JP2001523955A - 放射性同位体コンセントレーターのための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、診断画像化および腫瘍の治療のための放射性薬品を含む、併用核医学に関する。より詳細には、本発明は、細胞におけるラジオアイソトープを蓄積するために設計された、薬学的組成物、処置、診断及び遺伝子工学による放射画像化の方法を含む。ラジオアイソトープ蓄積を与える遺伝子工学とラジオアイソトープを導入した細胞との併用は、遺伝子発現の位置を確認し、同定するin vivo又はin vitroでの放射画像化、新生物形成及び非新生物形成細胞を殺す放射線療法、及び診断の適用を含む多くの用途がある。遺伝子構築物、ベクター、形質転換細胞及び方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 名称： ラジオアイソトープ・コンセントレーター方法および組成物 発明の分野 本発明は、細胞の破壊を画像化するための併用放射線療法、及びより詳細には 医薬品組成物、及び腫瘍細胞破壊、ケロイド傷跡組織のような非新生物形成組織 の破壊、脂肪組織、心肥大、その他におけるラジオアイソトープを濃縮するよう に設計された遺伝子操作による処置の方法に対する化合放射線療法にまたは形質 導入された細胞のラジオ画像化することに付随する、ex vivoまたはin vivoのい ずれかの形質導入された細胞のラジオ画像化、ならびに傍観者効果を受けやすい それらの追加の細胞に関する。 発明の背景 増殖的な挙動を基礎として新生物形成細胞と正常細胞を区別する抗新生物治療 の限られた能力は、増殖特異性よりむしろ腫瘍特異性である、新生物形成細胞の 生化学特性の検索を示唆した。残念ながら、現在の分子の遺伝子の研究は、この ような特性が新生物形成細胞の一貫した特徴であるという予想を支えることに失 敗した。むしろ、これらの研究は、新生物形成の状態が腫瘍特定の機能を仮定す ることなく説明されるが、成長調節遺伝子の構造またはそれらの数もしくは染色 体の生育環境での変化において、変化（時々最小の）の結果として、異常なレベ ルでの通常の増殖特異性の機能の単に操作以外だけに過ぎないことを示唆する。 この結論は、新生物形成細胞に高い特異性がある、継続的な検索がガン治療の問 題に一般的な解決のために頼ることができないということを示唆する。ガンの致 死率の大きな減少は、この種の性状の自然の発生に依存しない、代替のアプロー チを必要とする。 １つの代替の戦略が遺伝子挿入技術の予防的使用により、正常の及び新生物形 成細胞の間の違いを人工的に創造する方法を必要とする。すなわち、破壊のため の標的となる新生物形成細胞を組織的に及び特異的に利用できる生化学的に異な るものを製造することである。本発明は、骨髄のようなex vivoのプロトコルま たはin vivoでの腫瘍の処置のための新生物形成細胞を抑制し、殺すために放射 線処置の併用遺伝子操作を含む。遺伝子挿入プロトコルは、標的腫瘍細胞に生化 学的違いを人工的に製造し、その後、細胞を特に照射の効果を受けやすくして、 腫瘍細胞死に導くラジオアイソトープを蓄積するために用いられる。 したがって、本発明の目的は、腫瘍を視覚化又は処置し、かつ非新生物形成細 胞破壊、ならびに例えば、¹³¹I、¹²⁵I、¹⁸⁶RE、⁶⁴Cu、⁶⁷Cuのようなラジオアイ ソトープを用いて、治療の材料及び操作を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、放射線療法感度を与えるために腫瘍細胞の間の生 化学的違いを操作する遺伝子治療を用いて腫瘍を殺すことである。 本発明のもう一つの目的は、その細胞ではラジオアイソトープ濃縮が生じる遺 伝子を含有するために遺伝的に腫瘍細胞を設計することであり、ラジオアイソト ープに対する曝露によって、細胞及び目標とされた細胞死においてラジオアイソ トープ濃縮の蓄積を生じることである。 本発明のもう一つの目的は、ラジオアイソトープ濃縮の細胞を遺伝的に操作し て、in vivoで腫瘍のまたは形質転換された細胞をラジオ画像化のために提供す ることである。 発明の概要 本発明の態様に従って、放射性医薬品を用いる治療的方法ならびに診断用の細 胞におけるでラジオアイソトープを濃縮する方法が提供される。これらの方法は 、形質導入された細胞及び放射線療法の中で腫瘍及び非新生物の細胞の破壊をラ ジオ画像化することを含む。方法が、in vinoで細胞を変換することを含む、ま たは形質転換細胞では傍観者効果に因子をコード化している核酸一次構造及び次 の放射線療法の形質発現に、それらの細胞主題と同様にそれらの蓄積が生じてい る放射性核種の悪性変換細胞によって、取込みを提供できる作因をコード化して いる核酸（デオキシリボ核酸またはリボゾームリボ核酸）配列を有する。 核酸によってコード化される因子の好適な態様は、ラジオ画像化している症候 間または放射線療法は投与された放射性元素の致死率と同様に効果を目標として 、及び強化するラジオアイソトープ・コンセントレーターまたは輸送体である。 図面の説明 図１は、実施例部分にて説明されるように、いくつかのネズミ及びヒト腫瘍細 胞系、ヨウ素取込み実験を表しているグラフである。理解されるように、ヨウ化 ナトリウム・シンポーター（symporter）を含有する細胞は氷を有するFRTL細胞 またはベクターのない細胞であった対照細胞よりかなり高いヨウ素取込みを経験 した。 図2(a)-2(d)は、¹²⁵I蓄積の飽和速度式を表しているグラフである。¹²⁵I取込 みの飽和速度式は、ラインウィーバー-バークプロットによって、定まる外部[Γ ]の関数として、線状である。(Lineweaver Hら(「酵素解離定数の決定」)、J Am C hem Soc(1934)、56:658-660)。計算されたkMは31.3μMであった及び、それぞれ 、2(A)A375メラノーマでは34.7のμMヨウ素及び卵巣の2(C)IGROVは細胞を癌のよ うに損傷する。これらの値は、ラット甲状腺FRTL-5細胞について以前に報告され るそれと同様である。（Weiss SJら、「ラット甲状腺から培養細胞の連続系にお けるヨウ素運搬」、内分泌学、1984、114:1090-1098）グラフ2(B)及び2(D)では結 果が、2(B)A375メラノーマ及び2(D)IGROVではNIS活性にレトロウイルスのベクタ ーを含有しなくてまたはLNISNベクターについては変換されなかった卵巣のカル シノーマ細胞を示す。時間は、分で示し、曝露の後、¹²⁵I（0.345nm）まで30μM NaIの全体の濃縮である。迅速かつ支えられた¹²⁵I取込みを留意すること。 図３は、曝露に10μCi/ml 131Iに６時間後に変換された及び非形質導入された 腫瘍細胞のin vitroでの生存を表しているグラフである。生存率は、処置後に増 殖している細胞コロニー蒸留器の計数に基づく。これは、NISを表している腫瘍 が¹³¹I-媒介された甲状腺切除の、標準の、基礎がしっかりしたプロトコルを用 いて、選択的に殺されることが可能であることを示している。 図４は、12時間の曝露の後、133nm Na¹³¹I（10μCi/ml）に、30μMNaI腫瘍細 胞系を表しているグラフである。 図５は、¹³¹Iの６時間の曝露後８日間、BNL.1ME細胞の生存率を表しているグ ラフである。 図６は、単純ヘルペス・ウイルス性pHE700ベクターのプラスミド地図である。 Amp^R(アンピシリン耐性)；「a」、HSV-1パッケー遺伝子グ・シグナル；HSV tkプ ロモーター(HSV-1チミジン遺伝子キナーゼプロモーター)、hyg+(ハイグロマイシ ン耐性)、MCS(マルチクローン化部位)、ΔEBNA-1、修飾EBV核抗原遺伝子、ori P (EBV固有の潜在性複製起点）、ori S(HSV-1複製起点)。 図７は、Hstk遺伝子形質発現ユニットのタンデムリピートを含有しているpHE- tkベクターの光化学変異の効果の提案された機構を表している図である。変更さ れていないベクターについては、変換される許容細胞では、ＤＮＡ合成及び遺伝 子形質発現が起こる(上方)。PUVA処理の後、内部鎖ＤＮＡ架橋がウイルス性複製 を抑制する(Hanson CV、「psoralensを有するウィルスの光化学的失活：概要」、 血液細胞、1992、18：7-25、影響されない転写発現が可能である)。 図８は、PUVA変性ベクターからIGROV卵巣のカルシノーマ細胞では表されるHst k遺伝子活性を表しているグラフである。グラフは曝露の後、pHE-tkベクターにI GROV細胞増殖を表す。そして、3H-チミジン遺伝子移入によって、計られる。媒 介生物は、UVA曝露（0から7.5KJ/m²）のTMP（0または1μg/ml）及び異なってい る長さについては扱われた。腫瘍細胞は104cells/wellで板金でおおわれた及び 、前述したように増殖アッセイがおこなわれた。（リンク、CJ、ら、「事前のイ ンビトロ効能及び乳ガンの治療いおける単純ヘルペス・チミジンキナーゼ遺伝子 系の毒性研究」、Hybridoma、1995、14：143-147、第１節：大腸菌、プラスミド 及びバクテリオファージ、Ausubel FMその他(eds)。分子生物学では電流プロト コル。第１巻。John Wiley and Sons:ニューヨーク、1989、pp．1,4.2-1.4.3） 各サンプルが、官能性Hstk活性をさらに表すと共に、減少をベクター細胞毒性で は詳細に説明しているGCV（0または5.0のμg/ml）について示す。統合された³H −チミジン遺伝子は、最小限度（cpm）あたりの計数として計られて、対照（GCV でない）のパーセントとして表される。 図９は、供与量伝染における腫瘍質量直径を増やす理論的な効果を表すグラフ である。腫瘍菌体量の半径を増やすことは、結果として多数から送信されている β-粒子のより少ないものではなる。 図10は、単純ヘルペスウィルスpHE850ベクターのプラスミド地図である。Amp^R (アンピシリン耐性);「a」、パッケージングシグナル、HSV-tkプロモーター、HSV- 1、チミジンキナーゼプロモーター、hyg⁺(ハイグロマイシン耐性)；、MCS(マル チ クローン化部位)；ΔEBNA-1、修飾EBV核抗原遺伝子；ori P、(EBV固有の潜在性 複製起点)；ori S(複製起点)、GFP(緑色の蛍光タンパク)。 発明の詳細な説明 核医学の分野は、治療（新生物形成及び非新生物形成細胞の破壊のための放射 線療法）ならびに診断（ラジオ画像化）の放射性医薬品を長期間使用してきた。 -核医学では用いられる放射線核は、すべて合成であって、製造されるジェネ レータでも、製造される反応子または製造されるサイクロトロンである。いくつ かの重要な媒介変数は、診断上であるかまたは治療のプロトコルの放射性核の究 極の用途に影響を及ぼす。それが十分に画像化または標的組織の破壊に長くなけ ればならないが、また、受け入れられるクリアランス・パターンを有しなければ ならないように、効果的な生命で画像化に十分長くあるために、放射性核種の半 減期は重大である。理想的には、放射性医薬品は効果的な生命が診断上の手順の 継続時間の1.5倍えなければならない効果がある。効果的な生命で画像化が長く 十分であるために、ヨウ素121、131及び125のすべてのものはそれらのクリアラ ンス・パターンと比較して受け入れられる半減期を有する。放射性核種のいくつ かが珍しいように、有用性はまた、重大なパラメータである。¹³³Xeモリブデン9 9及び¹³¹Iは、uranium-235の分裂の副生成物である。これらの同位元素が、核反 応炉では大きい量で生じて、原子力産業によって、老廃物としてみなされる。対 象外の比率に対する標的は、また重要である。 放射性医薬品による処理の追加の重大な見方は、対象外の比率に標的を含む。 比率が十分に高くない場合、5:1、平らな画像化につき最低限及び一つの光子発 光間2:1は断層レントゲン写真撮影（SPECT）画像化を計算したと、非診断的な走 査がむずかしいかまたは不可能に病理学と背景を区別することをして結果になる ことができる。対象外の比率に対する非常に低い標的の結果は、不必要な線量、 鑑別の遅れ及び手順を繰り返す究極の必要では結果としてなっている非診断上の 走査でありえる。対象外の比率に標的診断上の放射性医薬品用途では重要に、そ れは治療の手順のため絶対に重要である。対象外の比率に対する低い標的は、主 要な病気の不適当な治療及び潜在的に死に至らしめる線量の送達では骨髄または 他の放射線に敏感な組織に結果としてなることができる。核種のいくつかの基は 、放射性医薬品として現在用いられる。最初の基が、同位元素carbon-11を発し ている、nitrogen-13、oxygen-15及びfiuorine-18すべてのものの中で含まれる 、それは製造されるサイクロトロンである。これらは、非常に短い半減期及び３ のサイクロトロン部位で、又はその近くで、それらの用途を設備に制限する効果 がある。18Fが輸送するのが可能である間、実用性は実質的にそれを不可能にす る。 ¹¹¹In、¹²³I及び²⁰¹Tl、第２の基は、γエミッタcobalt-57⁶⁷Gaを含む。これ らは、また、生じるサイクロトロンであって、長い半減期を有して、容易に移動 できる。²⁰¹Tlは、特に興味深い。カメラによって、イメージ発生のために集め られる大多数の光子が、パーセントから低いエネルギーmercury-201 Ｘ線である 135及び167-キロ電子ボルト・ガンマ線が低い。 第３の基が、gallium-68、krypton-81m、rubidium-82、99mTc及び113mINすべ てのものを含む、それはジェネレータが製造された放射性核種である。それほど 多くの化合物を結合するその能力と同様にその理想的な画像化エネルギー及び物 理的な半減期を原因として生じるので99mTcは、特に注目される。 最終的な基が、133^Xeモリブデン99及び¹³¹Iを含む、それはuranium-235の分裂 の副生成物である。これらの同位元素が、核反応炉では大きい量では生じ、原子 力産業によって、廃棄物としてみなされる。伝統的に、適切な放射性医薬品の設 計では限定要因は、標的器官の単に生理機能であって及び器官プロセス（例えば 抗原抗体反応、トラップをとりつけている身体検査、縛っているリセプタ引用、 循環から故意に損害を受ける細胞の収奪及び細胞膜全体の化学的生物種の及び通 常働いている代謝プロセスによる細胞への運搬）における、完全に依存する。し かし、本発明によれば、器官は活発にradioimagingすること及び放射性核種治療 （例えば131I、²⁰¹Tl及び99mTC）のための魅力的な特徴を有する放射性核種がい かなる器官についても甲状腺のヨウ素物symporter遺伝子による活性輸送によっ て、用いられることがこのことにより達成されている、本発明の放射性医薬品を 輸送するために変性されてもよい。放射性ヨウ素は優れた半減期効果がある。（¹²⁵ Iが60日の半減期を有すると、¹³¹Iが8.08の日の効果がある。）それは、多量 に利用できて、対象外の比率に良い標的を有する。しかし、用途がその活性輸 送のために甲状腺では甲状腺癌腫に限られていたことがある。放射線ヨウ素の甲 状腺取込みは、活性輸送による。第一の工程がヨウ化物の中でトラップをとりつ けて、それからサイログロブリン中間体（organification）を含んでいる中間体 合成を経て及びT3及びT4に共役の過程までに最終的に変えられる。静脈内注射に 続いている原基局在は、甲状腺の胃teratoids及びchloroidplexusではある。最 終的に、ヨージドがほぼ３週のTbiolを有するチロキシンとしての甲状腺では格 納されてまたは腎臓を取り除いた。また、活発に、Na+/K+能動輸送体によって、 取り入れる良い媒介変数を有する他の放射性核種が、201Tlある。心筋かん流画 像化は、201Tlについてはタリウム(Tl1+)の形で型通りに形成される。Tl1+がカ リウム・アナログであって、したがって、有効ににかなり文書化されたアデノシ ントリホスファターゼが動かされたナトリウム・カリウム能動輸送体機構によっ て、取り扱われた時から、これはカリウムを取り扱うために通常働いている代謝 経路の資化を含む。静脈内注射に続いているTl1+の原基局在は、心臓、肝臓及び 筋ではある。最終的に、それが腎臓にほとんどクリアされないように、リサイク ルされる。全身Tbiolは、ほぼ10日である。 代謝の移入が多分よりよいものであるにもかかわらず、神経内分泌起源遺伝子 の腫瘍も撮像することは活性輸送のカテゴリに入る説明が可能である。123Iまた は吹き込まれる131ImBGは、構造ではグアネチジンに類似している。エピネフリ ンの前駆体褐色細胞腫、神経芽細胞腫、パラガングリオーマ、それを基質として ホルモンの合成のために用いる：Pカルチノイド型腫瘍骨髄の過形成試みを含む これらの腫瘍がある。材料はしたがって、それらの中で蓄積する及び、蓄積され た追跡子活性は単に腫瘍では関数として増加する。 放射性ヨード取込み研究の詳細な説明が、Hee-Myung Park、第59章、「甲状腺」 、核医学第１巻では開示される、ロバートE．Henkin、1996、Mosby-Year Book I nc．に開示される。それについて、本願明細書に引用として含める。Pertechnet ateなTechnetium-99は、また、ヨウ化物と同じ機構によって、閉じ込められ、甲 状腺の官能性状況も推定するために用いられることが可能である。この放射性医 薬品の用途の効果は、非常により低い照射吸収線量及びより短い持続期間をテス トとために含む。 出願人の発明は、非特異性の作用による正常組織毒性の問題を解決する。遺伝 子動作中の放射性核種蓄積を含んで、本発明は正常組織合併症を無視できるレベ ルに引き下げる。現在まで、放射性医薬品を遺伝子操作プロトコルと組み合わせ るほとんどの試みがなかった。そして、実行可能性を示したWechselbaumらが照 射の大きい供与量に曝露に続いている腫瘍壊死因子形質発現をアップレギュレー トする。Wechselbaumら(int．J．Radiation Oncolo Biol)。生理学、24：565、5 67(1992)。Wechselbaum及びその同僚は、誘導される照射を活性化してもよくて または拡大してもよい遺伝子の構造物の前で、照射反応元素を置くことによって 、cylotoxicなタンパク質類をコード化することは合図する遺伝子または正常組 織を制限している供与量の照射寛容性を増やすタンパク質類をコード化する遺伝 子の転写を統制する可能性を提案した。以前に、Wechselbaumらの「照射をloniz ingすることによって、目標とされる遺伝子治療」を参照のこと。それについて 、本明細書に引用として含める。 他の併用治療は、ヘルペス変換細胞では照射感作体に選択的に新陳代謝する化 合物の用途を含む。哺乳動物細胞では一方不活発である照射感作体をリン酸化す ることは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子発現の用途を含む。ピ リミジンヌクレオシド・アナログの投与に、HSV-tk遺伝子については変形した腫 瘍細胞によって、活性照射感作体に対するこれらの化合物を新陳代謝させて及び それらの細胞が放射線療法により動かされやすくなる。このプロトコルが、つい にPCT公開第WO 96/26743号（1996年９月６日リンクらに公開される）で記載され ている。それについて、引用により本明細書に含める。 本発明は、ここでラジオアイソトープが変換細胞ではラジオ画像化することま たは放射線療法ために、選択的に蓄積されることによる方法論を記載する。本発 明によれば、ラジオアイソトープ・コンセントレーターである核酸については、 標的細胞が変形し、因子及び次の放射線療法をコード化している核酸一次構造の 形質発現に、ラジオアイソトープは標的細胞で蓄積される。 好適な実施例では、因子の取込みにより生じるラジオアイソトープ・コンセン トレーターである。これらの細胞にイオン化放射線を向け、これによりこれらの 細胞では照射の効果をラジオアイソトープの変換細胞が強化する。 ここで使用しているように、「ラジオアイソトープ・コンセントレーター・遺 伝子」という用語は、いかなる核酸一次構造もあるために解釈される形質発現を 含む。それについて、活発にまたは受動的に、輸入に対する細胞に前駆体を含ん でいる放射性医薬品を引き起こしてまたはそれの誘導体を活用させた。 本発明において有用なこの種のラジオアイソトープ・コンセントレーター・遺 伝子の１つの例はヨウ化ナトリウムsymporter遺伝子を含む。そして、それによ って、放射性がある沃素に甲状腺によって、沃素の及び曝露への取込みが生じる 。 本発明で有用な他のラジオアイソトープ・コンセントレーター・遺伝子は、ラ ジオアイソトープ・タリウムの取込みの責任がある動作中の（Na+-K+）アデノシ ントリホスファターゼを含む。、Henkinら、「核医学」、モズビーyear book、第I I巻による1996は本願明細書に引用したものとする93の「腫瘍画像化ではThalliu m-201クロリド及びTechnetium-99m Sestamibi」を章に分ける。 Thallium-201は、アデノシントリホスファターゼ酵素における２つの部位を縛っ て及び細胞により蓄積される(201Tl)。作因がナトリウムpotasium能動輸送体を ブロックするので、その取込みはウワバイン、ジギタリス及び利尿剤フロセミド により抑制される。201Tlは、腫瘍細胞の中でradioimagingすることでは用いら れて及び主に活気のある腫瘍細胞では蓄積する。自由民LM（エディタ）ではワッ クスマンAD（「核の腫瘍学ではThallium-201」）を参照のこと：核医学一年生草、 ニューヨーク、1991、193-209、レーヴン・プレス、ワックスマンA、「胸の優し い質量異常から悪性腫瘍の鑑別ではタリウム・シンチグラフィ」、J Nucl Med、31 ：767、1990(抽象的な)、ワックスマンAD、「胸の質量異常の評価ではタリウム・ シンチグラフィ」、J．Nucl Med、34(1)：18-23（1993）開示。それについて、本 願明細書に引用したものとする。99m Tc-sestamibiは、Na+-K+能動輸送体による 細胞によって、取り上げられる他の作因であって及びNa+-K+アデノシントリホス ファターゼを表している悪性変換細胞の中でradioimagingすることでは用いられ ることが可能である。いずれの種類のラジオアイソトープ・コンセントレーター ・遺伝子は本発明の方法では用いられることが可能である及び、技術のうちの１ つは本発明の範囲内のことを目的とする遺伝子/ラジオアイソトープ化合の多数 の変異を識別できる。例えば、Na+-K+アデノシントリホスファターゼ をコード化している遺伝子は、技術のうちの１つのそばにGenbankのようなデー タベースを捜すことによるまたはプライマを開発して及び公知技術である方法に 従う他の生物種から類似した配列を用いているPCRamplificationを用いることに よる技術では及びAusubel FMら、（ed.）「分子のBlologyでは電流プロトコル」、 第１巻にて開示したように、容易に位置できる。ジョン・ワイリー、ニューヨー ク、1989。 最近クローン化及びラットから輸送体遺伝子が有する甲状腺ヨージドの性格付 け報告し、ここで引用として含める。ダイ、G.、Tax、O.及びCarrasco（N.）「甲 状腺のヨージド輸送体のクローン化及び性格付け」、Nature、379:458-460(1996) 。Na+/1-symporter（NIS）遺伝子は、ツメガエルoocyiesではＲＮＡ転写物を有 する射出の後、ヨージド蓄積アッセイを用いることによって、単離した。NIS転 写産物が導かれるときに、これが800pmol／セルのヨージドの蓄積ができるよう にして。一次配列分析が、618のアミノ酸のタンパクをコード化する1854のbpの 予測された転写解読枠を有する長さでは、2,839bpの遺伝子を示した。この少な い相補ＤＮＡサイズはどちらのRVにでも容易にクローン化ができるようにするま たは、HSVはベクターの基礎を形成した。NISタンパクは、ドメインにわたってい る12の推定のメンブレンを有する。この分子の能動輸送体は、Na+/1-symporter として機能して及び甲状腺ホルモン合成の最初の段を考慮に入れる。このタンパ クは、したがって、甲状腺組織では及び能力間1125取込みの検出がハイパーアク ティヴな甲状腺組織を除去してまたは131Iを有するかなり差異を認められた甲状 腺ガンを治療するのを許す。甲状腺組織のこの面白い及び固有の性状が、放射線 療法を非常に濃縮可能である。(あるとしても甲状腺補足の潜在的な必要以外の 治療から体系の副作用)。NIS遺伝子及び、沃素蓄積を検出すること間方法が「ラ ット甲状腺から培養細胞の連続のラインではヨージド運搬」では開示されるもの として、同程度よく、その活性における追加の情報。ワイス、S.J.ら、内分泌学 vol 114(4)：ここで引用したものとする1090-1098。 甲状腺の主な機能がヨージドを閉じ込めることになっていて及びorganifyする ことになっているので、作因を調べている甲状腺間論理的選択は沃素追跡子(す なわち、放射性ヨード)である。利用できるいくつかの放射性ヨードがある：123 I、 131I及び125I。しかし、125Iは活発な甲状腺研究では間その低いエネルギー(28 のキロ電子ボルト)及びあまり長い半減期（60日）を原因として生じるのでもは や用いられない。甲状腺形態を撮像すること間、pertechnetateな99mTcは、また 、ほとんどの場合満足である。他の作因は、thallium-201、gallium-67、131Iか または123I metaiodobenzylguanidine(MIBG)、99mTc(V)ジメルカプトこはく酸(D MSA)、fluorine-18フルオロデオキシグルコース(FDG)及び99mT csestamibiを含 む。これらの第二の画像化遺伝子は、主に画像化甲状腺腫瘍及びそれらの転移に 用いられる。 放射性ヨードを用いている手順をラジオ画像化することは、長く公知技術であ って及び核医学第Ｉ巻及びIIでは詳細、モズビーPress、1996で開示される。そ れについて、引用したものとする。その多様なアイソトープの形式では沃素は、 また、放射標識単クローン抗体に画像化間及び治療間用いられた。古典的なradi oiodination方法は、Ｙ残渣にタンパク質類では放射性ヨードの共有原子価の付 着を含む。プロセスは、わずかに酸化剤（例えばクロラミンＴ、idogenまたはラ クトペルオキシダーゼ）を用いているアルカリ性pHで、沃素の穏やかな酸化反応 を含む。試薬が第二の分子、概してそれからＮ末端とともに化学反応する活性エ ステル及びＫアミノ基をradioiodinatingすることを含むBolton-hunterを通して 間接的な沃素化手順単クローン抗体。単クローン抗体のradioiodinationの開示 が、A．マイケルZimmer、「単クローン抗体をradiolabelingすることへの新しい アプローチ」、第40章、核医学第１巻、pp．511-515、Henkin、ロバートEで開示 される（ed.）1996(モズビー-Year Book)。 NIS遺伝子は、放射性がある沃素治療に甲状腺ガンの標準治療を作った。腺癌 の大多数は外科的に除去する及び、放射性ヨードは命令的な治療として甲状腺腺 癌の管理の間20年以上用いられた。放射性ヨード治療の効能は、腫瘍取込み及び 保持に甲状腺細胞では表される沃化ナトリウムsymporter遺伝子の存在のために 、直接関与する。効率的な取込み及び放射性ヨードに反応未分化の腫瘍及び骨髄 の癌腫が放射性ヨードにまず集中しないのに対して、例えば乳頭の細胞型または follicularでは差異を認められる腫瘍では観測されている。遂行された腫瘍取込 みは、ほぼ４日の生物学的半減期を有するグラムにつき放射性ヨード供与量 のほぼ0.5%である。5.6Gbq（131Iの150mCiに対する当量）の投与から、腫瘍は25 cGyまたは５つの回ととして同程度非常に外部の放射線療法のコースにより分配 されることができる吸収線量を受信してもよい。さらに、供与量は大きさまたは 場所に関係なく肉塊ではあらゆる官能性転移に分配される及び、腫瘍組織は照射 曝露が肉塊の残りまでに受信した数百回を受信する。腫瘍細胞の取込み及び死滅 間処理間効果的な放射性ヨードの供与量が、1.9の投与によって、5.6Gbqまで完 成している（131Iの50-150mCi。ラジオ画像化手順は、沃素の存在を識別して及 び腫瘍細胞ではその蓄積を追うために用いられる。これらの牛のようなTSH(ＴＳ Ｈ)は、存性ＴＳＨが抑制される甲状腺のガン転移では、放射性ヨードの蓄積を 増やすためにたびたび患者に与えられる。一旦適切な腫瘍取込みが放射性ヨード 画像化により保証されることができると、放射性ヨードの研究治療量は投与され る。伝統的に、放射性ヨードの供与量は、7.4Gbq（100-200mCi）まで、3.7の間 を変化する。線量測定が傷害ではガンの傷害ではポスト-外科の残されたガン組 織パーセント取込み及び放射性ヨードの効果的な半減期の多数の評価に基づく場 合、均一な良い反応が8,000の最小の腫瘍供与量については10000cGYに可能なこ とを示唆された。問題なく投与されることができる放射性ヨードの量における限 定要因が、可能性を含む。通常であるかまたは不可欠な組織における放射性ヨー ドの効果に損害を与えることから合併症を含む。放射性ヨードの普通の治療量か ら全身照射は、20-40cGyであると見積もられる。両者間に沃素範囲の300mCiまで もの30mCiととして同程度低い供与量を含む。標準のimpericalな供与量は150-20 0mCiであり、その蓄積を追っていて及び副作用を管理している放射性ヨードの投 与の方法は公知技術であってそれらの全部では基準によって、取り入れられる以 下の公表では記載されている。イチョウガニ科処理、第４のed.、チャールズM． Haskel、MD、FACP、W.B.ソーンダース社、1995。「甲状腺に対する照射は、両方 とも優しい甲状腺腫瘍及び腫瘍を誘導できる」、核医学通信、14:736-735、1993 。「甲状腺イチョウガニ科の放射性核種及び治療」、O'Doherty、M.J。ら、草花、 M.A.、ら、「量的精査では実際的な実施用途に対する放射性ヨード治療及び甲状 腺癌腫における原基結果を有するPETでは線量測定」、Radiother。Oncol.、1989 、15：345-57、O'Connel、M.E.A.、ら「量的精査及びPETを用いている差異 を認められた甲状腺癌腫ではRadiorodine治療線量応答類縁では線量アセスメン ト」、Radiother。Oncol．(印刷中の)、ハンセン病患者、R.、「甲状腺ガン（ニュ ーヨーク記念の病院方法）の治療では論争」、今日甲状腺、1-4(1982)。放射性ヨ ードの投与間甲状腺のガン及び処理プロトコルのハツカネズミ・モデルは、また 、技術では標準であって及びヨシオ（春日「甲状腺機能におけるヌードマウスで は放射性がある沃素により誘発された甲状腺切除に続いている人間の甲状腺組織 の動物臓器移植の効果」）では開示される。臨床投資する。med．(14(4)：277-28 1)(1981)、それは放射性がある沃素を有するハツカネズミ及び相伴う処理では0. 2ml.の供与量でこれらの細胞の人間の甲状腺組織及び形質発現の移植に基づく人 間の甲状腺ガンを模倣しているハツカネズミ・モデルを開示するまた、活性Radi ologica Therを参照のこと。物理学、1971年12月生物学10(6)G．Walinderによっ て、「ハツカネズミ甲状腺に対する1311供与量の決定」。 ラジオアイソトープまたは光線治療が発明の方法では用いられることが可能で あるかどうか、放射性核種の蓄積が生じるいかなるペプチドもまたはタンパク。 本発明の方法は、悪性変換細胞の中でradioimagingすること間用いられることが 可能である。これはマーカーとして統合された遺伝子の悪性変換細胞によって、 形質発現を追うために腫瘍の中でまたはex-vivoプロトコルのためにradioimagin gすることのような症候プロトコルを含むことができる。そして、その一つはラ ジオアイソトープ・コンセントレーター・遺伝子を含む。方法は、また、悪性変 換細胞によって、選択的に取り上げられるラジオアイソトープに、悪性変換細胞 に医薬品または他の作因の共役を通して、多様な化合物を目標とするために用い られることが可能である。 好適な実施例では、方法は腫瘍細胞のような新生物形成細胞の破壊間放射性医 薬品を蓄積して及び悪性変換細胞を破壊するために非新生物形成細胞と同様に放 射線療法を含む。 本発明の放射線療法は、また、追加分の効果に集中するために他の従来の放射 線増感剤と組み合わせられてもよい。治療の照射に細胞の感度を高めると報告さ れた従来の医薬品の例が、diltiazemの米国特許第4,628,047号で報告され、用途 ではそれらを含む。（化学的学名：d-3-aceotxy-cis-2。ドキソルビシンのよう な細胞障害能作因の方へ癌細胞の様々な型の感度を強化する3-dihydrO-5-[2-（d imethylamino）ethyl[-2-(p-methoxyphenyl]-15-benzo-thiazepin-4(5H)-1)。添 加物または添加物は、照射感作体前駆体またはそれの共役がそうすることができ るこの種の投与間、適切な液体伝播者または賦形剤のような薬学的に受け入れら れるキャリア及び任意の補助と組み合わせられてある。液体伝播者及び賦形剤は 、従来で及び市販である。蒸留水、生理食塩液、デキストロースの水溶液などは 、それについて図示する。伝統的に、IV治療が、むしろ好まれる。 一般に、活性化合物に加えて、本発明の医薬品組成物は、薬学的に用いられる ことが可能である製法に、活性化合物の加工を容易にする適切な賦形剤及び補助 を含有してもよい。 従来のキャリアを有する投与に加えて、技術（例えば移動式の注入液能動輸送 体）の技術のそれらにとって公知である様々な専門送達医薬品テクニックによっ て、活性成分は、投与されてもよい。 本発明の態様に従って、細胞では診断上であるかまたは治療の目的間放射性核 種を蓄積する方法は、提供される。方法は生体内に細胞を変換することを含むま たは、ラジオアイソトープをコード化している配列が蓄積を提供できる遺伝子に 集中する核酸（デオキシリボ核酸またはリボゾームリボ核酸）を有するインビト ロは作因をコード化している核酸一次構造の形質発現に、放射性核種を投与した 。 本発明で役に立つラジオアイソトープは、コンセントレーター・遺伝子につい ては細胞の取込み間対にされることができるいずれでも含む。ポテンシャル・ラ ジオアイソトープは、ラジオ核種金属186RE、188RE、64Cu、67Cu、90yttrium、1 09Pd、212Bi、203PB、212Pb,211At、97Ru、198Au、199Ag及び131Iを105Rh、含む が、これに限定されるものではない。あらゆるラジオアイソトープcoricentrato r遺伝子・ヌクレオチド配列。それについて、公知でまたは技術では技術のうち の１つ時までに確かめられる用いることができる。技術の技術のうちの１つは、 この種の遺伝子間Genbankのようなpublicallyなアクセスできるデータベースで はもう一方を識別するために同様に行うこの種の遺伝子を捜すことができる。 好適な実施例では、ラジオアイソトープ・コンセントレーター・遺伝子は、ヨ ー ジドsymporter遺伝子、Na/k+アデノシントリホスファターゼまたはカルシウム輸 送体である。 本発明の放射線療法は、細胞に与えられる。ラジオアイソトープは、開示され る公知のプロトコルに従って管理されて及びここで悪性変換細胞を視覚化してま たは変換された腫瘍細胞の成長を破壊するのに効果的な量では取り入れられる。 以前に記載されているように、これらの供与量は標準で及び公知技術である。本 発明は、元素の濃縮のために悪性変換細胞では等しい効果を有するラジオ元素の より低い供与量を考慮に入れてもよい。ラジオアイソトープが、寄主に与えられ てもよい、またはそのために生体内である放射線療法として公知技術である量で は細胞に使用する及び、毒性データと同様に寛容性は、周知である。例えば、ラ ジオアイソトープが組織的に、腹膜内の投与による非経口投与による、静脈の投 与によって、または筋内の投与または受け入れられる他のどの投与プロトコルに よっても投与される生体内であるかまたは前の活発なプロトコルである。 本発明によれば、生産者細胞またはラジオアイソトープ・コンセントレーター ・遺伝子があっている他の形質発現メディアが細胞に与えられるときに、すなわ ち、「傍観者効果」がそうする代謝協力がラジオアイソトープ・コンセントレー ター・遺伝子をコード化している核酸一次構造については、変換されない腫瘍細 胞がまた、選択的に視覚化されてもよくてまたは放射線療法の投与に殺されても よい結果になる。 1311のエネルギーが粒子壊変の位置から組織では7mmを進行することができた 時から、本発明の方法は有力な傍観者効果を有しなければならない。抗腫瘍の抗 体を用いることは、強い支えとなる証明が1311については治療の作因としてradi olabeledしたように、この事実は繰り返し見られた。Divgi、C.R.、「鑑別間単ク ローン抗体及びイチョウガニ科の治療の状況」、Oncolo １０：939-953(1996)。 遺伝子送達が再発する傷害では腫瘍細胞の100%を目標としなければならないので 、傍観者死滅はこの新規な方法の重要な元素である。位相ｉまたはII試験ではテ ストされている現在の遺伝子送達方法が人間ではかなり能率が悪いので、これは 重要である。人間では1311年の用途は、供与量及びモニタリングに関してかなり 特徴づけられる。1311年の5.6Gbqの投与は、照射線量当量では 25,000cGyまで甲状腺腫瘍に通常結果としてなる。Hershman、J.M.、Blahd、W.H 。及びゴードン。イチョウガニ科処理、ed．Haskell、c.m.743-752(W.B.ソーン ダース、フィラデルフィア、1995)ではH.E.である。 本発明によれば、遺伝子送達の方法は、標的組織では遺伝子送達及び形質発現 の錯体問題を克服するために使用されなければならない。実施態様が、悪性変換 細胞ではラジオアイソトープ・コンセントレーター・遺伝子の形質発現を提供す るポリヌクレオチド配列を含む。好適な実施例では、ポリヌクレオチド配列はラ ジオアイソトープ・コンセントレーター元素をコード化している遺伝子を含む形 質発現構造物であり、特定の規定する元素は有効に遺伝子とつながった。