DE69936577T2

DE69936577T2 - Lentivirale Verpackungszellen

Info

Publication number: DE69936577T2
Application number: DE69936577T
Authority: DE
Inventors: Philippe Cambridge LEBOULCH; Karen Reading WESTERMAN
Original assignee: Genetix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Bluebird Bio Inc
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-13
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2019-05-14
Also published as: WO1999058701A1; DE69936577D1; US6955919B2; EP1076715A1; AU3988799A; ES2291025T3; US6365150B1; CY1107760T1; US20020168346A1; ATE367447T1; EP1076715B1; US8034620B2; US7311907B2; PT1076715E; US20050170507A1; CA2328404C; US20080187997A1; CA2328404A1; DK1076715T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Der Erfolg von Gentherapie-Techniken hängt in hohem Maße von der Fähigkeit ab, eine Kombination aus einer stabilen Integration in die Chromosomen und einer hoch effizienten regulierten Expression der transferierten Gene auf für den Menschen sichere Weise zu erzielen. Mit vielen der derzeitigen Techniken lässt sich mit großen DNA-Fragmenten in vitro und in vivo eine wirksame vorübergehende Transfektion von Zellen durchführen. Die nachfolgende Integration in die Chromosomen ist jedoch sehr ineffizient. Um die geringen Integrationsgrade zu umgehen, können retrovirale Vektoren eingesetzt werden, welche sich sehr wirksam in empfängliche Zellen integrieren.
Während rekombinante retrovirale Vektoren die Integration eines Transgens in das Genom von Wirtszellen gestatten, können die meisten Retroviren nur sich teilende Zellen transduzieren, was ihre Verwendung für einen Gentransfer in vivo auf nicht proliferierende Zellen wie z.B. Hepatozyten, Muskelfasern, hämopoetische Stammzellen und Neuronen einschränkt. Sich nicht teilende Zellen stellen im Körper den vorwiegenden langlebigen Zelltyp dar und sind die am meisten gewünschten Ziele für einen Gentransfer, einschließlich Leber, Muskel und Hirn. Selbst Ausführungen, bei denen die Transduktion von hämopoetischen Stammzellen versucht wird, erfordern anspruchsvolle ex vivo-Techniken, um in diesen Zellen vor einer Infektion eine Zellteilung auszulösen.
Ein Weg, dieses Hindernis zu umgehen, besteht darin, an Stelle konventioneller retroviraler Vektoren lentivirale Vektoren zu verwenden. Lentiviren sind komplexe Retroviren, die sich auf Grund ihres höheren Komplexitätsgrades in das Genom von nicht proliferierenden Zellen integrieren und wie während einer latenten Infektion deren Lebenszyklen modulieren können. Diese Viren umfassen HIV-1, HIV-2 und SIV. Wie andere Retroviren verfügen Lentiviren über gag-, pol- und env-Gene, die von zwei langen endständigen Sequenzwiederholungen (LTR) flankiert werden. Jedes dieser Gene codiert multiple Proteine, welche am Anfang als ein Vorläufer-Polyprotein exprimiert werden. Das gag-Gen codiert die inneren Strukturproteine (Matrix, Capsid und Nucleocapsid). Das pol-Gen codiert die durch RNA gelenkte DNA-Polymerase (reverse Transkriptase, Integrase und Protease). Das env-Gen codiert die viralen Hüll-Glykoproteine und enthält zusätzlich ein für den Kern-Export von viraler RNA verantwortliches cis-acting Element (RRE). Die 5'- und 3'-LTRs dienen der Promotion von Transkription und Polyadenylierung der Virion-RNAs. Die LTR enthält alle anderen für die virale Replikation benötigten cis-acting Sequenzen. Neben der 5'-LTR befinden sich Sequenzen, welche für die reverse Transkription des Genoms (Bindungsstelle für den tRNA-Primer) und für eine effiziente Enkapsidierung der viralen RNA in Partikel benötigt werden (die psi-Stelle). Falls in dem viralen Genom die für die Enkapsidierung (oder Verpackung von retroviraler RNA in infektiöse Virionen) benötigten Sequenzen fehlen, ist das Ergebnis ein cis-Defekt, welcher eine Enkapsidierung von genomischer RNA verhindert. Die erhaltene Mutante ist jedoch immer noch in der Lage, die Synthese aller Virion-Proteine zu dirigieren. Ein zusammenfassender Überblick zu Lentiviren wie HIV ist z.B. in Field's Virology (Raven Publishers), Hrg. B.N. Fields et al., ^©1996 enthalten.
Zusätzlich zu gag, pol und env weisen Lentiviren, anders als andere Retroviren, verschiedene "akzessorischen" Gene mit einer Regulator- und Strukturfunktion auf. Speziell verfügt HIV-1 über mindestens sechs solcher Gene, nämlich Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu und Nef. Das nahe verwandte HIV-2 codiert nicht für Vpu, es codiert aber für ein anderes nicht verwandtes Protein Vpx, das in HIV-1 nicht gefunden wurde.
Das Vpr-Gen codiert ein Protein von 14 kD (96 Aminosäuren) (Myers et al. (1993) Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos National Laboratory, (N.M.). Das offene Leseraster von Vpr kommt auch in den meisten HIV-2- und SIV-Isolaten vor. Ein Vergleich der Aminosäuren zwischen HIV-2-Vpr und HIV-2-Vpx zeigt Bereiche großer Homologie, was nahe legt, dass das Vpx durch Verdopplung des Vpr-Gens entstanden sein könnte (Myers et al. (1993), supra). Vpr und Vpx kommen in reifen Viruspartikeln in mehrfachen Kopien vor und es ist gezeigt worden, dass sie sich an das p6-Protein binden, das einen Teil des von gag codierten Vorläufer-Polyproteins darstellt, welches beim Aufbau der Viren eine Rolle spielt ( WO 96/07741 ; WO 96/32494 ). Somit erfolgt der Einbau von Vpr und Vpx in Viruspartikel über die Wechselwirkung mit p6 (Lavallee et al. (1994) J. Virol. 68: 1926–1934 und Wu et alo. (1994) J. Virol. 68: 6161). Es ist ferner gezeigt worden, dass Vpr sich besonders mit dem carboxyendständigen Abschnitt von p6 verbindet. Die genaue Rolle von Vpr und Vpx muss jedoch noch eindeutig bestimmt werden, die bis heute gewonnenen Daten legen jedoch nahe, dass diese Proteine im Frühstadium einer Infektion eine Rolle spielen. Es ist auch gezeigt worden, dass Vpr und Vpx, welche bezüglich des HIV-Genoms in trans expimiert werden, eingesetzt werden können, um mit dem HIV-Virus heterologe Proteine anzusteuern ( WO 96/07741 ; WO 96/32494 ). Eine Beschreibung der Struktur und Funktion von Vpr und Vpx einschließlich der vollständigen Nucleotid- und Aminosäuresequenzen dieser Proteine sowie ihrer Bindungsdomänen stehen auch sowohl in WO 96/07741 als auch in Zhao et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(22): 1577 (Vpr); Mahalingham et al. (1995) Virology 207: 297 (Vpr) und Hu et al. (1989) Virology 173: 624) (Vpx). Andere relevante Schriften zu Vpr sind z.B. Kondo et al. (1995) J. Virol. 69: 2759; Lavallee et al. (1994) J. Virol. 68: 1926 und Levy et al. (1993) Cell 72: 541). Andere relevante Schriften zu Vpx sind z.B. Wu et al. (1994) J. Virol. 68: 6161. Alle der obigen Schriften werden hiermit als Referenz eingeführt.
Angesichts der Vorteile, die in der Gentherapie mit retroviralen Vektoren, insbesondere mit Lentiviren verbunden sind, welche in der Lage sind, sich nicht teilende Zelle zu infizieren, wären verbesserte Verfahren zur Erzeugung von reinen Vorräten an einem rekombinanten Virus, welche frei von einem replikations-kompetenten Helfervirus sind, im Stand der Technik von großem Wert. Im Allgemeinen werden rekombinante Retroviren gewonnen, indem ein geeigneter proviraler DNA-Vektor in Säugerzellen ("Verpackungszellen") eingeführt wird, welche die für eine Enkapsidierung der gewünschten rekombinanten RNA benötigten viralen Proteine produzieren, denen aber das Signal für die Verpackung von viraler RNA (Ψ-Sequenz) fehlt. Während die erforderlichen gag-, pol- und env-Gene des Retrovirus intakt sind, wird somit von diesen Verpackungslinien kein Wildtyp-Helfervirus freigesetzt. Werden die Zellen jedoch mit einem getrennten Vektor transfiziert, der die für das Verpacken benötigte Ψ-Sequenz enthält, kann durch Rekombination ein Wildtyp-Helfervirus entstehen (Mann et al. (1983) Cell 33: 153). Dies stellt, insbesondere im Falle von Lentiviren wie HIV, eine Hauptgefahr dar.
Die derzeitigen Ansätze zur Verhinderung von Sicherheitsgefahren, die mit einer Rekombination einhergehen, welche zur Erzeugung eines rekombinations-kompetenten Helfervirus führt, umfassen die Ausführung zusätzlicher Mutationen (z.B. LTR-Deletionen) in den zur Erzeugung von Verpackungs-Zelllinien eingesetzten viralen Konstrukten sowie die Abtrennung der viralen Gene, welche für die Produktion von Virionen auf gesonderte Plasmide notwendig sind. Es wurde beispielsweise vor kurzem gezeigt, dass das rekombinante murine Moloney-Leukämie-Virus (MuLV), das frei von einem nachweisbaren Helfervirus ist, erzeugt werden kann, wenn in den Verpackungszellen das gag- und das pol-Gen von dem env-Gen abgetrennt werden (Markowitzet al. (1988) J. Virol. 62(4): 1120). Diese Verpackungszellen enthielten zwei getrennte Plasmide, welche zusammen die für die Virion-Produktion benötigten viralen Proteine codierten, was die Wahrscheinlichkeit verringerte, dass Rekombinationsereignisse, welche für die Erzeugung eines intakten Retrovirus notwendig sind (d.h. zwischen drei Plasmid-Vektoren), auftreten würden, wenn mit einem das Ψ-Verpackungssignal enthaltenden dritten Vektor cotransfiziert wird.
