JPH08511507A - 哺乳動物宿主の結合組織を処置するための遺伝子導入 - Google Patents

哺乳動物宿主の結合組織を処置するための遺伝子導入

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JPH08511507A
JPH08511507A JP6520222A JP52022294A JPH08511507A JP H08511507 A JPH08511507 A JP H08511507A JP 6520222 A JP6520222 A JP 6520222A JP 52022294 A JP52022294 A JP 52022294A JP H08511507 A JPH08511507 A JP H08511507A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、組換え法を用いて産物コード化遺伝子を含むDNAベクター分子を作製し、該産物コード化遺伝子を含むDNAベクター分子を用いて哺乳動物宿主の結合組織細胞に感染させることを含んでなる、哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法に関する。非ウイルス手段を用いて哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法を提供する。また、結合組織病理学の研究用のモデル動物を作出する方法も開示する。さらに、本発明はインターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインをコードする遺伝子をin vivoで使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物宿主の結合組織を処置するための遺伝子導入 関連出願に対する引照 本発明は、1990年12月20日付けでファイルされた、現在係属中の米国出願番号 No.07/630,981に対する一部継続出願である。 発明の背景 発明の分野 本発明は、哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少 なくとも1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法に 関する。本方法は、該産物コード化遺伝子を含むDNAベクター分子を利用する こと、及び該ベクター分子を使用して哺乳動物宿主の結合組織細胞に感染させる ことを開示する。 本発明は、哺乳動物宿主の処置に用いるために、宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法を提供し、 このような導入を効果的に行うために非ウイルスベクター媒体を利用する方法を も含む。 本発明はまた、結合組織病理学の研究用のモデル動物を作出する方法にも関す る。 本発明はまた、関節炎に関係した病理学的変化に抵抗するために、末端切断型 のインターロイキン−1受容体をコードする遺伝 子を使用する方法に関する。特に、本発明は、軟骨及び他の軟組織に対するイン ターロイキン−1の破壊作用を緩和するために、インターロイキン−1受容体の 細胞外インターロイキン−1結合領域をコードする遺伝子を、in vivoで哺乳動 物宿主の滑膜細胞に導入するための方法を提供する。代替法としては、患者自身 の滑膜細胞にin vitroで遺伝子導入し、例えば、関節内注入といった移植法を使 って炎症中の関節に戻す。滑膜のin vitro操作の代替法としては、目的の産物コ ード化遺伝子をリポソームに導入し、直接関節部に注入する。こうして、このリ ポソームは滑膜細胞に融合し、滑膜組織へのin vivo遺伝子導入が完了する。滑 膜を扱うin vitro操作のさらなる代替法としては、目的の産物コード化遺伝子を 、「裸の」DNAとして関節部に導入する。「裸の」DNAが滑膜組織細胞に入 り、その結果、滑膜細胞へのin vivo遺伝子導入が完了する。 他の代替法としては、造血系子孫細胞類または成熟リンパ球または骨髄細胞を 、in vitroでトランスフェクトし、回収後、当業者に公知である技術を用いて、 患者の骨髄に注入することも可能である。関連技術の簡単な説明 関節炎は、痛みを伴い、構造変化が起こることもたびたびある関節の炎症を含 む。関節炎は、感染、免疫疾患、外傷、及び例えば変形性関節症といったような 変形性関節疾患を含む多くの症状に起因し、または関連する。関節の軟骨劣化及 び細胞変化に関する生化学については、相当な研究が成された。 健全な関節にあっては、軟骨内の細胞(軟骨細胞)及び滑膜包囲細胞(滑膜細 胞)は休止状態にある。この休止状態において、上記細胞は、基底レベルのプロ スタグランジンE2、及び、例えば、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメ リシンのような種々の天然プロテイナーゼ類を分泌し、これらは、軟骨退化能を 持っている。関節炎病態の進行中、上記細胞類は活性化される。活性化状態にお いて、滑膜細胞及び軟骨細胞は、多量のプロスタグランジンE2及び中性域活性 のプロティナーゼ類を合成し、分泌する。 病理生理学的に関連性のある細胞活性化因子を同定しようとして様々な努力が 払われた結果、サイトカインであるインターロイキン−1は、軟骨細胞及び滑膜 細胞を活性化し、in vitroにおいてもin vivoにおいても軟骨破壊を誘発させる ことが知られるようになった。さらに、インターロイキン−1は滑膜細胞の増殖 因子であり、滑膜細胞のマトリックス合成を促進させるが、インターロイキン− 1の持つ二つの特性は、これが関節炎に伴う滑膜肥厚に関与しているらしいこと を示唆している。対照的に、インターロイキン−1は軟骨細胞による軟骨マトリ ックス合成を阻害することで、軟骨修復を抑制する。また、インターロイキン− 1は、骨吸収を誘導するが、このことによって関節リウマチに見られる骨密度の 減少が説明出来るのかも知れない。インターロイキン−1は、炎症を引起し、リ ンパ球の増殖因子として働き、走化因子でもある。もしかすると、多形核リンパ 球(PMN)類の活性化因子でもあるかも知れない。充分な濃度では、インター ロイキン−1は発熱、筋肉衰弱及び嗜眠症を引き起こすこともある。 関節におけるインターロイキン−1の主要供給源は滑膜である。インターロイ キン−1は常駐性滑膜細胞から分泌されるが、この滑膜細胞は、大食細胞及び他 の白血球類と一体となって炎症状態を引起こす。 「非ステロイド系抗炎症剤」として指定される一分類(以降”NSAID”と 略す)に属する薬剤の開発に、多大な関心が払われてきた。NSAIDは、軟骨 合成及び修復を阻害し、炎症を抑制する。NSAIDの作用機序は、生体組織に おけるプロスタグランジン合成の阻害に主として関連したものであると考えられ る。本剤開発の殆どが、シクロオキシゲナーゼ〔プロスタグランジン前駆体(エ ンドパーオキサイド)のアラキドン酸からの形成を触媒する極めて重要な酵素〕 に対する、より優れた阻害剤の合成に充てられてきた。NSAIDによる抗炎症 作用の一部は、炎症中に行われるプロスタグランジン合成及び放出を阻害するこ とによるものであると考えられる。プロスタグランジンは炎症中の白血球浸潤の 速度と程度を調節する役割を担っているものと考えられている。NSAIDには 、例えば、アセチルサリチル酸(アスピリン)、フェノプロフェン・カルシウム (登録商標;Nalfon,Pulvules:Dista Products 社)、イブプロフェン(登録商標;Motrin:Upjhon社)及びインド メタシン(登録商標;インドシン;Merck,Sharp&Dohme社)が 含まれる。 これとは対照的に、本発明の基盤をなす研究により、軟骨を退化させる能力を 有する中性域活性プロテインキナーゼ類の産生は、プロスタグランジン合成を完 全に遮断した場合でも起こること を示される。 関節炎における処置は、NSAIDのような標的型薬剤では、例えば関節のよ うな哺乳動物宿主の特異的な部位に到達させることができないことによって妨害 される。例えば、経口、静脈内または筋肉内投与のような慣例的なドラッグデリ バリー経路は、関節へ薬剤を送達させるのに、滑膜の経血管潅流に依っている。 この方法が効果的でない理由は、滑膜毛細血管から関節域への小分子の経滑膜輸 送が、一般的には受動拡散によって行われるからなのである。こうした拡散は、 送達される分子サイズが大きくなるにつれて、益々非効率的になってしまう。そ れ故、例えば、タンパク質のような大型の薬剤分子が関節部分に進入することは 、実質的に制限されることになる。薬剤の関節内注入は、こうした制約を回避し てはいるが、関節内に投与された薬剤の半減期は、一般的に短い。薬剤の関節内 注入に関するもう1つの障害は、例えば、関節炎のような慢性的容態を処置する ために関節域で許容される薬剤量を得るために、頻繁な注入を繰り返さなければ ならないことである。従来の治療用薬剤では、選択的に関節だけに到達させるこ とは出来なかったので、持続性のある関節内投与を達成させるためには、哺乳動 物宿主を全身的に、高濃度の薬剤に曝さなければならなかった。非標的器官をこ のような状態に曝すことは、哺乳動物宿主に胃腸障害、血液学系、心臓血管系、 肝臓系及び腎臓系の諸変化といったような重大な副作用を抗関節剤がもたらす傾 向をいよいよ増大させることになる。 化学的または生化学的手段によって、遺伝物質を哺乳動物宿主細胞内に導入す ることが出来ることは証明済である。更に、導入 遺伝物質を発現させて、特異的なタンパク質を哺乳動物宿主細胞により大量に合 成させることもできる。導入された遺伝子物質を保持している細胞は、対応する 抗生物質存在下で、形質導入細胞を選択的に生育させる場合の選択マーカーを与 える抗生物質耐性遺伝子を含めることがある。インターロイキン−1産生を阻害 する化合物もまた既に知られている。 米国特許No4,778,806は、非経口によって、2−2’−〔1,3− プロパン−2−オネジル−ビス(チオ)〕ビス−1H−イミダゾール、または薬 学上許容されるその塩を投与することにより、単核細胞及び/または大食細胞に よるインターロイキン−1の産生を阻害する方法を開示する。本特許は、インタ ーロイキン−1の産生を阻害する化合物を開示する。これとは対照的に、本発明 の一態様においては、インターロイキン−1に対する結合能を持ち、その作用を 緩和する遺伝子治療が用いられている。 米国特許No4,780,470は、4,5−ジアリル−2(置換)イミダゾ ールを投与することによって、ヒト体内での単核細胞によるインターロイキン− 1の産生を阻害する方法を開示する。更に、本特許はインターロイキン−1の産 生を阻害するための化合物を開示する。 米国特許No.4,794,114は、チアゾル環、ピロリジン環またはピペ リジン環に融合したジアリル置換イミダゾール、または薬学的に許容されるその 塩を投与することによって5−リポオキシゲナーゼ経路を遮断する方法を開示す る。本特許はまたインターロイキン−1の産生を阻害する化合物を開示する。 米国特許No.4,870,101は、薬学的に許容される、ジスルフィラム 、テトラキス〔3−(2,6)−ジ−テルト−ブチル−4−ヒドロキシフェニル )プロピオニロキシメチル〕メタンまたは2,4−ジ−イソブチル−6−(N, N−ジメチルアミノメチル〕−フェノールのような抗オキシダント化合物を有効 量投与することによって、インターロイキン−1の放出を阻害し、かつ、インタ ーロイキン−1の介在する病態を緩和する方法を開示する。 米国特許No.4,816,436は、抗関節炎剤としてのインターロイキン −1使用のためのプロセスを開示する。本特許の陳述によれば、製剤化のための 適切な媒体と組合わせれば、関節内に注入投与して、関節炎または炎症の処置に 供することが可能である。これに対し、本発明は、関節炎に抵抗する方法として インターロイキン−1と結合し、その作用を緩和することのできる遺伝子を使用 および調製する方法を開示する。 米国特許No.4,935,343は、インターロイキン−1βには結合する が、インターロイキン−1αには結合しないモノクローナル抗体を利用して、イ ンターロイキン−1βを検出のためのイムノアッセイ法を開示する。本特許は、 モノクローナル抗体はインターロイキン−1βに結合し、インターロイキン−1 βがインターロイキン−1受容体に結合するのを阻害し、それによってインター ロイキン−1βの生物学的活性を阻害することを開示する。本特許で開示されて いるモノクローナル抗体は、組換DNA技術を用いる遺伝子工学を利用して、免 疫原を調製することによって入手可能である。この免疫原はマウスに注入され、 その 後、マウス脾臓細胞を骨髄細胞に融合させることによって不死生を獲得するに至 る。こうして得られた細胞には、雑種性連続的継代培養系(ハイブリドーマ=融 合雑種腫瘍細胞)があり、更に進んで、これをスクリーニングしてモノクローナ ル抗体を得ることも出来る。本特許の陳述によれば、その発明に係るモノクロー ナル抗体は、例えば、患者に免疫処置を施すといったような処置の場でも使用出 来るものである。即ち、モノクローナル抗体は、毒素と結合して免疫毒素となる こともあり得るし、放射性物質または薬物と結合して放射性薬剤ないし通常薬剤 になることもあり得る。 米国特許No.4,766,069は、ヒトインターロイキン−1遺伝子DN A配列を含む組換DNAクローニングベクターを開示する。本特許は、ヒトイン ターロイキン−1βの調製法及びその回収法を提供する。本特許は、T細胞及び B細胞を剌激し、免疫グロブリン合成を増大させる能力があることを利用したイ ンターロイキン−1のヒト免疫学的試薬としての用途を開示する。 米国特許No.4,396,601は哺乳動物宿主に遺伝的能力を補足的に供 与する方法を開示する。即ち、本特許は、宿主から再生能を持つ細胞を摘出した 後、遺伝物質が発現され、複製されることのできる宿主細胞の選択にとって有利 に働く少なくとも1つのマーカーを含む遺伝物質を用いて処理するプロセスを提 供する。本特許は、修飾された宿主細胞は、再生が可能となる条件下に宿主に戻 されることを記載する。本発明においては、遺伝子物質は、直接(a)宿主細胞 にin vivoで、または(b)引き続いて患者の関節に移植して戻すために滑膜細 胞にin vitroで導入 することが可能である。 米国特許No.4、968、607は、インターロイキン−1に結合性を示す 哺乳動物のインターロイキン−1受容体タンパク質をコードするDNA配列を開 示する。 上記の先行技術にもかかわらず、哺乳動物宿主の処置に用いるために、少なく とも1つの産物コード化遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細 胞中にin vitroで、あるいは、in vivoで導入する方法に対し、非常に現実的で 実質的な必要性が存在している。更に、末端切断型のインターロイキン−1受容 体をコードする遺伝子を、関節炎に関係する有害な病理学的変化に抵抗するのに 用いる方法に対する必要性も存在する。特に、インターロイキン−1受容体の細 胞外インターロイキン−1結合領域をコードし、インターロイキン−1に結合し てその作用を緩和することのできる遺伝子を、in vivoで宿主の滑膜細胞に発現 させる方法に対する必要性も存在する。発明の概要 本発明は、前項に述べた要求を満足させるものである。本発明においては、あ る遺伝子産物をコードしている、少なくとも一つ以上の遺伝子を宿主の処置に使 用するために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞に導入する方法 が提供される。本方法は、組換技術を用いてその産物をコードしている遺伝子を 含有するDNAベクター分子を生成し、そしてその産物のコード化遺伝子を含む DNA分子を用いて哺乳動物宿主の結合組織に感染させる事である。DNAベク ター分子としては、標的細胞、また は組織内に送達され、そこで目的の遺伝子産物をコードしている遺伝子の安定的 発現が保持されるものであれば、如何なるDNA分子であっても構わない。本発 明において好ましく用いられるDNAベクター分子は、ウイルスDNAベクター 又はプラスミドDNAウイルス分子のいずれかである。本方法を治療用に用いる 場合、その遺伝子産物をコードしている遺伝子を哺乳動物の結合組織内に導入す る事が望ましい。 特に、本方法が利用する遺伝子としては、以下に挙げるグループから選ばれた 物質の内、少なくとも一つ以上をコードする事が可能な一つの遺伝子がある。即 ち、(a)ヒト・インターロイキン−1レセプターアンタゴニストタンパク質ま たはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しくは断片、(b)Lac Zマーカー 遺伝子、β−ガラクトシダーゼタンパク質または、それの生物学的活性を持つ誘 導体若しくは断片をコードすることができる(c)可溶性インターロイキン−1 ・レセプタータンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しくは断片( d)プロテイナーゼ阻害物質、及び(e)サイトカイン。 また、本方法が利用するウイルスベクターとしては、以下に挙げるグループか ら選ばれる少なくとも一つ以上のベクターが含まれる。即ち、(a)MFG及び BAGの内から選ばれる少なくとも一つを包含するレトロウイルス・ベクター、 (b)アデノ関連ウイルス、(c)アデノウイルス、及び(d)それらだけに限 定されるものではないが、単純ヘルペス1もしくは単純ヘルペス2を含むヘルペ スウイルス。 更に、本発明の他の実施例において利用される遺伝子としては 、以下に挙げるグループから選ばれた、少なくとも一つ以上の物質をコードし得 る遺伝子類がある。即ち、(a)ヒト・インターロイキン−1レセプターアンタ ゴニストタンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しくは断片、(b )βガラクトシダーゼタンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しく は断片をコードし得るLac Z マーカー遺伝子、(c)可溶性インターロイ キン1レセプター タンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しくは 断片、(d)プロテイナーゼ阻害物質、及び(e)サイトカイン。並びに、同様 に利用されるDNAプラスミドベクターとしては、送達手段を問わず、標的細胞 または標的組織に到達した後、直ちにその内部において安定的に保持されるもの であれば当業者に公知であるところの如何なるベクターであっても良い。こうし た手段の一つとして、ウイルス性またはプラスミドDNAベクター分子を、直接 標的細胞または標的組織に送達させる方法がある。この方法においても、以下に 挙げるグループの中から選ばれた、少なくとも一つ以上の物質をコードし得る遺 伝子を利用する。