemäß der Erfindung beträgt erwünschterweise weniger als 15 KD, speziell 200 bis 10000 D, insbesondere 500 bis 5000 D. Die Verwendung von Aggregaten dieser Natur stellt sicher, dass die Aggregaterosion in der Vaskulatur zum Verlust von Fragmenten führt, die auf einfache Weise renal ausgeschieden werden, sogar obwohl das Aggregat als ein Ganzes eine verlängerte Retentionszeit im Bloodpool besitzt. Die renale Ausscheidung, die schnellste Bioeliminierungs-Route für die herkömmlichsten BCF-Mittel, ist natürlich bevorzugt, da Probleme der Toxizität verbunden mit einer Schwermetallretention im Körper minimiert werden.
Die zweite Form der Makrostruktur, die oben erwähnt ist, umfasst als eine Rückgrat-Struktur ein Makromolekül, wie einen oligomeren, polymeren oder dendrimeren Polychelatbildner, z.B. wie beschrieben in WO-91/05792, WO-90/12050, WO-93/06868 und GB 9407812.8 .
In dieser Ausführungsform dient das makromolekulare Skelett dazu, sowohl die Mehrzahl der Chelateinheiten als auch eine Mehrzahl von Opsonisierungs-Inhibitoreinheiten zu tragen.
Dendrimere Polychelatbildner, wie beschrieben in WO-93/06868 sind speziell als die Rückgratstrukturen bevorzugt, besonders jene, bei denen das Gesamtmolekulargewicht im Bereich von 2000 bis 20000 D liegt. Bei der Herstellung derartiger Polychelatbildner werden Chelatbildner-Einheiten auf das polymere Skelett an eine Mehrzahl von Anlagerungsstellen geladen. Für die Zwecke der Erfindung werden jedoch mindestens 3 derartige Stellen und bevorzugt 2 bis 50% derartiger Stellen beladen, statt mit Opsonisierungs-Inhibitoreinheiten.
Noch einmal können Chelat- und Opsonisierungs-Inhibitoreinheiten wie oben diskutiert verwendet werden, die Ersteren bevorzugt über bio-abbaubare Bindungen angelagert. Derartige bio-abbaubare Bindungen können am Chelatbildner sein: die Makrostrukturgrenzfläche kann so innerhalb der Polymerstruktur angeordnet sein, dass Chelat-tragende Fragmente mit Molekulargewichten unter dem Nieren-Schwellenwert freigesetzt werden. Damit Makromolekül:Chelatbildner- und Makromolekül:Inhibitor-Konjugation bewirkt wird, kann es nötig sein, dass das Makromolekül, der Chelatbildner und der Inhibitor derivatisiert werden, um geeignete Anlagerungsstellen bereitzustellen. Dies kann durch herkömmliche Mittel ausgeführt werden, z.B. durch Carbamatester-Aktivierung von Monomethoxy-PEG, um Nitrophenylcarbamat-PEG-methoxy zu ergeben, oder durch beliebige der Mittel, die für Polychelatbildner-Herstellung im MR-Gebiet beschrieben werden, z.B. in WO-90/12050 oder GB 9407812.8 .
Die schließliche Kategorie von Mitteln gemäß der Erfindung sind die sogenannten Partikel. Dies würde z.B. umfassen Zeolithe, z.B. wie beschrieben in WO-93/08846, die als ein chemischer/physikalischer Käfig wirken können, der die chelatierte diagnostische Metallspezies trägt. Derartige Strukturen werden jedoch im allgemeinen von geringerem Interesse für die Verabreichung in die Vaskulatur sein, aufgrund ihrer eventuellen Aufnahme durch das RES-System und die resultierende Wahrscheinlichkeit, dass die chelatierten Metalle eine verlängerte Bioretention besitzen. Gleichwohl können derartige partikuläre Chelatträger an Opsonisierungs-Inhibitoren konjugiert sein, wie jene, die oben diskutiert sind, um Kontrastmittel gemäß der Erfindung bereitzustellen. Wo dies ausgeführt wird, wird die Partikelgröße (Durchmesser) bevorzugt im Bereich von 20 bis 1000 nm, speziell 50 bis 500 nm liegen und die Beladungs-Niveaus werden bevorzugt 2 bis 20 Gew-% des jeweiligen paramagnetischen Metalls betragen.
Im allgemeinen gibt es, während mindestens drei Opsonisierungs-Inhibitoreinheiten an jede Makrostruktur bei den Mitteln der Erfindung angelagert sein sollten, ein optimales Beladungsniveau, über dem die Opsonisierungs-Inhibition verringert ist, und allgemein werden die Inhibitoreinheiten nicht auf mehr als 50% der Gesamtmasse der Struktur entfallen.
Von einem weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung auch ein Verfahren für die Herstellung der Kontrastmittel der Erfindung bereit, wobei das Verfahren umfasst (i) Metallieren einer Makrostruktur, an die eine Mehrzahl von Opsonisierungs-inhibierende Einheiten und chelatbildende Gruppen gebunden sind; oder (ii) Binden einer Mehrzahl von Opsonisierungs-inhibierenden Einheiten an eine Makrostruktur, die chelatierte ionische paramagnetische oder Schwermetall-Einheiten trägt; oder (iii) Erzeugen einer Makrostruktur aus einer Mehrzahl von molekularen Komponenten, wobei die Mehrzahl von Komponenten Opsonisierungs-inhibierende Einheiten und chelatierte ionische paramagnetische oder Schwermetall-Einheiten umfasst.
Im allgemeinen können, wo die Kontrastmittel der Erfindung polychelatbildende Moleküle umfasst, diese durch Konjugieren der chelatbildenden Einheiten an ein Rückgrat-Polymermolekül vor dem Konjugieren des Rückgrat-Polymers an einen beliebigen Opsonisierungs-Inhibitor, wie PEG, synthetisiert werden. Die Metallionen können zugegeben werden, um den Metallkomplex der Polychelatbildner zu bilden, vor oder nach der Konjugation des Polychelatbildners an den Inhibitor. Bevorzugt wird das Metall vor der Konjugation des Polychelatbildners an den Inhibitor zugegeben werden. Jedoch wird für einige Metallionen, wie Radionuklide mit einer kurzen Halbwertszeit, die Metallierung bevorzugt nach der Konjugation, gerade vor der Verwendung, ausgeführt werden.
Im allgemeinen können bekannte Verfahren verwendet werden, um die Chelatbildner an Rückgrat-Moleküle zu knüpfen. Siehe WO-90/12050. Derartige Verfahren umfassen z.B. die gemischte Anhydrid-Prozedur von Krejcarek et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 77:581 (1977), die cyclische Anhydrid-Prozedur von Hnatowich et al. (siehe Science 220:613 (1983) und woanders), die Rückgrat-Derivatisierungsprozedur von Meares et al. (siehe Anal. Biochem. 142:68 (1984) und das Verfahren, das von Manabe et al. in Biochemica et Biophysica Acta 883: 460–467 (1986) beschrieben ist, zum Anlagern von DTPA-Resten an ein Poly-Llysin-Rückgrat unter Verwenden einer Modifikation der cyclischen Anhydrid-Prozedur. Während für bevorzugte makrocyclische Chelatbildner, wie DOTA, die herkömmlichen Techniken der Konjugation des gemischten Anhydrids und des cyclischen Anhydrids, die durch Krejcarek und Hnatowich beschrieben werden, ineffektiv sind, wurde gefunden, dass Modifizieren der Prozedur des gemischten Anhydrids durch Umsetzen eines makrocyclischen Polycarbonsäure-Chelatbildners in einem wasserfreien Medium mit einer Aminbase einer ausreichenden Stärke zum Abziehen aller Carboxylprotonen (d.h. einen pKa, der hoch genug ist) ein Aminsalz ergibt, das mit einem Alkylhaloformiat reagieren kann, um ein aktiviertes Anhydrid zu erzeugen, das zum Konjugieren an Rückgrat-Polyamin fähig ist, ohne das unerwünschte Vernetzen, das mit bifunktionellen Polychelatbildnern des Stands der Technik in Zusammenhang steht, zu verursachen. Für die meisten makrocyclischen Chelatbildner wird Tetramethylguanidin oder eine Aminbase ähnlicher Stärke die bevorzugte Base sein.
Komplexere Konjugationstechniken, die z.B. die Verwendung von Rückgratderivatisierten makrocyclischen Chelatbildnern in einer Weise beinhalten, die jener von Meares et al. (supra) analog ist, können natürlich verwendet werden, aber die vergrößerten Kosten und die Komplexität der gesamten Herstellung machen dies zu einer weniger erwünschten Route. Auf ähnliche Weise können die Chelatbildner an das Rückgratpolymer durch ein Haloacetylhalogenid-, ein Phosgen- oder ein Thiophosgen-Verfahren, abhängig von der verfügbaren reaktiven Gruppe auf dem chelatierenden Mittel, angelagert werden.
Für Chelatbildner, z.B. Makrocyclen, mit einem anhängenden Carboxylat, einschließlich, aber nicht beschränkt auf DOTA, TETA, TRITA (1,4,7,10-Tetraazacyclotridecantetraessigsäure) und NOTA, kann eines der Carboxylate eine Einheit bilden, die mit einer primären Amingruppe des Rückgratpolymers reagieren kann. Verfahren zum Bilden einer reaktiven Einheit aus einer Carboxylatgruppe umfassen die modifizierte Reaktion des gemischten Anhydrids, z.B. unter Verwenden von Isobutylchloroformiat (IBCF) oder die Bildung eines „aktiven Esters" unter Verwenden eines Carbodiimids (DCC oder EDAC, vgl. Pierce Catalog (1988), Seiten 252 und 253). Beide Reaktionssequenzen geben Anlass zu einem Rückgratpolymer, das mehrfach mit den chelatbildenden Einheiten über stabile Amidbindungen substituiert ist. Das modifizierte Verfahren des gemischten Anhydrids ist jedoch das bevorzugte Verfahren zur Verwendung beim Verknüpfen von Carboxylat enthaltenden makrocyclischen Chelatbildnern mit dem Rückgrat-Polymer.
