DE19735593C2 - Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie - Google Patents

Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie

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Description

Die Erfindung betrifft einen Hüllprotein-modifizierten Baculovirus-Vektor für die Gentherapie; Anwendungsgebiete sind die Medizin, die Biotechnologie und die Gentechnik.
In den vergangenen Jahren sind zahlreiche Methoden und Vektoren für die Gentherapie entwickelt worden (Übersicht in Mulligan/1993/Science 260, 926). Dabei werden viele Vektoren, vor allem solche, die von Retroviren oder Adenoviren abgeleitet sind, favorisiert. Beide Virus-Vektortypen sind relativ breit anwendbar, wobei retrovirale Vektoren nur bei teilungsfähigen Zellen effektiv sind und Adenoviren auch bei ruhenden Zellen funktionieren. Beide Vektortypen sind zwar für die Genübertragung in Leberzellen (Hepatozyten) in vitro geeignet, können aber für eine in vivo Anwendung zur Gentherapie beim Menschen kaum in Betracht gezogen werden. Während für die Anwendung retroviraler Vektoren eine Leberteilresektion zur Stimulierung von Zellteilung (Regeneration) erforderlich wird, ist der adenovirale Gentransfer nicht sehr stabil (keine Integration in das Genom).
Alternative Vektoren mit potentieller Anwendbarkeit für den Lebergentransfer basieren auf Liposomen oder auch auf Multikomponenten-Partikeln mit Proteindomänen, die spezifisch an bestimmte Rezeptoren der Leber (z. B. Asialoglykoprotein- Rezeptor) binden und durch deren Internalisierung in die Zelle aufgenommen werden können (Übersicht in: Versland et al /1992/­ Seminars in Liver Disease 12, 332). Ein wesentlicher Nachteil dieser Vektoren besteht in der Aufnahme über den endozytotischen Weg der zu einer Degradation eines großen Teils der Vektoren und ihrer DNA in den Endosomen führt, so daß nur wenig funktionsfähige DNA den Zellkern erreichen kann. Eine Lösung für dieses Problem wurde zwar für die in vitro Anwendung gefunden; diese ist aber nicht auf die Situation in vivo (am Patienten) anwendbar. Sie basiert auf der gleichzeitigen Infektion der Zielzellen mit Adenovirus, was zur Auflösung der Endosomen und Freisetzung von Vektor (DNA) führt (Curiel, D. T., Agrawal, S., Wagner, E. und Cotten, M./1991, PNAS 88, 8850-8854).
In DE 44 07 859 wurde ein Baculovirus-Vektor vorgeschlagen, der therapeutische Gene hochspezifisch und effektiv in Leberzellen transferieren kann. Baculoviren gehören zu einer Familie großer DNA-Viren, deren Wirtsspektrum natürlicherweise ausschließlich auf Arthropoden beschränkt ist. Ihr Genom (80 kbp-200 kpb) ist in flexible Nukleokapside verpackt, die die Insertion großer Mengen Fremd-DNA ermöglicht.
Die entscheidende Voraussetzung für den baculoviralen Gentransfer in Säugerzellen ist die Insertion einer in Säugerzellen funktionsfähigen Expressionskassette. Damit wurde eine wichtige Voraussetzung für eine Therapie genetischer Erkrankungen der Leber geschaffen.
Die Effektivität des Gentransfers in Hepatozyten durch Baculovirus-Vektoren wird allerdings durch Serumkomponenten reduziert (Sandig et al., 1996; Hum. Gen. Ther. 7: 1937-1945). Diese Reduktion des Gentransfers ist vermutlich auf die Inaktivierung des Baculovirus-Vektors durch das Komplementsystem zurückzuführen und schränkt seinen therapeutischen Einsatz in vivo erheblich ein.
In WO 96/09074 A1 werden Baculovirus Vektoren beschrieben, um Gene in Säugerzellen zu exprimieren. Diese Vektoren sind allerdings nicht für die Anwendung geeignet, da die Hülle nicht spezifisch modifiziert ist, um Serumresistenz und Wirtsspektrum zu erreichen.
Aufgabe dieser Erfindung war deshalb die Konstruktion eines Baculovirus- Vektors, der durch Modifikation der Virushülle der Inaktivierung durch Serumkomponenten entkommt und therapeutische Gene hochspezifisch und effektiv in Leberzellen in vivo transferiert.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1 und 13 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Die dieser Erfindung zugrunde liegenden Technologien zur Generation Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektoren resultieren in einem breiten Spektrum neuartiger Vektoren, die durch Mutation und Selektion oder gezielte Modifizierung der Baculovirushülle (Insertion von Rezeptorliganden) auch eine Veränderung des Wirtsspektrums zum spezifischen "Targeting" von Nicht-Leberzellen ermöglichen. Das gesamte Spektrum an Baculovirus-Vektoren, das im Rahmen dieser Erfindung generiert wurde, soll eine Lösung für die Vielfalt von Ansprüchen an einen Vektor für die Gentherapie darstellen und für entsprechende Anwendungen am Menschen einsetzbar sein.
Als therapeutische DNA-Sequenz für den erfindungsgemäßen Vektor wird die cDNA eines Gens verwendet, das bei der zu behandelnden Krankheit defekt ist, d. h. fehlt oder durch Mutation verändert ist. Man kann auch einen Teil einer genomischen Sequenz einsetzen, die eine Mutation im Zielgen überspannt und mit dieser homolog rekombinieren kann.
