JPH06509578A - 悪性細胞利用による癌治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性細胞ｆ１用による癌治療法 １１弦１ 本発明は、米国国立予防衛生研究所認可番号Ａｌ００６９７に基づき、政府援助 の下で考案されたものである。米国政府は、本発明に関する特定の権利を有する 。

癌の進行を阻止するかまたは治療することを目的とした冶療法は、正常細胞と悪 性細胞の生物学的差異または代謝的差異に基づいて計画されることが多い。宿主 細胞と組織を代償にして癌細胞母集団が無制限または異常に成長することで特徴 づけられる。癌細胞の成長率が正常細胞と比較し相対的に高い場合には、癌細胞 側の代謝活性レベルが高くなければならない。悪性細胞関連活性には、デオキシ リボ核酸（ＤＮＡ）複製率が正常細胞の大半と比較して高いものがあり、癌の治 療的アプローチに用いる潜在的ターゲットとして広く調査されてきた。このため 、悪性細胞のＤＮＡ複製の１つ以上の性状に干渉することで、選択的に死滅させ る治療剤および治療法の開発に多大な努力がなされてきた。こうしたブローチは 、幾つかの成功を収めてきたが、このような治療法はしばしば非特異的であるの で、骨髄細胞などの高成長率の正常宿主細胞も同様の薬剤や冶療法で死滅しやす い。正常細胞に対する癌治療法の毒性は、重篤な副作用を引き起こし２、最終的 な効果を制限することが多い。

癌治療に関する別の問題は、主に、初期癌細胞の起点から離れた部位に癌細胞特 有の広がりまたは転位を起こすことにある。癌が進行すると、複数部位で悪性の 成長が見られることが多い。このような広がりは、外科的手段による癌治療の成 功を困難にしたり妨げたりする。

癌に対する効果的な治療法の考案は容易なことではないので、癌の分子主成分を 理解し、正常細胞からそれを発現させることを目的とした研究はさらに強化され てきた。この研究によって、正常細胞を根幹として完全成熟した悪性細胞へと導 く生物学的事象を理解することができた。Ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２２２．７７１　（１９８３）は、細胞腫瘍遺伝子が癌の発現に関与す るという研究結果の要約である。さらに、分子レベルでの腫瘍遺伝子機能を理解 することを目的とした努力が引き続きなされている。活性化腫瘍遺伝子は、癌発 現の動物モデル構築に用いられる一方、癌の病因論を確立する役割を果たしてき た（Ｈａｎａｈａｎ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ−川、、　２２．４７９　（１９８８） ）　。この知識を基にして、活性化腫瘍遺伝子が明らかに癌治療時の治療的介入 に対するターゲットの典型であることが認識されるようになった（Ｈｕｂｅｒ、 　Ｆｅｄ、　Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｂｉ。

１、　、！、、　３．５　（１９８９））。例えば、Ｄｅｒｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｃｅ１ｌ。

４！、　６９５　（１９８５）は、単クローン抗体によって形質転換網すること が明らかになった。しかし、活性化腫瘍遺伝子が癌治療に対する潜在的な治療タ ーゲットに相当する一方、治療ターゲットとそれに対応する正常細胞との差異は 微少であることが明らかになりつつある。この微少な違いは、中毒性副作用を伴 わずに特異的かつ効果的な療法を開発することは、困難であることを示唆してい る。

悪性細胞と正常細胞とは本質的に類似しているが、悪性細胞のほうが、両細胞型 が共有するターゲットまたは活性に影響する治療法が原因となり幾分死滅しやす い。

それに代わる腫瘍特異治療の開発へのアプローチが提示されているが、これは代 謝的差異を人工的に悪性細胞に導入して、治療剤によって死滅しやすくするもの である（Ｍｏｏｌｔｅｎ、　Ｃａｎ、　Ｒｅｓ、、　４６．５２７６（１９８６ ））　、この概念は、モザイク戦略であり、将来癌になる可能性がある組織のモ ザイク型の予防生成が必要である（Ｍｏｏｌｔｅｎ９Ｍｅｄ。

賎り帥邦郡、　２４．４３　（１９８７））。この戦略の成功は、悪性細胞に薬 剤感受性を付与するか、または、正常細胞に薬剤耐性を付与する挿入遺伝子を保 持することで、正腫瘍細胞が正常細胞と異なることに依存している。モザイク作 成の目的は、正常細胞と悪性細胞に有意な代謝的差異を人工的に作成することで ある。

この差異は、効果的に悪性細胞を死滅させるための治療ターゲットとして役立ち 、正常細胞に対する毒性は最小限で済む。癌は、単一形質転換細胞が増殖して生 ずることが多いので、癌が既知の場合の細胞はすべて同一化ずなオ）ぢクローン 化する傾向がある（Ｆｉａｌｋｏｗ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐリ−ｙｓ、　Ａｃｔａ、　４５８．２８３．　（１９７６））。悪性腫 瘍の発現前に、薬剤感受性遺伝子がその細胞に挿入された場合、引き続く癌を伴 う細胞はすべて適切な治療剤に対して感受性になる。薬剤感受性遺伝子を受容し ていない対象中の細胞は薬剤に耐性となる。このため、モザイク戦略は、治療に 使用する導入細胞の予防的利用法であることは明形質導入細胞由来の悪性細胞生 成が、いまだに観察され−Ｃいないからである。ヘルペスウィルスチミジンキナ ーゼ（Ｔ　Ｋ）をは乳類の細胞に挿入すると、それらの細胞はヌクレオシド類似 体ガンシクロビル（Ｇ　ＣＶ）に感受性を示す。ＧＣＶ毒性は細胞内でＧＣＶを 代謝活性化するＴＫ遺伝子の酵素活性によって付与される（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　４５．２２７　（１９７９ ））　ｏ活性化したＧＣＶは、細胞に対して毒性があり、細胞を死滅させる。Ｔ Ｋ遺伝子だけでは、ＧＣＶがない細胞に対して致死的ではない。ＴＫ遺伝子を含 有するマウスの腫瘍細胞系は、マウス　ｉｎ　ｖｉｖｏの腫瘍を生ずることから 明らかになった。ＧＣＶがマウスに投与された場合は、腫瘍退縮が生じるが、Ｇ ＣＶを受容していない対照マウスは、癌か進行して死に至る。（Ｍｏｏｌｔｅｎ 、　Ｃａｎ、　Ｒｅｓ、　、　４６．５２７６　（１９８６））。その後のＴＫ 遺伝子を保持するレトロウィルスベクターを用いた実験で、ＴＫ酵素活性を組織 培養内の腫瘍細胞系に付与した。マウスの腫瘍の１つである肉腫は、↓ｒ（ｖｉ ｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでＧＣＶ療法に対して感受性を示すことがわかった （Ｍｏｏｌｔｅｎ　ａｎｄ　ｆｅｌｌｓ、　ＪＮａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ ５ｔ、、　８２．２９７　（１９９０））。これらの実験から、遺伝工学を利用 し癌の化学療法用のターゲットを作成することによって、ｉｎ　ｖｉｖｏで腫瘍 細胞を死滅させることができることがわかった。

しかし、このような実験の著者らが指摘するように（Ｍｏｏｌｔｅｎ、　Ｃａｎ 、　Ｒｅｓ、、　４６．５２７６　（１９８６）；　Ｍｏｏｌｔｅｎ、　Ｍｅｄ 、Ｈｏｔｈｅｓｉｓ、　２４．４３　（１９８７）；　Ｍｏｏｌｔｅｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　８２．２９７　（１９ ９０））　、モザイク戦略には多くの欠点があり、遺伝学的に細胞を処理するた めに既存の技術では被検者に使用することができない。レトロウィルスを使用す る遺伝子療法に関しては、ヒトの長命正常幹細胞に対する遺伝子転移が非能率的 であることに現在の限界がある（Ｅｇｌｉｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｕｎ、、　１５１．２０１　（１９８８））　、レトロウィル スベクターは、は乳類の細胞に外来性遺伝子を転移するための現在の使用法では 最も効率的な伝達体である（Ｅｌｉｇｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｉ　ｕｅｓ、　６．６０８　（１９８８））　。さらに、モザイク戦略で考察 したようにｉｎ　ｖｉｖｏで使用した場合のレトロウィルスに関しては、遺伝的 に処理した細胞を動物に導入後における挿入遺伝子のベクターの発現は限定され た一過性であることも現在の限界である（Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔ　ａｌ、、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、、５１ ，１０７３　（１９８６））。癌治療に対してモザイクモデルを首尾良く適用す るには、１０リリで挿入した遺伝子がより遅い時期、できれば数年後に引き続き 発現し、このときに腫瘍がモザイク組織から生じなければならない。さらに、モ ザイク戦略には、後に腫瘍を生じると考えられる幹細胞に比較的高率で効率良く 感染させなければならない。

幹細胞への感染が非効率であれば、遺伝工学的に処理した細胞由来の腫瘍が生じ る確立は低くなる。挿入遺伝子の長期１ｎｙ↓叉９遺伝子発現および被検者の細 胞への効率的広範囲の遺伝子伝達に対する現在の技術は、現段階では役立たない 。

モザイクモデルの別の不利な点には、健康な被検者への遺伝子療法に使用（７た ベクターに緊縮安全性が必要であること（Ｍ　ｏ　ｏ　１　ｔ　ｅ　ｎ　、　Ｍ Ｌ叫−力辿邪卦、　２４　、４３　（１９８７）　；Ａｎｓｅｒｓｏｎ、　５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２２６．４０１　（１９８４））や、幹細胞への遺伝子挿入が必 要であり、細胞がほとんど規定されず、遺伝的操作が困難なことである。こうし たことを考慮すると、Ｍｏｏｌｔｅｎらが、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　ＣａｎＣ，、、 ｅｒ、、　Ｉｎ５ｔ、、　８２．２９７（１９９０）で指摘（またように、近い 将来癌化学寮法にモザイク戦略は適用できない。

レトロウィルス媒介による遺伝子伝達に依存する癌治療法への別のアプローチは 、［Ｇｅｎｅ　ＴｈｅｒａｐｙＪと称する特許出願に記載されている（米国出願 番号０７／３６５．５６７゜ＮＴｌ５公報番号ＰＢ８９−２０６１５５）。この アプローチは、対象の癌と闘争する遺伝子工学的免疫細胞に対する標識または治 療的遺伝子を保持するレトロウィルスの使用を記載したしのである。この場合、 遺伝子工学的に処理した細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり、特定の癌 に対する細胞障害免疫応答の媒介となると考えられている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎ　１．　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１６．８８９　 （１９８７））。ＴＩＬは、被検者腫瘍から外植されて、ｊｎ　ｖｉ５印の組織 培養で育成される。組織培養で成長させた後、この細胞はレトロウィルスベクタ ーで形質導入されて、ベクター遺伝子を発現するそれらのＴＩＬのみが成長する ように選択された後、患者に再注入される。このアプローチは、ＴＩＬを被検者 に戻して遺伝工学的処理したＴ　Ｉ　Ｌを使用して腫瘍をターゲットにしたり、 または、ｉｎ　ｙ−ｉｖｏに腫瘍を戻したりすることが可能である一面を示す。

