PT92931B - Metodo para tratar uma celula hospedeira ex-vivo para desordens hiperproliferativas ou infeccoes e respectiva construcao polinucleotidica - Google Patents

Description

CHIRON CORPORATION

EPÍGRAFE: ”MéTODO PARA TRATAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA EX-VIVO PARA DESORDENS ΗIPERPROLIEERATIVAS OU

INFECCOES E RESPECTIVA CONSTRUÇÃO

POLINUCLEOTÍDICA”

MEMÓRIA...... D E S C R I T I V......A

Pedidos relacionados

Este pedido é uma continuação em parte do pedido de serie i ncorpode patente co-pendente norte-americana, numero 300.637, depositado em 23 de Janeiro de 1939, aqui rado para referência, na sua totalidade.

Campo.......do........invento

Este invento relaciona-se com eneenharia genética e com o tratamento de desordens hiperproliferativas e i nf ecções.

Antecedentes.....do invento

A terapia da infecção virai está no seu início. Uma infecção bacteriana é tipicamente tratada com agentes, tal como antibióticos, que tiram partido das diterenças de metabolismo entre o oreanismo infecc.ioso e o seu hospedeiro.

Contudo, os vírus empregara largamente as enzimas do próprio hospedeiro para efectuar a sua replicação, deixando assim poucas oportunidades para uma intervenção farmacológica. Ao utilizar elementos reguladores fortes, o vírus obtém a transcrição e tradução dos seus próprios genes, a expensas dos genes do hospedeiro.

Nos mamíferos, a infecção virai é combatida naturalmente por linfócitos T citotóxicos, os quais reconhecem as proteínas virais quando expressas na superfície das células hospedeiras, e lisara as células infectadas. A destruição das células infectadas elimina a replicação posterior do virus. Outras defesas incluem a expressão do interferão, o qual inibe a síntese de proteínas e emergência das partículas virais, e a expressão de anticorpos, que removem dos fluidos do corpo as partículas virais livres. Contudo, a indução destes mecanismos naturais requer a exposição das proteínas virais ao sistema imunológico. Muitos vírus, como’ por exemplo, o vírus herpes simplex 1 (HSV-1), exibem uma fase de dormência ou latência, durante a qual a síntese de proteínas é pequena ou inexistente. A infecção virai é essencialmente invisível para o sistema imunológico, durante tais fases.

Os retrovirus transportam a forma infecciosa do seu genoma sob a forma de uma cadeia de RNA. No decurso da infecção, o RNA do genoma é reversamente transcrito para DNA, e é então tipicamente integrado numa posição aleatória do DNA cromossômico do hospedeiro. Por vezes, a integração ocorre numa posição que trunca um gene que codifica para um receptor essencial ou para um factor de crescimento, ou que coloca ura tal gene sob o controlo de um elemento regulador forte, cis-actuante, virai, o que pode resultar na transformação da célula para um estado maligno.

Os vírus também podem ser onoogénicos devido à acção dos seus factores reguladores trans-actuantes sob as sequências reguladoras das células do hospedeiro. De facto, a oncogénese foi a característica que levou à descoberta dos primeiros retrovírus conhecidos a infectar seres humanos. Os vírus HTLV-I e HTLV-II (vírus T-linfotrópicos humanos, I e

II) foram identificados nas células do sangue de pacientes que sofriam de leucemia de células T adultas (ATL), e acredita-se que induzem uma transformação neoplásica pela acção dos seus factores trans-activantes sob as regiões promotoras do linfócito. Os vírus HTLV-I e II infectam preferencialmente linfócitos humanos e, por vezes, levam à sua transformação em células malignas. Desde então, foram descobertos dois retrovírus adicionais que infectam seres humanos: os agentes etiológicos do SIDA, HIV-I e HIV-II. Contudo, os vírus HIV-I e II aparentemente só contribuem para o cancro através dos seus efeitos imunossupressores.

Os vírus HIV-I e HIV-II aparentemente infectam células que expressam a proteína de superfície CD4. Esta proteína está presente em abundância nos timócitos e em alguns linfócitos T e, em menor quantidade, em algumas células que apresentam antieénios. A infecção por HIV é essencialmente caracterizada por sintomas parecidos com os da gripe, a que se segue um período de latência longo, que pode

A durar 5 a 10 anos, Ao entrar na sua fase activa, a infecção por HIV leva a um declínio rápido da população ^:,auxiliar” de linfócitos T (Tj-p’ g^{ue é} geralmente reconhecido como um declínio na relação entre os linfócitos T T4⁺/Tg⁺ (CD4⁺/CDg⁺). 0 paciente sofre tipicamente de forte diarreia e, se o sistema nervoso central é afectado, exibe uma forma de demência. A deplecção das células T afecta o sistema imunológico, e o paciente sucumbe a uma infecção oportunista, por exemplo, P.carini i ou citomegalovírus, ou ao sarcoma de Kaposi. 0 sistema imunológico natural fica completamente incapaz de combater a infecção por HIV, apesar da presença típica, durante a latência, de títulos séricos de anticorpos, aparentemente neutralizantes.

A terapia corrente para a infecção por HIV per se é limitada principalmente à administração de A2T (3’-azido3’-desoxitimidina) para inibir a progressão virai, embora

M.S.Hirsh, J. I nfect.Dis. (1988) 157:427-31, tenha descrito uma inibição sinergística do HIV por A2T com GM-CSF (factor estimulante de colónias de granulócitos-monócitos) ou interferão alfa, 0 A2T é representativo de uma classe de agentes anti-virais didesoxinucleosídicos (ddN). Estes agentes tiram partido da capacidade das DNA-polimerases do hospedeiro para rejeitar um ddN, e da tendência das polimera.ses do vírus para aceitar ddNs e incorporá-los em po1inucleótidos replicantes. No decurso da incorporação, um ddN pára a polimerização, dado que lhe falta o grupo hidroxilo 3’ necessário à próxima ligação fosfodiéster. Os ddNs são tipicamente inactivos na sua forma administrada e dependera da fosforilação por enzimas da célula hospedeira para conversão para o ddNTP trifosfato activo.

H.Mitsuya et al , Nature (198?) 325:773-78, descreveu a organização do genoma do HIV, e sugeriu várias estratégias para o desenvolvimento de terapias para ó HIV. As terapias especuladas incluíam a administração de RNA ”anti-senso” (na forma de cadeias livres ou codificado por um ”anti-vírus”) para inibir a transcrição virai, a administração de inibidores da glicosilação, a administração de interferões para inibir a emergência de partículas virais, e a administração de análogos de didesoxinucleósidos para inibir a replicação virai. Os fármacos análogos de didesoxinucleósidos, úteis na terapia do HIV (e.g., A2T, ddC, etc), dependem das enzimas das células hospedeiras para activação através da fosforilação. D.Baltimore, Nature (1988) 335:395-96, sugeriu que o tratamento do SIDA poderia ser efectuado através da remoção de células da medula óssea de um paciente infectado, e transfecção de células hematopoiéticas do extracto de medula óssea com DNA, ou vírus codificando para um RNA. ou uma proteína capaz de interferir com o crescimento do HIV. 0 DNA poderia codificar para um RNA que se poderia ligar às proteínas reguladoras do HIV, a um RNA anti-senso, a polipéptidos virais mutantes, ou a uma proteína virai de ligação ao DNA à qual falte a função reguladora. As células transfectadas seriara então reintroduzidas no paciente, juntamente com a. caracterí stica vantajosa seleccionada, para assegurar a disseminação.

A.I.Dayton et al, Cel1 (1986) 44:941-47, expôs que o gene tat do HIV é essencial para a síntese e replicação da proteína virai. Dayton sugeriu que se poderia inibir o HIV interferindo com o gene tat, sem afectar de outra forma a célula hospedeira. Μ. A. Muesing et al. , Cel1 (1987) 48.:691 -701, descreveu que a proteína tat (em vez de somente o mRNA do tat) é essencial para a transactivação. Muesing também descobriu que uma fusão tat-art (tendo 114 aminoácidos fundidos à terminação C do tat por delecção de 7 nucleôtidos) mantinha por completo a actividade da tat. A.D.Frankel et al , Science ( 1988 ) 240:70 - 73, expôs que a tat forma dímeros ligados por metal in vitro, e sugeriu que possíveis tratamentos para o SIDA podem envolver a quelação de iões metálicos ou competição com a tat para ligação aos monómeros. A.D.Frankel et al, Proc.NatAcad.Sei.U5A (1988)

85:6297-300 descreveu a síntese de um fragmento da tat do

HIV que retém as propriedades de ligação a metais da tat. 0 fragmento formava heterodímeros com tat nativa, e podia deslocar a tat em homodímeros. Frankel sugeriu a utilização do fragmento da tat para inibir a dimerização da tat, usando lipossomas para ceder os peptidos ou um gene do fragmento da tat. A sequência de aminoácidos descrita para a tat de um

HIV-1 isolado é

Met	Glu	Pro	Val	Asp	Pro	Arg	Leu	Glu	Pro
Trp	Lys	His	Pro	Gly	Ser	Gin	Pro	Lys	Thr
Ala	Cys	Thr	Asn	Cys	Tyr	Cys	Lys	Lys	Cys
Cys	Phe	His	Cys	Gin	Val	Cys	Phe	Ile	Thr
Lys	Ala	Leu	Gly	Ile	Ser	Tyr	Gly	Arg	Lys
Lys	Arg	Arg	Gin	Arg	Arg	Arg	Pro	Pro	Gin
Gly	Ser	Gin	Thr	His	Gin	Val	Ser	Leu	Ser
Lys	Gin	Pro	Thr	Ser	Gin	Ser	Arg	Gly	Asp
Pro	Thr	Gly	Pro	Lys	Glu.

Foi encontrada uma proteína similar no HIV-2.

A sequência tar que é cis-actuante> e é regulada pela tat do HIV, encontra-se aproximadamente entre os nucleótidos +19 a +82 do genoma do HIV-1. A sequência contém duas sequências repetitivas alongadas e invertidas e é previsível que forme estruturas em ”stem loop” (Muessing, supra) 0 HIV-2 exibe uma região similar.

Haseltine, na patente norte-americana número 4.738.922, descreveu as regiões promotoras da LTR do HTLV I e II, e a sua utilização com activadores trans (luk) em vectores para expressão amplificada de proteínas heterólogas, exemplificadas pela cloranfenicol aceti1transferase (CAT). A LTR do HTLV-I promove, aparentemente, a expressão constitutiva, que é posteriormente amplificada na presença do luk do HTLV-I, enquanto que a LTR do HTLV-II requer, aparentemente, o luk do HTLV-II para ser expressa. Haseltine mencionou que factores virais trans-actuantes podem alterar a expressão dos genes da célula hospedeira ou de genes virais, e Haseltine formulou, ainda, o conceito da inserção de um vector, possuindo a LTR do HTLV fundida a um gene heterólogo, numa célula possuindo o genoma do HTLV, o que resulta na trans-activação do gene heterólogo e na sobre-expressão do seu produto. Haseltine descreveu a utilização da LTR do HTLV, na ausência de luk, para criar vacinas de cápside vazia, e sugeriu a utilização da LTR do HTLV para expressão de antigénios, com a finalidade de destruir a célula através de anticorpos monoclonais ou policlonais.

