JPH09504518A

JPH09504518A - 負の選択マーカーおよびサイトカインをコード化する遺伝子を用いる腫瘍細胞の遺伝子転換による腫瘍の治療

Info

Publication number: JPH09504518A
Application number: JP7510988A
Authority: JP
Inventors: カルヴァー，ケンネス，ダブリュ．; リンク，チャールズ，ジェイ．，ジュニア; ブレーズ，マイケル，アール．
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1993-10-06
Filing date: 1994-10-04
Publication date: 1997-05-06
Also published as: EP0722343A1; WO1995009655A1; CA2173495A1; EP0722343A4

Abstract

(57)【要約】宿主にある一つの腫瘍を治療する一つの方法であって、一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬をコード化する第１核酸配列、および腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、もしくは破壊をもたらす一つの作用薬をコード化する第２核酸配列を含む少なくとも１個の発現ベクターを宿主に投与することよりなり、ここでそのような作用薬は相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬ではないことを特徴とする方法。腫瘍は次いで相互作用薬で治療される。望ましくは第１核酸配列は（単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのような）負の選択マーカーをコード化し、また第２核酸配列は（インターロイキン−２のような）サイトカインをコード化し、また第１および第２核酸配列は第１および第２ウイルスベクターに含まれ、そのそれぞれが第１生産者細胞系および第２生産者細胞系に別々に含まれる。生産者細胞系は腫瘍に投与され、これにより生産者細胞系で生成されるウイルス粒子が腫瘍細胞に感染する。ガンシクロビルのような相互作用薬の宿主への投与により、腫瘍細胞は殺される。

Description

【発明の詳細な説明】負の選択マーカーおよびサイトカインをコード化する遺伝子を用いる腫瘍細胞の遺伝子転換による腫瘍の治療この出願は１９９２年５月１日に受理されその全体が引用例としてここにとり込まれている出願番号０７／８７７，５９１号を部分継承するものである。この発明は腫瘍の治療に関する。より詳細には、この発明は、相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える作用薬をコード化するＤＮＡ（ＲＮＡ）およびサイトカインをコード化するＤＮＡ（ＲＮＡ）を用いる（例えば卵巣癌のような）腫瘍の治療に関する。卵巣癌はアメリカ合衆国において年間約１９，０００人の新規の診断症例で全体として７０％の死亡率である婦人科悪性腫瘍から死に至るもっとも一般的な原因である。患者の２／３以上が、疾病の進行段階にあり、これに対して開腹が行われ腫瘍が一部除去された後で全身化学療法が支持されている（ヤング、他、「卵巣の癌」、ディヴァイタ、他、編、癌の原理と腫瘍学の実際、ジェイ，ビー．リピンコット社、フィラデルフィア、１２２６−１２５４ページ（１９９３年））。患者の約８０％はシスプラチンベースの化学療法を用いる初期治療に応答するが、その内、約１０乃至２０％だけが永続性の完全緩解を経験するにすぎない（ヤング、他、１９９３年）。天然製品であるパクリタクセル（Paclitaxel）は抗療性あるいは再発性疾病を持つ患者の２１％から５０％の他覚応答割合を提供する（タクソール臨床ブロシャー、癌治療部門１７、ＮＣＩ（１９８３年）；マクガイア、他、内科学年報、第３巻、４号、２７３−２７９ページ（１９８９年）；シグペン、他、ＡＳＣＯ紀要、９巻、１５６ページ（１９９０年）；アインジッグ、他、ＡＡＣＲ紀要、３１巻、１８７ページ（１９９０年）、サロシー、他、ＡＳＣＯ紀要、２巻、２２６ページ（１９９２年））。このような応答割合があったにも拘らず、初期治療後再発性あるいは抗療性疾病の患者は一様に致死的な結果を持つことになる。卵巣癌はかなりユニークな自然発達を有している。疾病の進行段階にある患者でさえ、長期間にわたり、その疾病を彼等の腹部に閉じ込めている。癌はしばしば腹部に局在化し、腸および尿管の閉塞で患者に大きな困難を与える。その結果腹腔内治療が化学治療薬を腹腔に局所投与することで開発されてきた（マイヤー、腫瘍学セミナー、２巻、２７５−２８４ページ（１９８４年））。これらの療法は適度な成功を収めたに過ぎなかった。というのはそれがもともと望まれた毒性減少プロフィールを提供しなかったためである。遺伝子転移は他の疾病の中でもとりわけ癌の治療に見込みのある手段としてある期間認識されてきた。癌治療のための遺伝子転移についての初期の応用は、抗腫瘍免疫応答を増強することに焦点をあてる間接的なアプローチであった。かくして例えば免疫細胞の細胞毒性を増加し、あるいはその増殖を高めるために努力が払われた。一つのアプローチにおいて、腫瘍細胞はサイトカイン遺伝子を用いて試験管内で修飾され患者自身の癌に対し患者を免疫化する試みで患者に再導入された。動物研究では、ＩＬ−４遺伝子はテッパー、他、細胞、５７巻：５０３ページ（１９８９年）により腫瘍に導入され、ＩＬ−２遺伝子は、フィアロン、他、細胞、６０巻：３９７ページ（１９９０年）、およびガンズバッヒャー、他、実験医学ジャーナル、１７２巻：１２１７ページ（１９９０年）、により、ガンマーインターフェロン遺伝子はガンズバッヒャー、他、癌研究、５０巻：７８２０ページ（１９９０年）により、また、ＴＮＦ遺伝子はアッシャー、他、免疫学ジャーナル、１４６巻：３２２７ページ（１９９１年）によりそれぞれ腫瘍に導入された。動物研究のそれぞれは再移植に対する遺伝子変更腫瘍の拒絶反応を示し、またこれら研究においてマウスは同一腫瘍を用いる次の再挑戦に対して免疫であった。エッゼディン、他、新生物学者、３巻：６０８−１４ページ（１９９１年）は腫瘍を治療する試みとして試験管内レトロウイルスベクター媒介遺伝子転移の使用について報告した。より詳細には、マウスレトロウイルスベクターが、単純性ヘルペスウイルス１から得るチミジンキナーゼ遺伝子（［「ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子」）をＣ６ラット神経膠腫誘導細胞系に試験管内で導入するのに使用された、レトロウイルスベクターをとり上げた細胞は抗ウイルス剤ガンシクロビルに感作され、培地内でガンシクロビルに曝された時には優先的に殺された。エッゼディン、他は、基本的にすべての感染細胞を殺すが未感染細胞は殺さないための試験管内条件を明確に規定する方法を使用することができた。加えてＣ６細胞は腫瘍を形成するためにヌードマウスに皮下で導入され、腫瘍を持つマウスはガンシクロビルで治療された。ガンシクロビルはＨＳＶ− １ｔｋ発現Ｃ６細胞により形成された腫瘍の成長を阻害したが、ＨＳＶ−１ｔｋ陰性Ｃ６細胞により形成された腫瘍には影響しなかった。エッゼディン、他はかくして、試験管内レトロウイルス遺伝子転移が細胞を細胞障害剤に感作させるのに使用することができ、次いで細胞がヌードマウスで腫瘍として増殖する時にそれが細胞を殺すのに使用出来ることを示した。著者はしかしながらＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子を原位置の腫瘍細胞に導入する実際的な方法を示さなかった。エッゼディン、他はまた腫瘍内ですべての細胞以下がｔｋ遺伝子をとり上げ、毒性を確認するのに十分な水準で遺伝子を発現し、その結果としてガンシクロビルに曝されることで細胞が殺されるという腫瘍緩解の前提条件であるすべての新形成腫瘍性細胞を拒絶する方法を示さなかった。ショート、他、神経科学研究ジャーナル、２７巻：４２７−３３ページ（１９９０年）は、レトロウイルスパッケージング細胞系を腫瘍に移植することにより、遺伝子を腫瘍細胞に受渡しすることについて述べている。パッケージング細胞系は複製欠損レトロウイルスベクターを生産したが、ここでＭｏＭＬＶＬＴＲプロモーターオペレーターがレトロウイルスベクター増殖のマーカーとして役立つβ−ガラクトシダーゼの発現を駆動するために使用された。パッケージング細胞系が腫瘍に移植された時、β−ガラクトシダーゼの原位置発現が通常の組織にではなく、パッケージング細胞および増殖腫瘍細胞にのみ見られた。腫瘍細胞に対する明らかな優先的選択にも拘らず、生産者細胞から腫瘍細胞へのレトロウイルスベクターの増殖は、ショート、他、によれば相対的に不十分であり、腫瘍内の細胞のある画分のみが感染された。更に、無細胞レトロウイルス粒子がパッケージング細胞系よりも直接腫瘍に導入された時には、事実上ガラクトシダーゼの発現は観察されなかった。ショート、他は、パッケージング細胞系が「キラー」あるいは「サプレッサー」遺伝子を腫瘍細胞に運ぶかもしれないが、腫瘍全細胞への直接遺伝子形質導入にもとづく治療効用に必要とされるものよりもはるかに低い感染効率が観察されたと考えた。単純性ヘルペスチミジンキナーセの腫瘍細胞への生体内レトロウイルス媒介転移は抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を与えるが、この転移により固化脳腫瘍を治療する新規なアプローチが記述されている（カルヴァー、他、科学、２５６巻、１５５０−１５５２ページ（１９９２年）；ラム、他、癌研究、５３巻、８３−８８ページ（１９９３年））。ガンシクロビルは形質導入腫瘍細胞により優先的にリン酸化され、ＤＮＡ合成に干渉する。遺伝子転移は腫瘍細胞を単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を運ぶマウスレトロウイルスベクターに感染させ、この遺伝子を宿主細胞のゲノムに組込むことで達成される。これらのベクターは腫瘍塊に注射されるマウスベクター生産者細胞で連続的に生産される。レトロウイルスはＤＮＡを活発に合成する細胞（すなわち複製細胞）のみを感染させるために、腫瘍細胞の優先的形質導入が達成される。このアプローチは現在臨床試験で評価されている（オールドフィールド、他、ヒト遺伝子療法、４巻、３９−６９ページ（１９９３年））。１９９３年３月４日公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／０４１６７は、脳腫瘍細胞を殺すために治療遺伝子をその細胞に転移させると称する方法を開示する。