即ち、(a)ヒト・インターロイキン−1 レセプターアンタ ゴニストタンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しくは断片、(b )βガラクトシダーゼタンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しく は断片をコードし得る Lac Zマーカー遺伝子、(c)可溶性インターロイ キン−1・レセプター タンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若し くは断片、(d)プロテイナーゼ阻害剤及び(e)サイトカイン。 本発明に対して限定されるという意味ではなく、あくまで一実 施例として本発明において開示されている方法においては、インターロイキン− 1のコード化配列を含むDNAプラスミド・ベクターをサイトメガロウイルス( CMV)プロモーターの下流側に連結した。このDNAプラスミド構築物をリポ ソーム内に封入し、関節内経由で、宿主であるウサギの膝関節内に注入した。イ ンターロイキン−1が発現し、有意量のインターロイキン−1 βを滑膜細胞か ら回収した。この代替方法として、「裸の」(naked)プラスミドDNAを膝関 節に注入し、そのDNAを滑膜組織内に、直接トランスフェクトする方法がある 。 更に、本発明別の態様では、哺乳動物宿主の処置用として、結合組織の少なく とも一つの細胞に、その遺伝子産物をコードしている少なくとも一つの遺伝子を 導入する方法を提供する。本方法の場合には、その遺伝子産物をコードしている 遺伝子を結合組織細胞に導入する非ウイルス性媒体を利用する。 本方法の更に特殊な例としては、以下に挙げるグループの中の少なくとも一つ から選ばれた非ウイルス性媒体を利用している。即ち、(a)少なくとも一つの リポソーム、(b)Ca3(PO42、(c)エレクトロポレーション〔電気穿 孔法〕及び(d)DEAE−デキストラン。また、遺伝子として利用されるのは 、以下に挙げるグループの中から選ばれた少なくとも一つに物質をコードし得る 遺伝子である。即ち、(a)ヒト・インターロイキン−1・レセプターアンタゴ ニストタンパク質またはその生物学的活性を持つ誘導体若しくは断片、(b)β −ガラクトシダーゼタンパク質またはそれの生物学的活性を持つ誘導体若しくは 断片をコードし得るLac Zマーカー遺伝子、(c)可溶性イン ターロイキン−1 レセプタータンパク質又はその生物学的活性を持つ誘導体若 しくは断片、(d)プロティナーゼ阻害物質、(e)可溶性腫瘍壊死因子レセプ タータンパク質またはその生物学的活性を持つ誘導体若しくは断片、及び(f) サイトカイン。 本発明の別の態様では、哺乳動物宿主の処置用に、その少なくとも一つの細胞 に、ある産物をコードしている少なくとも一つの遺伝子を導入する為の補足的な 手段を提供している。この補足的な方法では、標的細胞または組織にDNAベク ター分子を送達する為に、ウイルスを用いた生物学的手段が利用される。使用ウ イルスは偽ウイルスであり、かつ、そのゲノムが改変されて標的細胞内へ送達さ れた後、その場で複製する能力を保持せずに安定的に維持される能力だけを備え る様になったものの方が好ましい。改変ウイルスゲノムに組換DNA技術による 操作を加え、このウイルスゲノムが目的とする異型遺伝子を含有するDNAベク ター分子として働き、標的細胞または組織内で確実に発現される様にする。 また、本方法で利用する遺伝子としては、以下に挙げるグループから選ばれた 物質の内、少なくとも一つをコードし得る遺伝子である。即ち、(a)ヒト・イ ンターロイキン−1 レセプターアンタゴニストタンパク質またはその生物学的 活性を持つ誘導体若しくは断片、(b)ガラクトシダーゼタンパク質またはその 生物学的活性を持つ誘導体若しくは断片をコードし得るLac Zマーカー遺伝 子、(c)可溶性インターロイキン1・レセプタータンパク質またはその生物学 的活性を持つ誘導体若しくは断片。(d)プロテイナーゼ阻害物質及び(e)サ イトカイン。 本方法の別の態様は、結合組織病態研究用の動物モデルを構築する為の方法で あり、ここでは、少なくとも一つの遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織細胞の少な くとも一つの細胞に導入する方法を含むものである。 本発明の別の態様は、細胞外インターロイキン−1・レセプター結合ドメイン をコードしている遺伝子を使用する方法を提供する。この遺伝子は、in vitroで インターロイキン−1と結合して、その作用を中和して、哺乳動物宿主における 軟骨破壊を殆ど阻止する事ができる。 従来の薬理学的な試みとは異なり、本発明に係る方法は、in vivoの遺伝子治 療を用いて関節炎による影響で患者が陥る慢性的衰弱に対処しようとするもので ある。 本発明に係る末端切断型のインターロイキン−1・レセプターをコードしてい る遺伝子を使用する好ましい方法は、組換DNA技術を利用して、末端切断型の インターロイキン−1・レセプターをコードしている遺伝子を包含する感染性レ トロウイルス粒子を産生する細胞系を作製することである。このウイルス粒子産 生用の細胞系の作製は、以下の手順で行われる。即ち、まず、レトロウイルス・ ベクター中の、適切な真核細胞のプロモーターの制御下にある部分に、目的の遺 伝子コードを挿入する。次に、遺伝子コードを含むレトロウイルス・ベクターを 、レトロウイルスパッケージング細胞系にトランスフェクトさせて、末端切断型 インターロイキン−1・レセプターをコードしている遺伝子の発現能を持つウイ ルス粒子を産生させ、そして、こうして得られたウイルス粒子を用いて、哺乳動 物宿主の滑膜細胞に感染させる。 更に、特異的な例として、前項で述べた末端切断型インターロイキン−1・レ セプターをコードしている遺伝子を使用する方法の場合には、レトロウイルスパ ッケージング細胞系から得たウイルス粒子を関節内に直接注入することによって 、哺乳動物宿主の滑膜細胞で内側が覆われた関節部分に導入する事を伴う。好ま しい態様においては、膝関節から回収された滑膜細胞は、in vitroで培養後、遺 伝子治療用の送達システムとして用いられる。 出願人が特異的に開示した滑膜細胞の使用だけに限定されない事は明らかであ ろう。in vitroの培養技術用としては、滑膜以外に皮膚細胞の様な他の組織源の 利用が可能であろう。本発明に係る遺伝子の使用方法としては、関節炎の予防を 目的としても、またその治療を目的としても、両用に利用が可能である。出願人 は、膝関節に対する予防的又は治療的用途だけに限定していないのは明らかであ る。本発明は、如何なる関節炎に対する予防的又は治療的措置に使用する事も可 能であろう。 本発明の別の態様は、前項で述べた、末端切断型インターロイキン−1 レセ プターをコードしている遺伝子の使用法であり、滑膜細胞の培養時に、ウイルス 粒子に感染させてから本来の関節に自家移植される。本発明に係る遺伝子を使用 する本方法の場合もまた、障害を被りがちな如何なる領域に対する予防用として も、関節の治療用としても利用し得る。 別の態様では、インターロイキン−1に結合して、その作用を中和する事が出 来るインターロイキン−1・レセプターの細胞外インターロイキン−1受容体結 合ドメインをコードしている遺伝子を使用する方法としては、組換えDNA技術 を利用して、二つ の遺伝子を担うレトロウイルス・ベクターを作製する事を含む。それらの遺伝子 の内の一つは、インターロイキン−1レセプターの細胞外インタートロキン−1 受容体結合ドメインをコードしており、他の一つは、選別的抗生物質耐性をコー ドしている。本方法を使用する場合は、レトロウイルス・ベクターをレトロウイ ルスパッケージング細胞系にトランスフェクトさせて、この遺伝子を担う感染性 レトロウイルス粒子を産生する細胞系を得る事を伴う。本発明の別の態様は、イ ンタートロキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1・レセプター結合ドメ インをコードしている遺伝子を調製する方法を提供し、以下の過程を含む。即ち 、まず、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を合成し、この増幅されたインター ロイキン−1・レセプターをコードしている配列をレトロウイルス・ベクター中 に導入し、レトロウイルス・ベクターをレトロウイルスパッケージング細胞系中 に感染させ、そして、レトロウイルスパッケージング細胞系からウイルス粒子を 回収する。 本発明に係る別の態様では、患者に対して、治療有効量で、非経口投与する為 の組成物を提供する。即ち、該組成物は、インタートロキン−1受容体の細胞外 インターロイキン−1・レセプター結合ドメインをコードしている遺伝子及び適 切な製剤的担体を含む。 本発明に係る別の態様においては、用意された混合物は、予防上有効量で患者 に非経口投与する為に、インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン −1・レセプター結合領域をコードしている遺伝子及び適切な製剤的担体を含む 組成物を提供する。 更に、別の態様では、造血系前駆細胞又は成熟リンパ細胞若しくは骨髄細胞を 、本発明の明細書全体を通じて開示されている遺伝子類の中の何れかを含有する DNAベクター分子を用いて感染させる事を伴う。こうしてトランスフェクトし た細胞を回収し、当業者には公知で利用可能である技術を用いて、患者の骨髄に 移植する。本方法の範囲において、拒絶反応を軽減する為に、受容者の骨髄由来 細胞の代わりに提供者の骨髄由来細胞を使用する事も可能であろう。 本発明の別の態様では、目的の遺伝子を含むDNA分子を関節に直接注入した 後、in vivoで滑膜細胞をトランスフェクトした。宿主の滑膜細胞をトランスフ ェクトする事によって、目的の異種遺伝子の安定的発現を助ける為に必要とされ る、摘出、培養、in vitroでのトランスフェクション選別、及びDNAベクター 含有の滑膜細胞(実施例の項で説明)の移植過程を省く事が出来る。DNA分子 を関節内に注入する方法には、以下に限定されるものではないが、DNA分子を カチオン性リポソーム中に包含させる方法、または、それ自体を関節に直接注入 する方法が含まれる。ここで、DNA分子は、膝関節への実施例での表現形式と は異なるが、DNAベクター分子と表現する方が好ましく、それには、ウイルス 性DNAベクター分子でも良いが、更に好ましいのは、DNAプラスミドベクタ ー分子である。目的の異種遺伝子の発現を確実なものにするため、真核細胞中で 活性を持つプロモーター断片を異種遺伝子のコード領域の上流側に直接挿入する 。当業者は、公知の手法及びベクター調製技術を利用して、DNA分子を滑膜組 織内に導入させた後、適切レベルの発現を確実なものとす る事が可能であろう。 本発明の目的は、哺乳動物宿主の処置用に結合組織細胞中にその遺伝子産物を コードしている少なくとも一つの遺伝子を導入する方法を提供する事である。 本発明の目的は、治療のために、哺乳動物宿主の少なくとも一つの結合組織細 胞中に、産物をコードしている遺伝子を導入する方法を提供する事である。 本発明の目的は、治療的特性を有するタンパク質をコードしている少なくとも 一つの遺伝子を、哺乳動物の関節の滑膜基層細胞中に導入する方法を提供する事 である。本発明の目的は、結合組織病理研究用の動物モデルを提供する事である 。 本発明の目的は、インターロイキン−1α及びインターロイキン1βを含む実 質的に全てのインターロイキン−1のイソ型と結合し、それらの作用を中和する 事の出来るインターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメ インをコードする遺伝子をin vivoで使用する方法を提供する事である。 本発明の目的は、インターロイキン−1の実質的に全てのイソ型と結合し、中 和することが可能であるが故に、軟骨破壊をほぼ完全に阻止し、関節部分を覆っ ている軟組織を保護するという遺伝子を、哺乳動物宿主においてin vivoで使用 する方法を提供する事である。 本発明の目的は、疾患がきわめて進行しやすい患者の関節炎を予防するため、 実質的に全てのインターロイキン−1のイソ型と結合し、それらの作用を中和す る事の出来る、インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合 ドメインをコード する遺伝子をin vivoで使用する方法を提供する事である。 本発明の目的は、関節炎患者の治療のため実質的に全てのインターロイキン− 1のイソ型と結合し、それらの作用を中和する事の出来る、インターロイキン− 1受容体の細胞外インターロイキン−1・レセプター結合ドメインをコードして いる遺伝子をin vivoで使用する方法を提供する事である。 本発明の目的は、関節炎にみられる慢性的衰弱を呈する病態生理に対応する遺 伝子のin vivoで使用する方法を提供する事である。 加えて、本発明の目的は、インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイ キン−1結合ドメインをコードしている遺伝子及び適当な製剤的担体を含む、非 経口的投与のための組成物を提供することである。 上記及びその他本発明の目的は、以下の明細書で述べられている処、即ち、そ れらに関する参照用添付図面及び請求項に追加されている目的をみれば、充分に 理解されるであろう。 図面の簡単な説明 図1は、レトロウイルスベクターMFGのNcol及びBamHIクローニン グ部位に挿入されたヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパク質 (IRAP)をコードするcDNAの構造を示す。 図2は、レトロウイルスベクターMFG中に挿入された選択用neoマーカー を有するヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパク質(IRAP )をコードするcDNAの構造を示す。 図3は、LacZ+関節内投与してから約1月後の、ウサギの膝から回収され た滑膜細胞の顕微鏡写真を示す。;neo滑膜細胞は本発明を利用して得た。 図4は、MFG−IRAPウイルスベクターを利用する本発明の方法を用いて 感染させたHIG−82細胞(Georescu1988)の4種類の培養によ るインターロイキン1受容体アンタゴニストタンパク質の産生を表すウエスタン ブロットを示す。 図5は、MFG−IRAP感染したHIG−82細胞により条件付けされた培 養液の添加による滑膜細胞の阻害を表すデータを示す。 図6は、リポフェクション使用時の滑膜細胞によるLacZ遺伝子の取込み及 び発現を示す。ウェル1−リポソーム単独処理したコントロール細胞;ウェル2 −DNA単独処理したコントロール細胞;ウェル3−DNA +150nmol eリポソーム;ウェル4−DNA +240nmoleリポソーム;ウェル5− DNA +300nmoleリポソーム;ウェル6−DNA +6 00nmoleリポソーム。 図7は、インターロイキン−1結合ドメインのアミノ酸アレンジメントを示す 。 図8A−8Cは、ヒト及びマウスのインターロイキン1受容体のアミノ酸配列 及びヌクレオチド配列を示す。 図9は、レトロウイルスベクター中に挿入された末端切断型インターロイキン −1受容体をコードする遺伝子を示す。発明の詳細な説明 本明細書中で用いる「患者」という用語は、ヒトを含むがそれのみに限らない 動物界のメンバーを指す。 本明細書中で用いる「哺乳動物宿主」という用語は、ヒトを含むがそれのみに 限らない動物界のメンバーを指す。 本明細書中で用いる「結合組織」という用語は、哺乳動物宿主の靱帯、軟骨、 腱および滑膜を含むが、これらに限らない。 本明細書中で用いる「DC-chol」という用語は、カチオンコレステロール誘導 体を含むカチオンリポソームを意味する。DC-chol分子は、X.GaoおよびL.Huan g,Biochem.Biophys.Res.Commun.,179:280-285(1991)に記載されるような 、第三アミノ基と、中程度の長さのスペーサーアーム(2個の原子)と、カルバ モイルリンカー結合を含む。 本明細書中で用いる「SF-chol」という用語は、カチオンリポソームの一種で あると定義される。 本明細書中でリポソームに関連して用いられる「生物学的に活性な」という用 語は、標的細胞の中へ機能性DNAおよび/またはタンパク質を導入する能力を 指す。 本明細書中で核酸、タンパク質、タンパク質断片またはその誘導体に関連して 用いられる「生物学的に活性な」という用語は、野生型の核酸またはタンパク質 によって誘起される既知の生物学的機能を模倣する核酸またはアミノ酸配列の能 力として定義される。 本明細書中で用いる「維持(maintenance)」という用語は、リポソーム送達 との関連において用いるとき、導入されたDNAが 細胞内にとどまる能力を指す。他との関連において用いるとき、それは、治療効 果を奏するように標的細胞または組織内にDNAがとどまる能力を指す。 結合組織は治療的にターゲッティングするのが難しい器官である。当技術分野 で知られている薬物送達(ドラッグデリバリー)の静脈および経口ルートは、こ うした結合組織へ接近しにくく、しかも治療薬を哺乳動物宿主の全身にさらすと いう欠点を抱えている。より詳細には、公知の関節内注入は関節への直接的接近 をもたらすものの、注入される薬物の大半は関節内半減期が短い。本発明は、こ うした問題を、哺乳動物宿主の処置に用いることのできるタンパク質をコードす る遺伝子を哺乳動物宿主の結合組織へ導入することによって解決するものである 。より詳しくは、本発明は、抗関節炎特性を有するタンパク質をコードする遺伝 子を哺乳動物宿主の結合組織へ導入する方法を提供するものである。 本発明は、組換え法を用いて、ある産物をコードする遺伝子を含むウイルスベ クターを作製し、該産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを用いて哺乳動 物宿主の結合組織細胞に感染させることを含んでなる、哺乳動物宿主の処置に用 いるための、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞への少なくとも1 つの産物コード化遺伝子の導入方法を提供する。この方法は、好ましくは、治療 に用いるために哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞に該産物コード 化遺伝子を導入することを含むものである。 本発明の一実施態様において、上述した方法は、該遺伝子として、ヒトインタ ーロイキン−1受容体アンタゴニストタンパク質 (IRAP)をコードしうる遺伝子を用いることを包含する。 本発明のもう一つの実施態様において、上述した方法は、該遺伝子として、β −ガラクトシダーゼをコードしうるLac Zマーカー遺伝子を用いることを包 含する。 本発明のもう一つの実施態様において、上述した方法は、該遺伝子として、可 溶性インターロイキン−1受容体をコードしうる遺伝子を用いることを包含する 。 本発明の他の実施態様は、該遺伝子として、少なくともプロテイナーゼ阻害剤 をコードしうる遺伝子を用いることを含む上述した方法を包含する。