JP2008503217A - 新規抗原結合ポリペプチド及びそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国仮出願第60/581,334号、2004年6月18日出願、米国仮出願第60/648,222号、2005年1月28日及び米国仮出願第60/654,018号、2005年2月17日出願(それらの全体を本明細書中に参照により組み込む。)に対する優先権を主張する。
本発明は、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチド(ABP)を提供する。ある実施形態において、ABPは、完全な抗体重鎖を含有する。ある実施形態において、ABPは、完全な抗体軽鎖を含有する。ある実施形態において、ABPは、抗体軽鎖の可変領域を含有する。ある実施形態において、ABPは、抗体重鎖の可変領域を含有する。ある実施形態において、ABPは、抗体軽鎖の少なくとも1つのCDRを含有する。ある実施形態において、ABPは、抗体重鎖の少なくとも1つのCDRを含有する。ある実施形態において、ABPは、軽鎖の少なくとも1つのCDR及び重鎖の少なくとも1つのCDRを含有する。ある実施形態において、ABPは、Fabを含有する。ある実施形態において、ABPは、2以上のFab’sを含有する。ある実施形態において、ABPは、scFvを含有する。ある実施形態において、ABPは、2以上のscFvを含有する。ある実施形態において、ABPは、ミニボディを含有する。ある実施形態において、ABPは、2以上のミニボディを含有する。ある実施形態において、ABPは、ダイアボディを含有する。ある実施形態において、ABPは、2以上のダイアボディを含有する。ある実施形態において、ABPは、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する。ある実施形態において、ABPは、完全な軽鎖及び完全な重鎖を含有する。ある実施形態において、ABPは、一つ以上のFcドメイン又はその一部を含有する。ある実施形態において、ABPは、上記実施形態の何れかの組合せを含有する。ある実施形態において、ABPは、上記実施形態の何れかの、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を含有する。ある実施形態において、ABPは、結合パートナーに結合するポリペプチド(この結合パートナーは、抗原、ポリペプチド、核酸分子、ポリマー又はその他の分子もしくは物質を含有する。)を含有する。ある実施形態において、ABPは、非抗体骨格分子又は物質と会合させられる。
nは、0から10であり;R1は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり;R2は、H、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールであり;R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、R4は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。)。
nは、0から10であり;R1は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、又は存在せず;Xは、O、N、Sであるか、又は存在せず;mは0から10であり;R2は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。)。
本発明は、本明細書中に記載の、特定の方法、プロトコール、細胞株、コンストラクト及び試薬等に限定されず、そのようなものとして、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語が、特定の実施形態をただ説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton、Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman & Co.;第2版(1993、12月)を参照のこと。
I.導入
本発明において、少なくとも1個の非天然アミノ酸を含有するABP分子を提供する。本発明のある一定の実施形態において、少なくとも1個の非天然アミノ酸を有するABPは、少なくとも1つの翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、少なくとも1つの翻訳後修飾は、当業者にとって特定の反応基に適切であることが知られている化学の方法を利用した、以下に限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、DNA、RNA及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ(photocaged)部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記又は、第一の反応基を含有する少なくとも1個の非天然アミノ酸に対する第二の反応基を含有するその他の何らかの所望の化合物もしくは物質のあらゆる組合せを含む、分子の連結を含む。例えば、第一の反応基はアルキニル部分(以下に限定されないが、非天然アミノ酸、p−プロパルギルオキシフェニルアラニン(プロパルギル基はまた、アセチレン部分と呼ばれる場合がある。)において、などを含む。)であり、第二の反応基はアジド部分であり、[3+2]付加環化の化学の方法を利用する。別の例において、第一の反応基はアジド部分であり(以下に限定されないが、非天然アミノ酸p−アジド−L−フェニルアラニンにおいて、などを含む。)、第二の反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾されたABPポリペプチドのある一定の実施形態において、少なくとも1つの翻訳後修飾が糖部分を含む場合、少なくとも1つの翻訳後修飾を含む、少なくとも1個の非天然アミノ酸(以下に限定されないが、ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含む。)を使用する。ある一定の実施形態において、真核細胞中又は非真核細胞中で、インビボで翻訳後修飾を行う。
多岐にわたるABP’sがある。ABPは、それ自身、多岐にわたる抗原に特異的である。抗原特異的な、多岐にわたる多数のABP断片もある。したがって、ABPは、標的分子又は抗原に特異的に結合する能力を示すあらゆるポリペプチドを含むものとする。いずれの公知の抗体又は抗体断片もABPである。
本発明の多くの実施形態において、関心のあるABPをコードする核酸を単離し、クローニングし、多くの場合は、組み換え法を用いて変更を施す。以下に限定されないが、タンパク質発現に対して、又は変異型、誘導体、発現カセットもしくは抗原結合ポリペプチド由来のその他の配列の生成中に、このような実施形態を使用する。ある実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を異種プロモーターに操作可能に連結させる。
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを広げる。例えば、セレクターコドンには、以下に限定されないが、ユニークな3個の塩基コドン、非センスコドン、例えば、停止コドン(以下に限定されないが、アンバーコドン(UAG)又はオパールコドン(UGA)などを含む。)、非天然コドン、4以上の塩基コドン、レアコドンなどが含まれる。当業者にとって当然のことながら、少なくともABPの一部をコードする1つのポリヌクレオチド中に、以下に限定されないが、一つ以上、2以上、3を超える、4、5、6、7、8、9、10以上、所望する遺伝子に導入することができる、様々な数のセレクターコドンが存在する。
非常に多岐にわたる非天然コードアミノ酸が本発明における使用に適切である。あらゆる数の非天然コードアミノ酸をABPに導入することができる。一般に、導入された非天然コードアミノ酸は、20種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸(即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン)に対して実質的に化学的に不活性である。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、効率的かつ選択的に20種類の一般的なアミノ酸では見られない官能基(以下に限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒド及びアミノオキシ基)と反応し、安定な共役物を形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する非天然コードアミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドは、ポリマー(以下に限定されないが、ポリ(エチレングリコール)又はアルキン部分を含有する第二のポリペプチドを含む。)と反応し、アジド及びアルキン官能基の選択的反応を引き起こす安定な共役物を形成し、Huisgen[3+2]付加環化生成物を形成することができる。
本発明での使用に適切な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Sigma(USA)又はAldrich(Milwaukee,WI,USA)から市販されている。市販されていないものは、本明細書中で与えるようにして、又は様々な刊行物で与えるようにして、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、場合によっては合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Fessendon及びFessendonによるOrganic Chemistry(1982、第二版、Willard Grant Press,Boston Mass.);MarchによるAdvanced Organic Chemistry(第三版、1985、Wiley and Sons,New York);及びCarey及びSunbergによるAdvanced Organic Chemistry(第三版、パートA及びB、1990、Plenum Press,New York)を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について述べているさらなる刊行物としては、例えばWO2002/085923(題名「In vivo incorporation of unnatural amino acids」;Matsuokaら、(1995)J.Med.Chem.,38,4660−4669;King,F.E.及びKidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and of γ−Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates.J.Chem.Soc.,3315−3319;Friedman,O.M.及びChatterrji,R.(1959)Syntehsis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti−Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750−3752;Craig,J.C.ら、(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7−Chloro−4[[4−(diethylamino)−1−methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53、1167−1170;Azoulay,M.,Vilmont,M.及びFrappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201−5;Koskinen,A.M.P.及びRapoport,H.(1989)Synthesis of 4−Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino acids Analogues.J.Org.Chem.54、1859−1866;Christie,B.D.及びRapoport,H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L−Asparagine.Application to the Total Synthesis of (+)−Apovincamine through Amino Acids Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org.Chem.1989:1859−1866;Bartonら、(1987)Synthesis of Novel a−Amino−Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L−and D−a−Amino−Adipic Acids,L−a−aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated derivatives.Tetrahedron Lett.43:4297−4308;及びSubasingheら、(1992)Quisqualic acid analogues:syntehsis of beta−heterocyclic 2−aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate−sensitized site.J.Med.Chem.35:4602−7が挙げられる。また、特許出願、題名「Protein Arrays」2003年12月22日提出、第10/744,899号及び2002年12月22日出願の第60/435,821号も参照のこと。