したがって、遺伝工学技術を使用して正常細胞に副作用を与えない薬剤を用いて 癌細胞母集団を破壊しやすくする効果的な癌治療法か必要である。

ｌ引へ■ 本発明は、癌細胞および正常細胞（すなわち「腫瘍」細胞または「悪性」細胞） および「正常」細胞）を含む細胞母集団から癌細胞を除去する方法を提供するも のであり、 （ａ）　非癌細胞と癌細胞の混合物を供給し、（１））　癌細胞を、外来細胞か ら成る形質導入癌細胞と接触させ、形質導入癌細胞に癌細胞または非癌細胞より も実質的に治療剤に対する感受性を付与しくＣ）　形質導入癌細胞を、特定量の 前記形質導入癌細胞を死滅させるのに効果的な特定量の治療剤に接触させて、効 果的に前記癌細胞の実質的部分を死滅させる一方、前記非癌細胞には実質的損傷 を与えない悪性細胞利用による癌治療方法である。

ｊｎ　ｖｉｔｒｏで行なう場合、本発明の方法を用いて組織培徨から癌細胞を除 去することができる。例えば、癌細胞を自家骨髄移植を受ける患者由来のヒト骨 髄から除去することができる。ただし、本発明の方法は、非常に苦しんでいる被 検者または被検動物における癌の寛解および切除あるいはいずれか一方をもたら すなどして、癌治療に利用することが好ましい。本発明の処理経過では、ヒトま たは動物の癌患者すなわち「被検体」の癌細胞の一部または母集団を外植して、 外来遺伝子すなわち所望の治療剤に感受性を有する遺伝工学的処理による細胞ま たは形質導入細胞の母集団を生ずる遺伝子を用いて形質転換することができる。

有用な形質転換方法には、外来遺伝子の形質導入、エレクトロポレーションまた はリポソームの組込みを含む。形質導入癌細胞は、被検体に再内植することかで きるか、腫瘍塊または隣接部に内植することが好ましい。選択的な方法として、 被検体の癌細胞ｔ１集団を１−ｇ５ｉυで形質転換して、直接投与によって外来 遺伝子を含む［裸のＪ　ＤＮＡまたはリポソーム被包性遺伝子に対し所望の感受 性を誘導することができる。

ここで用いたように、用語「形質導入」は、遺伝工学の技術によって、細胞の正 常遺伝補体またはゲノムに加えてまたはその代わりに少なくとも１つの遺伝子ま たは遺伝子断片を含むように、癌細胞を形質転換することを意味する。用語「外 来」は、癌細胞の形質転換に使用する遺伝子に関して用いたものであり、遺伝子 （または遺伝子断片）を、細菌またはウィルス、好ましくはレトロウィルスなど の、ターゲットまたは「親」癌細胞のゲノムとは異なる源から得ることを意味す る。また、「外来遺伝子」なる用語は、合成遺伝子または合成遺伝子断片をすべ て含む。外来遺伝子を、癌細胞内の、ＳＶ４０などの形質転換後の遺伝子の発現 を促進するプロモーターおよび任意にｎｅｏ、ｈｐｔ、またはａｐｈｌＩなどの 選択可能な標識遺伝子を含むプラスミドベクターまたはウィルスベクターで、最 も好ましくはレトロウィルスベクターなどのベクター上に挿入し、形質導入癌細 胞の同定および絶縁を促進することが好ましい。

驚くことに、形質導入癌細胞を被検体に導入した結果の「雑種癌」は、形質導入 癌細胞の少なくとも一部を死滅するのに効果的な特定量の治療剤を被検体に投与 することによって、除去されるかまたは軽減されることがわかっている。治療因 子は、生物活性的化学単位（薬物）であっても良いし、紫外線またはγ線照射な どの生物活性化学照射線であっても良い。十分な数の形質導入癌細胞の破壊で一 連の現象が始まり、そのうちある現象は被検体の免疫系が媒介し、被形質導入癌 細胞の少なくとも一部を破壊する。意外にも、形質導入癌細胞数が、被形質導入 癌細胞数を上回る必要もないし、等しくなることさえ必要ない。さらに、外来遺 伝子によって形質転換された癌細胞は、被検体等から除去すべき親癌細胞系統に 同一である必要はないが、同一のまたは異なる型の癌細胞の↓μｖｉｔｒｏ確立 系由来であっても良い。

薬剤等の治療因子に癌細胞感受性を付与するために好ましい遺伝子は、癌細胞の レトロウィルスベクター上に導入されるものでり、好ましくは単純ヘルペスウィ ルス１型のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）などのレトロウィルス遺伝子また は遺伝子断片であっても良い。この遺伝子の発現によって、形質導入癌細胞を、 抗ウイルスヌクレオシド類似体ガンシクロビルによって根治しやすくなる。形質 導入癌細胞に関してここに用いたように、［実質的に治療剤に対する感受性］が あるとは、その薬剤は、正常な非癌細胞を損傷せずに形質導入癌細胞（すなわち 直接癌細胞）を死滅させ、苦しんでいる被検体を生命の危機にさらすことなく測 定可能な癌の軽減が生じる程、治療指数（Ｔ１．。）が十分に高いことを意味す る。

約１０乃至２００−５００またはそれ以上のＴ１．。は、本発明を実施中に達成 することができる。

本発明は、ガンシクロビルを引用して例示してるが、別の抗ウイルスヌクレオシ ド類似体も当業者によって知られており、本発明に利用することができ、それに はビダラビン、アサイクロバー、ＡＺＴ、カルボビル、ｄｄＩ、ｄｄｅ、リバビ リンなどを含む。治療剤に関しこのクラスの代表的な化合物は、米国特許第４， ９３１，５５９号、第３，９１７，８３７号、第３，８１７，９８２号および第 ４，７２７，２３２号、ならびに欧州特許出願公告番号第３４９．２４２号、第 ２３６，９３５号、第３１１，１００号、第３１６，０１７号および第３６９， ４０９号に開示されている。非ヌクレオシド抗ウィルスも、本発明に使用できる 。本発明の方法によって、別の細胞障害性薬剤の既知のクラスの治療係数も増加 することができるので、効果的に癌細胞を除去するのに使用することができる。

これらの薬剤に関する考察は、米国特許第４．９３８．９４９号および第５，０ ３５，８７８号に見られる。

本発明は、サイトカインまたはリンホカインに対応する外来遺伝子を有する形質 導入癌細胞を利用することができる。サイトカイン遺伝子を有する形質導入癌細 胞を単独で、または、治療因子に対する癌細胞感受性を付与する外来遺伝子を有 する上述の形質導入癌細胞と組み合わせて使用することができる。薬剤感受性を 付与する外来遺伝子およびサイトカイン遺伝子を有する形質導入癌細胞を、選択 的に使用することもできる。形質導入癌細胞に組込むべき好ましいサイトカイン 遺伝子としては、インターロイキン１−　（Ｉ　Ｌ−１）　、ＩＬ−２、ＩＬ− ４、ＩＬ−５、αインターフェロン及びγインターフェロンなとが挙げられる。

Ｌノトロウイルス保持のＩ　Ｌ　−１を有する形質導入癌細胞の例に限り、ＩＩ Ｓ　Ｖ　−Ｔ　Ｋ遺伝子をイアする形質導入癌細胞とともに使用することができ る。これらの形質導入癌細胞の組合せを用いて、正常非癌細胞を損傷せずに、実 質的な量の形質導入癌細胞および非形質導入癌細胞を死滅させることができる。

サイトカイン遺伝子を、ＨＳ　Ｖ　−Ｔ　Ｋなどのレトロウィルス遺伝子または 遺伝子断片とともに形質導入細胞に導入することもでき、それによって、治療薬 剤感受性およびサイトカイン活性を示す形質導入癌細胞を供給し、癌細胞に対す る死滅力は増強する。

本発明の実践においては、（財）ｖｉｔｒｏで形質導入癌細胞の母集団を増殖す なわち拡大させてから、被検体にそれらを投与することが好ましい。ある場合に は、被検体から獲得のｅｘ　ｖｉｖｏ母集団を別の源由来の形質導入癌細胞で補 足することができる。「致死」量のγ線で形質導入癌細胞に照射することによっ て、母集団を治療剤として使用することはできるが、複製することはできない。

一般に、細胞型を問わず、選択遺伝子を挿入するために受容体として機能するこ とができる。これらの形質導入細胞は、Ｉ■すまたは劫ロ工凹で作用して、（１ ）腫瘍細胞または悪性細胞を標的にし、（２）治療剤または治療処理に感受性が ある細胞母集団を供給することかできる。被検体に投与した場合、形質導入細胞 は、非修飾腫瘍細胞母集団または耐性腫瘍細胞母集団および癌治療に対して感受 性がある形質導入細胞にする。本発明の別の態様は、癌に対して被検体を免疫処 置する方法において、（１）癌細胞の母集団に遺伝子を導入して、遺伝工学的に 処理した細胞母集団を生成し、（２）　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

で遺伝学的に処理した細胞母集団を拡大させ、（３）単位量の細胞母集団を被検 体に内植し、（４）内植１７た細胞母集団に対して毒性の薬剤を被検体に投与す ることによって、内植した細胞母集団および非修飾腫瘍または癌細胞を死滅させ る悪性細胞利用による癌治療法を提供する。