Zusätzliche Verfahren zur Herstellung von sichereren Verpackungs-Zelllinien für Retroviren, insbesondere von Verpackungs-Zelllinien für Lentiviren, welche ein rekombinantes Retrovirus erzeugen, jedoch nicht selbst entweder ein nachweisbares Helfervirus hervorbringen oder virale Gene transferieren, würden in der Gentherapie beim Menschen von großem Wert sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Verpackungs-Zelllinien zur Verfügung, welche ein rekombinantes Retrovirus produzieren, das frei von einem nachweisbaren Helfer-Virus ist. Die von den Zelllinien der Erfindung produzierten Retroviren umfassen Lentiviren wie HIV, die in der Lage sind, heterologe DNA auf ein breites Spektrum von sich nicht teilenden Zellen zu transferieren. Neben anderen Vorteilen bieten die Verpackungszellen den Vorteil einer größeren Sicherheit, wenn sie in der Gentherapie beim Menschen eingesetzt werden, indem sie praktisch die Möglichkeit einer molekularen Rekombination ausschalten, welche zur Produktion eines replikations-kompetenten Helfervirus führt.
In einer Ausführungsform sieht die Erfindung eine retrovirale Verpackungs-Zelllinie vor, welche zumindest drei getrennte Expressionsvektoren enthält, die zusammen gag-, pol- und env-Polyproteine codieren und bei welchen, anders als bei anderen Verpackungs-Zelllinien, die gag- und pol-Gene zumindest teilweise auf unterschiedliche Vektoren verteilt sind, um die Wahrscheinlichkeit einer zur Produktion eines replikations-kompetenten Helfervirus führenden Rekombination mit anderen retroviralen Vektoren in der Zelle zu verringern. Der erste als pgag^pol bezeichnete Vektor codiert das vollständige gag-Polyprotein (welches die virale Matrix, das Capsid und Nucleocapsid-Proteine wie p17, p24, p9 und p6 enthält) und codiert in bestimmten Ausführungsformen auch einen Teil des pol-Polyproteins (welches virale Poloymerase-Proteine wie die Protease, die reverse Transkriptase und die Integrase enthält). In einer Ausführungsform umfasst der zusammen mit gag im ersten Vektor codierte Anteil von pol das Protease-Protein (PR). In den meisten lentiviralen Genomen wird PR von einem pol-Abschnitt codiert, der mit gag überlappt (siehe 5). In dieser Ausführungsform codiert der erste Vektor daher gag und den Abschnitt von pol, der im lentiviralen Genom (z.B. von HIV) mit gag überlappt. Andere überlappende oder nicht überlappende Abschnitte von pol können auch mit gag auf dem ersten Vektor enthalten sein. In einer anderen Ausführungsform jedoch sind gag und pol vollständig voneinander getrennt, so dass der erste Vektor alles gag und keinen Anteil von pol codiert.
Der zweite als pVpr-RTIN bezeichnete Vektor ergänzt den ersten Vektor pgag^pol, indem er den (die) restlichen Abschnitt(e) des nicht von pgag^pol codierten Polyproteins codiert. Das pol-Protein umfasst eine Protease (PR), eine reverse Transkriptase (RT) und eine Integrase (IN). In dem Falle, wenn pgag^pol die PR codiert, codiert somit der zweite Vektor vorzugsweise die RT und die IN. Zusätzlich codiert der zweite Vektor ein Targeting-Protein, welches die codierten pol-Proteine (z.B. RT und IN) zu auf der Innenseite der Plasmamembran sich zusammensetzenden Virionen lenkt. Normalerweise wird pol über gag zu den sich zusammensetzenden Virionen gelenkt, da sie zusammen als ein großes gag-pol-Vorläufer-Polyprotein (z.B. Pr160^gag-pol) exprimiert werden. In den Vektoren der vorliegenden Erfindung jedoch sind gag und mindestens ein Teil von pol auf verschiedene Vektoren verteilt. Somit wird in der Erfindung ein Mittel verwendet, das den vom zweiten Vektor codierten pol-Abschnitt zu sich zusammensetzenden Virionen lenkt. Das Targeting-Mittel (z.B. ein Protein oder Peptid) wird vorzugsweise im Leseraster mit dem pol-Abschnitt codiert, so dass der Vektor als ein einzelnes Fusionsprotein exprimiert wird.
Jedes geeignete Targeting-Mittel, welches sich an eine Komponente von sich zusammensetzenden retroviralen Virionen (z.B. lentivirale gag-Proteine) bindet, kann vom zweiten Vektor codiert werden (z.B. zusammen mit einem pol-Abschnitt). Geeignete Targeting-Mittel sind z.B. Antikörper, Fragmente von Antikörpern, Proteine und Peptide. In einer Ausführungsform ist das Targeting-Protein entweder Vpr oder Vpx, einschließlich der Fragmente und Mutanten derselben, welche sich an das gag-Protein p6 binden. Somit codiert in einer Ausführungsform der zweite Vektor ein Vpr- oder Vpx-Fusionsprotein, welches Vpr oder Vpx (oder Peptide, Mutanten oder Varianten derselben) sowie einen Abschnitt von pol enthält, wobei der pol-Abschnitt vorzugsweise RT und IN umfasst. Innerhalb dieses Fusions-Konstrukts befindet sich vor RT und IN vorzugsweise eine Protease-Spaltstelle, so dass sie von der PR gespalten und aktiviert werden, wenn sie sich mit den sich zusammensetzenden Virionen erst einmal zusammengeschlossen haben.
Der als pENV bezeichnete dritte Vektor codiert ein virales env, welches ein oder mehrere Hüllproteine für die vom ersten und zweiten Vektor codierten Viruspartikel zur Verfügung stellt. In einer Ausführungsform stammt das virale env von einem Lentivirus wie z.B. HIV, SIV, FIV, EIV (z.B. gp120 und gp41). In einer anderen Ausführungsform stammt das virale env von VSV (z.B. das VSV-G-Glycoprotein, welches die von dem ersten und zweiten Vektor codierten rekombinanten Retrovirus-Partikel pseudotypisiert). In noch einer anderen Ausführungsform stammt das virale env von einem Retrovirus des Typs C, wie z.B. MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, GaLV und RSV.
Die oben beschriebenen ersten, zweiten und dritten Vektoren werden in geeignete Verpackungszellen wie z.B. die humanen Nierenzellen 293T cotransfiziert, um die neuen Verpackungs-Zelllinien der Erfindung zu produzieren. Wenn sie mit einem vierten Vektor cotransfiziert werden, der die notwendigen Ψ- und LTR-Sequenzen für das Verpacken von RNA in Viruspartikel enthält, produzieren die Zellen ein rekombinantes helferfreies Retrovirus. Entsprechend stellt die Erfindung in einer anderen Ausführungsform eine Produktions-Zelllinie zur Verfügung, welche einen als pΨ bezeichneten vierten Vektor enthält (zusammen mit dem ersten, zweiten und dritten Vektor). Der vierte Vektor umfasst ein retrovirales Verpackungssignal (Ψ), vorzugsweise zusammen mit einem ausgesuchten Transgen, das von langen endständigen Wiederholungssequenzen (LTRs) flankiert wird. Jeder der ersten, zweiten, dritten oder vierten Vektoren kann auch ein RNA-Export-Element, wie z.B. das HIV RRE, und/oder ein Marker-Gen enthalten, welche den Nachweis von positiven Zelltransformanten sowie eines unerwünschten Helfervirus ermöglichen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer Verpackungs-Zelllinie zur Verfügung, die zur Erzeugung eines rekombinanten, helferfreien Retrovirus befähigt ist. Das Verfahren umfasst die Transfektion einer geeigneten Wirtszelle mit, wie jeweils oben beschrieben, einem ersten Vektor, der ein retrovirales gag-Polyprotein (in bestimmten Ausführungsformen) zusammen mit einem Abschnitt eines retroviralen pol-Proteins codiert, einem zweiten Vektor, der den Rest des retroviralen pol-Polyproteins codiert, welcher nicht von dem an ein Vpr- oder Vpx-Protein fusionierten ersten Vektor codiert wird, und einem dritten Vektor, der ein virales env-Protein codiert. Die ersten, zweiten und dritten Vektoren enthalten jeweils einen Promotor, der funktionsfähig an ein Gen gebunden ist, welches das gag-Polyprotein, das pol-Polyprotein, das Vpr-Protein, das Vpx-Protein oder das env-Protein codiert. In einer Ausführungsform ist der Promotor ein induzierbarer Promotor, der in den Verpackungszellen eine selektive Expression des gag-Polyproteins, des pol-Polyproteins, des Vpr-Proteins, des Vpx-Proteins oder des env-Proteins gestattet.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten Retrovirus zur Verfügung, indem eine Wirtszelle cotransfiziert wird mit einem ersten Vektor, der ein retrovirales gag-Gen und (in bestimmten Ausführungsformen) einen Abschnitt eines retroviralen pol-Gens umfasst, wobei beide funktionsfähig an einen Promotor gebunden sind; mit einem zweiten Vektor, der den nicht im ersten Vektor enthaltenen ganzen restlichen Abschnitt des retroviralen pol-Gens sowie ein Gen umfasst, das ein Vpr- oder ein Vpx-Protein ganz oder nur einen Abschnitt davon codiert, wobei die Gene funktionsfähig an einen Promotor gebunden sind und als ein einzelnes Fusionsprotein exprimiert werden; mit einem dritten Vektor, der ein virales env-Gen umfasst; und mit einem vierten Vektor, der ein virales Verpackungssignal, eine virale lange endständige Wiederholung (LTR) und vorzugsweise ein Transgen umfasst, wie sie alle jeweils oben beschrieben wurden. Nach der Cotransfektion des ersten, zweiten, dritten und vierten Vektors in geeignete Zellen kann das Virus wieder aus dem Zellkulturmedium gewonnen werden.
Die Verpackungs-Zelllinien der Erfindung und die von diesen Zelllinien produzierten rekombinanten Retroviren (z.B. HIV und SIV) können dazu verwendet werden, um auf sichere und effiziente Weise heterologe Nucleinsäuren (z.B. therapeutische Transgene) an sich teilende und sich nicht teilende Zellen zu liefern. Sie können z.B. eingesetzt werden, um Zielzellen mit einer gewünschten DNA in vitro zu transformieren. Zusätzlich lassen sie sich in vivo einsetzen, um therapeutische Gene an Zellen zu liefern (z.B. in Verfahren der Gentherapie beim Menschen), ohne die Gefahr einer Rekombination, die zu dem produzierenden replikations-kompetenten Helfervirus führt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Karte des Plasmids pgag^pol, welches in der Verpackungs-Zelllinie der Erfindung verwendet wurde. Das Plasmid enthält upstream zu einem HIV-gag und einem mutierten pol-Gen den CMV-Promotor. Das pol-Gen ist mutiert (z.B. durch Deletion oder ortsgerichtete Mutagenese, um die codierende Sequenz zu verändern), um die Expression von mindestens einem Abschnitt des pol-Polyproteins, vorzugsweise der reversen Transkriptase (RT) und der Integrase (IN), zu verhindern. Vorzugsweise ist auch pol mutiert, um die Expression von akzessorischen Genen zu verhindern.