より詳細に は、この方法は、好ましくは、プロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナー ゼの組織阻害剤を用いることを包含する。 本発明の他の実施態様は、該遺伝子として、少なくとも1つのサイトカインを コードしうる遺伝子を用いることを含む上述した方法を包含する。より詳細には 、この方法は、サイトカインとして、インターロイキン−1α、インターロイキ ン−1β、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン− 4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、イ ンターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インタ ーロイキン−11、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因 子βより成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを包含する。 本発明の更なる実施態様は、サイトカインとして、少なくとも1つの形質転換 成長因子(transforming growth factor)を用いることを含む上述した方法を包 含する。より詳細には、この方法 は、形質転換成長因子として、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3および TGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを包含する。それぞれ の形質転換成長因子はR & D Systems(614 McKinley Place,N.E.,Minneapolis ,MN 55413)から販売されている。 本発明の別の実施態様において、上述した方法は、サイトカインとして、少な くとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いることを包含する。繊維芽細胞増殖因子 もR & D Systems(614 McKinley Place,N.E.,Minneapolis,MN 55413)から販 売されている。 本発明の別の実施態様は、ウイルスベクターとして、レトロウイルスベクター を用いることを含む上述した方法を包含する。より詳しくは、この方法には、レ トロウイルスベクターとして、MFGおよびBAGより成る群から選ばれる少な くとも1つの物質を用いることが含まれる。本発明の好ましい実施態様は、該遺 伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパク質をコード しうる遺伝子を用いること、およびレトロウイルスベクターとしてMFGを用い ることを含む上述した方法を包含する。 本発明の別の好ましい実施態様には、β−ガラクトシダーゼをコードしうる遺 伝子としてLac Zマーカー遺伝子を用いること、およびレトロウイルスベク ターとしてMFGを用いることを含む上述した方法が含まれる。 本発明の他の好ましい実施態様では、β−ガラクトシダーゼをコードしうる遺 伝子としてLac Z neoマーカー遺伝子を用いること、およびレトロウイ ルスベクターとしてBAGを用い ることを含む上述した方法が提供される。 本発明の最も好ましい実施態様において、上述した方法は、MFGおよびBA Gより成る群から選ばれるレトロウイルスベクターを用いること、および該遺伝 子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードしうる遺伝子を用いること を包含する。 本発明の別の実施態様では、該遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ 阻害剤をコードしうる遺伝子を用いること、およびレトロウイルスベクターとし てMFGおよびBAGより成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いるこ とを含む上述した方法が提供される。 本発明の他の実施態様では、レトロウイルスベクターとしてMFGおよびBA Gより成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いること、および該遺伝子 として先に記載した少なくとも1つのサイトカインをコードしうる遺伝子を用い ることを含む上述した方法が提供される。 本発明の他の実施態様では、組換え法を用いて、ある産物をコードする遺伝子 を含むウイルスベクターを作製し、該産物コード化遺伝子を含むウイルスベクタ ーを用いて哺乳動物宿主の結合組織細胞に感染させることを含んでなる、哺乳動 物宿主の処置に用いるための、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞 への少なくとも1つの該産物コード化遺伝子の導入方法が提供され、その際、該 ウイルスベクターはアデノ関連ウイルス、アデノウイルスおよびヘルペスウイル ス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型または単純ヘルペスウイルス2型)より 成る群から選ばれる少なくとも1つのベクターである。 この方法は、該遺伝子として、(a)ヒトインターロイキン−1受容体アンタ ゴニストタンパク質、(b)可溶性インターロイキン−1受容体、(c)β−ガラ クトシダーゼをコードしうるLac Zマーカー遺伝子、(d)少なくとも1つ のプロテイナーゼ阻害剤および(e)少なくとも1つのサイトカインを含む群か ら選ばれる少なくとも1つの物質をコードしうる遺伝子を用いることを包含する 。より詳細には、この方法は、プロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナー ゼの組織阻害剤を用いること、およびサイトカインとして(a)TGF−β1、T GF−β2、TGF−β3およびTGF−αより成る群から選ばれる少なくとも1 つの形質転換成長因子、(b)少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子、(c)イン ターロイキン−1α、(d)インターロイキン−1β、(e)インターロイキン− 2、(f)インターロイキン−3、(g)インターロイキン−4、(h)インター ロイキン−5、(i)インターロイキン−6、(j)インターロイキン−7、(k )インターロイキン−8、(l)インターロイキン−9、(m)インターロイキン −10、(n)インターロイキン−11、(o)インターロイキン−12、(p) 腫瘍壊死因子αおよび(q)腫瘍壊死因子βを含む群から選ばれる少なくとも1 つの物質を用いることを包含する。 本発明の他の実施態様は、靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる 結合組織へ該遺伝子を導入することを含む上述した方法を包含する。この方法で は靱帯として十字靱帯(cruciate ligament)を用いることが好ましい。最も好 ましくは、この方法には十字靱帯として前十字靱帯(anterior cruciate ligame nt)および後十字靱帯(posterior cruciate ligament)より成る群から 選ばれる靱帯を用いることが含まれる。 本発明の他の実施態様は、維持および発現が可能なDNAを有する遺伝子を該 遺伝子として用いることを含む上述した方法を包含する。 本発明の更なる実施態様は、該遺伝子をin vitroで該細胞内に導入することを 含む上述した方法を包含する。この方法は、その後、感染細胞を哺乳動物宿主に 移植することを包含する。この方法はまた、結合組織細胞に感染させた後であっ て、その感染細胞を哺乳動物宿主に移植する前に、感染した結合組織細胞を保存 することを包含する。当業者には、感染した結合組織細胞を液体窒素下で10% DMSO中に入れて凍結保存できることが理解されよう。この方法は、関節炎に 非常にかかりやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に防止するため に該方法を用いることを包含する。 本発明の方法は、関節炎にかかった哺乳動物宿主に対して治療のために該方法 を用いることを包含する。この方法は、靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群か ら選ばれる結合組織を修復および再生させるために該方法を用いることを包含す る。この方法には、ヒトである哺乳動物宿主に対して該方法を用いることが含ま れる。 本発明の別の実施態様は、ある産物をコードする遺伝子を含むウイルスベクタ ーを哺乳動物宿主に直接導入することにより結合組織細胞にin vivo感染させる ことを含んでなる、上述した哺乳動物宿主の処置に用いるための、哺乳動物宿主 の結合組織の少なくとも1つの細胞への少なくとも1つの該産物コード化遺伝子 の導入方法を包含する。好ましくは、この方法は関節内注入により 哺乳動物宿主に直接導入することを含む。この方法は、関節炎に非常にかかりや すい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に防止するために該方法を用い ることを包含する。この方法はまた、関節炎にかかった哺乳動物宿主に対して治 療のために該方法を用いることを包含する。さらに、この方法には、先に規定し た結合組織を修復および再生させるために該方法を用いることが含まれる。 本発明のさらに別の実施態様において、哺乳動物宿主の処置に用いるための、 哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞への少なくとも1つの産物コー ド化遺伝子の導入方法は、該産物コード化遺伝子を結合組織細胞に導入するため の非ウイルス手段を用いることを包含する。この方法は、少なくとも1つのリポ ソーム、Ca3(PO4)2、エレクトロポレーションおよびDEAE−デキストランよ り成る群から選ばれる非ウイルス手段を用いることを包含する。この方法には、 リポソームとして、DC-cholおよびSF-cholより成る群から選ばれる物質を使用す ることも含まれる。 結合組織細胞へ産物コード化遺伝子を導入するための非ウイルス手段を用いる ことを含んでなる、哺乳動物宿主の処置に用いるための、哺乳動物宿主の結合組 織の少なくとも1つの細胞への少なくとも1つの産物コード化遺伝子の導入方法 は、非感染性の送達システムであることが理解されよう。非感染性の送達システ ムを利用することの利点は、挿入突然変異誘発の排除と、ウイルスにより誘発さ れる疾病の排除にある。 リポソームを用いるウイルスベクターは、レトロウイルスの結合組織細胞への 感染および組込みに必要とされる細胞分裂によっ て制限されないことが当業者には理解されよう。上述した非ウイルス手段を用い る方法は、該遺伝子として、(a)ヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニ ストタンパク質、(b)β−ガラクトシダーゼをコードしうるLac Zマーカ ー遺伝子、(c)可溶性インターロイキン−1受容体、(d)少なくとも1つのプ ロテイナーゼ阻害剤、(e)少なくとも1つの形質転換成長因子、および(f)少 なくとも1つのサイトカインを含む群から選ばれる少なくとも1つの物質をコー ドしうる遺伝子を用いることを包含する。より詳細には、この方法は、サイトカ インとして、インターロイキン−1α、インターロイキン−1β、インターロイ キン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン− 5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−8、イ ンターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロイキン−11、イン ターロイキン−12、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、少なくとも1つの繊維 芽細胞増殖因子および少なくとも1つの形質転換成長因子を含む群から選ばれる サイトカインを用いることを包含する。好ましくは、この方法には、形質転換成 長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3およびTGF−αより成 る群から選ばれる成長因子を用いることが含まれる。 本発明の別の好ましい実施態様には、プロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロ テイナーゼの組織阻害剤を用いることを含む上記の非ウイルス手段を用いる方法 を提供することが含まれる。産物コード化遺伝子を結合組織細胞へ導入するため に非ウイルス手段を用いる該方法は、靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から 選 ばれる結合組織へ該遺伝子を導入することを包含する。好ましくは、この方法に は靱帯として十字靱帯を用いることが含まれる。十字靱帯は前十字靱帯および後 十字靱帯より成る群から選ばれる。 本発明の他の実施態様は、上記の非ウイルス手段を用いること、および維持お よび発現が可能なDNAを有する遺伝子を該遺伝子として用いることを含んでな る、哺乳動物宿主の処置に用いるための、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞への少なくとも1つの産物コード化遺伝子の導入方法を提供する。 本発明の更なる実施態様では、産物コード化遺伝子を結合組織細胞へin vitro で導入するために非ウイルス手段を用いること、続いて該遺伝子を有する細胞を 哺乳動物宿主へ移植することを含んでなる、哺乳動物宿主の処置に用いるための 、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞への少なくとも1つの産物コ ード化遺伝子の導入方法が提供される。本発明の別の実施態様は、結合組織細胞 へ産物コード化遺伝子を導入した後であって、該遺伝子を有する結合組織細胞を 哺乳動物宿主に移植する前に、該遺伝子を有する結合組織細胞を保存することを 含む方法を提供する。この方法は液体窒素下で10%DMSO中に入れて凍結さ せた結合組織細胞を保存することを含む。この方法には、関節炎に非常にかかり やすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に防止するために該方法を用 いることが含まれる。さらに、この方法は、関節炎にかかった哺乳動物宿主に対 して治療のために該方法を用いることを包含する。この方法は、靱帯、軟骨、腱 および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再生させるために該方 法を用いることを包含する。 本発明の更なる実施態様は、哺乳動物宿主の結合組織細胞へ産物コード化遺伝 子を直接導入するためにin vivoで非ウイルス手段を用いることを含んでなる、 哺乳動物宿主の処置に用いるための、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つ の細胞への少なくとも1つの産物コード化遺伝子の導入方法を提供する。非ウイ ルス手段は少なくとも1つのリポソーム、Ca3(PO4)2およびDEAE−デキスト ランより成る群から選ばれる。好ましくは、この方法は関節内注入によって哺乳 動物宿主へin vivo導入することを含む。この方法には、関節炎に非常にかかり やすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に防止するために該方法を用 いることが含まれる。さらに、この方法は、関節炎にかかった哺乳動物宿主に対 して治療のために該方法を用いることを包含する。この方法はまた、靱帯、軟骨 、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再生させるために 該方法を用いることを包含する。 本発明の他の実施態様は、結合組織病理学の研究用のモデル動物を作る方法を 提供する。当業者には理解されるように、一般に、哺乳動物宿主の関節において インターロイキン−1が過剰に発現されることは関節炎症状を誘起させる原因と なる。本発明は、上述した本発明の遺伝子移入技術を使ってモデル動物を作出す るための方法を提供する。好ましくは、本発明の方法は、関節炎のためのモデル 動物をもたらす上述した本発明の遺伝子移入技術を使ってモデル動物を作出する 方法を提供する。例えば、本発明による遺伝子移入法にしたがってウサギの関節 においてインターロイキン−1を構成的に発現させると、関節炎の症状が現れる 。この モデルウサギは治療薬の試験に用いるのに適していることが当業者には理解され よう。この方法は、(a)組換え法を用いて産物コード化遺伝子を含むウイルス ベクターを作製し、そして(b)モデル動物を得るために該産物コード化遺伝子 を含むウイルスベクターを用いて哺乳動物宿主の結合組織細胞に感染させること を含んでなる、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞へ少なくとも1 つの該産物コード化遺伝子を導入することを包含する。この方法はサイトカイン およびプロテイナーゼより成る群から選ばれる物質を該遺伝子として用いること を含む。この方法はサイトカインとしてインターロイキン−1α、インターロイ キン−1βおよび腫瘍壊死因子−α(TNF−α)より成る群から選ばれる物質 を用いることを含む。この方法はプロテイナーゼとしてマトリックス・メタロプ ロテイナーゼを用いることを含む。マトリックス・メタロプロテイナーゼはコラ ゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメリシンより成る群から選ばれる酵素であ る。「コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメリシン」という用語の使用に は複数が含まれ、単数に限らないことが明らかだろう。当技術分野では、マトリ ックス・メタロプロテイナーゼとして多くのコラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよび ストロメリシンを本発明において使用できることが公知である。本発明の更なる 実施態様は、モデル動物を得るべく、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つ の細胞へ少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入するために非ウイルス手段 を用いることを含んでなる、結合組織病理学の研究用のモデル動物を作出する方 法を提供する。非ウイルス手段は少なくとも1つのリポソーム、Ca3(PO4)2、エ レクトロポレー ションおよびDEAE−デキストランより成る群から選ばれる。