Die modifzierte Reaktion des gemischten Anhydrids wird in einem wasserfreien Lösungsmittel bevorzugt mit einem Schmelzpunkt unter 5°C, gekühlt auf eine Temperatur nicht weniger als 5°C oder größer als ungefähr 55°C oberhalb seines Gefrierpunktes ausgeführt. Die Solubilisierung des Chelatbildners in dem geeigneten Lösungsmittel wird günstigerweise durch Herstellen des Aminsalzes des Chelatbildners unter Verwenden der Aminbase in situ bewirkt.
Die Wahl der Base wird durch den pKa der relevanten Carboxylate bestimmt. Für die meisten Chelatbildner ist Tetramethylguanidin (TMG) speziell bevorzugt. Im allgemeinen werden Basen günstigerweise von jenen Basen ausgewählt, deren pKa-Wert den höchsten pKa des Chelatbildners um mindestens 0,5, bevorzugt 0,8, speziell be vorzugt mindestens 1,0, überschreitet. Aminbasen mit pKa's von mindestens 11, speziell 11,3, besonders mindestens 12, sind besonders bevorzugt und neben TMG kann besonders erwähnt werden Piperidin, Chinuclidin und N-Ethylpiperidin und spezieller DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) und DBN (1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en). Weitere Basen werden von Martell und Smith in „Critical Stability Constants", Band 5, 1. Ausgabe, Plenum Press, NY 1982 aufgelistet.
Die angemessene Menge von purem (abgekühltem) Alkylhaloformiat wird nun unter Rühren zugegeben und die ursprüngliche Temperatur des Lösungsmittels wird durch Kühlen, z.B. durch Zugabe eines Kühlmittels, falls erforderlich, beibehalten. Isobutylchloroformiat ist speziell bevorzugt. Das resultierende Anhydrid des Chelatbildners kann mit Amin-enthaltendem Dendrimer umgesetzt werden, um einen Verstärker-Polychelatbildner zu bilden. Der Verstärker-Polychelatbildner wird an diesem Punkt für die meisten Anwendungen metalliert und durch Chromatographie oder Kristallisation gereinigt, um überschüssige Metallionen und Metallkomplexe niedrigeren Molekulargewichts zu entfernen. Für die Verwendung mit Ziel-spezifischen Molekülen wird der Verstärker-Polychelatbildner, oder die am wenigsten teilweise metallierte Form davon, der immer noch mindestens ein freies Amin enthält, an das Targeting-Molekül konjugiert, z.B. durch Reaktion mit einem oder vielen gut bekannten heterobifunktionellen Kopplungsmitteln. Gerade bei dieser Stufe kann das Beladen mit Opsonisierungs-Inhibitor günstigerweise bewirkt werden. In Situationen, wo eine vorherige Metallierung nicht angemessen ist, z.B. mit Radionuklidmetallionen mit kurzen Halbwertszeiten, kann das Inhibitor:Polychelatbildner-Konjugat unter Verwenden eines metallfreien Polychelatbildners und Koppeln wie oben beschrieben hergestellt werden, gefolgt von Metallierung (vide infra) und schließlicher schneller, einfacher Reinigung durch Chromatographie oder Filtration.
Die Chelatbildner können auch an das Rückgrat-Polymer durch eine nicht-koordinierende primäre Amingruppe oder eine entfernte Carboxylgruppe, die nicht in die Metallkoordination involviert ist, gebunden werden. Makrocyclische Chelatbildner, die eine nicht-koordinierende primäre Amingruppe besitzen, umfassen Primäramin- Seitenketten-derivatisierte DOTA-Makrocyclen, Primäramin-derivatisiertes DO3A und Primäramin-derivatisierte Hexaazasepulchrate und Sarcophagine, wie auch die breite Klasse von derivatisierten Kronenether-Kryptaten. Wo Carboxylgruppen an dem Chelatbildner (oder tatsächlich auf einer beliebigen anderen aktiven Einheit) für die Bindung verwendet werden, kann eine Routine-Carboxylaktivierungs-Chemie zum Anlagern z.B. an Aminfunktionen am Rückgrat oder an einen Linker, der an das Rückgrat konjugiert ist, verwendet werden.
Die nicht-koordinierende primäre Amingruppe auf diesen Chelatbildnern kann mit Haloacetylhalogenid unter gut bekannten Bedingungen umgesetzt werden, um ein Haloacetamid zu bilden. Das Haloacetamid kann mit einem primären Amin des Rückgratpolymers reagieren, um eine stabile Amidbindung zwischen dem Chelatbildner und dem Polymer zu bilden. Das Haloacetylhalogenid-Verfahren, das in De Riemer et al., J. Labelled Compd. Radiopharm 18:1517 (1981) beschrieben ist, kann zum Knüpfen von Amin enthaltenden Chelatbildnern an das Rückgratpolymer verwendet werden.
Amingruppen auf einem Chelatbildner können auch mit Phosgen oder Triphosgen umgesetzt werden, um eine reaktive Isocyanatgruppe zu erzeugen oder mit Thiophosgen, um eine reaktive Isothiocyanatgruppe zu erzeugen. Derartige Gruppen können mit einem primären Amin des Rückgratpolymers reagieren, um einen stabilen Harnstoff bzw. stabilere Thioharnstoffbindungen zwischen dem Liganden und dem Rückgratpolymer zu bilden. Gansow, Inorg. Chimica Acta 91:213 (1984) und Moi et al., J. Amer. Chem. Soc. 110:6266 (1988) beschreiben Verfahren zum Binden von Chelatbildnern an Proteine mit einer Amingruppe durch Bildung der Isocyanat- oder Isothiocyanat-Einheiten unter Verwenden der Phosgen- bzw. Thiophosgenverfahren. Siehe auch Desreux, Inorg. Chem. 19: 1319 (1980); Bryden et al., Anal. Chem. 53:1418 (1981); Delgardo et al., Talanta 29:815 (1982); Cacheris et al., inorg. Chem. 26:958 (1987); Moi et al., Inorg. Chem. 26:3458 (1987) und Meares et al., Acc. Chem. Res. 17:202 (1984).
Noch weitere Mittel des Koppelns der chelatbildenden Einheiten an das Rückgratpolymer werden durch die folgenden Reaktionsschemata veranschaulicht:
Für Amin-terminierende dendrimere Polymere repräsentiert das Material NH₂--Polymer ein Full-Generation-Dendrimer (z.B. G_2.0).
Die Einfügung einer Oligoaminosäure (z.B. Oligolysin)-Kette in die Polymer-an-Chelatbildner(oder Inhibitor)-Einheit-Bindung ist besonders erwünscht, da dies die Kapazität für eine gesteuerte hydrolytische in-vivo-Freisetzung der angelagerten Einheit bereitstellt. (Siehe „The Application of Drug Polymer Conjugates in Chemotherapy" von Hoes und Feijen in "Drug Carrier Systems" Roerlink et al. Herausgeber, J. Wiley, 1989).
Metallionen werden für die Chelatierung in den Bloodpool-Mitteln der Erfindung wegen ihrer Fähigkeit, ihre diagnostische Rolle auszuführen, gewählt. Diese Rollen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Verstärken von Bildern in MRI, Gamma-Szintigraphie oder CT-Scanning oder Röntgenstrahlung.
Metalle, die durch Chelatierung eingebaut werden können, umfassen Lanthanide und andere Metallionen, einschließlich Isotope und Radioisotope davon wie z.B. Mg, Ca, Sc, Ti, B, In, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Sr, Y, Sr, Tc, Ru, In, Hf, W, Re, Os, Pb und Bi. Besonders bevorzugte Radioisotope von einigen der Vorstehenden umfassen ¹⁵³Sm, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga ⁶⁸Ga ⁸⁹Sr, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ^99mTc, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹¹¹In, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re ²⁰³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹³Bi und ²¹⁴Bi. Die Wahl des Metallions für die Chelatierung wird durch die erwünschte diagnostische Anwendung bestimmt werden.
Wie erwähnt hängt die Wahl der Metallionen, die in Chelatkomplexen von den Kontrastmitteln der Erfindung gehalten werden, von der diagnostischen Technik ab, für die das Mittel verwendet werden soll. Für MRI und MRS sollten die Metallionen paramagnetisch und bevorzugt nicht radioaktiv sein. Für Röntgenstrahlungs- und Ultraschallbildgebung, sollten Schwermetallionen, z.B. mit Atomzahlen von mindestens 37, bevorzugt mindestens 50, verwendet werden, wieder bevorzugt nicht-radioaktive Spezien. Für die Szintigraphie sollten die Metallionen natürlich Ionen von radioaktiven Isotopen sein. Für MR, Röntgenstrahlung, EIT oder magnetometrische Bildgebung kann man chelatierende Gruppen verwenden, um an Schwermetallcluster (z.B. Polyoxyanionen und jene vollen oder teilweisen Schwefelanaloga) oder an Eisenoxide oder andere superparamagnetische polyatomare Spezien zu binden.