2 zeigt eine Karte des Plasmids pVpr-RTIN, welches in der Verpackungs-Zelllinie der Erfindung verwendet wurde. Das Plasmid enthält den induzierbaren RSV-LTR-Promotor upstream zu einem Vpr-Fusionsgen, welches Vpr und mindestens einen Abschnitt von HIV pol codiert, das in dem Plasmid pgag^pol mutiert ist. Somit ergänzt das pVpr-RTIN die mutierte, pgag^pol codierende Sequenz im pgag^pol. Vorzugsweise codiert pVpr-RTIN sowohl ein Fusionsprotein, das Vpr enthält, gefolgt von einer Protease-Spaltstelle unmittelbar upstream von RT und IN, als auch das HIV-RNA-Export-Element RRE, das so platziert ist, dass es zusammen mit Vpr, RT und IN transkribiert wird, wie dies alles ich 2 gezeigt wird.
3 zeigt eine Karte der in der Verpackungs-Zelllinie der Erfindung verwendeten Plasmide pENV und pΨ. Das Plasmid pENV enthält upstream von einem Gen, welches das VSVg-Glykoprotein codiert, den induzierbaren RSV-LTR-Promotor. Dieses Plasmid stellt ein pseudotypisiertes Hüllprotein für das rekombinante Retrovirus zur Verfügung. Das Plasmid pΨ enthält, von 5' nach 3', eine 5'-LTR, das HIV-Verpackungssignal (Ψ), ein mRNA-Export-Element (RRE von HIV), den CMV-Promotor, ein Markergen (GFP) und eine 3'-LTR. Die 5'-LTR (links) ist vorzugsweise eine Hybrid-LTR, welche in Kombination mit Abschnitten einer MuLV-LTR oder des CMV-Promotors minimale HIV-LTR-Sequenzen enthält. Die 3'-LTR (rechts) ist ebenfalls vorzugsweise ein Hybrid-Promotor, welcher in Kombination mit einer nicht-lentiviralen PolyA-Sequenz (z.B. aus dem β-Globin-Gen des Kaninchens) minimale HIV-LTR-Sequenzen enthält.
4 zeigt die Molekülstruktur des HIV-Virus mit den env-Proteinen (gp41 und gp120), den gag-Proteinen (p7/p9, p17 und p24) und den pol-Proteinen (IN, RT).
5 zeigt eine Karte des Genoms von HIV-1 mit der 5'-LTR, gag, pol, env, der 3'-LTR und den akzessorischen Genen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Anders als andere retrovirale Verpackungs-Zelllinien enthalten die von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten Zelllinien getrennte Expressionsvektoren, welche zumindest Abschnitte der gag-, pol- und env-Polyproteine codieren. Durch die Aufteilung von allen oder von Abschnitten der gag-, pol- und env-Gene auf drei getrennte Plasmide wird das Risiko einer molekularen Rekombination in den Verpackungszellen zur Produktion eines replikations-kompetenten Hefervirus praktisch ausgeschaltet. Außer dem Vorteil, dass eine stabile Genom-Integration der DNA in einem breiten Spektrum von sich teilenden und nicht teilenden Zellen ermöglicht wird, sind die retroviralen Verpackungszellen der Erfindung folglich für einen Einsatz in der Gentherapie beim Menschen sicherer.
DEFINITIONEN
Die folgenden hier zur Beschreibung der Erfindung verwendeten Ausdrücke und Begriffe sollen die unten ausgeführten Bedeutungen haben.
Der Begriff "retrovirale Verpackungs-Zelllinie" bezieht sich auf eine Zelllinie (typischerweise eine Zelllinie von Säugern), welche über die notwendigen codierenden Sequenzen verfügt, um Viruspartikel zu produzieren, denen die Fähigkeit fehlt, RNA zu verpacken und ein replikations-kompetentes Helfervirus zu produzieren. Wenn die Verpackungsfunktion in der Zelllinie vorgesehen ist (z.B. in trans), produziert die Verpackungs-Zelllinie ein rekombinantes Retrovirus, wodurch sie zu einer "retroviralen Produzenten-Zelllinie" wird.
Der Ausdruck "Retrovirus" bezieht sich auf jedes bekannte Retrovirus (z.B. Retroviren des Typs C wie das murine Moloney-Leukämie-Virus MoMuLV), das murine Harvey-Sarkom-Virus (HaMuSV), das murine Mammary-Tumor-Virus (MuMTV), das Gibbonaffen-Laukämie-Virus (GaLV), das feline Leukämie-Virus (FLV) und das Rous-Sarkom-Virus (RSV)). Die "Retroviren" der Erfindung umfassen auch die humanen T-Zell-Leukämie-Viren HTLV-1 und HTLV-2 sowie die Lentivirus-Familie der Retroviren, wie z.B. die humanen Immunodefizienz-Viren HIV-1, HIV-2, das Affen-Immunodefizienz-Virus (SIV), das feline Immunodefizienz-Virus (FIV), das Pferde-Immunodefizienz-Virus (EIV) sowie andere Klassen von Retroviren.
Die Ausdrücke "gag-Polyprotein", "pol-Polyprotein" und "env-Polyprotein" beziehen sich auf die von dem retroviralen gag- pol- bzw. env-Gen codierten multiplen Proteine, die typischerweise als einzelnes Vorläufer-"Polyprotein" exprimiert werden. Das HIV-gag codiert z.B. neben anderen Proteinen p17, p24, p9 und p6. Das HIV pol codiert neben anderen Proteinen die Protease (PR), die reverse Tanskriptase (RT) und die Integrase (IN). Das HIV-env codiert neben anderen Proteinen Vpu, gp120 und gp41. Der hier verwendete Ausdruck "Polyprotein" soll die gesamten oder jeden Abschnitt der gag-, pol- und env-Polyproteine umfassen.
Die Ausdrücke "Vpx" und "Vpr" betreffen die lentiviralen Proteine VPx bzw. Vpr, welche z.B. in der Patentanmeldung WO 96/07741 beschreiben werden, die hiermit vollständig als Referenz eingeführt wird. Diese Ausdrücke beziehen sich auch auf Fragmente, Mutanten, Homologe und Varianten von Vpr und Vpx, welche die Fähigkeit beibehalten., sich mit p6 zu verbinden.
Der Ausdruck "Fusionsprotein" bezieht sich auf ein Molekül mit zwei oder mehr miteinander verbundenen Proteinen. Das Fusionsprotein ist typischerweise eine Aminosäuresequenz, welche zwei oder mehr Proteinsequenzen umfasst.
Der Ausdruck "Vektor" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nucleinsäure, an welche es gebunden worden ist, zu transportieren. Der Ausdruck "Expressionsvektor" umfasst jeden Vektor (z.B. ein Plasmid, Cosmid oder Phagenchromosom), der ein Genkonstrukt in einer für die Expression durch eine Zelle geeigneten Form enthält (z.B. gebunden an einen Promotor). In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" untereinander austauschbar verwendet, da ein Plasmid eine gewöhnlich eingesetzte Form für einen Vektors ist. Darüber hinaus soll die Erfindung noch andere Vektoren umfassen, welche äquivalente Funktionen ausüben.
Der Ausdruck "Transgen" bedeutet eine Nucleinsäuresequenz, (z.B ein therapeutisches Gen), welche teilweise oder ganz heterolog, d.h. für eine Zelle, in welche sie eingeführt wird, fremd ist oder sie ist homolog zu einem endogenen Gen der Zelle, in welche sie eingeführt wird, wobei sie aber so konzipiert ist, dass sie in das Genom der Zelle so insertiert wird, dass sie das Genom der Zelle verändert (sie wird z.B. an einem Ort insertiert, der sich von dem des normalen Gens unterscheidet, oder ihre Insertion führt zu einem "Knockout"). Ein Transgen kann eine oder mehrere transkriptionelle regulatorische Sequenzen und jede andere Nucleinsäure wie z.B. Introns umfassen, welche für eine optimale Expression einer ausgewählten Nucleinsäure notwendig sein können.
Die Ausdrücke "Transformation" und "Transfektion" bedeuten die Einführung einer Nucleinsäure wie z.B. eines Expressionsvektors in eine Empfängerzelle.
Der Ausdruck "RNA-Export-Element" bezieht sich auf ein cis-wirkendes posttranskriptionelles regulatorisches Element, welches den Transport eines RNA-Transkripts vom Kern zum Cytoplasma einer Zelle reguliert. Beispiele für RNA-Export-Elemente sind, jedoch nicht ausschließlich, das rev-Response-Element (RRE) (siehe z.B. Cullen et al. (1991) J. Virol. 65: 1053 und Cullen et al. (1991) Cell 58: 423–426) und das posttranskriptionelle regulatorische Element des Hepatitis B-Virus (PRE) (siehe z.B. Huang et al. (1995) Molec. and Cell Biol. 15(7): 3864–3869; Huang et al. (1994) J. Virol. 68(5): 3193–3199; Huang et al. (1993) Molec. and Cell Biol. 13(12): 7476–7486 sowie das US-Patent 5,744,326 ). Im Allgemeinen sitzt das RNA-Export-Element innerhalb der 3'-UTR eines Gens und kann als eine Kopie oder als mehrfache Kopien insertiert werden. Die RNA-Export-Elemente lassen sich in jedes oder in alle der getrennten Vektoren insertieren, welche die Verpackungs-Zelllinien der vorliegenden Erfindung erzeugen.