Als Promotoren dienen in erster Linie starke virale Promotoren, vorzugsweise der sehr frühe Promoter des Cytomegalievirus (CMV). Ebenfalls in Betracht kommen zelltyp­ spezifische Promotoren.
Die Etablierungssequenz hat die Aufgabe, für eine Stabilisierung des Vektors in der Zelle ohne Integration in das Genom zu sorgen. Sie wird besonders in den Fällen verwendet, wenn eine Langzeitexpression erforderlich ist. Bevorzugte Etablierungssequenzen gemäß der Erfindung sind virale Kernetablierungssequenzen, wie die des Epstein-Barr- Virus, oder autonome Replikationssequenzen aus dem Säugergenom.
Die Herstellung der neuen Vektoren erfolgt in den folgenden wesentlichen Schritten:
  • A) Methode durch Mutagenese und Selektion (Anspruch 2, Ausführungsbeispiel 1):
    • 1. Mutagenisierung von Baculoviren durch Bromdesoxyuridin
    • 2. Inkubation der mutagenisierten Viren mit Serum
    • 3. Isolierung einzelner Virusklone durch Plaque-assay auf Insektenzellen
    • 4. Screening auf Serumresistenz und Infektionsspektrum
  • B) Methode durch Insertion modifizierter Hüllproteine (Anspruch 3-6, Ausführungsbeispiel 2):
    • 1. Klonierung der Sequenz eines N-terminal modifizierten Baculovirus-Hüllproteins (gp64) unter Kontrolle eines baculoviralen Promoters in einem Rekombinationsvektor
    • 2. 
    • 3. 
      • 1. Integration des Konstrukts in den Rekombinationsvektor, der die therapeutischen DNA-Sequenz zusammen mit dem Promoter enthält
      • 2. ggf. Einfügung einer Etablierungssequenz vor oder nach der Klonierung
      • 3. Transfektion des erhaltenen Konstrukts gemeinsam mit der DNA eines Insektenvirus in Insektenzellen und
      • 4. Gewinnung des in den Insektenzellen verpackten Vektors aus dem Überstand der Insektenzellkultur.
    • 4. 
      • 1. Stabile Integration des Konstrukts in die Virusverpackungszelle
      • 2. Gewinnung des Hüllprotein-modifizierten Baculovirus-Vektors durch Vermehrung eines unmodifizierten Vektors mit therapeutischer Expressionskassette in Insektenzellen
Durch diese Erfindung wird ein neuartiger Vektor für den Gentransfer geschaffen, der gegenüber den bisher entwickelten Virusvektoren (Retroviren, Adenoviren und unmodifizierte Baculoviren) erhebliche Vorteile bietet. Dazu gehören die Stabilität in Blut und Serum, die Leberspezifität bzw. freie Variierung des Zelltargetings, die fast unbegrenzte Möglichkeit, Fremd-DNA einzubauen, die Infektion nicht teilungsfähiger Zellen, die fehlende Cytotoxität und die einfache Generierung hochtitriger rekombinanter Viren.
Die Hüllprotein-modifizierten Baculovirus-Vektoren ermöglichen je nach Modifikation, ein gewünschtes Gen in das betroffene Organ eines Patienten einzuführen und seinen Weg zum Funktionsort optimal zu gestalten. Die Applikation des Vektors kann dabei lokal oder systemisch erfolgen. Dadurch wird eine wesentliche Voraussetzung für eine erfolgreiche Therapie genetischer und maligner Erkrankungen des Menschen geschaffen.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiel 1: I. Methode durch Mutagenese und Selektion (vgl. Abb. 1)
Der Gentransfer durch Baculoviren wird durch Serum reduziert (Stand der Technik).
Neue Baculovirus-Vektoren wurden durch Mutagenisierung von Baculoviren (109 pfu) durch Bromdesoxyuridin (50 mg/ml) in Insektenzellen hergestellt. 10 ml der Viren wurden mit 90 ml Serum 30 min bei 37°C inkubiert. Einzelne Virusklone wurden durch Plaque-assay auf Insektenzellen in bekannter Weise isoliert. Einzelene Virusplaques wurden bzgl. ihrer Infektionsfähigkeit in Leberzellen nach erneuter Serumbehandlung getestet. Das effektivste Virus erhielt den Namen Baculo-Serr. Viren mit verändertem Wirtsspektrum wurden ebenfalls isoliert.
Ausführungsbeispiel 2 (vgl. Abb. 2)
Es wird eine Sequenz für ein N-terminal modifiziertes Baculovirus-Hüllproteins (gp64) unter Kontrolle eines baculoviralen Promoters in einem Rekombinationsvektor in bekannter Weise kloniert. Die Modifizierung wird durch Insertion der DNA-Sequenz für Aminosäuren 1-320 des Komplement-Schutzproteins "decay accelerating factor (DAF)" zwischen die Signalsequenz und die Sequenz des Baculovirus- Hüllproteins gp64 auf DNA-ebene erreicht. Dieses Konstrukt wird entweder in den Rekombinationsvektor, der die therapeutischen DNA-Sequenzen zusammen mit dem Promoter enthält, kloniert oder stabil in die Virusverpackungszelle integriert. Bei der Virusproduktion wird das modifizierte Hüllprotein in die Hülle des Baculovirus-Vektors inseriert und vermittelt dadurch:
  • - Serum-Resistenz durch Insertion von Komplement- Schutzproteinen oder Glykosyltransferasen laut Ansprüchen 2 und 3 sowie 6 und 7,
  • - Zelltyp-spezifische Infektion außerhalb der bereits nachgewiesenen Leberzellspezifität durch Insertion spezifischer Rezeptorliganden laut Ansprüchen 4 und 5.