Für Zeolith-Makrostrukturen wird der Metall-Einbau bevorzugt vor der Konjugation der Opsonisierungs-Inhibitoren bewirkt. Poren-Mund-Engineering oder Oberflächen-Dealuminierung, wie in WO-93/08846 beschrieben, wird auch bevorzugt bewirkt werden.
Verfahren zum Komplexieren von Metallionen mit Chelatbildnern und Polychelatbildnern liegen innerhalb des Niveaus des Fachwissens. Jedes der verwendeten Metalle kann in eine chelatbildende Einheit durch eine von drei allgemeinen Verfahren eingebaut werden: direkter Einbau, Template-Synthese und/oder Transmetallierung. Direkter Einbau ist bevorzugt.
Für eine direkte Metallierung wird das Metall von sub-stöchiometrischen Gehalten bis zum vollen Einbau titriert, wobei so die Notwendigkeit für Dialyse und extensive chromatographische Reinigung eliminiert wird. Auf diese Weise werden signifikante Verluste, wie auch eine Verdünnung, vermieden. Nicht spezifisches Binden der Me tallionen wird auch verhindert. Jedoch wird die Anwendung der Erfindung auf Radionuklide mit kurzen Halbwertszeiten eine Metallierung als schließlichen Schritt erfordern, gefolgt von einer einfachen schnellen Reinigung (z.B. Gelfiltration), um überschüssiges, ungebundenes Radionuklid zu entfernen.
Die Metallionen Fe (III), Cr (III), Mn (II), Hg (II), Pb (II), Bi (III) und die Lanthaniden können direkt in Polyaminopolycarboxylate durch die folgende allgemeine Prozedur eingebaut werden. Eine wasserlösliche Form des Metalls, allgemein ein anorganisches Salz, wird in einem geeigneten Volumen destilliertem, entionisiertem Wasser aufgelöst. Der pH der Lösung wird unter 7 sein. Eine wässrige Lösung, die eine äquimolare Menge des Chelatbildners enthält, wird zu der Metalllösung bei Umgebungstemperatur unter Rühren gegeben. Der pH der Mischung wird langsam durch Zugabe einer Base, typischerweise 0,1 M NaOH, angehoben, bis die Donor-Gruppen des Chelatbildners deprotoniert sind, allgemein im pH-Bereich von 5 bis 9, abhängig von den chelatbildenden Einheiten. Besonders vorsichtig muss mit den Lanthanidionen umgegangen werden, um den pH unter 8 zu halten, um eine Präzipitation des Metallhydroxids zu vermeiden. Metalleinbau in von DOTA abgeleiteten und darauf bezogenen makrocyclischen chelatbildenden Einheiten wird normalerweise ein langsamer Prozess sein, wie in den unten zitierten Literaturstellen beschrieben. Spezifische Beispiele der Prozedur sind in den folgenden Literaturstellen enthalten.
Choppin et al., J. Inorg. Nucl. Chem., 33:127 (1971), Margerum, Rec. Chem. Prog., 24:237 (1973) und D'Olieslager et al, J. Inorg. Nucl. Chem, 35:4255 (1973) beschreiben einen direkten Einbau der Lanthaniden in Polyaminopolycarboxylate. Magerstadt, Mag. Res. Med., 3:808 (1986) und WO-A-87/06229 beschreiben den Einbau von Gd(III) in DOTA. Ein Verfahren zum Herstellen von Bi und Pb-Komplexen von DOTA wird von Kumar et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 31:145 (1989) beschrieben.
Der direkte Einbau von Hf, Zr, W, Hg und Ta können gemäß gut bekannten Verfahren ausgeführt werden. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4,176,173 (Winchell).
Transmetallierung ist nützlich, wenn das Metallion in einen geeigneteren Oxidationszustand für die Donoratome der chelatbildenden Einheit zum Binden reduziert werden muss. Zum Beispiel, um ^99mTc oder ^186/188Re einzubauen, muss das Metallion auf Tc(V) oder Re(V) durch die Verwendung von Reduktionsmitteln wie SnCl₂ oder Cystein durch gut bekannte Verfahren reduziert werden. Dieses Verfahren erfordert die Bildung eines intermediären Komplexes. Ein typisches Beispiel ist die Reduktion von ^99mTc mit Sn bei Vorhandensein eines schwach koordinierenden Liganden, wie Glucoheptonat, vor der Komplexierung mit Chelatbildnern wie DOTA. Diese Verfahren sind in der radiopharmazeutischen Technik gut bekannt. ⁶⁷Cu nutzt Tetraaminchelate, wie tet A oder tet B (s. Bhardaredj et al., JACS, 108:1351 (1986), um Cu(II) für eine Reaktion mit stärker bindenden Chelatbildnern zu stabilisieren.
Die Kontrastmittel der Erfindung können an Patienten zum Abbilden in Mengen verabreicht werden, die ausreichend sind, um den erwünschten Kontrast mit der besonderen Bildgebungstechnik zu ergeben. Allgemeine Dosierungen von 0,001 bis 5,0 mmol chelatiertem Bildgebungs-Metallion pro kg Patienten-Körpergewicht sind wirksam, um angemessene Kontrastverstärkungen zu erreichen. Für die meisten MRI-Anwendungen werden bevorzugte Dosierungen des Bildgebungsmetallions im Bereich von 0,001 bis 1,2, z.B. 0,01 bis 0,5, mmol/kg Körpergewicht sein, während für Röntgenstrahlungsanwendungen Dosierungen von 0,5 bis 1,5 mmol/kg im allgemeinen wirksam sind, um Röntgenstrahlungs-Abschwächung zu erreichen. Bevorzugte Dosierungen für die meisten Röntgenstrahlungs-Anwendungen betragen von 0,8 bis 1,2 mmol des Lanthanids oder Schwermetalls/kg Körpergewicht.
Für Röntgenstrahlungs-Anwendungen können, um den Photonenenergiebereich, über dem die Kontrastmittel der Erfindung optimal wirksam sind, zu strecken, zwei oder mehr verschiedene chelatierte Metalle gleichzeitig verwendet werden.
Es gibt viele Verfahren, die zum Anlagern von Polyethylenglykol oder Monomethylpolyethylenglykol an Polyamine oder andere Makrostrukturen verfügbar sind. Eine An lagerung kann z.B. durch eine inerte kovalente Bindung oder durch eine bioabbaubare Anlagerung (z.B. Carbamat) ausgeführt werden. Die Methodik für eine derartige Anlagerung kann in den folgenden Literaturstellen gefunden werden: Harris, Rev. Macromol. Chem. Phys. C25(3):325 (1985) und Delgado, Critical Rev. Drug Carrier Sys. 9(3, 4):249 (1992). So ist ein beispielhaftes Schema wie folgt:
Allgemeine Verfahren, um eine Opsonisierungs-Inhibitor-beladene Verbindung zu konstruieren:
H₂N-R ist eine Aminogruppe auf einer Makrostruktur (oder einer Makrostrukturkomponente oder auf einer Gruppe, die an eine Makrostruktur konjugieren kann, z.B. durch Reaktion mit einer Oberflächengruppe eines Partikels), die wirksame Einheiten (z.B. Metallchelate), die schon angelagert sind, besitzen kann oder nicht. McPEGX ist ein Methoxy-terminiertes PEG des Molekulargewichts 500 bis 10000.
Mögliche Routen unter Verwenden von PEG-Anlagerungschemie
Es sollte beachtet werden, dass viele aktivierte PEG-Verbindungen, die zur Verwendung bei der Herstellung von Aggregat-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung geeignet sind, kommerziell erhältlich sind, z.B. von Shearwater.

1. Cyanurchlorid-Route: Kopplungsbedingungen = pH 9, Reaktion mit Thiolen, mögliche Dimerisierung mit Mono-Derivat, UV-Chromophor. Reaktionen:
(siehe z.B. Anal. Biochem.165:114 (1987) und j. Biol. Chem. 252:3582 1977)).
2. Route, die zu einer Amidbindung zwischen PEG und Verstärker führt: eine Makrostruktur oder eine Makrostrukturkomponente, die mit Thiolen nicht reagiert, mögliche Esterhydrolyse mit Bernsteinsäurederivat Reaktionen:
(siehe z.B. Appl. Biochem. Biotechnol. 11:141 (1985) und Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)).
3. Carbamatbindung zwischen PEG und einer Makrostruktur oder einer Makrostrukturkomponente: lange Reaktionszeit, Kopplungsbedingungen = pH 8,5–9,2, merkliche Hydrolyse, aktiviertes PEG kann gespeichert werden. Reaktionen:
(siehe z.B. Klin. Paediatr. 200:184 (1988) und Anal. Biochem. 131:25 (1983)).
4. Anlagerung mit Sulfonylchloriden: milde Bedingungen (pH 7,5, Umgebungstemperatur), schnelle Reaktion Reaktionen:
(s. z.B. Biotechnol. Appl. Biochem. 12:119 (1990))
5. Aminbindung: sehr stabile Bindung: Reaktionen:
(Siehe z.B. J. Macromol. Sci., Rev. Poly. Chem. Phys., C25:325 (1985) und J. Polymer Sci. 22:341 (1984)).

* Verwende weniger als eine stöchiometrische Menge von Chelat (< y äq) um Stellen für die Anlagerung mehrer PEG-Einheiten offen zu lassen.

D im Schema oben repräsentiert ein Dendrimer der n-ten Generation, das zum Laden von Chelatbildner- und Opsonisierungs-Inhibitoreinheiten darauf umgesetzt ist. n ist allgemein niedrig, z.B. bis zu 5.
