DE69033975T2

DE69033975T2 - Rekombinanttherapien für Infektionen und hyperproliferative Störungen

Info

Publication number: DE69033975T2
Application number: DE69033975T
Authority: DE
Inventors: Mark A. Goldsmith; Robert O. Ralston
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1989-01-23
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2010-01-23
Also published as: JPH10179181A; DE69032841D1; JP2859252B2; PT92931B; US5861290A; US5837510A; DE69032841T2; DE69033975D1; PT92931A; ATE219519T1; ATE174514T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gentechnologie und die Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen und von Infektionen.

Hintergrund der Erfindung

Die Therapie der viralen Infektion ist in ihrem Anfangsstadium. Eine bakterielle Infektion wird typischerweise mit Agentien, wie z. B. Antibiotika, behandelt, die aus den Differenzen im Metabolismus zwischen dem infizierenden Organismus und seinem Wirt Nutzen ziehen. Allerdings nutzen Viren in großem Umfang die wirtseigenen Enzyme, um ihre Replikation durchzuführen und lassen somit wenig Möglichkeiten für eine pharmakologische Intervention. Durch Verwendung starker Regulationselemente erreicht das Virus eine Transkription und Translation seiner eigenen Gene auf Kosten der Gene des Wirts. Bei Säugern wird eine virale Infektion natürlicherweise durch cytotoxische T-Lymphozyten bekämpft, die virale Proteine erkennen, wenn sie an der Oberfläche von Wirtszellen exprimiert werden, und die infizierten Zellen lysieren. Eine Zerstörung der infizierten Zelle verhindert die weitere Virusreplikation. Andere Abwehrmaßnahmen umfassen die Expression von Interferon, das eine Proteinsynthese und eine virale Knospung verhindert, und die Expression von Antikörpern, die freie virale Partikel aus Körperflüssigkeiten entfernen. Allerdings verlangt eine Induktion dieser natürlichen Mechanismen, dass die viralen Proteine dem Immunsystem ausgesetzt werden. Viele Viren, z. B. Herpes simplex-Virus-1 (HSV-1), weisen eine ruhende oder latente Phase auf, während der eine geringe oder keine Proteinsynthese erfolgt. Während solcher Phasen ist die virale Infektion für das Immunsystem im Wesentlichen unsichtbar.
Retroviren tragen die infektiöse Form ihres Genoms in Form eines RNA-Strangs. Bei Infektion wird das RNA-Genom in DNA revers-transkribiert und wird typischerweise dann an einer statistischen Stelle in die chromosomale DNA des Wirts integriert. Gelegentlich erfolgt eine Integration an einer Stelle, die ein Gen, das für einen essentiellen cellulären Rezeptor oder Wachstumsfaktor codiert, stutzt oder die ein solches Gen unter die Kontrolle eines starken viralen cis-wirkenden Regulationselements stellt, was in einer Transformation der Zelle in einen bösartigen Zustand resultieren kann.
Viren können infolge der Wirkung ihrer trans-wirkenden Regulationsfaktoren auf Wirtszellen-Regulationssequenzen oncogen sein. Tatsächlich war die Oncogenese das Charakteristikum, das zur Entdeckung der ersten bekannten Retroviren zur Infektion von Menschen führte. HTLV-I und HTLV-II (humane T-lymphotrope Viren I und II) wurden in den Blutzellen von Patienten, die an Erwachsenen-T-Zellen-Leukämie (ATL) litten, identifiziert und es wird angenommen, dass sie durch die Wirkung ihrer trans-wirkenden Faktoren auf Lymphozytenpromotor-Regionen eine neoplastische Transformation induzieren. HTLV-I und -II infizieren vorzugsweise humane Lymphozyten und bewirken gelegentlich ihre Transformation zur Bösartigkeit. Seither wurden zwei zusätzliche Retroviren gefunden, die Menschen infizieren: HIV-I und HIV-II, die ätiologischen Agentien von AIDS. Allerdings tragen HIV-I und -II scheinbar nur durch ihre immunsupprimierenden Wirkungen zu Krebs bei.
HIV-I und -II infizieren anscheinend Zellen, die das Oberflächenprotein CD4 exprimieren. Dieses Protein ist reichlich an Thymozyten und einigen T-Lymphozyten vorhanden und in geringerem Ausmaß an einigen Antigen-zeigenden Zellen. Eine HIV-Infektion wird zu Beginn durch grippeartige Symptome, gefolgt von einer langen Latenzperiode, die 5 bis 10 Jahren dauern kann, charakterisiert. Bei Eintritt in ihre aktive Phase führt eine HIV-Infektion zu einer schnellen Abnahme bei der Population der T-Helferzellen (TH), das üblicherweise als eine Verringerung im Verhältnis T4&spplus;/T8&spplus; (CD4&spplus;/CD8&spplus;)-T-Lymphozyten erkannt wird. Der Patient erfährt typischerweise eine schwere Diarrhö und zeigt, wenn das Zentralnervensystem infiziert ist, eine Form von Demenz. Die Verarmung an TH-Zellen lähmt das Immunsystem und der Patient wird von einer opportunistischen Infektion durch z. B. P. carinii oder Cytomegalovirus befallen oder bekommt das Karposi-Sarkom. Das natürliche Immunsystem scheint völlig unfähig zu sein, eine HIV-Infektion zu bekämpfen, und zwar trotz des typischen Vorliegens von anscheinend neutralisierenden Serum-Antikörper-Titern während der Latenzzeit.
Die gängige Therapie bei HIV-Infektion per se ist hauptsächlich auf eine Verabreichung von AZT zur Hemmung der viralen Progression beschränkt, obgleich M.S. Hirsch, J. Infect. Dis. (1988) 157: 427-31 eine synergistische Hemmung von HIV durch AZT in Kombination mit GM-CSF (Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) oder α-Interferon beschreibt. AZT (3'-Azido-3'-desoxythymidin) ist für eine Klasse von antiviralen Didesoxynukleosid(ddN)-Mitteln typisch. Diese Mittel basieren auf der Fähigkeit von Wirts-DNA- Polymerasen, ein ddN abzustossen, und auf der Neigung viraler Polymerasen, ddNs zu akzeptieren und sie in replizierende Polynukleotide einzubauen. Beim Einbau stoppt ein ddN die Polymerisation, da ihm die 3'-Hydroxylgruppe fehlt, die für die nächste Phosphodiesterbindung notwendig ist. Die ddNs sind typischerweise in ihrer verabreichten Form inaktiv und sind von einer Phosphorylierung durch Wirtszellenzyme zur Umwandlung in das aktive Triphosphat ddNTP abhängig.
H. Mitsuya et al., Nature (1987) 325: 773-78 offenbaren die Organisation des HIV- Genoms und schlagen verschiedene Strategien zur Entwicklung von HIV-Therapien vor. Ins Auge gefasste Therapien umfassten eine Verabreichung von Antisinn-RNA (als freie Stränge oder durch ein "Antivirus" codiert), um die virale Transkription zu hemmen, Verabreichung von Glykosylierungsinhibitoren, Verabreichung von Interferonen, um eine virale Knospung zu hemmen, und Verabreichung von Didesoxynukleosid-Analoga, um eine virale Replikation zu hemmen. Didesoxynukleosid-analoge Arzneimittel, die als HIV-Therapie verwendbar sind (z. B. AZT, ddC usw.), sind von Wirtszellenzymen zur Aktivierung durch Phosphorylierung abhängig. D. Baltimore, Nature (1988) 335: 395-96 schlägt die Behandlung von AIDS durch Entfernung von Knochenmarkzellen aus einer infizierten Person und Transfektion hämatopoetischer Zellen in den Knochenmarkextrakt mit DNA oder Virus, das für eine RNA oder Protein codiert, die zur Wechselwirkung mit dem HIV-Wachstum fähig ist, vor. Die DNA könnte für RNA codieren, die an HIV-Regulationsproteine binden kann, für Antisinn-RNA, mutante virale Polypeptide oder ein virales DNA-bindendes Protein, dem seine Regulatorfunktion fehlt, codieren. Die transfizierten Zellen würden dann wieder in die Person eingeführt und mit einem selektiven Vorteil zur Sicherstellung einer Verbreitung ausgestattet.
A.I. Dayton et al. Cell (1986) 44: 941-47 beschreiben, dass das HIV-tat-Gen für die virale Proteinsynthese und -replikation essentiell ist. Dayton schlägt vor, dass man HIV durch Wechselwirkung mit tat hemmen könnte, ohne dass die Wirtszelle in anderer Weise beeinträchtigt wird. M.A. Muesing et al., Cell (1987) 48: 691-701 offenbaren, dass das tat-Protein (eher als tat-mRNA allein) für eine Transaktivierung essentiell ist. Muesing hatte auch festgestellt, dass eine tat-art-Fusion (bei der 114 Aminosäuren an das C-Ende von tat durch Deletion von 7 Nukleotiden fusioniert sind), die volle tat-Aktivität beibehielt. A.D. Frankel et al., Science (1988) 240: 70-73 beschreiben, dass tat metallgebundene Dimere in vitro bildet und schlagen vor, dass mögliche Behandlungen für AIDS eine Chelatbildung von Metallionen oder einen Wettbewerb um eine tat-Monomerbindung umfassen. A.D. Frankel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1988) 85: 6297-30 beschreiben die Synthese eines HIV-I-tat-Fragments, das die Metallbindungseigenschaften von tat beibehält. Das Fragment bildete mit nativem tat Heterodimere und kann tat in Homodimeren ersetzen. Frankel schlägt vor, das tat-Fragment zu verwenden, um eine tat- Dimerisierung zu hemmen, wobei Liposome eingesetzt werden, um die Peptide oder ein tat- Fragmentgen zuzuführen. Die Aminosäuresequenz, die für tat aus einem HIV-I-Isolat beschrieben wurde, ist:
Ein ähnliches Protein wird in HIV-II gefunden.
Die tar-Sequenz, die in cis wirkt und durch HIV-tat reguliert wird, wird in dem HIV-I- Genom etwa bei Nukleotiden +19 bis +82 gefunden. Die Sequenz enthält zwei extendierte, umgekehrte Wiederholungen und es wird somit vorausgesagt, dass sie geeignet ist, Stamm- Schleifen-Strukturen zu bilden (Muessing, supra). HIV-II weist eine ähnliche Region auf.