光ｍ叩良」１朋 本文において使用する用語の定義を以下に示す。「被検体」は、ヒトおよび動物 を意味する。「親細胞」は、被検体腫瘍細胞に一致し、直接被検体由来のまたは 組織培養で生育した細胞系由来の細胞源として機能するヒトおよび動物の細胞で ある。「親細胞」は、本質的に遺伝的及び表現型的にそこから生産された娘細胞 に一致し、例えば、両細胞は、（１）それらの細胞を死滅させる被検体の免役応 答や（２）旬■朋での娘細胞による親細胞の認識に関係する同一の細胞表面抗原 を含んでいることが挙げられる。「娘細胞」は、結果的に生ずる形質導入細胞に 治療剤に対する感受性を付与する遺伝子を挿入するために、遺伝子工学的に処理 した形質導入細胞をいう。娘細胞は、親細胞から由来し、挿入された遺伝子また は遺伝子断片を除いて、本質的遺伝的に親細胞と一致する。「担体細胞」は、形 質転換細胞系であるか非形質転換細胞系であるかを問わず、少なくとも１つの治 療剤に対して細胞に感受性を付与することができる１またはそれ以上の遺伝子を 含む。例えば、「担体細胞」は、それらが崩壊して親細胞のクラスが死に至る限 り４、「親細胞」から由来する必要はない。例えば、マウス線維肉腫細胞を使用 してマウスの乳癌細胞を死滅させたり、ヒト卵巣細胞系を使用してマウス線維肉 腫を治療することかできる。「雑種癌」または「雑種腫瘍」は、親細胞および娘 細胞または担体細胞の混合母集団から成る被検体の癌または腫瘍である。親細胞 および娘細胞または担体細胞は、必ずし、も同一被検体由来である必要はなく、 非常に多様な細胞系を使用して、娘細胞または担体細胞を生成することができる 。ｒｉｎｖｉμ」は、被検体内に存在するか又は生じる細胞または現象について 言及し、［知ｙｉｔｒｏＪは組織培養内に存在するかまたは生じる細胞または現 象について言及するものである。「感受性遺伝子」は、（１）直接、間接を問わ ず、そのような遺伝子を保持（−１発現する癌細胞に外因的に投与した治療剤に 感受性を付−′−３４−る遺伝子、（２）娘細胞または担体細胞および親細胞を 死滅させる被検体内の免疫応答を誘導または促進する遺伝子、または（３）娘細 胞または担体細胞および親細胞を死滅させやすくするあらゆる被検体内反応を誘 導する遺伝子、のことを意味する。

本発明は、雑種癌または雑種腫瘍を親細胞および娘細胞の混合物を動物宿主など の被検体内に内植することによって生成する場合に、それに続いて娘細胞に対し て毒性がある治療剤を投与することで親細胞および娘細胞または担体細胞を死滅 させるという所見に基づいている。

細胞か娘細胞のみの細胞母集団から成る場合について、この方法で被検体内で癌 細胞を死滅させることに関しては、Ｍｏｏｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、　Ｎａｔ ｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　８２．２９７（１９９０））において上述 したように明らかになっている。

ただし、適切な治療剤を雑種癌または雑種腫瘍を有する被検体に投与後、雑種癌 または雑種腫瘍を治療すると、被検体内の腫瘍または癌は完全に退縮するという 驚くべき所見もある。この所見では、治療的用途に関して適用された場合に、被 検体の正常非癌細胞に対する毒性が低い治療剤を使用することによってその被検 体の雑種癌細胞母集団を特異的に死滅させることができる。親細胞の死滅の原因 は、多少なりとも被検体に誘導した免疫応答によるものと考えられる。ただし、 被検体において親細胞を死滅させる付加的機構にも、親細胞死滅の原因があるこ とも考えられる。

親細胞死滅は、壊死またはアポブトシスに関係することか考えられる。壊死は、 細胞の膨潤、細胞膜崩壊、および核フロキュレーションによって特徴付けられる 。アポブトシスは、細胞縮化、膜小胞形成および染色質凝縮によって特徴付けら れる（Ｃｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、 　１０．１１５３　（１９９０））。親細胞の死滅は、ある程度アポブトシスに よる娘細胞または担体細胞の死に原因があり、検体が腫瘍に対１７て１免疫性」 を有することになる。

）Ｘ述したように、癌治療に用いるモザイク戦略は、遺伝子伝達および発現技術 に依存しているが、後に悪性になると考えられる正常細胞への遺伝子伝達に依存 するため、現在は実用的ではない（Ｍｏｏｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎ ａｔｌＣａｎｔ５ｅｒ−↓ｎ５ｔ−１８２，２９７（１９９０）；　Ｍｏｏｌｔ ｅｎ、　トし」ｎ爪ｊ＞ｃ；−ｐ−灸Ｌ２４．４３　（１９８７））。さまざま な病状に対する現在の遺伝子治療のアプローチは、リンパ球または上皮細胞なと の別の正常細胞への遺伝子挿入に依存している（Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 米国特許第４，８６８．１１６号）。本発明がこれらのアプローチと異なる点は 、悪性細胞を利用して挿入遺伝子を被検体内に伝達することにある。別の癌治療 法は、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　（米国特許第４，８７４．６０８号）によって述へら れているが、これは、薬剤を投与して悪性細胞に対する被検体の免役応答を促進 するものである。本発明においては、癌細胞を利用し７て悪性細胞に対する被検 体の反応の一環として免疫成分を有することができる　ｉｎ　ｖｉｖ。

反応を生じさせる。別の関連アプローチでは、遺伝子工学的に処理した細胞を投 与する以前に、治療プロトコルに基づき、癌細胞を正確に除去する（Ｒｏｓｅｎ ｂｅｒｇ　ｅｔ、ａｌ、。

−１μ−Ｅｎ　１．　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１６．８８９　（１９８７））。

従来の研究は、被検体の免疫化の効果は、使用される抗原の方に影響される。た だし、被検体の免疫化は、免疫化に用いる抗原が「標的」病原体に存在する未変 性抗原に類似している場合、最も効果的であることが一般に確認されている。本 発明では、生癌細胞は免疫源として機能して、癌細胞に対する特異的免役応答を 刺激する。

癌細胞は生きたものを使用しているが、０１９使用時には細胞分裂能力がないこ とが好ましい。非複製担体細胞は生きていると便利であり、致死照射によって得 ることができる。したがって、本文に述べる方法は、治療のために生の悪性細胞 を利用することによって、現在の癌治療に対するアプローチとは概念的に対向す る。また、本発明は、治療のため遺伝子工学的に処理した細胞または「形質導入 」細胞をに被検体に内植した直後に、現在利用できる遺伝子伝達技術を利用して 、遺伝子発現を促進する。このため、この方法は既存の遺伝子伝達および発現技 術に対する要求は比較的であるが、これは、被検体の細胞に挿入する遺伝子の発 現は、短時間すなわち適切な治療剤を投与して感受性娘細胞を死滅させるまでの 期間であり、このようにして治療法が開始される。

したがって、本発明は、造血細胞、中枢神経系細胞、肺細胞、胸部細胞、卵巣細 胞および肝細胞に関連する癌など広範囲にさまざまな動物またはヒトの癌治療に 利用することができる。治療しやすい特異的なヒトの癌は、結腸癌、卵巣癌、膵 臓癌、胃癌、神経芽腫、重層偏平上皮癌、線維肉腫、白血病などである。ここに 記載した遺伝工学的処理した娘細胞は、予め選択した薬剤療法または非薬剤療法 に非常に高い感受性を示すように意図されているので、被検体の娘細胞を死滅さ せるのに使用する薬剤治療または別の療法の経過を通じ、正常被検体細胞に対す る毒性は最小限である。

本発明の態様では、レトロウィルスベクターを使用して薬剤感受性を付与する遺 伝子を癌細胞母集団に伝達することが好ましい。ここにおいて好ましいベクター は、５ＴＫＳｐｌＴＬ、　ＬＡＳＮおよびＬＮＬと称されているものであり、Ｓ ＴＫベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）をコ ード化する遺伝子を大腸菌から輸送し、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）をヒト 単純ヘルペスウィルス１型から輸送する。他のウィルス源由来のＴＫ遺伝子をＳ ＴＫのＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の代わりに利用することも考えられる。Ｍｏｏｌｔｅ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ↓ｎｓｔ、、　８２．２ ９７　（１９９０））に記載されているように、Ｎｅ。

遺伝子はＬＴＲプロモーターによって発現され、ＴＫ遺伝子はＳＶ４０ウィルス 初期プロモータによって発現された。上述のように、ＴＫ遺伝子は、ＴＫタンパ ク質を発現するは乳類の細胞を抗ウイルスヌクレオシドガンシクロビル（ＧＣＶ ）　ニよって死滅しやすくする（Ｍｏｏｌｔｅｎ　ａｎｄ　Ｖｅｉｌｓ、　Ｊｊ ｊａｔｌ、　Ｃａｎシ猛−小止、　８２．２９７　（１９９０））。コツタめ、 このＳＴＫベクターは薬剤感受性遺伝子を悪性親細胞に伝達し１、悪性娘細胞ま たは悪性担体細胞を生成するよう機能した。Ｎｅｏ遺伝子を保持する細胞も、ネ オマイシン類似体Ｇ４１８による死滅に対して耐性であり、Ｇ４１８はＮｅｏタ ンパク質を発現しないは乳類細胞に対して毒性である。Ｎｅｏ遺伝子によって細 胞母集団の成長は可能であり、細胞を問わず、Ｇ４１８存在時に細胞を成長させ ることによってそのベクターを含み発現する。これは、ベクターを欠いた細胞す べてが、後続の試験が被検体内で実行される前に死滅したことを保証するもので ある。ＬＮＬベクターはＮｅｏ遺伝子のみを保持し、被検体に観察される効果は ベクター配列の存在またはｎｐｔの存在によらないことを示すための対照として 機能する。μＴＫベクターは、ＳＴＫベクターと同様であるが、ＴＫ遺伝子がヘ ルペスウィルスＴＫプロモーターによって発現される点が異なり、これは、Ｍｏ ｏｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、 　８２，２９７　（１９９０）に述べられている。

薬剤感受性を付与する遺伝子を有する形質導入癌細胞とともにサイトカイン遺伝 子を有する形質導入細胞を使用すると有用であることがわかった。また、遺伝子 感受性を付与する遺伝子とインターロイキン、インターフェロンなどのサイトカ イン遺伝子とを含むレトロウィルスを使用して、薬剤感受性とサイトカイン活性 を有する有用な形質導入癌細胞を生成できる。

親細胞へのベクター配列導入は、形質導入として知られる方法で達成することが できるが、これはＭｏｏｌｔｅｎ　ｅｔａｌ、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｉｎ−５ｔ、、　８２．２９７　（１９９０）で開示されている。形質導入は 、ＳＴＫベクターまたはＬＮＬ対照ベクターを含むさまざまな腫瘍細胞系を用い て実行された。このため、２つの異なる形質導入細胞系、すなわち】つはＴＫ　 （およびＮｅｏ）遺伝子とＮｅｏ遺伝子のみを保持する対照系とが、形質導入に よって各々の一次腫瘍細胞系から誘導された。結果として生じたＬＮＬ形質導入 細胞系（ＬＮＬ細胞）は、親細胞として使われ、結果として生したＳＴＫ形質導 入腫瘍細胞系（ＳＴＫ細胞）は娘細胞として使用した。同系マウスへのＬＮＬ細 胞、ＳＴＫ細胞またはＬＮＬ細胞とＳＴＫ細胞の混合物の注入後、ＧＣＶを投与 し、マウスにおける（　ＧＣＶによる）癌進行または停止の経過が追跡調査した 。９０％のＳＴＫ細胞と１０％のＬＮＬ細胞の混合物はＧＣＶ療法によってマウ スに効率良く抑制されたことかわかった。驚くことに、ＳＴＫ細胞とＬＮＬ細胞 とを各５０％ずつ含む混合物もＧＣＶ療法によってマウス内で死滅した。すべて の症例において、同−細胞型を受容したがＧＣＶで治療しなかった対照動物では 、腫瘍の形成および被検動物の死またはそのいずれかで評価されたように、癌が 進行した。ＧＣＶで治療した　１００％ＬＮＬ細胞から成る腫瘍を含む対照動物 も腫瘍は抑制されずに成長した。