このような方法では、選択マーカーおよびその複製に必要とされる少なくとも１個の遺伝子を含むレトロウイルスは、レトロウイルスに対応するプロウイルスＤＮＡの生産者細胞ゲノムへの組込みが修飾レトロウイルスの生成をもたらすように生産者細胞に導入され、そこではレトロウイルスの複製に必要とされる少なくとも１個の遺伝子が治療遺伝子あるいは遺伝子群により代替される。生産者細胞は次いで修飾レトロウイルスが生産者細胞のゲノムの一部としてとり込まれるように選択される。生産者細胞は次いで腫瘍細胞を修飾レトロウイルスで感染させるために分割腫瘍細胞に近接して移植され、これにより治療遺伝子あるいは遺伝子群を腫瘍細胞に転移させる。細胞は次いで腫瘍細胞に転移された治療遺伝子により代謝されるある物質を、細胞を殺す代謝物に投与することにより殺される。治療遺伝子は単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子であり、腫瘍細胞を殺す単純性ヘルペスチミジンキナーゼで代謝される物質はガンシクロビルあるいはアシクロビルであることが出来る。引用されたＰＣＴ出願は（ｉ）ＨＳＶｔｋ遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を運んだ複製欠損レトロウイルスがＧ４１８選択を経て神経膠腫細胞系に試験管内で安定的に形質導入出来たこと、（ii）形質転換細胞内のウイルスｔｋ遺伝子が対照神経膠腫細胞よりも約２０倍以上のものガンシクロビル感受性を細胞に与えたこと、および、（iii ）ラット脳に移植された時腫瘍を形成したある神経膠腫腫瘍細胞が、マーカー遺伝子を使ってレトロウイルスベクターを生産した生産者細胞系を腫瘍が注射された時に同じくβ−ガラクトシダーゼマーカーを発現したことを示すのみである。記載された実験のベクターはｔｋ遺伝子を運ばなかったし、また化学療法剤の全身投与もなかった。かくして問題のＰＣＴ出願は腫瘍細胞がそのような作用薬に対し生体内で感受性を与えられ得ることを示してはいない。マルツーザ、他による欧州特許出願番号４７６，９５３は同様の結果を開示する。この公開情報は更に腫瘍細胞内でＨＳＶｔｋ遺伝子あるいはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する複製欠損レトロウイルスベクターも記述する。ベクターは試験管内で神経膠腫細胞に形質移入され、ＨＳＶｔｋ活性を発現する安定細胞系は形質移入細胞からクローンされた。細胞系は次いでラットに移植され、生成する腫瘍は対照神経膠腫細胞腫瘍よりもガンシクロビル感受性の高いことが発見された。これら公開情報のようにその結果はＨＳＶｔｋ活性を発現する細胞をガンシクロビルが殺すことを示した。更にこの出願はリポーター遺伝子を含む複製欠損レトロウイルスベクターをラット脳にある神経膠腫細胞に運ぶために生産者細胞を使用することを開示する。しかし腫瘍細胞の１０％のみが形質導入された。前記の他の文献と同じように、マルツーザの出願は、ベクターが治療効果を達成するために腫瘍にある細胞全体に増殖するものでなければならないと仮定する。しかしそれは原位置の腫瘍のこの結果を果す方法を提議しない。この問題に対する解はアメリカ合衆国出願番号０７／８７７，５９１（以下「 ’５９１出願」）に記述されている。’５９１出願で説明されているように、「第三者効果」が生体内で腫瘍に生じることが出来、これにより例えば原位置腫瘍に投与される感作遺伝子はある腫瘍細胞に相互作用薬の効果に対する感受性を与える。もっともそのような細胞は形質転換されなかったものであった。生産者細胞を原位置腫瘍に顕微注射により投与されたウイルスｔｋ感作遺伝子は、第三者効果により、ウイルスｔｋを発現するために形質導入されない腫瘍細胞にガンシクロビル感受性を与える。’５９１出願はこの効果がこれまで予測され得なかった方法で感作遺伝子の治療効果を根本的に増加することを教える。遺伝子転移治療における第三者効果とその用途は、’５９１出願で十分に検討される。そこで記されたように、抗腫瘍療法が感作細胞に加えて免疫システムを刺激しあるいは活性化する遺伝子の投与により強化され、それにより腫瘍内で殺される腫瘍性細胞の全体の割合を増加させる。’５９１出願で開示される免疫応答増強遺伝子の中では、必ずしもそれに限定されないがＩＬ−１からＩＬ−１２までを含むサイトカインがあり、またある種のＭＨＣ決定因子などのような免疫同時活性化シグナル分子がある。 ’５９１出願はこの点についてＩＬ−２が特に望ましいサイトカインであることを開示する。’５９１出願はＩＬ−２活性が感作遺伝子の抗腫瘍効果を増加させる特定の機構に限定するものではない。それにも拘らずＩＬ−２およびその他の免疫応答増強遺伝子が免疫系を刺激あるいは活性化することにより治療効果を改善するであろうということを仮説として取上げている。この出願の発明者は中でもＩＬ−２遺伝子が免疫系活性なしで卵巣癌細胞をモデルシステムとして使用し、感作遺伝子の作用を増強するということを驚くべきことに発見した。以下に開示されるように試験管内実験でのＩＬ−２遺伝子は、ＨＳＶｔｋ発現ベクターの形質導入に際し卵巣腫瘍細胞系の細胞のガンシクロビル感受性を相乗強化した。加えてＩＬ−２および感作遺伝子の相乗効果がヌードマウスの移植卵巣細胞腫瘍内で免疫系の不在下で生体内で見られた。またＨＳＶｔｋに対するＩＬ−２／繊維肉腫細胞腫瘍のガンシクロビル媒介遺伝子療法の相乗効果が、免疫系を通じて作用しない機構により少なくとも部分的に含まれることにより無傷免疫系を用いて動物で示された。いずれの理論的類推にも限定されることなく、ＨＳＶｔｋに対するインターロイキン−２／卵巣細胞腫瘍に対するガンシクロビル媒介遺伝子療法の相乗効果がサイトカインの抗腫瘍活性についての異常で認識されていない機構を示している。宿主にある腫瘍の治療方法を提供することはこの発明の一つの目的であり、それによりチミジンキナーゼとサイトカインの間での相乗殺腫瘍効果が達成される。この発明の一つの見地に従って、宿主にある腫瘍を治療する一つの方法が提供される。腫瘍は第三者効果に感受性である。この方法は第三者効果を高める。宿主はヒトあるいは非ヒト動物宿主であってもよい。この方法は第１核酸配列、および第２核酸配列を投与することよりなる。第１核酸配列は腫瘍細胞が一つの相互作用薬に感受性を与えられるように一つの作用薬をコード化する。すなわち腫瘍細胞の成長はこの相互作用薬の投与により阻害され、妨げられ、あるいは破壊される。第２核酸配列は、腫瘍の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらすが、腫瘍細胞に一つの相互作用薬に対する感受性を与えない一つの作用薬をコード化する。第１核酸配列および第２核酸配列を腫瘍に投与すると、腫瘍は次いで一つの相互作用薬で治療される。相互作用薬の治療効果は、腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらす（が相互作用薬ではない）作用薬により高められ、またそのような効果は宿主の免疫系とは独立した効果である。ここで使用される「核酸配列」という用語は一つのＤＮＡあるいは一つのＲＮＡ分子を意味し、完全あるいは部分遺伝子配列を含み、また同じくポリヌクレオチドを含む。このような用語は隣接するペントースの３′および５′炭素の間のホスホジエステル結合により一つが他のものに結合されたデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドの線形シリーズを含む。第１および第２核酸配列は少なくとも１個の発現ベクターに含まれる。ここで使用される「発現ベクター」は第１およびもしくは第２核酸配列を含み、そのような配列の発現を提供出来る何らかの遺伝子構築物を意味する。一つの実施例において、第１核酸配列は第１発現ベクターに含まれ、また第２核酸配列は第２発現ベクターに含まれる。発現ベクターは細胞を形質移入し、第１およびもしくは第２核酸配列を生体内で発現出来るいずれかの発現ベクターであることが出来る。このような発現ベクターは、必ずしもそれに限定されないが、真核ベクター、原核ベクター（例えば細菌プラスミドなど）、およびウイルスベクターを含む。更にベクターはリポソーム内に含まれる。一つの実施例において、第１および第２発現ベクターはウイルスベクターである。使用されるウイルスベクターは、必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターである。望ましくは、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。望ましい実施例において、第１パッケージング細胞系は第１ウイルスベクターで形質導入され、第１ウイルスベクターは第１ウイルスベクターを含む第１生産者細胞系を形成するために腫瘍細胞が一つの相互作用薬に対する感受性を与えられるように一つに作用薬をコード化する第１核酸配列を含む。第２パッケージング細胞系もまた第２ウイルスベクターで形質導入され、この第２ウイルスベクターは、腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらす一つの作用薬をコード化する第２核酸配列を含み、ここでこの作用薬は一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬ではなく、第２ウイルスベクターを含む第２生産者細胞系を形成するものである。生産者細胞系は次いで腫瘍に投与され、これにより生産者細胞系は腫瘍細胞を形質導入出来るウイルスベクター粒子を生成する。望ましい実施例において、第１および第２ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。使用されるレトロウイルスベクターの例は、必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、および以下のレトロウイルスより誘導されるベクター、つまりラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスである。望ましくは、レトロウイルスベクターは感染性ではあるが非複製コンピテントレトロウイルスである。しかし複製コンピテントレトロウイルスも使用出来る。レトロウイルスベクターはレトロウイルス媒介遺伝子転移を真核細胞に媒介する作用薬として有用である。一般にレトロウイルスベクターは、ウイルスの構造遺伝子をコード化する多数の配列が欠失され、対象となる遺伝子（群）により代替されるように構築される。しばしば構造遺伝子（すなわちｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）は既知の遺伝子操作技術を使ってレトロウイルスバックボーンから除去される。これは適切な制限エンドヌクレアーゼあるいは、ある場合にはＢａｌ３１エキソヌクレアーゼを用いての消化を含み、パッケージングシグナルの適切な部分を含む断片を生成する。