Haseltine, U.S. 4 738 922, offenbart die HTLV-I und -II-LTR-Promotorregionen und ihre Verwendung mit Transaktivatoren (luk) in Vektoren zur amplifizierten Expression von heterologen Proteinen, für die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) ein Beispiel ist. HTLV-I-LTR begünstigt anscheinend eine konstitutive Expression, die in Gegenwart von HTLV-I-luk weiter verstärkt ist, während HTLV-II-LTR anscheinend HTLV-II-luk zur Expression benötigt. Haseltine erwähnt, dass virale trans-wirkende Faktoren die Expression von Wirtszellgenen wie auch von viralen Genen verändern können und Haseltine offenbart das Konzept des Einsetzens eines Vektors, der HTLV-LTR an ein heterologes Gen geschmolzen enthält, in eine Zelle, die das HTLV-Gen aufweist, was in einer trans-Aktivierung des heterologen Gens und der Überexpression seines Produktes resultiert. Haseltine offenbart die Verwendung des HTLV-LTR in Abwesenheit von luk, zur Bildung leerer Capsid-Vaccine und schlägt die Verwendung des HTLV-LTR zur Expression von Antigenen vor, um für eine Zerstörung der Zelle durch monoclonale oder polyclonale Antikörper zu sorgen.
E.A. Dzierzak et al., Nature (1988) 331: 35-41 beschreiben ein Prototyp-Gen- Therapieverfahren bei Mäusen. Dzierzak entfernte Knochenmarkzellen aus Mäusen, setzte die Mäuse einer letalen Strahlung aus und führte humane β-Globin(BG)-Gene in das entfernte Knochenmark unter Verwendung eines retroviralen Vektors, pSV(X)neo, ein. Das BG-Gen wurde eingesetzt, um aus der proviralen Transkription in umgekehrter Richtung zu lesen und es wurden Konstrukte sowohl mit als auch ohne die viralen LTR-Enhancer-Regionen hergestellt. Die Mäuse wurden dann mit dem rekombinierten Knochenmark, das hämatopoetische Stammzellen enthielt, wiederhergestellt. Dzierzak stellte fest, dass humanes β-Globin in den resultierenden rekombinanten Mäusen exprimiert wurde und dass die Expression nur in Zellen erythrozytenartiger Abstammung gefunden wurde. 3-K Yee et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1987) 84: 5197-201 offenbarten die Konstruktion retroviraler Vektoren, die für HPRT codieren, unter der Kontrolle entweder des Metallothionein-Promotors oder des humanen Cytomegalovirus(hCMV)-Promotors. Yee fand heraus, dass eine HPRT-Expression verdoppelt wurde, wenn die Transkriptions-Regulationssequenzen aus der U3-Region der retroviralen LTR deletiert waren.
S.-F. Yu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986) 83: 3194-98 offenbaren die Konstruktion von selbst-inaktivierenden("SIN")-retroviralen Gentransfervektoren. SIN-Vektoren werden erzeugt, indem die Promotor- und Enhancer-Sequenzen aus der U3-Region der 3'-LTR deletiert werden. Eine funktionelle U3-Region in den 5'-LTR erlaubt eine Expression des rekombinanten viralen Genoms in geeigneten Verpackungszelllinien. Allerdings wird bei Expression ihrer genomischen RNA und bei Umkehrtranskription in cDNA die U3-Region der 5-LTR des ursprünglichen Provirus deletiert und durch die U3-Region der 3'-LTR ersetzt. Wenn daher der SIN-Vektor eingebaut wird, ersetzt die nicht-funktionelle 3'-LTR-U3-Region die funktionelle 5'-LTR-U3-Region und macht das Virus unfähig, das genomische Transkript voller Länge zu exprimieren. Yu konstruierte ein rekombinantes Virus unter Verwendung der Mo-MuLV-LTR- Regionen und der Verpackungs(psi)-Sequenz und insertierte ein Neomycin-Resistenz(Neo)-Gen unter Kontrolle entweder eines Metallothionein-Promotors (Virus MT-N), eines HSV-tk- Promotors (Virus TK-N) oder eines SV40-Promotors (Virus SV-N) als selektierbarer Marker. Yu insertierte auch ein humanes c-fos-Gen unter Kontrolle eines humanen Metallothionein- Promotors (hMT) in TK-N und bewies eine induzierbare Transkription von c-fos in NIH-3T3- Zellen nach Infektion mit dem rekombinanten Virus.
S.L. Mansour et al., Nature (1988) 336: 348-52 beschreiben ein Verfahren zur Selektion von Zellen nach einer homologen Rekombination mit einem linearen Transfektionsvektor. Ein linearer Vektor, der eine Region hat, die zu einem Zielgen homolog ist, wurde hergestellt, ein Neomycinresistenz-Gen wurde in ein Exon der homologen Region insertiert und ein HSV-tk- Gen wurde außerhalb der homologen Region insertiert. Bei einer spezifischen homologen Rekombination zeigt die transformierte Zelle einen Phänotyp, der für die Zielregion und HSV-tk negativ ist und auf Neomycinresistenz positiv ist (homologe Rekombination in die Zielstelle zerstört das Zielstellengen und versagt beim Einbau des tk-Gens). Der Phänotyp unterscheidet Zellen, die eine homologe Rekombination aus einer nicht-spezifischen Integration haben, da die letztgenannten Zellen einen Phänotyp zeigen werden, der für das Zielgen HSV-tk und Neomycinresistenz positiv ist. Neomycinresistenz wird getestet, indem Zellen in Neomycin kultiviert werden, während tk&spplus; durch Kultivieren von Zellen in Gancyclovir (das durch tk in ein toxisches Produkt umgewandelt wird) untersucht wird.
R.D. Palmiter et al., Cell (1987) 80: 435-43 offenbaren die Herstellung von transgenen Mäusen, die ein DNA-Konstrukt haben, das für die Diphtherie-A-Kette codiert, unter Steuerung des Elastase-Promotors. Der Elastase-Promotor ist nur in pankreatischen Azinuszellen aktiv und fördert die Expression von Elastase. Die DNA-Konstrukte wurden in Mauseier mikroinjiziert und die resultierende Nachkommenschaft untersucht. Transgene Mäuse, in denen das Konstrukt aktiv war, konnten kein normales pankreatisches Gewebe entwickeln.
M.E. Selsted et al., J. Clin. Invest. (1985) 76: 1436-39 beschreiben die primäre Aminosäuresequenz für drei verwandte humane cytotoxische Effektor-Polypeptide, die als humane neutrophile antimikrobielle Peptide (HNPs) bezeichnet werden. Die drei HNPs haben 29 bis 30 Aminosäurereste und weisen Aktivität gegen Bakterien, Pilze und Herpes simplex-Virus auf (T. Gantz et al., J. Clin. Invest. (1985) 76: 1427-35).
T.L. Wasmoen et al., J. Biol. Chem. (1988) 263: 12559-63 beschreiben die primäre Aminosäuresequenz des Hauptbasisproteins (MBP) von humaner eosinophiler Granula. MBP ist ein Effektor-Polypeptid mit 117 Aminosäureresten, einem pI von 10,9 und zeigt cytotoxische Aktivität gegen Säugerzellen und Parasiten.
M.A. Adam et al., J. Virol. (1988) 62: 3802-06 offenbaren retrovirale Vektoren, die eine effiziente RNA-Verpackung mit einer psi+-Sequenz aufweisen. R.D. Cone et al., Mol Cell Biol (1987) 7: 887-97 offenbaren die Konstruktion von retroviralen Vektoren (pSVX) einschließlich eines Gens für humanes β-Globin und die Verwendung der rekombinanten Vektoren, um eine Expression von humanem β-Globin in einer murinen Erythroleukämie-Zelllinie zu erreichen. A. D. Miller et al., Mol Cell Biol (1986) 6: 2895-902 beschreiben Zelllinien, die für Verpackungsreplikations-defekte retrovirale Vektoren verwendbar sind.
Guild et al., J. Virol. (1988) 62: 3795-801 beschreiben retrovirale Vektoren, die Mo- MuLV-LTRs und psi (Verpackungs)-Sequenz verwenden und die zur Übertragung ganzer Gene in Säugerzellen verwendbar sind. Guild verwendete β-Actin- und Histon-Promotoren (die in im Wesentlichen allen Zellen wirksam sind), um eine Transkription von neor (als selektierbarer Marker) zu erreichen. Die Expression von neor wurde in vivo bewiesen, nachdem Virusinfizierte Knochenmarkzellen verwendet wurden, um letal bestrahlte Mäuse wiederherzustellen.
A.D. Friedman et al., Nature (1988) 335: 452-54 beschreiben eine Transfektion von tk- Mauszellen mit Plasmiden, die HSV-1-tk und HSV-1-VP16 exprimieren. VP16 wirkt als trans- Aktivator zur Transkription der unmittelbaren frühen Gene in Herpes simplex-Virus (HSV-1). Am VP16-Plasmid wurde der Promotor durch den Mo-MSV-Promotor ersetzt und das Carboxy-Ende des VP16 wurde deletiert. Das resultierende Plasmid codiert für ein mutantes VP16- Protein, das mit dem Wildtyp VP16 um eine DNA-Bindung konkurriert. Transfizierte Zellen wiesen bei einer späteren Infektion Resistenz gegenüber einer HSV-1-Replikation auf. Friedman schlägt vor, dass man Resistenz gegen HIV induzieren könnte, indem man eine dominante Mutante des HIV-trans-Aktivatorproteins (tat) transfiziert.
J. Sodroski et al., Science (1985) 229: 74-77 beschreiben die Lage des HIV-tat-Gens. J. Sodroski et al., Science (1985) 227: 171-73 offenbaren den Aufbau eines Plasmids, das CAT hat, unter der Kontrolle der HIV-LTR. Die HIV-LTR enthalten das Gen der transaktivierenden Region (tar), das durch tat induziert wird. Sodroski entdeckte, dass trans-aktivierende Faktoren eine Transkription von Genen unter der Kontrolle der HIV-LTR induzieren würden. B.M. Peterlin et al., Proc. Nat. Acad.Sci. USA (1986) 83: 9734-38 offenbarten Plasmide, die das HIV-tar- Gen haben und die Effekte der Orientierung und Position von tar auf eine Transaktivierung durch tat. Peterlin stellte fest, dass tar am besten funktioniert, wenn es stromabwärts von einem Promotor und einem Enhancer liegt. Eine Aktivierung mit tat erhöhte die Transkription zur RNA. G.J. Nabel et al., Science (1988) 239: 1299-302 offenbarten, dass ein HIV-tat-III-CAT- Fusionsplasmid durch HSV und Adenovirus-trans-wirkende Faktoren aktiviert werden könnte.
B.K. Felber et al., Science (1988) 239: 184-87 beschreiben einen Assay auf HIV unter Verwendung von CD4-exprimierenden Zelllinien, die mit dem Chloramphenicol- Acetyltransferase(CAT)-Gen transfiziert sind, unter Kontrolle der HIV-LTR. Bei Infektion mit HIV exprimierten die transfizierten Zelllinien CAT im Verhältnis zu der Menge an vorliegendem Virus. Felber schlug die Verwendung des Assays als Mittel zur Durchmusterung möglicher Anti-HIV-Arzneimittel auf ihre Fähigkeit, virales Wachstum zu hemmen, und zur Identifizierung von anti-tat-Arzneimitteln vor.
EP-A-0 340 301, die am 29. September 1989 veröffentlicht wurde, aber ein früheres Prioritätsdatum hat und daher den Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC darstellt, beschreibt retrovirale Vektoren für eine therapeutische Behandlung einschließlich solcher Vektoren, die fähig sind, die Expression eines Enzyms zu steuern, das die Zelle für ein zusätzliches Agens empfänglich macht.