さらに調査を実行して、通常ＧＣＶ耐性のＬＮＬ細胞の死滅の原因となる機構の 本質を決定した。免疫成分の存在によってＬＮＬ細胞が死滅することがわかった 。これは、マウスへのＳＴＫ細胞を内植し、ＧＣＶをＳＴＫが死滅するまで投与 することによって証明された。６乃至８週間後、さらにＳＴＫ細胞を同一マウス に内植し、ＧＣＶを投与せずに癌の進行を追跡調査した。試験動物の大半におい て癌の進行が起こらないことがゎがった。予めＳＴＫ細胞に対してＧＣＶを投与 しなかった対照動物では、予想通り腫瘍が成長した。免疫成分の存在は、亜致死 量（５００ｒａｄ）をマウスに照射して免疫応答を弱めた上で同様の実験を行な うことによって、さらに明らかになった。これらの動物をＳＴＫ細胞で攻撃した 後は、どの場合でもＧＣＶ投与後のＳＴＫ腫瘍を除去することができながった。

本発明の治療方法が成功するが否がは、少なくとも部分的には、（１）薬剤治療 で始まる腫瘍細胞死の機構と、（２）遺伝工学的に処理した腫瘍細胞の導入後の 宿主に誘導された免役応答と、にがかっている。上述のように、悪性細胞とそれ に対応する正常細胞とには、ごく少数の微細な差異しか存在しなくなる。娘細胞 または担体細胞に対する免役応答または物理的応答が始まると、親細胞も応答し やすくなる。（１）悪性細胞と正常細胞が緊密に類似している点と（２）本明細 書に開示した方法によって誘導される応答の効果という観点では、ヒトまたは動 物のまたは組織培養中の被検体細胞で悪性またはその他の疾患があるものは、本 発明の治療アプローチによって除去するための候補となる。例えば、病原性ヒト ウィルスに感染した細胞は、一般に感染細胞に標識をつける細胞表面抗原を１ま たはそれ以上発現する。これらの抗原は被検体のゲノムに対して外来であり、こ のため、本発明を使用して宿主に死滅応答を生じさせた後、細胞を死に至らせる 標識として機能する。ヒトの癌と度々結び付く抗原には癌胚抗原などがあり、悪 性細胞に挿入して娘細胞母集団を生産して、被検体に効果的な宿主反応を付与し て、親細胞および娘細胞を死滅させることができる。

免役応答の他、標的細胞死滅には他の機構が関連していることは明らかである。

組織培養におけるＬＮＬ５０％と５ＴＫ５０％との混合物は、ＧＣＶを培地に添 加した場合に死滅した。ＩＶｉ（イ）では混合細胞集団には免疫細胞が存在しな いのだ、非免疫成分も必要である。この機構はＧＣＶ治療によって誘導された細 胞の死に方にも関係があると考えられる。ＧＣＶに反応して死にががっている細 胞は、アポブトシスの過程で死ぬことがゎがった。アポブトシスの間、腫瘍細胞 はアポブトシス的小胞に分解する。この小胞は、親細胞によって摂取される。こ のため、ＴＫを発現している担体細胞はＣＣＶ暴露後に死に、ＴＫ酵素を含みか つ親細胞が摂取する食される小胞を生成すると考えられる。親細胞ないに摂取さ れると、ＴＫ酵素はＧＣＶを親腫瘍細胞に毒性がある形態に変換する。さらに、 娘細胞内の有意な量の毒性ＧＣＶ代謝はその後に親細胞を死滅させる一因となる 小胞となり、親細胞に転移される。

本発明の別な態様は、娘細胞をｉｎ　ｖｉｖｏの親細胞に回帰させることにある 。細胞介在反応は、娘細胞を攻撃してＧＣＶによって親細胞を除去した後、動物 の長期免疫化によると思われるが、ＧＣＶ投与投与口数日以内ＣＶによって娘腫 瘍細胞および親腫瘍細胞とが死滅するのは、腫瘍細胞に別の機構か関わっている からであることを示す。

ＧＣｖ治療後の急速な細胞死滅開始とともに、既知の細胞媒介反応が確立すると 考えられる以前に被検体内では腫瘍細胞死滅反応が起こった。親腫瘍細胞の死滅 は、娘細胞が回帰して親腫瘍細胞に滞留することが原因である。

これは、被検体への娘細胞の注入２４時間前に親細胞を注入することとＧＣＶ治 療の開始によって明らかになった。

親細胞および娘細胞を急速かつ再現可能に死滅させることによって、被検体は、 古典的な細胞媒介免疫が確立される以前にすべての細胞を死滅させることができ る。被検体による細胞死滅反応の正確な本質は分子レベルでは十分に理解されて いないが、被検体内の親細胞への娘細胞の回帰が関係すると思われる。悪性細胞 の転移または移動能力は、同一型の細胞が０桂（ト）および０旦９において相互 に集結あるいは成長する傾向による現象である。本発明の場合、娘細胞は被検体 に滞留する親細胞に移動することができ、ＧＣ■治療開始後、被検体によって親 細胞を急速に死滅させることができる。

娘細胞母集団を生成することができる方法を問わず、劫■Ｖにおいて所望の結果 を得ることができる。このような方法の使用は、適切な遺伝子を旬■９の腫瘍に 直接導入することが必要である。例えば、ウィルスベクターは　ｉｎ　ｖｉｖｏ 投与後投与針な腫瘍細胞に感染することができ、０用」で遺伝子操作するために 被検体から腫瘍細胞を外植する必要に迫られず、適切な娘細胞母集団を生成する ことができる。直接動■Ｖ遺伝子伝達を行なう方法は、Ｗｏｌｆらの、５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２４７．１４６５　（１９９０）に記載されており、ｉｎ　ｖｉｖｏ で十分な娘細胞母集団を、切用１９での遺伝子操作のために腫瘍細胞を外植する 必要なく、生成することができる。本発明の方法は、従来の癌治療法と並行して 用いて治療全体の効果を増大するこ次に、本発明を以下の詳細な例に関して説明 する。

縄Ｊ１増ｊ１検定。− ＷＥ旧マウス骨髄単球性腫瘍細胞系［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）番号ＴＩＢ　６８］は、ＢＡＬＢ／ Ｃ７ウス由来であるか、ＳＴＫベクターで形質導入した。形質導入に用いたウィ ルス株は、ＰＡ３１７またはｐｓｉ−２パツケージング細胞系由来の生産者細胞 系から誘導された。これらの細胞系は、組織培養で７０−９０％密集育成された 。新鮮な培地を加えた１６−２０時間後に、ウィルス株を単離した。ＷＥｌ系を ウィルス株内で８μｇ／ｍｌポリブレンで２４時間育成し、この時新鮮な媒質な いに細胞を置いた。２４時間後、形質導入細胞を、細胞型基づき２００−２００ ０μｇ／ｍｌ濃度のＧ４１ｇ　（ＧｅｎｅｔｉｃｉｎＳＧＩＢＣＯ社〕で選択し た。形質導入細胞を標準組織培地、胎児血清１０％びグルタミンを含むＤｕｂｌ ｅｃｃｏｓ　Ｍｏｄｉｆｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地で育成して、０　、８ｍｇ／ｍｌ のＧ４１８て補足し、ＳＴＫベクターを十分に保持し発現する細胞母集団を選択 した。Ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ且、　３３．１５３　（１９８３）か参 照となる。次に、生成細胞母集団ＷＥＨＩＭ−３ＴＫが組織培養のＧＣ■暴露に 対して感受性があるがを試験した。

形質導入ＷＥＨＩ−５ＴＫ細胞（ＩＸ　１０’）を３５ｍｍ組織培養平板に２４ 時間平板培養した後、Ｇｃｖに２４時間または７２時間暴露した。ＧＣＶ処置後 、３Ｈ−チミジン摂取量を測定することによって細胞を増殖検定した。この結果 は表１に示してあり、ＷＥ旧細胞はＧＣＶ暴露に感受性があり、対照ＷＥ旧細胞 は相対的に感受性がないことが明らかになった。結果は、ＧＣＶに暴露しなかっ た対照ＷＥ旧細胞と比較した細胞増殖を百分率で示した。

表づ、 ＧＣＶ濃度　増殖 細胞系　（μＭ）　（％） ２４時間　ＷＥＨＩ　Ｏ，００５１００暴露　０．０５　９５ ＷＥＨＩ−５ＴＫ　Ｏ，００５１００ ７２時間　ＷＥＨＩ　Ｏ，００５１００暴露　９０ ０．０５ ＷＥＨＩ−ＳＴＫ　Ｏ，００５１００ ０，０５８０ ５００，６ 性遣 Ｋｂａｌｂ−５ＴＫ細胞へのＧＣＶのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　性コロニー阻　１経堝 」良Ｉ３□ Ｋｂａｌｂマウス線維肉腫細胞系をＳＴＫベクターを用いて形質導入し、例１記 載の標準組織培養で育成し、ＳＴＫベクターを十分に保持し発現する細胞母集団 を選択した。

Ｋｂｌａｂ系自体は、ＢＡＬＢ／３Ｔ３クローンＡ３１細胞系（ＡＴＣＣ番号Ｃ ＣＬ　１６３）の形質転換腫瘍形成誘導体である。ＳＴＫベクター株をＹ２パッ ケージング系から得て、上述のように使用した。細胞５０００個を１０ｃｍ組織 培養皿に１８時間平板培養して、１μＭまたは１０μＭのＧＣＶを含むＤＭＥＭ に、時間を変えて暴露した。次に培地を除去し、培養板を無菌リン酸緩衝塩類溶 液で３回洗浄し、ＧＣＶを除去した後、ＧＣＶを含まない新鮮なりＥＭＥを添加 した。コロニー数を１４日後に数えた。その結果は表３に示され、Ｋｂａｌｂ− ５ＴＫ細胞系が半期間のＧＣＶ暴露によって死滅しゃすいことが明らかになった 。コロニーの最大数は、培養板１枚につき１５０個だった。ただし、１５０以上 のコロニーを含む板の場合には　１５０とみなして数えた。

