WO2006013103A2 - Induzierbare genexpression - Google Patents

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WO2006013103A2
WO2006013103A2 PCT/EP2005/008427 EP2005008427W WO2006013103A2 WO 2006013103 A2 WO2006013103 A2 WO 2006013103A2 EP 2005008427 W EP2005008427 W EP 2005008427W WO 2006013103 A2 WO2006013103 A2 WO 2006013103A2
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WO
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nucleic acid
protein
acid sequence
sequence
target nucleic
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PCT/EP2005/008427
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Frank Notka
Ralf Wagner
Diana Hammer
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Geneart Ag
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducible gene expression in which a target nucleic acid sequence to be expressed is modified at the nucleic acid level such that an increase in expression is achieved, and the nucleic acid sequence modified in this way is expressed under the control of an inducible transcription control sequence.
  • viruses rely on active export of their incompletely spliced transcripts from the nucleus of the infected host cell. This can be done either by using a cis-RNA signal within the viral transcripts (constitutive transport elements) or by using viral proteins.
  • Cis-active transport elements are used, for example, by MPMV-CTE (Mason-Pfizer Monkey Virus Constituent Transport Element), SRV-CTE (Simian Retrovirus Constituent Transport Element), Hepatitis B Virus PRE (Post-Transcriptional Regulatory Element) and HSV (Herpes Simplex Virus) (used within the TK (thymidine kinase) gene). These RNA elements recruit cellular factors and export pathways to allow for the nuclear export of viral transcripts.
  • MPMV-CTE Melat-Pfizer Monkey Virus Constituent Transport Element
  • SRV-CTE Syimian Retrovirus Constituent Transport Element
  • Hepatitis B Virus PRE Post-Transcriptional Regulatory Element
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • nuclear export may also be mediated via an export factor that specifically binds to a target sequence within the viral transcripts and transports them into the cytoplasm in association with cellular factors.
  • Ad-5 adenovirus 5 transcripts using the 34K and E4orf6 proteins
  • EBV Epstein-Barr virus
  • herpesvirus Saimiri transcripts using the ORF57 gene product HSV transcripts using the ICP 27 protein
  • HTLV-I and II human T-cell Leukemia Virus I and II
  • Rex proteins EIAV (Equine Infectious Anaemia Virus), SIV (simian immunodeficiency virus), and HIV-1 and HIV-2 (human immunodeficiency virus 1 and 2) transcripts using the Rev proteins.
  • HIV-1 Rev-mediated nuclear export is later HIV-1 transcripts. Like all lentiviruses, HIV-1 relies on activating multiple genes from only one proviral template and expressing them in a timed sequence. By alternative splicing events as well as further regulatory mechanisms taking place on RNA level different genes from only one ⁇ 9 kb primary transcript are generated. These viral transcripts can be divided into 3 classes due to their size: ⁇ 9 kb unspliced (gag, pol), ⁇ 4 kb single spliced (env, vif, vpr, vpu) and ⁇ 2 kb multiply spliced ⁇ rev, tat, nef) RNAs.
  • the single and unspliced transcripts can never be detected in the cytoplasm.
  • the un- and simply spliced transcripts then accumulate in the nucleus, and the late structural proteins (Gag, Env) and enzymes (Pol) they are able to translate can not be formed.
  • the viral Rev protein is thus essentially involved in the time-regulated expression of the viral genes.
  • HIV-1 Rev as well as the RNA transport molecules listed above Shuttle proteins that transport viral RNAs from the nucleus into the cytoplasm through interaction with an RNA target located within viral transcripts.
  • HIV-1 Rev specifically binds to its RNA target RRE, the "rev-responsive element".
  • This 351 nucleotide (nt) long region is located within the Env reading frame and thus part of all un-spliced and single-spliced transcripts.
  • RNP ribonucleoprotein
  • a cellular transcript can not leave the cell nucleus until the splicing process is complete, or all active splice sites have been removed from the primary transcript.
  • the late viral transcripts are intron-containing, incompletely spliced pre-mRNAs that are transported into the cytoplasm using Rev and RRE. Therefore, the influence of the cellular splicing machinery on the nuclear retention of late transcripts was studied early on (Mikaelian et al., 1996) (Kjems et al., 1991; Kjems et al., 1993; Chang et al., 1989; Powell et al. , Lu et al., 1990; O'Reilly et al., 1995).
  • HIV wild-type RNA relies on an alternative export pathway, characterized by the Crm1 protein, dependent on the HIV shuttle protein Rev, the synthetic mRNA is constitutively transported into the cytoplasm on the regular nuclear export pathway for cellular mRNAs. This constitutive expression of HIV proteins opens new avenues for HIV therapy at the genetic level.
  • anti-HIV genes in cells can be efficiently utilized for intracellular inhibition of HIV replication (Bunnell et al., 1998).
  • a whole range of HIV gene therapy strategies have been developed, ranging from antisense constructs and RNA decoys via specific RNA-degrading ribozymes and RNA interference to transdominant-negative HIV-derived proteins. Beside these Intracellular inhibitors that specifically interfere with HIV replication may also prevent the re-infection of cells or the spread of progeny viruses as part of gene therapy.
  • Various approaches are concerned with the expression of secretable anti-HIV proteins, immunostimulating or unspecific antiviral factors, and not least with the expression of cytotoxic factors after infection (for review, see Mautino et al., 2002).
  • viral replication can be accomplished by preventing virus release in a very specific manner, using HIV-derived protein derivatives.
  • Deletions in the gag mediate a transdominant negative (TDN) effect on the neoplasm and release of progeny viruses (Poblotzki et al., 1993, Trono et al., 1989, Smythe et al., 1994, Furuta et al., 1997). These deletions are located in p17MA, in the transition region of p17MA / p24CA and in the C-terminal domain of p24CA. The exact mechanism of action of the transdominant-negative effect has not been elucidated.
  • Tat, Rev, and Tat / Rev-dependent expression were studied, and in part the inhibition of HIV proliferation in vitro was described (Caruso et al., 1992, Harrison et al., 1992, Liu et al. , 1994).
  • thymidine kinase (Marcello et al., 1998) and interferon ⁇ 2 (Ragheb et al., 1999) could be increased by a factor of 5 and 4, respectively, and by a factor of 3.3 and ⁇ 2, respectively, by Rev .
  • HIV-1 TDN Gag derivatives For HIV-1 TDN Gag derivatives, a marked Rev-mediated induction of protein synthesis (with low basal activity) was shown, which was associated with a substantial inhibition of HIV replication (up to 94%) (Smythe et al., 1994; Furuta et al., 1997).
  • Tat- and Rev-dependent expression of TDN Gag For the combination of Tat- and Rev-dependent expression of TDN Gag, a significantly increased protein synthesis could also be achieved by cotransfection of tat and rev expression plasmids (Ding et al., 2002, Cara et al., 1998).
  • Rev influences the export of RNA from the nucleus and is only associated with the corresponding cis-active Retention sequences (INS, see above) and a cis-standing recognition sequence (RRE) functional.
  • Isolated gag genes which are reduced in size (and thus also in size), are efficiently transcribed under a correspondingly active promoter (eg CMV) and it seems likely that some of the RNA will enter the cytoplasm without the assistance of the Rev and is translated.
  • the length of the LTR used can also have an influence on the regulation. Thus, with a minimal LTR, a complete shutdown of transcription was detected in the absence of Tat (Miyake et al., 2001), thus a "dense" inducible promoter described.
  • the LTR / Tat system appears to be the more consistent switch module. Also because an induction by Rev is followed by action, which can lead to an initial virus multiplication, just before the inhibition can take effect through the transgene. Inter alia, the observed incomplete inhibition of replication after Rev induction is explained (Smythe et al., 1994).
  • TDN transdominant negative
  • TDN derivatives used so far are derived from the HIV-1 wild-type genome, thus contain INS motifs and are therefore dependent on a Rev-mediated nuclear export. As described above, therefore, the actual inhibitory effect is only with the presence of REV in the nucleus, whereby the first HIV transcripts unhindered enter the cytoplasm and can complete the replication. Therefore, it is not surprising that a combination of both regulatory systems leads to a very inefficient inhibition of HIV replication (Cara et al.,
  • transgene a gene to be expressed in a target nucleic acid sequence to be expressed
  • Inducible gene expression is e.g. is essential in the use of toxic gene products and has significant advantages over other constitutive expression in other therapeutically useful genes:
  • An uninfected cell is not stressed in its physiological performance by a high expression of additional factors under stress.
  • Non-specific or unforeseeable interactions of the gene products could lead to physiological modifications, such as activation, proliferation or the like, also in neighboring cells, in tissues or in the whole organism.
  • HIV-derived proteins are recognized by immune cells in the environment of HIV infection and the corresponding protein-expressing cells are eliminated.
  • a transcriptional control sequence is a nucleic acid sequence that enables expression of a nucleic acid sequence operatively associated therewith, particularly a gene. It may be a promoter, in addition, the transcriptional control sequence may also include other elements, such as enhancers and the like.
  • the inducible transcriptional control sequence is an inducible promoter.
  • any inducible promoter system is suitable, which in the state the technique is known.
  • a natural or artificial inducible promoter can be used, for example, a tetracycline-inducible promoter (Tet on / Tet off system).
  • an inducible viral promoter can also be used.
  • the transcriptional control sequence is induced by a transactive factor.
  • the transactive factor is a factor that acts in trans and has an impact on transcription. This is preferably a transcription factor. Most preferably, the transactive factor is a viral transactivating factor.
  • the inducible transcriptional control sequence is inducible by a viral transactive factor.
  • Transcriptional control sequence inducible by a viral transactive factor can be derived from any virus.
  • sequences of retroviruses HCV (hepatitis C
  • HBV hepatitis B virus
  • HSV herpes simplex virus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • SV40 simian virus 40
  • AAV adeno-associated virus
  • transactive factors used herein are accordingly, e.g. selected from, but not limited to, the following viral factors: NS5A
  • HCV HCV
  • HBX HBV
  • VP16 / ICP4 EBV
  • EBNA1 / Rta EBV
  • ART HHV8
  • Large T antigen SV40
  • Rep78 / 68 AAV
  • E1A adenovirus
  • a retroviral LTR promoter or a functional subsequence thereof is preferably used as an inducible transcription control sequence inducible by a viral transactive factor.
  • the transactive factor is a retroviral Tat or Tax protein.
  • the LTR promoter may be selected from the LTRs of HIV-1, HIV-2, SIV 1 HTLV and other related retroviruses, the LTR promoters exhibit. In particular, antiviral promoters are preferred, especially those of HIV.
  • a transactive factor in the sense of the present invention is thus a factor which exerts an influence on the transcription in trans, preferably in that the transactive factor interacts with the inducible transcriptional control sequence.
  • An example of such a transactive factor is thus the Tat protein already mentioned above.
  • the target nucleic acid sequence to be expressed is modified. This is done at the nucleic acid level and preferably so that the corresponding amino acid sequence is not or substantially not changed. If the amino acid sequence is changed in the modification of the nucleic acid sequence to increase gene expression, this should have no influence on the function of the resulting protein.
  • the modification of the target nucleic acid sequence to increase gene expression can be performed in a number of ways.
  • the codon usage of the transgene is preferably adapted to the codon usage of mammalian cells, more preferably that of human cells.
  • Modified target nucleic acid sequences suitable for gene therapy can be generated, for example, by choosing the codon distribution as occurs in exported cellular mRNA.
  • a codon choice should be used here, as in most or secondarily mammalian cells More preferably, codon selection is adapted to that of actively expressed mammalian genes. (Ausubel et al., 1994).
  • the nucleic acid sequence is modified using Gene Optimizer technology (German patent application DE 102 60 805.9, PCT / EP03 / 14850) for optimal expression in mammals.
  • the codon choice it is also possible to optimize the GC content.
  • this is achieved by adjusting the GC content of the transgene as accurately as possible to the GC content of the expression system used.
  • the degeneration of the genetic code is utilized, so that the change of the nucleic acid sequence for the purpose of increasing the GC content does not lead to a change in the amino acid sequence.
  • the optimal percentage of G and C nucleotides in a sequence to be expressed depends on the particular organism or cells in which the sequence is to be expressed. For example, the optimal GC content of nucleic acids in mammalian cells is about 50%.
  • the optimization of the GC content or the adaptation of the codon usage is preferably carried out by silent mutations or by mutations which do not influence the activity of the protein encoded by the transgene.
  • the codon usage need not necessarily be adjusted if the GC content of said gene is already over 50%.
  • Genes with wild-type codon usage can be made from long oligonucleotides by stepwise PCR, as indicated in the example.
  • Another way to modify the target nucleic acid sequence to be expressed for the purpose of enhancing expression is to either deliberately eliminate motifs that adversely affect transcription rather than the above or in addition thereto. This includes, for example, the deletion of nucleic acid motifs such as poly-A sequences and the like, which may already be known to the person skilled in the art.
  • Other such negative expression influencing motifs include RNA instability motifs, adenine-rich motifs, recognition motifs for endonucleases, motifs that influence RNA secondary structure, and the like.
  • the target nucleic acid sequence to be expressed preferably encodes a therapeutic and / or diagnostic protein.
  • a therapeutic and / or diagnostic protein may be selected from toxic gene products, suicide factors, apoptosis-inducing proteins, messengers, transactivators, regulatory proteins, transdominant-negative proteins, cytokines, chemokines, etc.