そのよ うな元素が、プロモーターである遺伝子に結ばれて細胞では遺伝子の転写及び究 極の形質発現を提供できる。プロモーターは、構成できるかまたは誘導可能であ りえる。哺乳動物細胞では活発であるプロモーターの多数が、公知技術である及 び適切なプロモーターの中で選抜であり、容易に技術で最適化して熟慮する。い くつかの適切なプロモーターは、開示されたm Maniantis「分子クローニング」 である。Cold Spring Harbor Press(1989)。好適な実施例では、プロモーターは ラジオアイソトープ・コンセントレーター・遺伝子、有効にマルチクローニング サイトに結ばれる遺伝子送達間、ウイルス性ベクター内で位置するウイルス性プ ロモーターである。形質発現構造物は、また、概してラジオアイソトープ・コン セントレーター・遺伝子に有効に結ばれる終結またはポリアデニル化配列を含む 。以下にｄを記載するように、本発明の構造物はベクターまたは遺伝子導入伝播 者内で更に成られてもよい。 誘導可能なプロモーターは、本発明の方法についてはラジオアイソトープ・コ ンセントレーター・遺伝子を活性化することではプロモーター及び特定のプロモ ーターが特定の細胞では活発かどうか識別するために診断上のturbidoscanでは 、例えば、同じプロモーターに、有効に結ばれる他のどの遺伝子もの活性を視覚 化するためにradioimagingすることでは用いられることが可能である。例えば、 チロシン水酸化酵素プロモーターは、脳の一部ではチロシン水酸化酵素活性を定 義するために用いられてもよい。これは、パーキンソン病の価値ある前兆である か、または診断上の情報を提供してもよい。 さらに他の実施態様では、プロモーターは悪性変換細胞だけでなく変形する腫 瘍細胞でも遺伝子の選択的遺伝子発現を提供できる腫瘍特定のプロモーターであ る。本実施例において、本発明のポリヌクレオチド配列は、診断によって、また は治療として用いられることが可能である。NIS遺伝子を有する腫瘍細胞または それらのような特定のプロモーターが実施例７では使って開示した腫瘍に、有効 に結ばれるその当量のトランスフォーメーションが、NIS遺伝子の調節発現が起 こる及び1251がとられる腫瘍を撮像する。したがって、本発明のベクターが、細 胞特定のプロモーターまたはinducibleなプロモーターに結ばれることができて 及び細胞の状態について放射性ヨード取込みに基礎をおいてradioimagingすると 共に非常に特定の情報を与えることができる。 遺伝子送達の２つの方法が、他の実験では成功したと証明された。最初の方法 はレトロウイルスの（RV）送達、Moolten、F.L.である、「腫瘍化学感受性は、 ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を挿入した：未来のイチョウガニ科コントロー ル戦略の方法」が、癌のように損傷する。46：5276-5281(1986)、リンク、C.J. 、Kolb、E.及びマルドゥーン（R.）「事前のインビトロ効能及び乳ガンの治療間 単純ヘルペス・チミジン遺伝子キナーゼ遺伝子系の毒性研究」、ハイブリドーマ1 4：143-147、1995。この遺伝子送達方法は、BreakfieldがRVの直接の卵着床を用 いている基が細胞（VPO）を製造することを一定方向に向ける効果があるXandra によって、初めに実行される仕事に基づく。ショート、M.P.、ら、「レトロウィ ルス・パッケー遺伝子グ細胞系の移植によるラット脳ではグリオーマ細胞に対す る遺伝子送達」、J．Neurosci。Res.、27：427-439、1990。この遺伝子送達方法 を用いて、単純ヘルペス・チミジンキナーゼ（HS-tk）遺伝子を導くためにxenog eneicなVPCの腹膜内の注入液を使用する再発する卵巣のガンをもつ患者の位相１ つの臨床試験は、出願人により使用された。リンク、C.J.、Moorman。D.、Sereg ina、T.。Tax、J.P.及びSchabold（K.J.）「低抗性または再発する卵巣のイチョ ウガニ科の処理のKinase/Gancicldvir系の単純ヘルペス・チミジン遺伝子を有す る活発な遺伝子治療では位相ｉ試験」、人間の遺伝子Ther.、Press(1996)では、 第７巻。このように、本発明は実施例において、NISのようなラジオアイソトー プ・コンセントレーター・タンパクをコード化する核酸一次構造を含んで いる新規なレトロウイルスのベクターを含む。 遺伝子送達の第２の及びより新規な方法は、HSV-1に基づくアンプリコン系で ある。ここで記載されているように、この遺伝子送達ベクターは出願人により開 発された。出願人のユニット（pfu/ml）を形成している3-10プラークのモイに向 かってpHEベクターが腫瘍細胞インビトロの>95%を変換することが分かった。HSV ベクターは、また、生体内に齧歯動物腫瘍に高いefflciency遺伝子導入を考慮に 入れる。Boviatsis、E.J.、ら、「手つかずのチミジンキナーゼ遺伝子を保持する Ganciclovirについては扱われる脳腫瘍及び単純ヘルペスウィルス媒介生物を収 容しているラットの長期の生存」、イチョウガニ科Res.、54：5745-5751(1994)。 これらの好適な実験的なモデルでは、遺伝子導入は完全な寛解傾向を誘導するの に十分効率的な及び長期若干の禽獣では生残であった。 好適な実施例では、パッケー遺伝子グ細胞系はレトロウイルスのベクター（例 えば先に記載されているそれら）については変換される。そして、それはNa+/I- symporter遺伝子を含む。変換されたパッケー遺伝子グ細胞が、生体内に投与さ れる、または前の活発な受け入れられる医薬品キャリアでは及び腫瘍の成長を抑 制して、防いでまたは破壊するのに効果的な量では腫瘍に。生産者細胞の投与に 腫瘍にとって、生産者細胞は、Na+/I-symporterをコード化している遺伝子を含 んでいるウィルス粒子を生成する。この種のウィルス粒子は、隣接した腫瘍細胞 を変換する。 ヒトであるかまたは動物の宿主生物は、それから適切な対応するラジオアイソ トープを与えられる。Na+/I-symporter遺伝子の場合ラジオアイソトープは、131 1である。遺伝子の形質発現に、ラジオアイソトープは悪性変換細胞では選択的 に集中される。先に、言及されるように、「傍観者効果」はまた、起こってもよ い。それによって、非変換された腫瘍細胞も同様に殺されてもよい。 目標とされた腫瘍が中にあってまたはそばに、肝臓、皮ふ、硬骨、筋、膀胱、 前立腺、腎臓、副腎、膵臓、心臓、血筋及び、その中に、甲状腺組織のような、 mitoticallyに比較的静止している細胞から成り立つ組織を囲むときに、直接に 間レトロウィルスを利用している活発な治療では本発明の方法は特に役に立つ。 発明の才のある方法も、腹膜では、クモ膜下腔では及び肋膜の腔では位置する腫 瘍に対して役に立たなければならない。その他に、器官では腫瘍減失、全部また は一部では、一般によく見られる本発明の処理の好適な標的が、例えば、肝臓で ある。 ベクターの中で腫瘍サイトに本発明の方法のために目標とすることは、多くの プロトコルにより達成されることができる。ベクターが、直接標的部位で機械的 に吹き込まれることができる。これが、プラスミドＤＮＡ、単純ヘルペス・ウイ ルス性が一定方向に向ける（どちらのアンプリコンでもまたは近い全部のウィル スベクター）レトロウイルスのベクター(MMKVまたは基礎を形成されるHIV)、ade noviralなベクター、Sandaiウィルスベクターまたはデオキシリボ核酸ポリリシ ン抗体複合体については完成していることができる。 方針は、また、外来物質（ファゴサイトーシスまたはマクロファージ）の選択 的な取込みにより起こることができる。他の方法は、epoリセプタのような腫瘍 細胞を分けることにおけるウイルス性標的または抗体がウイルス性エンベロープ に縮合した用途を含む。上記したように、組織かまたは腫瘍特定のプロモーター は、また、例７にて開示したように、用いられてもよい。 生産者細胞の直接の注入は、肉塊では特に複製-コンピテント・レトロウイル スのベクターが用いられるときに、ウィルスの望ましくない生殖を最小にする。 肉塊の大部分の細胞がamphotropicなレトロウイルスのベクター間リセプタを表 すので、腫瘍のローカル生育環境から逃げるいかなるベクター粒子も他の細胞に 直ちに縛らなければならない。しかし、大部分の細胞は、回路ではなくて、した がって、ベクターに沿って運ばれる遺伝子を統合しなくて及びそれが含有するい かなる遺伝子も表さない。したがって、回路では曝露の時点であるポテンシャル 的状赤血球の割合は少ない及び、正常組織における体系の毒作用は最小にされる 。 本発明によれば、扱われてもよい腫瘍は、悪性の及び非悪性の腫瘍を含む。扱 われてもよい悪性の（主要な及び転移）腫瘍は、副腎では起こっているそれらを 含むが、これに限定されるものではない、膀胱、硬骨、胸、首、内分泌腺(甲状 腺、脳下垂体及び膵臓があること)、大腸、直腸、心臓、造血組織、腎臓、肝臓 、肺臓、筋、神経系、脳、目、口腔、咽頭、喉頭、子房、男根、前立腺、皮ふ( メラノーマがあること)、こう丸、胸腺、及び子宮が含まれる。カポジ及びマス ト セル)、腫瘍及びこの種の細胞。 遺伝子操作方法 腫瘍細胞を変換する適切な形質発現伝播者では、ラジオアイソトープ・コンセ ントレーター作因をコード化する核酸一次構造が、含有される。しかし、特定の 所有者の形質発現伝播者は以前に論議された及び、適切な遺伝子導入伝播者は本 発明の方法により使用されてもよい。本発明も、放射線療法ではそれらの用途と 同様にこれらの新規な形質発現伝播者を含む。この種の発現ベクトルは、enkary oticなベクター、prokaryoticなベクター（例えば細菌ベクトル）及びウイルス 性ベクターを含むが、これに限定されるものではない。 一実施例では、発現ベクトルはウイルス性ベクターである。使用されてもよい ウイルス性ベクターは、レトロウイルスのベクター、アデノウィルスベクター及 びアデノ衛星ウィルスベクターを含むが、これに限定されるものではない。 好適な実施例では、パッケー遺伝子グ細胞系は、阻害を提供する作因をコード 化している核酸一次構造または要因を含有しているウイルス性ベクター、保全ま たは腫瘍細胞の破壊についてはウイルス性ベクターを含んでいる生産者細胞系を 形成するために作因をコード化している核酸一次構造の形質発現に変換される。 生産者細胞はそれから腫瘍に与えられる。それによって、生産者細胞は腫瘍細胞 を変換できるウィルス粒子を生成する。 好適な実施例では、ウイルス性ベクターは、レトロウイルスであるかまたはad enoviralなベクターである。使用されてもよいレトロウイルスのベクターの例は Moloneyマウス白血病ウィルス（脾臓ネクローシス・ウィルス）を含むが、これ に限定されるものではない及び、ベクターはレトロウィルス（例えばラウス肉腫 ウィルス、ハービー肉腫ウィルス、トリ白血病ウィルス、ヒト免疫不全ウイルス 、myeloproliferativeな肉腫ウィルス及び乳房の腫瘍ウィルス）に由来した。 レトロウイルスのベクターは、作因として真核細胞にレトロウイルスの調停し て解決された遺伝子導入を調停して解決するために役に立つ。レトロウイルスの ベクターが、一般に造られる。ウィルスの構造遺伝子間大多数の配列コード付け が、削除されて及び重要な遺伝子により置き換えられる。最もたびたび、構造遺 伝子（すなわちgag、env）は公知技術である遺伝子操作テクニックを用いている レトロウイルスのバックボーンから除去する。これは、パッケー遺伝子シグナル の適切な一部を含有しているフラグメントを生成するために適切な限定エンドヌ クレアーゼを有するか、若干の例では、Bal 31のエキソヌクレアーゼを有する消 化作用を含んでもよい。 これらの新しい遺伝子は、いくつかの一般的な方法ではproviralなバックボー ンに組み込まれた。最も率直な建設は、それからウイルス性調節配列のコントロ ールの下に、末端反復配列（LTR）内で写される単一遺伝子によって、レトロウ ィルスの構造遺伝子が置き換えられるものである。複数の遺伝子を的状赤血球に 導くレトロウイルスのベクターは、また、造られた。通常、この種のベクター1 では遺伝子がウイルス性LTRの制御調節の下にあること。その一方で、遺伝子が 表される瞬間継がれたメッセージを離れてまたは独自の調節（内部プロモーター ）の下にある。 効果を、主に遺伝子組換え間ベクター及びpackaging-defectiveなヘルパーウ ィルスの間でパッケー遺伝子グ細胞内でチャンスを減らす努力では、ウイルス性 バックボーンのウイルス性成分を最小にすることにあてた。パッケー遺伝子グー 不完全なヘルパーウィルスはレトロウィルスの構造遺伝子を提供するのに必要で ある。そして、それはベクターから削除された。 一実施例では、レトロウイルスのベクターが曲げる器具、ら、J．Virolでは記 載されている一連のベクターの人であってもよいこと。絶対の最低限に縮小して なる一連の欠失を含有しているN2ベクター（Armentano、ら、J.Virol.（61：164 7-1650）及び置換に基づく61：1639-1649（1987）ベクター及びパッケー遺伝子 グ系間の相同。これらの変化は、また、ウイルス性・proteinsが表されるという 見込みを減らした。これらのベクターの中で最初のものでは。LNL-XHC、タグに 対するギャグの自然のATG開始コードンが、部位特異的突然変異によって、変え られてあった。そして、このことによりその位置から意図されていないタンパク 質合成を削除する。 Moloneyマウス白血病ウィルス（MoMuLV）(5)では』確実なギャグ・スタートに とって、他のglycosylatedされたタンパク（pPr80gag）の形質発現ができる ようにする転写解読枠が、存在する。フレームシフトを含むMoloneyマウス肉腫 ウィルス（MoMuSV）が、これでは変更を有する5』領域及びpPr80gagのアミノ末 端のポテンシャル形質発現を取り除くグリコシル化部位の減失。MoMuSVのしたが って、ベクターLNL6が、作られた、LNL-XHCの両方の変えられたATGを取り入れた ‖及び5』一部。遺伝的に変換された的状赤血球ではウイルス性テストの次の製 造については、lnベクター系の5』構造は、したがって、レトロウイルスの解読 枠の形質発現の可能性を除去する。lnベクター（Biotechniquesなミラー（ら）( 7：980-990)1989）ではパッケー遺伝子グ-不完全なヘルパーウィルスを有する重 なりを減らす最終的な変更では、ミラーが直ちに先立っている特別なenv配列を 除去したこと』LTR。 いかなる遺伝子導入系によってもその適用法間遺伝子治療に満たされなければ ならない最高の必要は、安全性である。感染力をもつベクターの製造間利用され るパッケー遺伝子グ系と共に、安全性はベクターゲノム構造の化合に由来する。 ミラー、その他が、レトロウイルスの構造タンパク質の形質発現間lnベクター系 と共に組換え型野生型レトロウィルスの生成がほとんどベクターゲノム及びpack aging-defectiveなヘルパー・ゲノム（すなわちpPAM3を有するln）の間で遺伝子 組換えの全ての部位の脱離による最低限に引き下げられるベクターパッケー遺伝 子グ系を作るためにpPAM3プラスミド（パッケー遺伝子グ-不完全なヘルパー・ゲ ノム）の化合を開発した。 一実施例では、レトロウイルスのベクターは、先に言及されて及び追加分の曲 げる器具、ら（1987）及びミラー、その他（1989）では記載されているそれらの ような、ベクターのln系のMoloneyマウス白血病ウィルスであってもよい。この 種のベクターは、ハツカネズミ肉腫ウィルス及び変化されたギャグ開始コードン に由来するパッケー遺伝子グ・シグナルの一部を有する。ここで用いられて「変 化される」項が、ギャグ開始コードンが削除されてまたは変わったことを意味す るギャグ・タンパクまたはフラグメントまたは、それのトランケーションは、表 されない。 もう一つの実施例では、レトロウイルスのベクターは少なくとも４つのクローン 化または限定酵素認識部位を含んでもよい。そこにおいて、部位のうちの少なく とも２つは一度より10,000の塩基対では少ないものの真核細胞遺伝子では、出現 の平均の振動数を有する、すなわち、規制変異生成物は、少なくとも10,000の塩 基対の平均のデオキシリボ核酸大きさを有する。好適なクローン化部位は、NotI 、SnaBI、SaII及びXhoIから成っている基から選ばれる。好適な実施例では、レ トロウイルスのベクターは、各々のこれらのクローン化部位を含む。 この種のクローン化部位を含んでいるレトロウイルスのベクターが使用されると きに、NotI、SnaBI、SaII及び位置するXhoIから成っている基から選ばれる少な くとも２つのクローン化部位と互換性を持つ少なくとも２つのクローン化部位を 含むシャトル・クローニングベクタはレトロウイルスのベクターにおけるまた、 提供されてもよい。シャトル・クローニングベクタも、シャトル・クローニング ベクタからレトロウイルスのベクターまで移されることができる少なくとも一つ の所望の遺伝子を含む。 シャトル・クローニングベクタが、基本的「バックボーン」ベクターまたはフ ラグメントから造られてもよい、それはクローン化または限定酵素認識部位を含 む結さつされた一つ以上のリンカーである。先に記載されている互換性を持つか または相補的なクローン化部位は、クローン化部位に入れられる。シャトルベク トルの制限サイトに対応する端を有する遺伝子および／またはプロモーターは、 公知技術であるテクニックによるシャトルベクトルに結さつされてもよい。 シャトル・クローニングベクタは、prokaryoticな系ではDNAの塩基配列を拡大す るために使用されることができる。シャトル・クローニングベクタは、prokaryo ticな系では及び特に、バクテリアでは一般に用いられるプラスミドから製造さ れてもよい。したがって、例えば、シャトル・クローニングベクタは、pBR322の ようなプラスミドに由来してもよい、pUC 18、その他 ベクターは、一つ以上のプロモーターを含む。使用されてもよい適切なプロモ ーターは、レトロウイルスのLTRを含むが、これに限定されるものではない、SV4 0プロモーター、及びプロモーターがミラー、ら、Biotechniques、7では記載し たヒトサイトメガロウイルス(CMV)：(9つの)：980-990（1989）または他のどの プロモーター（例えばenkaryoticな細胞のプロモーターのような細胞のプロモー ター含む、しかし、制限する（ヒストン）政治家III‖及びp-actinプロモー ター）も。使用されてもよい他のウイルス性プロモーターは、アデノウィルスプ ロモーター、Tkプロモーター及びB19パルボウィルスプロモーターを含むが、こ れに限定されるものではない。適切なプロモーターの選抜は、ここで含有される 教示から当業者まで明らかである。 ベクターは、それから生産者細胞系を形成するためにパッケージ細胞系を変換 するために使用される。transfectedされてもよいパッケージ遺伝子細胞の例は 、PE501、PA317、Ψ2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、G P+E-86、GP+envAM12及びDAN細胞系を含むが、これに限定されるものではない。 阻害、保全または腫瘍細胞の成長の破壊間作因をコード化している核酸一次構造 の形質発現に、providngができる作因をコード化している核酸一次構造を含有し ているベクターは、公知技術であるいかなる手段によるもパッケー遺伝子グ細胞 を変換してもよい。この種の手段が、electroporationを含むが、これに限定さ れるものではない。 生産者細胞は、それから直接腫瘍にまたはに隣接して次の放射線療法に抑制し て、防いでまたは腫瘍の成長を破壊するのに効果的な量では投与される。一般に 、生産者細胞は患者によって、大目に見られる量では投与される、として、でき るだけ多くの生産者細胞を吹き込むことは、望ましい。投与される生産者細胞の 正確な量が、多様な第因子次第である。しかし、制限する、腫瘍の腫瘍及び大き さの型。 一般に、生産者細胞は、直接腫瘍にまたはに隣接して射出により投与される。生 産者細胞が、投与者の仕事を行われる‖薬学的に。患者に対する投与間適切な受 け入れられるキャリア。キャリアは、液体キャリア（例えば食塩水）であっても よい。 生産者細胞の投与に腫瘍にとって、生産者細胞は、ウィルス粒子を生成する。 ウィルス粒子は、それから周囲の腫瘍細胞を変換する。及び特定のガンの腫瘍細 胞では一般に、腫瘍細胞が活発に細胞の写しを作っているので、レトロウイルス の粒子は統合されられて及び優先してまたは排他的に腫瘍細胞では正常細胞に対 して表される。 好適な実施例では、本発明は共通に人間を感染させるベクター及び人間である パッケー遺伝子グ細胞系が基礎を形成したウイルス性を含む。例えば、活性aa-g alactosylエンベロープを表す共通に人間（例えばヘルペスウィルス、Epstein B arr Virus）を感染させるウィルスに由来するベクターは、用いられてはならな い。 最も好適な実施例では、ベクターは単純ヘルペスウィルス・プラスミドベクト ルを含む。単純ヘルペスウィルスtype-1（HSV-1）は、潜在的な役に立つ遺伝子 送達ベクトル系として、遺伝子治療、Glorioso、J．C.、「中枢神経系に対する遺 伝子導入間単純ヘルペスウィルス媒介生物の現像間示された。遺伝子治療学：直 接の遺伝子導入の方法及び適用法」、ジョンA.ウルフ、エディタ、1994のBirkhau serボストン281-302、ケネディP.G.、「神経学上のDrseasesでは遺伝子治療間単 純ヘルペスウィルス媒介生物の用途」Q J Med、1993年11月、86(11)：697-702、L atchman、D.S.、「遺伝子治療間単純ヘルペスウィルス媒介生物」。モルBiotechno l、1994年10月、2(2)：179-95。 HSV-1ベクターは、遺伝子移動間筋に用いられた。Huard。J．(「単純ヘルペス・ ウイルス１型媒介生物は、筋に遺伝子導入をMedratedした」)。遺伝子治療、1995 、2、385-392、及び脳、Kaplitt、M.G.、「プレプロエンケファリンプロモーター は、成体脳では直接にの後、活発な遺伝子導入では不完全な単純ヘルペス・ウイ ルス性媒介生物を通して、領域に特有の及び長期の形質発現を生む」、Proc Natl Acad Sci USA、1994年９月13日、91(19):8979-83‖及び、ネズミ脳腫瘍処理、B oviatsis、E.J.間用いられた、「手つかずのチミジン遺伝子キナーゼ遺伝子を保 持するGanciclovirについては扱われる脳腫瘍及び単純ヘルペスウィルス媒介生 物を収容しているラットの長期の生残」は物件、1994年11月15日、54(22)を癌の ようにむしばむ：5745-51、Mineta、T.、「Ganciclovir-Hypersensitiveな、リボ ヌクレオチドレダクターゼが欠けている単純ヘルペス・ウイルス性ミュータント を用いている悪性腫瘍神経膠腫の処理」、1994年８月１日イチョウガニ科物件、5 4(15)：3963-6。 ヘルパーウィルス依存しているミニのウイルス性ベクトルはより簡単な操作及び それらの容量間より大きい基本入(最高140kb)、ゲラー、アール間開発された、「 不完全な単純ヘルペスウィルス媒介生物間効果的な欠失突然変異体パッケー遺 伝子グ系:人間の遺伝子治療及びNeuronal Physiologyに対する可能な用途」、199 0年11月Proc Natl Acad Sci USA、87(22)：8950-4、Frenkel、N.、「単純ヘルペ スウィルス・アンプリコンA用途が広い欠陥ウィルス・ベクトル」、遺伝子治療l. 補足1、1994。複製不適格者HSVアンプリコンが技術では造られた、１つの例はゲ ラーら、科学、241、1988年９月によるpHSVlacベクターである。そして、ここに て取り入れられる。これらのHSVアンプリコンは、HSVゲノムの大きい欠失を外来 性ＤＮＡの基本入間宇宙空間を提供するために含有する。一般的に、それらはHS V-1パッケー遺伝子グ部位、HSV-1「ori S」複製部位及びIE 4/5プロモーター配 列を含む。これらのウィリオンは、ヘルパーウィルスにおける生殖間依存する。 ２種類の主に変化したヘルパーウィルスは、遺伝子組換えを最小にするために開 発された。他の相補的なHSVヘルパーウィルス系は、ここで熟慮されて及び技術 では技術のそれらの範囲内である。開発されたそのような系は、温度感受性突然 変異体である。変化したHSV温度感受性（TS）は、TS突然変異についてはIE3遺伝 子では開発された。デーヴィソンら、1984、J.陸上幕僚長Virol．(65：859-863) 。従って、このウィルスは、IEフェノタイプを有して、デオキシリボ核酸の写し を作らなくて、signifrcantlyに細胞生理を変えなくて及び子ウィルスを37'Cで 製造しない。ウィルスは、37'Cの許容温度で発達する。ｔｓ突然変異株は、しか し野生型に戻る傾向を有した。 反対では、第２のヘルパーウィルス系は、単に削除される大多数のIE3遺伝子を 有する欠失突然変異体である。これらは、野生型に戻らない。したがって、ヘル パーウィルスが本発明の最も好適なヘルパーウィルスであるように、HSV-1ベク ターは欠失突然変異体を用いることを包装した。例パターソンら、1990、J.ジェ ン間を参照のこと。Virol．(71：1775-1783)。他の複製不適格者ヘルパーウィル スが、用いられることができて及び技術意志では技術の中で一つである‖wmが『 適切な複製及び形質発現機能及び、ヘルパー細胞系及びベクターについてはコー ディネートされる‖「本発明内で熟考した。に提供する複製不適格者ヘルパーウ ィルスでは、結果としてなるIE遺伝子または他の遺伝子ではその他の突然変異認 めるそれがIE3または複製依存している遺伝子を表してまたはすでに変形し て及び市販であるヘルパー細胞系を得ることができる限り、いかなる細胞系もこ の段間用いられることが可能である。いかなる細胞系も、pHE及びIE3遺伝子を同 時に含有しているプラスミドを導くことによって、用いられることが可能である 。次に、ベクターはelectroporation、リン酸カルシウムＤＮＡトランスフェク ションまたは他のどの適切な方法によってもヘルパー細胞系に分配される。いか なる細胞系も、pHE及びIE8遺伝子を同時に含有しているプラスミドを導くことに よって、用いられることが可能である。細胞は、複製不適格者であるヘルパーウ ィルスIE8欠失突然変異体に感染する次または他の対応する欠失突然変異体であ る。IE3遺伝子または生産的なHSV-1感染では結果としてなっているヘルパーウィ ルス及び結果として生じるウィルスがたくわえるヘルパー細胞系補体ではこの種 の遺伝子が成るもう一方どちらのベクターデオキシリボ核酸でも含有しているHS V-1粒子またはヘルパー・ウィルスＤＮＡ、その全ては複製不適格者である。ヘ ルパー細胞系及び方法論についての更なる情報が、ゲラーら、PNAS、87では開示 される：1990年11月、8950-8954、「不完全な単純ヘルペスウィルス媒介生物間 効果的な欠失突然変異体パッケー遺伝子グ系：本発明がＥＢウィルスからそれら のような他のウイルス性配列、人間の乳頭しゅウイルスまたはベクターを許す牛 のような乳頭しゅウイルス型１と複製不適格者HSVアンプリコンを組み合わせる ミニ1HSVベクターを含む人間の遺伝子治療及びNauronal Physiologyに対する可 能な用途」が、細胞ではより大きいタイター及び非常に大きいデオキシリボ核酸 が挿入する１０回を成し遂げているepisomalな形式では維持される‖能力。 本発明の一実施例が、ヘルパーウィルスに依存するミニのウイルス性ベクターを 含む‖含む：(a)パッケージ/開裂間HSV-1「a」配列が、.andを合図する‖プラス ミド（replicateに対するシグナル及びヘルパーウィルスからパッケージに応答 して）の複製パッケー遺伝子グ間「ori S」複製起点、ベクトルがepisomalでは 維持されるのを許可するＥＢウィルス核抗原（EBV）(EBNA-1)遺伝子及びEBV潜在 性複製開始点（ori P）は、細胞核内で宿主ゲノムに対する組込みのない複製間 及び均一な複製間各々の２つの分裂細胞に形成する、（b）好ましくは（c）大腸 菌ではベクターの生殖間原核細胞から遺伝子(選択可能なマーカー遺伝子(例 えばアンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性遺伝子及びcol.)E1 ori)及び （d）NISのようなラジオアイソトープ・コンセントレーター・タンパクをコード 化している配列。選択的に、ベクターはまた、ポジティブなハイグロマイシン選 抜間遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを提供する原核細胞遺伝子を含ん でもよい。 この特定の実施態様では、単純ヘルペス・ウイルス性カプシッドへのミニのベク ターデオキシリボ核酸の.packaging機能は、ヘルパーウィルス及びヘルパー細胞 系により提供される。 他の実施態様ではまだHSVベクターがマンら、「レトロウィルス・パッケー遺伝 子グ・ミュータントの建設及びヘルパーのない不完全なレトロウィルスを製造す るその用途」33のSal.、pに記載のヘルパー自由なウイルス性ベクターを製造す るためにengrneeredされることができること。153-159、1983年５月、ウィルス 学のジャーナル、1989年９月、1989年９月、pp．3822-3829、Samulski「組換え型 アデノ衛星ウィルスのヘルパー自由な株：通常の組込みは、ウイルス性遺伝子形 質発現を必要としない」、及びKohnら、「哺乳動物細胞への高効率遺伝子導入：幅 広い哺乳動物寄生範囲を有するヘルパーのない組換え型レトロウィルスの生成」 、PNAS、81：1984年10月、6349-6353。また、本願明細書に引用したものとするO kasinki（米国特許第4,970,155号「HSVヘルパーVIRUSインディペンデント媒介生 物」）を参照のこと。 全ての引例は、ここでそれらの全部ではこれによって、明白に取り入れられる。 本発明は、現在以下の例に関して記載されている、しかし、本発明の範囲は、こ のことにより制限されることを目的としない。 例１ レトロウイルスのトランスダクション 放射線療法の後、ローカルに戻る及び化学療法に対する低抗性である乳癌は、む ずかしい臨床の対抗を表す。患者は、たびたび禁止の毒性に従属することのない 更なる外部の光線放射線療法を大目に見ることができない。同様に、特に結合さ れた様相治療の後、更なる化学療法は、大きい利点のない重大な毒性を提供でき る。この設定では、理想的な治療は、相当であるかまたは生命に脅威となる副作 用のないこれらの重大な傷害のより良い緩和間、よりローカル及び効果的な処理 を提供する。この端頃に、多くの実験室が目標とされた遺伝子導入漢民族、X.、 Kasahara、N.及びカン（Y.W.）に基づく分子の方法を調査していること「人間の 乳癌細胞の中でレトロウイルスに目標とすることをLigand-Drrectedした」（pro c.）国家アカデミSci米国（92：9747-9751（1995）またはプロモーター.specifi city）ハリス、J.D.、Gutiertez、A.A.、ハースト、H.C.、Sikora、K.及びLemoi ne(N.R「Tumor-Specificなプロドラッグ活性化を用いているイチョウガニ科間遺 伝子治療」)遺伝子Ther.、１：170-175、1994。これらの実験は、現像の舞台の初 期にあるが、いくらかの約束を示した。我々の提案は、かなり回りに境界線を引 かれた領域では照射を殺している腫瘍に集中する方法の新しい観念における焦点 に集まる。遺伝子は、それらを通常の甲状腺胞状細胞のヨージド取込みを模倣さ せる乳癌細胞へ移される。我々のプロジェクトでは、我々は従来のレトロウイル スの（RV）ベクター送達を甲状腺のヨージド輸送体遺伝子の我々の新規な単純ヘ ルペスウィルス（HSV）ベクター送達と比較する。 レトロウイルスのまたはヘルペス・ウイルス性は、効果的な移植間乳癌細胞に試 験管内に官能性甲状腺のsymporter遺伝子を一定方向に向ける。 甲状腺のヨージド輸送体遺伝子のクローン化及びLXSNレトロウイルスのベクター へのサブクローニング。以前に、ダイらにて説明したように、甲状腺のヨージド 輸送体遺伝子を孤立させるためにRneasyキット（Qiagen）を用いて浄化されたリ ボゾームリボ核酸間、ラットFRTL-5甲状腺から派生した細胞系は、供与源として 用いられた。リボゾームリボ核酸は、それからRT-PCR方法によって、相補ＤＮＡ （CLONETECH）を生成するために扱われた。これらは、それから鋳型としてPCR反 応間輸送体を拡大するために用いられた。報告するものの分類学的位置#90から 始まった31merが順番に配列するPCR増幅間プライマが、あった‖5』及び3』分類 学的位置#1950でから31mer。これらのプライマを有するPCR増幅が、私が据え付 けるKpnを加えた‖5』端及び私が据え付けるXhoために3』は、遺伝子の中で終わ る。適切な大きさ（1.8kb）のＤＮＡフラグメントが、得られた、Xhoについては 消化される規制変異私及びKpn私及びpREP7 anvitrogen では適切な部位にクローンとして生まれる)。クローンのうちの１つの次の配列 分析は、以前に、発表されたレポートに同一であった配列を現した。 SV40プロモーターコントロール・リンクC.J.、Kolb E、マルドゥーンR.、「事前 のインビトロ効能及び乳ガンの治療間単純ヘルペスthymidneキナーゼ遺伝子系の 毒性研究」、Hybridom'a、1995、14の下のそれが多くのクローン化部位及びネオ ものを含有するLXSNレトロウイルスのバックボーンに、NIS遺伝子は、それから クローンをつくられた』遺伝子：143-147、リンクCJら、「低抗性または再発する 卵巣のガンの処理間系の単純ヘルペス・チミジン遺伝子キナーゼ/ganciclovirを 有する活発な遺伝子治療では位相ｉ試験」、人間の遺伝子Ther、1996、7：1161− 1179。ベクターも、一時変異を複製コンピテント・レトロウィルスの突破を最小 にするために含有する。ミラー、A.D.及びButtimore(C.)「ヘルパーウィルス製 造に至っている遺伝子組換えを避けるレトロウィルス・パッケー遺伝子グ細胞系 の再設計」(Molec)。細胞Biol、6：2895-2902、1986。ベクターは他の場所でか なり記載されていた及び、発明者はインビトロ移植間LXSN及びHS-tk遺伝子及びg anciclovir方法を用いている乳癌細胞の死滅を以前に用いた。リンクC.J.、Kolb E、マルドゥーンR.、「事前のインビトロ効能及び乳ガンの治療間単純ヘルペス ・チミジン遺伝子キナーゼ遺伝子系の毒性研究」、ハイブリドーマ、1995、14：1 43-147。結果として生じるベクターは、LNISNという名前をつけられた。NIS活性 間インビトロ分析。ワイスらによる以前に発表されたプロトコルは、LNISNベク ターへの1251年の取込みがEMT-6乳癌細胞を変換したと決定するために用いられ た。ワイス、S.J.、Philp、N.J.及びGrollman（E.F.）「ラット甲状腺から培養細 胞の連続のラインではヨージド運搬」、内分泌学、114：1090-1098(1984)。手短 に言うと、ヨージド取込みは、キャリア自由な0.345-.345uM NaI125及び5-300μ M Nalの500のu1を加えることによって、始められた。いいえの後、120分インキ ュベーション反応より長く、均衡塩類溶液(HBSS)pH7.3は、氷のように冷たいひ とかせを有する洗っている細胞により終了される。10/0トリトンX-100は加えら れた及び、サンプルはシンチレーションカウンタでは数えられた。このアッセイ を評価するために、我々はFRTL-5ラット甲状腺細胞では最初に1251の取込みを分 析した。これらの結果は、図１ に示されて及び速い及び効果的な125I取込みを示す。対照細胞は、symporter機 能をブロックする氷における培養されて及びその結果1251の取込みを示さない。 直接の比較は、ベクターのない細胞及び以前にLNISNベクターsupernatesについ ては変換されて及びG418では14日間選ばれる細胞の間で実行された。nontransdu cedされた（陰性対照）細胞を有するNIS変換された癌細胞の1251の細胞内のレベ ルの比較は、NIS遺伝子機能の直接証拠を示す。濃縮のこのレベルは、通常の甲 状腺組織では生体内に得られるそれと同等である。さらに、取込みは速く及び支 えられる(私及び2(a-d)と想像すること)。ネガ対照細胞と比較したテスト細胞の 1251の細胞内のレベルの比較は、NIS遺伝子機能の直接証拠を提供する。では結 果としてなられるアフリカツメガエル卵細胞へのNIS ＲＮＡ転写物の直接の射出 を超える、細胞内のヨージド濃縮の30倍の増加。濃縮のこのレベルは、通常の甲 状腺組織では生体内に得られるそれと同等である。 1311まで選択的に癌細胞をradiosensitizeするNIS遺伝子のレトロウイルスのト ランスダクション。LNISNベクターは、インビトロ・クローン原性アッセイ間こ の方法の効能を決定するために1311を有するインキュベーションが続くヒト腫瘍 細胞ラインを変換するために用いられた。手短に言うと、ヨージド取込みは、30 uCi/mlのNaI131及び30uM NaIを加えることによって、始められた。LNISNについ ては細胞にベクター（NIS遺伝子でない）なしで変換される腫瘍細胞の生残率は 、比較された。細胞は、６時間間1311を含有している溶液にさらされた。(図3) 。次に、細胞は消化されて及びそれから菌体数で1.25x102及び1x104細胞の間で プレートにつき４通では各データ・ポイント間板金でおおわれるトリプシンであ った。７の後、10日まで、細胞は固定されて及び汚された。^〜50細胞を含有して いる肉眼で見えるコロニーは、数えられた。生残計測は、コロニー形成効率間訂 正された。結果は、図3-5では示される。対照細胞と比較してこれらの結果は設 計される細胞の選択的な放射線死がNIS遺伝子を表すことを示す。これらの初期 条件で、対照細胞の若干の死滅は起こる、しかし、より大きい死滅効果は細胞を 表すNISでは絶えず観測される。これらの結果は、遺伝子が機能するNISが1251の 取込み実験によって、予測したことを証明する。