この方法はサイ トカインおよびプロテイナーゼより成る群から選ばれる物質を該遺伝子として用 いることを包含する。この方法はサイトカインとしてインターロイキン−1α、 インターロイキン−1βおよびTNF−αより成る群から選ばれる物質を用いる ことを含む。この方法はまたプロテイナーゼとしてマトリックス・メタロプロテ イナーゼを用いることを含む。マトリックス・メタロプロテイナーゼとしてはコ ラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメリシンより成る群から選ばれる酵素が 含まれる。 本発明の更なる実施態様は、該遺伝子として、(a)ヒトインターロイキン− 1受容体アンタゴニストタンパク質またはその生物学的に活性な誘導体もしくは 断片、(b)β−ガラクトシダーゼをコードしうるLac Zマーカー遺伝子ま たはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片、(c)可溶性インターロイキン −1受容体タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片、(d) プロテイナーゼ阻害剤、(e)可溶性腫瘍壊死因子受容体タンパク質またはその 生物学的に活性な誘導体もしくは断片、および(f)サイトカインを含む群から 選ばれる少なくとも1つの物質をコードしうる遺伝子を使用すること、ならびに DNAベクターとして、任意のDNAベクターを用いること、好ましくは、採用 した送達方法の如何にかかわらず、送達したときに標的細胞または組織内に安定 した状態で維持され得る当業者に知られたプラスミドまたはウイルスベクターを 用いることを包含する。本発明の一実施態様では、対象遺伝子を含むDNA分子 の直接関節内注入の後に滑膜細胞がin vivoでトランスフェクトされる。宿主滑 膜細 胞のトランスフェクションは、対象の異種遺伝子の安定した発現を促進するため の分離、培養、in vitroトランスフェクション、選択およびDNAベクター含有 滑膜細胞の移植(「実施例」に記述される)の要件を回避する。関節内へのDN A分子の注入方法としては、カチオンリポソームへのDNA分子のカプセル化ま たは関節内へのDNA分子自体の直接注入があるが、これらに限らない。滑膜組 織のin vivoトランスフェクション後の対象の異種遺伝子の発現は、真核細胞内 で作用するプロモーター断片を異種遺伝子のコード領域の上流に直接挿入するこ とにより確実にされる。当業者であれば、滑膜組織へのDNA分子の挿入後に適 切な発現レベルを確保するための公知のベクター構築法を利用することができよ う。本発明の一例として(限定ではない)、CMVプロモーターの下流に連結さ れたインターロイキン−1βコード配列を含むDNAプラスミドベクターがリポ ソーム内にカプセル化され、そして宿主ウサギの膝関節に注入された。関節内注 入部位の滑膜組織からは相当量のインターロイキン−1βが回収されたので、イ ンターロイキン−1βが滑膜組織において発現されていた。 本発明の更なる実施態様は、哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿 主の結合組織の少なくとも1つの細胞へ少なくとも1つの産物コード化遺伝子を 導入するための別の方法を提供する。この別法は、標的細胞または組織へDNA ベクター分子を送達するためにウイルスを利用する生物学的手段を用いることを 包含する。好ましくは、ウイルスは偽ウイルスであり、偽ウイルスは標的細胞内 への送達および安定した維持を可能にする能力のみ を有し、標的細胞または組織内で複製する能力を保持しないようにそのゲノムが 変異されているものである。変異ウイルスゲノムを組換えDNA法によってさら に操作して、標的細胞または組織内で発現される対象の異種遺伝子を含むDNA ベクター分子としてウイルスゲノムが機能するようにする。この方法はまた、該 遺伝子として、(a)ヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパク 質またはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片、(b)β−ガラクトシダー ゼタンパク質またはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片をコードしうるL ac Zマーカー遺伝子、(c)可溶性インターロイキン−1受容体タンパク質 またはその生物学的に活性な誘導体もしくは断片、(d)プロテイナーゼ阻害剤 、(e)可溶性腫瘍壊死因子受容体タンパク質またはその生物学的に活性な誘導 体もしくは断片、および(f)サイトカインを含む群から選ばれる少なくとも1 つの物質をコードしうる遺伝子を使用することを包含する。 以下の実施例は、制限としてではなく、本発明の例示として提供されるもので ある。 実施例I AAVのパッケージング 組換え体アデノ関連ウィルス(AAV)ベクターの複製及びパッケージングに必 要なシスのみにしか作用しない配列は、AAV末端リピートである。ウィルスの複 製及びパッケージングに影響を及ぼすことなく4kbまでのDNAをその末端反復間 に挿入することができる。ウィルスrepタンパク質及びウィルスカプシドタンパ ク質は、アデノ関連ウィルスヘルパーにおいてそうであるようにウィルス複製の ためにトランスである必要がある。組換え体AAVベクターをパッケージするため には、末端リピートと治療用遺伝子を含むプラスミドを、rep及びカプシドタン パク質を発現するプラスミドと同時に細胞中に共トランスフェクトする。次にト ランスフェクトされた細胞に、トランスフェクトの約48〜72時間後において、ア デノ関連ウィルス及び細胞から単離されたウィルスを感染させる。上清を約56℃ に加熱し、アデノ関連ウィルスを不活化し、組換え体AAVの純粋なウィルストッ クを残す。 実施例II エレクトロポレーション エレクトロポレーションにかける結合組織細胞を、約107細胞/mlの濃度でヘペ ス緩衝生理食塩水(HBS)中に置く。エレクトロポレーションされるDNAを、約5 〜20μg/ml(HBS)の濃度で加える。混合物をキュベット中に入れ、Bio-RADエレ クトロポレーション装置(1414 Harbour Way South,Richmond,CA 94804)のキ ュベットホルダーに挿入する。殆どの真核生物細胞種においてDNA を導入するためには約960マイクロファラッドの静電容量で250〜300ボルトが必 要である。DNA及び細胞をBio-RADの装置のホルダーに挿入した後、ボタンを押し 、細胞-DNA溶液に設定電圧をかける。細胞はキュベットから除去され、プラスチ ック皿上に再プレート化される。 実施例III 図1に示したように、ヒトインターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IRAP) をコードするcDNAを、レトロウィルスベクターMFGのNcoI及びBamHIクローニング 部位に挿入した。具体的には、IRAP cDNAからのPstIからBamHIのフラグメントを 、NcoI部位(IRAPの翻訳開始部位を示す)からPstI部位(NcoI部位から約12塩基 対下流)までの合成オリゴヌクレオチドアダプターに結合し、NcoI及びBamHIで 消化したMFGバックボーンに結合する、3つの部分の連結反応において行った。 この1つの合成オリゴ体と2つのDNAフラグメントを含む3つの部分の連結は、 クローニングの分野における当業者に周知である。LTRは長い末端リピート(lon g terminal repeats)を意味し、5'SDは5'スプライス供与体を意味し、3'SAは3' スプライス受容体を意味する。図1のまっすぐな矢印と曲がった矢印はそれぞれ スプライシングされていないmRNAとスプライシングされたmRNAを示す。IRAPはス プライシングされたメッセージによりコードされる。 図2は、選択可能なneo遺伝子マーカーを有するヒトインターロイキン-1受容 体アンタゴニストタンパク質(IRAP)をコードするcDNAを示す。図3は、Lac Z+ 、neo +滑膜細胞の関節内注射の 1か月後のウサギの膝から得た滑膜の低出力顕微鏡写真を示す。組織はβ−ガラ クトシダーゼの存在について組織化学的に染色した。エオシンで対比染色したこ の顕微鏡写真は、強く染色された移植細胞の領域を示しており、これらの細胞が 宿主動物関節の滑膜内層をコロニー化したことを示している。 実施例IV 動物モデル 哺乳類の関節の滑膜に遺伝子を移す本発明の方法は、従来は可能でなかった関 節病理の発生と分析を可能とする。これは、可能性のある関節炎誘発性(arthri otogenic)化合物を関節に到達させる他の方法としては関節内注射しかなかった ことによるものである。そのような化合物は関節から短時間に消失してしまうば かりでなく、これらの化合物のボーラス注射の効果は、それらが長期間にわたっ て定常的に生成されるような生理的条件を正確に模倣するものではない。これに 対し、本発明の遺伝子移送技術は、関節炎過程に関与することが知られているか あるいは推測されている選択されたタンパク質を長期間、例えば少なくとも3か 月間にわたって関節内に発現させることを可能とする。従って本発明の動物モデ ルは、それぞれの遺伝子産物の関節炎過程に対する重要性を個々に評価すること を可能にする。候補となる遺伝子は、限定するものではないが、例えばインター ロイキン-1(IL-1)α、IL-1β及びTNF-αのようなサイトカイン、並びに例えば コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、及びストロメリシンのようなマトリックスメタロ プロテイナーゼをコードするものである。 さらに本発明の遺伝子移送技術は、治療用として可能性のあるタンパク質のス クリーニングに使用するのにも適している。この使用においては、本発明の動物 モデルは、その滑膜が可能性のある抗関節炎タンパク質をコードする遺伝子を発 現する関節において開始される。タンパク質の候補は、限定するものではないが 、例えばメタロプロテイナーゼの組織阻害剤のようなプロテイナーゼの阻害剤、 並びに例えば形質転換成長因子βのようなサイトカインである。 実施例V 滑膜細胞を遺伝子治療のデリバリーシステムとして使用するための方法 4mlのネムブトール(nembutol)の静脈内注射によりウサギを屠殺し、迅速に 膝の毛を剃る。滑膜を各膝から無菌的な条件下に外科的に取り出し、トリプシン 及びコラゲナーゼ(平衡ゲイ塩溶液中の0.2% w/v)によるそれぞれ約30分及び約 2時間の連続的な消化により細胞をその周囲のマトリックスから取り出す。この ようにして回収した細胞を、10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン及び約10 0)g/mlのストレプトマイシンを補充した4mlのハムF12栄養培地を入れた25cm2 培養フラスコに接種し、95%の空気及び5%のCO2の雰囲気中で37℃においてイン キュベートする。約3〜4日のインキュベートの後、細胞は集団となる。この段 階で培養培地を除去し、細胞シートを約5mlのグレイ平衡化塩溶液で2回洗浄し 、リンパ球のような非接着細胞を除去する。次いで接着細胞をトリプシン(平衡 塩溶液中の0.25% w/v)により処理す る。この処理により、繊維芽細胞のB型滑膜細胞は脱着されるが、マクロファー ジ、多形核白血球及びA型滑膜細胞は培養容器に結合したまま残される。脱着さ れた細胞を回収し、1:2の分割比で25cm2培養容器中に再接種し、培地を加え、培 養物をインキュベーターに戻す。集団が形成されたらこの手順を繰り返す。 3回目のこの過程の後で、細胞は均一に繊維芽細胞であり、B型滑膜細胞の均 一な集団を含む。この段階で、細胞に前記レトロウィルスベクターを感染させる 。 感染の後、約1mg/mlのG418を補充した新しい栄養培地(GIBCO/BRL,P.O.Box 68,Grand Island,NY 14072-0068)に細胞を移し、インキュベーターに戻す。 3日毎に培地を換え、その間、neo-細胞が死滅しneo+細胞が増殖して集団を形成 する。集団が形成されたときに上記したように細胞をトリプシン処理し、継代培 養する。X-galで染色してneo+細胞がLac Z+でもあることを確認するために1つ のフラスコを取っておく。継代培養が集団を形成したとき培地を回収し、IRAP、 可溶性IL-1R及び本明細書中に記載したその他の適当な遺伝子産物の存在につい て試験する。これで製造された滑膜細胞は移植できる状態となる。 移植の前日に、上記したようにしてトリプシン処理することにより細胞を回収 する。次いでこれらの細胞を栄養培地に懸濁し、未処理プラスチック遠心管中で 一晩インキュベートする。これらの条件において細胞は接着しないが、トリプシ ン処理により除去されたそれらの細胞表面タンパク質を再生する。 翌朝、細胞を遠心分離により回収し、ゲイ平衡化塩溶液中へ再懸濁することに より数回洗浄し、最終的にグレイ溶液中に約106 〜107細胞/mlの濃度で再懸濁する。この懸濁液の約1mlを関節内注射により宿主 ウサギの膝関節中に導入する。このためには、25-ゲージ皮下針を有する1mlシ リンジを使用する。注射は膝蓋腱を通して行う。X線不透性染料を注射して行っ た実験により、この方法により物質が関節の全ての部分にうまく導入されること が確認された。 実施例VI 実施例VのB型滑膜細胞の均一な集団の繊維芽細胞を全体として一様に製造す るための方法を行って、ウサギ滑膜繊維芽細胞の培養物を増殖させた。次いでこ れらの増殖したウサギ滑膜繊維芽細胞の培養物に、β−ガラクトシダーゼ(Lac Z)及びネオマイシン類縁体G418に対する耐性(neo+)をコードするマーカー遺 伝子を有する両栄養性レトロウィルスベクターを感染させた。感染及び約1mg/m lのG418を含む選択培地中での増殖の後、全ての細胞がβ−ガラクトシダーゼに ついての組織化学的染色において陽性に染色された。 Lac Zマーカー遺伝子を有するneo選択細胞を宿主ウサギの膝に移植して戻し、 これらの遺伝子のインビボにおける持続性と発現を調べた。移植の2週間後、宿 主動物膝の滑膜中のLac Z+細胞の島が観察された。これにより、本発明の方法の 、マーカー遺伝子をウサギ滑膜に導入しそれをその場で発現する能力が確認され た。 実施例VII neo選択Lac Z+滑膜細胞を細胞培養物から回収し、ゲイ平衡塩溶液中に懸濁し 、宿主ウサギの膝関節中に関節内注射した(それぞれの膝に約105〜107細胞)。 反対側の対照の膝にはキャリア溶液のみを与えた。移植後3か月までの間にウサ ギを屠殺し、その滑膜と周囲被膜を回収した。それぞれの試料を3種の方法によ り分析する。第3の滑膜は、全体的にβ−ガラクトシダーゼの存在について組織 化学的に染色した。第2の部分は、細菌β−ガラクトシダーゼに特異的な抗体を 使用する免疫細胞化学試験に使用する。最後の部分はトリプシン及びコラゲナー ゼにより消化して、回収された細胞をG 418の存在下に培養する。 滑膜組織のかたまりの染色により、肉眼で見えるLac Z+細胞の広範な範囲を明 らかになった。対照の滑膜は無色のままであった。滑膜の組織化学的試験により β−ガラクトシダーゼについて強く陽性に染色された細胞の島の存在が明らかに なった。これらの細胞は、滑膜内層の表皮層上に存在し、対照滑膜には存在しな かった。そのような組織からLac Z+,neo+細胞を増殖させることが可能であった 。対照組織から回収された細胞はLac Z-であり、G 418を培地に加えたとき死滅 した。これは、移植された形質導入滑膜繊維芽細胞が宿主動物関節の滑膜をうま く再コロニー化し、2つのマーカー遺伝子、Lac Z及びneoを発現し続けることを 示している。移植滑膜細胞中での関節内Lac Z及びneo発現は、一次細胞の使用に より3か月、HIG-82細胞系の使用により1か月維持された。 実施例VIII 本明細書の実施例中にこれまで記載した実施例の方法に基づき、そして当業者 に周知の標準的な組換え体技術を使用して図1に示すようにヒトIRAP遺伝子をMF Gベクター中に導入した。ウサギ由来の滑膜細胞培養物のこのウィルスベクター による感染の後、IRAPが培養培地に分泌された。 ヒトもしくはウサギIL-1αもしくはIL-1βを認識しないIPAR特異的ウサギポリ クローナル抗体またはウサギIRAPを使用して、当業者に周知のウェスタンブロッ ティングを行った。図4は、MFG-IRAPを感染させたHIG-82細胞の4つの培養物に よるIRAP製造を明らかにするウェスタンブロットを示す。IRAPの3つの形態は、 組換え体標準と共に移動する1つの非グリコシル化形態及び2つのより大きなグ リコシル化形態を示す。図4に示すウェスタンブロッティングの結果は、本発明 のMFG-IRAPベクターの感染の後、HIG-82滑膜細胞系(Georgescu,1988)によりI RAPが生成されたことを示している。図4のウェスタンブロッティングは、なら し培地のIRAP濃度が50ng/mlくらい高いものであることを示している。これはほ ぼ500ng IRAP/106細胞/日に相当する。図4のレーン1及びレーン2は、宿主動 物滑膜組織は第3日(レーン2)及び第6日(レーン1)においてかなりの量の HIG-IRAPを分泌することを示している。レーン3はヒト組換え体IRAPを示してい る。レーン6は、ウサギ滑膜細胞がMFG-IRAPによる感染の後、前記分子のより大 きなグリコシル化物を生成することを示している。レーン7は、本来のウサギ滑 膜細胞はこのグリコシル化形態を生成しないことを示している。 図5は、IRAP+滑膜細胞でならした培地が、組換え体ヒトIL-1 βに曝された関節軟骨細胞中の中性メタロプロテイナーゼの誘導をブロックする ことを示している。軟骨細胞は通常、1 U/106細胞以下のゼラチナーゼをその培 養培地中に分泌する。図5は、約5 U/mlまたは10 U/mlまでのIL-1を加えた場合 、ゼラチナーゼ生成はそれぞれ4 U及び6 U/108細胞を越えるまで増加することを 示している。本発明の方法により使用されるMFG-IRAP感染HIG-82細胞によりなら した培地の添加により、IL-1処理軟骨細胞によるゼラチナーゼ生成が阻害された 。5 U/ml IL-1(図5右図)では、阻害率は一方の培養について100%であり、他 方については41%であった。10 U/ml IL-1では、競争的阻害剤に予測されるよう に、阻害率は38%及び18%に減少した(図5左図)。これらのデータは、MFG-IRAP により感染されたHIG-82細胞により生成されるIRAPが生物学的に活性であること を示している。 実施例IX この実施例は、リポソームによる感染(リポフェクション)を使用した、滑膜 細胞によるLac Z遺伝子の取り込みと発現を示すものである。6ウェルプレート 中に含まれる滑膜細胞培養物に、リポフェクションによりLac Z遺伝子を形質導 入した。各ウェルの内容は以下の通りである。 