  • Specific examples are interferon ⁇ , SDF-I RANTES 1 MIP1 ⁇ , TNF, and interleukins especially the interleukins 2, 6, 10, 12, 15 and 28.
  • the target nucleic acid sequence to be expressed encodes a gene which, when activated by the LTR / Tat system, eg after activation by HIV infection, produces proteins which are suitable to induce the natural defense mechanisms of neighboring cells or to prevent infection by HIV by binding to the corresponding receptors.
  • these are in particular the receptors CD4, CCR5 or CXCR4.
  • enzymes such as thymidine kinase, cytosine deaminase, purine nucleoside phosphorylase, carboxypeptidase, carboxylesterase, nitroreductase, peroxidase, xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, glycosidase, thymidine phosphorylase and the like.
  • the method is particularly suitable for the expression of toxic gene products, eg thymidine kinase from herpesviruses, nucleases or apoptosis-inducing proteins (eg FAS / FAS ligand, caspases etc.).
  • TNF-related apoptosis-inducing ligand TRAIL
  • PLC protein kinase C
  • TNF tumor necrosis factor
  • AIF apoptosis-inducing factor
  • the transgene may be a regulator gene which, after its induced expression in a cell as a molecular switch molecule, switches the expression of other genes on or off.
  • a regulatory gene for example, a gene coding for a transcription factor can be used.
  • these applications are not limited to the infection with HIV, the skilled person is able to use appropriate systems for other infections.
  • the transgene is a viral gene.
  • the target nucleic acid sequence to be expressed may also be a gene for a transdominant-negative (TDN) protein.
  • TDN transdominant-negative
  • this is a viral TDN protein, preferably a retroviral, most preferably a lentiviral.
  • lentiviral TDN proteins are suitable here, for example derivatives of Pr55 9a9 , Gp41, Gp120, Rev, protease, integrase, reverse transcriptase, Nef, Vpr, Vpv or any other lentivirus protein which is suitable for the replication cycle of lentiviruses, in particular HIV interruption or to prevent the release / detachment of virus particles.
  • HIV-1 gag (group-specific antigen) becomes transgenic the codon choice being adapted to the choice of codons as found in human genes.
  • gag gene containing further deletions. This can increase the TDN effect.
  • further deletions in the p24 region or one or more assembly domains.
  • the amino acid sequence of the gag gene product was transformed into a synthetic gag-encoding reading frame using the
  • Reading frame was then constructed using long oligonucleotides and a stepwise PCR as a fully synthetic reading frame.
  • the syngag reading frame was cloned into an expression vector.
  • the syngag vector produced proved to be completely independent of the presence of the Rev protein, an RRE sequence, a 5 ' untranslated region (UTR), or the expression of the HIV gag
  • HIV-1 wild-type gene (wtgag) was found to be dependent on Rev, RRE and the 5 ' UTR including splice donor
  • the invention therefore preferably relates to a method for the expression of transdominant negative (TDN) lentivirus proteins in eukaryotic cells, comprising:
  • the inducibility of expression is limited to the presence of Tat, thus avoiding the need for the HIV RRE / Rev in the transfer construct, and ii) ensuring the Rev independence of the transcript by appropriate codon selection for the transfer construct ,
  • the transcriptional control sequence is preferably positioned to the transgene analogously to the natural occurrence.
  • the induction of the promoter is carried out by a lentiviral Tat protein, preferably by the HIV Tat protein, which acts as a trans-active factor.
  • a trans-acting factor means both a single protein and a protein complex.
  • RNA stability-influencing motifs The stabilization of the RNA and the improvement of the Kemexport properties as well as the independence of protein production from an RRE / Rev interaction (in the case of HIV-derived proteins) can be achieved, for example, by a corresponding codon selection, taking into account RNA stability-influencing motifs.
  • nucleic acid vector comprising:
  • a transcriptional control sequence inducible by a transactive factor, preferably by a viral transactivator, in operative association with the expression to be expressed
  • Target nucleic acid sequence wherein the sequence according to (a) is modified at the nucleic acid level so that an increase in expression is achieved.
  • a nucleic acid vector in this context is understood as meaning a nucleic acid construct which is suitable for expression of a target nucleic acid sequence contained therein in a suitable expression system, e.g. a cell, an organism or an in vitro system, and comprising at least one target nucleic acid sequence to be expressed and an inducible transcriptional control sequence operably linked thereto.
  • a suitable expression system e.g. a cell, an organism or an in vitro system
  • Such a vector may contain other coding sequences, e.g. Selection marker genes and the like.
  • the person skilled in the art is able to use the target nucleic acid sequence to be expressed in conjunction with its transcription control sequence in a suitable commercially available plasmid vector or the like or else a self-engineered one.
  • the target nucleic acid sequence to be expressed and the inducible transcription control sequence can also be selected here as described above.
  • the modification of the sequence can also be carried out as explained above.
  • a preferred embodiment relates to vectors that can be used in HIV gene therapy and are characterized in that they encode a therapeutic gene that is expressed after infection of the cell with HIV.
  • the transcription of corresponding genes is controlled by the HIV-specific LTR ("long terminal repeat") region and takes place only in the presence of the HIV Tat protein, whereby synthetic, adapted to the expression in human cells reading frame for the therapeutic Genes may be used to enhance gene expression, particularly RNA stability and RNA nuclear export, which may be directed against different steps in the HIV replication cycle and intervene with cell infection, replication of HIV, or propagation of progeny viruses.
  • the vector according to the invention may additionally contain a further transgene, which preferably codes for a therapeutic, gene therapeutic and / or diagnostic protein.
  • This further transgene may also be under the control of an LTR promoter, e.g. the same promoter as the sequence according to (a). Or it may be controlled by a separate promoter, which may be constitutive or inducible.
  • the vector may be, for example, viral (eg adeno-associated viruses, adenoviruses, retroviruses, herpesviruses, alphaviruses, etc.) or bacterial origin or a plasmid.
  • viral eg adeno-associated viruses, adenoviruses, retroviruses, herpesviruses, alphaviruses, etc.
  • the inducible transcriptional control sequence is selected such that expression of the foreign gene is dependent on the presence of the HIV-1 Tat protein. If the Tat transactivation is successfully reconstituted, preferably an increase in expression of the Tat-dependent gene should be at least 3-fold, preferably 5-fold, more preferably 10-fold or more.
  • the vector comprises a sequence according to SEQ ID NO. 1, 16 or 17.
  • the present invention further provides modified target nucleic acid sequences which, when in operative
  • Transcriptional control sequence causing increased gene expression.
  • these are modified
  • Target nucleic acid sequences selected from the sequences given in this invention in the Examples and Sequence Listing. Most preferably, the modified target nucleic acid sequences are selected from the following sequences: SEQ ID NO. 1, 16 and 17.
  • cells preferably eukaryotic cells, more preferably mammalian cells, most preferably human cells infected with a nucleic acid or a nucleic acid
  • nucleic acid is present in a transcriptional form.
  • the nucleic acid or the vector may for example be episomal or stably integrated into the chromosome. There may be one or more copies in the cell.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions based on the vectors and modified lentiviruses and cells disclosed herein.
  • the medicaments according to the invention are suitable as therapeutic and diagnostic applications, in particular they are suitable for the diagnosis, prevention or therapy of virus-associated diseases or / and tumor diseases.
  • the target nucleic acid sequence to be expressed is in particular a suicide gene or the like.
  • the drugs can be used for therapy, preferably for the treatment of antiviral infections, eg HIV and SIV, in particular HIV-1 and HIV-2.
  • antiviral infections eg HIV and SIV, in particular HIV-1 and HIV-2.
  • the expert is capable of the Promoter sequence to adapt to the system in which the expression is to take place.
  • antiviral infections can now be controlled by treating infected individuals in vitro, ex vivo and of course in vivo, eg by introducing the nucleic acids or vectors according to the invention into PMLs from these patients or in T cells in different stages of differentiation or stem cells.
  • Figure 1 shows schematically all the gag-encoding constructs produced.
  • FIG. 2 shows the results of the expression of various gag coding constructs in H1299 cells.
  • Figure 2A shows an HIV-1 p24-specific Western blot of transfected cells.
  • Figure 2B shows a p24 EL I SA test.
  • FIG. 3 shows the results of the expression of wild-type gag expressing constructs in the presence and absence of Tat and / or Rev.
  • Figure 3A shows an HIV-1 p24-specific Western blot of transfected cells.
  • Figure 3B an ELISA test.
  • Figure 4 shows the effect of the transdominant gag negative proteins on the release of HIV particles.
  • Figure 4A shows percent inhibition of particle release according to a p24 ELISA assay.
  • Figure 4B shows the percent inhibition of the infectivity of released virus particles.
  • Figure 5 shows the percent inhibition of viral particle release formed in the presence of trans-dominant negative gag constructs with further deletions in p24.
  • Figure 5A shows the percent release inhibition
  • Figure 5B shows the inhibition of infectivity in percent.
  • Figure 6 shows the sequences of TDsyngag and TDwtgag and a sequence comparison between TDwtgag and TDsyngag.
  • Figure 7 shows the nucleic acid sequences of TDsyngag delta 2 and TDsyngag delta 2 delta p7.
  • SEQ ID no. Figure 1 shows the nucleic acid sequence of TDsyngag.
  • SEQ ID no. Figure 2 shows the amino acid sequence of TDsyngag.
  • SEQ ID no. Figure 3 shows the nucleic acid sequence of TDwtgag.
  • SEQ ID no. 4 shows the amino acid sequence of TDwtgag.
  • SEQ ID no. Figure 16 shows the nucleic acid sequence of TDsyngag delta 2.
  • SEQ ID no. 17 shows the amino acid sequence of TDsyngag delta 2.
  • SEQ ID no. Figure 18 shows the nucleic acid sequence of TDsyngag delta 2 delta P7.
  • SEQ ID no. Figure 19 shows the amino acid sequence of TDsyngag delta 2 delta P7.
  • HIV-1 transdominant negative (TDN) Gag derivatives were prepared as constitutively, Tat, Rev or Tat / Rev dependent gene constructs.
  • Rev dependence was achieved by using HIV wild-type (wt) gene sequences, including the 5 ' untranslated region (UTR), in conjunction with the HIV Rev responsive element (RRE).
  • wt wild-type gene sequences
  • UTR 5 ' untranslated region
  • RRE HIV Rev responsive element
  • Rev independence was made possible by synthetic, GC-rich gene sequences, with the encoded amino acid sequence being identical for both constructs.
  • Dependence on Tat was achieved by using HIV-1 LTR as a transcriptional control. In contrast, for constitutive transcription, the CMV promoter / enhancer was used.
  • CMV-syngag constitutive expression
  • LTR-syngag action-dependent
  • LTR-wtgag-RRE rev dependent
  • Tat- and Rev-dependent Tat- and Rev-dependent
  • HIV-1 group-specific antigen (GenBank Accession Number: M15654.1 HIVBH102, nucleotides 112-1650, reference: Ratner L 1 Haseltine W, Patarca R, Livak KJ 1 Starcich B, Josephs SF 1 Doran ER, Rafalski JA, Whitehom EA 1 Builder K, et al. Complete nucleotide seqence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature. 1985 Jan 24-30; 313 (6000): 277-84) should be synthesized using a codon choice as found in human cells.
  • the amino acid sequence of the Gag protein (corresponding to GenBank accession number: M15654 JIVBH102, nucleotides 112-1408) was translated into a corresponding nucleotide sequence with a deletion of nt 304-489.
  • An appropriate software package (GeneOptimizer) was used for codon optimization and optimization of the RNA sequence.
  • codon optimization and optimization of the RNA sequence For the subcloning and for adding further sequence elements within untranslated regions further restriction sites further restriction sites were added.
  • the nucleic acid sequence, including the interfaces, is shown in SEQ ID NO. 1 indicated.
  • This sequence was prepared as a fully synthetic gene using synthetic oligonucleotides according to a method already described (Zolotukhin et al., 1996).
  • Figure 6 shows a comparison of the nucleic acid sequences of TDsyngag (codon selection derived from mammalian genes) and TDwtgag (codon selection derived from HIV structural genes).
  • the TDGag-encoding DNA fragment (“TDsyngag”) so prepared was amplified using the
  • CMV cytomegalovirus
  • RNA target sequence (Graf et al., 2000). This target sequence interacts at the RNA level with a viral nuclear export protein (in the case of HIV-1 Rev protein) and cellular nuclear export proteins.
  • the wild-type construct was C-terminally shortened by introducing two consecutive stop codons in the gag reading frame (codons for 372F and 373L were mutated).
  • the mutations were introduced by site-directed mutagenesis kit (Stratagene) using oligonucleotides gag-stop1 and gag-stop2.
  • the resulting construct was named pc-CMV-UTR-wtgag-RRE.
  • a deletion from nt 304 to nt 489 was inserted in this construct analogously to TDsyngag (pc-UTR-TDwtgag-RRE).
  • the coding sequence is shown in SEQ ID no. 3 indicated.
  • the coding sequences were placed under the transcriptional control of the HIV promoter to achieve Tat dependence of the Gag protein derivative.