Offenbarung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung einer Infektion oder einer hyperproliferativen Krankheit bei Wirtszellen, wobei die Infektion oder hyperproliferative Krankheit durch Expression von Regulationsfaktoren zur Regulation der Transkription von DNA gekennzeichnet ist, durch Insertieren eines Polynukleotidkonstrukts, das eine Regulationsregion, die durch den Regulationsfaktor aktiviert wird, und ein Effektorgen unter Kontrolle der Regulationsregion, das die Zelle für einen Schutz oder eine Zerstörung empfänglich macht, aufweist, in die Zellen.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein Polynukleotidkonstrukt zur Behandlung einer hyperproliferativen Krankheit oder Infektion durch ein infektiöses Agens bei einer Wirtszelle bereit, wobei die Infektion oder hyperproliferative Krankheit durch einen mit einer humanen Krankheit assoziierten trans-wirkenden Regulationsfaktor gekennzeichnet ist, der fähig ist, die Expression von Genen zu regulieren, wobei das Konstrukt umfasst:
(i) mindestens zwei Tandemkopien einer cis-wirkenden Regulationssequenz, die durch den trans-wirkenden Faktor kontrollierbar sind; und
(ii) ein Effektorgen unter der Kontrolle der cis-wirkenden Regulationssequenz, wobei das Effektorgen für ein Enzym codiert, das die Zelle für ein zusätzliches Agens empfänglich macht.
Geeignete Effektorgene zur Verwendung in einem solchen Konstrukt können für Enzyme codieren, die antivirale Verbindungen aktivieren, und dergleichen. Beispielsweise kann die Aktivierungsregion mindestens zwei Tandemkopien einer cis-wirkenden Regulationssequenz enthalten, die zur HIV-tar-Region homolog ist; das Effektorgen kann für HSV-1-Thymidinkinase (HSV-1-tk) codieren. Im Falle von Zellen, die mit HIV infiziert sind und auch ein solches Konstrukt tragen, aktiviert das HIV-tat-Protein die tar-Region und induziert die Transkription und Expression von HSV-1-tk, was zur Cytotoxizität führt, wenn mit Di-desoxynukleosid-Agentien, wie Gancyclovir, behandelt wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die zur Abgabe von DNA-Konstrukten der Erfindung an Wirtszellen verwendbar ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Schutz spezifischer Zellpopulationen in einem Organismus vor einer viralen Infektion, indem ein erfindungsgemäßes, Polynukleotidkonstrukt in die Zellen der Population insertiert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines generischen Polynukleotidkonstrukts der Erfindung.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTB1.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung des Vektors pMXSVNeo-tar/tk.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Resultate des Experiments, das in Beispiel 5 beschrieben wird.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Resultate des Experiments, das in Beispiel 4 beschrieben ist.

Modi zur Durchführung der Erfindung

A. Definitionen

Der Begriff "Behandlung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Verringerung oder Linderung von Symptomen bei einer Person, auf eine Verhinderung der Verschlechterung oder des Fortschreitens der Symptome, auf eine Hemmung oder Eliminierung des ursächlichen Agenses oder auf eine Verhinderung der Infektion oder der Krankheit bei einer Person, die davon frei ist. So kann z. B. eine Behandlung eines Krebspatienten eine Verringerung der Tumorgröße, eine Eliminierung bösartiger Zellen, die Verhinderung von Metastasen oder die Verhinderung des Rückfalls bei einem Patienten, der geheilt war, sein. Die Behandlung einer Infektion umfasst die Zerstörung des infektiösen Agenses, die Hemmung oder Wechselwirkung mit seinem. Wachstum oder seiner Reifung, die Neutralisierung seiner pathologischen Effekte und dergleichen.
Der Ausdruck "Infektion", wie er hier verwendet wird, umfasst eine Infektion durch Viren, Bakterien, Pilze und andere Parasiten, z. B. Leishmania- und Malaria-Parasiten. "Infektiöse Agentien" im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen Viren, z. B. HIV-I, HIV-II, HTLVI-, HTLV-II, Herpes-simplex-Virus (HSV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein- Barr-Virus (EBV), humanes Papilloma-Virus (HPV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C- Virus (HCV); Poliovirus und dergleichen; Bakterien, wie z. B. B. pertussis; und die ursächlichen Agentien von Tetanus, Diphtherie, Cholera und dergleichen; Mycobakterien, wie z. B. M. tuberculosis, und das ursächliche Agens von Lepra; Hefen und Pilze, z. B. C. albicans und P. carinii; Parasiten, wie z. B. Malaria-Plasmodia, Giardia und dergleichen. Bestimmte Verfahren und Konstrukte der Erfindung sind für intracelluläre infektiöse Agentien, z. B. Viren, Malaria und dergleichen am besten geeignet, während andere Verfahren und Konstrukte auf extracelluläre Infektionen anwendbar sind.
Der Ausdruck "hyperproliferative Krankheit" bezieht sich auf Krankheiten, die durch eine abnormale oder pathologische Vermehrung von Zellen gekennzeichnet sind, z. B. Krebs, Psoriasis, Hyperplasie und dergleichen.
Der Ausdruck "cis-wirkende Regulationssequenz" bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die fähig ist, auf einen trans-wirkenden Faktor zu reagieren und die Transkription von cis-lokalisierten Genen zu verstärken. Die am besten geeigneten cis-wirkenden Regulationssequenzen können von dem infektiösen Agens abgeleitet sein, das sie bekämpfen werden. Z. B. ist die tar-Region der HIV-I-LTR eine geeignete cis-wirkende Regulationssequenz zur Behandlung von HIV-I. Wenn man eine Zelltyp-spezifische Expression wünscht, kann man cis-wirkende Sequenzen verwenden, z. B. für T-Zellen: das CD2-Antigen (Genbank HUMATCCD2), IL-2 (Genbank HUMILA2A), IL-2-Rezeptor (Genbank HUMIL2R1), CD1-Antigen (Genbank HUMHTA1), CD3-Antigen (Genbank HUMATCT31), CD4-Antigen (Genbank HUMATCT4), T-Zellprotease (Genbank MUSSPTCS); für B-Zellen: IgG (Genbank HUMIGCA1), MHC-1- Antigen (Genbank HUMMHA2); für Macrophagen: Mac-1-Antigen (Genbank HUMLAP), IL-1 Genbank (HUMIL1P) und dergleichen. Diese cis-wirkende Regulationssequenz, die durch einen mit einer humanen Krankheit assoziierten trans-wirkenden Regulationsfaktor kontrollierbar ist, wird in mehreren Tandemkopien verwendet, um ihre Kompetition mit der endogenen cis- wirkenden Regulationsstelle zu erhöhen. Geeignete Sequenzen zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten (speziell Krebs) sind von den Bindungsstellen bekannter Oncoproteine oder durch Identifizieren eines bekannten Proteins, dessen Expression durch ein Oncogen verändert wird, erhältlich. Die cis-wirkende Regulationssequenz muss fähig sein, eine ausreichende Expression des Effektorgens bereitzustellen, um eine Empfänglichkeit für Schutz oder Zerstörung der Zelle zu erreichen, wenn eine Aktivierung durch den trans-wirkenden Faktor erfolgt, ohne dass eine wesentliche konstitutive Expression in Abwesenheit des trans-wirkenden Faktors zugelassen wird. Die Wahl der cis-wirkenden Sequenz wird vom trans-wirkenden Faktor, der mit der zu behandelnden Infektion oder Krankheit assoziiert ist, und vom ausgewählten Effektorgen abhängen. Die HIV-LTR enthalten sowohl die tar-Region, die für HIV-tat in hohem Maße selektiv ist als auch eine Region, die durch den endogenen nuklearen Faktor NF-KB aktiviert wird (die LTR haben Tandem-NF-KB-Bindungsregionen). Obgleich die tar-Sequenz eine Expression in Abwesenheit von tat stark unterdrückt (siehe z. B. Muesing, Peterlin, supra), beeinflussen die cis-wirkenden Elemente stromaufwärts der tar-Sequenz den Grad der konstitutiven Expression ("Lecken" = "leakness"), die in Abwesenheit von tat auftritt. Der Grad des Leckens in Abwesenheit von tat kann durch Deletion oder Substitution der cis-wirkenden Elemente (z. B. NF-KB-Bindungsstellen) innerhalb der HIV-I-LTR kontrolliert werden.
Der Ausdruck "für Schutz oder Zerstörung empfänglich" bedeutet, dass bei Infektion oder im Fall einer hyperproliferativen Krankheit das Vorliegen des Effektorgens in der Wirtszelle die Zelle für ein zusätzliches Agens empfänglich macht.
Wie oben angegeben wurde, exprimiert ein Polynukleotid-Konstrukt der Erfindung ein Enzym oder Protein, das die Zelle für ein zusätzliches Agens empfänglich macht, beispielsweise kann eine verstärkte Expression einer Nukleosidkinase die Wirtszelle für die Wirkung von Gancyclovir oder Acyclovir empfänglich machen oder kann die Wirksamkeit eines antiviralen Agenses, wie AZT, erhöhen. Didesoxynukleosidanaloga (ddNs), z. B. AZT, Didesoxycytidin, Acyclovir, Gancyclovir und dergleichen sind in ihrer nicht-phosphorylierten Form relativ untoxisch. Allerdings können spezifische virale oder intracelluläre Enzyme die ddNs in die entsprechenden Triphosphate umwandeln; an diesem Punkt wirkt das Agens als Kettenterminierungsagens während der Transkription oder Replikation. Die Nützlichkeit von ddNs basiert auf der Tatsache, dass (1) virale Polymerasen eine höhere Affinität für ddNs aufweisen als Säugerpolymerasen und (2) virale Nukleosidkinasen eine höhere Rate der Phosphorylierung für ddNs als Säugerkinasen aufweisen. Somit werden virale Enzyme (und folglich virale Gene) durch eine Kettentermination stärker beeinflusst als Säugerenzyme und -gene. Die HSV-1-Thymidinkinase (HSV-1-tk) ist bei der Umwandlung von ddNs in die entsprechenden Triphosphate wirksamer, was die Zellen, die aktive HSV-1-tk haben, für ddNs empfänglicher macht.
Geeignete Effektorgene zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen zusätzlich zu Genen, die für eine Nukleosidkinase codieren, welche zur Phosphorylierung von Didesoxynukleosidananaloga mit höherer Geschwindigkeit als Wirtszellnukleosidkinasen fähig sind, z. B. HSV-1-Thymidinkinase, Guaninkinase, Pflanzennukleosid-Phosphotransferase, Leishmania donovani-Purin-2'-desoxyribonukleosidease, L. donovani-Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase und andere geeignete Enzyme des Nukleosidmetabolismus, die fähig sind, Nukleosid, antivirale oder chemotherapeutische Mittel zu aktivieren.
Das Effektorgen kann unter der Kontrolle einer Vielzahl cis-wirkender Sequenzen in Verbindung mit einer starken Terminierungssequenz stehen.
Der Ausdruck "Vektor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein beliebiges Polynukleotidkonstrukt, das fähig ist, für die cis-wirkende Regulationssequenz und das ausgewählte Effektorgen (die ausgewählten Effektorgene) zu codieren, und das fähig ist, diese Gene in geeignete Zielzellen zu übertragen. Vektoren können linear oder kreisförmig, doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Vektoren können DNA, RNA, DNA/RNA-Hybride und DNA- und/oder RNA-Polynukleotide mit chemisch modifizierten Basen umfassen. Geeignete Vektoren im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen lineare dsDNA-Segmente, Plasmide, rekombinante Viren (z. B. rekombinantes Vaccinia-Virus, Adenovirus, Adenoassoziierte Viren und dergleichen), Replikations-defekte retrovirale Vektoren (einschließlich humane, murine, Affen-Vektoren und dergleichen), geeigneterweise nicht-pathogene Derivate von Replikations-kompetenten retroviralen Vektoren und dergleichen. Replikations-defekte retrovirale Vektoren sind derzeit bevorzugt.