これらの新しい遺伝子は各種周知の方法によりこれらのベクター内にとり込まれる。多分もっとも直接的な構築方法は、レトロウイルスの構造遺伝子が単一の遺伝子により代替され、それが長末端反復（ＬＴＲ）内でウイルス調節配列の制御の下で転写される方法である。レトロウイルスベクターは更に１個以上の遺伝子を標的細胞に導入出来るものとして構築されてきた。通常そのようなベクターにおいて、１個の遺伝子はウイルスＬＴＲの調節配列の下にあり、一方第２の遺伝子はスプライスメッセージから離れて、あるいはそれ自身の内部プロモーターの調節の下にある。ウイルスバックボーンのウイルス成分を最小にするように努力が向けられ、とりわけパッケージング細胞内でベクターとパッケージング欠損ヘルパーウイルスの間の組換えの機会を減小する努力が払われた。パッケージング欠損ヘルパーウイルスはベクター自身から欠失されたレトロウイルスの構造遺伝子を提供するのに必要である。一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、ベンダー、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻：１６３９−１６４９ページ（１９８７年）に記載されているようにベクターおよびパッケージングシステムの間の相同性を絶対最小値にまで減少させる一連の欠失および置換を含むＮ２ベクター（アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻：１６４７−１６５０ページ）にもとづく一連のベクターの一つである。これらの変化はウイルスタンパク質が発現される尤度も減少させた。これらベクターの最初のＬＮＬ−ＸＨＣにおいて、部位指向突然変異によりｇａｇの天然ＡＴＧ出発コドンがＴＡＧに変更され、これによりその点から先の意図しないタンパク質合成が排除された。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）から５′から真正ｇａｇ出発まで一つの読み取り枠が存在し、それはも一つのグリコシル化タンパク質（ｐＰｒ８０^gag）の発現を可能にする。モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）はフレームシフトおよびグリコシル化部位欠失を含むこの５′ 領域での変更を有し、ｐＰｒ８０^gagのアミノ末端の潜在的発現を未然に防ぐ。従ってベクターＬＮ６が作られ、それはＬＮＬ−ＸＨＣの変化したＡＴＧおよびＭｏＭｕＳＶの５′部分の両方をとり込んだ。ＬＮベクターシリーズの５′構造はかくして、レトロウイルス読み取り枠の発現の可能性、およびそれに続く遺伝子形質導入標的細胞内でのウイルス抗原の生産を除去する。パッケージング欠損ヘルパーウイルスでのオーバーラップを減少させる最終変更において、ミラーはＬＮベクターの３′ＬＴＲの直前にある余分のｅｎｖ配列を除去した（ミラー、他、バイオテクニク、７巻：９８０−９９０ページ、１９８９年）。遺伝子療法の適用のために何らかの遺伝子転換により満足させられねばならない最高の要求は安全性である。安全性はベクターゲノム構造と、感染性ベクターの生産に利用されるパッケージングシステムと一緒の組合せから誘導される。ミラー、他は一つのパッケージングシステムを作るためにレトロウイルス構造タンパク質を発現させるためのＰＰＡＭ３プラスミド（パッケージング欠損ヘルパーゲノム）とＬＮベクターシリーズとの組合せを展開させ、このベクターパッケージング欠損ヘルパーゲノム（すなわちｐＰＡＭ３を伴うＬＮ）との間の組換えの殆どすべての部位の排除を通じて最小に減少させられる。一つの実施例において、レトロウイルスベクターはベクターのＬＮシリーズのモロニーマウス白血病ウイルスで、前記記載のものであり、また更に、ベンダー、他（１９８７年）およびミラー、他（１９８９年）にも記述されている。このようなベクターはマウス肉腫ウイルスから誘導されるパッケージングシグナルの一部、および、突然変異ｇａｇ開始コドンを持つ。ここで使用される「突然変異（された）」という用語は、ｇａｇタンパク質あるいは断片もしくはその切形が発現されないように、ｇａｇ開始コドンが欠失あるいは変化されたことを意味する。も一つの実施例において、レトロウイルスベクターは４個のクローニングあるいは制限酵素認識部位を含み、ここで少なくとも２個の部位は１０，０００塩基対で１回以下の真核細胞の平均出現頻度を持ち、つまり制限製品は少なくとも１０，０００塩基対の平均ＤＮＡサイズを持つ。望ましいクローニング部位は、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される。望ましい実施例において、レトロウイルスベクターはこれらのクローニング部位のそれぞれを持つ。このようなベクターは更に１９９２年７月２３日に受理されたアメリカ合衆国特許出願番号９１９，０６２に説明されており、その全体がここで引用例としてとり込まれている。このようなクローニング部位を含むレトロウイルスベクターが使用される時、シャトルクローニングベクターもまた提供され、これはレトロウイルスベクターに位置するＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される少なくとも２個のクローニング部位と適合する少なくとも２個のクローニング部位を含む。シャトルクローニングベクターは更にシャトルクローニングベクターからレトロウイルスベクターに転移することの出来る少なくとも１個の望ましい遺伝子を含む。シャトルクローニングベクターは、クローニングあるいは制限酵素認識部位を含む１個もしくはそれ以上のリンカーと結合される基本的「バックボーン」ベクターあるいは断片から構築することが出来る。クローニング部位に含まれるものは前記の適合性、あるいは相補性クローニング部位である。シャトルベクターの制限部位に対応する末端を持つ遺伝子およびもしくはプロモーターは、従来既知の技術を通じてシャトルベクターに連結することが出来る。シャトルクローニングベクターは原核システムにあるＤＮＡ配列を増幅するのに使用することが出来る。シャトルクローニングベクターは、一般に原核システム、またはとりわけ細菌で使用されるプラスミドから調製することが出来る。かくして例えば、シャトルクローニングベクターは、ｐＢＲ３２２；ｐＵＣ１８、などのプラスミドから誘導することが出来る。ベクターは１個もしくは２個以上のプロモーターを含む。使用されるプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターでミラー、他、バイオテクニク、７巻、９号、９８０−９９０ページ（１９８９年）に記載のもの、あるいはその他のプロモーター（例えば、必ずしもそれに限定されないが、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターなどを含む真核細胞プロモーターのような細胞系プロモーター）を含む。使用される他のウイルスプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターである。適切なプロモーターの選択はここに含まれる教訓から従来の既知の技術に習熟した人達にとっては明白であろう。ベクターは次いで生産者細胞系を形成するためにパッケージング細胞系を形質導入するのに使用することが出来る。形質移入され得るパッケージング細胞の例は、必ずしもそれに限定されないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞系でミラー、ヒト遺伝子療法、１巻、５−１４ページ（１９９０年）に記載の通りであり、その全体が引用例としてここにとり込まれる。腫瘍細胞が一つの相互作用薬に対する感受性を与えられ、また一つの作用薬をコード化する核酸配列の発現に際し、腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらすことの出来る作用薬でこの作用薬が一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える作用薬ではないような作用薬をコード化する第１および第２核酸配列を含む第１および第２ベクターは、従来の周知の何らかの手段を通じてパッケージング細胞を形質導入することが出来る。このような手段は必ずしもそれに限定されないが、電気穿孔法、リポソームの使用、およびリン酸カルシウム沈殿である。第１および第２生産者細胞系は次いで腫瘍の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊するのに有効な量で腫瘍に直接あるいは隣接して投与される。一般に第１および第２生産者細胞は宿主に許容される大きさの量で投与される。一般に第１および第２生産者細胞系は、宿主の重量の約１×１０⁶細胞／ｋｇから約１×１０⁸細胞／ｋｇまでの量で投与される。投与される生産者細胞の正確な量は、必ずしもそれに限定されないが、腫瘍のタイプ、腫瘍の位置、および腫瘍のサイズを含む各種の要素に依存する。ある場合には生産者細胞の反復投与が必要とされる。一般に第１および第２生産者細胞系は、第１および第２生産者細胞系により生成されるベクター粒子が腫瘍細胞を形質導入出来るように腫瘍に投与される。第１および第２生産者細胞系は腫瘍に直接あるいは隣接して投与されるか、あるいは第１および第２生産者細胞により生成されるベクター粒子を腫瘍細胞までトラベルし形質導入することを可能にする全身経路で投与される。例えば生産者細胞系は中枢神経系の腫瘍を治療するために血流（すなわち静脈内投与）：あるいは脳脊髄液に注射することが出来る。生産者細胞は更に腹腔内、皮下、あるいは筋肉内で投与することも出来る。投与の正確な方式は治療される腫瘍のタイプに依存する。生産者細胞は患者への投与に適した調剤許容担体と併用して投与することが出来る。担体は例えば食塩水あるいは緩衝液もしくは他の等モル溶液のような液状担体である。第１および第２生産者細胞の腫瘍への投与に際し、生産者細胞はウイルスベクター粒子を生成する。ウイルスベクター粒子は次いで周囲の腫瘍細胞を形質導入する。腫瘍細胞、とりわけ癌性腫瘍細胞は、一般に活発に細胞を複製するため、レトロウイルスベクター粒子は正常細胞に対向する腫瘍細胞に優先的あるいは排他的にとり込まれまた発現される。この発明は（レトロウイルスベクターのような）第１発現ベクターに含まれる第１核酸配列、および（同じくレトロウイルスベクターであり得る）第２発現ベクターに含まれる第２核酸配列と関連して説明されてきたし、またそれにより、そのベクターが第１および第２核酸配列を含む第１および第２ウイルスベクター粒子を生成する第１および第２生産者細胞系に含まれるけれども、第１核酸配列および第２核酸配列が（一つのレトロウイルスベクターのような）一つの発現ベクターに含まれることも出来るということもこの発明の範囲内で考慮された。