REKOMBINANTE RETROVIRALE VEKTOREN
Die Verpackungszellen der vorliegenden Erfindung umfassen drei oder mehr retrovirale Vektoren, welche jeweils die gesamten oder einen Abschnitt von gag, pol und env codieren. Vorschriften zur Produktion von rekombinanten retroviralen Vektoren und zur Transformation der Verpackungs-Zelllinien sind im Stand der Technik gut bekannt (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (Hrg.) Green Publishing Associates, (1989), Abschnitte 9.10–9.14 und andere Standard-Laborhandbücher; Eglitis et al. (1985) Science 230: 1395–1398; Danos und Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014–3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141–6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039–8243; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377–8381; Chowdhury et al. (1991) Science 245: 1802–1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640–7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641–647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892–10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104–47115; US-Patent 4,868,116 ; US-Patent 4,980,286 ; PCT-Anmeldung WO 89/07136 ; PCT-Anmeldung WO 89/02468 ; PCT-Anmeldung WO 89/05345 und PCT-Anmeldung WO 92/07573 ). Darüber hinaus können geeignete retrovirale Sequenzen, welche in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, aus handelsüblichen Quellen bezogen werden. Derartige Sequenzen können z.B. in Form von retroviralen Plasmiden wie z.B. pLJ, pZIP, pWE und pEM gekauft werden. Geeignete Verpackungssequenzen, welche in den Vektoren der Erfindung verwendet werden können, sind ebenfalls im Handel erhältlich und umfassen z.B. die Plasmide ΨCrip, ΨCre, Ψ2 und ΨAm. Während die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf besondere Ausführungsformen beschrieben werden soll (z.B. besondere retrovirale Vektoren), lassen sich andere retrovirale Vektoren zur Verwendung in der Erfindung nach den hier beschriebenen Vorschriften herstellen.
In einer besonderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verpackungszelle mit drei oder mehr rekombinanten lentiviralen Vektoren zur Verfügung. Diese Vektoren lassen sich herstellen, indem ausgesuchte lentivirale Sequenzen in einen geeigneten Vektor insertiert werden (z.B. ein im Handel erhältliches Expressionsplasmid mit geeigneten regulatorischen Elementen (z.B. einem Promotor und einem Enhancer), Restriktionsstellen zum Klonieren, Mekergenen usw.). Dies lässt sich mit Einsatz von im Stand der Technik bekannten Standard-Klonierungstechniken, einschließlich einer PCR, erreichen. Lentivirale Sequenzen, die in solche Vektoren kloniert werden sollen, lassen sich aus jeder bekannten Quelle erhalten, einschließlich einer lentiviralen genomischen RNA oder von der viralen RNA entsprechenden cDNAs. Geeignete, der lentiviralen genomischen RNA entsprechende cDNAs sind im Handel erhältlich und umfassen z.B. pNLENV-1 (Maldarelle et al. (1991) J, Virol. 65: 5732), welche genomische Sequenzen des HIV-1 enthält. Andere Quellen für retrovirale (z.B. lentivirale) cDNA-Klone sind die American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD.
Sind die retroviralen Sequenzen (z.B. gag, pol, env, LTRs und cis-wirkende Sequenzen) erst einmal in einen geeigneten Vektor kloniert, können sie, wie hier beschrieben, modifiziert werden. In einer Ausführungsform werden die aus Plasmiden wie pNLENV-1 amplifizierten lentiviralen Sequenzen in einen geeigneten Backbone-Vektor wie z.B. einen pUC-Vektor (z.B. pUC19) (University of California, San Francisco), pBR322 oder pcDNA1 (InVitrogen, Inc.) kloniert und dann durch eine Deletion (unter Verwendung von Restriktionsenzymen), Substitution (z.B. unter Einsatz einer ortsgerichteten Mutagenese) oder eine andere (z.B. chemische) Modifikation modifiziert, um die Expression oder die Funktion der ausgesuchten lentiviralen Sequenzen zu verhindern. Wie in den hier wiedergegebenen Beispielen beschrieben, lassen sich Abschnitte der gag- pol- und env-Gene zusammen mit ausgewählten akzessorischen Genen entfernen oder mutieren. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform ein Abschnitt von pol deletiert oder auf andere Weise mutiert, um ein eingekürztes gag^pol-Gen zu gewinnen, welches das gesamte gag und einen Abschnitt von pol enthält.
Es ist bevorzugt, dass jeder Vektor der Erfindung die minimalen lentiviralen Sequenzen enthält, die benötigt werden, um die gewünschten lentiviralen Proteine (z.B. gag, pol und env) zu codieren oder die gewünschte lentivirale Funktion (z.B. Verpackung von RNA) zu dirigieren. Das heißt, dass der Rest des Vektors vorzugsweise nicht viralen Ursprungs ist oder aus einem anderen Virus als einem Lentivirus (z.B. HIV) stammt. In einer Ausführungsform werden die in den retroviralen Vektoren der Erfindung enthaltenen lentiviralen LTRs modifiziert, indem ein Abschnitt der LTR durch eine funktionell ähnliche Sequenz aus einem anderen Virus ersetzt und eine Hybrid-LTR erzeugt wird. Beispielsweise kann die lentivirale 5'-LTR, welche als Promotor dient, teilweise durch den CMV-Promotor oder eine LTR aus einem anderen Retrovirus (z.B. MuLV oder MuSV) ersetzt werden. Die lentivirale 3'-LTR kann alternativ oder zusätzlich teilweise durch eine Polyadenylierungssequenz aus einem anderen Gen oder Retrovirus ersetzt werden. In einer Ausführungsform wird ein Abschnitt der 3'-LTR des HSV-1 durch die Polyadenylierungssequenz des β-Globin-Gens von Kaninchen ersetzt. Durch die auf diese Weise erfolgende Minimierung der gesamten lentiviralen Sequenzen in den Vektoren der Erfindung wird die Aussicht auf eine Rekombination unter den Vektoren, welche zu einem replikations-kompetenten Helfervirus führt, größtmöglich verringert.
In der vorliegenden Erfindung lässt sich jeder geeignete Expressionsvektor verwenden. Wie unten in den Beispielen beschrieben, umfassen geeignete Expressionskonstrukte ein humanes Cytomegalovirus (CMV)-Immidiate-early-Promotor-Konstrukt. Der Cytomegalovirus-Promotor kann aus jeder geeigneten Quelle erhalten werden. Beispielsweise kann der vollständige Cytomegalovirus-Enhancer-Promotor von dem menschlichen Cytomegalovirus (hCMV) herrühren. Andere geeignete Quellen, um CMV-Promotoren zu erhalten, sind kommerzielle Quellen wie Clontech, InVitrogen und Stratagene. Ein Teil oder der gesamte Promotor kann in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Andere Beispiele für Konstrukte, die zur Ausführung der Erfindung eingesetzt werden können, sind Konstrukte, bei denen MuLV-, SV40-, Rous-Sarkom-Virus (RSV)-, Vaccinia P7.5- und Ratten-β-Actin-Promotoren verwendet werden. In einigen Fällen, wie bei RSV und MuLV, befinden sich die Promotor-Enhancer-Elemente innerhalb der oder neben den LTR-Sequenzen.
Geeignete, für eine Gentranskription, Translation, Prozessierung und Sekretion benötigte regulatorische Sequenzen sind fachbekannt und werden ausgesucht, um die Expression des gewünschten Proteins in einer geeigneten Zelle zu dirigieren. Der hier verwendete Ausdruck "regulatorische Sequenz" umfasst daher jedes genetische Element, das in 5'-Richtung (upstream) oder in 3'-Richtung (downstream) zu der translatierten Region eines Gens vorkommt und das die Expression des Gens kontrolliert oder beeinflusst, wie z.B. Enhamcer- und Promotor-Sequenzen. Derartige regulatorische Sequenzen werden z.B. in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Seite 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben und können zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung von einem Fachmann ausgesucht werden.
In einer Ausführungsform wird in der Erfindung ein induzierbarer Promotor innerhalb des retroviralen Vektors verwendet, so dass die Transkription ausgesuchter Gene an- und ausgeschaltet werden kann. Dies hält die von der Expression von cytotoxischen viralen Proteinen verursachte Toxizität möglichst klein, was die Stabilität der die Vektoren enthaltenden Verpackungszellen erhöht. Beispielsweise können hohe Expressionsgrade von VSV-G (Hüllprotein) und Vpr cytotoxisch sein (Yee, J.-K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9654–9568 (1994) und daher kann die Expression dieser Proteine in den Verpackungszellen der Erfindung von einem induzierbaren Operatorsystem wie z.B. dem induzierbaren Tet-Operatorsystem (GIBCOBRL) kontrolliert werden, was durch die Konzentration von Tetracyclin im Kulturmedium eine enge Regulation der Genexpression (d.h. Erzeugung von retroviralen Partikeln) gestattet. Da heißt, dass mit dem Tet-Operatorsystem in Gegenwart von Tetracyclin das Tetracyclin an das Tet-Transaktivator-Fusionsprotein (tTA) gebunden wird, was die Bindung von tTA an die Tet-Operatorsequenzen verhindert und die Expression des Gens unter der Kontrolle der Tet-Operatorsequenzen (Gossen et al. (1992) PNAS 89: 5547–5551) gestattet. In Abwesenheit von Tetracyclin bindet sich das tTA an die Tet-Operatorsequenzen, was die Expression des Gens unter der Kontrolle des Tet-Operators verhindert.
Beispiele für andere induzierbare Operatorsysteme, welche für eine kontrollierte Expression des für eine pseudotypisierte Hülle sorgenden Proteins eingesetzt werden können sind 1) induzierbare eukaryotische Promotoren, die auf Metallionen reagieren (z.B. der Metallothionein-Promotor), Glucocorticoid-Hormone und 2) das LacSwitch^TM Inducible Mammalian Expression System (Stratagene) von E. coli. Kurz gesagt bindet sich im Lactose-Operon von E. coli der Lac-Repressor als Homotetramer an den lac-Operator und blockiert so die Transkription des lac2-Gens. Induktoren wie Allolactose (ein physiologischer Induktor) oder Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG, ein synthetischer Induktor) binden sich an den Lac-Repressor, was zu einer Konformationsänderung führt und die Affinität des Repressors für den Operator effektiv verringert. Wenn der Repressor vom Operator entfernt wird, erfolgt wieder eine Transkription vom Lactose Operon.
In noch einem anderen Ansatz lässt sich eine selektive Expression von in den Vektoren der Erfindung enthaltenen retroviralen Genen erzielen, indem upstream zu ausgewählten codierenden Sequenzen ein Cre/lox-Repressor-System cloniert wird. Speziell kann zwischen dem (den) Gen(en), das (die) selektiv exprimiert werden soll(en), und einem 5'-Promotor ein Polystop-Signal insertiert werden. Das Polystop-Signal wird von zwei loxP1-Stellen flankiert (Sauer (1993) Methods in Enzymology 225: 890–900). Nach Kontakt mit der cre-Recombinase rekombinieren die lox-Stellen und deletieren das Polystop-Signal, was dem Promotor gestattet, dass er in cis arbeitet, um die Expression des Gens (der Gene) anzuschalten.