カルボニル反応基を有するアミノ酸により、特に求核付加又はアルドール縮合を介して分子(以下に限定されないが、PEG又はその他の水溶性分子など。)を連結する様々な反応が可能となる。
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジドなどの求核基を含有する非天然コードアミノ酸により、(以下に限定されないが、PEG又はその他の水溶性ポリマーを用いたものなど)共役物を形成させるための様々な求電子基による反応が可能となる。
アミノオキシ(ヒドロキシルアミンとも呼ばれる。)基を含有する非天然コードアミノ酸により、(以下に限定されないが、PEGはその他の水溶性ポリマーなどとの)共役物を形成するための、様々な求電子基との反応が可能となる。ヒドラジン、ヒドラジド及びセミカルバジドのように、アミノオキシ基の求核性が高まることにより、アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応できるようになる。例えば、Shao,J.及びTam,,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3839−3899(1995);H.Hang及びC.Bertozzi.Ace.Chem.Res.34:727−736(2001)を参照のこと。しかし、ヒドラジン基との反応により生じるものが対応するヒドラゾンである一方、オキシムは、通常、ケトンなどのカルボニル含有基とアミノオキシ基との反応に由来するものである。
アジド及びアルキン官能基のユニークな反応性により、ポリペプチド及び他の生物分子の選択的修飾にこれらの官能基が非常に有用となる。有機アジド、特にアルファティック(alphatic)アジド及びアルキンは、通常、通常の反応化学状態に対して安定である。特に、アジド及びアルキン官能基の両者とも、天然に生じるポリペプチドで見られる20種類の一般的アミノ酸の側鎖(即ちR基)に対して不活性である。しかし、近接近させた場合、アジド及びアルキン基の「バネ仕掛け」のような性質が現れ、それらは、Huisgen[3+2]付加環化反応を介して選択的かつ効率的に反応し、対応するトリアゾールを生成させる。例えば、Chin,J.ら、Science 301:964−7(2003);Wang,Q.ら、J.Am.Chem.Soc.125、3192−3193(2003);Chin,J.W.ら、J.Am.Chem.Soc.124:9026−9027(2002)を参照のこと。
β−置換アミノチオール官能基のユニークな反応性により、チアゾリジンの形成を介した、ポリペプチド及びアルデヒド基を含有する他の生物分子の選択的修飾に、これらの官能基が非常に有用となる。例えば、J.Shao及びJ.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3839−3899を参照のこと。ある実施形態において、β−置換アミノチオールアミノ酸をABPポリペプチドに取り込み、次いで、アルデヒド官能基を含有する水溶性ポリマーと反応させることができる。ある実施形態において、チアゾリジンの形成を介して、水溶性ポリマー、薬物共役物又はその他のペイロードをβ−置換アミノチオールアミノ酸を含有するABPポリペプチドにカップリングさせることができる。
真核細胞による非天然アミノ酸取り込みは、以下に限定されないが、タンパク質への取り込みなど、非天然アミノ酸を設計し選択する際に通常考慮される1つの問題である。例えば、α−アミノ酸の電荷密度が高いことから、これらの化合物が細胞透過性であろうことが示唆される。天然アミノ酸は、タンパク質を利用した輸送系の回収を介して真核細胞に取り込まれる。もしあれば、どの非天然アミノ酸が細胞により取り込まれるかを評価するスクリーニングを迅速に行うことができる。例えば、題名「Protein arrays」(2003年12月22日提出)、第10/744,899号及び第60/435,821号(2002年12月22日提出)における毒性アッセイ;及びLiu,D.R.及びSchultz,P.G.(1999)Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States 96:4780−4785を参照のこと。様々なアッセイで取り込みを容易に分析できるが、細胞への取り込み経路に反応しやすい非天然アミノ酸の設計に対する代替手段は、インビボでアミノ酸を生成させるために生合成経路を与えることである。
アミノ酸及び他の化合物の産生に対して、多くの生合成経路が細胞において既に存在する。特定の非天然アミノ酸に対する生合成法が天然には(以下に限定されないが、真核細胞においてなど。)存在し得ないが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、新しい酵素を添加するか、又は既存の宿主経路を改変することにより、場合によっては非天然アミノ酸に対する生合成経路を宿主細胞において生じさせる。さらなる新しい酵素は、場合によっては天然酵素又は人工的に生じさせた酵素である。例えば、p−アミノフェニルアラニンの生合成(WO2002/085923、題名「In vivo incorporation of unnatural amino acids」における実施例で与えられるように。)は、他の生物からの既知の酵素の組合せの添加に依存する。これらの酵素の遺伝子を含有するプラスミドを用いて細胞の形質転換を行い、これらの酵素の遺伝子を真核細胞に導入することができる。細胞中で発現させる場合、遺伝子は、所望する化合物を合成するための酵素的経路を与える。場合によっては添加されるこのタイプの酵素の例は、下記の実施例で与える。例えばGenbankにおいて、さらなる酵素の配列が記載されている。人工的に生じさせた酵素もまた、場合によっては同様に細胞へ添加する。このようにして、細胞の機構及び細胞のリソースを操作して非天然アミノ酸を産生させる。
以下に限定されないが、タンパク質構造及び/又は機能におけるテーラリング変更、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近可能性の変更、部分(以下に限定されないが、タンパク質アレイに対してなど。)への標的化、生物活性分子の付加、ポリマーの結合、放射性核種の結合、血清半減期の調節、組織浸透性の調節(例えば腫瘍)、能動輸送の調節、組織、細胞又は器官特異性の調節、免疫原性の調節、プロテアーゼ抵抗性の調節など、様々な目的で非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、触媒又は生物物理学的特性が向上しているか、又は完全に新しい触媒又は生物物理学的特性を有し得る。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性を場合によっては変更する:毒性、生体内分布、構造特性、分光学的特性、化学及び/又は光化学的特性、触媒能、半減期(以下に限定されないが、血清半減期など。)、他の分子との反応能(以下に限定されないが、共有又は非共有的な反応など。)など。少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、以下に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質(以下に限定されないが、抗体など。)及び、以下に限定されないが、タンパク質構造及び機能の研究などに有用である。例えば、Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function,Current Opinion in Chemical Biology,4:645−652を参照のこと。
修飾tRNA及びtRNAシンテターゼを用いて本発明の抗原結合ポリペプチドをインビボで生成させ、天然の系でコードされていないアミノ酸を付加又はこのようなアミノ酸で置換することができる。
本発明は、一つ以上の非天然アミノ酸のABPへの取り込みをもくろむ。ポリペプチドの活性を妨害しない特定の位置において一つ以上の非天然アミノ酸を取り込み得る。「保存的」置換(以下に限定されないが、疎水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、大きなアミノ酸の大きなアミノ酸による置換、親水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換など。)を行うことにより、及び/又は活性に必要のない位置に非天然アミノ酸を位置に挿入することにより、これを遂行することができる。
クローニングしたABPポリヌクレオチドを高レベルで発現させるために、通常、転写、転写/翻訳ターミネーターを支配するための強力なプロモーターを含有し、タンパク質をコードする核酸に対する場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターに本発明の抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら、及びAusbellらにより記載されている。
例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び細菌を含む多くの適切な発現系においてABPを発現させ得る。代表的な発現系の説明を下記で行う。
本明細書中で使用する場合、「酵母」という用語は、ABPをコードする遺伝子を発現することができるあらゆる様々な酵母を含む。このような酵母としては、以下に限定されないが、有子嚢酵母(Endomycetales、エンドミケス)、担子胞子酵母及び、不完全菌類(分芽菌)に属する酵母が挙げられる。有子嚢酵母は、Spermophthoraceae(スペルモフトラセア)及びSaccharomycetaceae(サッカロミケス)の2種類の科に分けられる。後者は、4種類の亜科、Schizosaccharomycoidae(シゾサッカロミコイデ)(例えばシゾサッカロミセス属)、Nadsonioideae(ナドソニオイデ)、Lipomycoideae(リポミコイデ)及びSaccharomycoideae(サッカロミコイデ)(例えば、ピチア属、クリベロミセス属及びサッカロミセス属)からなる。担子胞子酵母は、Leucosporidium(ロイコスポリジウム)、Rhodosporidium(ロドスポリジウム)、Sporidiobolus(スポリジオボルス)、Filobasidium(フィロバシディウム)及びFilobasidiella(フィロバシディエラ)属を含む。不完全菌類(分芽菌)に属する酵母は、Sporobolomycetaceae(スポロボロミセタセア)(例えば、スポロボロミセス属及びブレラ属)及びCryptococcaceae(クリプトコッカセア)(例えばカンジダ属)の2種類の科に分けられる。
「昆虫宿主」又は「昆虫宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーDNAに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた昆虫を指す。この用語は、トランスフェクトされたオリジナルの昆虫宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な突然変異のために、1個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態又はゲノムDNAもしくはトータルDNA相補体が必ずしも完全に同一である必要はないことを理解されたい。ABPをコードするヌクレオチド配列の存在など、適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
細菌発現技術は、当技術分野で周知である。細菌宿主での使用に対して多岐にわたるベクターが利用可能である。ベクターは、シングルコピー又は低もしくは高多コピーベクターであり得る。ベクターは、クローニング及び/又は発現に役立ち得る。ベクターに関する豊富な文献、多くのベクターが市販されていること、及びベクターならびにそれらの制限地図及び特性を記載するマニュアルを考慮すると、本明細書中で幅広い考察を行う必要はない。周知のとおり、ベクターは通常、選択を可能にするマーカーを含み、このマーカーは、細胞毒性物質耐性、原栄養性又は免疫性を規定し得る。しばしば、複数のマーカーが存在し、これらが様々な特性を規定する。
ABPを含有する細胞溶解液に対して、又は何らかの単離段階(以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)、逆相HPLC(「RP−HPLC」)、膨張層吸着又はそれらの何らかの組合せ及び/又は繰り返し(あらゆる適切な順番で)など。)の結果生じるあらゆるABP混合物に対して、様々な単離段階のうち何れかを行い得る。