Von einem weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung deshalb eine diagnostische Kontrastmittelzusammensetzung bereit, umfassend ein Kontrastmittel gemäß der Erfindung zusammen mit mindestens einem physiologisch tolerierbaren Träger oder Bindemittel.
Die Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung können mit herkömmlichen pharmazeutischen oder tiermedizinischen Hilfsmitteln formuliert werden, z.B. Emulgatoren, Fettsäureester, Geliermittel, Stabilisatoren, Antioxidantien, die Osmolalität einstellende Mittel, Puffer (z.B. Tromethaminhydrochlorid), Konservierungsmittel, antimikrobielle Mittel, den pH einstellende Mittel, Zugaben (0,01 bis 10 mol-%) von Chelatbildnern (wie z.B. DTPA oder DTPA-Bisamid) oder Kalziumchelat-Komplexen (wie z.B. Kalzium-DTPA oder CaNaDTPA-Bisamid) oder gegebenenfalls Zugaben (z.B. 1 bis 50 mol%) von Kalzium- oder Natriumsalzen (z.B. Kalziumchlorid, Kalziumascorbat, Kalziumglukonat oder Kalziumlaktat) etc., und können in einer Form vorliegen, die für die parenterale Verabreichung, z.B. Injektion oder Infusion direkt oder nach Dispersion in physiologisch tolerierbaren Trägermedien geeignet sind. Daher können die Kontrastmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in herkömmlichen pharmazeutischen Verabreichungsformen vorliegen, wie Pulvern, Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, etc.; jedoch werden Lösungen, Suspensionen und Dispersionen in physiologisch annehmbaren Trägermedien, z.B. Wasser, für Injektionen allgemein bevorzugt sein.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können deshalb für die Verabreichung unter Verwenden von physiologisch annehmbaren Trägern oder Bindemitteln in einer Weise formuliert werden, die vollständig innerhalb des Fachwissens liegt. Zum Beispiel können die Kontrastmittel, gegebenenfalls mit der Zugabe von pharmazeutisch annehmbaren Bindemitteln, suspendiert oder aufgelöst werden in einem wässrigen Medium, wobei die resultierende Lösung oder Suspension dann sterilisiert wird.
Die parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen gemäß der Erfindung, z.B. intravenöse Lösungen, sollten steril und frei von physiologisch nicht annehmbaren Mitteln sein und sollten eine niedrige Osmolalität besitzen, um eine Irritation oder andere nachteilige Effekte bei der Verabreichung zu minimieren. Geeignete Vehikel umfassen wässrige Vehikel, die üblicherweise für die Verabreichung von parenteralen Lösungen verwendet werden, wie Sodium Chloride Injection, Ringer's Injection, Dext rose Injection, Dextrose and Sodium Chloride Injection, Lactated Ringer's Injection und andere Lösungen, wie jene, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Ausgabe, Easton: Mack Publishing Co., Seiten 1405–1412 und 1461–1487 (1975) und The National Formulary XIV, 14. Ausgabe Washington: American Pharmaceutical Association (1975) beschrieben sind.
Von einem noch weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung die Verwendung eines Kontrastmittels gemäß der Erfindung zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung bereit.
Diese Erfindung wird durch die folgenden spezifischen Beispiele weiter veranschaulicht. Temperaturen sind in °C und Konzentrationen als Gewichtsprozentsätze angegeben, wenn nicht anders spezifiziert.
BEISPIEL 1
Gereinigter Extrakt von LaJolla Blue ZZ (LJBII)
a. Synthese

(i) Sulfonylierung: Siliciumphthalocyanin (5000 mg) wird in rauchender Schwefelsäure (15 ml) aufgelöst und auf 75°C 1 h lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wird auf Eis gegossen. Das Produkt wird gesammelt, mit 1 M HCl gewaschen und in 1 M NaOH (20 ml) wieder aufgelöst. Die unlöslichen Verunreinigungen werden durch Filtration entfernt und das Filtrat wird mit 1 M HCl neutralisiert. Das Produkt wird isoliert und in vacuo getrocknet.
(ii) PEGylierung: eines der oben genannten Sulfonate wird durch Chlorierung unter Verwenden von SOCl₂ (32 ml bei Umgebungstemperatur) modifiziert. Die Mischung wird 3 h lang bei 80°C erwärmt und gekühlt. Ungefähr 4 ml der Mischung wird Tropfenweise auf Eis gegeben und filtriert, dann in vacuo getrocknet. PEG-Ethanolamin (Avanti, durchschnittliches PEG = 2000; siehe auch H₂N-PEG-OH. Huang et al., Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 23:795 (1985) wird in 10 ml Dichlormethan aufgelöst und zum oben angegebenen Feststoff in Diisopropylethylamin (0,5 ml) gegeben. Nach Rühren für 20 h wird die Lösung teilweise verdampft und 2 ml Toluol wird zugegeben. Die Mischung wird getrocknet und gereinigt wie oben dargelegt.

b. Reinigung des rohen Produktes
Rohes LJBII wurde zuerst durch ein Membranfilter in Wasser (MWCO = 10 KD) filtriert: Der Rückstand wurde eingedampft und in Dichlormethan wieder aufgelöst und von einer Silikagelsäule mit einem 2,5% bis 50%-igen Methanolgradienten in Dichlormethan eluiert. Der Hauptpeak wurde gesammelt und auf Reinheit durch HPLC analysiert (95,5% reines Produkt, PKB-100-Säule, MeOH/H₂O, HOAc (0,48%) in Verhältnissen von 62,5/0,5/37, pH 7,1, 1,2 ml/min). Elementaranalyse N/S-Verhältnis = 9,75 bis 10,5, was ein Monosulfat, Monoamino-PEGyliertes Siliciumphthalocyanin anzeigt. Massenspektrometrie (M + Na) + bei 2187,5 bis 2980,4, entsprechend Ethylenoxidketten von 31 bis 49 Einheiten, was die vorhergesagte Struktur bestätigt.
c. Aggregation
Bei Konzentrationen größer als 0,15 mg/ml in Wasser durchlief gereinigtes LJBII nicht ein Membranfilter von MWCO 30 KD, aber durchlief ein 0,2 μm-Filter. Dies zeigte eine größere Struktur als nur die Monomereinheit an (MW = 2500).
d. Biodistribution
Die Biodistribution und Ausscheidung von gereinigtem La Jolla Blue II wurde in der erwachsenen männlichen Swiss Webster-Maus nach einer intravenösen Verabreichung bestimmt. Die Verbindung wurde bei einer Dosis von 0,05 mmol/kg an 24 Mäuse, die in Gruppen von 3 zugewiesen waren, verabreicht. Die Tiere wurden zu vorgewählten Zeitpunkten (3, 9, 15, 30 und 60 Minuten, 4 und 24 Stunden und 7 Tagen; Gruppen 1 bis 8, jeweils) nach der Verabreichung getötet. Urin- und Fäkalproben wurden von den Tieren in den Gruppen 6, 7 und 8 gesammelt. Proben wurden aus dem Blut und dem peritonealen Fluid entnommen und Hauptorgane (Leber, Milz, Nieren, Herz, Lungen, Hirn und Gallenblase) wurden herausgeschnitten, gewogen und in einem Detergens (0,01% Tween 20) homogenisiert. Aliquote Mengen dieser halb-gelösten Suspensionen wurden auf das Vorhandensein von Siliciumphthalocyanin entweder mit einem Fluorimeter oder durch UV-VIS-Absorptionsspektrophotometrie gemessen. Die Konzentration der Verbindung wurde aus Standardkurven für jedes der Gewebe, hergestellt unter identischen Bedingungen, von einem nicht behandelten Tier bestimmt.
Blutgehalte ergaben durchschnittlich 15,71 % ± 2,43 (S.A.) der verabreichten Dosis nach 3 min nach der Verabreichung, 12,64% ± 3,39 nach 4 h, 2,79% ± 0,14 nach 24 h und weniger als 1 % (0,05% ± 0,00) nach 7 Tagen. Die Leber ergab durchschnittlich 2,41 % ± 0,82 der verabreichten Dosis nach 3 min und änderte sich nicht beträchtlich während der 7 Tage der Studie. Die Lunge und die Leber ergaben durchschnittlich 1,09% ± 0,20 (nach 60 min) bzw. 1,37% ± 0,11 (nach 3 min), was aber auf annähernd 1 % oder weniger nach 15 min verringert wurde. Die kumulative Wiedergewinnung von La Jolla Blue II im Urin nach 2 h ergab durchschnittlich 45,52% ± 4,92 (n = 8) und annähernd 76% (n = 6) nach 24 h. Nach 7 Tagen wurde 78,01 % ± 10,10 (n = 3) des verabreichten La Jolla Blue II im Urin wiedergewonnen, wobei weniger als 1 % in Fäkalien nachgewiesen wurde.
Gereinigtes La Jolla Blue II zeigte eine Biodistribution und ein Ausscheidungsmuster, das konsistenter mit jenem eines Bloodpool-Mittels war als mit einem Mittel des extrazellulären Fluids. Weil die Verbindung durch Fluoreszenz bis zu 7 Tage detektierbar war, deutet dies an, dass es keinen signifikanten in-vivo-Metabolismus der Ringstruktur der Verbindung gab.