  • the HIV-1 Long Terminal Repeat (LTR) contains such a promoter. This region was amplified by PCR using oligonucleotides ItM and Itr2 from HIV-1 proviral DNA (HX10 see (Ratner et al., 1987)), and using the Mfu ⁇ and EcoR ⁇ cleavage sites directly 5 'in front of the ATG of the gag. cloned coded reading frame in the pc-CMV TDsyngag, wherein the CMV promoter was replaced by the LTR.
  • Figure 1 shows all the Gag-encoding constructs shown schematically.
  • Example 2 shows all the Gag-encoding constructs shown schematically.
  • TDgag constructs can be controlled by HIV regulatory proteins
  • the transfected cells were washed twice with ice-cold PBS (10 mM Na 2 HPO 4 , 1.8 mM KH 2 PO 4 , 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), scraped off in ice-cold PBS, centrifuged at 300 ⁇ g for 10 min Lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100 (w / v)) for 30 min on ice. Insoluble constituents of the cell lysate were centrifuged off for 30 minutes at 10,000 ⁇ g and 4 ° C. The total protein amount of the supernatant was determined by the Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Kunststoff) according to the manufacturer's instructions.
  • the samples were mixed with the same volume of 2-fold sample buffer (Laemmli, 1970) and heated to 95 0 C for 5 min. 50 ⁇ g total protein from cell lysates were separated on a 12.5% SDS / polyacrylamide gel (Laemmli, 1970), electrotransferred to a nitrocellulose membrane and with the monoclonal antibody p 24 -spezif ⁇ schen 13-5 (Wolf et al., 1990) analyzes and detects coupled by means of a secondary, AP (alkaline phosphatase) antibodies and by chromogenic staining detected (Fig. 2A).
  • AP alkaline phosphatase
  • cell lysates were quantified in a commercially available p24 ELISA test (NEN). 1 ⁇ g of the cell lysate was evaluated according to the manufacturer's instructions and the total concentration of HIV-1 p24 was determined (FIG. 2B).
  • H1299 cells were transiently transfected with the gag constructs.
  • the expression obtained was analyzed in the presence and absence of Tat or Rev ( Figure 2).
  • constitutive expression of the TDgag was detected independently of Tat or Rev ( Figure 2A, lanes 2 and 2B, 2).
  • the basal activity of the TDgag expression was slightly lower for the pc-LTR-TDsyngag construct compared to pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE, but significantly reduced for both constructs compared to the pc-CMV-TDsyngag and only slightly above the negative control (about factor 2.5 for pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE and 1.5 for pc-LTR-TDsyngag, Fig. 2B).
  • the gene product of pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE could not be detected by these methods.
  • the deletion in the gag leads to a reduced recognition by the monoclonal antibody and, in conjunction with a strongly restricted expression, the achieved TDgag amounts are insufficient for detection by antibodies. Therefore, the Tat and Rev dependence in a reference construct (complete wtgag sequence) was investigated. This construct (pc-LTR-UTR-wtgag-RRE) was dependent on both Tat and Rev. Tat alone led to an increase in expression by a factor of 4, Rev alone by a factor of 16 and the combination of Tat and Rev by a factor of 47 (Fig. 3).
  • H1299 cells were transiently transfected with combinations of plasmids as described in Example 1.
  • 15 ⁇ g HX10 proviral DNA and 30 ⁇ g each of the TDgag constructs or 30 ⁇ g pcDNA3.1 were used as control for uninhibited replication.
  • the cell culture supernatants were harvested, cell components were sedimented by centrifugation (10 min at 10,000 xg) and the supernatants were incubated with 10% of a Triton x 100 solution (5%) for lysis of the HIV particles in the supernatant at RT for 15 min.
  • the treated supernatants were used in appropriate dilutions in a p24 ELISA test (NEN) and the amount of p24 quantified.
  • the reduction of the p24 amount correlates directly with an inhibition of particle release after transfection with an HIV-provirus.
  • the determined p24 levels were set in relation to the control (cotransfection with pcDNA3.1, uninhibited) and percent inhibition calculated. For each combination at least 6 independent approaches were tested.
  • TDgag constructs tested resulted in a significant inhibition of particle release.
  • the TDsyngag (TDsg) constructs had a very high inhibition, independent of the upstream promoter.
  • the inhibitory effect of the TDwtgag (TDwtg) constructs was dependent on the promoter region.
  • the inhibition of particle release was significantly higher under a CMV promoter control than under the HIV LTR promoter.
  • the TDgag constructs have a trans-dominant negative effect on HIV infectivity H 1299 cells were transfected with plasmid combinations as described under Example 3, and the supernatants were harvested after 48 h and purified. To check the influence of the TDgag constructs on the release of infectious progeny viruses, the conditioned cell culture supernatants were checked in a corresponding indicator cell line (MAGI) (Kimpton et al., 1992).
  • MAGI indicator cell line
  • the eukaryotic MAGI (multinuclear activation of a galactosidase indicator) cells is an indicator cell line that has a
  • the MAGI cells were provided by the UK Medical Research Council (MRC).
  • MRC UK Medical Research Council
  • the viral LTR (long terminal repeat) promoter precedes the E. coli ⁇ -galactosidase gene (lacZ). The expression of the lacZ is therefore dependent on the transcriptional activity of the LTR
  • the medium was aspirated and the wells were washed with PBS.
  • the monolayers were fixed with 200 .mu.l fixing solution (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde in PBS) and washed again with PBS after incubation for 5 min at room temperature.
  • 200 ⁇ l of staining solution (16 mg of X-GaI in 4 ml of DMSO, ad 40 ml of PBS, addition of 400 ⁇ l of K-ferricyanide (400 mM), 400 ⁇ l of K-ferrocyamide (400 mM) and 80 ⁇ l of MgCl 2 (1 M )
  • the incubation was carried out at 37 ° C. for between 15 minutes and 3 hours. The blue cells were counted by light microscopy.
  • the inhibition was determined as reduction of blue cells and in relation to the number of blue cells in the positive control indicated as percent inhibition of infectivity. In essence, the results correlate with the particle release inhibition data (Figure 4B). Nearly complete inhibition was demonstrated for the pc-CMV-TDsyngag, pc-LTR-TDsyngag, and pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE constructs, while the pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE construct caused approximately 50% inhibition (FIG. Shown are the results of an exemplary experiment from two independent approaches, Figure 4B).
  • Deletion concerns amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids 230 to 300, an area in which very many amino acids
  • H1299 cells were transfected to check the TDN effect with combinations of HX10 (15 ug) and TDsyngagd2 or pcDNA3.1 (each 30 ug plasmid DNA) and the supernatants, as described under 3., in p24 -ELISA and, as described under 4., evaluated by means of the MAGI cells. Inhibition of particle release (results of the p24 ELISA evaluation, Fig. 5A, at least 6 independent approaches) and the infectivity of progeny viruses (results of the MAGI evaluation, Fig. 5B, two independent approaches) was demonstrated for all constructs used.
  • Gag-stop2 GTACTGAGAGACAGGCTAATTAATGAGGGAAGATCTGCCTTCC 12
  • HIV-i Rev-Independent Human Immunodeficiency Virus Type (1)
  • U1 small nuclear RNA plays a direct role in the formation of a rev- regulated human immunodeficiency virus env mRNA that remains unspliced, Proc. Natl. Acad. Be. USA 87, 7598-7602
  • RNA sequences in the gag region of human immunodeficiency virus type 1 decrease RNA stability and inhibition expression in the absence of Rev protein, J. Virol. 66, 150-159
  • HIV-1 gag mutants can dominantly interfere with the replication of the wild-type virus, Cell 59, 113-120

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Vektorkonstrukte für eine HIV-spezifische Gentherapie. Die Expression der Transgene ist an eine Infektion der Zelle mit HIV gekoppelt, indem die Transkription des Transgens durch eine von HIV abgeleitete Transkriptionskontrollregion kontrolliert wird. Das Transgen wird außerdem durch Modifikation der Nukleotidsequenz in der RNA­Stabilität und Expressionseffizienz verbessert.

Description

Induzierbare Genexpression
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die induzierbare Genexpression, wobei eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz auf Nukleinsäureebene so modifiziert wird, dass eine Steigerung der Expression erreicht wird, und die so modifizierte Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle einer induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz exprimiert wird.
Verschiedenste Viren sind auf einen aktiven Export ihrer unvollständig gespleißten Transkripte aus dem Zellkern der infizierten Wirtszelle angewiesen. Dies kann entweder über die Verwendung eines cis-ständigen RNA-Signals innerhalb der viralen Transkripte (konstitutive Transportelemente) erfolgen oder geschieht mit Hilfe viraler Proteine.
Cis-aktive Transportelemente werden beispielsweise von MPMV-CTE (Mason-Pfizer Monkey Virus constitutive transport element), SRV-CTE (Simian Retrovirus constitutive transport element), Hepatitis B-Virus PRE (posttranscriptional regulatory element) und HSV (Herpes Simplex Virus) (innerhalb des TK (Thymidinkinase)-Gens) verwendet. Diese RNA-Elemente rekrutieren zelluläre Faktoren und Exportwege, um den Kemexport der viralen Transkripte zu ermöglichen.
Alternativ dazu kann der Kernexport auch über einen Exportfaktor vermittelt werden, der spezifisch an eine Zielsequenz innerhalb der viralen Transkripte bindet und diese im Zusammenspiel mit zellulären Faktoren in das Zytoplasma transportiert. So werden beispielsweise Ad-5 (Adenovirus 5)- Transkripte mit Hilfe der 34K- und E4orf6-Proteine, EBV (Epstein-Barr Virus)-Transkripte mit Hilfe des EB2-Proteins, Herpesvirus Saimiri- Transkripte mit Hilfe des ORF 57-Genproduktes, HSV-Transkripte mit Hilfe des ICP 27-Proteins, HTLV-I und Il (human T-cell Leukemia Virus I und II)- Transkripte mit Hilfe der Rex-Proteine, EIAV (Equine Infectious Anaemia Virus)-, SIV (Simian Immunodeficiency Virus)-, und HIV-1 und HIV-2 (human Immunodeficiency Virus 1 und 2)-Transkripte mit Hilfe der Rev-Proteine exportiert.
Am besten untersucht ist der HIV-1 Rev vermittelte Kernexport später HIV-1 - Transkripte. Wie alle Lentiviren ist HIV-1 darauf angewiesen, aus nur einer proviralen Matrize mehrere Gene zu aktivieren und in einer zeitlich festgelegten Abfolge zu exprimieren. Durch alternative Spleißereignisse sowie weitere, auf RNA-Ebene stattfindende Regulationsmechanismen werden unterschiedliche Gene aus nur einem ~9 kb großen Primärtranskript generiert. Diese viralen Transkripte können aufgrund ihrer Größe in 3 Klassen aufgeteilt werden: ~9 kb ungespleißte (gag, pol), ~4 kb einfach gespleißte (env, vif, vpr, vpu) und ~2 kb mehrfach gespleißte {rev, tat, nef) RNAs.
Neben dem Auftreten von unvollständig bis mehrfach gespleißten Transkripten kann zudem eine zeitliche Abfolge in der Expression dieser unterschiedlichen RNA-Spezies beobachtet werden. So sind in der frühen Phase der Replikation im Zytoplasma der infizierten Zellen nur die mehrfach gespleißten ~2 kb RNAs, und ihre Genprodukte Rev, Tat und Nef nachweisbar. Erst zeitlich verzögert treten dort dann auch die un- (~9 kb) und einfach (~4 kb) gespleißten Transkripte und ihre Genprodukte Gag, Pol und Env in Erscheinung.
In Zellen, die mit Virus-Mutanten, denen ein aktives Rev-Protein fehlt, infiziert wurden, können die einfach- und nichtgespleißten Transkripte jedoch nie im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die un- und einfach gespleißten Transkripte akkumulieren dann im Kern und die von ihnen translatierten späten Strukturproteine (Gag, Env) und Enzyme (Pol) können nicht gebildet werden. Das virale Rev-Protein ist also in essentieller Weise an der zeitlich regulierten Expression der viralen Gene beteiligt.
HIV-1 Rev, ebenso wie die oben aufgeführten RNA-Transportmoleküle, sind Shuttle-Proteine, die virale RNAs über die Wechselwirkung mit einer innerhalb viraler Transkripte gelegenen RNA-Zielsequenz diese aus dem Kern in das Zytoplasma transportieren. So bindet HIV-1 Rev im Kern spezifisch an seine RNA-Zielstruktur RRE, das "Rev-responsive-element". Diese 351 Nukleotide (nt) lange Region ist innerhalb des Env-Leserahmens lokalisiert und damit Bestandteil aller un- und einfach gespleißten Transkripte. Anschließend wird dieser Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex über die Interaktion mit zellulären Faktoren aus dem Zellkern exportiert. Dazu ist eine C-terminal gelegene Leucin-reiche Sequenz notwendig, die als Kernexportsequenz NES ("nuclear export sequence") die nukleare Translokation des Rev-Proteins unter Verwendung zellulärer Mechanismen vermittelt (Pollard et al., 1998).
Immer noch umstritten ist der Grund, warum die späten Transkripte in Abwesenheit von Rev im Kern zurückbleiben, was eine notwendige Voraussetzung für die Rev-Abhängigkeit und damit die zeitlich regulierte Expression von gag, pol und env ist. Im Prinzip dominieren zwei alternative Vorstellungen zur Kernretention später Transkripte.