ある実施形態において、及び任意のさらなる段階として、第一のABP混合液に対してイオン交換クロマトグラフィーを行い得る。全般的に、Ion Exchange Chromatography:Principles and Methods(Cat.No.18−1114−21、Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を参照のこと。市販されているイオン交換カラムとしては、HITRAP(R)、HIPREP(R)及びHILOAD(R)カラム(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)が挙げられる。このようなカラムは、Q SEPHAROSE(R)Fast Flow、Q SEPHAROSE(R)High Performance及びQ SEPHAROSE(R)XLなどの強力な陰イオン交換体;SP SEPHAROSE(R)High Performance、SP SEPHAROSE(R)Fast Flow及びSP SEPHAROSE(R)XLなどの強力な陽イオン交換体;DEAE SEPHAROSE(R)Fast Flowなどの弱い陰イオン交換体;及びCM SEPHAROSE(R)Fast Flowなどの弱い陽イオン交換体(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を利用する。精製段階の何れかの段階でABPに対して陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、実質的に純粋なABPを単離し得る。何らかの適切な陽イオン交換マトリクスを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー段階を行い得る。有用な陽イオン交換マトリクスとしては、以下に限定されないが、繊維状、多孔性、非多孔性、微小顆粒、ビーズ状又は架橋陽イオン交換マトリクス材料が挙げられる。このような陽イオン交換マトリクス材料としては、以下に限定されないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル又は前出のものの何れかの混合物が挙げられる。
当業者にとって公知の適切なプロトコールに従い、RP−HPLCを行って、タンパク質を精製し得る。例えば、Pearsonら、Anal Biochem.(1982)124:217−230(1982);Rivierら、J.Chrom.(1983)268:112−119;Kunitaniら、J.Chrom.(1986)359:391−402を参照のこと。ABPに対してRP−HPLCを行って、実質的に精製されたABPを単離し得る。この場合、以下に限定されないが、少なくとも約C3から少なくとも約C30、少なくとも約C3から少なくとも約C20又は少なくとも約C3から少なくとも約C18など、様々な長さのアルキル官能基によるシリカ誘導体化樹脂を使用し得る。あるいは、ポリマー性樹脂を使用し得る。例えば、TosoHaas Amberchrome CG1000sd樹脂を使用し得る(これは、スチレンポリマー樹脂である。)。様々なアルキル鎖長を有するシアノ又はポリマー性樹脂も使用し得る。さらに、エタノールなどの溶媒を用いて、RP−HPLCカラムを洗浄し得る。SourceRPカラムは、RP−HPLCカラムの別の例である。
ABPに対して疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を行い得る。全般的に、Hydrophobic Interaction Chromatography Handbook:Principles and Methods(Cat.No.18−1020−90、Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))を参照のこと(本明細書中に参照により組み込む。)。適切なHICマトリクスとしては、以下に限定されないが、アガロース、架橋アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ(メタクリレート)マトリクス及び混合形態の樹脂(以下に限定されないが、ポリエチレンアミン樹脂又はブチルもしくはフェニル置換ポリ(メタクリレート)マトリクスなど。)を含む、アルキル又はアリール置換マトリクス、例えばブチル、ヘキシル、オクチル又はフェニル置換マトリクスなどがある。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのための市販ソースとしては、以下に限定されないが、HITRAP(R)、HIPREP(R)及びHILOAD(R)カラム(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)が挙げられる。
例えば、ゲルろ過(Gel Filtration:Principles and Methods(Cat.No.18−1022−18、Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)(本明細書中に参照により組み込む。)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー(以下に限定されないが、HA−Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT Ceramic Hydroxyapatite(BioRad)、Bio−Gel HTPヒドロキシアパタイト(BioRad)などの、適切なマトリクス)、HPLC、膨張層吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥などを用いて、第一のABP混合物又は何らかのその後のそれらの混合物に対してさらに別の単離段階を行い、あらゆる過剰な塩を除去し、緩衝液を次の単離段階もしくは最終製剤の処方にも適した緩衝液で置換することができる。
非組み換え宿主細胞、突然変異誘発宿主細胞又は細胞を使用しない系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、いくつかのストラテジーが利用されてきた。これらの系はまた、本発明の抗原結合ポリペプチドの作製での使用にも適切である。Lys、Cys及びTyrなどの反応性側鎖によるアミノ酸の誘導体化により、リジンがN2−アセチル−リジンに変換される。化学合成によっても、非天然アミノ酸を取り込む直接的な方法が得られる。ペプチド断片の、酵素的ライゲーション及びネイティブ化学ライゲーションの最近の開発により、より大きなタンパク質を調製することが可能である。例えば、P.E.Dawson及びS.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem.,69:923(2000)。100を超える非天然アミノ酸を実際にあらゆるサイズの様々なタンパク質へ部位特異的に取り込むために、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されたサプレッサーtRNAを、タンパク質生合成に対応可能なインビトロ抽出物に添加するという一般的なインビトロ生合成法が使用されてきた。例えば、V.W.Cornish,D.Mendel及びP.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995、34:621(1995);C.J.Noren,SJ.Anthony−Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,A general method for site−specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science 244:182−188(1989);及びJ.D.Bain、CG.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala、Biosynthetic site−specific incorporation of a non−natural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111:8013−8014(1989)を参照のこと。タンパク質安定性、タンパク質フォールディング、酵素機構及びシグナル伝達の研究のために、様々な官能基がタンパク質に導入されてきた。
本明細書に記載の組成物、方法、技術及びストラテジーを用いて、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾を為すことができる。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の取り込み(以下に限定されないが、標識;色素;ポリマー;水溶性ポリマー;ポリエチレングリコールの誘導体;光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、DNA、RNA及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ(photocaged)部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記もしくはその他の何らかの所望の化合物の組合せなど。)が含まれる。本明細書に記載の、組成物、方法、技術及びストラテジーの説明目的の非限定例として、本明細書に記載の組成物、方法、技術及びストラテジーがまた、他の官能基(以下に限定されないが上記で挙げたものなど。)を添加するのに適用可能(必要に応じて適切な改変を行い、当業者が本明細書中での開示を思いつき得る。)であるという了解のもと、以下の記述は、非天然アミノ酸ポリペプチドに巨大分子ポリマーを添加することに焦点を当てる。
XO−(CH2CH2O)n−CH2CH2−Y
により表すことができる(式中、nは、2から10,000であり、XはH又は、以下に限定されないがC1−4アルキルなどの末端修飾である。)。
−PEG−CO2−PEG−+H2O→PEG−CO2H+HO−PEG−
ポリ(エチレングリコール)又はPEGという用語が、以下に限定されないが、本明細書中で開示するものなど、当技術分野で公知の形態全てを表すか又は含むことは、当業者により理解される。
X−A−ポリ−B−N=N=N
(式中、N=N=Nはアジド部分であり、Bは連結部分(存在してもよく存在しなくてもよい。)であり、ポリは、水溶性の非抗原性ポリマーであり、Aは、連結部分(存在してもよく存在しなくてもよく、Bと同じか異なっていてもよい。)であり、Xは第二の官能基である。)を有する。A及びBに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、18個以下、より好ましくは1個から10個の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられる。窒素、酸素又はイオウなどのヘテロ原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分枝され得る。A及びBに対する連結部分のその他の例としては、以下に限定されないが、10個以下、より好ましくは5個から6個の炭素原子を含有する多官能性のアリール基が挙げられる。このアリール基は、もう1つの炭素原子、窒素、酸素又はイオウ原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第5,932,462号;同第5,643,575号;及び米国特許公開2003/0143596(それぞれを本明細書中に参照により組み込む。)に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全ての連結部分が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
X−CH2CH2O−−(CH2CH2O)n−−CH2CH2−N=N=N
(式中、Xは、上述のような官能基であり、nは約20から約4000である。)を有するポリマー骨格を含有する。別の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造:
X−CH2CH2O−−(CH2CH2O)n−−CH2CH2−−O−(CH2)m−W−N=N=N(式中、Wは、1個から10個の炭素原子を含有する、脂肪族又は芳香族リンカー部分であり;nは約20から約4000であり;Xは上述のような官能基であり、mはmは1から10である。)を有するポリマー骨格を含有する。
示されるように、本発明での使用に適切なポリマー骨格は、式:X−PEG−L(式中、PEGはポリ(エチレングリコール)であり、Xは、アジド基と反応しない官能基であり、Lは適切な脱離基である。)を有する。適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン及びビニルピリジンならびにケトンが挙げられる。適切な脱離基の例としては、以下に限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート及びトシレートが挙げられる。
X−PEG−M+N−リンカー−N=N=N→PG−X−PEG−リンカー−N=N=N(式中、PEGはポリ(エチレングリコール)であり、Xは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり;Mは、アジド官能基と反応性がないが、N官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。)。
BocHN−PEG−NH2+HO2C−(CH2)3−N=N=N
X−A−ポリ−B−C≡C−R(式中、Rは、H又はアルキル、アルケン、アルキオキシ又はアリールもしくは置換アリール基の何れかであり得;Bは連結部分(存在してもよく存在しなくてもよい。)であり;ポリは、水溶性非抗原性ポリマーであり;Aは連結部分(存在してもよく存在しなくてもよく、Bと同じか異なっていてもよい。)であり、Xは第二の官能基である。)を有する。
X−CH2CH2O−−(CH2CH2O)n−−CH2CH2−O−(CH2)m−C≡CH(式中、Xは、上述のような官能基であり、nは約20から約4000であり、mは1から10である。)を有するポリマー骨格を含有する。ヘテロ二官能性PEGポリマーのそれぞれの具体例を下記に示す。