VIRALE HÜLLPROTEINE UND PSEUDOTYPISIERUNG
Zusätzlich zum Codieren von retroviralen Proteinen, welche zur Produktion und zum Aufbau von Kernvirionen benötigt werden (z.B. gag- und pol-Proteine), codieren die Verpackungs-Zelllinien der Erfindung auch virale Hüllproteine (env), welche den Bereich an Wirtszellen festlegen, welche letztlich von den aus den Zellen erzeugten rekombinanten Retroviren infiziert und transformiert werden können. Im Falle von Lentiviren, wie z.B. HIV-1, HIV-2, SIV, FIV und EIV, umfassen die env-Proteine gp41 und gp120. Die von den Verpackungszellen der Erfindung exprimierten viralen env-Proteine werden vorzugsweise auf einem Vektor codiert, der von den viralen gag- und pol-Genen getrennt ist, wie dies bereits weiter oben beschrieben wurde.
Beispiele für env-Gene retroviralen Ursprungs, welche in der Erfindung verwendet werden können, sind, jedoch nicht ausschließlich, retrovirale Hüllproteine des Typs C, wie z.B. die vom murinen Moloney-Leukämie-Virus MoMuLV), vom murinen Harvey-Sarkom-Virus (HaMuSV), vom murinen Mammary-Tumor-Virus (MuMTV), vom Gibbonaffen-Laukämie-Virus (GaLV) und vom Rous-Sarkom-Virus (RSV). Andere virale env-Gene, die verwendet werden können, sind z.B. env-Gene aus immundefizienten Viren (HIV-1, HIV-2, FIV, SIV und EIV), humane T-Zell-Leukämie-Viren (HTLV-1 und HTLV-3) und das vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) (Protein G). Wenn rekombinante Retroviren der Erfindung produziert werden (z.B. rekombinante Lentiviren), kann das retrovirale (z.B. lentivirale) Wildtyp-env-Gen verwendet werden oder es kann durch jedes andere virale env-Gen, wie z.B. durch die oben angeführten, ersetzt werden. Verfahren zu einer auf diese Weise erfolgenden Pseudotypisierung von rekombinanten Viren mit Hüllproteinen von anderen Viren sind im Stand der Technik gut bekannt. Der hier verwendete Ausdruck "Pseudotyp-Hülle" ist ein anderes Hüllprotein als das natürlicherweise mit dem retroviralen Kernvirion vorkommende, welches das retrovirale Kernvirion einhüllt (was zu einem phänotypisch gemischten Virus führt).
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verpackungszellen zur Verfügung, welche rekombinante, mit dem VSV-G-Glycoprotein pseudotypisierte Lentiviren (z.B. HIV, SIV, FIV, EIV) produzieren. Das VSV-G-Glycoprotein verfügt über einen breiten Wirts-Bereich. Mit dem VSV-G-Glycoprotein pseudotypisierte Retroviren weisen daher einen breiten (pantropen) Wirts-Bereich auf und sind in der Lage, Zellen wirksam zu infizieren, welche gegen eine Infektion gegen ökotropische und amphotropische Retroviren resistent sind (Yee et al. (2004) PNAS 91: 9564–9568). Jeder geeignete Serotyp (z.B. Indiana, New Jersey, Chandipura, Piry) und Stamm (VSV Indiana, San Juan) von VSV-G lässt sich in der vorliegenden Erfindung einsetzen. Das zur Pseudotypisierung des Kernvirions ausgewählte Protein legt den Wirtsbereich der Verpackungs-Zelllinie fest. VSV-G tritt mit einem spezifischen Phospholipid auf der Oberfläche der Säugerzellen in Wechselwirkung (Schlegel, R., et al., Cell, 32: 639–646 (1983); Spuertzi, F., et al., J. Gen. Virol., 68: 387–399 (1987)). Somit verfügen die Verpackungs-Zelllinien, welche VSV-G verwenden, um eine pseudotypisierte Hülle für das retrovirale Kernvirion zu liefern, über einen breiten (pantropischen) Wirts-Bereich. Darüber hinaus lassen sich mit VSV-G pseudotypisierte Retrovirus-Partikel mittels Ultrazentrifugation auf mehr als das 100-fache aufkonzentrieren (Burns, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 8033–8037 (1993)). Stabile mit VSV-G pseudotypisierte retrovirale-Verpackungs-Zelllinien gestatten die Erzeugung von Virus-Präparationen in großem Maßstab (z.B. aus 10 bis 50 Litern Überstand), um retrovirale Stocklösungen im Bereich von 10⁷ bis 10¹¹ Retrovirus-Teilchen pro ml zu erhalten.
Die viralen Hüllproteine der Erfindung (ob pseudotypisiert oder nicht) können auch modifiziert sein, z.B. durch Aminosäure-Insertionen, Deletionen oder Mutationen, um angestrebte Hüllsequenzen wie eine ökotropische Hülle mit dem EPO-Liganden, sybthetische und/oder andere Hybrid-Hüllen und Derivate des VSV-G-Glycoproteins zu produzieren. Ferner ist gezeigt worden, dass es möglich ist, das Infektions-Spektrum von Retroviren und folglich von auf Retroviren basierenden Vektoren einzuschränken, indem die viralen Verpackungsproteine auf der Oberfläche des Virus-Teilchens modifiziert werden (siehe z.B. die PCT-Schriften WO 93/25234 und WO 94/06920 ). Beispielsweise umfassen Strategien für die Modifikation des Infektions-Spektrums von retroviralen Vektoren: das Ankoppeln von für die Zelloberfläche spezifischen Antikörpern an das virale env-Protein (Roux et al. (1989) PNAS 86: 9079–9083; Julan et al. (1992) J. Gen. Virol. 73: 3251–3255 und Goud et al. ((1983) Virology 163: 251–254) oder das Ankoppeln von Zelloberflächen-Rezeptorliganden an die viralen env-Proteine (Neda et al. (1991) J. Biol. Chem. 255: 14143–14146). Das Ankoppeln kann in Form der chemischen Vernetzung mit einem Protein oder einer anderen Spezies (z.B. Lactose zur Überführung des env-Proteins in ein Asialoglycoproteun) sowie durch Erzeugung von Fusionsproteinen (z.B. Einzelketten-Antikörper/env-Fusionsproteine) erfolgen. Während diese Technik dafür von Nutzen ist, die Infektion auf bestimmte Gewebetypen zu beschränken, kann sie auch eingesetzt werden, um einen ökotropen Vektor in einen amphotropen Vektor zu überführen.
VERPACKUNGS-ZELLLINIEN
Es kann jede geeignete Zelllinie verwendet werden, um die Verpackungszellen der Erfindung herzustellen. Im Allgemeinen sind die Zellen Säugerzellen. In einer besonderen Ausführungsform sind die zur Herstellung der Verpackungs-Zelllinie verwendeten Zellen menschliche Zellen. Geeignete menschliche Zelllinien, die eingesetzt werden können, sind z.B. 293-Zellen (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol., 36: 59–72), tsA-201-Zellen (Heinzel et al. (1988) J. Virol., 62: 3738) und NIH3T3-Zellen (ATTC). Andere geeignete Verpackungs-Zelllinien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind von anderen menschlichen Zelllinien stammende (z.B. von einer embryonischen Zelllinie stammende) Verpackungs-Zelllinien und von einer murinen Zelllinie stammende Verpackungs-Zelllinien, wie z.B. Psi-2-Zellen (Mann et al. (1983) Cell, 33: 153–159); FLY (Cossett et al. (1993) Virol., 193: 385–395); BOSC 23-Zellen (Pear et al. (1993) PNAS 90: 8392–8396); PA317-Zellen (Miller et al. (1986) Molec. and Cell. Biol., 6: 2895–2902); die kat-Zelllinie (Finer et al. (1994) Blood, 83: 43–50); GP+E-Zellen und GP+EM12-Zellen (Markowitz et al. (1988) J. Virol., 62: 1120–1124) und Psi-Crip- und Psi-Cre-Zellen ( US-Patent 5,449,614 ; Danos, O. und Mulligan et al. (1988) PNAS 85: 6460–6464). Die Verpackungs-Zelllinien der vorliegenden Erfindung können retrovirale Partikel mit einem pantropen, amphotropen oder ökotropen Wirts-Bereich produzieren. Bevorzugte Verpackungs-Zelllinien produzieren retrovirale Partikel, wie z.B. lentivirale Partikel (z.B. HIV-1, HIV-2 und SIV), die in der Lage sind, sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen zu infizieren.
ZELLTRANSFEKTION UND SCREENING
Die rekombinanten retroviralen Vektoren der Erfindung, welche zusammen die (für die Produktion von leeren Viruspartikeln benötigten) gag-, pol- und env-Proteine codieren, in denen gag und pol zumindest zum Teil auf zwei getrennte Vektoren aufgeteilt sind, werden zur Erzeugung von Verpackungs-Zelllinien unter Einsatz von Standard-Transfektionstechniken in geeignete Zellen cotransfiziert. Zu diesem Zweck kann jede bekannte Zelltransfektions-Technik eingesetzt werden. Wie im Stand der Technik bekannt, werden im Allgemeinen die Zellen mit den Vektoren in einem passenden Medium unter geeigneten Transfektions-Bedingungen inkubiert (d.h. kultiviert). Beispielsweise lassen sich Verfahren wie die Elektroporation und die Caclciumphosphat-Fällung (O'Mahoney et al. (1994) DNA & Cell Biol. 13(12): 1227–1232) einsetzen.
Positive Verpackungszelltransformanten (d.h. Zellen, welche die retroviralen Vektoren aufgenommen und integriert haben) können auf den Gebrauch von verschiedenen Selektionsmarkern hin gescreent werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Beispielsweise können in den Vektoren Marker-Gene wie z.B. das grüne Fluorenszenz-Protein (GFP)-Gen, das Hygromycin-Resistenz (Hyg)-Gen, das Neomycin-Resistenz (Neo)-Gen und das β-Galactosidase (β-gal)-Gen enthalten sein und auf ihre Verwendung in z.B. enzymatischen Aktivitäts-Assays oder Arzneimittel-Resistenz-Assays hin untersucht werden. Alternativ können die Zellen wie von Goff et al. (1981) J. Virol. 38: 239 beschrieben als ein Maß für die virale Proteinproduktion auf ihre reverse Transkriptase (RT)-Aktivität hin untersucht werden.