Es wird angenommen, dass ein zelluläres Transkript den Zellkern erst dann verlassen kann, wenn der Spleißprozess vollständig abgeschlossen ist, respektive alle aktiven Spleißstellen aus dem Primärtranskript entfernt worden sind. Bei den späten viralen Transkripten handelt es sich um Intron- haltige, nur unvollständig gespleißte pre-mRNAs, die mit Hilfe von Rev und RRE ins Zytoplasma transportiert werden. Deshalb wurde schon frühzeitig der Einfluss der zellulären Spleißmaschinerie auf die Kernretention der späten Transkripte untersucht (Mikaelian et al., 1996) (Kjems et al., 1991 ; Kjems et al., 1993; Chang et al., 1989; Powell et al., 1997; Lu et al., 1990; O'Reilly et al., 1995). Durch das Vorhandensein unterschiedlich aktiver Spleißstellen scheint der Spleißprozess bei HIV-1 -Transkripten nur suboptimal zu erfolgen. Deshalb wurde von mehreren Gruppen die Hypothese aufgestellt, dass Rev den Export von Transkripten ermöglicht, die innerhalb der Spleißmaschinerie durch Ausbildung ineffizienter Spleißkomplexe festgehalten werden.
Konträr dazu konnte aber gezeigt werden, dass die späten HIV-1-Gene, wie beispielsweise env, auch in Abwesenheit von aktiven Spleißstellen in ihrer Expression reprimiert bleiben und damit der Einfluss der Spleißmaschinerie mehr indirekt zu sein scheint (Nasioulas et al., 1994). Daher wurden so genannte inhibitorische Sequenzen (INS) oder cis-aktive Repressor- Elemente (CRS) innerhalb der Leserahmen postuliert, welche die Expression negativ beeinflussen (Nasioulas et al., 1994; Olsen et al., 1992; Schwartz et al., 1992b; Maldarelli et al., 1991). Diese innerhalb der kodierenden mRNA gelegenen Repressor-Sequenzen besitzen jedoch kein gemeinsames Sequenzmotiv wie etwa das AUUUA-Instabilitätsmotiv innerhalb des 3'-UTR der instabilen GM-CSF mRNA (Chen et al., 1995), sondern fallen nur durch ihren durchweg hohen A/U Gehalt auf. So resultierte die Fusion der postulierten INS-haltigen Fragmente aus Leserahmen später Gene (wie gag und env) an ein CAT-Reportersystem in einer reduzierten Reporteraktivität (Cochrane et al., 1991 ; Rosen et al., 1988). Diese Reduktion der Expression von gag und pol konnte durch mehrfache stille Punktmutationen innerhalb der "wobble"-Positionen teilweise wieder aufgehoben werden (Schwartz et al., 1992a; Schneider et al., 1997). Die un- und einfach gespleißten HIV-1 mRNAs scheinen also cis- aktive Repressor-Elemente zu besitzen, die entweder durch multiples Spleißen entfernt oder durch einen Rev/RRE vermittelten Kernexport überwunden werden.
Eine elegante Methode, um die Rev-Abhängigkeit von HIV-Transkripten zu umgehen, wurde von Schwartz und Schneider, wie bereits erwähnt, in Form einer partiellen Änderung des Leserahmens von HIV-Genen entwickelt. Eine konsequente Weiterführung dieses Konzeptes führte zur Synthese eines kodonoptimierten HIV-gag-po/-Gens unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide (Wagner et al., 2000; Graf et al., 2000). Diese Form der Anpassung des G/C-Gehalts und des Kodongebrauchs an den von Säugerzellen ermöglichte eine konstitutive Synthese des Gag-Pol- Polyproteins in Säugerzellen in großen Mengen. Der zugrunde liegende Mechanismus dieser Abkopplung der Proteinsynthese von der Rev- Abhängigkeit ist ein veränderter Kernexport der mRNA. Während die HIV- Wildtyp-RNA auf einen alternativen, durch das Crm1 -Protein charakterisierten Exportweg, in Abhängigkeit des HIV Shuttle-Proteins Rev, angewiesen ist, wird die synthetische mRNA auf dem regulären Kernexportweg für zelluläre mRNAs konstitutiv in das Zytoplasma transportiert. Diese konstitutive Expression von HIV-Proteinen eröffnet neue Wege für eine HIV-Therapieform auf genetischer Ebene.
Die Publikation von Graf et al. (2000) offenbart jedoch kein Verfahren für eine mit Hilfe eines transaktiven Faktors induzierbare Genexpression.
Ebenso wie die genannte Publikation von Graf et al. befasst sich auch die DE 1 053 781 A1 mit dem RNA-Export aus dem Zellkern ins Cytoplasma. Diese Patentanmeldung befasst sich damit, Reportergene von Rev abhängig zu machen, um die Expression des Reportergens über den Kernexport steuern zu können.
Da eine Rev- bzw. RRE-Abhängigkeit der Entwicklung von HlV-basierten Vektoren gewisse Beschränkungen auferlegt, synthetisierten Kotsopoulou et al. (2000) ein kodonoptimiertes HIV-1-gag-po/-Gen. Dieses Gen wurde in einen Säuger-Expressionsvektor eingefügt und auf die Abhängigkeit von Rev hin untersucht. Die Autoren verwendeten jedoch keine mit Hilfe von transaktiven Faktoren induzierbare Promotoren. Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist demnach nicht offenbart.
Die Expression von anti-HIV-Genen in Zellen kann effizient für eine intrazelluläre Hemmung der HIV-Replikation genutzt werden (Bunnell et al., 1998). Inzwischen wurde eine ganze Reihe von HIV-Gentherapie-Strategien entwickelt, die von Antisenskonstrukten und RNA-Decoys über spezifische RNA-abbauenden Ribozyme und RNA interference bis zu transdominant- negativen, von HIV abgeleiteten Proteinen reichen. Neben diesen intrazellulären Hemmstoffen, die gezielt Schritte der HIV-Replikation stören, kann im Rahmen einer Gentherapie auch die Neuinfektion von Zellen oder die Verbreitung von Nachkommenviren verhindert werden. Verschiedene Ansätze befassen sich mit der Expression von sezernierbaren anti-HIV- Proteinen, immunstimulierenden oder unspezifische antiviralen Faktoren und nicht zuletzt mit der Expression von zelltoxischen Faktoren nach erfolgter Infektion (Übersicht siehe Mautino et al., 2002).
Neben diesen eher unspezifischen Hemmstrategien kann die Virusvermehrung durch eine Verhinderung der Virusfreisetzung auf sehr spezifische Weise, unter Verwendung HIV-eigener Proteinderivate erfolgen. Deletionen im Gag vermitteln einen transdominant-negativen (TDN) Effekt auf die Neubildung und Freisetzung von Nachkommenviren (von Poblotzki et al., 1993; Trono et al., 1989; Smythe et al., 1994; Furuta et al., 1997). Diese Deletionen liegen im p17MA, im Übergangsbereich von p17MA/p24CA und in der C-terminalen Domäne des p24CA. Der genaue Wirkmechanismus des transdominant-negativen Effektes ist nicht aufgeklärt. Einige Anhaltspunkte deuten jedoch auf einen Einfluss der reduzierten Cyclophilin A- Bindekapazität des mutierten p24CA (Chiu et al., 2002) und auf ein verändertes Membran Targeting, von der Plasmamembran zur ER Membran, bei Deletionen im p17MA (Facke et al., 1993; Gallina et al., 1994; Ono et al., 2004) hin. Da Gag ein sehr stark multimerisierendes Polyprotein ist und eine exakte Zusammenlagerung für die korrekte Ausbildung von HIV- Partikeln notwendig ist (WiIk et al., 2001), ist es naheliegend, dass TDN Gag-Deletionsderivate mit funktioneller Assembly Domäne (C-terminale Domäne des p24CA) durch eine Bindung an Wildtyp Gag-Proteine den Zusammenbau von HlV-Capsiden direkt beeinträchtigen und so nachweislich zu einer Hemmung der HIV-Replikation führen.
Gerade die letzte Strategie weist jedoch bei einer konstitutiven Protein- Expression einige Probleme auf. So kann die Expression des Fremdgens zu Zelltoxizität, einer Fehlregulation der zellulären Funktionen, einer Herabregulierung der Transkription und, gerade Im Fall eines von HIV abgeleiteten Proteins, zu einer unerwünschten Immunantwort führen (Smythe et al., 1994). Um diese Problematik zu umgehen, werden unterschiedliche Strategien verfolgt, die Expression des Transgens von einer HIV-Infektion abhängig zu machen.
In verschiedenen Ansätzen wurde eine Tat-, eine Rev- und eine Tat/Rev- abhängige Expression untersucht und teilweise die Hemmung der HIV- Vermehrung in vitro beschrieben (Caruso et al., 1992; Harrison et al., 1992; Liu et al., 1994). Übereinstimmend konnte die Expression von Thymidinkinase (Marcello et al., 1998) bzw. Interferon α2 (Ragheb et al., 1999) durch Tat um den Faktor 5 bzw. 4 und durch Rev um den Faktor 3,3 bzw. <2 gesteigert werden. Die kombinierte Zugabe von Tat und Rev führte dagegen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen: Die Expression der Thymidinkinase war um den Faktor 7 erhöht, während für Interferon α2 eine Steigerung der Expression um den Faktor >300 angegeben wurde. Für HIV- 1 TDN Gag-Derivate konnte eine deutliche Rev-vermittelte Induktion der Proteinsynthese (bei geringer Basalaktivität) gezeigt werden, die mit einer weitgehenden Hemmung der HIV-Replikation (bis 94 %) verbunden war (Smythe et al., 1994; Furuta et al., 1997). Für die Kombination von Tat- und Rev-abhängiger Expression von TDN Gag konnte ebenfalls eine deutlich erhöhte Proteinsynthese durch Kotransfektion von tat- und rev- Expressionsplasmiden erzielt werden (Ding et al., 2002; Cara et al., 1998). Hier zeigte sich jedoch, dass die Hemmung der HIV-Replikation nur partiell erfolgte (Cara et al., 1998) und nur durch Kombination mit verschiedenen Hemmstrategien auf ein hohes Niveau anstieg (Ding et al., 2002; Cara et al., 1998). Im Gegensatz dazu führte die LTR/Tat-induzierbare Expression von Suizidgenen, wie TK, mehrfach zu einer Hemmung der Virusreplikation (Marcello et al., 1998; Miyake et al., 2001 ; Ragheb et al., 1999).
Die Basalaktivität betreffend, ist übereinstimmend gezeigt worden, dass eine Abhängigkeit von Rev nicht zu einer absoluten Verhinderung der Proteinsynthese führt. Rev beeinflusst den Export der RNA aus dem Zellkern und ist nur in Verbindung mit entsprechenden cis-aktiven Rückhaltesequenzen (INS, siehe oben) und einer cis-ständigen Erkennungssequenz (RRE) funktionell. Isolierte und in ihrer Größe (und damit auch in der Größe der INS) reduzierte gag-Gene werden unter einem entsprechend aktiven Promotor (z.B. CMV) effizient transkribiert und es liegt nahe, dass ein gewisser Teil der RNA ohne die Unterstützung des Rev ins Zytoplasma gelangt und translatiert wird.
Für die Regulation durch LTR/Tat gibt es keine einheitlichen Daten. In den meisten Berichten wurde eine Basalaktivität der Gene unter LTR-Kontrolle beschrieben (Caruso et al., 1992; Ding et al., 2002; Muratori et al., 2002; Cara et al., 1998). Mögliche Erklärungen dieser Expression in Abwesenheit von Tat sind eine Aktivierung des LTR-Promotors durch TNFα, das aus den entsprechenden transduzierten Zellen sezemiert wurde (Muratori et al., 2002) oder Elemente des Vektorkonstrukts, die von HIV abgeleitet sind (Miyake et al., 2001).
Auch die Länge des verwendeten LTR kann einen Einfluss auf die Regulation haben. So wurde mit einem minimalen LTR eine komplette Abschaltung der Transkription in Abwesenheit von Tat nachgewiesen (Miyake et al., 2001), also ein "dichter" induzierbarer Promotor beschrieben.
Für eine HIV-abhängige Transgen-Expression scheint daher das LTR/Tat- System das konsequentere Schaltermodul zu sein. Auch deswegen, weil eine Induktion durch Rev der durch Tat nachgeschaltet ist, was zu einer initialen Virusvermehrung führen kann, und zwar kurz bevor die Hemmung durch das Transgen greifen kann. So wird unter anderem die beobachtete unvollständige Hemmung der Replikation nach Rev-Induktion erklärt (Smythe et al., 1994).