Ε. A. Dzierzak et al, em Nature (1988) 331: 357 ί

-41, descreveu um método prototípico de terapia de genes em ratos. Dzierzak removeu células da medula óssea de ratos, expôs os ratos a radiação letal, e introduziu genes da β-globina (BG) humana na medula removida usando um vector retroviral, pSV(X)neo. 0 gene da BG foi inserido para leitura na direcção oposta à da transcrição proviral, e foram preparadas construções com e sem as regiões enhancer” da

LTR virai. Os ratos foram, então, reconstituídos com a medula óssea recombinante, contendo ”stem cells” hematopoiéticas. Dzierzak descobriu que a β-globina humana era expressa pelos ratos resultantes da recombinaçao, e que a expressão só se encontrava em células da linhagem eritróide. J-K Yee et al, Proc.Nat.Acad.Sei,USA (1987) 84: 5197-201, descreveram a construção de vectores retrovirais que codificam para a HPRT, sob o controlo do promotor da metalot ioni na. ou do promotor do citomegalovírus humano (hCMV) . Yee descobriu que a expressão do HPRT duplicava quando eram delectadas sequências reguladoras da transcrição da região U3 da LTR do retroví rus.

S.-F. Yu et al., Proc.Nat.Acad.Sei.USA (1986)

83:3194-98, descreveu a construção de vectores de transferência auto-inactivantes (SIN”’» do gene retroviral. Os vectores SIN são criados pela delecção das sequências promotora e enhancer” da região U3 da LTR 3’ . Uma região funcional U3 na LTR 5’ permite a expressão cio genoma virai recombinante em linhas celulares de encapsulação adequadas. Contudo, durante a expressão do seu DNA genómico e transcrição reversa para cDNA, a região U3 da LTR 5’ do provírus origi8 nal é delectada, e é substituída pela região U3 da LTR 3’ . Assim) quando o vector SIN é integrado, a região U3 não funcional da LTR 3’ substitui a região U3 da LTR 5’ , tornando o vírus incapaz de expressar completamente a transcrição genómica. Yu construiu um vírus recombinante usando as regiões LTR do Mo-MuLV e a sequência de encapsulação (psi), e inseriu um gene de resistência à neomicina (Neo) sob o controlo de um promotor da metalotionina (vírus MT-N), ou de um promotor do tk do HSV (vírus TK-N), ou de um promotor do

SV40 (vírus SV-N), como marcador seleccionável. Yu inseriu também um gene c -fos humano, sob o controlo de um promotor da metalotionina humana (hMT), no TK-N, e demonstrou existir uma transcrição indutível do c-fos em células NIH 3T3, após injecção do vírus recombinante.

S. L. Mansour et al., Nature (1988) 335:348-52, descreveu um método para seleccionar células após recorabinação homóloga com um vector linear de transfecção. Foi preparado um vector linear possuindo uma região homóloga de um gene alvo, um gene de resistência à neomicina inserido num exon da região homóloga, e um gene tk do HSV fora da região homóloga. Após recombinação homóloga específica, a célula transformada exibe um fenotipo negativo para a região alvo e para a tk do HSV, e positivo para a resistência à neomicina (a recombinação homóloga na posição alvo inactiva o gene da posição alvo, e não proporciona a incorporação do gene tk). O fenotipo distingue as células possuindo a recombinação homóloga das resultantes da integração não-específica, dado que estas últimas células exibirão um fenotipo positivo para o gene alvo, para a tk do HSV, e para a resistência à neomicina. A resistência à neomicina é testada cultivando células em neomicina, enquanto que a característica tk⁺ é testada cultivando células em ganciclovir (o qual é convertido num produto tóxico pela tk).

R.D.Palmiter et al , ÇelI (1987) 80:435-43, descreveu a preparação de um rato transgénico possuindo uma construção de DNA que codifica para a cadeia da difteria A, sob o controlo do promotor da elastase. 0 promotor da elastase é activo apenas em células dos ácinos do pâncreas, e promove a expressão da elastase. As construções de DNA foram microinjectadas em óvulos de rato, e foram examinados os descendentes resultantes. Os ratos transgénicos, em que a construção se tornou activa, não desenvolveram um tecido pancreático normal.

M.E.Selsted et al . , JCliη, Invest. (1985 ) 76:1436-39, descreveu a sequência primária de aminoacidos para três polipéptidos efectores citotóxicos humanos aparentados, denominados péptidos antimicrobianos de neutrófilos (HNPs). Os três HNPs possuem 29-30 resíduos de aminoácidos e exibem actividade contra bactérias, fungos, e vírus herpes simplex (T.Gantz et al,, JClinInvest (1985) 76:1427-35).

T.L.Wasmoen et al , J.Biol.Chem. (1988 ) 263: 12559-63, descreveu a sequência primária de aminoácidos da proteína básica pricipal dos grânulos de eosinófilo humano (MBP). A MBP é um polipéptido efector possuindo 117 resíduos de aminoácidos, um pl de 10,9, e exibe actividade citotóxica contra células e parasitas de mamíferos.

Μ. A. Adam et al , JVirol (1988) 62.:3802-05, descreveu vectores retrovirais que exibem uma encapsulação eficiente de RNA, possuindo uma sequência psi⁺. R.D.Cone et al, , Mol Ce 11 Biol , (198?) 7:887-97, descreveu a construção de vectores retrovirais (pSVX) incluindo o gene da β-globina humana, e a utilização dos vectores recombinantes para obter a expressão da β-globina humana numa linha celular de eritroleucemia murina. A.D.Miller et al,, Mol.Cel1 Biol. (1986)

6:2895-902, descreveu linhas celulares úteis para a encapsulação de vectores retrovirais de replicação defectiva.

Guild et al. , J.Vi ro1. (1988) 62:3795-801, descreveu vectores retrovirais que utilizam as LTRs do Mo-MuLV e a sequência psi (de encapsulação), úteis para transferir genes completos para células de mamíferos. Guild empregou promotores da β-actina e de histonas (que são activos essencialmente em todas as células) para obter a transcrição do neo¹ (como um marcador seleccionàvel ). A expressão do neo^f foi demonstrada in vivo, após terem sido usadas células de medula óssea, infectadas por vírus, para reconstituir ratos irradiados letalmente.

A.D.Friedman et al. , Nature (1988 ) 335:452-54 >

descreveu a transfecção de células tk de rato corn plasmídeos que expressam o tk do HSV-1, e com o VP16 do HSV-1. 0

VP16 age como um activador trans na transcrição dos genes precoces imediatos do vírus herpes simplex (HSV-1). No plasmídeo VP16, o promotor foi substituído pelo promotor do MoMSV, e foi delectada a extremidade carboxilo do VP16. O plasmideo resultante codifica para uma proteina mutante do ί

VP16, que compete cora o VP15 de tipo selvagem para a ligação ao DNA. As células transfectadas exibiram resistência à replicação do HSV-1 após uma infecção posterior. Friedman sugeriu que se poderia induzir a resistência ao HIV através da transfecção com um mutante dominante da proteína transactivadora do HIV (tat).

J. Sodroski et al , 5cience (1985) 229:74-77, descreveu a localização do gene tat do HIV. J. Sodroski et al., Science (1985) 227:171-73, descreveu a construção de um plasmideo possuindo o gene CAT sob o controlo da LTR do HIV. A LTR do HIV contém o gene da região trans-activante (tar), que é induzido pelo tat. Sodroski descobriu que os factores trans-activantes induziriam a transcrição de genes, sob o controlo da LTR do HIV. B.M.Peterlin et_al. ,

Proc . Nat. Acad . Sei USA (1985) 83.:9734-38, descreveu plasmídeos possuindo o gene tar do HIV, e os efeitos da orientação e posicionamento do tar sobre a trans-activação pelo tat. Peterlin descobriu que o tar proporciona melhores resultados quando se encontra a jusante de um promotor e de um enhancer”. A activação com tat aumentou a transcrição para

RNA. C.J.Nabel et al., Science (1988) 239:1299-302, descreveu que um plasmideo de fusão tat-III-CAT do HIV poderia ser activado pelo HSV e por factores trans-actuantes do adenovírus.

B. K. Fe 1 ber et_______a.L·.., Science (1 988 ) 239 : 184-87 , descreveu um ensaio para o HIV, usando linhas de células que expressam o CD4 transfectadas com o gene da cloranfenicol acetiltransferase (CAT) sob controlo da LTR do HIV. Após

infecção com o HIV, as linhas de células transfectadas expressaram o CAT proporcionalmente à quantidade de vírus presente. Felber sugeriu a utilização do ensaio como um meio para a avaliação de possíveis fármacos anti-HIV quanto à sua capacidade para inibir o desenvolvimento virai, e para identificar fármacos anti-tat.

Descrição do invento

Um aspecto do invento é um método para tratar células hospedeiras de uma infecção ou desordem hiperproliferativa, método esse caracterizado pela expressão de factores reguladores, capazes de regular a transcrição do DNA, através da inserção, nas células, de uma construção polinucleotídica possuindo uma região de regulação, a qual é activada pelo factor de regulação, e um gene efector sob controlo da região de regulação, que torna a dita célula susceptível a protecção ou destruição. 0 produto de expressão do gene pode destruir directamente as células, como no caso das citotoxinas, ou pode aumentar a susceptibi1 idade da célula à destruição por agentes farmacológicos. Alternativamente, o produto de expressão do gene pode inibir directamente o agente maligno ou infeccioso, e.g., por competição por locais de ligação, por ligação sob a forma de RNA anti-senso, por expressão de anticorpos ou inibidores de proteinas, pela expressão de ribozimas específicos de sequência, pela expressão de enzimas que activam compostos anti-virais, e semelhantes. Por exemplo, a região de activação pode ser homóloga da região tar do HIV, e o gene efector pode codifi13 car para a ricina A ou para a timidina quinase do HSV-1. No decurso da infecção com o HIV, a proteína tat do HIV activa a região tar, e induz a transcrição e expressão da ricina A, o que resulta na morte da célula, ou a transcrição e expressão do tk do HSV-1, o que resulta em citotoxicidade quando a célula é tratada com agentes didesoxinucleosídicos, como o ganciclovir.

Outro aspecto do invento é uma construção de DNA que realiza o método do invento.

Outro aspecto do invento é uma composição útil para inserir as construções de DNA do invento nas células hospedeiras.

Outro aspecto do invento é um método para proteger de infecções virais populações específicas de células de um organismo, através da inserção nas células da população de uma construção po 1 inucleot í dica compreendendo uma. sequência cis-actuante, a qual promove a expressão de um gene vizinho apenas na presença de factores trans-actuantes que se encontram de forma substancial apenas na população seleccionada de células; e, sob controlo da sequência cis-actuante, um gene efector que protege a célula ou a torna susceptível de protecção. De preferência, a sequência cis-actuante é derivada do hospedeiro. 0 gene efector é, de preferência, codi ficante de uma nucleósido quinase, tal como a timidina quinase do HSV-1.

Outro aspecto do invento é uma construção polinucleotídica útil para proteger de infecções populações seleccionadas de células, construção essa que compreende uma sequência cis-actuante, que promove a expressão de um gene vizinho apenas na presença de factores trans-actuantes que se encontram de forma substancial apenas na população seleccionada de células; e, sob controlo da sequência cis-actuante, um gene efector que protege a célula ou a torna susceptível de protecção. De preferência, a sequência cis-actuante é derivada do hospedeiro. 0 gene efector é, de preferência, codificante de uma nucleósido quinase, tal como a timidina quinase do HSV-1 .

Breve descrição das figuras

A Figura 1 é cleotídica genérica do

A Figura 2 é

A Figura 3 um diagrama de invento.

um diagrama do é um diagrama uma construção polinuvector pTBl. do vector pMXSVNeo-tar/tk.

A Figura 4 ilustra graficamente os resultados da experiência descrita no Exemplo 5.