ウェル1 リポソームのみで処理された対照細胞 ウェル2 DNAのみで処理された対照細胞 ウェル3 DNA+150nmolリポソーム ウェル4 DNA+240nmolリポソーム ウェル5 DNA+300nmolリポソーム ウェル6 DNA+600nmolリポソーム 滑膜繊維芽細胞の亜集団培養物(sub-confluent cultures)を含むウェル3〜 6は、150〜600nmol/ウェルの「DC-コール」リポソームあるいは「SF-コール」 と複合化した6μgのDNAを感染させた。3日後、細胞をβ−ガラクトシダーゼ の発現について組織化学的に染色した(図6)。 表1は、選択を行わない滑膜細胞培養物のLac Z+表現型への変換においてリポ ソーム「DC-コール」及び「SF-コール」を使用した結果を示す。表1は、約300n mol/ウェルの濃度の「DC-コール」リポソームが、全体で滑膜細胞培養物中の約3 0%の滑膜細胞を選択することなくLac Z+表現型へ変換したことを示している。D C-コールについてのウェル6においては、高いリポソーム濃度の毒性効果により 発現が減少している。 本発明の別の態様においては、インターロイキン-1の中和のための遺伝子及び 該遺伝子の使用方法が提供される。インターロイキン-1は、関節炎における軟骨 破壊の主要媒介物である。インターロイキン-1はまた炎症も起こし、骨吸収の非 常に強力な誘発物である。これらの効果の多くは、プロスタグランジンE2、中性 プロテイナーゼ、即ちコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、及びストロメリシン、及び プラスミノーゲンアクティベータの細胞合成を強力に増加させるインターロイキ ン-1の能力によるものである。インターロイキン-1の軟骨に対する異化作用は、 その軟骨細胞による軟骨マトリックスの合成を抑制する能力により増悪される。 インターロイキン-1は、関節炎の関節から吸引される滑液中に高濃度で存在し、 動物における組換え体インターロイキン-1の関節内注射により軟骨破壊及び炎症 が発生することが示されている。 インターロイキン-1には幾つかの種類があり、例えば17,000ダルトンの非グリ コシル化ポリペプチドである。2つの種類は以前にクローン化されている、イン ターロイキン−1α及びインターロイキン−1βである。α形態は約5のplを有 し、β形態は約7のplを有する。これらのアイソフォームの存在にもかかわらず 、インターロイキン-1α及びインターロイキン-1βは実質的に同一の生物学的性 質を有し、同一の表面受容体を有する。I型インターロイキン-1受容体は、80kD a(キロダルトン)の糖タンパク質であり、図7に示したようにジスルフィド架 橋により1つに保持された3つの免疫グロブリン様ドメインに配置された319ア ミノ酸の細胞外インターロイキン-1結合部分を含む。21アミノ酸膜貫通 ドメインが前記細胞外部分を217アミノ酸の細胞質ドメインに結合している。図8 A〜8Cはヒト及びマウスインターロイキン-1受容体のアミノ酸及びヌクレオチド 配列を示す。図8Bにおいては、インターロイキン-1受容体の21アミノ酸膜貫通領 域を太い実線で示した。図8A及び8Bにおいては、PCRのための5'及び3'オリゴヌ クレオチドの位置を細い短い線でそれぞれ示した。膜貫通ドメインのまさに5'の 、停止コドンに変異されるリシンアミノ酸は図8Bにおいて実線の円で示した。 これまでのところ、滑膜は関節炎の関節におけるインターロイキン-1の主要な 、そしておそらくは唯一の関節内供給源であると考えられる。関節炎の関節から 回収した滑膜は高いレベルのインターロイキン-1を分泌する。滑膜内層に存在す る滑膜細胞及び浸潤する血液単核細胞の両方がインターロイキン-1を生成する。 本発明は、高い親和性でインターロイキン-1に結合する能力を有するが、細胞 外で放出され、従ってシグナル形質導入においては不活性である、インターロイ キン-1受容体の末端切断型(truncated form)をコードする遺伝子をインビボで 使用する方法を提供する。この末端が切断され改変された受容体のインターロイ キン-1に対する結合は、インターロイキン-1の関節内活性を阻害する。 インターロイキン-1に結合し中和することができるインターロイキン-1受容体 の細胞外インターロイキン-1結合ドメインをコードする遺伝子を使用するこの方 法は、切断された可溶性の活性形態の前記受容体をコードする、末端切断型イン ターロイキン-1受容体遺伝子を有するレトロウィルスベクターを使用することを 含む。新規なインターロイキン-1受容体遺伝子の発現は、真核細胞 内で活性なベクター中に含まれる調節配列により制御される。この組換え体ウィ ルスベクターは、該組換え体ベクターを有する感染性ウィルス粒子の製造のため に必要なウィルスタンパク質を安定にトランスに発現する細胞系にトランスフェ クトされる。これらのウィルス粒子は、インビボにおける直接のウィルス感染に より組換え体インターロイキン-1受容体を宿主動物滑膜細胞に到達させるのに使 用される。 レトロウィルスベクターに挿入される可溶性ヒトインターロイキン-1受容体は 、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により製造することができる。ヒトインターロ イキン-1受容体の5'リーダー配列に相補的なオリゴヌクレオチド(GCGGATCCCCTC CTAGAAGCT)及びインターロイキン-1受容体の膜貫通ドメインから直ぐ上流の領 域に相補的なオリゴヌクレオチド(GCGGATCCCATGTGCTACTGG)をPCRのプライマー として使用する。膜貫通ドメインに隣接するインターロイキン-1受容体の領域に ついてのプライマーは、1つの塩基の変化を含み、アミノ酸319(AAG)における lysコドンが停止コドン(TAG)に変化している。膜貫通ドメインの直ぐ上流に翻 訳停止コドンを挿入することにより、前記細胞により分泌されるインターロイキ ン-1受容体の末端切断型が生成される。BamHI認識配列(GGATCC)をPCRプライマ ーの5'末端に付加し、増幅の後、得られるインターロイキン-1受容体フラグメン トをBamHI部位にクローン化する。ヒトT-細胞からのcDNAライブラリーを、イン ターロイキン-1受容体cDNAの供給源として使用する。cDNAライブラリーからのイ ンターロイキン-1受容体の適当な領域を増幅するためには、DNAに相補的プライ マーを付加し、サーモサイクラー及び当業者に 周知の標準的なPCR反応条件を使用して、50サイクルのアニーリング、プライマ ー延長、及び変性を行う。PCR法を使用したインターロイキン-1可溶性受容体の 増幅の後、得られたフラグメントをBamHIで消化し、pLJレトロウィルスベクター に挿入する。pLJレトロウィルスベクターはA.J.Korman及びR.C.Mulliganから 入手可能である。Alan J.Korman,J.Daniel Frantz,Jack L.Strominger及びR ichard C.Mulligan共著のProc.Natl.Acad.Sci.,Vol.84,pp.2150-2154(1 987年4月)も参照されたい。制限酵素分析を行い、挿入物の正確な方向を決定し た。 標準的なCaPO4トランスフェクション方法、及びウィルスベクターが安定に組 み込まれており、抗生物質G 418に対する耐性に基づいて選択される細胞を使用 して、末端切断型インターロイキン-1受容体を有するレトロウィルスベクターを CRIP(Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.85,pp.6460-6464(1988),O.Danos a nd R.C.Mulligan)パッケージング細胞系中に移す。ネオマイシン耐性(neo-r )遺伝子を含むウィルスベクターは細胞系にG 418に対する耐性を与えることが できる。CRIP細胞系は、ベクターウィルスRNAを感染性粒子にパッケージングす るのに必要な3種のウィルスタンパク質を発現する。さらに、CRIP細胞系により 生成されたウィルス粒子は、ヒト細胞を含む広範な種類の哺乳類細胞に効率よく 感染することができる。この細胞系により生成されたレトロウィルス粒子は全て 複製欠陥を有するが、滑膜細胞中に安定に組み込まれる能力を有し、これにより これらの細胞の受け継がれ得る形質となる。この方法により製造されたウィルス ストックは実質的にヘルパーウィルス粒子による汚染がなく、また非病原的で ある。 より具体的には、末端切断型インターロイキン-1遺伝子は、例えば、適当な真 核生物プロモーター、例えば図9に示したpLJベクターのような遺伝子移送ベク ター内に既に含まれているレトロウィルスプロモーターの制御下にある、レトロ ウィルスベクター中に挿入することができる。図9は、pLJインターロイキン受 容体レトロウィルスベクターの構造及び部分制限エンドヌクレアーゼマップを示 す。参照番号10は、レトロウィルスベクターに挿入されたインターロイキン-1受 容体を示す。参照番号12は、図8に示したpLJインターロイキン受容体レトロウ ィルスベクターの構造の各末端の長い末端リピート(LTR)を示す。これらのLTR はウィルス転写とインターロイキン-1受容体の発現を制御する。抗生物質ネオマ イシンに対する耐性をコードする細菌遺伝子(neo-r)を参照番号16で示す。シ ミアンウィルス40エンハンサープロモーター(SV40)は、参照番号18に示され、 これはneo-r遺伝子の発現を制御する。参照番号20及び22はそれぞれ、得られた インターロイキン受容体フラグメントがクローン化される部位を示す。異なる真 核生物プロモーターを含むその他のベクターを使用し、インターロイキン-1受容 体発現の一般的に最大のレベルを得ることができることも当業者に理解されるで あろう。トランスフェクション、及びやはりpLJベクターに含まれるネオマイシ ン耐性遺伝子の発現について選択することにより単離された安定な形質転換体に より、末端切断され改変されたインターロイキン-1受容体を含むベクターをレト ロウィルスパッケージング細胞系(CRIP)中に導入する。CRIP細胞系は、外来レ トロウィルスRNAのパッケー ジングに必要なタンパク質の全てを発現する。G418選択CRIP細胞系により生成さ れたウィルス粒子は、哺乳類細胞に感染し、インターロイキン-1末端切断型受容 体を安定に発現することができる組換え体レトロウィルスを有する。ウィルス粒 子を使用し、ウィルスを関節空間に注射することによりインビボで直接滑膜細胞 に感染させる。 本発明の別の態様は、本明細書中にこれまで記載したウィルス粒子を使用して 、哺乳類宿主の関節の内層から得た培養中の滑膜細胞に感染させる方法を提供す る。この培養中の滑膜細胞の感染の利点は、インターロイキン-1受容体レトロウ ィルス構築物を有する感染細胞を、G418を使用してネオマイシン耐性遺伝子の発 現について選択できることである。インターロイキン-1受容体を発現する感染滑 膜細胞は、その後関節内注射により関節に移植して戻すことができる。移植され た細胞は、関節空間内で高いレベルの可溶性インターロイキン-1受容体を発現し 、これによりインターロイキン-1α及びインターロイキン-1βを含むインターロ イキン-1の実質的に全てのアイソフォームに結合し、これを中和する。 関節内の滑膜細胞の移植に使用される方法は日常的なものであり、慢性的な炎 症性関節疾患の治療に使用されるものとしては比較的重要でない方法である。滑 膜は開放手術の間にも関節から回収することができるが、今日では特に膝につい ては関節鏡により滑膜切除をすることが広く行われている。関節鏡は、小さな穿 剌傷から膝内に挿入される小さな中空のロッドである。関節鏡は、ファイバー選 択システム(fibre-option system)の関節内への挿入を可能とするばかりでな く、手術用具の接近も可能とし、滑膜 組織を関節鏡を使用して採取することができる。このような方法は、「脊髄」麻 酔下に行うことができ、患者はその日のうちに帰宅することができる。この方法 により、この遺伝子治療を受ける患者から十分な滑膜を得ることができる。 切除された組織に含まれる滑膜細胞は、結合組織マトリックスの酵素的消化に より無菌的に回収することができる。一般的には、滑膜を約1ミリメーターの直 径の切片に切断し、トリプシン(グレイ平衡塩溶液中の0.2% W/V)で37℃におい て30分間、そしてコラゲナーゼ(グレイ平衡塩溶液中の0.2% W/V)で37℃におい て2時間、連続的に消化する。この消化から回収した細胞を、平方センチメート ル当たり104〜105細胞の濃度で、10%胎児ウシ血清と抗生物質を補充したハンクF12 培地を含むプラスチック培養皿に接種する。3〜7日後、培養培地を取り除く 。リンパ球のような非接着細胞をゲイ平衡塩溶液で洗浄することにより除去し、 新しい培地を加える。接着細胞はこの時点でそのまま使用できるようになり、増 殖させて集団を形成させるか、1回以上の継代培養を行う。継代培養することに より、細胞数を増やし、マクロファージのような非分割細胞を除去することがで きる。 このように回収された細胞は遺伝子操作の後、トリプシン処理やかき取ること 等の手段により培養皿から取り出し、標準懸濁物とすることができる。ゲイ平衡 塩溶液もしくはその他の適当な組成の等張塩溶液、あるいは生理食塩水が適当な キャリアである。次いで、細胞の懸濁物を宿主哺乳類動物の関節に注射すること ができる。この種の関節内注射は日常的なものであり、医師の診察室において簡 単に行うことができる。手術は必要ない。この方法 により非常に大きな数の細胞を導入することができ、必要に応じ繰り返して注射 することができる。 本発明のまた別の態様は、本明細書にこれまで記載した製造方法により製造さ れた遺伝子である。このレトロウィルスに保有された遺伝子は、非経口投与のた めに、適当な薬学的キャリア、例えば緩衝化された生理食塩水に混合することが できる。この遺伝子は、治療上有効な量で患者に投与することができる。より具 体的には、この遺伝子を薬学的に適当なキャリア中に治療上有効な量含有させて 、関節内注射により投与することができる。 本発明のまた別の態様においては、この遺伝子を予防的な手段として患者に投 与し、関節炎が進行している可能性が非常に高いと診断された患者における関節 炎の進行を防止することができる。より具体的には、このレトロウィルスに保有 された遺伝子を適当な薬学的キャリア中に予防上有効な量含有させて、関節内注 射を含む非経口注射により投与することができる。 実施例X CMVプロモーターの下流に連結されたインターロイキン-1βコード配列を含むD NAプラスミドベクター分子の50マイクログラムをカチオン性リポソーム中に封入 し、ゲイ生物学的緩衝液と混合し、ウサギの膝関節中に関節内注射した。注射の 48時間後に、1ナノグラムのインターロイキン-1βをその膝関節領域から回収し た。即ち、DNA含有リポソーム溶液の滑膜組織領域中への注射により、リポソー ムの滑膜細胞への融合、DNAプラスミドベクターの滑膜細胞中への移送、そして その後のIL-1β遺伝子の発現が促 進されたものである。さらに、封入していない(即ち裸の)DNAを関節領域中に 注射し、その後の滑膜細胞中でのIL-1β遺伝子の発現を測定することにより、DN Aベクターの滑膜細胞中へのトランスフェクションを監視することができる。従 って、いずれの方法も、本発明において同様に例示した滑膜のインビトロ操作の 信頼のできる代替手段として利用することができる。 当業者であれば、哺乳類宿主の結合組織細胞中にインビトロで、あるいはイン ビボで、治療的特性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を 導入する方法が本発明により提供されることが理解されるであろう。この方法は 、維持及び発現の可能なDNAを有する遺伝子を使用することを含む。 当業者であれば、本発明により、哺乳類宿主の関節炎症状の治療のために、哺 乳類宿主の結合組織中の少なくとも1の細胞中に、その産物をコードする少なく とも1つの遺伝子を導入する方法が提供されることが理解されるであろう。 当業者であれば、哺乳類宿主の結合組織を修復し、再生させる方法が本発明に より提供されることが理解されるであろう。 さらに本発明により、結合組織病理の研究のための動物モデルを製造する方法 が提供されることが理解されるであろう。 当業者であれば、本発明により、インターロイキン-1の実質的に全てのアイソ フォームに結合し中和することができるインターロイキン-1受容体の細胞外イン ターロイキン-1結合ドメインをコードする遺伝子を使用する方法及び製造する方 法が提供され、これにより哺乳類宿主の軟骨を病理学的劣化から実質的に保護す る方法が提供されることが理解されるであろう。さらに、当業者で あれば、本発明の遺伝子を使用する方法により炎症が軽減され、関節の軟組織が 保護され、関節炎に罹患する患者において起こる骨の損失が抑制されることが理 解されるであろう。 本明細書にこれまで記載した発明に使用されるウィルスベクターが、例えば末 端切断型インターロイキン-1受容体遺伝子を保有するレトロウィルスベクターで 形質導入された患者からの自己滑膜細胞の直接の関節内注射または移植により、 インビボであるいは培養中に滑膜細胞をトランスフェクトするのに使用できるこ とは、当業者であれば理解するであろう。 上記においては説明の目的で本発明の特定の態様を記載したが、添付の請求の 範囲に定義された本発明を逸脱することなく本発明の詳細についての多数の変形 が可能であることは当業者に明らかであろう。