Allerdings konnte für eine Tat-induzierbare Expression von transdominant- negativen (TDN) Gag-Derivaten, im Gegensatz zu Suizidgenen, bisher noch keine hinreichende Hemmung der HIV-Replikation nachgewiesen werden (siehe oben). Für diesen Mangel gibt es mehrere Erklärungsmöglichkeiten: i) Die TDN-Wirkung korreliert mit der Menge des TDN-Proteins, d.h. es muss ein gewisses Limit überschritten werden, um eine wirkungsvolle Intervention zu erreichen. Die Proteinmenge ist aber in großem Maß abhängig von der Promotoraktivität. Diese ist im Vergleich zu hoch aktiven viralen Promotoren (z.B. CMV, SV40) im HIV-1 LTR relativ gering, also möglicherweise nicht ausreichend.
ii) Die bisher verwendeten TDN-Derivate sind vom HIV-1 Wildtyp-Genom abgeleitet, enthalten folglich INS-Motive und sind daher von einem Rev- vermittelten Kernexport abhängig. Wie oben beschrieben, setzt daher die eigentliche Hemmwirkung erst mit der Anwesenheit des REV im Zellkern ein, wodurch die ersten HIV-Transkripte ungehindert in das Zytoplasma gelangen und die Replikation vollenden können. Daher ist es nicht verwunderlich, dass eine Kombination aus beiden Regulationssystemen zu einer sehr ineffizienten Hemmung der HIV-Replikation führt (Cara et al.,
1998).
Außer dem LTR-tat-System sind viele andere induzierbare virale Promotoren bekannt. Auch andere induzierbare Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt. Oftmals kann jedoch mit einem induzierbaren System nicht der gewünschte Grad der Genexpression erreicht werden. Daher war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur induzierbaren Genexpression bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur induzierbaren Genexpression, umfassend
(i) Bereitstellen einer zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, (ii) Modifizieren der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, so dass eine Steigerung der Expression erreicht wird,
(iii) operatives Verknüpfen der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz mit einer induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz, (iv) Exprimieren der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionssystem durch einen transaktiven Faktor.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die induzierbare Expression eines in einer zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz kodierten Gens (nachfolgend auch Transgen) deutlich verbessert werden kann, wenn zum einen seine Sequenz auf Nukleinsäureebene zu einer Steigerung der Genexpression modifiziert wird und andererseits die Zielnukleinsäure unter der Kontrolle einer durch einen transaktiven Faktor induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz exprimiert wird.
Eine induzierbare Genexpression ist z.B. bei der Verwendung von toxischen Genprodukten essentiell und hat bei anderen, therapeutisch einsetzbaren Genen gegenüber einer konstitutiven Expression entscheidende Vorteile:
- Eine nicht infizierte Zelle wird in ihrer physiologischen Leistung nicht durch eine hohe Expression zusätzlicher Faktoren unter Stress gesetzt.
- Unspezifische oder nicht absehbare Wechselwirkungen der Genprodukte könnten zu physiologischen Modifikationen, wie Aktivierung, Proliferation oder ähnlichem, auch bei benachbarten Zellen, in Geweben oder im gesamten Organismus führen. - Von HIV stammende Proteine werden im Umfeld einer HIV-Infektion von Immunzellen erkannt und die entsprechenden Protein-exprimierenden Zellen eliminiert.
- Im Fall von toxischen Faktoren muss eine konstitutive Produktion vermieden werden.
Eine Transkriptionskontrollsequenz ist eine Nukleinsäuresequenz, welche die Expression einer damit operativ assoziierten Nukleinsäuresequenz, insbesondere eines Gen, ermöglicht. Es kann sich hierbei um einen Promotor handeln, zusätzlich kann die Transkriptionskontrollsequenz auch weitere Elemente umfassen, wie etwa Enhancer und dergleichen. Vorzugsweise handelt es sich bei der induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz um einen induzierbaren Promotor. Hierbei ist grundsätzlich jedes induzierbare Promotorsystem geeignet, das im Stand der Technik bekannt ist. Es kann beispielsweise ein natürlicher oder artifizeller induzierbarer Promotor verwendet werden, beispielsweise ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor (Tet on/Tet off-System). Des Weiteren kann aber auch ein induzierbarer viraler Promotor verwendet werden.
Die Transkriptionskontrollsequenz wird durch einen transaktiven Faktor induziert. Bei dem transaktiven Faktor handelt es sich um einen Faktor, welcher in trans wirkt und einen Einfluss auf die Transkription hat. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um einen Transkriptionsfaktor. Besonders bevorzugt ist der transaktive Faktor ein viraler transaktiver Faktor.
Vorzugsweise ist die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar. Eine virale induzierbare
Transkriptionskontrollsequenz, die durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar ist, kann von einem beliebigen Virus abgeleitet sein.
Vorzugsweise werden hierfür Sequenzen von Retroviren, HCV (Hepatitis C-
Virus), HBV (Hepatitis B-Virus), HSV (Herpes simlex-Virus), EBV (Epstein- Barr-Virus), SV40 (Simian-Virus 40), AAV (Adeno-assoziierter Virus),
Adenovirus, Papillomviren oder Ebolavirus verwendet. Die hierbei verwendeten transaktiven Faktoren sind demgemäß z.B. ausgewählt aus den folgenden viralen Faktoren, jedoch nicht beschränkt auf diese: NS5A
(HCV), HB X (HBV), VP16/ICP4 (EBV), EBNA1/Rta (EBV), ART (HHV8), Large T-Antigen (SV40), Rep78/68 (AAV), E1A (Adenovirus), E2
(Papillomvirus) und VP30 (Ebolavirus).
Als induzierbare Transkriptionskontrollsequenz, die durch einen viralen transaktiven Faktor induzierbar ist, wird vorzugsweise ein retroviraler LTR- Promotor oder eine funktionelle Teilsequenz davon verwendet. Vorzugsweise ist daher der transaktive Faktor ein retrovirales Tat oder Tax Protein. Der LTR-Promotor kann ausgewählt sein aus den LTRs von HIV-1 , HIV-2, SIV1 HTLV und anderen verwandten Retroviren, die LTR-Promotoren aufweisen. Insbesondere sind Antivirale Promotoren bevorzugt, insbesondere die von HIV.
Ein transaktiver Faktor im Sinne der vorliegenden Erfindung ist somit ein Faktor, welcher in trans einen Einfluss auf die Transkription ausübt, vorzugsweise indem der transaktive Faktor mit der induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz wechselwirkt. Ein Beispiel für einen solchen transaktiven Faktor ist somit das oben bereits erwähnte Tat-Protein.
Zur Verbesserung der Genexpression wird die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz modifiziert. Dies geschieht auf Nukleinsäureebene und bevorzugt so, dass die entsprechende Aminosäuresequenz nicht oder im wesentlichen nicht verändert wird. Wird die Aminosäuresequenz bei der Modifikation der Nukleinsäuresequenz zur Erhöhung der Genexpression verändert, so sollte dies keinen Einfluss auf die Funktion des resultierenden Proteins haben.
Die Modifikation der Zielnukleinsäuresequenz zur Erhöhung der Genexpression kann auf mehrere Arten durchgeführt werden.
Zum einen ist es möglich, den Kodongebrauch des Transgens an das verwendete Expressionssystem anzupassen. Ein eukaryontisches Expressionssystem, insbesondere eines auf Säugerbasis ist bevorzugt, insbesondere handelt es sich hierbei um Säugerzellen, vorzugsweise humane Zellen. Daher wird der Kodongebrauch des Transgens vorzugsweise an den Kodongebrauch von Säugerzellen, stärker bevorzugt den von humanen Zellen, angepasst.
Erfindungsgemäße und vorzugsweise für die Gentherapie geeignete modifizierte Zielnukleinsäuresequenzen lassen sich beispielsweise erzeugen, indem man die Kodonverteilung so wählt, wie sie in exportierter zellulärer mRNA auftritt. Bevorzugt soll hierbei eine Kodonwahl verwendet werden, wie in sie Säugerzellen am häufigsten oder am zweithäufigsten verwendet wird (Ausubel et al., 1994), noch mehr bevorzugt wird die Kodonwahl an die von aktiv exprimierten Säugergenen angepasst. Vorzugsweise wird die Nukleinsäuresequenz unter Verwendung der Gene Optimizer-Technologie (deutsche Patentanmeldung DE 102 60 805.9, PCT/EP03/14850) für eine optimale Expression in Säugetieren modifiziert.
Anstelle der oder auch zusätzlich zur Anpassung der Kodonwahl, ist es aber auch möglich, den GC-Gehalt zu optimieren. Vorzugsweise wird dies erreicht, indem der GC-Gehalt des Transgens so genau wie möglich an den GC-Gehalt des verwendeten Expressionssystems angepasst wird. Dabei wird vorzugsweise die Degeneration des genetischen Codes ausgenutzt, sodass die Änderung der Nukleinsäuresequenz zwecks Erhöhung des GC- Gehalts nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz führt. Der optimale Prozentsatz an G und C Nukleotiden in einer zu exprimierenden Sequenz hängt, wie bereits erwähnt, von dem jeweiligen Organismus, bzw. den jeweiligen Zellen ab, in denen die Sequenz exprimiert werden soll. Beispielsweise liegt der optimale GC-Gehalt bei Nukleinsäuren in Säugerzellen bei etwa 50 %. Es gibt bereits Referenzdokumente, in denen der Fachmann den optimalen GC-Gehalt für verschiedene Organismen bzw. Zellen nachschlagen kann Es existiert die regelmäßig aktualisierte Codon Usage Database unter www.Kazusa.or.jp/codon/ von Y. Nakamura am Kazusa DNA Research Institute, siehe auch Nakamura, Y. et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28, 292. Es ist dann für den Fachmann kein Problem, die Nukleinsäuresequenz der zu exprimierenden Zielnukleinsäure bezüglich des GC-Gehalts zu optimieren.
Die Optimierung des GC-Gehalts oder die Anpassung des Kodongebrauchs erfolgt vorzugsweise durch stumme Mutationen oder durch Mutationen, die die Aktivität des vom Transgen kodierten Proteins nicht beeinflussen. Der Kodongebrauch muss nicht unbedingt angepasst werden, wenn der GC- Gehalt des besagten Gens bereits über 50% beträgt. Gene mit vom Wildtyp abweichenden Kodongebrauch können, wie im Beispiel angegeben, aus langen Oligonukleotiden mit einer schrittweisen PCR hergestellt werden. Eine weitere Möglichkeit, die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz zwecks Verbesserung der Expression zu modifizieren, besteht darin, entweder anstelle der obigen Möglichkeiten oder zusätzlich dazu, Motive gezielt zu eliminieren, welche die Transkription negativ beeinflussen. Dies umfasst z.B. die Deletion von Nukleinsäuremotiven wie etwa poly-A Sequenzen und dergleichen, die dem Fachmann bereits bekannt sein dürften. Weitere solcher die Expression negativ beeinflussenden Motive umfassen RNA-Instabilitätsmotive, adeninreiche Motive, Erkennungsmotive für Endonukleasen, Motive, welche die RNA-Sekundärstruktur beeinflussen und dergleichen.
Die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz kodiert vorzugsweise für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein. Ein solches Protein kann z.B. ausgewählt sein aus toxischen Genprodukten, Suizidfaktoren, Apoptose induzierenden Proteinen, Botenstoffen, transaktiven Faktoren, Regulatorproteinen, transdominant-negativen Proteinen, Cytokinen, Chemokinen etc. Spezifische Beispiele sind Interferon α, SDF-I RANTES1 MIP1α, TNF und Interleukine, insbesondere die Interleukine 2, 6, 10, 12, 15 und 28. Vorzugsweise kodiert die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz für ein Gen, das bei Verwendung des LTR/Tat- Systems, z.B. nach Aktivierung durch HIV-Infektion Proteine produziert, die geeignet sind, die natürlichen Abwehrmechanismen benachbarter Zellen zu induzieren oder durch Bindung an die entsprechenden Rezeptoren eine Infektion mit HIV zu verhindern. Bei HIV sind dies insbesondere die Rezeptoren CD4, CCR5 oder CXCR4.
Weitere Beispiele sind Enzyme, wie z.B. Thymidinkinase, Cytosindeaminase, Purin Nukleosid Phosphorylase, Carboxypeptidase, Carboxylesterase, Nitroreductase, Peroxidase, Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase, Glykosidase, Thymidinphosphorylase und dergleichen. Besonders geeignet ist das Verfahren für die Expression von toxischen Genprodukten, z.B. Thymidinkinase aus Herpesviren, Nukleasen oder Apoptose- induzierende Proteine (z.B. FAS/FAS-Ligand, Kaspasen etc.). Neben den Kaspasen sind auch TNF-related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL), Proteinkinase C (PKC), Tumornekrosefaktor (TNF), Apoptosis- Inducing Factor (AIF) und dergleichen geeignet. Nach Infektion mit HIV würde in diesem Fall die Expression von Genen induziert, die Zellen schädigen und somit die neue Produktion und Verbreitung von Nachkommenviren verhindern.
Weiterhin kann es sich bei dem Transgen um ein Regulatorgen handeln, das nach seiner induzierten Expression in einer Zelle als molekulares Schaltermolekül die Expression anderer Gene an- oder abschaltet. Als solches Regulatorgen kann beispielsweise ein Gen verwendet werden, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert. Natürlich sind diese Anwendungsmöglichkeiten nicht auf die Infektion mit HIV beschränkt, der Fachmann ist in der Lage, entsprechende Systeme auch für andere Infektionen zu verwenden.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Transgen um ein virales Gen.
Weiterhin kann es sich bei der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz auch um ein Gen für ein transdominant-negatives (TDN) Protein handeln. Vorzugsweise handelt es sich dabei um ein virales TDN Protein, vorzugsweise ein retrovirales, am meisten bevorzugt ein lentivirales.