A Figura 5 ilustra graficamente os resultados da experiência descrita no Exemplo 4.

Formas de realização do invento

A · Dst inições

O termo tratamento”, tal como aqui é usado, refere-se à redução ou alivio de sintomas num paciente, ao evitar que os ditos sintomas progridam ou se agravem, à inibição ou eliminação do agente causador, ou ao evitar a infecção ou desordem num paciente que não a apresenta. Assim, por exemplo, o tratamento de um paciente com cancro pode consistir na redução do tamanho do tumor, na eliminação das células malignas, em evitar a metastase, ou em evitar a reincidência num paciente que foi curado. 0 tratamento da infecção inclui a destruição do agente infeccioso, a inibição ou interferência com o seu desenvolvimento ou maturação, a neutralização dos seus efeitos patológicos, ou outros.

termo infecção”, tal como aqui é usado, inclui a infecção por vírus, bactérias, fungos, e outros parasitas, tal como a Leishmania e os parasitas da malária. No âmbito deste invento, o termo agente infeccioso” inclui vírus como o HIV-I, HIV-II, HTLV-Ij HTLV-II, vírus herpes simplex (HSV), citomegalovírus (CMV), vírus de Epstein-Barr (EBV), papilomavírus do homem (HPV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da poliomielite, e semelhantes; bactérias como a B,pertussis, e os agentes causadores do tétano, difteria, cólera e semelhantes; micobactérias como a M.tuberculosis e o agente causador da lepra; leveduras e fungos como a Candida albicans e o P .___c a r i n i i; parasitas como o Plasmodium da malária, Giardia, e semelhantes.

Certos métodos e construções do invento são mais adequados para agentes infecciosos intracelulares, tais como vírus, o agente da malária e semelhantes, enquanto que outros métodos e construções são aplicáveis a infecções extracelulares.

termo desordem hiperproliferativa” refere-se a desordens caracterizadas pela proliferação anormal ou pato16 'ί

lógica de células, por exemplo, cancro, psoríase, hiperplasia e semelhantes.

termo sequência reguladora cis-actuante” refere-se a uma sequência polinucleotídica capaz de responder a um factor trans-actuante, e de intensificar a transcrição de genes posicionados em cis. As sequências reguladoras cis-actuantes mais apropriadas podem ser derivadas do agente infeccioso que se destinam a combater. Por exemplo, a região tar da LTR do HIV-1 é uma sequência reguladora cis-actuante adequada para tratamento do HIV-1. Quando é desejável a expressão específica de um tipo celular, podem ser empregues sequências cis-actuantes como, por exemplo, e para células T, o antigénio CD2 (Genbank HUMATCCD2), IL-2 (Genbank HUMIL2A), receptor da IL-2 (Genbank HUMIL2R1 ), antigénio CD1 (Genbank HUMHTA1), antigénio CD3 (Genbank HUMATCT31), antigénio CD4 (Genbank HUMATCT4), protease de células T (Genbank MUSSPTCS); para células B, IgG (Genbank HUMIGCA1), antigénio MHC-1 (Genbank HUMMHA2); para macrofagos, antigénio Mac-1 (Genbank HUMLAP ), IL-1 (.Genbank HUMIL1P)» e semelhantes. A sequência reguladora cis-actuante pode ser usada em múltiplas cópias em série, de modo a aumentar a sua competição para o local regulador cis-actuante endógeno. Podem obter-se sequências apropriadas para o tratamento de desordens hiperpro1iferativas (especialmente cancros) a partir dos locais cie ligação de oncoprotemas conhecidas, ou por identificação de uma proteína conhecida cuja expressão seja alterada por um oncogene. A sequência reguladora cis-actuante deve ser capaz de proporcionar uma expressão do gene efector que seja suficiente para conferir à célula a susceptibilidade à protecção ou destruição, quando activada pelo factor trans-actuante, não permitindo uma expressão constitutiva substancial na ausência do factor trans-actuante. A escolha da sequência cis-actuante vai depender do factor trans-actuante associado à infecção ou desordem a tratar, e do gene efector seleccionado. Por exemplo, a LTR do HIV contém a região tar, que é altamente selectiva para o tat do HIV, e também uma região activada pelo factor endógeno nuclear NF-j<B (a LTR tem regiões de ligação em série ao NF-^B). Apesar da sequência tar suprimir fortemente a expressão na ausência de tat (veja-se, por exemplo, Muesing, Peterlin, supra) , os elementos cis-actuantes a montante da sequência tar influenciam o grau de expressão constitutiva (escapamento”) que ocorre na ausência de tat. 0 grau de escapamento na ausência de tat pode ser controlado por delecção ou substituição dos elementos cis-actuantes (e.g., locais de ligação do NF-^B) dentro da LTR do HIV-I. Para utilizar a sequência tar com genes efectores como a ricina A (que é eficaz a concentrações intracelulares muito baixas), remover-se-iam os locais de ligação ao NF-^B, usando endonucleases de restrição, antes de inserir o vector nas células hospedeiras. Por contraste, se o gene efector codificar para um produto que não é particularmente toxico para a célula hospedeira (por exemplo, a proteína rpt-1 que se encontra em linfócitos T ern repouso', veja-se Patarca, supra) , mas que requer uma concentração superior para obter a inibição virai, é necessário empregar uma sequência cis-actuante que

proporcione uma elevada expressão após a indução, mas que também permita alguma expressão constitutiva em baixo grau.

termo susceptível de protecção ou destruição” significa que, após infecção ou por ocasião de uma desordem hiperproliferativa, a presença do gene efector na célula hospedeira torna a célula (a) capaz de inibir o agente infeccioso ou o estado hiperproliferativo, ou (b) o gene efector destrói a célula hospedeira, ou torna-a sensível a um agente tóxico exógeno adicional. 0 agente tóxico” adicional não inclui o sistema imunológico do hospedeiro ou os anticorpos, uma vez que a imunidade é frequentemente suprimida ou ineficaz em casos de infecção ou doença hiperproliferativa. A inibição da infecção pode ser conseguida através da redução dos níveis intracelulares de nutrientes ou metabolitos de que o agente infeccioso necessita (e.g., nucleótidos purínicos ou pirimidinicos, carbohidratos, fosfatos, etc), enzimas de regulação negativa do hospedeiro requeridos pelo agente infeccioso (por exemplo, enzimas ribossomais, proteases endógenas, enzimas de enrolamento das proteínas, proteínas de transporte e semelhantes), factores de regulação negativa da célula hospedeira usados pelo agente infeccioso (por exemplo, o factor nuclear NF-^B, que se encontra em linfocitos activaclos que regulanvpositivamente a transcrição do HIV-1), factores de regulação positiva, virais ou da célula hospedeira, que suprimem a expressão do gene virai através do bloqueio da célula hospedeira numa fase estática do ciclo mitòtico (no caso de certos vírus e desordens hiperprol i f erat i vas ) , e semelhantes.

A inibição também pode ser conseguida por interferência com o ciclo de vida do agente infeccioso, por exemplo, pela expressão de factores que se ligam a importantes factores reguladores do agente infeccioso e causam a sua inibição ou desactivação, pela expressão de factores reguladores do hospedeiro ou agente infeccioso que regulam negativamente a expressão do agente (por exemplo, os vírus que têm uma fase latente devem ter factores que evitem a expressão constitutiva, devida às suas fortes regiões de regulação), pela expressão de mutantes defectivos não infecciosos das proteínas de revestimento, do envólucro ou da cápside, do agente infeccioso, pela codificação para cópias múltiplas da sequência de ligação dos polinucleotideos (de tal forma que as sequências competem pela ligação ao agente de regulação do agente infeccioso, limitando assim a transcrição do agente), pela expressão de factores que atacam as proteínas, lípidos ou carbohidratos do agente infeccioso (tais como péptidos antimicrobianos dos neutrófilos, proteína básica principal do grânulo do eosinófilo, e semelhantes), ou que inibem ou evitam o processamento pelas enzimas do agente infeccioso. Alternativamente, podem codificar-se citoquinas que podem interferir com os agentes infecciosos, ou inibi-los, ou que podem ser citotóxicas, por exemplo, interferões , inter1euquinas, factores de necrose do tumor, factores de estimulação de colónias, factores de transformação do crescimento (alfa e beta), factores de crescimento epidérmico, e semelhantes. A expressão da citoquina também é útil no tratamento de desordens hiperproliferativas. Por exemplo, as citoquinas podem inibir ou destruir tumores directamente, ou podem induzir a diferenciação até um estado final (não neoplásico). As desordens hiperproliferativas também podem ser tratadas usando qualquer um dos métodos apropriados atrás descritos. Por exemplo, a inibição de funções da célula (tais como o ciclo mitótico, a expressão de proteínas, e semelhantes) pode inibir a proliferação.

As técnicas citotóxicas podem envolver a expressão directa de uma toxina celular, tal como a ricina A, a toxina de difteria, e semelhantes, ou podem empregar um dos métodos atras descritos num grau que resulte na morte da célula (por exemplo, a inibição completa da respiração celular). Alternativamente, pode conseguir-se a expressão de uma enzima, ou proteína, que torna a célula susceptível a um agente adicional', por exemplo, a expressão aumentada de uma nucleósido quinase pode tornar a célula hospedeira susceptível à acção do ganciclovir ou aciclovir, ou pode aumentar a potência de um agente anti-virai como ο AZT. Os análogos dos didesoxinucleósidos (ddNs) como o AZT, a didesoxicitidina, o aciclovir, o ganciclovir, e semelhantes, são relativamente não-tóxicos na sua forma não-fosforilada. Contudo, enzimas virais específicos ou intracelulares podem converter os ddNs nos trifosfatos correspondentes, altura em que o agente age como um agente de terminação de cadeia durante a transcrição ou replicação. A utilidade dos ddNs e baseada no facto de que (1) as polimerases virais exibem uma afinidade para as ddNs superior às das polimerases de mamíferos, e (2) algumas nucleósido quinases virais exibem uma maior taxa de fosfori 21 lação de ddNs do que as quinases de mamíferos. Assim, as enzimas virais (e, consequentemente, os genes virais) são mais afectados pela terminação da cadeia do que os genes e as enzimas de mamíferos. A timidina quinase do HSV-1 (tk do

HSV-1) é mais eficiente na conversão de ddNs nos trifosfatos correspondentes, tornando assim mais susceptíveis aos ddNs as células que possuem o tk do HSV-1 activo.

termo gene efector” refere-se a uma sequência de polinucleótidos, a qual, quando expressa (devido à acção do factor trans-actuante sobre a sequência reguladora cis-actuante) torna a célula hospedeira susceptível a protecção ou destruição, tal como atrás descrito. As proteínas citotóxicas dentro do âmbito do invento não incluem proteínas virais possivelmente tóxicas sob controlo da sua região virai de regulação normal. 0 gene efector deve ser um gene que não se.ja naturalmente regulado pela região de regulação cis-actuante empregue. Uma classe de genes efectores adequados inclui genes que codificam para uma nucleosido quinase capaz de fosforilar análogos dos didesoxinucleósidos a uma taxa superior às nucleosido quinases das células hospedeiras, por exemplo, a. timidina quinase do HSV-1, a guanina quinase, uma nucleosido fosfotransferase vegetal, a purina 2’ desoxiribonucleosidase de Leishmania.....dono van i , a. guanina fosforibosiItransferase da L. donovani, e outras enzimas adequadas, envolvidas no metabolismo nucleosídico, e capazes de inactivar agentes nucleosídicos quimioterápicos ou antivirais. Outra classe de agentes efectores inclui genes funcionais a nível do mRNA, tal como o mRNA anti-senso, e ribo22 !

zimas (veja-se Walbot et al. , Nature (1988) 334:196-97).