Ähnliche Assays können verwendet werden, um auf die Produktion eines unerwünschten replikations-kompetenten Helfervirus durch die Verpackungszellen hin zu testen. Beispielsweise können in dem die viralen Verpackungssequenz (Ψ) und LTRs enthaltenden "Produzenten"-Vektor Marker-Gene wie die oben beschriebenen enthalten sein. Nach der vorübergehenden Infektion der Verpackungszellen mit dem Produzenten-Vektor können die Verpackungszellen mit anderen Nicht-Verpackungszellen subkultiviert werden. Diese Nicht-Verpackungszellen werden mit den rekombinanten replikationsdefizienten retroviralen Vektoren der Erfindung, welche das Marker-Gen enthalten, infiziert. Weil diese Nicht-Verpackungszellen jedoch nicht die zur Herstellung von Virus-Partikeln benötigten Gene (z.B. das gag-, pol- und env-Gen) enthalten, sollten sie dann wieder nicht in der Lage sein, andere Zellen zu infizieren, wenn sie mit diesen anderen Zellen subkultiviert werden. Wenn diese anderen Zellen positiv für die Gegenwart des Marker-Gens sind, wenn sie mit den Nicht-Verpackungszellen subkultiviert wurden, ist ein unerwünschtes replikations-kompetentes Virus produziert worden.
Um auf die Produktion eines unerwünschten Helfervirus hin zu testen, können die Verpackungszellen der Erfindung entsprechend mit einer ersten Zelllinie (z.B. NIH3T3) subkultiviert werden, die dann wieder mit einer zweiten Zelllinie subkultiviert wird, welche auf die Gegenwart eines Marker-Gens oder von RT-Aktivität hin getestet wird, was auf das Vorkommen eines replikations-kompetenten Helfervirus hinweist. Wie im Stand der Technik bekannt, können Marker-Gene daraufhin geprüft werden, ob sie in FACS, Färbeassays oder enzymatischen Aktivitäts-Assays eingesetzt werden.
VERWENDUNGEN IN DER GENTHERAPIE
Die neuartigen Verpackungs-Zelllinien der Erfindung lassen sich verwenden, um von einem unerwünschten Helfervirus freie, rekombinante Retroviren (z.B. rekombinante Lentiviren) zu produzieren, welche in der Lage sind, heterologe DNAs (z.B. ein therapeutisches Transgen) in eukaryotische Zellen zu transferieren (und effizient zu integrieren). Das heißt, das rekombinante Virus kann aus Verpackungs-Zelllinien der Erfindung gewonnen und als virales Material in Kultur oder in vivo zur Infektion von Empfängerzellen verwendet werden. Im Falle von sekretierten Proteinen oder von in hämatopoetischen Zellen exprimierten Proteinen lassen sich empfindliche Asays wie der ELISA oder das Western Blotting einsetzen, um die Effizienz des Gentransfers zu bestimmen.
Speziell lassen sich die von den Verpackungszellen der Erfindung produzierten Lentiviren auf sichere Weise einsetzen, um nicht nur verschiedene sich teilende Zelltypen sondern auch sich nicht teilende Zelltypen zu transformieren, was das Spektrum der durch Gentherapie behandelbaren Krankheiten vergrößert. Diese rekombinanten Lentiviren können z.B. eingesetzt werden, um Neuronen, Muskel-, Herz-, Lungen-, Leber-, Haut- und Knochenmarkszellen zu transformieren.
Mit Hilfe der Erfindung lässt sich ein breites Spektrum heterologer DNAs transferieren. Derartige DNAs sind z.B. therapeutische Gene (die z.B. therapeutische Proteine codieren, welche zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden können). Weil über die rekombinanten Retroviren (z.B. Lentiviren) der Erfindung sich nicht teilende als auch sich teilende Zellen transformiert werden können, umfassen die behandelbaren Krankheiten z.B. Globin-Erkrankungen, einen Mangel am Koagulationsfaktor des Blutes, Nerven-Erkrankungen, Atoimmun-Krankheiten und Lungen-Krankheiten. Somit können die therapeutischen Gene, die transferiert werden sollen, z.B. die Gene für das menschliche β-Globin, den Faktor VIII, den Faktor IX, und das zystische Fibrom sein. Alternativ können die retroviralen Vektoren der Erfindung verwendet werden, um an Zellen Antisense-Polynucleotide abzugeben, damit die Expression ausgesuchter Gene gehemmt wird (Yee, J.-K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9564–9568 (1994); Dranoff, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 3539–3543 (1993); Miller, A.D., et al., Meth. in Enz., 217: 581–599 (1993)).
Zusätzlich lassen sich die Verpackungs-Zelllinien der vorliegenden Erfindung auch verwenden, um erwünschte DNA enthaltende Retroviren zu produzieren, um eine die erwünschte DNA oder erwünschte Gene in Säugerzellen wie z.B. menschliche Zellen einzuführen, die dann an lokalisierte Bereiche des Körpers verabreicht werden (z.B. eine ex vivo-Infektion von autologen weißen Blutkörperchen zur Abgabe von Protein in lokalisierte Bereiche des Körpers, siehe z.B. US-Patent 5,399,346 ).
BEISPIELE
Präparation einer von einem Helfervirus freien lentiviralen Verpackungs-Zelllinie
Stabile Verpackungs-Zelllinien, welche ein rekombinantes von einem nachweisbaren Helfervirus freies HIV produzieren, wurden wie unten beschrieben, präpariert. Die Verpackungs-Zelllinien eliminieren praktisch die Möglichkeit von rekombinatorischen Ereignissen, welche zu einem intakten replikations-kompetenten Helfervirus führen können, indem in ihnen die zur Produktion und den Aufbau von Virionen sowie zur Verpackungs-RNA benötigten codierenden Sequenzen auf vier getrennte Plasmide aufgeteilt werden, welche hier als pgag^pol-, pVpr-RTIN-, pENV- und pΨ-Plasmid bezeichnet werden. Diese Plasmide enthalten minimale gemeinsame HIV-Sequenzen sowie minimale nicht codierende HIV-Sequenzen. Sie enthalten auch induzierbare Promotoren, um eine durch die Expression von cytotoxischen Proteinen wie Vpr verursachte Toxizität gegen die Verpackungszellen zu verhindern. Werden die Zellen vorübergehend in geeignete Verpackungszellen von Säugern cotransfiziert, produzieren sie von HIV stammende retrovirale Vektorpartikel ohne eine Rekombination zur Produktion eines Helfervirus.
Plasmid-Präparation
Jedes Expressions-Plasmid wurde mit Hilfe von Standard-Klonierungstechniken (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual 2. Auflage Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York, USA) konstruiert. Die Oligonucleotide zum Klonieren wurden mit Hilfe von Standardvorschriften synthetisiert oder von im Handel befindlichen Quellen wie GENSET Inc. erhalten Die Genauigkeit der Plasmid-Konstruktion wurde mit Hilfe von Standard-Nucleotid-Sequenzierungstechniken bestätigt. Alle Plasmide enthielten geeignete Promotor-Sequenzen wie z.B. den Promotor des Human Early Cytomegalusvirus (hCMV) und wahlweise ein Reporter-Gen wie das Gen für das grüne fluoreszierende Protein (GFP). Geeignete lentivirale (z.B. HIV-1) codierende und nicht codierende Sequenzen wurden mittels Amplifikation ausgesuchter Sequenzen von zur Verfügung stehenden Plasmiden mit proviraler DNA wie z.B. dem PNLENV-1 (Maldarelli et al. (1991) J. Virol. 65: 5732) erhalten.
Das Plasmid pgag^pol
Das Plasmid pgag^pol wurde so konzipiert, dass es das gag-Polyprotein und einen Teil des pol-Polyproteins codiert, vorzugsweise den Teil von pol, der im lentiviralen Genom mit gag überlappt, einschließlich, aber nicht ausschließlich der lentiviralen Protease (PR) (siehe z.B. 5). Dies wurde erreicht, indem entweder ein Abschnitt der pol codierenden Sequenz deletiert wurde oder durch Mutation eines Abschnitts der pol codierenden Sequenz, so dass nur ein Teil des pol-Gens exprimiert wurde.
Zur Konstruktion des pgag^pol wurde eine das provirale HIV-Genom enthaltende cDNA wie z.B. PNLENV-1 (Maldarelli et al. (1991) J. Virol. 65: 5732) (von Stephen Goff freundlicherweise zur Verfügung gestellt) amplifiziert und in einen oder mehrere geeignete Expressionsvektoren wie z.B. pCDNA 1 und pCDNA 3 (Invitrogene Corp.) cloniert. Ausgesuchte codierende und nicht codierende Sequenzen wurden in dem Plasmidvektor mit Hilfe von Standardtechniken deletiert oder auf andere Weise mutiert, so dass nur die gewünschten gag- und pol-Polyproteine exprimiert wurden. Falls sie nicht aus dem Vektor deletiert wurden, wurden die HIV-Sequenzen, die nicht exprimiert werden sollten (z.B. die das reverse Transkriptas (RT)-Gen und das Integrase (IN)-Protein von pol codierenden Sequenzen, die env-Proteine codierenden Sequenzen, die akzessorischen Gene und die cis wirkenden nicht codierenden Sequenzen (z.B. die Export-Elemente und die LTR-Sequenzen) mutiert, so dass sie nicht länger über eine genügende Homologie mit den Nucleotidsequenzen verfügten, die in jedem der weiter unten beschriebenen Plasmide pVpr-RTIN, pENV oder pΨ enthalten sind. Ein geeigneter Promotor wie der CMV.Promotor wurde upstream zu den gag^pol-codierenden Sequenzen ebenfalls in den Vektor cloniert, falls er nicht bereits in dem Plasmid-Grundgerüst enthalten war. Eine Karte von pgag^pol wird in 1 gezeigt.