図から分かるように、死滅はA3 75、BNL.1ME、CT26及びNIS遺伝子（図４及び5）については変換され たIGROV細胞では観測された。 細胞を製造しているベクターを有する活発な遺伝子送達では。レトロウイルスの VPCの卵着床は、最初の方法として腫瘍細胞標的にNIS遺伝子を分配するために用 いられた。腫瘍細胞に効果的に遺伝子を分配するVPCの卵着床は、脳腫瘍モデル ではC6神経膠腫腫瘍を有する齧歯動物にlacZ VPCを差し込むことによって、最初 に示された。染色は、神経膠腫に効果的な遺伝子導入を示した。（短いMPら、「 レトロウィルス・パッケー遺伝子グ細胞系の移植によるラット脳ではグリオーマ 細胞に対する遺伝子送達」、J Neurosci物件、1990、27:427-439）単純ヘルペス 型では抗腫瘍の効果私チミジン遺伝子キナーゼ（Hstk）VPC卵着床が、活発な腫 瘍モデルではいくつかでは評価された。ラット脳では発達する9Lgliosarcomaは 、モデルとして人間のglioblastoma multiforme間用いられた。(「実験的な脳腫 瘍の治療間レトロウイルスのベクター生産者細胞を有する活発な遺伝子導入では」 、ハトKwら科学(1992)、256：1550-1552)。より最近の仕事は、一つにはそれに Hstk VPCによるこの9L腫瘍破壊が免疫系によって、生体内に調停して解決される ことを示唆して及び腫瘍回帰間医薬品選抜を必要としない。(Tapscott SJら、「 選択可能な遺伝子を有するトランスダクションによるラット9L gliosarcoma腫瘍 の遺伝子治療は、医薬品選抜を必要としない」、ProcNatl Acad Sci USA 1994、9 1：8185-8189)。他の基はラット脳腫瘍モデルでは、抗腫瘍の効能も示した。そ して、複製コンピテント・ヘルパーウィルスの添加については以外、C6グリオー マ細胞の卵着床を用いる。(Takamiya Yら(『悪意のある脳腫瘍間レトロウィルス 遺伝子治療の^〜An実験的なモデル)」、J Neurosurg、1993、79：104-110)。Hstk 系の抗腫瘍の効能間証明は、また、結腸直腸の転移のラット・モデルでは、肝臓 に示された。（カルーソーMら「自己不活化遺伝子のsituトランスダクションで は以後の確立したmacroscoprc肝臓転移の回帰」、Proc Natl Acad Sci（USA）199 3、90:7024-7028）このモデルでは、BDIXラットがsyngeneicな大腸癌腫細胞系を 有する肝臓莢膜の下に吹き込まれたこと。GCV処理の終わりの検死で、ほぼ、Qne が第３に禽獣の中で病理学上自由な腫瘍であったことが分かった。以下の２つの 実験は、VPC卵着床の実行可能性を示す。 MC38腹膜内の結腸の腺癌に対するLTKOSN VPCの抗腫瘍の効能。C57B1/6つのハ ツカネズミが、MC38結腸の腺癌の腹膜内の植菌については吹き込まれた‖（親切 に、S.ローゼンバーグ（NCI）により提供される)。実験は、臨床試験（表1）間 最も効果的なLTKOSNクローンを決定する試みでは実行された。ベクターLTKOSNは 、遺伝子が内部SV40早い（シミアンウィルス４０）プロモーター（LTR-HStk-SV- neo'-LTR）から、LXSNバックボーンでは写したウイルス性末端反復配列(LTR)か ら写されるHstk遺伝子及びバクテリアのネオマイシン耐性（neo'）を含有する。 2x104 MC38腫瘍細胞の受け取られる射出がｉmlハンクでは懸濁した禽獣は、日１ における腹膜の腔への均衡塩類溶液（HBSS）である。日６における、アニマルは ｉml HBSSでは懸濁される処理細胞を受信した。５日後に、禽獣はGCVの14本の日 コースについては扱われた。全ての円錐体は、腫瘍については単独で吹き込まれ る禽獣と比較して活性のある程度を示した。LTKOSN.2（クローン2）は、しかし クローン9、10または12より良い活性を示した。毒性の証明は、生き残っている 禽獣では観測されなかった。実験の間に死んだ禽獣は、進歩的な腹膜内の癌腫症 によって、生じる死亡を有した。この実験は、GCV処理が続くLTKOSN.2 VPCの射 出を有する腹膜内の腺癌を扱う効能を確立する。 表１ ・ 腹膜内のMC38結腸のADENOCARC1NOMA基におけるLTKOSN VPCクローンの効能 ・ 腹膜内の腺癌のMC38へのLTKOSN.2 VPCの活発なトランスダクション効率では評価 。C57B1/6つのハツカネズミは、1ml HBSS IP（日1）では懸濁される38の結腸の2 x104mc腺癌細胞の腹膜内の植菌については吹き込まれた。日７における、アニマ ルは1ml HBSSでは懸濁される1x107 LTKOSN.2 VPC細胞を受信した。日27 における、ハツカネズミは犠牲にされた。腫瘍は、消化されて及びRPMI+を有す る培養ではペニシリン、ストレプトマイシン及びfungizoneに10% FBを出した。 培養では回復される細胞は、MC38形態の中であった。VPCは、これらのハツカネ ズミでは14日以後検出されなかった。２日後に、細胞はクローン原性アッセイで は生体内にLTKOSN.2ベクターにより変換されたMC 38の細胞のパーセンテージを 決定するために用いられた。LTKOSN/扱われた2VPCハツカネズミからMC38のuv細 胞（陰性対照）及びMC 38の細胞は、三つ組の一つでは組織培養ざらでは選ばれ た密度で種をまかれた。その翌日、1mg/ml G418は、各セットでは６つの皿のう ちの３つに加えられた。９日後に、細胞はメタノール：酢酸を据えられて及びク リスタルバイオレットで汚された。３つの別々のクローン原性アッセイは、２つ の禽獣（表2）から、準備された。50を超える細胞を有する全てのコロニーは数 えられた及び、比率は計算された：O/o抵抗する=G418抵抗するコロニー/医薬品 が不在で全体のコロニー。これらの結果は、活発なトランスダクションではLTK) SN.2VPCによって、デモをする。但し、これらの細胞の47%だけが、そうである、 自由な（表１及び2）禽獣残り腫瘍の50%、変換する。これらの実験は、効果的な 腹膜内の遺伝子送達間この方法のユーティリティを決める。 表２ ADENOCARCINOMAが分析する腹膜内のMC 38への活発なLTKOSN.2 VPCトランスダク ション振動数では コントロール：媒介生物LTKOSN.2 VPCは、コロニー形成効率G418抵抗するコロニ ー・コロニー形成効率G418抵抗するコロニーMeaniS.Dを扱わなかった。 実施例２ ・ 単純ヘルペス・ウイルス性ベクターを有する抗腫瘍の治療。HSV-basedされたベ クターの２つの幅広いカテゴリのうちの１つは、アンプリコンである。（Spaete RRら、「単純ヘルペスウィルス・アンプリコン:新しいeucaryoticな欠陥ウィルス ・クローン化-拡大しているベクター」、細胞、1982、30：295-304）HSV-1 lytic な複製起点（ori S）及びシグナル配列を包装しているHSV-1終末を有するプラス ミドが、拡大されることができて及び伝染性のHSV-1ウィリオンにヘルパーウィ ルスの面前で包装されることができる。(Spaete RRら、「単純ヘルペスウィルス ・アンプリコン:ベクターを拡大している新しいeucaryotrc欠陥ウィルス・クロ ーン化」、細胞、1982、30:295-304、Kwong ADら、「単純ヘルペスウィルス・ア ンプリコン：成熟核DNAの塩基配列を含有している造られた不完全なゲノムの複 製における大きさの効果」J Virol(1984)、51：595-603、ゲラーAIら、「不完全 なHSV-1ベクターは、洗練された周囲のニューロンでは大腸菌β-ガラクトシダー ゼを表す」、科学、1988、241：1667-1669、ゲラーAIら、「大腸菌β-ガラクトシ ダーゼの安定した形質発現では不完全な単純ヘルペスウィルス１つのベクター結 果を有する洗練された中枢神経系ノイロンの感染」、Proc Natl Acad Sci USA 19 90、87：1149-1153)。このプラスミド系は、より簡単なクローン化ができるよう にして及びprokaryotic及び真核細胞の間でシャトルベクトルとしてgenomicな情 報を運ぶ。(Kwong ADら(「単純ヘルペスウィルス・アンプリコン)。欠陥ウィルス ・ゲノム内で拡大される空想的なニワトリ・オバルブミン・遺伝子−−−の効果 的な形質発現」ウィルス学(1985)、142:421-425)。アンプリコン系はHSV-1ベクタ ーの長所を保持する、しかし、ウイルス性株はより低いタイターを有する傾向が ある及び、製造は時間がかかる。(Spaete RRら、「単純ヘルペスウィルス・アン プリコン：新しいeucaryoticな欠陥ウィルス・クローン化-拡大しているベクタ ー」、細胞、1982、30：295-304)。以前に報告されたアンプリコン系は、能率的 に包装して及び大きい大きさＤＮＡフラグメント（>15kb）を維持することがで きなかった。(Kwong ADら、「単純ヘルペスウィルス・アンプリコン：成熟 核DNAの塩基配列を含有している造られた不完全なゲノムの複製における大きさ の効果」、J Virol、1984、51：595-603)。HsVベクターは、生体内に効果的な遺 伝子導入を示した。(Palella TDら、「私が一定方向に向ける組換え型単純ヘルペ ス型に感染するハツカネズミの脳味噌では人間のHPRTメッセンジャーＲＮＡの形 質発現」、遺伝子、1989、80：137-144、Chiocca EAら、「単純ヘルペスウィルス ・ミュータントによるラット脳ニューロンではlacZ遺伝子の移植及び形質発現」 、新しいBiol 1990、2:739-7.46、アンダーソンJKら、「ヘルペスウィルスベクタ ーを用いている哺乳動物中枢神経系への遺伝子導入：ニューロン特異的エノラー ゼプロモーターを用いているニューロンではバクテリアのlacZ遺伝子の拡張形質 発現」、人間の遺伝子Ther、1992、3：487-499、Ho Dら、「グルコース輸送物質遺 伝子を表している不完全な単純ヘルペスウィルスベクターを有する中枢神経系生 理学を変えること」、Proc Natl Acad Sci USA 1993、90：3655-3659、MJら、「チ ロシン水酸化酵素を表しているHSVベクターによるParkinsonianラットでは長期 の行動の回収」、科学、1994の間、266：1399-1403、Glorioso JCら、「人間の遺 伝子治療間単純ヘルペスウィルスベクターの現像及び適用法」、Annu聖職者Micro biol 1995、49：675-710)。いくつかの基は、制癌性の治療学としてHSVベクトル を開発している。変性HSVウィルス及びベクターの細胞変性効果は、優れた効果 に腫瘍細胞に対して用いられることが可能である。Martuza及びcoworkersが、人 間の神経膠腫m裸のmrceを扱うために最初にチミジン遺伝子キナーゼ否定の(Hstk )HSVを用いた‖(Martuza RLら「genetrcallyなengmeeredされたウィルス・ミュー タントによって、人間の神経膠腫の実験的な治療」、科学、1991、252：854-856) 。105pfuの欠陥ウィルスについてだけは扱われる若干のハツカネズミは、生残を 引き伸ばした。これらの最初の変性HSVベクターは、複製コンピテントであった 。感染（特にウイルス性脳炎）に対する関心のため、他の基はリボヌクレオチド レダクターゼ転写因子ICP4またはICPOのような他の遺伝子では、不完全なHSVベ クトル（γ134.5遺伝子）を開発した。(Boviatsis EJら、「ラット脳腫瘍への抗 腫瘍活性及びリポータ遺伝子導入は、不完全な単純ヘルペスウィルスベクターに ついてはチミジン遺伝子キナーゼまたはリボヌクレオチドレダクターゼでは接種 した」、遺伝子Ther、1994、1：323-331、Takamiya Y ら、「悪意のある脳腫瘍の遺伝子治療：単純ヘルペス・ウイルス１型-チミジン遺 伝子キナーゼ遺伝子及び野生型レトロウィルスを運んでいるラット神経膠腫ライ ンは、他の腫瘍細胞を殺す」、J Neurosci物件、1992、33：493-503、Mineta Tら 、「ganciclovir-hypersensitiveな、リボヌクレオチドレダクターゼが欠けてい る単純ヘルペス・ウイルス性ミュータントを用いている悪性腫瘍神経膠腫の処理」 、イチョウガニ科物件、1994、54：3963-3966、眼房Rら、「人間の悪意のある神 経膠腫のscidハツカネズミ・モデルでは脳腫瘍の治療間遺伝子工学による単純ヘ ルペスウィルスの比較」、Proc Natl Acad Sci USA、1995、92：1411-1415)。GCV 処理の手つかずのHstk遺伝子を含有している不完全なHSVへもの追加は、腫瘍死 滅を強化する。(Boviatsis EJら、「手つかずのチミジン遺伝子キナーゼ遺伝子を 保持するganciclovirについては扱われる脳腫瘍及び単純ヘルペス活力ベクター を収容しているラットの長期の生残」、イチョウガニ科物件、1994、54：5745-57 51)。最近、効果は多数の特定の遺伝子欠失を有するHSVミュータントにおける、 それらの治療係数を強化するために焦点に集まった。(Glorioso JCら「人間の遺 伝子治療間単純ヘルペスウィルスベクターの現像及び適用法」(Annu聖職者Micro biol 1995)、49:675-710、Mineta Tらが、「悪性腫瘍神経膠腫の処理間多くの変 化する単純ヘルペスvirus-1を減らした」ナットMed 1995、1：938-943)。これら のデータは、我々のHSVアンプリコンベクターが生体内にNIS遺伝子を腫瘍に変形 させるために役に立つことを示唆する。 pHE700単純ヘルペス・アンプリコンベクターを有する遺伝子送達。HSV-1 lytic な複製起点（ori S）を含有しているプラスミド及びシグナル配列を包装してい るHSV-1終末は、拡大されることができて及び伝染性のHSV-1ウィリオンにヘルパ ーウィルスを処理することの面前で包装されることができる。(Spaete RRら「単 純ヘルペスウィルス・アンプリコン：新しいeucaryoticな欠陥ウイルス・クロー ン化-拡大しているベクター」、細胞、1982、30：295-304、Kwong ADら、「単純ヘ ルペスウィルス・アンプリコン：成熟核DNAの塩基配列を含有している造られた 不完全なゲノムの複製における大きさの効果」、J Virol、1984、51：595-603、 ゲラーAIら、「不完全なHSV-1ベクターは、洗練された周囲のニューロンでは大腸 菌β‐ガラクトシダーゼを表す」、科学、1988、241：1667-1669、 ゲラーAIら、「私が一定方向に向ける不完全な単純ヘルペスウィルスを有する洗 練された中枢神経系ノイロンの感染は、大腸菌β‐ガラクトシダーゼの安定した 形質発現では結果としてなる」、Proc Natl Acad Sci USA 1990、87：1149-1153) 。我々の新規なアンプリコンベクター（pHE）は、ベクター複製及びパッケー遺 伝子グがHSV-1ウィリオンにできるようにするHSV-1 ori S及びパッケー遺伝子グ 配列を含有する。我々は、また、ＥＢウィルス（EBV）配列をエピソームとして トランスフェクション細胞細胞核ではプラスミドを維持するために含有するHSV アンプリコンを造った。(WestphalなEmら、「人間の癌細胞への高効率遺伝子導入 間新規な感染力をもつmini-HSV」、ガン遺伝子Ther、1995、2:324)。EBVが、固有 の潜在性複製起点を含有するために示された‖(ori。ウイルス性自己複製を導く P)及び溶菌サイクルを入れることのない細胞では維持。(Yates JLら、「多様な哺 乳動物細胞ではＥＢウィルスに由来するプラスミドの安定した複製」、天性、198 5、313：812-815、ReismanのDら、「ＥＢウィルスに由来するプラスミドの推定の 複製開始点は、２つのcis-actingしている成分から成る」、モル細胞Biol 1985 5 1822 1882)。ＥＢウィルス核抗原1（EBNA-1）が、ori P.間transactivatorを縛 っているデオキシリボ核酸をコード化する‖(Yates JLら、「多様な哺乳動物細 胞ではＥＢウィルスに由来するプラスミドの安定した複製」天性1985の313812の 815のReismanのDら「ＥＢウィルスに由来するプラスミドの推定の複製開始点は、 2つのcis-actingしている成分から成る」モル細胞Brol、1985、5：1822-1832、ロ ーリンズ博士ら、「ヘルペスウィルス・デオキシリボ核酸を有する細胞の核のフ ィブリノゲン及びＥＢウィルス核抗原の配列に特有の相互作用」、癌細胞、1986 、4:525-542、ゴールドスミスKら(「EBNA1アミノ酸配列の確認は、ＤＮＡ合成の ＥＢウィルス潜在性オリ遺伝子の官能性元素の相互作用間要求した」J Virol 199 3)、67：3418-3426)。研究者は、ori Pを含有していて及びEBNA-1遺伝子を表し ているプラスミドベクトルがより効果的な成熟核発現ベクトルであることを以前 に証明した。(Yates JLら「多様な哺乳動物細胞ではEpstem-Barrウィルスに由来 するプラスミドの安定した複製」天性1985313812 815)。多様な基は、形質発現 間治療の意志を有する人間の腫瘍ではこの種のEBNA-1ベースのベクターを用いた 。(Judde JGら、「EBV-associatedされた新形 成の目標とされた治療ではＥＢウィルス核兵器antigen-1の用途」、人間の遺伝子 Ther、1996、7：647-653)。EBV配列を有するHSVアンプリコンの化合は、HSVアン プリコン系の使いやすさを改善する。我々の複製不適格者pHEベクターは、高いe ifficiencyを有する分かれている及び静止した細胞に、transgene(s)を分配する こと間試験管内の及び生体内に広い屈性を保つ。この改良されたベクターが、21 kbデオキシリボ核酸挿入物を有するベクトルを高力価で生じてもよくて及びパッ ケージしてもよくて及び運ぶ。 Episomalな維持及びアンプリコンベクターパッケー遺伝子グ。エピソームとして のpHEベクターの維持は、E5細胞へのpHE700-lac及びハイグロマイシンを有する 選抜のトランスフェクションにより示された。pHE700-lacベクターは、pHE700( 図6)の多くのクローン化部位にクローンをつくられるバクテリアのLacZ遺伝子を 含有する。医薬品選抜の日16までに、ほとんどすべての細胞は、β‐ガラクトシ ダーゼを表した。ウイルス性株を生成するために、pHE700-lacプラスミドを含有 しているこれらの選ばれたE5細胞がd120ヘルパーウィルスに感染して(親切に、N ．DeLuca（ピッツバーグ大学）により提供される)。結果として生じる上澄は、p HE700-Iacベクター及びヘルパーウィルスを含有する。加えられるヘルパーウィ ルスの感染の多重性（モイ）は、0.01の間に0.1まで24-36時間以内にウィルスの ベクター製造を誘導するためにあった。得られる平均のタイターは、1:10のd120 ヘルパーウィルス（pfu）に対するpHE700-lacベクター（bfu）の比率を有する2x 106bfu/mlであった。 pHE700-lacベクターインビトロのトランスダクション及び形質発現。上澄を含有 しているpHE700-lacは、人間の的状赤血球インビトロを変換するために用いられ た。β‐ガラクトシダーゼ遺伝子形質発現はpHE700-lacベクター（3-10モイ）を 有する感染の後、多様な洗練されたヒト細胞では評価された。そして、VA13通常 の繊維芽細胞がある。全ての細胞は、固定されて及び感染の後、X-galな2つの日 で汚された。形質発現は、48-72時間トランスダクションの後、起こっているピ ークの形質発現を有するほぼ２週間続いた。 ラット及びハツカネズミではpHE700-lacベクターの活発な形質発現では。中枢神 経系への遺伝子送達間pHE700-lacベクターの効率は、評価された。T・heラッ ト尾状核または海馬は、pHE700-lacウイルス性ベクター上澄については吹き込ま れた。ウイルス性株（2×105bfu）は、一方的にstereotaxicallyにラット脳に噴 射された。高いβ‐ガラクトシダーゼ形質発現が、射出部位のまわりで分かった ‖尾を有する及び、X-galな染色によって、定まるhippocampalな射出に続いてい る有歯の回では、48時間は、射出を掲示する。これらの脳領域では遺伝子形質発 現は、射出の後の２つの及び14の日の間で検出されて及び２の間で７日まで最も 目立っていた。我々は、また、皮下のA375人間のメラノーマ異種移植片に、athy micなヌードマウス（示されないデータ）では、アンプリコンベクターの効果的 な遺伝子導入を示した。 HSVアンプリコンベクター細胞毒性。d120HSVヘルパーウィルスが、このHSVアン プリコンベクターを包装するのに必要である‖(DeLuca NAら、「immediate-early に調節タンパク質ICP4をコード化している遺伝子では単純ヘルペス・ウイルスＩ 型の欠失突然変異体の単離及び性格付け」、J Vrrol、1985、56:558-570、DeLuca NAら、「ナンセンス・ペプチドを特定している単純ヘルペスウィルス型1(HSV-1) ICP4遺伝子の活性」、核酸物件1987、15:4491-4511)。ヘルパーウィルスd120が、 正常細胞ではウイルス性複製を防ぐ両方のIE3遺伝子座の欠失を有するが、IE3遺 伝子を表すE5ヘルパー細胞系では、複製ができるようにする‖(DeLuca NAら、「i mmediate-earlyに調節タンパク質ICP4をコード化している遺伝子では単純ヘルペ ス・ウイルスＩ型の欠失突然変異体の単離及び性格付け」、J Virol、1985、56:5 58-570、DeLuca NAら「ヘルペスsnnple xvrrus型1(HSV1のActivitles)ICP4ナン センス・ペプチドを特定していしていること」(核酸物件1987)、15:4491-4511) 。このヘルパーウィルスによって、感染する正常細胞インビトロ（示されないデ ータ）に、相当な細胞毒性が生じる。あいにく、現在HSVアンプリコンベクター をヘルパーウィルスから切り離して及びまだ高いアンプリコン・タイターを維持 するために利用できる発表された方法が、ない。このcyiotoxicity関心のため、 我々はpsoralen及びuvA光顕（PUVA）をHSVベクターの細胞毒性を減らすが、高水 準遺伝子形質発現（図7）を保持するために用いる：P新規な方法を開発した。Ps oralensに、形成する多環式平面状分子が、共有原子価である、シクロブタン型 リンケージ（ハンソンCVら(「デオキシリボ 核酸の写真薬品失活及びpsoralen denvativesによるＲＮＡウィルス」)。Ｊジェ ンVirol(1978)、40：345-358)。完全にpsoralen及びUVAを有する方法をクロスリ ンクすることを加えている前の研究は、ウィルスを機能させないためにＤＮＡ合 成及びウイルス性遺伝子形質発現をブロックすることによって、ウィルスを機能 させなかった。（ハンソンCV、「psoralensを有するウィルスの写真薬品失活： 概要」(血液細胞1992)、18：7-25、Redfield DCら「風邪のPsoralen失活及びウ ィルス-感染細胞の単純ヘルペスウィルス」が、Immunに感染させる‖198132 121 6 1226 Swanstrom Rら、「ラウス肉腫ウィルスのリボゾームリボ核酸ゲノムを有 するpsoralen denvatrvesの相互作用」ウィルス学、1981、113:613-622、HJら、「 Ｂ型肝炎及び非A、非Ｂウィルスを含有している血液成分の写真薬品汚染除去」 、ランセット1988を変える、2：1446-1450、リンLら「血小板濃縮物では細胞提携 のヒト免疫不全ウイルスのPhotochemcalなmactivation」、血液、1993、82：292- 297、Cotten Mら、「ウィルス・カプシッドのendosomolyiicな活性を維持すると 共に、アデノウィルス粒子のPsoralen処理はウイルス複製及び転写を除去する」 、ウィルス学、1994、205：254-261)。我々の実験では、ウイルス性複製及びtra nsgene形質発現の差失活では結果としてなるベクターでは、適切なPUVA供与量は 、デオキシリボ核酸架橋を誘導する。リポータ・遺伝子生成物の遺伝子形質発現 を保持すると共に、従来のPUVA処理はE5ヘルパー細胞ではウイルス性複製を抑制 する。 IHSVアンプリコンベクターの細胞毒性の選択的な脱離を評価するために、transg ene活性を維持すると共に、細胞のＤＮＡ合成を計った細胞増殖アッセイは前述 したように、用いられた。(リンク、CJ、ら、「事前のインビトロ効能及び乳ガン の治療間単純ヘルペス・チミジン遺伝子キナーゼ遺伝子系の毒性研究」、ハイブ リドーマ、1995、14：143-147)。pHE-tkベクターは、pHEベクター多くのクロー ン化部位に、CMVプロモーターコントロール（図6）の下に、Hstk遺伝子を挿入す ることによって、発生した。細胞死を誘導する中毒性形式に、Hstkを表す細胞は 、ganciclovir（GCV）をphosphorylateすることができる。(Moolten(FL)、「相談 される腫瘍化学感受性は、ヘルペスチミジン遺伝子キナーゼ遺伝子を挿入した： 未来のガン・コントロール戦略間方法」、イチョウガニ科物件、1986、 46：5276-5281)。卵巣のカルシノーマ細胞がヘルパーウィルスd120についてはパ ッケージされるpHE-tkベクトルについては、変換したIGROVについては、テスト は実行された。非処理のpHE-tkベクター株は、かなり感染細胞におけるヘルパー ウィルス及びpHE-tkベクターの細胞毒性を示している細胞の増殖を減らした。( 図8)。しかし、実質的にPUVA扱われたベクターに感染する細胞は、それらの増殖 速度（図8）を維持した。さらに重要なことには、PUVAから細胞毒性がベクター がベクターにさらされない細胞のそれの近くで、引き下げられたpHE-tkを扱うと 共に、我々はベクターが官能性transgene形質発現を保持することが分かった。 変性ベクターから小さい抑制する効果だけが分かった条件の下に、Govは細胞の 増殖を減らした。PUVA扱われたベクターにより変換される細胞におけるGCVのこ の抗増殖効果は、Hstk酵素機能（図』'88）を示す。したがって、PUVA処理は、 ベクター調停して解決された細胞毒性を防ぐが、Hstk遺伝子形質発現ができるよ うにした。我々の結果は、TMP及びUVA照射の化合がHSVベクターの差動の失活で は結果としてなることを証明する。我々は、interstrandデオキシリボ核酸架橋 がウイルス性ＤＮＡ合成をブロックして及びランダムにベクターゲノムの異なる 領域を機能させないと仮定する。架橋の近くに位置する遺伝子はたぶん機能させ なくされる、しかし、遺伝子形質発現は転写によって、異なる機能させなくされ た領域を有する他のベクターからまたは他の転写単位からアンプリコンベクター （図7）でを、補足できる。したがって、いかなる一つのベクターもの複製を禁 止すると共に、クロスリンクされたデオキシリボ核酸は測定できるtransgene形 質発現を保持する。したがって、写真薬品一時変異は、組換え型野生株ウイルス のレスキューのために両方ともビトロではまたは中で活発に起こるかもしれない いかなるlyticなウイルス性複製も防がなければならない。これらのPUVA扱われ たベクターは、NIS遺伝子のような治療の遺伝子を用いている活発な抗腫瘍の戦 略では間理想的な候補者である。 例３ 試験管内のOVARIAN癌細胞及び131I放射線療法による増加する細胞破壊に対す るレトロウイルスの及びヘルペスVIRAL媒介生物遺伝子導入のデモンストレーシ ョン。 NIS遺伝子を腫瘍回転楕円体に変形させるレトロウイルスのベクタートランスダ クションのインビトロ効能。我々の最初のデータは、1311年までにNISでは誘導 される重大な死滅がメラノーマ及び卵巣の癌細胞を変換することを示した。しか し、効果を殺しているより偉大な傍観者が感謝されることができる条件の下に、 これらの結果は、よりよく調査されてもよい。この目的間、我々は軟寒天では発 達する回転楕円体腫瘍を用いる：p。(Courtenay VDら、「2つの軟寒天テクニック を用いている生検からヒト腫瘍細胞コロニーの成長」、Br J イチョウガニ科、19 78、38：77-81、Tveit KMら、「Courtenay軟寒天アッセイでは人間の卵巣の癌腫 のコロニー形成能」、制癌性の物件、1989、9：1577-1582)。この系では質量がそ うする腫瘍の増加する半径が、すぐ近くの細胞に方法類似したではそれに活発な 腫瘍菌体量ではエネルギーのより大きい全体的な沈着を許す。供与量から1311が 菌体密度、半径及びβエネルギーの止まっている仕事率によって、1311年の壊変 から影響を受けることを蓄積する。画分『方程式が、内面化された供与量の中で （負けたこと）細胞から送信される蓄積されたヨージドから、以下に単純化され てあることができる：画分＝e-ユトを送信した。ここで細胞半径mがメーターで 測るkg/m3（約1.3×103kg/m3）及びt=ではβエネルギー（3.009のm2/kg）×菌体 密度間仕事率を止めているｕ=‖(Troulfanidis N(1995の)「照射の計測及び検出 」(vol第２の版)。テイラー及びフランシス(ワシントン)D.C.、（1992の）保健 物理学及び放射線学のハンドブック。では：Schleien B(Ed)。Scinta社、銀水源 、MD)。半径の小さい変化は、指数的に吸収線量に影響を及ぼす。例えば、8.0の um半径を有する丸い細胞が、エネルギー（理論的な極量）のうちの3.1010だけを 吸収する‖から580のum半径を有する菌体量が可能な供与量の900/0以上を吸収す ると共に、1311を内面化する。この類縁は、図９によって、詳細に説明される。 したがって、細胞集塊がかなりより高い供与量を受信する小さいtumor-likeが、 1311を蓄積した‖単層では細胞に。このモデル系は、より密接に生体内の腫瘍の 幾何を模倣して及びしたがって、卵巣のガンのための遺伝子目指す放射線療法間 、より正確にNISの効能を示さなければならない。 我々は、確立したプロトコルを軟寒天では我々の腫瘍細胞系（NISを有する及び なしで）の細胞小集塊を発達させるために用いる：P。(Courtenay VDら(「2つの 軟寒天テクニックを用いている生検からヒト腫瘍細胞コロニーの成長」)。Br Jイ チョウガニ科(1978)、38:77-81 Tveit KMら「人間の卵巣の癌腫の能力をCourten ay軟寒天アッセイでは形成しているコロニー」制癌性の物件(1989)、9：1577−1 582)。0.5から4mmへの個体「回転楕円体」は、以前に単層細胞間記載されている 類似した条件の下に、直径1311にさらされる。効能は、曝露の後、回転楕円体成 長を計ることにより決定される。傍観者効果は、変換されるNIS及びベクター細 胞でない多様なパーセンテージを含有している混ぜられた個体群回転楕円体を用 いて査定される。プロジェクトでは次の段は、培養では官能性NIS遺伝子を腫瘍 回転楕円体へ移すためにIHSVアンプリコンベクターをテストすることになってい る。 緑の蛍光性のタンパク及びNIS遺伝子を含有しているHSVベクターのクローンをつ くる。いかなる遺伝子治療戦略も評価して及び開発することの重要な一部は、正 確に遺伝子転写効率を計ることになっている。このデータが、レベルを決定する ために重要である‖『ベクターの中で、トランスダクションは生体内にtransgen eの治療のレベルを得ることを要求した。HSVの系がそれを一定方向に向ける瞬間 、wmがクローンをつくられた意志である‖G418医薬品選択可能なマーカー（neor ）を含有しない。我々のベクターは、緑の蛍光性のタンパク（GFP）の変法を表 す。このコードン変性GFP遺伝子も、セリン65をＴ突然変異に大いにfiuorophore 活性を強化するために含有する。(Chalfie Mら、「遺伝子形質発現間マーカーと しての緑の蛍光性のタンパク」、科学、1994、263：802-800Heim Rら「改良された 緑の蛍光」、天性、1995、373:663-664)。我々が、細胞にいかなる定着テクニッ クも必要とすることなくレトロウイルスの遺伝子送達を示すために最近コードン 最適化された、赤色の移されたミュータントGFP遺伝子の用途を示した‖(マルド ゥーンRRら、「humamzedされた赤色のシフトされた緑の蛍光性のタンパク質遺伝 子を用いているレトロウイルスの調停して解決された移植の追跡及び計量」、バ イオ・テクニック、1997、22：162-167、JPら、「ヒト腫瘍細胞への人間らしくな られた赤色のシフトされた緑の蛍光性のタンパクのレトロウ イルスの移植及び形質発現」、天性Biotechnol、1996を徴集する、14：610-614) 。単一コピー遺伝子形質発現は、腫瘍細胞では24時間以内に蛍光顕微鏡の下のレ トロウイルスのsupernatesに対する曝露の後、またはセットされる標準のFITC濾 過器を用いているFAC分析によって、視覚化される。このマーカーは、生活組織 の直接の目視観測または凍結切片（定着を必要としない）によって、インビトロ の及び活発な遺伝子導入の検出を許す。マーカーは、遺伝子導入を個々の細胞基 礎における観測させられる。優秀なGFP遺伝子形質発現及び翻訳腫瘍細胞（pHE70 0ベクターにより変換される）を送ることでは見える。最近、新しいHSVアンプリ コンベクターが、造られた‖(pHE850)、赤を含有する‖-移す、最適化されたGFP 遺伝子及び別々のmulticloningが据え付ける（図10）コードン。この新しいベク ターはNIS遺伝子の移植間腫瘍細胞に用いられる、それもNIS遺伝子転写解読枠が そうするpHE8NISアンプリコンベクターに、NIS遺伝子のGFP共発現クローン化を 観測することによって、遺伝子転写効率の速い決定ができるようにした時から、 pHE850ベクターバックボーン（図10）の多くのクローン化部位にクローンをつく られる。このベクターは、下調べ成熟核発現プラスミドから直接のサブクローニ ングを考慮に入れる大きいmulticloningしている部位を含有する。NIS遺伝子が 、Kpnが側面に並んでいるpREP7に以前にsubclonedされた‖私が据え付ける及び これらがそうする私及びXhoが、サブクローンにpHE850の多くのクローン化部位 に用いられる。アンプリコンは、d120（不完全なIE3遺伝子）ヘルパーウィルス のtrans-complementationができるようにするIE3遺伝子を含有しているE5細胞で は、ローリングサークル複製を経る。ヘルパーウィルスの面前で、アンプリコン がウイルス性までkbが長く獲得する152のデオキシリボ核酸の写しを作ること、 そうすると、包装される。したがって、ほぼ14.6kbのpHE8NISプラスミド間、少 なくとも10の形質発現カセットは、タンデムリピートとして結果として生じるウ イルス性ベクターでは存在する。これは、目標とされた癌細胞ではNIS遺伝子形 質発現の強いレベルを提供しなければならない。 pHE8NISウイルス性ベクター製造。閉pHE8NISプラスミドは、製造につきLipofect ionを有する複製寛大なIE3遺伝子がプロトコル（GibcoBRL）であることを表して いるE5細胞にtransfectedされる。ある日後で、トランスフェクショ ン細胞はヒグロマイシンＢ（ICN生医学的な会社、オーロラ、オハイオ）を有す る選抜に置かれる。ハイグロマイシン抵抗するコロニーは、消化されるトリプシ ン及び皿の上へ板金でおおわれる細胞である。安定した選抜の後、２週間ハイグ ロマイシンでは、トランスフェクション細胞の個体群は、GFP形質発現間調べら れる。蛍光間ポジティブであるならば、細胞はそれからdl20ヘルパーウィルスに ついては変換される。ベクター株を生み出すために、pHE8NISを含有している３ つの×106のハイグロマイシン耐性細胞は、10cmの皿における板金でおおわれる 。細胞が合流に届くまで成長したあと、1mlのOpti-MEM、Gibco、BRLではd120ウ ィルスの0.1人のモイに対する0.01は２時間間37'Cで感染を許すために加えられ る。ウィルス溶液が、それから除去する及び新しい媒体である‖加える追加の24 36時間に。48-72時間以後、細胞はlysedされる。デブリを除去する遠心の後、得 られるSupernatesは、緑の形成性ユニット（gfu/ml）間、supernateなベクター タイターを定義するためにテストされる。 pHE8NlSベクターsupernatesのPUVA処理。PUVA処理間、多様な濃縮(5つのμg/ml に対する0)ではTMP、トリオキサレン、シグマが30のマイニュート間UVA曝露の異 なっている長さを有する37(Cでウィルス株に加えられること(0-7.5kJ/m2)。UVA 供与源は、SpectrolineモデルXX-15A球根、ウェストベリー、ニューヨークであ る。1mlのウイルス性株は、１によく6-wellプレートの中で置かれて及び多様な 回（=0.5の１分kJ/m2@365nm）間照らされる。ウイルス複製能力は、寛大なE5細 胞をクリスタルバイオレットで汚すことによるインキュベーションの後の正確に 計った３つの日である。GFPは、蛍光顕微鏡法によって、視覚化される。 pHE8NISベクターを有するインビトロ効率及び効能。実験的な設計は、類似した 傾向では例ではここで以前に示されるそれに使用される。pHE8NISベクターの10 人のモイに対する３は、遺伝子導入及び形質発現を達成するために加えられる。 GFP形質発現は、生細胞の蛍光顕微鏡検査法によって、培養では6、12、18、24及 び36時間に、トランスダクションの後、観測される。GFP陽性細胞及びGFPネガ細 胞の数は、高い電力を供給された分野につきモイ間トランスダクション効率が用 いたベクターを計算するために録音される。以前に、最適のモイを用いて 示されるように、GFP分析により現されるように、1251年の取込みは決定される 。テストの完成の後、腫瘍細胞クローン原性アッセイでは1251年の取込み及び13 11を有する死滅間、研究は回転楕円体腫瘍については軟寒天ではレトロウイルス のベクター効能実験間開発される条件の下に実施される。 例４ RV媒介生物を移すためにVPCを用いる活発な遺伝子導入では評価 間生体内である禽獣をテストすることは、最初に甲状腺を除去する1311（0.2mCi ）年の投与された低い量であって及びそれからSynthroid補足における上記した ように置かれる。