Outra classe de genes efectores inclui genes que codificam para citoquinas úteis em desordens antivirais ou anti-hiperproliferativas, como o factor de necrose do tumor, interferão alfa, interferão beta, interferão gama, factor beta de transformação do crescimento, péptidos inibidores, e interleuquina-2. Outros genes efectores no âmbito deste invento incluem inibidores de proteases, que podem inibir o processamento das proteínas essenciais, e inibidores de glicosilação, fosforilação, e miristilação de proteínas virais. A RNAase é também adequada. Pode, alternativamente, ”titular-se” o factor trans-actuante fornecendo diversas sequências cis-actuantes em conjunção com uma sequência de terminação forte.

No contexto da expressão específica de célula, o gene efector tera de conferir à célula. susceptibi 1 idade à protecção, mas não à destruição. Assim, evita-se a delecçao de uma classe celular inteira, como a classe das células Tj_j. Esta técnica pode ser usada para aumentar a razão terapêutica de certos agentes antivirais e quimioterápicos, como o AZT. Por exemplo, o AZT inibe a replicação do HIV, mas é relativamente tóxico para as células da medula óssea. Os linfócitos T são comumente infectados na infecção por HIV, e são mais tolerantes ao AZT. Por transfecção de um aspirado de medula óssea com uma construção polinucleotidica que expresse, por exemplo, o tk do HSV-1 apenas em linfócitos T (por exemplo, sob o controlo do promotor do antigenio CD4 ) , reintrodução das células no paciente, e administração de uma ?

quantidade de AZT inferior à dosagem habitual, pode aumentar-se a concentração intracelular de AZT fosforilado nos linfócitos T, tolerantes, sem aumentar os niveis de AZT fosforilado nas ”stem cells”, sensíveis (na medula óssea).

As construções polinucleotídicas do invento podem, igualmente, ser concebidas para o tratamento de desordens autoimunes, através do uso de uma sequência cis-actuante que responda a um factor trans-actuante, característico das células imunes específicas que participam na desordem auto-imune particular em tratamento, e de um gene efector que suprima a actividade dessas células.

O termo ”mRNA anti-senso” refere-se a um mRNA que e complementar de, e capaz de formar complexos de RNA de cadeia dupla com, uma cadeia com senso” de mRNA. A hibridização do mRNA inibe a sua tradução para proteínas', assim, o mRNA anti-senso actua como um inibidor muito específico da síntese proteica. 0 mRNA anti-senso pode ser protector, se complementa, por exemplo, o mRNA de uma proteina virai ou o mRNA transcrito a partir de um oncogene activo. 0 mRNA anti-senso pode ser destrutivo, por exemplo, quando complementa uma enzima essencial da célula hospedeira, como uma enzima intracelular sem vias metabólicas alternativas eficazes, ou quando torna a célula hospedeira susceptível a agentes que inibem as vias alternativas metabólicas. Ver, também, G.Zon et___al., EP 288.163, que descreveu o uso de oligodesoxinucleótidos para a inibição da replicação retroviral e da proliferação oncogéníca.

termo ribozima” refere-se a um polinucleótido invento incluem catalítico de RNA, capaz de catalizar a clivagem do RNA ao nivel de uma sequência específica. As ribozimas são úteis para atacar moléculas de mRNA particulares. Por exemplo, na leucemia mielôide crónica, uma translocação cromossómica envolvendo os genes ber e abl (cromossoma Filadélfia) resulta na expressão de uma proteína de fusão bcr-abl, que se acredita resultar numa função anormal da oncoproteína abl. Uma vez que a fusão entre os genes ber e abl ocorre em pontos situados entre um de dois introns, o produto transcrito, após ”splicing” (excisão-reparação) a partir da fusão ber-abl, contem apenas duas sequências possíveis ao nível da junção de excisão-reparação entre os exons do ber e do abl. Já que o mRNA de bcl-abl ocorrerá apenas em células linfóides que tenham sofrido esta translocação cromossómica oncogénica, pode ser preparada uma ribozima específica para qualquer uma de duas junções de excisão-reparação do mRNA de fusão bcr-abl, que poderá, assim, inibir a expressão da oncoproteína correspondente.

termo ”vector”, tal como aqui é usado, refere-se a qualquer construção polinucleotidica com a capacidade de codificar para a sequência reguladora cis-actuante e para os eene<s) efector(es) seleccionados, e capaz, igualmente, de transferir estes genes para células alvo adequadas. Os vectores podem ser lineares ou circulares, de cadeia simples ou dupla. Os vectores podem compreender DNA, RNA, híbridos DNA/RNA, e polinucleótidos de DNA e/ou RNA possuindo bases quimicamente modificadas. Vectores adequados no âmbito deste segmentos de DNA linear de cadeia dupla, plasmídeos, vírus recombinantes(e.g., vacinas recombinantes, adenovírus, vírus adeno-associados, e semelhantes), vectores retrovirais de replicação defectiva (incluindo os das espécies humana, símia, murina, e semelhantes), derivados não-patogénicos de vectores retrovirais de competência replicativa adequados, e semelhantes. Os vectores retrovirais de replicação defectiva são presentemente preferidos.

B· Método geral

A preparação das construções polinucleotídicas é conduzida usando métodos geralmente conhecidos da técnica.

Uma vez que um agente infeccioso, ou uma desordem hiperproliferativa tenham sido seleccionados para tratamento, o primeiro passo é a identificação de um factor trans-actuante associado, uma sequência cis-actuante apropriada, e um gene ef ector.

São já conhecidos, e caracterizados, alguns factores trans-actuantes virais. Outros factores trans-actuantes virais podem ser identificados através de análise por delecção do - genoma virai clonado. Por exemplo, pode ser clonado e sequenciado um novo vírus usando técnicas padronizadas, e podem identificar-se os moldes abertos de leitura. De seguida, são preparados mutantes de delecção usando enzimas de restrição, e os vírus mutantes são ensaiados quanto à sua competência transcriccional em células hospedeiras adequadas. Aos mutantes que exibem uma transcrição muito baixa de mRNA, falta provavelmente um gene codificando para um factor trans-actuante, ou para uma sequência reguladora cis26

-actuante. Pode determinar-se, geralmente, se a delecção afecta o factor trans-actuante ou a sequência cis-actuante, através do exame da posição e conteúdo da sequência genómica (e.g., as sequências reguladoras cis-actuantes virais são, geralmente, encontradas a montante dos moldes abertos de leitura). A sequência da região cis-actuante virai pode ser comparada, sob o ponto de vista da sua homologia, com regiões cis-actuantes conhecidas. Uma vez que sequências cis-actuantes homólogas podem reagir com o mesmo factor trans-actuante, podem desta forma ser identificados factores trans-actuantes endógenos adequados. Alternativamente, as proteínas virais podem ser recombinantemente expressas por hospedeiros apropriados (e.g., bactérias, leveduras, culturas de células de mamífero), e os extractos purificados podem ser marcados e avaliados quanto à sua ligação aõ património genómico virai. Desta forma, podem ser identificados pares adequados de factor trans-actuante/sequência cis-actuante. A adequação do par pode ser avaliada usando o ensaio de expressão do CAT, descrito em detalhe nos exemplos e no texto que se segue. Nestes ensaios, a sequência cis-actuante é clonada num vector adequado, e um gene ”informativo” adequado (e.g.,'CAT, β-galactosidase, etc) é ligado à sequência cis-actuante, para proporcionar um controlo cis. A construção de teste é então transferida para uma célula hospedeira adequada (e.g., cultura de células de mamífero) e ensaiada quanto à expressão do gene informativo na presença e na ausência, do factor trans-actuante. Genes efectores adequados são já conhecidos da técnica, ou podem ser clona27 dos usando técnicas padronizadas.

Os parasitas intracelulares (incluindo os vírus) induzem frequentemente a expressão de interferão. Assim, o isolamento da sequência cis-actuante dc interferão deverá permitir a identificação dos factores trans-actuantes envolvidos na resposta anti-parasítica, e deverá permitir, igualmente, a preparação de construções polinucleotidicas apropriadas para este invento.

As desordens hiperproliferativas são caracterizadas por uma regulação génica, ou actividade de um produto de expressão genica, não apropriados, envolvendo tipicamente factores de crescimento ou de diferenciação celular e, ocasionalmente, genes codificantes de proteínas estruturais. A regulação génica não-apropriada pode resultar da expressão de um factor trans-actuante disfuncional (e.g., um factor em que uma truncagern ou uma mutação genética eliminaram a inibição do factor. ou um factor que se liga irreversivelmente, etc». da expressão em excesso de um factor, ou receptor, trans-actuante (e.g., devida à justaposição translocacional de um promotor forte), ou outros defeitos. De qualquer modo, a desordem exibe caracteristicamente um factor trans-actuante que, ou é diferente dos encontrados nas células normais, ou está presente em quantidades anormalmente grandes. Os factores trans-actuantes codificados pelos vírus associados com desordens hiperpro1iferativas (e.g.. HTLV-I, HTLV-II, os genes E6 e E7 do HPV tipo 16 e tipo 18) podem igualmente ser usados para regular a expressão de um gene efector, como squi descrito. Logo que seja identificada a sequência cis28

-actuante afectada,

pode ser seleccionado um gene efector adequado. Uma vez que os factores trans-actuantes característicos são, geralmente, de certa forma homólogos dos factores trans-actuantes normais, é de esperar que a sequência cis-actuante exiba alguma regulação por meio de um factor trans-actuante endógeno, em células normais. Assim, os genes efectores preferidos para o tratamento de desordens hiperprol iferativas são, a baixas concentrações, relativamente não-tóxicos para a célula hospedeira. No entanto, a actividade dos factores trans-actuantes pode ser constitutivamente elevada nas células hiperproliferativas, enquanto que a actividade pode ser mais baixa e flutuante (como durante o ciclo celular) nas células normais. Esta diferenciação pode ser explorada para permitir a acumulação de elevados níveis de produto de expressão do gene efector em células hiperplásicas.

Similarmente, muitos factores trans-actuantes específicos de um tipo celular, e sequências reguladoras cis-actuantes, têrn sido descobertos e descritos na literatura. Podem ser determinadas sequências reguladoras cis-actuantes por meio dos métodos atrás apontados. Deve notar-se que, em certos casos, um factor trans-actuante associado a uma desordem hiperproliferativa, e a sua sequência reguladora cis-actuante, serão idênticos aos factores trans-actuantes específicos de um tipo celular, e sequências reguladoras normais, Em tais casos, a desordem hiperproliferativa é tipicamente causada por um excesso de concentração do factor trans-actuante. Em conformidade com esta situação, o gene efector deve ser cuidadosamente escolhido.