Das Plasmid pVpr-RTIN
Das Plasmid pVpr-RTIN wurde so konzipiert, dass es ein Vpr- (oder VPx-)Fusionsprotein codiert, welches den vom Plasmid pgag^pol nicht codierten restlichen Teil des pol-Polyproteins von HIV enthält. Speziell codierte pVr-RTIN ein Fusionsprotein, das Vpr enthielt (welches durch Vpx ersetzt worden sein konnte) oder Teile davon,. die sich an p6 binden, sowie die reverse Transkriptase (RT) und die Integrase (IN) von pol. Wie in 2 gezeigt, befand sich vor den RT- und IN-codierenden Sequenzen upstream eine Protease-Spaltstelle. Ist das Vpr- (oder Vpx)-Fusionsprotein erst einmal in den Verpackungszellen exprimiert, vereinigt es sich über p6 mit von gag oder pgag^pol produzierten zusammengebauten HIV-Virionen. Dies gestattet den an das Vpr fusionierten RT- und IN-Proteinen, dass sie in die Kernvirionen verpackt werden. Somit wirkt Vpr (oder Vpx) so, dass es die RT- und IN-Proteine dazu bringt oder "huckepack trägt", um die viralen Teilchen auf der Innenseite der Plasmamembran zusammenzubauen, wo die gag-Polyprotein-Vorläufer einen derartigen viralen Aufbau lenken.
Um pVpr-RTIN zu konstruieren, wurden die die gewünschten lentiviralen Sequenzen enthaltenden Expressions-Plasmide wie für pgag^pol beschrieben konstruiert (z.B. durch Mutation der in PNLENV-1 enthaltenen Sequenzen nach dem Klonieren in ein passendes Expressions-Konstrukt). Die Vpr- (oder Vpx)-codierende Sequenz wurde sodann im Leseraster mit den in dem Plasmid enthaltenen pol-codierenden Sequenzen (z.B. RT und IN) in das Plasmid kloniert. Dies erfolgte, indem zuerst mit einem die vollständige Vpr-codierende Sequenz enthaltenden Plasmid, wie z.B. SCVCMV (Yau et al. (1995) J. Virol. 69: 7032–7044) eine PCR durchgeführt wurde Dies gestattete, dass an den Beginn der Vpr- (oder Vpx)-codierenden Sequenz eine Kozak-Sequenz und ganz an das Ende der Vpr-codierenden Sequenz eine Bgl 2-Stelle platziert werden konnten und dass mutante Vpr.Vektoren für eine verminderte Cytotoxizität erzeugt werden konnten. Es ist z.B. gezeigt worden, dass ein Austausch von GGG (Gly an Aminosäureposition 75) durch AAC (Asn) oder eine Deletion an der Vpr-codierenden Sequenz derart, dass nur die N-terminalen Aminosäuren 1–88 codiert wurden (Yau et al. (1995), supra), die Toxizität des Vpr-Proteins in den Zellen herabsetzen. Das erhaltene amplifizierte Vpr- (oder Vpx)-Konstrukt wurde sodann in das Plasmid kloniert, welches die pol-codierende Teilsequenz im Leseraster mit z.B. den RT- und IN-codierenden Sequenzen enthielt, wobei die 33 Basenpaare lange Protease(PT)-Spaltstelle, welche vor IN sitzt, zu beachten und beizubehalten war. An Stelle der PR-Stelle unmittelbar vor IN können auch andere HIV- und Nicht-HIV-PR-Stellen verwendet werden. Beispielsweise kann die HIV-1-Protease- Spaltstelle mit der Aminosäuresequenz VSQNYPIV (SEQ ID NO: 1), die in der Verbindung zwischen HIV-1 p16^GAG und p24^GAG liegt, verwendet werden. Beispielsweise kann die HIV-1-Protease-Spaltstelle mit der Aminosäuresequenz VSQNYPIV (SEQ ID NO: 1), die in der Verbindung zwischen HIV-1 p16^GAG und p24^GAG liegt, verwendet werden. Alternativ kann die HIV-1-Protease-Spaltstelle mit der Aminosäuresequenz ARULAEA (SEQ ID NO: 2), die in der Verbindung zwischen HIV-1 p24^GAG und p2^GAG liegt, verwendet werden. Eine Karte des Plasmids pVpr-RTIN wird in 2 gezeigt.
Das Plasmid pENV
Das Plasmid pENV wurde konzipiert, um die für das rekombinante Lentivirus gedachten Hüllproteine zu codieren. Diese Proteine sind notwendig, um Virion-Partikel zu bilden und den Wirtszellbereich festzulegen, welcher mit dem rekombinanten Lentivirus infiziert (und somit transformiert) werden kann. Wird in pENV ein nicht-lentivirales (z.B. Nicht-HIV) env-Gen eingesetzt, produziert die erhaltene Verpackungs-Zelllinie pseudotypisierte lentivirale Virionen. Beispielsweise kann die codierende Sequenz für das vesikuläre Stomatitis-Virus-Glycoprotein (VSVg) an Stelle des HIV-env-Gens eingesetzt werden. Dies bietet die Vorteile, dass ein breiterer (pantroper) Wirtsbereich für das rekombinante Lentivirus und eine größere Stabilität erworben werden, was ein Aufkonzentrieren der Viruspartikel durch Ultrazentrifugation gestattet.
Zur Herstellung von pENV wurde mit Hilfe von Standard-Klonierungstechniken eine gewünschte env-codierende Sequenz (z.B. HIV von PNLENV-1 oder VSVg) in einen oder mehrere geeignete Expressionsvektoren kloniert. Wie in 3 gezeigt, befand sich vor der env-codierenden Sequenz upstream ein geeigneter Promotor (z.B. ein induzierbarer Promotor wie der RSV-Promotor) und downstream ein Polyadenylierungssignal. Das pENV kann auch einen Selektionsmarker wie das Neomycin (neo)-Resistenzgen enthalten.
Das Plasmid pΨ
Das Plasmid pΨ wurde so konzipiert, dass es eine lange endständige Wiederholung (LTR) und Verpackungssequenzen (Ψ) enthielt, die für die Verpackung von RNA benötigt werden, welche zusammen mit einem in Frage kommenden Transgen (d.h. einem in der Gentherapie beim Menschen eingesetzten therapeutischen Gen) von pΨ in lentivirale Virionen transkribiert wurde. Die linke (5') LTR fungiert als Promotor und die rechte (3') LTR wirkt als Polyadenylierungssequenz. Bei der Konstruktion des pΨ mit Hilfe von auf Lentiviren (z.B. HIV) basierenden Vektoren ist es bevorzugt, die lentiviralen LTR-Sequenzen durch funktionell ähnliche Sequenzen aus anderen Viren zu ersetzen. Dies vermindert die Wahrscheinlichkeit einer Rekombination (z.B. mit den Plasmiden pgag^pol, pVpr-RTIN und pENV) und erhöht die Sicherheit der Verpackungs-Zelllinie. Beispielsweise kann eine Hybrid-5'-LTR eingesetzt werden, welche einen Teil der HIV-5'-LTR durch den CMV-Promotor oder eine LTR aus einem anderen Retrovirus (z.B. MuLV oder MuSV) ersetzt, und es kann eine Hybrid-3'-LTR eingesetzt werden, welche einen Teil der HIV-3'-LTR durch eine retrovirale Polyadenylierungssequenz oder eine β-Globin-Polyadenylierungssequenz des Kaninchens ersetzt. Das Plasmid pΨ enthält auch vorzugsweise ein RNA-Exportelement (z.B. das Rev-Responsive Eelement (RRE) des HIV (Cullen et al. (1991) Science 16: 346–350; Rosen et al. (1990) AIDS 4: 499–509) oder das post-transkriptionelle regulatorische Element (PRE) des HBV (Huang et al. (1995) Molec. and Cell Biol. 15(7): 3864–3869)), welches den Export von RNA aus dem Kern der Wirtszelle in das Cytoplasma verursacht, sowie ein Markergen (z.B. GFP), wie dies alles in 3 gezeigt wird.
Das Plasmid pΨ wurde wie oben für die Plasmide pgag^pol, pVpr-RTIN und pENV beschrieben konstruiert, indem z.B. HIV-LTR, Ψ und RRE (z.B. aus pNLENV-1) in ein geeignetes Grundgerüst wie z.B. pUC19 subkloniert wurden. Zur Gewinnung von Hybrid-LTRs wurden Standardtechniken eingesetzt, indem z.B. ein geeigneter Promotor und geeignete Polyadenylierungssequenzen in HIV-LTR-Sequenzen kloniert wurden und ein passender Anteil der HIV-LTRs deletiert wurde. Ein geeigneter Restriktionsort zum Klonieren von heterologen cDNAs (z.B. von Transgenen) wurde dem pΨ ebenfalls hinzugefügt, gefolgt von einer Insertion eines gewünschten therapeutischen Gens (z.B. humanes β-Globin).
Cytotoxizität
Bei der Konstruktion der oben beschriebenen Plasmide können zusätzliche Schritte unternommen werden, um auf die aus der Expression von viralen Proteinen wie VPR und viralen Proteasen resultierende potentielle Toxizität gegen Zellen einzugehen. In einem Ansatz können die für diese Proteine codierenden Sequenzen deletiert werden, so dass sie nur die für ihre Funktion nötigen kleinstmöglichen Anteile (z.B. VPR/p6-Bindungsdomänen) codieren. Es ist z.B. bekannt, dass die Expression von VPR in voller Länge gegenüber Zellen toxisch sein kann, dass aber eine eingekürzte Form des Proteins, welche nur die ersten 88 N-terminalen Aminosäuren enthält, die Cytotoxizität des Proteins verringert, ohne dass seine Funktion (d.h. seine Fähigkeit, sich an p6 zu binden) beeinträchtigt wird. Somit codieren in einem Ansatz die Plasmide der Erfindung ein eingekürztes weniger toxisches VPR-Protein.
In einem anderen Ansatz wird auf die Cytytoxizität eingegangen, indem in den Plasmiden der Erfindung konventionelle Repressorelemente verwendet werden. Es können z.B. das TET-regulierte Expressionssystem (GIBCO BRL Inc.) oder das LacSwitch^TM Inducible Mammalian Expression System (Stratagene) zum Einsatz kommen. Kurz gesagt bindet sich in dem Lactose-Operon von E. coli der Lac-Repressor als ein Homotetramer an den lac-Operator und blockiert so die Transkription des lac2-Gens. Induktoren wie Allolactose (ein physiologischer Induktor) oder Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG, ein synthetischer Induktor) binden sich an den Lac-Repressor und verursachen eine Konformationsänderung und eine effektive Abnahme der Affinität des Reprssors zum Operator. Wird der Repressor vom Operator entfernt, erfolgt wieder eine Transkription vom Lactose Operon.