Ｋｂａｌｂ−３ＴＫ：）　ｏニー数 Ｋｂａｌｂ−５ＴＫヒト結腸癌細胞とＨＣＴ−３ＴＫヒト結腸癌細胞へのｉｎ　 ｖｉｔｒｏ毒性。コロニー阻害検定。

２つの細胞系についてＧＣＶの感受性を試験した。ＨＣＴヒト結腸癌細胞をＡＣ ＴＴ　（ＣＣＬ　２２５）がら得て、例１のようにＳＴＫベクターで細胞系を形 質導入し、ＨＣＴ−３ＴＫ細胞系を得た。初日、２Ｘ　１０”個の細胞を表３に 示した濃度でＧＣＶを含む培地を使って６０ｍｍ板で平板培養した。この板を１ ０−１４日間３７℃で放置した後、染色した。コロニー数を数えて、結果を表３ に示した。１５０以上のコロニーを含む板は、１５０として数えた。ＴＫを発現 する細胞は、ＧＣＶおよびベクターを含まない対照細胞に敏感であるか、ＬＮＬ ベクターが耐性であった。

表１ １□系　ＧＣＶ濃　Ｍ　コロニー Ｋｂａｌｂ　０　１５０ ０．００５　１５０ ０．０５　１５０ Ｋｂａｌｂ−ＬＮＬ　Ｏ１５０ ０，００５１５０ ０，０５１５０ Ｋｂａｌｂ−５ＴＫ　０　１５０ ０．００５　１５０ ０．０５　８０ Ｋｂａｌｂ−μＴＫ　０　１５０ ＨＣＴ−５ＴＫ　０　１５０ Ｉ！、ｂ−ａｌｂｌｓＴＫ細胞−ｂ　、ｋ　Ｕ　、　Ｋｂａｌｂ−５ＴＫ細胞を 千１用するＧＣＶ巾Ｘ且ネトる　ｉ川−！（ハ）タカ（応□や一■−退縮検定。

１グループにつきＢＡＬＢ／ｃマウス４匹の４グループに対して、１マウスにつ き無菌塩類液に含んだ２×１０δ個の細胞を皮下注射（Ｓ、Ｃ，）　した。この 際、以下の細胞または細胞混合物を使用する。グループ１は、Ｋｂａｌｂ−５Ｔ Ｋ　；グループ２は、９０％のＫｂａｌｂ−３ＴＫおよび１０％のＫｂａｌｂ− ＬＮＬ　；グループ３は、Ｋｂａｌｂ−３ＴＫとＫｂａｌｂ−ＬＮＬを各５０％ ずっ；グループ４は、１００％のＫｂａｌｂ−ＬＮＬである。注射後最初の３日 間は、ＧＣＶを腹腔内に１日２回、ただし１回の投与量を１５０ｍｇ　ＧＣＶ／ ｋｇマウスで５日間投与した。注射部位の腫瘍の大きさは、細胞が動物に投与さ れた時間から０．３．９および１７７日目各グループの１動物から判断して決定 した。表４に示した結果は、３日目まではすべてのグループで腫瘍が成長したこ とを意味する。グループ１．２および３では、ＧＣＶ投与開始後、９日目の腫瘍 サイズは３日目と同じままであり、１７日までに完全に退縮した。グループ４の 腫瘍は、実験中抑制されずに成長し続けた。これらの結果は、細胞混合物からな る腫瘍をＧＣＶ耐性腫瘍細胞は明らかに死滅することがわかる。

表□千 注射後　腫瘍直径 １勺グー火−二−マ〉−−−−−−一−−−−−−−−」Ｖ雛−一一一−−−− −−−−−■−！ｎｍ）１　Ｑ　Ｑ １７　１４．２ 形　導入Ｋｂａｌｂ細胞母集団およびＥＭＴ６．８細胞母集馴順訓するＧＣＶ療 法に文・する　ｉｎ　ｖｉｖｏ反応　宿主の生存とＫｂａｌｂ−ＬＮＬ腫瘍また はＥＭＴ６　、影弛−隻−ヘの注入Ｋｂａｌｂ−５ＴＫｍ　Ｄ　Ｏ）檄旬・ ＥＭＴ６．８マウス乳癌細胞系をＡＴＣＣから得た。１グループがＢＡＬＢ／ｃ マウス６匹から成る６グループに、０日目に動物１体につき無菌塩類液に２Ｘ　 １０５形質導入腫瘍細胞を含、！：　Ｋｂａｌｂ−ＬＮＬを各５０％ずつであっ た。ＢＡＬＢ／Ｃ７ウス６匹から成る２　／Ｉ、　：　ｊ　４には、０日目に、 ２Ｘ１０’個のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞をｉ、ｐ注入し、その２４時間後にｌＸ ｌ０’個のＫｂａｌｂ−８ＴＫ細胞をｉｐ注入した。すべてのグループに対する 初回細胞注入後５日目に、（１日２回、１５０ｍｇ　ＧＣＶ／ｋｇｉｐ注入によ る）１日ＧＣＶ療法を実行した。グルー７１の動物には、０１目に、２Ｘ　１０ ’個のＥＭＴ６．８細胞をｉ、ｐ注入し、その後追跡調査した。グループ６の動 物には、ＯＢ　［］　ｉ、：　２　Ｘ　ＩＯ’１’ｌｌ　（７）　ＥＭＴ６．８ 細胞ヲ：、ｐ、ｔｉ与ｔ、、１ｆＥ３目に１×１０６個のＫｂａｌｂ−５ＴＫ細 胞を注入し、（１５０ｍｇ　ＧＣＶ注入を１１」２回行なう）　ＧＣＶ冶療治療 始した。その後生存動物を追跡調査した。結果は表５に示しおり（時間を超過し て生存した各グループの動物数）、（グループ３の）腫瘍細胞の混合細胞は、Ｇ ＶＣ療法によってｉｎ　ｖｉｖｏで死滅し、対照（グループ１）に比較して長時 間生存することかわかった。グループ４の６動物中５動物が実験期間３０Ｅ」を 超えて生存した。グループ４の結果から、適切な治療が開始された後、光圧腫瘍 近辺に導入された形質導入腫瘍細胞は、その光圧腫瘍細胞を退縮させることがわ かった。ここにおける結果も、腹腔腫瘍がＧＣＶ療法に反応することを示した。

これらの結果は、娘細胞は腹腔に親癌細胞が導入されてから、被検体動物に注入 されて、劫旦ｖにおいて親細胞へ移動するが親細胞を標的として死滅させてしま うことができた。この結果動物は長期７ぐ７ス６グループを使用し、腹膜に予め 注入したＫｂａｌｂ−ＬＮＬ由来の腫瘍に対するＫｂａｌｂ−３ＴＫ細胞の効果 を明らかにした。マウスには次のようにｐｉ注入した。−，７”二ズユ（対照、 ６動物）では、２Ｘ　１０’個のＫｂａｌｂ細胞を０日目に注入し、別の治療は 行なわなかった。グループ２（対照、４動物）では、２Ｘ　１０’個のＫｂａｌ ｂ−ＬＮＬ細胞を０日目に投与し、別の治療は行なわなかった。ｆ　ｔＩ、−Ｈ プ３（対照、１０動物）２Ｘ１０’個のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を０日目に注入 し、注入後５日目から１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇのｉ、ｐ、ｂ、ｉ、ｄを２５日間 投与した（合計ＧＣＶ　５当量）。グループ４（８動物）では、２Ｘ　１０’個 のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を０日目に注入し、ｌＸｌ０’個のＫｂａｌｂ−５Ｔ Ｋ細胞をｉｐ、注入し、９日目から　２５日間　１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇをｉ、 ｐ、ｂ、ｉ、ｄ、投与した。りｌを一二ブ１（８動物）では、２Ｘ　１０’個の Ｋｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を０日目に注入し、５日目にＩＸ　１０’個のＫｂａｌ ｂ−５ＴＫ細胞をｉ、ｐ。

注入し、９日目から　２．５日間１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇをｉ、ｐ、ｂ、ｉ、ｄ 。

投与した。グルー１６（１２動物）では、２Ｘ１０’個のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細 胞を０日目に注入し、１日目にＩＸ　１０７個のＫｂａｌｂ−５ＴＫ細胞をｉ、 ｐ注入し、５日目から２．５日間１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇをｉ、ｐ、ｂ、ｉ、ｄ 投与した。細胞注入後、グループ１．２または３では２１日まで生存する動物は 観察されず、治療効果は全くないまま一貫して癌は進行した。グループ６の動物 は、グループ２の平均生存日数が１９日未満であるのと比較すると、ｐ＜Ｑ、Ｑ ｌで平均生存日数は３１．６日だった。グループ４の生存率は、２６日目で５０ ％、４３日目で２５％だったが、グループ５の生存日数は、Ｋｂａｌｂ−ＬＮＬ 細胞細胞注入後３ロ 果から、光圧睡瘍は娘細胞の内植とＧＣＶ治療の実行とによって、退縮せさるを 得なくなったことがわかった。

各グループＤＢＡ／２マウス６匹、４グループ各々について０日目に２Ｘ１０’ 個の細胞をｉｐ．投与し、１日目（２４時間後）に（　１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇ をｉ．ｐ投与で）−日ＧＣＶ療法を開始し２、実験期間中継続１７た。２０５細 胞系は、ＤＢＡ／２マウスで生成されたメチルコラントレン誘導線維肉腫である 。２０５細胞系は、例１の処理に従って２０５−３ＴＫ細胞またはＬＮＬ　２０ ５細胞を生じるＩ−　Ｎ　Ｌベクター中のＳＴＫいずれかによって形質導入され た。各グループの動物の腫瘍サイズを、３、９および１５日目に測定した。マウ スへの注入は次の通りである。グループ１には、２Ｘ１０′１個のＬＮＬ細胞， グループ２には、ＬＮＬ　２０５細胞と　２０５−３ＴＫ細胞を５０％ずつ．グ ループ３には、９０％のＬＮＬ　２０５細胞（すなわち１．８Ｘ　１０’個の細 胞）および１０％の２０５−ＳＴＫ細胞（すなわち２ｘｌＯ’個の細胞）；グル ープ４には、２０５−３ＴＫ細胞を注入（７た。グループ２および４のすべての 動物に、１５日までに腫瘍退縮が起こった（１５日目には腫瘍は検出できなかっ た）。グループ３では、１５日までに動物５０％に腫瘍退縮か生した。グループ １では、すべての動物の腫瘍が成長し、１５日目までには少なくとも直径が７ｍ ｍにまで達した。これらの結果は、被検体の悪性細胞のごく一部しか遺伝子工学 的に適切な遺伝子で処理して、治療効率を上げるために好ましい娘細胞母集団を 生成する必要がなかったことを示す。