B. Allgemeines Verfahren

Die Herstellung von Polynukleotidkonstrukten wird unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, durchgeführt. Sobald ein infektiöses Agens oder eine hyperproliferative Krankheit zur Behandlung ausgewählt ist, besteht der erste Schritt darin, einen assoziierten trans-wirkenden Faktor, eine geeignete cis-wirkende Sequenz und ein Effektorgen zu identifizieren.
Einige virale trans-wirkende Faktoren sind bereits bekannt und charakterisiert. Andere virale trans-wirkende Faktoren können durch Deletionsanalyse des clonierten viralen Genoms identifiziert werden. Z. B. kann ein neues Virus unter Anwendung von Standardtechniken cloniert und sequenziert werden, und die offenen Leseraster identifiziert werden. Dann werden Deletionsmutanten unter Verwendung von Restriktionsenzymen hergestellt und die mutanten Viren auf Transkriptionskompetenz in geeigneten Wirtszellen untersucht. Mutanten, die eine sehr geringe mRNA-Transkription aufweisen, fehlt entweder ein Gen, das für einen transwirkenden Faktor codiert, oder eine cis-wirkende Regulationssequenz. Ob die Deletion den trans-wirkenden Faktor oder die cis-wirkende Sequenz beeinträchtigt, kann im Allgemeinen durch Untersuchung der Position und des Gehalts der genomischen Sequenz bestimmt werden (z. B. werden cis-wirkende virale Regulationssequenzen im Allgemeinen stromaufwärts der offenen Leseraster gefunden). Die Sequenz der cis-wirkenden viralen Region kann bezüglich der Homologie mit bekannten cis-wirkenden Regionen verglichen werden. Da homologe cis- wirkende Sequenzen mit demselben trans-wirkenden Faktor reagieren können, können somit geeignete endogene trans-wirkende Faktoren identifiziert werden. Alternativ können virale Proteine rekombinant in geeigneten Wirten (z. B. Bakterien, Hefe, Säugerzellkultur) exprimiert werden und gereinigte Extrakte markiert und auf Bindung an die virale Genombibliothek durchgemustert werden. Auf diese Weise können geeignete trans-wirkender Faktor/cis- wirkende Sequenz-Paare identifiziert werden. Die Eignung des Paars kann unter Verwendung des CAT-Expressionsassays, der im Folgenden und in den Beispielen detailliert beschrieben wird, beurteilt werden. In diesen Assays wird die cis-wirkende Sequenz in einen geeigneten Vektor cloniert und ein geeignetes Reportergen (z. B. CAT, β-Galactosidase usw.) wird an die cis-wirkende Sequenz ligiert, um für eine cis-Kontrolle zu sorgen. Das Testkonstrukt wird dann in eine geeignete Wirtszelle (z. B. eine Säugerzellkultur) transferriert und auf Reportergenexpression in Gegenwart und Abwesenheit des trans-wirkenden Faktors untersucht. Geeignete Effektorgene sind auf dem Fachgebiet bekannt oder können unter Verwendung von Standardtechniken cloniert werden.
Intracelluläre Parasiten (einschließlich Viren) induzieren oft eine Interferonexpression. Auf diese Weise sollte die Isolierung der cis-wirkenden Interferonsequenz eine Identifizierung von trans-wirkenden Faktoren, die bei der Anti-Parasiten-Antwort involviert sind, und die Herstellung geeigneter Polynukleotidkonstrukte der Erfindung erlauben.
Hyperproliferative Krankheiten werden durch eine ungeeignete Genregulierung oder Genproduktaktivität, bei der typischerweise Zellwachstums- oder Differenzierungsfaktoren und gelegentlich Gene, die für Strukturproteine codieren, involviert sind, charakterisiert. Eine ungeeignete Genregulation kann aus der Expression eines dysfunktionell trans-wirkenden Faktors (z. B. eines Faktors, bei dem eine Stutzung oder Mutation eine Hemmung des Faktors eliminiert hat oder der irreversibel bindet usw.) aus der Überexpression eines trans-wirkenden Faktors oder Rezeptors (infolge der trans-lokalisierten angrenzenden Position eines starken Promotors) oder anderen Defekten resultieren. In jedem Fall weist die Krankheit charakteristischerweise einen trans-wirkenden Faktor auf, der sich entweder von denen, die in normalen Zellen gefunden werden, unterscheidet oder in abnormal großen Mengen vorliegt. Die trans-wirkenden Faktoren, die durch Viren, welche mit hyperproliferativen Krankheiten assoziiert sind (z. B. HTLV- I, HTLV-II, die E6- und E7-Gene von HPV, Typ 16 und Typ 18) assoziiert sind, codiert werden, können auch zur Regulierung der Expression eines Effektorgens verwendet werden, was hier beschrieben wird. Sobald die betroffene cis-wirkende Sequenz identifiziert ist, kann ein geeignetes Effektorgen ausgewählt werden. Als die charakteristischen trans-wirkenden Faktoren gibt es im Allgemeinen die, die zu normalen trans-wirkenden Faktoren mindestens etwas homolog sind, wobei die cis-wirkende Sequenz wahrscheinlich eine gewisse Regulation durch endogene trans-wirkende Faktoren in normalen Zellen aufweist. Allerdings kann die Aktivität der transwirkenden Faktoren in hyperproliferativen Fällen konstitutiv hoch sein, wohingegen die Aktivität in normalen Zellen niedriger und fluktuierend (wie während des Zellzyklus) sein kann. Der Unterschied kann ausgenützt werden, um eine Akkumulation hoher Level eines Effektorgenprodukts in hyperplastischen Zellen zu ermöglichen.
Was Fig. 1 angeht, so ist ein retroviraler Vektor der Erfindung dargestellt, ausgenommen eine Insertion einer oder mehrerer weiterer Kopien der cis-wirkenden Regulationssequenz. Der Vektor umfasst die 5'-retroviralen LTR- und Primer-Bindungsstelle (1), eine psi- Enkapsidierungs(Verpackung)-Signalsequenz (2), eine fakultative 3'-RNA-Weiterverarbeitungssignalsequenz (3), ein Effektorgen (4), eine 5'-cis-wirkende Regulationssequenz (5), einschließlich eines Promotors, fakultativ eines Promotors (6) und eines selektierbaren Markergens (7), und eine 3'-retrovirale LTR- und Primer-Bindungsstelle (8).
Die Sequenzen 1 bis 8 werden den retroviralen Teil des Vektors, während Sequenz 9 typischerweise von einem Plasmid stammt und für die Haltung des Vektors in Zellkultur sorgt. Die 5'-LTR (1) und die R'-LTR (8) sorgen für eine reverse Transkription und Integration des Vektors in das Wirtszellgenom. Geeignete LTRs umfassen die, die vom Moloney- Maus-Leukämievirus (Mo-MuLV) (Shinnick et al., Nature (1981) 293: 54), vom Harvey-Maus- Sarkom-Virus (Ha-MSV), (Van Beveran et al., Cell (1981) 27: 97); HTLV-I, HTLV-II, HIV-I und HIV-II stammen. Bei Replikations-defekten Retroviren ist die U3-Region der 3'-LTR (8) inaktiviert. Die psi-Sequenz (2) muss enthalten sein, um den Vektor in virale Capside einzuschließen, die bei der Verpackungszelllinie erzeugt werden; dieser ist aber sonst inaktiv, wenn er einmal in das Wirtsgenom integriert ist. Geeignete psi-Sequenzen wurde von Cepko et al., Cell (1984) 37: 1053-62; Guild et al., supra; und Kriegler et al., Cell (1984) 38: 483 beschrieben. Wenn der Vektor nicht retroviral ist und eher durch Transfektion als durch Infektion insertiert weiden soll, können die LTR-Sequenzen und die psi-Sequenz weggelassen werden. Das Effektorgen (4) ist wie oben beschrieben. In rekombinanten retroviralen Vektoren als "interner Promotor" wird das Effektorgen (4) mit seiner eigenen Promotor/cis-wirkenden Regulationssequenz (5) und Terminatorsequenz/Polyadenylierungssequenz (4) ausgestattet (obgleich der Terminator und PA-Sequenzen vom Effektorgen stammen können).
Das Effektorgen kann in jeder Richtung orientiert sein, ist normalerweise aber in Richtung entgegengesetzt zum LTR-Leseraster orientiert. In rekombinanten retroviralen Vektoren als "Enhancer-Replacement" ist das Effektorgen (4) in derselben Richtung wie die LTR orientiert und wird nicht mit einer getrennten cis-wirkenden Regulationssequenz (5) oder Terminatorsequenz/Polyadenylierungssequenz (4) versehen. Stattdessen wird die cis-wirkende Regulationssequenz innerhalb der 3'-LTR (8)-U3-Region bereitgestellt, so dass das Effektorgen durch die cis-wirkende Regulationsregion nur nach rerverser Transkription kontrolliert wird.
Der selektierbare Marker (7) codiert, wenn er vorhanden ist, für ein Merkmal, das es Zellen ermöglicht, die Markersequenz zu exprimieren, um unter Bedingungen zu überleben, die auf transfizierte Zellen selektieren. Der selektierbare Marker codiert typischerweise ein Enzym, das Resistenz gegen ein Antibiotikum, z. B. Chloramphenicol, Neomycin (Southern et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1: 327-41) oder Hygromycin (Gritz et al., Gene (1983) 25: 179-88), verleiht. Der selektierbare Marker ist, wenn er verwendet wird, üblicherweise mit seinem eigenen Promotor (6) ausgestattet, der die Expression des Markergens während der Selektion von transfizierten/infizierten Zellen erlaubt. Geeignete Markergen-Promotoren umfassen den Histonpromotor, den HSV-1-tk-Promotor und den Metallothionein-Promotor.
Sequenz 9 ist eine Polynukleotid-Aufrechterhaltungs-Sequenz, die für die stabile Aufrechterhaltung des Vektors in Producerzellen sorgt. Typischerweise stammt Sequenz 9 von einem Plasmid und stellt einen Replikationsursprung (z. B. pBR322 ori oder der Hefe-2u- Ursprung) und (üblicherweise) einen Antibiotikum-Resistenzmarker bereit. Geeignete- Erhaltungssequenzen umfassen pXf3, pBR322, pUC18, pML und dergleichen. Im Fall von linearen DNA-Sequenzen, die für eine zielgerichtete Integration verwendet werden, kann der Vektor an einem Punkt innerhalb Sequenz 9 linearisiert werden. Die LTR-Regionen 1 und 8 werden durch Sequenzen ersetzt, die der Sequenz mit der gewünschten Zielrekombination homolog sind. Sequenz 2 wird gelöscht. Sequenz 9 umfasst Polynukleotidsequenzen, die für die Erhaltung und Replikation in mikrobiellen Wirten sorgen, und zusätzlich einen Gegenselektionsmarker (der für die Deletion transfizierter Wirtszellen, die eine nicht-spezifische Integration durchmachen, sorgt).