(春日Yほか（「甲状腺機能におけるヌードマウスでは放射性が ある沃素により誘発された甲状腺切除に続いている人間の甲状腺組織の動物臓器 移植の効果」）は、ClinにMed（1991）に投資する、14:277-281)。標準化された レトロウイルスの株は、PA3l7パッケー遺伝子グ細胞では前述したように、発生 する。(リンク、CJ、ら、「事前のインビトロefflcacy及び乳ガンの治療間単純ヘ ルペス・チミジン遺伝子キナーゼ遺伝子系の毒性研究」ハイブリドーマ1995、14： 143-147)。ベクターは最初に細胞を包装しているGP+E86自己指向性に一時的にtr ansfectedされる、そうすると、結果として生じるsupernatesは対数期では成長 しているPA317細胞を変換するために用いられる。細胞は限界希釈によって、ク ローンをつくられる及び、20のクローンは活性間titeredされる。最も高いタイ ターLNISN VPCのいくつかは、大規模に発達して及び活発なテストでは間用いら れる。 1311を有する反応間pretransducedされた腫瘍モデルの効能をテストする。0.3mC iの計画的な1311の処理供与量が効果的であると保証するために、最初の小さい 実験は、1311については実施される。SK-OV-3腫瘍細胞はLNISNベクターについて は変換される及び、安定したtransgene形質発現を有する個体クローンは得られ る。Athymicなヌードマウス(nu/nu)は、皮下に前の腹壁に10x106 SK-OV-3腫瘍細 胞を注射される。この菌体数は、固体の3-4mm腫瘍質量では、5-7日（shQwnでな いデータ）以内で、通常結果としてなる。投与される細胞が、変換される‖前の 活発な表３に従う卵着床の前に。基Dは、NIS遺伝子（１対１の比率）を表 していない細胞と組み合わせられるNIS遺伝子を表している腫瘍細胞が傍観者放 射線死によって、1311の投与の後、破壊されることができるかどうか決定する。 14日後に、禽獣が131Iの0.3mCiの一つの静脈内注射を受信する‖（春日Yほか（「 甲状腺機能におけるヌードマウスでは放射性がある沃素により誘発された甲状腺 切除に続いている人間の甲状腺組織の動物臓器移植の効果」）は、ClinにMed（19 91）に投資する、14:277-281、Walinder G、「ハツカネズミ甲状腺に対する131の ｉ供与量の決定」、公式記録Radio Ther Ph s Biol 1971、558-578)。反応は、腫 瘍計測記録された隔週出版物（mm3）により決定される。 表３ PRETRANSDUCED腫瘍に対する131Iの活発な抗腫瘍活性では ベクター生産者細胞注射を有する活発な遺伝子導入では以後のテスト効能は、13 1I投与によって、あとに続いた。前の実験が、標的腫瘍細胞にレトロウイルスの VPCの直接の卵着床によって、効果的な遺伝子導入を示した‖（短いMPら、「レト ロウィルス・パッケー遺伝子グ細胞系の移植によるラット脳ではグリオーマ細胞 に対する遺伝子送達」、J Neurosci物件、1990、27：427-439、CJら、「低抗性ま たは再発する卵巣のガンの処理間系の単純ヘルペス・チミジン遺伝子キナーゼ/g anciclovirを有する活発な遺伝子治療では位相ｉ試験」、人間の遺伝子Ther、199 6を結ぶ、7:1161-1179、カルーソーMら、「自己不活化遺伝子のsituトランスダク ションでは以後の確立した肉眼で見える肝臓転移の回帰」、Proc Natl Acad Sci 社1993、90：7024-7028)。このアプローチは、SK-OV-3腫瘍モデル(表4)で実行さ れる。SK-OV-3細胞がLNISNベクターについてはpretransducedした１０x106につ いては、５つの正の制御ハツカネズミ（基A）は、吹き込ま れる。８つのハツカネズミは、各々基B、C及びDではどちらの（B）LNChRG VPC（ NIS遺伝子以外でない、移植GFP遺伝子）でも、（C）HBSSだけまたは（D）LNISNV PCを有する処理が続く10x106 SK-OV-3腫瘍細胞を有する腹くう内に噴射される。 3日処理細胞の射出の後、各基では５つのハツカネズミは、静脈内に1311の0.3mC iの中で吹き込まれる。反応は、禽獣の隔週の目視観測によって、腹水の悪液質 間決定される。1311については扱われないDによる基Bから禽獣は、neor形質発現 間G418選抜によって、表２間用いられる同じ方法により評価される。この狙いは 、同位元素の活発な効能ではコンセントレーター概念を決めなければならない。 表４ 1311続かれるネズミ媒介生物生産者細胞を有する活発な遺伝子導入では以後の効 能 ハツカネズミ群法VPCの数は、同位元素を吹き込まなかった ・ 例５ ・ 活発な遺伝子転写効率US1NG単純ヘルペスウィルス（HSV）では、アンプリコンは NIS遺伝子の移植による緑の蛍光性のタンパク（GFP）及び効能が131I投与によっ て、続いたEXPRESS1NGを一定方向に向ける。 抗腫瘍の遺伝子治療は、治療の遺伝子の非常に効果的な遺伝子導入及び形質発現 を必要とする。HSVベクターは、これらの性状の両方とも提供して及びNIS遺伝子 治療を有する我々の抗腫瘍の方法間遺伝子導入伝播者である。それらが能率的に 非分裂細胞（試み段階）を変換して及び大きい環境収容力を有した時から、こ れらのベクターは極めて魅力的である。 例えば、最も人間の上皮の腫瘍は、細胞周期のGO段階では、それらの細胞の重大 な乳癌がそれらの細胞のほぼ90だけ/oをＳ期では有する効果がある。(Witzig TE ら、「結節-正乳癌では前兆第因子としてのデオキシリボ核酸多倍数性及びパー セントＳ期：２つの未来の無作為化された試験では記載される患者から結果」(J Clin Oncol 1993)、11：351-359)。ネズミ・レトロウイルスのベクターはこれ らの試み細胞を変換しない。これは、次のことの故である。有糸分裂は細胞を変 換することを必要とする。(Takamiya Yら、「悪意のある脳腫瘍の遺伝子治療：単 純ヘルペスウィルス型l-チミジン遺伝子キナーゼ遺伝子及び野生型レトロウィル スを運んでいるラット神経膠腫ラインは、他の腫瘍細胞を殺す」、 JNeurosci物 件、1992、33：493-503)。HSV-1 Iyticな複製起点（ori S）を含有しているプラ スミド及びシグナル配列を包装しているHSV-1終末は、拡大されることができて 及び伝染性のHSV-1 ウィリオンにヘルパーウィルスを処理することの面前で包装 されることができる。(Spaete RRら、「単純ヘルペスウィルス・アンプリコン： 新しいeucaryoticな欠陥ウィルス・クローン化-拡大しているベクター」、細胞、 1982、30：295-304、Kwong ADら、「単純ヘルペスウィルス・アンプリコン：成熟 核DNAの塩基配列を含有している造られた不完全なゲノムの複製における大きさ の効果」、J Virol、1984、51：595-603、ゲラーAIら、「不完全なHSV-1 ベクター は、洗練された周囲のニューロンでは大腸菌β‐ガラクトシダーゼを表す」、科 学、1988、241：1667-1669、ゲラーAIら「私が一定方向に向ける不完全な単純ヘ ルペスウィルスを有する洗練された中枢神経系ノイロンの感染は、大腸菌β‐ガ ラクトシダーゼの安定した形質発現では結果としてなる」(Proc Natl Acad Sci USA 1990)、87：1149-1153)。この方法は、1HSV アンプリコン系をレトロウイル スの方法を有する腫瘍を変換する限られた能力を原因として生じるので用いる： P。再び、この狙いは、送達系及び死滅方法の基礎科学調査の及び人間の臨床試 験間前臨床コース・データを開発する二重の目的を有する。 GFPの遺伝子導入及び形質発現をSK-OV-3ネズミ・モデルでは評価する。SK-Ov-3 人間の卵巣のカルシノーマ細胞wmの成長間寛大であるAthymicなヌードマウ ス（nu/nu）ハツカネズミが、用いられる。日１における10x106細胞の射出は、3 -4mm腫瘍では日5-7までに結果としてなる。GFP形質発現間正の制御として役立つ ５匹の動物は、変性GFP遺伝子を含有しているLNChRGベクターについては、以前 に変換される10x106 SK-OV-3細胞を注射される。５つの禽獣の３つの残留する基 は、各々直接皮下の腫瘍に噴射されるpHE8NISベクター(HBSSの100のuu1では停止 した)の多様な供与量（5つのｘ108、１つのｘ109または5×109gfu/ml）を受信す る。禽獣はそれから犠牲にされる及び、腫瘍は腫瘍細胞懸濁液の凍結切片または FAC分析の蛍光顕微鏡検査法によって、トリプシン消化作用の後、調べられる。 我々は、凍結組織切片から変性GFP遺伝子（示されないデータ）を含有している 成熟核発現プラスミドの射出の後、以前にGFP形質発現の直接の視覚化を示した 。次に、一連の類似した実験は、腹膜内の腫瘍については遺伝子導入efflciency を決定するために実施される。１０の射出×日１における106の細胞は、多数の 腹膜内の腫瘍では全ての禽獣では日7-10までに植菌、リンク、未発表の目視観測 の後、結果としてなる。各々が受信する５つのハツカネズミの３つの基が、腹こ う内投与を導く‖私ml含有しているHBSSの私×107、１x108または1×109gfu/ml のpHE8NlSベクター。GFP形質発現間分析は、５日、射出の後、２を実行される。 ネズミでは1311の処理が続くpHE8NISベクターを用いている抗腫瘍の効能間、異 種移植片モデルを評価する。Athymicな裸の（nu/nu）ハツカネズミは、得られる (Harpan-Sprague)。禽獣は、不毛なハツカネズミ食品（Teklad）及びH2Oをアド リブで入れられる。サニー木っ端及びmicroisolator ハツカネズミ・ケージ（研 究室生成物）は、用いられる。ケージは、我々の一杯サービス齧歯動物設備では 保たれる。直通E(表5)がそうする基ではハツカネズミが、腹膜内に10x106SK-OV- 3細胞については日１における吹き込まれる。これは、多数の腹膜内の腫瘍では 禽獣では日7-10までにinnoculation及びアニマル死亡の後、ほぼ30日腫瘍射出、 リンク、未発表の目視観測の後、結果としてなる。対照群は、（A）HBSS及び（B ）pHE-tkベクター（HSVベクター細胞毒性間コントロール）だけである。基（C） (D)及び（E）意志‖pHE8NISベクター（表5）の３つの供与量レベルで注射する。 基Ｆではハツカネズミが、SK-OV-3細胞を受信する。レトロウイルス のベクター及びwmが正の制御として腫瘍死滅間1311奉仕するLNISNを有するpretr ansducedした。３日処理細胞の射出の後、各基から５つのアニマルは、131Iの0. 3mCiの静脈内注射を受信する。禽獣は、毎日毒性または感染の証明間ベクター投 与の後、観測される。反応は、禽獣の隔週の目視観測によって、悪液質または腹 水間決定される。完全な反応は、完全な腫瘍破壊（検死での見える病気でない） を有する禽獣として定義される。アニマルが日60（この時間によって、死亡が全 ての非処理のまたはコントロール・アニマルでは起こることができなければなら ない）における犠牲にされるときに、これは決定される。60日で生き残っている ハツカネズミでは残留する腫瘍沈澱物は、収穫される。この腫瘍の別々の一部は 、組織病理学染色間現在の細胞の浸透物間腫瘍では送られる。 表５ 131I群法量数ハツカネズミが続くpHE8NIS媒介生物射出を有する活発な遺伝子導 入では以後の効能 ・ ０日：腹膜の腔日５への腫瘍卵着床：媒介生物は、腹膜の腔日８に投与者の仕事 を行った：1311は、投与者の仕事を行った（0.3mCi） ・ ・ 例６ ・ ラジオアイソトープ・コンセントレーター治療を用いている細胞を一掃すること 間前の活発なプロトコル ・ リンパ球の養子移入は、寄主病気（GVHD）対、allogeneicな骨髄移植の後、移植 を扱うために変性した。AllogeneicなBMT(骨髄移植体)は、準備の摂生によって 、及び移植によって、Graft-versus-Leukemia（GVL）と呼ばれている抗白血病剤 効果を出すimmunocompetentなドナー細胞の骨髄異型移植では誘導されるmyeloab lationによって、白血病を治す。Horowitz mMら「骨髄移植の後のGraft-Versus- Leukemia反応」(血液1990)、75:555-562、Weiden、P.L.、Horowitz M.M.、「臨 床の骨髄移植体では移植対Lenkenua Effects」Hematolo 1990、12：691-708。こ の反lenkemicな効果間最近直接の証明は、ドナー末しょう血液白血球の注入液に よって、後戻りをもつ患者にallogeneicなBMT（表I）の後、示された。国際骨髄 移植体レジストリは、早期の白血病間HLA-同一の同胞BMTを経験した2,254人の患 者からデータを分析して及びGvHDを開発した患者のための後戻り危険では、重大 な還元を見つけた。Horowitz mMら「骨髄Transplantatronの後のGraft-Versus-Le ukemia反応」血液1990 75 505 562、Weiden、P.L.、Horowrtz M M「臨床の骨髄移 植体では移植対白血病効果」、血液学1990、12：691-708。不幸にも、GvHDによっ て、必ずしも処置できなくて及び相当な忍耐強い羅病率及び死亡率が生じる。移 植から成熟したＴ細胞の収奪は、鋭い及び慢性のGvHDの効果的な保全では結果と してなる。全体的な生残が改善されないために、Ｔ細胞枯渇のこの利点は増加す る移植失敗及び白血病後戻りで相殺される。Marmontする。午前ら、「白血病では HLA-同一の移植体のＴ細胞枯渇」、血液、1991、78：2120-2130。Ｔ細胞枯渇は、 AML及び全てではGvHDの減失を原因として生じるので白血病後戻りを増やす。細 胞CMLの場合、消失してもよいGvL効果（GvHDから独立している）が、Ｔ細胞枯渇 のプロセスの間、また、ある。Kolb及び同僚は、CMLについてはallogeneicなBMT の後、後戻りする患者間、本来のドナーからlenkocyte注入液が寛解傾向を誘導 できると最初に報告した。KolbにH.J。ら、「髄移植体レシピエントでは再発する 慢性の骨髄性白血病の治療間ドナー白血球輸血」、血液、1990、76：2462-2465。 既存のデータは、cytogeneticな後戻 りだけまたは慢性の位相だけを応答してもらうCMLをもつその患者がこの処理に より高度な病気をもつ患者より良いとわかる。結論として、allogeneicなBMTが 、それが有するGvL効果と関連する‖GvHD-dependentな及びGvHD-independentな 成分。GvHD間現在の医薬品治療は部分的に効果的なだけである及び、レシピエン ト組織の進歩的なGvHD破壊はたびたび致命的である。したがって、それらによっ て、GvHDが生じる場合だけ、adoptivelyな移されたlymphocyiesを破壊すること が可能であることは、たいへん望ましい。 ABMTの後の後戻り間テーブルｉ.ドナー白血球 病気細胞他のRx NR-notは、報告した、アール-急性の白血病 例７ 本発明間役に立つ腫瘍特定のプロモーター 以下が、本発明間役に立ってもよくて、多くてもよい腫瘍特定のプロモーターの リストである‖他のこの種のプロモーターが、公知で及び技術ではgenbankのよ うな資源では技術のそれらが利用できる。 本発明間役に立つ腫瘍特定のプロモーターは、以下を含むが、これに限定される ものではない： R73368519-73377389-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbpri.seq gopher.nih .gov：HUMPRDA1Aホモ・サピエンスPRAD1/cyclin D 1つのプロトオンコ遺伝子、 プロモーター領域及びR131139159-131144243-の700gb、側面に位置しているOgb ：HSU24128人間のプロホルモン・コンベルターゼ（PC1/3）遺伝子、プロモータ ー及び５』/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/700g bgbpri.seq gopher.nih.go v：metalloproteinase-3組織R21667172-21676635-/gopherlib/データ/dB/.genba nk-92/gbrod.seq gopher.nih.gov間700gb MMTIMP3MIM.musculus（Balb/C）TIMP- 3遺伝子：S76735 HrMA4 alpha=muscle-specfficなアクチン｛プロモーター｝[Ha locynthia R91434337-91436077-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/700gb gbin v.seq gopher.nih.gov：SPU16263 Strongylocentrotus purpuratus細胞質のアク チン私（SpCyl）遺伝子（R94170781-94174495-/gopherlib/dataJdb/.genbank-92 /700gb gbinv.seq gopher.nih.gov：SUSMSP130AS.purpuratus細胞表面グリコプ ロテイン（msp 130）遺伝子）5』脇側及びR95059129-95062574-/gopherlib/data /db/.genbank-92/gbinv.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：SUSMSP130BS.purpuratus細胞sutfaceグリコプロテイン（msp 130）メッセ ンジャーＲＮＡ（５）』は、終わる。R95062574-95068440-/gopherlib/datajdb/ .genbank-92/700gb gbinv.seq gopher.nih.gov：変法に特有の界面グリコプロテ イン間TBVSG118A T．bruceiプロモーター領域R96463813-96467678-/gopherlib/ データ/dB/.genbank-92/gbinv.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：BTU15731 Bos taurusソマトトロピン受容体遺伝子、エキソンｉ及び肝臓- 特性 R8476848-8482291-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam。seq gopher.nih 。 カルモジュリン（エキソン1）間700gb gov：DOGCAMIIイヌ・遺伝子。 R10631174-10634811-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：LC15LOPRO L.cuniculus 15-リポキシゲナーゼ・遺伝子(プロモーター領域) 。 R12667022-12669806-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：MDU32208 Monodelphis domesticaユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（PGP9.5 ）遺伝子、 R12823493-12828679-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：OALGBヒツジは、beta-lactoglobulin遺伝子をariesする。 R14266321-14279312-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：OCKK3 O.cuniculusケラチンK3遺伝子。 R15952615-15964713-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：RAB15LOXラビットerythyoid細胞-特定の15-リポキシゲナーゼ（15-液体酸 素）遺伝子(R19673279-19689638-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70) Ogb：RABSURFAラビット肺臓界面活性剤プロテインＡ関連した遺伝子が、遺伝子 を完了する及び R22419294-22432460-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：S55298 LINE/c-MYC 6unction配列}[イヌ、送ることのできる性交による腫 瘍、R22998775-23000354-/gopherlib/dataldb/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：S64695 ＬＨβ-サブユニット[ヒツジ（Genomicな）1779nt]。 R23183638-23187681-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：S65740 K3ケラチン[ウサギ（Genomicな）6045nt]。 R23217050-23227115-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam。seq gopher.nih.gov 70 Ogb：SSIKBAG S.scrofa IkBa遺伝子‖（プロモーター領域。 R25337255-25341446-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb：A08215 Patatin遺伝子及びプロモーター配列。 R4651664-4655250-/gopherlib/データ/dB/.genbank-92/gbpat.seq gopher.nih.gov 70 pSKIIIからOgb：A15840プロモーター領域プロテイナーゼ・遺伝子。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１２月２８日（１９９９．１２．２８） 【補正内容】 明細書 表題：放射性同位体コンセントレーターのための方法及び組成物 発明の分野 本発明は、細胞の破壊をイメージングするための組み合わせ放射線療法に関し 、より具体的には腫瘍細胞破壊、非新生物組織破壊、例えばケロイド瘢痕組織、 脂肪組織、心肥大などに放射性同位体を凝集させるために設計された遺伝子操作 による薬学的組成物及び治療法に関係し、又はエクスビボもしくはインビボのい ずれかで形質導入された細胞及びバイスタンダー効果（bystander effect）に感 受性のそれらの付加的な細胞のラジオイメージングのための組み合わせ放射線療 法に関係する。 発明の背景 抗新生物療法には、増殖挙動に基づき新生物細胞を正常細胞から区別する能力 に限界があることから、増殖特異的というよりむしろ腫瘍特異的である新生物細 胞の生化学的特徴の研究が行われている。残念なことに、現在の分子遺伝学的研 究は、そのような特徴が新生物細胞の一貫した特性であるという予想を裏付ける ことができていない。むしろ、これらの研究は、新生物状態が腫瘍特異的機能で はなく、増殖制御遺伝子の構造の変化（時に極微小である）又はそれらの数もし くは染色体環境の変化の結果としての、正常な増殖特異的機能の異常なレベルで の作動を仮定するだけで説明できることを示唆している。この結論は、新生物細 胞の高度に特異的な属性の継続的な研究が、癌療法の問題の一般的な解決にとっ て、あてにできないことを示唆している。癌の致死性の大幅な減少には、そのよ うな属性の自然発生に頼らない別の方法が必要であろう。 一つの代替的な戦略は、遺伝子挿入技術の予防的な使用による、正常細胞と新 生物細胞の差違の人工的な創造を必要とする。換言すれば、組織的かつ特異的に 新生物細胞を破壊の標的とするために活用されうる生化学的な差違を作出するこ とである。この発明は、骨髄パージング（bone marrow purging）のようなエク スビボのプロトコル又はインビボの腫瘍の処置のため、増殖を阻害し新生物細胞 を殺すための、細胞の遺伝子操作及び放射線治療の組み合わせに関する。遺伝子 挿入プロトコルを使用して、標的腫瘍細胞において生化学的差違を人工的に作出 し、次に、その差違を活用して、腫瘍細胞死亡をもたらす放射性同位体の細胞に よる取り込み及び蓄積を引き起こすことにより、特異的に細胞を放射線効果に対 して感受性にさせる。 したがって、本発明の目的は、例えば¹³¹Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹⁸⁶ＲＥ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃ ｕなどのような放射性同位体を使用して、腫瘍を可視化もしくは処置するため、 又は非新生物細胞破壊のための治療用材料及び方法を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、放射線療法感受性を付与するために活用される生 化学的差違を腫瘍細胞において作出するための遺伝子治療を用いて、腫瘍を殺す ことである。 本発明のもう一つの目的は、腫瘍細胞における放射性同位体凝集を引き起こし 、放射性同位体への曝露時に、細胞内の放射性同位体の蓄積及び標的細胞の死亡 を引き起こす遺伝子を含むよう腫瘍細胞を遺伝子操作することである。 本発明のもう一つの目的は、インビボの腫瘍又は形質転換された細胞のラジオ イメージングを提供するため、放射性同位体凝集のため細胞を遺伝子操作するこ とである。 発明の概要 本発明の一つの態様によると、診断のため細胞に放射性同位体を凝集させる方 法、及び放射性医薬品を用いた治療の方法が提供される。これらの方法は、形質 導入された細胞のラジオイメージング並びに腫瘍細胞及び非新生物細胞の破壊の ための放射線療法を含む。該方法は、形質転換された細胞と、作用物質（agent ）をコードする核酸配列の発現及びその後の放射線療法時のバイスタンダー効果 に対して感受性の細胞とにおける蓄積が引き起こされるよう、形質転換された細 胞による放射性核種の取り込みを提供することができる作用物質をコードする核 酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列で、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで、細 胞を形質導入することを含む。 好ましい実施態様において、核酸によりコードされる作用物質は、診断用ラジ オイメージングのためであれ、又は放射線療法のためであれ、投与された放射活 性エレメントの効果及び致死性を指向させ、かつ増強する、放射性同位体のコン セントレーター又は輸送体である。 図面の説明 図１は、実施例の項に記載されるいくつかのネズミ又はヒトの腫瘍細胞系に関 するヨウ素取り込み実験を図示するグラフである。見て分かるように、ヨウ化ナ トリウム共輸送体を含む細胞は、氷を有するＦＲＴＬ細胞又はベクターを有しな い細胞である対照細胞よりもかなり高いヨウ素取り込みを行った。 図２（ａ）〜（ｄ）は、¹²⁵Ｉ蓄積の飽和動態を図示するグラフである¹²⁵Ｉ取 り込みの飽和動態は、ラインウィーバー・バーク・プロットにより決定されたよ うに、外部［Γ］の関数としての直線である(Lineweaver H et al，“The deter mination of enzyme dissociation constants”，J Am Chem Soc ，1934;56:658- 660)。計算されたｋＭは、２（Ａ）Ａ３７５黒色腫細胞においては３１．３μＭ であり、２（Ｃ）ＩＧＲＯＶ卵巣癌細胞においては３４．７μＭであった。これ らの値は、ラット甲状腺ＦＲＴＬ−５細胞について以前に報告された値と類似し ている（Weiss SJ et al.，“Iodide transport in a continuous line of cult ured cells from rat thyroid)”，Endocrinology，1984;114:1090-1098)。グラ フ２（Ｂ）及び２（Ｄ）の結果は、レトロウイルスベクターを含まないか、又は ＬＮＩＳＮベクターで形質導入された、２（Ｂ）Ａ３７５黒色腫細胞及び２（Ｄ ）ＩＧＲＯＶ卵巣癌細胞におけるＮＩＳ活性を示している。時間は、３０μM Ｎ ａＩという総濃度における¹²⁵Ｉ(０．３４５nM)への曝露後の分単位で示した。 急速かつ持続的な¹²⁵Ｉ取り込みに注意されたい。 図３は、形質導入された腫瘍細胞及び形質導入されていない腫瘍細胞の、１０ μＣｉ／ｍｌ¹³¹Ｉへの曝露時の６時間後のインビトロ生存率を図示するグラフ である。生存率（％）は、処理後に依然として増殖性であった細胞コロニーの数 に基づいている。これは、ＮＩＳを発現している腫瘍が、¹³¹Ｉ媒介性甲状腺切 除のための標準的なよく確立されたプロトコルを用いて、選択的に殺されうるこ とを証明している。 図４は、１３３nM Ｎａ¹³¹Ｉ（１０μCi／ml）３０μM ＮａＩへの１２時間の 曝露の後の腫瘍細胞系を図示するグラフである。 図５は、６時間の¹³¹Ｉへの曝露から８日後のＢＮＬ．１ＭＥ細胞の生存率（ ％）を図示するグラフである。 図６は、単純ヘルペスウイルスｐＨＥ７００ベクターのプラスミド地図である 。 Ａｍｐ^R、アンピシリン耐性；「a」、ＨＳＶ−１パッケージング・シグナル；ＨＳ Ｖ−ｔｋプロモーター、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ・プロモーター；ｈｙｇ＋ 、ハイグロマイシン耐性；ＭＣＳ、マルチクローニング・サイト；ΔＥＢＮＡ− １、改変型ＥＢＶ核抗原遺伝子；ｏｒｉＰ、ＥＢＶ特有潜在性複製開始点(EBV u nique latent replication origin)；ｏｒｉＳ、ＨＳＶ−１複製開始点。 図７は、Ｈｓｔｋ遺伝子発現ユニットのタンデム・リピートを含むｐＨＥ−ｔ ｋベクターの光化学的改変の効果の提唱されたメカニズムを示す図である。未改 変ベクターで形質導入された許容性の細胞において、ＤＮＡ複製及び遺伝子発現 の両方が起こる(上)。ＰＵＶＡ処理の後、鎖内ＤＮＡ架橋がウイルス複製を阻害 するが(Hanson CV，“Photochemical inactivation of viruses with psoralens :an overview”，Blood Cells，1992;18:7-25)、影響を受けていない転写ユニッ トからのトランスジーン発現は許容される。 図８は、ＩＧＲＯＶ卵巣癌細胞におけるＰＵＶＡ改変ベクターから発現された Ｈｓｔｋ遺伝子活性を図示するグラフである。グラフは、³Ｈ−チミジン取り込 みにより測定された、ｐＨＥ−ｔｋベクターへの曝露後のＩＧＲＯＶ細胞増殖を 図示している。ベクターをＴＭＰ（０又は１μｇ／ｍｌ）及び異なる長さのＵＶ Ａ曝露（０から７．５ＫＪ／ｍ²）で処理した。腫瘍細胞を１０⁴個／ウェルで播 き、以前の記述のようにして増殖アッセイを行った(Link,CJ,et al.，“Prelimi nary in vitro efficacy and toxicities studies of the herpes simplex thym idine kinase gene system for the treatment of breast cancer”，Hybridoma ，1995;14:143-147;Section １:（Escherichia coli,plasmids,and bacteriopha ges）Ausubel FM et al“Current Protocols in molecular biology”（Vol.1） John Wiley and Sons:New York，1989，1，4.2-1.4.3)。各試料は、依然として 機能的Ｈｓｔｋ活性を発現しているが、ベクター毒性の減少を示す、ＧＣＶ（０ 又は５．０μg／ml）で示されている。取り込まれた³Ｈ−チミジンは１分当たり のカウント（cpm）として測定され、対照（ＧＣＶなし）に対するパーセントと して表されている。 図９は、増大する腫瘍塊の直径の、線量透過に対する理論上の効果を図示する グラフである。腫瘍細胞塊の半径を増大させると、塊から透過されるβ粒子の減 少が生じる。 図１０は、単純ヘルペスウイルスｐＨＥ８５０ベクターのプラスミド地図であ る。Ａｍｐ^R、アンピシリン耐性；「a」、パッケージング・シグナル；ＨＳＶ−ｔ ｋプロモーター、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ・プロモーター；ｈｙｇ＋、ハイ グロマイシン耐性；ＭＣＳ、マルチクローニング・サイト；ΔＥＢＮＡ−１、改 変型ＥＢＶ核抗原遺伝子；ｏｒｉＰ、ＥＢＶ特有潜在性複製開始点；ｏｒｉＳ、 複製開始点；ＧＦＰ、緑色蛍光性タンパク質(green fluorescent protein)。 発明の詳細な説明 核医学の分野では、診断（ラジオイメージング）ならびに治療（新生物細胞及 び非新生物細胞両方の破壊のための放射線療法）のため、古くから放射性医薬品 が使用されてきた。 核医学において使用される放射性核種は、全て合成であり、ジェネレーターで 製造されるか、リアクターで製造されるか、又はサイクロトロンで製造される。 いくつかの重要なパラメーターが、診断又は治療のプロトコルのための放射性核 種の最終的な使用に影響を与える。放射性核種の半減期は、イメージング又は標 的組織の破壊にとって十分な長さでなければならず、さらに、有効寿命がイメー ジングにとって十分な長さであるよう、許容される除去パターンを有していなけ ればならないため、重要である。理想的には、放射性医薬品の有効半減期は、診 断過程の時間の１．５倍に等しいべきである。ヨウ素１２１、１３１、及び１２ ５は全て、有効寿命がイメージングにとって十分な長さであるような除去パター ンと比較された許容される半減期を有する。放射性核種のうちのいくつかは稀少 であるため、入手可能性も重要なパラメーターである。１３３^Xeモリブデン９９ 及び¹³¹Ｉは、全てウラン−２３５の分裂の副生成物である。これらの同位体は 、核リアクターで大量に製造され、原子力産業では廃棄物と見なされている。標 的と非標的の比率も重要である。 放射性医薬品による処理のさらなる重要な面は、標的と非標的の比率を含む。 二次元イメージングに関しては５：１最小、シングルフォトンエミッション・コ ンピュータ連動断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングには２：１、比率が十分に 高くない場合には、非診断的スキャンはバックグラウンドから病理を区別するこ とを困難又は不可能にしうる。極めて低い標的−非標的比の結果は、不必要な放 射線量をもたらす非診断的スキャン、診断の遅延及び最終的な過程反復の必要で ありうる。標的と非標的の比率は、診断的放射医学的使用において重要であるが 、治療的過程にとっては絶対に不可欠である。標的と非標的の比率が低い場合に は、原発性疾患の治療が不適切なものとなり、骨髄又はその他の放射線感受性組 織に潜在的に致死的な放射線量が輸送されることになりうる。いくつかの核種の 群が、放射性医薬品として現在使用されている。第一の群は、全てサイクロトロ ンで製造される陽電子放出（positive emitting）同位体、炭素−１１、窒素− １３、酸素−１５及びフッ素−１８からなる。これらは、極めて短い半減期を有 し、最初の３つの使用はサイクロトロンのある場所又はその近くの施設に制限さ れる。¹⁸Ｆは輸送が可能であるが、実用は事実上不可能である。 第二の群は、ガンマ線放出核種、コバルト−５７⁶⁷Ｇａ、¹¹¹Ｉｎ、¹²³Ｉ、及 び²⁰¹Ｔｌを含む。これらもサイクロトロンで製造され、長い半減期を有し、容 易に輸送可能である。²⁰¹Ｔｌが特に重要である。１３５及び１６７ｋｅＶガン マ線の存在率（％）は低いため、画像形成のためカメラにより収集されるフォト ンの大半は、低エネルギー水銀−２０１ｘ線である。 第三の群は、全てジェネレーターで製造される放射性核種である、ガリウム− ６８、クリプトン−８１ｍ、ルビジウム−８２、⁹⁹ｍＴｃ及び^133mＩＮを含む。⁹⁹ ｍＴｃは、イメージング・エネルギー及び物理学的半減期が理想的であり、非 常に多くの化合物に結合することができるため、特に注目される。 最後の群は、全てウラン−２３５の分裂の副生成物である、１３３^Xeモリブデ ン９９及び¹³¹Ｉを含む。これらの同位体は、核リアクターで大量に製造され、 原子力産業では廃棄物と見なされている。伝統的に、適当な放射性医薬品の設計 における制限要因は、単純には標的臓器の生理学的機能であり、完全には抗原抗 体反応、物理学的捕捉、受容体部位結合、意図的に損傷を与えられた細胞の循環 血中からの除去、及び正常に機能する代謝プロセスによる、細胞膜を介して細胞 内への化学物質の輸送のような臓器プロセスに依存する。しかし、本発明によれ ば、臓器が本発明の放射性医薬品を能動輸送するよう改変され、それにより、甲 状腺ヨウ素共輸送体遺伝子を介した能動輸送により、¹³¹Ｉ、²⁰¹Ｔｌ、及び^{99 m} ＴＣのようなラジオイメージング並びに放射性核種療法両方のための魅力的な 特徴を有する放射性核種を、いかなる臓器でも使用することが可能となる。放射 性ヨウ素は優れた半減期プロフィールを有しており、¹²⁵Ｉの半減期は６０日、^{1 31} Ｉの半減期は８．０８日である。それは、豊富に入手可能であり、良好な標的 と非標的の比率を有している。しかし、甲状腺における能動輸送のため、甲状腺 癌にその使用が制限されていた。放射性ヨウ素の甲状腺による取り込みは、能動 輸送による。第一の段階は、ヨウ素の捕捉を含み、それが次にチログロブリン中 間体を含む中間体合成（有機物化(organification)）を受け、カップリングのプ ロセスにより最終的にＴ₃及びＴ₄へと変換される。静脈注入後の最初の局在部位 は、甲状腺胃奇形（thyroid stomach teratoids）及び脈絡叢である。最終的に 、ヨウ素は、約３週間のＴ_biolでチロキシンとして甲状腺に貯蔵されるか、又は 腎臓を介して除去される。 良好なパラメータを有するもう一つの放射性核種は、やはりＮａ⁺／Ｋ⁺ポンプ を介して能動的に取り込まれる、²⁰¹Ｔｌである。心筋灌流イメージングは、通 常、タリウム（Ｔｌ¹⁺）の形態の²⁰¹Ｔｌで形成される。