ベクターは次いでパッケージング細胞系に形質導入され、第１および第２核酸配列を含むウイルスベクター粒子を生成する生産者細胞系を形成する。このようなウイルスベクター粒子は生産者細胞の腫瘍への投与に際し生産者細胞系により生成され、それによって第１および第２核酸配列を含むこのようなウイルスベクター粒子が腫瘍細胞を形質導入し、また腫瘍細胞は第１および第２核酸配列によりコード化されるタンパク質を発現する。第１核酸配列および第２核酸配列がそれぞれ第１および第２発現ベクターに含まれるということがこの発明の範囲内にあることも考慮されるものである。第１および第２発現ベクター（第１および第２レトロウイルスベクターであってもよい）は次いで単一パッケージング細胞系に形質導入されて一つの生産者細胞系を形成し、これが第１および第２核酸配列をそれぞれ含む第１および第２ウイルスベクター粒子を生成する。第１および第２ウイルスベクター粒子は、生産者細胞の腫瘍への投与に際し腫瘍細胞を形質導入し、腫瘍細胞は第１および第２核酸配列によりコード化されるタンパク質を発現する。この発明に従って治療される腫瘍は悪性および非悪性腫瘍を含む。治療される悪性（初期および転移性を含む）腫瘍は、必ずしもそれに限定されないが、副腎；膀胱；胸部；頸部；内分泌腺（甲状腺、下垂体、および膵臓を含む）；結腸；直腸；心臓：造血組織；腎臓；肝臓；肺；筋；神経系；脳；眼；口腔；咽頭；喉頭；卵巣；陰茎；前立腺；皮膚（黒色腫を含む）；睾丸；胸腺；および子宮に生じる悪性腫瘍を含む。この発明に従って、腫瘍細胞に相互作用薬に対する感受性を与える作用薬は負の選択マーカーであり、すなわち化学治療薬あるいは相互作用薬と併用して腫瘍細胞の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊する一つの物質である。かくして負の選択マーカーを用いて腫瘍細胞の形質導入をする際に、一つの相互作用薬がヒト宿主に投与される。相互作用薬は腫瘍の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊するために負の選択マーカーと相互作用する。使用される負の選択マーカーは、必ずしもそれに限定されないが、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼなどのチミジンキナーゼ；およびシトシンデアミナーゼである。一つの実施例において、負の選択マーカーは、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼよりなるグループから選択される一つのウイルスチミジンキナーゼである。このようなウイルスチミジンキナーゼが使用される時相互作用薬あるいは化学療法薬は望ましくはヌクレオチド類似体、例えばガンシクロビルおよびアシクロビルよりなるグループから選択されるものである。そのような相互作用薬は基質としてのウイルスチミジンキナーゼにより効果的に利用され、その相互作用薬はかくしてウイルスチミジンキナーゼを発現する腫瘍細胞のＤＮＡに致死的にとり込まれ、その結果腫瘍細胞の死を結果することになる。も一つの実施例において、負の選択マーカーはシトシンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼが負の選択マーカーである場合には、望ましい相互作用薬は５−フルオロシトシンである。シトシンデアミナーゼは５− フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに転換し、後者は非常に細胞障害効果を持つ。かくしてシトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞は５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに転換し、死滅させられる。使用されるも一つの相互作用薬は１−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）である。相互作用薬は形質導入腫瘍細胞の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊するのに有効な量で投与される。例えば、相互作用薬は患者に対する全体の毒性に依存し、１日当り宿主の体重の５ｍｇから１０ｍｇ／ｋｇの量で投与することが出来る。相互作用薬は、例えば静脈内投与により、非経口投与により、腹腔内投与により、あるいは筋肉内投与によるなど望ましくは全身投与される。生産者細胞あるいは負の選択マーカーを含む他の発現媒体が生体内で腫瘍に投与される場合には、「第三者効果」が生じる。すなわち負の選択マーカーをコード化する核酸配列でもともと形質導入されなかった腫瘍細胞が相互作用薬の投与で殺される。「第三者効果」は１９９２年５月１日受理されたアメリカ合衆国特許出願番号０７／８７７，５１９で開示され、それは引用例としてここにとり込まれる。この発明の範囲はいずれかの理論的類推で制限されるものではないが、形質転換腫瘍細胞は、相互作用薬に対し細胞外的に作用するか、もしくは隣接する非形質転換腫瘍細胞によりとり上げられるび漫性形態の負の選択マーカーを生産し続け、それが次いで相互作用薬の作用に感受性に富むようになる。負の選択マーカーおよび相互作用薬の一方もしくは両方が腫瘍細胞の間で連通することも可能である。一つの実施例において、腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらす作用薬であって、ここでこの作用薬が腫瘍細胞に相互作用薬に対する感受性を与える作用薬ではなく、またそのような作用薬が第２核酸配列によりコード化される作用薬はサイトカインである。一つの実施例において、サイトカインはインターロイキンである。使用される他のサイトカインはインターフェロンおよびＧＭ−ＣＳＦなどのようなコロニー刺激因子を含む。第２核酸配列によりコード化されるインターロイキンは、必ずしもそれに限定されないが、インターロイキン −１、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、およびインターロイキン−１２を含む。一つの実施例において、インターロイキンはインターロイキン−２である。この発明の範囲はいずれの理論的類推により制限されるものではないが、サイトカインをコード化する遺伝子を含む発現ベクター（レトロウイルスベクター粒子など）の腫瘍への投与は、腫瘍細胞によるサイトカイン（例えばインターロイキン−２など）の発現を可能にする。サイトカインの発現は、腫瘍に対する免疫系を活性化させ、負の選択マーカーの第三者効果により殺されなかった残存腫瘍細胞の根絶を助ける。加えて、出願人はサイトカイン（インターロイキン−２など）が負の選択マーカー（単純性ヘルペスチミジンキナーゼなど）の第三者効果を高めることを思いがけなく発見した。かくしてサイトカインと負の選択マーカーとの間の相互作用により提供される相乗効果が存在する。望ましい実施例において、第１パッケージング細胞系は、単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を含む前記記載のもののような第１レトロウイルスベクターで形質導入される。第２パッケージング細胞系はインターロイキン−２を含む前記記載のもののようなレトロウイルスベクターで形質導入される。形質導入パッケージング細胞系（生産者細胞）は許容出来る調剤担体でまた腫瘍の成長を阻害し、妨げ、あるいは破壊するのに有効な量で腫瘍に生体内投与される。生産者細胞の腫瘍への投与に際し、生産者細胞は負の選択マーカーをコード化する遺伝子を含むウイルス粒子の第１グループ、およびサイトカインをコード化する遺伝子を含むウイルス粒子の第２グループとを生成する。このウイルス粒子の２個のグループは腫瘍細胞を形質導入する。宿主は次いでガンシクロビル、あるいは１− ２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などの作用薬を与えられ、それが単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼと相互作用し、形質導入腫瘍細胞を殺す。前記の通り「第三者効果」も起こり、それにより非形質導入腫瘍細胞もまた殺される。加えて、形質導入腫瘍細胞によるインターロイキン−２の発現は、腫瘍に対する免疫応答を刺激し、ベクター粒子で形質導入されずまた単純性ヘルペスチミジンキナーゼ第三者効果の結果として殺されなかったこれらの腫瘍細胞を殺すのに役立つ。この発明の方法は、標的腫瘍が身体の特定の領域で延長された期間にわたり局在化する場合、例えば、延長された期間腹部に局在化して留まる傾向のある卵巣癌などのような場合に特に有用であり、また黒色腫、腎臓癌、膿腫癌、肝臓腫瘍、および頭部と頸部の癌にも有用である。卵巣癌細胞が腹部に局在化して留まるために、生産者細胞は腹腔内で投与される。生産者細胞のこのような注射は、体内のウイルスの望ましくない増殖を最小にするし、とりわけ複製コンピテントレトロウイルス細胞が連続して生産されるこのようなベクターが使用される場合には有効である。体内の大抵の細胞は両栄養性レトロウイルスベクターのためのレセプターを発現するために、腫瘍の局所環境から逃れるいすれのベクター粒子も直ちに他の細胞と結合する。しかし大抵の細胞はサイクル内にはなく、従ってベクターにより運ばれる遺伝子とは結合せず、またそれが含むいずれの遺伝子も発現しない。かくして被曝の際にサイクルにある潜在的標的細胞の割合は小さく、また正常組織に対する全身毒性効果も最小になるであろう。更にも一つのこの発明の見地に従って、宿主にある腫瘍の治療方法が提供される。腫瘍は第三者効果に対して感受性である。この方法は第三者効果を高め、一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える第１作用薬をコード化する一つの核酸配列を腫瘍に投与することよりなる。第２作用薬が次いで腫瘍に投与される。第２作用薬は腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらす。第２作用薬は、一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える作用薬ではない。第２作用薬は宿主の免疫系には依存しない独自の効果により、相互作用薬の治療効果を高める。腫瘍は次いで相互作用薬で治療される。一つの実施例において第１作用薬をコード化する核酸配列が前記のもののようなウイルスベクターである発現ベクターに含まれる。ウイルスベクターは一つの生産者細胞系に含まれ、この細胞系は腫瘍の細胞を形質転換するのに有効な量でウイルスを生産するために腫瘍に投与される。