BEISPIEL 2
Amphoterer Gd-DO3A-Komplex:
Herstellung von auf GdAE-D03A basierendem amphoterem Mittel:
a) 1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-10-methoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododekan
(1a) 1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododekanhydrobromid (25,0 g, 42 mmol) wurde in Acetonitril aufgeschlämmt und mit TMG (70 ml) behandelt. Methylbromacetat (6,5 g, 42 mmol) wurde in einer Portion zugegeben und die Mischung wurde 3 h lang unter Rückfluß gekocht. Nach Rühren bei Umgebungstemperatur für zusätzliche 18 h wurde das Lösungsmittel und überschüssiges TMG durch Rotationsverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in CHCl₃ aufgelöst, gewaschen mit Wasser und getrocknet (Na₂SO₄). Verdampfen des Lösungsmittels lieferte das Titelprodukt als ein blasses Öl (23 g, 95%).
¹H NMR (CDCl₃): 1,4 (s, 27 H), 2,8 (s, 16 H), 3,2 (s, 6 H), 3,4 (s, 2 H), 3,6 (s, 3 H)
b) 1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl-1,4,7,10-tetraazacyciododekan
(1b) Methylester 1a (23,0 g, 40 mmol) wurde in Methanol (500 ml) aufgelöst und mit Ethylendiamin (200 ml) behandelt. Die Mischung wurde bei Umgebungstem peratur 3 Tage lang gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Ethylendiamin wurden durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde verdampft, um das Titelprodukt als ein viskoses Öl (18 g, 75%) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl₃): 1,4 (s, 27 H), 2,5–3,0 (m, 20 H), 3,3 (m, 8 H), 6,0 (br s, 1 H)
c) 1,4,7-Tri-(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododekan (1c oder AE-D03A)
Ester (1b) (10,0 g, 16 mmol) wurde durch Reaktion mit sauberem TFA (200 ml) bei Umgebungstemperatur für 3 h entschützt. Nach dem Entfernen des TFA wurde der Rückstand in 1 M NaOH aufgelöst und auf eine Ionenaustauschsäule geladen ([AG 1 × 8 (OH-)], 200 ml). Diese Säule wurde mit Wasser gewaschen und das Produkt wurde mit 1,5 M HOAc eluiert. Konzentrieren der Fraktionen, die das Titelprodukt enthielten, ergab 7,0 g (93%) als einen weißen Feststoff.
¹H NMR (D₂O): 2,9–3,6 (br. mult.) Analyse berechnet für C₁₈H₃₄N₆O₇HOAc: C, 47,14; H, 8,11; N, 16,49. Gefunden: C, 47,40; H, 7,98; N, 16,48.
d) 1,4,7-Tri-(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-Gadolinium (III) (1d)
Der Ligand (1c oder AE-DO3A) (1g) wurde in Wasser aufgelöst und der pH auf 5 mit HCl eingestellt. Zur Lösung wurden 1,0 Äquivalente Gd(Acetat)₃ unter Rühren gegeben. Nach mehreren Stunden wurde der pH auf 6 eingestellt und die Lösung wurde auf 45°C für ein paar Stunden erwärmt. Eine aliquote Menge wurde entfernt und auf freies Gd3+ durch den Xylenolorange-Test (negativ) getestet. Der Feststoff wurde nach Entfernen der wässrigen Lösung isoliert. Das rohe Material wurde mit kochendem Ethanol verrieben und heiß filtriert, um Salze zu entfernen. Ausbeute 95%.
e) GdAE-D03A-N-Octadecyl
Der Komplex von (1d) wird in DMF aufgelöst und mit Octadecylbromid (Aldrich, 1,0 Äquivalente) behandelt. Nach Rühren bei Umgebungstemperatur für 24 h wurde das DMF verdampft unter verringertem Druck. Dieser Rückstand wird in Chloroform aufgelöst und mit Wasser gewaschen. Die organischen Extrakte werden getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft, um 1,4,7-Tri-(carboxymethyl)-10-(N-(octadecyl)-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-Gadolinium (III) (1e) zu ergeben.
f) GdAE-D03A-N-Octadecyl-N-PEG5000
Die Verbindung von (1e) wird in Chloroform aufgelöst und mit 1,1 Äquivalenten Triethylamin und 1,0 Äquivalenten von Methoxysuccinal-PEG5000 (Shearwater Corp.) behandelt. Nach Rühren bei Umgebungstemperatur für 24 h wird die Reaktionsmischung mit Wasser gewaschen, getrocknet und durch Rotationsverdampfen konzentriert. Das rohe Produkt wurde aus Ethanol/Isopropanol/Wasser umkristallisiert.
BEISPIEL 3
Auf Aminkern-Dendrimer basierendes Mittel
A) Herstellung eines Dendrimers der Generation 4
Man folgte der selben Prozedur wie in Watson (WO-93/06868), um das Dendrimer der Generation 4.0 zu erzeugen. G₄ (0,56 g) wurde in e.i. H₂O (20 ml) aufgelöst und in einem getrennten Kolben wurde D03A-bz-NCS (2,31 g, 20% Überschuss, hergestellt wie in GB 9407812.8 beschrieben) in H₂O (80 ml) aufgelöst und der pH mit 5 N NaOH auf 8,5 eingestellt. Die letztere Lösung wurde langsam (kleine aliquote Mengen) zu der dendrimeren Lösung unter kräftigem Rühren gegeben. Die Zugabe war innerhalb von 10 min abgeschlossen. Nach Rühren für 4 Tage ließ man die Lösung durch eine Fritte mittlerer Porosität laufen und die flüchtigen Stoffe wurden durch Rotationsverdampfen (Wärme-Einstellung 60) entfernt. 0,48 g des leicht orangefarbenen Feststoffs wurde genommen und unter Verwenden eines Centriprep C-10-Filters filtriert. Es wurde durch GPC gezeigt, dass dies die Verunreinigungen niedrigen Molekulargewichts vom erwünschten Produkt effektiv trennte. Der Rest der rohen Mischung wurde auf diese Weise filtriert und insgesamt wurden 2,1 g des Produktes isoliert. Die Integration des ¹H NMR-Spektrums ergab eine annähernde durchschnittliche Beladung von 30 Chelaten pro Dendrimer (y = 30) für einen 63%-igen Beladungswirkungsgrad. Das Produkt wurde auch durch ¹³C NMR und CZE-Analyse charakterisiert.
B) Gadolinium-Einbau:
Das Produkt des Schrittes A (551 mg) wurde in e.i. H₂O (11 ml) aufgelöst, während Gd(OAc)₃·4H₂O (0,90 g) in 8 ml H₂O aufgelöst wurde. Die Dendrimer-Lösung wurde zu dem Letzteren gegeben, da sich nicht das gesamte Gadoliniumacetat gelöst hatte. Zusätzliches H₂O wurde zugegeben (10 ml) und der pH überprüft (5,0). Nach 24 h bei Umgebungstemperatur wurde die Lösung auf 45°C 3,5 h lang erwärmt, die resultierende Lösung wurde filtriert (2 × 45 min) unter Verwenden von Centriprep C-10-Filter, um das meiste der nicht umgesetzten Gadoliniumsalze zu entfernen. Der pH der resultierenden Lösung wurde auf 9 angehoben, um jegliches nicht umgesetztes Gadolinium als Gd(OH)₃ zu präzipitieren, und durch ein 0,45 μm-Filter filtriert. Ein Xylenolorange-Test war für freies Gadolinium negativ. Die Entfernung von Chloridsalzen wurde durch Ultrafiltration ausgeführt und durch GPC überwacht. Dies führte zur Bildung eines reinen Produkts (ungefähr 300 mg).
C) PEGylierung
Das Produkt von Schritt B, G₄(N[CS]N-bz-DO3A)₃₀ (160 mg, 5,3 × 10^–6 mol) und PEG-NPC (Nitrophenylcarbamat) 5000 (480 mg, 9,6 × 10^–5 mol, Shearwater Chemi cal SPA) werden in getrennten Kolben angeordnet, zu denen entionisiertes Wasser gegeben wird (jeweils 10 ml). Die leicht wolkige PEG-Lösung wird schnell zu G₄(N[CS]N-bz-DO3A)₃₀ gegeben und die resultierende Lösung (pH 7,8) wird bei Umgebungstemperatur 24 h lang gerührt. Die Lösung wird unter Verwenden von Ultrafiltration (Centriprep C-10 und C-30) gereinigt. TLC (MeOH/CHCl₃, 1:1) zeigt, dass die Entfernung von PEG-Spezien effizient ist. Das Produkt wird durch konventionelle spektroskopische Methoden (NMR, IR, UV) und Lichtstreuung (LALLS, PCS) charakterisiert. Alternativ wird das Produkt unter Verwenden von G-50-Sephadex-Chromatographie gereinigt.
BEISPIEL 4
Auf Dendrimer basierendes Mittel
(a) Synthese von P_G2(DO3A)₁₀
P_G2(NH₂)₂₄ (250 mg, 0,05 mmol) (hergestellt wie beschrieben in GB9407812.8 ) wurde in H₂O (15 ml) aufgelöst und der pH notiert (10,1). In einem getrennten Kolben wurde DO3A-bz-NCS (750 mg, 1,18 mmol, 23,6 äq), aufgelöst in H₂O (40 ml), angeordnet. Der pH wurde von 2,1 auf 7,0 mit 1 N NaOH angehoben. Die P_G2-Lösung wurde zu dem Chelat schnell zugegeben und der pH notiert (8,0). Die leicht wolkige gelbe Lösung wurde 6 h lang gerührt, zu diesem Zeitpunkt filtriert (0,2 μm) und die resultierende klargelbe Lösung auf 30 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde in vier C-3-Centriprep-Einheiten angeordnet und ultrafiltriert (3 × 60 min). Die Rückstände wurden kombiniert und abgezogen, um das Titelprodukt als leicht gelben Feststoff (610 mg) zu ergeben. Die Elementaranalyse zeigte das Vorhandensein von etwas nicht reagiertem Chelat an. NMR und ein Fluoreszenzaminassay zeigte an, dass 10 der 24 Stellen modifiziert worden waren.