Um vector retroviral genérico do invento é representado na Figura 1. 0 vector compreende uma LTR 5’ retroviral e um local de ligação do ”primer” (1„), uma sequência psi de sinal de encapsidação (encapsulação) (2), uma sequência 3’, opcional, de sinal de processamento de RNA (3), um gene efector (4), uma sequência 5’ reguladora cis-actuante (5), incluindo um promotor, opcionalmente, um promotor (6) e um gene marcador seleccionável (7), uma LTR 3’ retroviral e um local de ligação de ”primer” (8). As sequências 1_ - 8 constituem a porção retroviral do vector, enquanto que a sequência 9 é, tipicamente, derivada de um plasmídeo, e proporciona a manutenção do vector na cultura celular. A LTR 5’ (1_) e a LTR 3’ (8) proporcionam a transcrição reversa e a integração do vector no genoma da célula hospedeira. LTRs adequadas incluem as derivadas do vírus da leucemia murina de Moloney (Mo-MuLV) (Shinnick et al , Nat ure (1981) 293:543), o virus do sarcoma murino de Harvey CHa-MSV), (Van

Beveran et al . , Ce11 (1981) 27:97), o HTLV-I, o HTLV-II, o

HIV-l,e o HIV-2. Nos retrovirus de replicação defectiva, a região U3 da LTR 3’ (8) é inactivada. A sequência psi (2) terá que estar incluída no vector, para que este possa ser incluído nas cápsides virais que se geram na linha celular de encapsulação, mas é, de outra forma, inactiva quando integrada no genoma do hospedeiro. Foram descritas sequências psi adequadas por Cepko et al. , Cel 1 (1984) 37:1053-62

Guild et al., supra; e Kriegler et al, Cel1 (1984) 38:483

Quando o vector é não retroviral, e se destina a ser inseri30 do por transfecção e não por infecção, as sequências LTR e psi podem ser omitidas. 0 gene ef.ector (4) é como atrás descrito. Nos vectores retrovirais recombinantes de promotor interno”, o gene efector (4) é provido com os seus próprios promotor / sequência reguladora cis-actuante (5), e sequência de terminação / sequência de poliadenilação (4) (apesar de a sequência de terminação e de poliadenilação poderem ser derivadas do gene efector).

gene efector pode ser orientado em qualquer das orientações possíveis, mas é usualmente orientado na direcção oposta à do molde de leitura da LTR. Nos vectores retrovirais recombinantes de substituição do 'enhancer”’, o gene efector (4) é orientado na mesma direcção que a LTR, e não estã provido de uma sequência reguladora cis-actuante (5) ou de sequência de terminação / sequência de poliadenilação ¢.4), distintas. Em vez disso, a sequência reguladora cis-actuante é incluída na região U3 da LTR 3’ (8), de forma a que o gene efector seja controlado pela região reguladora cis-actuante apenas depois da. transcrição reversa.

marcador seleccionável C7), quando presente, codifica para uma característica que permite às células, que expressam a sequência, do marcador, a sobrevivência sob condições seleccionantes para as células transfectadas. 0 marcador seleccionável codifica, tipicamente, para uma enzima que confere resistência a um antibiótico, por exemplo, cloranfenicol, neomicina. (Southern et al.,_., J.Mol. Appl. Gen.

(1982) 1..: 327-41) ou higromicina (Gritz et al . , Gene (1983) 25:179-88 ). 0 marcador seleccionável, quando usado, é geral31

mente provido com o seu próprio promotor (6), que permite a expressão do gene marcador durante a selecção das células transfectadas/infectadas. Promotores adequados para o gene marcador incluem o promotor de histonas, o promotor do tk do HSV-1, e o promotor da metalotionina,

A sequência 9 é uma sequência polinucleotídica de manutenção, que proporciona a manutenção estável do vector dentro das células produtoras. Tipicamente, a sequência 9 é derivada de um plasmídeo, e fornece uma origem de replicação (como a ori do pBR322, ou a ori da levedura 2μ), e (usual mente) um-marcador de resistência a um antibiótico. Sequências de manutenção adequadas incluem a derivada do pXf3, pBr322, pUC18, pML, e semelhantes. No caso de segmentos lineares de DNA usados para integração dirigida, o vector pode ser linearizado num ponto incluído na sequência 9. As regiões LTR 1 e 3 são substituídas por sequências homólogas da sequência de recombinaçao dirigida desejada. A sequência 2 é delectada. A sequência 9 inclui sequências polinucleotídicas que proporcionam a sua manutenção e replicação em hospedeiros microbianos, incluindo, adicionalmente, um marcador de selecção counter” (que permite a eliminação das células hospedeiras transfectadas que sofreram uma integração não específica).

Desenvolvimento de sistemas de act i vação.....de fármacos

Como sistema-protótipo para activação de fármacos citotóxicos, é escolhido o gene da timidina-quinase, do vírus Herpes Simplex tipo I (tk do HSV-1). 0 gene tk do HSV32

-1 pode activar uma variedade de análogos dos didesoxinucleosidos (ddNs), por conversão destes fármacos em espécies 5¹ monofosfato. Os ddNMPs podem actuar como inibidores competitivos das nucleótido quinases, ou das nucleósido quinases, celulares, causando a deplecção dos reservatórios de nucleótidos celulares; após a conversão em espécies trifosfato pelas enzimas celulares, os ddNTPs podem ser incorporados nas cadeias nascentes de DNA (e, possivelmente, de RNA), causando a terminação da cadeia.

Um dos ddNs melhor caracterizados, que pode ser activado pelo gene tk do HSV-1, é o aciclovir (aciclo-G). A segurança e eficácia do aciclovir deriva, primariamente, da sua activação selectiva pelo tk do HSV-1: o aciclo-G é convertido em aciclo-GMP, pela timidina quinase do HSV-1 (tk), com uma eficiência várias centenas de vezes superior à das timidina quinases celulares (KM da tk do HSV-1 = 0,005 x KM da tk Vero; Vrel da tk do HSV-1 = 3 000 000 x Vrel da tk

Vero). As enzimas celulares convertem, então, o aciclo-GMP em aciclo-GTP, que é incorporado no DNA pela DNA polimerase do HSV-1, causando a terminação da síntese de DNA virai. 0 aciclo-GTP inibe a síntese do DNA do HSV-1 a cerca de 1/20 da concentração requerida para obter uma inibição semelhante da síntese de DNA celular (Ρ. A. Furman et al., J.Virol.

(1979) 32: 72-77).

Logo que é identificada uma sequência reguladora cis-actuante, esta é testada quanto ao seu efeito sobre um sistema modelo. Por exemplo, a sequência reguladora cis-actuante pode ser clonada num plasmídeo com um gene infor33 mativo adequado, como o gene CAT ou o da β-galactosidase. 0 plasmídeo é, então, transfectado numa linha celular adequada (e.g., células CHO, HeLa, HUT78, e semelhantes). 0 factor trans-actuante pode ser fornecido por selecçâo de uma linha celular hospedeira que expresse o factor trans-actuante, ou por co-transfecção da linha celular hospedeira com um plasmídeo codificando para o factor trans-actuante, sob o controlo de um promotor diferente (indutível ou constitutivo). As células hospedeiras transfectadas são, então, ensaiadas quanto à expressão do gene informativo.

A adequação de um gene efector, como o tk do HSV-1, é testemunhada através da sua clonagem num plasmídeo adequado, sob o controlo da região reguladora cis-actuante seleccionada. 0 plasmídeo contém também, de preferência, um marcador seleccionável, permitindo a selecçâo das células que foram geneticamente transformadas pelo vector.

Estrutura geral dos vectores da timidina quinase

A estrutura geral dos vectores retrovirais que podem ser usados para criar retrovírus recombinantes, contendo um gene efector ligado a elementos reguladores cis-actuantes, é mostrada na Figura 1. Os vectores retrovirais básicos para a expressão do gene tk do HSV-1 são derivados do Vírus da Leucemia Murina de Moloney (Mo-MuLV). Todos os genes do Mo-MuLV (gag> pol e env) foram removidos, de forma a gerar vírus de replicação completamente defectiva. Os componentes remanescentes são requeridos para a expressão e encapsulação do RNA virai, transcrição reversa e integração, e transcrição cio gene tk Ce gene marcador, se desejado) nas células alvo. Estes componentes consistem em Sequências

Longas Repetitivas Terminais (LTRs) do Mo-MuLV, nos locais de ligação do primer” à cadeia (+) e à cadeia (-)> e no sinal de encapsidação do RNA (sequência psi).

έ construída uma unidade híbrida de transcrição, com o fim de regular a expressão do gene tk do HSV-1 de um modo específico de um tipo celular, em que a sequência codi ficante do tk da HSV-1 substitui a sequência codificante de uma unidade de transcrição específica de um tipo celular. A expressão do gene tk do HSV-1 através destes vectores pode ser conseguida por duas formas. 0 primeiro tipo de vector usa uma sequência enhancer” / elemento regulador distinta, para regular a expressão do tk do HSV-1. Neste tipo de vector, a transcrição do tk do HSV-1 é feita na orientação oposta à do sentido (+) do provírus (como mostra a Figura 1). 0 gene tk é provido do seu próprio sinal de poliadenilação, e, se desejado, pode também ser provido com um intron entre a sequência codificante do tk e o sinal de poliadenilação. A interferência transcricional potencial, nesta primeira classe de vectores, pode ser reduzida retirando as sequências enhancer” / elemento regulador à região LTR 3’ do vector. Uma vez que apenas as sequências U3 ds. LTR 3’ são transcritas para RNA virai , estas sequências formam ambas as LTRs do provírus resultante. Isto permite a integração do cDNA proviral, mas resulta na perda dos enhancers” e dos elementos reguladores de ambas as LTRs do oroví rus.

Η

No segundo tipo de vector (vector de substituição do enhancer”), a LTR do Mo-MLV fornece a sequência enhancer e a do elemento regulador, que controlam a expressão do gene tk do HSV-1. A LTR do Mo-MLV pode dirigir a expressão de genes heterólogos numa variedade de tipos celulares (excluindo as stem cells” hematopoiéticas), mas é mais eficiente nas células T. 0 controlo da expressão génica celular, específica de tipo, do tk do HSV-1, pode ser conseguido pela substituição de sequências específicas enhancer” / elemento regulador pelas sequências enhancer” / elemento regulador pertencentes à LTR 3’ do Mo-MLV. A LTR 5’ do Mo-MLV é mantida no vector, para permitir a expressão eficiente do RNA virai na linha celular de encapsulação usada para gerar o vírus infeccioso.

Pode ser incorporado um gene de um marcador seleccionável nestes vectores, em posição 3’ relativamente ao gene tk do HSV-1, de forma a. permitir a selecção in vitro das células transformadas. A expressão do gene marcador é proporcionada pelo seu próprio elemento regulador. Em geral, este elemento regulador seria derivado de um gene celular moderadamente activo que é constitutivamente expresso em todos os tecidos. Alguns exemplos de tais elementos reguladores poderão ser o promotor da |3-actina citoplasmática, os promotores das histonas, e promotores de enzimas elicolíticas.

segundo tipo de vector usa um enhancer / elemento regulador distinto para regular a expressão do gene tk do HSV-1. Neste tipo de vector, a transcrição do tk cio HSV-1 é feita na orientação oposta à do sentido (+) do provírus. 0 gene tk é provido do seu próprio sinal de poliadenilação, e, se desejado, pode também ser provido com um intron entre a sequência codificante do tk e o sinal de poliadenilação. A interferência transcricional potencial, nesta segunda classe de vectores, pode ser reduzida retirando as sequências ”enhancer” / elemento regulador à LTR 3’ do vector. Isto permite a integração do cDNA proviral, mas resulta na perda dos enhancers” e dos elementos reguladores de ambas as LTRs do provírus.

Como para a primeira classe de vectores, pode ser proporcionado um marcador seleccionável, que é transcrito na direcção oposta à do gene tk do HSV-1. A transcrição é, deste modo, iniciada no centro do provírus integrado e prossegue em direcções opostas, de uma forma análoga à transcrição dos genes E2/E3 dos adenovírus humanos.