【手続補正書】特許法第184条の8 【提出日】1995年3月31日 【補正内容】 請求の範囲 1.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 組換え法を用いて該産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを作製し、 そして 該産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを用いて哺乳動物宿主の結合 組織細胞に感染させる、 ことを含む上記方法。 2.治療に用いるために哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内に前 記の産物コード化遺伝子を導入することを含む、請求項1に記載の方法。 3.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパ ク質をコードする遺伝子を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 4.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードする遺伝子 を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 5.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードする遺 伝子を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 6.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項5に記載の方法。 7.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードする遺伝子を用 いることを含む、請求項1に記載の方法。 8.前記のサイトカインとして、インターロイキン−2、インター ロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキ ン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9 、インターロイキン−10、インターロイキン−11およびインターロイキン− 12より成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項 7に記載の方法。 9.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項7に記載の方法。 10.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項9 に記載の方法。 11.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項7に記載の方法。 12.前記のウイルスベクターとしてレトロウイルスベクターを用いることを含む 、請求項2に記載の方法。 13.前記のレトロウイルスベクターとしてMFGおよびBAGより成る群から選 ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項12に記載の方法。 14.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパ ク質をコードする遺伝子を用いること、および前記のレトロウイルスベクターと してMFGを用いることを含む、請求項13に記載の方法。 15.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードする遺伝子 を用いることを含む、請求項13に記載の方法。 16.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤を コードする遺伝子を用いることを含む、請求項13に記載の方法。 17.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項16に記載の方法。 18.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードする遺伝子を用 いることを含む、請求項13に記載の方法。 19.前記のサイトカインとして、インターロイキン−2、インターロイキン−3 、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、イン ターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロ イキン−10、インターロイキン−11およびインターロイキン−12より成る 群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項18に記載の方 法。 20.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項18に記載の方法。 21.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項20 に記載の方法。 22.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項18に記載の方法。 23.前記のウイルスベクターとしてアデノ関連ウイルス、アデノウイルスおよび ヘルペスウイルスより成る群から選ばれる少なくとも1つのベクターを用いるこ とを含む、請求項1に記載の方法。 24.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパ ク質をコードする遺伝子を用いることを含む、請求項23に記載の方法。 25.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードする遺伝子 を用いることを含む、請求項23に記載の方法。 26.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードする遺 伝子を用いることを含む、請求項23に記載の方法。 27.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項26に記載の方法。 28.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードする遺伝子を用 いることを含む、請求項23に記載の方法。 29.前記のサイトカインとして、インターロイキン−2、インターロイキン−3 、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、イン ターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロ イキン−10、インターロイキン−11およびインターロイキン−12より成る 群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項28に記載の方 法。 30.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項28に記載の方法。 31.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項30 に記載の方法。 32.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項28に記載の方法。 33.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織へ前記の遺伝子 を導入することを含む、請求項1に記載の方法。 34.前記の靱帯として十字靱帯を用いることを含む、請求項33に記 載の方法。 35.前記の十字靱帯として、前十字靱帯および後十字靱帯より成る群から選ばれ る靱帯を用いることを含む、請求項34に記載の方法。 36.前記の遺伝子として、維持および発現が可能なDNAを有する遺伝子を用い ることを含む、請求項1に記載の方法。 37.前記の遺伝子を前記の細胞内にin vitroで導入することを含む、請求項1に 記載の方法。 38.続いて前記の感染細胞を哺乳動物宿主へ移植することを含む、請求項37に記 載の方法。 39.結合組織細胞への感染後であって、哺乳動物宿主への感染細胞の移植前に、 感染させた結合組織細胞を保存することを含む、請求項37に記載の方法。 40.前記の感染させた結合組織細胞を液体窒素下で10%DMSO中に保存する ことを含む、請求項39に記載の方法。 41.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項38に記載の方法。 42.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項38に記載の方法。 43.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項38に記載の方法。 44.ヒトである哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いることを含む、請求項43に 記載の方法。 45.前記の産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを直接的に 哺乳動物宿主へ導入することにより前記の細胞にin vivo感染させることを含む 、請求項14に記載の方法。 46.関節内注入によって哺乳動物宿主へ直接導入することを含む、請求項45に記 載の方法。 47.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項45に記載の方法。 48.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項45に記載の方法。 49.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項45に記載の方法。 50.ヒトである哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いることを含む、請求項45に 記載の方法。 51.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 結合組織細胞内に該産物コード化遺伝子を導入するための非ウイルス手段を 用いることを含み、該非ウイルス手段が少なくとも1つのリポソーム、Ca3(PO4)2 、エレクトロポレーションおよびDEAE−デキストランより成る群から選ば れる上記方法。 52.前記のリポソームとしてDC−コレステロールおよびSF−コレステロール より成る群から選ばれる物質を用いることを含む、請求項51に記載の方法。 53.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴ ニストタンパク質をコードする遺伝子を用いることを含む、請求項51に記載の方 法。 54.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードする遺伝子 を用いることを含む、請求項51に記載の方法。 55.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードする遺 伝子を用いることを含む、請求項51に記載の方法。 56.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項55に記載の方法。 57.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードする遺伝子を用 いることを含む、請求項51に記載の方法。 58.前記のサイトカインとして、インターロイキン−2、インターロイキン−3 、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、イン ターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロ イキン−10、インターロイキン−11およびインターロイキン−12より成る 群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項57に記載の方 法。 59.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項57に記載の方法。 60.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項59 に記載の方法。 61.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項57に記載の方法。 62.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織へ 前記の遺伝子を導入することを含む、請求項51に記載の方法。 63.前記の靱帯として十字靱帯を用いることを含む、請求項62に記載の方法。 64.前記の十字靱帯として、前十字靱帯および後十字靱帯より成る群から選ばれ る靱帯を用いることを含む、請求項63に記載の方法。 65.前記の遺伝子として、維持および発現が可能なDNAを有する遺伝子を用い ることを含む、請求項51に記載の方法。 66.前記の遺伝子を前記の細胞内にin vitroで導入することを含む、請求項51に 記載の方法。 67.続いて前記の遺伝子を有する細胞を哺乳動物宿主へ移植することを含む、請 求項66に記載の方法。 68.前記の産物コード化遺伝子を結合組織細胞内に導入した後であって、該遺伝 子を有する結合組織細胞を哺乳動物宿主へ移植する前に、該遺伝子を有する結合 組織細胞を保存することを含む、請求項67に記載の方法。 69.前記の遺伝子を有する結合組織細胞を液体窒素下で10%DMSO中に保存 することを含む、請求項68に記載の方法。 70.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項67に記載の方法。 71.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項67に記載の方法。 72.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項67に記載の方法。 73.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 哺乳動物宿主の結合組織細胞内に該産物コード化遺伝子を直接導入するため の非ウイルス手段をin vivoで用いることからなり、該非ウイルス手段が少なく とも1つのリポソーム、Ca3(PO4)2およびDEAE−デキストランより成る群か ら選ばれる上記方法。 74.関節内注入によって哺乳動物宿主へin vivo導入することを含む、請求項73 に記載の方法。 75.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項73に記載の方法。 76.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項73に記載の方法。 77.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項73に記載の方法。 78.結合組織病理学の研究用のモデル動物を作出する方法であって、 (a)組換え法を用いて産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを作製 し、そして(b)モデル動物を得るために該産物コード化遺伝子を含むウイルス ベクターを用いて哺乳動物宿主の結合組織細胞に感染させることにより、哺乳動 物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺 伝子を導入することを含む上記方法。 79.前記の遺伝子としてサイトカインおよびプロテイナーゼより成 る群から選ばれる物質を用いることを含む、請求項78に記載の方法。 80.前記のサイトカインとしてインターロイキン−1α、インターロイキン−1 βおよびTNF−αより成る群から選ばれる物質を用いることを含む、請求項79 に記載の方法。 81.前記のプロテイナーゼとしてマトリックス・メタロプロテイナーゼを用いる ことを含む、請求項79に記載の方法。 82.前記のマトリックス・メタロプロテイナーゼとしてコラゲナーゼ、ゼラチナ ーゼおよびストロメリシンより成る群から選ばれる酵素を用いることを含む、請 求項78に記載の方法。 83.結合組織病理学の研究用のモデル動物を作出する方法であって、 モデル動物を得るために哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内 に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入するための非ウイルス手段を用い ることからなり、該非ウイルス手段が少なくとも1つのリポソーム、Ca3(PO4)2 、エレクトロポレーションおよびDEAE−デキストランより成る群から選ばれ る上記方法。 84.前記の遺伝子としてサイトカインおよびプロテイナーゼより成る群から選ば れる物質を用いることを含む、請求項83に記載の方法。 85.前記のサイトカインとしてインターロイキン−1α、インターロイキン−1 βおよびTNF−αより成る群から選ばれる物質を用いることを含む、請求項84 に記載の方法。 86.前記のプロテイナーゼとしてマトリックス・メタロプロテイナーゼを用いる ことを含む、請求項84に記載の方法。 87.前記のマトリックス・メタロプロテイナーゼとしてコラゲナーゼ、ゼラチナ ーゼおよびストロメリシンより成る群から選ばれる酵素を用いることを含む、請 求項86に記載の方法。 88.関節炎に関係した有害な病理学的変化に抵抗するために末端切断型のインタ ーロイキン−1受容体をコードする遺伝子を用いる方法であって、 組換え法を用いて末端切断型のインターロイキン−1受容体をコードする遺 伝子を含むレトロウイルスパッケージング細胞系を作製し、 末端切断型インターロイキン−1受容体をコードする該遺伝子を、適当な真 核生物プロモーターの制御下にあるレトロウイルスベクターに挿入し、 末端切断型インターロイキン−1受容体をコードする該遺伝子を発現しうる ウイルス粒子を生産するために、末端切断型インターロイキン−1受容体をコー ドする該遺伝子を含むレトロウイルスベクターをレトロウイルスパッケージング 細胞系にトランスフェクトし、そして 該レトロウイルスパッケージング細胞系から得られたウイルス粒子を用いて 哺乳動物宿主の炎症を起こした関節の滑膜細胞に感染させる、 ことを含む上記方法。 89.哺乳動物宿主の関節内腔にある滑膜細胞において複製して発現するDNAを 有する前記の遺伝子を用いる、請求項88に記載の方法。 90.関節炎を非常に発症しやすい患者において関節炎の発症を実質的に防止する ために前記の方法を用いることを含む、請求項88に 記載の方法。 91.関節炎にかかった患者を治療するために前記の方法を用いることを含む、請 求項88に記載の方法。 92.哺乳動物宿主の炎症を起こした関節内腔にある滑膜細胞に前記のウイルス粒 子を直接導入することにより、哺乳動物宿主の滑膜細胞に感染させることを含む 、請求項88に記載の方法。 93.非経口注入によって前記のウイルス粒子を導入することを含む、請求項92に 記載の方法。 94.関節内注入によって前記のウイルス粒子を導入することを含む、請求項92に 記載の方法。 95.関節内注入を用いることにより、形質導入した滑膜細胞を患者の関節に移植 することを含む、請求項130に記載の方法。 96.前記のウイルス粒子を他の滑膜細胞に導入することにより、哺乳動物宿主の 滑膜細胞に感染させることを含む、請求項130に記載の方法。 97.インターロイキン−1と結合して、それを中和することができるインターロ イキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインをコードする遺伝 子を用いる方法であって、 組換え法を用いて、インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン −1結合ドメインをコードする第1の遺伝子と選択可能な抗生物質耐性をコード する第2の遺伝子を保有するレトロウイルスベクターを作製し、そして 該レトロウイルスベクターをレトロウイルスパッケージング細胞系にトラン スフェクトして、非病原性で、複製に欠陥があるが組込み能のある、両栄養的で 、感染性の、該遺伝子を保有するレ トロウイルス粒子を産生する細胞系を得る、 ことを含む上記方法。 98.