(b) Synthese von P_G2(GdDO3A)₁₀
P_G2(DO3A)₁₀ (560 mg, 0,333 mmol) und Gd(OAc)₃ (410 mg, 1,22 mmol) wurden in getrennten Kolben angeordnet und jeweils in H₂O aufgelöst (20 bzw. 10 ml). Das Gd wurde zum Dendrimer gegeben und der pH auf 5,5 mit 1 N NaOH eingestellt. Der pH wurde alle 2 h überwacht. Nach Rühren wurde die Lösung konzentriert und das überschüssige Gd wurde über erschöpfende Ultrafiltration (C-3-Einheiten 7 × 40 min) entfernt. Zu diesem Zeitpunkt war ein Xylenolorange-Test negativ. Das Titelprodukt wurde als ein leicht gelber Feststoff (270 mg) isoliert. Niedrigwinkel-Laserlicht-Streuung (LALLS) und Fluoreszenzspektroskopie bestimmten, dass die Chelatbeladung 10 betrug. Das Produkt wurde zum nächsten Schritt, der PEGylierung, mitgenommen.
(c) Synthese von P_G2(GdDO3A)₁₀(PEG₂₀₀₀)₁₄
P_G2(GdDO3A)₁₀ (270 mg, 2,35 × 10^–5 mol) wurde in Boratpuffer pH 8,7, 80 ml aufgelöst. Diese Lösung wurde schnell in einen getrennten Kolben gegeben, der festes PEG₂₀₀₀-NPC (0,89 g, 4,49 × 10^–4 mol, 20 äq.) enthielt. Die Lösung wurde sofort hellgelb (Vorhandensein von p-Nitrophenol). Nach Rühren für 18 h wurde die Lösung konzentriert und man ließ sie eine Sephadex-G-25-Säule herunterlaufen, um Nitrophenol und Salze zu entfernen. Überschüssiges PEG wurde durch Dialyse (Sigma 12 kD-Schlauch) gegen Boratpuffer (pH 9) entfernt. LALLS zeigte das Vorhandensein einer Spezies, die einem MW von 4000 entsprach, zusammen mit dem Produkt bei MW 30kD an.
Die Charakterisierung des Produktes wurde durch eine Anzahl von Verfahren ausgeführt. LALLS zeigte einen MW von 31 kD bei einer Beladung von 10 oder 11 PEG-Molekülen an. Fluoreszenzspektroskopie zeigte eine volle Beladung der endständigen Amingruppen, d.h. 14 PEG-Moleküle angelagert an. Elementaranalyse deutete auch auf eine volle Beladung von PEG hin. Das Produkt, das als ein gelber Feststoff (410 mg) isoliert wurde, wurde als P_G2(GdDO3A)₁₀(PEG₂₀₀₀)₁₄ identifiziert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 13,7 mM^–1s^–1.
BEISPIEL 5
Maßstabvergrößerung von G₃(GdDO3A)₁₀ (PEG₂₀₀₀)₉
(a) Herstellung von G₃(N[CS]N-bz-DO3A)₁₀
Die zuvor entwickelte Prozedur wurde mit den Ausgangsmaterialien G₃ (400 mg, 7,97 × 10^–5 mol) (s. GB9407812.8 ) und DO3A-bz-NCS (1,48 g, 2,3 mmol) eingesetzt. Das Produkt wurde als ein gelber Feststoff (1,44 g) isoliert. ¹H NMR-Integration zeigte, dass die Beladung 10 Chelate von 24 endständigen Aminstellen war.
(b) Herstellung von G₃(N[CS]N-bz-DO3A)₁₀
Herkömmliche synthetische Verfahren wurden mit G₃(N[CS]N-bz-DO3A)₁₀ (1,33 g) und Gd(OAc)₃·3H₂O verwendet. Das Titelprodukt wurde als ein blassgelber Feststoff (760 mg) isoliert. Lichtstreuung und Fluoreszenz zeigte das Vorhandensein von 10 Chelaten an, in Übereinstimmung mit dem vorigen Ergebnis. Der Rest des Materials wurde zum nächsten Schritt übertragen.
(c) Herstellung der Maßstabsvergrößerung von G₃(GdDO3A)₁₀ PEG₂₀₀₀

(i) Die Reaktion wurde anfänglich in einem kleinen Maßstab mit 100 mg G₃(GdDO3A)₁₀ und 220 mg PEG₂₀₀₀-NPC versucht. Das Produkt wurde auf eine ähnliche Weise wie oben beschrieben aufgearbeitet, um das Produkt als einen cremefarbenen Feststoff (140 mg) zu ergeben.
(ii) Die oben für P_G2(GdDO3A)₁₀(PEG₂₀₀₀)₁₄ beschriebene Prozedur wurde hier wieder verwendet mit den Mengen: G₃(GdDO3A)₁₀ (650 mg) und PEG₂₀₀₀-NPC (2,1 g). Das Produkt wurde als ein cremefarbener Feststoff (750 mg) isoliert und charakterisiert unter Verwenden von LALLS, Fluoreszenz, ICP (Gd) und Wasseranalyse. Alle waren in Übereinstimmung mit der zugeordneten Struktur. Eine PEG-Beladung von 13,8 wurde durch einen Fluoreszenzassay von endständigen Aminen identifiziert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 13,7 mM^–1s^–1.

BEISPIEL 6
Synthese von G₃(GdDO3A)₁₀ (PEG₅₀₀₀)x
G₃(GdDO3A)₁₀ (100 mg) und PEG₅₀₀₀-NPC (0,615, ca 15 äq) wurden wie oben beschrieben kombiniert. Das Produkt wurde als ein cremefarbener Feststoff (530 mg) isoliert. Fluoreszenzspektroskopie zeigte an, dass die Reaktion hocheffizient war, wobei PEG die 14 verbleibenden Aminstellen besetzte. TLC zeigte das Vorhandensein von freiem nicht umgesetzten PEG an, während LALLS anzeigte, dass das PEG mit einem Molekulargewicht von 10000 dimerisiert worden war. Eine PEG-Beladung von 11,3 wurde durch einen Assay identifiziert. Relaxivität (Wasser 20 MHz) r₁ = 15,8 mM^–1s^–1.
Beispiel 7
1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-10-methoxycarboaylmethyl-1 4 7 10-tetraazacyclododekan
1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododekanhydrobromid (25,0 g, 42 mmol) wurde in Acetonitril aufgeschlämmt und mit TMG (70 ml) behandelt. Methylbromacetat (6,5 g, 42 mmol) wurde in einer Portion zugegeben und die Mischung wurde 3 h lang unter Rückfluss gekocht. Nach Rühren bei Umgebungstemperatur für zusätzliche 18 h wurden das Lösungsmittel und überschüssiges TMG durch Rotationsverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in CHCl₃ aufgelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Verdampfen des Lösungsmittels lieferte das Titelprodukt als ein blasses Öl (23 g, 95%).
¹H NMR (CDCl₃): 1,4 (s, 27 H), 2,8 (s, 16 H), 3,2 (s, 6 H), 3,4 (s, 2 H), 3,6 (s, 3 H).
Beispiel 8
1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-10-(N-(2-aminoethyl)-amidomethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododekan
Das Methylester des Beispiels 7 (23,0 g, 40 mmol) wurde in Methanol (500 ml) aufgelöst und mit Ethylendiamin (200 ml) behandelt. Die Mischung wurde bei Umgebungstemperatur 3 Tage lang gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Ethylendiamin wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde verdampft, um das Titelprodukt als ein viskoses Öl (18 g, 75%) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl₃): δ 1,4 (s, 27 H), 2,5–3,0 (m, 20 H), 3,3 (m, 8 H), 6,0 (br s, 1 H).
Beispiel 9
1,4,7-Tri-(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethl)amidomethl)-1 4 7 10-tetraazacyclododekan [GdAE-DO3A]
Das Ester des Beispiels 8 (10,0 g, 16 mmol) wurde durch Reaktion mit sauberem TFA (200 ml) bei Umgebungstemperatur für 3 h entschützt. Nach Entfernen des TFA wurde der Rückstand in 1 M NaOH aufgelöst und auf eine Ionenaustauschersäule [AG 1 × 8 (OH-), 200 ml] geladen. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und das Produkt mit 1,5 M HOAc eluiert. Konzentrieren der Fraktionen, die das Titelprodukt enthielten, ergab 7,0 g (93%) als einen weißen Feststoff.
¹H NMR (D₂O): δ 2,9–3,6 (br. mult.) Analyse berechnet für C₁₈H₃₄N₆O₇HOAc: C, 47,14; H, 8,11; N, 16,49. Gefunden: C, 47,40; H, 7,98; N, 16,48.
Beispiel 10
1,4,7-Tri-(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-Gadolinium (III)
Die Verbindung des Beispiels 9 (1,0 g, 2,38 mmol) wurde in Wasser (37 ml) aufgelöst. Der pH wurde auf 5 durch die Zugabe von 1 M NaOH eingestellt. Gadolinium(III)-acetat wurde in kleinen Portionen zugegeben, bis ein leichter Überschuss von Metall (durch Xylenolorange) vorhanden war. Während der Zugabe wurde der pH bei 5 bis 6 gehalten. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Ligand (50 mg) wurde zugegeben und das Rühren wurde fortgesetzt, bis ein negativer Xylenolorange-Test erhalten wurde. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde auf Sephadex G-10 chromatographiert, um anorganische Salze zu entfernen. Die Fraktionen wurden durch MS (FAB): MH⁺ = 602 analysiert.