ウイルスベクターは前記記載の通りレトロウイルスベクターであり、前記記載の量で投与される。も一つの実施例において、第１作用薬は前記記載のものから選択される一つの負の選択マーカーであり、前記記載の量で投与される。まだも一つの実施例では、第２作用薬はサイトカインであり、前記記載のものから選択されるものである。この発明はここで次の実施例と関連して説明される。しかしこの発明の範囲はそれにより限定されるものではない。実施例１Ａ．ｐＧ１ＴｋＳｖＮａの構築以下はｐＧ１ＴｋＳｖＮａの構築を説明し、その概略図は図６で示される。このベクターはレトロウイルスブロモーターおよび細菌遺伝子、ＳＶ４０プロモーターで駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ^R）により調節される単純性ヘルペスウイルスＩから得られるチミジンキナーゼ（ｈＴＫ）を含んでいる。ｈＴＫ遺伝子はアシクロビルおよびガンシクロビルに対する感受性をＤＮＡ類似体に与え、一方Ｎｅｏ^R遺伝子製品はネオマイシン類似体、Ｇ４１８に対する耐性を与える。ｐＧ１ＴｋＳｖＮａを作るために、３段階のクローニング戦略が使用された。まず単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｔｋ）がＧ１プラスミドバックボーンにクローンされてｐＧ１Ｔｋを生成した。第２に、Ｎｅｏ^R遺伝子（Ｎａ）がプラスミドｐＳｖＢｇにクローンされ、ｐＳｖＮａを作り出した。最後にＳｖＮａがｐＳｖＮａから切除され、ｐＧ１Ｔｋに結合されてｐＧ１ＴｋＳｖＮａを生成した。プラスミドｐＧ１ＴｋＳｖＮａはプラスミドｐＧ１から誘導された（図３）。プラスミドｐＧ１はｐＬＮＳＸから構築され（パーマー、他、血液、７３巻、４３８−４４５ページ）、ここで引用例としてとり込まれた。プラスミドｐＧ１の構築戦略は図１で示される。５′モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片、および３′ＬＴＲを含む３．０キロベースＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片、細菌性複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子はそれぞれ分離された。７個のユニーククローニング部位を含むリンカーがそれ自身にＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片を閉じ込めるために使用され、かくしてプラスミドｐＧ０を生成した。プラスミドｐＧ０は５′ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片をｐＧ０のユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することでベクタープラスミドｐＧ１を生成するために使用された（図３）。かくしてｐＧ１（図３）はレトロウイルスベクターバックボーンよりなり、それはＭｏＭｕＳＶから誘導される５′部分、真正ＡＴＧ出発コドンがＴＡＧに突然変異されるｇａｇの短部分（ベンダー、他、１９８７年）、５′ から３′までの間にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＡｐａＩ、およびＣｌａＩの各部位を含む５４塩基対多重クローニング部位（ＭＣＳ）、更に７７６４から７８１３塩基対のＭｏＭｕＳＶの３′部分（ヴァンビヴァレン、他、コールドスプリングハーバー、２巻、５６７ページ、１９８５年に記載された数）で構成され、これらの文献は引用例としてここにとり込まれている（図２）。ＭＣＳは、ｐＧ１プラスミドｎｅｏ^r遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ヒグロマイシン^r遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターの非切断制限酵素のスクリーンにもとづき最大数のユニーク挿入部位を生成するように設計された。ｐＢｇを構築するために（図４）、β−ガラクトシダーゼをコード化する３．０キロベースＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩｌａｃＺ断片がｐＭＣ１８２１から分離された（ファルマチア）。この断片はβ−ガラクトシダーゼ読み取り枠の５′および３′最末端を欠いている。完全読み取り枠を修復し、ｌａｃＺ遺伝子の各末端に制限部位を加えるリンカーが合成され、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩｌａｃＺ断片に結合された。５′リンカーの構造は以下の通りであった：５′−１／２ＮｄｅＩ−ＳｐｈＩ−ＮｏｔＩ−ＳｎａＢＩ−ＳａｌＩ−ＳａｃＩＩ−ＡｃｃＩ−ＮｒｕＩ−ＢｇＩＩＩ−ＩＩＩ２７塩基対リポソーム結合シグナルーコザックコンセンサス配列／ＮｃｏＩ−ｌａｃＺ読み取り枠の最初の２１塩基対−１／２ＢａｍＨＩ−３′。３′リンカーの構造は以下の通りであった：５′−１／２突然変異ＥｃｏＲＩ−ｌａｃＺ読み取り枠の最後の５５塩基対 −ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ−１／２ＥｃｏＲＩ−３′。リンカー内の制限部位が選ばれたが、それは制限部位がネオマイシン耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、あるいはＳＶ４０プロモーターには存在していないためであった。２７塩基対リポソーム結合シグナルは５′ リンカーに含まれていたが、それはｍＲＮＡの安定性を高めるもとの考えられる（ハーゲンビュッヒレ、他、細胞、１３巻：５５１−５６３ページ、１９７８年、およびローレンスならびにジャクソン、分子生物学ジャーナル、１６２巻：３１７−３３４ページ、１９８２年）。この二つとも引用例としてここにとり込まれている。コザックコンセンサス配列(5'-GCCGCCACCATGG-3')はｍＲＮＡ翻訳の開始をシグナルするために示され（コザック、核酸研究、１２巻：８５７−８７２ページ、１９８４年）引用例としてここにとり込まれている。コザックコンセンサス配列はＡＴＧ翻訳開始コドンをマークするＮｃｏＩ部位を含む。ｐＢＲ３２２（ボリヴァール、他、遺伝子、２巻：９５ページ、１９７７年）はＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、アンピシリン耐性遺伝子および細菌性複製起点を含む２．１キロベース断片が分離された。前記の結合された５′リンカー−ｌａｃＺ−３′リンカーＤＮＡがｐＢｇを生成するためにｐＢＲ３２２ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩベクターに結合された。ｐＢｇはシャトルプラスミドとして有用であるが、それはｌａｃＺ遺伝子が切除され、も一つの遺伝子がｌａｃＺ遺伝子の５′および３′末端に存在するいずれかの制限部位に挿入出来るためである。これらの制限部位はｐＧ１プラスミド内で反復されるために、シャトルプラスミド構築物内で代替するｌａｃＺ遺伝子あるいは遺伝子群は容易にｐＧ１に移ることが出来る。単純性ヘルペスウイルスタイプＩチミジンキナーゼ遺伝子（ジェンバンク、アクセス番号Ｖ００４６７、引用例としてここに取り込まれる）を含有する１．７４キロベースＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩ断片がｐＸ１プラスミド（ヒューバーマン、他、指数細胞研究、１５３巻、３４７−３６２ページ（１９８４年）、引用例としてここにとり込まれる）から切除され、ＤＮＡポリメラーゼＩの大型（クレノウ）断片で平滑化され、プラスミドｐＧ１Ｔｋを形成するためにｐＧ１多重クローニング部位のユニークＳｎａＢＩ部位に挿入された（図５）。プラスミドｐＳＶ２Ｎｅｏから得られる３３９塩基対ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＳＶ４０初期プロモーター断片（サザン、他、分子および応用遺伝子学ジャーナル、１巻：３２７−３４１ページ（１９８２年））が次いでプラスミドｐＳｖＢｇを生成するためにユニークＮｒｕＩ部位にあるｐＢｇに挿入された（図５）。ｐＳｖＢｇプラスミドはｌａｃＺ遺伝子を除去するためにＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで消化され、その末端はクレノウ断片を使って平滑化された。ネオマイシン耐性遺伝子のコード配列を含む８５２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＡｓｕＩＩ断片がｐＮ２（アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６４７−１６５０ページ（１９８７年））から除去され、クレノウ断片で平滑化され前記の通り生成された２．５キロベース平滑ＢｇｉｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片に結合され、ｐＳｖＮａを生じた。ＳＶ４０プロモーター／ネオマイシン耐性遺伝子カセットが次いで１１９１塩基対ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＳｖＮａから除去された。ｐＧ１Ｔｋプラスミドは次いでＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ｐＧ１ＴｋＳｖＮａを生成するためにＳＶ４０／ｎｅｏ^r断片で結合された（図６）。Ｂ．生産者細胞系の生成生産者細胞系はベクタープラスミドおよびパッケージング細胞から作られた。ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ生産者細胞は、従来の臨床関連レトロウイルスベクター生産者細胞を作るのに使用されたものと同じ技術により作られた。ベクタープラスミドｐＧ１ＴｋＳｖＮａＤＮＡは環境栄養性パッケージング細胞系、ＰＥ５０１に形質移入された。ＰＥ５０１形質移入細胞から得た上澄みは、次いで両栄養性パッケージング細胞系（ＰＡ３１７）に形質移入するために使用された。形質移入生産者細胞のクローンが次いでＮｅｏ^R遺伝子を含むクローンを選別するためにＧ４１８含有培地で成育された。クローンは次にレトロウイルスベクター生産のために滴定された。いくつかのクローンが、次いで更に検査のために選択され、最後に一つのクローンが臨床用に選択された。