示されるように、本反応での使用に適切なポリマー骨格は、式:X−PEG−Nu(式中、PEGはポリ(エチレングリコール)であり、Nuは求核部分であり、Xは、Nu、L又はアセチレン官能基と反応しない官能基である。)を有する。
X−PEG−L+−C≡CR’→X−PEG−C≡CR’(式中、PEGはポリ(エチレングリコール)であり、Xは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり;R’は、H又は、アルキル、アルコキシ、アリール又はアリールオキシ基もしくは置換アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基の何れかである。)。
本発明のある実施形態において、カルボニル含有非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドをPEG骨格と直接連結される、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有するPEG誘導体で修飾する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−O−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000である(即ち、平均分子量は5から40kDaの間である。)。)を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−X−NH−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000であり、Xは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基(C=O)である。)を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−NH−C(O)−NH−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000である。)を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−NH−C(O)(CH2)m−O−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000である(即ち、平均分子量は5から40kDaの間である。)。)を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−NH−C(O)(CH2)m−X−NH−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000であり、Xは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基(C=O)である。)を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−NH−C(O)(CH2)m−NH−C(O)−NH−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000である。)を有する。
[RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−NH−C(O)]2CH(CH2)m−X−NH−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000であり、Xは、場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基(C=O)である。)を有する。
[RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−C(O)−NH−CH2−CH2]2CH−X−(CH2)m−NH−C(O)−NH−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、Xは場合によってはNH、O、S、C(O)であるか又は存在せず、mは2から10であり、nは100から1,000である。)を有する。
[RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−C(O)−NH−CH2−CH2]2CH−X−(CH2)m−O−NH2(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、Xは場合によってはNH、O、S、C(O)であるか又は存在せず、mは2から10であり、nは100から1,000である。)を有する。
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するPEG誘導体により、抗原結合ポリペプチドを修飾する。一般に、PEG誘導体は、1から100kDaの平均分子量を有し、ある実施形態においては、10から40kDaの平均分子量を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−N3(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000である(即ち、平均分子量は5から40kDaの間である。)。)を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−NH−C(O)−(CH2)p−N3(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、pは2から10であり、nは100から1,000である(即ち、平均分子量は5から40kDaの間である。)。)を有する。
[RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−NH−C(O)]2CH(CH2)m−X−(CH2)p−N3(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、pは2から10であり、nは100から1,000であり、Xは、場合によっては、各場合において、O、N、S又はカルボニル基(C=O)である(存在してもよいし、存在しなくてもよい。)。)を有する。
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有するPEG誘導体により、抗原結合ポリペプチドを修飾する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−C≡CH(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、nは100から1,000である(即ち、平均分子量は5から40kDaの間である。)。)を有する。
RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−NH−C(O)−(CH2)p−C≡CH(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、pは2から10であり、nは100から1,000である。)を有する。
[RO−(CH2CH2O)n−O−(CH2)2−NH−C(O)]2CH(CH2)m−X−(CH2)p−C≡CH(式中、Rは単純アルキル(メチル、エチル、プロピルなど。)であり、mは2から10であり、pは2から10であり、nは100から1,000であり、Xは、場合によっては、O、N、S又はカルボニル基(C=O)であるか、又は存在しない。)を有する。
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む活性化官能基(以下に限定されないが、エステル、カーボネートなど。)を含有するPEG誘導体により、抗原結合ポリペプチドを修飾する。一般に、PEG誘導体は、1から100kDaの平均分子量、ある実施形態においては、10から40kDaの平均分子量を有する。
抗原結合ポリペプチドに連結させ得るその他の代表的なPEG分子ならびに、PEG化の方法には、次の文献に記載のものが含まれる。例えば、米国特許公開2004/0001838;2002/0052009;2003/0162949;2004/0013637;2003/0228274;2003/0220447;2003/0158333;2003/0143596;2003/0114647;2003/0105275;2003/0105224;2003/0023023;2002/0156047;2002/0099133;2002/0086939;2002/0082345;2002/0072573;2002/0052430;2002/0040076;2002/0037949;2002/0002250;2001/0056171;2001/0044526;2001/0027217;2001/0021763;米国特許第6,646,110号;同第5,824,778号;同第5,476,653号;同第5,219,564号;同第5,629,384号;同第5,736,625号;同第4,902,502号;同第5,281,698号;同第5,122,614号;同第5,473,034号;同第5,516,673号;同第5,382,657号;同第6,552,167号;同第6,610,281号;同第6,515,100号;同第6,461,603号;同第6,436,386号;同第6,214,966号;同第5,990,237号;同第5,900,461号;同第5,739,208号;同第5,672,662号;同第5,446,090号;同第5,808,096号;同第5,612,460号;同第5,324,844号;同第5,252,714号;同第6,420,339号;同第6,201,072号;同第6,451,346号;同第6,306,821号;同第5,559,213号;同第5,612,460号;同第5,747,646号;同第5,834,594号;同第5,849,860号;同第5,980,948号;同第6,004,573号;同第6,129,912号;WO97/32607、EP229,108、EP402,378、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、WO98/05363、EP809996、WO96/41813、WO96/07670、EP605963、EP510356、EP400472、EP183503及びEP154316(これらを本明細書中に参照により組み込む。)。本明細書に記載のPEG分子の何れも、以下に限定されないが、1本鎖、分枝鎖、分岐鎖、一官能性、二官能性、多官能性又はそれらのあらゆる組合せを含む、あらゆる形態で使用することができる。
様々な分子を本発明の抗原結合ポリペプチドに融合させて、血清中のABPの半減期を調節することもできる。ある実施形態において、分子を本発明の抗原結合ポリペプチドと連結又は融合させて、動物における内在性血清アルブミンに対する親和性を促進する。
本発明は、糖残基を有する一つ以上の非天然コードアミノ酸を取り込んでいる抗原結合ポリペプチドを含む。糖残基は、天然(以下に限定されないが、N−アセチルグルコサミンなど。)又は非天然(以下に限定されないが、3−フルオロガラクトースなど。)の何れかであり得る。糖はN−又はO−結合型グリコシド結合(以下に限定されないが、N−アセチルガラクトース−L−セリンなど。)又は非天然結合(以下に限定されないが、オキシム又は対応するC−もしくはS−結合型グリコシドなど。)の何れかにより、非天然コードアミノ酸に連結し得る。
本発明はまた、以下に限定されないが、ABPホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体(即ち、三量体、四量体など。)などの、ABPの組み合わせを提供するが、この場合、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有するABPポリペプチドは、ポリペプチド骨格に直接、又はリンカーを介しての何れかで、別のABPもしくはそれらの変異型又は非ABPポリペプチドもしくはそれらの変異型である何らかの他のポリペプチドと結合している。単量体と比較してその分子量が大きいことから、ABP二量体又は多量体共役物は、以下に限定されないが、異なる薬理学的、薬物動態的特性、単量体ABPと比べて、調節された治療半減期又は調節された血漿半減期など、新しい、又は所望する特性を示し得る。ある実施形態において、本発明のABP二量体は、ABP受容体の二量体化を調節する。他の実施形態において、本発明のABP二量体又は多量体は、ABP受容体アンタゴニスト、アゴニスト又はモジュレーターとして作用する。
R−(CH2CH2O)n−O−(CH2)m−X(式中、nは約5から3,000であり、mは2から10であり、Xは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル又はカルボニル含有部分であり得、Rは、Xと同じもしくは異なリ得る、キャッピング基、官能基又は脱離基である。)を有する水溶性活性化ポリマーとの反応により形成された、一つ以上のABPを含有する多量体を提供する。Rは、例えば、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシ、N−ヒドロキシスクシンイニジルエステル、1−ベンゾトリアゾリルエステル、N−ヒドロキシスクシンイニジルカーボネート、1−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート及びトレシレート、アルケン及びにケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