Insbesondere sind hierbei lentivirale TDN Proteine geeignet, z.B. Derivate von Pr559a9, Gp41 , Gp120, Rev, Protease, Integrase, Reverse Transkriptase, Nef, Vpr, Vpv oder jedes andere Lentivirus-Protein, das dazu geeignet ist, den Replikationszyklus von Lentiviren, insbesondere HIV zu unterbrechen oder die Freisetzung/Ablösung von Viruspartikeln zu verhindern.
Vorzugsweise wird HIV-1 gag (gruppenspezifisches Antigen) als Transgen verwendet, wobei dessen Kodonwahl an die Kodonwahl, wie sie in humanen Genen vorzufinden ist, angepasst wird.
Besonders bevorzugt wird ein gag-Gen verwendet, das weitere Deletionen enthält. Dies kann die TDN Wirkung noch verstärken. Vorzugsweise handelt es sich dabei um weitere Deletionen im p24-Bereich oder einzelne oder mehrere Assembly-Domänen.
Beispielsweise wurde die Aminosäuresequenz des gag-Genprodukts in einen synthetischen Gag-kodierenden Leserahmen, unter Verwendung der
Kodonwahl von humanen Genen, rückübersetzt. Dieser „syngag" benannte
Leserahmen wurde dann unter Verwendung von langen Oligonukleotiden und einer schrittweisen PCR als vollsynthetischer Leserahmen aufgebaut.
Anschließend wurde der syngag-Leserahmen in einen Expressionsvektor einkloniert. Der hergestellte syngag-Vektor erwies sich in der Expression des HIV-Gag als vollständig unabhängig von der Präsenz des Rev-Proteins, einer RRE-Sequenz, einer 5' untranslatierten Region (UTR) oder
Spleißstellen. Das Ausgangs-gag-Gen, welches in seiner Kodonwahl dem
HIV-1 Wildtyp-Gen entspricht (wtgag), erwies sich in seiner Expression dagegen als abhängig von Rev, RRE und dem 5'-UTR inklusive Spleißdonor
(Graf et al., 2000).
Des Weiteren betrifft die Erfindung daher vorzugsweise ein Verfahren zur Expression von transdominant-negativen (TDN) Lentivirus-Proteinen in eukaryontischen Zellen, umfassend:
(a) Einbringen eines Vektors, umfassend eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz, die für ein TDN Lentivirus-Protein kodiert und deren Kodongebrauch an den von Säugern angepasst ist, und eine durch Lentivirus Tat-Protein induzierbare Promotorsequenz in operativer Verknüpfung mit der Zielnukleinsäuresequenz, in eine eukaryontische
Zelle,
(b) Bereitstellen des Tat-Proteins so dass eine Expression der Zielnukleinsäuresequenz induziert wird. Überraschenderweise kann LTR/Tat-System trotz der genannten Limitation angewendet werden, wenn, wie oben beschrieben, die Expression des TDN- Derivats von Rev/RRE unabhängig ist. In der vorliegenden Erfindung wird dies erreicht durch die Anpassung des Kodongebrauchs an den von Säugerzellen.
In der Kombination von LTR- und synthetischen HIV-Leserahmen verbindet sich eine frühe Expression des TDN-Gens - in einer frühen Phase der HIV- Infektion - mit einem effizienten Kernexport (plus einer RNA-Stabilisierung) und damit einer Proteinbiosynthese, bevor HIV-eigene Struktur- und damit Targetproteine produziert werden. Insgesamt bietet diese Kombination i) eine hohe TDN-Proteinmenge mit ii) einem kinetisch günstigen Expressionsverlauf und iii) einer sehr effizienten Induzierbarkeit.
In Abgrenzung zu den bisher beschrieben Verfahren ist i) die Induzierbarkeit der Expression auf die Anwesenheit von Tat beschränkt, wodurch die Notwendigkeit des HIV RRE/Rev im Transferkonstrukt vermieden wird und ii) die Rev-Unabhängigkeit des Transkripts durch eine geeignete Kodonwahl für das Transferkonstrukt gewährleistet.
Die Transkriptionskontrollsequenz wird zum Transgen bevorzugt analog zum natürlichen Auftreten positioniert.
Die Induzierung des Promotors erfolgt durch ein lentivirales Tat-Protein, vorzugsweise durch das HIV Tat-Protein, das als trans-aktiver Faktor fungiert. Dies ermöglicht es, dass eine Induzierung des Promotors, durch eine Infektion der Zelle, die den Vektor enthält, mit einem Lentivirus, insbesondere HIV, von selbst eintritt. Unter einem solchen in trans aktiven Faktor wird im Sinne dieser Anmeldung sowohl ein einzelnes Protein als auch ein Proteinkomplex verstanden.
Die Stabilisierung der RNA und die Verbesserung der Kemexporteigenschaften sowie die Unabhängigkeit der Proteinproduktion von einer RRE/Rev-Wechselwirkung (im Fall von HIV-abgeleiteten Proteinen) kann beispielsweise erreicht werden durch eine entsprechende Kodonwahl, unter Berücksichtigung RNA-Stabilität-beeinflussender Motive.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Nukleinsäure-Vektor umfassend:
(a) eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz,
(b) eine durch einen transaktiven Faktor, vorzugsweise durch einen viralen transaktiven Faktor, induzierbare Transkriptionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit der zu exprimierendeπ
Zielnukleinsäuresequenz, wobei die Sequenz gemäß (a) auf Nukleinsäureebene so modifiziert ist, dass eine Steigerung der Expression erreicht wird.
Unter einem Nukleinsäure-Vektor wird in diesem Zusammenhang ein Nukleinsäure-Konstrukt verstanden, welches zur Expression einer darauf enthaltenen Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionssystem, z.B. einer Zelle, einem Organismus oder einem in vitro System, geeignet ist und mindestens eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz und eine mit dieser in operativer Verknüpfung stehende induzierbare Transkriptionskontrollsequenz umfasst. Ein solcher Vektor kann weitere kodierende Sequenzen enthalten, wie z.B. Selektionsmarkergene und dergleichen. Der Fachmann ist in der Lage, die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz in Verknüpfung mit ihrer Transkriptionskontrollsequenz in einen geeigneten kommeriell erhältlichen Plasmid-Vektor oder dergleichen oder auch einen selbst konstruierten einzusetzen.
Die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz und die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz können auch hier wie oben beschrieben ausgewählt werden. Auch die Modifizierung der Sequenz kann wie oben erläutert erfolgen. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft Vektoren, die in der HIV- Gentherapie eingesetzt werden können und sich dadurch auszeichnen, dass sie für ein therapeutisches Gen kodieren, das erst nach Infektion der Zelle mit HIV exprimiert wird. Die Transkription entsprechender Gene wird dabei von der HIV-eigenen LTR („long terminal repeat")-Region kontrolliert und erfolgt erst in Anwesenheit des HIV-Tat-Proteins. Dabei werden vorzugsweise synthetische, an die Expression in humanen Zellen angepasste Leserahmen für die therapeutischen Gene verwendet, zur Steigerung der Genexpression, insbesondere der RNA-Stabilität und des RNA- Kernexportes. Diese Gene können vorzugsweise gegen unterschiedliche Schritte im HIV-Replikationszyklus gerichtet sein und intervenieren mit der Infektion von Zellen, der Replikation von HIV oder der Verbreitung von Nachkommenviren.
Der erfindungsgemäße Vektor kann zusätzlich ein weiteres Transgen enthalten, das vorzugsweise für ein therapeutisches, gentherapeutisches und/oder diagnostisches Protein kodiert. Dieses weitere Transgen kann sich ebenfalls unter der Kontrolle eines LTR-Promotors, z.B. desselben Promotors wie die Sequenz gemäß (a) befinden. Oder aber es kann durch einen separaten Promotor, der konstitutiv oder induzierbar sein kann, gesteuert sein.
Der Vektor kann z.B. viralen (z.B. Adeno-assoziierte Viren, Adenoviren, Retroviren, Herpesviren, Alphaviren etc.) oder bakteriellen Ursprungs oder ein Plasmid sein. Besonders bevorzugt wird die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz so ausgewählt, dass die Expression des Fremdgens von der Anwesenheit des HIV-1 Tat-Proteins abhängig ist. Wird die Tat-Transaktivierung erfolgreich rekonstituiert, sollte vorzugsweise eine Steigerung der Expression des Tat-abhängigen Gens um mindestens das 3- fache, bevorzugt das 5-fache, noch mehr bevorzugt das 10-fache oder mehr zu messen sein. Vorzugsweise umfasst der Vektor eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1, 16 oder 17.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin modifizierte Zielnukleinsäuresequenzen bereit, welche, wenn sie in operativer
Verknüpfung mit einer geeigneten induzierbaren
Transkriptionskontrollsequenz stehen, eine gesteigerte Genexpression bewirken. Vorzugsweise sind diese modifizierten
Zielnukleinsäuresequenzen ausgewählt aus den in dieser Erfindung in den Beispielen und im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen. Am meisten bevorzugt sind die modifizierten Zielnukleinsäuresequenzen ausgewählt aus den folgenden Sequenzen: SEQ ID NO. 1 , 16 und 17.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, vorzugsweise eukaryontische Zellen, stärker bevorzugt Säugetierzellen, am meisten bevorzugt humane Zellen, die mit einer Nukleinsäure oder einem
Vektor, wie oben beschrieben, transformiert sind, wobei die Nukleinsäure in einer transkriptionsfähigen Form vorliegt. Die Nukleinsäure bzw. der Vektor können beispielsweise episomal vorliegen oder stabil ins Chromosom integriert sein. Dabei können in der Zelle ein oder mehrere Kopien vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Arzneimittel auf der Basis der hier offenbarten Vektoren und modifizierten Lentiviren und Zellen. Die erfindungsgemäße Arzneimittel sind geeignet als therapeutische und diagnostische Anwendungen, insbesondere sind sie geeignet zur Diagnose, Prävention oder Therapie von Virus-assoziierten Erkrankungen oder/und Tumorerkrankungen. Für diese Anwendungen kann z.B. die zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz insbesondere ein Suizidgen sein oder dergleichen.
Beispielsweise können die Arzneimittel zur Therapie eingesetzt werden, vorzugsweise zur Therapie von Antiviralen Infektionen, z.B. HIV und SIV, insbesondere HIV-1 und HIV-2. Der Fachmann ist in der Lage, die Promotorsequenz an das System anzupassen, in dem die Expression stattfinden soll. Somit können nun Antivirale Infektionen bekämpft werden, indem infizierte Personen in vitro, ex vivo und natürlich in vivo behandelt werden, z.B. durch Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Vektoren in PMLs aus diesen Patienten oder in T-Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien oder Stammzellen.
Die Erfindung soll durch die folgenden Figuren und Beispiele näher erläutert werden.
Abbildungen und Sequenzen
Abbildung 1 stellt alle hergestellten gag-kodierenden Konstrukte schematisch dar.
Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Expression verschiedener gag¬ kodierender Konstrukte in H1299-Zellen.
Abbildung 2A zeigt einen HIV-1 p24-spezifischen Western Blot von transfizierten Zellen.
Abbildung 2B zeigt einen p24-EL I SA-Test.
Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der Expression Wildtyp gag- exprimierenden Konstrukten in An- und Abwesenheit von Tat und/oder Rev.
Abbildung 3A zeigt einen HIV-1 p24-spezifischen Western Blot von transfizierten Zellen.
Abbildung 3B einen ELISA-Test.
Abbildung 4 zeigt die Wirkung der transdominanten negativen gag-Proteine auf die Freisetzung von HIV-Partikeln. Abbildung 4A zeigt die Hemmung der Freisetzung von Partikeln in Prozent gemäß einem p24 ELISA-Test.
Abbildung 4B zeigt die Hemmung der Infektiosität der freigesetzten Viruspartikel in Prozent.
Abbildung 5 zeigt die Hemmung der Freisetzung von Viruspartikeln in Prozent, die in Anwesenheit von transdominant negativen gag-Konstrukten mit weiteren Deletionen im p24 gebildet wurden.
Abbildung 5A zeigt die Hemmung der Freisetzung in Prozent.
Abbildung 5B zeigt die Hemmung der Infektiosität in Prozent.
Abbildung 6 zeigt die Sequenzen von TDsyngag und TDwtgag sowie einen Sequenzvergleich zwischen TDwtgag und TDsyngag.
Abbildung 7 zeigt die Nukleinsäuresequenzen von TDsyngag delta 2 und TDsyngag delta 2 delta p7.
SEQ ID No. 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz von TDsyngag.
SEQ ID No. 2 zeigt die Aminosäuresequenz von TDsyngag.
SEQ ID No. 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz von TDwtgag.
SEQ ID No. 4 zeigt die Aminosäuresequenz von TDwtgag.
SEQ ID No. 5 bis 15 zeigen verschiedene Oligonukleotide.
SEQ ID No. 16 zeigt die Nukleinsäuresequenz von TDsyngag delta 2. SEQ ID No. 17 zeigt die Aminosäuresequenz von TDsyngag delta 2.
SEQ ID No. 18 zeigt die Nukleirisäuresequenz von TDsyngag delta 2 delta P7.