Ｔｌ¹⁺はカリウム類似 体であり、したがってよく証明されたＡＴＰａｓｅにより駆動されるナトリウム カリウムポンプ機構により効率よく取り扱われるため、これは、カリウムの取り 扱いのための正常に作動する代謝経路の利用を含む。静脈注入後のＴｌ¹⁺の最初 の局在部位は、心臓、肝臓及び筋肉である。最終的には、それは腎臓へは極微量 しか除去されないため、再利用される。全身Ｔ_biolは約１０日である。 神経内分泌系由来の腫瘍のイメージングも、能動輸送のカテゴリーに分類され るが、おそらく代謝的取り込みの方がよりよい説明である。注入された¹²³Ｉ又 は¹³¹ＩｍＢＧは、グアネチジンと構造が類似している。エピネフリンの前駆体 、したがって、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、傍神経節腫、カルチノイド型腫瘍、 随過形成を含むこれらの腫瘍は、それをホルモン合成の基質として使用すること を試みる。したがって、素材はそれらの中に蓄積し、蓄積された微量の活性は、 時間の関数として腫瘍内で単調増加する。 放射性ヨウ素取り込み研究の詳細な説明は、Hee-Myung Park，Chapter 59，“ The Thyroid Gland”，Nuclear Medicine，Vol.1;Robert E．Henkin，1996， Mosby-Year Book Inc.に開示されており、その開示は参照として本明細書に組み 込まれる。テクネチウム−９９過テクネチウム酸塩も、ヨウ素と同じ機構により 捕捉され、甲状腺機能状態を推定するために使用されうる。この放射性医薬品の 使用の利点には、放射吸収線量がはるかに低く、試験の時間が短いことが含まれ る。 出願人らの発明は、非特異的な作用による正常組織に対する毒性の問題を解決 する。本発明は、遺伝子により活性化される放射性核種蓄積を含み、正常組織の 合併症を無視しうるレベルにまで減少させる。現在までに、放射性医薬品を遺伝 子操作プロトコルと組み合わせる試みはほとんど存在せず、Wechselbaumらは、 大量放射線への曝露後に腫瘍壊死因子発現をアップレギュレートできる実行可能 性を証明した。Wechselbaum et al.，Int ．J．Radiation Oncology，Biol．Phys . ，24:565,567(1992)。Wechselbaumらは、放射線誘導性シグナルを活性化もしく は増幅しうる遺伝子構築物、又は正常組織の放射線耐性限界を増大させるタンパ ク質をコードする遺伝子の前に、放射線反応エレメントを置換することにより、 細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子の転写を制御できる可能性を提唱した。 開示が参照として本明細書に組み込まれる、Wechselbaum et al.，“Gene Thera py Targeted by Ionizing Radiation”、既出、を参照のこと。 もう一つの組み合わせ療法は、ヘルペスで形質転換された細胞において選択的 に放射線増感剤へと代謝される化合物の使用が含まれる。それは、リン酸化され なければ哺乳動物細胞において不活型である放射線増感剤をリン酸化するための 、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子の発現の使用を含む。ピリミ ジン・ヌクレオシド類似体を投与すると、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子で形質転換された 腫瘍細胞は、これらの化合物を活性型の放射線増感剤へと代謝し、これらの細胞 の放射線療法に対する感受性を高める。このプロトコルは、その開示が参照とし て特に組み込まれる、Linkらの１９９６年９月６日に公開されたＰＣＴ公開第Ｗ Ｏ９６／２６７４３号に詳細に記述されている。 本発明は、本明細書において、ラジオイメージング又は放射線療法において使 用するための、放射性同位体が形質転換された細胞に選択的に蓄積される方法を 記述する。本発明によると、標的細胞が放射性同位体コンセントレーターである 核酸で形質転換され、作用物質をコードする核酸配列の発現、及びその後の放射 線療法により、放射性同位体が標的細胞内に蓄積する。 好ましい実施態様において、作用物質は、形質転換された細胞に電離放射線を 指向させ、それによりこれらの細胞における放射線の効果を増強するため、形質 転換された細胞による放射性同位体の取り込みを引き起こす放射性同位体コンセ ントレーターである。 本明細書において使用されるように、「放射性同位体コンセントレーター遺伝 子」とは、その発現が、その前駆体又は結合型誘導体を含む放射性医薬品の細胞 による能動的又は受動的なインポートを引き起こす、任意の配列を含むと解釈さ れるものとする。 本発明にとって有用なそのような放射性同位体コンセントレーター遺伝子の一 例は、甲状腺によるヨウ素の取り込み及び放射性ヨウ素への曝露を引き起こすヨ ウ化ナトリウム共輸送体遺伝子を含む。 本発明にとって有用なもう一つの放射性同位体コンセントレーター遺伝子は、 放射性同位体タリウムの取り込みに必要な（Ｎａ⁺−Ｋ⁺）により活性化されるＡ ＴＰａｓｅを含む。参照として本明細書に組み込まれる、Henkin et al.，“Nuc lear Medicine”，1996 by Mosby Year Book，Inc．Vol.II，Chapter 93“Thall ium-201 Chloride and Technetium-99m Sestamibi in Tumor Imaging”を参照の こと。タリウム−２０１（²⁰¹Ｔｌ）はＡＴＰａｓｅ酵素上の２つの部位に結合 し、細胞により蓄積される。ウワバイン、ジギタリス、及び利尿薬フロセミドは ナトリウムカリウムポンプを遮断するため、これらの薬剤はその取り込みを阻害 する。²⁰¹Ｔｌは腫瘍細胞のラジオイメージングに使用されており、生存腫瘍細 胞の領域に主に蓄積する。開示が参照として本明細書に組み込まれる、Waxman A D，“Thallium-201 in nuclear oncology”，In Freeman LM，editor：Nuclear Medicine annual，New York，1991,193-209,Raven Press;Waxman A，“Thallium scintigraphy in the differentiation of malignant from benign mass abnor malities of the breast”，J Nucl Med，31:767，1990(abstract);Waxman AD, “Thallium scintigraphy in the evaluation of massabnormalities of the br east”，J ．Nucl Med，34(1):18-23,1993を参照のこ と。９９ｍ Ｔｃ−セスタミビ（sestamibi）は、Ｎａ⁺−Ｋ⁺ポンプを介して細胞 により取り込まれるもう一つの作用物質であり、Ｎａ⁺−Ｋ⁺ＡＴＰａｓｅを発現 する形質転換された細胞のラジオイメージングにおいて使用されうる。任意のそ のような放射性同位体コンセントレーター遺伝子を本発明の方法において使用す ることができ、当業者は本発明の範囲に含まれることが意図される極めて多様な 遺伝子／放射性同位体の組み合わせを同定することができる。ジェンバンク(Gen bank)のようなデータベースを検索することにより、又は当業者に既知の、例え ばAusubel FM et al,(eds.)“Current Protocols in Molecular Biology”Vol.1 ，John Wiley & Sons,New York，1989に開示されているような方法に従い、プラ イマーを開発し、他の種由来の類似体配列を用いたＰＣＲ増幅を用いることによ り、当業者は、Ｎａ⁺−Ｋ⁺ＴＰａｓｅをコードする遺伝子を容易に位置決定する ことができる。 最近、ラット由来の甲状腺ヨウ素輸送体遺伝子のクローニング及び特徴決定が 報告されており、それは本明細書に参照として組み込まれる。Dai，G.，Levy，O ．& Carrasco，N.，“Cloning and Characterization of the Thyroid Iodine T ransporter”，Nature，379:458-460(1996)。Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体（ＮＩＳ） 遺伝子は、ＲＮＡ転写物の注入後アフリカツメガエル卵母細胞におけるヨウ素蓄 積アッセイを用いることにより単離された。ＮＩＳ転写物が導入されたとき、１ 細胞当たり８００ｐｍｏｌのヨウ素の蓄積が可能となった。一次配列の分析は、 ６１８アミノ酸のタンパク質をコードする１８５４ｂｐの推定オープン・リーデ ィング・フレームを有する２，８３９ｂｐの長さの遺伝子を証明した。この小さ いｃＤＮＡサイズは、ＲＶ又はＨＳＶのいずれかに基づくベクターへのクローニ ングを容易に可能にするであろう。ＮＩＳタンパク質は、１２個の膜貫通ドメイ ンを有する。この分子ポンプは、Ｎａ＋／Ｉ−共輸送体として機能し、甲状腺ホ ルモン合成の第一段階を可能にする。したがって、このタンパク質は、甲状腺組 織におけるＩ¹²⁵取り込みの検出、及び機能亢進状態の甲状腺組織を切除するか 又は高分化甲状腺癌を¹³¹Ｉで治療する能力を可能にする。甲状腺組織のこの興 味深い独特の性質は、甲状腺補足の必要の可能性を除けば、治療による全身性副 作用が、存在するとしても極めて少なく、極めて集中的な放射線療法を可能にす る。ＮＩＳ遺伝子及びその活性に関するさらなる情報、並びにヨウ素蓄積を検出 するための方法は、参照として本明細書に組み込まれる、“Iodide Transport i n a Continuous Line of Cultured Cells From Rat Thyroid”，Welss，S．J．e t al.，Endocrinology，Vol.114(4):1090-1098に開示されている。 甲状腺の主要な機能は、ヨウ素を捕捉し有機物化（organify）することである ため、甲状腺スキャニング剤の論理的な選択が、ヨウ素トレーサー、即ち放射性 ヨウ素である。¹²³Ｉ、¹³¹Ｉ、及び¹²⁵Ｉなど、いくつかの放射性ヨウ素が利用 可能である。しかし、¹²⁵Ｉは、エネルギーが低く(２８ｋｅＶ)、半減期が極め て長いため(６０日)、もはやインビボの甲状腺研究には使用されていない。甲状 腺形態学のイメージングには、^99mＴｃ過テクネチウム酸塩もほとんどの場合に おいて満足のゆくものである。その他の作用物質には、タリウム−２０１、ガリ ウム−６７、¹³¹Ｉ又は¹²³Ｉメタヨードベンジルグアニジン(ＭＩＧＢ)、^99mＴ ｃ（ｖ）ジメルカプトコハク酸(ＤＭＳＡ)、フッ素−１８フルオロデオキシグル コース(ＦＤＧ)、及び^99mＴｃセスタミビが含まれる。これらの二次的なイメー ジング剤は、甲状腺新生物及びそれらの転移をイメージングするために主に使用 される。 放射性ヨウ素を用いたラジオイメージング過程は、当分野において古くから既 知であり、Nuclear Mediclne，Vol.I and II，Mosby Press，1996に詳細に開示 されている。その開示は、参照として組み込まれる。様々な同位体型のヨウ素が 、イメージング及び治療のためモノクローナル抗体を放射標識するためにも使用 されている。古典的な放射性ヨウ素化法は、タンパク質中のチロシン残基への放 射性ヨウ素の共有結合を含む。このプロセスは、クロラミン−Ｔ、イドゲン(ido gen)、又はラクトペルオキシダーゼのような酸化剤を用いた、弱アルカリ性ｐＨ におけるヨウ素の穏和な酸化を含む。ボルトン・ハンター（Bolton-hunter）試 薬を介した間接的なヨウ素化過程は、二次分子、典型的には活性エステルを放射 性ヨウ素化し、それをモノクローナル抗体のＮ末端及びリジン・アミノ基と反応 させることを含む。モノクローナル抗体の放射性ヨウ素化の開示は、A. Michael Zimmer, “New Approaches to radiolabeling monoclonal antibodies”，Chap ter 40，Nuclear Medicine，Vol.1，pp.551-515，Henkin， Robert E（ed.）1996，Mosby-Year Book Inc.,既出、に開示されている。 ＮＩＳ遺伝子は、放射性ヨウ素療法を甲状腺癌の標準的な治療にした。腺癌の 大部分が外科的に除去され、放射性ヨウ素は、甲状腺癌の管理のための命令的（ injunctive）な療法として２０年以上にわたり使用されている。放射性ヨウ素療 法の有効性は、甲状腺細胞に発現しているヨウ化ナトリウム・共輸送体遺伝子の 存在による腫瘍の取り込み及び保持に直接関連している。効率のよい取り込み及 び放射性ヨウ素に対する反応が、乳頭又は卵胞のような細胞型において分化した 腫瘍に観察されるが、未分化腫瘍及び髄癌はほとんど放射性ヨウ素を濃縮しない 。もたらされた腫瘍取り込みは、１グラム当たりの放射性ヨウ素線量の約０．５ ％であり、生物学的半減期は約４日である。５．６Ｇｂｑ（１５０ｍＣｉの¹³¹ Ｉと等価）の投与から、腫瘍は２５ｃＧｙ又は１クールの外的放射線療法により 到達されうる吸収線量の５倍もの線量を受容しうる。さらに、線量は、大きさ又 は体内の位置に関わらず、あらゆる機能的転移に到達され、腫瘍組織は身体の残 部により受容された放射線曝露の数百倍の放射線曝露を受容する。腫瘍細胞の取 り込み及び殺すための療法に有効な放射性ヨウ素の線量は、１．９から５．６Ｇ ｂｑ（５０〜１５０ｍＣｉ）の¹³¹Ｉの投与により達成される。ラジオイメージ ング過程は、ヨウ素の存在を同定するため、及び腫瘍細胞におけるその蓄積を追 跡するために使用される。これらのウシＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）は、内因 性甲状腺刺激ホルモンが抑制されている、甲状腺癌転移における放射性ヨウ素の 蓄積を増加させるため、しばしば患者に与えられる。適切な腫瘍取り込みが放射 性ヨウ素イメージング実験により保証された後、治療線量の放射性ヨウ素が投与 される。伝統的に、放射性ヨウ素の線量は、３．７から７．４Ｇｂｑ（１００〜 ２００ｍＣｉ）の間で変化する。線量測定が癌病巣における外科後残存癌組織パ ーセント取り込み量の推定及び病巣における放射性ヨウ素の有効半減期に基づく 場合、８，０００から１０，０００ｃＧＹの最少腫瘍線量で、均一に良好な反応 が可能であることが示唆されている。安全に投与されうる放射性ヨウ素の量に対 する制限因子は、正常又は生存組織に対する放射性ヨウ素の障害効果からの複雑 化の可能性を含む。通常の治療線量の放射性ヨウ素からの全身照射は２０〜４０ ｃＧｙであると推定される。ヨウ素の線量は、３０ｍＣｉもの低い線量から ３００ｍＣｉもの高い線量までにわたる。標準的なインペリカル（imperical） 線量は１５０〜２００ｍＣｉであり、その蓄積を探知し副作用を管理する放射性 ヨウ素の投与の方法は、当分野において既知であり、参照として完全に組み込ま れる以下の出版物に記述されている。Cancer Treatment，4th Ed.，Charles M． Haskel，MD，FACP，W．B．Saunders Co.，1995，“Radiation to the thyroid c an induce thyroid neoplasms both benign and malignant”；Nuclear Medicin e Communications ，(1993)14:736-735。“Radionuclides and Therapy of Thyro id Cancer”，O'Doherty，M．J．et al;Flower，M．A.，et al.，“Radiation D ose Assessment in Radioiodine Therapy to Practical Implementation Use in Quantitative Scanning and PET with Initial Results on Thyroid Carcinoma ”，Radiother ．Oncol.，1989，15:345-57；O'Connel，M．E．A.，et al.，“Ra diation Dose Assessment in Radioiodine Therapy Dose Response Relationshi ps in Differentiated Thyroid Carcinoma Using Quantitative Scanning and P ET”，Radiother.Oncol.，(inpress)；Leper，R.，“Controvesies in the Trea tment of Thyroid Cancer，the New York Memorial Hospital Approach”，Thyr oid Today ，(1982)1-4。甲状腺癌のマウスモデル及び放射性ヨウ素の投与のため の治療プロトコルも当分野において標準的であり、ヒト甲状腺組織の移植及びこ れらの細胞のマウスにおける発現に基づくヒト甲状腺癌を模倣したマウスモデル 、並びに０．２mlの用量の放射性ヨウ素での併用治療を開示している、Yoshlo， Kasuga“The Effect of Xenotransplantation of Human Thyroid Tissue Follow ing Radioactive Iodine-induced Thyroid Ablation on Thyroid Function in t he Nude Mouse”，Clin ．Invest．Med.，14(4):277-281，(1981)に開示されてい る。G．WalinderによるActive Radiologica Ther ．Phvsics．Biol．10(6)Decemb er 1971“Determination of the ¹³¹I Dose to the Mouse Thyroid”も参照のこ と。 放射性同位体であれ、又はビーム治療であれ、放射性核種の蓄積を引き起こす 任意のペプチド又はタンパク質が本発明の方法において使用されうる。本発明の 方法は、形質転換された細胞のラジオイメージングに使用されうる。これは、腫 瘍のラジオイメージングのような診断プロトコル、又は形質転換された細胞もし くは取り込まれた遺伝子（そのうちの一つは放射性同位体コンセントレーター遺 伝子を含む）による発現を探知するためのマーカーとしてのエクスビボ・プロト コルを含む。本方法は、形質転換された細胞により選択的に取り込まれる放射性 同位体への医薬品又はその他の作用物質の結合を介して、形質転換された細胞へ 様々な化合物を指向させるために用いることもできる。 好ましい実施態様において、本方法は、放射性医薬品を蓄積させ形質転換され た細胞を破壊するための、腫瘍細胞のような新生物細胞及び非新生物細胞の破壊 のための放射線療法を含む。 本発明の放射線療法は、効果をさらに凝集させるため、その他の伝統的な放射 線増感剤と組み合わされてもよい。治療的放射線照射に対して細胞を感作するこ とが報告されている伝統的な作用物質は、ドキゾルビシンのような細胞毒性薬剤 に対する様々な型の癌細胞の感受性を増強するためのジルチアゼム（化学名：ｄ −３−アセトキシ−シス−２，３−ジヒドロ−５−［２−（ジメチルアミノ）エ チル［−２−（ｐ−メトキシフェニル］−１，５−ベンゾ−チアゼピン−４（５ Ｈ）−１）の使用を報告している米国特許第４，６２８，０４７号のものを含む 。 そのような投与のため、放射線増感剤前駆体又はその結合体は、適当な液体ビ ヒクル又は賦形剤のような薬学的に許容される担体及び所望による一つ又は複数 の補助添加剤と組み合わされうる。液体ビヒクル及び賦形剤は通常のものであり 、商業的に入手可能なものである。その例は、蒸留水、生理食塩水、デキストロ ースの水性溶液などである。伝統的に静注療法が好ましい。 一般的に、活性化合物に加え、本発明の薬学的組成物は、薬学的に使用されう る調製物への活性化合物の加工を容易にする適当な賦形剤及び補助剤を含んでい てもよい。 通常の担体との投与に加え、活性成分は、携帯型注入ポンプのような当業者に 既知の、様々な特別化された送達薬物技術により投与されうる。 本発明の一つの態様に従い、診断又は治療の目的のため、細胞内に放射性核種 を蓄積させる方法が提供される。本方法は、放射性同位体コンセントレート遺伝 子をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列が発現されたとき、投与された放 射性核種の蓄積を提供することができる、放射性同位体コンセントレート遺伝子 をコードする核酸配列でインビボ又はインビトロで細胞を形質導入することを含 む。 本発明にとって有用な放射性核種は、細胞の取り込みのためのコンセントレー ター遺伝子と対になりうる任意の放射性核種を含む。可能性のある放射性同位体 は、放射性核種金属¹⁸⁶ＲＥ、¹⁸⁸ＲＥ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁹⁰イットリウム、¹⁰⁹ Ｐｄ、²¹²Ｂｉ、²⁰³ＰＢ、²¹²Ｐｂ、²¹¹Ａｔ、⁹⁷ＲＵ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁹⁸Ａｕ、¹⁹⁹ Ａｇ、及び¹³¹Ｉを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチド配列が既知で あるか、又は当業者によって確認されうる任意の放射性同位体コンセントレータ ー遺伝子が使用されうる。当業者は、類似の作用を有する、他のそのような遺伝 子を同定するため、ジェンバンクのような公衆が利用可能なデータベースにおい て、そのような遺伝子を検索することができる。 好ましい実施態様において、放射性同位体コンセントレーター遺伝子はヨウ素 共輸送体遺伝子、Ｎａ／ｋ＋ＡＴＰａｓｅ、又はカルシウム輸送体である。 次に、本発明に従い、放射線療法が細胞に投与される。放射性同位体は、本明 細書に開示され組み込まれた既知のプロトコルに従い、形質転換された細胞を可 視化するため、又は形質導入された腫瘍細胞の増殖を破壊するために有効な量で 投与される。これらの投与量は、標準的なものであり、前記のように当分野にお いて既知である。本発明は、形質転換された細胞におけるエレメントの濃縮のた め、同等の有効性を有する、より低用量の放射性エレメントを可能にしうる。放 射線療法は長い間利用されており、耐性及び毒性のデータが周知であるため、放 射性同位体は、当分野において既知の量で宿主又はインビボの細胞に投与されう る。放射性同位体は、例えば静脈内投与、非経口投与、腹腔内投与、もしくは筋 肉内投与により、又はインビボもしくはエクスビボのプロトコルのための許容さ れるその他の任意の投与プロトコルにより、全身に投与される。 本発明に従い、放射性同位体コンセントレーター遺伝子を含む産生細胞又はそ の他の発現培地が細胞に投与されると、代謝的協同作用、「バイスタンダー効果 」が生じる、即ち放射性同位体コンセントレーター遺伝子をコードする核酸配列 で形質導入されていない腫瘍細胞も、放射線療法が投与されたときに、選択的に 可視化されるか、又は殺される。¹³¹Ｉエネルギーは組織において粒子崩壊の地点から７mm移動することができ るため、本発明の方法は、強力なバイスタンダー効果を有しているべきである。 この事実は、¹³¹Ｉで放射性標識された抗腫瘍抗体を治療作用物質として使用す るための強力な支持的証拠として繰り返し観察されている。Divgi，C．R.，“St atus of Monoclonal Antibodies for Diagnosis and Therapy of Cancer”，Onc ology 10:939-953(1996)。バイスタンダーを殺すことは、遺伝子のデリバリーが 再発性病巣における腫瘍細胞の１００％を標的とする必要がないことを意味する ため、この新規なアプローチの重要なエレメントである。フェイズＩ又はＩＩ試 験で試験されている現在の遺伝子デリバリー法はヒトにおいてはかなり効率が悪 いため、これは重要である。ヒトにおける¹³¹Ｉの使用は、用量及びモニタリン グに関してよく特徴決定されている。５．６Ｇｂｑの¹³¹Ｉの投与は、通常、甲 状腺腫瘍に対する２５，０００ｃＧｙと同等の放射線量をもたらす。Hershman， J．M.，Blahd，W．H．& Gordon，H．E．in Cancer Treatment（ed．Haskell，C ．M.）743-752(W．B．Saunders，Philadelphia，1995)。 本発明に従い、遺伝子のデリバリーの方法は、標的組織における遺伝子のデリ バリー及び発現の複雑な問題を克服するために利用されなければならない。その 最も単純な実施態様において、本発明は、形質転換された細胞における放射性同 位体コンセントレーター遺伝子の発現を提供するポリヌクレオチド配列を含む。 好ましい実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、放射性同位体コンセント レーター・エレメントをコードする遺伝子及び遺伝子と機能的に連結したある種 の制御エレメントを含む発現構築物である。そのようなエレメントの一つは、遺 伝子と機能的に連結したとき、細胞における遺伝子の転写及び最終的な発現を提 供することができるプロモーターである。プロモーターは構成性であっても、又 は誘導性であってもよい。哺乳動物細胞において活性を有する複数のプロモータ ーが当分野において既知であり、適当なプロモーターの選択は、当業者により容 易に最適化され、本明細書において考慮されている手段である。いくつかの適当 なプロモーターが、Maniantis，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor P ress，1989に開示されている。好ましい実施態様において、プロモーターは、放 射性同位体コンセントレーター遺伝子の挿入のためのマルチプル・クローニン グ・サイトと機能的に連結した遺伝子のデリバリーのためのウイルス・ベクター 内に位置するウイルス・プロモーターである。発現構築物は、典型的には、放射 性同位体コンセントレーター遺伝子と機能的に連結した終結又はポリアデニル化 配列も含む。本発明の構築物は、さらに下記のベクター又は遺伝子導入ビヒクル に含まれていてもよい。 誘導性のプロモーターは、例えば特定のプロモーターが特定の細胞において活 性を有するか否かを同定するための診断的比濁スキャン（turbidoscan）におけ るプロモーターと同じプロモーターと機能的に連結した放射性同位体コンセント レーター遺伝子及び任意のその他の遺伝子の活性化における、プロモーターの活 性を可視化するためのラジオイメージングにおいて、本発明の方法と共に使用さ れうる。例えば、チロシン・ヒドロキシラーゼ・プロモーターは脳の一部にチロ シン・ヒドロキシラーゼ活性を制限するために用いられうる。これは、パーキン ソン病のための貴重な予後又は診断のための情報を提供しうる。 さらにもう一つの実施態様において、プロモーターは、形質転換された細胞の みならず形質転換された腫瘍細胞においても遺伝子の選択的な発現を提供するこ とができる腫瘍特異的プロモーターである。この実施態様において、本発明のポ リヌクレオチド配列は診断又は治療のため使用されうる。実施例７に開示された プロモーターのような腫瘍特異的プロモーターと機能的に連結したＮＩＳ遺伝子 又はその等価物による腫瘍細胞の形質転換は、ＮＩＳ遺伝子の制御された発現が 起こり¹²⁵Ｉが取り込まれる腫瘍をイメージングするために使用されうる。 このように、本発明のベクターは、細胞特異的プロモーター又は誘導性プロモ ーターにつながれ、放射性ヨウ素取り込みに基づくラジオイメージングと共に、 細胞の状態に関する極めて特異的な情報を与えることができる。 他の実験において成功が示されている２つの遺伝子のデリバリーの方法が、好 ましい。第一の方法は、レトロウイルス（ＲＶ）のデリバリーである(Moolten， F．L．“Tumor Chenosensitivity Conferred by Inserted Herpes Thymidine Ki nase Genes:Paradigm for a Prospective Cancer Control Strategy”，Cancer Res ．46:5276-5281(1986);Link，C．J.，Kolb，E．& Muldoon，R.，“Prelimina ry In Vitro Efficacy and Toxicities Studies of the Herpes Simplex Thymidine Kinase Gene System for the Treatment of Breast Cancer ”，Hybridoma 14:143-147(1995))。この遺伝子デリバリー法は、ＲＶベクター 産生細胞（ＶＰＣ）の直接的な埋め込みを用いてXandra Breakfieldのグループ により最初になされた研究に基づいている。Short，M．P.，et al.，“Gene Del ivery to Glioma Cells in Rat Brain by Grafting of a Retrovirus Packaging Cell Line”，J ．Neurosci．Res.，27:427-439(1990)。この遺伝子デリバリー 法を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔｋ）遺伝子を導入するた めに異種ＶＰＣの腹腔内注入を利用する、再発性卵巣癌患者のためのフェイズＩ 臨床試験が、本出願人らによって利用されている。Link，C．J.，Moorman，D.， Seregina，T.，Levy，J．P．& Schabold，K．J.，“A Phase I Trial of In Viv o Gene Therapy With the Herpes Simplex Thymidine Kinase/Ganciclovir Syst em for the Treatment of Refractory or Recurrent Ovarian Cancer”，Human Gene Ther. ，Vol.7，Inpress(1996)。したがって、本発明は、一つの実施態様に おいて、ＮＩＳのような放射性同位体コンセントレーター・タンパク質をコード する核酸配列を含む新規なレトロウイルス・ベクターを含む。 第二のより新規な遺伝子デリバリー法は、ＨＳＶ−１に基づくアンプリコン（ amplicon）系である。この遺伝子デリバリーのベクターは本明細書に記述されて いるように本出願人らによって開発された。３〜１０プラーク形成単位（ｐｆｕ ／ｍｌ）のＭＯＩの出願人らのｐＨＥベクターは、インビトロで腫瘍細胞の９５ ％超を形質導入することが見出されている。ＨＳＶベクターは、齧歯類腫瘍への インビボ高効率遺伝子導入も可能にする。Boviatsis，E．J．et al.，“Long-Te rm Survival of Rats Harboring Brain Neoplasms Treated With Ganciclovir a nd a Herpes Simplex Virus Vector That Retains an Intact Thymidine Kinase Gene”，Cancer Res.，54:5745-5751(1994)。これらの好ましい実験モデルにお いて、遺伝子導入は、この実験動物の数匹において完全な緩解及び長期生存を誘 導するために十分に効率的であった。 好ましい実施態様において、パッケージング細胞系は、Ｎａ⁺／Ｉ^-共輸送体遺 伝子を含む、前述のもののようなレトロウイルス・ベクターで形質導入される。 形質導入されたパッケージング細胞は、許容される薬学的担体中で、腫瘍の増殖 を阻害、予防、又は破壊するために有効な量で、インビボ又はエクスビボで腫瘍 に投与される。産生細胞を腫瘍に投与したとき、産生細胞はＮａ⁺／Ｉ^-共輸送体 をコードする遺伝子を含むウイルス粒子を生成する。そのようなウイルス粒子は 隣接する腫瘍細胞を形質導入する。 次に、ヒト又は動物の宿主生物に適当な対応する放射性同位体が与えられる。 Ｎａ⁺／Ｉ^-共輸送体遺伝子の場合、放射性同位体は¹³¹Ｉである。遺伝子が発現 すると、形質転換された細胞に放射性同位体が選択的に濃縮される。前述のよう に、「バイスタンダー効果」も起こるかもしれず、それにより形質導入されてい ない細胞も同様に殺されうる。 レトロウイルスを利用して直接インビボ療法を行うための本発明の方法は、標 的の腫瘍が、とりわけ肝臓、皮膚、骨、筋肉、膀胱、前立腺、腎臓、副腎、膵臓 、心臓、血管及び甲状腺組織などのような比較的分裂が少ない細胞からなる組織 にあるか、又はそれらに囲まれているとき、特に有用である。本発明のアプロー チは、クモ膜下、腹腔、及び胸膜腔に位置する腫瘍に対しても有用であるはずで ある。さらに、例えば肝臓のような、全部又は一部が失われても一般的に支障が ない臓器内の腫瘍は、本発明に係る療法の好ましい標的である。 本発明の方法のための腫瘍部位へのベクターの指向は、多数のプロトコルを介 して達成されうる。ベクターは機械的に標的部位に直接注入されうる。これは、 プラスミドＤＮＡ、レトロウイルス・ベクター(ＭＭＫＶ又はＨＩＶに基づく)、 単純ヘルペスウイルスベクター(アンプリコン又はほぼ完全なウイルスベクター) 、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、又はＤＮＡポリリジン 抗体複合体を用いて達成されうる。指向は、外来材料の選択的な取り込み（貪食 又はマクロファージ）によっても起こりうる。もう一つの方法は、ｅｐｏ受容体 のような分裂中の腫瘍細胞上のウイルス標的を含むか、又はウイルス・エンベロ ープに融合した抗体を使用する。既述のように、組織又は腫瘍に特異的なプロモ ーターも実施例７に開示されたように使用されうる。 産生細胞の直接注入は、特に複製能のあるレトロウイルスベクターが使用され るとき、体内でのウイルスの望ましくない繁殖を最少限に抑える。身体のほとん どの細胞は両性レトロウイルスベクターの受容体を発現しているため、腫瘍の局 所的な環境から脱出するベクター粒子は直ちに他の細胞に結合するはずである。 しかし、ほとんどの細胞が周期内になく、したがってベクターにより保持される 遺伝子を取り込まず、それが含む遺伝子を発現しない。このように、曝露の時点 で周期内にある可能性のある標的細胞の割合は小さく、正常組織に対する全身性 毒性効果は最少限に抑えられる。 本発明に従って処置されうる腫瘍は、悪性腫瘍及び非悪性腫瘍を含む。処置さ れうる悪性（原発性及び転移性を含む）腫瘍には、副腎腺、膀胱、骨、乳房、頸 部、内分秘腺(甲状腺、下垂体、及び膵臓を含む)、大腸、直腸、心臓、造血組織 、腎臓、肝臓、肺、筋肉、神経系、脳、眼、口腔、咽頭、喉頭、卵巣、陰茎、前 立腺、皮膚(黒色腫を含む)、睾丸、胸腺、及び子宮において発生するものが含ま れるが、これらに限定されない。そのような腫瘍の例には、アプドーマ(apudoma )、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心臓病、癌(例えば、 ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン・ピアス（Brown-Pearce ）癌、腺管癌、エールリッヒ（Ehrlich）腫瘍、上皮内癌、クレブス（Krebs）２ 癌、メルケル細胞癌、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭癌、硬癌、 細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮癌、及び移行上皮癌)、骨髄腫、黒色腫、 軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂 肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、 滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エ ナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形種、胸腺腫、栄養膜腫瘍、腺癌、腺 腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、半 陰陽性卵巣腫瘍、肝癌、汗腺腫、島細胞腫、ライディヒ細胞腫、乳頭腫、セルト ーリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫 、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣腫、節細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経 芽腫、感覚上皮腫、神経腺腫、神経腫、パラガングリオーマ、非クロム親和性傍 神経節腫、被角血管腫、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化血管腫 (angioma sclerosing)、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管 周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体 腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉 腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫( 例えば、ユーイング実験肉腫、カポージ肉腫、及び肥満細胞肉腫)、新生物及び その他のそのような細胞の腫瘍が含まれる。 遺伝子工学法 放射性同位体コンセントレーターをコードする核酸配列は腫瘍細胞に形質導入 を生じさせる適当な発現ビヒクル内に含まれる。ある一定の商品名のある発現ビ ヒクルが上述のように議論されているが、適当な遺伝子移入ビヒクルを本発明方 法により使用してもよい。本発明はまたこれらの新規な発現ビヒクルおよびそれ らの放射線治療における使用を含む。そのような発現ベクターは、真核性ベクタ ー、原核性ベクター（例えばバクテリアベクターのような）を含むが、これらに 限定されない。 一つの実施態様において、発現ベクターはウイルスベクターである。