Im LacSwitch^TM Inducible Mammalian Expression System wird ein Vektorsystem verwendet, in welchem einige Elemente des Lactose-Operons für den Einsatz in eukarytischen Zellen zur Kontrolle der Genexpression modifiziert worden sind. Dieses Verfahren zur induzierbaren Expression von exogenen Genen in eukaryotischen Zellen besteht aus einem eukaryotischen Lac-Repressor-Expressionsvektor p3'SS und den zwei den eukarytischen lac-Operator enthaltenden Vektoren pOP13CAT und pOPRSVICAT, von denen jeder von Stratagene bezogen werden kann, in welche sich die in Frage kommenden lentiviralen Gene durch Klonieren insertieren lassen. Diese Vektoren werden in kultivierte Zellen transfiziert, wo die Expression der lentiviralen Gene unterdrückt wird, bis ein Induktor wie IPTG zum Einsatz kommt, welcher eine Induktion binnen 4 bis 8 Stunden gestattet.
In noch einem anderen Ansatz kann eine selektive Expression der in den Plasmiden der Erfindung enthaltenen lentiviralen Gene dadurch erzielt werden, dass in ein cre/lox- Repressor-System upstream zu den codierenden Sequenzen geklont wird. Speziell wird zwischen das (die) Gen(e), welches (welche) selektiv exprimiert werden soll(en) und seinem (ihrem) Promotor ein Polystop-Signal insertiert. Das Polystop-Signal wird von zwei loxP1-Stellen flankiert (Sauer (1993) Methods in Enzymology 225: 890–900). Nach Kontakt mit der cre-Rekombinase rekombinieren die beiden lox-Stellen und deletieren das Polystop-Signal, was dem Promotor gestattet, dass er in cis wirkt, um die Expression des Gens (der Gene) anzuschalten. Dieser Ansatz hat den zweifachen Vorteil, dass den Plasmiden der Erfindung gestattet wird, die toxischen Proteine zu codieren und diese in den Verpackungszellen ohne toxische Nebenwirkungen bleiben, und dass die Sicherheit der Verpackungszellen erhöht wird, weil die Plasmide über längere Zeiträume in Kultur verbleiben können, ohne dass ein Virus produziert wird.
Zum Insertieren eines cre/lox-Repressorsystems in Plasmide können Oligos eingesetzt werden, um zwei ein Polystop-Signal überspannende lox-Stellen upstream von der gag^pol-codierenden Sequenz aber downstream von der Promotorsequenz zu klonieren, wie dies in 1 dargestellt ist.
Transfektion, Infektion und Selektion von Zellen
Zur Erzeugung von Verpackungszellen wird eine geeignete Zelllinie mit den Plasmiden 1–3 cotransfiziert, welche zusammen die viralen Proteine codieren, die zur Bildung von helferfreien, replikations-defizienten, lentiviralen Virionen benötigt werden. Das Plasmid 4 kann sodann auf die Verpackungszellen transfiziert werden, um eine Produzenten-Zelllinie zu erzeugen (d.h. welche Virionen produziert, die das Plasmid 4 verpackt haben).
Als Verpackungs-Zelllinie kann jede geeignete Zelllinie eingesetzt werden. Es können z.B. menschliche 293T-Zellen (Nieren-Fibroblasten) verwendet werden. Diese Zellen können gezüchtet und wie bei Pear et al. (1993) PNAS 90: 8392–8396 und Danos et al. (1988) PNAS 85: 6460–6464 beschrieben transfiziert werden. Kurz gesagt können die Zellen bei 37°C mit 5% CO₂/95% Luft in mit 10% hitzeinaktiviertem Kalbsserum (CS) supplementiertem DMEM, 4,5 mg/ml Glucose, 2,0 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin gezüchtet werden.
Die Plasmid-DNAs lassen sich nach dem Qiagen-Verfahren (Qiagen, Inc.) herstellen und in Zellen transfizieren, indem z.B. die Calciumphosphat-Methode (5'3', Inc.) eingesetzt wird. Nach Transfektion der Plasmide 1–3 in die Zellen können die Kolonien auf die Verwendung von 320 μg/ml Hygromycin B (Calbiochem) hin gescreent werden. Die Kolonien können gesammelt, expandiert und wie bei Goff et al. (1981) J. Virol. 38: 239–248 beschrieben auf ihre reverse Transfektase-Aktivität sowie auf ihre Infektivität (nach vorübergehender Transfektion mit dem vierten Plasmid) hin gescreent werden, indem sie z.B. mittels der fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) mit Hilfe des grünen Fluoreszenzproteins (GFP, Clonetech) auf GFP hin oder mit Hilfe von z.B. einem β-Galactosidase-Mobilisierungs-Assay wie bei Pear et al. (1993) supra und Danos et al. (1988) supra beschrieben auf ihre β-Gal-Expression hin untersucht werden. Die Infektivität lässt sich an verschiedenen sich teilenden und nicht teilenden Zelltypen testen.

Claims

Lentivirale Verpackungs-Zelllinie mit einem ersten ein retrovirales gag-Polyprotein und einen Abschnitt eines retroviralen pol-Polyproteins codierenden Vektor; einem zweiten Vektor, der den Rest des retroviralen pol-Polyproteins codiert, welcher nicht vom ersten Vektor codiert wird, wobei der zweite Vektor an ein VPr- oder ein VPx-Protein oder Peptid fusioniert ist; und einem ein virales env-Protein codierenden dritten Vektor.
Verpackungs-Zelllinie nach Anspruch 1, wobei das Lentivirus ausgewählt ist aus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV und EIV:
Verpackungs-Zelllinie nach Anspruch 1, wobei (a) das vom ersten Vektor codierte retrovirale gag-Polyprotein eine retrovirale Matrix, ein Capsid- und ein Nucleocapsidprotein umfasst; oder (b) der Abschnitt des vom ersten Vektor codierten pol-Polyproteins eine retrovirale Protease umfasst; oder (c) der vom zweiten Vektor codierte Rest des retroviralen pol-Proteins eine retrovirale reverse Transkriptase sowie eine retrovirale Integrase umfasst.
Verpackungs-Zelllinie nach Anspruch 3, wobei der Rest des retroviralen pol-Polyproteins ferner eine Protease Spaltstelle upstream von der reversen Transkriptase und der Integrase umfasst.
Verpackungs-Zelllinie nach Anspruch 1, wobei (a) das vom dritten Vektor codierte env-Protein ein Hüllprotein umfasst, das aus einem Virus ausgewählt ist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe Retrovirus vom C-Typ, Lentivirus und Virus der Stomatitis herpetica; oder (b) die Transkription eines jeden von diesen Vektoren codierten Proteins von einem induzierbaren Promotor angetrieben wird; oder (c) die Transkription eines jeden von diesen Vektoren codierten Proteins über den Kontakt der Cre-Recombinase mit einer oder mehreren Lox-Stellen in diesem Vektor induziert wird; oder (d) ein vierter Vektor umfasst wird, der ein Verpackungssignal, eine virale lange endständige Sequenzwiederholung (LTR) sowie ein Transgen umfasst, wobei eine Expression zusammen mit dem ersten, zweiten und dritten Vektor in der Verpackungszelllinie zur Produktion eines rekombinanten, helferfreien Retrovirus führt, welches das Transgen enthält.
Verfahren zur Gewinnung einer zur Produktion eines rekombinanten, helferfreien Lentivirus befähigten Verpackungszelllinie, wobei das Verfahren die Transfektion einer Wirtszelle umfasst mit einem ein retrovirales gag-Polyprotein und einen Abschnitt eines retroviralen pol-Proteins codierenden ersten Vektor; einem den nicht vom ersten Vektor codierten Rest des retroviralen pol-Proteins codierenden zweiten Vektor; und einem ein virales env-Protein codierdenen dritten Vektor.
Verfahren nach Anspruch 6, in welchem der erste, zweite und dritte Vektor jeweils einen induzierbaren Promotor umfassen, der funktionsfähig mit einem das gag-Polyprotein, das pol-Polyprotein, das Vpr-Protein oder -Peptid, das Vpx-Protein oder -Peptid oder das env-Protein codierenden Gen verbunden ist und in welchem gegebenenfalls der Schritt enthalten ist, die Wirtszelle mit einem den Promotor induzierenden Mittel in Kontakt zu bringen.
Verfahren nach Anspruch 6, in welchem das Lentivirus ausgewählt ist aus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV und EIV:
Verfahren nach Anspruch 6, in welchem (a) das von dem ersten Vektor codierte retrovirale gag-Polyprotein eine lentivirale Matrix, ein Capsid- und eine Nucleocapsid-Protein umfasst; oder (b) der vom ersten Vektor codierte Abschnitt des pol-Polyproteins eine retrovirale Protease umfasst; oder (c) der vom zweiten Vektor codierte Rest des retroviralen pol-Polyproteins eine retrovirale reverse Transkriptase sowie eine retrovirale Integrase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, in welchem das vom dritten Vektor codierte env-Protein ein Hüllprotein umfasst, welches aus einem Virus ausgewählt ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe Retrovirus vom C-Typ, Lentivirus und Virus der Stomatitis herpetica;
Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten Lentivirus, welches die Transfektion einer Wirtszelle umfasst mit einem ersten Vektor, der funktionsfähig mit einem Promotor verbunden ein retrovirales gag-Gen und einen Abschnitt eines retroviralen Gens umfasst; einem zweiten Vektor, der den nicht vom ersten Vektor codierten Abschnitt des retroviralen pol-Gens sowie ein Gen umfasst, welches das gesamte oder nur einen Abschnitt eines Vpr- oder Vpx-Proteins codiert, wobei beide Gene als ein einziges Fusionsprotein exprimiert werden und funktionsfähig an einen Promotor gebunden sind; einem dritten Vektor, der ein virales env-Gen umfasst; und einem vierten Vektor, der ein virales Verpackungssignal, eine virale lange endständige Sequenzwiederholung (LTR) sowie ein funktionsfähig mit einem Promotor verbundenes Transgen umfasst, und der Gewinnung des rekombinanten Virus.
Verfahren nach Anspruch 11, in welchem (a) jeder der im ersten, zweiten, dritten oder vierten Vektor enthaltenen Promotoren induzierbar ist und gegebenenfalls ferner der Schritt des in Kontakt Bringens der Wirtszelle mit einem den Promotor induzierenden Mittel umfasst wird; oder (b) das Retrovirus ein Lentivirus, wahlweise HIV, ist; oder (c) der Abschnitt des im ersten Vektor enthaltenen pol-Gens eine retrovirale Protease codiert, oder (d) der Rest des im zweiten Vektor enthaltenen pol-Gens eine retrovirale reverse Transkriptase und eine retrovirale Integrase codiert.
Verpackungszelllinie, die mit einem Verfahren nach jedem der Ansprüche 6 bis 10 gewonnen werden kann.