DE69637123T2

DE69637123T2 - Die expression von cyclin g1 in tumoren

Info

Publication number: DE69637123T2
Application number: DE69637123T
Authority: DE
Inventors: Erlinda M. Glendale GORDON; Frederick L. Glendale HALL; W. French San Marino ANDERSON
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1995-11-01
Filing date: 1996-10-31
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2016-11-01
Also published as: EP0858346B1; NZ538525A; DE69637123D1; CA2236482A1; ATE363916T1; JP4117367B2; AU7528496A; WO1997016209A1; CA2236482C; EP0858346A1; JP2007209344A; AU724439B2; JPH11514884A; EP0858346A4; ES2288756T3

Description

Diese Erfindung betrifft die Expression von Cyclin G1 in Tumoren. Ganz besonders betrifft diese Erfindung: (i) die Behandlung von Tumoren wie einem Knochensarkom oder einem Ewing-Sarkom durch Inhibieren des Cyclin G1 Proteins in den Tumorzellen; (ii) die Verhinderung der Restenosierung durch Inhibieren des Cyclin G1 Proteins in Zellen an der Stelle eines invasiven vaskulären Verfahrens oder einer vaskulären Läsion; (iii) die Immortalisierung von Zellen durch Transduzieren solcher Zellen mit einem für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotid; (iv) das Empfänglichermachen von Zellen gegenüber einer Infektion oder Transduktion durch einen retroviralen Vektor durch Transfizieren der Zellen mit einem für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotid vor der oder gleichzeitig mit der retroviralen Transduktion oder Infektion; und (v) ein in vitro Verfahren für die Feststellung von Krebs durch Bestimmen des Grads der Expression des Cyclin G1 Proteins in Zellen. Diese Erfindung betrifft auch Expressionsvehikel, vorzugsweise retrovirale Vektoren und adenovirale Vektoren, die Polynucleotide umfassen, die für Mittel codieren, die das Cyclin G1 Protein inhibieren, wie Antisense-Polynucleotide und Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die das Cyclin G1 Protein erkennen, und Expressionsvehikel, die ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gene, die für eine neue Klasse von Proteinen, die als Cycline bekannt sind, codieren, wurden als neue Klasse von Protoonkogenen identifiziert, und cyclinabhängige Kinase-(oder Cdk-)Inhibitoren wurden als Tumorsuppressoren identifiziert, wodurch die molekularen Mechanismen der zellulären Transformation und Tumorgenese mit der Enzymologie, die die Zellzyklussteuerung lenkt, verbunden werden. (Hall, et al., Curr. Opin. Cell Biol., Band 3, Seiten 176-184 (1991); Hunter, et al., Cell, Band 55, Seiten 1071-1074 (1991); Hunter, et al., Cell, Band 79; Seiten 573-582 (1994); Elledge, et al., Curr. Opin. Cell Biol., Band 6, Seiten 874-878 (1994); Peter, et al., Cell, Band 79, Seiten 181-184 (1994)). Die sequentielle Expression von spezifischen Cyclinen und die wesentlichen Funktionen von spezifischen Cdk-Komplexe wurden definiert (Wu, et al., Int. J. Oncol., Band 3, Seiten 859-867 (1993); Pines, et al., New Biologist, Band 2, Seiten 389-401 (1990); Pines, Cell Growth and Differentiation, Band 2, Seiten 305-310 (1991); Reed, Ann. Rev. Cell Biol., Band 8, Seiten 529-561 (1992); Sherr, Cell, Band 79, Seiten 551-555 (1994)), wodurch direkte Verbindungen mit den grundsätzlichen Mechanismen der DNA-Replikation, der Transcription, der Reparatur, der genetischen Instabilität und der Apoptose zur Verfügung gestellt werden. (D'Urso, et al., Science, Band 250, Seiten 786-791 (1990); Wu, et al., Oncogene, Band 9, Seiten 2089-2096 (1994); Roy, Cell, Band 79, Seiten 1093-1101 (1994); Meikrantz, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 91, Seiten 3754-3758 (1994)). Sowohl der universelle Cdk-Inhibitor p21/WAF1/CIP1 (Xiong, et al., Nature, Band 366, Seiten 701-704 (1993); Harper, et al., Mol. Biol. Cell, Band 6, Seiten 387-400 (1995)), und Cyclin G1 (Wu, et al., Oncol. Reports, Band 1, Seiten 705-711 (1994)) werden durch das Wildtyp-p53- Tumorsuppressorprotein bei der Initiation der DNA-Reparatur und/oder Apoptose induziert. (El-Deiry, et al., Cell, Band 75, Seiten 817-825 (1993); El-Deiry, et al., Cancer Res., Band 54, Seiten 1169 1174 (1994)). So stellen die molekularen Komponenten, die kritische Zellzykluskontrollpunkte regulieren, strategische Ziele für die potentielle therapeutische Intervention bei der Behandlung von Zellproliferationsstörungen, einschließlich des pädiatrischen Knochenkrebs dar, bei denen die Rb- und die p53 Tumorsuppressorgene oft inaktiviert werden. (Hansen, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 82, Seiten 6216-6220 (1985); Toguchida, et al., Nature, Band 338, Seiten 156-158 (1989); Toguchida, et al., Cancer Res., Band 48, Seiten 3939-3943 (1988); Diller, et al., Mol. Cell. Biol., Band 10, Seiten 5772-5781 (1990)). Frühere Untersuchungen haben das progressive Profil der Cyclinexpression und der Cdk-Aktivierung (Wu, 1993; Carbonaro-Hall, et al., Oncogene, Band 8, Seiten 1649-1659 (1993); Hall, et al., Oncogene, Band 8, Seiten 1377-1384 (1993); Williams, et al., J. Biol. Chem., Band 268, Seiten 8871-8880 (1993); Albers, et al., J. Biol. Chem., Band 268, Seiten 22825-22829 (1993)), sowie die p53-unabhängige Induzierung von p21/WAF1/CIP1 (Wu, et al., Oncol. Reports, Band 2, Seiten 227-231 (1995)) in MG-63 Osteosarkoma-Zellen charakterisiert. Antisense-Oligonucleotid-Strategien, die gegen Cyclin D1 gerichtet sind, inhibieren die Zellzyklusprogression in diesen Osteosarkoma-Zellen wirksam. (Wu, 1993).
Ein metastatisches Karzinom ist, da es mit einem schlechten Ausgang verbunden ist, ein wichtiges Ziel für die Gentherapie. Kolorektaler Krebs ist beispielsweise die zweitwichtigste Ursache von Krebstod in den Vereinigten Staaten nach Lungenkrebs, gefolgt von Brust- und Pankreaskrebs (Silberberg et al., Cancer Clin., Band 40, Seiten 9-26 (1990)). Von diesen Karzinomen weist Pankreaskrebs die schlechteste Prognose auf. Die mittlere Überlebenszeit von Patienten mit metastatischem Pankreaskrebs beträgt drei bis sechs Monate, und praktisch alle Patienten sind innerhalb eines Jahres tot (Merrick et al., Gastroenterol. Clin. N. Amer., Band 19, Seiten 935-962 (1990)). Etwa 40% der Patienten haben entweder in der Leber oder dem peritonealen Hohlraum oder in beidem zum Zeitpunkt der Diagnose eine metastatische Erkrankung. Eine Chemotherapie ist trotz multimodaler Therapie für eine metastatische Erkrankung unwirksam. Folglich sind alternative Ansätze bei einem metastatischen Karzinom wünschenswert.
Wu, et al. (Oncol. Reports, Band 1, Seiten 705-711 (1994)), der bereits vorstehend erwähnt wurde, offenbart die deduzierte Aminosäuresequenz und cDNA-Sequenz für humanes Cyclin G1 Protein. Wu, et al., offenbaren auch, dass ein höherer Grad an Cyclin G1 Expression in Osteosarkomzellen und in Ewing-Sarkomzellen als in normalen diploiden humanen Fibroblasten gefunden wurde. Obgleich Wu, et al., angeben, dass die Überexpression des Cyclin G1 Proteins in humanen Osteosarkomzellen eine potentielle Verbindung zu Krebs schafft, offenbaren Wu, et al. nicht die Behandlung von Krebs durch Stören oder Inhibieren der Funktion des Cyclin G1 Proteins in Krebszellen.
Okamoto, et al. (The EMBO Journal, Band 13, Nr. 19, Seiten 4816-4822, 1994) beschreiben, dass Cyclin G ein Transcriptionsziel des p53 Tumorsuppressorproteins ist.
Tamura et al. (ONCOGENE, Band 8, Seiten 2113-2118, 1993) beschreiben, dass Cyclin G ein neues Säuger-Cyclin mit Homologie für die Spaltung von Hefe Cig1 ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben entdeckt, dass durch das Stören und/oder Inhibieren der Funktion oder Expression des Cyclin G1 Proteins in Krebszellen das Wachstum und/oder Überleben solcher Krebszellen inhibiert, verhindert oder zerstört werden kann. So betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung eines Tumors (vorzugsweise eines kanzerösen Tumors) durch Inhibieren des Cyclin G1 Proteins, durch die Verabreichung von Antisense-Oligonucleotiden für ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid, oder von Antikörpern zu dem Cyclin G1 Protein.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung (i) das Verhindern einer Restenosierung durch Inhibieren des Cyclin G1 Proteins in Zellen an der Stelle eines invasiven vaskulären Verfahrens oder einer vaskulären Läsion; (ii) die Immortalisation von Zellen durch Transduzieren von Zellen mit einem für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotid; (iii) das Transduzieren von Zellen mit einem für das Cyclin G1 Protein codierenden Nucleotid, um die Zellen für die Transduktion oder Infektion mit einem retroviralen Vektor empfänglicher zu machen; und (iv) einen Krebs-Assay, der die Feststellung des Cyclin G1 Proteins und/oder eines für ein solches Protein codierenden Polynucleotids umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsvehikel, die Polynucleotide umfassen, die für Mittel codieren, die das Cyclin G1 Protein inhibieren, und Expressionsvehikel, die ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid umfassen. Solche Expressionsvehikel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, virale Vektoren wie retrovirale Vektoren und adenovirale Vektoren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, in denen zeigen:
1 eine Nucleotidsequenz der humanen Cyclin G1 cDNA;
2 das Färben von MG-63 osteogenen Sarkomzellen nach der Transduktion solcher Zellen mit einem retroviralen Vektor, einschließlich einer β-Galactosidase oder eines lacZ-Gens;
3 eine graphische Darstellung des Grads der Konfluenz (%) in Mischungen von MG-63 Zellen, die mit einem retroviralen Vektor transduziert wurden, einschließlich des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(TK-)Gens, und Zellen, die mit einem solchen Vektor nicht transduziert wurden;
4 eine schematische Ansicht der retroviralen Vektoren G1aD1SvNa, G1aG1SvNa, G1p21SvNa und G1XSvNa;
5 eine graphische Darstellung der Zellzählungen in Kulturen von MG-63 Zellen, die mit G1XSvNa, G1aD1SvNa, G1aG1SvNa oder G1Ip21SvNa transduziert wurden;
6 ein Western-Blotting der Expression von p29 Cyclin G1 Protein in MG-63 Zellen, die mit G1XSvNa, G1aG1SvNa oder G1aDISvNa transduziert wurden;
7 das morphologische Erscheinungsbild von MG-63 Zellen durch Lichtmikroskopie 72 Stunden nach der Transduktion solcher Zellen mit G1XSvNa, G1aG1SvNa, G1aD1SvNa oder G1p21SvNa;
8 die Feststellung von apoptotischen Zellen in Kulturen von MG-63 Zellen, die mit G1XSvNa, G1aG1SvNa, G1aD1SvNa oder G1p21SvNa transduziert wurden;
9A die FACS-Analyse von PI-gefärbten Kernen 48 Stunden nach der Transduktion von VX2 Karzinomzellen mit einem retroviralen Vektor, der Antisense-Cyclin G1 (G1aG1SvNa) trägt, im Vergleich zu derjenigen des Kontroll-(G1XSvNa)Vektors.
9B die FACS-Analyse von PI-gefärbten Kernen 48 Stunden nach der Transduktion von MG-63 Osteosarkomzellen mit retroviralen Vektoren, die Antisense-Cyclin G1 (G1aG1SvNa) tragen, im Vergleich zu dem Kontroll-(G1XSvNa)Vektor.
10: Zytostatische Wirkungen von retroviralen Vektoren, die Antisense-Cyclin G1 tragen, und dem Wildtyp p53 in transduzierten undifferenzierten VX2 Karzinomzellen. Die Zelldichten wurden mittels Zellzählen in Zellkulturen von VX2 Zellen in seriellen Intervallen nach der retroviralen Vektortransduktion vor der G418 Selektion gemessen.
11: Morphologisches Erscheinungsbild von VX2-Zellen 10 Tage nach der Transduktion mit retroviralen Vektoren, die Antisense-Cyclin G1 (G1aG1SvNa) tragen, dem Wildtyp p53 (G1p53SvNa) oder dem Kontroll-(G1XSvNa)Vektor nach der G418 Selektion.
12: Inhibierung des VX2-Tumorwachstums bei Nacktmäusen nach der intratumoralen Injektion des retroviralen Vektors, der das Antisense-Cyclin G1 trägt. Die prozentuale Erhöhung der Tumorgröße, aufgetragen auf der vertikalen Achse, ist als Funktion der Zeit (Tage), aufgetragen auf der horizontalen Achse, ausgedrückt;
13A: Grobes Erscheinungsbild von repräsentativen VX2 tumortragenden Mäuse eine Woche nach der Behandlung mit retroviralen Vektoren, die Antisense-Cyclin G1 (G1aG1SvNa) tragen, oder dem Kontrollvektor (G1XSvNa).
13B: Hämatoxylineosin-Färbung von mit Formalin fixierten Tumorabschnitten eine Woche nach der Behandlung mit retroviralen Vektoren, die Antisense-Cyclin G1 (G1aG1SvNa) tragen, oder dem Kontrollvektor (G1XSvNa). 40fache Vergrößerung.
14 eine graphische Darstellung von Tumorgrößen bei Mäusen, denen MNNG/HOS-Zellen injiziert wurden, gefolgt von der Injektion der retroviralen Vektoren G1XSvNa oder G1aG1SvNa. Tumorvolumina werden 0, 4, 6, 8, 10 und 12 Tage nach der Injektion der retroviralen Vektoren gemessen.
15: (A) Glatte Muskelzellen der Aorta, die nukleärzielgerichtete β-Galactosidase (Zellen mit blauen Kernen) exprimieren, gefolgt von der Transduktion mit dem G1nBgSvNa Vektor; (B) Zytostatische und zytozide Wirkungen von Antisense-Cyclin G1 und Wildtyp p53 in transduzierten Aorten-SMC. Zelldichten wurden mittels direktem Zellzählen in Kulturen von Aorten-SMC gemessen, die in seriellen Intervallen nach der Transduktion mit retroviralen Vektoren, die Antisense-G1 (G1aG1SvNa) tragen, und dem Wildtyp p53 (G1p53SvNa) sowie dem Kontrollvektor (G1XSvNa) geernet wurden; (C) ³H-Thymidineinverleibung in gezüchteten Aorten-SMC nach der Transduktion mit retroviralen Vektoren (n = 3 jeder Gruppe) Die Radioaktivität wird als dpm pro Vertiefung ausgedrückt. Die Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel ± 1 Standardabweichung ausgedrückt;
16: Das morphologische Erscheinungsbild der Aorten-SMC, beobachtet mittels Lichtmikroskopie 24 Stunden nach der Transduktion mit Kontroll- und retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektoren (A = G1XSvNa Kontrollvektor; B-D = G1aG1SvNa). Die Feststellung von Apoptose in vaskulären SMC nach der Transduktion des retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektors; (E) mit dem G1XSvNa Kontrollvektor transduzierten Zellen, (F) mit dem G1aG1SvNa Antisense-Cyclin G1 Vektor transduzierte Zellen. Die dunkle Färbung der apoptotischen Körper wird sowohl innerhalb als auch außerhalb der synzytialen Zellen festgestellt;
17: Zytozide "Bystander"-Wirkung bei Antisense-Cyclin G1 vektortransduzierten Aorten-SMC. Einverleibung von nichttransduzierten, fluoreszent markierten Aorten-SMC in multizellulären Synzytien bei Legen auf eine SMC-Kultur, die zuvor mit einem Antisense-Cyclin G1 Vektor transduziert worden ist. A und B, geringe Vergrößerung, C und D, hohe Vergrößerung; A und C, Phasenkontrast; B und D UV-Licht. Ein repräsentatives multinukleäres Synzytium, dem Zellen einverleibt wurden, die die fluoreszente Markierung enthalten, ist durch den Pfeil identifiziert. (E) Quantifizierung der Synzytienbildung im Lauf der Zeit in vaskulären SMC, transfiziert mit retroviralen Vektoren: G1XSvNa, Kontrollvektor; G1aG1SvNa, Vektor, der das Antisense-Cyclin G1 Gen trägt; G1p53SvNa, Vektor, der den Wildtyp p53 trägt;
18: (A) Hochdichte Kulturen von Aorten-SMC, mit einer 200 μl Pipettenspitze abgekratzt, um eine 1 mm Spur ohne Zellen zu schaffen; (B) Das Erscheinungsbild des "gewundenen" Rands sofort nach dem Abkratzen und Waschen, um abgelöste Zellen zu entfernen; (C) Aorten-SMC, die nukleäre zielgerichtete β-Galactosidase entlang der Ränder der Spur exprimieren; (D) Proliferation und Migration der mit dem G1XSvNa Kontrollvektor transduzierten Aorten-SMC in die Spur 24 Stunden nach der Verletzung; (E) Apoptotische und degenerative Änderungen in mit dem G1aG1SvNa Vektor transduzierten Aorten-SMC mit ausgeprägter Synzytienbildung; und
19: Test der Wirksamkeit eines Antisense-Cyclin G1 Vektors bei einem Rattenkarotisverletzungsmodell der Restenosierung. Die Elastinschicht der Tunica media ist (in A-D) durch die Verhoeffsche Färbung identifiziert. Die Neointima, die aus proliferierenden glatten Muskelzellen (rötlichgelbe färbende Zellen) besteht, wird durch eine Siris-Rotfärbung identifiziert. A und C = nichtbehandelte arterielle Segmente; B und D = mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelte arterielle Segmente. E und F = höhere Vergrößerung von nichtbehandelten bzw. mit aG1 behandelten arteriellen Segmenten; G = Analyse der Verhältnisse von Neointima zu Media von nichtbehandelten (NT), Kontroll-(GIX) und mit Antisense-Cyclin G1 (aG1) behandelten arteriellen Segmenten sind als vertikale Balken dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel, das das Cyclin G1 Protein inhibiert, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren für die Behandlung eines Tumors in einem Wirt zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst das Verabreichen eines Mittels das das Cyclin G1 Protein inhibiert an einen Wirt oder an den Tumor. Das Mittel wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um das Cyclin G1 Protein in den Tumorzellen zu inhibieren.
Der Begriff "Behandeln eines Tumors", wie hier verwendet, bedeutet, daß für das Inhibieren, Verhindern oder Zerstören des Wachstums der Tumorzellen gesorgt wird.
Der Begriff "Inhibieren des Cyclin G1 Proteins", wie hier verwendet, bedeutet, dass das Mittel die Expression eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids, inhibiert oder verhindert oder die Funktion des Cyclin G1 Proteins inhibiert oder verhindert.
Mittel, die das Cyclin G1 Protein inhibieren, sind Antisense-Oligonucleotide oder Polynucleotidfragmente oder -sequenzen, die zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär sind und die sich an ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid binden, um die Expression eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids zu verhindern und Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die das Cyclin G1 Protein erkennen.
Bei einer Ausführungsform ist das Mittel, das das Cyclin G1 Protein inhibiert, ein Antisense-Polynucleotid, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist. Eine Nucleotid-cDNA (1) und eine deduzierte Aminosäuresequenz von humanem Cyclin G1 Protein ist beschrieben in Wu, et al., Oncology Reports, Band 1, Seiten 705-711 (1994), das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Der Begriff "Polynucleotid", wie hier verwendet, bedeutet eine polymere Form des Nucleotids jeder Länge und umfasst Ribonucleotide und Desoxyribonucleotide. Ein solcher Begriff umfasst auch Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA sowie Einzelstrang- und Doppelstrang-RNS. Der Begriff umfasst auch modifizierte Polynucleotide wie methylierte und geschützte Polynucleotide.
Im Allgemeinen umfasst das Antisense-Polynucleotid, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist, mindestens 15 Nucleotide, vorzugsweise mindestens 18 Nucleotide und stärker bevorzugt 18 bis 20 Nucleotide. Bei einer Ausführungsform ist das Antisense-Polynucleotid zu der gesamten Länge des für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär.