使用して もよいウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベ クター、およびアデノ関連ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。 好適な実施態様において、パッケージング細胞系に（その作用物質をコードす る核酸配列が発現する際に腫瘍細胞の阻害、防止または破壊をもたらす作用物質 または因子（factor）をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターで形質 導入してそのウィルスベクターを含むプロデューサー細胞系を形成する。このプ ロデューサー細胞をついで腫瘍に投与し、それによりプロデューサー細胞は、腫 瘍細胞を形質導入する能力を有するウイルス粒子を生成する。 好適な実施態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスまたはアデノ ウイルスベクターである。使用できるレトロウイルスベクターの例としては、モ ロニー（Moloney）ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、並びにラウス（R ous）肉腫ウイルス、ハーベイ（Harvey）肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、 ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよびヒト乳癌ウイルスのよう なレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。 レトロウイルスは、真核性細胞へのレトロウイルス媒介遺伝子移入を媒介する のに有用である。レトロウイルスベクターは、一般に、このウイルスの構造遺伝 子をコードする配列の大半を欠失させ問題としている遺伝子（群）で置換して構 築される。ほとんどの場合、構造遺伝子（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅ ｎｖ）は、レトロウイルスのバックボーンから当技術において既知の遺伝子工学 技術を用いて分離される。これは、適当な制限エンドヌクレアーゼ、またはある 場合にはＢａｌ ３１を用いた消化であって、パッケージングシグナルの適当な 部分を含有するフラグメントを生成するものを含む。 これらの新しい遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルスバックボー ンに導入されている。最も直截簡明な構築物は、レトロウイルスの構造遺伝子を 単一の遺伝子で置換し、ついでこれを長い末端反復配列（ＬＴＲ）内のウイルス 性調節配列の制御下に転写するものである。レトロウイルスベクターには標的細 胞内に２以上の遺伝子を導入することができるように構築されたものもある。通 常、そのようなベクターにおいては、一つの遺伝子がウイルスＬＴＲの調節制御 下にあり、第二の遺伝子はスプライスされたメッセージがオフの状態で発現され るか、または独自の内部プロモーターの調節下にある。 ウイルスバックボーンのウイルスの成分を最小限にする努力がなされているが 、大部分、パッケージング細胞内におけるベクターとパッケージング欠損性ヘル パーウイルスとの間の組み換えの機会を減らそうとするものである。パッケージ ング欠損性ヘルパーウイルスは、レトロウイルスの構造遺伝子を提供するのに必 要であるが、これらの構造遺伝子はベクター自体から欠失されている。 一つの実施態様において、レトロウイルスベクターは、Bender，et al.，J ．V irol. ，61:1639-1649(1987)に記載されている一連のベクターの一つであっても よく、これらは、Ｎ２ベクター（Armentano，et al.，J ．Virol.，61:1647-1650 ）(一連の欠失および置換を含み絶対最低限までベクター系とパッケージング系 との間のホモロジーを低下させてある)に基づいている。これらの変化もウイル スタンパク質が発現される可能性を低下させている。これらのベクターの最初の もの、ＬＮＬ−ＸＨＣでは、部位指向突然変異誘発によりｇａｇの天然ＡＴＣ出 発コドンがＴＡＧへ改変され、それにより、意図されていないタンパク質合成が その地点から開始することがないようにしている。 モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）において、５’から真性ｇａ ｇ開始点に、オープンリーディングフレームが存在し、これは他のグリコシル化 されたタンパク質（ｐＰｒ８０^gag）の発現を可能にする。モロニーネズミ肉腫 ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）は、この５’領域に改変（フレームシフトおよびグリ コシル化部位の喪失を含む）を有し、ｐＰｒ８０^gagのアミノ末端の発現可能性 を除去している。したがって、ベクターＬＮ１６を作出し、これをＬＮＬ−ＸＨ Ｃの改変されたＡＴＧとＭｏＭｕＳＶの５’部分との両方に導入した。ＬＮベク ターシリーズの５’構造は、このようにレトロウイルスのリーディングフレーム の発現およびそれにつづく遺伝的に形質導入された標的細胞内におけるウイルス 抗原の産生の可能性を排除している。パッケージング欠損性ヘルパーウイルスと の重複を低減させる最終的改変において、Millerは、ＬＮベクター内の３’ＬＴ Ｒ直前のｅｎｖの範囲外の配列を除去している(Miller，et al.，Biotechniques ，7:980-990，1989)。 いかなる遺伝子移入系もそれが遺伝子治療に適用されるために満たさなければ ならない至上の要請は安全性である。安全性はベクターゲノム構造と、感染性ベ クターの製造に用いられるパッケージング系との組み合わせに由来する。Miller ，et al.はレトロウイルス性構造タンパク質の発現用のｐＰＡＭ３プラスミド（ パッケージング欠損性ヘルパーゲノム）とＬＮベクターシリーズとの組み合わせ を開発してベクターパッケージング系（ここでは、組み換え野生型レトロウイル スの生成が最低限にまで低減されているが、これは、ベクターゲノムとパッケー ジング欠損性ヘルパーゲノムとの間におけるほとんどすべての部位の除去による ）（すなわち、ｐＰＡＭ３付きＬＮ）を作出した。 一つの実施態様において、レトロウイルスベクターは、ＬＮシリーズの（上述 し、かつさらにBender，et al．（１９８７）およびMiller，et al．（１９８９ ）に記載されているもののような）ベクターのモロニーネズミ白血病ウイルスで あってもよい。そのようなベクターは、マウス肉腫ウイルスに由来するパッケー ジングシグナルの一部と、突然変異したｇａｇ開始コドンとを有する。本明細書 で用いられる「突然変異した」という用語は、ｇａｇ開始コドンが欠失されまた は改変されてｇａｇタンパク質またはフラグメントまたはその先頭切断体（trun cations）が発現しないようにしたことを意味する。 もう一つの実施態様において、レトロウイルスベクターは、少なくとも４つの クローニングまたは制限酵素認識部位を含むものであってもよく、ここで、これ らの部位のうち少なくとも２つは、真核性遺伝子における平均出現頻度が１０， ０００塩基対において１回未満である。すなわち、この制限産物は、平均ＤＮＡ サイズが少なくとも１０，０００塩基対である。好ましいクローニング部位は、 ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩからなる群より選ばれる。好適 な実施態様において、レトロウイルスベクターは、これらのクローニング部位の それぞれを含む。 そのようなクローニング部位を含むレトロウイルスベクターを用いると、シャ トルクローニングベクターが提供されるが、これは少なくとも２つのクローニン グ部位を含み、これらのクローニング部位は、レトロウィルスベクター上に位置 する、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩからなる群より選ばれる 少なくとも２つのクローニング部位と適合性を有する。シャトルクローニングベ クターはまた少なくとも１つの所望の遺伝子を含み、この遺伝子は、シャトルク ローニングベクターからレトロウイルスベクターに移入することができる。 シャトルクローニングベクターは、基本的な「バックボーン」ベクターまたは フラグメント（クローニングまたは制限酵素認識部位を含む１種以上のリンカー が結合されている）から構築してもよい。クローニング部位に含まれているのは 上述の適合性または相補性クローニング部位である。シャトルベクターの制限部 位に対応する端部を有する遺伝子および／またはプロモーターを当技術において 既知の技法によりシャトルベクターに結合してもよい。 シャトルクローニングベクターを用いて真核性系においてＤＮＡ配列を増幅す ることができる。シャトルクローニングベクターは、真核性系、特にバクテリア において一般的に用いられているプラスミドから調製してもよい。したがって、 例えば、シャトルクローニングベクターはｐＢＲ３２２；ｐＵＣ１８；等のよう なプラスミドから導いてもよい。 ベクターは、１種以上のプロモーターを含む。使用できる適当なプロモーター としては、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメ ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター(Miller，et al.，Biotechniques， 7:(9):980-990(1989)に記載)、または任意の他のプロモーター（例えば、真核性 細胞性プロモーターのような細胞性プロモーターであって、限定されないが、ヒ ストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーターを含む）が挙げられが、 これらに限定されない。使用できる他のウイルスプロモーターとしては、アデノ ウイルスプロモーター、ＴＫプロモーターおよびＢ１９パルボウイルスが挙げら れるが、これらに限定されない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に組み 込まれている教示から当業者には明らかであろう。 ついでベクターを用いてパッケージング細胞系に形質導入してプロデューサー 細胞系を形成する。トランスフェクションすることができるパッケージング細胞 の例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９− １４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、Ｇ Ｐ＋ｅｎｖＡＭ１２およびＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これらに限定されない 。（その作用物質をコードする核酸配列が発現する際に腫瘍細胞の阻害、防止ま たは破壊をもたらす作用物質をコードする核酸配列を含有するベクターは、当技 術において知られている任意の手段によりパッケージング細胞を形質導入するこ とができる。そのような手段としては、電気穿孔、リポソームの使用およびCaPO₄ 沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。 ついでプロデューサー細胞をその後の放射線治療において腫瘍の成長を阻害、 防止または破壊するのに有効な量で腫瘍に対して直接にまたはそれに隣接して投 与する。一般に、プロデューサー細胞は、患者の耐えられる量で投与するが、で きるだけ多くのプロデューサー細胞を注入するのが望ましい。プロデューサー細 胞の正確な投与量は種々の因子によって決まり、これらの因子は、腫瘍のタイプ および腫瘍のサイズを含むが、これらに限定されない。 一般に、プロデューサー細胞は、腫瘍に直接にまたは隣接して注入により投与 する。プロデューサー細胞は、患者に投与するのに適した薬学的に許容しうる担 体と組み合わせて投与する。担体は例えば食塩溶液のような液状担体であっても よい。 腫瘍に対してプロデューサー細胞を投与すると、プロデューサー細胞は、ウイ ルス粒子を生成する。ウイルス粒子はついで周囲の腫瘍細胞を形質導入する。腫 瘍細胞および特に癌性腫瘍細胞は、一般に活発に複製している細胞であるので、 レトロウイルス粒子が腫瘍細胞内に組み込まれ、優先的にまたはもっぱらそこで 発現されるが、これは正常細胞とは対照的である。 好適な実施態様において、本発明は、ヒトおよびヒトに基づくパッケージング 細胞系に共通して感染するウイルスベクターを特徴とする。例えば、ヒトに共通 に感染するウイルス（例えばヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス） から導かれるベクターを使用することができるが、これらは活性α−ガラクトシ ルエンベロープを発現しない。 最も好適な実施態様において、ベクターは、単純ヘルペスウイルスプラスミド ベクターを含む。単純ヘルペスウイルスのタイプ−１（ＨＳＶ−１）が遺伝子治 療用の可能性のある有用な遺伝子伝達ベクター系であることが証明されている(G lorioso，J．C.，“Development of Herpes Simplex Virus Vectors for Gene T ransfer to the Central Nervous System．Gene Therapeutics:Methods and App lications of Direct Gene Transfer”，Jon A．Wolff，Editor，1994 Birkhaus er Boston，281-302;Kennedy，P.G.，“The Use of Herpes Simplex Virus Vect ors for Gene Therapy in Neuroiogical Diseases”，Q J Med，Nov．1993，86( 11):697-702;Latchman，D.S.，“Herpes Simplex Virus Vectors for Gene Ther apy”，Mol Biotechnol，Oct．1994，2(2):179-95)。 ＨＳＶ−１ベクターが筋肉（Huard，J.，“Herpes Simplex Virus Type 1 Vec tor Mediated Gene Transfer to Muscle”，Gene Therapy，1995，2，385-392; および脳（Kaplitt，M．G.，“Preproenkephalin Promoter Yields Region-Spec ific and Long-Term Expression in Adult Brain After Direct In Vivo Gene T ransfer Via a Defective Herpes Simplex Viral Vector”，Proc Natl Acad Sc i USA ，Sep 13，1994，91(19):8979-83）に対する遺伝子の移入に用いられてお り、かつネズミ脳腫瘍治療に用いられている(Boviatsis，E．J.，“Long-Term S urvival of Rats Harboring Brain Neoplasms Treated With Ganciclovir and a Herpes Simplex Virus Vector That Retains an Intact Thymidine Kinase Gen e”，Cancer Res，Nov 15，1994，54(22):5745-51;Mineta，T.，“Treatment of Malignant Gliomas Using Ganciclovir- Hypersensitive，Ribonucleotide Reductase-Deficient Herpes Simplex Viral Mutant"，Cancer Res，Aug 1，1994，54(15):3963-6)。 ヘルパーウイルス依存ミニウイルスベクターがより容易な操作およびより大き な挿入能力（140kb以下）のために開発されている(Geller，Al．“An Efficient Deletion Mutant Packaging System for Defective Herpes Simplex Virus Vec tors:Potential Applications to Human Gene Therapy and Neuronal Physiolog y”，Proc Natl Acad Sci USA，Nov 1990，87(22):8950-4;Frenkel，N.，“The Herpes Simplex Virus Amplicon:A Versatile Defective Virus Vector”，Gene Therapy ．1．Supplement 1 ，1994)。複製無能力ＨＳＶアンプリコンが当技術に おいて構築されており、その一例は、ｐＨＳＶｌａｃベクター（Geller et al，Science ，241，Sept．1988、参照としてり本明細書に組み込まれる）である。こ れらのＨＳＶアンプリコンは、ＨＳＶゲノムの大きな欠失を含み外来ＤＮＡ挿入 用のスペースを提供している。典型的には、それらはＨＳＶ−１パッケージング 部位、−１“ｏｒｉ Ｓ”複製部位とＩＥ ４／５プロモーター配列とを含む。こ れらのビリオンはヘルパーウイルスに増殖を依存している。 最初に、２つのタイプの突然変異体ヘルパーウイルスが開発されて組み換えを 最小限にしている。ここでは他の相補的ＨＳＶへルパーウイルス系も企図されて おり、当業者の範囲内のものである。開発されているそのような系の一つは、温 度感受性突然変異体である。ＨＳＶ温度感受性（ＴＳ）突然変異体はＴＳ突然変 異をＩＥ３遺伝子に持つものとして開発されている(Davison et al，1984，J ．G en．Virol .，65:859-863)。したがって、このウイルスはＩＥ表現型を持ち、Ｄ ＮＡを複製せず、細胞生理を有意に変更せず、かつ３７℃で子孫ウイルスを産生 しない。ウイルスは３７℃の許容温度で成長する。ＴＳ突然変異体は、しかしな がら野生型に復帰する傾向を有していた。 これに対して、第２のヘルパーウイルス系はＩＥ３遺伝子の大部分を単純に欠 失した欠失突然変異体である。これらは野生型に復帰しない。したがって、ヘル パーウイルスとして欠失突然変異体を用いてパッケージしたＨＳＶ−１ベクター は、本発明の最も好適なヘルパーウイルスである。例えば、Patterson et al.， 1990，J ．Gen．Virol.，71:1775-1783を参照のこと。他の複製無能力ヘルパー ウイルスを用いることができ、当業者には認識されるように、ＩＥ遺伝子または 他の遺伝子における突然変異であって、その結果複製無能力ヘルパーウイルス（ 適当な複製および発現機能を提供し、かつヘルパー細胞系およびベクターと調和 的に働く）を提供するものも本発明内のものとして企図されている。この工程の ために、ＩＥ３または複製依存遺伝子を発現する能力を有する限り、またはすで に形質転換され市販されているヘルパー細胞系を得ることができる限り、任意の 細胞系を使用することができる。ｐＨＥとＩＥ３遺伝子を含有するプラスミドと を同時に導入することにより任意の細胞系を用いることができる。次に、ベクタ ーがヘルパー細胞系に到達するが、これは電気穿孔、リン酸カルシウムＤＮＡト ランスフェクションまたは他の適当な方法により行われる。ｐＨＥとＩＥ３遺伝 子を含有するプラスミドとを同時に導入することにより任意の細胞系を用いるこ とができる。細胞は次にヘルパーウイルスＩＥ３欠失突然変異体または他の相当 する欠失突然変異体（複製無能力である）を用いて感染させる。ＩＥ３遺伝子ま たはヘルパー細胞系内の他のそのような遺伝子がヘルパーウイルスを補完して生 産的ＨＳＶ−１感染を生じ、得られたウイルスストックはベクターＤＮＡまたは ヘルパーウイルスＤＮＡのいずれかを含有するＨＳＶ−１粒子からなり、それら のすべてが複製無能力である。ヘルパー細胞系および方法論に関するさらなる情 報はGeller et al.，PNAS，87:8950-8954，November 1990，“An Efficient Del etion Mutant Packaging System for Defective Herpes Simplex Virus Vectors :Potential Applications to Human Gene Therapy and Neuronal Physiology” に開示されている。本発明は、ＨＳＶミニベクターを含み、これは複製無能力Ｈ ＳＶアンプリコンを、エプスタイン・バーウイルス、ヒトパピローマウイルスま たはウシパピローマウイルスのタイプ１のような、ベクターを細胞内にエピソー ム形態に維持することができる他のウイルス性配列と結合し、１０倍の力価達成 および非常に大きなＤＮＡ挿入能力を達成している。 本発明の一つの実施態様は、ヘルパーウイルス依存ミニウイルスベクターに関 し、このベクターは、(a)パッケージ／分裂シグナル用のＨＳＶ−１“ａ”配列 およびプラスミドの（ヘルパーウイルスからの複製およびパッケージシグナルに 応答する）複製パッケージング用“ori Ｓ”複製起点；(ｂ)エプスタイン・バー ウ イルス（ＥＢＶ）核抗原（ＥＢＮＡ−１）遺伝子およびＥＢＶ潜伏複製起点（ｏ ｒｉ Ｐ）にれらはベクターが、ホストゲノムに対する組み込みなしの複製のた めに、かつ２つの分裂細胞のそれぞれに対する均等な複製のために、核内にエピ ソーム形態で維持されることを可能にする)；好ましくは、（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ におけるベクターの増殖用の真核性細胞からの遺伝子（アンピシリン耐性または テトラサイクリン耐性遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子およびｃｏｌ． Ｅ１ ｏｒｉ）および（ｄ）ＮＩＳのようなラジオアイソトープコンセントレー タータンパク質をコードする配列を含む。場合によっては、ベクターは、第二の 選択可能なマーカー、例えばハイグロマイシン選択陽性遺伝子を用意する原核遺 伝子を含んでもよい。 この特定の実施態様において、ミニベクターＤＮＡの単純ヘルペスウイルスキ ャプシドへのパッケージング機能が、ヘルパーウイルスおよびヘルパー細胞系に より提供される。 またもう一つの実施態様において、Mann et al.，“Construction of a Retro -Virus Packaging Mutant and its Use to Produce Helper-Free Defective Ret rovirus”，33 Sal.，p．153-159，May 1983，Journal of Virology,September 1989,pp.3822-3829,September 1989;Samulski“Helper Free Stocks of Recombi nant Adeno-Associated Viruses:Normal Integration Does Not Require viral Gene Expression”;and Kohn et al.，“High Efficiency Gene Transfer Into Mammalian Cells:Generation of Helper-Free Recombinant Retrovirus With Br oad Mammalian Host Range”，PNAS，81:6349-6353，October 1984に記載されて いるように、ＨＳＶベクターを操作してヘルパーのないウイルスベクターを生成 することができる。Ｏｋａｓｉｎｋｉ米国特許第４，９７０，１５５号「ＨＳＶ ヘルパーウイルス無依存ベクター」も参照(参照として本明細書に組み込まれる) 。 本明細書に引用されているすべての引用文献は、これにより全体を明示的に組 み込まれる。次に、以下の実施例について、本発明を説明する；しかしながら、 本発明の範囲はそれにより限定されることを意図するものではない。 実施例１ レトロウイルス形質導入 放射線療法後、局所に再発し、かつ化学療法では難治性の乳癌は、困難な臨床 上の努力目標を提示している。患者は、しばしば治療をやめたくなるような毒性 に曝露されることなくさらなる外部照射放射線療法を耐えることができない。同 様に、さらなる化学療法は、顕著な毒性を示すが大きな利益を与えないことがあ り、特に複合モダリティー療法ではそうである。この環境では、理想的な治療は これらの顕著な病変の実質的なまたは生命を脅かすような副作用のない、よりよ い一時抑えのためのより局所的かつ有効な治療を提供することであろう。この目 的に向けて、多数の研究室が標的とされる遺伝子移入（Han，X.，Kasahara，N． & Kan，Y．W.，“Ligand-Directed Retroviral Targeting of Human Breast Can cer Cells”，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，92:9747-9751(1995)またはプロ モーター特異性（Harris，J．D.，Gutierrez，A．A.，Hurst，H．C.，Sikora，K ．& Lemoine，N．R.，“Gene Therapy for Cancer Using Tumor-Specific Prodr ug Activation”，Gene Ther.，1:170-175(1994)）に基づく分子的アプローチを 研究している。これらの実験は、開発の初期段階にあるが、若干の見込みを示し ている。我々の提案は、腫瘍を殺す放射線をよく絞り込まれた領域内に集中させ る方法に関する新しい考えに焦点を置いている。正常な甲状腺濾胞細胞のヨウ化 物取り込みを模倣させる遺伝子を乳癌細胞に移入する。我々のプロジェクトでは 、甲状腺ヨウ化物輸送体遺伝子の伝統的レトロウイルス（ＲＶ）ベクターのデリ バリーを我々の新規な単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターのデリバリーと 比較する。 インビトロでの機能的甲状腺の共輸送体遺伝子の乳癌細胞への有効な移入のた めのレトロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクター 甲状腺ヨウ化物輸送体遺伝子のクローニングおよびＬＸＳＮレトロウイルスベ クター内へのサブクローニング。ラットＦＲＴＬ−５甲状腺由来細胞系をＲＮＡ 源として用い、Ｒｎｅａｓｙキット（Qiagen）を用いて精製して甲状腺ヨウ化物 輸送体遺伝子をDai et al.（既出）に記載のとおり単離した。ついでＲＮＡをＲ Ｔ−ＰＣＲ法により処理してｃＤＮＡ（CLONETECH）を生成した。ついでこれら をＰＣＲ反応のテンプレートとして用いて輸送体を増幅した。ＰＣＲ増幅のプ ライマーは、報告された配列の＃９０位置で始まる５’３１量体および＃１９５ ０位置で始まる３’３１量体であった。これらのプライマーを用いたＰＣＲ増幅 は遺伝子の５’末端にＫｐｎＩ部位を、３’末端にＸｈｏＩ部位を付加した。適 当なサイズ（１．８kb）のＤＮＡフラグメントを得、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで 制限消化し、ｐＲＥＰ７（Invitrogen）の適当な部位にクローニングした。続い てクローンの一つの配列分析を行い、公表された報告（既出）と同等の配列であ ることが判明した。 ついでＮＩＳ遺伝子を、マルチークローニング部位とＳＶ４０プロモーターの 制御下のｎｅｏ^r遺伝子とを含有するＬＸＳＮレトロウイルスバックボーン内に クローニングした（Link C．J.，Kolb E，Muldoon R.，“Preliminary in vitro efficacy and toxicities studies of the herpes simplex thymidine kinase gene system for the treatment of breast cancer”，Hybrldoma，1995，14:14 3-147;Link CJ et al.，“A phase I trial of in vitro gene therapy with th e Herpes simplex thymidine kinase/ganciclovir system for the treatment o f refractory or recurrent ovarian cancer”，Human Gene Ther，1996，7:116 1-1179)。ベクターはまた複製能力レトロウイルスの発生を最低限にする修飾を 含む(Miller，A．D．& Buttimore，C.，“Redesign of Retrovius Packaging Ce ll Lines to Avoid Recombination Leading to Helper Virus Production”，Mo lec ．Cell Biol ，6:2895-2902(1986))。ベクターは他の所でよく記載されており 、本発明者は先にＬＸＳＮを、インビトロ移入およびＨＳ−ｔｋ遺伝子およびガ ンシクロビア（ganciclovir）アプローチを用いる乳癌細胞の殺傷のために用い た(Link C.J.，Kolb E，Muldoon R.，“Preliminary in vitro efficacy and to xicities of the herpes simplex thymidine kinase gene system for the trea tment of breast cancer”，Hybridoma，1995，14:143-147)。得られたベクター をＬＮＩＳＮと命名した。 ＮＩＳ活性のインビトロ分析。先に公表されたWeiss et al.によるプロトコル を用いてＬＮＩＳＮベクター形質導入ＥＭＴ−６乳癌細胞への¹²⁵Ｉ取り込みを 決定した(Welss，S．J.，Philp，N.J．& Groliman，E．F.，“Iodide Transport in a Continuous Line of Cultured Cells From Rat Thyroid”，End ocrinology ，114:1090-1098(1984))。簡潔に言うと、ヨウ化物取り込みを０．３ ４５−．３４５μM担体を含まないＮａＩ¹²⁵および５−３００μM ＮａＩ ５０ ０μlを添加することにより開始した。１２０分以下のインキュベーション反応 後、細胞を氷冷ハンクスの平衡塩類溶液[Hank's Balanced Salt Solution（ＨＢ ＳＳ）］ｐＨ７．３で洗浄することにより反応を停止した。１％トリトンX−100 を添加し、サンプルをシンチレーションカウンターでカウントした。このアッセ イを評価するために、我々は、はじめにＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞への¹²⁵ Ｉ取り込みを分析した。これらの結果は、図１に示されており、急速かつ有効な¹²⁵ Ｉの取り込み証明している。対照細胞を氷上でインキュベートして共輸送体 機能をブロックした結果、¹²⁵Ｉの取り込みを示さない。ベクターなしの細胞と あらかじめＬＮＩＳＮベクター上清を形質導入しＧ４１８中で１４日間選択した 細胞とを直接比較した。ＮＩＳ形質導入腫瘍細胞における細胞内¹²⁵Ｉ濃度を非 形質導入（陰性対照）細胞と比較すると、ＮＩＳ遺伝子機能の直接的証拠を示し ている。このレベルの濃度は、正常なインビボ甲状腺組織で得られたものに匹敵 する。さらに、この取り込みは、急速かつ持続的である(図１および２(ａ−d)) 。被験細胞の細胞内¹²⁵Ｉ濃度を陰性対照細胞と比較すると、ＮＩＳ遺伝子機能 の直接的証拠が提供される。ＮＩＳ ＲＮＡ転写物のアフリカツメガエルの卵母 細胞への直接注入の結果、細胞内ヨウ化物濃度の３０倍を越える上昇が生じた。 このレベルの濃度は、正常なインビボ甲状腺組織で得られるものに匹敵する。 ＮＩＳ遺伝子のレトロウイルス形質導入をして腫瘍細胞を¹³¹Ｉに対して選択 的に放射線感作する。ＬＮＩＳＮベクターを用いてヒト腫瘍細胞系を形質導入し た後、インビトロのクローン産性アッセイのために¹³¹Ｉでインキュベーション してこのアプローチの効力を決定した。簡潔に言うと、３０μCi/mlのＮａＩ¹³¹ および30μM ＮａＩを添加することによりヨウ化物取り込みを開始した。ＬＮＩ ＳＮ形質導入腫瘍細胞のベクターを含まない（ＮＩＳ遺伝子でない）細胞に対す る生存率を比較した。細胞を６時間¹³¹Ｉ含有溶液に曝露した(図３)。次に、細 胞をトリプシン消化し、ついでプレート当たり１．２５×１０²と１×１０⁴ の間の細胞数で各データポイントに対して４重で播いた。７〜１０日後、細胞を 固定し染色した。≦５０細胞を含む巨視的コロニーをカウントした。生存率測定 をプレーティング効率に対して校正した。結果を図３〜５に示す。これらの結果 は、ＮＩＳ遺伝子を発現するように操作された細胞の選択的放射線殺傷を対照細 胞と比較して示す。これらの初期条件下で、対照細胞の若干の殺傷が起きるが、 より大きな殺傷効果は一貫してＮＩＳ発現細胞で観察される。これらの結果は、 ＮＩＳ遺伝子が¹²⁵Ｉ取り込み実験により予言されているとおり機能しているこ とを示している。図からわかるように、殺傷は、ＮＩＳ遺伝子で形質導入された ものである、Ａ３７５、ＢＮＬ．１ＭＥ、ＣＴ２６およびＩＧＲＯＶ細胞で観察 された(図４および５)。 ベクター産生細胞を用いたインビボ遺伝子デリバリー。レトロウイルスＶＰＣの インプラントを第一の方法として用いてＮＩＳ遺伝子を腫瘍細胞の標的内に到達 させた。ＶＰＣをインプラントして腫瘍細胞内に有効に遺伝子を到達させること は最初に脳腫瘍モデルで、ｌａｃＺ ＶＰＣを、Ｃ６グリオーマ腫瘍（神経膠腫 ）を持つ醤歯類に植え付けることにより実証された。染色するとグリオーマへの 効率的な遺伝子移入が実証された(Short MP et al.，“Gene delivery to gliom a cells in rat brain by grafting of a retrovirus packaging cell line”，J Neurosci Res ，1990;27:427-439)。単純ヘルペスタイプＩチミジンキナーゼ（ Ｈｓｔｋ）ＶｐＣ移植における抗腫瘍効果がいくつかのインビボ腫瘍モデルで評 価されている。９Ｌグリオサルコーマ（膠肉腫）のラット脳内での成長はヒトグ リオブラストーマ（膠芽腫）多形性モデルとして用いられている(Culver KW et al.，“In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for t reatment of experimental brain tumors”，Science，1992;256:1550-1552)。 より最近の研究は、部分的にこの９Ｌ腫瘍のＨｓｔｋ ＶＰＣによる破壊がイン ビボ免疫系により媒介されており、腫瘍退行のために薬剤選択を必要としないこ とを示唆している(Trapscott SJ et al.，“Gene therapy of rat 9L gliosarco ma tumors by transduction with selectable genes does not require drug se lection”，Proc Natl Acad Sci ，USA，1994; 91:8185-8189)。他のグループはＣ６グリオーマ細胞を用いてラット脳腫瘍モデ ルにおける抗腫瘍効力も実証しているが、複製能力ヘルパーウイルスを添加して いる(Takamiya Y et al.，“An experimental model of retrovirus gene thera py for malignant brain tumors”，J Neurosurg，1993;79:104-110)。Ｈｓｔｋ 型の抗腫瘍効力に対する証拠もラットの結腸直腸の肝への転移モデルで実証され ている(Caruso M et al.，“Regression of established macroscopic liver me tastases after in situ transduction of suicide gene”，Proc Natl Acad Sc i （USA） 1993;90:7024-7028)。このモデルでは、ＢＤＩＸラットに肝カプセル下 で同系の結腸癌腫（colon carcinoma）細胞系を注入した。ＧＣＶ治療の終点に おける屍検で動物のほぼ３分の１が病理学的に腫瘍がないことが判明した。以下 の２つの実験はＶＰＣのインプラントの実現可能性を示している。ＭＣ３８腹膜 内結腸腺癌に対するＬＴＫＯＳＮ ＶＰＣの抗腫瘍効力。Ｃ５７Ｂ１／６マウス にＭＣ３８結腸腺癌の腹膜内接種物（S．Rosenberg，ＮＣＩの好意により提供さ れた）を注入した。臨床的試行に対して最も有効なＬＴＫＯＳＮクローンを決定 する試みで実験を行った(表１)。ベクターＬＴＫＯＳＮは、ウイルスの長い末端 反復配列（ＬＴＲ）から転写されたＨｓｔｋ遺伝子と、内部ＳＶ４０（サルウイ ルス４０）の初期プロモーターから転写されたバクテリアのネオマイシン耐性（ ｎｅｏ^r）遺伝子とをＬＸＳＮバックボーン中に含有する(ＬＴＲ−ＨＳｔｋ−Ｓ Ｖ−ｎｅｏ^r−ＬＴＲ)。動物は１日目に、２×１０⁴ＭＣ３８腫瘍細胞をハンク スの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）１mlに懸濁した注入液を動物の腹膜に投与した。 ６日目に、ＨＢＳＳ １mlに懸濁した処理細胞を動物に投与した。５日後、動物 をＧＣＶの14日間コースで処置した。すべての錐体が腫瘍単独を注入した動物と 比べてある程度の活性を示した。しかしながら、ＬＴＫＯＳＮ.２（クローン２ ）は、クローン９、１０または１２よりも良い活性を示した。生存動物では毒性 の証拠は観察されなかった。実験中に死亡した動物は、進行性腹膜内癌腫症によ り引き起こされた死が原因であった。この実験は、腹膜内腺癌腫をＬＴＫＯＳＮ .２ ＶＰＣの注入とその後のＧＣＶ治療とによる治療の効力を立証する。 表１ 腹膜内ＭＣ３８結腸腺癌腫に対するＬＴＫＯＳＮ ＶＰＣクローンの効能 ＭＣ３８腹膜内腺癌腫へのＬＴＫＯＳＮ.２ ＶＰＣのインビボ形質導入効力の評 価。Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、２×１０⁴ＭＣ３８結腸腺癌腫細胞をＨＢＳＳ Ｉ Ｐに懸濁した注入液を腹膜内への注入により播種した(１日目)。