SEQ ID No. 19 zeigt die Aminosäuresequenz von TDsyngag delta 2 delta P7.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von unabhängigen, Tat-abhängigen, Rev-abhängigen und
Tat- und Rev-abhängigen Gag-Genderivaten
HIV-1 transdominant-negative (TDN) Gag-Derivate wurden als konstitutiv, Tat-, Rev- oder Tat/Rev-abhängig exprimierende Genkonstrukte hergestellt. Die Rev-Abhängigkeit wurde durch die Verwendung von HIV Wildtyp(wt)- Gensequenzen, inklusive des 5'-nicht translatierten Bereiches (UTR), in Verbindung mit dem HIV Rev-Responsive-Element (RRE) erreicht. Die Rev- Unabhängigkeit wurde durch synthetische, GC-reiche Gensequenzen ermöglicht, wobei die kodierte Aminosäuresequenz für beide Konstrukte identisch ist. Eine Abhängigkeit von Tat wurde durch die Verwendung des HIV-1 LTR als Transkriptionskontrolle erreicht. Demgegenüber wurde für eine konstitutive Transkription der CMV-Promotor/Enhancer verwendet. Durch entsprechende Kombination der Elemente wurde eine konstitutive Expression (CMV-syngag), eine Tat-abhängige (LTR-syngag) eine Rev- abhängige (CMV-UTR-wtgag-RRE) und eine Tat- und Rev-abhängige (LTR- UTR-wtgag-RRE) Expression von identischen (auf Proteinebene) TDN Gag- Derivaten generiert.
Der Leserahmen des HIV-1 gruppenspezifischen Antigens (gag) (GenBank Accession Nummer: M15654.1 HIVBH102, Nukleotide 112-1650; Referenz: Ratner L1 Haseltine W, Patarca R, Livak KJ1 Starcich B, Josephs SF1 Doran ER, Rafalski JA, Whitehom EA1 Baumeister K, et al. Complete nucleotide seqence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature. 1985 Jan 24-30; 313 (6000): 277-84) sollte unter Verwendung einer Kodonwahl, wie sie in humanen Zellen zu finden ist, künstlich aufgebaut werden. Dazu wurde die Aminosäuresequenz des Gag-Proteins (entspricht GenBank Accession Nummer: M15654 JIVBH102, Nukleotide 112-1408) mit einer Deletion von nt 304-489 in eine entsprechende Nukleotidsequenz übersetzt. Für die Kodonoptimierung und Optimierung der RNA-Sequenz wurde ein entsprechendes Software-Paket (GeneOptimizer) verwendet. Zur Subklonierung sowie zum Anfügen weiterer Sequenzelemente innerhalb nicht translatierter Regionen wurden weitere Restriktionsschnittstellen eingefügt. Die Nukleinsäuresequenz, inklusive der Schnittstellen, ist in SEQ ID NO. 1 angegeben.
Diese Sequenz wurde als vollsynthetisches Gen unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide nach einer bereits beschriebenen Methode (Zolotukhin et al., 1996) hergestellt.
In Abbildung 6 ist ein Vergleich der Nukleinsäuresequenzen von TDsyngag (Kodonwahl abgeleitet von Säugergenen) und TDwtgag (Kodonwahl abgeleitet von HlV-Strukturgenen) gezeigt. Das so hergestellte TDGag kodierende DNA-Fragment ("TDsyngag") wurde unter Verwendung der
Schnittstellen EcoRI und Xho I in den Expressionsvektor pcDNA3.1(+)
(Invitrogen) unter die transkriptionelle Kontrolle des Cytomegalo-Virus (CMV) early promotor/enhancer gestellt ("pc-CMV-TDsyngag").
Zur Herstellung eines analogen, jedoch in seiner Kodonwahl dem HIV- Wildtyp entsprechenden Expressionsplasmids, wurde die kodierende Region des HIV-1 gag, inklusive des 5'-nicht translatierten Bereichs (UTR), subkloniert und, um die Voraussetzungen für einen Rev-vermittelten Kernexport zu erfüllen, dem wtgag-kodierenden Bereich eine RNA- Zielsequenz (RRE) angefügt (Graf et al., 2000). Diese Zielsequenz interagiert auf RNA-Ebene mit einem viralen Kernexportprotein (im Falle von HIV-1 das Rev-Protein) und zellulären Kernexportproteinen.
Um eine Anpassung auf Proteinebene zu gewährleisten, wurde das Wildtyp- Konstrukt durch Einführung von zwei aufeinander folgenden Stop-Kodons im gag Leserahmen C-terminal verkürzt (Kodons für 372F und 373L wurden mutiert). Die Mutationen wurden durch gerichtete Mutagenese (QuickChange site-directed mutagenesis kit, Stratagene) unter Verwendung der Oligonukleotide gag-stop1 und gag-stop2 eingeführt. Das resultierende Konstrukt wurde pc-CMV-UTR-wtgag-RRE bezeichnet. Unter Verwendung der Oligonukleotide DeM und Del2 wurde in diesem Konstrukt - analog dem TDsyngag - eine Deletion von nt 304 bis nt 489 eingefügt (pc-UTR-TDwtgag- RRE). Die kodierende Sequenz ist in SEQ ID No. 3 angegeben.
Die kodierenden Sequenzen wurden unter die transkriptionelle Kontrolle des HlV-Promotors gestellt, um eine Tat-Abhängigkeit des Gag-Proteinderivats zu erreichen. Der HIV-1 Long Terminal Repeat (LTR) beinhaltet einen solchen Promotor. Diese Region wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide ItM und Itr2 aus proviraler HIV-1 DNA (HX10 siehe (Ratner et al., 1987)) amplifiziert und unter Verwendung der Schnittstellen Mfu\ und EcoR\ direkt 5' vor das ATG des gag-kodierenden Leserahmen im pc-CMV- TDsyngag kloniert, wobei der CMV-Promotor durch das LTR ersetzt wurde. Für den Austausch des Promotors im wtgag-Konstrukt wurden Teile des HIV-Genoms unter Verwendung der Oligonukleotide Itr1 und Itr3 in einer PCR-Reaktion amplifiziert und unter Verwendung der Schnittstellen Mlu\ und C/al der CMV-Promotor im pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE-Konstrukt ausgetauscht. Dabei wurde der natürliche Leserahmen des HlV-Provirus (mit der Reihenfolge LTR, UTR, gag) wieder hergestellt. Die resultierenden Konstrukte wurden im Weiteren als "pc-LTR-TDsyngag" bzw. "pc-LTR-UTR- TDwtgag-RRE" bezeichnet.
In Abbildung 1 sind alle hergestellten Gag-kodierenden Konstrukte schematisch dargestellt. Beispiel 2
Die Expression der TDgag-Konstrukte kann durch HIV- Regulatorproteine kontrolliert werden
Sämtliche Zellkulturprodukte waren von Life Technologies (Karlsruhe). Alle Säugerzelllinien wurden bei 37 0C und 5 % CO2 kultiviert. Die humane Lungenkarzinomzelllinie H1299 wurden in Dulbecco's Modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit L-Glutamin, D-Glucose (4,5 mg/ml), Natriumpyruvat, 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) kultiviert. Die Zellen wurden nach Erreichen der Konfluenz im Verhältnis 1:10 subkultiviert.
1 x 106 Zellen wurden in Petrischalen (Durchmesser: 100 mm) ausgesät und 24 h später durch Calciumphosphat Kopräzipitation (Graham et al., 1973) mit 30 μg TDgag-Plasmiden und 15 μg pc-tat (Tat Expressionsplasmid) bzw. pc-rev (Rev-Expressionsplasmid) oder pcDNA 3.1 Vektor (Referenzplasmid) transfiziert. Bei Kotransfektionen von gag, tat und rev wurden je 15 μg Plasmid eingesetzt. Zellen und Kulturüberstände wurden 48 h nach der Transfektion geerntet. Die transfizierten Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl) gewaschen, in eiskaltem PBS abgekratzt, 10 min bei 300 xg abzentrifugiert und in Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.5% Triton X- 100 (w/v)) 30 min auf Eis lysiert. Unlösliche Bestandteile des Zelllysates wurden 30 min bei 10000 xg und 4°C abzentrifugiert. Die Gesamtproteinmenge des Überstandes wurde mit dem Bio-Rad- Proteinassay (Bio-Rad, München) nach Herstellerangaben bestimmt.
Die Proben wurden mit gleichem Volumen an 2-fach Probenpuffer (Laemmli, 1970) versetzt und 5 min auf 95 0C erhitzt. 50 μg Gesamtprotein aus Zelllysaten wurden über ein 12,5%-iges SDS/Polyacrylamidgel aufgetrennt (Laemmli, 1970), auf eine Nitrocellulose-Membran elektrotransferiert und mit dem monoklonalen p24-spezifιschen Antikörper 13-5 (Wolf et al., 1990) analysiert und mittels einem sekundären, AP- (Alkalische Phosphatase) gekoppelten Antikörper detektiert und mittels chromogener Färbung nachgewiesen (Abb. 2A).
Ergänzend dazu wurden die Zelllysate in einem kommerziell erhältlichen p24 ELISA-Test (NEN) quantifiziert. Je 1 μg des Zelllysates wurden nach den Angaben des Herstellers ausgewertet und die Gesamtkonzentration an HIV- 1 p24 bestimmt (Abb. 2B).
H1299 Zellen wurden transient mit den gag-Konstrukten transfiziert. Die erzielte Expression wurde in An- und Abwesenheit von Tat oder Rev analysiert (Abb. 2). Für das pc-CMV-TDsyngag wurde eine konstitutive Expression des TDgag unabhängig von Tat oder Rev nachgewiesen (Abb. 2A, Spur 2 und 2B, 2). Die Expression des TDgag konnte für das pc-CMV- UTR-TDwtgag-RRE-Konstrukt durch Rev um den Faktor 7 (Abb. 2A, Spuren 3 und 4 und 2B 3 und 4) und für das pc-LTR-TDsyngag-Konstrukt durch Cotransfektion von pc-tat um den Faktor 2,5 (Abb. 2A1 Spuren 5 und 6 und 2B, 5 und 6) gesteigert werden. Die Basalaktivität der TDgag Expression war dabei für das pc-LTR-TDsyngag-Konstrukt im Vergleich zu pc-CMV- UTR-TDwtgag-RRE etwas geringer, für beide Konstrukte aber gegenüber dem pc-CMV-TDsyngag deutlich reduziert und nur geringfügig über der Negativkontrolle (ca. Faktor 2,5 für pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE und 1,5 für pc-LTR-TDsyngag; Abb. 2B). Das Genprodukt von pc-LTR-UTR-TDwtgag- RRE konnte mit diesen Methoden nicht nachgewiesen werden. Die Deletion im Gag führt zu einer verringerten Erkennung durch den monoklonalen Antikörper und in Verbindung mit einer stark eingeschränkten Expression sind die erreichten TDgag Mengen unzureichend für einen Nachweis durch Antikörper. Daher wurde die Tat- und Rev-Abhängigkeit in einem Referenzkonstrukt (komplette wtgag-Sequenz) untersucht. Dieses Konstrukt (pc-LTR-UTR-wtgag-RRE) war sowohl von Tat als auch von Rev abhängig. Tat allein führte zu einer Expressionszunahme um den Faktor 4, Rev alleine um den Faktor 16 und die Kombination von Tat und Rev um den Faktor 47 (Abb. 3).
Beispiel 3
Die TDgag-Konstrukte haben auf die HlV-Partikelfreisetzung einen transdominant negativen Effekt
H1299 Zellen wurden, wie unter Beispiel 1 beschrieben, mit Kombinationen von Plasmiden transient transfiziert. Für eine Transfektion wurden 15 μg HX10 provirale DNA und je 30 μg der TDgag-Konstrukte oder 30 μg pcDNA3.1 als Kontrolle für eine ungehemmte Replikation eingesetzt. Nach 48 h wurden die Zellkulturüberstände geerntet, Zellbestandteile durch Zentrifugation (10 min bei 10000 xg) sedimentiert und die Überstände mit 10 % einer Triton x 100 Lösung (5 %) zur Lyse der HIV-Partikel im Überstand 15 min bei RT inkubiert. Die behandelten Überstände wurden in entsprechenden Verdünnungen in einen p24 ELISA-Test (NEN) eingesetzt und die p24-Menge quantifiziert. Die Reduktion der p24-Menge korreliert dabei direkt mit einer Hemmung der Partikelfreisetzung nach Transfektion mit einem HlV-Provirus. Die bestimmten p24-Mengen wurden in Relation zu der Kontrolle (Cotransfektion mit pcDNA3.1, ungehemmt) gesetzt und die Hemmung in Prozent berechnet. Für jede Kombination wurden mindestens 6 unabhängige Ansätze getestet.
Wie aus Abb. 4A zu ersehen ist, haben alle getesteten TDgag-Konstrukte zu einer erheblichen Hemmung der Partikelfreisetzung geführt. Die TDsyngag (TDsg)-Konstrukte hatten unabhängig vom vorgeschalteten Promoter eine sehr hohe Hemmung bewirkt. Die Hemmwirkung der TDwtgag (TDwtg)- Konstrukte war dagegen von der Promotorregion abhängig. Die Hemmung der Partikelfreisetzung war unter einer CMV-Promotorkontrolle deutlich höher als unter dem HIV LTR-Promotor.