Bei einer Ausführungsform ist das Antisense-Polynucleotid komplementär zu mindestens einem Abschnitt der für das Cyclin G1 Protein codierenden mRNA und somit fähig, sich an diesen zu binden oder mit diesem zu hybridisieren, wodurch die Translation solcher mRNA inhibiert wird. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Polynucleotid komplementär zu der für das Cyclin G1 Protein codierenden Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNA und somit fähig, sich an diese zu binden oder mit dieser zu hybridisieren, wodurch die Transkription einer solchen DNA zu mRNA verhindert wird oder die Replikation solcher DNA inhibiert wird. Das Antisense-Polynucleotid kann sich an jeden Abschnitt der für das Cyclin G1 Protein codierenden DNA oder mRNA binden, jedoch bindet sich ein solches Antisense-Polynucleotid vorzugsweise an das 5'-Ende der DNA oder mRNA.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Antisense-Polynucleotid ein Ribozym sein, das die Spaltung der für das Cyclin G1 codierenden mRNA fördert. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Ribozym" jeden Einzelstrang des Polynucleotids, der eine sekundäre Struktur bildet, die die katalytische Spaltung eines Ziel-mRNA-Moleküls fördert, wenn die spezifische sequenzbasierte Erkennung der Ziel-mRNA erreicht wird.
Das Antisense-Oligonucleotid kann gemäß Techniken, die Fachleuten bekannt sind, synthetisiert werden, wie beispielsweise einer automatischen Oligonucieotid-Synthetisierungsvorrichtung. Das Antisense-Oligonucleotid wird dann einem Wirt in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Expression eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids in Tumorzellen eines Wirts zu inhibieren. Das Antisense-Oligonucleotid kann in einer Menge von etwa 0,1 μM bis etwa 10 μM, vorzugsweise etwa 1 μM bis etwa 5 μM, verabreicht werden. Der Wirt kann ein tierischer Wirt und insbesondere ein Säugerwirt, einschließlich eines humanen und nichthumanen Primatenwirts, sein. Das Antisense-Oligonucleotid wird im Allgemeinen dem Wirt systemisch zusammen mit einem annehmbaren pharmazeutischen Träger wie einer physiologischen Kochsalzlösung verabreicht. Alternativ können die Antisense-Oligonucleotide innerhalb von Liposomen enthalten sein, die dem Wirt systemisch zusammen mit einem annehmbaren pharmazeutischen Träger verabreicht werden. Eine solche systemische Verabreichung kann beispielsweise eine intravenöse, intraarterielle oder intraperitoneale Verabreichung sein. Alternativ kann das Antisense-Oligonucleotid dem Tumor direkt verabreicht werden.
Die Antisense-Oligonucleotide können modifiziert werden, um das Oligonucleotid gegen Degradation durch Nucleasen zu stabilisieren und/oder um die Fähigkeit des Antisense-Oligonucleotids, in die Tumorzellen einzudringen, zu verbessern.
Eine solche Modifikation kann durch Substituieren von mindestens einer der Phosphodiesterbindungen des Antisense-Oligonucleotids mit einer Struktur bewirkt werden, die für eine erhöhte Stabilisierung des Antisense-Oligonucleotids gegen Degradation durch Nucleasen sorgt und/oder die Fähigkeit des Antisense-Oligonucleotids, in die Tumorzellen einzudringen, verbessert. Solche Substitutionen können Phosphorthioat- und Phosphordithioat-Bindungen, Phosphotriester-, Alkyl- oder Arylphosphonatbindungen wie Methylphosphonatbindungen, kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkylstrukturen oder kurzkettige heteroatomare oder heterocyclische Strukturen wie beispielsweise CH₂-NH-O-CH₂, CH₂-N(CH₃)-O-CH₂, CH₂-O-N(CH₃)-CH₂, CH₂N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂ und O-N(CH₃)-CH₂-CH₂ sowie Morpholino-Strukturen umfassen. Beispiele solcher Modifikationen sind in der PCT-Anmeldung Nr. WO93/05182 , veröffentlicht am 18. März 1993, und in dem US-Patent Nr. 5,034,506 , erteilt am 23. Juli 1991, beschrieben. Beispiele von Alkyl- oder Arylphosphonatbindungen sind auch beschrieben in den US-Patenten Nr. 4,469,863 und 4,511,713 . Alternativ kann mindestens ein Nucleotid des Antisense-Oligonucleotids an eine Komponente konjugiert werden, die eine Aminosäure, ein Dipeptidnachahmer, ein Zucker, ein Zuckerphosphat, ein Neurotransmitter, ein hydrophiles Polymer wie Polyhydroxypropylmethacrylamid, Dextrane, Polymaleinsäureanhydrid, ein Cyclodextrin, eine Stärke oder Polyethylenimin sein kann. Beispiele solcher Komponenten sind in der PCT-Anmeldung Nr. WO94/01448 , veröffentlicht am 20. Januar 1994, beschrieben. Weitere Beispiele von Komponenten, die bei dem Modifizieren des Antisense-Oligonucleotids verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Alkyl- oder Arylphosphorate, Carbamate, Sulfamate und (Thio)formacetal.
Die vorstehend angegebenen Modifikationen können an dem Antisense-Oligonucleotid während der Synthese des Antisense-Oligonucleotids durch Mittel, die Fachleuten bekannt sind, durchgeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Antisense-Oligonucleotid, wenn das Antisense-Oligonucleotid direkt oder in einem Liposom verabreicht wird, mindestens eine Phosphorothioat- oder Phosphorodithioat-Linkerkomponente, die an dem Grundgerüst des Antisense-Oligonucleotids während der Synthese durch Fachleuten bekannte Techniken angeheftet werden kann.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird das Antisense-Oligonucleotid dem Wirt durch Transduzieren von Tumorzellen des Wirts mit einem für ein Antisense-Polynucleotid codierenden Polynucleotid verabreicht, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist.
Das für ein Antisense-Polynucleotid codierende Polynucleotid, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist, kann innerhalb eines geeigneten Expressionsvehikel enthalten sein, das in die Tumorzelle transduziert wird. Solche Expressionsvehikel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Plasmide, eukaryontische Vektoren, prokaryontische Vektoren (wie beispielsweise bakterielle Vektoren) und virale Vektoren.
Bei einer Ausführungsform ist der Vektor ein viraler Vektor. Virale Vektoren, die verwendet werden können, umfassen RNS-Virusvektoren (wie retrovirale Vektoren) und DNA-Virusvektoren (wie adenovirale Vektoren, adenoassoziierte Virusvektoren, Herpes-Virus-Vektoren und Vaccinia-Virus-Vektoren). Wenn ein RNS-Virusvektor beim Konstruieren des Vektors verwendet wird, liegt das für das Antisense-Polynucleotid codierende Polynucleotid in der Form von RNS vor. Wenn ein DNA-Virusvektor beim Konstruieren des Vektors verwendet wird, liegt das für das Antisense-Polynucleotid codierende Polynucleotid in der Form von DNA vor.
Bei einer Ausführungsform ist der virale Vektor ein retroviraler Vektor. Beispiele von retroviralen Vektoren, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Moloney-Maus-Leukämie-Virus, Milznekrosevirus und Vektoren, abgeleitet von Retroviren wie dem Rous-Sarcoma-Virus, dem Harvey-Sarcoma-Virus, dem Geflügel-Leukosevirus, dem humanen Immundefektvirus, dem myeloproliferativen Sarcomavirus und dem Brusttumorvirus. Der Vektor ist im Allgemeinen ein replikationsinkompetentes Retrovirusteilchen.
Retrovirale Vektoren sind als Mittel brauchbar, den retroviral vermittelten Gentransfer in eukaryontische Zellen zu vermitteln. Retrovirale Vektoren sind im Allgemeinen derartig konstruiert, dass die Mehrzahl der für die strukturellen Gene des Virus codierenden Sequenzen deletiert und durch das bzw. die Gen(e), die von Interesse sind, ersetzt wird. Am häufigsten werden die strukturellen Gene (d.h. gag, pol and env) aus dem retroviralen Grundgerüst unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Gentechniktechniken entfernt. Dies kann die Verdauung mit der geeigneten Restriktions-Endonuclease oder in einigen Fällen mit der BaI 31 Exonuclease umfassen, um Fragmente zu erzeugen, die geeignete Abschnitte des Verpackungssignals enthalten.
Diese neuen Gene wurden dem proviralen Grundgerüst auf mehrere allgemeine Wege einverleibt. Die einfachsten Konstruktionen sind diejenigen, bei denen die strukturellen Gene des Retrovirus durch ein einziges Gen ersetzt werden, das dann unter der Kontrolle der viralen regulatorischen Sequenzen innerhalb der langen terminalen Sequenzwiederholung (LTR) transcribiert wird. Retrovirale Vektoren wurden auch konstruiert, die mehr als ein Gen in die Zielzellen einführen können. Üblicherweise steht bei solchen Vektoren ein Gen unter der regulatorischen Kontrolle der viralen LTR, während das zweite Gen entweder von einer gespleißten Botschaft exprimiert wird oder unter der Regelung seines eigenen inneren Promotors steht. Alternativ können zwei Gene aus einem einzigen Promotor durch die Verwendung einer inneren Ribosomeneintrittsstelle exprimiert werden.
Anstrengungen wurden auf das Minimieren der viralen Komponente des viralen Grundgerüsts im Wesentlichen in einer Anstrengung gerichtet, die Möglichkeit der Rekombination zwischen dem Vektor und dem verpackungsdefekten Helfervirus innerhalb der Verpackungszellen zu verringern. Ein verpackungsdefektes Helfervirus ist notwendig, um die strukturellen Gene eines Retrovirus zur schaffen, die aus dem Vektor selbst deletiert worden sind.
Beispiele von retroviralen Vektoren, die verwendet werden können, umfassen retrovirale Vektoren, die aus retroviralen Plasmidvektoren erzeugt werden, die abgeleitet sind aus Retroviren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Vektoren wie denjenigen, die in Miller, et al., Biotechniques, Band 7, Seiten 980-990 (1989) und in Miller, et al., Human Gene Therapy, Band 1, Seiten 5-14 (1990) beschrieben sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann der retrovirale Plasmidvektor mindestens vier Klonierungs- oder Restriktionsenzymerkennungsstellen umfassen, wobei mindestens zwei der Stellen eine durchschnittliche Häufigkeit des Vorkommens in eukaryontischen Genen von weniger als einmal in 10.000 Basenpaaren aufweisen; d.h. das Restriktionsprodukt besitzt eine durchschnittliche DNA-Größe von mindestens 10.000 Basenpaaren. Bevorzugte Klonierungsstellen sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus NotI, SnaBI, SalI und XhoI. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der retrovirale Plasmidvektor jede dieser Klonierungsstellen. Solche Vektoren sind des weiteren in der US-Patentveröffentlichung 5,672,510 (Serial No. 08/340,805), eingereicht am 17. November 1994, und in der PCT-Anmeldung Nr. WO91/10728 , veröffentlicht am 25. Juli 1991, beschrieben.
Wenn ein retroviraler Plasmidvektor, der solche Klonierungsstellen aufweist, verwendet wird, kann auch ein Shuttle-Klonierungsvektor vorgesehen werden, der mindestens zwei Klonierungsstellen aufweist, die mit mindestens zwei Klonierungsstellen kompatibel sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus NotI, SnaBI, SalI und XhoI, die sich auf dem retroviralen Vektor befinden. Der Shuttle-Klonierungsvektor umfasst auch mindestens ein gewünschtes Gen, das von dem Shuttle-Klonierungsvektor auf den retroviralen Vektor transferiert werden kann.
Der Shuttle-Clonierungsvektor kann aus einem grundlegenden "Grundgerüst"-Vektor oder Fragment konstruiert werden, an dem ein oder mehrere Linker ligasiert sind, die Klonierungs- oder Restriktionserkennungsstellen enthalten. In den Klonierungsstellen enthalten sind die kompatiblen oder komplementären Klonierungsstellen, die vorstehend beschrieben sind. Gene und/oder Promotoren, die Enden haben, die den Restriktionsstellen des Shuttle-Vektors entsprechen, können mittels im Stand der Technik bekannter Techniken in den Shuttle-Vektor ligasiert werden.
Der Shuttle-Klonierungsvektor kann verwendet werden, um DNA-Sequenzen in prokaryontischen Systemen zu amplifizieren. Der Shuttle-Clonierungsvektor kann aus Plasmiden hergestellt werden, die im Allgemeinen in prokaryontischen Systemen und insbesondere in Bakterien verwendet werden. So kann der Shuttle-Clonierungsvektor beispielsweise von Plasmiden wie pBR322; pUC 18; usw. abgeleitet werden.
Der retrovirale Plasmidvektor umfasst einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die retrovirale LTR; den SV40 Promotor; und den humanen Zytomegalovirus-(CMV-)Promotor, der in Miller, et al., Biotechniques, Band 7, Nr. 9, 980-990 (1989), beschrieben ist oder jeden anderen Promotor (z.B. zelluläre Promotoren wie beispielsweise eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Histon-, polIII-, und S-Actin-Promotoren). Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Adenovirus-Promotoren, TK-Promotoren und B19 Parvovirus-Promotoren. Die Auswahl eines geeigneten Promotors ist für Fachleute aus den hier enthaltenen Lehren ersichtlich.
Der retrovirale Plasmidvektor wird dann verwendet, um eine Verpackungszelllinie zu transduzieren, um eine Erzeugerzelllinie zu bilden. Beispiele von Verpackungszellen, die transfiziert werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die PE501-, PA317-, Ψ-2-, Ψ-AM-, PA12-, T19-14X-, VT-19-17-H2-, Ψ CRE-, Ψ CRIP-, GP+E-86-, GP+envAm12- und DAN-Zellinien, wie in Miller, Human Gene Therapy, Band 1, Seiten 5-14 (1990) beschrieben. Der retrovirale Plasmidvektor, der das für das Antisense-Polynucleotid codierende Polynucleotid enthält, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist, transduziert die Verpackungszellen mittels jedes im Stand der Technik bekannten Mittels. Solche Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und die CaPO₄-Ausfällung.
Die Verpackungszellen werden so Erzeugerzellen, die retrovirale Vektoren erzeugen, die ein für ein Antisense-Polynucleotid codierendes Polynucleotid umfassen, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist. Solche retroviralen Vektoren werden dann in die Tumorzellen transduziert, wodurch die transduzierten Tumorzellen das Antisense-Polynucleotid erzeugen, das zu mindestens einem Abschnitt des für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist.
Die retroviralen Vektoren werden einem Wirt in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um das Wachstum von Tumorzellen durch die Inhibierung der Expression des für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids in den Tumorzellen zu inhibieren, zu verhindern oder zu zerstören. Eine solche Verabreichung kann eine systemische Verabreichung, wie vorstehend beschrieben, oder eine direkte Injektion der retroviralen Vektoren in den Tumor sein. Im Allgemeinen werden die retroviralen Vektoren in einer Menge von mindestens 1 × 10⁵ cfu/ml verabreicht, und im Allgemeinen ist eine solche Menge nicht höher als 1 × 10⁹ cfu/ml. Vorzugsweise werden die retroviralen Vektoren in einer Menge von etwa 1 × 10⁶ cfu/ml bis etwa 1 × 10⁸ cfu/ml verabreicht. Die genaue zu verabreichende Dosierung hängt von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich des Alters, des Gewichts und des Geschlechts des Patienten und der Größe und dem Schweregrad des Tumors ab, der behandelt wird.
Die retroviralen Vektoren können auch zusammen mit einem akzeptablen pharmazeutischen Träger wie beispielsweise einer physiologischen Kochsalzlösung, Protaminsulfat (Elkins Sinn, Inc., Cherry Hill, N.J.), Wasser, wässerigen Puffern wie Phosphatpuffern und Tris-Puffern, oder Polybren (Sigma Chemical, St. Louis, MO) verabreicht werden. Die Wahl eines geeigneten pharmazeutischen Trägers wird für Fachleute aus den hier enthaltenen Lehren als offensichtlich erachtet.
Bei einer weiteren Alternative können retrovirale Erzeugerzellen wie diejenigen, die von den vorstehend beschriebenen Verpackungszellen abgeleitet sind, die ein für ein Antisense-Polynucleotid codierendes Polynucleotid umfassen, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist, einem Wirt verabreicht werden. Solche Erzeugerzellen können bei einer Ausführungsform systemisch (z.B. intravenös oder intraarteriell) an einem Punkt in enger Nähe zu dem Tumor verabreicht werden oder die Erzeugerzellen können dem Tumor direkt verabreicht werden. Die Erzeugerzelllinie erzeugt dann retrovirale Vektoren, einschließlich eines für ein Antisense-Polynucleotid codierenden Polynucleotids, in vivo, wodurch solche retroviralen Vektoren dann die Tumorzellen transduzieren.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel, das das Cyclin G1 Protein inhibiert, ein Antagonist für das Cyclin G1 Protein, der sich an das Cyclin G1 Protein bindet und es inhibiert. Beispiele von Antagonisten für das Cyclin G1 Protein umfassen, sind Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die das Cyclin G1 Protein erkennen.
Bei einer Ausführungsform ist der Antagonist ein Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon, der das Cyclin G1 Protein erkennt. Der Begriff "Fragment oder Derivat davon" bedeutet einen Antikörper mit Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäureresten mit Bezug auf den nichtmodifizierten Antikörper, jedoch erkennt ein solches Fragment oder Derivat das Cyclin G1 Protein. Ein solcher Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Bei einer Ausführungsform ist der Antikörper ein einkettigen Antikörper.
Vorzugsweise wird der Antikörper dem Wirt derart verabreicht, dass der Antikörper oder das Fragment oder Derivat davon in die Tumorzellen eintritt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper oder das Fragment oder Derivat davon, der bzw. das das Cyclin G1 Protein erkennt, dem Wirt durch Transduzieren von Tumorzellen des Wirts mit einem für den Antikörper codierenden Polynucleotid oder ein Fragment oder Derivat davon, das das Cyclin G1 Protein erkennt, verabreicht. Das Polynucleotid kann in einem geeigneten Expressionsvehikel wie denjenigen, die vorstehend beschrieben sind, enthalten sein. Bei einer Ausführungsform ist das Polynucleotid in einem retroviralen Vektor enthalten, der ein retroviraler Vektor sein kann, wie vorstehend beschrieben ist.
Der Vektor, der das für einen Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon codierende Polynucleotid enthält, das das Cyclin G1 Protein erkennt, wird dem Wirt in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Funktion des Cyclin G1 Proteins in den Tumorzellen in dem Wirt zu inhibieren. Wenn ein retroviraler Vektor verwendet wird, wird ein solcher retroviraler Vektor in einer Menge von etwa 1 × 10⁶ cfu/ml bis etwa 1 × 10⁸ cfu/ml verabreicht. Ein solcher Vektor kann systemisch verabreicht werden (wie beispielsweise mittels intravenöser, intraarterieller oder intraperitonealer Verabreichung) oder alternativ kann der Vektor direkt dem Tumor verabreicht werden. Die Vektoren transduzieren dann die Tumorzellen, wodurch der Antikörper oder ein Fragment oder ein Derivat davon, der das Cyclin G1 Protein erkennt, in den Tumorzellen exprimiert wird. Ein solcher Antikörper oder Fragment oder Derivat davon bindet sich an das Cyclin G1 Protein in den Tumorzellen, wodurch die Funktion des Cyclin G1 Proteins in den Tumorzellen inhibiert wird.
Tumore, die gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Inhibierung des Cyclin G1 Proteins behandelt werden können, umfassen nichtbösartige sowie bösartige oder kanzeröse Tumore. Kanzeröse Tumore, die behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, osteogenes Sarkom und Ewing-Sarkom und andere neoplastische Erkrankungen, bei denen das Cyclin G1 exprimiert wird, wie Glioblastom, Neuroblastom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Leukämien, Lymphome (einschließlich Hodgin- und Nichthodgin-Lymphom), Fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, Darmkrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs wie hepatozelluläre Karzinome und Adenokarzinome.
Die vorstehend angegebenen Behandlungen, bei denen das Cyclin G1 inhibiert wird, können auch in Kombination mit anderen Behandlungen von Tumoren kombiniert werden, wie beispielsweise (i) Strahlung; (ii) Chemotherapie; oder (iii) die Transduktion der Tumorzellen mit einem für einen negativen selektiven Marker codierenden Polynucleotid wie beispielsweise einem viralen Thymidinkinasegen, gefolgt von der Verabreichung eines Wechselwirkungsmittels wie beispielsweise Ganciclovir, das die Zellen tötet, die mit dem für den negativen selektiven Marker codierenden Polynucleotid transduziert sind.
Bei einer Ausführungsform wird ein Mittel, das das Cyclin G1 Protein inhibiert, einem Wirt gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren verabreicht. Das Wachstum aller Tumorzellen, die das Mittel enthalten, wird inhibiert, verhindert oder zerstört. Des weiteren werden die Tumorzellen mit einem für einen negativen selektiven Marker oder "Selbstmord"-Gen codierenden Polynucleotid transduziert. Das für den negativen selektiven Marker codierende Polynucleotid kann in einem Expressionsvehikel wie denjenigen, die vorstehend beschrieben sind, enthalten sein. Wenn die Tumorzellen erst mit dem für den negativen selektiven Marker codierenden Polynucleotid transduziert sind, wird ein Wechselwirkungsmittel dem Wirt verabreicht, wodurch das Wechselwirkungsmittel mit dem negativen selektiven Marker in Wechselwirkung steht, um das Wachstum der Tumorzellen zu verhindern, zu inhibieren oder zu zerstören.
Negative selektive Marker, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Thymidinkinase wie Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase, Zytomegalovirus-Thymidinkinase und Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase; und Zytosindesaminase.
Bei einer Ausführungsform ist der selektive Marker eine virale Thymidinkinase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase, Zytomegalovirus-Thymidinkinase und Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase. Wenn solche viralen Thymidinkinasen verwendet werden, ist das Wechselwirkungs- oder chemotherapeutische Mittel vorzugsweise ein Nucleosidanalogon, beispielsweise eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ganciclovir, Acyclovir und 1-2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinofuranosil-5-ioduracil (FIAU). Solche Wechselwirkungsmittel werden wirksam durch die viralen T-Thymidinkinasen als Substrate verwendet, und solche Wechselwirkungsmittel sind so letal der DNA der Tumorzellen einverleibt, die die viralen Thymidinkinasen exprimieren, was zu dem Tod der Tumorzellen führt.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der negative selektive Marker Cytosindesaminase. Wenn Cytosindesaminase der negative selektive Marker ist, ist ein bevorzugtes Wechselwirkungsmittel 5-Fluorcytosin. Cytosindesaminase wandelt 5-Fluorcytosin in 5-Fluoruracil um, das sehr zytotoxisch ist. So wandeln Tumorzellen, die das Cytosindesaminasegen exprimieren, das 5-Fluorcytosin in 5-Fluoruracil um und werden getötet.
Das Wechselwirkungsmittel wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um das Wachstum der transduzierten Tumorzellen zu inhibieren, zu verhindern oder zu zerstören. Beispielsweise kann das Wechselwirkungsmittel in einer Menge von 5 mg bis 10 mg/kg Körpergewicht in Abhängigkeit von der Gesamttoxizität einem Patienten verabreicht werden. Das Wechselwirkungsmittel wird vorzugsweise systemisch wie beispielsweise mittels intravenöser Verabreichung, mittels parenteraler Verabreichung, mittels intraperitonealer Verabreichung oder mittels intramuskulärer Verabreichung verabreicht.
Wenn ein Expressionsvehikel, wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind, einschließlich eines negativen selektiven Markers, Tumorzellen verabreicht wird, kann sich eine "Bystander"-Wirkung ergeben, d.h. Tumorzellen, die ursprünglich nicht mit der für den negativen selektiven Marker codierenden Nucleinsäuresequenz transduziert wurden, können bei Verabreichung des Wechselwirkungsmittels getötet werden. Obgleich die Anmelder nicht beabsichtigen, auf irgendeine theoretischen Denkweise beschränkt zu werden, können die transformierten Tumorzellen eine diffusionsfähige Form des negativen selektiven Markers erzeugen, die entweder extrazellulär auf das Wechselwirkungsmittels wirkt oder von benachbarten, nichttransformierten Tumorzellen aufgenommen wird, die dann gegenüber der Wirkung des Wechselwirkungsmittels empfänglich werden. Es ist auch möglich, dass eines oder beide von negativem selektiven Marker und Wechselwirkungsmittel zwischen Tumorzellen übertragen werden.
Mittel, die das Cyclin G1 Protein inhibieren, können auch eine vaskuläre Restenosierung nach invasiven vaskulären Verfahren wie einer Angioplastie, vaskulären Implantaten wie arteriellen Implantaten oder einer koronaren Bypasschirurgie verhindern. So wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für das Verhindern einer Restenosierung zur Verfügung gestellt, das das Verabreichen eines Mittels, das das Cyclin G1 Protein inhibiert, an einen Wirt oder an die Stelle eines invasiven vaskulären Verfahrens oder einer vaskulären Läsion umfasst. Das Mittel wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Restenosierung in einem Wirt zu verhindern. Das Mittel kann während oder nach dem invasiven vaskulären Verfahren verabreicht werden. Der Begriff "invasives vaskuläres Verfahren", wie hier verwendet, bedeutet jedes Verfahren, das die Reparatur, das Entfernen, Ersetzen und/oder Umleiten (z.B. Bypass oder Shunt) eines Abschnitts des vaskulären Systems umfasst, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Arterien und Venen. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Angioplastie, vaskuläre Implantate wie arterielle Implantate, das Entfernen von Blutgerinnseln, das Entfernen von Abschnitten von Arterien oder Venen und die koronare Bypasschirugie.
Mittel, die das Cyclin G1 Protein inhibieren und die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die vorstehend erwähnt sind. Vorzugsweise ist das Mittel, das das Cyclin G1 Protein inhibiert, ein Antisense-Polynucleotid, das komplementär zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids wie vorstehend beschrieben ist und sich so an diesen binden oder diesen hybridisieren kann. Ein solches Antisense-Oligonucleotid kann eine Länge haben wie vorstehend beschrieben und kann in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist, um eine Restenosierung zu verhindern. Eine solche Menge kann wie vorstehend beschrieben sein. Das Antisense-Oligonucleotid kann intravaskulär verabreicht werden und kann direkt an die Stelle des invasiven vaskulären Verfahrens oder der vaskulären Läsion verabreicht werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Antisense-Oligonucleotid dem Wirt durch Transduzieren von vaskulären Zellen an der Stelle eines invasiven vaskulären Verfahrens oder einer vaskulären Läsion mit einem für ein Antisense-Polynucleotid codierenden Polynucleotid, das zu mindestens einem Abschnitt eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids komplementär ist, verabreicht. Ein solches für das Antisense-Polynucleotid codierendes Polynucleotid kann in einem geeigneten Expressionsvehikel wie vorstehend beschrieben enthalten sein, das in die Zellen der Stelle eines invasiven vaskulären Verfahrens oder einer vaskulären Läsion transduziert wird. Bei einer Ausführungsform ist das Expressionsvehikel ein viraler Vektor wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Bei einer Ausführungsform ist der virale Vektor ein retroviraler Vektor, der wie vorstehend beschrieben sein kann.
Wenn ein retroviraler Vektor verwendet wird, wird ein solcher retroviraler Vektor in einer vorstehend beschriebenen Menge verabreicht und wird intravaskulär verabreicht. Bei einer Ausführungsform wird der retrovirale Vektor der Stelle des invasiven vaskulären Verfahrens oder der vaskulären Läsion verabreicht. Die Vektoren transduzieren die vaskulären Zellen an der Stelle des invasiven vaskulären Verfahrens oder der vaskulären Läsion, wodurch das Antisense-Oligonucleotid in solchen Zellen erzeugt wird, wodurch die Expression eines für das Cyclin G1 codierenden Polynucleotids in solchen Zellen inhibiert wird und so die Restenosierung durch Verhindern der Proliferation solcher Zellen verhindert wird.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Mittel, das das Cyclin G1 Protein inhibiert, ein Antagonist für das Cyclin G1 Protein, der sich an das Cyclin G1 Protein bindet und dieses inhibiert wie vorstehend beschrieben, und bei einer Ausführungsform kann es ein Antikörper oder Fragment oder Derivat davon sein, der bzw. das das Cyclin G1 Protein erkennt.
Der Antikörper wird dem Wirt derart verabreicht, dass der Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon in die Zellen an der Stelle des invasiven vaskulären Verfahrens oder der vaskulären Läsion eintritt. Vorzugsweise wird der Antikörper oder das Fragment oder Derivat davon, der bzw. das das Cyclin G1 Protein erkennt, durch das Transduzieren von Zellen an der Stelle des invasiven vaskulären Verfahrens oder einer vaskulären Läsion mit einem für den Antikörper oder das Fragment oder Derivat davon codierenden Polynucleotid, der bzw. das das Cyclin G1 Protein erkennt, verabreicht. Das Polynucleotid kann in einem geeigneten Expressionsvehikel enthalten sein, wie denjenigen, die vorstehend beschrieben sind. Bei einer Ausführungsform ist das Expressionsvehikel ein retroviraler Vektor, wie vorstehend beschrieben, der in einer vorstehend beschriebenen Menge verabreicht werden kann. Ein solcher Vektor wird intravaskulär wie vorstehend beschrieben verabreicht und kann der Stelle eines invasiven vaskulären Verfahrens oder einer vaskulären Läsion direkt verabreicht werden.
Dieses Verfahren ist auf die Verhinderung und Behandlung einer Restenosierung und die Verhinderung oder Behandlung von vaskulären Läsionen nach einer Vielzahl von invasiven vaskulären Verfahren anwendbar, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, kardiovaskulärer Angioplastie, arterieller Implantate und koronarer Bypasschirurgie. Dieses Verfahren ist auch bei der Verhinderung und Behandlung von vaskulären Läsionen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Läsionen der Oberschenkelarterien, der Karotis oder der Nierenarterien, insbesondere der Nierenarterien, die mit Nierendialysefisteln verbunden sind, verwendbar.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro Verfahren für das Immortalisieren von Nichttumorzellen zur Verfügung gestellt, das das Transduzieren der Nichttumorzellen mit einem für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotid oder einem Derivat oder Analogon davon umfasst. Der Begriff "Derivat oder Analogon davon", wie hier verwendet, bedeutet, dass das Protein ein Protein sein kann, das Deletionen und/oder Substitutionen der Aminosäurereste mit Bezug auf die native Cyclin G1 Proteinsequenz aufweist und dennoch die gleichen biologischen Eigenschaften wie natives oder nichtmodifiziertes Cyclin G1 Protein beibehält. Obgleich der Umfang dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung nicht nur auf irgendwelche theoretischen Schlussfolgerungen eingeschränkt werden soll, haben die Anmelder entdeckt, dass die Überexpression des Cyclin G1 Proteins in Nichttumorzellen zu der Zellimmortalisierung und permanenten Zelllinien beitragen würde, die die Fähigkeit beibehalten, auf anschließende Zellzyklusereignisse zu reagieren, wobei die Verwendung viraler Onkogene, die eine Zelltransformation verursachen, vermieden wird.
Das für das Cyclin G1 Protein codierende Polynucleotid oder ein Fragment oder Derivat davon kann in einem geeigneten Expressionsvehikel enthalten sein, das wie vorstehend beschrieben sein kann. Bei einer Ausführungsform ist das Expressionsvehikel ein retroviraler Vektor, der wie vorstehend beschrieben sein kann.
Nichttumorzellen, die gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung transduziert werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fibroblasten, Hepatozyten, Muskelzellen, Endothelialzellen und Epithelialzellen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro Verfahren des Verbesserns der Transduktion von Zellen mit einem retroviralen Vektor zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst das Transduzieren der Zellen mit einem ersten Expressionsvehikel, das ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid enthält. Das erste Expressionsvehikel ist kein retroviraler Vektor. Die Zellen werden auch mit einem zweiten Expressionsvehikel transduziert, das vorzugsweise ein ein therapeutisches Mittel codierendes Polynucleotid enthält. Das zweite Expressionsvehikel ist ein retroviraler Vektor. Dieses Verfahren kann zum Transduzieren von Zellen in vivo oder ex vivo oder in vitro verwendet werden.
Das erste Expressionsvehikel kann jedes Expressionsvehikel sein, das kein retroviraler Vektor ist. Solche Expressionsvehikel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Plasmidvektoren, eukaryontische Vektoren, prokaryontische Vektoren (wie beispielsweise bakterielle Vektoren) und andere virale Vektoren als retrovirale Vektoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, adenovirale Vektoren, mit den Adenovirus verbundene Vektoren, Herpes-Virus-Vektoren und Vaccinia-Virus-Vektoren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das erste Expressionsvehikel ein adenoviraler Vektor. Obgleich diese Ausführungsform nicht auf irgendwelche theoretischen Schlussfolgerungen beschränkt ist, wird das Cyclin G1 Protein in der sehr frühen G1 Phase induziert, wenn eine Zellaktivierung stattfindet. Die Transduktion der Zellen mit einem adenoviralen Vektor, einschließlich eines für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotids sorgt für eine vorübergehende Überexpression des Cyclin G1 Proteins in den Zellen, wodurch die Zellen aktiviert werden und die erhöhte Integration des retroviralen Vektors, einschließlich des für das therapeutische Mittel codierenden Polynucleotids in die Zellen ermöglicht wird. Ein solches Verfahren ist insbesondere auf das Einführen von retroviralen Vektoren in Zellen mit niedrigen Replikationsindizes und einer niedrigen Transduktionseffizienz anwendbar.
Der adenovirale Vektor, der verwendet wird, kann bei einer Ausführungsform ein adenoviraler Vektor sein, der im Wesentlichen das vollständige adenovirale Genom enthält (Shenk et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 111(3): 1-39 (1984)). Alternativ kann der adenovirale Vektor ein modifizierter adenoviraler Vektor sein, bei dem mindestens ein Abschnitt des adenoviralen Genoms deletiert worden ist.
Bei der bevorzugten Ausführungsform umfasst der adenovirale Vektor ein adenovirales 5'-ITR, ein adenovirales 3'-ITR, ein adenovirales Vercapsidierungssignal; eine für das Cyclin G1 Protein codierende DNA-Sequenz und einen eine für das Cyclin G1 Protein codierende DNA-Sequenz steuernden Promotor. Der Promotor ist frei von mindestens der Mehrheit der adenoviralen E1- und E3-DNA-Sequenzen, jedoch nicht frei von allen der E2- und E4-DNA-Sequenzen und für die adenoviralen Proteine codierenden DNA-Sequenzen, die durch den adenoviralen späten Hauptpromotor gefördert werden.
Bei einer Ausführungsform ist der Vektor auch frei von mindestens einem Abschnitt von mindestens einer DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den E2- und E4-DNA-Sequenzen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Vektor frei von mindestens dem größten Teil der adenoviralen E1- und E3-DNA-Sequenzen und frei von einem Abschnitt der anderen der E2- und E4-DNA-Sequenzen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Gen in dem E2a-Bereich, das für das 72 Kilodalton Bindungsprotein codiert, mutiert, um ein temperaturempfindliches Protein zu erzeugen, das bei 32°C aktiv ist, der Temperatur, bei der die viralen Teilchen erzeugt werden. Dieser temperaturempfindliche Mutant ist in Ensinger et al., J. Virology, 10:328-339 (1972), Van der Vliet et al., J. Virology, 15:348-354 (1975) und Friefeld et al., Virology, 124:380-389 (1983) beschrieben.
Ein solcher Vektor wird bei einer bevorzugten Ausführungsform zunächst durch Konstruieren eines Shuttle-Plasmids gemäß Standardtechniken konstruiert, das beginnend an dem 5'-Ende die "kritischen linken Endelemente" enthält, die ein adenovirales 5'-ITR, ein adenovirales Vercapsidierungssignal und eine E1a-Enhancer-Sequenz, einen Promotor (der ein adenoviraler Promotor oder ein Fremdpromotor sein kann); eine multiple Clonierungsstelle (die wie hier beschrieben sein kann), ein Poly-A-Signal und ein DNA-Segment, das einem Segment des adenoviralen Genoms entspricht, umfassen. Der Vektor kann auch eine dreiteilige Leader-Sequenz enthalten. Das DNA-Segment, das dem adenoviralen Genom entspricht, dient als Substrat für die homologe Rekombination mit einem modifizierten oder mutierten Adenovirus, und eine solche Sequenz kann beispielsweise ein Segment des Adenovirus-5-Genoms umfassen, das nicht länger als von der Base 3329 zur Base 6246 des Genoms ist. Das Plasmid kann auch einen selektierbaren Marker und einen Ursprung der Replikation enthalten. Der Ursprung der Replikation kann ein bakterieller Ursprung der Replikation sein. Repräsentative Beispiele solcher Shuttle-Plasmide umfassen pAvS6, das in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen Nr. WO94/23582 , veröffentlicht am 27. Oktober 1994, and WO95/09654 , veröffentlicht am 13. April 1995, beschrieben ist. Die für das Cyclin G1 Protein codierende DNA-Sequenz kann dann in die multiple Clonierungsstelle inseriert werden, um einen Plasmidvektor zu erzeugen.
Dieses Konstrukt wird dann verwendet, um einen adenoviralen Vektor zu erzeugen. Die homologe Rekombination wird mit einem modifizierten oder mutierten Adenovirus durchgeführt, bei dem mindestens der größte Teil der adenoviralen E1- und E3-DNA-Sequenzen deletiert worden sind. Eine solche homologe Rekombination kann durch die Cotransfektion des Plasmidvektors und des modifizierten Adenovirus in eine Helferzelllinie, wie 293 Zellen, mittels CAPO₄ Präzipitation bewirkt werden. Bei einer solchen homologen Rekombination wird ein rekombinanter adenoviraler Vektor gebildet, der DNA-Sequenzen, die von dem Shuttle-Plasmid zwischen der NotI Stelle und dem homologen Rekombinationsfragment abgeleitet sind, und DNA enthält, die von dem deletierten E1- und E3-Adenovirus zwischen dem homologen Rekombinationsfragment und dem 3'-ITR abgeleitet ist.
Bei einer Ausführungform überlappt sich das homologe Rekombinationsfragment mit Nucleotiden 3329 bis 6246 des Adenovirus 5 (ATCC VR-5) Genoms.
Durch eine solche homologe Rekombination wird ein Vektor gebildet, der ein adenovirales 5'-ITR, ein adenovirales Vercapsidierungssignal, eine E1a-Enhancer-Sequenz, einen Promotor, eine DNA-Sequenz, die für das Cyclin G1 Protein codiert, ein Poly-A-Signal, eine adenovirale DNA, die frei von mindestens dem größten Teil der adenoviralen E1- und E3-DNA-Sequenzen ist, und ein adenovirales 3'-ITR umfasst. Der Vektor kann auch eine dreiteilige Leader-Sequenz enthalten. Der Vektor kann dann in eine Helferzelllinie wie die 293 Helferzelllinie (ATCC Nr. CRL1573) transfiziert werden, die die E1a- und E1b-DNA-Sequenzen enthält, die für die virale Replikation erforderlich sind, um adenovirale Teilchen zu erzeugen. Die Transfektion kann mittels Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, Mikroinjektion oder mittels Proteoliposomen stattfinden.
Der vorstehend beschriebene Vektor kann eine multiple Clonierungsstelle enthalten, um die Insertion der DNA-Sequenz, die für das Cyclin G1 Protein codiert, in den Clonierungsvektor zu erleichtern. Im Allgemeinen umfasst die multiple Clonierungsstelle "seltene" Restriktionsenzymstellen, d.h. Stellen, die in eukaryontischen Genen mit einer Häufigkeit von etwa einer in jeweils 10.000 bis etwa einer in jeweils 100.000 Basenpaaren zu finden sind. Ein geeigneter Vektor wird so durch Schneiden des Clonierungsvektor mittels Standardtechniken an geeigneten Restriktionsstellen in der multiplen Clonierungsstelle und dann Ligasieren der DNA-Sequenz, die für das Cyclin G1 Protein codiert, in den Clonierungsvektor, gebildet.
Die für das Cyclin G1 Protein codierende DNA-Sequenz steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, der aus denjenigen, die hier beschrieben sind, ausgewählt werden kann, oder eine solche DNA kann unter der Kontrolle ihres eigenen nativen Promotors stehen.
Bei einer Ausführungsform kann der Adenovirus unter Verwendung eines künstlichen Hefechromosoms (oder YAC), das ein adenovirales Genom enthält, gemäß dem Verfahren, das in Ketner, et al., PNAS, Band 91, Seiten 6186-6190 (1994) beschrieben ist, zusammen mit den hier enthaltenen Lehren konstruiert werden. Bei dieser Ausführungsform wird das künstliche Hefechromosom des Adenovirus durch die homologe Rekombination in vivo zwischen der adenoviralen DNA und den künstlichen Hefechromosomplasmidvektoren, die Segmente der adenoviralen linken und rechten genomischen Termini tragen, hergestellt. Eine für das Cyclin G1 Protein codierende DNA-Sequenz kann dann in die adenovirale DNA geclont werden. Das modifizierte adenovirale Genom wird dann aus dem künstlichen Hefechromosom des Adenovirus ausgeschnitten, um zur Erzeugung von adenoviralen Vektorteilchen wie vorstehend beschrieben verwendet zu werden.
Der retrovirale Vektor, der das zweite Expressionsvehikel ist, kann wie vorstehend beschrieben sein. Ein solcher retroviraler Vektor umfasst ein für ein therapeutisches Mittel codierendes Polynucleotid. Der Begriff "therapeutisch" wird in einem generischen Sinn verwendet und umfasst Behandlungsmittel, prophylaktische Mittel und Substitutionsmittel.
Die für therapeutische Mittel codierenden Polynucleotide, die in dem retroviralen Plasmidvektor enthalten sein können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, für Tumornekrosefaktor-(TNF-)Gene codierende Polynucleotide wie TNF-α; für Interferon wie Interferon-α, Interferon-β und Interferon-γ codierende Gene; für Interleukine wie IL-1, IL-1β und Interleukine 2 bis 14 codierende Gene; für GM-CSF codierende Gene; für Adenosindesaminase oder ADA codierende Gene, für zellulläre Wachstumsfaktoren wie Lymphokine codierende Gene, welche Wachstumsfaktoren für Lymphozyten sind; für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und den Keratinozytenwachstumsfaktorr (KGF) codierende Gene; für lösliches CD4 codierende Gene; Faktor VIII; Faktor IX; Zytochrom b; Glucocerebrosidase; T-Zellrezeptoren; den LDL-Rezeptor, ApoE, ApoC, ApoAI und andere Gene, die an dem Cholesterintransport und -metabolismus beteiligt sind; das alpha-1-Antitrypsin-(α1AT-)Gen; das Insulingen; das Hypoxanthinphosphoribosyltransferase-Gen; das CFTR-Gen; negative selektive Marker oder "Selbstmord-" Gene wie virale Thymidinkinasegene, wie das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinasegen, das Zytomegalovirus-Virus-Thymidinkinasegen und das Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinasegen; Fc-Rezeptoren für antigenbindende Domänen von Antikörpern, Antisense-Sequenzen, die die virale Replikation inhibieren, wie Antisense-Sequenzen, die die Replikation von Hepatitis B oder Hepatitis-Non-A-Non-B-Virus inhibieren; Antisense-c-myb-Oligonucleotide; und Antioxidantien wie, jedoch nicht beschränkt auf, Mangansuperoxiddismutase (Mn-SOD), Katalase, Kupfer-Zink-Superoxiddismutase (CuZn-SOD), extrazelluläre Superoxiddismutase (EC-SOD) und Glutathionreduktase; Gewebeplasminogenaktivator (tPA); Harn-Plasminogenaktivator (Urokinase); Hirudin; das Phenylalaninhydroxylasegen; Stickoxidsynthetase; vasoaktive Peptide; angiogene Peptide; das Dopamingen; das Dystrophingen; das β-Globingen; das α-Globingen; das HbA-Gen; Protoonkogene wie die ras-, src- und bcl-Gene; Tumorsuppressorgene wie p53 und Rb; den LDL-Rezeptor; das Heregulin-α-Proteingen für die Behandlung von Brust-, Eierstock-, Magen- und Gebärmutterschleimhautkrebs; monoklonale Antikörper, die spezifisch für Epitope sind, die in innerhalb der β- Kette eines T-Zellantigenrezeptors enthalten sind; das Mehrfacharzneimittelresistenz-(MDR-)Gen; für Ribozyme codierende Polynucleotide; Antisense-Polynucleotide; für sekretorische Peptide codierende Gene, die als Konkurrenzinhibitoren des Angiotensin-converting-Enzyms, der Calciumkanäle der vaskulären glatten Muskeln oder der adrenergen Rezeptoren wirken, und für Enzyme codierende Polynucleotide, die amyloide Plaques innerhalb des Zentralnervensystems zerlegen. Es ist jedoch ersichtlich, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf irgendein bestimmtes therapeutisches Mittel beschränkt ist.
Das für das therapeutische Mittel codierende Polynucleotid steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die retrovirale LTR, den SV 40 Promotor, den Zytomegalovirus-(CMV-)Promotor, den Rous-Sarcoma-Virus-(RSV-)Promotor, den Histonpromotor, den polIII Promotor, den β-Actinpromotor, induzierbare Promotoren wie den MMTV-Promotor, den Metallothioneinpromotor, Hitzeschockpromotoren, Adenoviruspromotoren, den Albuminpromotor, den ApoAI-Promotor; B19 Parvoviruspromotoren; humane Globinpromotoren; virale Thymidinkinasepromotoren wie den Herpes-Simplex-Thymidinkinasepromotor; retrovirale LTR's; humane Wachstumshormonpromotoren und den MxIFN induzierbaren Promotor. Der Promotor kann auch der native Promotor sein, der das für das therapeutische Mittel codierende Polynucleotid kontrolliert. Es ist jedoch auch ersichtlich, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf spezifische Fremdgene oder Fremdpromotoren beschränkt ist.
Das erste Expressionsvehikel, das vorzugsweise ein adenoviraler Vektor ist, der eine für das Cyclin G1 Protein codierende DNA-Sequenz oder ein analoges Derivat davon aufweist, und der retrovirale Vektor, der ein für das therapeutische Mittel codierendes Polynucleotid aufweist, können Zellen in vivo oder in vitro transduzieren.
Bei einer Ausführungsform werden die Zellen mit dem ersten Expressionsvehikel, das vorzugsweise ein adenoviraler Vektor ist, vor der Transduktion der Zellen mit dem zweiten Expressionsvehikel (d.h. dem retroviralen Vektor) transduziert. Bei einer weiteren Ausführungsform werden die Zellen mit dem ersten Expressionsvehikel und dem zweiten Expressionsvehikel gleichzeitig transduziert.
In den folgenden Passagen sind die erwähnten in vivo Verfahren und Behandlungsmethoden als solche nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Wenn er in vivo verabreicht wird, wird der adenovirale Vektor in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die gewünschten Zellen mit dem für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotid zu transduzieren. Der adenovirale Vektor kann systemisch wie beispielsweise mittels intravenöser, intraarterieller oder intraperitonealer Verabreichung verabreicht werden. Alternativ kann der adenovirale Vektor mittels direkter, nichtsystemischer Injektion einem gewünschten Gewebe, einem gewünschten Organ oder einer gewünschten Masse von Zellen wie beispielsweise einem Tumor verabreicht werden. Im Allgemeinen wird der adenovirale Vektor bei einer Vielzahl von Infektionen von etwa 1 bis etwa 10 verabreicht (?).
Der retrovirale Vektor wird dem tierischen Wirt in vivo in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um in dem Tier eine therapeutische Wirkung hervorzurufen.
Das Tier kann ein Säuger, einschließlich humaner und nichthumaner Primaten sein. Die retroviralen Vektoren können systemisch, beispielsweise intravenös oder intraarteriell oder intraperitoneal oder direkt mittels nichtsystemischer Injektion in ein gewünschtes Gewebe, ein gewünschtes Organ oder eine gewünschte Masse von Zellen wie beispielsweise einen Tumor verabreicht werden.
Die retroviralen Vektoren werden einem Tier in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um bei dem Tier eine therapeutische Wirkung hervorzurufen. Im Allgemeinen werden die retroviralen Vektoren in einer Menge von mindestens 1 × 10⁵ cfu/ml verabreicht, und im Allgemeinen übersteigt eine solche Menge 1 × 10⁹ cfu/ml nicht. Vorzugsweise werden die retroviralen Vektoren in einer Menge von etwa 1 × 10⁶ cfu/ml bis etwa 1 × 10⁸ cfu/ml verabreicht. Die genaue Dosierung, die zu verabreichen ist, hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich dem Alter, der Größe, dem Gewicht und Geschlecht des Patienten, der Erkrankung, die behandelt wird, und deren Schweregrad.
Die retroviralen Vektoren und die adenoviralen Vektoren werden jeweils dem Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger wie beispielsweise einer physiologischen Kochsalzlösung verabreicht. Andere pharmazeutische Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Mineralöl, Alaun und Lipidbläschen wie Liposome. Die Wahl eines geeigneten pharmazeutischen Trägers wird als innerhalb des Umfangs der hier enthaltenen Lehren liegend von Fachleuten erachtet.
Bei einer Ausführungsform sind die eukaryontischen Zellen, die in vivo mit den retroviralen und adenoviralen Vektoren transduziert werden, primäre humane Zellen. Das für ein therapeutisches Mittel codierende Gen kann jedes Gen mit einer klinischen Brauchbarkeit, beispielsweise therapeutische oder Markergene, sein. Vorzugsweise sind die primären humanen Zellen Blutzellen. Der Begriff "Blutzellen", wie hier verwendet, sollen alle Formen von kernhaltigen Blutzellen sowie Vorläufer und Vorstufen davon, enthalten.
Das Gen, das durch die Blutzellen getragen wird, kann jedes Gen sein, dass die therapeutischen Wirkungen der Blutzellen direkt erhöht. Das von den Blutzellen getragene Gen kann jedes Gen sein, das gestattet, dass die Blutzellen eine therapeutische Wirkung ausüben, die sie normalerweise nicht haben, wie ein für einen Gerinnungsfaktor codierendes Gen (z.B. Faktor VIII oder Faktor IX), das bei der Behandlung von Hämophilie brauchbar ist. Das Gen kann für ein oder mehrere Produkte mit therapeutischen Wirkungen codieren. Beispiele von geeigneten Genen umfassen diejenigen, die für Zytokine wie TNF, Interleukine (Interleukine 1-12), Interferone (α-, β-, γ-Interferone), T-Zellrezeptorproteine und Fc-Rezeptoren zum Binden an Antikörper codieren.
Die retroviralen Vektoren sind bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten brauchbar, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Adenosindesaminasemangel, Sichelzellenanämie, Thalassämie, Hämophilie, Diabetes, α-Antitrypsinmangel, Hirnerkrankungen wie Alzheimer-Krankheit und andere Krankheiten wie Wachstumsstörungen und Herzkrankheiten, beispielsweise diejenigen, die durch Änderungen der Weise, in der Cholesterin metabolisiert wird, verursacht werden und Defekte des Immunsystems.
Bei einer Ausführungsform können die retroviralen Vektoren einen negativen selektierbaren Marker wie beispielsweise ein virales Thymidinkinasegen und ganz besonders das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(TK-)Gen enthalten. Solche retroviralen Vektoren können zusammen mit den vorstehend beschriebenen adenoviralen Vektoren Tumorzellen (insbesondere Krebszellen) in einem humanen Patienten in vivo verabreicht werden. Die adenoviralen Vektoren und die retroviralen Vektoren transduzieren dann die Tumorzellen. Nachdem die retroviralen Vektoren die Tumorzellen transduziert haben, wird dem Patienten ein Wechselwirkungsmittel wie Gancyclovir oder Acyclovir verabreicht, das mit dem Protein in Wechselwirkung steht, das von dem negativen selektierbaren Marker exprimiert wird, um alle replizierenden Zellen (d.h. die Tumorzellen) zu töten, die mit dem retroviralen Vektor, einschließlich des negativen selektierbaren Markers transduziert wurden.
Die adenoviralen Vektoren und die retroviralen Vektoren, die vorstehend erwähnt werden, werden auch in einem Tiermodell verabreicht, um die Wirksamkeit einer Gentherapiebehandlung zu bestimmen. Beispielsweise können ein adenoviraler Vektor, der ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid enthält, und ein retroviraler Vektor, der ein für ein therapeutisches Mittel codierendes Polynucleotid enthält, Tieren der gleichen Spezies verabreicht werden. Der retrovirale Vektor wird den Tieren in verschiedenen Mengen verabreicht. Durch die Bestimmung der Wirksamkeit der Gentherapiebehandlung bei dem Tier kann eine wirksame Menge des retroviralen Vektors bestimmt werden, die einem humanen Patienten verabreicht werden soll.
Bei einer weiteren Ausführungsform werden die adenoviralen Vektoren, die eine für das Cyclin G1 Protein codierende DNA-Sequenz enthalten, einem Patienten zusammen mit retroviralen Erzeuger-Zellen in vivo verabreicht, die retrovirale Vektoren erzeugen, die ein für ein therapeutisches Mittel codierendes Polynucleotid enthalten.
Eine solche Ausführungsform ist besonders auf die Behandlung von Tumoren (einschließlich maligner und nichtmaligner Tumoren) anwendbar wie beispielsweise Lebertumoren, Knochentumoren und Lungentumoren. Beispielsweise können die Erzeugerzellen einen retroviralen Plasmidvektor enthalten, der einen negativen selektivierbaren Marker enthält. Die adenoviralen Vektoren und die retroviralen Erzeugerzellen werden dann dem Tumor verabreicht, wodurch die Erzeugerzellen retrovirale Vektorteilchen erzeugen, die das für den negativen selektierbaren Marker codierende Polynucleotid enthalten. Die adenoviralen Vektoren und die retroviralen Vektorteilchen, die durch die retroviralen Erzeugerzellen erzeugt werden, transduzieren die Tumorzellen, wodurch die Tumorzellen die negativen selektivierbaren Marker erzeugen. Bei Verabreichung eines Wechselwirkungsmittels an den Patienten, werden die transduzierten Tumorzellen getötet.
Alternativ können die adenoviralen Vektoren und der retrovirale Vektor eukaryontische Zellen in vitro transduzieren, wodurch die eukaryontischen Zellen in vitro für die in vitro Herstellung des therapeutischen Mittels gezüchtet werden, oder alternativ können die transduzierten eukaryontischen Zellen einem Wirt als Teil eines Gentherapieverfahrens verabreicht werden, wodurch die transduzierten eukaryontischen Zellen das therapeutische Mittel in vivo in einem Wirt exprimieren.
Wie vorstehend angegeben, können die vorstehend angegebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung von geeigneten Expressionsvehikeln durchgeführt werden, die entweder ein für ein Mittel codierendes Polynucleotid, das das Cyclin G1 Protein inhibiert (wenn man einen Tumor durch Inhibieren des Cyclin G1 Proteins behandeln möchte) oder ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid enthalten (wenn man eine Zelllinie immortalisieren oder die retrovirale Transduktion von Zellen verbessern möchte). So wird gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvehikel geschaffen, das ein für ein Mittel codierendes Polynucleotid enthält, das bei einer Ausführungsform ein Mittel ist, das das Cyclin G1 Protein inhibiert. Solche Mittel umfassen diejenigen, die vorstehend beschrieben sind, wie beispielsweise Antisense-Polynucleotide oder Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die das Cyclin G1 Protein erkennen, oder einen cyclinabhängigen Kinaseinhibitor. Bei einer weiteren Ausführungsform codiert das Polynucleotid für das Cyclin G1 Protein.
Das Expressionsvehikel kann ausgewählt werden aus denjenigen, die vorstehend beschrieben wurden, und kann vorzugsweise ein viraler Vektor, einschließlich RNS-Virusvektoren und DNA-Virusvektoren, wie vorstehend beschrieben, sein.
Bei einer Ausführungsform ist der virale Vektor ein RNS-Virusvektor und ist vorzugsweise ein retroviraler Vektor wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Bei einer weiteren Ausführungsform ist der virale Vektor ein DNA-Virusvektor und ist vorzugsweise ein adenoviraler Vektor wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind.
Des weiteren wird ein Verfahren zur Feststellung von Krebs durch die Feststellung der erhöhten Expression des Cyclin G1 Proteins zur Verfügung gestellt, wobei eine solche erhöhte Expression festgestellt wird durch Feststellen von erhöhten Mengen von für Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotiden oder durch Feststellen von erhöhten Mengen von Cyclin G1 Protein im Vergleich zu normalen nichtkanzerösen Zellen. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren von Zellen mit einem Mittel, das sich (i) an Cyclin G1 Protein bindet und/oder (ii) einem für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotid. Das Binden des Mittels an Cyclin G1 Protein und/oder ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid wird dann bestimmt.
Das Cyclin G1 Protein wird intrazellulär exprimiert und, um mit Bezug auf die erhöhte Expression des Cyclin G1 Proteins zu testen, werden geeignete Verfahren vor dem Kontaktieren der Zellen mit einem Mittel, das sich an das Cyclin G1 Protein bindet und/oder einem für das Cyclin G1 Protein codierenden Polynucleotid verwendet, um das Binden des Mittels in dem Assay zu ermöglichen. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Fixierung einer histologischen Probe der Zellen vor dem Assay.
Mittel, die bei diesem Aspekt verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Polynucleotide (z.B. DNA- oder RNS-Sonden), die sich an ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid hybridisieren können, und Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die das Cyclin G1 Protein erkennen.
Bei einer Ausführungsform ist das Mittel ein Polynucleotid, das sich an ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid hybridisiert.
Bei einer anderen Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper oder Fragment oder Derivat davon, der bzw. das das Cyclin G1 Protein erkennt. Solche Antikörper umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, monoklonale Antikörper, polyclonale Antikörper und einzelkettige Antikörper.
Bestimmte Eigenschaften von Krebs können mittels der Analyse der Menge des Bindens an das Cyclin G1 Protein, das in den Zellen exprimiert ist, oder der Menge des Bindens an ein für das in den Zellen vorhandene Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid bestimmt werden. Eine Bestimmung einer erhöhten Menge des Bindens des Mittels an das Cyclin G1 Protein im Vergleich zu derjenigen, die bei normalen Zellen beobachtet wird, oder an ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid kann ein Anzeichen für das Vorhandensein von Krebszellen sein. Krebs, der gemäß diesem Verfahren bestimmt werden kann, umfasst das osteogene Sarkom und das Ewing-Sarkom und andere neoplastische Erkrankungen, bei denen das Cyclin G1 exprimiert wird, wie denjenigen, die vorstehend beschrieben sind.
Die Bestimmung des Bindens des Mittels an das Cyclin G1 Protein oder an ein für das Cyclin G1 Protein codierendes Polynucleotid kann mittels einer Vielzahl von Assay-Verfahren, die für Fachleute bekannt sind, bestimmt werden. Solche Assays umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, direkte und indirekte Sandwich-Assays, kolorimetrische Assays und ELISA-Assays.
Bei den vorstehend angegebenen Assays wird das Mittel, das sich an das Cyclin G1 Protein oder an das Polynucleotid bindet, das für das Cyclin G1 Protein codiert, oder ein Bindemittel, das sich an das Mittel bindet, wenn ein indirekter Sandwich-Assay verwendet wird, an eine feststellbare Markierung oder einen feststellbaren Marker gekoppelt. Solche Markierungen oder Marker umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, radioaktive Isotope von beispielsweise Iod, Kobalt oder Tritium, ein Enzym, einen fluoreszenten Farbstoff, einen absorbierenden Farbstoff, eine chemilumineszente Substanz, eine Spinmarkierung, Biotin, Hämatoxylin, ein gefärbtes Teilchen oder jede andere einem Fachmann bekannte Markierungssubstanz.
Bei einer Ausführungsform werden fixe Zellen, bei denen der Verdacht besteht, dass sie Krebszellen sind, mit einem Antikörper kontaktiert, der das Cyclin G1 Protein erkennt. Die Feststellung des gebundenen Antikörpers kann durch ein indirektes Sandwich-Assay bestimmt werden, bei dem ein Biotin-Avidin-Komplex verwendet wird, der an den Antikörper gebunden ist. Das Avidin wird an ein Enzym wie beispielsweise alkalische Phosphatase gebunden. Die Probe wird mit einem Substrat für das Enzym kontaktiert, das ein gefärbtes Reaktionsprodukt erzeugt. Durch Messen der Entwicklung des gefärbten Reaktionsprodukts kann die Menge des Cyclin G1 Proteins in der Probe der Zellen bestimmt werden, wodurch das Vorhandensein von Krebs und/oder dessen Ausmaß oder dessen Schweregrad bestimmt wird bzw. werden.
BEISPIELE
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, jedoch soll der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht dadurch eingeschränkt werden.
Beispiel 1
MATERIALIEN UND METHODEN
Clonen von Antisense-Cyclin G1, Antisense-Cyclin D1 und p21/WAF1/CIP1 Expressionskonstrukten.
Die voll codierenden Bereiche des humanen Cyclins G1 (1) (Wu, et al., Oncol. Reports, Band 1, Seiten 705-711 (1994)), Cyclin D1 (Xiong, et al., Cell, Band 65, Seiten 691-699 (1991)), und p21/WAF1/CIP1 (Harper, et al., Mol. Biol. Cell., Band 6, Seiten 387-400 (1995); El-Deiry, et al., Cell, Band 75, Seiten 817-825 (1993)), einschließlich der Stop-Codone, wurden durch primerdirigierte RT-PCR-Amplifikation hergestellt. Um das Antisense-Cyclin G1 (aG1) zu schaffen, wurde das Expressionskonstrukt, das 586 bp N-terminale Fragment, einschließlich –65 bp des untranslatierten Bereichs, durch doppelte Verdauung mit XbaI/HpaI aus dem CYCG1 Gen freigesetzt, das ursprünglich aus einer humanen WI-38 Fibroblasten-(ATCC, Rockville, Maryland) cDNA-Bibliothek isoliert wurde und dann durch glatte Ligasierung in den pcDNA3 Vektor (Invitrogen, San Diego, Kalifornien) an der EcoRV-Stelle geclont wurde. Der 605 N-terminale Bereich von Cyclin D1 (Antisense-Orientierung, aD1) und der voll codierende 495 bp Bereich von WAF1/CIP1 (p21) wurden durch Verdauung mit NdeI/NcoI bzw. NdeI/EcoRI, freigesetzt, gefolgt von dem Clonen des glatten Endes in den pcDNA3 Vektor an der EcoRV-Stelle. Die Struktur jedes Konstrukts wurde durch manuelle DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung eines modifizierten Didesoxy-Kettenabruchverfahrens bestätigt (United States Biochemicals).
Konstruktion von retroviralen Vektoren, die Zellzykluskontrollgene (G1aG1SvNa, G1aD1SvNa und G1p21SvNa: retrovirale Vektorquelle, pG1XSvNa; Insertquelle, pcDNA3aG1, pcDNA3aD1, pcDNA3p21) tragen.
Um jeden retroviralen Vektor zu schaffen, wurde pG1XSvNa (Genetic Therapy, Inc., Gaithersburg, Maryland) mit NotI verdaut, die 5'-Phosphate wurden durch Behandlung mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase entfernt und das sich ergebende Fragment wurde dann gelgereinigt (1% Agarose), ausgeschnitten und elektroeluiert. pG1XSvNa ist ein retroviraler Plasmidvektor, der abgeleitet ist von pG1 (beschrieben in der PCT-Anmeldung Nr. WO91/10728 , veröffentlicht am 25. Juli 1991) und der eine retrovirale 5'-LTR, eine retrovirale 3'-LTR, einen Mehrfachclonierungsbereich und ein Neomycinresistenzgen unter der Kontrolle des SV40 Promotors enthält. pG1XSvNa ist des weiteren in der PCT-Anmeldung Nr. WO95/09654 , veröffentlicht am 13. April 1995, beschrieben. Dieses Verfahren erzeugt ein 5856 bp langes Fragment der DNA, das nicht relegieren oder rezirkularisieren kann (?). Um die aG1-, aD1- und p21-Insertfragmente zu isolieren, wurden die jeweiligen Plasmid-DNA doppelt mit HindIII/NotI für aG1 und EcoRI/NotI für aD1 bzw. p21 verdaut. Diese Verdauungsprodukte wurden auf 1% Agarosegel aufgelöst, was das 597 bp HindIII/NotI-Fragment von aG1, das 632 bp EcoRI/NotI-Fragment von aD1, und das 522 bp EcoRI/NotI-Fragment von p21 ergab. Diese Banden wurden dann aus den Agarosegelen ausgeschnitten und dann elekroeluiert. Das NotI-Ende jedes Inserts wurde an das NotI Ende des verdauten pG1XSvNa Vektors ligasiert und auf 1% Agarosegels isoliert, was 6453, 6488 and 6378 bp lange Fragmente für aG1, aD1 bzw. p21 ergab. Jedes Fragment wurde dann elekroeluiert und mit dem Klenow-Fragment behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, und dann ligasiert, um geschlossene Plasmid-DNA, einschließlich der jeweiligen Gene, die von Interesse sind, zu erzeugen. Ein erfolgreiches Clonen und eine erfolgreiche Insertorientierung wurden mittels Restriktionsanalyse bestimmt. Die erwarteten DNA-Fragmente, die durch Verdauung mit BstEII und NotI erzeugt wurden, waren 920, 955 und 845 bp für aG1-, aD1- bzw. p21-Inserte und ± 5500 bp für die Vektor-DNA.
Retrovirale Vektorüberstände und Erzeugerzelllinien.
Die β-Galactosidase- und HStk-Expressionsvektoren wurden freundlicherweise als PA317 Verpackungszellclone mit hohem Titer (Titer: 1,3 × 10⁶ und 4,9 × 10⁶ G418^r koloniebildende Einheiten, cfu/ml für β-Galactosidase bzw. HStk Vektoren) von Genetic Therapy, Inc. (Gaithersburg, MD) zur Verfügung gestellt. Die drei experimentellen retroviralen Plasmidvektoren, die Zellzykluskontrollenzym-cDNA tragen, wurden in PA317 Zellen verpackt (Miller, et al., Mol. Cell Biol., Band 6, Seiten 2895-2902 (1986)) und als gepoolte Vektorüberstände getestet (Vektortiter: jeweils 1 × 10⁶ cfu/ml). Die Vektoren werden als G1BgSvNa, G1TK1SvNa.7, G1p21SvNa, G1aD1SvNa und G1aG1SvNa bezeichnet, um die Reihenfolge von Promotoren und Codierungsbereichen anzugeben, die in jedem Vektor enthalten sind (G1 Vektor, lange terminale Wiederholungs-(LTR-)Sequenzen des Moloney-Maus-Leukämie-Virus; Bg, β-Galactosidase oder lacZ Gen; HStk, Herpes-Simplex-Thymidinkinasegen; aG1, humanes Antisense-Cyclin G1; aD1, Antisense-Cyclin D1; p21, Cdk-Inhibitor p21/Waf1/Cip1 Gen; Sv, SV40 früher Bereichs-Enhancer/-Promotor; und Na.7, neo^r Gen, Clon 7). Der retrovirale Vektor G1TK1SvNa 7 wird des weiteren in der PCT-Anmeldung Nr. WO95/09654 , veröffentlicht am 13. April 1995, beschrieben. Der retrovirale Vektor G1BgSvNa wurde aus dem Plasmid pG1BgSvNa erzeugt. pG1BgSvNa wurde durch Verdauen von pSvNa (PCT-Anmeldung Nr. WO95/09654 ) und pG1Bg (PCT-Anmeldung Nr. WO91/10728 ) mit SalI und HindIII konstruiert. Das SalI-HindIII-Fragment von pSvNa, das den SV40 Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen enthält, wurde an das mit SalI/HindIII verdaute pG1Bg ligasiert, um pG1BgSvNa zu bilden.
Die Vektorquelle, G1XSvNa, die nur das von dem SV40 Promotor angetriebene neo^r Gen enthält, wurde als Kontrolle für die Wirkungen der Gentransduktion und G418 Selektion verwendet.
Zellen, Zellkulturbedingungen und Transduktion von Zellen mit lacZ, Zellzykluskontrollgenen und HStk-Vektoren.
Humane osteogene Sarcoma-(MG-63, ATCC Nr. CRL 1427) Zellen und primäre normale diploide humane Fibroblasten (Leberursprungs) wurden mit einer Plattierungsdichte von 2,5 × 10⁴ Zellen in jeder der Platten mit sechs Vertiefungen in DMEM, ergänzt mit 10% FBS (D10), gezüchtet. Nach einer Anheftung über Nacht wurden die Zellen 1 ml des jeweiligen retroviralen Vektors in Gegenwart von Polybren (8 μg/ml) während zwei Stunden ausgesetzt, wonach 1 ml frisches D10 jeder Vertiefung zugegeben wurde. Achtundvierzig Stunden nach der Transduktion mit dem lacZ-Vektor, wurde die Gentransferwirksamkeit durch Bestimmen des Prozentsatzes von LacZ positiven Zellen bei X-gal-Färbung und Lichtmikroskopie gemessen.
Ganciclovir (GCV) Zytotoxizität/"Bystander"-Wirkungen in mit dem HStk-Vektor transduzierten MG-63 Zellen.
Anfängliche Dosisabhängigkeitsstudien (?) bestimmten die Empfindlichkeit von MG-63 Zellen und die optimalen Konzentrationen von G418, die verwendet wurden, um die transduzierten Zellen auszuwählen. Bei der G418 Selektion wurden unterschiedliche Anteile von HStk-transduzierten und nichttransduzierten MG-63 Zellen (Plattierungsdichte 2,5 × 10⁴ Zellen) 20 μg GCV/ml D10 in jeder der Platten mit sechs Vertiefungen während 10 Tagen ausgesetzt. Folglich wurden die "Bystander"-Wirkungen von GCV in HStk-transduzierten MG-63 durch Bestimmen des Grads der Konfluenz von Zellen in jeder Vertiefung in 10 Tage alten Kulturen gemessen. Die "Bystander"-Wirkungen der GCV-Behandlung wurden mit denjenigen in den HStk-transduzierten NIH 3T3 Zellen (ATCC Nr. CRL 1658) verglichen.
Bewertung des Zellwachstums, der Proteinexpression und Apoptose in MG-63 Zellen, die chimäre retrovirale Vektoren tragen.
Zur Bewertung der zytostatischen Wirkungen von retroviralen Vektoren, die Zellzyklusmodulatoren tragen, wurden die Zellen, die mit Kontrollvektoren oder Vektoren, die Zellzyklusmodulatoren exprimieren, transduziert wurden, mit Bezug auf ihr proliferatives Potential durch Zählen der Anzahl der lebensfähigen Zellen in jeder Kultur in seriellen Intervallen (0, 24, 48, 72, 144 und 192 Stunden) nach der Transduktion bewertet. Eine Western-Analyse der Proteinexpression wurde wie vorstehend beschrieben (Williams, et al., J. Biol. Chem., Band 268, Seiten 8871-8880 (1993); Wu, et al., Oncol. Reports, Band 2, Seiten 227-231 (1995)) unter Verwendung von polyklonalem Antipeptid-Antikörper, der die C-terminalen 18 Aminosäuren von humanem Cyclin G1 erkennt (Wu, et al., 1994) durchgeführt. Um die Vergleichswirksamkeit der Antisense G1, Antisense D1 und p21 Expression bei der Induktion der Apoptose in MG-63 Zellen zu analysieren, wurden die Zellen anfänglich mittels Lichtmikroskopie mit Bezug auf morphologische Änderungen untersucht, die mit der Apoptose verbunden sind (Zellschrumpfen, Zytolyse, nukleare Fragmentation und Kondensation von Chromatin). Die relative Anzahl von apoptotischen Zellen wurde des weiteren unter Verwendung des Apoptag Plus in situ Apoptosefeststellungskits (Oncor, Gaithersburg, MD) bestätigt und quantifiziert, das die entstehenden 3'-OH DNA-Enden, die durch die endonucleasevermittelte DNA-Fragmentation erzeugt werden, spezifisch feststellt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen retroviralen Vektoren, die aG1-, aD1- und p21-Inserte tragen, und Kontrollvektoren wurde mittels einer Varianzanalyse bestimmt.
ERGEBNISSE
Humanes Osteogenes Sarkom als Target für die Gentherapie unter Verwendung von retroviralen Vektoren.
Anfängliche Studien zielten auf die Charakterisierung der Transduktionswirksamkeit von humanen Osteosarcoma-Zellen unter Verwendung des retroviralen G1BgSvNa Vektorkonstrukts ab. Die scheinbare Transduktionswirksamkeit des retroviralen Vektors war relativ hoch, wobei sie annähernd 80 bis 90% für die transformierten MG-63 Zellen im Vergleich zu normalen diploiden Fibroblasten war, bei denen Transduktionswirksamkeiten von 20 bis 30% beobachtet wurden. 2 zeigt das β-Galactosidase-Färben von MG-63 Zellen nach der Transduktion mit dem LacZ-Vektor. Als nächstes wurden die potentiellen zytoziden "Bystander"-Wirkungen durch Mischen von Zellen, die mit dem Herpes-Simplex-Thymidinkinase-(HStk-)Gen transduziert wurden, mit nichttransduzierten Zellen, gefolgt von der Aussetzung an 20 μg/ml Ganciclovir (GCV), untersucht. 3 ist eine graphische Darstellung, die den Grad der Konfluenz (%) in Mischungen von HStk+ und HStk– MG-63 Zellen, die 10 Tage in Gegenwart von GCV (20 μg/ml) gezüchtet wurden, zeigt. Die nichttransduzierten Kulturen, die 100% HStk– Zellen enthielten, wiesen eine 75%ige Konfluenz auf. Im Gegensatz dazu wiesen die Kulturen, die 10% HStk+/90% HStk– und 30% HStk+/70% HStk-Zellen enthielten, nur eine 15%ige Konfluenz auf, während Kulturen, die 50% HStk+/50% HStk Zellen enthielten, eine 10%ige Konfluenz aufwiesen und Kulturen mit mehr als 50% HStk+ Zellkulturen eine < 10%ige Konfluenz aufwiesen. Die Nichtlinearität der Überlebenskurve zeigt eine beträchtliche "Bystander"-Wirkung von GCV in Mischkulturen von MG-63 Zellen. Sowohl die hohe Transduktionswirksamkeit von retroviralen Vektoren als auch das Auftreten ausgeprägter "Bystander"-Wirkungen bei der HStk+/GCV Behandlung bestätigen die Machbarkeit der Gentherapie für humane osteogene Sarkome unter Verwendung von retroviralen Vektoren.
Zytostatische und zytozide Wirkungen des retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektors in gezüchteten humanen osteogenen Sarcoma-Zellen.
Die Struktur von experimentellen retroviralen Vektorkonstrukten ist schematisch in 4, einschließlich der Position des Neomycin-Phosphotransferase-(neo^r)Gens, das stromabwärts der jeweiligen Gene für drei Zellzykluskontrollproteine positioniert ist, von denen zwei gestutzte Fragmente sind, die in der Antisense-Orientierung konstruiert sind, dargestellt. Die erwarteten Größen der Transcripte für die Antisense-Cyclin G1, die Antisense-Cyclin D1 und die p21 Expressionsvektoren sind 3421, 3456 bzw. 3346 Basenpaare. Die Transduktion von MG-63 Zellen mit jedem der Testvektoren (5) ließ eine deutliche Verringerung der Anzahl der lebensfähigen Zellen, die 24 bis 168 Stunden nach der Transduktion beobachtet wurden, beim Vergleich mit transduzierten Kulturen erkennen, die den Kontrollvektor enthielten, der nur das neo^r Gen exprimierte. Die Zelldichten wurden mittels Zellzählen in Kulturen von MG-63 Zellen in seriellen Intervallen nach der Transduktion mit den retroviralen Vektoren, die das Antisense-Cyclin G1 (G1aG1), das Antisense-Cyclin D1 (G1aD1) und p21 (G1p21) sowie den Kontrollvektor G1XSvNa (G1X) tragen, gemessen.
Wie in 6 gezeigt, wurde die Vergleichsexpression des p29 Cyclin G1 Proteins mittels Western-Blotting analysiert, und es wurde gefunden, dass sie in MG-63 Zellen, die den Antisense-Cyclin G1 Vektor tragen, beträchtlich verringert war.
Antisense-Knockout Cyclin G1 induziert eine Apoptose in humanen osteogenen Sarcoma-Zellen.
Das morphologische Erscheinungsbild von MG-63 Zellen wurde mittels Lichtmikroskopie 72 Stunden nach der Transduktion von retroviralen Vektoren, die das Antisense-Cyclin G1, das Antisense-Cyclin D1, den p21 Inhibitor tragen, und Kontrollvektorkonstrukten beobachtet (7). Zusätzlich zu beträchtlichen Verringerungen der Zelldichten, die in Kulturen beobachtet wurden, die mit Vektoren transduziert wurden, die Antisense-Cyclin G1 sowie Antisense-Cyclin D1 und p21 Konstrukte enthielten (siehe 5), wurde ein morphologischer Beweis von apoptotischen Änderungen, einschließlich Zellschrumpfen, nukleärer Segmentation, Chromatinkondensation und nukleärer Fragmentation (Arends, et al., Int. Rev. Exp. Pathol., Band 32, Seiten 223-254 (1991); Wyllie, et al., International Review of Cytology, Band 68, Seiten 251-306 (1980)), in Zellen, die mit jedem dieser Zellzykluskontrollelemente transduziert wurden, festgestellt. Um den Mechanismus des Zelltods weiter zu untersuchen, wurde ein molekularer/immunzytochemischer Ansatz (Arends, et al., Amer. J. Path., Band. 136, Seiten 593-608 (1990); Gavrieli, et al., J. Cell Biol., Band 119, Seiten 493-501 (1992)) verwendet, um die endonucleasevermittelte DNA-Spaltungsfragmente festzustellen, die für die Apoptose charakteristisch sind (Bursch, et al., Biochem. Cell Biol., Band 68, Seiten 1071-1074 (1990); Compton, Canc. Metast., Band 11, Seiten 105-119 (1992)). 8 zeigt die Feststellung von apoptotischen Zellen durch die immunzytochemische Analyse der DNA-Fragmentation in Kulturen, die die chimären Vektoren tragen, die Antisense-Cyclin G1, Antisense-Cyclin D1 und p21 Konstrukte enthalten. Das Induzieren der Apoptose in jeder der Kulturen, die mit den Zellzykluskontrollvektoren transduziert wurden, wurde als sehr signifikant (Antisense-Cyclin G1, mittleres Auftreten = 38,8 ± 5,0%, n = 6, p < 0,001; Antisense-Cyclin D1, mittleres Auftreten = 37,4 ± 24,4%, n = 6, p < 0,01; und p21, mittleres Auftreten = 37,5 ± 8,2%, n = 6; p < 0,001) im Vergleich zu Kulturen bestimmt, die mit den Kontrollvektor transduziert wurden (mittleres Auftreten = 3,6 ± 4,1%, n = 6). Diese Ergebnisse bestätigen, dass sich die beobachteten zytoziden Wirkungen dieser mit retroviralen Vektoren vermittelten Zellzyklusblockaden aus der Apoptose ergeben.
Das metastatische osteogene Sarkom ist ein Ziel für experimentelle Gentherapien, da es immer mit einem tödlichen Ausgang verbunden ist. Dieser Typ des Sarkoms neigt dazu, lokal zu rezidivieren, sich auf andere Knochen oder die Lunge auszubreiten, die chirurgisch unzugängliche Stellen sind. Tatsächlich haben kürzliche Studien über eine erhöhte Überlebenszeit bei Patienten berichtet, die sich einer agressiven Metastasektomie unterzogen haben (Damron, et al., Oncology, Band 9, Seiten 327-340 (1995)). Die Sicherheit und Wirksamkeit von therapeutischen Vektoren, die spezifische Zellzykluskontrollenzyme oder HStk tragen, könnten durch die intratumorale Injektion der Erzeugerzellen oder des Vektorüberstands in metastatische Herde, gefolgt von der Metastasektomie und der histologischen Untersuchung nach einem Beweis der Apoptose, Zytolyse oder offenkundigen Zytodifferentiierung, bewertet werden. Die vorliegende Studie offenbart eine relativ hohe Transduktionswirksamkeit von MG-63 Osteosarcoma-Zellen mit Bezug auf die vorstehend erwähnten retroviralen Vektoren im Vergleich zu normalen diploiden Fibroblasten. Interessanterweise ist die scheinbare Transduktionswirksamkeit dieser Zellen (80 bis 90%) weit größer als der Prozentsatz von Zellen in der S-Phase in asynchronen Kulturen (Carbonaro-Hall, et al., Oncogene, Band 8, Seiten 1649-1659 (1993)). Nichttransduzierte MG-63 Zellen zeigten beträchtliche zytozide "Bystander"-Wirkungen von Ganciclovir beim Mischen mit mit HStk+ transduzierten Zellen, die zusammen mit retroviraler Transduktionsempfänglichkeit die Machbarkeit der Entwicklung von Gentherapieansätzen in der klinischen Behandlung von metastatischen Krankheiten bestätigen.
Frühere Studien charakterisierten die genaue Sequenz der Cyclin-Expression in MG-63 Osteosarcoma-Zellen (Wu, et al., Int. J. Oncol., Band 3, Seiten 859-867 (1993); Carbonaro-Hall, 1993; Hall, et al., Oncogene, Band 8, Seiten 1377-1384 (1993); Williams, et al., J. Biol. Chem., Band 268, Seiten 8871-8880 (1993)), was die zeitweilige Lokalisierung eines neuen mit Cdk verbundenen Zellzyklusblockpunkts ermöglicht, der von dem antiproliferativen Mittel Rapamycin offenbart wird (Albers, et al., J. Biol. Chem., Band 268, Seiten 22825-22829 (1993)). Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung mit retroviralen Vektoren bestätigen die Ergebnisse von früheren Untersuchungen, bei denen durchdringende Antisense-Oligonucleotide verwendet werden (Wu, 1993), dass die gegen den Cyclin D1 Locus gerichteten Antisense-Strategien die Osteosarcoma-Zellproliferation wirksam inhibieren. Der Mechanismus des Zelltods, der bei Zellen beobachtet wird, die mit jedem der experimentellen Konstrukte (d.h. aG1, aD1 und p21) transduziert wurden, wurde als Apoptose bestimmt, die mit Bezug auf die therapeutische Wirksamkeit in vivo von beträchtlicher Bedeutung ist.
Die physiologische Funktion von Cyclin G1 und sein therapeutisches Potential ist von besonderem Interesse, da dieses Kandidaten-Protooncogen (CYCG1) zunächst mit der Krebspathogenese in humanen Osteosarkomen verbunden wurde (Wu, 1994). Des weiteren legt eine kürzliche Studie nahe, dass Cyclin G1 wie p21 ein transcriptionelles Ziel des p53 Tumorsuppressorproteins ist (Okamoto, et al., EMBO J., Band 13, Seiten 4816-4822 (1994)). Jedoch wurde die anfängliche Hypothese, dass Cyclin G1 kontraintuitiv als inhibierende Untereinheit von cyclinabhängigen Kinasen in einen p53-vermittelten Pfad fungieren könnte, um eine Tumorgenese zu verhindern, durch Experimente unberücksichtigt gelassen, bei denen eine erzwungene Überexpression von Cyclin G1 kein Zellcyclin-Anhalten in entweder normalen oder neoplastischen Zelllinien verursachte (Okanoto, 1994). Im Gegensatz hierzu ist die vorliegende Untersuchung der erste Beweis, dass Cyclin G1 für das Überleben und/oder Wachstum von Osteosarcoma-Zellen wesentlich ist. Diese neuen Daten unterstützen das Konzept, dass Cyclin G1 an der Zellaktivierung oder "Kompetenz" beteiligt ist (Wu, 1994) und dass die Blockade der Cyclin G1 Expression durch Antisense-Konstrukte große zytozide sowie zytostatische Wirkungen ausübt.
Beispiel 2
Materialien und Methoden
Retrovirale Vektorüberstände und Erzeugerzelllinien.
Die β-Galactosidase und p53 Expressionsvektoren wurden freundlicherweise als PA317 Verpackungszellclone mit hohem Titer (Titer: 1,3 × 10⁶ und 2 × 10⁶ koloniebildende Einheiten, cfu/ml für β-Galactosidase bzw. p53 Vektoren) von Genetic Therapy, Inc. (Gaithersburg, MD) zur Verfügung gestellt. Der experimentelle Vektor, der die Antisense-Cyclin G1 cDNA trägt, wurde in PA317 Zellen verpackt und zu Clonen mit hohem Titer wachsen gelassen (Vektortiter: jeweils 1 × 10⁶ cfu/ml). Die Vektoren werden als G1BgSvNa, G1p53SvNa.7 und G1aG1SvNa bezeichnet, um die Reihenfolge von Promotoren und Codierungsbereichen anzugeben, die in jedem Vektor enthalten sind (G1 Vektor, lange terminale Wiederholungs-(LTR-)Sequenzen des Moloney-Maus-Leukämie-Virus; Bg, β-Galactosidase oder lacZ-Gen; p53, p53 Tumorsuppressorgen; aG1, humanes Antisense-Cyclin G1; Sv, SV40 Enhancer/Promotor des frühen Bereichs; und Na, neo^r Gen). Die Vektorquelle, G1XSvNa, die nur das von dem SV40 Promotor angetriebenen neo^r Gen enthielt, wurde als Kontrolle für die Wirkungen der Gentransduktion und G418 Selektion verwendet.
Der Vektor G1p53SvNa.7 wurde aus pG1XSvNa und dem Plasmid pp53 konstruiert. Das Plasmid pp53 wurde aus pBSK-SN3 konstruiert, das von PharmaGenics (Allendale, New Jersey) erhalten wurde, das ein 1,8 kb XbaI-Fragment enthält, das den offenen Wildtyp p53 Leserahmen sowie 5' und 3' nichttranslatierte Bereiche enthielt, die in die XbaI Stelle von pBluescriptSK (Stratagene, LaJolla, Kalifornien) geclont wurden. pBSK-SN3 wurde mit SmaI verdaut und teilweise mit NcoI verdaut, um ein 1.322 bp Fragment zu erzeugen, das den offenen p53 Leserahmen enthielt. Das Fragment wurde gelgereinigt und in das Plasmid pBg (in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO91/10728 , veröffentlicht am 25. Juli 1991) statt dem β-Galactosidasegen zwischen der NcoI- und der XhoI-Stelle ligasiert, um das Plasmid pp53 zu ergeben.
Das Plasmid pG1XSvNa wurde mit SnaBI und NotI verdaut. Die SnaBI- und NotI-Stellen befinden sich in dem Polylinker-Bereich des Plasmids. Das Verdauungsprodukt erzeugte ein Fragment mit einer Länge von 5.848 Basenpaaren. Die Enden des Fragments wurden mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt.
Das Plasmid pp53 wurde mit NotI und SmaI verdaut. Das Verdauungsprodukt erzeugte ein Fragment mit 2.081 Basenpaaren und ein Fragment mit 1.400 Basenpaaren. Das Fragment mit 1.400 Basenpaaren enthielt das p53 Gen. Dieses Fragment wurde isoliert und gelgereinigt.
Das Fragment mit 5.848 Basenpaaren, das von pG1XSvNa erhalten wurde und das Fragment mit 1.400 Basenpaaren, das von pp53 erhalten wurde, wobei jedes Fragment klebrige/glatte Enden aufwies, wurden ligasiert, um pG1p53SvNa zu bilden. Das sich ergebende Plasmid wurde identifiziert und mittels mehrerer diagnostischer Restriktionsanalysen bestätigt. Das pG1p53SvNa wurde dann in PA317 Zellen verpackt, um den retroviralen Vektor G1p53SvNa.7 zu erzeugen.
Zellen, Zellkulturbedingungen und Transduktion von Zellen mit lacZ, Antisense-Cyclin G1 und p53 Vektoren.
Undifferenzierte Kaninchencarcinoma-(VX2)Zellen und andere primäre und etablierte Zelllinien wurden mit einer Plattierungsdichte von 2,5 × 10⁴ Zellen in jeder der Platten mit sechs Vertiefungen in DMEM, ergänzt mit 10% FBS (D10), gezüchtet. Nach dem Anheften über Nacht wurden die Zellen an 1 ml des jeweiligen retroviralen Vektors in Gegenwart von Polybren (8 μg/ml) während 2 Stunden ausgesetzt, wonach 1 ml frisches D10 jeder Vertiefung zugegeben wurde. Achtundvierzig Stunden nach der Transduktion mit dem lacZ-Vektor wurde die Wirksamkeit des Gentransfers durch Bestimmen des Prozentsatzes der positiven lacZ-Zellen bei Färben mit X-gal und Lichtmikroskopie gemessen.
Bewertung der Zellproliferation und Zellzykluskinetik in VX2, transduziert mit retroviralen Vektoren, die Zellzykluskontrollgene tragen.
Um die zytostatischen Wirkungen von retroviralen Vektoren, die Zellzyklusmodulatoren tragen, zu bewerten, wurden die Zellen, die mit Kontrollvektoren transduziert wurden, oder Vektoren, die das Antisense-Cyclin G1 exprimieren, oder p53 Gene mit Bezug auf ihr proliferatives Potential durch Zählen der Anzahl der lebensfähigen Zellen in jeder Kultur in seriellen Intervallen nach der Transduktion bewertet. Die Wirkung der Zellzyklusmodulatoren auf die Zellzykluskinetik von VX2-(Karzinom-) sowie MG-63 (Sarcoma-)Zellen wurde mittels FACS-Analyse getestet. Das Überleben von transduzierten VX2-Zellen in Gegenwart von G418 wurde auch bewertet, um zu bestimmen, in welchem Ausmaß das Antisense-Cyclin G1 für die transduzierten Zellen zytozid war.
Die Entwicklung eines Tumormodells in athymischen Nacktmäusen für die in vivo Gentherapie unter Verwendung von retroviralen Vektoren, die Zellzyklusmodulatoren tragen.
Undifferenzierte Karzinom-(VX2-)Tumore wuchsen erfolgreich auf Nacktmäusen durch das subkutane Implantieren von VX2-Zellen. Diese Tumore wuchsen schnell innerhalb von drei Wochen und sind chirurgisch für die Bewertung von Änderungen des Tumorvolumens und der Tumormorphologie zugänglich. Kurz gesagt, wurden VX2-Tumore während 5 Wochen in athymischen Nacktmäusen durch subkutane Injektion von 1 × 10⁷ VX2-Zellen wachsen gelassen. Wenn die Tumore die Größe von 100 mm³ erreicht hatten, wurden 100 μl des konzentrierten retroviralen Vektorüberstands (G1aG1SvNa, das das Antisense-Cyclin G1 Gen trägt, oder der G1XSvNa Kontrollvektor, der nur das neo^r Gen trägt: Vektortiter, 1 × 10⁸ cfu/ml) in den Tumor unter Metofan-Anästhesie jeden Tag während 2 Wochen injiziert. Das Tumorvolumen wurde jeder Woche unter Verwendung einer Schublehre gemessen und die prozentuale Änderung des Tumorvolumens wurde bestimmt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor und den mit dem Kontrollvektor behandelten Tumoren wurde unter Verwendung des Student t-Tests getestet. Des weiteren wurden mit Formalin fixierte Tumore mit Hämatoxylin-Eosin (H & E) für die histologische Untersuchung gefärbt.
Ergebnisse

Eine große Vielzahl von Zelllinien wurde mit Bezug auf die Empfindlichkeit gegenüber retroviralen Vektoren, die Zellzyklusmodulatoren tragen, getestet. Die Ergebnisse eines solchen Testens sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben. TABELLE I In vitro Transduktionswirksamkeiten und zytostatische Wirkungen eines retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektors bei Krebs- und Nichtkrebszellen

Zelllinie	Zelltyp	Transduktions-Wirksamkeit (G1BgSvNa)	Zytostatische Wirkung (G1aG1SvNa)
Humaner Krebs
MG-63	Osteosarkom	80%	+
HT29	Darmkarzinom	13%	+
Bxpc-3	Pankreaskarzinom	9%	+
Miapaca	Pankreaskarzinom	19%	+
Mnng/Hos	Osteosarkom	15%	+
EW-1	Ewing-Sarkom	5%	+
MDA-MB 231	Brustkrebs	< 1%	–
Nichthumaner Krebs
XC-6 (Ratte)	Osteosarkom	22%	+
Km12C (Ratte)	Darmkrebs	20%	+
Km12C4A (Ratte)	Darmkrebs	15%	+
Km12SM (Ratte)	Darmkrebs	15%	+
C6 (Ratte)	Gliom	5%	+
VX-2 (Kaninchen)	undifferenziertes CA	6%	+
Humaner Nichtkrebs
primär	Knochenmarkstroma	22%	–
primär	aktiviertes Keratozyt	20%	+
primär	Leberfibroblast	23%	–
primär	Keloidfibroblast	31%	+
primär	Dermalfibroblast	24%	+
ECU	endothelial	5%	–
Nichthumaner Nichtkrebs
A10 (Ratte)	glatter Aortenmuskel	45%	+
NIH3T3 (Maus)	Fibroblast	30%	+

Von den getesteten Zellen wurde die Proliferation von 4 Darmkrebszellen (HT-29, KM12C4A, KM12C und KM12SM), Swing-Sarkom (EW 1), C6 Gliom, 2 Pankreaskrebs (BxPc3, Miapaca) und 2 Osteosarkom (MG-63, MnngHOS) durch den retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektor inhibiert. Die HT29, BxPc3 und KM12SM Zellen waren auch gegenüber dem Wildtyp p53 empfänglich. Unter den Nichtkrebszelllinien wurde die Zytostase durch das Antisense-Cyclin G1 und p53 in glatten Aortenmuskelzellen von embryonischen Ratten und humanen Haut- und Keloidfibroblasten, jedoch nicht in humanen normalen Stroma-, humanen von der Leber abgeleiteten Fibroblasten oder humanen Endotheizellen induziert.
Die FACS-Analyse wurde verwendet, um die Wirkung des retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektors auf die Zellzykluskinetik von sarkomatösen und karzinomatösen Tumorzellen zu untersuchen. Undifferenzierte VX2 Karzinomzellen, die mit retroviralen Vektoren transduziert wurden, die Antisense-Cyclin G1 trugen, wiesen große Änderungen der Zellzykluskinetik bei einer FACS-Analyse auf, wobei eine Verbreiterung der Spitzen gezeigt wurde, was eine nukleäre Fragmentation und eine Verringerung von Zellen in der S-Phase anzeigte (9A). Im Vergleich hierzu zeigte die FACS-Analyse von MG-63 Zellen, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor transduziert wurden, eine Akkumulation von Zellen in der G1-Phase und eine beträchtliche Verringerung der Anzahl von Zellen in der S-Phase, was nahelegt, dass der Mechanismus der Zytostase bei diesen transduzierten Zellen einen G1-Phasenzellzyklusblock begleitet (9B).
Gleichzeitig mit der geänderten Zellzykluskinetik inhibierten die Antisense-Cyclin G1 sowie die p53 Vektoren die Proliferation von VX2-Karzinomzellen während 144 Stunden im Vergleich zu den mit dem Kontrollvektor behandelten Zellen (10). Bei der Selektion von transduzierten Zellen mit G418 wurden nur 5% der VX2-Zellen eliminiert (11), was anzeigt, dass die große Mehrheit von Zellen, die das Antisense-Cyclin G1 und das Wildtyp p53 tragen einem Zelltod, wahrscheinlich über eine Apoptose, erfahren haben. Diese Daten stellen den ersten in vitro Beweis dar, dass das Antisense-Cyclin G1 möglicherweise eine Antitumoraktivität bei Krebs eines Epithelursprungs aufweist.
12 zeigt die Inhibierung des Wachstums von VX2-Tumoren bei Nacktmäusen durch die Injektion eines retroviralen Vektors, der Antisense-Cyclin G1 (G1aG1) trägt, in den Tumor im Vergleich zu dem Wachstum von VX2-Tumoren bei Mäusen, die den Kontrollvektor erhielten (G1X; p < 0,05 nach 7 Tagen; p < 0,001 nach 11 Tagen; und p < 0,05 nach 21 Tagen; n = 3 Mäuse in jeder Gruppe). Bei einer von fünf behandelten Mäusen, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelt wurden, wurde eine 12%ige Verringerung der Tumorgröße eine Woche nach der Behandlung festgestellt. Im Gegensatz hierzu wurde das Tumorwachstum bei den Mäusen, die mit dem Kontrollvektor behandelt wurden, nicht angehalten.
Die Mäuse, die mit dem Antisense Cyclin G1 Vektor behandelt wurden, zeigten sehr viel kleinere Tumore als die Kontrollmäuse. 13A zeigt repräsentative, mit dem Antisense-Cyclin G1 behandelte Mäuse im Vergleich zu den mit dem Kontrollvektor behandelten Mäusen, während 13B die histopathologischen Charakteristiken von mit Formalin fixierten und mit H&E gefärbten VX2-Tumorabschnitten zeigt, die nach 21 Tagen (eine Woche nach der Beendigung der Behandlung) geerntet wurden. Die Abschnitte von Tumoren, die mit dem Kontrollvektor behandelt wurden, zeigten Bereiche einer erhöhten Zelldichte mit anaplastischen spindelförmigen Zellen und zahlreichen mitotischen Figuren. Im Gegensatz hierzu zeigten die Abschnitte von Tumoren, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelt wurden, Bereiche mit verringerter Zelldichte mit weniger mitotischen Figuren und einer beträchtlichen mononukleären Zellinfiltration. Es wurden jedoch restliche Tumorzellen in Abschnitten des Tumors, die den Antisense-Cyclin G1 Vektor erhielten, festgestellt, was anzeigt, dass eine Population von Tumorzellen nicht wirksam transduziert wurde. Zusammengenommen scheint der retrovirale Vektor, der das Antisense-Cyclin G1 exprimiert, bei diesem Tumormodell des undifferenzierten Karzinoms Antitumorwirkungen in vivo aufzuweisen.
ERÖRTERUNG
Krebs ist ein Hauptziel für die Gentherapie, da Patienten mit Krebs, insbesondere diejenigen mit einer metastatischen Erkrankung, oft wenige oder keine Behandlungsoptionen haben und für experimentelle Therapien infrage kommen. Das Zuführungssystem für den retroviralen Vektor wurde in 76 der 106 genehmigten humanen Versuchen verwendet. Bei diesem Vektorsystem wird ein replikationsinkompetenter Maus-Retrovirus verwendet, und bis jetzt hat seine Verwendung sowohl ex vivo als auch in vivo keine größeren Nebenwirkungen verursacht.
Andere Gentherapiestrategien umfassen 1) Verbesserung der Immunreaktion durch die Injektion von Tumorimpfstoffen, die transduzierte bestrahlte Tumorzellen enthalten, die Zytokine, MHC Klasse 1 oder B7 Gene exprimieren, 2) erzwungene Expression von Tumorsuppressorgenen, 3) Knockout der Protooncogen-Überexpression durch Antisense-Vektoren, und 4) erzwungene Expression von Wachstumsfaktor-Rezeptorgenen. In den letzten Jahren wurde über die Überexpression oder Amplifikation von verschiedenen Zellzykluskontrollgenen bei verschiedenen malignen Krankheiten berichtet, was anzeigt, dass das Antisense-Knockout dieser überexprimierten Gene verwendet werden könnte, um die Kontrolle der Zellproliferation wiederherzustellen, die Zytostase zu induzieren, das Tumorwachstum zu inhibieren und die Tumorlast zu verringern.
Diese Konzepte ergeben sich aus anfänglichen Untersuchungen der knospenden Hefe S. cerevisiae, bei der extrazelluläre Signale, die das Wachstum und die Differentierung modulieren, über eine Regulierung des aG1 Kontrollpunkts, der START genannt wird, wirken (Hartwell, Science, Band 183, Seiten 46-51 (1974); Cross et al., Ann. Rev. Cell Biol., Band 5, Seiten 341-395 (1989)), was locker zu dem G1 Restriktionspunkt (R-Punkt) analog ist, der in Tierzellen in Kultur beobachtet wird (Pardee, Science, Band 246, Seiten 603-608 (1989)). Deshalb führte die Erkenntnis, dass G1 Cycline (Clns) in S. cerevisiae zusammen mit einer Cdk-Untereinheit (Cdc28) erforderlich waren, damit Zellen START passierten, zu der Hypothese, dass G1 spezifische Cycline tatsächlich als stromaufwärtige Komponenten des Säuger-S-Phasen-Förderungsfaktors fungieren können (Draetta, Trends Biochem. Sci., Band 15, Seiten 378-383 (1990); Reed, Trends in Genetics, Band 7, Seiten 95-99 (1991)). Das Untersuchen der humanen cDNA-Bibliotheken für Gene, die dazu dienen könnten, Cln-defiziente Hefezellen zu retten, führte zu der Identifikation und dem molekularen Clonen von drei neuen Familien von humanen G1 Cyclinen (Cycline C, D und E: Lew et al., Cell, Band 66, Seiten 1197-1206 (1991); Koff et al., Cell, Band 66, Seiten 1217-1228 (1991); Xiong et al., Cell, Band 65, Seiten 691-699 (1991); Sherr, Cell, Band 73, Seiten 1059-1065 (1993)). Spätere Studien haben das PRAD1/Cyclin D1 Gen an das Chromosom 11q13 kartiert, was das Cyclin D1 als das BCL-1 Onkogen, das in B-Zellneoplasmen transloziert und überexprimiert wird (Rosenberg et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 88, Seite 9638 (1991); Withers et al., Mol. Cell. Biol., Band 11, Seite 4846 (1991)) und als 11q13 Onkogen impliziert, das in Plattenepithelzell-, Brust-, Speiseröhren- und Blasenkrebs amplifiziert und überexprimiert wird (Lammie et al., Oncogene, Band 6, Seite 439 (1991); Jiang et al., Cancer Res., Band 52, Seite 2980 (1992); Motokura et al., Curr. Opin. Genet. Dev., Band. 3, Seite 5 (1993)). Eine genetische Amplifikation, eine erhöhte Expression und ein geänderter Metabolismus von Cyclin E wurden auch in humanen Krebszellen beobachtet (Buckley et al., Oncogene, Band 8, Seite 2127 (1993); Keyomarsi et al., Cancer. Res., Band 54, Seite 380 (1994)). Kürzlich wurde ein humanes Cyclin von G-Typ, ein G1 Cyclin, das in einem Untersatz von Osteosarcoma-Zellen deutlich überexprimiert wurde, isoliert (Wu et al., 1994). Zusammengenommen bestätigen diese Erkenntnisse, dass die konstitutive, ektopische oder deregulierte Expression von G1 Cyclinen, die normalerweise Signaltransduktionspfade mit dem enzymatischen Mechanismus des Zellzyklus verbinden (Hunter und Pines, Cell, Band 66, Seiten 1071-1074 (1991); Sherr, (1993)), eine wichtige Rolle bei der neoplastischen Transformation und Tumorgenese spielen kann (Hunter und Pines, Cell, Band 79, Seiten 573-382 (1994)), und als strategische Orientierungspunkte für die Entwicklung von neuen Gentherapieansätzen für Krebs- und hyperproliferative Krankheiten verwendet werden könnte.
Bei dieser Studie wurden die Sicherheit und die Wirksamkeit eines retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektorüberstands als potentieller Gentherapieansatz gegen Krebs getestet. Eine große Vielzahl von Krebszellen zeigte eine Empfindlichkeit gegen das Antisense-Knockout-Cyclin G1 im Vergleich zum Wildtyp p53. Die Proliferation von einigen nichtkanzerösen Zellen wurde auch durch den Antisense-Cyclin G1 Vektor inhibiert, was auch seine potentielle Nützlichkeit bei der Behandlung von nichtmalignen fibroproliferativen Erkrankungen nahe legt. Folglich zeigten verschiedene Zelltypen eine differentielle Empfindlichkeit gegenüber Zellzyklusmodulatoren. Der Antisense-Cyclin G1 Vektor wies große Wirkungen auf die Zellzykluskinetik von sowohl karzinomatösen als auch sarkomatösen Tumorzellen mit einer Nettowirkung einer verringerten DNA-Synthese, wie durch eine Verringerung von Zellen in der S-Phase bewiesen wird, auf. Diese Daten legen nahe, dass der Mechanismus der Zytostase bei diesen transduzierten Zellen einen aG1 Phasenzellzyklusblock begleitet. Bei der Selektion von transduzierten Zellen mit G418 wurden nur 5% der VX2-Zellen eliminiert, was anzeigt, dass die große Mehrheit von Zellen, die das Antisense-Cyclin G1 und den Wildtyp p53 tragen, einem Zelltod, wahrscheinlich über eine Apoptose, unterzogen wurden.
Schließlich wurde das in vivo Tumorwachstum dramatisch durch die aufeinanderfolgende Injektion eines konzentrierten retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektorüberstands in den Tumor inhibiert. Im Gegensatz hierzu wurde das Tumorwachstum bei Mäusen, die mit dem Kontrollvektor behandelt wurden, nicht angehalten. Eine histologische Untersuchung der Tumore eine Woche nach Beendigung der Behandlung zeigte Bereiche einer erhöhten Zelldichte mit anaplastischen spindelförmigen Zellen und zahlreichen mitotischen Figuren bei den mit dem Kontrollvektor behandelten Tumoren. Im Gegensatz hierzu zeigten Abschnitte der Tumore, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelt wurden, Bereiche mit einer verringerten Zelldichte mit weniger mitotischen Figuren und einer beträchtlichen mononukleären Zellinfiltration. Zusammengenommen stellen diese Erkenntnisse den ersten Beweis einer in vivo Antitumoraktivität eines retroviralen Vektors dar, der das Antisense-Cyclin G1 in einem Modell eines undifferenzierten Karzinoms exprimiert.
Beispiel 3
Inhibierung des in vivo Tumorwachstums durch einen retroviralen Vektor, der das Antisense-Cyclin G1 trägt, bei athymischen Nacktmäusen
Osteosarkomtumore wurden während zwei Wochen bei athymischen Nacktmäusen durch subkutane Injektion von 1 × 10⁷ MNNG/HOS-Zellen wachsen gelassen. Wenn die Tumore eine Größe von 100 mm³ erreichten, wurden 100 μl konzentrierter retroviraler Vektorüberstand (G1XsvNa Kontrollvektor, der nur das neo^r Gen trägt, oder G1aG1SvNa, das das Antisense-Cyclin G1 Gen trägt; Vektortiter: jeweils 1 × 10⁸ cfu/ml) jeden Tag während 10 Tagen in den Tumor injiziert.
Das Tumorvolumen wurde in Intervallen von 0, 4, 6, 8, 10 und 12 Tagen nach der Vektorinjektion gemessen. 14 zeigt das Tumorvolumen bei jedem der vorstehend angegebenen Intervalle. Wie in 14 gezeigt, weist die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelte Maus einen kleineren Tumor als die mit dem Kontrollvektor behandelte Maus auf.
Ein Färben mit Hämatoxylin und Eosin von mit Formalin fixierten MNNG/HOS-Tumorabschnitten während zwei Tagen, gefolgt von der Behandlung mit den retroviralen Vektoren, die das Antisense-Cyclin G1 Gen (G1aG1SvNa) oder den Kontrollvektor (G1XSvNa) tragen, zeigt einen verringerten mitotischen Index (1% für mit dem Antisense-Cyclin G1 behandelte Tumore im Vergleich zu 3,5% für die mit dem Kontrollvektor behandelten Tumoren) und eine erhöhte Stromabildung.
Die FACS-Analyse von mit PI gefärbten Kernen, die von MNNG/HOS-Tumoren erhalten wurden, zeigte eine dramatische Verringerung der Anzahl der aneuploiden Zellen in den mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelten Tumoren (2%) im Vergleich zu derjenigen in den mit dem Kontrollvektor behandelten Tumoren (45%). Des weiteren zeigte die diploide Population von Zellen von den mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelten Tumoren eine 77%ige Akkumulation von Zellen in der G1-Phase im Vergleich zu 49% in mit dem G1XSvNa Kontrollvektor behandelten Tumoren und eine beträchtliche Verringerung der Anzahl von Zellen in der S-Phase (15% im Vergleich zu 25%), was nahe legt, dass der Mechanismus der Zytostase in den transduzierten Tumoren wurde von einem G1-Phasenzellzyklusblock begleitet wurde.
Beispiel 4
MATERIALIEN UND METHODEN
Retrovirale Vektoren, Vektorüberstände und Erzeugerzelllinien.
Die cDNA-Sequenz, die für das humane Cyclin G1 codiert (Accession#X77794), ist wie ursprünglich von Wu et al., 1994, beschrieben. Der experimentelle Vektor, der die Antisense-Cyclin cDNA trägt (Wu, et al., 1994) wurde in PA317 Zellen verpackt und zu Clonen mit hohem Titer wachsen gelassen (Vektortiter: jeweils 1 × 10⁶ cfu/ml). Die β-Galactosidase- und p53-Expressionsvektoren wurden freundlicherweise als PA317 Verpackungszellclone mit hohem Titer (Titer: 5 × 10⁵ und 2 × 10⁶ koloniebildende Einheiten, cfu/ml für β-Galactosidase bzw. p53-Vektoren) von Genetic Therapy, Inc. (Gaithersburg, MD) zur Verfügung gestellt. Die Vektoren werden als G1nBgSvNa (beschrieben in den PCT-Anmeldungen Nr. WO95/19427 , veröffentlicht am 20. Juli 1995 und WO96/22212 , veröffentlicht am 25. Juli 1996), G1p53SvNa.7 und G1aG1SvNa bezeichnet, um die Reihenfolge der Promotoren und Codierungsbereiche anzugeben, die in jedem Vektor enthalten sind (G1, lange terminale Sequenzwiederholungs-(LTR-)Sequenzen des Moloney-Maus-Leukämie-Virus; Bg, β-Galactosidase-Gen; p53, p53 Tumorsuppressorgen; aG1, humanes Antisense-Cyclin G1; Sv, SV40 Enhancer/Promotor des frühen Bereichs; und Na, neo^r Gen). Die retroviralen Vektorüberstände wurden weiter auf einen Titer von 1 × 10⁸ cfu/ml mittels Niedriggeschwindigkeitszentrifugation konzentriert. Das Vektorgrundgerüst, G1XSvNa, das nur das von dem SV40 Promotor angetriebene neo^r Gen enthielt, wurde als Kontrolle für die Wirkungen der Transduktion und G418 Selektion verwendet.
Zellen, Zellkulturbedingungen und Transduktion mit retroviralen Vektoren.
Glatte Muskel-(A10-)Zellen der Rattenaorta wurden von ATCC (Kat. #CRL1476) erhalten und als Monoschichten mit einer Plattierungsdichte von 2,5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS; D10), aufrechterhalten. Nach einer Anheftung über Nacht wurden die Zellen 1 ml des jeweiligen retroviralen Vektors in Gegenwart von Polybren (8 μg/ml) während 2 Stunden unter periodischem Schütteln ausgesetzt, wonach 1 ml frisches D10 jeder Vertiefung zugegeben wurde. Achtundvierzig Stunden nach der Transduktion mit dem β-Galactosidasevektor wurde die Gentransferwirksamkeit durch Bestimmen des Prozentsatzes der β-galactosidase-positiven Zellen bei Aussetzen an X-gal (β-Galactosidase) Färben wie in Lal, et al., J. Histochem. Cytochem., Band 42, Seiten 953-956 (1994) beschrieben, und Visualisieren mittels Lichtmikroskopie gemessen.
Analyse der Zellproliferation, DNA-Synthese, Cyclin G1 Protein-Expression und Apoptose
Um die zytostatischen Wirkungen von retroviralen Vektoren, die Zellzyklusmodulatoren tragen, zu bewerten, wurden die SMC, die mit Kontrollvektoren oder Vektoren, die das bzw. die Antisense-Cyclin G1 (oder p53) Gen(e) exprimieren, transduziert wurden, mit Bezug auf ihr proliferatives Potential durch Zählen der Anzahl der lebensfähigen Zellen in jeder Kultur in seriellen Intervallen nach der Transduktion bewertet wurden. Die gezeigten Werte stellen das Mittel der dreifache ± Standardabweichung (S.D.) dar. Die Wirkung der Zellzyklusmodulatoren auf die DNA-Synthese wurde durch das Einverleiben von ³H-Thymidin in DNA überwacht, wie in Gordon, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 93, Seiten 2174-2179 (1996) beschrieben ist. Kurz gesagt wurden 24 Stunden nach der Transduktion mit dem Antisense-Cyclin G1 oder dem retroviralen Kontrollvektor die Zellkulturen an ³H-Thymidin (1 μCi pro Vertiefung; spezifische Aktivität, 6,7 Ci/mMol; 1 Ci = 37 GBq; New England Nuclear) während 2 Stunden ausgesetzt. Die Zellen wurden dann auf Eis verbracht, zweimal mit kalter, mit Phosphat gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann dreimal mit eiskalter 5%iger Trichloressigsäure (TCA) gespült. Die letzte TCA-Spülung wurde entfernt und das mit TCA ausgefällte Material wurde mit 0,2 ml 1 M Natriumhydroxid, gefolgt von der Neutralisierung mit einem gleichen Volumen 1 M Essigsäure löslich gemacht. Die Einverleibung von ³H-Thymidin in zelluläre Makromoleküle wurde mittels Flüssigszintillationszählen gemessen und als Radioaktivitätseinheiten in dpm/Vertiefung ausgedrückt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen unbehandelten und mit Vektor behandelten Gruppen wurde mittels einer Varianzanalyse bestimmt (ANOVA).
Eine Western-Blotting-Analyse der Cyclinexpression wurde, wie in Wu, et al., Int. J. Oncol., Band 3, Seiten 859-867 (1993) und Colton, Statistics in Medicine, Seite 99, Little, Brown & Co., (1974) beschrieben, unter Verwendung eines polyklonalen Antipeptidantikörpers durchgeführt, der die C-terminalen 18 Aminosäuren des humanen Cyclin G1 erkennt (Wu, et al., 1994). Das Auftreten der Apoptose bei transduzierten Zellkulturen wurde mit dem Apoptag Plus in situ Feststellungskit (Oncor) bewertet, das die entstehenden 3'-OH DNA-Enden, die durch die endonucleasevermittelte DNA-Fragmentation erzeugt wurden unter Verwendung von enzymatischer (terminaler Desoxynucleotidyltransferase; TdT) von mit Digoxigenin markierten Nucleotiden, gefolgt von der immunzytochemischen Feststellung der modifizierten DNA-Fragmente, feststellt (Skotzko, et al., Cancer Res., Band 55, Seiten 5493-5498 (1995)).
Retrovirusvermittelter Transfer des Antisense Cyclin G1 Gens in einem Rattenkarotisverletzungsmodell der vaskulären Restenosierung.
Unter allgemeiner Anästhesie (Ketamin, 10 mg/kg; Rompun, 5 mg/kg) wurde gemäß einem Protokoll, das von der USC Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurde, ein arterieller 2F Intimax Embolektomiekatheter (Applied Medical Resources Corp., Laguna Hills, CA) verwendet, um das Karotisendothel von Wistar-Ratten (die jeweils 400-500 g wogen) zu denudieren. Der Katheter wurde in die Aorta carotis externa eingesetzt, die distal ligiert wurde und in die Aorta carotis communis eingeführt. Der Ballon wurde auf ein Volumen von 10 μl aufgeblasen und dreimal entlang der Länge der Aorta carotis communis geführt. Nach einer Ballonverletzung wurde der Embolektomiekatheter entfernt und die Aorta carotis interna wurde genau distal von der Gabelung vorübergehend ligiert. Die distale Hälfte des verletzten Segments wurde gleichermaßen vorübergehend ligiert und dann den retroviralen Vektoren 15 Minuten ausgesetzt. Jede Gruppe der Tiere erhielt eine Infusion von 100 μl konzentriertem Antisense-Cyclin G1 Vektor mit hohem Titer (n = 7) oder einem Kontrollvektor, der nur das neo^r Gen (n = 4) trug, wonach sich die Ratten erholen durften und mit einer normalen Maus-/Rattendiät und Wasser ad libitum versorgt wurden. Für die Zwecke der Analgesie wurde den Tieren Buprenex, 0,2 mg/kg subkutan alle 12 Stunden während 72 Stunden nach der Operation gegeben. Die Ratten wurden 2 Wochen nach dem Induzieren der vaskulären Verletzung durch eine Überdosis Natriumpentobarbital (120 mg/kg i.m.) geopfert, und mit Formalin fixierte Abschnitte sowohl von verletzten als auch nichtverletzten kontralateralen Karotisarterien wurden mit Hämatoxylin-Eosin, Siris rot Verhoeffs Elastinfärbemittel gefärbt. Histologische Abschnitte wurden mittels Lichtmikroskopie untersucht und die morphometrische Bewertung der Neointimaim Vergleich zu den Media-Oberflächenbereichen wurde unter Verwendung eines Digitalisierungssystems durchgeführt; das Ausmaß der Intimahyperplasie nach einer vaskulären Verletzung wird als Verhältnis von Neointima zu Media ausgedrückt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Verhältnissen von Neointima zu Media von nichtbehandelten und mit Vektor behandelten Gefäßen wurde mittels gepaartem T-Test bestimmt (Colton, 1974).
Ergebnisse
Transduktion von Aorten-SMC mit retroviralen Vektoren, die Zellzykluskontrollgene tragen.
Bei Verwendung eines nuklear zielgerichteten β-Galactosidase Vectors (G1nBgSvNa) betrug die scheinbare Transduktionswirksamkeit von Ratten-(A10)Aorten-SMC etwa 45% (15A), die ähnlich Maus-NIH3T3-Zellen und etwas größer als normale humane Fibroblasten oder narbenabgeleitete (Keloid-)Fibroblasten) war, bei denen eine Transduktionswirksamkeit von 20% bzw. 30% beobachtet wurde. Die Transduktion von Aorten-SMC mit Vektoren, die das Antisense-Cyclin G1 (aG1) trugen, zeigte eine ausgeprägte Verringerung der Anzahl von lebensfähigen Zellen, die 24 bis 144 Stunden nach der Transduktion beobchtet wurde, im Vergleich zu transduzierten Kulturen, die den leeren (Kontroll-)Vektor enthielten (15B). Eine Western-Blotting-Analyse bestätigte die Herunterregulierung der Cyclin G1 Proteinexpression in Aorten-SMC, die mit Antisense-Cyclin G1 transduziert wurden, im Vergleich zu dem Kontrollvektor (nicht gezeigt). Die Proliferation der A10-Zellen wurde auch durch die retroviral vermittelte Überexpression des p53 Tumorsuppressorgens in Sense-Orientierung inhibiert. Sowohl die Antisense-Cyclin G1 als auch die p53 Vektoren inhibierten die Zellzyklusprogression wie durch die Einverleibung von ³H-Thymidin bestimmt (p < 0,001 sowohl für aG1 als auch p53; 15C).
Antisense-Cyclin G1 induziert die Degeneration, die multizelluläre Synzytien-Bildung und die Apoptose in Aorten-SMC.
Die in 16 gezeigten Fotomikrographien zeigen das morphologische Erscheinungsbild der Aorten-SMC, beobachtet mittels Lichtmikroskopie 24 Stunden nach der Transduktion mit Kontroll- und retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektoren. Wie in 16A gezeigt, zeigten die mit dem Kontrollvektor transduzierten Zellen keine signifikanten morphologischen Änderungen. Im Gegensatz hierzu wurde eine signifikante Verringerung der Zelldichte in Kulturen beobachtet, die mit Vektoren transduziert wurden, die das Antisense-Cyclin G1 trugen, verbunden mit offenkundigen degenerativen Änderungen, einer erhöhten multinukleären Synzytiumbildung und einer Zytolyse (16B, 16C, 16D). Auffallenderweise überstieg der Anteil von Zellen, die in den Synzytien enthalten sind, die Transduktionswirksamkeit bei weitem, wie mittels der Transduktion und Expression der β-Glactosidase bestimmt. Die Synzytiumbildung fand in A10 Kulturen, die mit den Antisense-Cyclin G1 Vektorüberständen transduziert wurden, die von drei unterschiedlichen Clonen mit hohem Titer abgeleitet wurden, sowie dem p53 Vektor in einem gewissen Umfang, jedoch nicht in den Kontroll-(G1XSvNa) oder β-Galactosidase-Vektoren, statt. Um den Mechanismus des Zelltods weiter zu untersuchen, wurde ein molekularer und immunzytochemischer Ansatz verwendet, um die endonucleasevermittelten DNA-Spaltungsfragmente festzustellen, die für die Apoptose charakteristisch sind. Wie in 16E und 16F gezeigt, wurde kein Beweis einer Apoptose in Zellen, die mit dem Kontrollvektor transduziert wurden, beobachtet (16E); jedoch wurde eine Anzahl von apoptotischen Zellen in den mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor transduzierten Kulturen beobachtet (16F). Diese Ergebnisse zeigen an, dass sich die zytoziden Wirkungen des Antisense-Cyclin G1 Vektors in A10 Aorten-SMC teilweise aus der Apoptose, Zelldegeneration und aberranten Synzytiumbildung ergeben.
Beweis für eine zytozide "Bystander"-Wirkung bei Aorten-SMC-Kulturen, die mit retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektoren transduziert wurden.
Um zu bestätigen, dass nichttransduzierte Zellen den multizellulären Synzytien einverleibt wurden, die in den mit Antisense-Cyclin G1 transduzierten Kulturen gefunden wurden, beluden wir nichttransduzierte A10 Zellen mit einem fluoreszenten Marker und legten die markierten Zellen auf zuvor transduzierte Kulturen zwei Stunden nach dem Auswaschen des Vektorüberstands. Die Einverleibung von nichttransduzierten, fluoreszent markierten glatten A10 Muskelzellen in multinukleare Synzytien war klar ersichtlich, wenn diese markierten Zellen auf zuvor transduzierte A10 Kulturen gelegt wurden (17A und 17B, geringe Vergrößerung; 17C und 17D, hohe Vergrößerung; 17A und 17C, Phasenkontrast; 17B und 17D, UV-Licht). Ein representatives multinukleäres Synzytium, dem Zellen einverleibt sind, die die fluoreszente Markierung enthalten, sind durch den Pfeil identifiziert. Vierundzwanzig Stunden nach der Co-Kultur mit nichttransduzierten, fluoreszent markierten Aorten-SMC wurde eine beträchtliche Anzahl der multinukleierten Synzytien auch mit dem fluoreszenten Farbstoff markiert, was angibt, dass ein Zellverschmelzen zwischen den transduzierten und nichttransduzierten Zellen stattgefunden hat. Diese Erkenntnis liefert einen zusätzlichen Beweis einer neuen zytoziden "Bystander-Wirkung", die von der klassischen "Bystander-Wirkung" unterscheidbar ist, die durch das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase/Ganciclovir-System induziert wird und durch in empfänglichen Zellen vorhandene Spaltgrenzflächen vermittelt wird.
Die Phänomenologie der Zellverschmelzung wurde im Lauf der Zeit verfolgt (17E, die eine beträchtliche Erhöhung der Anzahl der Synzytien gezeigt, die sich während 4 bis 8 Stunden bei Aorten-SMC erhöhte, die mit den Antisense-Cyclin G1 Vektor (G1aG1SvNa) transduziert wurden, im Vergleich zu den Zellen, die mit dem Kontrollvektor (G1XSvNa; p < 0,001) transduziert wurden. Ein nennenswerter Grad der Synzytiumbildung wurde auch in Zellen festgestellt, die mit dem Wildtyp p53 Vektor (G1p53SvNa) transduziert wurden, der auch eine ausgeprägte Zytostase in A10-Zellen hervorrief. Die Anzahl der Synzytien, die in mit p53 transduzierten Zellen beobachtet wurden, war beträchtlich geringer als diejenige, die in mit aG1 transduzierten Zellen nach 8, 12 und 24 Stunden beobachtet wurde (p < 0,001).
Der Antisense-Cyclin G1 Vector inhibiert die Proliferation und Migration von glatten Aortenmuskelzellen in einem in vitro "Gewebe"-Verletzungsmodell.
Hochdichte (konfluente) Monoschichtkulturen von A10 SMC, die eine Kontaktinhibierung von Zellwachstum aufweisen, können stimuliert werden, um sich entlang einer Spur einer Zell-/Gewebestörung zu proliferieren, was eine charakteristische "Wundheilungs"-Reaktion während eines Zeitraums von 7 Tagen zeigt. 18A zeigt hochdichte Kulturen von Aorten-SMC, die mit einer 200 μl Pipettenspitze gekratzt wurden, um eine 1 mm Spur ohne Zellen zu schaffen. 18B zeigt das Erscheinungsbild des "Wund"-Rands unmittelbar nach dem Kratzen und Waschen, um abgelöste Zellen zu entfernen. Wie in 18C gezeigt, war die anschließende Transduktion der Zellkulturen (mit t = 24 Stunden) mit einem nukleär-gezielten β-Galactosidase-Vektor am größten an den Rändern der "Wunde", einem Bereich aktivierter SMC-Proliferation. 18D zeigt die Proliferation und Migration von Aorten-SMC in die Wundspur mit t = 24 Stunden nach der Verletzung. Im Gegensatz hierzu wurden apoptotische und andere degenerative Änderungen in den SMC beobachtet, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor (18E) transduziert wurden. Vor allem waren diese degenerativen Änderungen durch eine multizelluläre Synzytienbildung gekennzeichnet, die weder in dem Kontroll- noch dem β-Galactosidase-Vektor beobachtet wurde. Des weiteren waren die Zellproliferation und offene Zellmigration in die Wundspur in den mit dem Antisense-Cyclin G1 transduzierten Zellkulturen deutlich verringert, was durch das verzögerte Schließen der Wundspur (etwa 7 Tage) im Vergleich zu den mit dem Kontrollvektor behandelten Kulturen (etwa 3 Tage) bewiesen wird.
Inhibierung der Neointima-Bildung in vivo durch die Infusion von Antisense-Cyclin G1 Vektorüberstand mit hohem Titer.
Frühere Untersuchungen haben den direkten Transfer von rekombinanten Markergenen in die arterielle Wand durch retrovirale Vektoren mit viralen Titern von 10⁴-10⁶ Teilchen/ml (Nabel, et al., Science, Band 249, Seiten 1285-1288 (1990)) gezeigt, und eine Reihe von Untersuchungen hat die Wirksamkeit von zytostatischen Gentherapien, die durch andere Methoden bei Tiermodellen der vaskulären Restenosierung zugeführt wurden, gezeigt. Bei dieser Untersuchung wurden retrovirale Vektorüberstände mit hohem Titer (viraler Titer: 1 × 10⁸ cfu/ml) erzeugt, um die Wirksamkeit von Antisense-Cyclin G1 zu testen, das durch hoch konzentrierte retrovirale Vektoren bei dem Rattenkarotisverletzungsmodell der Restenosierung zugeführt wurde. Die histologische Untersuchung von gefärbten Abschnitten, die von mit einem ballonverletzten unbehandelten Arterien erhalten wurden, zeigte eine beträchtliche Neointima-Bildung nach 2 Wochen, wie durch die Invasion der Tunica intima durch proliferierende vaskuläre SMC bewiesen (19A und 19C). Im Gegensatz hierzu zeigen verletzte arterielle Segmente, die mit Antisense-Cyclin G1 Vektorüberständen mit hohem Titer behandelt wurden, eine beträchtliche Verringerung der Neointima-Bildung (19B und 19D). Die morphometrische Analyse bestätigte eine beträchtliche Inhibierung der Neointima-Bildung bei verletzten Karotisarterien, die mit dem retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelt wurden (I:M Verhältnis 0,4 ± S.D. 0,4) im Vergleich zu unbehandelten arteriellen Segmenten (I:M Verhältnis 1,1 ± 0,4; p < 0,001; 19G). Bei Kontrolluntersuchungen gab es keinen Unterschied zwischen dem Ausmaß der Neointima-Bildung in unbehandelten arteriellen Segmenten (I:M Verhältnis 1,3 ± SD 0,5) im Vergleich zu Vektoren mit hohem Titer, die nur das neo^r Gen enthielten (I:M Verhältnis 1,5 ± 0,2).
ERÖRTERUNG
Klinische Versuche auf der Grundlage der molekularen Blockade von identifizierten Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktorrezeptoren, die bei der Pathogenese von Intima-Hyperplasie beteiligt sind, haben bewiesen, dass sie keine wirksamen Vehikel für die zytostatische vaskuläre Therapie sind (Faxon, et al., J. Amer. Coll. Cardiol., Band 25, Seiten 362-369 (1995)). So wurde vorgeschlagen, dass Ansätze, die intrazelluläre Signalisierungskaskaden zielgerichtet anvisieren, an denen viele das Wachstum regelnde Molekülen beteiligt sind, strategischer sein können (Gibbons, et al., Science, Band 272, Seiten 689-693 (1996)). Dementsprechend haben sich neue Gentherapieansätze, die SMC-Proliferation und Neointima-Bildung zu inhibieren, seit kurzem auf Zellzykluskontrollmechanismen konzentriert. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass Antisense-Ansätze gegen die den Zellzyklus regulierende Gene bemerkenswert wirksam bei der Begrenzung der Neointima-Hyperplasie bei Tiermodellen der Läsionsbildung nach sowohl einer Bypasschirurgie (Mann, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 92, Seiten 4502-4506 (1995)) als auch einer Ballonangioplastie sind. Eine einzige intraluminale Zuführung von Antisense-Cdc2-Kinase oder -Cdk2-Kinase rief eine beträchtliche Inhibierung der Neointima-Hyperplasie hervor (Morishita, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 90, Seiten 8474-8478 (1993); Morishita, et al., J. Clin. Invest., Band 93, Seiten 1458-1464 (1994); Abe, Biochem. Biophys. Res. Comm., Band 198, Seiten 16-24 (1994)). Es wurde auch berichtet, dass ein adenoviraler Vektor, der eine nichtphosphorylierbare, konstitutiv aktive Form von Rb trägt, die SMC-Proliferation und Neointima-Bildung nach einer Ballonangioplastie inhibiert (Chang, et al., Science, Band 267, Seiten 518-522 (1995)). Gegen E2F gerichtete molekulare Strategien wurden auch entwickelt, da die konzertierte Induktion von zahlreichen, den Zellzyklus regelnden Genen durch diesen Transcriptionsfaktor geregelt wird. Oligonucleotide, die die E2F-cis-Elementsequenz enthalten, fungieren als "Lockvögel", die E2F innerhalb der Zelle binden und die Neointima-Läsionsbildung in vivo inhibieren (Morishita, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 92, Seiten 5855-5859 (1995)). Eine weitere Unterstützung des Konzepts der zytostatischen Gentherapie, die auf der Inhibierung von Zellzykluskontrollenzyme beruht, wird durch kürzliche Erkenntnisse zur Verfügung gestellt, dass Rapamycin, das die Aktivierung der Zellteilungs-/Zyklusenzyme inhibiert (Albers, et al., Ann. New York Acad. Sci., Band 696, Seiten 54-62 (1993); Albers, et al., J. Biol. Chem., Band 268, Seiten 22825-22829 (1993); Jayaraman, et al., J. Biol. Chem., Band 34, Seiten 25385-25388 (1993), auch die Bildung einer vaskulären Läsion sowohl in Ratten- als auch Schweinemodellen inhibiert (Gregory, et al., Transplantation, Band 59, Seiten 655-661 (1995); Marx, et al., Circ. Res., Band 76, Seiten 412-417 (1995)).
Cyclin G1 ist ein Mitglied der sogenannten G1-Familie von Cyclinen, die zusammen mit cyclinabhängigen Proteinkinasen während der G1-Phase des Zellzyklus wirken (Wu, et al., Int. J. Oncol., Band 3, Seiten 859-867 (1993); Sherr, Cell, Band 79, Seiten 551-555 (1994)). Das Cyclin G1, das im frühen G1 induziert wird und von dem angenommen wird, dass es an den molekularen Mechanismen der Zellaktivierung beteiligt ist (Wu et al., Oncol. Reports, Band 1, Seiten 705-711 (1994)), scheint ein transcriptionelles Ziel des p53 Suppressorgens zu sein (Okamoto, et al., EMBO J., Band 13, Seiten 4816-4822 (1994)). Die Cyclin G1 Überexpression wurde zuerst mit Krebs in Verbindung gebracht (Wu, et al., 1994) und in letzter Zeit wurde berichtet, dass die Herunterregulierung der Cyclin G1 Expression durch retrovirale Vektoren, die das Antisense-CYCG1 tragen, das Wachstum und Überleben von humanen Osteosarcoma-(MG-63)Zellen inhibiert (Skotzko, et al., 1995).
Bei diesem Beispiel wurden die Wirkungen von retroviralen Vektoren, die ein Antisense-Cyclin G1 Konstrukt tragen, auf die Proliferation von glatten A10 Rattenaortenmuskelzellen untersucht. Retrovirale Vektoren, die das Antisense-Cyclin G1 Gen tragen, sowie das p53 Gen in Sense-Orientierung inhibierten das Überleben und die Proliferation von transduzierten A10 Zellen in 2- bis 6-tägigen Kulturen. Die Zytostase wurde mit einer verringerten DNA-Synthese und Herunterregulierung von Cyclin G1 in vaskulären SMC, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor transduziert wurden, im Vergleich zu denjenigen, die mit dem Kontrollvektor transduziert wurden, in Verbindung gebracht. Die morphologische Untersuchung der transduzierten SMC ließ eine Zytolyse, eine enorme Synzytien-Bildung und offene apoptotische Änderungen erkennen, die von einem Zellschrumpfen, einer nukleären Fragmentation und einer Chromatinkondensation bewiesen wurden, die sowohl in den mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor als auch mit dem p53 Vektor transduzierten A10 Zellen beobachtet wurden. Es wurde jedoch gefunden, dass die Anzahl der multinukleären Synzytien in den mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor behandelten Zellkulturen beträchtlich größer war. Ausgeprägte "Bystander"-Wirkungen wurden in A10 Zellen festgestellt, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor transduziert wurden, wie mittels quantitativer Zellverschmelzungs-Assays und der fluoreszenten Markierung von nichttransduzierten Zellen bestimmt. Diese Erkenntnisse geben an, dass der Antisense-Cyclin G1 Vektor einen "verschmelzungsfördernden Faktor", möglicherweise eine Protease oder Glycosylase, induziert, der die Zellverschmelzung und Synzytien-Bildung, vielleicht durch Verstärken von Mechanismen, die mit den fusogenen Eigenschaften des MoMuLV-Hüllproteins verbunden sind, erleichtert (Jones, et al., J. Virol., Band 67, Seiten 67-74 (1993)).
Zytostatische Gentherapien für die Restenosierung zeigen Ansätze von zusätzlichen therapeutischen Ergebnissen, da berichtet wird, dass die Inhibierung von den Zellzyklus regelnden Genen eine vaskuläre Zellapoptose auslöst (Gibbons, et al., 1996; Laird, et al., Circulation, Band 93, Seiten 529-536 (1996)). Bei mitotisch aktivierten SMC wie bei Osteosarcoma-Zellen (Skotzko, et al., 1995) ist die Zytotoxizität der Cyclin G1 Blockade mindestens teilweise auf die Aktivierung eines apoptotischen Pfads zurückzuführen (16F). Des weiteren scheint ist das Induzieren des Zellzyklusanhaltens unter einigen Umständen auch die SMC-Migration und die extrazelluläre Matrixerzeugung zu inhibieren (Giro, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Band 90, Seiten 654-658 (1993)). Bei dem in vitro "Gewebeverletzungs"-Modell wurden sowohl die Proliferation als auch die Migration von A10 Zellen, die mit dem Antisense-Cyclin G1 Vektor transduziert wurden, in dem Bereich der Zellverletzung inhibiert (18E). Mit den Beobachtungen der ausgeprägten Zytotoxizität, der Zellzyklusblockade und der multizellulären Synzytien-Bildung zusammen unterstützen diese Erkenntnisse das Konzept weiter, dass Cyclin G1 einen strategischen Locus für die therapeutische Intervention bei der Behandlung von proliferativen Erkrankungen darstellen kann.
Wenn ein potentielles therapeutisches Gen erst einmal identifiziert worden ist, bleibt das Problem, den Gentransfervektor wirksam der geeigneten physiologischen Stelle zuzuführen. In dem Fall der Ballonangioplastie sorgen sowohl die Denudation der Endothelverkleidung als auch die mitogene Aktivierung von benachbarten SMC für günstige Bedingungen für die Zuführung von retroviralen Vektoren, da die therapeutischen Gene, die durch retrovirale Vektoren zugeführt werden, vorzugsweise in mitotisch aktiven Zellen exprimiert werden. Bei der vorliegenden Untersuchung wurden Überstände mit hohem Titer (10⁸ cfu/ml) erzeugt, um die Transduktionswirksamkeit von vaskulären SMC, und folglich die Wirksamkeit von retroviralen Vektoren, bei diesem experimentellen Modell der Restenosierung zu erhöhen. Tatsächlich können die in vitro Untersuchungen der durch retrovirale Vektoren vermittelten Genzuführung bei embryonischen A10 SMC für die Physiologie der Restenosierung besonders relevant sein, da zahlreiche Berichte angegeben haben, dass embryonische und Neointima-SMC ähnliche Reaktionen auf mitogene Signale aufweisen (Schwartz, et al., The Vascular Smooth Muscle Cell, Schwartz, et al., Herausgeber, Seiten 81-139, Academic Press, Inc., New York (1995)). Diese Untersuchung bei dem Rattenkarotisarterienverletzungsmodell der Restenosierung zeigt die Wirksamkeit dieses Ansatzes: Abschnitte von durch einen Ballon verletzten Karotisarterien, die mit einer Infusion von hoch konzentriertem (10⁸ cfu/ml) retroviralen Antisense-Cyclin G1 Vektorüberstand behandelt wurden, zeigten eine beträchtliche Verringerung der Neointima-Bildung. Zusammengenommen unterstützen diese Daten die Nützlichkeit von retroviralen Vektoren, die Cyclin G1 tragen, allein oder in Kombinatin mit p53 oder dem nun klassischen Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase/GCV-Ansatz bei der Entwicklung von neuen Gentherapiestrategien, um die vaskuläre Restenosierung zu bekämpfen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verwendung eines Wirkstoffs, der Cyclin G1 Protein hemmt, wobei der Wirkstoff umfasst: i) Antisense-Oligonukleotide oder -Polynukleotide oder Fragmente davon oder Sequenzen, die zu mindestens einem Abschnitt eines das Cyclin G1 Protein kodierenden Polynukleotids komplementär sind und die an ein das Cyclin G1 Protein kodierendes Polynukleotid binden, um eine Expression eines das Cyclin G1 Protein kodierenden Polynukleotids zu verhindern, oder ii) Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die alle das Cyclin G1 Protein erkennen, wobei die Fragmente oder Derivate des Antikörpers Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäureresten bezüglich des nicht modifizierten Antikörpers aufweisen, zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln eines Tumors bei einem Wirt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung das Antisense-Polynukleotid in einer Form umfasst, die zur Transduktion von Tumorzellen des Wirts damit geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Antisense-Polynukleotid in einem retroviralen Vektor als Expressionsvehikel enthalten ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung den Antikörper oder das Fragment oder Derivat davon in einer Form umfasst, die zur Transduktion von Tumorzellen des Wirts damit geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Antikörper oder das Fragment oder Derivat davon durch ein Polynukleotid kodiert wird, das in einem retroviralen Vektor als Expressionsvehikel enthalten ist, das zur Transduktion von Tumorzellen geeignet ist.
In-vitro-Verfahren zum Unsterblichmachen von Nicht-Tumorzellen, umfassend: die Transduktion der Nicht-Tumorzellen mit einem das Cyclin G1 Protein kodierenden Polynukleotid oder einem Derivat oder Analog davon, wobei das Derivat oder Analog ein Protein ist, das Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäureresten bezüglich der nativen Cyclin G1 Proteinsequenz aufweist, aber dieselben biologischen Eigenschaften wie natives oder nicht modifiziertes Cyclin G1 Protein behält und von einem Antikörper erkannt wird, der natives oder nicht modifiziertes Cyclin G1 Protein erkennt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Cyclin G1 kodierende Polynukleotid oder ein Derivat oder Analog davon in einem retroviralen Vektor enthalten ist.
In-vitro-Verfahren zum Erhöhen der Transduktion von Zellen mit einem retroviralen Vektor, der ein einen therapeutischen Wirkstoff kodierendes Polynukleotid aufweist, umfassend: die Transduktion der Zellen mit einem ersten Expressionsvehikel, das ein das Cyclin G1 Protein kodierendes Polynukleotid aufweist, wobei das erste Expressionsvehikel kein retroviraler Vektor ist; und die Transduktion der Zellen mit einem zweiten Expressionsvehikel, das ein ei nen therapeutischen Wirkstoff kodierendes Polynukleotid aufweist, wobei das zweite Expressionsvehikel ein retroviraler Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das erste Expressionsvehikel ein adenoviraler Vektor ist.
Expressionsvehikel, umfassend ein Polynukleotid, das einen Wirkstoff kodiert, der das Cyclin G1 Protein hemmt, wobei der Wirkstoff umfasst: i) Antisense-Oligonukleotide oder -Polynukleotide oder Fragmente davon oder Sequenzen, die zu mindestens einem Abschnitt eines das Cyclin G1 Protein kodierenden Polynukleotids komplementär sind und die an ein das Cyclin G1 Protein kodierendes Polynukleotid binden, um die Expression eines das Cyclin G1 Protein kodierenden Polynukleotids zu verhindern, oder ii) Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die alle das Cyclin G1 Protein erkennen, wobei die Fragmente oder Derivate des Antikörpers Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäureresten bezüglich des nicht modifizierten Antikörpers aufweisen.
Expressionsvehikel nach Anspruch 10, wobei das Expressionsvehikel ein viraler Vektor ist.
Expressionsvehikel nach Anspruch 11, wobei der Vektor ein retroviraler Vektor ist.
Expressionsvehikel nach Anspruch 1l, wobei der Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Verwendung eines Wirkstoffs, der das Cyclin G1 Protein hemmt, wobei der Wirkstoff umfasst: i) Antisense-Oligonukleotide oder -Polynukleotide oder Fragmente davon oder Sequenzen, die zu mindestens einem Abschnitt eines das Cyclin G1 Protein kodierenden Polynukleotids komplementär sind und die an ein das Cyclin G1 Protein kodierendes Polynukleotid binden, um die Expression eines das Cyclin G1 Protein kodierenden Polynukleotids zu verhindern, oder ii) Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon, die alle das Cyclin G1 Protein erkennen, wobei die Fragmente oder Derivate des Antikörpers Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäureresten bezüglich des nicht modifizierten Antikörpers aufweisen, zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Verhindern oder Behandeln einer Restenosierung bei einem Wirt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung das Antisense-Polynukleotid in einer Form umfasst, die zur Transduktion von Zellen des Wirts damit geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Antisense-Polynukleotid in einem retroviralen Vektor als Expressionsvehikel enthalten ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Wirkstoff, der das Cyclin G1 Protein hemmt, an der Stelle eines invasiven vaskulären Verfahrens aktiv ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das invasive vaskuläre Verfahren eine Angioplastie ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das invasive vaskuläre Verfahren ein vaskuläres Transplantat ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Wirkstoff, der das Cyclin G1 Protein hemmt, an der Stelle einer vaskulären Läsion aktiv ist.