５×１０⁵ＰＥ５０１細胞（ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９８０−９９０ページ（１９８９年）、引用例としてここにとり込まれている）が皿当り１０％の胎仔ウシ血清（ＨＧＤ１０）で補充された高グルコースダルベッコ修飾必須培地（ＤＭＥＭ）成育培地１０ｍｌを入れた１００ｍｍ皿で平板培養された。細胞は３７℃、５％、ＣＯ₂／空気で一晩保温された。プラスミドｐＧ１ＴｋＳｖＮａは次いで次のような処置によりＤＮＡ５０μｇを用いるリン酸カルシウム沈澱によりＰＥ５０１に形質移入された。ＤＮＡ５０μｇ、１０×ＣａＣｌ₂ ５０μｌ、および無菌Ｈ₂Ｏ４５０μｌがポリプロピレン管１５ｍｌ内でＤＮＡ５０μｇ、２×ＢＢＳ０．０５ｍｌ（Ｎ−Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタン−スルホン酸５０ｍＭ、ＮａＣｌ２８０ｍＭ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １．５ｍＭ、およびｐＨ６．９５のヘペス５０ｍＭを含有する）を含むＣａＣｌ₂溶液０．２５Ｍを産出するために混合された。ＤＮＡ溶液は次いで室温で約２０分から１時間放置された。皿は次いで３５℃で３％ＣＯ₂／大気で一晩保温された。一晩保温された後、最適沈澱物を持つ培養皿が次いで選択された。皿は次に塩および塩溶液を除去するためにＰＢＳで洗浄された。ＨＧＤ１０培地１０ｍｌが次いで皿に加えられ、この皿は３７℃で５％大気で約４８時間保温された。４８時間後に上澄みが形質移入細胞から採取された。皿はＰＢＳ５ｍｌですすぎ洗いされた。ＰＢＳが次いで除去され、細胞はトリプシン−ＥＤＴＡで除去された。細胞の連続希釈液が次いでＨＧＤ１０およびＧ４１８０．８ｍｇ／ｍｌを含む培地の６個の１００ｍｍ皿に接種された。細胞の６個の皿は毎日検査された。培地は死亡細胞を除去するために必要に応じて交換された。生きた細胞あるいはコロニーは、コロニーがクローンされるのに十分である（つまりコロニーが裸眼で見る）ような大きさに成長するようにされた。ＰＥ５０１細胞のこのようなコロニーから得られるＰＥ５０１環境栄養性含有上澄みは約５乃至１０ｍｌの量で採取され、低温管に置かれ、液体窒素で− ７０℃で凍結された。ＰＡ３１７細胞（ミラー、他、分子細胞生物学、６巻：２８９５−２９０２ページ（１９８６年））は次いでグルコース４．５ｇ／ｌ、グルタミン補足剤、および胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）１０％を含むダルベッコ修飾必須培地で１００ｍｍ平板当り５×１０⁴細胞濃度で平板培養された。ＰＥ５０１上澄みは次いで解凍され、ポリブレン８μｇ／ｍｌが上澄みに加えられた。培地はＰＡ３１７細胞の平板から吸引され、ウイルス上澄みの７乃至８ｍｌが加えられ一晩保温された。ＰＥ５０１上澄みは次いで除去され、細胞は新鮮なＦＢＳ１０％で約１８−２０時間再肥育された。１日後、培地はＦＢＳ１０％およびＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）で交換された。平板は次いでモニターされ、培地は必要に応じて瀕死あるいは死滅細胞を取り除くために新鮮ＦＢＳ１０％およびＧ４１８で交換された。平板はＧ４１８耐性コロニーの外観を見るため少なくとも１０乃至１４日間モニターされた。クローニングリングがすべての選択されたコロニーの周りに置かれた。細胞はトリプシン化され、ＨＧＤ１０５ｍｌにヒポキサンチンアミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）１Ｘの加えられた６個のウエル皿でウエルで培養された。もしクローンが密集に成長したなら、それはトリプシン化され１００ｍｌ皿で保温された。１００ｍｌ皿のクローンが密集に近づくと、その両栄養性ベクター含有上澄みは除去され、細胞をペレット化してとり出すために５分間、１，２００乃至１，５００ｒｐｍで遠心分離された。上澄みは６個の冷凍小びん（１ｍｌ／小びん）にアリコートされ、液体窒素に貯蔵された。ＰＢＳ５ｍｌが皿に加えられ、細胞はすすぎ洗いされ、ＨＧＤ１０を再補給され、ＤＭＳＯ１０％の１ｍｌアリコートで液体窒素で凍結された。レトロウイルスベクターの最高力価を持つものを決定するために異なったクローンがモニターされた。生産者細胞系ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３と指名された最高力価をもクローンがマスター細胞バンクを生産するために使用された。Ｃ．ｐＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａの調製プラスミドｐＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａ（図８）は、図７で示される図形表示に従って調製された。それはｐＧ１ＴｋＳｖＮａ（図６）から部分読み取り枠を除去して調製された。ｐＳＰＴＫ５′の生成：プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＴｋから得たＤＮＡが制限酵素ＢｇＩＩＩおよびＳｍａＩで消化され、１１６３塩基対（ｂｐ）ヘルペスチミシンキナーゼ（ＴＫ）断片がアガロースゲル電気泳動により分画され、分離された。この断片はＴＫ５ ′未翻訳領域の５６塩基対およびＴＫ翻訳読み取り枠の１１０７塩基対を含んでいる。１１６３塩基対ＴＫ断片はプラスミドベクターｐＳＰ７３（プロメガコーポレイション，マジソン，ウイスコンシン）に結合されたが、後者は既に制限酵素ＢｇＩＩＩおよびＳｍａＩで消化されていた。生成する結合プラスミド構築物はｐＳＰＴＫ５′と名付けられたがそれはこのプラスミドがＴＫ読み取り枠の５′部分は含むが、読み取り枠の最後の２１塩基対および翻訳終止コドンを欠いているためである。ＴＫ読み取り枠のＰＣＲ：ｐＧ１ＮａＳｖＴｋプラスミドＤＮＡはそれをＢｇＩＩＩで消化することにより線形化された。線形化ｐＧ１ＮａＳｖＴｋはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用され、このＰＣＲはＴＫ読み取り枠の最初の１７塩基対を含む正プライマー(5'-GCACCATGGCTTCGTACCCCTGC-3')、およびＸｈｏＩ部位の相補配列、ＴＫ翻訳終止コドン、またＴＫ読み取り枠の最後の１９塩基対を含む逆プライマー(5'-CCTGCATCGATTCTCGAGTC AGTTAGCCTCCCCCATCTCC-3')を用いるＰＣＲであった。ＰＣＲ３０サイクルが以下のように行われた：９４℃で１分間、および６０℃で２分間、更に７２℃の延長サイクルで７分間が最終であった。ＰＣＲ裂品はアガロースゲルで分画され、全長ＴＫ読み取り枠を含む予期された１２１５塩基対断片が分離された。この分離断片は制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化され、消化製品はアガロースゲルで分画され、また４２０塩基対断片が分離された。この断片は、ＴＫ読み取り枠のアミノ酸２４９−２５０をコード化するヌクレオチドにあるＰｓｔＩ部位から、ＴＧＡ翻訳終止コドンのすぐ下流にあるＸｈｏＩ部位まで延びる。ｐＳＰＴＫ１の生成：ｐＳＰＴＫ５′はＰｓｔＩで消化され、ｐＳＰ７３ベクターおよびＴＫ読み取り枠の５′部分を含む３９９３塩基対断片は続くアガロースゲル電気泳動で分離された。この３３９３塩基対断片はＴＫ読み取り枠（前記）の３′末端を含むＰＣＲ生成４２０塩基対ＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ断片に結合された。結合プラスミドＤＮＡは大腸菌ＤＫ５αコンピテント細胞（ジブコ／ＢＲＬ、ゲイザースバーク，メリーランド）に形質転換され、またアンピシリン耐性コロニーから得られるＤＮＡは制限酵素消化によりスクリーンされた。全長ＴＫ読み取り枠を含むものと見られるプラスミドは、ｐＳＰＴＫ１と名付けられた。いくつかのｐＳＰＴＫ１クローンから得られるＤＮＡはＰｓｔＩ部位からＸｈｏＩ部位に到るまでの領域（ＰＣＲにより生成された領域）においてジデオキシ配列された。ｐＳＰＴＫ１クローン＃４は、この領域で予期されたＴＫ配列に適合することが判明し、ｐＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａの構築に使用された。ｐＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａの生成：ｐＳＰＴＫ１ＤＮＡはＢｇｌＩＩで消化され、５′張出し末端は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのデオキシメクレオチドおよびクレノウ断片で消化ＤＮＡの培養により修復された。ＤＮＡは次いでＴＫ５′未翻訳領域の５６塩基対および全長ＴＫ読み取り枠を持つ１２２５塩基対断片を生成するためにＸｈｏＩ消化された。この平滑／ＸｈｏＩ断片は、ＳｎａＢＩおよびＳａｌＩで消化されたｐＧ１ＸＳｖＮａＤＮＡに結合された。ｐＧ１ＸＳｖＮａを構築するために、１．２キロベースＳｖＮａ断片が、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＳｖＮａ（前記パートＡ）から切除された。この断片はＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＧ１に結合された。結合プラスミドはｐＧ１ＸＳｖＮａと名付けられ、ここで「Ｘ」は多重クローニング領域の一つを示している。ｐＧ１ＸＳｖＮａおよびＴＫ結合から得たＤＮＡ製品はＤＨ５αに形質転換され、アンピシリン耐性コロニーから得たＤＮＡは前記の通りスクリーンされた。診断用制限酵素消化によるＴＫ断片を含むように見られるプラスミドはｐＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａと名付けられた（図８）。クローン＃２は５′−ＬＴＲの初めから３′−ＬＴＲの末端までジデオキシ配列化され、また無傷読み取り枠を含むことが発見された。ｐＧ１Ｔｋ１ＳｖＮａは前記記載の方法（前記パートＢ）によりＰＡ３１７と組合せて生産者細胞を生産するために使用された。このような生産者細胞系は生産者細胞系ＰＡ３１７／ｐＧ１ＳｖＮａ．７と指定された。Ｄ．ｐＧ１Ｉ２ＳｖＮａの構築ｐＧ１がＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断された。ｐＬＮＳＸからのＳＶ４０プロモーター、およびｐＮ２からのｎｅｏ^r遺伝子を含むｐＳｖＮａ（図９）もまたＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断され、ＳＶ４０プロモーターおよび β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ断片はｐＧ１ＸＳｖＮａを形成するためにＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ消化ｐＧ１に結合された（図１０）。