標準的なインビトロ又はインビボアッセイを用いて、ABP活性を測定することができる。例えば、ABPを結合する、細胞又は細胞株(以下に限定されないが、ネイティブのABP抗原もしくは結合パートナーを含有する細胞又は組み換えABP抗原もしくは結合パートナー産生細胞)を使用して、ABP結合をモニタリングすることができる。非天然アミノ酸を含有する非PEG化又はPEG化抗原結合ポリペプチドの場合、BIAcoreTMバイオセンサー(Pharmacia)などの当技術分野で公知の技術を用いて、その抗原又は結合パートナーに対するABPの親和性を測定することができる。
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのABPの共役あり又は無しで、ABPの構築により得られる生物学的半減期の延長である。ABP血清濃度が急激に低下することにより、共役及び非共役ABP及びそれらの変異型を用いた治療に対する生物学的反応を評価することが重要となる。好ましくは、本発明の、共役及び非共役ABPならびにそれらの変異型の血清半減期は、i.v.投与後も長く、これにより、例えばELISA法により、又は一次スクリーニングアッセイにより測定することが可能となる。本明細書に記載のとおりにインビボ生物学的半減期の測定を行う。
以下に限定されないが、適切な製薬担体と組み合わせるなどして、治療用途のために、本発明の、ポリペプチド又はタンパク質(以下に限定されないが、ABP、シンテターゼ、一つ以上の非天然アミノ酸を含有するタンパク質など。)を場合によっては使用することができる。このような組成物は、例えば、化合物の治療的有効量と医薬的に許容される担体又は賦形剤とを含有する。このような担体又は賦形剤としては、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び/又はそれらの組合せが挙げられる。投与様式に適切となるように処方物を調製する。一般に、タンパク質の投与方法は、当技術分野で周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
本発明のABPポリペプチドは、多岐にわたる疾患を治療するのに有用である。以下に限定されないが、抗増殖剤、抗炎症剤又は抗ウイルス剤が使用されるような、ABPアゴニスト又はアンタゴニストに影響を受け得る疾患(単独で、又は状態もしくは疾患の一部としての何れか。)に罹患しているヒト患者への様々な手段による投与に効果的な強度で、ABPを含有する医薬組成物を処方し得る。ABPの平均量は変化し得、特に、有資格の医師の推奨及び指示に基づくものであるべきである。ABPの正確な量は、治療する正確な状態のタイプ、治療する患者の状態ならびに組成物中の他の成分などの因子に対する選択性の問題である。本発明はまた、抗癌化学療法剤などの別の活性剤の治療的有効量を投与することを提供する。与える量は、ABPを用いた治療に基づき、当業者により容易に決定し得る。
この実施例は、非天然コードアミノ酸をABPに取り込むのに好ましい部位の選択に対する、可能性のある多くの一連の基準を説明する。
この実施例は、E.コリにおける非天然コードアミノ酸を含むABPのクローニング及び発現について詳述する。
ペリプラスムscFv−108:EGFR−特異的モノクローナル抗体mAb108(米国特許第6,217,866号、本明細書中に参照により組み込む。)の可変領域(VL及びVH)をscFv断片として、(GGGGS)4リンカー配列とともに酵母BGL2(C7)ペリプラスムリーダー配列の下流にクローニングした(Humphreys,DP.ら、Protein Expr Purif.2000年11月20日;20(2):252−64)。c−myc抗体ならびに6xHisタグにより認識されるエピトープ配列をVLドメインの下流にクローニングした。野生型scFv−108コンストラクトならびに、VLドメインにアンバー停止コドン(TAG)を含有する変異型(図2、パネルA)をE.コリ発現ベクターへと誘導プロモーターの制御下にクローニングした。このプラスミドはまた、構成的にアンバーサプレッサーチロシルtRMATyr/CUAをMethanococcus jannaschii(メタノコッカス・ジャナシ)(Mj tRNATyr/CUA)から発現した。アンバー停止コドンの位置を示す。作製したコンストラクトを配列番号18(ヌクレオチド配列)及び配列番号19(翻訳されたタンパク質配列)で示す。コンストラクトを表3及び4に記載する。
パラ−アセチル−フェニルアラニン(pAcF)による抑制:当技術分野で公知の標準的プロトコールを用いて、E.コリにおけるアンバー突然変異の抑制を行った。簡潔に述べると、E.コリにおける抗体断片(scFv及びFab)のペリプラスム抑制のために、M.ジャナシからの直交化チロシルtRNA−シンテターゼ(MjTyrRS)をコードするプラスミドを用いて、発現ベクターコンストラクトをE.コリに形質転換した。一晩細菌を培養したものをLB培地(Luria−Bertani)又はSuperbrothの何れかを含有する振盪フラスコ中で1:100希釈し、37℃にておよそ0.8のODになるまで増殖させた。Fab及びscFv発現を誘導し、一方、パラ−アセチル−フェニルアラニン(pAcF)を4mMの最終濃度になるように添加することにより、アンバーコドンの抑制を行った。25℃で一晩培養物をインキュベートした。同一の条件下で、野生型(アンバーコドンを欠く。)scFv及びFab断片(Fab−4D5−cysを含む。)の発現を行った。細胞性scFv断片の発現/抑制(図2、パネルB)を同様にして行った。
遠心分離により細胞を回収し、ライソザイム100μg/mLを添加したペリプラスム放出緩衝液(50mM NaPO4、20%スクロース、1mM EDTA、pH8.0)中で懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。遠心分離後、上清中の抗体断片をそれらのHisタグによりProBindビーズ(Invitrogen;Carlsbad,CA)上に固定し、結合緩衝液でビーズをよく洗浄し、次いで0.5Mイミダゾールを用いて、結合した断片をビーズから溶出した。精製した断片を保存緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、10%グリセロール、5%スクロース、pH7.8)中で透析した。細胞質で発現されたscFv断片の小規模分析の場合、培養液15mLからのE.コリを遠心分離により回収し、DNase10μg/mLを添加した細胞溶解緩衝液1mL(B−PER、Pierce Biotechnology;Rockfold,IL)中で再懸濁した。混合物を37℃で30分間インキュベートし、Protein Loading緩衝液(Invitrogen;Carlsbad,CA)中で1xになるように希釈し、SDS−PAGEにより分析した。
PEG化:pAcF−scFv−108タンパク質およそ1mgを反応緩衝液(100mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA、pH4.0)中で50μLの最終体積まで濃縮した。一官能性(ヒドロキシルアミン)5K PEG(反応緩衝液中で平衡化)の100倍モル過剰量とともに、100μL最終体積で反応混合物を28℃にて32時間インキュベートした。PEG化物質を続くゲル電気泳動により評価し、細胞結合アッセイに直接使用した。
PEG化:pAcF−scFv−108タンパク質およそ1mgをネイティブ反応緩衝液(20mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA、pH4.0)及び変性反応緩衝液(20mM NaOAc、150mM NaCl、1mM EDTA、8M尿素、pH4.0)中で50μLの最終体積になるまで濃縮した。一官能性(ヒドロキシルアミン)5KPEG(対応する反応緩衝液中で平衡化)の100倍モル過剰量とともに、100μL最終体積で反応混合物を28℃で32時間インキュベートした。16時間後、反応混合物をSDS−PAGEにより調べ、細胞結合アッセイに直接使用した。
強力な陽イオン交換カラム(SP−5PW、20ミクロン)を用いて、二量体化反応混合物を精製した。緩衝液A:20mM NaOAc、pH4.0;緩衝液B:20mM NaOAc、1M NaCl、pH4.0。scFv二量体を40%のBで溶出した。精製二量体のSDS PAGE分析(図15)から、1回のカラム精製後、二量体の純度がおよそ90%となったことが分かった。
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入及び、それに続く、アミノオキシ含有PEGとの反応について詳述する。
R−PEG(N)−O−(CH2)n−O−NH2(式中、Rはメチルであり、nは3であり、Nはおよそ5,000MWである。)のアミノオキシ含有PEG誘導体と、カルボニル含有アミノ酸を含有するABP変異型とを反応させる。25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH6.0、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH7.0又は10mM 酢酸ナトリウム(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH4.5中で10mg/mLとなるように溶解させた、p−アセチル−フェニルアラニンを含有する精製ABPを、アミノオキシ含有PEGの10倍から100倍過剰量と反応させ、次いで室温にて10時間から16時間撹拌する(Jencks,W.J.Am.Chem.Soc.1959、81、pp475)。次いで、すぐに精製及び分析を行うために、PEG-ABPを適切な緩衝液に希釈する。
アミド結合を介してPEGに連結しているヒドロキシルアミン基からなるPEGとの共役
実施例3に記載の手段を用いて、次の構造を有するPEG物質をケトン含有非天然コードアミノ酸とカップリングさせる:
R−PEG(N)−O−(CH2)2−NH−C(O)(CH2)−O−NH2(式中、R=メチル、n=4、Nはおよそ20,000MWである。)。反応、精製及び分析条件は実施例3に記載のとおりである。
この実施例は、2個の個別の非天然コードアミノ酸のABPへの導入について詳述する。
この実施例は、ヒドラジド含有PEGへの抗原結合ポリペプチドの共役及び続くインシトゥ還元について詳述する。
R−PEG(N)−O−(CH2)2−NH−C(O)(CH2)n−X−NH−NH2(式中、R=メチル、n=2、N=10,000MWであり、Xはカルボニル(C=O)基である。)。p−アセチルフェニルアラニンを含有する精製ABPを25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH6.0、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH7.0又は10mM 酢酸ナトリウム(Sigma Chemical,St.Louis,MO)pH4.5中で0.1から10mg/mLに溶解させ、ヒドラジド含有PEGの1倍から100倍過剰量と反応させ、10から50mMの最終濃度になるようにH2O中に溶解している保存1M NaCNBH3(Sigma Chemical,St.Louis,MO)を添加することにより、対応するヒドラゾンをインシトゥで還元する。4℃からRTにて18時間から24時間、暗所で反応を行う。約pH7.6の1M Tris(Sigma Chemical,St.Louis,MO)を50mMの最終Tris濃度になるように添加することにより、又はすぐに精製するために適切な緩衝液中に希釈することによって、反応を停止させる。
この実施例は、アルキン含有アミノ酸のABPへの導入及びmPEG−アジドによる誘導体化について詳述する。
R−PEG(N)−O−(CH2)2−NH−C(O)(CH2)n−N3(式中、Rはメチルであり、nは4であり、Nは10,000MWである。)。
この実施例は、ABPにおける、大きな疎水性アミノ酸の、プロパルギルチロシンでの置換について詳述する。
Me−PEG(N)−O−(CH2)2−N3
カップリング手段は実施例7の手段に従う。これにより、天然の大きな疎水性アミノ酸の1つとほぼ等比体積であり、ポリペプチド内の別の部位でPEG誘導体により修飾される非天然のコードアミノ酸を含有するABP変異型が生成する。
この実施例は、一つ以上のPEGリンカーにより分けられる、ABPホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体の生成について詳述する。
N3−(CH2)n−C(O)−NH−(CH2)2−O−PEG(N)−O−(CH2)2−NH−C(O)−(CH2)n−N3(式中、nは4であり、PEGは、およそ5,000の平均MWを有する。)の形態の二官能性PEG誘導体と反応させ、2個のABP分子がPEGにより物理的に離されている対応するABPホモ二量体を生成させる。同様の方法において、抗原結合ポリペプチドを一つ以上の他のポリペプチドとカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成することができる。実施例7及び3に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
この実施例は、ABPへの糖部分のカップリングについて詳述する。
この実施例は、PEG化ABPアンタゴニストの生成について詳述する。
R−PEG(N)−O−(CH2)n−O−NH2(式中、Rはメチルであり、nは4であり、Nは20,000MWである。)のアミノオキシ-含有PEG誘導体と、カルボニル含有アミノ酸を含有するABP変異型とを反応させ、ポリペプチド中の1箇所でPEG誘導体により修飾されている非天然のコードアミノ酸を含有するABPアンタゴニストを生成させる。実施例3に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