７日目に、動物 に、１×１０⁷ ＬＴＫＯＳＮ.２ ＶＰＣ細胞をＨＢＳＳ１mlに懸濁したものを 投与した。２７日目にマウスを屠殺した。腫瘍を消化し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢ Ｓ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾン（fungizone）ととも に培養内においた。培養から回収された細胞は、ＭＣ３８の形態をしていた。Ｖ ＰＣはこれらのマウスにおいて１４日後に検出されなかった。２日後、細胞をク ローン産性アッセイに用いてインビボでＬＴＫＯＳＮ.２ベクターにより形質導 入されているＭＣ３８細胞の百分率を決定した。ＭＣ３８ＮＶ細胞（陰性対照） およびＬＴＫＯＳＮ/２ ＶＰＣ処置マウスからのＭＣ３８細胞を三重に組織培養 皿内に選択された密度で接種した。次の日、Ｇ４１８ １mg/mlを各セットの３〜 ６枚の皿に添加した。９日後、細胞をメタノール：酢酸で固定し、クリスタルバ イオレットで染色した。３つの別個のクローン産性アッセイを２匹の動物から組 み立てた(表２)。５０細胞を越えるすべてのコロニーをカウントし、割合を計算 した：耐性率（％）＝Ｇ４１８耐性コロニー／全コロニー(薬剤非存在下)。これ らの結果はＬＴＫ）ＳＮ.２ ＶＰＣによるインビボ形質導入を実証している。こ れらの細胞の４７％だけが形質導入されるが、動物の５０％は無腫瘍のままであ る（表１および２)。これらの実験は効率的な腹膜内遺伝子デリバリー に対するこのアプローチの有用性を証明している。 表２ 腹腔内ＭＣ３８腺癌腫へのインビボＬＴＫＯＳＮ.２ ＶＰＣ形質導入頻度 実施例２ 単純ヘルペスウイルスのベクターを用いた抗腫瘍治療。ＨＳＶ−系ベクターの２ つの広いカテゴリーの一つはアンプリコンである(Spaete RR et al.，“The her pes simplex virus amplicon:A new eucaryotic defective-virus cloning-ampl ifying vector”，Cell，1982;30:295-304)。ＨＳＶ−１溶菌複製起点（ｏｒｉ Ｓ）およびＨＳＶ−１末端パッケージングシグナル配列を持つプラスミドをヘ ルパーウイルスの存在下、感染性ＨＳＶ−１ビリオン内に増幅およびパッケージ ングすることができる(Spaete RR et al.，“The herpes simplex virus amplic on:A new eucaryotic defective-virus cloning-amplifying vector”，Cell，1 982;30:295-304;Kwong AD et al，“Herpes simplex virus amplicon:Effect of size on replication of constructed defective genomes containing eukaryo tic DNA sequences”，J Virol，1984;51:595-603;Geller AI et al，“A defec tive HSV-1 vector expresses Escherichia coli β-galactosidase in culture d peripheral neurons”，Science，1988;241:1667-1669;Geller AI et al，“I nfection of cultured central nervous system neurons with a defective her pes simplex virus 1 vector results in stable expression of Escherichia c oli beta-galactosidase”，Proc Natl Acad Sci USA ，1990；87:1149-1153)。このプラスミド系はより容易なクローニングを可能 にし、シャトルベクターとして原核性細胞と真核性細胞との間でゲノム情報を運 ぶ(Kwong AD et al.，“The Herpes simplex virus amplicon．Efficient expre ssion of a chimeric chicken ovalbumin gene amplified within defective vi rus genomes”，Virology，1985;142:421-425)。このアンプリコン系はＨＳＶ− １ベクターのメリットを保持するが、ウイルスストックは力価が低下しやすく、 産生は時間がかかる(Spaete RR et al.，“The herpes simplex virus amplicon : A new eucaryotic defective-virus cloning-amplifyingvector”，Cell，198 2;30:295-304)。先に報告されたアンプリコン系は大きいサイズのＤＮＡフラグ メント（＞１５ｋｂ）を効率的にパッケージングおよび維持することができた(K wong AD et al.，“Herpes simplex virus amplicon:Effect of size on replic ation of constructed defective genomes containing eukaryotic DNA sequenc es”，J Virol，1984;51:595-603)。ＨｓＶベクターはインビボで効率的な遺伝 子移入を実証している(Palella TD et al.，“Expression of human HPRT mRNA in brains of mice infected with a recombinant herpes simplex type １ vec tor”，Gene，1989;80:137-144;Chiocca EA et al.，“Transfer and expressio n of the lacZ gene in rat brain neurons by herpes simplex virus mutants ”，New Biol，1990;2:739-746;Anderson JK et al，“Gene Transfer into mam malian central nervous system using herpes virus vectors:extended expres sion of bacterial lacZ gene in neurons using the neuron-specific enolase promoter”，Human Gene Ther，1992;3:487-499;Ho D et al.，“Altering cen tral nervous system physiology with a defective herpes simplex virus vec tor expressing the glucose transporter gene”，Proc Natl Acad Sci USA，1 993;90:3655-3659;During MJ et al.，“Long-term behavioral recovery in Pa rkinsonian rats by an ＨＳＶ vector expressing tyrosine hydroxylase”，S cience ，1994;266:1399-1403;Glorioso JC et al.，“Development and applica tion of herpes simplex virus vectors forhuman gene therapy”，Annu Rev M icrobiol ，1995;49:675-710)。いくつかのグループがＨＳＶベクターを抗癌治 療薬として開発している。修飾されたＨＳＶウイルスおよびベクターの細胞病理 学上の効果を腫瘍細胞に対して優れた利点をもつように用いることができる。Ma rtuzaおよび共同研究者ははじめてチミジンキナーゼ（Ｈｓｔｋ）陰性ＨＳＶを 用いてヌードマウスにおいてヒトグリオーマを治療した(Martuza RL et al.，“ Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineere d virus mutant”，Science，1991;252:854-856)。わずか１０⁵ｐｆｕの欠損性 ウイルスで処置された数匹のマウスは生存期間が長かった。これらの当初の修飾 されたＨＳＶベクターは複製能力を有していた。感染の問題（特にウイルス性脳 炎）のため、他のグループは、リボヌクレオチドレダクターゼ転写因子ＩＣＰ４ またはＩＣＰ０、_γI３４．５遺伝子のような他の遺伝子を欠損しているＨＳＶ ベクターを開発した(Boviatsis EJ et al.，“Antitumor activity and reporte r gene transfer into rat brain neoplasms inoculated with herpes simplex virus vectors defective in thymidine kinase or ribonucleotide reductase ”，Gene Ther，1994;1:323-331;Takamiya Y et al.，“Gene therapy of malig nant brain tumors:a rat glioma line bearing the herpes simplex virus typ e 1-thymidine kinase gene and wild type retrovirus kills other tumorcell s”，J Neurosci Res，1992;33:493-503;Mineta T et al.，“Treatment of mal ignant gliomas using ganciclovir-hypersensitive，ribonucleotide reductas e-deficient herpes simplex viral mutant”，Cancer Res, 1994;54:3963-3966 ;Chambers R et al.，“Comparison of genetically engineered herpes simple x viruses for the treatment of brain tumors in a scid mouse model of hum an malignant glioma”，Proc Natl Acad Sci USA，1995；92:1411-1415)。無傷 のＨｓｔｋ遺伝子を含む欠損性ＨＳＶにＧＣＶ処理を加えても腫瘍殺傷が増加す る(Bovlatsis EJ et al.，“Long-term survival of rats harboring brain neo plasms treated with ganciclovir and a herpes simplex virus vector that r etains an intact thymidine kinase gene”，Cancer Res，1994;54:5745-5751) 。最近、複数の特定遺伝子欠失を持つＨＳＶ突然変異体の治療指数の向上に努力 が集中している(Glorioso JC et al.，“Development and application of herpes simplex virus vectors for human genetherapy”，Ann u Rev Microbiol ，1995;49:675-710;Mineta T et al.，“Attenuated multi-mut ated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas”，Na t Med ，1995;1:938-943)。これらのデータは我々のＨＳＶアンプリコンベクター がＮＩＳ遺伝子をインビボで腫瘍に移入するのに有用であることを示唆している 。 ｐＨＥ７００単純ヘルペスアンプリコンベクターを用いる遺伝子デリバリー。Ｈ ＳＶ−１溶菌複製起点（ｏｒｉ Ｓ）およびＨＳＶ−１末端パッケージングシグ ナル配列を持つプラスミドを、トランス作用ヘルパーウイルスの存在下、感染性 ＨＳＶ−１ビリオン内に増幅およびパッケージングすることができる(Spaete RR et al.，“The herpes simplex virus amplicon:A new eucaryotic defective- virus cloning-amplifying vector”，Cell，1982;30:295-304;Kwong AD et al ，“Herpes simplex virus amplicon:Effect of size on replication of const ructed defective genomes containing eukaryotic DNA sequences”，J Virol ，1984;51:595-603;Geller AI et al，“A defective HSV-1 vector expresses Escherichia coli β-galactosidase in cultured peripheral neurons”，Scie nce ，1988;241:1667-1669;Geller AI et al，“Infection of cultured central nervous system neurons with a defective herpes simplex virus １ vector results in stable expression of Escherichia coli beta-galactosidase”，P roc Natl Acad Sci USA ，1990;87:1149-1153)。我々の新規なアンプリコンベク ター、ｐＨＥ、はＨＳＶ−１ ｏｒｉ Ｓおよびベクター複製およびＨＳＶ−１ ビリオンへのパッケージングが可能なパッケージング配列を含む。我々はエプス タイン・バーウイルス（ＥＢＶ）配列をも含むＨＳＶアンプリコンを構築してこ のプラスミドをエピソームとしてトランスフェクションした細胞核内に維持した (Westphal EM et al.，“Anovel infectmini-ＨＳＶ for high efficiency gene transfer into human cancer cells”，Cancer Gene Ther，1995;2:324)。ＥＢ Ｖは、細胞において溶菌サイクルに入らずに、ウイルスの自己複製および維持を 指向する独特な 潜伏複製起点（ｏｒｉ Ｐ）を含むことが実証されている(Yates JL et al.，“ Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in variou s mammalian cells”)，Nature，1985;313;812-815;Reisman D et al.，“A put ative origin of replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus is composed of two cis-acting components”，Mol Cell Biol，1985;5:1822-1 832)。エプスタイン・バーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ−１）は、ｏｒｉ Ｐに 対するトランスアクチベーターを結合するＤＮＡをコードしている(Yates JL et al.，“Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus i n various manmmalian cells”，Nature，1985;313;812-815;Reisman D et al. ，“A putative origin of replication of plasmids derived from Epstein-Ba rr virus is composed of two cis-acting components”，Mol Cell Biol，1985 ;5:1822-1832;Rawlins DR et al.，“Sequence-specific interactions of cell ular nuclear factor I and Epstein-Barr virus nuclear antigen with herpes virus DNAs”，Cancer Cells，1986;4:525-542;Goldsmith K et al.，“Identi fication of EBNA-1 amino acid sequences required for the interaction of the functional elements of the Epstein-Barr virus latent origin of DNA r eplication”，J Virol，1993;67:3418-3426)。研究者らは先に、ｏｒｉ Ｐを 含有しかつＥＢＮＡ−１遺伝子を発現するプラスミドベクターが真核性発現ベク ターよりも有効であることを実証した(Yates JL et al.，“Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells ”，Nature，1985;313;812-815)。種々のグループがそのようなＥＢＮＡ−１系 ベクターを、治療目的をもってヒト腫瘍において発現するために使用している(J udde JG et al.，“Use of Epstein-Barr virus nuclear antigen-1 in targete d therapy of EBV-associated neoplasia”，Human Gene Ther，1996;7:647-653 )。ＨＳＶアンプリコンとＥＢＶ配列を組み合わせるとＨＳＶアンプリコン系の 使用の容易さが改善される。我々の複製無能力ｐＨＥベクターは導入遺伝子を分 裂細胞および静止細胞の両方に到達する広い親和性を維持し、インビトロとイン ビボの両方で高効率である。この改良されたベクターは、高力価で製造すること ができ、ベクター を２１kbＤＮＡ挿入物でパッケージおよび担持することができよう。 エピソーム維持およびアンプリコンベクターパッケージング。ｐＨＥベクターの エピソームとしての維持は、ｐＨＥ７００−ｌａｃのＥ５細胞へのトランスフェ クションとハイグロマイシンを用いた選択により実証された。ｐＨＥ７００−ｌ ａｃベクターはｐＨＥ７００のマルチクローニング部位にクローンされたバクテ リアのＬａｃＺ遺伝子を含有する(図６)。薬剤選択の１６日目までにほとんどす べての細胞がβ−ガラクトシダーゼを発現した。ウイルスストックを発生するに は、これらの選択された、ｐＨＥ７００−ｌａｃを含有するＥ５細胞をｄ１２０ ヘルパーウイルス（N．DeLuca、ピッツバーグ大学の好意により提供された）で 感染させた。得られた上清はｐＨＥ７００−ｌａｃベクターとヘルパーウイルス の両方を含有している。添加されたヘルパーウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）は ０．０１〜０．１であり、２４〜３６時間以内にウイルスベクター産生を誘発し た。得られた平均力価は２×１０⁶ｂｆｕ/mlであり、ｐＨＥ７００−ｌａｃベク ター（ｂｆｕ）のｄ１２０ヘルパーウイルス（ｂｆｕ）に対する比は１：１０で あった。 インビトロにおけるｐＨＥ７００−ｌａｃベクターの形質導入および発現。ｐＨ Ｅ７００−ｌａｃ含有上清を用いてヒト標的細胞をインビトロで形質導入した。 β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を、ＶＡ１３正常繊維芽細胞を含む種々の培養 ヒト細胞）においてｐＨＥ７００−ｌａｃベクターで感染させた後評価した。す べての細胞を感染２日後に固定し、Ｘ−ｇａｌで染色した。発現を約２週間継続 したが、ピーク発現は形質導入後４８〜７２時間に起こった。 ラットおよびマウスにおけるｐＨＥ７００−ｌａｃベクターのインビボ発現。ｐ ＨＥ７００−ｌａｃベクターの中枢神経系への遺伝子のデリバリーに対するｐＨ Ｅ７００−ｌａｃベクターの効率を評価した。ラットの尾状核または海馬状突起 にｐＨＥ７００−ｌａｃウイルスベクター上清を注入した。ウイルスのストック （２×10⁵bfu）をラット脳内に片側に立体定位注入した。高いβ−ガラクトシ ダーゼ発現が尾状核内の注入部位の周囲に、および海馬への注入後、歯状脳回に おいて見られ、これは注入後48時間Ｘ−ｇａｌ染色することにより確認された。 これらの脳領域における遺伝子発現が注入後２〜１４日に検出され、最も顕著な のは２〜７日であった。我々はまたアンプリコンベクターの皮下Ａ３７５ヒトメ ラノーマ異種移植片の無胸腺症ヌードマウスへの有効な遺伝子移入を実証してい る(データは示されていない)。 ＨＳＶアンプリコンベクターの細胞傷害性。ｄ１２０ＨＳＶヘルパーウイルスは このＨＳＶアンプリコンベクターをパッケージするのに必要である(DeLukaNA et al.，“Isolation and characterization of deletion mutants of herpes sim plex virus type １ in the gene encoding immediate-early regulatory prote in ICP4”，J Virol，1985;56:558-570;DeLuca NA et al.，“Activities of he rpes simplex virus type １（ＨＳＶ−1)ICP4 genes specifying nonsense pep tides”，Nucleic Acids Res，1987;15;4491-4511)。ヘルパーウイルスｄ１２０ は、ＩＥ３遺伝子の両座位に欠失を有し、正常細胞におけるウイルスの複製を防 止しているが、ＩＥ３遺伝子を発現するＥ５ヘルパー細胞系においては複製が可 能である(DeLuka NA et al.，“Isolation and characterization of deletion mutants of herpes simplex virus type 1 in the gene encoding immediate-ea rly regulatory protein ICP4”，J Virol,1985;56:558-570;DeLuca NA et al. ，“Activities of herpes simplex virus type 1（HSV-1）ICP4 genes specify ing nonsense peptides”，Nucleic Acids Res，1987;15;4491-4511)。このヘル パーウイルスは、感染された正常細胞にインビトロで実質的な細胞傷害性を引き 起こす(データは示されていない)。残念なことに、ヘルパーウイルスからＨＳＶ アンプリコンベクターを分離しかつ依然として高アンプリコン力価を維持するた めに現在利用し得る公表された方法はない。この細胞傷害性の問題のために、我 々は、ソラレンおよびＵＶＡ光（ＰＵＶＡ）を使用してＨＳＶベクターの細胞傷 害性を低減するが、高度の遺伝子発現は維持する新規な方法を開発した(図７)。 ソラレンは多環式の平板状分子であって共有結合性シクロブタン型リンケージを 形成している(Hanson CV et al.， “Photochemical inactivation of DNA and RNA viruses by psoralen derivati ves”，J Gen Virol，1978;40:345-358)。ソラレンおよびUVAを用いる架橋法を 適用する従前の研究は、ＤＮＡ複製およびウイルス遺伝子発現をブロックするこ とによりウイルスを完全に不活化してウイルスを不活化した(Hanson CV，“Phot ochemical inactivation of viruses with psoralens:an overview”，Blood Ce lls ，1992;18:7-25;Redfield DC et al.，“Psoralen inactivation of influen za and herpes simplex viruses of virus-infected cells”，Infect Immun, 1 981;32:1216-1226;Swanstrom R et al.，“Interaction of psoralen derivativ es with the RNA genome of Rous Sarcoma Virus”，Virology，1981;113:613-6 22;Alter HJ et al.，“Photochemical decontamination of blood components containing hepatitis B and Non-A，non-B virus”，Lancet，1988;2:1446-145 0;Lin L et al.，“Photochemical inactivation of cell-associated human in munodeficiency virus in platelet concentrates”，Blood，1993;82:292-297; Cotton M et al.，“Psoralen treatment of adenovirus particles eliminates virus replication and transcription while maintaining the endosomolytic activity of the virus capsid”，Virology，1994;205:254-261)。我々の実験 では、適当なＰＵＶＡ線量がベクター内でＤＮＡの架橋を誘発し、その結果ウイ ルスの複製および導入遺伝子発現の不活化に差が生じる。先にＰＵＶＡ処理する とＥ５ヘルパー細胞内のウイルス複製を阻害するが、一方レポーター遺伝子産物 の遺伝子発現は保持する。 遺伝子導入活性を維持しつつＨＳＶアンプリコンベクターの細胞傷害性の選択 的除去を評価するために、細胞のＤＮＡ合成をアッセイする細胞増殖を前述のと おり用いた(Link，CJ，et al.，“Preliminary in vitro efficacy and toxicit ies studies of the herpes simplex thymidine kinase gene system for the t reatment of breast cancer”，Hybridoma,1995;14:143-147)。Ｈｓｔｋ遺伝子 をｐＨＥベクターのマルチ−クローニング部位にＣＭＶプロモーターの制御下に 挿入することによりｐＨＥ−ｔｋベクターを生成した(図６)。Ｈｓｔｋを発現す る細胞はガンシクロビア(ＧＣＶ)をリン酸化して有毒の形に変え、 これが細胞死を誘発する(Moolten，FL，“Tumor chemosensitivity conferred b y inserted herpes thymidine kinase genes:Paradigm for a prospective canc er control strategy”，Cancer Res，1986;46:5276-5281)。試験は、ヘルパー ウイルスｄ１２０でパッケージしたｐＨＥ−ｔｋベクターを用いて形質導入した ＩＧＲＰＶ卵巣癌腫細胞で実施した。無処理ｐＨＥ−ｔｋベクターストックは細 胞増殖を顕著に減少させ、感染細胞に対するヘルパーウイルスおよびｐＨＥ−ｔ ｋベクターの細胞傷害効果を示している(図８)。しかしながら、ＰＵＶＡ処理ベ クターを感染させた細胞は実質的にそれらの増殖率を維持した(図８)。重要なの は、ＰＵＶＡ処理ｐＨＥ−ｔｋベクターからの細胞傷害性がベクターに曝露され なかった細胞のそれの近くまで低減されている一方で、我々はこのベクターが機 能的な導入遺伝子発現を保持していることを見いだした。ＧＣＶは、修飾された ベクターからの阻害効果がわずかしかない条件下では細胞増殖を低下させた。Ｐ ＵＶＡ処理ベクターにより形質導入した細胞に対するＧＣＶのこの抗増殖効果は Ｈｓｔｋの酵素機能を示している(図８)。このように、ＰＵＶＡ処理はベクター 媒介細胞傷害性を防止したが、Ｈｓｔｋ遺伝子の発現は許容した。我々の結果は 、ＴＭＰおよびＵＶＡ照射の組み合わせの結果、ＨＳＶベクターの不活化に差が 出ることを実証している。我々は、ストランド間のＤＮＡ架橋がウイルスＤＮＡ 複製をブロックし、ベクターゲノムの異なる領域を無作為に不活化すると仮定す る。架橋近傍に位置する遺伝子は不活化されているようであるが、遺伝子の発現 は異なる不活化領域を持つ他のベクターまたはアンプリコンベクターの他の転写 ユニットからの転写により補完され得る(図７)。したがって、架橋されたＤＮＡ は、測定し得る導入遺伝子の発現を保持する一方、いずれの単一ベクターの複製 も禁止する。このように、光化学的修飾はインビトロまたはインビボの両方で組 み替え野生型ウイルスの助けにより起こることのあるいかなる溶菌的ウイルス複 製も阻止する必要がある。これらのＰＵＶＡ処理ベクターは、ＮＩＳ遺伝子のよ うな治療用遺伝子を用いたインビボ抗腫瘍戦略の理想的候補である。 実施例３ レトロウイルスおよびヘルペスウイルスベクター遺伝子の卵巣癌細胞へのインビ トロでの移入および¹³¹Ｉ放射線治療による細胞の破壊増加の実証 レトロウイルスベクターを形質導入してＮＩＳ遺伝子を腫瘍スフェロイドへ移入 するインビトロの効力。我々の初期のデータは、ＮＩＳ形質導入メラノーマおよ び乳癌細胞における、¹³¹Ｉにより誘発される顕著な殺傷を示した。しかしなが ら、これらの結果はより大きなバイスタンダー殺傷効果が認められる条件下でよ く検討する方がよいかもしれない。このために、我々は軟質寒天中で成長したス フェロイド腫瘍を用いる(Courtenay VD et al.，“Growth of human tumorcell colonies from biopsies using two soft-agar techniques”，Br J Cancer，19 78;38:77-81;TveitKMetal.，“Colony-forming ability of human ovarian carc inomas in the Courtenay soft agar assay”，Anticancer Res，1989:9:1577-1 582)。この系での腫瘍塊の半径の増加は近傍の細胞にエネルギーの全体的蓄積が インビボの腫瘍細胞塊のそれと類似する方法で強化されることを可能にしている 。蓄積された¹³¹Ｉからの線量は細胞の密度、半径および¹³¹Ｉ崩壊からのβ線エ ネルギーの阻止能により影響を受ける。細胞から透過された（細胞により失われ た）蓄積されたヨウ化物からの内在化された線量の分率は下記式に簡略化するこ とができる： 透過分率＝ｅ^{- μt}；ここで、μ＝β線エネルギーの阻止能（３．００９m²/kg ）×細胞密度（kg/cm³）(約１．３×１０³kg/cm³)およびｔ＝細胞の半径（メー トル）である(Troulfanidis N（1995）“Measurement and detection of radiat ion”，Vol．2nd edition．Taylor and Francis，Washington，D．C.;（1992）T he health physics and radiological handbook．In:Schleien B(Ed).Scinta，I nc.，Silver Spring，MD)。半径の小さな変化が指数関数的に吸収線量に影響す る。例えば、半径８．０μｍの丸い細胞は、内在化された¹³¹Ｉからエネルギー の３．１％（理論最大線量）だけしか吸収しないが、半径５８０μmの細胞塊は 可能な線量の９０％を越える量を吸収する。この関係を図９に示す。したがって 、小さな腫瘍様細胞集合体は蓄積された¹³¹Ｉから単層の細胞よりも遙かに高い 線量を受け取ることになる。このモデル系はインビボの腫瘍の形状をより精密に 近似するので、卵巣癌に対するＮＩＳの遺伝子指向放射線治療について の効力をより精確に実証するものである。 我々は確立されたプロトコルを用いて我々の腫瘍細胞系の小さな細胞集合体を 軟質寒天中で（ＮＩＳを添加した場合および無添加の場合について）成長する(C ourtenay VD et al.，“Growth of human tumor cell colonies from biopsies using two soft-agar techniques”，Br J Cancer，1978;38:77-81;Tveit KM et al.，“Colony-forming ability of human ovarian carcinomas in the Courte nay soft agar assay”，Anticancer Res，1989;9:1577-1582)。直径０．５〜４ mmの個別の「スフェロイド」は、単層細胞用に前述した同様の条件下でそれぞれ¹³¹ Ｉに曝露する。効力は、暴露後のスフェロイドの成長を測定することにより 決定する。バイスタンダー効果を、種々のパーセンテージのＮＩＳ形質導入細胞 およびベクターなしの細胞を含む混合集団スフェロイドを用いて評価する。この プロジェクトの次の工程は、ＨＳＶアンプリコンベクターが機能的ＮＩＳ遺伝子 を培養内の腫瘍スフェロイドへの移入を試験することである。 緑色蛍光性タンパク質とＮＩＳ遺伝子との両方を含有するＨＳＶベクターのクロ ーニング。あらゆる遺伝子治療戦略を評価および開発する際の重要な部分は精確 に遺伝子移入効率を測定することである。このデータはインビボで導入遺伝子の 治療レベルを得るのに必要なベクター形質導入のレベルを決定するために必須で ある。クローニングするＨＳＶベクターの第二の部位は、Ｇ４１８薬剤選択可能 マーカー（ｎｅｏ^r）を含まない。我々のベクターは緑色蛍光性タンパク質（Ｇ ＦＰ）の変異体である。このコドン修飾ＧＦＰ遺伝子もセリン６５のスレオニン への突然変異を含み蛍光団活性が大幅に向上している(Chalfie M et al.，“Gre en Fluorescent Protein as a marker for gene expression”，Science，1994; 263:802-805;Heim R et al.，“Improved green fluorescence”，Nature，1995 ;373:663-664)。我々は最近コドン最適化、赤方偏倚突然変異体ＧＦＰ遺伝子を 用いてレトロウイルス遺伝子の細胞へのデリバリーを固定化技法を用いる必要な く行うことを実証した(Muldoon RR et al.，“Tracing and quantitation of re troviral mediated transfer using a humanized，red shifted green fluoresc ent protein gene”，Bio Techniques，1997;22:162- 167;Levy JP et al.，“Retroviral transfer and expression of humanized，r ed shifted green fluorescent protein into human tumor cells”，Nature Bi otechnol 1996;14:610-614)。単一コピー遺伝子発現はレトロウイルス上清に暴 露後２４時間以内に腫瘍細胞内で、蛍光顕微鏡下または標準ＦＩＴＣフィルター セットを用いるＦＡＣＳ分析によって可視化される。このマーカーは、（固定化 を必要とせずに）生きている組織または冷凍部分を直接観察することによりイン ビトロまたはインビボの遺伝子移入の検出を可能とする。このマーカーは、遺伝 子移入を個々の細胞ベースで観察することを可能にする。優れたＧＦＰ遺伝子発 現および翻訳が、ｐＨＥ７００ベクターにより形質導入された生きている腫瘍細 胞内で視認可能である。最近、新しいＨＳＶアンプリコンベクターが構築され、 ｐＨＥ７００ベクターは赤方偏倚した、コドン最適化されたＧＦＰ遺伝子および 別のマルチークローニング部位（図１０）を含む。この新しいベクターは、ＮＩ Ｓ遺伝子の腫瘍細胞への移入に用いられる。これもＧＦＰ共発現を観察すること により遺伝子移入効率を迅速に決定することができるためである。 ＮＩＳ遺伝子のｐＨＥ８ＮＩＳアンプリコンベクターへのクローニング。ＮＩＳ 遺伝子オープンリーディングフレームをｐＨＥ８５０ベクターバックボーンのマ ルチクローニング部位にクローニングする(図１０)。このベクターは大きなマル チクローニング部位を含み、この部位は、ｐＲＥＰ真核性発現プラスミドから直 接サブクローニングが可能である。ＮＩＳ遺伝子は、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ部 位が両端にあるｐＲＥＰ７に予めサブクローニングされ、これらはｐＨＥ８５０ のマルチ−クローニング部位へサブクローニングするのに使用される。アンプリ コンはＩＥ３遺伝子を含むＥ５細胞内でローリングサークル型複製を受け、ｄ１ ２０（ＩＥ３遺伝子欠損性）ヘルパー遺伝子のトランス−コンプリメンテーショ ン（trans-complementation）が可能である。ヘルパーウイルスの存在下、アン プリコンは１５２ｋｂ長のウイルスＤＮＡが得られるまで複製し、ついでパッケ ージングする。したがって、約１４．６kbのｐＨＥ８ＮＩＳプラスミドに対して 少なくとも１０個の発現カセットがタンデム反復で得られたウイルスベクター内 に存在する。これは、標的とする癌細胞内で強いレベルのＮＩＳ遺伝子発現 を提供するはずである。 ｐＨＥ８ＮＩＳ ウイルスベクター産生。閉じたｐＨＥ８ＮＩＳプラスミドを、 複製可能ＩＥ３遺伝子を発現するＥ５細胞内にリポフェクションを用いて製造業 者（GibcoBRL）のプロトコルによりトランスフェクションした。１日後、トラン スフェクションされた細胞をハイグロマイシンB（ICN Biomedical Inc.，Aurora ，Ohio）で選択する。ハイグロマイシン耐性コロニーをトリプシン消化し、細胞 を皿上に置く。