Beispiel 11
1,4,7-Tri-(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-N-hemisuccinamid
Die Verbindung des Beispiels 9 (6,1 g, 13,6 mmol) in Pyridin (20 ml) wurde erwärmt, bis die Auflösung abgeschlossen war. Bernsteinsäureanhydrid (1,5 g, 15 mmol) wurde zugegeben und die Mischung wurde 1 h lang erwärmt. Die Lösung wurde gekühlt und Aceton wurde zugegeben, um das Produkt auszufällen. Der weiße Feststoff wurde gründlich mit Aceton gewaschen und getrocknet unter Vakuum, um 5,0 g des Titelprodukts (67%) zu liefern.
Beispiel 12
1,4,7-Tri-(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododekan-N-hemisuccinamid-Gadolinium (III)

(A) Die Verbindung des Beispiels 11 (1,9 g, 3 mmol) wurde in Wasser (30 ml) aufgelöst. Der pH wurde mit 1 N NaOH auf 5,0 eingestellt. Gadolinium(III)-Chlorid (–1,4/10ml) in Wasser wurde tropfenweise zugegeben, bis ein leichter Überschuss von Metall mehrere Stunden lang verblieb. Zusätzliches Gadolinium (50 mg) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde gerührt, bis ein negativer Xylenolorange-Test erhalten wurde. Das Wasser wurde verdampft und der Rückstand wurde mehrere Male mit Ethanol behandelt. Das Titelprodukt wurde mit präparativer Umkehrphasen(C₁₈)-HPLC mit 2% Methanol in Wasser als die mobile Phase gereinigt.
(B) Die Titelverbindung wurde auch durch eine alternative Prozedur hergestellt: Die Verbindung des Beispiels 9 (240 mg, 0,4 mmol) in DMSO (10 ml) wurde bei 80°C erwärmt, bis die Auflösung abgeschlossen war. Bernsteinsäureanhydrid (40 mg, 0,4 mmol) wurde zugegeben und die Mischung wurde 6 h lang erwärmt. Nach Kühlen auf Umgebungstemperatur wurde Aceton zugegeben, um das Titelprodukt auszufällen. Das weiße Pulver wurde mit Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet. MS (FAB): MH⁺ 683,2, MNa⁺ 705,1.

Beispiel 13
13-Cholesteryl-3,6,9,12-tetraoxa-dodekan-1-ol
Cholesterintosylat (2,0 g, 3,7 mmol) und Tetraethylenglykol (6,42 ml, 37 mmol) wurden in Dioxan (100 ml) aufgewärmt und bei 70°C 6 h lang erwärmt. Das Lösungsmit tel wurde verdampft und der Rückstand wurde in Toluol aufgelöst und gründlich mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und zu einem Öl konzentriert. Das rohe Material wurde durch Chromatographie auf einer kurzen Säule aus Silika mit einer Gradientenelution von 0–20% Methanol in Chloroform gereinigt, um 1,0 g (49%) des Titelproduktes als ein blasses Öl zu liefern.
Beispiel 14
13-Cholesteryl-3,6,9,12-tetraoxa-dodekan-1-säure
Die Verbindung des Beispiels 13 (0,5 g) in Aceton (20 ml) wurde durch die tropfenweise Zugabe von Jones-Reagens oxidiert, bis ein leichter Überschuss vorhanden war. Die Reaktionsmischung wurde mit Isopropanol behandelt und durch einen Pfropfen aus Silikagel filtriert. Das rohe Titelprodukt war rein, durch TLC und NMR.
Beispiel 15
GdDO3A-Stearylamid
Die Verbindung des Beispiels 9 (100 mg, 1,6 mmol) wurde in DMSO (10 ml) aufgelöst und wurde mit Stearoylchlorid (51 mg, 1,6 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei 60°C 2 h lang erwärmt und über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Wasser wurde zugegeben (50 ml) und das Produkt wurde in Chloroform (3 × 100) extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet und konzentriert, um die Titelverbindung als einen weißen Feststoff zu liefern. MS (FAB) 868,5 MH⁺.
Beispiel 16
GdAE-DO3A-Cholesterylcarbamat
Die Verbindung des Beispiels 9 (300 mg, 0,8 mmol) wurde in DMSO aufgelöst (20 ml) und mit Cholesterinchloroformiat (225 mg, 0,5 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei 80° 5 h lang erwärmt. Man ließ die Mischung bei Umgebungstemperatur stehen, bis farblose Kristalle abgeschieden waren. MS (FAB) MH⁺ 1014,5, MNa⁺ 1036,5.
Beispiel 17
LaDO3A-Succinyl-PE
LaDO3A-Succinamid (130 mg, 0,2 mmol) wurde in DMSO (3 ml) aufgelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (39 mg, 0,2 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von N-Hydroxysuccinimid (22 mg, 0,2 mmol). Die Reaktionsmischung wurde bei Umgebungstemperatur 1 h lang gerührt und PE (130 mg, 0,2 mmol) in Chloroform (20 ml) wurde zugegeben. Nach 6 h wurde die Reaktionsmischung filtriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft, um das Titelprodukt zu ergeben.
TLC (65 CHCl₃/25 MeOH/4 H₂O/1 Ameisensäure) R_f = 0,2. MS (FAB): MH⁺ 1400,7, MNa⁺ 1422,7.
Beispiel 18
GdAE-DO3A-Glutaryl-PE
Ei-PE-Glutaryl (100 mg, 0,11 mmol) in Chloroform (5 ml) wurde mit N-Hydroxysuccinimid (25 mg, 0,21 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (50 mg, 20,25 mmol) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt und filtriert, um den Harnstoff zu entfernen. Die Verbindung des Bei spiels 10 (100 mg, 0,16 mmol) in Methanol (1 ml) und 1 ml Triethylamin wurden zugegeben. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur 6 h lang gerührt und zum Trocknen verdampft. Der Rückstand wurde in Chloroform (10 ml) aufgelöst und in einem Dialysesack angeordnet. Die Reaktionsmischung wurde gegen Natriumacetatpuffer (1 L, 50 mM, ph 5,5, 12 h), Tris-Puffer (1 L, pH 8, 50 mM, 5 h) und entionisiertem Wasser (1 L, 5 h) dialysiert. Eine kleine Menge von Präzipitat, das sich in der Chloroformschicht gebildet hatte, wurde durch die Zugabe von Methanol aufgelöst. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und verdampft, um das Titelprodukt als einen weißen, wachsartigen Feststoff (150 mg, 89%) zu ergeben. TLC (65 CHCl₃/35 Me-OH/4 H₂O/1 Ameisensäure) R_f = 0,2. MS (FAB): MNa⁺ 1459.
Beispiel 19
Eine Mischung von Ei-PC (52 μmol) und Ei-PE-Glutaryl (48 μmol) in Chloroform wurde zu einem dünnen Film unter Vakuum verdampft. Die Lipidmischung wurde in Diethylether (3 ml) aufgelöst und mit 23 ml Puffer (25 mM MES, 100 mM NaCl) behandelt. Eine Emulsion wurde durch Beschallen der Mischung gebildet. Der Ether wurde verdampft, um ein Gel zu bilden. Das Gel ließ man durch Verwirbeln und Verdampfen des restlichen Lösungsmittels zusammenfallen. Ein zusätzlicher ml Puffer wurde zugegeben, und das Verdampfen wurde fortgesetzt, bis alle Spuren von Lösungsmittel entfernt waren. Die Liposomen wurden mit GdAE-DO3A (140 mg) und EDAC (130 mg) über Nacht bei Umgebungstemperatur mit schnellem Rühren behandelt. Nicht umgesetzte Reagenzien wurden entfernt durch Durchlaufenlassen des Produktes durch eine Sephadex-G-75-Säule (1 × 8 in). Die Liposomen wurden dreimal durch zwei 100 mm-Membranen extrudiert. Analyse der Endmischung ergab [Gd] = 1,14 mM, [P] = 5,04 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis waren 47,1 % des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 18 ± 2 (mMsec)^–1.
Beispiel 20
Dieselbe Prozedur, die für die Synthese des Beispiels 19 beschrieben ist, wurde verwendet. Ei-PC (20 μmol) und Dioleoyl-PE-succinyl (17 μmol). Analyse der Endmischung ergab [Gd] = 0,56 mM, [P] = 3,8 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis waren 30% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 18 ± 2 (mMsec)^–1.
Beispiel 21
Dieselbe Prozedur, die für die Synthese des Beispiels 19 beschrieben ist, wurde verwendet. Ei-PC (10 μmol) und Dioleoyl-PE-dodecanoyl (8 μmol) wurden verwendet. Die Liposomen wurden extrudiert (2 × 200 nm, 3 × 50 nm). Analyse der Endmischung ergab [Gd] = 0,66 mM, [P] = 3,49 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis waren 43% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser 20 MHz) r₁ = 17 ± 2 (mMsec)^–1.