ｐＧ１ＸＳｖＮａはＳｎａＢＩ部位で切断され、インターロイキン−２リーダー配列、およびコザック領域、オリゴマーを加えたインターロイキン−２分泌シグナル、および除去された３′未翻訳領域を使ってＡＴＣＣから得る成熟インターロイキン−２コード配列を含むＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ制限断片がｐＧ１Ｉ２ＳｖＮａを形成するために切断ｐＧ１ＸＳｖＮａに結合された（図１１）。ｐＧ１Ｉ２ＳｖＮａは前記パートＢで説明された方法でＰＡ３１７と組合せて一つの生産者細胞系を生産するために使用された。この生産者細胞系は以下で時々ＰＡ３１７／Ｇ１Ｉ２ＳｖＮａ．５として引用される。Ｅ．ｐＧ１Ｉ２ＧＳｖＮａの構築ｐＧ１ＸＳｖＮａはＳｎａＢＩ部位で切断され、インターロイキン−２リーダー配列、コザック領域、およびロッシュインターロイキン−２遺伝子を鋳型として用いるＰＣＲ生成完全コード配列を含むＢｇ１ＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片がｐＧ１Ｉ２ＧＳｖＮａ．１１を形成するために切断ｐＧ１ＸＳｖＮａに結合された（図１２）。ｐＧ１Ｉ２ＧＳｖＮａは前記パートＢで説明された方法によりＰＡ３１７と組合せて一つの生産者細胞系を生産するために使用された。この生産者細胞系は以下でＰＡ３１７／Ｇ１Ｉ２ＧＳｖＮａとして時々引用される。Ｆ．単純性ヘルペスチミジンキナーゼ生産者細胞およびもしくはインターロイキン−２生産者細胞の胸腺欠損マウスへの投与６８匹の胸腺欠損メスマウスが１５−３０×１０⁶ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞をハンクスＢＳＳ溶液１ｍｌあるいは１．５ｍｌで腹腔内に注射された。マウスは次いで４グループに分割された。Ａグループはマウス１９匹を含み、各マウスは１０×１０⁶ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞を、ＯＶＣＡＲ −３細胞注射７日後に腹腔内に受けた。Ｂグループは１５匹のマウスを含み、各マウスは１０×１０⁶ＰＡ３１７／Ｇ１Ｉ２ＳｖＮａ．５生産者細胞をＯＶＣＡＲ−３細胞注射７日後に腹腔内に受けた。Ｃグループは１８匹のマウスを含み、各マウスは１０×１０⁶ＰＡ３１７／Ｇ１Ｉ２ＳｖＮａ．５生産者細胞の注射をＯＶＣＡＲ−３細胞注射の７日後に腹腔内で受けた。Ｄグループは１６匹のマウスを含み、各マウスは２×１０⁶ＰＡ３１７／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．５３生産者細胞および２×１０⁶ＰＡ３１７／Ｇ１Ｉ２ＳｖＮａ生産者細胞をＯＶＣＡＲ−３細胞注射７日後に腹腔内注射で受けた。生産者細胞注射７日後に、Ａグループの９匹のマウス、Ｂグループの６匹のマウス、Ｃグループの１３匹のマウス、およびＤグループの１１匹のマウスがガンシクロビル（ＧＣＶ）を５ｍｇ／ｋｇの量で１日２回１４日間腹腔内で受けた。他のマウスは治療を受けなかった。次いですべてのマウスが腫瘍の成長を評価された。各グループの無腫瘍マウス数が以下の表Ｉで示される。表Ｉで示されるように、２×１０⁶単純性ヘルペスチミジンキナーゼ生産者細胞および２×１０⁶インターロイキン−２生産者細胞が与えられガンシクロビルで治療されたマウス１１匹の９匹が、腫瘍のない状態で見出された。これに反して、１０×１０⁶単純性ヘルペスチミジンキナーゼ生産者細胞が与えられガンシクロビルで治療されたマウス９匹の内５匹のみが腫瘍のない状態で見出された。この結果は単純性ヘルペスチミジンキナーゼとインターロイキン−２の間に相乗殺腫瘍効果があることを示している。この相乗作用はこの実験に使用されたヌードマウスが免疫不全であるということは予期していなかった。インターロイキン −２は単純性ヘルペスチミジンキナーゼの第三者効果を突然に増加させ、第三者効果によるこのような増加は免疫系の活性を必要としない。実施例２３０匹のＣ５７ＢＬ黒色で生後６−８週のマウスがそれぞれ２×１０⁵形質導入ＭＣＡ２０５繊維肉腫細胞の皮下注射を受けた。マウスは各グループが１０匹の３グループに分割された。ＩグループはｐＧ１ＴｋＳｖＮａから生成されたベクター粒子で形質導入されたＭＣＡ２０５細胞を受けた。ＩＩグループはｐＧ１Ｉ２ＳｖＮａから生成されたベクター粒子で形質導入されたＭＣＡ２０５細胞を受けた。ＩＩＩグループはｐＧ１ＴｋＳｖＮａから生成されたベクター粒子で形質導入された１×１０⁵ＭＣＡ２０５細胞およびｐＧ１Ｉ２ＳｖＮａで形質導入された１×１０⁵ＭＡＣ２０５細胞を受けた。マウスがＭＣＡ２０５細胞で注射された５日後、各グループの５匹のマウスは毎日ガンシクロビル（ＧＣＶ）５ｍｇ／ｋｇを腹腔内で受け治療された。腫瘍退行の平均時間が記録された。その結果は以下の表ＩＩで与えられる。ガンシクロビル治療を受けなかった動物では、インターロイキン−２遺伝子で形質導入された腫瘍の平均サイズは、単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子で形質導入された腫瘍よりも３２％小さいものであった。ガンシクロビル治療を受けたすべての動物はその腫瘍が完全に分解した。単純性ヘルペスチミジンキナーゼおよびインターロイキンの両方で腫瘍を形質導入された動物は、腫瘍の完全な分解までの時間を著しく減少させた。かくして組合わさった２個の遺伝子は、ガンシクロビル治療でより急速な腫瘍破壊を誘発した。加えて、ガンシクロビルの投与に際しインターロイキン−２のみで形質導入された腫瘍の完全な腫瘍退行という事実についての一つの可能な説明は、インターロイキン−２などのサイトカインが腫瘍細胞にある内因性チミジンキナーゼ遺伝子の発現を活性化する、ということであった。この誘発は驚くほど大きいものに違いない。と言うのは内因性酵素が基質としてのガンシクロビルを、全然と言う訳ではなくともかなりの程度使用出来ないためである。実施例３ヒトＯＶＣＡＲ−３細胞は、ｐＧ１ＴｋＳｖＮａあるいはｐＧ１Ｉ２ＳｖＮａのいずれかより生成されたベクター粒子で形質導入され、Ｇ４１８１．０ｍｇ／ｍｌで７−１４日選択された。Ｇ４１８選択で生き残った細胞はこの実施例で形質導入腫瘍細胞として使用された。第１日に、ＯＶＣＡＲ−３細胞がマイクロタイタ平板のウエルに胎仔ウシ血清１０％を有する全量で１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に加えられた。各ウエルは異なった割合（パーセントでの）の野生型ＯＶＣＡＲ−３細胞：ｐＧ１ＴｋＳｖＮａから生成されたベクター粒子で形質導入されたＯＶＣＡＲ−３細胞；およびｐＧ１Ｉ２ＳｖＮａから生成されたベクター粒子で形質導入されたＯＶＣＡＲ− ３細胞を有していた。第２日には、１００μｌのガンシクロビルが２．５μｇ／ｍｌ、５．１μｇ／ｍｌあるいは１２．５μｇ／ｍｌの濃度で各ウエルに加えられた。細胞は４４乃至４８時間恒温器で３７℃、５％ＣＯ₂で培養された。次いで０．５μＣｉの³Ｈ−チミジンが平板の各ウエルに２０μｌの量で加えられた。４乃至８時間後、細胞が収穫され、放射能が分当りカウント（ｃｐｍ）で測定された。ｃｐｍは本検定において増殖率に直接比例する。増殖割合の減少が各ウエルでされた。その結果は下記の表ＩＩＩで示される。前記表で示されるように、この検定においてインターロイキン−２およびガンシクロビルは単純性ヘルペスチミジンキナーゼ効果のみとほぼ匹敵する第三者効果を誘発する。単純性ヘルペスチミジンキナーゼおよびインターロイキン−２形質導入細胞が一緒に培養されると、第三者効果は相乗強化される。これが示唆することは、単純性ヘルペスチミジンキナーゼおよびインターロイキン−２の生体内相乗作用が単に免疫応答を増強するということでなく、説明し難い機構を含み、それによりインターロイキン−２が直接あるいは間接的にガンシクロビルに対する抗腫瘍応答に影響するということである。このような機構は免疫系の活性を含まない。実施例４実施例３の手法がＡ３７５黒色腫細胞に関して繰返された。野生型および形質導入細胞の各種の割合を含む各ウエルにおいて細胞増殖の減少パーセントが以下の表ＩＶで示される。実施例５実施例３の手法が７８６−０腎臓癌細胞に関連して繰返された。野生型および形質導入細胞の各種の割合を含む各ウエルにおいて細胞増殖の減少パーセントが以下の表Ｖで示される。実施例６１５人の女性で、すべてが１８才およびそれ以上の年令で腹腔に局在化した再発性あるいは進行性上皮卵巣癌を患っておりまたこの疾病の標準の治療に失敗した人達のそれぞれが腹腔内テンクホーフカテーテルを与えられる。カテーテルの設置の少なくとも２日後に、各患者は治療サイクルを開始する。このサイクルは各患者にＰＡ３１７／Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａ．７生産者細胞およびＰＡ３１７／Ｇ１Ｉ２ＧＳｖＮａ．１１生産者細胞をテンクホーフカテーテルを通じて４時間以上にわたり投与することにより開始される。投与される液全体の量は１および４リットルの間であり、生産者細胞は約２×１０⁶細胞／ｍｌから約１０×１０⁶細胞／ｍｌまでの濃度で５０：５０の細胞混合物として投与される。治療サイクル当りの生産者細胞の全数は約１×１０¹⁰細胞数である。患者が生産者細胞を受けて１４日後に、各患者はガンシクロビルを毎日５ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で１４日間受ける。ガンシクロビル治療の１４日の期間を終えた後、患者は７日間治療無しの期間を受け治療サイクルを終結する。ガンシクロビル治療のない７日目の終りに、治療サイクルが繰返される。この明細書で引用されるすべての特許、公開公報（公開された特許出願を含む）、およびデータベースエントリーの開示は、あたかもこのような個別の特許、公開情報、データベースエントリーが特異的かつ個別に引用例としてとり込まれるよう指示されたかのように、同じ範囲でその全体が引用例として特異的にとり込まれている。しかしこの発明の範囲は前記の特異的な実施例に限定されるものではない。この発明は特に説明されたもの以外にも実施することが出来、しかもなお以下の特許請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/04 ＡＤＵＣ１２Ｎ 5/10 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者ブレーズ，マイケル，アール. アメリカ合衆国，20854 メリーランド, ロックヴィル，ランカシャードライブ 1986

Claims