阿１ 」Ｌ■かにおける腫瘍細胞に対する生ず応答日の成分の証明，　ＧＣＶ１９　１ 率よる初期癌細胞の死滅後の腫鼻細胞への２　目の攻撃に対する動物の　化。

ＢＡＬＢ／ｅマウスから成る３グループを使用した。グループ１（８動物）には 、２Ｘ　１０’個のＫｂａｌｂ−８ＴＫをｓ．ｃ．注入し、他の治療はしなかっ た。グループ２（３動物）には、（１）２Ｘ１０４個のＫｂａｌｂ−５ＴＫ細胞 を８．Ｃ注入し、内植３日針ＣＣＶ療法（１日　１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇ，　ｉ ．１）、）を開始し、５日間続け、（２）ＧＣＶ療法療法中断６俊Ｋｂａｌｂ細 胞を注入した。グループ３（３動物）には、（１）２Ｘ１０’個のＫｂａｌｂ− ３ＴＫ細胞を５．Ｃ注入し、内植３日後にＣＣＶ療法（１日　１５０ｍｇＧＣＶ ／ｋｇ，　ｉ．ｐ．）を開始して５日間継続し、（２）ＧＣＶ療法療法中止８浚 のＫｂａｌｂ細胞をＳ．Ｃ注入した。細胞内植１２日後に動物の腫瘍サイズを測 定した。対照グループ１の８動物の平均腫瘍サイズは、直径６．１ｍｍだった。

グループ２の腫瘍サイズは、それぞれ直径４．９、０、Ｏ（すなわち２動物では 腫瘍を検出できなかった）。グループ３では、まったく腫瘍が検出できなかった 。これらの結果は、１ｎｖｉｖ。

初期腫瘍崩壊に関して免疫効果があったことを示す。有意外にだいするＴ検定を 使用（７た結果、この免疫性の結果は統計的に有意であることがわかった（　Ｐ −＜０．００１）。

２０５細胞系を使用し、実験を繰り返した。１日目、２８７’７７．１．：　Ｌ Ｘ　１０’個（７）　２０５−３ＴＫ　（１００％）細胞または２０５−５ＴＫ 　（５０％）細胞および２０５　（５０％）細胞から成る母集団を注入し、ＧＣ Ｖ療法を同日開始して、５日間継続した。

４３日間にｌＸｌ０’個の２０５腫瘍細胞を皮下注射した。注入１２目後、２８ マウス中１３マウスからは腫瘍が検出できなかった。

ｆＬ旦 を−ト神経芽腫ｍ胞系を使用するＧＣＶ療法へのｉｎ　ｖｉｖ。

（ｌ−０廻１遍ｌ１棟−寅。

ヒト神経芽腫細胞系、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ　１０）をＳＴＫベ クターで形質導入し、Ｇ４１８を含む培地で育成し、ＳＫＮＭＣ−５ＴＫ細胞系 を生成した。ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹に対して１．５Ｘ　１０６個のＳＫＮＭＣ −８ＴＫ細胞をｓｃ、注入し、そのうち２匹にＧＣＶ療法（１日　１５０ｍｇＧ ＣＶ／ｋｇ、　ｉ、ｐ注入）を翌日開始した（１日目）。残りのマウスには、Ｇ ＣＶ治療はしなかった。６日目に、各動物の腫瘍サイズを測定した。

ＧＣＶ冶療治療ない対照動物の腫瘍直径は６．５ｍｍたった。

ＧＣＶ療法を行なった２動物からは腫瘍が検出できなかった。この結果、ＴＫベ クターはＴＫベクターは　ｉｎ　ｖｉｖｏのヒト腫瘍細胞にＴＫ遺伝子を十分有 効に発現するので、ＧＣＶ療法か効果的になることが明らかになった。この実験 ては、ヒト腫瘍細胞はｉｎ　ｖｉｖｏの被検体によって死滅しゃすいこともわか った。ヒトの細胞がこの治療方法に反応するという観察結果は、別の種（ヒト） 由来の癌は、開示した方法によって治療しやすいことを示す。

例１０ 親細胞を死滅させる混合物中の娘細胞、腹　ｐ’ｌｌ玉おける腫　阻　検寡。

上述の例４に述べたように、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＫｂａｌｂ細胞母集団、Ｋｂ ａｌｂ−ＬＮＬ細胞母集団またはＫｂａｌｂ−５ＴＫを注入した。この動物グル ープには、以下の細胞から成る細胞母集団を注入した。グループ１（５動物、２ Ｘ　１０’個、非ＧＣＶ処置）はＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞；グループ２（９動物 、２Ｘ　１０’個、１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇＳｉ、ｐ、、ｂ、ｉ、ｄ、、開始後 ５日目７’４（１２動物、２Ｘ　１０’個、１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇ、　ｉ、ｐ 、、ｉ、ｂ、ｄ、。

開始後５日目より　２５日間）はＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞；グルーズｊ（１２動 物、２Ｘ　１０’個、１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇ、　ｉ、ｐ、、ｉ、ｂ、ｄ、、開 始後５日目より　２５日間）は、５０％のＫｂａｌｂ−３ＴＫ細胞５０％のＫｂ ａｌｂ−ＬＮＬ細胞、であった。グループ１．２および３のすべての動物の平均 生存日数は２０日未満で、２１日以−ト生存する動物はなかった。グループ４お よび５の動物の平均生存日数は３０日以上で、５８日の生存率はグループ５では 　１００％だった。８０日間のグループ４の生存率は８３％であり、グループ５ では６６％だった。グループ５の結果から、親細胞を含む腫瘍内に存在すること かでき、効果的な抗腫瘍応答を生ずることがあきらかになった。

初日、Ｂａ１ｂ／ｃマウスに５Ｘ　１０’個のＫｂａｌｂ腫瘍細胞を注入した。

１．２および３日目に、マウスに血清と混合させたＤＭＥＭにＬＮＬ株またはＳ ＴＫ株を含ませたものをｉ、ｐ注入した（１回注入量４．０ｍｌ、各ウィルス力 価は約ｌＸｌ０’ｃｆｕ／ｍｌ）。３グループを追跡調査した。開始後５日目か ら２５日間、グループ１にＬＮＬベクターを投与し、ＧＣｖ療法を行なった（　 １５０ｍｇ／ｋｇ　ｂ、ｉ、ｄ、）。グループ２にはＳＴＫヘクターを投与した かＧＣＶ療法は行なわなかった。

グループ３には、開始５日後から　２，５日間ＳＴＫベクターを投与してＧＣＶ 療法を行なった。グループ２では、投与後１８目まで生存せず、グループ１では ２６日まで生存しなかった。３５日目のグループ３の生存率は２５％だった。こ への遺伝子伝達後に延命することがわかった。

例−Ｌλ Ｅ　）−郡津ｍ　ｍ　Ｉｔ’、、３系使用−ｐＧＣＶ療法に対する　ｉｎ　ｖｉ ｖｏ応＠、ｉ　ｖｉｖｏにおけるＢ　＊　１（ｆｌ　”ＩＩ　兼”＆。

Ｂａ１ｂ／ｃマウスから成る２グループにｉｐ投与した。一方のグループには、 初日に２Ｘ　１０’個のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を投与し、１日目！１Ｘ１０６ 個）ＳＫＯＶ−３ＴＫ細胞をｉ、ｐ、投与したが、他の治療はしなかった。もう 一方のグループには初日に２Ｘ１０’個のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を、２日目に ２Ｘ　１０’個ノ５ＫＯＶ−８ＴＫ細胞をｉ、ｐ、投与した後、開始４日後がら ２．５日間　１５０ｍｇＧＣＶ／ｋｇ　（５当量）　ｉ、ｐ、ｂ、ｉ、ｄ注入し た。上述のように、５ＫＯＶ−８ＴＫ細胞系は、ＳＴＬベクターを用いて、（Ａ ＴＣＣから得た）ヒト卵巣腺癌細胞系５Ｋ−ＯＶ−３の感染によって得られた。

グループ１の動物の生存率は、２０日間で５０％、２５日目で０％だった。グル ープ２の生存率は、２０日間で　１００％、２５日目と５５日目で７５％だった 。この結果、親腫瘍母集団および種が異なる細胞系由来の腫瘍担体細胞母集団に よって、ＧＣＶＣ性療法後腫瘍細胞を死滅させることができたことが明らかにな った。ヒト卵巣癌細胞系を使用して得られた結果から、親腫瘍細胞が異なる腫瘍 由来の細胞は、予想外のことではあるが１ｎｖｉｖ。

における腫瘍死滅応答を付与することができたことが示された。この例ではヒト 腫瘍細胞系を使用することで、本方法が臨床的に適応できることがあきらかにな った。

例１３ 細胞系混合物を利用するＧＣＶ療法に文・するｉｌ　ｖｉｔｒｏ応答。ＧＣＶ感 受性細胞によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＧＣＶ耐性細胞の死滅。

細胞混合試験によって、組織培養内の娘細胞によって親細胞が死滅することが明 らかになった。Ｋｂａｌｂ−８ＴＫおよびＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞からなる５種 類の混合物を１０ｃｍ組織培養板培養板培養し、１０μＭのＧＣＶでの治療を細 胞を平板培養せた時点（処置１）か、細胞が密集した時点（処置２．３）で行な い、１４日間放置した。ＧＣＶ治療１４後、培養板を染色しコロニー数を数えた 。細胞混合物の構成は次の通りである。すなわち、混合物１は　１００％Ｋｂａ ｌｂ−ＬＮＬ細胞から成り、ｉｔ１ｍ’；ｔは１０％のＫｂａｌｂ−５ＴＫ細胞 おＫｂａｌｂ−５ＴＫ細胞および５０％のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞から成り、μ ｍ合−物−膚は９０％のＫｂａｌｂ−３ＴＫ細胞および１０％のＫｂａｌｂ−Ｌ ＮＬ細胞から成り、混−Ｉ−ラ−は１００％のＫｂａｌｂ−５ＴＫ細胞から成る 。得られた結果は表６に示してあり、１０ｃｍ培養板当たりのコロニー数を記し た。

表準 逃げ１　処置２ 平板培養　細胞密集時に 細胞混合物　時点でＧＣＶ添加　ＧＣＶ添加Ｉ　ＴＮＴＣ＊　ＴＮＴＣＴＮＴＣ ＴＮＴＣ２ＴＮＴＣ１２０００ ３ＴＮＴＣ４００ ＊　ＴＮＴＣは、多すぎて数えられないことを意味する（培養板肉たり　１５０ コロニ一以上） この結果から、密集細胞のほうが、ブレーティング密度が低い場合よりも死滅効 果が高いことがわかった。混合物２から得られた結果は、少数でさえ娘細胞がご く近い位置にある場合は、親細胞を死滅させる相対的に効果が高い機構が存在す ることを示す。劫■における条件も、細胞が互いに隣接している処置２の状態に ほぼ同様と考えられる。組織培養中のＫｂａｌｂ−５ＴＫ細胞をＧＣＶ処置する ことでＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を死滅させた結果、免疫応答に加えて、ある機構 が親細胞死滅を示す（財）■Ｖの観察結果の要因となり得たことがわかった。