Beispiel 22
Dasselbe Verfahren, das zum Herstellen von Beispiel 19 verwendet wurde, wurde für eine Mischung von Ei-PC (56 μmol) und Ei-PE (53 μmol) verwendet. Die Liposomen wurden mit EDAC (100 mg) und GdAE-DO3A-Succinamid (80 mg) über Nacht bei Umgebungstemperatur mit schnellem Rühren behandelt. Nach dem Entfernen des nicht umgesetzten Reagens wurden die Liposomen extrudiert (3 × 200 nm und 3 × 50 nm). Eine Analyse der Endmischung ergab [Gd] = 0,39 mM, [P] = 5,87 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis waren 14% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser 20 MHz) r₁ = 27 ± 2 (mMsec)^–1.
Beispiel 23 (vergleichend)
Liposomen wurden von Ei-PC (13 μmol) und Cholesterinhemisuccinat (16 μmol) durch dasselbe Verfahren, das zum Herstellen des Beispiels 19 verwendet wurde, hergestellt. Die Liposomen wurden mit EDAC (25 mg) und GdAE-DO3A (25 mg) behandelt. Nach dem Entfernen der nicht umgesetzten Reagenzien wurden die Liposomen extrudiert (3 × 200 nm und 3 × 50 nm). Analyse der Endmischung ergab [Gd] = 0,26 mM, [P] = 2,93 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis waren 7,2% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 21 ± 2 (mMsec)^–1.
Beispiel 24 (vergleichend)
Liposomen wurden von Ei-PC (80 μmol) und 6-(Cholesteryl)-7-oxaheptan-1-ol (80 μmol) durch das für die Herstellung des Beispiels 19 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Liposomen wurden mit EDAC (70 mg) und GdAE-DO3A (40 mg) behandelt. Nach dem Entfernen der nicht umgesetzten Mittel wurden die Liposomen extrudiert (3 × 200 nm und 3 × 50 nm). Analyse der Endmischung ergab [Gd] = 0,39 mM, [P] = 3,34 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis waren 11 % des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁= 19 ± 2 (mMsec)^–1.
Beispiel 25 (vergleichend)
Liposomen wurden aus Ei-PC (68 μmol), Ei-PE-Glutaryl (55 μmol) und Hirn-PS (6 μmol) durch das für die Herstellung des Beispiels 19 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Liposomen wurden mit GdAE-DO3A (40 mg) und EDAC (75 mg) behandelt. Nach dem Entfernen der nicht umgesetzten Reagenzien wurden die Liposomen extrudiert (3 × 200 nm und 3 × 100 nm). Die Analyse der Endmischung ergab [Gd] = 0,51 mM, [P] = 4,15 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis waren 29% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser 20 MHz) r₁ = 18 ± 2 (mMsec)^–1.
Beispiel 26 (vergleichend)
Liposomen wurden durch das für die Synthese des Beispiels 19 beschriebene Verfahren aus Cholesterinhemisebacad (130 μmol) und Ei-PC (130 μmol) hergestellt. Die Liposomen werden mit GdAE-DO3A (120 mg) und EDAC (120 mg) behandelt. Nicht umgesetzte Reagenzien werden durch Gelchromatographie entfernt und die Liposomen werden extrudiert.
Beispiel 27
Die Verbindung des Beispiels 16 (71 mg, 6 μmol) wurde zu Dioleoyl-PC (15 mg, 20 μmol) in Chloroform gegeben. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Ether (1 ml) aufgelöst. Wasser (1 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde beschallt, bis eine Emulsion gebildet war. Der Ether wurde langsam unter Vakuum verdampft. Ein dickes Gel bildete sich. Zusätzliches Wasser (1 ml) wurde zugegeben und das Gel wurde verwirbelt, bis das Gel zusammenfiel, um Vesikel zu bilden. Das Produkt wurde extrudiert (3 × 200 nm, 3 × 50 nm).
Beispiel 28
Die Verbindung des Beispiels 18 (25 mg, 17,4 μmol) und Ei-PC (13,7, 18 μmol) wurden in Chloroform (3 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde zum Trocknen unter Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Ether (3 ml) aufgelöst und filtriert. MES-Puffer (3 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde beschallt, bis sich eine Emulsion bildete. Der Ether wurde durch Verdampfen unter Vakuum unter gelegentlichem Verwirbeln entfernt.
Beispiel 29
Die Verbindung des Beispiels 15 (50 μmol) und hydriertes Ei-PC (150 μmol) werden in einer Mischung von Chloroform (10 ml) und Methanol (2 ml) aufgelöst. Das Lö sungsmittel wird bei 75° verdampft. Der restliche dünne Film wird in MES-Puffer bei 75° durch Schütteln hydratisiert. Nach viermaligem Ausfrieren werden die Liposomen bei 75° extrudiert (3 × 100 nm).
Beispiel 30
Pharmakokinetik
Ein Katheter wurde in die Jugular-Vene einer Ratte Tage vor der Studie eingesetzt. Eine 300 μl-Probe Blut wurde gezogen und in einem tarierten Röhrchen angeordnet, das vor der Injektion der Probe Heparin enthielt. Die Testverbindung wurde zum Zeitpunkt 0 injiziert. Blutproben (300 μl) wurden bei Intervallen über eine 24-stündige Zeitdauer genommen. Nach 7 Tagen wurde das Tier getötet und die Leber, Milz und die Nieren wurden entfernt. Blut- und Organproben wurden mit Salpetersäure und Wasserstoffperoxid verdaut und auf die Gadolinium-Konzentration (μg/g) durch ICP analysiert.
Beispiel 31 (vergleichend)
Biodistribution
(2-Aminoethyl)-DO3A wurde mit ¹⁵³Gd markiert. Das Chelat wurde an 1:1 Ei-PC/Ei-Glutaryl-Liposomen (100 nm) wie in Beispiel 13 gekoppelt. Die radiomarkierten Liposomen wurden in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert. Drei Mäuse wurden für jeden Zeitpunkt verwendet. Proben von Blut, Leber, Milz, Niere und Haut wurden nach 1 Tag, 3 Tagen und 7 Tagen gezählt. Die injizierte Dosis, die in jedem Organ zurückgehalten wurde, wurde berechnet und ist unten präsentiert. Die Halbwertszeit der Eliminierung für die Leber betrug 3,2 Tage.

Claims

Bioabbaubares Blood Pool-Kontrastmittel mit einem Gesamtmolekulargewicht von mindestens 10 KD, umfassend eine nicht-liposomale Makrostruktur, an die eine Mehrzahl von Opsonisierungs-inhibierenden Einheiten gebunden ist und die chelatierte ionische paramagnetische oder Schwermetall-Einheiten trägt.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, bei dem die chelatierten ionischen paramagnetischen oder Schwermetall-Einheiten über eine Zwischengruppe gebunden sind, wobei die Zwischengruppe ein Opsonisierungs-Inhibitor ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Makrostruktur ein Makromolekül ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 3, bei dem das Makromolekül ein dendrimeres Polychelat mit daran gebundenen Opsonisierungs-inhibierenden Einheiten ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 4, bei dem das Makromolekül ein Dendrimer umfasst, das Chelatbildner- und Opsonisierungs-Inhibitor-Anlagerungsorte besitzt, von denen 2 bis 50% mit Opsonisierungs-inhibierenden Einheiten beladen sind.
Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Opsonisierungs-inhibierende Einheit eine amphiphile Polymereinheit ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 6, bei dem die Opsonisierungs-inhibierende Einheit die Formel I besitzt -A-(R₁R₂)_n-B (I)wobei A eine Bindung oder eine funktionelle Gruppe ist, die eine Anlagerung an die Makrostruktur gekoppelt an (R₁R₂)_n durch eine Bindung oder eine Linkereinheit ermöglicht, eine Gruppe von R₁ und R₂ eine lipophile Einheit ist und die andere Gruppe von R₁ und R₂ eine hydrophile Einheit ist, n eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 200 ist und B eine endständige Gruppe ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 7, bei dem die Wiederholungseinheit R₁R₂ eine Alkylenoxy-, Alkylenthio- oder Alkyleniminogruppe ist.
Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Opsonisierungs-inhibierende Einheit eine Polyethylenglycoleinheit ist.
Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Opsonisierungs-inhibierende Einheit eine Glycosaminoglycan-Einheit ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 10, bei der die Opsonisierungs-inhibierende Einheit eine Chondroitin-Einheit ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, bei der die Makrostruktur ein Molekülaggregat ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 12, deren Opsonisierungs-inhibierende Einheit 15 bis 85% des Gesamtgewichtes umfasst.
Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 12 und 13, dessen individuelle Komponenten des Molekülaggregats Molekulargewichte von weniger als 15 KD besitzen.
Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 12 bis 14, das ein Aggregat von Molekülen der Formel II ist C-D-E (II)wobei C eine hydrophile Metallchelat-enthaltende Einheit ist, D eine Opsonisierungs-inhibierende Einheit ist und E eine hydrophobe Einheit ist.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend ein Kontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zusammen mit mindestens einem physiologisch tolerierbaren Trägermittel oder Hilfsstoff.
Verfahren zur Herstellung eines Kontrastmittels nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst (i) Metallieren einer Makrostruktur, an die eine Mehrzahl von Opsonisierungs-inhibierenden Einheiten und chelatbildende Gruppen gebunden sind; oder (ii) Binden einer Mehrzahl von Opsonisierungs-inhibierenden Einheiten an eine Makrostruktur, die chelatierte ionische paramagnetische oder Schwermetall-Einheiten trägt; oder (iii) Erzeugen einer Makrostruktur aus einer Mehrzahl von molekularen Komponenten, wobei die Mehrzahl von Komponenten Opsonisierungs-inhibierende Einheiten und chelatierte ionische paramagnetische oder Schwermetall-Einheiten umfasst.
Verwendung eines Kontrastmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung einer diagnostischen Bildgebungszusammensetzung.