ABP分子が直接連結している、ABPホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体の生成
アジド含有アミノ酸を含有する別のABP変異型にアルキン含有アミノ酸を含有するABP変異型を直接カップリングさせることができる(それらのそれぞれが、以下に限定されないが実施例10に記載の部位で非天然コードアミノ酸により置換されている。)。これにより、2個のABP変異型が物理的に連結している対応するABPホモ二量体が生成する。同様の方法において、一つ以上の他のポリペプチドに抗原結合ポリペプチドをカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成させ得る。実施例3、6及び7に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
mPEG−OH+Br−CH2−C≡CH→mPEG−O−CH2−C≡CH
20,000Daの分子量のmPEG−OH(mPEG−OH 20kDa;2.0g、0.1mmol、Sunbio)をTHF(35mL)中のNaH(12mg、0.5mmol)で処理した。次に、キシレン中80重量%溶液として溶解している臭化プロパルギルの溶液(0.56mL、5mmol、50当量、Aldrich)及びKIの触媒量を溶液に添加し、生じた混合物を2時間加熱還流した。次いで水(1mL)を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にCH2Cl2(25mL)を添加し、有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させ、体積をおよそ2mLまで減少させた。このCH2Cl2溶液をジエチルエーテル(150mL)に滴下添加した。生じた沈殿物を回収し、冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、乾燥させ、プロパルギル−O−PEGを得た。
mPEG−OH+Br−(CH2)3−C≡CH→mPEG−O−(CH2)3−C≡CH
20,000Daの分子量のmPEG−OH(20kDa;2.0g、0.1mmol、Sunbio)をTHF(35mL)中のNaH(12mg、0.5mmol)で処理した。次に、5−ブロモ−L−ペンチン(0.53mL、5mmol、Aldrich)の50当量及びKIの触媒量を混合物に添加した。生じた混合物を16時間加熱還流した。次いで水(1mL)を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にCH2Cl2(25mL)を添加し、有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させ、体積をおよそ2mLまで減少させた。このCH2Cl2溶液をジエチルエーテル(150mL)に滴下添加した。生じた沈殿を回収し、冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、乾燥させ、対応するアルキンを得た。同様の反応において5−クロロ−1−ペンチンを使用できる。
(1)m−HOCH2C6H4OH+NaOH+Br−CH2−C≡CH→m−HOCH2C6H4O−CH2−C≡CH
(2)m−HOCH2C6H4O−CH2−C≡CH+MsCl+N(Et)3→m−MsOCH2C6H4O−CH2−C≡CH
(3)m−MsOCH2C6H4O−CH2−C≡CH+LiBr→m−Br−CH2C6H4O−CH2−C≡CH
(4)mPEG−OH+m−Br−CH2C6H4O−CH2−C≡CH→mPEG−O−CH2−C6H4O−CH2−C≡CH
THF(50mL)及び水(2.5mL)中の3−ヒドロキシベンジルアルコール(2.4g、20mmol)の溶液に、粉状の水酸化ナトリウム(1.5g、37.5mmol)を最初に添加し、次いでキシレン中80重量%溶液として溶解している臭化プロパルギルの溶液(3.36mL、30mmol)を添加した。反応混合物を還流温度で6時間加熱した。この混合物に10%クエン酸(2.5mL)を添加し、溶媒を真空除去した。残渣を酢酸エチル(3x15mL)で抽出し、合わせた有機層をNaCl飽和溶液(10mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、濃縮し、3−プロパルギルオキシベンジルアルコールを得た。
mPEG−NH2+X−C(O)−(CH2)N−C≡CR’→mPEG−NH−C(O)−(CH2)n−C≡CR’
上記で示すとおり、末端官能基を含有するポリ(エチレングリコール)ポリマーをアルキン官能基含有反応性分子とカップリングさせることにより、末端アルキン含有ポリ(エチレングリコール)ポリマーを得ることもできる。nは、1から10である。R’はH又はC1からC4の小さいアルキル基であり得る。
(1)HO2C−(CH2)2−C≡CH+NHS+DCC→NHSO−C(O)−(CH2)2−C≡CH
(2)mPEG−NH2+NHSO−C(O)−(CH2)2−C≡CH→mPEG−NH−C(O)−(CH2)2−C≡CH
4−ペンチン酸(2.943g、3.0mmol)をCH2Cl2(25mL)中で溶解させた。N−ヒドロキシスクシンイミド(3.80g、3.3mmol)及びDCC(4.66g、3.0mmol)を添加し、溶液を室温にて一晩撹拌した。生じた粗製NHSエステル7をさらに精製せずに次の反応において使用した。
この実施例は、ポリ(エチレングリコール)のメタンスルホニルエステル(これはまた、ポリ(エチレングリコール)のメタンスルホネート又はメシレートとも呼ばれ得る。)の調製を示す。同様の手段により、対応するトシレート及びハロゲン化物を調製することができる。
トルエン150mL中のmPEG−OH(MW=3,400、25mg、10mmol)を窒素下で2時間共沸蒸留し、溶液を室温に冷却した。この溶液に、無水CH2Cl240mL及び無水トリエチルアミン(15mmol)2.1mLを添加した。溶液を氷浴中で冷却し、蒸留した塩化メタンスルホニル(15mmol)1.2mLを滴下添加した。溶液を窒素下で室温にて一晩撹拌し、無水エタノール2mLを添加することにより、反応を停止させた。混合物を真空蒸発させて、主にトルエン以外の溶媒を除去し、ろ過し、再び真空下で濃縮し、次いでジエチルエーテル100mL中で沈殿させた。ろ過液を冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、真空乾燥させ、メシレートを得た。
(1)N3−C6H4−CO2H→N3−C6H4CH2OH
(2)N3−C6H4CH2OH→Br−CH2−C6H4−N3
(3)mPEG−OH+Br−CH2−C6H4−N3→mPEG−O−CH2−C6H4−N3
米国特許第5,998,595号(本明細書中に参照により組み込む。)に記載の方法を用いて、4−アジドベンジルアルコールを生成させることができる。0℃にて、CH2Cl2中の4−アジドベンジルアルコール(1.75g、11mmol)の溶液に、塩化メタンスルホニル(2.5g、15.7mmol)及びトリエチルアミン(2.8mL、20mmol)を添加し、反応物を16時間冷蔵庫に置いた。通常の処理により、淡黄色の油状物質としてメシレートを得た。この油状物質(9.2mmol)をTHF(20mL)中で溶解させ、LiBr(2.0g、23.0mmol)を添加した。反応混合物を1時間加熱還流し、次いで室温に冷却した。この混合物に水(2.5mL)を添加し、溶媒を真空除去した。酢酸エチル(3x15mL)で残渣を抽出し、合わせた有機層をNaCl飽和溶液(10mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮し、所望の臭化物を得た。
NH2−PEG−O−CH2CH2CO2H+N3−CH2CH2CO2−NHS→N3−CH2CH2−C(O)NH−PEG−O−CH2CH2CO2H
NH2−PEG−O−CH2CH2CO2H(MW3,400Da、2.0g)をNaHCO3(10mL)の飽和水溶液中で溶解させ、溶液を0℃に冷却した。激しく撹拌しながら3−アジド−1−N−ヒドロキシスクシンイミドプロピオネート(5当量)を添加した。3時間後、H2O 20mLを添加し、さらに45分間室温で混合物を撹拌した。0.5N H2SO4を用いてpHを3に調整し、およそ15重量%の濃度までNaClを添加した。反応混合物をCH2Cl2(100mLx3)で抽出し、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルにより沈殿させた後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させ、オメガ−カルボキシ−アジドPEG誘導体を得た。
mPEG−OMs+HC≡CLi→mPEG−O−CH2−CH2−C≡C−H
当技術分野で公知のように調製し、−78℃に冷却した、THF中のリチウムアセチリド(4当量)の溶液に、THF中で溶解させたmPEG−OMsの溶液を激しく撹拌しながら滴下添加した。3時間後、反応物を室温に温め、ブタノール1mLを添加することで反応停止させた。次に、H2O 20mLを添加し、さらに45分間室温にて混合物を撹拌した。0.5N H2SO4を用いてpHを3に調整し、およそ15重量%の濃度までNaClを添加した。反応混合物をCH2Cl2(100mLx3)で抽出し、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルにより沈殿させた後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させ、1−(ブタ−3−イニルオキシ)−メトキシポリエチレングリコール(mPEG)を得た。
L.Wangら、(2001)、Science292:498−500、J.W.Chinら、Science301:964−7(2003))、J.W.Chinら、(2002)、Journal of the American Chemical Society 124:9026−9027;J.W.Chin及びP.G.Schultz、(2002)、Chem Bio Chem 11:1135−1137;J.W.Chinら、(2002)、PNAS United States of America 99:11020−11024;及びL.Wang及びP.G.Schultz(2002)、Chem.Comm.,1−10に記載の方法を用いて、タンパク質へ部位選択的にアジド−及びアセチレン−含有アミノ酸を取り込ませた。アミノ酸を取り込ませた後、2mM PEG誘導体、1mM CuSO4及び〜1mg銅細線存在下で、37℃にて4時間、リン酸緩衝液(PB)、pH8中の0.01mMタンパク質を用いて付加環化反応を行った。
この実施例は、非天然コードアミノ酸を含有するABP及びPEG化ABPのインビトロ及びインビボ活性を測定する方法を述べる。
0℃にて90分間、様々な濃度の(体積10μL)、非標識ABP、ABPもしくはネガティブ対照非存在下又は存在下で、及び、125I−ABP(およそ100,000cpm又は1ng)存在下で、PBS/1%BSA(100μL)中で、各2測定試料ずつ、細胞(3x106)をインキュベートする(総体積:120μL)。次に細胞を再懸濁し、350μLプラスチック遠沈管中の200μL氷冷FCS上に重ねるように添加し、遠心分離する(1000g、1分間)。管の端を切ってペレットを回収し、ペレット及び上清を個別にガンマカウンター(Packard)でカウントする。
PEG−ABP、非修飾ABP及び緩衝溶液をマウス又はラットに投与する。この結果から、非修飾ABPと比較して、本発明のPEG化ABPの活性が活性が高く、半減期が長くなっていることが示される。
雄Sprague−Dawleyラット(約7週齢)を使用する。投与日に、各動物の体重を測定する。非共役及び共役ABP試料を100μg/kg体重、それぞれこれらのラットの尾静脈に静脈内投与する。投与から1分、30分、1、2、4、6及び24時間後に、CO2麻酔下で各ラットから血液500μLを採取する。血液試料を室温で1.5時間保存し、次いで、遠心分離(4℃、18000xgで5分間)により血清を分離する。分析する日まで血清試料を−80℃で保存する。氷上で試料を凍結融解した後、ABPインビトロ活性分析により血清試料中の活性ABPの量を定量する。
非天然コードアミノ酸を含有するPEG化ABPの安全性及び/又は有効性のヒト臨床試験
目的 皮下投与した、非天然のコードアミノ酸を含有するPEG化組み換えヒトABPの安全性及び薬物動態学的を、同じ標的抗原に特異的な市販の製品(例えば、Herceptin(R)、Bexxar(R)、Campath(R)、CEA−Scan(R)、Enbrel(R)、Erbitux(R)、Humira(R)、Myoscint(R)、Prostascint(R)、Raptiva(R)、Remicade(R)、ReoPro(R)、Rituxan(R)、Simulect(R)、Synagis(R)、Verluma(R)、Xolair(R)、Zenapax(R)、Zevalin(R)又はAvastin(R)。)と比較すること。
これは、健康な男性ボランティアにおける、フェーズIの、1ヶ所の施設での非盲検の無作為化2期クロスオーバー試験である。18名の対象者を無作為に2つの処置順序群の1つに割り当てる(各群9名)。2回の別個の投与期間にわたり、非天然コードアミノ酸を含有するPEG化ABP及び選択した市販製品の同等の投与量を用いて、大腿上方にボーラスs.c.注射としてABPを投与する。市販製品の投与の用量及び頻度は、包装のラベルに指示されている通りである。さらなる対象者の群を加えることにより、必要に応じて、市販製品を用いた、さらなる投与、投与頻度又はその他のパラメーターをこの試験に付け加え得る。各投与期間は、14日間のウォッシュアウト期間を置くことにより分けられる。2回の投与期間それぞれに対して、少なくとも12時間前から投与後72時間まで、被験者を試験施設に収容するが、投与期間と投与期間の間は収容しない。PEG化ABPに対して同じように試験する、さらなる投与、頻度又はその他のパラメーターを加える場合は、さらなる被験者群を付け加え得る。ABPの実験処方物は、非天然コードアミノ酸を含有するPEG化ABPである。