ハイグロマイシン中で２週間安定選択した後、トランスフェクシ ョンされた細胞集団をＧＦＰ発現について試験する。蛍光に対して陽性であれば 、細胞をｄ１２０ヘルパーウイルスで形質導入する。ベクターのストックを生成 するために、ｐＨＥ８ＮＩＳを含有する３×１０⁶個ハイグロマイシン耐性細胞 を10cmの皿上にプレーティングする。細胞が密集状態になるように成長した後、 Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Gibco、BRL）1ml中の０．０１〜０．１ＭＯＩのｄ１２０ウ イルスを添加し、３７℃で２時間感染させる。ウイルス溶液を除去し、新鮮培地 を２４〜３６時間添加する。４８〜７２時間後細胞を溶菌する。得られた上清を 遠心分離して残滓を除去した後、緑色形成ユニット（gfu/ml）について試験して 上清のベクターの力価を決定する。 ｐＨＥ８ＮＩＳベクター上清のＰＵＶＡ処理。ＰＵＶＡ処理のために、ＴＭＰ（ トリオクサレン(Trioxalen)、Sigma）を種々の濃度（０〜５μg/ml）でウイルス ストックに添加し、３７℃で３０分間異なる長さでＵＶＡ露光（０〜７．５kJ/m² ）する。ＵＶＡ源はSpectroline Model XX-15A電球（Westbury、New York）で ある。ウイルスストック1mlを６−ウェルプレートの一つのウェル内に起き、種 々の時間（１分=０．５kJ/m²＠３６５nm）照射する。インキュベーションの３日 後に、染色許容性Ｅ５細胞をクリスタルバイオレットで染色することによりウイ ルス複製能力を測定する。ＧＦＰを蛍光顕微鏡検査により可視化する。 ＰＨＥ８ＮＩＳベクターを用いた際のインビトロ効率と効力。本明細書の実施例 で先に述べたのと同様の様式の実験設計を用いる。ｐＨＥ８ＮＩＳベクターの３ 〜１０ＭＯＩを適用して遺伝子移入と発現を達成する。ＧＦＰ発現を培養中の生 細胞の蛍光顕微鏡検査により、形質導入後６、１２、１８、２４および３６時間 後に観察する。ＧＦＰ陽性細胞およびＧＦＰ陰性細胞の数を高倍率視野で記録し て、用いたＭＯＩに対するベクター形質導入効率を計算する。¹²⁵Ｉの取り込み をＧＦＰ分析により判明した最適のＭＯＩを用いて先に実証したように決定する 。腫瘍細胞での¹²⁵Ｉ取り込みおよび¹³¹Ｉでの殺傷についての腫瘍細胞クローン 産性アッセイにおける試験が完了した後、軟質寒天中のスフェロイド腫瘍を用い てレトロウイルスベクターの効力実験用に開発された条件下で検討する。 実施例４ ＶＰＣを用いたインビボでの遺伝子移入によるRVベクターの移入の評価 インビボ試験動物に対して最初に低量の¹³¹Ｉ（０．２mCi）を投与して甲状腺 を切除し、ついで前述のようにシントロイド（Synthroid）補助物上に置く(Kasu ga Y et al.，“The effect of xenotransplantation of human thyroid tissue following radioactive iodine-induced thyroid ablation on thyroid functi on in the nude mouse”，Clin Invest Med，1991;14;277-281)。標準化レトロ ウイルスストックをPA317パッケージング細胞内に前述のとおり生成する(Link， CJ，et al.，“Preliminary in vitro efficacy and toxicities studies of th e herpes simplex thymidine kinase gene system for the treatment of breas t cancer”，Hybridoma，1995;14;143-147)。このベクターを最初に一時的にＧ Ｐ＋Ｅ８６同種指向性パッケージング細胞内に形質導入し、ついで得られた上清 を用いて対数期のＰＡ３１７細胞を形質導入する。細胞を限界希釈によりクロー ニングし、２０クローンを活性について滴定した。最も高い力価のＬＮＩＳＮＶ ＰＣのいくつかを大規模成長してインビボ試験に用いる。 予備形質導入した腫瘍モデルの¹³¹Ｉを用いた応答に対する効力試験。 計画された¹³¹Ｉ処理線量の０．３mCiが有効であることを確認するために、¹³¹ Ｉを用いて初期小実験を行う。ＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞をＬＮＩＳＮベクター で形質導入して個々の安定な導入遺伝子発現クローンを得る。無胸腺症ヌードマ ウス（nu/nu）に１０×１０⁶ＳＫ−ＯＶ−３を前部腹壁内に皮下注入する。通常 、この細胞数は５〜７日内に固形の３〜４mmの腫瘍塊を生じる数となる(データ は示されていない)。投与された細胞は移植前に表３に従って生体外で形質導入 する。群ＤはＮＩＳ遺伝子を発現する腫瘍細胞とＮＩＳ遺伝子を発現しない細胞 と（１：１の比率）で組み合わせたものがバイスタンダー放射線殺傷により¹³¹ Ｉ投与後に破壊できるかを決定するものである。14日後、動物に０．３mCiの¹³¹ Ｉを一回静脈注入する(Kasuga Y et al.，“The effect of xenotransplantatio n of human thyroid tissue following radioactive iodine-induced thyroid a blation on thyroid function in the nude mouse”，Clin Invest Med，1991;1 4;277-281;Walinder G，“Determination of the ¹³¹I dose to the mouse thyr oid”，Acta Radio Ther Phys Biol，1971;558-578)。応答は２週に１度腫瘍測 定値を記録（mm³）することにより決定する。 表３¹³¹ Ｉの予備形質導入された腫瘍に対するインビボ抗腫瘍活性 プロデューサー細胞注入でインビボで遺伝子導入した後、¹³¹Ｉ投与した場合 の効力試験。先の実験は、標的細胞内にレトロウイルスＶＰＣの直接移植によっ て有効な遺伝子移入が起こることを実証している(short MP et al.，“Gene del ivery to glioma cells in rat brain by grafting of a retrovirus packaging cell line”，J Neurosci Res，1990;27;427-439;Link CJ et al,“A phase I trial of in vivo gene therapy with the Herpes simplex thymidine kinase/g anciclovir system for the treatment of refractory or recurrent ovarian cancer”，Human Gene Ther，1996;7:1161-1179;Caruso Met al.，“Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene”，Proc Ntl Acad Sci （USA）1993;90;7 024-7028)。このアプローチはＳＫ−ＯＶ−３腫瘍モデルを用いて行う(表４)。 ５匹の陽性対照マウス（群Ａ）にＬＮＩＳＮベクターで予備形質導入した１０× １０⁶のＳＫ−ＯＶ−３細胞を注入する。群Ｂ、ＣおよびＤの各８匹の腹腔内へ １０×１０⁶のＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞を注入し、（Ｂ）ＬＮＣｈＲＧＶＰＣ(Ｇ ＦＰ遺伝子を移入するが、ＮＩＳ遺伝子は移入しない)、（Ｃ）ＨＢＳＳのみま たは（Ｄ）ＬＮＩＳＮ ＶＰＣのいずれかで処理する。処理細胞の注入３日後、 各群５匹のマウスに０．３mCiの¹³¹Ｉを静脈内注入する。応答は、腹水のカヘキ シーについて動物を２週に１度観察することにより行う。群Ｂ〜Ｄからの動物で¹³¹ Ｉで処理していないものを表２で使用したのと同じ方法によるＧ４１８選択 でｎｅｏ^r発現について評価する。この目的はアイソトープコンセントレーター のコンセプトのインビボでの効力を証明するものである。 表４ ネズミベクタープロデューサー細胞でインビボ遺伝子移入し、¹³¹Ｉ処理した後 の効力 実施例５ 緑色蛍光性タンパク質(ＧＦＰ)を発現する単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)を用い るインビボ遺伝子移入効率およびＮＩＳ遺伝子を移入した後の¹³¹Ｉ投与による 効力 抗腫瘍遺伝子治療は、高効率の遺伝子移入および治療用遺伝子の発現を必要と する。ＨＳＶベクターはこれらの性質の両方を提供し、我々のＮＩＳ遺伝子治療 を用いた抗腫瘍アプローチのための遺伝子移入ビヒクルとなる。これらのベクタ ーは非常に魅力的であるが、それは非分裂細胞（Ｇ₀期）を効率的に形質導入し 、かつ大きな担持能力を持つからである。 たいていのヒト上皮新生物はそれらの細胞の有意なパーセンテージが細胞周期 のＧ₀期にあり、例えば乳癌はそれらの細胞の約９％のみがS期にある(Witzig TE et al.，“ＤＮＡ ploidy and percent S-phase as prognostic factors in no de-positive breast cancer:results from patients enrolled in two prospect ive randomized trials”，J Clin Oncol，1993;11:351-359)。ネズミレトロウ イルスベクターはこれらＧ₀期の細胞形質導入しないが、それは、細胞を形質導 入するためには有糸分裂が必要とされるからである(Takamiya Y et al.，“Gene therapy of malignant brain tumors:a rat glioma line bearing the herpes simplex virus type 1-thymidine kinase gene and wild type retrovirus kill s other tumor cells”，J Neruoscl Res，1992;33:493-503)。ＨＳＶ−１溶菌 性複製起点（ｏｒｉ Ｓ）およびＨＳＶ−１末端パッケージングシグナル配列を 含有するプラスミドは、トランス作用性ヘルパーウイルスの存在下で増幅および 感染性ＨＳＶ−１内にパッケージングすることができる(Spaete RR et al.，“T he herpes simplex virus amplicon:A new eucaryotic defective-virus clonin g-amplifying vector”，Cell，1982;30:295-304;Kwong AD et al．“Herpes si mplex virus amplicon:Effect of size on replication of constructed defect ive genomes containing eucaryotic DNA sequences”，J Virol，1984;51:595- 603;Geller AI et al，“A defective HSV-1 vector expresses Escherichia co li β-galactosidase in cultured peripheral neurons”，Science，1988;241: 1667-1669;Geller AI et al,“Infection of cultured central nervous system neurons with a defective herpes simplex virus 1 vector results in stabl e expression of Escherichia coli beta-galactosidase”，Proc Natl Acad Sc i USA ，1990;87:1149-1153)。このアプローチは、ＨＳＶアンプリコン系を使用 するが、腫瘍をレトロウイルスアプローチで形質導入する能力が限定されている からである。 再びこの目的はデリバリー系および殺傷方法の基礎科学的研究の目的と、ヒト臨 床試験用の前臨床データを展開する二重の目的をもつ。 ＳＫ−ＯＶ−３ネズミモデルにおける遺伝子移入とＧＦＰの発現の評価。ＳＫ− ＯＶ−３ヒト卵巣癌腫細胞の成長を許容する、無胸腺症ヌードマウス（nu/nu） マウスを用いる。１日目に１０×１０⁶細胞の注入をすると５〜７日までに３〜 ４mmの腫瘍が生じる。ＧＦＰ発現に対する陽性対照となる動物５匹に、修飾され たＧＦＰ遺伝子を含有するＬＮＣｈＲＧベクターで予め形質導入してある１０× １０⁶ＳＫ−ＯＶ−３細胞を注入する。動物各５匹の残りの３つの群に種々の用 量（５×１０⁸、１×１０⁹または５×１０⁹gfu/ml）のｐＨＥ８ＮＩＳベクター （ＨＢＳＳ１００μlに懸濁）を直接皮下の腫瘍に注入した。ついで動物を屠殺 し、腫瘍を凍結切片の蛍光顕微鏡検査またはトリプシン消化後の腫瘍細胞の懸濁 液のFACS分析により検査する。我々は修飾されたＧＦＰ遺伝子を含有する真核性 発現プラスミドの注入後、凍結組織切片からのＧＦＰ発現の直接的視覚化を実証 している(データは示されていない)。次に、一連の同様の実験を腹腔内腫瘍で行 って遺伝子移入効率を決定した。１日目に１０×１０⁶細胞を注入すると多発性 腹腔内腫瘍がすべての動物で接種後７〜10日までに生じる(Link、未公表の観察) 。各群５匹のマウスの３つの群では、１×１０⁷、１×１０⁸または１×１０⁹gfu /mlのｐＨＥ８ＮＩＳベクターを含有するＨＢＳＳ 1mlの直接腹腔内注入を受け る。 ネズミ異種移植モデルにおけるｐＨＥ８ＮＩＳを用い、ついで¹³¹Ｉ処理した場 合の抗腫瘍効力の評価。無胸腺症ヌード（nu/nu）マウスを入手する(Harpan-Spr ague)。動物に無菌マウスフード（Teklad）およびＨ₂Ｏ無制限（adlibitum）を 給餌する。サニ−チップ（Sani-chip）とマイクロアイソレーター付きマウスケ ージ（実験室製品）を用いる。ケージは我々の完全サービス齧歯動物施設に保管 する。群Ａ〜Ｅのマウス（表５）に１０×１０⁶ＳＫ−ＯＶ−３細胞を１日目に 腹腔内注入する。これの結果として、多発性腹腔内腫瘍がこれらの動物に注入後 ７〜10日までに生じ、腫瘍接種後約30日までに動物死が起きる (Link、未公表の観察)。対照群は（Ａ）ＨＢＳＳのみおよび（Ｂ）ｐＨＥ−tkベ クター（ＨＳＶベクター細胞傷害性に対する対照）である。群(Ｃ)、（Ｄ）およ び（Ｅ）は３つの用量レベルのｐＨＥ8NISベクター（表５）を注入する。群Ｆの マウスはＬＮＩＳＮレトロウイルスベクターで予備形質導入されたＳＫ−ＯＶ− ３細胞を受け、¹³¹Ｉによる腫瘍殺傷に対する陽性対照とする。処理細胞の注入 ３日後に、各群の動物５匹に¹³¹Ｉを０．３mCiの腹腔内注入する。動物をベクタ ー投与後の毒性または感染の証拠について毎日観察する。応答は、カヘキシーま たは腹水症について動物を２週に１度観察することにより決定される。完全な応 答は、完全な腫瘍破壊（屍検の際に目に見える疾病がない）が起きている動物で あると定義される。これは６０日目に動物が屠殺されるときに決定される(この 時間枠によりすべての未処置または対照動物において死亡を起こしうるはずであ る)。６０日目に生存するマウス内に残る腫瘍堆積物を採取する。この腫瘍の別 の部分を腫瘍に存在する細胞性浸潤物を組織病理染色に送る。 表５ pHE8NISベクター注入後、¹³¹Ｉ処理したインビボ遺伝子移入後の効力 ０日目：腹腔内に腫瘍移植 ５日目：腹腔内にベクター投与 ８日目：¹³¹Ｉ投与(０．３mCi) 実施例６ 放射性同位体コンセントレーター療法を用いる、細胞を取り除くためのエクスビ ボプロトコル 同種骨髄移植後の移植片ウイルス対宿主病（ＧｖＨＤ）を治療するために修飾さ れたリンパ細胞の養子移入。同種ＢＭＴ（骨髄移植）が白血病を治癒させるのは 予備的治療方式により誘発された骨機能除去と骨髄に移植片対白血病（ＧｖＬ） と呼ばれる効果を奏する免疫能力ドナー細胞の同種移植片を移入することによる (Horowitz MM et al．“Graft-Versus-Luekemia Reaction After Bone Marrow T ransplantation”，Blood 1990;75:555-562;Weiden，P.L.，Horowitz M．M.，“ Grafts-vs-Leukemia Effects in Clinical Bone Marrow Transplant”，Hematol ogy 1990;12:691-708)。最近、この抗白血病効果に対する直接的証拠が、ドナー 末梢血白血球を患者に注入して同種ＢＭＴ後に再発することにより示された(表 Ｉ)。国際骨髄移植登録（The International Bone Marrow Transplant Registry ）が、ＨＬＡ−同一同胞ＢＭＴを初期白血病に対して受けた２，２５４人の患者 からのデータを分析して、ＧｖＨＤを発症した患者については再発の危険性が顕 著に減少することを見いだした(Horowitz MM et al．“Graft-Versus-Leukemia Reaction After Bone Marrow Transplantation”，Blood 1990;75:555-562;Weid en，P.L.，Horowitz M.M.，“Graft-vs-Leukemia Effects in Clinical Bone Ma rrow Transplant”，Hematology 1990;12:691-708)。不幸なことに、ＧｖＨＤは 常に治療可能であるとは限らず、患者の病的状態および死亡率はかなりのもので ある。移植片から成熟Ｔ細胞を除去すると急性および慢性ＧｖＨＤが効果的に防 止される。Ｔ細胞欠失の利益は移植片の不全と白血病の再発によって相殺される ので全体としての生存率は改善されない(Marmont，A.M．et al.，“T-Cell Depl etion of HLA-Identical Transplants in Leukemia”，Blood，1991;78:2120-21 30)。Ｔ細胞欠失はＡＭＬおよびＡＬＬで白血病の再発を増加するが、これはＧ ｖＨＤの喪失のためである。細胞ＣＭＬの場合、ＧｖＬ効果（ＧｖＨＤとは独立 ）もあるが、これはＴ細胞欠失の過程で失われるかもしれない。Ｋｏｌｂと同僚 は同種ＢＭＴ後ＣＭＬを再発する患者に対して、元のドナーからの白血球注入が 寛解を引き起こすことを最初に報告した(Kolb，H.J.et al.，“Donor Leukocyte Transfusion for Treatment of Recurrent Chronic Myelogenous Leukemia in Marrow Transplant Recipients”，Blood，1990; 76:2462-2465)。既存のデータから見いだされたのは、細胞遺伝学的再発のみま たは慢性期のＣＭＬ患者は、より病気が進行した患者よりもこの治療によく応答 するということである。結論として、同種ＢＭＴは、ＧｖＨＤ依存性及びＧｖＨ Ｄ非依存性の成分を有するＧｖＬ効果を伴う。ＧｖＨＤに対する現在の医薬療法 は、部分的にのみ有効であり、レシピエント組織の進行性ＧｖＨＤ破壊はしばし ば致命的である。したがって、養子移入された白血球をそれらがＧｖＨＤを引き 起こす場合に限って破壊することができることが大いに望ましい。 表Ｉ． ABMT後の再発に対するドナー白血球 NR−未報告； ＡＬ−急性白血病 実施例７ 本発明に有用な腫瘍特異的プロモーター 下記は本発明に有用な腫瘍特異的プロモーターのリストであり、他の多くのそ のようなプロモーターが知られており、当業者はジェンバンクのような供給源か ら入手可能である。 本発明に有用な腫瘍特異プロモーターは下記のものを含むがこれらに限定され ない： Ogb:HSU24128 ヒトプロホルモンコンベルターゼ(PC1/3)遺伝子、プロモーター および５’フランキング R73368519-73377389-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbpri.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:HUMPRDA1A ホモサピエンスRRAD1/cyclin D1原癌遺伝子、プロモーター領域 および R131139159-131144243-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbpri.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:MMTIMP3MIメタロプロテイナーゼ−３組織用M.musculus（Balb/C）TIMP-3 遺伝子 R21667172-21676635-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbrod.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:S76735 HrMA4アルファ＝筋特異性アクチン｛プロモーター｝[ハロシンチア R91434337-91436077-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbinv.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:SPU16263 Strongylocentrotus purpuratus細胞質アクチンI(SpCyI)遺伝子、 R9417O781-94174495-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbinv.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:SUSMSP130A S．purpuratus細胞表面糖タンパク質（msp130）遺伝子、５’フ ランクおよび R95059129-95062574-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbinv.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:SUSMSP130B S．purpuratus細胞表面糖タンパク質（msp130）mRNA、５’末端 。R95062574-95068440-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbinv.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:TBVSG118A変異体特異表面糖タンパク質用のT．brucelプロモーター領域 R96463813-96467678-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbinv.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:BTU15731 Bos taurusソマトトロピンレセプター遺伝子、エクソン１、およ び肝特異的 R8476848-8482291-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:DOGCAMIIカルモジュリン用イヌ遺伝子、エクソン１ R10631174-10634811-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:LC15LOPRO L.cuniculus １５−リポキシゲナーゼ遺伝子、プロモーター領域 。 R12667022-12669806-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:MDU32208 Monodelphis domestica ユビキチンＣ−末端ヒドロラーゼ（pGP9 .5）遺伝子 R12823493-12828679-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:OALGB Ovis ariesベータ−ラクトグロブリン遺伝子 R14266321-14279312-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:OCKK3 0．cuniculusケラチンＫ３遺伝子。 R15952615-15964713-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:RAB15LOXウサギ赤芽球細胞特異的１５−リポキシゲナーゼ（１５−ｌｏｘ） 遺伝子、R19673279-19689638-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:RABSURFAウサギ肺サーファクタントタンパク質Ａ関連遺伝子、完全遺伝子お よび R22419294-22432460-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:S55298 LINE/c-MYC｛接着配列｝[イヌ、伝染性性病性腫瘍、R22998775-2300 0354-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:S64695黄体形成ホルモンベータ−サブユニット［ヒツジ、ゲノム性、1779 nt]。 R23183638-23187681-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:S65740 K3ケラチン[ウサギ、ゲノム性、６０４５nt]。 R23217050-23227115-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:SSIKBAG S．scrofa IkBa遺伝子（プロモーター領域 R25337255-25341446-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbmam.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:A08215パタチン遺伝子およびプロモーター配列 R4651664-4655250-/gopherlib/data/db/.genbank-92/gbpat.seq gopher.nih.gov 70 Ogb:A15840 pSKIIIからのプロモーター領域プロテイナーゼ遺伝子 請求の範囲 １． 腫瘍細胞において放射性同位体を蓄積する方法であって、 放射性同位体コンセントレーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド配 列で前記腫瘍細胞を形質転換し、 その後、放射性同位体が前記形質転換された細胞に引き入れられるように 、前記細胞を前記放射性同位体と接触させる ことを特徴とする方法。 ２． 前記放射性同位体コンセントレーター遺伝子がヨウ化ナトリウム共輸送体 である請求項１記載の方法。 ３． 前記放射性同位体コンセントレーターがＮａ⁺／Ｋ⁺ＡＴＰａｓｅである請 求項１記載の方法。 ４． 前記放射性同位体が¹³¹Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ−ＭＩＢＧ、¹²³Ｉ及び⁹⁹Ｔ過テ クネチウム酸塩からなる群から選択される、請求項２記載の方法。 ５． 前記放射性同位体が¹³¹Ｉである、請求項１記載の方法。 ６． 前記放射性同位体が²⁰¹Ｔｌである、請求項３記載の方法。 ７． 前記放射性同位体が⁹⁹Ｔである、請求項３記載の方法。 ８． 前記放射性同位体コンセントレーター遺伝子が骨Ｃａ輸送体である、請求 項１記載の方法。 ９． 前記放射性同位体が⁹⁹Ｔｃである、請求項８記載の方法。 １０． 前記放射性同位体コンセントレーター遺伝子の発現を識別するために前 記細胞を画像化する工程を更に含む、請求項１記載の方法。 １１． 前記放射性同位体が前記形質転換された細胞を殺すのに有効な量で投与 される、請求項１記載の方法。 １２． 前記放射性同位体が前記形質転換された細胞をラジオイメージングする のに有効な量で投与される、請求項１０記載の方法。 １３． 前記形質転換が、前記細胞の群に、放射性同位体コンセントレーター遺 伝子を発現するために複製欠失ウイルスベクターのプロジューサー細胞系を到達 させることを含む、請求項１記載の方法。 １４． 前記ベクターの前記到達（デリバリー）が前記プロジューサー細胞系の 直接注入を含む、請求項１３記載の方法。 １５． 前記ベクターが単純ヘルペスウイルスアンプリコンベクターである、請 求項１３記載の方法。 １６． 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１３記載の方法 。 １７． 腫瘍に、放射性同位体コンセントレーター遺伝子をコードするポリヌク レオチドを複製細胞で発現するベクターを到達させるための、医薬品を製造する 方法において、 放射性同位体遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する発現構築物、 前記遺伝子に作動可能に結合されるプロモーター及びポリアデニル化信号を薬学 的に許容可能な担体に配置することを特徴とする方法。 １８． 放射性同位体コンセントレーター遺伝子をコードするヌクレオチド配列 ； 前記遺伝子に作動可能に結合されるプロモーター；及び ポリアデニル化信号 を含むことを特徴とする、形質転換された細胞において放射性核種の蓄積のため の発現構築物。 １９． 前記プロモーターが腫瘍特異的プロモーターである、請求項１８記載の 構築物。 ２０． 前記放射性同位体コンセントレーター遺伝子が、ヨウ化ナトリウム共輸 送体遺伝子、ナトリウムカリウムアデノシントリホスファターゼ遺伝子及び骨カ ルシウム輸送体遺伝子からなる群から選択される、請求項１８記載の構築物。 ２１． 前記放射性同位体コンセントレーター遺伝子がＦＲＴＬ細胞から単離さ れる、請求項２０記載の構築物。 ２２． 前記ヨウ化ナトリウム共輸送体遺伝子がＦＲＴＬ細胞から単離される、 請求項２１記載の構築物。 ２３． 放射性同位体コンセントレーター遺伝子を含むことを特徴とするウイル スベクター。 ２４． 前記ベクターが単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項２３記載 のベクター。 ２５． 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２３記載のベク ター。 ２６．前記放射性同位体コンセントレーター遺伝子が、ヨウ化ナトリウム共輸送 体遺伝子、ナトリウムカリウムアデノシントリホスファターゼ遺伝子及び骨カル シウム輸送体遺伝子からなる群から選択される、請求項２３記載のベクター。 ２７． 前記放射性同位体コンセントレーター遺伝子がヨウ化ナトリウム共輸送 体遺伝子である、請求項２６記載のベクター。 ２８． 前記ヨウ化ナトリウム共輸送体遺伝子がＦＲＴＬ細胞から単離される、 請求項２７記載のベクター。 ２９． 請求項２６記載のウイルスベクターで形質転換される細胞。 ３０． 請求項２３記載のベクターで形質転換されるベクタープロジューサー細 胞系。 ３１． 腫瘍細胞及びバイスタンダー効果に付されるそれらの細胞において放射 性同位体を蓄積する方法であって、 Ｎａ⁺／Ｋ⁺ＡＴＰａｓｅをコードするポリヌクレオチド配列で前記腫瘍細 胞を形質転換し、 その後、放射性同位体が前記形質転換された細胞に引き入れられるように 、前記細胞と放射性同位体とを接触させる ことを特徴とする方法。 ３２． 放射性同位体コンセントレーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド 配列で腫瘍細胞を形質転換し、その後、放射性同位体が前記形質転換された細胞 に引き入れられるように、前記細胞と前記放射性同位体とを接触させることを含 む、腫瘍細胞及びバイスタンダー効果に付されるそれらの細胞において放射性同 位体を蓄積する方法であって、 前記転換が、放射性同位体コンセントレーターを発現するための単純ヘル ペスウイルスのプロジューサー細胞系を前記細胞の群に到達させることを特徴と する方法。 【図１】【図２】【図２】【図３】【図５】 【図４】 【図６】【図７】【図８】 【図９】【図１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 43/00 49/02 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リンク，チャールズ，ジェイ．，ジュニア アメリカ合衆国 アイオワ州 50309― 9976，デモイン，ウッドランド アヴェニ ュ 1415

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 細胞及び傍観者効果を受けやすいラジオアイソトープを蓄積する方法にお いて、 ラジオアイソトープ・コンセントレーターをコード化するポリヌクレオ チド配列を有する前記細胞を形質転換し、 その後、前記ラジオアイソトープを前記形質転換された細胞に引き入れ るように、ラジオアイソトープを有する前記細胞に接触する ことを特徴とする方法。 ２． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーターがヨウ化ナトリウム・シン ポーター（symporter）である請求項１記載の方法。 ３． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーターがNa+/K+アデノシントリホ スファターゼである請求項１記載の方法。 ４． 前記ラジオアイソトープが¹³¹I、¹²⁵I、¹³¹I-MIBG、¹²³I及び⁹⁹T過テクネ チウム酸塩からなる群から選択される、請求項２記載の方法。 ５． 前記ラジオアイソトープが¹³¹Iである、請求項１記載の方法。 ６． 前記ラジオアイソトープが²⁰¹Tlである、請求項３記載の方法。 ７． 前記ラジオアイソトープが⁹⁹Tである、請求項３記載の方法。 ８． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーターが骨Ca輸送体である、請求 項１記載の方法。 ９． 前記ラジオアイソトープが⁹⁹Tcである、請求項８記載の方法。 １０． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーター・遺伝子の発現を識別す るために前記細胞を画像化する工程を更に含む、請求項１記載の方法。 １１． 前記ラジオアイソトープが前記形質転換された細胞を殺すのに有効な量 で投与される、請求項１記載の方法。 １２． 前記ラジオアイソトープが前記形質転換された細胞をラジオ画像化する のに情緒的な量で投与される、請求項１０記載の方法。 １３． 前記形質転換が、前記細胞の群に、ウイルスのラジオアイソトープ・コ ンセントレーターを発現する複製欠失ベクターの産生細胞系を送達することを含 む、請求項１記載の方法。 １４．前記ベクターの前記送達が前記産生細胞系の直接注入を含む、請求項４記 載の方法。 １５． 前記ベクターが単純ヘルペスウイルス・アンプリコン・ベクターである 、請求項１４記載の方法。 １６． 前記ベクターがレトロウイルス・ベクターである、請求項１４記載の方 法。 １７． 生物中の腫瘍細胞を殺す方法であって、 前記腫瘍に、ラジオアイソトープ・コンセントレーター遺伝子をコード 化するポリヌクレオチドを複製細胞で発現するベクターを送達し、 前記腫瘍において細胞を複製する前記因子を発現し、 ベクターを、前記ベクターを発現する前記腫瘍細胞において前記ベクタ ーがラジオアイソトープを濃縮し、かつ前記コンセントレーター遺伝子を発現し ない前記腫瘍において前記傍観者効果によって他の細胞を感作するのに有効な量 および経路で前記生物に投与し、及び 前記腫瘍細胞を放射性核種治療に曝露する ことを含む方法。 １８． 前記ポリヌクレオチドの送達が、ラジオアイソトープ・コンセントレー ターを発現する複製欠失ベクターの産生細胞系を前記腫瘍に送達すること含む、 請求項１７記載の方法。 １９． 前記ベクターの前記送達が、前記産生細胞系の直接注入を含む、請求項 １８記載の方法。 ２０．ラジオアイソトープ・コンセントレーター遺伝子をコード化するヌクレオ チド配列； 前記遺伝子に結合されて作動可能なプロモーター；及び ポリアデニル化信号 を含む、形質転換された細胞において放射性核種の蓄積のための発現構築物。 ２１． 前記プロモーターが腫瘍特異的プロモーターである、請求項２０記載の 構築物。 ２２． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーター遺伝子が、ヨウ化ナトリ ウム・シンポーター遺伝子、ナトリウム・カリウム・アデノシントリホスファタ ーゼ遺伝子及び骨カルシウム輸送体遺伝子からなる群から選択される、請求項２ ０記載の構築物。 ２３． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーター遺伝子がヨウ化ナトリウ ム・シンポーター遺伝子である、請求項２２記載の構築物。 ２４． 前記ヨウ化ナトリウム・シンポーター遺伝子がFRTL細胞から単離される 、請求項２３記載の構築物。 ２５． ラジオアイソトープ・コンセントレーター遺伝子を含むウイルスベクタ ー。 ２６． 前記ベクターが単純ヘルペス・ウイルスベクターである、請求項２５記 載のベクター。 ２７． 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２５記載のベク ター。 ２８． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーター遺伝子が、ヨウ化ナトリ ウム・シンポーター遺伝子、ナトリウム・カリウム・アデノシントリホスファタ ーゼ遺伝子及び骨カルシウム輸送体遺伝子からなる群から選択される、請求項２ ５記載のベクター。 ２９． 前記ラジオアイソトープ・コンセントレーター遺伝子がヨウ化ナトリウ ム・シンポーター遺伝子である、請求項２８記載のベクター。 ３０． 前記ヨウ化ナトリウム・シンポーター遺伝子がFRTL細胞から単離される 、請求項２９記載のベクター。 ３１． 請求項２８記載のウイルスベクターで形質転換される細胞。 ３２． 請求項２５記載のベクターで形質転換されるベクター産生細胞系。