Entwicklung von Arznei-Aktivierunssystemen

Als Prototypsystem zur Aktivierung von cytotoxischen Arzneimitteln wählen wir das Thymidinkinase-Gen von Herpes-simplex-Virus, Typ 1 (HSV-1-tk). HSV-1-tk kann eine Vielzahl von Didesoxynukleosid-Analoga (ddNs) durch Umwandlung dieser Arzneimittel in die (5')-Monophosphat-Spezies aktivieren. Die ddNMPs können als kompetitive Inhibitoren eines cellulären Nukleotids oder von Nukleosidkinasen wirken, was eine Erschöpfung der cellulären Nukleotidpools bewirkt; nach der Umwandlung in Triphosphatspezies (ddNTPs) durch celluläre Enzyme können ddNTPs in neue DNA(und möglicherweise RNA)-Stränge eingebaut werden, was eine Kettenterminierung verursacht.
Eines der am besten charakterisierten ddNs, das durch HSV-1-tk aktiviert werden kann, ist Acyclovir (Acyclo-G). Die Sicherheit und Wirksamkeit von Acyclovir resultiert in erster Linie aus seiner selektiven Aktivierung durch HSV-1-tk: Acyclo-G wird mehrere tausend Mal wirksamer durch HSV-1-Thymidinkinase (tk) als durch celluläre Thymidinkinasen in Acyclo- GMP umgewandelt (Km für HSV-1-tk = 0.005X Km Vero tk; Vrel HSV-1-tk = 3.000.000X Vrel Vero tk). Celluläre Enzyme können Acyclo-GMP in Acyclo-GTP umwandeln, welches durch HSV-1-DNA-Polymerase in DNA eingebaut wird, was eine Beendigung der viralen DNA-Synthese verursacht. Acyclo-GTP hemmt die HSV-1-DNA-Synthese bei etwa 1/20 der Konzentration, die für eine ähnliche Inhibierung der cellulären DNA-Synthese erforderlich ist (P.A. Furman et al., J. Virol. (1979) 32: 72-77).
Sobald eine cis-wirkende Regulationssequenz identifiziert wurde, wird sie auf ihren Effekt in einem Modellsystem untersucht. Beispielsweise kann die cis-wirkende Regulationssequenz in ein Plasmid mit einem geeigneten Reportergen, z. B. CAT oder β-Galactosidase, cloniert werden. Das Plasmid wird dann in eine geeignete Zelllinie (z. B. CHO-Zellen, HeLa, HUT78 und dergleichen) transfiziert. Der trans-wirkende Faktor kann durch Selektieren einer Wirtszelllinie, die den trans-wirkenden Faktor exprimiert, oder durch Co-Transfektion der Wirtszelllinie mit einem Plasmid, das für den trans-wirkenden Faktor unter der Kontrolle eines anderen Promotors (entweder induzierbar oder konstitutiv) codiert, zugeführt werden. Die transfizierten Wirtszellen werden dann auf Expression des Reportergens untersucht.
Die Eignung eines Effektorgens, z. B. HSV-1-tk, wird durch Clonieren in ein geeignetes Plasmid unter Kontrolle der selektierten cis-wirkenden Regulationsregion bestätigt. Das Plasmid enthält vorzugsweise auch einen selektierbaren Marker, der es ermöglicht, dass die Zellen, die durch den Vektor genetisch transformiert werden, selektiert werden.

Allgemeine Struktur von Thymidinkinase-Vektoren

Die allgemeine Struktur von retroviralen Vektoren, die zur Erzeugung rekombinanter Retroviren, die ein Effektorgen an cis-wirkende Regulationselemente gebunden enthalten, verwendet werden können, ist in Fig. 1 dargestellt. Die grundlegenden retroviralen Vektoren zur Expression von HSV-1-tk stammen vom Moloney-Maus-Leukämievirus (Mo-MuLV). Alle Mo- MuLV-Gene (gag, Pol und env) würden aus den Vektoren entfernt, um vollständig Replikations-defekte Viren zu erzeugen. Die verbleibenden Komponenten werden zur Expression und Verpackung viraler RNA, reversen Transkription und Integration und Transkription des tk-Gens (und Markergens, wenn gewünscht) in den Zielzellen benötigt. Diese Komponenten bestehen aus den Mo-MuLV-langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs), den Plus- und Minus- Strang-Primerbindungsstellen und dem RNA-Einkapsidierungssignal (psi-Sequenz).
Um die Expression von HSV-1-tk in Zelltyp-spezifischer Weise zu regulieren, wird eine Hybridtranskriptionseinheit aufgebaut, in der die HSV-1-tk-codierende Sequenz die codierende Sequenz einer Zelltyp-spezifischen Transkriptionseinheit ersetzt.
Eine Expression des HSV-tk-Gens über diese Vektoren kann auf zwei Wegen erfolgen. Der erste Vektortyp verwendet ein getrenntes Enhancer-Regulationselement, um die Expression von HSV-1-tk zu regulieren. Bei diesem Vektortyp schreitet die Transkription von HSV-1-tk in entgegengesetzter Orientierung zum Plus-Sinn des Provirus fort (wie in Fig. 1 dargestellt). Das tk-Gen wird mit seinem eigenen Polyadenylierungssignal ausgestattet und kann, wenn gewünscht, auch mit einem Intron zwischen der tk-codierenden Sequenz und dem Polyadenylierungssignal ausgestattet sein. Eine potentielle transkriptionale Wechselwirkung in der ersten Klasse von Vektoren kann verringert werden, indem die Enhancer/Regulationselement- Sequenzen aus den 3'-LTR des Vektors entfernt werden. Da nur die U3-Sequenzen der 3'-LTR in viraler RNA transkribiert werden, bilden diese Sequenzen beide LTRs in dem resultierenden Provirus. Dies erlaubt eine Integration der proviralen c-DNA, führt aber zum Verlust der Enhancer und der Regulationselemente aus beiden LTRs des Provirus.
Im zweiten Vektortyp (Enhancer-Ersatzvektor) liefern die Mo-MLV-LTR die Enhancer- und Regulationselement-Sequenzen, die die Expression des HSV-1-tk-Gens steuern. Die Mo- MLV-LTR können die Expression von heterologen Genen in einer Vielzahl von Zelltypen (ausgenommen hämatopoetische Stammzellen) steuern, sind aber in T-Zellen am wirksamsten. Die Steuerung der Zelltyp-spezifischen Genexpression von HSV-1-tk kann durch Substitution der Enhancer/Regulationselement-Sequenzen durch spezifische Enhancer/Regulationselement- Sequenzen innerhalb der 3'-Mo-MLV-LTR erreicht werden. Die 5'-Mo-MLV-LTR werden im Vektor zurückgehalten, um eine wirksame Expression von viraler RNA in der Verpackungszelllinie zu ermöglichen, die zur Erzeugung von infektiösem Virus verwendet wird.
In diese Vektoren kann in 3' zu dem HSV-1-tk-Gen ein selektierbarer Marker eingearbeitet werden, um eine in-vitro-Selektion von transformierten Zellen zuzulassen. Eine Expression des Markergens wird durch sein eigenes Regulationselement bereitgestellt. Im Allgemeinen würde dieses Regulationselement von einem moderat aktiven cellulären Gen stammen, das in allen Geweben konstitutiv exprimiert wird. Einige Beispiele solcher Regulationselemente wären der cytoplasmische β-Actinpromotor, Histonpromotoren und Promotoren für glykolytische Enzyme.
Der zweite Vektortyp verwendet ein getrenntes Enhancer/Regulationselement, um eine Expression von HSV-1-tk zu regulieren. Bei diesem Vektor schreitet die Transkription von HSV-1-tk in entgegengesetzter Orientierung zum Plus-Sinn des Provirus fort. Das tk-Gen ist mit seinem eigenen Polyadenylierungssignal ausgestattet und kann, wenn gewünscht, mit einem Intron zwischen der tk-codierenden Sequenz und dem Polyadenylierungssignal ausgestattet sein. Eine potentielle transkriptionale Wechselwirkung in dieser zweiten Vektorenklasse kann reduziert werden, indem die Enhancer/Regulationselement-Sequenzen aus den 3'-LTR des Vektors entfernt werden. Dies erlaubt eine Integration der proviralen cDNA, führt aber zu einem Verlust der Enhancer und der Regulationselemente aus beiden LTRs des Provirus.
Ein selektierbarer Marker kann wie in der ersten Klasse der Vektoren bereitgestellt werden und wird in der entgegengesetzten Richtung von HSV-1-tk transkribiert. Die Transkription wird somit im Zentrum des integrierten Provirus initiiert und schreitet in entgegengesetzten Richtungen fort, und zwar in einer Weise, die der Transkription der E2/E3-Gene humaner Adenoviren analog ist.