ABP投与前後に静脈に針を直接刺し、連続血液を採取する。血清ABP濃度を調べるための静脈血液試料(5mL)を投与前約30、20及び10分(3種類のベースライン試料)及び投与からおよそ30分ならびに、1、2、5、8、12、15、18、24、30、36、48、60及び72時間後に採取する。各血清試料を2つに分注する。血清試料を全て−20℃で保存する。血清試料をドライアイス上で発送する。第1日の最初の投与直前、第4日の午前及び第16日の投与直前、第19日の午前に、絶食臨床検査(血液学、血清化学及び尿検査)を行う。
血清ABP濃度を測定するために、ラジオイムノアッセイ(RA)又はELISAキット法を用いる。
1.一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する、抗原結合ポリペプチド。
2.一つ以上の翻訳後修飾を含有する、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
3.リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
4.水溶性ポリマーに連結されている、請求項3に記載の抗原結合ポリペプチド。
5.二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも1つのさらなる抗原結合ポリペプチドに連結されている、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
6.二官能性リンカー又はポリマーが、第二のポリペプチドに連結している、請求項5に記載の抗原結合ポリペプチド。
7.第二のポリペプチドが、抗原結合ポリペプチドである、請求項6に記載の抗原結合ポリペプチド。
8.第二のポリペプチドが、非抗原結合ポリペプチドである、請求項6に記載の抗原結合ポリペプチド。
9.水溶性ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)部分を含有する、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
10.二官能性ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)部分である、請求項5に記載の抗原結合ポリペプチド。
11.前記水溶性ポリマーが、抗原結合ポリペプチドに存在する非天然コードアミノ酸と連結している、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
12.ポリ(エチレングリコール)部分を含有する水溶性ポリマーに連結している少なくとも2個のアミノ酸を含有する、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
13.前記水溶性ポリマーに連結している少なくとも1個のアミノ酸が、非天然コードアミノ酸である、請求項12に記載の抗原結合ポリペプチド。
14.抗原結合ポリペプチドが、ABP受容体又は抗原に対する抗原結合ポリペプチドの親和性を調節する一つ以上の、アミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
15.安定性、組み換え宿主細胞における発現レベル又はインビトロでの合成、免疫原性、プロテアーゼ抵抗性、組織もしくは器官特異性又は抗原結合ポリペプチドの溶解性を調節する一つ以上の、アミノ酸置換、付加又は欠失を含有する、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
16.非天然コードアミノ酸が、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性があり、ポリペプチドにおける20種類の一般的アミノ酸のいずれに対しても非反応性である、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
17.非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含有する、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
18.非天然コードアミノ酸が、カルボニル基を含有する、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
19.非天然コードアミノ酸が、構造
nは、0から10であり;R1は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり;R2は、H、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールであり;R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、R4は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。)を有する、請求項18に記載の抗原結合ポリペプチド。
20.非天然コードアミノ酸が、アミノオキシ基を含有する、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
21.非天然コードアミノ酸が、ヒドラジド基を含有する、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
22.非天然コードアミノ酸が、ヒドラジン基を含有する、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
23.非天然コードアミノ酸が、セミカルバジド基を含有する、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
24.非天然コードアミノ酸が、アジド基を含有する、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
25.非天然コードアミノ酸が、構造
nは、0から10であり;R1は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであるか又は存在せず;Xは、O、N、Sであるか又は存在せず;mは0から10であり;R2は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。)を有する、請求項24に記載の抗原結合ポリペプチド。
26.非天然コードアミノ酸が、アルキン基を含有する、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
27.非天然コードアミノ酸が、構造:
nは、0から10であり;R1は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり;Xは、O、N、Sであるか又は存在せず;mは0から10であり、R2は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、R3は、H、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。)を有する、請求項26に記載の抗原結合ポリペプチド。
28.水溶性ポリマーが、約0.1kDaから約100kDaの間の分子量を有する、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
29.水溶性ポリマーが、約0.1kDaから約50kDaの間の分子量を有する、請求項28に記載の抗原結合ポリペプチド。
30.カルボニル含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含有する水溶性ポリマーと反応させることにより調製される、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
31.アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基が、アミド結合を介して水溶性ポリマーと連結されている、請求項30に記載の抗原結合ポリペプチド。
32.カルボニル基を含む水溶性ポリマーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含有する非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドと反応させることにより調製される、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
33.アルキン含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アジド部分を含有する水溶性ポリマーと反応させることにより調製される、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
34.アジド含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アルキン部分を含有する水溶性ポリマーと反応させることにより調製される、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
35.アジド又はアルキン基が、アミド結合を介して水溶性ポリマーに連結されている、請求項17に記載の抗原結合ポリペプチド。
36.水溶性ポリマーが、分枝又は分岐ポリマーである、請求項4に記載の抗原結合ポリペプチド。
37.水溶性ポリマーの各分枝が、約1kDaから100kDaの間の分子量を有する、請求項36に記載の抗原結合ポリペプチド。
38.ポリペプチドが、抗原結合ポリペプチドアンタゴニストである、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
39.ポリペプチドが、一つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有する、請求項38に記載の抗原結合ポリペプチド。
40.ポリマーが、水溶性ポリマー及びポリ(エチレングリコール)からなる群から選択される部分を含有する、請求項39に記載の抗原結合ポリペプチド。
41.非天然コードアミノ酸が、糖部分を含有する、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
42.リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、糖部分を介してポリペプチドに連結している、請求項3に記載の抗原結合ポリペプチド。
43.抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有しており、このポリヌクレオチドが少なくとも1個のセレクターコドンを含有する、単離核酸。
44.セレクターコドンが、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される、請求項43に記載の単離核酸。
45.請求項3に記載の抗原結合ポリペプチドを調製する方法(この方法は、非天然コードアミノ酸を含有する単離抗原結合ポリペプチドを、この非天然コードアミノ酸と反応する部分を含有する、リンカー、ポリマー又は生物活性分子と接触させることを含む。)。
46.ポリマーが、水溶性ポリマー及びポリ(エチレングリコール)からなる群から選択される部分を含有する、請求項45に記載の方法。
47.非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含有する、請求項45に記載の方法。
48.非天然コードアミノ酸がカルボニル部分を含有し、リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有する、請求項45に記載の方法。
49.アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分が、アミド結合を介して、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項48に記載の方法。
50.非天然コードアミノ酸が、アルキン部分を含有し、リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、アジド部分を含有する、請求項45に記載の方法。
51.非天然コードアミノ酸が、アジド部分を含有し、リンカー、ポリマー又は生物活性分子がアルキン部分を含有する、請求項45に記載の方法。
52.アジド又はアルキン部分が、アミド結合を介して、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項47に記載の方法。
53.ポリ(エチレングリコール)部分が、約0.1kDaから約100kDaの間の平均分子量を有する、請求項46に記載の方法。
54.ポリ(エチレングリコール)部分が、分枝又は分岐ポリマーである、請求項46に記載の方法。
55.請求項1に記載の抗原結合ポリペプチドと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
56.非天然コードアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている、請求項55に記載の組成物。
57.ABPにより調節される疾患を有する患者を治療する方法(この方法は、請求項55に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。)。