Formulação e administração

A formulação das construções polinucleotídicas do invento dependem da. forma da construção. Por exemplo, quando o vector é um vírus competente (infeccioso ) , este pode ser formulado do mesmo modo que as vacinas de vírus vivos. Tais formulações são, tipicamente, soros fisiológicos tamponados para injecção, ou formulações tamponadas orais, podendo qualquer das formulações conter, opcionalmente, antibióticos. Podem ser preparadas formulações de lipossomas por métodos padronizados; por exemplo, pela, suspensão de lipidos em clorofórmio, secagem dos lipidos contra as paredes de um

I

Lipof ecti n

MD), e recipiente, e hidratação dos lípidos corn uma solução contendo uma construção polinucleotídica, Os lípidos apropriados são conhecidos da técnica, e incluem a fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, leticina e semelhantes. Um lípido sintético particularmente útil para a transfecção polinucleotídi ca é o cloreto de N-C1 -(2,3-dioleiloxi)propi1]-N,N,N-trime tilamónio, f D (disponível através de BRL, Gaithersburg, descrito por P.L.Felgner comercial mente disponível sob a designação (R ) et

ProcNatAcadSei.USA (1937 ) 84:7413.

Os vectores retrovirais recombinantes podem também ser formulados para administração in vivo (se forem de replicação defectiva). Os vectores baseados no HIV-1 ou HIV-2 demonstrarão os mesmos tropismos celulares que o vírus nativo, proporcionando assim um meio eficiente e simples de direccionamento para as populações celulares apropriadas, in vivo, no tratamento de uma infecção por HIV-1 ou HIV-2. Os vectores baseados no HIV podem empregar os promotores das LTR do HIV, a sequência tar, e o gene tat para o controlo ds. expressão de genes heterõlogos. Pode melhorar-se a especificidade do vector para as células alvo, através de uma escolha apropriada de construções de encapsulação (e.g., o gene env ) .Por exemplo, o isolado SP1G2 do HIV-1 (M.Quiroga et al, ”Modern Approaches to New Vaccines” (1989, Cold Spring Harbor Laboratories), pág. 80) é naturalmente selectivo para a infecção de macrófagos', assim, encapsulando o vector num envólucro derivado do HlV-l^pigj' pode efectuar-se o direccionamento para os macrófagos. Similarmente, pode fazer-se a encapsulação dos vectores usando genes recombinantes de envólucro que incorporam sequências derivadas de envólucros ou cápsides derivados do vírus da hepatite B (ou do HAV, ou do HCV), para obter a libertação direccionada para os hepatócitos. Através do uso de uma linha celular de encapsulação que expresse proteínas do envólucro derivadas do HIV-2, pode obter-se um método eficaz de direccionamento dos vectores do invento, para a protecção das células Tq, devido à afinidade da gp!60^env para as células CD4⁺ (Smith et al., Science (1987) 238:1704-06).

modo de administração das construções polinucleotídicas do invento depende da natureza do vector. Por exemplo, os vectores retrovirais podem ser administrados por inoculação, parentericamente ou oralmente. Quando o vector é um vírus infeccioso recombinante, a administração pode ser feita por injecçâo parentérica, por administração oral ou intranasal, e semelhantes. As formulações de lipossomas são, de preferência, administradas por spray intranasal ou injecçâo intravenosa, 0 método de administração presentemente preferido é o de incubação de vectores retrovirais defectivos com células autólogas -de um aspirado de medula celular, ou com linfócitos T, ex vivo, seguida pela reintrodução das células tratadas, através de técnicas padronizadas. Abreviadamente, as células de medula óssea são aspiradas por métodos conhecidos da técnica, de transplantes de medula óssea, e são geralmente aspiradas a partir do osso pélvico. Se desejado (particularmente no tratamento da leucemia e de outras desordens hiperplásicas ) , o paciente pode ser tratado com quimioterapia ou radioterapia após a aspiração da medula óssea, com o fim de reduzir a carga de células infectadas ou hiperproliferativas. O aspirado pode ser tratado para remover materiais indesejáveis (e.g., células tumorais, bactérias, partículas virais, e semelhantes), por exemplo por imunoprecipitação, imunoadsorção, imunoreacção com fixação do complemento, selecção de células activadas por fluorescência (FACS), e semelhantes. Idealmente, as ”stem cells” hematopoiéticas são marcadas e isoladas através do uso de MAbs específicas das ”stem cells”. 0 aspi rado tratado é, então, transfectado ou infectado com uma construção do invento. Um método de infecção é o de manter a cultura de células do aspirado em contacto com títulos infecciosos de vectores retrovirais de replicação defectiva, durante um período de tempo suficiente para assegurar a eficiência da inoculação. Podem adicionar-se factores de crescimento para células hematopoiéticas (por exemplo, a IL-3), durante a co-cultura (E.A. Dzierzak, supra). Podem ser usadas as técnicas de transfecção mediadas por fosfato de cálcio, conhecidas para as células murinas (ver, por exemplo, E.A. Dzierzak, supjr a., S - F . Yu et al . , Proc .____Nat Acad.

Sei. USA (1986) 83.:3194-98). As construções podem, igualmente, ser introduzidas por e1ectroporação (S. Mansour, supra). Alternativamente, pode usar-se um agente de transfecção como o Lipofectin^^*. Quando o vector inclui um marcador, as células infectadas podem ser separadas ou seleccionadas,· se necessário. As células infectadas são, então, reintroduzidas no paciente usando métodos empregues na transplantação autó40

Ioga de medula óssea, tipicamente por perfusão intravenosa ou injecção, Pode, igualmente, fazer-se a transfecção ou infecção de linfócitos, in vivo ou ex vivo, usando construções deste invento. A infecção usando construções baseadas no MLV é, de preferência, conduzida'ex vivo, já que o envólucro é inactivado pelo complemento humano. Podem seleccionar-se subconjuntos específicos da população linfocítica, através do uso de anticorpos monoclonais para a separação do subconjunto desejado, ou por outros métodos conhecidos da técnica; ver, por exemplo, P.W. Kantoff et âJL·.' Proc · Nat .Acad.Sei.USA (1986) 83: 6563-67.

Se desejado, podem converter-se alguns dos linfócitos, ou das células de medula óssea, em células de encapsularão, através da inserção de construções independentes capazes de expressar os genes virais codificando para as proteínas gag-pol e env, seguindo-se a inserção de um vector deste invento (0. Danos et al., Proc.Nat.Acad.Sei.USA (1988)

85:6460-64). Quando as células autólogas de encapsulação são reintroduzidas no paciente, a. expressão contínua do retrovírus de replicação defectiva, durante o tempo de vida da célula, resulta na transferência da construção terapêutica do invento para um grande número de células hospedeiras.

Ç_._______Exemplos

Os exemplos abaixo apresentados são fornecidos como um guia mais apropriado para o praticante com perícia normal na técnica, e não pretendem ser, por qualquer forma, limitativos do invento.

Exemplo 1

Vectores retrovirais recombinantes

Foram construídos vectores retrovirais, usando técnicas padronizadas de manipulação do DNA recombinante (T.

Maniatis et al , Molecular Cloning:__A Laboratory Manual (New

York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)). Os plasmídeos usados na construção de vectores retrovirais foram obtidos a partir das seguintes fontes: o pMX11125VNeo foi concedido por M. McMann (UCSF), o SV-N foi concedido por E. Gilboa (construído como descrito por Yu, supra )

O plasmídeo pMX1112SVNeo é construído por inserção de um fragmento Cla-Cla do promotor precoce do SV40, ligado ao gene neo , no plasmídeo pMX1112 (descrito por A.M.C.

Brown et al, ”Retroviral Vectors”, págs. 189-212, em DNA

Cloning:___A Practical Approach”, vol. 3 (D.M. Glover, ed. ,

IRL Press, 198?)). 0 gene neo¹ do SV40 é posicionado entre a sequência de encapsulação psi e a região LTR 3’ do Mo-MuLV no plasmídeo. 0 plasmídeo pMXSVNeolS foi preparado a partir do pMXl112SVNeo, através da remoção do local de restrição da

EcoRI, a montante da região LTR 5’ do Mo-MULV, da inserção de um ”linker” de EcoRI no local de restrição da Xhol, e da adição do ”poli-1inker” do pUC18 entre o novo local de restrição da EcoRI e o local de restrição da HindIII. 0 plasmídeo pTARl contém a região LTR 5’ do HIV (incluindo a sequência tar), um gene codificando para a CAT, e um sinal de poliadenilação e um intron t do 5V40, tendo sido construído por clonagem do fragmento de restrição do HIV-1 por Xhol-Narl (9F2) (R.Sanchez-Pescador et al. , Sc i ence (1982)

I 'Ή do

227:484 -92 ) no pML. Foi adicionado um ”poli-1inker” sintético ao local de restrição da NarI, e o fragmento de restrição por Stul-BamHl (C.M.Gorraan et pSV2CAT

Proc.Nat.Acad.Sei.USA (1982 ) 79:6777-81 ), contendo o gene CAT e sinais de processamento de RNA do SV4O, foi inserido para formar o pTARl. 0 pTARl foi cortado com Asp718 e Xhol, e o fragmento resultante foi cionado no pMXSVNeol8 para produzir o pTBl , mostrado na Figura 2, 0 plasmideo pTATl foi construído com o gene tat do HIV, sob o controlo do EP do SV40, e flanqueado pelo sinal de poliadenilação do SV40 (Peterlin et al. , supra ). 0 plasmideo pRT contém o gene tk, o promotor, e os sinais de processamento de RNA do HSV-1. 0 plasmideo ptar/tk foi preparado por clonagem do fragmento de restrição do pRT por BglII-EcoRI (contendo a sequência codificante tk e o sinal de poliadenilação ) no pTARl, no lugar do gene CAT. 0 plasmideo pMXSVNeo-tar/tk foi construído por clonagem da porção do ptar/tk, resultante da restrição por Asp718-EcoRI, no ”poli-1inker” do pMXSVNeolS (o pMXSVNeo-tar/tk está representado na Figura 3).

Os retrovírus anfotrópicos capazes de infectar células humanas foram preparados usando técnicas padronizadas (R. Mann et al, Cell (1983), 33 : 153-59). Abreviadamente, a linha celular anfotrópica cie encapsulação PA-317 (Miller et al. , Mol.Cell Biol (1986) 6:2895 -902; ATCC CRL

9078) foi transfectada com o vector plasmíclico, usando a técnica. cie co-precipi tação com CaP04 CR. Graham et al . , Viro! . (1973) 52.:456-67). Foram aplicados 10 pg do vector

plasmídico e 25 pg de transportador de DNA do esperma de 5 salmão, na forma de um co-precipitado de CaPO/j , a 5 x 10 células PA-317, numa placa de cultura de tecidos com 6 mm, durante S a 15 horas. 0 precipitado foi removido e a monocamada foi enxaguada com tampão salino de fosfato Dulbecco. Foi aplicado meio fresco (meio de Eagles modificado por Dulbecco, DMEM, suplementado com 107, de soro fetal bovino e com antibióticos), e permitiu-se que as células se desenvolvessem e recuperassem durante dois dias. As células transfectadas foram, então, tratadas com tripsina e transferidas o para um frasco em T de 150 mrrt, sendo cultivadas durante 10 a 14 dias em meio contendo G418 a 0,8 mg/ml. As colónias resultantes, resistentes ao G418, foram tratadas com tripsina e clonadas por diluição limitante em placas de cultura de tecidos com -95 cúpulas. 0 retrovírus recombinante, produzido pelos clones individuais, foi caracterizado através de infecção de linhas celulares humanas (HeLa, ATCC CCL 2; HUT78, ATCC TIB 151), para determinar o título virai e a geração da estrutura proviral correcta.