同様の実験を行ない、ＨＣＴ細胞またはＨＣＴ−８ＴＫ細胞と混合させたＫｂａ ｌｂ−ＬＮＬ細胞を致死照射（３０００ｒａｄｓ）　Ｉ、た腫瘍担体細胞源とし て使用した。Ｋｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞とＨＣＴ細胞、または、Ｋｂａｌｂ−ＬＮ Ｌ細胞と　ＨＣＴ−３ＴＫ細胞から成る総計２Ｘ１０’個の細胞を１０ｃｍ板で 平板培養した。ＨＣＴ細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ２２５）から得た。）ＩＣＴ細 胞およびＨＣＴ−５ＴＫ細胞を移植に先立って照射した。０．１０．５０．９０ および９９％のＨＣＴ細胞とＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞の混合物によって、それぞ れの平板に１５０を超えるコロニーが生じた。同様の一連のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ 細胞とＨＣＴ−８ＴＫ細胞の混合物をＧＣＶで平板培養した。１００％のＫｂａ ｌｂ−ＬＮＬ母集団では、平板当たり　２００を超えるコロニーを有した。１０ ％のＨＣＴ−３ＴＫから成る母集団には、平板につき２５細胞があり、５０％の 母集団では平板当たりのコロニー数は４であった。９０％または９９％ＨＣＴ− ５ＴＫ細胞から成る母集団にはコロニーは存在しなかった。致死照射した担体細 胞とＴＫ遺伝子の発現１０匹のＢａ１ｂ／ｃマウスから成る２グループをｉｐ注 入した。初日、グループ１には２Ｘ　１０’個のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を注入 し、１日目および２日目に、５Ｘ　１０’個のＫｂａｌｂ−５ＴＫ細胞（注入直 前に３０００ｒａｄｓでγ線致死照射したもの）を１ｐ注入し、３日目からはＧ ＣＶ療法を施した（２５日間１５０ｍｇ／ｋｇ、　ｉ、ｐ、ｂ、ｉ、ｄ、）　、 グループ２に、初日２Ｘ　１０’個のＫｂａｌｂ−ＬＮＬ細胞を注入し、１日目 に５Ｘ１０’個の細胞（注入直前に３０００ｒａｄｓでγ線致死照射したもの） をｉｐ。

注入し、２日目にも注入してから、３日目からＧＣＶ療法を施した（２．５日間 １５０ｍｇ／ｋｇ、　ｉ、ｐ、ｂ、ｉ、ｄ、）　、対照グループ２にはＫｂａｌ ｂ−３ＴＫ細胞を全く投与しなかった結果、２０日目の生存率は２０％、２１日 目には１０％、２４日目には０％であった。グループ１の動物の生存率は、２５ 日目は１００％、４０日目は３０％、４３日目は１０％、６８日目は０％であっ た。　ｉｎ　ｖｆｖｏにおいてＧＣＶを使用し致死照射した娘細胞の処置によっ て、親細胞を保持する動物は延命した。

組織培養試験を実行し、致死照射したＫｂａｌｂ−８ＴＫ細胞およびＫｂａｌｂ −ＬＮＬ細胞（３０００ｒａｄｓのγ線照射）に対するＧＣＶの毒性を測定した 。細胞を照射し、亜密集状態で平板培養し、ブレーティング後さまざまな時間に １０μＭのＧＣＶよ暴露した。照射後成長するコロニーは全く観察されないこと から、３０００ｒａｄｓの放射量は実際に致死量だった。ブレーティング後、０ ．２．４および６日目にＧＣＶに暴露したＫｂａｌｂ−ＬＮＬは、残存しており 、ブレーティング後２８日にもごく少数だが付着していた。細胞は生きていたが 分裂能力はなかった。ブレーティング後初日（すなわち細胞の平板培養と同時に ＧＣＶを添加して）、ＧＣＶに暴露したＫｂａｌｂ−８ＴＫ細胞は、ブレーティ ング後７日までにすべて死滅した。平板に残存し付着していたものは認められな かった。ブレーティング後２．４および６日後にＧＣＶに暴露したＫｂａｌｂ− ＳＴＫ細胞は、ブレーティング後１４口重に残存し平板に付着していたが、２８ 日目に平板に付着していた細胞は観察されなかった。この結果は、致死照射した Ｋｂａｌｂ−５ＴＫ細胞はＧＣＶによる死滅に対して感受性があり、特に照射直 後にＧｃｖに暴露した場合に死滅しやすかった。この結果から、Ｋｂａｌｂ−３ ＴＫに対する照射後のＤＮＡ合成および修復とＧＣＶ毒性が関連していると考え られる。

Ｋｂａｌｂ腫瘍細胞およびＫｂａｌｂ−ＳＴＫ腫瘍細胞を個別に平板培養し、Ｇ ＣＶに暴露した。数日にわたって時間を変えて形態学的に調査した。光学顕微鏡 による調査の結果、Ｋｂａｌｂ−３ＴＫ細胞死は、アポブトシスによって生じる ことがわかった。Ｋｂａｌｂ−５ＴＫ細胞は、顕著な細胞縮化、小胞形成および 核染色質凝縮によって特徴付けられ、これらすべてがアポブトシスの兆候を示す ものである（Ｃｏｔｔｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、 　１０．１１５３．　（１９９０）。Ｋｂａｌｂ細胞は、検出可能な形態学的変 化を示さず、ＧＣＶでは死滅しなかった。さらに分析した結果、死んだまたは瀕 死のＫｂａｌｂ−８ＴＫ細胞が組織培養板から解離し、ＧＣＶ中でこれらの細胞 を含む組織培地を健康Ｋｂａｌｂ細胞を含む板に移動させた時、Ｋｂａｌｂ細胞 のほとんどが死んだことがわかった。アポブトシスによる瀕死の細胞存在中にＫ ｂａｌｂ細胞の死滅かＧＣＶによって誘導されたことは、毒性代謝産物、恐らく はリン酸化ＧＣＶが、Ｋｂａｌｂ細胞に対する毒性の原因であったことを示すも のである。Ｋｂａｌｂ細胞はＫｂａｌｂ−３ＴＫ細胞から直接、間接を問わずま たはどちらがでＫｂａｌｂ−３ＴＫ細胞を得たが、これは死細胞由来のアポブト シス体を摂取することによると考えられる。Ｋｂａｌｂ細胞は既知の免疫応答を 問わず媒介にならないので、この細胞死滅のメカニズムの発動には、いかなる免 疫応答も関与しない。腫瘍細胞は、ＧＣＶ療法（例８）をまったく使用せずにｉ ｎ　ｖｉｖｏ死滅するので、この方法では複数の腫瘍細胞死滅メカニズムが生じ る。

性上ｊ ＨＳＶ−ＴＫ修飾卵巣腫瘍細胞の■Ｐ（および′　のガンシクロビル療法を伴二 Σ劉」呵」二阻）（蘭工例１１の遺伝子修飾腫瘍細胞の最大耐量（ＭＴＤ）　（ 用量当たり細胞ＩＸ　１０”個まで）を測定することができる。

初日、４例に対して３Ｘ　１０’個のＩ（ＳＶ−ＴＫ陽性の照射腫瘍細胞をｉｐ に初回投与した。ｉ、ｐ、注入の約２４時間後から、７日間ガンシクロビル療法 を施す。ガンシクロビル療法２週間後、処置の副作用および病状を再評価する。

有害な毒性が上述のｉｐ腫瘍注入およびガンシクロビル療法から生じず、化学療 法が必要と考えられる腫瘍が進行している証拠が明らかにない場合には、その患 者には次回投与をするのが適当と考える。この計画を、グループ１に対する投与 量をＩＸ　１０’個から３Ｘ　１０”個に代えて継続するた。グループ１で療法 中止後も有害な副作用がないと保証できる場合には、グループ２の１回投与量濃 度を高くする、このパターンをグループ４まで続ける。患者が副作用以外の理由 で脱落した場合には、別の患者をそのグループに加えて、そのグループに対する 最低投与量がら療法を開始する。

各周期の最初の８日間は、患者を入院させる。ワクチンを１日目に投与し、ガン シクロビルを２−８日目に投すする。この処置を３週間間隔で合計３周期続ける 。この治療終了後、患者を定期的に調査し、進行があるがどうかを確認し、進行 が認められるまで続ける。

）−７−＋　＞　ｂよび投与。試験の開始にあたって、以下に示す４つの治療計 画の１つに患者を割り当てる。グレード１１以上のレベルの毒性が生じなければ 、各治療の投与量を増やす。グレード１■の毒性（好中球減少症または血小板減 少症を除く）に対して、投与を繰り返すが、全体的な毒性を考慮した場合に、医 師の判断で投与量を下げることはできる。グレードＩＩＩまたはＩＶの毒性に対 しては、投与レベルを１つ下げる ｌ　蒐」」Ｌ比３　募堅」旧え与　乳］」旧え与１４　３Ｘ　１０’　ＩＸ　１ ０”　３Ｘ　１０”５−８　１Ｘ　１０’　３Ｘ　１０’　ＬＸ　１０’９−１ ２　３Ｘ　１０’　ＩＸ　１０”　３Ｘ　１０”１３−１６　ｌｘ　１０’　３ ｘ　１０’　ｌｘ　１０”ワクチンを１０００ｃｃの標準塩類液で調整し、小径 腹腔カテーテルを治療日に挿入して投与し、注入１時間後に取り外す。技師によ ってカテーテルの位置および注入液の拡散について流量試験を行なった後、ワク チンを投与する。

ガンシクロビルは、ヌクレオシド類似体であり、サイトメガロウィルス感染治療 用の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）認可薬剤である。ガンシクロビルは、腎臓で排 出されて、クレアチニンクリアランス試験が前処理試験として必要である。無菌 粉末として供給され、無菌水で再構成される。毒性ＩＶに対する投与では、１０ ０ｃｃの標準塩類液か、５％のぶどう糖と水で調整し、１時間がけて注入する。

患者のクレアチニンクリアランスが８０を超える場合には、ガンシクロビルの標 準投与量は５ｍｇ／ｋｇ　ｂ、ｉ、ｄ、である。治療中は、毎日ＣＢＣおよび血 小板数を数える。絶対顆粒球数が７５０未満になるが、血小板が５０，０００未 満になった場合には、投薬を中止することが望ましい。