前記の細胞系由来のレトロウイルス粒子を哺乳動物宿主の炎症を起こした関 節内腔にある滑膜細胞に直接感染させることによって前記の遺伝子を導入するこ とを含む、請求項97に記載の方法。 99.培養下の自己由来の滑膜細胞の形質導入により前記の遺伝子を導入し、培養 物を抗生物質で処理することにより滑膜細胞系を選択し、そして選択した滑膜細 胞を哺乳動物の冒された関節内に移植することを含む、請求項97に記載の方法。 100.前記のウイルス粒子の導入が非経口注入による、請求項97に記載の方法。 101.前記のウイルス粒子の導入が関節内注入による、請求項97に記載の方法。 102.インターロイキン−1と結合して、それを中和することができるインターロ イキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインをコードする遺伝 子を調製する方法であって、 タンパク質分泌のためのシグナル配列を含む上記の細胞外インターロイキン −1結合ドメインのポリメラーゼ連鎖反応により該遺伝子を合成し、 増幅されたインターロイキン−1受容体コード配列をレトロウイルスベクタ ーに導入し、 該レトロウイルスベクターを両栄養的レトロウイルスパッケージング細胞系 にトランスフェクトし、そして 該レトロウイルスパッケージング細胞系から該遺伝子を含むウイルス粒子を 回収する、 ことを含む上記方法。 103.請求項102の方法により調製された遺伝子。 104.インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインを コードする遺伝子および適当な製剤上の担体を含有する、治療上有効な量で患者 に非経口投与するための組成物。 105.インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインを コードする遺伝子および適当な製剤上の担体を含有する、予防上有効な量で患者 に非経口投与するための組成物。 106.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の滑膜組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 組換えDNA法を用いて該産物コード化遺伝子を含むDNAベクター分子を 作製し、そして 該DNAベクター分子を哺乳動物宿主の関節内に注入し、続いて該DNAベ クター分子が滑膜細胞に接触する、 ことを含む上記方法。 107.前記のDNAベクター分子を予防的に導入する、請求項106に記載の方法。 108.関節内に注入する前に、前記のDNAベクター分子をリポソーム内に保持さ せる、請求項106に記載の方法。 109.関節内に注入する前に、前記のDNAベクター分子をリポソーム内に保持さ せる、請求項107に記載の方法。 110.前記のDNAベクター分子がプラスミドである、請求項108に記載の方法。 111.前記のDNAベクター分子がプラスミドである、請求項109に 記載の方法。 112.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパ ク質をコードする遺伝子を用いることを含む、請求項106に記載の方法。 113.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードする遺伝子 を用いることを含む、請求項106に記載の方法。 114.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードする遺 伝子を用いることを含む、請求項106に記載の方法。 115.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項114に記載の方法。 116.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードする遺伝子を用 いることを含む、請求項106に記載の方法。 117.前記のサイトカインとして、インターロイキン−2、インターロイキン−3 、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、イン ターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロ イキン−10、インターロイキン−11およびインターロイキン−12より成る 群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項116に記載の 方法。 118.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項116に記載の方法。 119.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項11 8に記載の方法。 120.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードする 遺伝子を用いることを含む、請求項106に記載の方法。 121.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 組換え法を用いて該産物コード化遺伝子を含むDNAベクター分子を作製し 、そして 該DNAベクター分子を含む偽ウイルスを用いて哺乳動物宿主の結合組織細 胞に感染させる、 ことを含む上記方法。 122.前記のDNAベクターが変異ウイルスゲノム分子であって、哺乳動物宿主の 結合組織の少なくとも1つの細胞において発現される対象の異種遺伝子を含む、 請求項121に記載の方法。 123.前記の単純ヘルペスウイルスベクターが単純ヘルペスウイルス1型および単 純ヘルペスウイルス2型より成る群から選ばれる、請求項23に記載の方法。 124.滑膜細胞が関節から取り出された滑膜細胞である、請求項130に記載の方法 。 125.滑膜細胞が膝関節から取り出されたものである、請求項123に記載の方法。 126.滑膜細胞が皮膚細胞である、請求項130に記載の方法。 127.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードする遺伝子を用い ることを含む、請求項1に記載の方法。 128.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードする遺伝子を用い ることを含む、請求項13に記載の方法。 129.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードする 遺伝子を用いることを含む、請求項23に記載の方法。 130.関節炎に関係した有害な病理学的変化に抵抗するために末端切断型のインタ ーロイキン−1受容体をコードする遺伝子を用いる方法であって、 組換え法を用いて末端切断型のインターロイキン−1受容体をコードする遺 伝子を含むレトロウイルスパッケージング細胞系を作製し、 末端切断型インターロイキン−1受容体をコードする該遺伝子を、適当な真 核生物プロモーターの制御下にあるレトロウイルスベクターに挿入し、 末端切断型インターロイキン−1受容体をコードする該遺伝子を発現しうる ウイルス粒子を生産するために、末端切断型インターロイキン−1受容体をコー ドする該遺伝子を含むレトロウイルスベクターをレトロウイルスパッケージング 細胞系にトランスフェクトし、そして 哺乳動物宿主の関節内腔へ移植するための形質導入された滑膜細胞を作るべ く、前記のウイルス粒子を培養下の滑膜細胞に直接導入することにより哺乳動物 宿主の滑膜細胞に感染させる、 ことを含む上記方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI C12N 5/10 9162−4B C12N 15/00 ZNAA 15/09 ZNA 9281−4B 5/00 B // A61K 38/00 9455−4C A61K 37/54 38/22 9455−4C 37/02 38/46 9455−4C 37/64 38/55 9455−4C 37/24 (72)発明者 エヴァンス,クリストファー エイチ アメリカ合衆国 15211 ペンシルバニア 州 ピッツバーグ,メイプル テラス 111番地 (72)発明者 ロビンス,ポール ディー アメリカ合衆国 15232 ペンシルバニア 州 ピッツバーグ,エルマー ストリート 5816番地

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 組換え法を用いて該産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを作製し、 そして 該産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを用いて哺乳動物宿主の結合 組織細胞に感染させる、 ことを含む上記方法。 2.治療に用いるために哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内に前 記の産物コード化遺伝子を導入することを含む、請求項1に記載の方法。 3.前記の遺伝子として、ヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタン パク質をコードしうる遺伝子を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 4.前記の遺伝子として、β−ガラクトシダーゼをコードしうるLac Zマー カー遺伝子を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 5.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードしうる遺伝 子を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 6.前記の遺伝子として、少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードしう る遺伝子を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 7.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組 織阻害剤を用いることを含む、請求項5に記載の方法。 8.前記の遺伝子として、少なくとも1つのサイトカインをコードしうる遺伝子 を用いることを含む、請求項1に記載の方法。 9.前記のサイトカインとして、インターロイキン−1α、インターロイキン− 1β、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、 インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インタ ーロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロ イキン−11、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β より成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項8に 記載の方法。 10.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項8に記載の方法。 11.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項10 に記載の方法。 12.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項8に記載の方法。 13.前記のウイルスベクターとしてレトロウイルスベクターを用いることを含む 、請求項1に記載の方法。 14.前記のレトロウイルスベクターとしてMFGおよびBAGより成る群から選 ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項13に記載の方法。 15.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパ ク質をコードしうる遺伝子を用いること、および前 記のレトロウイルスベクターとしてMFGを用いることを含む、請求項14に記載 の方法。 16.β−ガラクトシダーゼをコードしうる前記の遺伝子としてLac Zマーカ ー遺伝子を用いること、および前記のレトロウイルスベクターとしてMFGを用 いることを含む、請求項14に記載の方法。 17.β−ガラクトシダーゼをコードしうる前記の遺伝子としてLac Z ne oマーカー遺伝子を用いること、および前記のレトロウイルスベクターとしてB AGを用いることを含む、請求項14に記載の方法。 18.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードしうる遺伝 子を用いることを含む、請求項14に記載の方法。 19.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードしうる 遺伝子を用いることを含む、請求項14に記載の方法。 20.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項19に記載の方法。 21.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードしうる遺伝子を 用いることを含む、請求項14に記載の方法。 22.前記のサイトカインとして、インターロイキン−1α、インターロイキン− 1β、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、 インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インタ ーロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロ イキン−11、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β より成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用い ることを含む、請求項21に記載の方法。 23.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項21に記載の方法。 24.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項23 に記載の方法。 25.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項21に記載の方法。 26.前記のウイルスベクターとしてアデノ関連ウイルス、アデノウイルスおよび ヘルペスウイルスより成る群から選ばれる少なくとも1つのベクターを用いるこ とを含む、請求項1に記載の方法。 27.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパ ク質をコードしうる遺伝子を用いることを含む、請求項26に記載の方法。 28.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードしうる遺伝 子を用いることを含む、請求項26に記載の方法。 29.前記の遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼをコードしうるLac Zマーカ ー遺伝子を用いることを含む、請求項26に記載の方法。 30.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードしうる 遺伝子を用いることを含む、請求項26に記載の方法。 31.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項30に記載の方法。 32.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードしうる遺伝子を 用いることを含む、請求項26に記載の方法。 33.前記のサイトカインとして、インターロイキン−1α、インターロイキン− 1β、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、 インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インタ ーロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロ イキン−11、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β より成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項32に 記載の方法。 34.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項32に記載の方法。 35.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項34 に記載の方法。 36.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項33に記載の方法。 37.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織へ前記の遺伝子 を導入することを含む、請求項1に記載の方法。 38.前記の靱帯として十字靱帯を用いることを含む、請求項37に記載の方法。 39.前記の十字靱帯として、前十字靱帯および後十字靱帯より成る群から選ばれ る靱帯を用いることを含む、請求項38に記載の方法。 40.前記の遺伝子として、維持および発現が可能なDNAを有する遺伝子を用い ることを含む、請求項1に記載の方法。 41.前記の遺伝子を前記の細胞内にin vitroで導入することを含む、請求項1に 記載の方法。 42.続いて前記の感染細胞を哺乳動物宿主へ移植することを含む、請求項41に記 載の方法。 43.結合組織細胞への感染後であって、哺乳動物宿主への感染細胞の移植前に、 感染させた結合組織細胞を保存することを含む、請求項41に記載の方法。 44.前記の感染させた結合組織細胞を液体窒素下で10%DMSO中に保存する ことを含む、請求項43に記載の方法。 45.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項42に記載の方法。 46.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項42に記載の方法。 47.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項42に記載の方法。 48.ヒトである哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いることを含む、請求項47に 記載の方法。 