Formulierung und Verabreichung

Die Polynukleotidkonstrukte der Erfindung können in Abhängigkeit von der Konstruktform formuliert werden. Wenn der Vektor z. B. ein kompetentes (infektiöses) Virus ist, kann es in der gleichen Weise wie lebende Virus-Vaccine formuliert werden. Solche Formulierungen sind typischerweise gepufferte, physiologische Kochsalzlösung zur Injektion oder gepufferte orale Formulierungen, von denen jede gegebenenfalls Antibiotika enthalten kann. Liposomformulierungen können nach Standardmethoden hergestellt werden, z. B. indem Lipide in Chloroform suspendiert werden, die Lipide an den Wänden eines Behälters getrocknet werden und die Lipide mit einer Lösung, die das Polynukleotidkonstrukt enthält, hydratisiert werden. Geeignete Lipide sind auf dem Fachgebiet bekannt; sie schließen Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Lecithin und dergleichen ein. Ein synthetisches Lipid, das zur Polynukleotidtransfektion besonders nützlich ist, ist N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, das im Handel unter dem Namen Lipofectin® (erhältlich von BRL, Gaithersburg, MD) erhältlich ist und das von P.L. Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA (1987) 84: 7413 beschrieben wird.
Rekombinante retrovirale Vektoren können auch zur in-vivo-Verabreichung (bei fehlerhafter Replikation) formuliert werden. Vektoren, die auf HIV-I oder HIV-II basieren, werden denselben cellulären Tropismus wie das native Virus zeigen, wodurch ein effizientes und umfassendes Mittel zum Abzielen auf geeignete Zellpopulationen in vivo bei Behandlung einer HIV-I- oder HIV-II-Infektion bereitgestellt wird. Vektoren auf der Basis von HIV können die HIV-LTR-Promotoren, die tar-Sequenz und das tat-Gen zur Kontrolle der Expression heterologer Gene verwenden. Man kann die Zielzellspezifität des Vektors durch geeignete Wahl von Verpackungskonstrukten (z. B. env-Gen) verfeinern. Zum Beispiel ist das Isolat HIV-ISF162 (M. Quiroga et al., "Modern Approaches to New Vaccines" (1989, Cold Spring Harbor Laboratories) S. 80) natürlicherweise für eine Makrophagen-Infektion selektiv: auf diese Weise kann durch Verpacken des Vektors in eine von HIV-ISF162-abgeleitete Hülle ein Zielen auf den Makrophagen erreicht werden. Ähnlich ermöglicht die Verpackung von Vektoren unter Verwendung rekombinanter Hüllgene, die Sequenzen enthalten, die von Hüllen oder Capsiden stammen, die von Hepatitis-B-Virus (oder HAV oder HCV) stammen, eine zielgerichtete Abgabe an Hepatocyten. Durch Verwendung einer Verpackungszelllinie, die Hüllproteine exprimiert, welche von HIV-II stammen, kann man ein wirksames Verfahren zum Targeting der Vektoren der Erfindung zum Schutz von TH-Zellen infolge der Affinität von gp160env für CD4+ (Smith et al., Science (1987) 238: 1704-06) erhalten.
Der Verabreichungsmodus von Polynukleotidkonstrukten der Erfindung hängt von der Natur des Vektors ab. Beispielsweise können retrovirale Vektoren durch Inokulation, parenteral oder oral verabreicht werden. Wenn der Vektor ein infektiöses rekombinantes Virus ist, kann eine Verabreichung durch parenterale Injektion, orale oder intranasale Verabreichung und dergleichen erfolgen. Liposomformulierungen werden vorzugsweise durch ein intranasales Spray oder eine intravenöse Injektion verabreicht. Das derzeit bevorzugte Verabreichungsverfahren besteht in der Inkubierung defekter retroviralen Vektoren mit abgesaugten autologen Knochenmarkzellen oder T-Lymphozyten ex vivo, worauf sich eine Wiedereinführung der behandelten Zellen durch Standardtechniken anschließt. Kurz, Knochenmarkzellen werden nach Techniken, die auf diesem Gebiet für Knochenmarktransplantationen bekannt sind, abgesaugt und werden im Allgemeinen aus dem Nierenbecken abgesaugt. Wenn gewünscht (insbesondere bei der Behandlung von Leukämie und anderen hyperplastischen Krankheiten) kann die Person mit Chemotherapie oder Radiotherapie nach der Knochenmarkabsaugung behandelt werden, um die Belastung mit infizierten oder hyperproliferierenden Zellen zu reduzieren. Das Aspirat kann zur Entfernung von unerwünschtem Material (z. B. Tumorzellen, Bakterien, virale Partikel und dergleichen), z. B. durch Immunpräzipitation, Immunadsorption, Immunreaktion mit Komplementfixierung, Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) und dergleichen, durchgemustert werden. Idealerweise werden hämatopoetische Stammzellen markiert und unter Verwendung Stammzell-spezifischer MAbs isoliert. Das durchgemusterte Aspirat wird dann transfiziert oder mit einem Konstrukt der Erfindung infiziert. Ein Infektionsverfahren besteht in der Haltung der aspirierten Zellen in Kultur in Kontakt mit infektiösen Titern Replikations-defekter retroviraler Vektoren über einen Zeitraum, der eine effiziente Inokulation sicherstellt. Wachstumsfaktoren für hämatopoetische Zellen (z. B. IL-3) können während der Cokultivierung zugesetzt werden (E.A. Dzierzak, supra). Es können die Calciumphosphat-Transfektionstechniken, die für murine Zellen bekannt sind, angewendet werden (siehe z. B. E.A. Dzierzak, supra; S-F. Yu et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986) 83: 3194-98). Konstrukte können auch durch Elektroporation eingeführt werden (S. Mansour, supra). Alternativ kann man ein Transfektionsagens, wie z. B. Lipofectin®, verwenden. Wenn der Vektor einen Marker beinhaltet, können die infizierten Zellen, wenn gewünscht, durchgemustert oder selektiert werden. Die infizierten Zellen werden dann wieder in das Subjekt eingeführt, wobei Methoden für eine autologe Knochenmarktransplantation angewendet werden, typischerweise eine intravenöse Infusion oder Injektion. Man kann auch Lymphozyten entweder in vivo oder ex vivo unter Verwendung von Konstrukten der Erfindung transfizieren oder infizieren. Eine Infektion unter Verwendung von Konstrukten auf MLV-Basis wird vorzugsweise ex vivo durchgeführt, da die Hülle durch humanes Komplement inaktiviert wird. Spezifische Subsets der Lymphozytenpopulation können durch Verwendung monoclonaler Antikörper zur Trennung des gewünschten Subsets oder durch andere Methoden, die auf dem Gebiet bekannt sind, selektiert werden: siehe z. B. P.W. Kantoff et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986) 83: 6563-67.
Wenn dies gewünscht wird, kann man einige der Lymphozyten oder Knochenmarkzellen in Verpackungszellen umwandeln, indem unabhängige Konstrukte, die zur Expression der viralen Gene, die für gag-pol und env codieren; fähig sind, insertiert werden und danach eine Insertion eines erfindungsgemäßen Vektors folgt. O. Danos et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1988) 85: 6460-64. Wenn die autologen Verpackungszellen wieder in das Subjekt eingeführt werden, führt eine kontinuierliche Expression von Replikations-defektem Retrovirus während der Zelllebenszeit zu einem Transfer des therapeutischen Konstrukts der Erfindung in eine große Zahl von Wirtszellen.

C. Beispiele

Die im Folgenden angegebenen Beispiele werden als weiterer Leitfaden für den Fachmann auf diesem Gebiet und nicht als Beschränkung der Erfindung in irgendeiner Weise aufgeführt.

BEISPIEL 1

Rekombinante retrovirale Vektoren

Retrovirale Vektoren wurden unter Anwendung von Standardtechniken zur Manipulation von rekombinanter DNA konstruiert (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)). Plasmide, die beim Aufbau von retroviralen Vektoren eingesetzt werden, wurden aus folgenden Quellen erhalten: pMX1112SVNeo war ein Geschenk von M. McMann (UCSF), SV-N war ein Geschenk von E. Gilboa (konstruiert wie von Yu beschrieben, supra).
Plasmid pMX1112SVNeo wird aufgebaut, indem ein Cla-Cla-Fragment des SV40- frühen Promotors, der an das neo'-Gen gebunden ist, in das Plasmid pMX1112 insertiert wird (beschrieben von A.M.C. Brown et al., "Retroviral Vectors", S. 189-212, in "DNA Cloning": a practical approach, Bd. 3 (D.M. Glover, Herausgeber, IRL Press, 1987)). Das SV40-neo'-Gen ist, zwischen der psi-Verpackungssequenz und der 3'-Mo-MuLV-LTR-Region am Plasmid positioniert. Plasmid pMXSVNeo18 wurde aus pMX1112SVNeo durch Entfernen der EcoRI-Stelle stromaufwärts der 5'-Mo-MuLV-LTR, Insertieren eines EcoRI-Linkers an der XhoI-Stelle und. Einfügen des pUC18-Polylinkers zwischen die neue EcoRI-Stelle und die HindIII-Stelle hergestellt. Plasmid pTAR1 enthält die HIV-5'-LTR (einschließlich der tar-Sequenz), ein Gen, das für CAT codiert, und ein SV40-Polyadenylierungssignal und das t-Intron und wurde durch Clonieren des XhoI-NarI-Fragments von HIV-I (SF2) (R. Sanches-Pescador et al., Science (1982) 227: 484-92) in pML cloniert. Ein synthetischer Polylinker wurde an die NarI-Stelle angefügt und das Stu1-BamHI-Fragment von pSV2CAT (C.M. Gorman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6777-81), das das CAT-Gen, und SV40-RNA-Bearbeitungssignale erhält, wurde unter Bereitstellung von pTAR1 insertiert. pTAR1 wurde mit Asp718 und XhoI gespalten und das resultierende Fragment wurde in pMXSVNeo18 cloniert, um pTB1 herzustellen, das in Fig. 2 dargestellt ist. Das Plasmid pTAT1 wurde mit dem HIV-tat-Gen unter der Kontrolle des SV40 EP aufgebaut und durch das SV40-Polyadenylierungssignal flankiert (Peterlin et al., supra). Das Plasmid pRT enthält das HSV-1-tk-Gen, Promotor und RNA-Verarbeitungssignale. Das Plasmid ptar/tk wurde durch Clonieren des Bg1II-EcoRI-Fragments von pRT (enthaltend die tk- codierende Sequenz und ein Polyadenylierungssignal) in pTAR1 anstelle des CAT-Gens hergestellt. Plasmid pMXSVNeo-tar/tk wurde durch Clonieren des Asp718-EcoRI-Teils von ptar/tk in den pMXSVNeo18-Polylinker konstruiert (pMXSVNeo-tar/tk ist in Fig. 3 dargestellt).
Amphotrope Retroviren, die fähig sind, humane Zellen zu infizieren, wurden nach Standardtechniken hergestellt (R. Mann et al., Cell (1983) 33: 153-59). Kurz ausgedrückt, die amphotrope Verpackungszelllinie PA-317 (Miller et al., Mol. Cell Biol. (1986) 6: 2895-902, ATCC CRL 9078) wurde unter Anwendung der CaPO&sub4;-Copräzipitationstechnik mit Plasmidvektor transfiziert (R. Graham et al., Virol. (1973) 52: 456-67). 10 ug Plasmidvektor plus 25 ug Lachssperma-DNA-Träger wurden als CaPO&sub4;-Copräzipitat auf 5 · 10&sup5; PA-317-Zellen in einer 60 mm-Gewebekulturschale für 8 bis 16 h angewendet. Das Präzipitat wurde entfernt und die Monoschicht wurde mit Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung gespült. Es wurde frisches Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagles-Medium, DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika) aufgetragen und die Zellen wurden 2 Tage lang wachsen gelassen und isoliert. Die transfizierten Zellen wurden dann trypsiniert und in einen 150 mm²-T-Kolben überführt und für 10 bis 14 Tage in einem Medium, das 0,8 mg/ml 6418 enthielt, wachsen gelassen. Die resultierenden G418-resistenten Kolonien wurden trypsiniert und durch limitierende Verdünnung in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen cloniert. Rekombinantes Retrovirus, das durch einzelnen Clone produziert worden war, wurde durch Infektion von humanen Zelllinien (HeLa, ATCC CCL 2: HUT78, ATCC TIB 161) charakterisiert, um den viralen Titer und die Erzeugung der korrekten proviralen Struktur zu bestimmen.
Ecotrope rekombinante Retroviren wurden wie oben beschrieben hergestellt, außer dass die ecotrope Verpackungszelllinie Psi-2 (R. Mann, supra) anstelle von PA-317 verwendet wurde.