58.請求項43に記載の核酸を含有する細胞。
59.直交化tRNAシンテターゼ又は直交化tRNAを含有する、請求項58に記載の細胞。
60.非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを調製する方法(この方法は、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの発現が可能な条件下で、セレクターコドンを含有する抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(一つ以上)、直交化RNAシンテターゼ及び直交化tRNAを含む細胞を培養することと、抗原結合ポリペプチドを精製することと、を含む。)。
61.抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間を調節する方法(この方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。)。
62.ポリヌクレオチドによりコードされる抗原結合ポリペプチド(前記ポリヌクレオチドは、セレクターコドンを含有しており、前記ポリペプチドは、少なくとも1個の非天然コードアミノ酸を含有する。)。
63.非天然コードアミノ酸が、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子と連結されている、請求項62に記載の抗原結合ポリペプチド。
64.水溶性ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)部分を含有する、請求項63に記載の抗原結合ポリペプチド。
65.非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含有する、請求項62に記載の抗原結合ポリペプチド。
66.ポリ(エチレングリコール)部分が、約0.1kDaから約100kDaの間の分子量を有する、請求項64に記載の抗原結合ポリペプチド。
67.ポリ(エチレングリコール)部分が、分枝又は分岐ポリマーである、請求項64に記載の抗原結合ポリペプチド。
68.ポリ(エチレングリコール)部分が、約1kDaから約100kDaの間の分子量を有する、請求項67に記載の抗原結合ポリペプチド。
69.請求項62に記載の抗原結合ポリペプチドと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
70.二重特異性ABP(互いに連結している、第一のABPと第二のABPとを含有しており、前記第一のABP及び前記第二のABPは異なるエピトープに特異的に結合し、前記第一のABPは、第一の抗原において少なくとも1個のエピトープに対する結合特異性を有し、第二のABPは、第一のエピトープとは異なる、第一の抗原又は第二の抗原の第二のエピトープに対して結合特異性を有しており、前記二重特異性ABPは、少なくとも1個の非天然コードアミノ酸を含有する。)。
71.前記第一のABP及び前記第二のABPが、リンカーにより連結されている、請求項70に記載の二重特異性ABP。
72.前記リンカーが、ペプチドリンカーである、請求項71に記載の二重特異性ABP。
73.前記リンカーが、タンパク質分解的切断部位を欠くペプチドリンカーである、請求項72に記載の二重特異性ABP。
74.前記第一のABPが、一本鎖ABPであり、前記第二のABPが、一本鎖ABPであり、前記第一のABPが、ペプチドリンカーにより前記第二のABPにカップリングしている、請求項70に記載の二重特異性ABP。
75.請求項70に記載の二重特異性ABPと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
76.疾患又は状態を治療するための方法(この方法は、これを必要とする患者に請求項75に記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む。)。
77.生物活性分子とカップリングしている請求項70に記載の二重特異性ABPを含む、ABP。
78.前記生物活性分子が、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド及びABPからなる群から選択される、請求項77に記載のABP。
79.融合タンパク質である、請求項77に記載のABP。
80.一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織を検出する方法(この方法は、検出可能な標識に連結させた請求項70に記載のABPと細胞又は組織とを接触させることと;前記標識を検出することと、を含み、細胞又は組織と会合している前記標識の検出が、ABPが結合する一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織の存在を示す。)。
81.前記検出可能標識が、ガンマ放出体、陽電子放射体、MRI標識及び蛍光標識からなる群から選択される、請求項80に記載の方法。
82.前記検出可能標識が、ガンマ放出体であり、前記検出が、ガンマカメラによるイメージングを含む、請求項80に記載の方法。
83.前記検出可能標識が、陽電子放射体であり、前記検出が、陽電子放出断層撮影(PET)によるイメージングを含む、請求項80に記載の方法。
84.前記検出可能標識が、MRI標識であり、前記検出が、核磁気共鳴影像法による検出を含む、請求項80に記載の方法。
85.1個のアミノ酸における抗原結合ポリペプチドへの共有結合により連結される水溶性ポリマーを含有する、抗原結合ポリペプチド。
86.水溶性ポリマーが、ポリ(エチレングリコール)部分を含有する、請求項85に記載の抗原結合ポリペプチド。
87.水溶性ポリマーに共有結合するアミノ酸が、非天然コードアミノ酸である、請求項85に記載の抗原結合ポリペプチド。
88.少なくとも1つのリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有しており、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、リボソームにおいてポリペプチドに組み込まれる非天然コードアミノ酸の官能基を介してポリペプチドに連結されている、抗原結合ポリペプチド。
89.前記抗原結合ポリペプチドが、モノPEG化されている、請求項88に記載の抗原結合ポリペプチド。
90.一つ以上の非天然コードアミノ酸に連結されており、前記非天然コードアミノ酸が、リボソームにおいて事前選択部位でポリペプチドに取り込まれる、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有する、抗原結合ポリペプチド。
91.1個の、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有する、請求項90に記載の抗原結合ポリペプチド。
92.抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間を調節する、一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含有する、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
93.抗原結合ポリペプチドの免疫原性を調節する方法(この方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。)。
94.単離核酸の配列が、配列番号18、20、22、25、27及び29又はそれらの断片からなる群から選択される、請求項43に記載の単離核酸。
95.配列番号:19、21、23、24、26、28、30、31又はそれらの断片からなる群から選択される、抗原結合ポリペプチド。
96.抗原結合ポリペプチドが、変性条件下でリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結される、請求項3に記載の抗原結合ポリペプチド。
Claims (23)
- 一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する、抗原結合ポリペプチド。
- 抗原結合ポリペプチドが一つ以上の翻訳後修飾を含有する、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
- 抗原結合ポリペプチドがリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド。
- 抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有し、該ポリヌクレオチドが少なくとも1個のセレクターコドンを含有する、単離核酸。
- 請求項3に記載の抗原結合ポリペプチドを調製する方法(該方法は、非天然コードアミノ酸を含有する単離抗原結合ポリペプチドを、該非天然コードアミノ酸と反応する部分を含有する、リンカー、ポリマー又は生物活性分子と接触させることを含む。)。
- 請求項1に記載の抗原結合ポリペプチド及び医薬的に許容される担体を含有する組成物。
- 請求項6に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、ABPにより調節される疾患を有する患者を治療する方法。
- 請求項4に記載の核酸を含有する細胞。
- 非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを調製する方法(該方法は、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの発現が可能な条件下で、セレクターコドンを含有する抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(一つ又は複数)、直交化RNAシンテターゼ及び直交化tRNAを含む細胞を培養すること及び抗原結合ポリペプチドを精製することを含む。)。
- 抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間を調節する方法(該方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。)。
- ポリヌクレオチドによりコードされる抗原結合ポリペプチドであって、前記ポリヌクレオチドは、セレクターコドンを含有し、及び前記ポリペプチドは、少なくとも1個の非天然コードアミノ酸を含有する、方法。
- 請求項11に記載の抗原結合ポリペプチド及び医薬的に許容される担体を含有する組成物。
- 互いに連結している第一のABPと第二のABPとを含有する、二重特異性ABP(前記第一のABPと前記第二のABPは、異なるエピトープに特異的に結合し、前記第一のABPは、第一の抗原における少なくとも1個のエピトープに対して結合特異性を有し、第二のABPは、前記第一のエピトープとは異なる、第一の抗原又は第二の抗原における第二のエピトープに対して結合特異性を有しており、及び前記二重特異性ABPは、少なくとも1個の非天然コードアミノ酸を含有する。)。
- 請求項13に記載の二重特異性ABPと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
- 疾患又は状態を治療するための方法であって、治療を必要とする患者に請求項14に記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
- 生物活性分子と組み合わせた、請求項13に記載の二重特異性ABPを含有する、ABP。
- 一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織を検出する方法であって、検出可能な標識を結合させたABPと請求項13に記載の細胞又は組織を接触させること及び前記標識を検出することを含み、細胞又は組織に会合する前記標識の検出は、ABPが結合する一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織の存在を示す、前記方法。
- 単一のアミノ酸における抗原結合ポリペプチドへの共有結合により連結される水溶性ポリマーを含有する抗原結合ポリペプチド。
- 少なくとも1個のリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有し、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、リボソームにおいてポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸の官能基を介してポリペプチドに結合する、抗原結合ポリペプチド。
- 一つ以上の非天然コードアミノ酸に結合している、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有しており、前記非天然コードアミノ酸が、リボソームにおいて事前選択部位でポリペプチドに取り込まれる、抗原結合ポリペプチド。
- 抗原結合ポリペプチドの免疫原性を調節する方法(該方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。)。
- ポリペプチドが配列番号19、21、23、24、26、28、30、31又はそれらの断片からなる群から選択される、抗原結合ポリペプチド。
- 抗原結合ポリペプチドが変性条件下で、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結される、請求項3に記載の抗原結合ポリペプチド。
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