49.前記の産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを直接的に哺乳動物宿主 へ導入することにより前記の細胞にin vivo感染させることを含む、請求項1に 記載の方法。 50.関節内注入によって哺乳動物宿主へ直接導入することを含む、請求項49に記 載の方法。 51.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項49に記載の方法。 52.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項49に記載の方法。 53.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項49に記載の方法。 54.ヒトである哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いることを含む、請求項49に 記載の方法。 55.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 結合組織細胞内に該産物コード化遺伝子を導入するために非ウイルス手段を 用いることを含み、該非ウイルス手段が少なくとも1つのリポソーム、Ca3(PO4)2 、エレクトロポレーションおよびDEAE−デキストランより成る群から選ば れる上記方法。 56.前記のリポソームとしてDC−コレステロールおよびSF−コレステロール より成る群から選ばれる物質を用いることを含む、請求項55に記載の方法。 57.前記の遺伝子としてヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタンパ ク質をコードしうる遺伝子を用いることを含む、請求項55に記載の方法。 58.β−ガラクトシダーゼをコードしうる前記の遺伝子としてLac Zマーカ ー遺伝子を用いることを含む、請求項55に記載の方法。 59.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードしうる遺伝 子を用いることを含む、請求項55に記載の方法。 60.前記の遺伝子として少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードしうる 遺伝子を用いることを含む、請求項55に記載の方法。 61.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項60に記載の方法。 62.前記の遺伝子として少なくとも1つのサイトカインをコードしうる遺伝子を 用いることを含む、請求項55に記載の方法。 63.前記のサイトカインとして、インターロイキン−1α、インターロイキン− 1β、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、 インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インタ ーロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロ イキン−11、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β より成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項62に 記載の方法。 64.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項62に記載の方法。 65.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項64 に記載の方法。 66.前記のサイトカインとして少なくとも1つの繊維芽細胞増殖因子を用いるこ とを含む、請求項62に記載の方法。 67.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織へ前記の遺伝子 を導入することを含む、請求項55に記載の方法。 68.前記の靱帯として十字靱帯を用いることを含む、請求項67に記載の方法。 69.前記の十字靱帯として、前十字靱帯および後十字靱帯より成る群から選ばれ る靱帯を用いることを含む、請求項68に記載の方法。 70.前記の遺伝子として、維持および発現が可能なDNAを有する遺伝子を用い ることを含む、請求項55に記載の方法。 71.前記の遺伝子を前記の細胞内にin vitroで導入することを含む、請求項55に 記載の方法。 72.続いて前記の遺伝子を有する細胞を哺乳動物宿主へ移植することを含む、請 求項71に記載の方法。 73.前記の産物コード化遺伝子を結合組織細胞内に導入した後であって、該遺伝 子を有する結合組織細胞を哺乳動物宿主へ移植する前に、該遺伝子を有する結合 組織細胞を保存することを含む、請求項72に記載の方法。 74.前記の遺伝子を有する結合組織細胞を液体窒素下で10%DMSO中に保存 することを含む、請求項73に記載の方法。 75.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項72に記載の方法。 76.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項72に記載の方法。 77.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項72に記載の方法。 78.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 結合組織細胞内に該産物コード化遺伝子を直接導入するために非ウイルス手 段をin vivoで用いることからなり、該非ウイルス手段が少なくとも1つのリポ ソーム、Ca3(PO4)2およびDEAE−デキストランより成る群から選ばれる上記 方法。 79.関節内注入によって哺乳動物宿主へin vivo導入することを含む、請求項78 に記載の方法。 80.関節炎を非常に発症しやすい哺乳動物宿主において関節炎の発症を実質的に 防止するために前記の方法を用いることを含む、請求項78に記載の方法。 81.治療のために関節炎にかかった哺乳動物宿主に対し前記の方法を用いること を含む、請求項78に記載の方法。 82.靱帯、軟骨、腱および滑膜より成る群から選ばれる結合組織を修復および再 生するために前記の方法を用いることを含む、請求項78に記載の方法。 83.結合組織病理学の研究用のモデル動物を作出する方法であって、 (a)組換え法を用いて産物をコードする遺伝子を含むウイルスベクターを 作製し、そして(b)該産物コード化遺伝子を含むウイルスベクターを用いて、 モデル動物をもたらす哺乳動物宿主の結合組織細胞に感染させることにより、哺 乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード 化遺伝子を導入することを含む上記方法。 84.前記の遺伝子としてサイトカインおよびプロテイナーゼより成る群から選ば れる物質を用いることを含む、請求項83に記載の方法。 85.前記のサイトカインとしてインターロイキン−1α、インター ロイキン−1βおよびTNF−αより成る群から選ばれる物質を用いることを含 む、請求項84に記載の方法。 86.前記のプロテイナーゼとしてマトリックス・メタロプロテイナーゼを用いる ことを含む、請求項84に記載の方法。 87.前記のマトリックス・メタロプロテイナーゼとしてコラゲナーゼ、ゼラチナ ーゼおよびストロメリシンより成る群から選ばれる酵素を用いることを含む、請 求項83に記載の方法。 88.結合組織病理学の研究用のモデル動物を作出する方法であって、 モデル動物をもたらす哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも1つの細胞内に 少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入するために非ウイルス手段を用いる ことからなり、該非ウイルス手段が少なくとも1つのリポソーム、Ca3(PO4)2、 エレクトロポレーションおよびDEAE−デキストランより成る群から選ばれる 上記方法。 89.前記の遺伝子としてサイトカインおよびプロテイナーゼより成る群から選ば れる物質を用いることを含む、請求項88に記載の方法。 90.前記のサイトカインとしてインターロイキン−1α、インターロイキン−1 βおよびTNF−αより成る群から選ばれる物質を用いることを含む、請求項89 に記載の方法。 91.前記のプロテイナーゼとしてマトリックス・メタロプロテイナーゼを用いる ことを含む、請求項89に記載の方法。 92.前記のマトリックス・メタロプロテイナーゼとしてコラゲナーゼ、ゼラチナ ーゼおよびストロメリシンより成る群から選ばれる酵素を用いることを含む、請 求項91に記載の方法。 93.関節炎に関係した有害な病理学的変化に抵抗するために末端切断型のインタ ーロイキン−1受容体をコードする遺伝子を用いる方法であって、 組換え法を用いて末端切断型のインターロイキン−1受容体をコードする遺 伝子を含むレトロウイルスパッケージング細胞系を作製し、 末端切断型インターロイキン−1受容体をコードする該遺伝子を、適当な真 核生物プロモーターの制御下にあるレトロウイルスベクターに挿入し、 末端切断型インターロイキン−1受容体をコードする該遺伝子を発現しうる ウイルス粒子を生産するために、末端切断型インターロイキン−1受容体をコー ドする該遺伝子を含むレトロウイルスベクターをレトロウイルスパッケージング 細胞系にトランスフェクトし、そして 該レトロウイルスパッケージング細胞系から得られたウイルス粒子を用いて 哺乳動物宿主の滑膜細胞に感染させる、 ことを含む上記方法。 94.哺乳動物宿主の関節内腔にある滑膜細胞において複製および発現することが 可能なDNAを有する前記の遺伝子を用いる、請求項93に記載の方法。 95.関節炎を非常に発症しやすい患者において関節炎の発症を実質的に防止する ために前記の方法を用いることを含む、請求項93に記載の方法。 96.関節炎にかかった患者を治療するために前記の方法を用いることを含む、請 求項93に記載の方法。 97.前記のウイルス粒子を哺乳動物宿主の関節内腔にある滑膜細胞に直接導入す ることにより、哺乳動物宿主の滑膜細胞に感染させることを含む、請求項93に記 載の方法。 98.非経口注入によって前記のウイルス粒子を導入することを含む、請求項97に 記載の方法。 99.関節内注入によって前記のウイルス粒子を導入することを含む、請求項97に 記載の方法。 100.あとで患者の関節内に移植しうる形質導入滑膜細胞を形成するために、前記 のウイルス粒子を培養下の滑膜細胞に直接導入することによって哺乳動物宿主の 滑膜細胞に感染させることを含む、請求項93に記載の方法。 101.関節内注入を用いることによって患者の関節内に形質導入滑膜細胞を移植す ることを含む、請求項100に記載の方法。 102.前記のウイルス粒子を他の滑膜細胞に導入することによって哺乳動物宿主の 滑膜細胞に感染させることを含む、請求項93に記載の方法。 103.インターロイキン−1と結合して、それを中和することができるインターロ イキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインをコードする遺伝 子を用いる方法であって、 組換え法を用いて、インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン −1結合ドメインをコードする第1の遺伝子と選択可能な抗生物質耐性をコード する第2の遺伝子を保有するレトロウイルスベクターを作製し、そして 該レトロウイルスベクターをレトロウイルスパッケージング細胞系にトラン スフェクトして、非病原性で、複製に欠陥があるが 組込み能があり、両栄養的で、感染性の、該遺伝子を保有するレトロウイルス粒 子を産生する細胞系を得る、 ことを含む上記方法。 104.前記の細胞系からのレトロウイルス粒子を哺乳動物宿主の関節内腔にある滑 膜細胞に直接感染させることによって前記の遺伝子を導入することを含む、請求 項103に記載の方法。 105.培養下の自己由来の滑膜細胞の形質導入により前記の遺伝子を導入し、培養 物を抗生物質で処理することにより滑膜細胞の細胞系を選択し、そして選択した 滑膜細胞を哺乳動物の冒された関節内に移植することを含む、請求項103に記載 の方法。 106.前記のウイルス粒子の導入が非経口注入による、請求項103に記載の方法。 107.前記のウイルス粒子の導入が関節内注入による、請求項103に記載の方法。 108.インターロイキン−1と結合して、それを中和することができるインターロ イキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインをコードする遺伝 子を調製する方法であって、 タンパク質分泌のためのシグナル配列を含む上記の細胞外インターロイキン −1結合ドメインのポリメラーゼ連鎖反応により該遺伝子を合成し、 増幅されたインターロイキン−1受容体コード配列をレトロウイルスベクタ ーに導入し、 該レトロウイルスベクターを両栄養的レトロウイルスパッケージング細胞系 にトランスフェクトし、そして 該レトロウイルスパッケージング細胞系から該遺伝子を含むウ イルス粒子を回収する、 ことを含む上記方法。 109.請求項108の方法により作製された遺伝子。 110.インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインを コードする遺伝子および適当な製剤上の担体を含有する、治療上有効な量で患者 に非経口投与するための組成物。 111.インターロイキン−1受容体の細胞外インターロイキン−1結合ドメインを コードする遺伝子および適当な製剤上の担体を含有する、予防上有効な量で患者 に非経口投与するための組成物。 112.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の滑膜組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 組換えDNA法を用いて該産物コード化遺伝子を含むDNAベクター分子を 作製し、そして 該DNAベクター分子を哺乳動物宿主の関節内に注入し、続いて該DNAベ クター分子が滑膜細胞に接触する、 ことを含む上記方法。 113.前記のDNAベクター分子を予防的に導入する、請求項112に記載の方法。 114.関節内に注入する前に、前記のDNAベクター分子をリポソーム内に保持さ せる、請求項112に記載の方法。 115.関節内に注入する前に、前記のDNAベクター分子をリポソーム内に保持さ せる、請求項113に記載の方法。 116.前記のDNAベクター分子がプラスミドである、請求項114に記載の方法。 117.前記のDNAベクター分子がプラスミドである、請求項115に記載の方法。 118.前記の遺伝子として、ヒトインターロイキン−1受容体アンタゴニストタン パク質をコードしうる遺伝子を用いることを含む、請求項112に記載の方法。 119.前記の遺伝子として可溶性インターロイキン−1受容体をコードしうる遺伝 子を用いることを含む、請求項112に記載の方法。 120.前記の遺伝子として、β−ガラクトシダーゼをコードしうるLac Zマー カー遺伝子を用いることを含む、請求項112に記載の方法。 121.前記の遺伝子として、少なくとも1つのプロテイナーゼ阻害剤をコードしう る遺伝子を用いることを含む、請求項112に記載の方法。 122.前記のプロテイナーゼ阻害剤としてメタロプロテイナーゼの組織阻害剤を用 いることを含む、請求項121に記載の方法。 123.前記の遺伝子として、少なくとも1つのサイトカインをコードしうる遺伝子 を用いることを含む、請求項112に記載の方法。 124.前記のサイトカインとして、インターロイキン−1α、インターロイキン− 1β、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、 インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インタ ーロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロ イキン−11、インターロイキン−12、腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β より成る群から選ばれる少なくとも1つの物質を用いることを含む、請求項123 に記載の方法。 125.前記のサイトカインとして少なくとも1つの形質転換成長因子を用いること を含む、請求項124に記載の方法。 126.前記の形質転換成長因子としてTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3お よびTGF−αより成る群から選ばれる成長因子を用いることを含む、請求項12 5に記載の方法。 127.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードしうる遺伝子を用 いることを含む、請求項112に記載の方法。 128.インターロイキン−1βをコードする前記の遺伝子がCMVプロモーター断 片の下流に隣接して配置される、請求項124に記載の方法。 129.哺乳動物宿主の処置に用いるために、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも 1つの細胞内に少なくとも1つの産物コード化遺伝子を導入する方法であって、 組換え法を用いて該産物コード化遺伝子を含むDNAベクター分子を作製し 、そして 該DNAベクター分子を含む偽ウイルスを用いて哺乳動物宿主の結合組織細 胞に感染させる、 ことを含む上記方法。 130.前記のDNAベクターが変異ウイルスゲノム分子であって、哺乳動物宿主の 結合組織の少なくとも1つの細胞において発現される対象の異種遺伝子を含む、 請求項129に記載の方法。 131.前記の単純ヘルペスウイルスベクターが単純ヘルペスウイルス1型および単 純ヘルペスウイルス2型より成る群から選ばれる、請求項26に記載の方法。 132.滑膜細胞が関節から取り出された滑膜細胞である、請求項100 に記載の方法。 133.滑膜細胞が膝関節から取り出されたものである、請求項132に記載の方法。 134.滑膜細胞が皮膚細胞である、請求項100に記載の方法。 135.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードしうる遺伝子を用 いることを含む、請求項1に記載の方法。 136.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードしうる遺伝子を用 いることを含む、請求項14に記載の方法。 137.前記の遺伝子として可溶性の腫瘍壊死因子受容体をコードしうる遺伝子を用 いることを含む、請求項26に記載の方法。
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