Foram preparados retrovírus ecotrópicos recombinantes como acima descrito, sendo, no entanto, usada a linha celular ecotrópica de encapsulação Psi-2 (R.Mann, supra), no uear da. PA - 31 7 .

Exemplo 2

Infecção de células com retrovírus recombinantes

Foram infectadas linhas celulares com retrovírus recombinantes, usando métodos padronizados (R.Mann, supra) .

Abreviadamente, foram colocadas 5 x 10^ células em placas de cultura de tecidos com 60 mm, e permitiu-se o seu desenvolvimento durante 16 horas. Os sobrenadantes isentos de células, obtidos a partir das células de encapsulação contendo vectores plasmídicos, foram aplicados sobre as células alvo, durante 6 a 8 horas, na presença de polibreno a 8 pg/ml. No caso dos vírus portadores do marcador de resistência ao

G418, as células foram cultivadas, seleccionadas, e clonadas como acima descrito para a preparação de clones de encapsulação. Foram titulados retrovírus portadores do tk do HSV-1, mas sem o marcador de rsistência ao G418, utilizando linhas de células tk: L-M (tk-) (ATCC CCL 1,3) para vírus ecotrópicos, células 143 B (ATCC CRL 8303) para vírus anfotrópicos. Foi efectuada a selecção das colónias tk\ usando meio HAT.

Exemplo 3

Ensaio de trans-activação pela sequência tat do HIV

Os plasmídeos pTARl, pTBl, e pTB2 (possuindo a região LTR do HIV na orientação oposta à do pTBl), codificando para a CAT, sob o controlo da sequência reguladora cis-actuante tar do HIV, foram transfectados em células

HeLa. 0 plasmídeo pTATl, expressando o agente trans-actuante tat do HIV, foi transfectado em metade das células HeLa.

Após 48 horas, as células foram lisadas, e fez-se a incubação dos lisados com cloranfenicol marcado com ^C. Os produtos foram extraídos com EtOAc, e analisados por cromatografia em camada fina.

Os resultados indicaram que a CAT foi expressa pelas células HeLa que continham um plasmídeo codificando para a sequência tar e um plasmídeo codificando para a tat, mas não pelas células HeLa que não possuíam o plasmídeo pTATl. Apesar de o grau de expressão constitutiva (escapamento”) variar pouco entre o pTARl, o pTBl , e o pTB2, a expressão da CAT em resposta à sequência tat do HIV foi mais elevada em células contendo o pTBl e o pTB2 do que em células contendo o pTARl (ao qual faltam as LTRs do Mo-MuLV e o enhancer” do SV40).

	Exemplo 4 Genes efectores citotóxicos antivirais
-1 a r /1 k,	Foi produzido o retrovírus anfotrópico MXSVNeo- o qual foi usado para infectar células HUT78 (ATCC
TIB 161)	. As células transformadas (células HUT-tk”) foram

seleccionadas usando G418 a 1 mg/ml. A sensibilidade das células HUT-tk, cultivadas em massa, ao aciclovir, foi determinada por cultura em meio contendo diversas concentrações do fármaco. As células HUT78 contendo o

pMXSVNeo-	-tar/tk (células HUT-tk”) foram centrifugadas para
obtenção	de um pellet”, e expostas ao polibreno (2 pg/ml),
a 37°C,	durante 30 minutos. Obteve-se, então, um novo
pellet”	5 de células, sendo estas ressuspensas, a 10 células
por ml,	e expostas ao HIV-1 (SE2), durante 1,5 horas, a

37^C'C. Obteve-se novo ”pellet” das células, que foram ressuspensas, em meio RPMI 1S40 contendo 107, de soro de vitelo 4 fetal e antibióticos, a 10 células por 50 pl. Distribuiu-se. então, 50 ul da suspensão celular pelas cúpulas de uma ^4 placa com 24 cúpulas, contendo 1 ml de meio com 45, 100, ou 200 μΜ de aciclovir. Foi adicionado o SF2 do HIV (suficiente para originar 3 unidades de DO num ensaio ELISA para pesquisa da p25gag, após 7 dias de incubação), e permitiu-se a sua propagação durante 7 dias, sendo, então, ensaiado por ELISA anti-p25gag. As células HUT78 normais serviram como controles em relação ao efeito do gene tk do HSV-1. Os resultados destas experiências são mostrados na Figura 5.

Se bem que a replicação do HIV nas células HUT78 não tenha sido significativamente afectacla pelo aciclovir, a replicação foi fortemente inibida pelo aciclovir em células HUT-tk (cerca de 60X com 100 μΜ de aciclovir). Os efeitos citopáticos/citotóxicos tornaram-se patentes em ambos os tipos celulares (dados não mostrados). Apesar de a análise dos clones de células HUT-tk isoladas evidenciarem uma variação na sensibilidade ao aciclovir, as células HUT-tk cultivadas em massa mostraram-se capazes de restringir significativamente a replicação virai.

Exemplo 5

Ensaio de.....inibição da replicação do HIV

Podem usar-se células infectáveis pelo HIV, transformadas de forma a exibirem um fenótipo positivo para a tk do HSV-1, com o fim cie testar análogos cie nucleósidos quanto à sua actividade antiviral e citotoxicidacle (Mitsuya, supra).

Foram clonadas, por diluição limitante, células HUT78 contendo o pMXSVNeo-tar/tk (células HUT-tk), e en47 saiada a sua sensibilidade a concentrações variáveis de aciclovir, como medida da expressão constitutiva do gene tk. Um clone especialmente sensível, designado por tk-5, foi escolhido para testar a capacidade de expressão, por parte das células, de elevados níveis de tk, para activar o AZT e resistir a uma infecção por HIV.

Células HUT78, células HUT-tk cultivadas em massa (do Exemplo 4), e células TK-5, foram centrifugadas para formação de um ”pellet” e expostas a polibreno (2 pg/ml), a

37°C, durante 30 minutos. Preparou-se, então, um ”pellet” das células, as quais foram ressuspensas, a 10 células por ml, e expostas ao HIV-1 (SF2), durante 1,5 horas, a 37°C.

Preparou-se novo ”pellet” das células, que foram ressuspen5 sas em meio RPMI 1640, contendo soro e antibióticos, a 10 células por 50 μΐ. Distribuiu-se 50 μΐ da suspensão de células pelas cúpulas individuais de uma placa de 24 cúpulas, contendo 1 ml de meio com 0, 1,5, ou 10 uM de AZT. As células infectadas foram cultivadas durante 7 dias, e a replicação do vírus foi, então, ensaiada por ELISA anti-p25gag. Os resultados são apresentados na Figura 4.

Exemplo 6

Construção de vectores específicos de timidina quinase

A estrutura de vários vectores retrovirais contendo o tk do HSV-1 é mostrada, na Figura 1. As características funcionais e aplicações terapêuticas destes vectores são abaixo descritas.

SIN-tar/tk-H4 Neo: Este vector emprega o vector auto-inactivante descrito por Yu, usando a sequência cis-actuante tar do HIV e o gene efector tk do HSV-1, e contendo um gene de resistência à neomicina sob o controlo do promotor da histona H4. Este plasmideo confere susceptibilidade a ddNs nas células infectadas com HIV.

SIN-CD4/tk (-H4 Neo): Este vector é idêntico ao vector SIN-tar/tk-H4 Neo acima descrito, excepto no que diz respeito à sequência cis-actuante tar, que é substituída pela sequência cis-actuante que serve de promotor à expressão do antigénio CD4 nas células Tj-p 0 promotor da histona/marcador de resistência à neomicina é opcional. Este vector confere susceptibi1 idade a ddNs em todas as células CD4⁺. Uma vez que o antigénio CD4 é correntemente avaliado como sendo uma importante porta de entrada para o HIV, este vector poderia ser, igualmente, útil no tratamento de infecções por HIV.

SIN-Macl/tk (-H4 Neo): Este vector é semelhante ao

SIN-tar/tk-H4 Neo, sendo a sequência cis-actuante tar do HIV substituída pela sequência cis-actuante que regula a expressão do antigene Macl nos macrófagos. 0 promotor da histona / marcador de resistência à neomicina é opcional.

Este vector confere suscept ibi 1 idade a. ddNs em todos os macrófagos, que servem igualmente como células hospedeiras para o HIV.

SIN-tar/rA (-H4 Neo): Este vector emprega a sequência cis-actuante tar do HIV, controlando o gene efector da ricina A, e usa o neo¹ como marcador seleccionável.

SIN-fos/ppt: Este vector emprega o vector auto49 ή

inactivante descrito por Yu, usando a sequência cis-actuante do oncoeene fos (R.Treisman, Ce 11 (1986) 46:567 -74 ) usando um gene efector da fosfotransferase de uma planta. Este vector, em combinação com um ddN, seria útil no tratamento de estados de malignidade do tipo fos.

SIN-pcna/tnf: Este vector utiliza a sequência cis-actuante que regula o Antigénio Nuclear das Células Proliferativas (PCNA) (descrito por J.E.Selis, Leukemia (1988) 2:561-601) e um gene efector de um factor de necrose tumoral (TNF). Apesar de o PCNA ser expresso em todas as células, esta expressão é passageira e ocorre apenas durante a divisão celular. Assim, as células normais infectadas com o vector não produziriam concentrações tóxicas de TNF, enquanto que as células hiperproliferativas neoplásicas, que estão constantemente em divisão celular, expressariam concentrações tóxicas.

SIN-acg/ifn: este vector emprega a sequência reguladora cis-actuante que proporciona a expressão da gonadotropina alfa coriónica (acg) (S.E.Goeltz, Science (1985) 228:187 -90 ) , em combinação com um gene efector do B-interferão. Este vector, tal como o vector precedente, baseia-se no facto de que a acg não é frequentemente expressa em células normais, e se poderia tornar útil no tratamento do cancro.

SIN-IgG/Rbz: Este vector emprega a sequência cis-actuante de uma IgG, juntamente com um gene efector de ribozima, específico para o local de splicing” de bcl/abl, que ocorre na leucemia mielóide crónica (CML). Ao ser expressa a IgG pelas células B, é obtida a protecção de tipo »

τ '1 celular contra a CML.

SIN-e7/Ld: Este vector usa a sequência cis-actuante que responde ao gene E7 do papilomavírus humano tipo 16 (HPV 16), em conjunção com um gene da purina 2’-desoxiribonucleosidase da- Leishmania donovani. Uma vez que a expressão do gene E7 do HPV16 está associada ao carcinoma do cérvix uterino (Phelps et al , Çell. (1988) 53; 539-47 ), este vector (em combinação com o fármaco 6-metilpurina 2-desoxiribosido) destrói as células em que o gene E7 é expresso.

HIV-2/tk: Este vector é derivado do HÍV-2 após delecção de todos os seus genes internos, excepto no que diz respeito à porção do gene gag que se sobrepõe ao sinal psi (de encapsidação ), e ao elemento de resposta rev do gene env. 0 gene tk do HSV-1 é inserido na posição 3’ relativamente à sequência psi, e é expresso sob o controlo da LTR do HIV-2. Se desejado, a sequência tar do HIV-1 pode ser substituída pela sequência tar do HIV-2. Este vector pode ser usado para expressar o gene tk do HSV-1 a partir de um RNA do comprimento do genoma, através da delecção ou alteração dos codões ATG da sequência gag do HIV (Guild et al. , supra) , obtendo a expressão do gene tk do HSV-1 a partir do seu proprio codão de iniciação ATG. Alternativamente, pode incluir-se o aceitador de ”splícine” do gene env do HIV-2, em posição 5’ imediatamente adjacente ao gene tk do HSV-1, sem alterar os codões de iniciação do gag, obtendo assim, a. expressão do tk do HSV-1 através de um mRNA subgenómico resultante do splicing”. Em qualquer dos casos, a expressão do tk do HSV-1 depende da sua complementação resi pela sequência tat, proveniente de ura provírus HIV-1 dente ou de um vírus HIV-1 superinfectante. A expressão do tk, em combinação com a administração de ACV ou GCV, activa, então, os níveis tóxicos do agente antiviral, destruindo, assim, a célula infectada. Estas construções podem ser encapsuladas em envólucros de HIV-2 ou em envólucros de HIV-1SF162’ sendo estes últimos úteis no direccionamento para, e destruição de, macrôfagos infectados.