Claims (13)

1. Vektor für die Gentherapie, bestehend aus einem Baculovirus, welches die Komponenten
  • 1. modifizierte Virus-Hüllproteine
  • 2. eine therapeutische DNA-Sequenz und
  • 3. einen Promoter für die Expression in Säugerzellen enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikation der Virus-Hüllproteine eine Serumresistenz oder ein verändertes Wirtsspektrum bewirkt.
2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Virus-Hüllproteine durch spezifische Insertion von Komplement-Schutzproteinen modifiert sind.
3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Komplement-Schutzproteine DAF (decay-accelerating factor, CD55), MCP (membrane cofactor protein, CD46), CD 59 (protectin) oder Kombinationen dieser sind.
4. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Virus-Hüllproteine durch einen spezifischen Rezeptorliganden modifiert sind.
5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Rezeptorliganden Heregulin, Steel Faktor, CD4 oder Transferrin sind.
6. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Virus-Hüllproteine durch Veränderung des Glykosylierungsmusters modifiziert sind.
7. Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung des Glykosylierungsmusters durch Gykosyltransferasen vermittelt ist.
8. Vektor nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Virus-Hüllproteine durch Vermittlung entsprechend eingebrachter DNA-Sequenzen in das Virusgenom oder durch stabiles Einbringen der notwendigen DNA-Sequenzen in die virusverpackende Zellinie modifiziert sind.
9. Vektor nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß als therapeutische DNA-Sequenz die cDNA oder die genomische DNA-Sequenz des Gens oder der Gene enthalten sind, die bei der zu behandelten Krankheit defekt sind oder ein Teil einer genomischen Sequenz, die eine Mutation im Zielgen überspannt und eine Korrektur des Gendefekts mittels homologer Rekombination bewirkt.
10. Vektor nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß der Promoter für die Expression in Säugerzellen ein starker viraler oder ein zelltyp-spezifischer Promoter ist.
11. Vektor nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Etablierungssequenz enthalten ist.
12. Vektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Etablierungssequenz eine virale Kernetablierungssequenz, insbesondere die des Epstein-Barr Virus, oder eine autonome Replikationssequenz ist.
13. Verfahren zur Herstellung des Vektors nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Hüllproteine von Baculovirus durch Mutation und Selektion auf Serumresistenz bzw. verändertes Wirtsspektrum oder durch Insertion der für die Modifikation notwendigen DNA-Sequenzen in das Baculovirus-Genom oder in die Vektor-produzierenden Insektenzelle, verändert werden,
die therapeutische DNA-Sequenz zusammen mit dem Promoter und ggf. einer Etablierungssequenz ebenfalls in das Baculovirusgenom inseriert und der Vektor aus dem Überstand der Insektenzellkultur gewonnen wird.
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