例１７ サイトメガロを発現する細胞、およびＨＳＶ−ＴＫ遺云の組合せによるラット脳 腫　のｉｎ　ｖｉｖｏにおける死滅。

細胞混合試験を使用し、ラットの脳の神経膠腫細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおける死 滅を明らかにした。Ｃ６と称するラット神経膠腫細胞を実験に使用した。このＣ ６ラット細胞系はＡＴＣＣ（７）カタログは＃ＣＣＬ１０７から得た。５Ｘ　１ ０’個（７）Ｃ６細胞を以下のように頭蓋骨内接種（前頭葉）した。グルーブ１ ：０６細胞のみ、グループ２　：　Ｈ３Ｖ−ＴＫ遺伝子を発現する照射Ｃ６神経 膠腫細胞（Ｃ６−３ＴＫ）の５％混合物（４，７５Ｘ１０４個（７）ＣＧ＋　２ ．５Ｘ　１０”個（７）Ｃ６−３ＴＫ）　、グループ３　：　ＩＬ−１サイトカ インを産生する照射ｋｂａｌｂ−ＩＬ−１細胞（５Ｘ　１０’）の混合物、グル ープ４　：　４．ＯＸ　１０”個（７）　Ｃ６−５ＴＫと５Ｘ　１０’個のｋｂ ａｌｂ−ＩＬ−１゜ＩＬ−１ｃＤＮＡ遺伝子をベックマン社から入手し、Ｂａｍ 旧制限部位でｐＰＢＮＣレトロウィルスベクターにサブクローニングした。ｐＢ ＮＣベクターは、ＬＴＲ促進ネオマイシン耐性遺伝子およびＩＬ−１遺伝子促進 に使用するＣＭＶプロモーターとを含む。ウィルス株を使用して細胞系を形質導 入した。これらの処置すべてを標準方法を使用し実行した。各グループは３動物 から成る。腫瘍接種直後に開始し、各グループにガンシクロビル療法（１日２回 、６０ｍｇ／ｋｇ）を６日間続けた。

Ｃ６１１１腫　ｋｂａｌｂ−ＩＬ−Ｉ　Ｃ６−８ＴＫ　腫瘍グループ　（５ｘｌ Ｏ’）　（５ｘｌＯ’＊）　（２，５ｘｌＯ”＊＊）　ＧＣＶ　形成＊　１０， ０００ｒａｄｓで照射 ＊　＊　３，０ＯＯｒａｄｓで照射 ラットを腫瘍接種倹約３週間口に犠牲にし、脳を取り出した。６脳をＣ６腫瘍の 成長に関して評価した。グループ１．２および３は、腫瘍接種部位に腫瘍が形成 されていることが明らかになった。グループ２の結果は、Ｈ３Ｖ−ＴＫ陽性細胞 およびＨ５Ｖ−ＴＫ陰性細胞の５％混合物は、腫瘍を根治するのに十分なＨＳ　 Ｖ　−Ｔ　Ｋ陽性細胞を含まないことを示唆する。グループ４の動物の腫瘍は根 治したことがわかり、Ｈ３Ｖ−ＴＫを発現する腫瘍細胞とサイトカイン遺伝子の 組合せを投与すると効果が強力になることが明らかになった。ＩＬ−１分泌細胞 の単独投与では、腫瘍塊に効果があり、サイトカイン分泌細胞はＨ５Ｖ−ＴＫ遺 伝子に関して見られるような「パイスタンダー効果」を提示することができるこ とを示唆する。

本文中に引用した特許および出版物は、本文中の参照に採用しである。上述の例 は、本発明の範囲および精神に反することなく、好転可能な病状ならびに遺伝子 伝達方法および使用する遺伝子ベクターに関して変更することができることは理 解されよう。本発明の態様の多くはその範囲内で可能であるので、添付した請求 の範囲に定義した以外は、本発明がその特定の態様に限定されないとみなすこと ができる。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｄ　４７３／１８ 　８４１５−４ＣＣ１２Ｎ　５／１０ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１９ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＣＡ、 ＦＩ、ＪＰ、　Ｎｏ（７２）発明者　マキューリ、フレイブ・ニスアメリカ合衆 国　１４５３４　ニューヨーク、ビッツフォード、ロング・メドウ・サークル５ １ ＦＩ （７２）発明者　ムールテン、フレデリック・エルアメリカ合衆国　０２１６５ 　マサチューセッツ、ウェスト・ニュートン、トラン・アヴエニュ　２０ （７２）発明者　ケプリン、デイヴイッドアメリカ合衆国　９００３４　カリフ ォルニア、ロサンジェルス、メントン・アヴエニュ３７４２、ナンバー１９

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．癌細胞および非癌細胞から成る細胞母集団から癌細胞を除去するための悪性 細胞使用による癌治療方法において、 （ａ）非癌細胞および癌細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ混合物を供給し、 （ｂ）細胞混合物と外来遺伝子を含む形質導入癌細胞母集団とを接触させて、実 質的に癌細胞または非癌細胞よりも治療剤に対する感受性を高め、（ｃ）形質導 入癌細胞母集団と特定量の前記形質導入癌細胞死滅に効果的な特定量の前記治療 剤とを接触させて、実質量の前記癌細胞を効果的に死滅させる一方、前記非癌細 胞を実質的に損傷させない ことを特徴とする悪性細胞使用による癌治療方法。
2. ２．前記癌細胞混合物を外来サイトカイン遺伝子を含む形質導入癌細胞母集団に も接触させることを特徴とする請求の範囲第１項記載の悪性細胞使用による癌治 療方法。
3. ３．前記細胞混合物を組織培養に供給することを特徴とする請求の範囲第１項記 載の悪性細胞使用による癌治療方法。
4. ４．前記細胞混合物が培養骨髄細胞を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記 載の悪性細胞使用による癌治療方法。
5. ５．前記細胞混合物がｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養腫瘍細胞系由来であることを特徴と する請求の範囲第１項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
6. ６．前記細胞混合物が造血細胞、中枢神経系細胞、肺細胞、胸細胞、卵巣細胞お よび肝細胞からなるグループから選出したヒト細胞であることを特徴とする請求 の範囲第１項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
7. ７．前記癌細胞がヒト黒色腫、ヒト卵細胞癌、ヒト神経芽腫、ヒト重層偏平上皮 癌、ヒト線維肉腫およびヒト白血病に関連することを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
8. ８．前記外来細胞がヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子である ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
9. ９．前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ　ＴＫ）である ことを特徴とする請求の範囲第８項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
10. １０．ステップ（ｂ）以前に、癌細胞母集団を外来遺伝子を含むベクターでｉｎ 　ｖｉｔｒｏで形質転換し、形質導入癌細胞母集団を生成することを特徴とする 請求の範囲第１項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
11. １１．前記癌細胞母集団をヒトから外植し、外来遺伝子を前記外植癌細胞の少な くとも複数に挿入し、形質導入癌細胞母集団を生成することを特徴とする請求の 範囲第１０項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
12. １２．前記外来遺伝子がレトロウイルスべくたーによって輸送されることを特徴 とする請求の範囲第１０項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
13. １３．前記外来遺伝子がＳＴＫレトロウイルスによって輸送されることを特徴と する請求の範囲第１０項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
14. １４．前記レトロウイルスベクターがさらに外来サイトカイン遺伝子を含むこと を特徴とする請求の範囲第１２項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
15. １５．前記癌細胞母集団をトランスフェクション、エロクトロポレーション、ま たは、遺伝子のリポソーム伝達によって形質転換することを特徴とする請求の範 囲第１０項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
16. １６．前記治療剤が抗ウイルスヌクレオシド類似体であることを特徴とする請求 の範囲第１項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
17. １７．前記治療剤がガンシクロビルであることを特徴とする請求の範囲第１６項 記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
18. １８．前記治療剤がアサイクロバーであることを特徴とする請求の範囲第１６項 記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
19. １９．前記形質導入癌細胞をステップ（ｃ）以前に致死照射することを特徴とす る請求の範囲第１項記載の悪性細胞使用による癌治療方法。
20. ２０．ｉｎ　ｖｉｖｏに使用し、癌細胞および非癌細胞から成る細胞母集団から 癌細胞を除去するために、外来遺伝子を含み、実質的に癌細胞または非癌細胞よ りも治療剤に対する感受性を高めることを特徴とする形質導入癌細胞母集団。
21. ２１．少なくとも複数の形質導入癌細胞が外来サイトカイン遺伝子を含むことを 特徴とする請求の範囲第２０項記載の形質導入癌細胞母集団。
22. ２２．癌を罹患したヒトの腫瘍退縮に効果を与えるために使用することを特徴と する請求の範囲第２０項記載の形質導入癌細胞母集団。
23. ２３．ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養腫瘍細胞系由来の細胞を含むことを特徴とする請求 の範囲第２０項記載の形質導入癌細胞母集団。
24. ２４．ヒトから外植された癌細胞を含むことをことを特徴とする請求の範囲範囲 第２０項記載の形質導入癌細胞母集団。
25. ２５．前記細胞が、造血細胞、中枢神経系細胞、肺細胞、胸細胞、卵巣細胞およ び肝細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求の範囲範囲第２ ４項記載の形質導入癌細胞母集団。
26. ２６．前記癌細胞がヒト黒色腫、ヒト卵細胞癌、ヒト神経芽腫、ヒト重層偏平上 皮癌、ヒト線維肉腫およびヒト白血病に関連することを特徴とする請求の範囲第 ２４項記載の形質導入癌細胞母集団。
27. ２７．前記外来細胞がヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子であ ることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の形質導入癌細胞母集団。
28. ２８．前記ヘルペスウイルスが単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ　ＴＫ）であ ることを特徴とする請求の範囲第２７項記載の形質導入癌細胞母集団。
29. ２９．前記形質癌細胞が致死照射されていることを特徴とする請求の範囲第２８ 項記載の形質導入癌細胞母集団。
30. ３０．癌細胞および非癌細胞から成る細胞母集団から癌細胞除去を目的とし、少 なくとも複数の癌細胞が形質導入癌細胞でありかつ外来遺伝子を含み、実質的に 癌細胞または非癌細胞よりも治療剤に対する感受性を高めて、特定量の形質導入 癌細胞を死滅させる効果によって、実質量の前記癌細胞を効果的に死滅させる一 方、前記非癌細胞を実質的に損傷させないための薬剤として使用することを特徴 とする治療剤。
31. ３１．抗ウイルスヌクレオシド類似体を含むことを特徴とする請求の範囲第３１ 項記載の治療剤。
32. ３２．ガンシクロビルを含むことを特徴とする請求の範囲第３１項記載の治療剤 。
33. ３３．アサイクロバーを含むことを特徴とする請求の範囲第３１項記載の治療剤 。
34. ３４．少なくとも複数の形質導入細胞が外来サイトカイン遺伝子を含むことを特 徴とする請求の範囲第３１項記載の治療剤。
35. ３５．癌細胞および非癌細胞から成る細胞母集団から癌細胞除去を目的とし、外 来遺伝子を含み、実質的に癌細胞または非癌細胞よりも治療剤に対する感受性を 高め、治療的用途として薬剤を製造するための形質導入癌細胞の使用。
36. ３６．少なくとも複数の前記形質導入癌細胞が外来サイトカイン遺伝子を含むこ とを特徴とする請求の範囲第３５項記載の形質導入癌細胞の使用。