HIV-2/TCR-tk: esta construção incorpora internamente o promotor do receptor das células T, para dirigir a expressão do tk do HSV-1, e contém o RRE do env e o sinal psi da extremidade 5’ do gene gag do HIV-2. A região LTR 3’ do vector é modificada através da inserção da sequência enhancer” da região constante do TCR alfa (descrita por Ho et__al_j_, Proc , Nat . Acad . Sc i . USA (1989) 86.:6714 ), de acordo com o princípio apresentado por J. Overhauser et___al . > J . Virol.

(1985 ) 54.:133-34, para a construção de um MoMLV respondendo a glucocorticóides. 0 vector HIV-2/TCR-tk pode ser usado para infectar e transformar geneticamente células CD4⁺ in vivo. Uma vez que nem o vector nem a célula. T4 contêm normalmente a sequência tat. não ocorre a expressão de produtos de transcrição, com início na LTR virai, na ausência de infecção por HIV. A iniciação de transcrição (expressão do tk) ocorre a partir do promotor interno do TCR. A expressão a partir deste promotor é acentuada pela presença dos enhancers” do TCR alfa incorporados nas LTRs provirais.

Este vector proporciona a expressão constitutiva do tk nos linfócitos Tj-ι geneticamente transformados, que, por sua vez, activa um agente antiviral (e.g.,ACV, ddC e semelhantes). Isto permite o uso do ACV, e compostos relacionados, em células nas quais estes não seriam, normalmente, eficazes, aumentando, igualmente, a eficácia do ΑΣΤ a baixas concentrações, como mostra a Figura 4. A possibilidade de emprego de vários agentes antivirais deverá reduzir as hipóteses de desenvolvimento de resistência aos fármacos por parte do HIV. Pode ser preparado um vector análogo através da substituição dos componentes do vírus MLV pelas sequências do HIV utilizadas, e pelo uso de uma linha celular anfotrópica de encapsulação de MLV.

Exemplo 7

Administração das construções in vivo (A) São construídas linhas celulares de encapsulação para, vectores baseados no HIV, como se segue:

É isolada a sequência codificante gag-pol, a partir do HIV-1 ou do HIV-2, a qual é inserida num vector de expressão, sob o controlo do promotor imediato precoce principal (MIE) do citomegalovirus humano (CMV). é proporcionada uma sequência cie pol iadeni lação adequada, em posição 3’ relativamente à inserção da sequência gag-pol', por exemplo, a sequência codificante de poli A do SV40. Ambas as sequências, gag-pol e env, têm de conter o elemento de resposta rev (RRE), presente na região codificante do env, de forma a obter o transporte para, fora do núcleo (M.H.Malim et al . ,

Nature (I989 ) 338:254-57 ).

A sequência env (incluindo o RRE ) , que determinará a especificidade final do vector acabado, é obtida a partir de um isolado seleccionado a partir do HIV-I, HIV-2 ou SIV-1, e é inserida num vector de expressão distinto, sob o controlo do promotor MIE do CMV. Nesta construção, é empregue uma sequência de poliA da β-globina. Pode inserir-se um intron em posição 5’ relativamente à sequência codificante env, opcionalmente contendo uma sequência codificante de um p

marcador ou gene informativo (e.g., neo ).

São construídos vectores similares distintos, para a inserção do cDNA tat e do cDNA rev, sob o controlo do promotor precoce do SV40. Estes vectores empregam sequências de poli A do SV40. Através da separação das sequências que codificam para gag-pol, env, tat, e rev, a possibilidade de recombinação para regeneração de um vírus HIV funcional é minimizada.

Os vectores de expressão são, então, usados para construção de uma linha celular de encapsulação, por transfecção de uma linha celular apropriada, por exemplo, NIH-3T3 , HeLA, ou semelhantes. Após transfecção com um vector retroviral do invento, como o HIV-2/TCR-tk, é preparada uma construção protectora, no âmbito do invento, com a capacidade de infectar a população de células hospedeiras que é infectada durante uma infecção genuína por HIV (principal mente células Tp). Quando administrado em combinação com agentes antivirais adequados, como o AZT, ACV, ddC ou semelhantes, este tratamento protege as células infectadas contra a replicação infecciosa do HIV.

B) São preparadas construções tróficas para macrófagos/monócitos, seguindo o procedimento da parte A, acima descrita, mas utilizando o gene env do HIV-1sfi62 Ρ^θΓθ fornecer a proteína env. Após a transfecção com um vector do invento, como o HIV-2/tk, é proporcionada uma construção ablativa que é capaz de superinfectar e destruir as células hospedeiras que são reservatórios do HIV e da infecção, particularmente macrófagos e monócitos.

Claims (32)

1. REIVINDICAÇÕES

   1- Um método para tratar uma célula hospedeira ex vivo de uma desordem hiperproliferativa ou infecção por um agente infeccioso, sendo as mesmas caracterizadas por um factor regulador trans-actuante capaz de regular a expressão dos genes, caracterizado pelo facto de compreender:

   - a inserção numa célula hospedeira ex vivo de uma construção polinucleotídica compreendendo uma sequência reguladora cis-actuante que é controlável pelo referido factor regulador transactuante; e

   - um gene efector sob o controlo da sequência reguladora cis-actuante, sendo o referido gene efector capaz de expressar uma proteína que torna a referida célula sujeita à protecção ou destruição, em resposta quer a uma desordem hiperproliferativa ou a uma infecção provocada por um agente infeccioso, que é caracterizada pela expressão do referido factor regulador trans-actuante.
2. 2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do dito gene efector tornar a célula susceptível à destruição.
3. 3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o dito gene efector codificar para um mRNA anti-senso que se liga ao mRNA da célula hospedeira codificando para uma proteína da célula hospedeira essencial, e inibe a expressão da dita proteína.
4. 4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o dito gene efector codificar para uma proteína citotóxica.
5. 5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a dita proteína citotóxica ser uma proteína inibidora dos ribossomas.
6. 6- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto da dita proteína inibidora dos ribossomas ser a ricina A ou a toxina da difteria.
7. 7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o dito gene efector codificar para uma nucleósido quinase capaz de fosforilar análogos de didesoxinucleótidos a uma taxa maior que as nucleósido quinases da célula hospedeira.
8. 8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o dito gene efector codificar para um produto de expressão do gene que torna a célula hospedeira susceptível de protecção.
9. 9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto do dito produto de expressão do gene efector ι

   'Ή compreender mRNA anti-senso, mRNA esse que é capaz de inibir a dita infecção ou desordem hiperproliferativa.
10. 10- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto do dito mRNA anti-senso inibir a infecção ou desordem hiperproliferativa pela ligação ao RNA codificado pelo dito agente infeccioso ou específico da dita desordem hiperproliferativa.
11. 11- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pelo facto da dita infecção compreender infecção por HIV-1 ou HIV-2.
12. 12- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizado pelo facto do dito produto de expressão do gene efector compreender um anticorpo específico para um antigénio, associado com a dita infecção ou desordem hiperproliferativa.
13. 13- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o dito produto de expressão do gene efector compreender o factor de necrose tumoral, o interferão-α, o interferão-β, o interferão gama, o factor-β de transformação de crescimento, péptidos inibidores, interleuquina-2, ou uma combinação dos mesmos.
14. 14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto do dito produto de expressão do gene efector compreender um inibidor da protease que inibe o processamento de proteínas do agente infeccioso, ou proteínas específicas para a dita desordem hiperproliferativa.
15. 15- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto do dito produto de expressão do gene efector compreender uma proteína que inibe a glicosiiação ou miristilação de proteínas do agente infeccioso ou proteínas específicas para a dita desordem hiperproliferativa.
16. 16- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto do dito produto de expressão do gene efector compreender uma RNase.
17. 17- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da dita sequência reguladora cis-actuante estar presente em, pelo menos, duas cópias em série.
18. 18- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do dito gene efector compreender:

    - pelo menos duas cópias de uma sequência de polinucleótido homóloga de uma região de elemento regulador do dito agente infeccioso ou desordem hiperproliferativa, e capaz de se ligar a um factor trans-actuante associado ao dito agente infeccioso ou à referida desordem hiperproliferativa, em que as ditas sequências de polinucleótido homólogas competem com as ditas regiões de elemento regulador do agente infeccioso, ou dos ditos elementos reguladores da desordem hiperproliferativa, para o dito factor trans-actuante; e uma região de terminador forte.
19. 19- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 18, caracterizado pelo facto do dito agente infeccioso compreender HIV-1 ou HIV-II e o dito agente activante compreender tat.
20. 20- Uma construção polinucleotídica para tratar uma célula hospedeira devido a uma desordem hiperproliferativa ou infecção, por um agente infeccioso, sendo a referida infecção ou desordem hiperproliferativa, caracterizada por um factor regulador trans-actuante capaz de regular a expressão de DNA, caracterizada pelo facto de compreender:

    - Uma sequência reguladora cis-actuante que é controlável pelo referido factor regulador trans-actuante;

    - Um gene efector sob o controlo da sequência reguladora cis-actuante, que torna a referida célula susceptivel de protecção ou de destruição.
21. 21- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 20, caracterizada pelo facto de compreender ainda:

    - uma sequência de manutenção de polinucleótido que proporciona a manutenção estável da dita construção no interior das células mamíferas.
22. 22- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizada pelo facto da dita sequência de manutenção compreender um vector virai.
23. 23- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 20, caracterizada pelo facto da dita construção polinucleotídica compreender um vector recombinante virai seleccionado a partir do vírus da varíola bovina, HIV-I, HIV-II, adenovirus ou virus associado com o adenovirus.
24. 24- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 20, caracterizada pelo facto do dito vector virai compreender um vector retroviral de replicação defectiva.
25. 25- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 24, caracterizada pelo facto do dito vector retroviral de replicação defectiva compreender ainda uma glicoproteína gp160^env proveniente de HIV-1 ou HIV-II.
26. 26- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizada pelo facto da dita sequência de manutenção compreender um vector de direccionamento para um gene.
27. 27- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 20, caracterizada pelo facto da dita sequência reguladora cis-actuante ser capaz de responder à proteína tat de HIV.
28. 28- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 27, caracterizada pelo facto do dito gene efector codificar para uma proteína citotóxica.
29. 29- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 28, caracterizada pelo facto da dita proteína citotóxica compreender a ricina A ou a toxina da difteria.
30. 30- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizada pelo facto do dito gene efector codificar para uma nucleósido quinase, capaz de fosforilar análogos de didesoxinucleósido, a uma taxa maior que as nucleósido quinases da célula hospedeira.
31. 31- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizada pelo facto da dita nucleósido quinase compreender a timidina quinase de HSV-1.
32. 32- Uma construção, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizada pelo facto de a mesma ser pMXSVNeo-tar/tk.

    Lisboa, 23 de Janeiro de 1990