BEISPIEL 2

Infektion von Zellen mit rekombinanten Retroviren

Zelllinien wurden unter Anwendung von Standardverfahren mit rekombinanten Retroviren infiziert (R. Mann, supra). Kurz ausgedrückt, 5 · 10&sup6; Zellen wurden in 60 mm-Gewebekulturplatten plattiert und 16 Stunden wachsen gelassen. Zellfreie Überstände aus Verpackungszellen, die Plasmidvektoren enthielten, wurden für 6 bis 8 h in Gegenwart von 8 ug/ml Polybren auf die Zielzellen aufgebracht. Im Fall von Viren, die den G418-Resistenzmarker tragen, wurden Zellen wachsen gelassen, selektiert und cloniert, wie es oben zur Herstellung der Verpackungsclone beschrieben ist. Retroviren, die HSV-1-tk tragen, denen aber der G418- Resistenzmarker fehlt, wurden unter Verwendung von tk-Zelllinien getitert: L-M (tk-) (ATCC CCL 1.3) für ecotrope Viren, 143-B-Zellen (ATCC CRL 8303) für amphotrope Viren. Eine Selektion auf tk&spplus;-Kolonien wurde unter Verwendung eines HAT-Mediums durchgeführt.

BEISPIEL 3

Assay auf Transaktivierung durch HIV-tat

Die Plasmide pTAR1, pTB1 und pTB2 (das die HIV-LTR-Region in entgegengesetzter Orientierung zu pTB1 hat), die für CAT unter Kontrolle der HIV-tar-cis-wirkenden Regulationssequenz codieren, wurden in HeLa-Zellen transfiziert. Das Plasmid pTATI, das das HIV-tat- trans-wirkende Agens exprimiert, wurde in die Hälfte der HeLa-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen lysiert und ¹&sup4;C-Chloramphenicol wurde mit den Lysaten inkubiert. Die Produkte wurden mit EtOAc extrahiert und durch Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Resultate zeigten an, dass CAT in HeLa-Zellen exprimiert wurde, die sowohl ein tar-codierendes Plasmid als auch ein tat-codierendes Plasmid enthielten, aber nicht in HeLa- Zellen exprimiert wurden, denen das pTAT1-Plasmid fehlte. Obgleich der Level der konstitutiven Expression (Lecken) zwischen pTAR1, pTB1 und pTB2 etwas variierte, war die CAT- Expression als Reaktion auf HIV-tat in Zellen, die pTB1 und pTB2 enthielten, höher als in Zellen, die pTAR1 enthielten (denen die Mo-MuLV-LTRs und der SV40-Enhancer fehlte).

BEISPIEL 4

Antivirale cytotoxische Effektorgene

Es wurde amphotroper MXSVNeo-tar/tk-Retrovirus produziert und zur Infektion von HUT78-Zellen (ATCC TIB 161) verwendet. Transformierte Zellen ("HUT-tk-Zellen") wurden unter Verwendung von 1 mg/ml G418 selektiert. Die Empfindlichkeit von HUT-tk-Zellen in Massekultur gegenüber Acyclovir wurde durch Wachstum in einem Medium, das verschiedene Arzneimittelkonzentrationen enthielt, bestimmt. HUT78-Zellen, die pMXSVNeo-tar/tk ("HUT- tk-Zellen) enthielten, wurden pelletiert und Polybren (2 ug/ml) bei 37ºC für 30 Minuten ausgesetzt. Die Zellen wurden dann pelletiert und mit 10&sup5; Zellen pro ml resuspendiert und für 1,5 h bei 37ºC HIV-I (SF2) ausgesetzt. Die Zellen wurden dann pelletiert und in RPMI-1640- Medium, das 10% fötales Kälberserum und Antibiotika enthielt, mit 104 Zellen pro 50 ul resuspendiert. 50 ul Zellsuspension wurden dann auf Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen verteilt, die 1 ml Medium mit 45, 100 oder 200 uM Acyclovir enthielten. HIV-SF2 wurde zugesetzt (in ausreichender Menge, um 3 OD in einem p25-gag-ELISA nach 7 Tagen Inkubation bereitzustellen) und sich 7 Tage vermehren gelassen und danach durch anti-p25gag-ELISA untersucht. Normale HUT78-Zellen dienten als Kontrolle für den Effekt von HSV-1-tk. Die Resultate dieser Experimente sind in Fig. 5 dargestellt.
Obgleich die HIV-Replikation in HUT78-Zellen durch Acyclovir nicht signifikant beeinträchtigt wurde, wurde die Replikation durch Acyclovir in HUT-tk-Zellen stark gehemmt (um etwa 60% mit 100 uM Acyclovir). Cytophatische/cytotoxische Effekte wurden bei beiden Zelltypen sichtbar (Daten nicht gezeigt). Obgleich eine Analyse von Einzelzellclonen von HUT-tk eine Schwankung bei der Empfindlichkeit gegenüber Acyclovir zeigte, waren die in Masse kultivierten HUT-tk-Zellen fähig, eine virale Replikation signifikant einzuschränken.

BEISPIEL 5

Assay auf Hemmung der HIV-Replikation

HIV-infizierbare Zellen, die zu einem HSV-1-tk-positiven Phänotyp transformiert worden waren, können zur Durchmusterung von Nukleosid-Analogen auf antivirale Aktivität und celluläre Cytotoxizität (Mitsuya, supra) verwendet werden.
HUT78-Zellen, die pMXSVNeo-tar/tk enthielten ("HUT-tk-Zellen"), wurden durch limitierende Verdünnung cloniert und auf Empfindlichkeit gegenüber variierenden Konzentrationen an Acyclovir als Maß für eine konstitutive tk-Expression untersucht. Ein besonders empfindlicher Clon wurde als TK.5 bezeichnet und ausgewählt, um die Fähigkeit von Zellen, die hohe Level an tk exprimieren, zur Aktivität von AZT und Beständigkeit gegen HIV-Infektion zu testen.
HUT78, in Masse kultivierte HUT-tk (aus Beispiel 4) und TK.5-Zellen wurden pelletiert und Polybren (2 ug/ml) bei 37ºC für 30 Minuten ausgesetzt. Die Zellen wurden dann pelletiert und mit 10&sup5; Zellen pro ml resuspendiert und HIV-I (SF2) für 1,5 Stunden bei 37ºC ausgesetzt. Die Zellen wurden dann pelletiert und in RPMI-1640-Medium, das Serum und Antibiotika enthielt, mit 10&sup5; Zellen pro ul resuspendiert. 50 ul Zellsuspension wurden dann in einzelne Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, die 1 ml Medium mit 0, 1, 5 oder 10 uM AZT enthielten, verteilt. Die infizierten Zellen wurden für 7 Tage kultiviert und die Virusreplikation wurde durch anti-p25gag-ELISA analysiert. Die Resultate sind in Fig. 4 dargestellt.

BEISPIEL 6

Konstruktion von spezifischen Thymidinkinase-Vektoren

Die Struktur verschiedener retroviraler Vektoren, die HSV-1-tk enthalten, ist in Fig. 1 dargestellt. Die funktionellen Charakteristika und die therapeutischen Anwendungen dieser Vektoren werden im Folgenden beschrieben.
SIN-tar/tk-H4Neo: Dieser Vektor verwendet den selbst-inaktivierenden Vektor, der von Yu beschrieben wird und der die HIV-tar-cis-wirkende Sequenz und das HSV-1-tk-Effektorgen enthält und der Neomycinresistenz unter Kontrolle des H4-Histon-Promotors aufweist. Dieses Plasmid verleiht Suszeptibilität für ddNs bei Zellen, die mit HIV infiziert sind.
SIN-CD4/tk (-H4Neo): Dieser Vektor ist mit dem SIN-tar/tk-H4Neo-Vektor, der oben beschrieben wurde, identisch, außer dass die cis-wirkende tar-Sequenz durch die cis-wirkende Sequenz ersetzt wird, die eine Expression des CD4-Antigens in TH-Zellen fördert. Histon- Promotor/Neomycinresistenz-Marker ist fakultativ. Dieser Vektor verleiht allen CD4&spplus;-Zellen Empfänglichkeit für ddNs. Da derzeit angenommen wird, dass das CD4-Antigen beim Eintrittsmodus für HIV wichtig ist, würde dieser Vektor auch bei der Behandlung der HIV- Infektion nützlich sein.
SIN-Mac1/tk (-H4Neo): Dieser Vektor ist SIN-tar/tk-H4Neo ähnlich, wobei die HIV-tar- cis-wirkende Sequenz durch die cis-wirkende Sequenz, die die Mac1-Antigen-Expression in Makrophagen reguliert, ersetzt ist. Histonpromotor/Neomycinresistenz-Marker ist fakultativ. Dieser Vektor verleiht allen Makrophagen, die auch als Wirtszellen für HIV dienen, Empfänglichkeit für ddNs.
SIN-tar/rA-H4Neo: Dieser Vektor verwendet die HIV-I-tar-cis-wirkende Sequenz, die das Ricin-A-Effektorgen kontrolliert, wobei neor als selektierbarer Marker verwendet wird.
SIN-fos/ppt: Dieser Vektor verwendet den selbst-inaktivierenden Vektor, der von Yu beschrieben wird, wobei die fos-oncogene cis-wirkende-Sequenz verwendet wird (R. Treisman, Cell (1986) 46: 567-74), die ein Pflanzen-Phosphotransferase-Effektorgen verwendet. Dieser Vektor sollte in Kombination mit ddN bei der Behandlung von Malignitäten des fos-Typs verwendbar sein.
SLIN-pcan/tnf: Dieser Vektor verwendet die cis-wirkende Sequenz, die Proliferation Cell Nuclear Antigen (beschrieben von J.E. Selis, Leukemia (1988) 2: 561-601) reguliert, und ein Tumor-Nekrosefaktor-Effektorgen. Obgleich PCNA in allen Zellen exprimiert wird, ist die Expression vorübergehend und tritt nur während der Zellteilung auf. Somit würden normale Zellen, die mit dem Vektor infiziert sind, keine toxischen Konzentrationen an TNF produzieren, wohingegen neoplastische hyperproliferative Zellen, die konstant in der Zellteilung sind, toxische Konzentrationen exprimieren würden.
SIN-acg/ifn: Dieser Vektor verwendet die cis-wirkende Regulationssequenz, die in Kombination mit einem β-Interferon-Effektorgen die Expression von α-Chorion-Gonadotropin liefert (S.E. Goelz, Science (1985) 228: 187-90). Dieser Vektor beruht wie der vorhergehende Vektor auf der Tatsache, dass acg in normalen Zellen nicht häufig exprimiert wird und sollte in der Krebsbehandlung nützlich sein.
SIN-IgG/Rbz: Dieser Vektor verwendet die cis-wirkende Sequenz aus IgG zusammen mit einem Ribozym-Effektorgen, das für die bc1/ab1-Spleißstelle spezifisch ist, die bei chronischer myelogener Leukämie (CML) auftritt. Da IgG in B-Zellen exprimiert wird, wird ein Zelltyp-Schutz gegen CML erhalten.
SIN-e7/Ld: Dieser Vektor verwendet die cis-wirkende Sequenz, die dem E7-Gen von humanem Papillomavirus, Typ 16 (HPV 16) entspricht, in Verbindung mit einem Leishmania donovani-Purin-2'-desoxyribonukleosidasegen. Da die Expression von HPV16-E7-Gen mit einem Karzinom der Uterin-Cervix verbunden ist (Phelps et al., Cell (1988) 53: 539-47), zerstört dieser Vektor (in Kombination mit dem Arzneimittel 6-Methylpurin-2-desoxyribosid) Zellen, in denen das E7-Gen exprimiert wird.
HIV-II/tk: Dieser Vektor stammt von HIV-II, aus dem alle internen Gene außer dem Teil des gag-Gens, der mit dem psi (Encapsidierungs-)Signal überlappt, und dem rev- Antwortelement aus dem env-Gen deletiert sind. Das HSV-1-tk-Gen wird 3' von der psi- Sequenz insertiert und wird unter der Kontrolle der HIV-II-LTR exprimiert. Auf Wunsch kann die HIV-I-tar-Sequenz die HIV-II-tar-Sequenz ersetzen. Dieser Vektor kann eingesetzt werden, um HSV-1-tk aus einer Genom-Längen-RNA zu exprimieren, indem die HIV-gag-Sequenz ATG-Codons deletiert oder verändert werden (Guild et al., supra), wobei eine Expression des HSV-1-tk-Gens aus seinem eigenen ATG-Startcodon erhalten wird. Alternativ kann man den HIV-II-env-Spleißakzeptor genau 5' vom HSV-1-tk-Gen einschließen, ohne die gag-Startcodons zu verändern, wodurch die Expression des HSV-1-tk über eine gespleißte subgenomische mRNA erreicht wird. In jedem Fall ist eine Expression von HSV-1-tk von einer Komplementierung durch tat entweder aus residentem HIV-I-Provirus oder einem superinfizierenden HIV-I- Virus abhängig. Eine Expression von tk in Kombination mit einer Verabreichung von ACV oder GCV aktiviert dann toxische Level des antiviralen Agenses; auf diese Weise wird die infizierte Zelle zerstört. Diese Konstrukte können entweder in HIV-II-Hüllen oder in HIV-ISF162- Hüllen verpackt werden, wobei die Letztgenannten zur Abzielung auf und zur Zerstörung von infizierten Makrophagen nützlich sind.
HIV-II/TCR-tk: Dieses Konstrukt enthält den T-Zellrezeptor-promotor intern, um die Expression von HSV-1-tk zu steuern, und enthält RRE aus env und das psi-Signal vom 5'-Ende des HIV-II-gag-Gens. Die 3'-LTR des Vektors ist durch Insertion der TCR-α-konstanten Region als Enhancersequenz (beschrieben von Ho et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1989) 86: 6714) gemäß dem Prinzip, das von J. Overhauser et al., J. Virol. (1985) 54: 133-34 für die Konstruktion eines auf Glucocorticoid-ansprechenden MoMLV beschrieben ist, modifiziert. Der HIV- II/TCR-tk-Vektor kann verwendet werden, um CD4&spplus;-Zellen in vivo zu infizieren und genetisch zu transformieren. Da weder der Vektor noch die T4-Zelle normalerweise tat enthalten, tritt in Abwesenheit einer Infektion mit HIV keine Initiierung der Expression von Transkripten in den viralen LTR auf. Eine Initiation der Transkription (Expression von tk) erfolgt vom inneren TRC-Promotor aus. Eine Expression von diesem Promotor wird durch die Abwesenheit der TCR-α-Enhancer, die in die proviralen LTR eingebaut sind, verstärkt. Dieser Vektor stellt eine konstitutive Expression von tk in den genetisch transformierten TH-Lymphozytenbereit, was wiederum ein antivirales Agens (z. B. ACV, ddC und dergleichen) aktiviert. Dies erlaubt die Verwendung von ACV und verwandten Verbindungen in Zellen, in denen sie normalerweise nicht wirksam wären. Es erhöht auch die Wirksamkeit von AZT bei niedrigen Konzentrationen, wie es in Fig. 4 dargestellt ist. Die Fähigkeit, eine Vielzahl antiviraler Agentien zu verwenden, sollte die Möglichkeit der Entwicklung von Arzneimittelresistenz durch HIV reduzieren. Ein analoger Vektor kann hergestellt werden, indem MLV-Virus-Komponenten für die verwendeten HIV-Sequenzen eingesetzt werden und indem eine MLV-amphotrope Verpackungszelllinie verwendet wird.