【特許請求の範囲】１．宿主にある一つの腫瘍を治療する一つの方法であって、ここで前記腫瘍は：（ａ）前記腫瘍に第１核酸配列を投与し、前記第１核酸配列は、一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬をコード化し、（ｂ）前記腫瘍に第２核酸配列を投与し、前記第２核酸配列は腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらす一つの作用薬をコード化し、ここで前記作用薬は一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬ではなく、ここで腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらし、またここで前記作用薬が一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬ではない前記作用薬は、前記宿主の負疫系とは関係なく一つの作用により前記相互作用薬の治療効果を高め、また（ｃ）前記腫瘍を前記相互作用薬を用いて治療する、ことよりなる第三者効果を高めることで、前記腫瘍が前記第三者効果に感受性であることを特徴とする方法。２．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記第１核酸配列および前記第２核酸配列が少くとも一つの発現ベクターに含まれることを特徴とする方法。３．請求の範囲第２項記載の方法であって、ここで前記少くとも一つの発現ベクターが前記第１核酸配列を含む一つの第１発現ベクターであり、また前記第２核酸配列を含む一つの第２発現ベクターであることを特徴とする方法。４．請求の範囲第３項記載の方法であって、ここで前記第１発現ベクターおよび前記第２発現ベクターのいずれもがウイルスベクターであり、また前記第１ウイルスベクターが第１生産者細胞系に含まれ、前記第２ウイルスベクターが第２生産者細胞系に含まれ、ここで前記第１生産者細胞系および前記第２生産者細胞系は腫瘍に投与され、またここで前記第１生産者細胞系は第１ウイルスを産出し、第２生産者細胞系は第２ウイルスを産出し、ここで前記第１ウイルスおよび前記第２ウイルスが前記腫瘍の細胞を形質転換するのに有効な量で投与されることを特徴とする方法。５．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記第１核酸配列が負の選択マーカーをコード化することを特徴とする方法。６．請求の範囲第５項記載の方法であって、ここで負の選択マーカーが単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼよりなるグループから選択されることを特徴とする方法。７．請求の範囲第６項記載の方法であって、ここで前記相互作用薬がガンシクロビルおよびアシクロビルよりなることを特徴とする方法。８．請求の範囲第７項記載の方法であって、前記相互作用薬がガンシクロビルであることを特徴とする方法。９．請求の範囲第１項記載の方法であって、前記第２核酸配列がサイトカインをコード化することを特徴とする方法。１０．請求の範囲第９項記載の方法であって、前記サイトカインがインターロイキンであることを特徴とする方法。１１．請求の範囲第１０項記載の方法であって、ここで前記インターロイキンが、インターロイキン−１，インターロイキン−１β，インターロイキン−２，インターロイキン−３，インターロイキン−４，インターロイキン−５，インターロイキン−６，インターロイキン−７，インターロイキン−８，インターロイキン−９，インターロイキン−１０，インターロイキン−１１、およびインターロイキン−１２よりなるクラスから選択されることを特徴とする方法。１２．請求の範囲第１１項記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン−２であることを特徴とする方法。１３．請求の範囲第４項記載の方法であって、前記第１ウイルスベクターおよび前記第２ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする方法。１４．請求の範囲第４項記載の方法であって、ここで前記第１生産者細胞系が宿主の体重の約１×１０⁶細胞／Ｋｇから約１×１０⁸細胞／Ｋｇの量で投与されることを特徴とする方法。１５．請求の範囲第４項記載の方法であって、ここで前記第２生産者細胞系が宿主の体重の約１×１０⁶細胞／Ｋｇから約１×１０⁸細胞／Ｋｇの量で投与されることを特徴とする方法。１６．請求の範囲第７項記載の方法であって、ここで前記相互作用薬が１日当り宿主体重の約５ｍｇ／Ｋｇから約１０ｍｇ／Ｋｇの量で投与されることを特徴とする方法。１７．請求の範囲第１項記載の方法であって、前記腫瘍が卵巣癌であることを特徴とする方法。１８．第１ウイルスベクターを含む第１生産者細胞、および第２ウイルスベクターを含む第２生産者細胞よりなる一つの組成物であって、前記第１ウイルスベクターは一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬をコード化する第１核酸配列を含み、前記第２ウイルスベクターは、腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらす一つの作用薬をコード化する第２核酸配列を含み、ここで前記作用薬は一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬ではなく、ここで腫瘍細胞の成長、妨げ、あるいは破壊をもたらす前記作用薬であって、前記作用薬は一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬ではない前記作用薬は、免疫系とは無関係な一つの作用によって前記相互作用薬の治療効果を高める、ことを特徴とする一つの組成物。１９．請求の範囲第１８項記載の組成物であって、ここで前記第１核酸配列が負の選択マーカーをコード化することを特徴とする組成物。２０．請求の範囲第１９項記載の組成物であって、前記負の選択マーカーが単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼよりなるグループから選択されることを特徴とする組成物。２１．請求の範囲第１８項記載の方法であって、前記第２核酸配列がサイトカインをコード化することを特徴とする組成物。２２．請求の範囲第２１項記載の方法であって、前記サイトカインがインターロイキンであることを特徴とする組成物。２３．請求の範囲第２２項記載の組成物であって、前記インターロイキンが、インターロイキン−１，インターロイキン−１β，インターロイキン−２，インターロイキン−３，インターロイキン−４，インターロイキン−５，インターロイキン−６，インターロイキン−７，インターロイキン−８，インターロイキン− ９，インターロイキン−１０，インターロイキン−１１、およびインターロイキン−１２よりなるクラスから選択されることを特徴とする組成物。２４．請求の範囲第２３項記載の組成物であって、前記インターロイキンがインターロイキン−２であることを特徴とする組成物。２５．請求の範囲第１８項記載の組成物であって、前記第１ウイルスベクターおよび前記第２ウイルスベクターのそれぞれがレトロウイルスベクターであることを特徴とする組成物。２６．宿主にある腫瘍を治療する一つの方法であって、ここで前記腫瘍が、（ａ）一つの核酸配列を前記腫瘍に投与し、前記核酸配列は一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える第１作用薬をコード化し、（ｂ）腫瘍細胞の成長の阻害、妨げ、あるいは破壊をもたらす第２作用薬を前記腫瘍に投与し、ここで前記第２作用薬は一つの相互作用薬に対する感受性を腫瘍細胞に与える一つの作用薬ではなく、ここで前記第２作用薬は前記宿主の免疫系とは無関係の一つの作用により前記相互作用薬の治療効果を高め、また、（ｃ）前記腫瘍を前記相互作用薬で治療する、ことよりなる一つの第三者効果を高めることにより、前記腫瘍が前記第三者効果に感受性になることを特徴とする一つの方法。２７．請求の範囲第２６項記載の方法であって、ここで前記第１作用薬をコード化する前記核酸配列が一つの発現ベクターに含まれることを特徴とする方法。２８．請求の範囲第２７項記載の方法であって、ここで前記発現ベクターが一つのウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターが一つの生産者細胞系に含まれ、前記生産者細胞系は腫瘍に投与され、前記生産者細胞系は一つのウイルスを生産し、前記ウイルスは前記腫瘍の細胞を形質転換するのに有効な量で生産されることを特徴とする方法。２９．請求の範囲第２６項記載の方法であって、前記第１作用薬が負の選択マーカーであることを特徴とする方法。３０．請求の範囲第２９項記載の方法であって、ここで前記負の選択マーカーが、単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼよりなるグループから選択されることを特徴とする方法。３１．請求の範囲第３０項記載の方法であって、前記相互作用薬がガンシクロビルおよびアシクロビルよりなるグループから選択されることを特徴とする方法。３２．請求の範囲第３１項記載の方法であって、前記相互作用薬がガンシンクロビルであることを特徴とする方法。３３．請求の範囲第２６項記載の方法であって、前記第２作用薬がサイトカインであることを特徴とする方法。３４．請求の範囲第３３項記載の方法であって、前記サイトカインがインターロイキンであることを特徴とする方法。３５．請求の範囲第３４項記載の方法であって、ここで前記インターロイキンが、インターロイキン−１、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、およびインターロイキン−１２よりなるクラスから選択されることを特徴とする方法。３６．請求の範囲第３５項記載の方法であって、前記インターロイキンがインターロイキン−２であることを特徴とする方法。３７．請求の範囲第２８項記載の方法であって、前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする方法。３８．請求の範囲第２８項記載の方法であって、ここで前記生産者細胞系が宿主の体重の約１×１０⁶細胞／ｋｇから約１×１０⁸細胞／ｋｇの量で投与されることを特徴とする方法。３９．請求の範囲第３１項記載の方法であって、ここで前記相互作用薬が１日当り宿主体重の約５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする方法。４０．請求の範囲第２６項記載の方法であって、前記腫瘍が卵巣癌であることを特徴とする方法。