Beispiel 4
Die TDgag-Konstrukte haben auf die HlV-Infektiösität einen transdominant negativen Effekt H 1299 Zellen wurden, wie unter Beispiel 3 beschrieben, mit Plasmidkombinationen transfiziert und die Überstände nach 48 h geerntet und aufgereinigt. Zur Überprüfung des Einflusses der TDgag-Konstrukte auf die Freisetzung infektiöser Nachkommenviren, wurden die konditionierten Zellkulturüberstände in einer entsprechenden Indikatorzelllinie (MAGI) überprüft (Kimpton et al., 1992).
Bei den eukaryontischen MAGI (multinuclear activation of a galactosidase indicator)-Zellen handelt es sich um eine Indikatorzelllinie, die eine
Reportergenkassette enthält, welche durch HIV-Infektion induziert werden kann. Die MAGI-Zellen wurden vom UK Medical Research Council (MRC) zur Verfügung gestellt In dieser Kassette ist der virale LTR (long terminal repeat)-Promotor dem E. coli ß-Galactosidasegen (lacZ) vorgeschaltet. Die Expression des lacZ ist demnach von der Transkriptionsaktivität des LTR-
Promotors durch das virale Tat abhängig.
Für die Infektion wurden am Vortag 3 x 104 Zellen pro 300 μl Medium (in 48- Well-Platten) ausgesät. Nach Ernte der transfizierten H1299-Zellüberstände wurden die Magi-Zellen mit 100 μl Überstand je Ansatz infiziert und 48 h kultiviert.
Zur Auswertung der Infektiosität wurde das Medium abgesaugt und die Wells mit PBS gewaschen. Die Monolayer wurden mit 200 μl Fixierlösung (1 % Formaldehyd, 0,2 % Glutaraldehyd in PBS) fixiert und nach Inkubation von 5 min bei Raumtemperatur noch mal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 200 μl Färbelösung (16 mg X-GaI in 4 ml DMSO, ad 40 ml PBS; Zugabe von 400 μl K-Ferricyamid (400 mM), 400 μl K-Ferrocyamid (400 mM) und 80 μl MgCI2 (1 M)) auf die Zellen gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 37 0C zwischen 15 min und 3 h. Die blauen Zellen wurden im Lichtmikroskop ausgezählt.
Die Hemmung wurde als Reduktion blauer Zellen bestimmt und in Relation zu der Zahl an blauen Zellen in der Positivkontrolle als Prozent-Hemmung der Infektiosität angegeben. Im Wesentlichen korrelieren die Ergebnisse mit den Daten der Hemmung der Partikelfreisetzung (Figur 4B). Nahezu vollständige Hemmung wurde für die Konstrukte pc-CMV-TDsyngag, pc- LTR-TDsyngag und pc-CMV-UTR-TDwtgag-RRE nachgewiesen, während das Konstrukt pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE eine etwa 50 %ige Hemmung bewirkte (abgebildet sind die Ergebnisse eines exemplarischen Experimentes aus zwei unabhängigen Ansätzen, Figur 4B).
Beispiel 5
Transdominant negativer Effekt von Tat-abhängigen TDgag-Derivaten mit einer weiteren Deletion im p24
Ausgehend von den Konstrukten pc-CMV-TDsyngag, pc-LTR-TDsyngag, pc- CMV-UTR-TDwtgag-RRE und pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE wurde durch die
Verwendung der Oligonukleotide Del3 und Del4 (syngag) und Del5 und Del6
(wtgag) eine weitere Deletion in den gag-Leserahmen eingeführt. Diese
Deletion betrifft die Aminosäuren 230 bis 300, ein Bereich in dem sehr viele
CTL-Epitope identifiziert wurden. Die Expression des entsprechenden TDN Gag-Derivates nach Transfektion von H 1299 Zellen mit den neu entstandenen Konstrukten pc-CMV-TDsyngagd2, pc-LTR-TDsyngagd2, pc-
CMV-UTR-TDwtgagd2-RRE und pc-LTR-UTR-TDwtgagd2-RRE
(schematische Übersicht siehe Abb. 1) konnte nicht nachgewiesen werden, da die Modifikationen die Affinität der verfügbaren gag-spezifischen Antikörper beeinflussen und weder im Western Blot noch im p24-ELISA spezifische Signale zu detektieren waren.
Wie unter 3. beschrieben, wurden H1299 Zellen zur Überprüfung der TDN- Wirkung mit Kombinationen aus HX10 (15 μg) und TDsyngagd2 bzw. pcDNA3.1 transfiziert (je 30 μg Plasmid DNA) und die Überstände, wie unter 3. beschrieben, im p24-ELISA und, wie unter 4. beschrieben, mittels der MAGI-Zellen ausgewertet. Eine Hemmung der Partikelfreisetzung (Ergebnisse der p24-ELISA-Auswertung, Abb. 5A, mindestens 6 unabhängige Ansätze) und der Infektiosität von Nachkommenviren (Ergebnisse der MAGI-Auswertung, Abb. 5B, zwei unabhängige Ansätze) wurde für alle eingesetzten Konstrukte gezeigt. Die Reihenfolge der Hemmeffekte (Partikelfreisetzung) ist hier pc-CMV-TDsyngagd2 (98,45 %) >pc-LTR-TDsyngagd2 (97,49 %) >pc-CMV-UTR-TDwtgagd2-RRE (80,99 %) >pc-LTR-UTR-TDwtgagd2-RRE (73,69 %) und entspricht damit im Wesentlichen den Ergebnissen der TDgag-Experimente. Die synthetischen Leserahmen zeigen auch hier offensichtlich eine Überlegenheit in der Hemmung in der Partikelfreisetztung. Die Reduktion von infektiösen Nachkommenviren war dagegen in diesem experimentellen Ansatz vergleichbar (Abb. 5B). Im direkten Vergleich der Rev-Abhängigkeit mit der Tat-Abhängigkeit ergeben sich für die Kombination LTR mit synthetischem Leserahmen klare Vorteile.
Tabelle 1 : Verwendete Oligonukleotide
'Bezeichnung Sequenz 5' - 3' SEQ ID NO
Dell TAAAGCTTCCTTGGTGTC 5
Del2 TTCAGCCCAGAAGTAATACC 6
Del3 TACAAGACCCTGCGCGCCGAGCAGGCC 7
Del4 CTCCCTCATCTGGCCGGGGGCGATGGG 8
Del5 TTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGG 9
De!6 TATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCT 10
Gag-slop1 GGAAGGCCAGATCTTCCCTCATTAATTAGCCTGTCTCTCAGTAC 11
Gag-stop2 GTACTGAGAGACAGGCTAATTAATGAGGGAAGATCTGCCTTCC 12
Itr1 ATTGTCGACACGCGTTGGAAGGGCTAATTCACTCC 13
Itr2 ATTGAATTCCTCTCTCCTTCTAGCCTC . 14
Itr3 GCTTGCCCATACTATATG 15 Literatur
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Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur verbesserten induzierbaren Genexpression, umfassend (i) Bereitstellen einer zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, (ii) Modifizieren der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, so dass eine Steigerung der Expression erreicht wird, (iii) operatives Verknüpfen der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz mit einer induzierbaren Transkriptionskontrollsequenz,
(iv) Exprimieren der modifizierten Zielnukleinsäuresequenz in einem geeigneten Expressionssystem durch einen transaktiven Faktor.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei für die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ein induzierbarer natürlicher viraler
Promotor oder ein induzierbarer artifizieller Promotor verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die induzierbare Transkriptionskontrollsequenz ausgewählt wird aus viralen Transkriptionskontrollsequenzen, insbesondere aus den folgenden
Viren: Retroviren, HCV, HBV, HSV, EBV, SV40, AAV1 Adenovirus, Papillomviren, Ebolavirus.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine induzierbare Transkriptionskontrollsequenz verwendet wird, die durch ein retrovirales Tat oder Tax-Protein als transaktiven Faktor induzierbar ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kodongebrauch der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz an das
Expressionssystem angepasst wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Kodongebrauch an den von Säugern angepasst wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Kodongebrauch an den von Menschen angepasst wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der GC- Gehalt der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz an den des Expressionssystems angepasst wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der GC-Gehalt der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz für den von Säugern optimiert wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz negative transkriptions- beeinflussende Motive eliminiert werden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Modifikation der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz im
Wesentlichen ohne Veränderung der entsprechenden Aminosäuresequenz durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird, die für ein therapeutisches und/oder diagnostisches Protein kodiert.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das therapeutische und/oder diagnostische Protein ausgewählt ist aus toxischen Genprodukten, Suizidfaktoren, Apoptose induzierenden Proteinen, Botenstoffen, transaktiven Faktoren, Regulatorproteinen, transdominant-negativen Proteinen, Cytokinen, Chemokinen, Interleukinen, Interferon α, RANTES, MIP1α, TNF, Thymidinkinasen, Nukleasen, FAS, FAS-Ligand, Kaspasen und Transkriptionsfaktoren.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird, die für ein virales transdominant-negatives (TDN) Protein kodiert.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird, die für ein retrovirales TDN- Protein kodiert.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird, die für ein TDN Lentivirus- Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gag, Env, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpv, Reverser Transkriptase, Protease und Integrase, kodiert.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Expression von transdominant-negativen (TDN) Lentivirus-Proteinen in eukaryontischen Zellen, umfassend:
(a) Einbringen eines Vektors, umfassend eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz, die für ein TDN Lentivirus-Protein kodiert und deren Kodongebrauch an den von Säugern angepasst ist, und eine durch ein Lentivirus Tat-Protein induzierbare Promotorsequenz in operativer Verknüpfung mit der Zielnukleinsäuresequenz, in eine eukaryontische Zelle, (b) Bereitstellen des Tat-Proteins, so dass eine Expression der
Zielnukleinsäuresequenz induziert wird.
18. Nukleinsäure-Vektor umfassend:
(a) eine zu exprimierende Zielnukleinsäuresequenz, (b) eine durch einen transaktiven Faktor induzierbare
Transkriptionskontrollsequenz in operativer Verknüpfung mit der zu exprimierenden Zielnukleinsäuresequenz, wobei die Sequenz gemäß (a) auf Nukleinsäureebene so modifiziert ist, dass eine Steigerung der Expression erreicht wird.
19. Vektor nach Anspruch 18, wobei die Sequenz gemäß (a) so modifiziert ist, dass die entsprechende Aminosäuresequenz nicht verändert ist.
20. Vektor nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Kodongebrauch der Sequenz gemäß (a) an den von Säugetieren angepasst ist.
21. Vektor nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Sequenz gemäß (a) so modifiziert ist, dass der GC-Gehalt für den von Säugern optimiert ist.
22. Vektor nach Anspruch 21 , wobei die Sequenz gemäß (a) so modifiziert ist, dass der GC-Gehalt für den von Menschen optimiert ist.
23. Vektor nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die Sequenz gemäß (a) für ein therapeutisches Protein und/oder diagnostisches Protein und/oder trans-dominant negatives (TDN) Virus-Protein, insbesondere ein TDN Lentivirus-Protein, kodiert.
24. Vektor nach Anspruch 23, wobei das diagnostische und/oder therapeutische Protein ausgewählt ist aus toxischen Genprodukten, Suizidfaktoren, Apoptose induzierenden Proteinen, Botenstoffen, transaktiven Faktoren, Regulatorproteinen, transdominant-negativen Proteinen, Cytokinen, Chemokinen, Interleukinen, Interferon α,
RANTES, MIP1α, TNF, Thymidinkinasen, Nukleasen, FAS, FAS-Ligand, Kaspasen und Transkriptionsfaktoren.
25. Vektor nach Anspruch 23, wobei das TDN Virus-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gag, Env, Tat, Rev, Nef, Vpv, Vpu,
Reverser Transkriptase, Protease und Integrase.
26. Vektor nach Anspruch 25, wobei das TDN Lentivirus-Protein das Gag- Protein ist.
27. Vektor nach Anspruch 25 oder 26, wobei das TDN Lentivirus-Protein ein Gag-Protein mit Deletionen im p24-Bereich ist.
28. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 bis 27, wobei die Sequenz gemäß (a) die Sequenz der SEQ ID NO: 1 , 16 und 18 umfasst.
29. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche 18 bis 28, wobei die Promotorsequenz eine lentivirale LTR-Sequenz oder eine funktionelle Teilsequenz davon ist.
30. Modifizierter Lentivirus, umfassend ein modifiziertes Genom, welches eine oder mehrere stumme Mutationen in proteinkodierenden Bereichen enthält, welche den Kodongebrauch an den von Säugetieren anpassen.
31. Zelle, die einen Vektor oder einen modifizierten Lentivirus nach einem der Ansprüche 18 bis 30 enthält.
32. Arzneimittel, umfassend als Wirkstoff einen Vektor, einen modifizierten Lentivirus oder eine Zelle nach einem der Ansprüche 18 bis 31.
33. Verwendung eines Vektors und/oder eines modifizierten Lentivirus und/oder einer Zelle nach einem der Ansprüche 18 bis 31 zur
Herstellung eines Arzneimittels für die Gentherapie und/oder Diagnostik.
34. Verwendung nach Anspruch 33 für die Gentherapie und/oder Diagnose bei retroviralen Infektionen.
35. Verwendung nach Anspruch 33 zur Behandlung und/oder Diagnose von Antiviralen Infektionen.
36. Verwendung nach Anspruch 33 zur Behandlung und/oder Diagnose einer HIV-Infektion.
37. Verwendung nach Anspruch 33 zur ex vivo Transduktion von PMLs aus mit HIV infizierten Personen.
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