BEISPIEL 7

In-vivo-Verabreichung von Konstrukten

(A) Verpackungszelllinien für Vektoren auf HIV-Basis werden wie folgt konstruiert:
Die für gag-pol codierende Sequenz wird aus HIV-I oder HIV-II isoliert und unter Kontrolle des humanen Cytomegalovirus (CMV)-Haupt-immediate early(MIE)-Promotor in einen Expressionsvektor insertiert. Es wird eine geeignete Polyadenylierungssequenz 3' von der gag- pol-Insertion bereitgestellt, z. B. die für SV40-polyA cdierende Sequenz. Sowohl die gag-pol- wie auch die env-Sequenz muss das rev-Antwortelement (RRE), das in der env-codierenden Region vorliegt, enthalten, um einen Kernaustritt zu erreichen (M.H. Malim et al., Nature (1989) 338: 254-57).
Die env-Sequenz (einschließlich des RRE), die die ultimative Spezifität des fertiggestellten Vektors bestimmen wird, wird aus dem selektierten HIV-I-, HIV-II- oder SIV-1-Isolat erhalten und unter Kontrolle des CMV-MIE-Promotors in einen getrennten Expressionsvektor insertiert. Bei dieser Konstruktion wird eine β-Globin-polyA-Sequenz verwendet. 5' zu der env- codierenden Sequenz kann in ein Intron insertiert werden, das gegebenenfalls eine codierende Sequenz für einen Marker oder ein Reportergen (z. B. neor) enthält.
Es werden getrennte ähnliche Vektoren aufgebaut, um tat-cDNA und rev-cDNA unter der Kontrolle des SV40-early-Promotors zu insertieren. Diese Vektoren verwenden SV40- polyA-Sequenzen. Durch Abtrennen der codierenden Sequenzen für gag-pol, env, tat und rev wird die Rekombinationsmöglichkeit zur Regeneration eines funktionellen HIV-Virus auf ein Minimum beschränkt.
Die Expressionsvektoren werden dann verwendet, um eine Verpackungszelllinie durch Transfektion einer geeigneten Zelllinie, z. B. NIH-3T3, HeLa oder dergleichen, aufzubauen. Bei Transfektion mit einem retroviralen Vektor der Erfindung, z. B. HIV-II/TCR-tk, wird ein Schutzkonstrukt der Erfindung hergestellt, das zur Infektion der Population der Wirtszelle fähig ist, welche während einer bona fide-HIV-Infektion (hauptsächlich TH-Zellen) infiziert wird. Bei Verabreichung in Kombination mit geeigneten antiviralen Agentien, z. B. AZT, ACV, ddC oder dergleichen, schützt diese Behandlung infizierte Zellen vor einer infektiösen HIV-Replikation.
(B) Makrophagen/Monozyten-trophe Konstrukte werden nach dem obigen Verfahren von Teil A hergestellt, allerdings unter Verwendung des HIV-ISF162-env-Gens unter Bereitstellung von env-Protein. Bei Transfektion mit einem erfindungsgemäßen Vektor, z. B. HIV-II/tk, wird ein ablatives Konstrukt bereitgestellt, das fähig ist, Wirtszellen, die Reservoire für HIV und Infektion sind, insbesondere Makrophagen und Monozyten, zu superinfizieren und zu zerstören.

Claims

1. Polynucleotid-Konstrukt zur Behandlung einer hyperproliferativen Krankheit oder Infektion durch ein infektiöses Agens bei einer Wirtszelle, wobei die Infektion oder hyperproliferative Krankheit durch einen mit einer humanen Krankheit assoziierten trans-wirkenden Regulationsfaktor gekennzeichnet ist, der fähig ist, die Expression von Genen zu regulieren, wobei das Konstrukt umfasst:

(i) mindestens zwei Tandemkopien einer cis-wirkenden Regulationssequenz, die durch den trans-wirkenden Faktor kontrollierbar sind; und

(ii) ein Effektorgen unter der Kontrolle der cis-wirkenden Regulationssequenz, wobei das Effektorgen für ein Enzym codiert, das die Zelle für ein zusätzliches Agens empfänglich macht.

2. Polynucleotid-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das Effektorgen für eine Nucleosidkinase codiert, die fähig ist, Didesoxynucleotid-Analoge mit einer größeren Rate zu phosphorylieren als Wirtszellen-Nucleosidkinasen.

3. Polynucleotid-Konstrukt nach Anspruch 2, wobei das Effektorgen für Herpes simplex-Virus Typ 1-Thymidinkinase (HSV-1 tk) codiert.

4. Polynucleotid-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die cis-wirkende Regulationssequenz fähig ist, auf HIV- tat-Protein zu reagieren.

5. Polynucleotid-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die cis-wirkende Regulationssequenz fähig ist, eine zellspezifische Expression zu steuern.

6. Polynucleotid-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das außerdem eine Polynucleotid-Aufrechterhaltungs-Sequenz umfasst, die für die stabile Aufrechterhaltung des Konstrukts in Säugerzellen sorgt.

7. Polynucleotid-Konstrukt nach Anspruch 6, das in Form eines viralen Vektors oder eines Gentargetvektors vorliegt.

8. Polynucleotid-Konstrukt nach Anspruch 7, das ein rekombinanter viraler Vektor ist, der aus Vaccinia, HIV-1, HIV-2, Adenovirus und adenoassoziiertem Virus ausgewählt ist.

9. Polynucleotid-Konstrukt nach Anspruch 7, das ein replikationsdefekter retroviraler Vektor ist.

10. Polynucleotid-Konstrukt nach Anspruch 9, das außerdem eine gp160env-Glycoprotein-codierende Sequenz, die von HIV-1 oder HIV-2 stammt, umfasst.

11. Virales Partikel, das einen viralen Vektor, wie er in einem der Ansprüche 7 bis 10 beansprucht ist, enthält.

12. Virales Partikel nach Anspruch 11, das ein infektiöses replikationsdefektes rekombinantes Retrovirus ist.

13. Zusammensetzung zur Behandlung einer hyperproliferativen Krankheit oder Infektion durch ein infektiöses Agens bei einer Wirtszelle, wobei die Zusammensetzung ein virales Partikel nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

14. Zusammensetzung zur Behandlung einer hyperproliferativen Krankheit oder Infektion durch ein infektiöses Agens, wobei die Zusammensetzung ein Polynucleotid-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger ein Liposom umfasst.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Liposom außerdem Antikörper umfasst, die für die Wirtszellen, die behandelt werden sollen, spezifisch sind.

17. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein virales Partikel nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung.

18. Verfahren zur Behandlung einer hyperproliferativen Krankheit oder Infektion durch ein infektiöses Agens bei einer ex vivo-Wirtszelle, wobei die Infektion oder die hyperproliferative Krankheit durch einen mit einer humanen Krankheit assoziierten trans-wirkenden Regulationsfaktor gekennzeichnet ist, der fähig ist, die Expression von Genen zu regulieren, wobei das Verfahren Insertieren eines Polynucleotid- Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in die Zelle umfasst.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die ex vivo-Wirtszelle mit einem viralen Partikel nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 infiziert ist.

20. Ex vivo-Zellen, die ein Polynucleotid-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthalten.

21. Zellen nach Anspruch 20 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung.